CN117756936A - 一种Axl拮抗抗体或抗原结合片段 - Google Patents

一种Axl拮抗抗体或抗原结合片段 Download PDF

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Abstract

本发明涉及特异性结合Axl受体酪氨酸激酶的细胞外结构域并且至少部分抑制Axl活性的抗体或抗原结合片段、其抗体药物偶联物、以及含有本发明抗体或抗原结合片段或其抗体药物偶联物的组合物；同时还涉及本发明的抗‑Axl抗体或抗原结合片段用于治疗Axl介导的相关肿瘤中的用途和方法。

Description

一种Axl拮抗抗体或抗原结合片段
技术领域
本文涉及特异性结合Axl(酪氨酸激酶受体)的拮抗抗体或抗原结合片段、包含该抗体或抗原结合片段的抗体药物偶联物，包含该抗体或抗原结合片段的组合物、及其使用上述抗体或抗原结合片段、抗体药物偶联物或组合物用于预防或治疗Axl介导的相关肿瘤。
背景技术
Axl又称Ark、UFO或Tyro-7，是属于Tyro-3家族的受体酪氨酸激酶。该家族的成员还包括MerTK以及Sky等。其配体为Gas6，Gas6是一种分子量为70kDa的蛋白质，与抗凝因子S同源。Axl结合配体并激活后，会引起一系列的信号级联，导致PI3K-Akt(Franke et al.,Oncogene 22:8983-8998,2003)以及Ras/Erk和β-catenin/TCF(Goruppi et al.,Mol.CellBiol.21:902-915,2001)通路的激活。
Axl在正常组织，包括大脑、心脏、骨骼肌、***以及单核细胞上仅有低水平表达，已有证据表明，其在淋巴细胞上不表达。成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞以及神经元内的Akt磷酸化，是由Axl激活引起的，这种诱导磷酸化对这些细胞的存活至关重要，参见(Goruppi et al.,Mol Cell Biol 17:4442-4453 1997)、(Hasanbasic et al.,Am JPhysiol Heart CircPhysiol,2004)、vascular smooth muscle cells(Melaragno etal.,J.Mol.Cell Cardiol.37:881-887,2004)、和neurons(Allen et al.,Mol.Endocrinol.13:191-201 1999)。另外，Axl还在细胞黏附和趋化过程中发挥作用，Axl敲除会引起整合素IIb3的激活异常，从而导致血小板聚合和凝血过程受影响。
Axl在多种肿瘤组织中异常高表达，比如乳腺癌(Meric et al.,Clin.CancerRes.8:361-367,2002；Berclaz et al.,Ann.Oncol.12:819-824,2001)、结肠癌(Chen etal.,Int.J.Cancer 83:579-584,1999；Craven et al.,Int.J.Cancer 60:791-797,1995)、***癌(Jacob et al.,Cancer Detect.Prev.23:325-332,1999)、肺癌(Wimmel et al.,Eur J Cancer 37:2264-2274,2001)、胃癌(Wu et al.,Anticancer Res 22:1071-1078,2002)、卵巢癌(Sun et al.,Oncology 66:450-457,2004)、子宫内膜癌(Sun et al.,Ann.Oncol.14:898-906,2003)、肾癌(Chung et al.,DNA Cell Biol.22:533-540,2003)、肝细胞癌(Tsou et al.,Genomics 50:331-340,1998)、胸腺肿瘤(Ito et al.,Thyroid12:971-975,2002；Ito et al.,Thyroid 9:563-567,1999)、食管肉瘤(Nemoto et al.,1997)、慢性髓淋巴瘤(Janssen et al.,A novel putative tyrosine kinase receptorwith oncogenic potential.Oncogene,6:2113-2120,1991；Braunger et al.,Oncogene14:2619-2631 1997；O'Bryan et al.,Mol Cell Biol 11:5016-5031,1991)、急性髓系淋巴瘤(Rochlitz et al.,Leukemia 13:1352-1358,1999)、骨肉瘤(Nakano et al.,J.Biol.Chem.270:5702-5705,2003)、黑色素瘤(van Ginkel et al.,Cancer Res 64:128-134,2004)、以及头颈部肿瘤(Green et al.,Br J Cancer.200694:1446-5,2006)中有高表达。
已有研究表明Axl在侵袭性很强的乳腺癌中异常高表达，且与肿瘤迁移高度相关。体外实验证实肿瘤组织的迁移和侵袭依赖于Axl的活性，而采用抗体治疗抑制这种活性则可以抑制其活性(WO04008147)。同样，在体内抑制Axl，例如表达一种无活性的Axl或采用siRNA抑制Axl的表达，则可以有效的阻断了小鼠体内移植瘤的生长(Vajkoczy,P.,et al.,Proc.Natl.Acad.Science U.S.A.103:5799-5804.2005；Holland et al.,Cancer Res.65:9294-9303,2005)。
肿瘤细胞中Axl的异常活化与对体外和体内靶向治疗剂的获得性耐药性广泛相关(Zhang等，Nat Genet.44:852,2012；Byers等，Clin Cancer Res.19:279,2013)。在几种癌症实验模型，包括三阴性乳腺癌、激素抗性***癌和肺腺癌中，Axl靶向剂通过逆转EMT/CSC特征而阻断肿瘤形成、转移和逆转耐药性(例如，对埃罗替尼erlotinib)(Holland等，Cancer Res 70:1544,2010；Gjerdrum，Proc natl Acad Sci USA 107:1124,2010；Zhang等，Nat Genet.44:852,2012；Paccez等，Oncogene.32:698,2013)。
目前已公开多篇抗-Axl抗体相关专利，例如，WO2011159980A1中公开的抗-Axl单克隆抗体YW327.6或YW327.42；WO2011014457A1中公开的3种抗-Axl抗体3G9、8B5和12A11；CN109311997A中公开的抗-Axl抗体10G5(目前第一个进入临床开发的完全人源化单克隆抗体)。上述专利中描述的抗Axl抗体具有不同的性质，例如3G9、8B5、12A11、10G5四种抗体均诱导Axl表达的下调，但只有3G9、8B5和10G5阻断配体与Axl受体的结合；另外，阻断配体结合的抗体YW327.6S2能够减弱MDA-MB-231异种移植肿瘤生长并增强抗vEGF治疗的作用，而12A11抗体则不具备此功能。目前有5款Axl相关抗体药物开发进入了临床I/II期试验，包括3款靶向Axl的药物偶联抗体(ADC)，1款抗-Axl的单克隆抗体，1款靶向Axl的CAR-T免疫细胞，皆用于肿瘤治疗。其中3款Axl抗体偶联的ADC药物中有2款因安全性或稳定性等问题宣布临床失败。
Axl是一个在多种肿瘤组织中高表达，且在肿瘤的发生、发展过程中作为主要驱动者，其药物开发潜力尚未被完全释放。其一，现有抗体其阻断功能不高，另外，依赖偶联药物对肿瘤进行杀伤的策略，可能会由于潜在毒性限制其应用范围。基于这一推断，筛选获得具有较高阻断活性的抗体，并通过基因工程手段，探索除ADC策略之外的治疗手段，具有潜在的成药优势，可能会为未被满足的临床需求提供可选的解决方案。
发明内容
1.发明概要
本发明涉及靶向AXL的新重组抗体，以及包含一种或多种这些抗体的药物组合物，以及这些抗体和药物组合物用于治疗癌症的用途。本文所述的抗体和组合物可用于治疗患者癌症的方法中；可用于制造用于治疗患者癌症的药物。
与目前可用的此类癌症的治疗(包括抗体治疗)相比，预期本文所述的抗体具有较高的阻断活性，其具有可单独或与另一种癌症治疗剂组合提供优异的临床获益的潜能。
第一方面，本发明提供了一种Axl拮抗抗体或抗原结合片段，其包含特异性结合AXL的可变区，所述可变区包含：(i)重链可变区(VH)结构域和(ii)轻链可变区(VL)结构域，其中，所述VH结构域包含选自下组的一项或多项：(i)SEQ ID NO:1、2或3所示的VH CDR1，(ii)SEQ ID NO:4、5或6所示的VH CDR2，和(iii)SEQ ID NO:7或8所示VH CDR3，和/或
所述VL结构域包含选自下组的一项或多项：(i)SEQ ID NO:9或10所示的VL CDR1，(ii)SEQ ID NO:11或12所示的VL CDR2和(iii)SEQ ID NO:13或14所示的VL CDR3。
第二方面，本公开提供了一种特异性结合AXL的的抗体或其抗原结合片段，其包含重链框架区(VH-FRs)和轻链可变区框架区(VL-FRs),其中，所述VH-FRs包含(i)-(iv)中的一项或多项:(i)选自SEQ ID NO:15、16、17、37和37任一项所示氨基酸序列的重链可变区框架区VH-FR1结构域，(ii)选自SEQ ID NO:18、19、20、38、39和40任一项所示氨基酸序列的重链可变区框架区VH-FR2结构域，(iii)选自SEQ ID NO:21、22、23、24和25任一项所示氨基酸序列的重链可变区框架区VH-FR3结构域，或(iv)选自SEQ ID NO:26或27、所示氨基酸序列的重链可变区框架区VH-FR4结构域；和/或所述VL-FRs包含(v)-(viii)中的一项或多项:(v)选自SEQ ID NO:28、29、44或45任一项所示氨基酸序列的轻链可变区框架区VL-FR1结构域，(vi)选自SEQ ID NO:30、31、32、46、47和48任一项所示氨基酸序列的重链可变区框架区VL-FR2结构域，(vii)选自SEQ ID NO:33、34、49、50和51任一项所示氨基酸序列的重链可变区框架区VL-FR3结构域，和(viii)SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链可变区框架区VL-FR4结构域。
第三方面，本公开提供了一种Axl拮抗抗体或或其抗原结合片段，且其包含(i)抗体重链可变区(VH)结构域和(ii)抗体轻链可变区(VL)结构域：其中，所述重链可变区(VH)结构域包含下组的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:52、53、54、55、56、57、58和60任一项所示的氨基酸序列；和/或
所述轻链可变区(VL)结构域包含下组的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:61、62、63、64、65或66任一项所示的氨基酸序列。
通常，虽然如下面进一步所讨论的那样，单独的VH结构域可用于结合抗原，但是VH结构域与VL结构域配对以提供抗体抗原结合位点。
第四方面，本公开提供了一种Axl拮抗抗体或其抗原结合片段，其包括重链(H)和轻链(L)，其中，所述轻链(L)包含：(i)SEQ ID NO:76、77、78、79、80或81任一项所示的氨基酸序列；和/或，
所述重链(H)包含：(i)SEQ ID NO:67、68、69、70、71、72、73或74任一项所示的氨基酸序列。
一实施方式中，所述重链包含权利要求1所述的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或包含权利要求3所述的重链可变区(VH)；
所述轻链包含权利要求1所述的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或包含权利要求3所述的轻链可变区(VL)。
第五方面，本公开提供了前述Axl拮抗抗体或抗原结合片段的变体，其中，所述变体包含一个或多个骨架区和/或一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸序列改变。
优选的，所述的变体包含：
(i)在前述多个方面所述抗原体中一个或多个框架区FRs或一个或多个CDRs经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列；
(ii)和在前述多个方面所述抗原结合蛋白中的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
第六方面，本发明提供了第一到第四方面所述的Axl拮抗抗体或其抗原结合片段的变体，其中，所述变体：(1)与前述任一项所述的抗体的Axl结合结构域竞争结合Axl；(2)结合与前述任一项所述的抗体相同的表位；(3)结合与前述任一项所述的抗体结合的表位重叠的表位，
(4)其与如前述方面所述的抗体竞争与AXL受体酪氨酸激酶结合。
第六方面，本发明提供了可以前述特异性结合AXL的抗原结合分子或抗原结合片段或变体，与竞争结合AXL抗原的抗体，其中，所述抗体结合AXL抗原,且包含本文公开的抗体VH和/或VL结构域或本文公开的VH CDR3或这些中任一个的变体。
抗体间的竞争可在体外容易地测定，例如使用ELISA.
本发明中可通过将特定报告分子标记到在其它未标记抗体的存在下可以被检测出的一种抗体上，以使得鉴定结合相同表位或重叠表位的抗体成为可能
在一实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段或变体，其进一步包含：
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加；和
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换；
优选地，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，更优选为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区，进一步优选地，其是人IgG1或人IgG4重链恒定区；
优选地，所述轻链恒定区是包含λ型轻链恒定区和κ型轻链恒定区；进一步优选地，其是人κ型轻链恒定区。
优选地，所述抗体或抗原结合蛋白包括：(i)抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或一部分；(ii)全抗体；或(iii)抗原结合抗体片段。
在本领域中有各种方法可用于获得针对Axl并且可与前述抗体竞争结合Axl的抗体。
一实施方式，所述变体为所述VH和VL结构域的变体，本文列出了其序列并且其可用结合于Axl的抗体中并且可借助于序列改变或突变和筛选的方法获得。本发明也提供了此类方法。
前述方面任一项所述Axl拮抗抗体或抗原结合片段或其变体，其中所述Axl为灵长类AXL,或优选的，所述AXL为人Axl。
优选地，所述抗体、抗原结合蛋白或其抗原结合片段，或其变体与AXL受体酪氨酸激酶结合。
更优选地，所述抗原结合蛋白或其抗原结合片段或其变体与AXL受体酪氨酸激酶结合上的O-联聚糖结合。
正如所讨论的，可根据本发明采用本文特别公开其序列的任何VH和VL结构域的可变结构域氨基酸序列变体。特定变体可包括一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或***)，可以为少于约20个改变，少于约15个改变，少于约10个改变或少于约5个改变、4、3、2或1个改变。可在一个或多个骨架区和/或一个或多个CDR中产生改变。
优选地，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体和单域抗体。
优选地，所述抗原结合蛋白选自下组：单克隆抗体、单链抗体、鼠源抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、人源化抗体和全人源抗体、和异种缀合抗体；单可变结构域、结构域抗体、单链抗体、不含铰链区的单价抗体、微抗体、双抗体、三链抗体、κ(λ)抗体、BiTE、DVD-lg、SIP、SMIP或DART和TandabsTM。
更优选的，所述抗原结合蛋为scFv抗体分子或单克隆抗体，或优选的，所述抗原结合蛋为全长IgG1抗体；或优选的，所述抗原结合蛋为嵌合抗体或人源化抗体；或更优选的，所述抗原结合蛋白为完全人抗体。
前述方面的AXL拮抗抗体或其抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其具有下述一项或多项功能：在结合细胞表面存在人AXL的胞外域的Ig-like结构域，抑制AXL结合至Gas6、下调AXL受体的表达、增加AXL受体内化的速度、抑制AXL受体下游的信号传导、增加细胞死亡的速度和抑制肿瘤生长、抑制Axl自体磷酸化、减少纤维化标记物的表达，如减少α-SMA、Col1A1、MCP1和/或TGF-β的表达。
一些实施方式中，本发明的前述Axl拮抗抗体，其以不大于5×10-11M的KD结合Axl；优选的，本发明的前述AAxl拮抗抗体，其以不大于1.5×10-11M的KD结合Axl；
进一步优选的，其以不大于2×10-5s-1的k解离结合Axl；或更进一步可选的，其以不大于3×10-6s-1的k解离结合Axl。
一些实施方式中，本发明的前述Axl拮抗抗体，
其以(i)以高于10-3M的KD结合鼠Axl；
(ii)以高于10-3M的KD结合人Mer；和/或
(iii)以高于10-3M的KD结合人Tyro3。
一些实施方式中，本发明的前述Axl拮抗抗体，其以0.01nM～0.5nM的亲和常数KD(平衡解离常数)与人Axl结合；
一些实施方式中，本发明的前述Axl拮抗抗体，其以0.0001μg/mL～0.1μg/mL的EC50与细胞上的人Axl结合；
一些实施方式中，本发明的前述Axl拮抗抗体，其抑制Gas6与Axl的结合(例如人Axl)；
一些实施方式中，本发明的前述Axl拮抗抗体，其完全抑制AKT的Gas6依赖性磷酸化；
一些实施方式中，本发明的前述Axl拮抗抗体，其下调Axl受体总蛋白水平程度至20％～80％，下调Axl受体膜蛋白水平程度至10％～90％；
一些实施方式中，本发明的前述Axl拮抗抗体，其使Axl受体内化的速率增加1～15倍；
一些实施方式中，本发明的前述Axl拮抗抗体，其使非小细胞肺癌以及胶质瘤中肿瘤细胞的凋亡率提高1～7倍；和/或
一些实施方式中，本发明的前述Axl拮抗抗体，其)抑制肿瘤细胞的增殖，肿瘤抑制率为20％～100％。
一些实施方式中，其中所述Axl为灵长类AXL,或优选的，所述AXL为人Axl。
另一方面，本发明还提供了一种多聚核苷酸，其包含：(1)一个或多个编码选自任一项前述方面的Axl拮抗抗体或抗原片段、抗体或抗原结合片段的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、或重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)中的任一项的核苷酸序列、(2)一个或多个编码权利要求1-13所述的抗体或抗原结合片段的重链、轻链、或重链和轻链的核苷酸序列。
在另外的方面中，本发明提供了一种制备本发明的Axl拮抗抗体、其VH结构域和/或VL结构域的方法。
另一方面，本发明还提供了载体和宿主细胞，其包含编码本文所述的抗AXL抗体或抗原结合部分的重链或其抗原结合部分、轻链或其抗原结合部分或两者的核苷酸序列。一些实施方案中，本发明通过培养所述宿主细胞来生产本文所述的抗AXL抗体或VH克斌结构域或VL可变结构域或其组合的方法，以及通过混合本文所述的Axl拮抗抗体或抗原结合部分来生产抗体组合物的方法。
生产方法可包括分离和/或纯化产物的步骤。
生产方法可包括将产物配制成包括至少一种另外的组分，如药学上可接受的赋形剂的组合物。
一些实施方案中，本文所述的生产Axl拮抗抗体或抗原结合片段或抗体组合物的方法包括使根据本发明所述的抗体库和所述抗原接触，并且选择该库中能够结合所述抗原的一个或多个抗体成员。
该库可展示在噬菌体颗粒的表面，每个颗粒含有编码展示在其表面的抗VH结构域，和任选展示的VL结构域(若存在)的核酸。
选择能够结合抗原并且展示在噬菌体颗粒上的抗体之后，可从展示所述选定抗体的噬菌体颗粒取得核酸。通过由具有取自展示所述选定抗体的噬菌体颗粒的核酸的序列的核酸表达，此类核酸可用于抗体或抗体VH可变结构域(或任选地抗体VL可变结构域)的后续生产。
具有所述选定抗体的抗体VH可变结构域的氨基酸序列的抗体VH可变结构域可呈分离形式提供，正如包含此类VH结构域的抗体可能的那样。
本发明的抗体可结合鼠、大鼠、猴、非人灵长类和/或人Axl。在一些实施方案中该抗体特异性结合灵长类Axl。例如，该抗体可特异性结合人和猴Axl。在一个实施方案中，该抗体仅特异性结合人Axl。
该抗体可为嵌合、人源化或CDR移植抗Axl抗体。例如，该抗体可为嵌合人/小鼠抗体。
可在适当条件下比较不同抗体的结合亲和力和中和效力。
除抗体序列以外，根据本发明所述的抗体可包含其它氨基酸，例如形成肽或多肽，如折叠结构域，或赋予分子除结合抗原的能力以外的其它功能特征。
本发明的抗体可携带可检测标记，或可与毒素(如细胞毒素)、酶或有机部分缀合(例如经由肽键或接头)。
另一方面，本发明提供一种抗体偶联药物，其中，所述的抗体偶联药物含有：(a)前述任一项所述的抗体或抗原结合片段，其任选地经由肽键或接头与效应分子缀合；
(b)与所述抗体或其抗原结合片段偶联的效应分子，所述效应分子选自可检测标记、毒蛋白、化疗药物、小分子药物、核素，或其组合本领域的技术人员将知道许多将分子与蛋白质化学缀合的方法
一个实施方案中，抗体可与可检测、荧光标记，例如异硫氰酸荧光素(FITC)，或与报告酶如辣根过氧化物酶(HRP)缀合。
在优选的实施方案中，抗体与细胞毒性药物缀合，形成抗体-药物缀合物(ADC)。
当抗体供制药用时，连接抗体和药物的键优选在循环(例如，血液循环)中稳定，但偶联物一旦被隔绝在细胞内就不稳定。因此，偶联为免疫偶联物的抗体可用于治疗(例如)癌症的方法中。
另一方面，本发明提供了一种前述任一项的抗体或其抗原结合片段或其变体，其用作药物。
一实施方式中，前述任一项的抗体或其抗原结合片段或其变体，其用于治作为疗癌症、肿瘤、免疫病症、心血管病症、血栓形成、或糖尿病的药物。
一实施方式中，前述任一项的抗体或其抗原结合片段或其变体，其用于作为抑制细胞增殖、促进Axl下调、抑制转移、或抑制血管发生的药物。
另一方面，本发明提供了前述任一项的Axl拮抗抗体在制备治疗与AXL过高表达相关的药物中的用途。
一实施方式中，其中所述用途为该前述任一项的抗体或其抗原结合片段或其变体用于治疗与AXL过高表达相关的癌症、免疫病症、心血管病症、血栓形成、或糖尿病的用途。
一实施方式中，优选地，其中所述用途为该前述任一项的抗体或其抗原结合片段或其变体药用于抑制细胞增殖、抑制血管发生、促进Axl下调、和/或抑制转移的用途。
另一方面，本发明提供了一种采用前述的抗体在制备用于治疗或诊断人或动物身体的装置中的应用，例如治疗(可包括预防性治疗)人患者中的疾病或病症的方法中，该方法包括向所述患者施用有效量的本发明的抗体或其缀合物或药物缀合物。可根据本发明治疗的疾患包括本文别处所讨论的那些。
另一方面，本发明提供了一种治疗具有癌症的个体的药盒套装，其包含根据本发明前述方面所述的抗体、抗原结合片段或变体，前述的抗体药物偶联物、或前述的药物组合物，进一步包括对该个体施用的其它的治疗剂，可选的，还包括阐明使用方案的说明书。
其中该其它的治疗剂选自下组：VEGF拮抗剂，EGFR拮抗剂和化疗剂。
一实施方式中，本发明提供了一种治疗具有免疫病症、心血管病症、血栓形成或糖尿病的个体的药盒套装，包括可以有效量对该个体施用的前述任一项的抗体或抗原结合片段或其变体，或偶联物，或药物配制剂，还包括包装插页。
另一方面，本发明提供了一种在个体中抑制血管发生、抑制细胞增殖、促进Axl受体下调或抑制转移的药盒套装，包括可以有效量对该个体施用的前述任一项的抗体，或前述的偶联物，或药物配制剂，还包括包装插页。
在一些实施例中，所述肿瘤或癌症是Axl介导的相关肿瘤或癌症；
在一些实施例中，所述肿瘤或癌症是与Axl过表达相关的肿瘤；
优选的，，所述肿瘤选自乳腺癌、中枢神经***癌、子宫内膜癌、肾癌、大肠癌、肺癌、食道癌、舌癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、胃癌、间皮瘤、黑色素瘤、纤维肉瘤、膀胱癌、直肠癌、淋巴瘤、***、头颈癌、上呼吸消化道癌、结直肠癌、尿路癌或结肠癌；更优选地，每种癌症独立地选自腺癌、鳞状细胞癌、混合腺鳞癌、未分化癌；更优选地，所述卵巢癌包括高级别卵巢严重腺癌、卵巢粘液性囊腺癌或恶性卵巢布伦纳瘤；肾癌包括透明细胞肾细胞癌；舌癌包括舌鳞状细胞癌；肺癌包括肺腺癌、肺腺鳞癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、肺***状腺癌或非小细胞肺癌；胰腺癌包括胰腺腺癌或胰腺导管腺癌；食管癌包括食管鳞状细胞癌；间皮瘤包括双相间皮瘤；中枢神经***癌症包括神经胶质瘤、胶质母细胞瘤或多形性胶质母细胞瘤；胃癌包括胃腺癌；乳腺癌包括导管乳腺癌、乳腺癌或HR+乳腺癌；膀胱癌包括膀胱鳞状细胞癌；黑素瘤包括恶性黑素瘤；结肠癌包括结肠腺癌；头颈癌包括头颈小鳞状细胞癌。
另一方面，本发明提供了一种检测鉴别和AXL过高表达相关的疾病的个体的的测试套装，其包含用于测定AXL与本发明的抗体或其抗原片段或其变体，的结合水平的一种或多种试剂，还包括包装插页。
根据本发明所述的抗体可用于成像方法中，例如以确定与抗体结合的细胞的存在或位置。
附图说明
图1鼠源单克隆抗体结合活性检测
A鼠源单克隆抗体18G7与hAXL(或AXL阳性细胞)的ELISA(左图)&FACS(右图)--剂量依赖性结合曲线。横坐标表示抗体浓度(对数值)，纵坐标表示结合信号强度。B鼠源单克隆抗体8A3与hAXL(或AXL阳性细胞)的ELISA(左图)&FACS(右图)--剂量依赖性结合曲线。横坐标表示抗体浓度(对数值)，纵坐标表示结合信号强度。
图2鼠源单克隆抗体阻断活性检测
A ELISA(左图)&FACS(右图)检测发现，鼠源单克隆抗体18G7剂量依赖性阻断GAS6与AXL(或AXL阳性细胞)的结合。横坐标表示抗体浓度(对数值)，纵坐标表示GAS6与AXL的结合信号强度。B ELISA(左图)&FACS(右图)检测发现，鼠源单克隆抗体8A3剂量依赖性阻断GAS6与AXL(或AXL阳性细胞)的结合。横坐标表示抗体浓度(对数值)，纵坐标表示GAS6与AXL的结合信号强度。
图3嵌合单克隆抗体结合活性检测
A嵌合抗体18G7-CHI与AXL(或AXL阳性细胞)的ELISA(左图)&FACS(右图)--剂量依赖性结合曲线。横坐标表示抗体浓度(对数值)，纵坐标表示结合信号强度。B嵌合抗体8A3-CHI与AXL(或AXL阳性细胞)的ELISA(左图)&FACS(右图)--剂量依赖性结合曲线。横坐标表示抗体浓度(对数值)，纵坐标表示结合信号强度。
图4嵌合单克隆抗体阻断活性检测
A ELISA(左图)&FACS(右图)检测发现，嵌合抗体18G7-CHI剂量依赖性阻断GAS6与AXL(或AXL阳性细胞)的结合。横坐标表示抗体浓度(对数值)，纵坐标表示GAS6与AXL的结合信号强度。B ELISA(左图)&FACS(右图)检测发现，嵌合抗体18G7-CHI剂量依赖性阻断GAS6与AXL(或AXL阳性细胞)的结合。横坐标表示抗体浓度(对数值)，纵坐标表示GAS6与AXL的结合信号强度。
图5嵌合抗体18G7-CHI、8A3-CHI与涂覆有rhAxl的传感器芯片CM5相互作用的Biacore分析。示出了减去空白表面信号后的曲线。右下方表格示出了亲和力常数。
图6嵌合抗体引起的细胞内化水平检测
A梯度浓度嵌合抗体18G7-CHI处理后，FACS检测靶蛋白AXL内化水平的变化。4℃条件下细胞不发生内吞，用作为阴性对照。B梯度浓度嵌合抗体8A3-CHI处理后，FACS检测靶蛋白AXL内化水平的变化。4℃条件下细胞不发生内吞，用作为阴性对照。
图7嵌合抗体引起的细胞膜上的蛋白水平检测
A梯度浓度嵌合抗体18G7-CHI、10G5-hlgG1、lgG1(对照组)处理4小时后，FACS检测AXL在细胞膜上的蛋白水平。B梯度浓度嵌合抗体8A3-CHI、10G5-hlgG1、lgG1(对照组)处理4小时后，FACS检测AXL在细胞膜上的蛋白水平。
图8采用免疫印迹的方法检测嵌合抗体18G7-CHI、8A3-CHI处理细胞24小时后，全细胞AXL总蛋白水平的变化。抗GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为负载对照。
图9嵌合抗体18G7-CHI,8A3-CHI阻断配体诱导的Axl下游的信号传导。665nm波长的吸光度代表anti-AKT-Pser473的信号强度，615nm波长的吸光度代表anti-AKT的信号强度(作为参照)，665/615代表AKT磷酸化的相对水平。每个给药浓度平行设2个副孔，取标准误(SEM),*P<0.05,**P<0.01。
图10嵌合抗体18G7-CHI,8A3-CHI抑制A549和U251肿瘤细胞增殖。CCK8试剂盒检测细胞增殖水平，每个抗体样品平行设2个副孔，取标准误(SEM)。
图11嵌合抗体18G7-CHI,8A3-CHI抑制A549细胞迁移，A加入的抗体浓度为1μg/mL；B加入的抗体浓度为10μg/mL。箭头长度代表细胞迁移距离，折线图的每个时间点分析统计了9个样本数值，取标准误(SEM)。
图12嵌合抗体18G7-CHI,8A3-CHI抑制A549细胞侵袭。黑色区域代表侵袭过来的细胞。
图13梯度浓度嵌合抗体18G7-CHI-AF,8A3-CHI-AF(脱岩藻糖基)介导的PBMC细胞毒性(ADCC)对应曲线图。效应细胞：靶细胞＝40:1，每个给药浓度点平行设置了2个副孔，取标准误(SEM)。
图14嵌合抗体8A3-CHI对A549异种移植肿瘤生长的抑制。以4mg/kg、12mg/kg腹腔内给药抗体，每周两次，从平均肿瘤大小达到100mm3开始给药。显示了用载体(无菌PBS)或嵌合抗体处理组的肿瘤生长曲线。误差条表示平均标准误差(SEM)。使用双因素ANOVA分析进行统计学分析。****P<0.0001。
图15人源化抗体与hAXL(或AXL阳性细胞)的ELISA(左图)&FACS(右图)—剂量依赖性结合曲线。横坐标表示抗体浓度(对数值)，纵坐标表示结合信号强度。
图16人源化抗体剂量依赖性阻断GAS6与AXL(或AXL阳性细胞)的结合曲线，左图为ELISA水平，右图为FACS水平。横坐标表示抗体浓度(对数值)，纵坐标表示GAS6与AXL的结合信号强度。
图17人源化抗体与涂覆有rhAxl的传感器芯片CM5相互作用的Biacore分析。示出了减去空白表面信号后的曲线。
图18人源化抗体阻断配体诱导的Axl下游的信号传导。665nm波长的吸光度代表anti-AKT-Pser473的信号强度，615nm波长的吸光度代表anti-AKT的信号强度(作为参照)，665/615代表AKT磷酸化的相对水平。每个给药浓度平行设2个副孔，取标准误(SEM)。
图19梯度浓度人源化抗体435、441处理4小时后，FACS检测靶蛋白AXL内化水平。4℃条件下细胞不发生内吞，用作为阴性对照。
图20梯度浓度人源化抗体435，441，10G5，lgG1(对照组)处理4小时后，FACS检测AXL在细胞膜上的蛋白水平。
图21采用免疫印迹的方法检测人源化抗体435,441处理细胞24小时后，全细胞AXL总蛋白水平的变化。抗GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为负载对照。
图22人源化抗体435、441剂量依赖性抑制U251肿瘤细胞增殖。CCK8试剂盒检测细胞增殖水平，每个抗体样品平行设2个副孔，取标准误(SEM)。
图23人源化抗体435、441促进细胞凋亡。使用Annexin V-FITC/7-AAD ApoptosisDetection Kit染色凋亡细胞，FACS检测人源化抗体435、441,10G5-hlgG1，lgG1处理U251细胞3天后的细胞凋亡情况。通过细胞凋亡的四分象限图显示出的活细胞比例，证明人源化抗体435、441促进了细胞凋亡。
图24人源化抗体431、441抑制肿瘤细胞迁移。划线法检测细胞迁移水平，培养条件为1％血清的培养基，抗体浓度为2μg/mL。分析样本数为9，误差条表示平均标准误差(SEM)，使用双因素ANOVA分析进行统计学分析，**P<0.01,****P<0.0001。
图25人源化抗体431、441抑制肿瘤细胞侵袭。细胞侵袭的实验条件为：抗体浓度为5μg/mL，处理时间24小时，显微镜物镜为10X，黑色区域代表侵袭过来的细胞。
图26抗体18G7-CHI(嵌合抗体)、435(18G7人源化抗体)与鼠源-AXL的剂量依赖性结合曲线。横坐标表示抗体浓度(对数值)，纵坐标表示结合信号强度。
图27抗体18G7-CHI(嵌合抗体)、435(18G7人源化抗体)与食蟹猴-AXL的剂量依赖性结合曲线。横坐标表示抗体浓度(对数值)，纵坐标表示结合信号强度。
具体实施方式
除非另作说明，否则下列的每一个术语应当具有下文所述的含义。除非本文中另外说明，否则可变区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interes，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991中所述的EU编号体系。
定义
除非另有说明外，本文使用的术语“一个”(“a”)、“一个”(“an”)、“该”(“the”)和类似的术语被解释为涵盖单数和复数。同时应当注意的是，术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。
“约”或“大约”指相关技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。在一些实施方案中，本文中提到的“约”或“大约”指所描述的数值以及其±10％、±5％、±1％或±0.1％的范围。
“包括”或“包含”指抗体或抗原结合片段包括所列举的元素(如抗体或抗原结合片段中的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、重链和轻链等)，但不排除含有其它元素。举例来说，当本发明的抗体或其结合片段被描述为包含VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3时，指的是，本发明的抗体或其结合片段可以仅包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，也可以包含除VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3外的其余未提及的元素。
同时，当“包括”或“包含”一词在本文中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。此外，本领域技术人员清楚多肽N端由起始密码子编码的甲硫氨酸在某些实际情况下(例如在特定表达***表达时)会被保留，但不实质影响多肽的功能。因此，本申请说明书和权利要求书中在描述具体的多肽氨基酸序列时，尽管其可能不包含N端由起始密码子编码的甲硫氨酸，然而此时也涵盖包含该甲硫氨酸的序列，相应地，其编码核苷酸序列也可以包含起始密码子：反之亦然。
术语“和/或”涵盖由该术语连接的项目的所有组合，应视作各个组合已经单独的在本文列出。例如，“A和/或B”涵盖了“A”、“A和B”以及“B”。例如，“A、B和/或C”涵盖“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”、“A、B和C”。
术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的氨基酸单体组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也意在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得，它可能以包括化学合成的任何方式产生。
除非另有说明，本文所用的术语“异源多肽”定义为不是宿主细胞的天然多肽，其中已修饰改变了天然序列的天然蛋白质或其表达由于用重组DNA技术操纵宿主细胞定量改变的天然蛋白质。
“氨基酸”是指既含氨基又含羧基的有机化合物，比如α-氨基酸，其可直接或以前体的形式由核酸编码。单个氨基酸由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码。每一个氨基酸由至少一个密码子编码。相同氨基酸由不同密码子编码称为“遗传密码的简并性”。氨基酸包括天然氨基酸和非天然氨基酸。天然氨基酸包括丙氨酸(三字母代码：Ala，一字母代码：A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氦酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷气酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氦酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Ph，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氦酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氦酸(Val，V)。
“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸残基被另一个含有化学性质(例如电荷或疏水性)相似的侧链(R基团)的氨基酸残基所取代。一般而言，保守氨基酸取代不大会在实质上改变蛋白质的功能性质。含有化学性质相似侧链的氨基酸类别的实例包括：1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸。
本发明中关于细胞、核酸、多肽、抗体等所使用的术语“分离的”，例如“分离的”DNA、RNA、多肽、抗体是指分别于细胞天然环境中的其它组分如DNA或RNA中的一种或多种所分离的分子。本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或细胞培养基的核酸或肽，或化学合成时的化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。分离的多肽、抗体等通常通过至少一个纯化步骤制备。在一些实施方案中，分离的核酸、多肽、抗体等的纯度至少为约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点)或其中任何值。
术语“重组”涉及多肽或多聚核苷酸，意指天然不存在的多肽或多聚核苷酸的形式，不受限制的实施例可以通过组合产生通常并不存在的多聚核苷酸或多肽。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目组成的一个函数。
术语有“至少80％～至少100％同源性”意指至少有80％同源性、至少有85％同源性、至少有90％同源性、至少有95％同源性、至少有96％同源性、至少有97％同源性、至少有98％同源性、至少有99％同源性、至少有100％同源性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点但不包括100％)的其中任何值。
术语“至少80～至少100％同源性”包括至少85％同源性～至少95％同源性、“至少90％同源性～至少92％同源性”
本文中的“至少80％序列同一性”为约80％序列同一性、约81％序列同一性、约82％序列同一性、约83％序列同一性、约84％序列同一性、约85％序列同一性、约86％序列同一性、约87％序列同一性、约88％序列同一性、约89％序列同一性、约90％序列同一性、约91％序列同一性、约92％序列同一性、约93％序列同一性、约94％序列同一性、约95％序列同一性、约96％序列同一性、约97％序列同一性、约98％序列同一性、约99％序列同一性，约100％序列同一性、或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括终点但不包括100％)的其中任何值。
本文中的“至少有80％同源性”为约80％同源性、约81％同源性、约82％同源性、约83％同源性、约84％同源性、约85％同源性、约86％同源性、约87％同源性、约88％同源性、约89％同源性、约90％同源性、约91％同源性、约92％同源性、约93％同源性、约94％同源性、约95％同源性、约96％同源性、约97％同源性、约98％同源性、约99％同源性、约100％同源性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括范围终点的值)的其中任何值；“至少有85％同源性”为约85％同源性、约86％同源性、约87％同源性、约88％同源性、约89％同源性、约90％同源性、约91％同源性、约92％同源性、约93％同源性、约94％同源性、约95％同源性、约96％同源性、约97％同源性、约98％同源性、约99％同源性、约100％同源性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括范围终点的值)的其中任何值；“至少有90％同源性”为约90％同源性、约91％同源性、约92％同源性、约93％同源性、约94％同源性、约95％同源性、约96％同源性、约97％同源性、约98％同源性、约99％同源性、约100％同源性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括范围终点的值)的其中任何值；“至少有95％同源性”为约95％同源性、约96％同源性、约97％同源性、约98％同源性、约99％同源性、约100％同源性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括范围终点的值)的其中任何值；“至少有97％同源性”为约97％同源性、约98％同源性、约99％同源性、约100％同源性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括范围终点的值)的其中任何值；“至少有98％同源性”为约98％同源性、约99％同源性、约100％同源性，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括范围终点的值)的其中任何值；“至少有99％同源性”为约99％同源性、约100％同源性，或这两个值之间的范围(包括范围终点的值)的其中任何值。
除非另有说明，本文所用的术语“抗原”是一个部分或分子，其包含与抗体或抗原结合片段特异性结合的表位。正如，抗原与抗体特异性结合。在一个具体的实施方案中，本文所述的抗体结合的抗原是Axl(例如，人AxI)或其片段，例如，Axl的细胞外结构域(例如人Axl的胞外结构域)。
“表位”或“结合部位”是抗原上抗原结合肽(例如抗体)特异地结合的范围或区域。抗原表位可以是线性表位或构象、非线性或不连续的表位。例如，表位可以是多肽的连续氨基酸(“线性”表位)，或者表位可以包含来自多肽的两个或更多个非连续区域的氨基酸(一个“构象”，“非线性”或“不连续”表位)。本领域技术人员将理解，一般而言，线性表位可能依赖或可能不依赖于二级、三级或四级结构。例如，在一些实施方案中，抗体与一组氨基酸结合，无论它们是否折叠成天然的三维蛋白质结构。在其他实施方案中，抗体需要构成表位的氨基酸残基表现出特定构象(例如弯曲、扭曲、转折或折叠)以便识别和结合表位，并且抗原表位可以含有直接参与结合的氨基酸残基(也称作表位的优势免疫成分)和其他氨基酸残基，其不直接参与结合，例如由特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基(换句话说，氨基酸残基是在特异性抗原结合肽的“足迹”内)。根据本发明，在本文术语表位包括Axl的任意特殊区域中两种类型的氨基酸结合部位，该部位特异地结合抗Axl抗体，或另外的Axl特异性物质，除非另作说明(例如，在本发明的一些上下文中涉及直接结合特殊氨基酸残基的抗体)。Axl可以含有许多不同的表位，其可以包括，不限于，(1)线型肽抗原决定簇，(2)在成熟Axl构象中，由一个或多个位置互相接近非毗连氨基酸组成的构象抗原决定簇；和(3)翻译后抗原决定簇，其存于共价连接到Axl的在全部或部分分子结构中，例如碳水化合物基团。
本文的特异性识别和结合抗原的蛋白质包括但不限于完整的抗体、任何抗原结合片段、或单链(例如scFv)。
除非另有说明，术语“抗体”是指特异性识别和结合抗原的免疫球蛋白分子，其由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成。轻链和重链都分成结构和功能同源性的区域。功能性的区域包含但不限于“可变区”和“恒定区”。术语“可变区”和“恒定区”就功能而言，应理解为，轻链和重链的可变区决定了抗原识别和特异性，轻链和重链的恒定区赋予重要的生物学性质，可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括但不限于分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)还可以被细分为具有搞变性的区域(成为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的成为框架区(FR)的区域。各重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)由下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧酸末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。
除非另有说明，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”包括适体、镜像异构体和双价抗体，还包括通过与特定抗原结合形成复合物起抗体作用的任何合成或基因工程蛋白质。术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被成为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版,Raven Press,N.Y.(1989))，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的“抗原结合片段”、“抗体片段”、或“抗原结合部分”。在一些情况下，“抗原结合片段”、“抗体片段”、或“抗原结合部分”包括Fab片段、Fab’片段、F(ab)2片段、F(ab’)2片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、互补决定区(CDR)片段及单链抗体(例如，scFv)，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。其中，除非另有说明，术语“Fab片段”指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab)2片段”具有通过二硫键连接在一起的两个Fab片段；术语“F(ab’)2片段”指包含通过铰链区上的二硫键连接的两个Fab片段的抗体片段；术语“Fab’片段”可以通过处理F(ab’)2片段得到，通过还原二硫键以产生Fab’片段；术语“Fd片段”指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”指由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人，Nature 341:544-546(1989))；1989))。
除非另有说明，术语“单链可变片段”、“单链抗体”或“scFv”是指含有免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白。在一些方面，这些区域与10个至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接VH的N端和VL的C端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区和引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。
本发明公开的抗体、抗体片段、或抗原结合片段，及抗体、抗体片段、或抗原结合片段的变体或衍生物，包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、嵌合、人源化、全人源、单链、灵长类化抗体，表位结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fvs、单链可变片段、单链Fvs(scFv)、二硫键连接的Fvs(sdFv))，包含VL或VH结构域的片段，由Fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗Id)抗体。
除非另有说明，本领城技术人员将会理解，重链的类别包括gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)或epsilon(ε)，也包括所述类别的亚类(例如Y1-Y4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgA、IgD、IgG、IgM或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5)已被充分表征并且赋予的特异性功能也已知。所有的免疫球蛋白种类都在本文公开的保护范围内。在一些实施方案中，免疫球蛋白分子为IgG种类。IgG种类通常包含分子量约23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽和分子量约为53,000-70,000的两条相同的重链多肽。这四条链通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链从“Y”的口开始并延续通过可变区包围重链。
除非另有说明，本领城技术人员将会理解，轻链可以分为kappa(κ)或lambda(λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤，B细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉状末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。免疫球蛋白κ轻链可变区为Vκ；免疫球蛋白λ轻链可变区为Vλ。
除非另有说明，本文所用的术语“恒定区”或“恒定结构域”是本领域熟知的抗体术语(有时称之为“Fc”)，是指抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基终端部分不直接参与抗体与抗原的结合，但可以表现出各种效应子功能，例如与Fc受体的相互作用。该术语是指免疫球蛋白分子的一部分，其具有相对于免疫球蛋白可变结构域通常更保守的氨基酸序列。
除非另有说明，本文所用的术语“重链恒定区”包括CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域，或变体或片段中的至少一种。抗体的重链恒定区可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包括源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一实施方案中，重链恒定区可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG3分子的铰链区。在另一实施方案中，部分重链可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG4分子的嵌合铰链区。
除非另有说明，本文所用的术语“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的一部分氨基酸序列。较佳地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。“轻链-重链对”是指可通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。
抗体的“可变域”或”可变区”是指抗体的轻链或重链的一部分，用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性，在不同的抗体之前可变域在序列上广泛地不同，其一般位于轻链或重链的氨基末端，重链中可变区的长度约110到130个氨基酸，轻链中可变区的长度约90到110个氨基酸。可变区包括互补决定区(CDR)及位于互补决定区(CDR)两侧的框架区(FR)。序列中的变异性集中在CDR中，可变域中较少变化的部分称为框架区(FR)。通常，在N-终端到C-终端的方向上，CDRs和FRs的空间排列方向如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。其中，CDR1、CDR2和CDR3也称为高变区。轻链的CDRs和重链的CDRs主要负责抗体与抗原的相互作用和抗体对表位的特异性。在某些实施方案中，可变区是人可变区。除非另有说明，本文的抗体的可变区是指单独的抗体轻链的可变区、单独的抗体重链的可变区、或抗体轻链的可变区与抗体重链的可变区组合。每条链中的CDR由FR紧密靠近地保持在一起，并且与来自其他链的CDR一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成。
术语“CDR”(互补决定区)，也称为“高变区”，是指在序列上高度可变和/或形成结构限定的环的抗体可变区的每个区域。其允许抗体选择性识别并特异性结合抗原上的表位。更具体地说，抗原结合位点由重链可变区(VH)中的3个CDR(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)链中的3个CDR(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)决定，或由VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3中的1、2、3、4或5个CDR决定。其中，“VHCDR1”为重链第一互补决定区、“VHCDR2”为重链第二互补决定区、“VHCDR3”为重链第三互补决定区；“VLCDR1”为轻链第一互补决定区、“VLCDR2”为轻链第二互补决定区、“VLCDR3”为轻链第三互补决定区。重链可变区(VH)中位于互补决定区(CDR)两侧的框架区(FR)包含重链第一框架区(VHFR1)、重链第二框架区(VHFR2)、重链第三框架区(VHFR3)、重链第四框架区(VHFR4)。轻链可变区(VL)中位于互补决定区(CDR)两侧的框架区(FR)包含轻链第一框架区(VLFR1)、轻链第二框架区(VLFR2)、轻链第三框架区(VLFR3)、轻链第四框架区(VLFR4)。
在天然存在的抗体中，每个抗原结合域中存在的六个“互补决定区”或“CDR”是短的、不连续的氨基酸序列，它们被特异性定位以在抗体在水性环境中呈现其三维构型时形成抗原结合域。抗原结合域中的其余氨基酸(称为“框架”区)显示较少的分子间变异性。框架区主要采用β折叠构型，CDR形成环，这些环连接β折叠结构并且在某些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区起到形成支架的作用，该支架通过链间、非共价相互作用将CDR定位在正确的方向上。由定位的CDR形成的抗原结合域定义了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员可以容易地鉴定分别包含CDR和框架区的氨基酸，因为它们已经被精确定义(参见“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”Kabat,E.,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,(1983)；以及Chothia and Lesk,J.MoI.Biol.,196:901-917(1987))。
同一抗体的可变区的CDR的边界，根据不同的编号***，可能有所差异。因此，在涉及用本发明编号***的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体：其可变区序列包含本发明的CDR序列，但是由于应用了不同的编号***而导致其所声称的CDR边界与本发明的具体CDR边界不同。本文中抗体的CDR可以根据以下编号***决定：(a)kabat编号***(Kabat et al.(1971)Ann.NY Acad.Sci.190:382-391 and,Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest FifthEditionU.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No：91-3242)；(b)Chothia编码***(Chothia and Lesk，1987，J.Mol.Biol.，196:901-917；Al-Lazikani et al.，1997，J.Mol.Biol.，273:927-948；Chothia etal，1992，J.Mol.Biol，227:799-817；TramontanoAetal1990，J.Mol.Biol.215(1)：175-82；U.S.Patent No.7.709,226：and Martin,A.Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody VariableDomainsin Amibody EngineeringKontermann and Dubeleds.，Chapter31，pp.422-439，Springer-Verlag,Berlin(2001))；(c)ImMunoGeneTics(IMGT)编号***，Lefranc,M.-P.，1999，The Immunologist，7:132-136and Lefranc,M.-P.et al.，1999，Nucleic AcidsRes.，27:209-212("IMGT CDRs)；(d)AbM编号***(describedinMacCallumetal.，1996，J.Mol.Biol.，262:732-745.Seealso.eg,Martin,A.，“Protein Sequence and StructureAnalysis ofAntibody Variable Domains in Antibody Engineering,KontermannandDubel.eds.，Chapter 31，pp.422-439，Springer-VerlagBerlin(2001))；(e)Contact编号***(MacCallum et al.，(1996)J Mol Biol 5:732-745))。根据Kabat、Chothia、IMGT、AbM、Contact编号***决定的CDR包括相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集，尽管如此，应用任一编号***来指代抗体或其变体的CDR都在本发明范围内。包含特定CDR的确切残基编号将根据CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员通常可以根据抗体的可变区氨基酸序列确定出CDR包含哪些特定的残基。
除非上下文另外指明或与之矛盾，氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Ehrenmann,F.,Kaas,Q.and Lefranc,M.-P.(IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a database and a tool for immunoglobulins or antibodies,T cellreceptors,MHC,IgSF and MhcSF)Nucl.Acids Res.,38(S1):D301-D307(2010).Epub2009Nov 9；DOI:10.1093/nar/gkp946.PMID:19900967.LIGM:361的原则，也参见因特网http地址https://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi。
除非另有说明，本文所用的术语“VH”、“重链可变区(VH)”、或“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域。“CH1”或“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个恒定区。“CH2”或“CH2结构域”不与其它结构域紧密配对，而是在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间***两个N-连接的分支碳水化合物链。“CH3”或“CH3结构域”从CH2结构域开始延伸到IgG分子的C-末端，大约包含108个残基。本文所用的术语“VL”、“轻链可变区(VL)”、或“VL结构域”包括免疫球蛋白轻链的氨基末端可变结构域。“CL”或“CL结构域”包括免疫球蛋白轻链的恒定区。“铰链区”包括连接CH1结构域和CH2结构域的部分重链区域。所述铰链区包含约25个残基并且是有韧性的，从而使得两个N端抗原结合区能够独立移动。铰链区可以被细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(Rouxetal.,J.Immunol 161:4083(1998))。“二硫键”指两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸的硫醇基团可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥接。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接。
除非另有说明，本文所用的术语“单克隆抗体”是本领域技术人员众所周知的术语，是指从同源或基本上同源的抗体群体中获得的抗体。术语“单克隆”不限于用于制备抗体的任何特定方法。通常，单克隆抗体群体可以由细胞,细胞群或细胞系产生。在一些具体实施方案中,如本文所用的“单克隆抗体”是由单细胞(例如，产生重组抗体的杂交瘤或宿主细胞)产生的抗体，其中该抗体特异性结合Axl表位(例如人Axl的胞外结构域)，通过例如ELISA、本领域已知的测试方法、或本发明实施例提供的其他抗原结合或竞争性结合测定法测得。在一些特定实施方案中，单克隆抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体是单价抗体或多价(例如，二价)抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体是单价抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体是多价(例如，二价)抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体是单特异性或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。
除非另有说明，本文所用的术语“多克隆抗体”是指包括多种不同抗体的抗体群,所述抗体特异性结合一个或多个抗原内的相同和/或不同表位。
本文使用的术语“嵌合抗体”是指抗体，其中可变区来源于非人物种(例如来源于啮齿动物)和恒定区来源于不同的物种，例如人。嵌合抗体可通过抗体工程产生。“抗体工程”是用于不同类型的抗体修饰的通用术语，和其是技术人员众所周知的方法。具体而言，嵌合抗体可通过使用描述于的标准DNA技术产生。因此，嵌合抗体可以是经遗传学工程改造的重组抗体。一些嵌合抗体可以是遗传学或酶学两者工程改造的。产生嵌合抗体在技术人员的知识内，因此产生本发明的嵌合抗体可通过本文所述的方法之外的其它方法实现。开发用于治疗应用的嵌合单克隆抗体以减少抗体免疫原性。它们可通常包含对目的抗原具有特异性的非人(例如鼠)可变区，和人恒定抗体重链和轻链结构域。在嵌合抗体的背景下使用的术语“可变区”或“可变结构域”是指包含免疫球蛋白的重链和轻链两者的CDR和框架区的区。
除非另有说明，本文所用的术语“人源化抗体”是指经遗传学工程改造的非人抗体，其包含人抗体恒定结构域和经修饰以包含高水平的与人可变结构域的序列同源性的非人可变结构域。这可通过移植一起形成抗原结合位点的六个非人抗体互补决定区(CDR)到同源的人受体框架区(FR)上实现。为了完全重建母体抗体的结合亲和力和特异性，可能需要置换母体抗体(即非人抗体)的框架残基到人框架区中(回复突变)。结构同源性建模可有助于鉴定框架区中对抗体的结合性质重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可包含非人CDR序列、任选地包含一个或多个突变至非人氨基酸序列的氨基酸回复突变的基本上的人框架区和完全的人恒定区。任选地，可应用不必然是回复突变的另外的氨基酸修饰以获得具有优选特征(例如亲和力和生物化学性质)的人源化抗体。
除非另有说明，本文所用的术语“全人源抗体”通常是指将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达的抗体。抗体所有部分(包括抗体的可变区和恒定区)均由人类来源的基因所编码。全人源抗体可以大大减少异源抗体对人体造成的免疫副反应。本领域获得全人源抗体的方法可以有噬菌体展示技术、转基因小鼠技术、核糖体展示技术和RNA-多肽技术等。
本文的任一实施方案中的人源化或嵌合抗体可称为“人源化或嵌合Axl抗体”、“本发明的人源化或嵌合抗体”、“Axl抗体”、“AXL抗体”、“抗-Axl抗体”、“本文的Axl抗体”、或“本发明的Axl抗体”，其全部具有相同的含义和目的，除非上下文另外矛盾。
多聚核苷酸或多聚核苷酸序列(或多肽或抗体序列)与另一序列有具有一定百分比(例如80％、85％、90％、95％、98％或者99％)的“同一性、序列同一性、同源性或序列同源性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。可以使用目测或本领域已知的软件程序来确定该比对和同一性百分比或序列同一性，比如Ausubel etal.eds.(2007)在Current Protocols in Molecular Biology中所述的软件程序。优选使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的BLAST，例如BLASTN和BLASTP，两者使用下列默认参数：Geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sortby＝HIGHSCORE；Databases＝non-redundant；GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDStranslations+SwissProtein+SPupdate+PIR。生物学上等同的多聚核苷酸是具有上述指定百分比的同一性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多聚核苷酸。
多聚核苷酸是由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)，或当多聚核苷酸是RNA时胸腺嘧啶换为尿嘧啶(U)。“多聚核苷酸序列”可以以多聚核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。
除非另有说明，本文所用的术语“多聚核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多聚核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是不受限制的多聚核苷酸的实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多聚核苷酸、分支的多聚核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多聚核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在该修饰，则对核苷酸的结构修饰可以在组装多聚核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多聚核苷酸，例如通过与标记组分缀合。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本发明公开的任何多聚核苷酸的实施例包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。
除非另有说明，本文所用的术语“编码”应用于多聚核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多聚核苷酸，在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，经转录和/或翻译可以产生该多肽和/或其片段。
除非另有说明，本文所用的术语“分离的”多聚核苷酸或核酸分子是从核酸分子的自然来源(如小鼠或人)中存在的其他核酸分子中分离出来的。此外，一个“分离”的核酸分子，如cDNA分子，可以基本上不含其他细胞材料，或通过重组技术生产培养基，或化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。例如，“基本上不含”包括多核苷酸或核酸分子的制备物，其含量少于其他物质(如细胞)的约15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(特别是少于约10％)
除非另有说明，本文所用的术语"结合”是指抗体与预定抗原或靶标的结合，当在BIAcore3000仪器上通过例如表面等离子体共振(SPR)技术使用抗原作为配体和抗体作为分析物测定时，与它们的结合通常具有对应于约10-6M或更小、例如10-7M或更小、例如约10- 8M或更小、例如约10-9M或更小、约10-10M或更小或约10-11M或甚至更小的KD的亲和力，和以对应于比其结合并非预定抗原或密切相关抗原的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力低至少10倍、例如低至少100倍、例如低至少1,000倍、例如低至少10,000倍、例如低至少100,000倍的KD的亲和力结合预定抗原。亲和力更低的程度取决于抗体的KD，以致当抗体的KD极低时(即，抗体是高度特异的)，则抗原的亲和力低于非特异性抗原的亲和力的程度可以是至少10,000倍。
除非另有说明，本文所用的术语“特异性结合”或“对……具有特异性”通常是指抗体或抗原结合片段与特定抗原通过其抗原结合结构域与表位互补性结合形成相对稳定的复合物。“特异性”可以用抗体或抗原结合片段与特定抗原或表位结合的相对亲和力表达。例如，如果抗体“A”比抗体“B”与同一抗原的相对亲和力大，可以认为抗体“A”比抗体“B”对该抗原具有更高的特异性。特异性结合可以用平衡解离常数(KD)来描述，较小的KD意味着较紧密的结合。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域内众所周知的，并包括例如平衡透析、表面等离子共振、生物膜层光学干涉测量法等。“特异性结合”抗原a的抗体包括与抗原a平衡解离常数KD小于或等于约100nM、小于或等于约10nM、小于或等于约5nM、小于或等于约1nM或小于或等于约0.5nM的抗体。
除非另有说明，本文所用的术语“阻断”是指抗体或其抗原结合片段抑制两个分子间结合(例如人Axl和配体Gsa6)的能力。在某些实施方式中，阻断两个分子间结合的抗体或抗原结合片段可将两个分子间结合的相互作用抑制至少150％或至少180％。
除非另有说明，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。“KD”通过表面等离子体共振术(SPR)测定的。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物结合和解离的速率。术语“kd”、“kdis”或“koff”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。术语“ka”或“kon”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率常数。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kd、kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数KD(参见Davies等人,Annual Rev Biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量KD、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用生物膜干涉技术(BLI)或表面等离子体共振术(SPR)来测量解离常数。
除非另有说明，术语“IC50”即半数抑制浓度(half maximal inhibitoryconcentration),是指某一种物质对某些生物程序抑制达到50％抑制效果时的浓度。
除非另有说明，术语“EC50”即半数有效浓度(concentration for 50％ofmaximal effect,EC50)是指能引起50％最大效应的浓度。
除非另有说明，术语“效应功能”指归因于免疫球蛋白Fc区的那些生物学活性。免疫球蛋白效应功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、Fc受体结合作用、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。
在本申请中，术语“ADCC”是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)，通常是指是指具有杀伤活性的细胞通过其表面表达的Fc受体(FcR)识别包被于靶抗原上的Fc段。借助所述ADCC，免疫***的效应细胞主动溶解其膜表面抗原已被特异性抗体结合的靶细胞。
在本申请中，术语“CDC”是补体依赖型细胞毒性(complementdependentcytotoxicity，CDC)，通常是指补体参与的细胞毒作用。即通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原结合，形成复合物而激活补体经典途径，所形成的攻膜复合物对靶细胞发挥裂解效应。
在本申请中，术语“ADCP”即抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis)，其是指，吞噬细胞(例如单核-巨噬细胞、中性粒细胞)，通过其表面表达的Fc受体(FcR)识别特异性结合于靶细胞(例如病毒感染的细胞和肿瘤细胞)表面抗原的抗体的Fc片段，直接吞噬靶细胞(例如病毒感染的细胞和肿瘤细胞)。
除非另有说明，术语“糖基化”是指，将糖基转移至蛋白质，并与蛋白质上的氨基酸残基(例如天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸；此类氨基酸残基亦被称为糖基化位点)形成糖苷键的过程。糖基化通常在糖基转移酶的催化下进行，其是一种重要的蛋白质翻译后修饰，使蛋白转变为糖蛋白，并影响/改变蛋白的功能。
除非另有说明，术语“Axl介导的信号转导”意指通过Axl与第二信使分子的直接或间接相互作用触发的第二信使途径的激活。
除非另有说明，术语“Axl磷酸化”是指氨基酸残基，优选酪氨酸残基被第二Axl蛋白(转磷酸作用)或被另一种具有蛋白质激酶活性的蛋白质磷酸化。
除非另有说明，术语“细胞增殖”是指引起人细胞特别地但不限于人癌细胞的增殖的所有牵涉Axl的过程。它们促成或导致细胞DNA的复制、复制的DA至两个同等大小的染色体组的分离以及整个细胞的物理***(称为胞质***)，并且受Axl的非催化或催化活性(优选包括Axl磷酸化和/或Axl介导的信号转导)刺激或介导。
除非另有说明，术语“转移”是指支持癌细胞从原发性肿瘤扩散，渗入***和/或血管、通过血流循环，并且在身体的其他部位的正常组织中的远距离病灶(转移灶)中生长的所有牵涉Axl的过程。特别地，其是指引起转移并且由Axl的非催化或催化活性(优选包括Axl磷酸化和/或Axl介导的信号转导)刺激或介导的肿瘤细胞的细胞事件例如增殖、迁移、锚定不依赖性、细胞凋亡的逃脱或血管生成因子的分泌。
除非另有说明，促进肿瘤细胞的凋亡是指阻止人细胞，优选但不限于人癌细胞程序化细胞死亡(细胞调亡)的所有牵涉Axl的过程。特别地，其指使人细胞，优选但不限于人癌细胞免受因生长因子的撤离、缺氧、对化疗剂或辐射的暴露或Fas/Apo-1受体介导的信号转导的起始而透导的细胞调亡，并且受Axl的非催化或催化活性(优选包括Axl磷酸化和/或Axl介导的信号转导)刺激或介导的过程。
除非另有说明，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
除非另有说明，术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。
除非另有说明，术语“抗体药物偶联物”或“ADC”是指与一个或多个化学药物(其可以任选地是治疗剂或细胞毒性剂)化学连接的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，ADC包括抗体、细胞毒性或治疗药物和使得药物能够与抗体连接或偶联的接头。ADC通常具有与抗体偶联的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个数的药物。可以包括在ADC中的药物有但不限于：有丝***抑制剂、抗肿瘤抗生素、免疫调节剂、基因治疗的载体、烷化剂、抗血管生成剂、抗代谢物、含硼试剂、化疗保护剂、激素、抗激素剂、皮质类固醇、光活性治疗剂、寡核苷酸、放射性核素试剂、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和放射致敏剂。在一些实施方案中，包括在ADC中的药物可以是类美登素药物。在一些实施方案中，包括在ADC中的药物可以是如本申请所述的如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在ADC中，抗体通过自身半胱氨酸或疏基化的氨基酸如疏基化赖氨酸，形成二硫键，与药物偶联。
除非另有说明，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防、减缓、改善或停止不良的生理改变或紊乱，例如疾病的进程，包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善、缓和、减轻或消失(无论是部分还是全部)、延长与不接受治疗时预期的生存期限等。需要治疗的患者包括已经患有病症或紊乱的患者，容易患有病症或紊乱的患者，或者需要预防该病症或紊乱的患者，可以或预期从施用本发明公开的抗体或药物组合物用于检测、诊断过程和/或治疗中受益的患者。
除非另有说明，术语“患者”指需要诊断、预防、预后或治疗的任何哺乳动物，包括人类、狗、猫、兔子、鼠、马、牛等。
除非另有说明，术语“给予”或“施用”是指将物质(例如，本文提供的人源化抗-Axl抗体或其抗原结合片段)注射或以其他方式物理递送至受试者或患者(例如，人)，例如通过粘膜、局部、皮内、肠胃外、静脉内、肌肉内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。
如本文所用,术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以降低和/或改善给定的状况、障碍或疾病和/或与之相关的症状的严重程度和/或持续时间的疗法(例如，本文提供的抗体或药物组合物)的量。这些术语还涵盖减少、减缓或改善给定疾病的进展；减少、减缓或改善给定疾病的复发或发作；和/或改善或增强预防或治疗效果。在一些实施方案中，本文所用的“有效量”还指本文所述的抗体达到特定结果的量。
术语“药学上可接受的辅料”是指适用于递送药物，在制剂中使用的任何非活性物质。包括但不限于填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、增溶剂、包衣材料、赋形剂、表面活性剂、抗氧剂、防腐剂、盐、氨基酸等。
可以按常规方法根据本文所述抗体氨基酸序列设计合成编码抗体的DNA，将其置入表达载体中，然后转染宿主细胞，在培养基中培养被转染的宿主细胞产生单克隆抗体。在一些实施方案中，表达抗体载体包括至少一个启动子元件，抗体编码序列，转录终止信号和polyA尾。其他元件包括增强子，Kozak序列及***序列两侧RNA剪接的供体和受***点。可以通过SV40的前期和后期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复序列如RSV、HTLV1、HIVI及巨细胞病毒的早期启动子来获得高效的转录，也可应用其它一些细胞的启动子如肌动蛋白启动子。合适的表达载体可包括pHR、pIRES1neo，pRetro-Off，pRetro-On，PLXSN，或者Plncx，pcDNA3.1(+/-)，pcDNA/Zeo(+/-)，pcDNA3.1/Hygro(+/-)，PSVL，PMSG，pRSVcat，pSV2dhfr，pBC12MI和pCS2等。常使用的哺乳动物细胞包括293细胞，Cos1细胞，Cos7细胞，CV1细胞，鼠L细胞和CHO细胞等。
详细说明
Axl是TAM家族(包括Tyro-3、Axl和MerTK)的受体酪氨酸激酶，在一些具体实施方式中，Axl是人Axl。天然Axl包含一个由两个纤连蛋白3型样重复序列和两个免疫球蛋白样重复序列组成的胞外结构域，以及一个胞内酪氨酸激酶结构域。在本申请中，所述AXL蛋白可以为人AXL蛋白(AAH32229.1)；也可以为食蟹猴AXL蛋白(Genbank登录号HB387229.1)。所述AXL蛋白可以包括AXL蛋白的变体。例如，所述变体可以为：1)在所述AXL蛋白的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽；和2)与所述AXL蛋白具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
特异性活性概述
在一方面，本发明提供一种Axl拮抗抗体或抗原结合片段，其特异性结合人Axl。例如人Axl的细胞外结构域(ECD)并调节Axl表达和/或Axl活性。
在一些实施方案中，本发明公开的抗体或抗原结合片段可以结合人Axl的细胞外结构域的一个或多个结构域。在某些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段可以结合人Axl胞外结构域的一个或多个表位。作为非限制性实施例，在一些实施方案中，本文公开的抗体或抗原结合片段可结合人Axl胞外结构域的Ig-like结构域。
本文的特异性结合Axl(例如人Axl)的抗体或抗原结合片段(例如嵌合抗体或其抗原结合片段，或人源化抗体或其抗原结合片段)表现出如下一种或多种特性：(1)与人Axl胞外结构域的Ig-like结构域结合；(2)以0.01nM～0.5nM的亲和常数KD(平衡解离常数)与人Axl结合，优选地，以0.01nM～0.3nM的亲和常数KD(平衡解离常数)与人Axl结合；更优选地，以0.03nM～0.2nM的亲和常数KD(平衡解离常数)与人Axl结合；本文中亲和常数KD(平衡解离常数)经表面等离子体共振技术测得；(3)在ELISA与人Axl结合的EC50值为0.0001μg/mL～0.1μg/mL，优选地，为0.0001μg/mL～0.01μg/mL，更优选地，为0.0001μg/mL～0.005μg/mL，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测得；在FACS与人Axl结合的EC50值为0.001μg/mL～1μg/mL，优选地，为0.001μg/mL～0.5μg/mL，更优选地，为0.005μg/mL～0.3μg/mL，采用流式细胞荧光分析技术(FACS)测得；(4)抑制Gas6与Axl的结合(例如人Axl)，抑制率为50％以上，优选地为70％以上，更优选地为80％以上，进一步优选地，为90％以上；采用酶联免疫吸附实验(ELISA)或流式细胞荧光分选技术(FACS)测得；(5)结合人Axl并阻断、抑制或减少Gas6的Axl配体诱导AKT的磷酸化(例如，在U251胶质瘤细胞系中)程度为100％～200％，为120％～190％，更优选地，为150％～180％；所述磷酸化实验通过AKT信号通路检测试剂盒(THUNDERTM Phospho-AKT pan(S473)TR-FRET Cell Signaling Assay Kit，Bioauxilium)测定；(6)与不和抗体接触的其它经过相同处理的样品相比，增加Axl受体内化的速率为1～15倍，优选地，为5～15倍，更优选地，为9～15倍，进一步优选地，增为7～12倍，采用流式细胞仪测得；(7)使总蛋白下调程度与不和抗体接触的其他经过相同处理的样品相比至少降低20％～80％，优选地，至少降低40％～80％，更优选地，至少降低60％～80％；采用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)测得；(8)使Axl受体膜蛋白下调程度与不和抗体接触的其他经过相同处理的样品相比至少降低10％～90％，优选地，降低20％～80％，更优选地，降低40％～60％；采用流式细胞荧光分析技术(FACS)测得；(9)促进非神经胶质瘤中肿瘤细胞的凋亡，其中，肿瘤细胞的凋亡率和不与抗体接触外其它经过相同处理的样品相比提高了1～7倍，优选地，提高了2～6倍，更优选地，提高了3～5倍，进一步优选地，提高了4～5倍；所述细胞凋亡率通过细胞活力测定法(例如，Annexin V-FITC/7-AAD Apoptosis DetectionKit)测得；和/或(10)抑制肿瘤细胞的增殖，抑制肿瘤的迁移和侵袭水平，肿瘤抑制率为20～100％，优选地，为30～90％，更优选地，为40～80％。
在本申请中，所述Axl拮抗抗体或抗原结合片段的竞争性结合的能力可以通过测定所述抗体、其抗原结合片段或变体的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数来衡量。检测所述解离平衡常数的方法可以选自以下组：酶联免疫吸附法、表面等离振子共振(SRP)法、电位滴定法、分光光度法、细管电泳法、荧光法和薄层色谱pH法。例如，所述抗体、其抗原结合片段或变体可以经SRP法(例如，使用生物大分子相互作用仪)检测。
抗原结合分子、抗体或抗原结合片段可变区
本发明的抗体或抗原结合片段可以是例如抗体18G7-CHI、18G7-2或、抗体18G7-3、抗体18G7-4、抗体18G7-5、抗体18G7-6、抗体18G7-7、抗体18G7-8、抗体18G7-434、抗体18G7-435、抗体18G7-436、抗体8A3-CHI、抗体8A3-427、抗体8A3-438、抗体8A3-440、抗体8A3-428、抗体8A3-439、或抗体8A3-441，或此系列抗体的抗原结合片段。本发明的抗体或抗原结合片 段包含表1中的CDRs。本发明的抗体或抗原结合片段包含表2中的重链可变区(VH)和/或轻 链可变区(VL)。本发明的抗体或抗原结合片段包含表3中的框架区(FRs)。
CDRs、FRs和可变区
在一些实施方案中，本发明的CDRs根据ImmunoGeneTics(IMGT)编号***(例如,Lefranc,M.-P.,1999,The Immunologist,7:132-136；Lefranc,M.-P.等,1999,NucleicAcids Res.,27:209-212(“IMGT CDR”)；或DOI:10.1093/nar/gkp946.PMID:19900967.LIGM:361)进行编号。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合人Axl的抗体或其抗原结合片段包含通过IMGT编号***确定的抗体18G7-CHI、抗体18G7-2、抗体18G7-3、抗体18G7-4、抗体18G7-5、抗体18G7-6、抗体18G7-7、抗体18G7-8、抗体18G7-434、抗体18G7-435、抗体18G7-436、抗体8A3-CHI、抗体8A3-427、抗体8A3-438、抗体8A3-440、抗体8A3-428、抗体8A3-439、抗体8A3-441、抗体Abcom1、和抗体Abcom2的CDRs和FRs。
在一些实施方案中，本文提供的特异性结合人Axl的抗体或其抗原结合片段，其包含如表1和表2所示的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的互补决定区(CDRs)，其使用标准的单字母氨基酸缩写。
表1. 18G7-CHI及其人源化AXL拮抗抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的CDRs氨基酸序列(IMGT)
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表2.重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的CDRs氨基酸序列(IMGT)
一方面，本发明提供了一种特异性结合人Axl的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段包含特异性结合AXL的可变区，所述可变区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，所述轻链可变区(VL)包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中，所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3包含选自(i)、(ii)和(iii)中的一项或多项：(i)选自SEQ ID NO:1、2或3任一项所示的VH CDR1，(ii)选自SEQ IDNO:4、5或6任一项所示的VH CDR2，和(iii)选自SEQ ID NO:7或8任一项所示VH CDR3；所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含选自(iv)、(v)和(vi)中的一项或多项：(iv)SEQ ID NO:9或10所示的VL CDR1，(v)选自SEQ ID NO:11或12任一项所示的VL CDR2和(vi)选自SEQ ID NO:13或14任一项所示VL CDR3。
一方面，本发明提供一种Axl拮抗抗体或抗原结合片段，其包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中，所述重链可变区(VH)包含VHFR1、VHFR2、VHFR3、VHFR4；所述轻链可变区(VL)包含VLFR1、VLFR2、VLFR3、VLFR4；其中，所述VHFR1分别包含如SEQ ID NO:15、16和17、36和37、144和151任一项所示的氨基酸序列、所述VHFR2分别包含SEQ ID NO:18、19和20、38、39和40、145和152任一项所示的氨基酸序列、所述VHFR3分别包含SEQ ID NO:21、22、23、24和25、41、42和43、146和153任一项所示的氨基酸序列，所述VHFR4分别包含SEQ IDNO:26或27、147所示的氨基酸序列；和所述VLFR1分别包含如SEQ ID NO:28、29、44和45、148和154任一项所示的氨基酸序列、VLFR2分别包含SEQ ID NO:30、31和32、38、39和40、149和155任一项所示的氨基酸序列、VLFR3、VLFR4、、SEQ ID NO:33、34、48、50和51、150或156任一项所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
一方面，本发明提供一种Axl拮抗抗体或抗原结合片段，其包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中，所述重链可变区(VH)包含如SEQ ID NO：52-60中任一项所示的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含如SEQ ID NO：61-66中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述抗体或抗原结合片段可以是例如本文给与命名的抗体18G7-CHI或其抗原结合片段，抗体18G7-2或其抗原结合片段，抗体18G7-3或其抗原结合片段，抗体18G7-4或其抗原结合片段，抗体18G7-5或其抗原结合片段，抗体18G7-6或其抗原结合片段，抗体18G7-7或其抗原结合片段，抗体18G7-8或其抗原结合片段，抗体18G7-434或其抗原结合片段，抗体18G7-435或其抗原结合片段，抗体18G7-436或其抗原结合片段，抗体8A3-CHI或其抗原结合片段，抗体8A3-427或其抗原结合片段，抗体8A3-438或其抗原结合片段，抗体8A3-440或其抗原结合片段，抗体8A3-428或其抗原结合片段，抗体8A3-439或其抗原结合片段，或抗体8A3-441或其抗原结合片段。一些示例性实施例中，本发明所述抗体或抗原结合片段可以是上述抗体或抗原结合片段的变体。
在一些示例性实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段包含表1和表2中的CDRs。在一些示例性实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段包含表3和表4中的框架区(FRs)。在一些示例性实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段包含表5中的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。
在某些实施方式中，本文提供的特异性结合人Axl的抗体或其抗原结合片段，其包含如表3所示18G7-CHI及其人源化抗体的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的框架区(FRs)或表4所示的鼠源嵌合抗体8A3-CHI及其人源化抗体的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的框架区(FRs)，其使用标准的单字母氨基酸缩写。
对于本领域技术人员而言，应当清楚的是，本文所述的抗体或抗原结合片段的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)中的CDRs和FRs应按照FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序排列。
表3.重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的FRs氨基酸序列(IMGT)
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/>
表4.重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的FRs氨基酸序列(IMGT)
/>
CDRs
在一些实施方式中，本文所述的Axl拮抗抗体或抗原结合片段，包含如表5所示的VH。在一些实施方式中，本文所述的特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含如表5所示的VL。
在一些实施方式中，所述AXL是人AXL。
在一些实施方案中，本文所述抗体或抗原结合片段中，所述VH(如表5所示)和所述VL(如表5所示)包含表1、表2的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3和VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3中的1个、2个、3个、4个、5个或6个CDR的氨基酸序列。
在一些特定实施方案中，本文所述抗体或抗原结合片段进一步包含抗体18G7-CHI的VHCDR1、VHCDR2、和/或VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)。在一些具体实施方式中，所述抗体或抗原结合片段进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些特定实施方案中，本文所述抗体或抗原结合片段包含抗体18G7-CHI的VLCDR1、VLCDR2和/或VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)。在一些具体实施方式中，所述抗体或抗原结合片段进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-CHI的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，以及18G7-CHI的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7和SEQ ID NO:9、11和13所示)。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-CHI的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，以及18G7-CHI的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表3的SEQ ID NO:15、18和21和26所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含18G7-CHI的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)，以及18G7-CHI的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表3的SEQID NO:28、30和33和35所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-2的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR33(分别如表1的SEQ ID NO:2、4和7所示)。在一些具体实施方式中，所述抗体或抗原结合片段进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-2的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)。在一些具体实施方式中，所述抗体或抗原结合片段进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-2的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3和的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，分别如表1的SEQ ID NO:2、4和7和SEQ ID NO:9、11和13所示)所示。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-2的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:2、4和7所示)，以及18G7-2的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表3的SEQ ID NO:16、19和22和27所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含18G7-2的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQID NO:9、11和12所示)，以及18G7-2的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表3的SEQ IDNO:29、31和34和35所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-3的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:2、4和7所示)，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)(如SEQ ID NO:62所示)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-3的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)，进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)(SEQ ID NO:54)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-3所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3和所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别如表1的SEQ ID NO:2、4和7和SEQ ID NO:9、11和13所示。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-3的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:2、4和7所示)，以及18G7-3的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表3的SEQ ID NO:16、20和23和27所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含18G7-3的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQID NO:9、11和13所示)，以及18G7-3的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表3的SEQ IDNO:29、31和34和35所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-4的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-4的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)，进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-4的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，以及18G7-4的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7和SEQ ID NO:9、11和13所示。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-4的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，并进一步包含18G7-4的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表3的SEQ ID NO:16、20和24和27所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含18G7-4的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)，并进一步包含18G7-4的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表3的SEQ ID NO:29、31和34和35所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-5的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-5的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)，进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-5的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，，以及18G7-5的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-5的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，以及18G7-5的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表3的SEQ ID NO:17、20和25和27所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含18G7-5的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQID NO:9、11和13所示)，，以及18G7-5的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表3的SEQ IDNO:29、31和34和27所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-6的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:2、4和7所示)，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-6的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)，进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-6的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:2、4和7所示)，以及18G7-6的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-6的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:2、4和7所示)，，以及18G7-6的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表3的SEQ ID NO:16、19、22和27所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含18G7-6的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQID NO:9、11和13所示)，以及18G7-6的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表3的SEQ IDNO:29、32、34和35所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-7的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:2、4和7所示)，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-7的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)，进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-7的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:2、4和7所示)，以及18G7-7的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-7的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:2、4和7所示)，以及18G7-7的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表3的SEQ ID NO:16、20、23和27所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含18G7-7的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQID NO:9、11和13所示)，以及18G7-7的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表3的SEQ IDNO:29、32、34和35所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-8的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-8的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)，进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-8的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，以及VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-8的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，以及18G7-8的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表3的SEQ ID NO:16、20、24和27所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含18G7-8的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQID NO:9、11和13所示)，以及18G7-8的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表3的SEQ IDNO:29、32、34和35所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-435的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-435的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)，进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-435的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，以及18G7-435的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-435的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，，以及18G7-435的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表3的SEQ ID NO:17、20、25和27所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含18G7-435的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)，以及18G7-435的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表3的SEQID NO:29、32、34和35所示)。在
一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-436的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-436的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)，进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-436的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，以及18G7-436的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-436的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，以及18G7-436的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表3的SEQ ID NO:15、18、21和26所示)。在一些具体实施方式中，所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3如表1所示，且所述VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4如表3所示。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含18G7-436的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)，以及18G7-436的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表3的SEQ ID NO:29、32、34和35所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-434的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含18G7-434的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)，进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-434的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，以及18G7-434的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含18G7-434的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:1、5和7所示)，以及18G7-434的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表3的SEQ ID NO:17、20、25和27所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含18G7-434的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)，以及18G7-434的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表3的SEQID NO:28、30、33和35所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含8A3-CHI的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含8A3-CHI的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)，进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含8A3-CHI的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，以及8A3-CHI的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含8A3-CHI的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，以及8A3-CHI的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表4的SEQ ID NO:36、38、41和26所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含8A3-CHI的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)，以及8A3-CHI的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表4的SEQID NO:44、46、49和35所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含8A3-427的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含8A3-427的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)，进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含8A3-427的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，以及8A3-427的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含8A3-427的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，以及8A3-427的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表4的SEQ ID NO:37、39、42和27所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含8A3-427的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)，以及8A3-427的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表4的SEQID NO:45、47、50和35所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含8A3-438的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含8A3-438的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)，进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含8A3-438的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，以及8A3-438的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含8A3-438的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，以及8A3-438的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表4的SEQ ID NO:37、39、43和27所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含8A3-438的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)，以及8A3-438的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表4的SEQID NO:45、47、50和35所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含8A3-440的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含8A3-440的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)，进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含8A3-440的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，以及8A3-440的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)。在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含8A3-440的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3分别如表2的SEQ IDNO:3、6和8所示)，以及8A3-440的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表4的SEQ ID NO:45、47、50和35所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含8A3-440的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，以及8A3-440的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表4的SEQ IDNO:37、40、43和27所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含8A3-428的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含8A3-428的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含8A3-428的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，，以及8A3-428的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含8A3-428的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，，以及8A3-428的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表4的SEQ ID NO:37、39、42和27所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含8A3-428的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别如表2的SEQID NO:10、12和14所示)，以及8A3-428的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表4的SEQ IDNO:45、48、51和27所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含8A3-439的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含8A3-439的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)，进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含8A3-439的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，以及8A3-439的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含8A3-439的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，以及8A3-439的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表4的SEQ ID NO:37、39、43和27所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含8A3-439的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别如表2的SEQID NO:10、12和14所示)，以及8A3-439的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表4的SEQ IDNO:45、48、51和35所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含8A3-441的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含8A3-441的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)，进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含8A3-441的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，以及8A3-441的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表4的SEQ ID NO:10、12和14所示)。在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含8A3-441的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQID NO:3、6和8所示)，以及8A3-441的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表4的SEQ ID NO:37、40、43和27所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含8A3-441的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)。，以及8A3-441的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表4的SEQ ID NO:45、48、51和35所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含Abcom1的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:142、143和7所示)，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含Abcom1的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)，进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含Abcom1的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:142、143和7所示)，以及Abcom1的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含Abcom1的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:142、143和7所示)，以及Abcom1的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表3的SEQ ID NO：144、145、146和147所示)。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含Abcom1的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表1的SEQ ID NO:9、11和13所示)，以及Abcom1的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表3的SEQID NO：148、149、150和35所示)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含Abcom2的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，进一步包含如表5所示的轻链可变区(VL)。在一些实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段，包含Abcom2的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)，进一步包含如表5所示的重链可变区(VH)。在一些特定实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含Abcom2的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，以及Abcom2的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:10、12和14所示)。
在一些特定的实施方式中，本文所述的抗体或抗原结合片段包含Abcom2的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，以及Abcom2的VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4(分别如表4的SEQ ID NO：151、152、153和147所示)。在一些具体实施方式中，所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3如表2所示，且所述VHFR1、VHFR2、VHFR3和VHFR4如表4所示。在一些特定实施方式中，本文所述抗体或抗原结合片段包含Abcom2的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(分别如表2的SEQ ID NO:3、6和8所示)，以及Abcom2的VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4(分别如表4的SEQ ID NO：154、155、156和35所示)。在一些具体实施方式中，所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3如表2所示，且所述VLFR1、VLFR2、VLFR3和VLFR4如表4所示。
可变区
一方面，本发明提供一种Axl拮抗抗体或抗原结合片段，起包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中，所述重链可变区(VH)包含如SEQ ID NO：52-60中任一项所示的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含如SEQ ID NO：61-66中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明所述抗体或抗原结合片段可以是例如本文给与命名抗体18G7-CHI或其抗原结合片段，抗体18G7-2或其抗原结合片段，抗体18G7-3或其抗原结合片段，抗体18G7-4或其抗原结合片段，抗体18G7-5或其抗原结合片段，抗体18G7-6或其抗原结合片段，抗体18G7-7或其抗原结合片段，抗体18G7-8或其抗原结合片段，抗体18G7-434或其抗原结合片段，抗体18G7-435或其抗原结合片段，抗体18G7-436或其抗原结合片段，抗体8A3-CHI或其抗原结合片段，抗体8A3-427或其抗原结合片段，抗体8A3-438或其抗原结合片段，抗体8A3-440或其抗原结合片段，抗体8A3-428或其抗原结合片段，抗体8A3-439或其抗原结合片段，或抗体8A3-441或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本文提供特异性结合人Axl的一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段包括表5所示的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其使用标准的单字母氨基酸缩写。
表5.重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)
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在一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:52)和VL(SEQ ID NO:61)，其示例性抗体为称为“18G7-CHI”的鼠源抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:52所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:61所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ ID NO:52所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:61所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:53)和VL(SEQ ID NO:62)，其示例性抗体在此称为“18G7-2”的人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:53所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:62所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ IDNO:53所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:62所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:54)和VL(SEQ ID NO:62)，其中，示例性抗体为称为“18G7-3”人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:54所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:62所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ IDNO:54所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:62所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:55)和VL(SEQ ID NO:62)。其中，示例性抗体为称为“18G7-4”的人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:55所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:62所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ IDNO:55所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:62所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:56)和VL(SEQ ID NO:62)，其中，示例性抗体为称为“18G7-5”的人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:56所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:62所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ IDNO:56所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:62所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:53)和VL(SEQ ID NO:63)。其中，示例性抗体为称为“18G7-6”的人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:53所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:63所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ IDNO:53所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:63所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:54)和VL(SEQ ID NO:63)。其中，示例性抗体为称为“18G7-7”。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQID NO:54所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:63所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ ID NO:54所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:63所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:55)和VL(SEQ ID NO:63)。其中，示例性抗体为称为“18G7-8”的人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:55所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:63所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ IDNO:55所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:63所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:56)和VL(SEQ ID NO:63)。其中，示例性抗体为称为“18G7-435”的人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:56所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:63所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ IDNO:56所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:63所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:52)和VL(SEQ ID NO:63)。其中，示例性抗体为称为“18G7-436”的人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:52所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:63所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ IDNO:52所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:63所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:56)和VL(SEQ ID NO:61)。其中，示例性抗体为称为“18G7-434”的人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:56所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:61所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ IDNO:56所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:61所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:57)和VL(SEQ ID NO:64)。示例性抗体为称为“8A3-CHI”的鼠源嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:57所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:64所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ IDNO:57所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:64所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:58)和VL(SEQ ID NO:65)。示例性抗体为称为“8A3-427”的人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:58所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:65所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ ID NO:58所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:65所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:59)和VL(SEQ ID NO:65)。示例性抗体为称为“8A3-438”的人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:59所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:65所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ ID NO:59所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:65所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:60)和VL(SEQ ID NO:65)。示例性抗体为称为“8A3-440”人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:60所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:65所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ ID NO:60所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:65所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:58)和VL(SEQ ID NO:66)。示例性抗体为称为“8A3-428”的人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:58所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:66所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ ID NO:58所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:66所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:59)和VL(SEQ ID NO:66)。示例性抗体为称为“8A3-439”的人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:59所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:66所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ ID NO:59所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:66所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:60)和VL(SEQ ID NO:66)。示例性抗体为称为“8A3-441”的人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:60所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:66所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ ID NO:60所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:66所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:157)和VL(SEQ ID NO:158)。示例性抗体称为“Abcom1”(本领域常规技术技术人员应该知晓，Abcom1抗体在某些实施例中也可以是18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、18G7-436、或18G7-434)。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:157所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:158所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ ID NO:157所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:158所示的VL氨基酸序列。
在另一些特定实施方式中，本文提供了一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，包含VH(SEQ ID NO:159)和VL(SEQ ID NO:160)。示例性抗体称为“Abcom2”(本领域常规技术技术人员应该知晓，Abcom1抗体在某些实施例中也可以是8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、或8A3-441)。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个重链和一个轻链，所述重链包含SEQ ID NO:159所示的VH氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:160所示的VL氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含一个单链，所述单链包含SEQ ID NO:159所示的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:160所示的VL氨基酸序列。
在一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表5所列的18G7-CHI和18G7-436的重链可变区(VH)(SEQID NO:52)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表5所列的18G7-2和18G7-6的重链可变区(VH)(SEQID NO:53)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表5所列的18G7-3和18G7-7的重链可变区(VH)(SEQID NO:54)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表5所列的18G7-4和18G7-8的重链可变区(VH)(SEQID NO:55)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表5所列的18G7-5、18G7-435和18G7-434的重链可变区(VH)(SEQ ID NO:56)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表5所列的8A3-CHI的重链可变区(VH)(SEQ ID NO:57)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表5所列的8A3-427和8A3-428的重链可变区(VH)(SEQ ID NO:58)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表5所列的8A3-438和8A3-439的重链可变区(VH)(SEQ ID NO:59)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表5所列的8A3-440和8A3-441的重链可变区(VH)(SEQ ID NO:60)。
在一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表5所列的18G7-CHI和18G7-434的轻链可变区(VL)(SEQID NO:61所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表5所列的18G7-2、18G7-3、18G7-4、和18G7-5的轻链可变区(VL)(SEQ ID NO:62所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表5所列的18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435和18G7-436的轻链可变区(VL)(SEQ ID NO:63所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表5所列的8A3-CHI的轻链可变区(VL)(SEQ ID NO:64所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表5所列的8A3-427、8A3-438、和8A3-440的轻链可变区(VL)(SEQ ID NO:65所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表5所列的8A3-428、8A3-439、和8A3-441的轻链可变区(VL)(SEQ IDNO:66所示)。
重链和轻链
一方面，本发明提供一种Axl拮抗抗体或抗原结合片段，其包含重链H和轻链L，其中，所述重链H包含SEQ ID NO:67-75任一项所示的氨基酸序列，所述L链包含SEQ ID NO:76-81任一项所示的氨基酸序列，如表6所示。
表6.重链和轻链的氨基酸序列
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在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和/或轻链，所述重链和轻链分别包含如表6中18G7-CHI的SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-CHI的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-CHI的重链可变区(SEQ ID NO：52)。在一些具体实施方案中，所述包含SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-CHI的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-CHI的轻链可变区(SEQ IDNO：61)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含如表6中18G7-2的SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-2的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-2的重链可变区(SEQ ID NO：53)；所述包含SEQID NO：77所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-2的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-2的轻链可变区(SEQ ID NO：62)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链，分别包含如表6中18G7-3的SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：77所示所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-3的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-3的重链可变区(SEQ ID NO：54)；所述包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-3的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-3的轻链可变区(SEQ ID NO：62)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链，分别包含如表6中18G7-4的SEQ ID NO：70和77所示的氨基酸序列在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-4的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-4的重链可变区(SEQ ID NO：55)；所述包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-4的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-4的轻链可变区(SEQ ID NO：62)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链，分别包含如表6中18G7-5的SEQ ID NO：71和77所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-5的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-5的重链可变区(SEQ ID NO：56)；所述包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-5的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-5的轻链可变区(SEQ ID NO：62)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链，分别包含如表6中18G7-6的SEQ ID NO：68和78所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-6的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-6的重链可变区(SEQ ID NO：53)；所述包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-6的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-6的轻链可变区(SEQ ID NO：63)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链分别包含如表6中18G7-7的SEQ ID NO：69和78所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-7的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-7的重链可变区(SEQ ID NO：54)；所述包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-7的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-7的轻链可变区(SEQ ID NO：63)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链，分别包含如表6中18G7-8的SEQ ID NO：70和78所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-8的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-8的重链可变区(SEQ ID NO：55)；所述包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-8的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-8的轻链可变区(SEQ ID NO：63)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链，分别包含如表6中18G7-435的SEQ ID NO：71和78所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-435的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-435的重链可变区(SEQ ID NO：56)；所述包含SEQ IDNO：78所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-435的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-435的轻链可变区(SEQ ID NO：63)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链，分别包含如表6中18G7-436的SEQ ID NO：67和78所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-436的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-436的重链可变区(SEQ ID NO：52)；所述包含SEQ IDNO：78所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-436的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-436的轻链可变区(SEQ ID NO：63)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链，分别包含如表6中18G7-434的SEQ ID NO：71和76所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-434的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-434的重链可变区(SEQ ID NO：56)；所述包含SEQ IDNO：76所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-434的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-434的轻链可变区(SEQ ID NO：61)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链，分别包含如表6中8A3-CHI的SEQ ID NO：72和79所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列的重链含有表2所示的8A3-CHI的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的8A3-CHI的重链可变区(SEQ ID NO：57)；所述包含SEQ IDNO：79所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的8A3-CHI的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的8A3-CHI的轻链可变区(SEQ ID NO：64)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链，分别包含如表6中8A3-427的SEQ ID NO：73和80所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列的重链含有表2所示的8A3-427的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的8A3-427的重链可变区(SEQ ID NO：58)；所述包含SEQ IDNO：80所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的8A3-427的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的8A3-427的轻链可变区(SEQ ID NO：65)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链，分别包含如表6中8A3-438的SEQ ID NO：74和80所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列的重链含有表2所示的8A3-438的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的8A3-438的重链可变区(SEQ ID NO：59)；所述包含SEQ IDNO：80所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的8A3-438的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的8A3-438的轻链可变区(SEQ ID NO：65)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链，分别包含如表6中8A3-440的SEQ ID NO：75和80所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列的重链含有表2所示的8A3-440的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的8A3-440的重链可变区(SEQ ID NO：60)；所述包含SEQ IDNO：80所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的8A3-440的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的8A3-440的轻链可变区(SEQ ID NO：65)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链，分别包含如表6中8A3-428的SEQ ID NO：73和81所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列的重链含有表2所示的8A3-428的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的8A3-428的重链可变区(SEQ ID NO：58)；所述包含SEQ IDNO：81所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的8A3-428的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的8A3-428的轻链可变区(SEQ ID NO：66)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链，分别包含如表6中8A3-439的SEQ ID NO：74和81所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列的重链含有表2所示的8A3-439的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的8A3-439的重链可变区(SEQ ID NO：59)；所述包含SEQ IDNO：81所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的8A3-439的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的8A3-439的轻链可变区(SEQ ID NO：66)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链，分别包含如表6中8A3-441的SEQ ID NO：75和81所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列的重链含有表2所示的8A3-441的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的8A3-441的重链可变区(SEQ ID NO：60)；所述包含SEQ IDNO：81所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的8A3-441的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的8A3-441的轻链可变区(SEQ ID NO：66)。
在在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链，分别包含如表6中Abcom1的SEQ ID NO：161和162所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：161所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的Abcom1的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的Abcom1的重链可变区(SEQ ID NO：157)；所述包含SEQ IDNO：162所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的Abcom1的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的Abcom1的轻链可变区(SEQ ID NO：158)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链和轻链，分别包含如表6中Abcom2的SEQ ID NO：163和164所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：163所示的氨基酸序列的重链含有表2所示的Abcom2的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的Abcom2的重链可变区(SEQ ID NO：159)；所述包含SEQ IDNO：164所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的Abcom2的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的Abcom1的轻链可变区(SEQ ID NO：160)。
在一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表6所列的18G7-CHI和18G7-436的重链(如SEQ ID NO:52所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表6所列的18G7-2和18G7-6的重链(如SEQ ID NO:53所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表6所列的18G7-3和18G7-7的重链(如SEQ ID NO:54所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表6所列的18G7-4和18G7-8的重链(如SEQ ID NO:55所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表6所列的18G7-5、18G7-435和18G7-434的重链(如SEQ ID NO:56所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表6所列的8A3-CHI的重链(如SEQ ID NO:57所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表6所列的8A3-427和8A3-428的重链(如SEQ ID NO:58所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表6所列的8A3-438和8A3-439的重链(如SEQ ID NO:59所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表6所列的8A3-440和8A3-441的重链(如SEQ ID NO:60所示)。
在一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表6所列的18G7-CHI和18G7-434的轻链(如SEQ ID NO:61所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表6所列的18G7-2、18G7-3、18G7-4、和18G7-5的轻链(如SEQ ID NO:62所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表6所列的18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435和18G7-436的轻链(如SEQ ID NO:63所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表6所列的8A3-CHI的轻链(如SEQ ID NO:64所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表6所列的8A3-427、8A3-438、和8A3-440的轻链(如SEQ ID NO:65所示)。在另一个具体实施方式中，本文提供一种特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含如表6所列的8A3-428、8A3-439、和8A3-441的轻链(如SEQ ID NO:66所示)。
本文重链与轻链连接形成抗体或抗原结合片段的方法是本领域公知的。
恒定区
一方面，本发明提供一种特异性结合Axl(例如人Axl)的抗体或抗原结合片段，其包含重链和轻链，所述重链包含本文所述的重链可变区VH以及重链恒定区CH的氨基酸序列，所述轻链包含轻链可变区VL和轻链恒定区CL的氨基酸序列。本文所述抗体或抗原结合片段的轻链可以是κ轻链或λ轻链。
在一些实施方案中，本文所述抗体或抗原结合片段的轻链是κ轻链。在另一些实施方案中，本文所述抗体的轻链是λ轻链。在又一些具体实施方案中，本文所述抗体的轻链是人κ轻链或人λ轻链。
在一些具体实施方案中，本文所述的特异性结合Axl(例如，人Axl)的抗体或抗原结合片段包含轻链，其中轻链可变区(VL)的氨基酸序列包含本文所述SEQ ID NO：61、SEQID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、和SEQ ID NO：66所示的任一氨基酸序列，其中轻链恒定区包含人λ轻链恒定区的氨基酸序列。在另一些具体实施方案中，本文所述的特异性结合Axl(例如，人Axl)的抗体或抗原结合片段包含轻链，其中轻链可变区(VL)的氨基酸序列包含本文所述的SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ IDNO：64、SEQ ID NO：65、和SEQ ID NO：66所示的任一氨基酸序列，其中轻链恒定区包含人κ轻链恒定区的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，本文所述的特异性结合Axl(例如人Axl)的抗体或抗原结合片段包含重链，其中重链可变区(VH)的氨基酸序列包含本文所述的SEQID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、或SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、和SEQ ID NO：60所示的任一氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述抗体或抗原结合片段的重链可以是gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)或epsilon(ε)重链。在一些具体实施方案中，所述抗体的重链可以包含人gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)或epsilon(ε)重链。
在一些实施方案中，本发明所述特异性结合AXL(例如人AXL)的抗体包含重链和轻链，其中，所述重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)，所述轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。
一具体实施方式中所述重链恒定区包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子任一项的恒定区的氨基酸序列。一具体实施方式中所述重链恒定区包含人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子任一项的恒定区的氨基酸序列。一具体实施方式中，所述重链恒定区包含(IgG2a或IgG2b)免疫球蛋白分子任一亚型的恒定区的氨基酸序列。在一些具体实施方式中，本文所述的特异性结合Axl多肽(例如人Axl)的抗体或抗原结合片段，其重链恒定区CH包含人IgG1(例如，同种型a、z或f)、人IgG2或人IgG4恒定区的氨基酸序列。
恒定区可以介导多种效应功能。例如补体的C1部分与IgG或IgM抗体的Fc区(与抗原结合)的结合激活了补体***。补体的激活在细胞病原体的调理作用和裂解中发挥重要作用。补体的激活也会刺激炎症反应，也可能参与自身免疫超敏反应。另外，抗体的Fc区可以结合表达Fc受体(FcR)的细胞。有许多Fc受体对不同类别的抗体具有特异性，包括IgG(gamma受体)、IgE(epsilon受体)、IgA(alpha受体)、和IgM(mu受体)。抗体与细胞表面Fc受体的结合触发许多重要且多样的生物学反应，包括抗体包被颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包被的靶细胞的裂解(称为抗体依赖性细胞毒性或ADCC)、炎症介质的释放和免疫球蛋白产生的控制。
在一些实施方案中，本文所述的Axl抗体或其抗原结合片段能够引发效应子功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些具体实施方案中，本文所述的Axl抗体或其抗原结合片段能够引发ADCC。在一些实施方案中，恒定区不具有效应功能或具有减弱的效应功能。例如，在一些实施方案中，本文所述的Axl抗体或其抗原结合片段可包含Fc区，其中Fc区的一部分已经缺失或以其他方式改变以提供所需的生化特征，例如，与含有未改变Fc区域的免疫原性大致相同的融合蛋白相比，增加在炎症组织中的定位、增加组织穿透、缩短血清半衰期或增加血清半衰期。在一些实施方案中，本文所述的Axl抗体或抗原结合片段包括与一个或多个Fc受体(FcRs)结合亲和力改变的Fc区域。在一些具体实施方案中，本文所述的Axl抗体或其抗原结合片段包含能够结合一种或多种Fc受体(FcR)的野生型Fc区。
嵌合、人源化和CDR移植所得的变体
如本文中所用，“嵌合”抗体或“人源化”抗体或“CDR移植”抗体包括本文所述抗Axl抗体或源自其中的任何CDR与源自非鼠类，优选人抗体的一种或多种蛋白质或肽的任何组合。
嵌合或人源化抗体包括其中CDR源自一种或多种本文所述的抗Axl抗体并且抗体的至少一部分或剩余部分源自一种或多种人抗体的那些抗体。因此，抗体的人部分可包括骨架、CL(例如Cκ或Cλ)、CH结构域(例如CH1、CH2、CH3)、铰链区(其在人中基本上无免疫原性)。
源自人抗体的抗体区域不需要与人抗体具有100％的同一性。在优选实施方案中，为了可以忽略免疫原性而保留尽可能少的小鼠氨基酸残基，但必要时可以保留小鼠残基以支撑由CDR形成的抗原结合位点，而同时使抗体的人源化增加到最大限度。相对于非修饰抗体，此类变化或变型任选且优选地保持或降低在人或其它物种中的免疫原性。
应该注意的是，人源化抗体可由能够表达功能性重排的人免疫球蛋白(例如，重链和/或轻链)基因的非人动物或原核或真核细胞产生。进一步地，当抗体为单链抗体时，其可以包含在天然人抗体中未发现的接头肽。例如，scFv可以包含接头肽，例如二至约二十个甘氨酸或其它氨基酸残基(优选甘氨酸和丝氨酸残基(例如，Gly4Ser或Gly2Ser重复序列))，其连接重链的可变区和轻链的可变区。此类接头肽被认为在人中是无免疫原性的。在一些实施方案中接头长度为至少12个氨基酸。
可以通过，例如合成包含与许多单独人骨架框内融合的非人靶单克隆抗体的全部六个CDR的组合文库来进行抗体人源化。可以利用含有代表所有已知重链和轻链人种系序列的基因的人骨架文库。然后可以筛选所得组合文库以与目标抗原结合。这种方法可允许选择在维持与亲本抗体的结合活性方面，最有利的全人骨架组合。然后可以通过各种技术进一步优化人源化抗体。
全抗体
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体，如18G7-CHI，包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)(包含如表5所示的SEQ IDNO:52)，重链可变区包含18G7-CHI的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)(包含如表5所示的SEQ ID NO:61)，轻链可变区包含18G7-CHI的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体，如18G7-2，包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)包含如表5所示的SEQ ID NO:53)，重链可变区包含18G7-2的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)包含如表5所示的SEQ ID NO:62)，轻链可变区包含18G7-2的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体如18G7-3，包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)包含如表5所示的SEQ ID NO:54)，重链可变区包含18G7-3的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)包含如表5所示的SEQ ID NO:62)，轻链可变区包含18G7-3的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体，如18G7-4包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)包含如表5所示的SEQ ID NO:55)，重链可变区包含18G7-4的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)包含如表5所示的SEQ ID NO:22)，轻链可变区包含18G7-4的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体如18G7-5包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)包含如表5所示的SEQ ID NO:56)，重链可变区包含18G7-5的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)包含如表5所示的SEQ ID NO:62)，轻链可变区包含18G7-5的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体如18G7-6包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)包含如表5所示的SEQ ID NO:53)，重链可变区包含18G7-6的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)包含如表5所示的SEQ ID NO:63)，轻链可变区包含18G7-6的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体如18G7-7包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)包含如表5所示的SEQ ID NO:54)，重链可变区包含18G7-7的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)包含如表5所示的SEQ ID NO:63)，轻链可变区包含18G7-7的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体如18G7-8包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)包含如表5所示的SEQ ID NO:55)，重链可变区包含18G7-8的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)包含如表5所示的SEQ ID NO:63)，轻链可变区包含18G7-8的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体，如18G7-435包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)包含如表5所示的SEQ IDNO:56)，重链可变区包含18G7-435的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)包含如表5所示的SEQ ID NO:63)，轻链可变区包含18G7-435的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体，如18G7-436，包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)包含如表5所示的SEQ IDNO:52)，重链可变区包含18G7-436的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)包含如表5所示的SEQ ID NO:63)，轻链可变区包含18G7-436的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体，如18G7-434，包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)包含如表5所示的SEQ IDNO:56)，重链可变区包含18G7-434的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)包含如表5所示的SEQ ID NO:61)，轻链可变区包含18G7-434的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体，如8A3-CHI，包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)包含如表5所示的SEQ IDNO:57)，重链可变区包含8A3-CHI的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)包含如表5所示的SEQ ID NO:64)，轻链可变区包含8A3-CHI的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体，如8A3-427，包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)(包含如表5所示的SEQ IDNO:58)，重链可变区包含8A3-427的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)包含如表5所示的SEQ ID NO:65)，轻链可变区包含8A3-427的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体，如8A3-438，包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)(包含如表5所示的SEQ IDNO:59)，重链可变区包含8A3-438的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)(包含如表5所示的SEQ ID NO:65)，轻链可变区包含8A3-438的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体，如8A3-440，包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)(包含如表5所示的SEQ IDNO:60)，重链可变区包含8A3-440的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)(包含如表5所示的SEQ ID NO:65)，轻链可变区包含8A3-440的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗，如8A3-428，体包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)(包含如表5所示的SEQ ID NO:58)，重链可变区包含8A3-428的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)(包含如表5所示的SEQ ID NO:66)，轻链可变区包含8A3-428的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体，如8A3-439，包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)(包含如表5所示的SEQ IDNO:59)，重链可变区包含8A3-439的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)(包含如表5所示的SEQ ID NO:66)，轻链可变区包含8A3-439的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体，如8A3-441包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)(包含如表5所示的SEQ IDNO:60)，重链可变区包含8A3-441的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)(包含如表5所示的SEQ ID NO:66)，轻链可变区包含8A3-441的VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体如称为“Abcom1”，Abcom1抗体在某些实施例中也可以是18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、18G7-436、或18G7-434)，包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)(包含如表5所示的SEQ ID NO:157)，重链可变区包含Abcom1的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)(包含如表5所示的SEQID NO:158)，轻链可变区包含Abcom1的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，本文的特异性结合Axl多肽(例如，人Axl)的抗体，如称为为“Abcom2”(本领域常规技术技术人员应该知晓，Abcom1抗体在某些实施例中也可以是8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、或8A3-441)，包含轻链和重链，其中：(a)重链包含重链可变区(VH)(包含如表5所示的SEQ ID NO:159)，重链可变区包含Abcom2的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；(b)轻链包含轻链可变区(VL)(包含如表5所示的SEQID NO:160)，轻链可变区包含Abcom2的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；(c)重链进一步包含重链恒定区，重链恒定区包含人IgG(例如IgG1)恒定区的氨基酸序列；(d)轻链进一步包含轻链恒定区，轻链恒定区包含人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区的氨基酸序列。
抗体或抗原结合片段的变体
一方面，本发明提供前述方面所述抗体或抗原结合蛋白的变体，所述变体：(1)与前述任一方面所述的抗体或抗原结合片段的Axl结合结构域竞争结合Axl；(2)结合与前述人一方面项所述的抗体或抗原结合片段相同的表位；(3)结合与前述任一方面所述的抗体结合的表位重叠的表位。
一实施方式中，所述变体包含一个或多个骨架区和/或一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸序列改变。
1、CDR保守替换、增加、减少氨基酸、肽链延长或缩短产生的变体
其中，所述“与Axl(例如，人Axl的ECD)的免疫特异性结合作用不变”是指，CDRs的氨基酸被替换、增加、减少、CDR的氨基酸序列延长或缩短的抗体或抗原结合片段与Axl的免疫特异性结合作用程度是氨基酸被替换、增加、减少、CDR的氨基酸序列延长或缩短前与Axl的免疫特异性结合作用程度的至少80％、至少90％、至少95％、或100％。
2、通过氨基酸增加、减少、替换、延申或缩短并得到与Axl(例如，人Axl的ECD)的免疫特异性结合作用不变，保留特异性结合AXL能力的CDR、VH或VL，是产生Axl拮抗抗体的变体的重要方式。
在一些实施方案中，与Axl(例如，人Axl的ECD)的免疫特异性结合作用不变的前提下，本文所述抗体或抗原结合片段的VH的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3)和/或VL的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3)中的一个或多个CDRs中的1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸可被替换。
可从VH或VL结构域取得一个或多个CDR并且并入合适骨架中。这在下面有进一步讨论。
一实施方式中，所述变体为VH和VL结构域的变体。其序列并且其可用于抗Axl的抗体中并且可借助于序列改变或突变和筛选的方法获得。
可根据本发明采用本文特别公开其序列的任何VH和VL结构域的可变结构域氨基酸序列变体。特定变体可包括一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或***)，可以为少于约20个改变，少于约15个改变，少于约10个改变或少于约5个改变、4、3、2或1个改变。可在一个或多个骨架区和/或一个或多个CDR中产生改变。
一实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段的变体，其进一步包含：
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加；和
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换；
优选地，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，更优选为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区，进一步优选地，其是人IgG1或人IgG4重链恒定区；
优选地，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。优选地，所述轻链恒定区是人κ轻链恒定区。或优选的，所述轻链恒定区是λ轻链恒定。
一实施方式中，本发明提供一种结合AXL的抗体、抗原结合蛋白、其抗原结合片段的变体，其中所述抗体包括：(i)抗体重链恒定区CH和/或抗体轻链恒定区CL的全部或一部分；(ii)包含重链可变区VH、重链恒定区CH和轻链可变区VL和轻链恒定区CL的全抗体；或(i)包含重链可变区VH、和轻链可变区VL的抗原结合抗体片段，其中，所述VH包含选自SEQID NO:52～60任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:52～60任一项所示的氨基酸序列具有至少80～99％序列同源性的氨基酸序列，所述VL包含选自SEQ ID NO:61～66任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:61～66任一项所示的氨基酸序列具有至少80～99％序列同源性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明所述的抗体的变体可以是任何类型(例如，IgA、IgD、IgG、IgM、IgE或IgY)、任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何亚型(例如，IgG2a或IgG2b)的免疫球蛋白分子。在某些实施方案中，本发明所述的抗体是IgG抗体(例如，人IgG)，或其一类(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或其亚型。
在一些具体实施方方式中，本发明所述的抗体是IgG1抗体(例如，人IgG1)。
在一些具体实施方案中，抗体是单克隆抗体，是包含两个重(H)链/轻(L)链对的4链抗体单元，其中两条重链的氨基酸序列是相同，并且两条轻链的氨基酸序列是相同的。
在一些实施方案中，在与Axl(例如，人Axl的ECD)的免疫特异性结合作用不变的前提下，本文所述抗体或抗原结合片段的VH的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3)和/或VL的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3)中的一个或多个CDRs中的1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸可被替换。
通过移位表1、表2和表5中任一CDR的N端和/或C端氨基酸得到的CDR末端边界与移位前的CDR末端边界相比差一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸。
在一些实施方案中，与Axl(例如，人Axl的ECD)的免疫特异性结合作用不变的前提下，本文所述抗体或抗原结合片段的VH的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3)和/或VL的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3)增加或减少1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸，其中，所述“与Axl(例如，人Axl的ECD)的免疫特异性结合作用不变”是指，氨基酸被增加或减少后的抗体或抗原结合片段的变体与Axl的免疫特异性结合作用程度是氨基酸增加或减少前与Axl的免疫特异性结合作用程度的至少80％、至少90％、至少95％、或100％。
在一些实施方案中，与Axl(例如，人Axl的ECD)的免疫特异性结合作用不变的前提下，本文所述抗体或抗原结合片段的VH的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3)和/或VL的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3)中的一个或多个CDRs可增加1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸。在一些实施方案中，与Axl(例如，人Axl的ECD)的免疫特异性结合作用不变的前提下，本文所述抗体或抗原结合片段的VH的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3)和/或VL的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3)中的一个或多个CDRs可减少1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸。
在一些实施方案中，与Axl(例如，人Axl的ECD)的免疫特异性结合作用不变的前提下，本文所述抗体或抗原结合片段的VH的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3)和/或VL的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3)的氨基末端可延伸1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，与Axl(例如，人Axl的ECD)的免疫特异性结合作用不变的前提下，本文所述抗体或抗原结合片段的VH的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3)和/或VL的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3)的羧基末端延伸1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，与Axl(例如，人Axl的ECD)的免疫特异性结合作用不变的前提下，本文所述抗体或抗原结合片段的VH的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3)和/或VL的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3)的氨基末端缩短1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，与Axl(例如，人Axl的ECD)的免疫特异性结合作用不变的前提下，本文所述抗体或抗原结合片段的VH的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3)和/或VL的CDRs(例如，表1、表2和表5中的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3)的羧基末端缩短1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个氨基酸。本领域已知的方法可用于确定是否与Axl(例如人Axl ECD)的免疫特异性结合作用不变，例如本文提供的“实施例6”中描述的结合测定方法。
对于全长抗体分子而言，可以从杂交瘤细胞系的基因组DNA或mRNA获得免疫球蛋白基因。在哺乳动物载体***中克隆抗体重链和轻链。通过使用本领域已知的方法测序来确认组装。抗体构建体可以在其它人或哺乳动物宿主细胞系中表达。然后可通过瞬时转染测定法和目标表达抗体的蛋白质印迹分析来验证所述构建体。可以使用快速测定法分离和筛选具有最高生产率的稳定细胞系。
编码人源化抗体、片段和区域的恒定区(C)的人基因可通过已知方法源自人胎肝脏文库。人C区基因可源自任何人细胞，包括表达和产生人免疫球蛋白的细胞。人重链恒定区(CH区)可源自任何已知类别或同种型的人重链，包括其γ、μ、α、δ、ε及其亚类，如G1、G2、G3和G4。因为重链同种型负责抗体的各种效应功能，所以CH结构域的选择将由所需效应功能来指导，如补体固定或抗体依赖的细胞毒性(ADCC)中的活性。优选地，CH结构域源自γ1(IgG1)。
人轻链恒定区(CL区)可源自任一人L链同种型，κ或λ，优选κ。
编码人免疫球蛋白C区的基因可通过标准克隆技术从人细胞获得的(Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1989)and Ausubel等人编辑，Current Protocols inMolecularBiology(1987-1993))。人C区基因可容易地从含有代表两类轻链、五类重链及其亚类的基因的已知克隆物获得。
嵌合抗体片段，如Fab和F(ab’)2，可通过设计被适当截短的嵌合重链基因来制备。例如，编码F(ab’)2片段的重链部分的嵌合基因将包括编码重链的CH1结构域和铰链区的DNA序列，其后是翻译终止密码子，以得到截短分子。
工程化或人源化非人或人抗体的制备方法可以使用并且是本领域中公知的。通常，人源化或工程化抗体具有来自于非人来源的一个或多个氨基酸残基，所述来源例如包括但不限于小鼠、大鼠、兔、非人灵长类或其它哺乳动物。这些人氨基酸残基常常被称为“导入”残基，其通常取自已知人序列的“导入”可变、恒定结构域或其它结构域。
重链和轻链可变区的氨基酸序列百分比同源性变体
在一些实施方案中，本发明特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体的变体包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH包含与SEQ ID NO:52-60任一项所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区，和所述VL包含与SEQ ID NO:61-66任一项所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区。
在一些实施方案中，本发明所述的抗体或抗原结合片段变体包含与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区。在一些实施方案中，本发明特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体的变体包含与SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区。在一些实施方案中，本发明所述的抗体或抗原结合片段变体包含与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区。在一些实施方案中，本发明所述的抗体或抗原结合片段变体包含与SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区。在一些实施方案中，本发明所述的抗体或抗原结合片段变体包含与SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区。在一些实施方案中，本发明所述的抗体或抗原结合片段变体包含与SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区。在一些实施方案中，本发明所述的抗体或抗原结合片段变体包含与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区。在一些实施方案中，本发明所述的抗体或抗原结合片段变体包含与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区。在一些实施方案中，本发明所述的抗体或抗原结合片段变体包含与SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区。在一些实施方案中，本发明所述的抗体或抗原结合片段变体包含与SEQ ID NO：157所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区。在一些实施方案中，本发明所述的抗体或抗原结合片段变体包含与SEQ ID NO：159所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区。
在一些实施方案中，本文特所述的抗体或抗原结合片段变体包含与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-CHI的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-2的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-3的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-4的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-5的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-6的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-7的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-8的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-435的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-436的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ IDNO：56所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-434的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-CHI的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-427的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-438的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-440的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-428的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-439的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-441的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ IDNO：157所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体Abcom1的VHCDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：159所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体Abcom2的VHCDRs相同的VHCDRs。
在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-CHI或18G7-436的VH CDRs相同的VH CDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-2或18G7-6的VH CDRs相同的VH CDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-3或18G7-7的VH CDRs相同的VH CDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQID NO：55所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-4或18G7-8的VH CDRs相同的VH CDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-5、18G7-434或18G7-435的VH CDRs相同的VH CDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-CHI的VH CDRs相同的VH CDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-427或8A3-428的VH CDRs相同的VH CDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-438或8A3-439的VH CDRs相同的VHCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-440或8A3-441的VH CDRs相同的VH CDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：157所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体Abcom1的VH CDRs相同的VH CDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：159所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体Abcom2的VH CDRs相同的VH CDRs。
在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：158所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：160所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-CHI的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ IDNO：61所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-434的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-2的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-3的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-4的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-5的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-6的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-7的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-8的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-435的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ IDNO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-436的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-CHI的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-427的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-438的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-440的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-428的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-439的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-441的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ IDNO：158所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体Abcom1的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：160所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体Abcom2的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列至少有至少80％～至少100％同源性同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-CHI或18G7-434的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列至少有至少80％～至少100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-2、18G7-3、18G7-4、或18G7-5的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQID NO：63所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435或18G7-436的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-CHI的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-427、8A3-438或8A3-440的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-428、8A3-439或8A3-441的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：158所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体Abcom1的VLCDRs相同的VLCDRs。在一些实施方案中，本文抗体或抗原结合片段的变体包含与SEQ ID NO：160所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体Abcom2的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些变体实施方案中，本文的特异性结合人Axl的抗体或抗原结合片段包含如本文所述的保守序列修饰。对于抗体或抗原结合片段等多肽，保守序列修饰包含保守氨基酸替换，例如保守序列中的一个氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替换。具有类似侧链的氨基酸残基家族在本技术领域已被定义。家族成员包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，在一些特定实施方案中，将人抗Axl抗体中预测的非必需氨基酸残基替换为来自同一侧链家族的另一个氨基酸残基。在一些特定实施方案中，对本文的抗-Axl抗体或抗原结合片段的氨基酸保守序列的修饰程度为至多1、2、3、4、5或6个氨基酸，与修饰前同源性为至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％。因此，例如，至多替换表1和表2所示任一CDR中5个保守的氨基酸，至多替换表1和表2所示任一CDR中4个保守的氨基酸，至多替换表1和表2所示任一CDR中3个保守的氨基酸，至多替换表1和表2所示任一CDR中2个保守的氨基酸，或至多替换表1和表2所示任一CDR中1个保守的氨基酸。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-CHI的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-CHI的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQ IDNO：61所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-CHI的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-CHI的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-434的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列至少有80％、至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-434的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列至少80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-434的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列至少有880％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-434的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-2的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-2的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQID NO：62所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-2的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-2的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-3的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-3的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQ IDNO：62所示的氨基酸序列至少80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-3的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列至少有80％、至少有85％、至少有90％、至少有95％、至少有96％、至少有97％、至少有98％、至少有99％、有100％同源性有80％、至少有85％、至少有90％、至少有95％、至少有96％、至少有97％、至少有98％、至少有99％、至少有100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-3的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-4的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-4的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQID NO：62所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-4的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-4的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列具有至少80％～99％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列具有至少80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-5的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列具有至少80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-5的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列具有至少80％～99％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列至具有至少80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-5的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-5的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-6的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-6的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQ IDNO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-6的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列至少有880％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-6的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-7的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-7的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQID NO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-7的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-7的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-8的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-8的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQID NO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-8的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-8的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-435的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-435的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQ IDNO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-435的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列至少有880％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-435的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列至少80％～99％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-436的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-436的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQID NO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体18G7-436的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列至少有880％～99％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体18G7-436的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-CHI的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-CHI的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQID NO：64所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-CHI的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-CHI的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-427的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-427的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQID NO：65所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-427的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-427的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-438的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-438的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQID NO：65所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-438的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-438的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-440的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-440的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQID NO：65所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-440的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-440的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-428的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-428的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQID NO：66所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-428的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-428的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-439的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-439的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQID NO：66所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-439的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-439的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-441的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-441的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQID NO：66所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体8A3-441的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体8A3-441的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：157所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：157所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体Abcom1的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：157所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体Abcom1的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQ ID NO：158所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQ ID NO：158所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体Abcom1的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：158所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表1所示的抗体Abcom1的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文特异性结合Axl(例如人Axl的胞外结构域)的抗体或抗原结合片段的变体，包含：(a)重链可变区，其与SEQ ID NO：159所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(b)重链可变区，其与SEQ ID NO：159所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与抗体Abcom2的VHCDRs相同的VHCDRs；或(c)重链可变区，其与SEQ ID NO：159所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的重链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体Abcom2的VH CDRs相同的VH CDRs；以及(d)轻链可变区，其与SEQ ID NO：160所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性；(e)轻链可变区，其与SEQ ID NO：160所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与抗体Abcom2的VLCDRs相同的VLCDRs；或(f)轻链可变区，其与SEQ ID NO：160所示的氨基酸序列至少有80％～100％同源性的轻链可变区；其中，抗体包含与表2所示的抗体Abcom2的VLCDRs相同的VLCDRs。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链，所述重链包含本文所述的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的变体或包含本文所述的重链可变区(VH)的变体
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含轻链，所述轻链包含本文所述的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的变体，或包含本文所述的轻链可变区(VL)的变体。
重链和轻链的变体
一实施方式中，本发明提供Axl拮抗抗体或抗原结合片段的变体，所述变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：67-75中任一项所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：76-81中任一项所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％同源性的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：67所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：76所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQID NO：67所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：76所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：68所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：77所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQID NO：68所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％同源性的氨基酸序列；所述轻链与SEQ ID NO：77所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：69所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链与SEQ ID NO：77所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQID NO：69所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：77所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：70所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：77所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：70所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：77所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：71所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：77所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：71所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：77所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：68所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：78所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：68所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；所述轻链包与SEQ ID NO：78所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：69所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：78所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：69所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：78所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含SEQ ID NO：70所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：78所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：70所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：78所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：71所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：78所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：71所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：78所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包与SEQ ID NO：67所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：78所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：67所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：78所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：71所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：76所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：71所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：76所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：72所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：79所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：72所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；所述轻链与SEQ ID NO：79所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：73所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：80所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：73所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：80所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：74所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：80所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：74所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：80所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：75所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：80所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：75所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：80所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：73所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：81所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：73所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：81所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：74所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：81所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：74所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：81所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：75所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：81所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：75所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：81所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：161所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ IDNO：161所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含SEQ ID NO：162所述的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：162所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：163所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：164所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：163所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO：164所述的氨基酸序列至少有80％～至少有99％％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述重链包含与SEQ ID NO：67所述的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的氨基酸序列；在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的变体包含重链和/或轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：76所述的氨基酸序列至少有80％～99％同源性的氨基酸序列。
恒定区的变体
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段，其特异性结合Axl多肽(例如人Axl)。所述抗体或抗原结合片段包含本文所述的轻链可变区(VL)氨基酸序列和本文所述的重链可变区(VH)氨基酸序列，以及进一步包含了经一个或多个氨基酸修饰的恒定区。其中所述恒定区包含人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、人免疫球蛋白分子任一分类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、或IgG1)，或人免疫球蛋白分子任一亚型(例如，IgG 2a或IgG2b)的恒定区的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述修饰指的是最多有1、2、3、4、5或6个氨基酸被取代。
一实施方式中，本发明的Axl拮抗抗体或其抗原结合片段的变体可包含经过恒定区修饰产生的恒定区变体，所述修饰的恒定区包含：
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加；和
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换；
优选地，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，更优选为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区，进一步优选地，其是人IgG1或人IgG4重链恒定区；
优选地，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。
在一些实施方案中，本文所述的特异性结合Axl多肽(例如人Axl)的抗体或抗原结合片段包含本文所述的VL氨基酸序列和本文所述的VH氨基酸序列，以及进一步包含了经一个或多个氨基酸修饰的重链恒定区CH，所述修饰指的是最多有1、2、3、4、5或6个氨基酸被取代。
在某些实施方案中，本文提供的Axl拮抗抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，其包含在一个或多个氨基酸位置的氨基酸修饰(例如取代)。在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段Fc可以被修饰以改变其效应功能，进而影响抗体的生物学特性。例如，在一些实施方案中，恒定区氨基酸的缺失或修饰(通过点突变或其他方式)可以改变抗体的Fc受体结合。在一些实施方案中，恒定区氨基酸的修饰可以增加或减少抗体的血清半衰期。在一些实施方案中，恒定区被修饰以消除二硫键或寡糖部分。在一些实施方案中，恒定区可以去岩藻糖基化。
效应功能降低的抗体包括Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个被取代的抗体。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的Fc可以被修饰使其不具有一种或多种效应功能。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的Fc可以被修饰使得其具有改变的ADCC活性和/或改变的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段的Fc可以被修饰以使其不结合Fc受体和/或补体因子。在某些实施方案中，本文的抗体或其抗原结合片段的Fc可以被修饰以使其优先结合Fc受体。
在一些实施方案中，构成本文抗体或抗原结合片段的多肽还包含信号序列，例如，N端信号序列。在某些情况下，此类多肽在最初产生时可包含此类信号序列，例如翻译时，但可在组装最后抗体或抗原结合片段之前或期间去除信号序列。在一些替代实施方案中，抗体或抗原结合片段的多肽不包含信号序列。
在一些具体实施方案中，本文所述的Axl抗体或其抗原结合片段包含能够结合一种或多种Fc受体(FcR)的野生型Fc区。在另一些具体的实施方案中，本文所述的Axl抗体或其抗原结合片段包含相对于野生型Fc区对一种或多种Fc受体(FcR)具有增强的结合亲和力的Fc区。在另一些具体的实施方案中，本文所述的Axl抗体或其抗原结合片段包含相对于野生型Fc区对一种或多种Fc受体(FcR)具有降低的结合亲和力的Fc区。在另一些具体的实施方案中，本文所述的Axl抗体或其抗原结合片段包含一种或多种Fc受体(FcR)没有结合亲和力的Fc区。在另一些具体的实施方案中，本文所述的Axl抗体或其抗原结合片段包含对任何Fc受体(FcR)没有结合亲和力的Fc区。在另一个具体实施方案中，本文所述的Axl抗体或其抗原结合片段不包含Fc区。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或其抗原结合片段可以被修饰以改变其效应功能，进而影响抗体的生物学特性。例如，在一些实施方案中，恒定区氨基酸的缺失或修饰(通过点突变或其他方式)可以改变抗体的Fc受体结合。在一些实施方案中，恒定区氨基酸的修饰可以增加或减少抗体的血清半衰期。在一些实施方案中，恒定区被修饰以消除二硫键或寡糖部分。在一些实施方案中，恒定区可以去岩藻糖基化。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段可以被修饰使其不具有一种或多种效应功能。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段可以被修饰使得其具有改变的ADCC活性和/或改变的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段可以被修饰以使其不结合Fc受体和/或补体因子。在某些实施方案中，本文的抗体或其抗原结合片段可以被修饰以使其优先结合Fc受体。
在一些实施方案中，构成本文抗体或抗原结合片段的多肽还包含信号序列，例如，N端信号序列。在某些情况下，此类多肽在最初产生时可包含此类信号序列，例如翻译时，但可在组装最后抗体或抗原结合片段之前或期间去除信号序列。在一些替代实施方案中，抗体或抗原结合片段的多肽不包含信号序列。
工程化变体
如本领域已知，通过工程化导入序列可用于降低免疫原性或降低、增强或改变结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期或任何其它合适特征。通常，在可变和恒定区的非人序列经人或其它氨基酸置换时，保持了部分或全部非人或人CDR序列。
抗体也可以任选地人源化，保持对抗原的高亲和力和其它有利的生物学性质。为了实现这个目标，任选地可以通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念人源化产物的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常可用并且为本领域的技术人员所熟悉。说明并展示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序可用。对这些展示的检查容许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能上的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以选择FR残基并且由共有和导入序列组合，以便实现所需抗体特征，如对靶抗原增加的亲和力。
糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。抗体糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列，以便产生或去除一个或多个糖基化位点而便利地实现。抗体包含Fc区时，可改变与之附接的碳水化合物。
在一个实施方案中，提供了具有缺乏附接于(直接或间接)Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，此类抗体中岩藻糖的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。
半胱氨酸工程化变体
在某些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程化抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基经半胱氨酸残基取代。
抗体产品
在一些实施方案中，本发明所述包含如SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-2的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-2的重链可变区(SEQ IDNO：53)；所述包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-2的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-2的轻链可变区(SEQ ID NO：62)。
在在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-3的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-3的重链可变区(SEQ ID NO：54)；所述包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-3的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-3的轻链可变区(SEQ ID NO：62)。
在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-4的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-4的重链可变区(SEQ ID NO：55)；所述包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-4的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-4的轻链可变区(SEQ ID NO：62)。
在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-5的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-5的重链可变区(SEQ ID NO：56)；所述包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-5的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表
在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-6的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-6的重链可变区(SEQ ID NO：53)；所述包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-6的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-6的轻链可变区(SEQ ID NO：63)。
在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：69所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-7的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-7的重链可变区(SEQ ID NO：54)；所述包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-7的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-7的轻链可变区(SEQ ID NO：63)。
在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-8的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-8的重链可变区(SEQ ID NO：55)；所述包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-8的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-8的轻链可变区(SEQ ID NO：63)。
在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-435的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-435的重链可变区(SEQ IDNO：56)；所述包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-435的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-435的轻链可变区(SEQ ID NO：63)。
在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-436的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-436的重链可变区(SEQ IDNO：52)；所述包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-436的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-436的轻链可变区(SEQ ID NO：63)。
在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：71所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的18G7-434的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的18G7-434的重链可变区(SEQ IDNO：56)；所述包含SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列的轻链含有表1所示的18G7-434的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的18G7-434的轻链可变区(SEQ ID NO：61)。
在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列的重链含有表2所示的8A3-CHI的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的8A3-CHI的重链可变区(SEQ IDNO：57)；所述包含SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的8A3-CHI的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的8A3-CHI的轻链可变区(SEQ ID NO：64)。
在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列的重链含有表2所示的8A3-427的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的8A3-427的重链可变区(SEQ IDNO：58)；所述包含SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的8A3-427的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的8A3-427的轻链可变区(SEQ ID NO：65)。
在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列的重链含有表2所示的8A3-438的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的8A3-438的重链可变区(SEQ IDNO：59)；所述包含SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的8A3-438的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的8A3-438的轻链可变区(SEQ ID NO：65)。
在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列的重链含有表2所示的8A3-440的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的8A3-440的重链可变区(SEQ IDNO：60)；所述包含SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的8A3-440的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的8A3-440的轻链可变区(SEQ ID NO：65)。
在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列的重链含有表2所示的8A3-428的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的8A3-428的重链可变区(SEQ IDNO：58)；所述包含SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的8A3-428的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的8A3-428的轻链可变区(SEQ ID NO：66)。
在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列的重链含有表2所示的8A3-439的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的8A3-439的重链可变区(SEQ IDNO：59)；所述包含SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的8A3-439的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的8A3-439的轻链可变区(SEQ ID NO：66)。
在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列的重链含有表2所示的8A3-441的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的8A3-441的重链可变区(SEQ IDNO：60)；所述包含SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的8A3-441的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的8A3-441的轻链可变区(SEQ ID NO：66)。
在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：161所示的氨基酸序列的重链含有表1所示的Abcom1的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的Abcom1的重链可变区(SEQ ID NO：157)；所述包含SEQ ID NO：162所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的Abcom1的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的Abcom1的轻链可变区(SEQ ID NO：158)。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO：163所述的氨基酸序列；所述轻链包含SEQ ID NO：164所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述包含如SEQ ID NO：163所示的氨基酸序列的重链含有表2所示的Abcom2的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或表5所示的Abcom2的重链可变区(SEQ ID NO：159)；所述包含SEQ ID NO：164所示的氨基酸序列的轻链含有表2所示的Abcom2的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或表5所示的Abcom1的轻链可变区(SEQ ID NO：160)。
通常，虽然如下面进一步所讨论的那样，单独的VH结构域可用于结合抗原，但是VH结构域与VL结构域配对以提供抗原结合位点。
在一个优选的实施方案中，VH结构域(SEQ ID NO:52)与VL结构域(SEQ ID NO:61)配对，使得形成包含VH和VL结构域两者的抗体抗原结合位点。在其它实施方案中，SEQ IDNO:52所示的VH结构域与除SEQ ID NO:61所示的VL以外的VL结构域配对，本领域中明确了轻链混杂性。
在一个优选的实施方案中，VH结构域(SEQ ID NO:56)与VL结构域(SEQ ID NO:61)配对，使得形成包含VH和VL结构域两者的抗体抗原结合位点。在其它实施方案中，SEQ IDNO:56所示的VH结构域与除SEQ ID NO:61所示的VL以外的VL结构域配对，本领域中明确了轻链混杂性。
在一个优选的实施方案中，VH结构域(SEQ ID NO:55)与VL结构域(SEQ ID NO:62)配对，使得形成包含VH和VL结构域两者的抗体抗原结合位点。在其它实施方案中，SEQ IDNO:55所示的VH结构域与除SEQ ID NO:62所示的VL以外的VL结构域配对，本领域中明确了轻链混杂性。
在一个优选的实施方案中，VH结构域(SEQ ID NO:56)与VL结构域(SEQ ID NO:62)配对，使得形成包含VH和VL结构域两者的抗体抗原结合位点。在其它实施方案中，SEQ IDNO:56所示的VH结构域与除SEQ ID NO:62所示的VL以外的VL结构域配对，本领域中明确了轻链混杂性。
在一个优选的实施方案中，VH结构域(SEQ ID NO:52)与VL结构域(SEQ ID NO:63)配对，使得形成包含VH和VL结构域两者的抗体抗原结合位点。在其它实施方案中，SEQ IDNO:52所示的VH结构域与除SEQ ID NO:63所示的VL以外的VL结构域配对，本领域中明确了轻链混杂性。
在一个优选的实施方案中，VH结构域(SEQ ID NO:53)与VL结构域(SEQ ID NO:63)配对，使得形成包含VH和VL结构域两者的抗体抗原结合位点。在其它实施方案中，SEQ IDNO:53所示的VH结构域与除SEQ ID NO:63所示的VL以外的VL结构域配对，本领域中明确了轻链混杂性。
在一个优选的实施方案中，VH结构域(SEQ ID NO:54)与VL结构域(SEQ ID NO:63)配对，使得形成包含VH和VL结构域两者的抗体抗原结合位点。在其它实施方案中，SEQ IDNO:54所示的VH结构域与除SEQ ID NO:64所示的VL以外的VL结构域配对，本领域中明确了轻链混杂性。
在一个优选的实施方案中，VH结构域(SEQ ID NO:55)与VL结构域(SEQ ID NO:63)配对，使得形成包含VH和VL结构域两者的抗体抗原结合位点。在其它实施方案中，SEQ IDNO:55所示的VH结构域与除SEQ ID NO:63所示的VL以外的VL结构域配对，本领域中明确了轻链混杂性。
在一个优选的实施方案中，VH结构域(SEQ ID NO:57)与VL结构域(SEQ ID NO:64)配对，使得形成包含VH和VL结构域两者的抗体抗原结合位点。在其它实施方案中，SEQ IDNO:57所示的VH结构域与除SEQ ID NO:64所示的VL以外的VL结构域配对，本领域中明确了轻链混杂性。
在一个优选的实施方案中，VH结构域(SEQ ID NO:58)与VL结构域(SEQ ID NO:65)配对，使得形成包含VH和VL结构域两者的抗体抗原结合位点。在其它实施方案中，SEQ IDNO:58所示的VH结构域与除SEQ ID NO:65所示的VL以外的VL结构域配对，本领域中明确了轻链混杂性。
在一个优选的实施方案中，VH结构域(SEQ ID NO:59)与VL结构域(SEQ ID NO:65)配对，使得形成包含VH和VL结构域两者的抗体抗原结合位点。在其它实施方案中，SEQ IDNO:59所示的VH结构域与除SEQ ID NO:65所示的VL以外的VL结构域配对，本领域中明确了轻链混杂性。
在一个优选的实施方案中，VH结构域(SEQ ID NO:60)与VL结构域(SEQ ID NO:65)配对，使得形成包含VH和VL结构域两者的抗体抗原结合位点。在其它实施方案中，SEQ IDNO:60所示的VH结构域与除SEQ ID NO:65所示的VL以外的VL结构域配对，本领域中明确了轻链混杂性。
在一个优选的实施方案中，VH结构域(SEQ ID NO:58)与VL结构域(SEQ ID NO:66)配对，使得形成包含VH和VL结构域两者的抗体抗原结合位点。在其它实施方案中，SEQ IDNO:58所示的VH结构域与除SEQ ID NO:66所示的VL以外的VL结构域配对，本领域中明确了轻链混杂性。
在一个优选的实施方案中，VH结构域(SEQ ID NO:59)与VL结构域(SEQ ID NO:66)配对，使得形成包含VH和VL结构域两者的抗体抗原结合位点。在其它实施方案中，SEQ IDNO:59所示的VH结构域与除SEQ ID NO:66所示的VL以外的VL结构域配对，本领域中明确了轻链混杂性。
在一个优选的实施方案中，VH结构域(SEQ ID NO:60)与VL结构域(SEQ ID NO:66)配对，使得形成包含VH和VL结构域两者的抗体抗原结合位点。在其它实施方案中，SEQ IDNO:60所示的VH结构域与除SEQ ID NO:66所示的VL以外的VL结构域配对，本领域中明确了轻链混杂性。
一方面，本发明提供一种前述方面的特异性结合AXL的抗原结合蛋白或其抗原结合片段的变体，其中，所述变体：(1)与前述任一方面所述的抗体的Axl结合结构域竞争结合Axl；(2)结合与前述任一方面所述的抗体相同的表位；(3)结合与前述任一项所述的抗体结合的表位重叠的表位。
在一些实施方式中，其中所述抗体、抗原结合蛋白抗原结合片段或其变体包括：(i)抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或一部分；(ii)全抗体；或(iii)抗原结合抗体片段。
在一些实施方式中，前述方面所述的抗体、抗原结合片段或其变体，其中所述抗原结合蛋白选自下组：单克隆抗体、单链抗体、鼠源抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、人源化抗体和全人源抗体、和异种缀合抗体；单可变结构域、结构域抗体、单链抗体、不含铰链区的单价抗体、微抗体、双抗体、三链抗体、κ(λ)抗体、BiTE、DVD-lg、SIP、SMIP或DART和TandabsTM；和/或，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体和单域抗体。
在一些优选实施方式中，前述方面所述的抗原结合蛋白或抗体、抗原结合片段或变体中，所述抗原结合蛋白活抗体可以为scFv抗体分子或单克隆抗体，在一些优选实施方式中，所述抗原结合蛋白和抗体为全长IgG1抗体；在一些优选实施方式中，所述抗原结合蛋白或抗体为嵌合抗体或人源化抗体；或更优选实施方式中，所述抗原结合蛋白或抗体为完全人抗体。
抗体活性
本文提供了特异性结合Axl并且可以调节Axl活性和/或表达(例如，抑制Axl活性和/或表达)的抗体。
Axl活性可以涉及任何本领域已知或描述的Axl活性。Axl活性包括但不限于：Axl受体二聚化、Axl受体磷酸化(例如，细胞质结构域中的酪氨酸磷酸化或自磷酸化)、Axl受体下游信号传导(例如，P13K、PLC、GRB2、RAC1、SOCS-1、AKT、STAT1或MAPK/ERK信号传导)、Axl配体(例如Gas6)诱导细胞增殖，或细胞存活(例如自然杀伤(NK)细胞)、调节NK细胞、树突细胞或巨噬细胞、吞噬作用、抑制促炎细胞因子的产生(例如，抑制TLR诱导的促炎细胞因子(例如，TNF、IL-6、IL-12和I型干扰素)的产生)。
前述任一方面所述的抗体、抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其具有下述一项或多项功能：(1)与AXL受体酪氨酸激酶结合，或与AXL受体酪氨酸激酶结合上的O-联聚糖结合，(2)在结合细胞表面存在的Axl之后内化，(3)抑制AXL结合至Gas6，(4)下调AXL受体的表达，(5)增加AXL受体内化的速度，(6)抑制AXL受体下游的信号传导，(7)增加细胞死亡的速度和抑制肿瘤生长，(8)抑制Axl自体磷酸化，(9)减少纤维化标记物的表达，如减少α-SMA、Col1A1、MCP1和/或TGF-β的表达。
在一些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段或其变体特异性结合Axl多肽，例如人Axl的ECD(细胞外结构域)，并且抑制(例如，部分抑制)Axl活性。
在一些实施方案中，(通过本文所述或本领域技术人员已知的方法测得，例如酶联免疫吸附实验(ELISA)、或流式细胞荧光分析技术(FACS))，测得本文所述的抗体或抗原结合片段特异性结合人Axl并阻断或抑制(例如部分抑制)Axl配体(例如Gas6)与Axl的结合程度为为50％～100％。在一些具体实施方案中，测得本文所述的抗体或抗原结合片段抑制Gas6与Axl的结合程度为60％～100％。在一些具体实施方案中，测得本文所述的抗体或抗原结合片段抑制Gas6与Axl的结合程度为70％～100％。在一些具体实施方案中，测得本文所述的抗体或抗原结合片段抑制Gas6与Axl的结合程度为75％～98％。在一些具体实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段抑制Gas6与Axl的结合程度为75％、80％、、85％90％、91％、95％、98％、或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括范围终点的值)的其中任何整数值值。
在一些具体实施方式，本文所述的Axl拮抗抗体或其抗原结合片段或变体(例如单克隆抗体)对Axl抗原的蛋白的结合能力可以通过EC50值来表征。在一些具体实施方式，本文所述的Axl拮抗抗体(例如单克隆抗体)或其变体与Axl的结合作用可以通过EC50值来表征。EC50值反映了Axl拮抗抗体或抗原结合片段或变体与Axl的结合达到50％时的浓度。在一些具体实施方式中，本文的Axl拮抗抗体或其抗原结合片段(例如，表1的抗体18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、18G7-436、18G7-434、或Abcom1；或表2所示的抗体8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、或Abcom2)或其抗原结合片段；或抗体，其包含上述表1和表2所示的抗体的CDRs；或抗体，其包含表5所示的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL))，或变体结合人Axl蛋白的ELISA分析的EC50至多为约10ng/mL、5ng/mL、或至多为约4.5ng/mL、或至多为约4ng/mL、至多为约3.5ng/mL、至多为约3ng/mL、至多为约2.5ng/mL、至多为约2ng/mL、或至多为约1.5ng/mL、或至多为约1ng/mL、或至多为约0.5ng/mL、或至多为约0.3ng/mL、或至多为约0.2ng/mL、或至多为约0.1ng/mL、至多为约0.075ng/mL、或至多为约0.05ng/mL、或至多为约0.02ng/mL、或至多为约0.01ng/mL。
其结合人Axl蛋白的FACS分析的EC50约至多为约10000ng/mL、或至多为约5000ng/mL、至多为约2000ng/mL、至多为约1000ng/mL、至多为约500ng/mL、至多为约200ng/mL、或至多为约100ng/mL、或至多为约1ng/mL、或至多为约50ng/mL、或至多为约30ng/mL、或至多为约25ng/mL、或至多为约20ng/mL、至多为约15ng/mL、或至多为约10ng/mL、或至多为约5ng/mL、或至多为约1ng/mL。
在一些具体实施方式，本文所述的Axl拮抗抗体或其抗原结合片段或变体(例如单克隆抗体)对Axl配体(如Gas6)结合Axl的抑制作用可以通过IC50值来表征。IC50值反映了抗Axl抗体在抑制Axl配体与Axl的结合达到50％时的浓度。在一些具体实施方式中，本文的Axl拮抗抗体或其抗原结合片段(例如，表1的抗体18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、18G7-436、18G7-434、或Abcom1；或表2所示的抗体8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、或Abcom2)或其抗原结合片段；或抗体，其包含上述表1和表2所示的抗体的CDRs；或抗体，其包含表5所示的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL))，或变体阻断配体GAS6与Axl结合的IC50值：在一些实施方案中，本文的Axl拮抗抗体或抗原结合片段或变体阻断配体GAS6与Axl结合在FACS IC50值至多为约1000ng/mL、或至多为约7000ng/mL、或至多为约5000ng/mL、或至多为约2000ng/mL、或至多为约1000ng/mL、或至多为约900ng/mL、或至多为约700ng/mL、或至多为约600ng/mL、或至多为约500ng/mL、或至多为约300ng/mL、或至多为约200ng/mL、或至多为约100ng/mL、或至多为约70ng/mL、或至多为约50ng/mL、或至多为约0.01ng/mL。在一些实施方案中，本文的Axl拮抗抗体或抗原结合片段或变体阻断Axl配体与Axl结合的ELISA分析的IC50值多为约10000ng/mL、或至多为约8000ng/mL、至多为约7000ng/mL、或至多为约6000ng/mL、或至多为约5000ng/mL、或至多为约4500ng/mL、或至多为约4000ng/mL、或至多为约3500ng/mL、或至多为约3000ng/mL、或至多为约2500ng/mL、或至多为约2000ng/mL、或至多为约1000ng/mL、或至多为约500ng/mL、或至多为约300ng/mL。
上述FACS水平上的EC50值由本文所述或本领域技术人员熟知的测试方法测得(例如，例如流式细胞荧光分选技术(FACS))。
在一些实施方案中，Axl拮抗抗体或抗原结合片段或变体能够阻断(例如，部分阻断)或抑制(例如，部分抑制)Axl(如人Axl)的下游信号传导，例如MAPK的磷酸化、P13K的磷酸化、或AKT的磷酸化。在一些实施方案中，本文所述的作为Axl活性抑制剂的Axl拮抗抗体或抗原结合片段或变体(例如，抗体18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、18G7-436、18G7-434、或Abcom1或其CDRs；或表2所示的抗体8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、或Abcom2)或其抗原结合片段或CDRs；或抗体，其包含表5所示的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL))，或其变体，可以抑制下游信号传导，例如AKT的磷酸化。在一些实施方案中，本文所述的Axl拮抗抗体或抗原结合片段或其变体可以抑制或减少Gas6的Axl配体诱导AKT的磷酸化程度至范围为约5％～200％、或约10％～180％、或20％～150％、或约40％～130％、或约50％～120％、或约60％～100％、或约70％～90％、或约80％～90％。
在一些实施方案中，本文所述的Axl拮抗抗体或抗原结合片段或变体可以抑制或减少Gas6的Axl配体诱导AKT的磷酸化程度为100％～200％。在一些实施方案中，本文所述的Axl拮抗抗体或抗原结合片段或变体可以抑制或减少Gas6的Axl配体诱导AKT的磷酸化程度为120％～190％。在一些实施方案中，本文所述的Axl拮抗抗体或抗原结合片段或其变体可以抑制或减少Gas6的Axl配体诱导AKT的磷酸化程度为150％～180％。上述磷酸化实验通过AKT信号通路检测试剂盒(THUNDERTMPhospho-AKT pan(S473)TR-FRET Cell SignalingAssay Kit，Bioauxilium)测定。
受体的内化是指受体蛋白通过质膜凹陷从而脱离细胞膜进入细胞质的过程，内化后受体失活，信号转导过程可能中断，也可能会进一步调控下游效应。在一些实施方案中，本文所述的作为Axl活性抑制剂的Axl拮抗抗体或抗原结合片段(例如，抗体18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、18G7-436、18G7-434、或Abcom1或其CDRs；或抗体，其包含表2所示的抗体8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、或Abcom2)其抗原结合片段，或其CDRs；或抗体，其包含表5所示的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL))，或其变体，增加Axl受体内化的速率，Axl受体内化的速率和不与抗体接触的其它经过相同处理的样品相比至少增加1～15倍；优选地，Axl受体内化的速率和不与抗体接触的其它经过相同处理的样品相比至少增加5～15倍；更优选地，Axl受体内化的速率和不与抗体接触的其它经过相同处理的样品相比至少增加7～15倍；进一步优选地，Axl受体内化的速率和不与抗体接触的其它经过相同处理的样品相比至少增加7～12倍。上述内化实验数据由流式细胞仪测得。
Axl受体的总蛋白水平和膜蛋白水平的下调，会减少受体与配体结合的几率，从而减少下游信号的传导。在一些实施方案中，本文所述的作为Axl活性抑制剂的特异性结合Axl的抗Axl抗体(例如，表1所示的抗体18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、18G7-436、18G7-434、或Abcom1或表所示的抗体8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、或Abcom2)或其抗原结合片段；或抗体，其包含表1所示的抗体的CDRs；或抗体，其包含表2所示的抗体的CDRs；或抗体，其包含表5所示的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL))，或其变体，可以下调Axl受体的总蛋白水平和膜蛋白水平。在一些实施方案中，本文的Axl受体总蛋白下调程度和不与抗体接触的其它经过相同处理的样品相比至少降低10％～90％；优选地，本文的Axl受体总蛋白下调程度和不与抗体接触的其它经过相同处理的样品相比至少降低20％～80％；更优选地，本文的Axl受体总蛋白下调程度和不与抗体接触的其它经过相同处理的样品相比至少降低40％～80％；进一步优选地，本文的Axl受体总蛋白下调程度和不与抗体接触的其它经过相同处理的样品相比至少降低50％～60％)上述Axl受体总蛋白下调实验数据由蛋白质免疫印迹法(Western Blot)测得。在一些实施方案中，本文的Axl受体膜蛋白下调程度和不与抗体接触的其它经过相同处理的样品相比至少降低10％～90％；优选地，本文的Axl受体总蛋白下调程度和不与抗体接触的其它经过相同处理的样品相比至少降低20％～80％；更优选地，本文的Axl受体总蛋白下调程度和不与抗体接触的其它经过相同处理的样品相比至少降低40％～60％。上述Axl受体膜蛋白下调实验数据由流式细胞荧光分析技术(FACS)测得。
本文所述的作为Axl活性拮抗剂的抗Axl抗体(例如，表1所示的抗体18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、18G7-436、18G7-434、或Abcom1或其CDRs；或表2所示的抗体8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、或Abcom2)或其抗原结合片段；或抗体，其包含表1所示的抗的CDRs；或抗体，其包含表1所示的抗体的CDRs；或抗体，其包含表5所示的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL))，或其变体，促进肿瘤细胞的凋亡(例如非小细胞肺癌(A549)和人胶质瘤(U251))，肿瘤细胞的凋亡率和不与抗体接触外其他经过相同处理的样品相比至少提高1～7倍；优选地，肿瘤细胞的凋亡率和不与抗体接触外其他经过相同处理的样品相比至少提高2～6倍；更优选地，肿瘤细胞的凋亡率和不与抗体接触外其他经过相同处理的样品相比至少提高3～5倍；进一步优选地，肿瘤细胞的凋亡率和不与抗体接触外其他经过相同处理的样品相比至少提高4～5倍。所述细胞凋亡率通过细胞活力测定法(例如，Annexin V-FITC/7-AADApoptosis Detection Kit)测得。
本文所述的作为Axl活性拮抗剂的抗Axl抗体(例如，抗体18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、18G7-436、18G7-434、或Abcom1或其CDRs；或抗体，其包含表2所示的抗体8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、或Abcom2)或其抗原结合片段；或抗体，其包含表1所示的抗体的CDRs；或抗体，其包含表2所示的抗体的CDRs；或抗体，其包含表5所示的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL))，或其变体，抑制肿瘤细胞(例如非小细胞肺癌(A549)和人胶质瘤(U251))的增殖、迁移和侵袭水平，其中肿瘤抑制率为20％～100％；优选地，肿瘤抑制率为30％～90％；更优选地，肿瘤抑制率为40％～80％(上述抗-Axl抗体肿瘤抑制率的实验数据由本文的方法或本领域技术人员熟知方法测得。
本文中与Axl活性测试相关的细胞和细胞系是容易获得，或者使用本领域已知的方法容易鉴定的。例如，内源性表达Axl或具有Axl信号传导活性的细胞和/或细胞系是本领域技术人员已知的。在某些实施方案中，本文测试使用的细胞或细胞系可以内源性或重组地表达Axl。
本文所述方法和测试中所使用的细胞系包括但不限于原代细胞、转化细胞、干细胞、肥大细胞、原始生殖细胞、***、***细胞、胚胎干细胞、造血细胞、红白血病细胞(例如,F36P和TF-1细胞系)、人单核细胞系(例如急性单核细胞白血病细胞系)、人髓性白血病细胞系(例如MO7E细胞)、胃肠道间质瘤细胞系(例如，ST-882、GIST430和GIST882)、神经母细胞瘤细胞系(例如SK-N-SH、SK-SY5Y、H-EP1、SK-N-BE(2)、SK-N-BE(ZkM17)、SK-N-BE(2)C、LA-N-l、或LA-N-1-5s)、小细胞肺癌细胞系(H526、ECC12、TMK1、MKN7、GCIY、HGC27等)、人非小细胞肺癌细胞系(A549等)、人胶质瘤细胞系(U251)、人***细胞系(Hela)、和黑色素瘤细胞系(例如SKMEL3、SKMEL5、G361、MALME-3M、HMCB)。在一些特定实施方案中，可用于本文所述方法和测定的细胞包括免疫细胞(例如，巨噬细胞、树突细胞和自然杀伤(NK)细胞)。在特定实施方案中，可用于本文所述方法和测定的细胞包括为A549细胞系、U251细胞系、和Hela细胞系。
或者，表达Axl的细胞和细胞系，例如人Axl，可以常规重组产生。可以被工程化以重组表达Axl的细胞包括但不限于COS细胞、HEK 293细胞、CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)、H1299细胞、成纤维细胞(例如人成纤维细胞，例如NIH3T3细胞和MEFS)。在一个具体实施方案中，本文所用的细胞是表达人Axl ECD(细胞外结构域)的HEK 293细胞。在一个具体实施方案中，本文所用的细胞是表达人Axl ECD(细胞外结构域)的CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)。
在一些实施方案中，本发明所述的特异性结合人Axl的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，与异源多肽融合。在一些实施方案中，本发明所述的分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段与人Axl特异性结合，且与效应分子缀合。
在一个具体的实施方案中，本发明所述的分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段与人Axl特异性结合，与效应分子缀合，所述效应分子是一种细胞毒性药物。
多聚核苷酸
一方面，本文提供一种多聚核苷酸，其包含：(1)一个或多个编码选自前述任一方面所述的Axl拮抗抗体或抗原结合片段或变体中的任一项的核苷酸序列；(2)一个或多个编码(1)的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、或重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)中的任一项的核苷酸序列，(3)一个或多个编码(1)的重链、轻链、或重链和轻链的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-CHI)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-CHI的VHCDR1(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：82)；编码18G7-CHI的VHCDR2(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：91)；和编码18G7-CHI的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：100)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-CHI)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-CHI的VLCDR1(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：109)；编码18G7-CHI的VLCDR2(SEQID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：115)；和编码18G7-CHI的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：121)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-CHI)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-CHI的VHCDR1(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：82)；编码18G7-CHI的VHCDR2(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：91)；编码18G7-CHI的VHCDR3(SEQID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：100)；在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-CHI的VLCDR1(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：109)；编码18G7-CHI的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：115)；和编码18G7-CHI的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：121)。
在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-2)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-2的VHCDR1(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：83)；编码18G7-2的VHCDR2(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：92)；和编码18G7-2的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：101)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-2)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-2的VLCDR1(SEQID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：110)；编码18G7-2的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：116)；和编码18G7-2的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：122)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-2)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-2的VHCDR1(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：83)；编码18G7-2的VHCDR2(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：92)；编码18G7-2的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：101)；本文提供编码18G7-2的VLCDR1(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：110)；编码18G7-2的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：116)；和编码18G7-2的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：122)。
在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-3)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-3的VHCDR1(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：84)；编码18G7-3的VHCDR2(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：93)；和编码18G7-3的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：102)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-3)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-3的VLCDR1(SEQID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：110)；编码18G7-3的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：116)；和编码18G7-3的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：122)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-3)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-3的VHCDR1(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：84)；编码18G7-3的VHCDR2(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：93)；编码18G7-3的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：102)；本文提供编码18G7-3的VLCDR1(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：110)；编码18G7-3的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：116)；和编码18G7-3的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：122)。
在一些实施方案中，本文提供编码抗-Axl抗体(例如，表1的18G7-4)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-4的VHCDR1(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：85)；编码18G7-4的VHCDR2(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：94)；和编码18G7-4的VHCDR3(SEQ IDNO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：103)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-4)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-4的VLCDR1(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：110)；编码18G7-4的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQID NO：116)；和编码18G7-4的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：122)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-4)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-4的VHCDR1(SEQID NO：1)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：85)；编码18G7-4的VHCDR2(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：94)；编码18G7-4的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ IDNO：103)；本文提供编码18G7-4的VLCDR1(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：110)；编码18G7-4的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：116)；和编码18G7-4的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：122)。
在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-5)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-5的VHCDR1(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：86)；编码18G7-5的VHCDR2(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：95)；和编码18G7-5的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：104)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-5)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-5的VLCDR1(SEQID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：110)；编码18G7-5的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：116)；和编码18G7-5的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：122)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-5)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-5的VHCDR1(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：86)；编码18G7-5的VHCDR2(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：95)；编码18G7-5的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：104)；本文提供编码18G7-5的VLCDR1(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：110)；编码18G7-5的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：116)；和编码18G7-5的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：122)。
在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-6)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-6的VHCDR1(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：83)；编码18G7-6的VHCDR2(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：92)；和编码18G7-6的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：101)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-6)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-6的VLCDR1(SEQID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：111)；编码18G7-6的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：117)；和编码18G7-6的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：123)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-6)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-6的VHCDR1(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：83)；编码18G7-6的VHCDR2(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：92)；编码18G7-6的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：101)；本文提供编码18G7-6的VLCDR1(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：111)；编码18G7-6的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：117)；和编码18G7-6的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：123)。
在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-7)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-7的VHCDR1(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：84)；编码18G7-7的VHCDR2(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：93)；和编码18G7-7的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：102)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-7)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-7的VLCDR1(SEQID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：111)；编码18G7-7的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：117)；和编码18G7-7的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：123)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-7)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-7的VHCDR1(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：84)；编码18G7-7的VHCDR2(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：93)；编码18G7-7的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：102)；本文提供编码18G7-7的VLCDR1(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：111)；编码18G7-7的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：117)；和编码18G7-7的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：123)。
在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-8)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-8的VHCDR1(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：85)；编码18G7-8的VHCDR2(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：94)；和编码18G7-8的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：103)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-8)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-8的VLCDR1(SEQID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：111)；编码18G7-8的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：117)；和编码18G7-8的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：123)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-8)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-8的VHCDR1(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：85)；编码18G7-8的VHCDR2(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：94)；编码18G7-8的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：103)；本文提供编码18G7-8的VLCDR1(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：111)；编码18G7-8的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：117)；和编码18G7-8的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：123)。
在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-435)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-435的VHCDR1(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：86)；编码18G7-435的VHCDR2(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：95)；和编码18G7-435的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：104)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-435)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-435的VLCDR1(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：111)；编码18G7-435的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：117)；和编码18G7-435的VLCDR3(SEQID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：123)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-435)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-435的VHCDR1(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：86)；编码18G7-435的VHCDR2(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：95)；编码18G7-435的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：104)；本文提供编码18G7-435的VLCDR1(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：111)；编码18G7-435的VLCDR2(SEQID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：117)；和编码18G7-435的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：123)。
在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-436)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-436的VHCDR1(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：82)；编码18G7-436的VHCDR2(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：91)；和编码18G7-436的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：100)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-436)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-436的VLCDR1(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：111)；编码18G7-436的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：117)；和编码18G7-436的VLCDR3(SEQID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：123)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-436)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-436的VHCDR1(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：82)；编码18G7-436的VHCDR2(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：91)；编码18G7-436的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：100)；本文提供编码18G7-436的VLCDR1(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：111)；编码18G7-436的VLCDR2(SEQID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：117)；和编码18G7-436的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：123)。
在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-434)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-434的VHCDR1(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：86)；编码18G7-434的VHCDR2(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：95)；和编码18G7-434的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：104)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-434)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-434的VLCDR1(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：109)；编码18G7-434的VLCDR2(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：115)；和编码18G7-434的VLCDR3(SEQID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：121)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表1的18G7-434)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-434的VHCDR1(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：86)；编码18G7-434的VHCDR2(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：95)；编码18G7-434的VHCDR3(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：104)；本文提供编码18G7-434的VLCDR1(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：109)；编码18G7-434的VLCDR2(SEQID NO：11)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：115)；和编码18G7-434的VLCDR3(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：121)。
在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表2的8A3-CHI)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-CHI的VHCDR1(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：87)；编码8A3-CHI的VHCDR2(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：96)；和编码8A3-CHI的VHCDR3(SEQ ID NO：8)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：105)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表2的8A3-CHI)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-CHI的VLCDR1(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：112)；编码8A3-CHI的VLCDR2(SEQID NO：12)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：118)；和编码8A3-CHI的VLCDR3(SEQ ID NO：14)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：124)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表2的8A3-CHI)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-CHI的VHCDR1(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：87)；编码8A3-CHI的VHCDR2(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：96)；编码8A3-CHI的VHCDR3(SEQID NO：8)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：105)；本文提供编码8A3-CHI的VLCDR1(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：112)；编码8A3-CHI的VLCDR2(SEQ ID NO：12)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：118)；和编码8A3-CHI的VLCDR3(SEQ ID NO：14)的核苷酸序列(如SEQID NO：124)。
在一些实施方案中，本文提供编码抗-Axl抗体(例如，表2的8A3-427)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-427的VHCDR1(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：88)；编码8A3-427的VHCDR2(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：97)；和编码8A3-427的VHCDR3(SEQID NO：8)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：106)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表2的8A3-427)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-427的VLCDR1(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：113)；编码8A3-427的VLCDR2(SEQ ID NO：12)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：119)；和编码8A3-427的VLCDR3(SEQ ID NO：14)的核苷酸序列(如SEQ IDNO：125)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表2的8A3-427)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-427的VHCDR1(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：88)；编码8A3-427的VHCDR2(SEQ IDNO：6)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：97)；编码8A3-427的VHCDR3(SEQ ID NO：8)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：106)；本文提供编码8A3-427的VLCDR1(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：113)；编码8A3-427的VLCDR2(SEQ ID NO：12)的核苷酸序列(如SEQ IDNO：119)；和编码8A3-427的VLCDR3(SEQ ID NO：14)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：125)。
在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表2的8A3-438)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-438的VHCDR1(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：89)；编码8A3-438的VHCDR2(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：98)；和编码8A3-438的VHCDR3(SEQ ID NO：8)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：107)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表2的8A3-438)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-438的VLCDR1(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：113)；编码8A3-438的VLCDR2(SEQID NO：12)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：119)；和编码8A3-438的VLCDR3(SEQ ID NO：14)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：125)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表2的8A3-438)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-438的VHCDR1(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：89)；编码8A3-438的VHCDR2(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：98)；编码8A3-438的VHCDR3(SEQID NO：8)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：107)；本文提供编码8A3-438的VLCDR1(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：113)；编码8A3-438的VLCDR2(SEQ ID NO：12)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：119)；和编码8A3-438的VLCDR3(SEQ ID NO：14)的核苷酸序列(如SEQID NO：125)。
在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表2的8A3-440)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-440的VHCDR1(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：90)；编码8A3-440的VHCDR2(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：99)；和编码8A3-440的VHCDR3(SEQ ID NO：8)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：108)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表2的8A3-440)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-440的VLCDR1(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：113)；编码8A3-440的VLCDR2(SEQID NO：12)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：119)；和编码8A3-440的VLCDR3(SEQ ID NO：14)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：125)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表2的8A3-440)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-440的VHCDR1(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：90)；编码8A3-440的VHCDR2(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：99)；编码8A3-440的VHCDR3(SEQID NO：8)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：108)；本文提供编码8A3-440的VLCDR1(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：113)；编码8A3-440的VLCDR2(SEQ ID NO：12)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：119)；和编码8A3-440的VLCDR3(SEQ ID NO：14)的核苷酸序列(如SEQID NO：125)。
在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表2的8A3-428)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-428的VHCDR1(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：88)；编码8A3-428的VHCDR2(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：97)；和编码8A3-428的VHCDR3(SEQ ID NO：8)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：106)。在一些实施方案中，本文提供编码特异性结合人Axl的抗体(例如，表2的8A3-428)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-428的VLCDR1(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：114)；编码8A3-428的VLCDR2(SEQID NO：12)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：120)；和编码8A3-428的VLCDR3(SEQ ID NO：14)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：126)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表2的8A3-428)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-428的VHCDR1(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：88)；编码8A3-428的VHCDR2(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：97)；编码8A3-428的VHCDR3(SEQ ID NO：8)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：106)；本文提供编码8A3-428的VLCDR1(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：114)；编码8A3-428的VLCDR2(SEQ ID NO：12)的核苷酸序列(如SEQID NO：120)；和编码8A3-428的VLCDR3(SEQ ID NO：14)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：126)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表2的8A3-439)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-439的VHCDR1(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：89)；编码8A3-439的VHCDR2(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：98)；和编码8A3-439的VHCDR3(SEQID NO：8)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：107)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表2的8A3-439)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-439的VLCDR1(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：114)；编码8A3-439的VLCDR2(SEQ ID NO：12)的核苷酸序列(如SEQID NO：120)；和编码8A3-439的VLCDR3(SEQ ID NO：14)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：126)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表2的8A3-439)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-439的VHCDR1(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：89)；编码8A3-439的VHCDR2(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：98)；编码8A3-439的VHCDR3(SEQ ID NO：8)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：107)；本文提供编码8A3-439的VLCDR1(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：114)；编码8A3-439的VLCDR2(SEQ ID NO：12)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：120)；和编码8A3-439的VLCDR3(SEQ ID NO：14)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：126)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表2的8A3-441)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-441的VHCDR1(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：90)；编码8A3-441的VHCDR2(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：99)；和编码8A3-441的VHCDR3(SEQID NO：8)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：108)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表2的8A3-441)轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-441的VLCDR1(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：114)；编码8A3-441的VLCDR2(SEQ ID NO：12)的核苷酸序列(如SEQID NO：120)；和编码8A3-441的VLCDR3(SEQ ID NO：14)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：126)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表2的8A3-441)重链可变区(VH)的CDRs(VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3)和轻链可变区(VL)的CDRs(VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-441的VHCDR1(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：90)；编码8A3-441的VHCDR2(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：99)；编码8A3-441的VHCDR3(SEQ ID NO：8)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：108)；本文提供编码8A3-441的VLCDR1(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：114)；编码8A3-441的VLCDR2(SEQ ID NO：12)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：120)；和编码8A3-441的VLCDR3(SEQ ID NO：14)的核苷酸序列(如SEQ ID NO：126)。
在一些具体实施方案中，本文提供包含编码Axl拮抗抗体的多聚核苷酸序列，该Axl拮抗抗体包含重链可变区(VH)的CDRs，例如，包含如表1所示的Abcom1的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。在一些具体实施方案中，本文提供包含编码Axl拮抗抗体的多聚核苷酸序列，该Axl拮抗抗体包含轻链可变区(VL)的CDRs，例如，包含如表1所示的Abcom1的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。在一些具体实施方案中，本文提供了包含编码Axl拮抗抗体的多聚核苷酸序列，该Axl拮抗抗体包含重链可变区(VH)的CDRs，例如，包含如表1所示的Abcom1的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，以及轻链可变区(VL)的CDRs，例如，包含如表1所示的Abcom1的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。
在一些具体实施方案中，本文提供包含编码Axl拮抗抗体的多聚核苷酸序列，该Axl拮抗抗体包含重链可变区(VH)的CDRs，例如，包含如表2所示的Abcom2的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。在一些具体实施方案中，本文提供包含编码Axl拮抗抗体的多聚核苷酸序列，该Axl拮抗抗体包含轻链可变区(VL)的CDRs，例如，包含如表2所示的Abcom2的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。在一些具体实施方案中，本文提供了包含编码Axl拮抗抗体的多聚核苷酸序列，该Axl拮抗抗体包含重链可变区(VH)的CDRs，例如，包含如表2所示的Abcom2的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，以及轻链可变区(VL)的CDRs，例如，包含如表2所示的Abcom2的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。
在一些具体实施方案中，本文提供的多核苷酸包含编码本文所述抗体的核苷酸序列，所述抗体包含框架区(人框架区)(例如，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的框架区),其中抗体特异性结合Axl多肽(例如人Axl多肽)。
在一个具体实施方案中，本文提供的是包含编码Axl拮抗抗体或其抗原结合片段的VH、VL、或VH和VL的核苷酸序列的多核苷酸序列，如下表7中所示：
表7、VH和VL核苷酸序列
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在一些实施方案中，本发明提供一种多聚核苷酸序列，该多聚核苷酸序列包含编码本文所述抗体重链和/或轻链的核苷酸序列。关于轻链，在一些实施方案中，本文所述的多聚核苷酸序列包含编码κ轻链的多聚核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的多聚核苷酸序列包含编码λ轻链的多聚核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的多聚核苷酸序列包括编码本文所述抗体的核苷酸序列，该抗体包含人κ轻链或人λ轻链。在一些具体的实施方案中，本文提供的多聚核苷酸序列包括编码本文所述特异性结合到Axl多肽(例如，人Axl多肽)的抗体或抗原结合片段或其变体的多聚核苷酸序列，其中，该抗体或抗原结合片段的轻链可变区(VL)的氨基酸序列可以包括本文所述的任一轻链可变区(VL)的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:61、62、63、64、65、或66)，并且，其中轻链恒定区包含人κ轻链恒定区的氨基酸序列。关于重链，在一些实施方案中，本文所述的多聚核苷酸序列包含编码人IgG1重链恒定区的核苷酸序列。在一些具体的实施方案中，本文提供的多聚核苷酸序列包括编码本文所述特异性结合到Axl多肽(例如，人Axl多肽)的抗体或抗原结合片段或其变体的多聚核苷酸序列，其中，该抗体或抗原结合片段的重链可变区(VH)的氨基酸序列可以包含本文所述的任一重链可变区(VH)的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:52、53、54、55、56、57、58、59、或60)，并且，其中重链恒定区包含人IgG1重链恒定区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的是包含编码本文所述抗体或抗原结合片段的重链的核苷酸序列，该重链包含本文所述的抗体的重链可变区(VH)(例如表5)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：60所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：157所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：159所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)。
在一些实施方案中，本文提供的是包含编码本文所述抗体或抗原结合片段的轻链的核苷酸序列，该轻链包含本文所述的抗体的轻链可变区(VL)(例如表5)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：158所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些具体实施方案中，本文所述的多聚核苷酸编码包含如SEQ ID NO：160所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl多肽(例如人Axl))的重链可变区(VH)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:127所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的轻链可变区(VL)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:136所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、或更多序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的特异性结合Axl的多肽(例如人Axl)的抗体可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:127所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，和与SEQ ID NO:136所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、或更多序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的轻链可变区(VL)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:137所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的重链可变区(VH)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:128所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的特异性结合Axl的多肽(例如人Axl)的抗体可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ IDNO:128所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，和与SEQ ID NO:137所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的重链可变区(VH)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:129所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的特异性结合Axl的多肽(例如人Axl)的轻链可变区抗体可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:129所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，和与SEQ ID NO:137所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的重链可变区(VH)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:130所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的特异性结合Axl的多肽(例如人Axl)的抗体可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:130所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，和与SEQ ID NO:137所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、或更多序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的重链可变区(VH)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的特异性结合Axl的多肽(例如人Axl)的抗体可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，和与SEQ ID NO:137所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的轻链可变区(VL)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:138所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的重链可变区(VH)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:128所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的特异性结合Axl的多肽(例如人Axl)的抗体可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ IDNO:128所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，和与SEQ ID NO:138所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的重链可变区(VH)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:129所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的特异性结合Axl的多肽(例如人Axl)的抗体可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:129所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，和与SEQ ID NO:138所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的重链可变区(VH)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:130所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的特异性结合Axl的多肽(例如人Axl)的抗体可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:130所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，和与SEQ ID NO:138所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的重链可变区(VH)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的特异性结合Axl的多肽(例如人Axl)的抗体可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，和与SEQ ID NO:138所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的重链可变区(VH)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:132所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的轻链可变区(VL)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:139所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的特异性结合Axl的多肽(例如人Axl)的抗体可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ IDNO:132所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，和与SEQ ID NO:139所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的轻链可变区(VL)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:140所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的重链可变区(VH)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:133所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的特异性结合Axl的多肽(例如人Axl)的抗体可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ IDNO:133所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，和与SEQ ID NO:140所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、或更多序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的重链可变区(VH)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:134所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的特异性结合Axl的多肽(例如人Axl)的抗体可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:134所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，和与SEQ ID NO:140所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的重链可变区(VH)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:135所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的特异性结合Axl的多肽(例如人Axl)的抗体可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:135所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，和与SEQ ID NO:140所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的轻链可变区(VL)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:141所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的重链可变区(VH)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:133所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的特异性结合Axl的多肽(例如人Axl)的抗体可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ IDNO:133所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，和与SEQ ID NO:141所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的重链可变区(VH)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:134所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的特异性结合Axl的多肽(例如人Axl)的抗体可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:134所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，和与SEQ ID NO:141所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、或更多序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段(特异性结合Axl的多肽(例如人Axl))的重链可变区(VH)，可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:135所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的特异性结合Axl的多肽(例如人Axl)的抗体可以被多聚核苷酸编码，该多聚核苷酸包含与SEQ ID NO:135所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列，和与SEQ ID NO:141所示的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、90％、至少95％、至少97％、至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-CHI)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-CHI重链可变区(VH)(SEQ ID NO：52)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：127)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-CHI)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-CHI轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：61)的核苷酸序列(例如SEQID NO：136)。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-CHI重链可变区(VH)(SEQ ID NO：52)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：127)；和编码18G7-CHI轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：61)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：136)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-2)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-2重链可变区(VH)(SEQ ID NO：53)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：128)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-2)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-2轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：62)的核苷酸序列(例如SEQ IDNO：137)。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-2重链可变区(VH)(SEQ ID NO：53)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：128)和编码18G7-2轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：62)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：137)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-3)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-3重链可变区(VH)(SEQ ID NO：54)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：129)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-3)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-3轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：62)的核苷酸序列(例如SEQ IDNO：137)。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-3重链可变区(VH)(SEQ ID NO：54)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：129)和编码18G7-3轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：62)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：137)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-4)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-4重链可变区(VH)(SEQ ID NO：55)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：130)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-4)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-4轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：62)的核苷酸序列(例如SEQ IDNO：137)。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-4重链可变区(VH)(SEQ ID NO：55)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：130)和编码18G7-4轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：62)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：137)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-5)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-5重链可变区(VH)(SEQ ID NO：56)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：131)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-5)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-5轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：62)的核苷酸序列(例如SEQ IDNO：137)。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-5重链可变区(VH)(SEQ ID NO：56)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：131)和编码18G7-5轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：62)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：137)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-6)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-6重链可变区(VH)(SEQ ID NO：53)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：128)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-6)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-6轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：63)的核苷酸序列(例如SEQ IDNO：138)。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-6重链可变区(VH)(SEQ ID NO：53)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：128)和编码18G7-6轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：63)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：138)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-7)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-7重链可变区(VH)(SEQ ID NO：54)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：129)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-7)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-7轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：63)的核苷酸序列(例如SEQ IDNO：138)。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-7重链可变区(VH)(SEQ ID NO：54)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：129)和编码18G7-7轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：63)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：138)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-8)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-8重链可变区(VH)(SEQ ID NO：55)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：130)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-8)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-8轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：63)的核苷酸序列(例如SEQ IDNO：138)。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-8重链可变区(VH)(SEQ ID NO：55)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：130)和编码18G7-8轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：63)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：138)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-435)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-435重链可变区(VH)(SEQ ID NO：56)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：131)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-435)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-435轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：63)的核苷酸序列(例如SEQID NO：138)。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-435重链可变区(VH)(SEQ ID NO：56)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：131)和编码18G7-435轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：63)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：138)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-436)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-436重链可变区(VH)(SEQ ID NO：52)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：127)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-436)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-436轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：63)的核苷酸序列(例如SEQID NO：138)。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-436重链可变区(VH)(SEQ ID NO：52)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：127)和编码18G7-436轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：63)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：138)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-434)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-434重链可变区(VH)(SEQ ID NO：56)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：131)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的18G7-434)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-434轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：61)的核苷酸序列(例如SEQID NO：136)。在一些具体实施方案中，本文提供编码18G7-434重链可变区(VH)(SEQ ID NO：56)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：131)和编码18G7-434轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：61)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：136)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的8A3-CHI)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-CHI重链可变区(VH)(SEQ ID NO：57)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：132)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的8A3-CHI)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-CHI轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：64)的核苷酸序列(例如SEQ IDNO：139)。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-CHI重链可变区(VH)(SEQ ID NO：57)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：132)和编码8A3-CHI轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：64)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：139)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的8A3-427)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-427重链可变区(VH)(SEQ ID NO：58)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：133)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的8A3-427)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-427轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：65)的核苷酸序列(例如SEQ IDNO：140)。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-427重链可变区(VH)(SEQ ID NO：58)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：133)和编码8A3-427轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：65)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：140)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的8A3-438)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-438重链可变区(VH)(SEQ ID NO：59)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：134)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的8A3-438)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-438轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：65)的核苷酸序列(例如SEQ IDNO：140)。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-438重链可变区(VH)(SEQ ID NO：59)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：134)和编码8A3-438轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：65)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：140)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的8A3-440)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-440重链可变区(VH)(SEQ ID NO：60)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：135)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的8A3-440)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-440轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：65)的核苷酸序列(例如SEQ IDNO：140)。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-440重链可变区(VH)(SEQ ID NO：60)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：135)和编码8A3-440轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：65)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：140)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的8A3-428)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-428重链可变区(VH)(SEQ ID NO：58)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：133)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的8A3-428)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-428轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：66)的核苷酸序列(例如SEQ IDNO：141)。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-428重链可变区(VH)(SEQ ID NO：58)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：133)和编码8A3-428轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：66)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：141)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的8A3-439)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-439重链可变区(VH)(SEQ ID NO：59)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：134)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的8A3-439)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-439轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：66)的核苷酸序列(例如SEQ IDNO：141)。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-439重链可变区(VH)(SEQ ID NO：59)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：134)和编码8A3-439轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：66)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：141)。
在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的8A3-441)重链可变区(VH)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-441重链可变区(VH)(SEQ ID NO：60)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：135)。在一些实施方案中，本文提供编码Axl拮抗抗体(例如，表5的8A3-441)轻链可变区(VL)的多聚核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-441轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：66)的核苷酸序列(例如SEQ IDNO：141)。在一些具体实施方案中，本文提供编码8A3-441重链可变区(VH)(SEQ ID NO：60)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：135)和编码8A3-441轻链可变区(VL)(SEQ ID NO：66)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：141)。
通过本领域技术人员已知的常规方法得到并解析多聚核苷酸序列。编码本文所述抗体和其抗体修饰形式的变体的核苷酸序列可以使用本领域技术人员已知的常规方法来确定，即，用已知的编码特定氨基酸的核苷酸密码子组装和配对产生编码抗体的核苷酸序列。这种编码抗体的多聚核苷酸序列可以由化学合成的寡核苷酸组装而成，简而言之，这涉及到合成包含编码抗体部分序列的重叠寡核苷酸，该重叠寡核苷酸经退火、连接后用PCR扩增。
使用本领域中已知的方法(如PCR)，从合适来源(如杂交瘤)的多聚核苷酸序列中生成编码本文所述抗体的多聚核苷酸序列。例如，使用产生目标抗体的杂交瘤细胞的基因组DNA以及杂交到已知序列的3’端和5’端的合成引物进行PCR扩增。这种PCR扩增方法可用于获得包含编码抗体轻链和/或重链序列的多聚核苷酸序列。这种PCR扩增方法可用于获得包含编码抗体轻链可变区和/或重链可变区的多聚核苷酸序列。扩增的多聚核苷酸序列可克隆到宿主细胞中的表达载体并进一步表达，例如，生成嵌合抗体和人源化抗体。
编码Axl拮抗抗体的多聚核苷酸序列可以很容易地分离出来，并使用常规程序进行测序(例如，使用寡核苷酸探针，该探针能够特异性结合编码抗Axl抗体重链和轻链的多聚核苷酸序列)。杂交瘤细胞可以作为这种多聚核苷酸序列的来源。一旦分离出多聚核苷酸序列，可将其放入表达载体中，然后将其转染到宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、CHO细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以获得在重组宿主细胞中合成抗-Axl抗体。
用包括VH或VL多聚核苷酸序列、酶切位点，以及保护酶切位点的侧翼序列的PCR引物扩增scFv的VH或VL多聚核苷酸序列，以产生scFv抗体。利用本领域技术人员已知的克隆技术，PCR扩增的VH结构域可以克隆到表达重链恒定区的载体上，如人类γ4恒定区，PCR扩增的VL结构域可以克隆到表达轻链恒定区的载体上，如人kappa或lambda恒定区。在某些实施例中，用于表达VH或VL结构域的载体包含EF-1α启动子、分泌信号、可变区的克隆位点、恒定区的克隆位点，及一个筛选标志的克隆位点例如新霉素。VH和VL结构域也可以克隆到一个表达必要恒定区的载体中。然后使用本领域技术人员已知的方法，将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中以产生稳定或瞬态且表达全长抗体的细胞系，例如IgG。
多聚核苷酸序列也可以被修改，例如，用人类的重链和轻链恒定区取代小鼠的序列的相应位置，或者将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价连接。
在一实施方式中，本发明制备Axl拮抗抗体的方法包括：
(a)提供起始核酸库，所述起始核酸库编码包括待置换的CDR3或缺乏CDR3编码区的VH结构域；
(b)将所述库与编码基本上如本文对VH CDR3所列的氨基酸序列的供体核酸组合，使得所述供体核酸***所述库的CDR3区内，以便提供编码VH结构域的产物核酸库；
(c)表达所述库的核酸；
(d)选择对Axl有特异性的抗体；并且
(e)回收所述抗体和/或编码所述抗体的核酸。
同样，可采用类似方法，其中将本发明的VL CDR3与编码包括待置换的CDR3或缺乏CDR3编码区的VL结构域的起始核酸库组合。
类似地，一个或多个或全部三个CDR可移植到VH或VL结构域库中，然后筛选该库中对Axl有特异性的一种或多种抗体。
免疫球蛋白可变结构域的很大一部分将包含至少三个CDR区及其***骨架区。优选地，该部分还将包括第一和第四骨架区中任一个或两个的至少约50％，这50％是第一骨架区的C端50％和第四骨架区的N端50％。可变结构域很大一部分的N端和C端处另外的残基可以是通常与天然存在的可变结构域区不相关的那些残基。例如，通过重组DNA技术制成的本发明抗体的构建可导致由引入的接头所编码的N或C端残基的引入以利于克隆或其它操纵步骤。其它操纵步骤包括引入接头以将本发明的可变结构域连接到包括免疫球蛋白重链、其它可变结构域(例如，在双抗体生产中)或如下文更加详细讨论的蛋白质标记的其它蛋白质序列中。
虽然在本发明的优选方面中，优选包含一对VH和VL结构域的抗体，但是基于VH或VL结构域序列的单结合结构域形成了本发明的其它方面。已知单免疫球蛋白结构域，特别是VH结构域，能够以特异性方式结合靶抗原。
在任一种单结合结构域的情况下，这些结构域可用于筛选能够形成能够结合Axl的双结构域抗体的互补结构域。
表达载体和宿主细胞
另一方面，本文提供了细胞(例如，宿主细胞)，该细胞表达(例如，重组)本文所述特异性结合Axl(如人Axl，如人AXL的细胞外结构域)抗体或其抗原结合片段或其变体、相关多聚核苷酸、及表达载体。本文提供的载体(例如，表达载体)包括多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包括编码特异性结合的抗体的核苷酸序列或用于在宿主细胞(优选在哺乳动物细胞中)中重组表达的片段。本文还提供了包含这些载体的宿主细胞，用于重组表达本文所述的特异性结合抗体(例如，人或人源化抗体)。同时，本文提供用于产生本文所述抗体的方法，包括从宿主细胞表达该抗体。
本文所述的特异性结合人Axl的抗体(例如，本文所述的全长抗体、抗体的重链和/或轻链、或单链抗体)或其变体的重组表达需要构建包含编码抗体的多聚核苷酸的表达载体。一旦多核苷酸编码抗体分子、抗体重链和/或轻链、或其片段(例如，重链和/或轻链可变区)的多聚核苷酸，可以使用本领域熟知的重组DNA技术制备用于产生抗体分子的载体。本文描述了通过表达含有编码核苷酸序列的抗体或抗体片段(例如，轻链或重链)或其变体的多聚核苷酸制备蛋白质的方法。使用本领域技术人员熟知的方法构建包含抗体或抗体片段(如轻链或重链)的编码序列和适当转录和翻译控制信号序列的表达载体。这些方法包括体外DNA重组技术、合成技术和体内遗传重组等。本文还提供了可复制的载体，该载体包括编码本文所述抗体分子、抗体的重链或轻链、或其变体、抗体或其片段的重链或轻链可变区、重链或轻链的CDRs的核苷酸序列、以及可操作连接的启动子。这些包括编码抗体分子恒定区和可变区、或其变体的核苷酸序列的载体可被克隆到表达全重链或其变体、全轻链或其变体，或全重链和全轻链的或其变体的载体上。
表达载体可以通过常规技术转移到细胞(例如，宿主细胞)，然后将所得细胞通过常规技术培养以产生本文所述的抗体或其片段(例如，包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs的抗体或抗原结合片段，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或其变体。因此，本文提供宿主细胞，该宿主细胞包含编码本文所述抗体或其片段、其重链或轻链、或本文所述的单链抗体的多核苷酸(例如，包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs的抗体或抗原结合片段，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或其变体，以及可连接到表达此类序列的启动子。在一些实施方案中，为了表达双链抗体，分别编码重链和轻链的载体可以在宿主细胞中共同表达，以表达整个免疫球蛋白分子，具体如下。在一些实施例中，宿主细胞包含一个载体，该载体包含编码本文所述抗体或其片段(例如，包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs的抗体或抗原结合片段，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或其变体的重链和轻链的多聚核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞包含第一载体和第二载体，第一载体包含编码本文所述抗体或其片段(例如，包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs的抗体或抗原结合片段，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或其变体的重链或重链可变区的多聚核苷酸，以及第二载体包含编码本文所述抗体或其片段(例如，包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs的抗体或抗原结合片段，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或其变体的轻链或轻链可变区的多聚核苷酸。另一个实施方式中，第一宿主细胞包含第一载体，第二宿主细胞包含第二载体，第一载体包含编码本文所述抗体或其片段(例如，包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs的抗体或抗原结合片段，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或其变体的重链或重链可变区的多聚核苷酸，并且第二载体包含编码本文所述抗体或其片段(例如，包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs的抗体或抗原结合片段，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或其变体的轻链或轻链可变区的多聚核苷酸。在一些实施方案中，通过第一宿主细胞表达的重链或重链可变区与第二宿主细胞表达的轻链或轻链可变区一起形成本发明的抗-Axl抗体或抗原结合片段(例如，包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs的抗体或抗原结合片段，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或其变体。在一些实施方案中，本发明提供包含第一宿主细胞和第二宿主细胞的宿主细胞群体。
在一些具体实施方式中，本文提供一种包含第一载体和第二载体的载体群，第一载体包含编码本文所述抗-Axl抗体或其抗原结合片段(例如，包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs的抗体或抗原结合片段，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或其变体的重链或重链可变区的多聚核苷酸，并且第二载体包含编码本文所述抗-Axl抗体或其抗原结合片段(例如，包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs的抗体或抗原结合片段，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或其变体的轻链或轻链可变区的多聚核苷酸。
在一些具体实施方式中，本文提供一种载体，该载体包含编码本文所述抗-Axl抗体或其抗原结合片段(例如，包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs的抗体或抗原结合片段，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或其变体的重链或重链可变区的多聚核苷酸，以及编码本文所述抗-Axl抗体或其抗原结合片段(例如，包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs的抗体或抗原结合片段，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或其变体的轻链或轻链可变区的多聚核苷酸。
多种宿主表达载体***可用于表达本文所述的抗体分子(例如，包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs的抗体或抗原结合片段，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或其变体。这种宿主表达***指产生及纯化目标编码序列的载体，也指当转化或转染适当的核苷酸编码序列时，可在原位表达本文所述的抗体分子的细胞。这些包括但不限于微生物，例如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(如毕赤酵母)；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞***；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒、CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染的植物细胞***或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞***，或含有重组表达构建体的哺乳动物细胞***(例如,COS、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa和NIH 3T3细胞)，该构建体含有源自哺乳动物细胞基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒(例如,腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子。在一些特定实施方式中，用于表达本文所述抗体(例如，包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs的抗体或抗原结合片段，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或抗原结合片段或变体的细胞是CHO细胞，例如来自ExpiCHO-STM(Thermo)的CHO细胞。在具体实施例中，哺乳动物表达载体为PHR。在特定实施方式中，细菌细胞如大肠杆菌或真核细胞(例如，哺乳动物细胞)，用于表达重组抗体分子，特别是用于表达整个重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是一种有效的抗体表达***，其含有来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件的载体。在某些实施例中，本文所述的抗体由CHO细胞或NSO细胞产生。在一些具体实施方式中，编码本文所述特异性结合到人Axl的抗体的核苷酸序列的表达由组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调控。
在细菌***中，可以根据所表达的抗体分子的使用意图，有利地选择多种表达载体。例如，当要生产大量这样的抗体时，为了生成抗体分子的药物组合物，可以需要直接表达易于纯化的高水平融合蛋白产品的载体。这类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278，在该载体中，抗体编码序列可以与lac Z编码区单独连接到载体中，从而产生融合蛋白。例如，pGEX载体也可用于表达谷胱甘肽5-转移酶(GST)融合蛋白。一般来说，这种融合蛋白是可溶性的，在游离谷胱甘肽存在的情况下，通过吸附和结合基质谷胱甘肽琼脂糖珠洗脱，可以很容易地从裂解细胞中纯化。pGEX载体设计包含凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，使克隆的目的基因产物能从GST部分释放。
在昆虫***中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)可以作为表达外源基因的载体。该病毒在夜蛾细胞中生长。抗体编码序列可以被单独克隆到病毒的非必需区域(例如，多面体基因)，并置于AcNPV启动子(例如，多面体启动子)的控制区域上。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达***。在腺病毒用作表达载体的情况下，目标抗体编码序列可以连接到腺病毒转录/翻译控制复合体，例如，晚期启动子和前导序列。这种嵌合基因可以通过体外或体内重组的方式***腺病毒基因组。嵌合基因***病毒基因组的非必需区(例如，E1或E3区域)将产生重组病毒，该重组病毒能在受感染的宿主细胞中表达抗体分子。为有效翻译***的抗体编码序列也需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同步，以确保***片段翻译的完整性。这些外源的翻译控制信号和起始密码子可以有多种来源，包括天然的和合成的。加入适当的转录增强子元件、转录终止子等可以提高表达效率。
此外，还可以选择一种宿主细胞株来调节***序列的表达，或以所需的特定方式修改和加工基因产物。蛋白质的此类修饰(如糖基化)和加工(如切割)对蛋白质的功能很重要。不同的宿主细胞对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有各自的特点和特定的机制。选择合适的细胞系或宿主***以保证外源蛋白表达的正确修饰和加工。为此，可以使用具有主要转录产物的正确加工，糖基化和基因产物磷酸化细胞机制的真核宿主细胞。这样的哺乳动物宿主细胞包括但不包括仅限于CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、HEK 293、NIH3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、NS0(一种不内生产生任何免疫球蛋白链的小鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7030和HsS78Bst细胞。在某些实施例中，本文所述的Axl拮抗抗体(例如，包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs的抗体或抗原结合片段，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或其变体在哺乳动物细胞中产生，如CHO细胞。
可以产生稳定表达长期、高产重组蛋白的细胞。例如，稳定表达本文所述的Axl拮抗抗体或其抗原结合片段(例如，包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs的抗体或抗原结合片段，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或其变体的细胞可以被设计。在一些具体实施例中，本文提供的细胞稳定地表达本文所述抗体(例如，包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs的抗体或抗原结合片段，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或其抗原结合片段的轻链/轻链可变域和重链/重链可变域。
在某些方面，宿主细胞可以通过适当的表达控制元件(如启动子、增强子、编码序列、转录终止子、多聚腺苷位点等)和可选标志物来控制DNA转化，而不是使用包含病毒复制起点的表达载体。引入外源DNA/多聚核苷酸后，工程细胞可以在富集培养基中生长1-2天，然后切换到选择性培养基。重组质粒中的可选择标记赋予其可供选择的抗性，并允许细胞稳定地将质粒整合到它们的染色体中，形成菌落，从而可以克隆和扩增到细胞系中。本方法可有效地用于构建表达本文所述抗-Axl抗体或其片段的工程细胞系。
通过载体扩增可以提高抗体分子的表达水平。当该载体中含有可扩增的标记物时，标记基因的拷贝数会随着宿主细胞中的抑制物水平的增加而增加。由于扩增的区域与抗体基因相关，所以抗体的产量也会增加。
宿主细胞可以与本文描述的两个或多个表达载体共转染，第一个载体可编码重链的衍生多肽，第二个载体可编码轻链的衍生多肽。这两个载体可以包含相同的选择标记，使重链和轻链多肽的表达水平相等。可以用不同数量的两种或多种表达载体共转染宿主细胞。例如,宿主细胞可以如下比例的第一表达载体和和第二个表达载体共转染宿主细胞：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15、1:20、1:25、1:30,1:35,1:40,1:45或1:50。
另外，可以使用单个载体编码和表达重链和轻链。在这种情况下，轻链应放在重链之前，以避免过量的无毒重链。重链和轻链的编码序列可以是cDNA或基因组DNA。表达载体可以是单顺反子或多顺反子。一个多顺反子核酸结构可以编码2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多，也可以编码在2-5、5-10或10-20范围内的基因/核苷酸序列。例如，双结构子核酸结构可以按以下顺序：启动子、第一基因(例如，本文所述抗体的重链)和第二基因(例如，本文所述抗体的轻链)。在这样的表达载体中，两个基因的转录都可以由启动子驱动，而来自第一个基因的mRNA翻译可以通过帽依赖的机制扫描，来自第二个基因的mRNA翻译可以通过不依赖帽的机制扫描，如IRES。
一旦通过重组表达产生了本文所述的抗体分子，就可以用目前已知的任何免疫球蛋白分子纯化方法来纯化抗体分子，例如，层析法(例如，离子交换法、亲和层析法，特别是针对蛋白A后的特异性抗原的亲和层析法，和定量柱层析法)、离心法、差溶法，或任何其他蛋白质纯化的标准技术。此外，本文所述的抗体可以融合到本文所述的异源多肽序列或本领域中已知的异源多肽序列，以促进纯化。
在一些具体实施例中，分离或纯化了本文所述的抗体。一般来说，分离出的抗体是基本上不含与所分离抗体具有不同抗原特异性的其他抗体。例如，在一些特定实施例中，本文所述的抗体制备基本上不含细胞材料和/或化学前体。“基本上不含细胞材料”这一用语包括抗体的制备物，其从细胞成分中分离出来，细胞成分来源于分离细胞或重组细胞。因此，基本上不含有细胞材料的抗体包括抗体的制备物，其异源蛋白(此处也称为“污染蛋白”)和/或抗体变体的含量小于约30％，20％，10％，5％，2％、1％、0.5％或0.1％(按干重计算)。例如，不同的翻译后修饰形式的抗体或其他抗体变体(如抗体片段)。当重组产生抗体时，通常基本不需要培养基，即培养基占蛋白质制备物体积的比例小于约20％、10％、2％、1％、0.5％或0.1％。当化学合成产生抗体时，通常基本不含化学前体或其他化学物质，即抗体与参与抗体合成的化学前体或其他化学物质分离。相应地，这种抗体制备物中除目标抗体外，化学前体或化合物的含量少于约30％、20％、10％或5％(按干重计)。
抗体的制备
一方面，本文提供了一种制备特异性结合人Axl的抗体或其抗原结合片段，或其变体的方法。
本发明的特异性结合Axl(例如人Axl的细胞外结构域)的抗体(或抗原结合片段)或其变体的合成可采用本领域已知的任何合成抗体的方法，例如，通过化学合成或重组表达技术。除非另有说明，本文所述的方法为本技术领域中的分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰，核酸杂交以及相关领域中的常规技术。
一实施方式中，所述制备特异性结合人Axl的抗体或其抗原结合片段的方法，包括培养本文所述的宿主细胞。
一实施方式中，所述制备与人Axl特异性结合的抗体或抗原结合片段的方法，包括使用所述细胞或宿主细胞(例如，包含编码本文所述抗体的多核苷酸的细胞或宿主细胞)表达(例如，重组表达)该抗体或抗原结合片段或其变体。在一个具体实施方案中，细胞是分离的细胞。在一个具体实施方案中，外源多核苷酸被引入细胞。在一个具体实施方案中，该方法进一步包含从细胞或宿主细胞中获得的抗体或其抗原结合片段的纯化步骤。
使用本领域已知的多种技术制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。这里使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。例如，可以从外源表达本文所述抗体的宿主细胞中重组合成单克隆抗体或其抗原结合片段(例如，抗-Ax抗体包含表1或表2所示的18G7-CHI、18G7-2、18G7-3、18G7-4、18G7-5、18G7-6、18G7-7、18G7-8、18G7-435、18G7-436、18G7-434、8A3-CHI、8A3-427、8A3-438、8A3-440、8A3-428、8A3-439、8A3-441、Abcom1或Abcom2的CDRs，或包含表5所示的VH和/或VL的抗体或抗原结合片段)或其变体。例如，这种抗体的轻链和/或重链。
使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体是本领域常规且众所周知的。例如，在杂交瘤方法中，对小鼠或其他合适的宿主动物，例如绵羊、山羊、兔子、大鼠、小鼠、仓鼠或猕猴进行免疫，以诱导产生淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白(例如人类Axl的细胞结构外域)的抗体。另一种方法，淋巴细胞可以体外免疫。使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。此外，RIMMS(多位点重复免疫)技术可用于免疫动物。
在一些实施方案中，小鼠(或其他动物，例如大鼠、猴子、驴、猪、绵羊、仓鼠或狗)可以用抗原(例如Axl，例如人Axl)免疫，并且一旦检测到免疫反应，例如，在小鼠血清中检测到对抗原特异的抗体，收获小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过众所周知的技术将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤。杂交瘤细胞经有限稀释筛选和克隆。在一些实施方案中，将免疫小鼠的脾细胞与SP20骨髓瘤细胞融合。
所制备的杂交瘤细胞被接种并在合适的培养基中生长，该培养基最好含有一种或多种可以抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)，这些物质可以阻止HGPRT缺陷细胞的生长。
具体实施方式中采用了能有效融合、通过已筛选的抗体-产生细胞支持得到稳定的高水平的抗体产物、并对培养基(例如HAT培养基)敏感的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞系是鼠源骨髓瘤细胞系，例如SP20骨髓瘤细胞系。人源骨髓瘤和鼠-人异源骨髓瘤细胞系也可用于产生人单克隆抗体产物。
杂交瘤细胞生长的培养基用于测定靶向人Axl抗原(例如，人Axl的细胞外结构域)的单克隆抗体产物。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过本领域已知的方法确定，例如，免疫沉淀法或体外结合测定法，例如，放射免疫分析法(RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA)。
在杂交瘤细胞被鉴定产生了预期的特异性、亲和性、和/或活性的抗体后，克隆可以通过有限的稀释步骤传代并通过标准的方法增殖。为达到此目的，合适的培养基包括D-MEM或RPMI 1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物体内作为腹水肿瘤生长。
亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规的免疫球蛋白纯化程序(例如，蛋白A-琼脂糖)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基、腹水或血清中分离出来。
在一些实施方案中，与亲本抗体相比，通过亲和性成熟制备的抗体变体改善了亲和性、稳定性、和/或表达水平。本技术领域众所周知的亲和性成熟技术和/或本文所述技术可以改变CDR(s)，然后筛选结合分子以获得期望的结合变化。不受理论约束，抗体库可以展示在生物体(如噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞)的表面或与其编码的mRNA或DNA(如共价或非共价)相关。所展示抗体的亲和性选择允许携带编码抗体的遗传信息的生物体或复合物分离。编码抗体的遗传信息使用噬菌体展示等展示方法进行两轮或三轮的突变和选择，通常会得到亲和力更高的抗体片段(例如，在低纳摩尔或皮摩尔范围内)。
在一些实施方式中，本文所述的抗体包括特异性识别Axl抗原(例如人Axl细胞外结构域)且可通过本领域中任何已知技术产生的抗体片段。例如，本文所述的Fab和F(ab’)2片段可以通过免疫球蛋白分子的蛋白水解裂解产生，使用酶如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)。Fab由完整的轻链和重链的VH和CH1结构域组成。一个F(ab’)2片段包含一个抗体分子的两个抗原结合臂，在铰链区通过二硫键连接。
在一些实施方式中，本文所述的抗体或其抗原结合片段也可以使用本领域中已知的各种噬菌体展示方法产生。在噬菌体展示方法中，功能抗体域显示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面。特别是编码VH和VL的DNA序列从动物的cDNA文库中扩增出来。将编码VH和VL结构域的DNA与scFv连接子进行PCR重组，克隆到噬菌体载体中。该载体在大肠杆菌中被电穿孔，大肠杆菌被辅助噬菌体感染。这些方法使用的噬菌体通常是包括fd和M13在内的丝状噬菌体，VH和VL结构域通常重组融合到噬菌体基因III或基因VIII上。表达与特定抗原结合的噬菌体可以被抗原选择或鉴定，例如使用标记抗原、结合抗原、被捕获到固体表面或珠状物的抗原。
在筛选噬菌体后，噬菌体上的抗体编码区可以被分离出来，用于产生完整的抗体，包括人类抗体，或任何其他需要的抗原结合片段，并在任何需要的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。
在一些实施方式中，利用PCR引物(包括VH或VL核苷酸序列、一个酶切位点以及保护酶切位点的侧翼序列)从模板(如单链抗体克隆)中扩增VH或VL序列，可获得完整抗体。在一具体实施方式中，例如scFV克隆。利用现有的克隆技术，将扩增的VH可变区克隆到表达VH框架区的载体中，将扩增的VL可变区克隆到表达VL框架区的载体中，如人类kappa或lambda恒定区。VH和VL可变区也可以克隆到一个表达必要恒定区的载体中。然后将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中，使用本领域已知的技术。在一具体实施方式中，，产生表达全长抗体(如IgG)的稳定或瞬时细胞系。
在一具体实施方式中，，嵌合抗体是一种分子，其抗体的不同部分来自于不同的免疫球蛋白分子。例如，嵌合抗体可以包含小鼠或大鼠单克隆抗体的可变区与人抗体的恒定区域融合。
在一具体实施方式中，人源化抗体可以使用本领域已知的多种技术来生产，包括但不限于CDR-移植。
人源化抗体能够与预定抗原结合，并且其包含基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的框架区和基本上具有非人免疫球蛋白(例如，鼠免疫球蛋白)的氨基酸序列的CDRs。在一些特定实施方式中，人源化抗体还包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的一部分。
该抗体还可以包括重链的CHI、铰链、CH2、CH3和CH4区域。人源化抗体可以从任何类型的免疫球蛋白中选择，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，也可以从任何类型的人免疫球蛋白中选择，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。特异性结合人类Axl细胞结构域的人类抗体可以通过多种已知的方法制备，包括上述噬菌体展示法，使用来自人类免疫球蛋白序列的抗体库。
在一些实施方案中，可以使用鼠-人杂交瘤产生人抗体。例如，经eb病毒(EBV)转化的人外周血淋巴细胞可与小鼠骨髓瘤细胞融合，产生分泌人单克隆抗体的鼠-人杂交瘤，这些鼠-人杂交瘤可通过筛选确定哪些分泌特异性结合靶抗原(如人Axl的ECD)的人单克隆抗体。
一实施方式中，通过在所Axl拮抗抗体的VH结构域氨基酸序列中添加、缺失、取代或***一个或多个氨基酸的方式，提供为所述VH结构域的氨基酸序列变体的一个或多个VH结构域，任选地将这样提供的一个或多个VH结构域氨基酸序列变体与一个或多个VL结构域组合以提供一个或多个VH/VL组合；和/或
一实施方式中，通过在所述Axl拮抗抗体的VL结构域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或***一个或多个氨基酸的方式，提供为所述VL结构域的氨基酸序列变体的VL结构域，并且将这样提供的一个或多个VL结构域氨基酸序列变体与一个或多个VH结构域组合以提供一个或多个VH/VL结构域组合；
并且测试所述VH结构域氨基酸序列变体、VL结构与氨基酸序列变体或VH/VL组合或多个组合以鉴定结合Axl的抗体。
抗体偶联药物
本文涉及一种抗体偶联药物(ADC)，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或可检测或功能标记的一种或多种。
在一些实施方案中，本文的抗体或抗原结合片段与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
在一些实施方式中，本发明的抗体可偶联的效应分子有可检测或功能标记。可检测标记包括放射性标记如[131I]或[99Tc]，可以使用放射性免疫缀合物领域中已知的常规化学方法使标记附接于本发明的抗体。标记还包括酶标记如辣根过氧化酶。标记还包括化学部分，如生物素，其可经由与特定同源可检测部分，例如标记的亲和素(avidin)或链霉亲和素(streptavidin)的结合来检测。优选地，标记还包括荧光标记如FITC。在一些实施方案中，本文的抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)。
在一些实施方式中，本发明的抗体可偶联的效应分子有稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂(例如小分子药物)。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
在一些实施方案中，抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADC)。
在一些实施方案中，药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在一些实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。在一些实施方案中，缀合的如本文所述的抗体的药物可以是酶活性毒素或其片段，所述毒素或其片段包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素(ricin)A链、相思豆毒素(abrin)A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-八叠球菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆毒蛋白(Phytolacca americana proteins)(P API、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯。
在一些实施方案中，有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
在一些实施方案中，接头连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
在一些实施方案中，通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
药物组合物
本文涉及一种药物组合物，其包含有效治疗量的本文的抗体或抗原结合片段、或本文的抗体偶联药物，以及至少一种药学上可接受的辅料。其中所述抗体包含本文公开的重链、轻链、重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的氨基酸序列。
组合物的剂型包括但不限于液体、半固体和固体剂型。液体剂型包括但不限于溶液(例如，可注射和可输注溶液)、微乳液、脂质体、或混悬液。固体剂型包括但不限于冻干粉、片剂、丸剂、胶囊、微胶囊和粉剂。组合物递送方式包括但不限于口服、注射或输注。组合物的各种剂型可以通过本领域已知的常规技术制备。
本文的药物组合物还可包含一种或多种另外的治疗剂，所述另外治疗剂的合适量可以由本领域技术人员根据所用的辅料、剂型、以及期望的释放和药效动力学特征等多种因素进行选择，所述另外治疗剂的量通常为产生治疗效果的有效量。
在制备药物中的应用
本发明的抗体及其抗原结合片段和变体，及其组合物，可用于制备治疗任AXL异常高表达相关疾病的药物。
人Axl具有高特异性的抗体来提供治疗益处的临床适应症包括其中Axl过表达，或其中Axl拮抗作用将提供临床益处的任何疾患。这些包括免疫失调、心血管病症、血栓形成、糖尿病、免疫检查点病症或增生性疾病，如癌症，特别是转移性癌症。此外，已知Axl会在许多上皮源癌症中起作用。
诊断试剂盒
在一方面，本发明提供一种诊断试剂盒，其包括本发明的Axl拮抗抗体及其抗原结合片段和变体，及和允许测定所述组成部分与转移性癌细胞的结合的一种或多种试剂可用于检测患者中的药AXL表达水平。
药盒套装
在一方面，本发明提供一种治疗AXL异常高表达相关肿瘤或癌症的药盒，其使用方法包括：予该受试者治疗有效量的前述人一方面所述的抗体或其抗原结合片段、前述的抗体药物偶联物、药物组合物、以预防或治疗AXL异常高表达相关肿肿瘤；还包括包装插页。
其中在一些实施例中，所述肿瘤或癌症肿瘤是Axl介导的相关肿瘤或癌症肿瘤。
在一些实施例中，所述肿瘤或癌症肿瘤是与Axl过表达相关的肿瘤。
目标免疫检查点病症包括：慢性病毒感染、黑素瘤、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、***癌、肾细胞癌、胰腺癌、食道癌、膀胱癌、骨髓瘤、肾癌、膀胱癌、脑部肿瘤和淋巴瘤。
在一些实施方式中，目标癌症包括：乳腺癌、中枢神经***癌、子宫内膜癌、肾癌、大肠癌、肺癌、食道癌、舌癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、胃癌、间皮瘤、黑色素瘤、纤维肉瘤、膀胱癌、直肠癌、淋巴瘤、***、头颈癌、上呼吸消化道癌、结直肠癌、尿路癌或结肠癌；更优选地，每种癌症独立地选自腺癌、鳞状细胞癌、混合腺鳞癌、未分化癌；更优选地，所述卵巢癌包括高级别卵巢严重腺癌、卵巢粘液性囊腺癌或恶性卵巢布伦纳瘤；肾癌包括透明细胞肾细胞癌；舌癌包括舌鳞状细胞癌；肺癌包括肺腺癌、肺腺鳞癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、肺***状腺癌或非小细胞肺癌；胰腺癌包括胰腺腺癌或胰腺导管腺癌；食管癌包括食管鳞状细胞癌；间皮瘤包括双相间皮瘤；中枢神经***癌症包括神经胶质瘤、胶质母细胞瘤或多形性胶质母细胞瘤；胃癌包括胃腺癌；乳腺癌包括导管乳腺癌、乳腺癌或HR+乳腺癌；膀胱癌包括膀胱鳞状细胞癌；黑素瘤包括恶性黑素瘤；结肠癌包括结肠腺癌；头颈癌包括头颈小鳞状细胞癌。
具体实施例
结合如下具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：Axl抗原与检测蛋白、对照抗体的制备
本实施例构建了三个Axl(人源序列Genbank：M76125)的表达载体，分别为AXL-ECD-HIS(其氨基酸序列为SEQ ID NO:165)、AXL-ECD-mFc(其氨基酸序列为SEQ ID NO:166)和AXL-ECD-hFc(其氨基酸序列为SEQ ID NO:167)，其中AXL-ECD的C-端连接HIS、mFc或者hFc标签，通过限制性酶切位点，克隆到哺乳动物表达载体PHR中。1.1AXL-ECD-mFc/-hFc真核表达载体的表达与纯化
AXL-ECD-mFc/-hFc蛋白表达：按照制造商所述，使用ExpiFectamine CHO转染试剂盒(Gibco)将编码AXL-ECD胞外区蛋白的pHR-AXL ECD-mFc或者pHR-AXL ECD-hFc质粒DNA瞬时转染到expiCHO S细胞(Thermo Fisher)中，将转染后的ExpiCHO-S细胞放置于ExpiCHO-S表达培养基中培养10天后，收集细胞上清液。
AXL-ECD-mFc/-hFc蛋白纯化：将所得细胞(CHO细胞，中国仓鼠卵巢细胞，ATCC,CRL-2092)上清液离心(6000×g，10mins)并过滤(使用0.45μm滤膜)后纯化。纯化条件如下：仪器：AKTA；流速：1mL/min；预装柱：型号Hitrap MabSelect SuReProtein A(GE，#11-0034-93-GEC)，用10倍体积buffer1(PBS，索莱宝，P1010,pH7.4)平衡；洗脱剂A：buffer1(PBS，pH7.4)；洗脱剂B：buffer3(100mM甘氨酸，150mM NaCl，pH为3.0)；洗脱次序：用洗脱剂A(约30mL)洗脱至A280值稳定，随后用洗脱剂B洗脱。收集A280值在30以上的峰值所对应的洗脱液，预先将收集试管中加入15μL/mL中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH为9.0)，使所得抗体液的pH值维持在7.0-8.0。所得抗体液经10KD超滤管进行缓冲液置换(缓冲液更换为PBS)和浓缩。所得蛋白用Nanodrop检测浓度，并用SDS-PAGE检测纯度。
1.2AXL-ECD-HIS或者GAS6-ECD-HIS蛋白表达与纯化
AXL-ECD-HIS或者GAS6-ECD-HIS(gene ID2621，AA279-678)蛋白表达：按照制造商所述，使用ExpiFectamine 293转染试剂盒(Gibco)将编码AXL-ECD胞外区蛋白的pHR-AXLECD-HIS质粒DNA或者编码GAS6-ECD胞外区蛋白的pHR-GAS6 ECD-HIS质粒DNA瞬时转染到expi293 F细胞(Thermo Fisher)中，将转染后的Expi293细胞放置于表达培养基中培养7天，收集细胞上清液。
AXL-ECD-HIS或者GAS6-ECD-HIS蛋白纯化：将所得细胞上清液离心(6000×g，10mins)并过滤(使用0.45μm滤膜)后纯化。纯化条件如下：预装柱：HIS-excel预装柱(GE，17-3712-05)，用10倍柱床体积的PBS缓冲液平衡；仪器：AKTA；速率：1mL/min；杂蛋白洗脱液：PBS-10咪唑；目的蛋白洗脱液：PBS-500咪唑；洗脱次序：用杂蛋白洗脱液洗脱，随后用目的蛋白洗脱液洗脱。所得洗脱液经10KD超滤管进行缓冲液置换(缓冲液更换为PBS)后浓缩。所得蛋白用Nanodrop检测浓度，并用SDS-PAGE检测纯度。
1.3参照抗体10G5-mIgG2a与参照抗体10G5-hIgG1的真核表达载体的表达与纯化
阳性参照抗体10G5-mIgG2a(其重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:168；其轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:169)和10G5-hIgG1(其重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:170；其轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:171)的可变区源自于CN109311997A的抗体H1L1，将10G5-mIgG2a和10G5-hIgG1的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的核苷酸序列克隆到PHR-X-K和PHR-X-G表达载体中。
采用上述AXL-ECD-mFc/-hFc真核表达载体的表达与纯化方法，对10G5-mIgG2a和10G5-hIgG1进行表达与纯化。
实施例2：小鼠抗AXL单克隆抗体的制备
2.1小鼠免疫
将AXL-mFc(实施例1中表达纯化的AXL-ECD-mFc蛋白)免疫抗原与弗氏完全佐剂(sigma，F5881)按照1:1比例混合后，采用腹部皮下多点注射的方式，对健康的6-8周龄的20g左右的雌鼠(BALA/C)进行第一次免疫，注射剂量为50μg/只；第一次免疫结束后，每间隔两周，将AXL-mFc免疫抗原与弗氏不完全佐剂(sigma，F5506)按照1:1比例混合后，采用皮下注射的方式，对雌鼠进行一次加强免疫，共持续3次，注射剂量为30μg/只；加强免疫结束后的第10天对雌鼠进行眼眶内眦静脉窦采血，并用ELISA免疫测定法对抗体效价进行评估；抗体效价评估结束后间隔两周将AXL-mFc免疫抗原采用腹腔注射的方法对雌鼠进行冲刺免疫，注射剂量为50μg/只；冲刺免疫结束后第3天进行细胞融合。
2.2细胞融合、杂交瘤细胞筛选与克隆化
将存在rhAxl(Recombinant Human Axl Fc Chimera Protein)特异性抗体的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP20)(脾细胞:骨髓瘤细胞＝2.5:1)进行电融合。将电融合后的细胞接种在96孔板中用黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶(HAT)培养基进行培养以筛选杂交瘤。7-12天后，将培养基中的上清液采用酶联免疫吸附测定(ELISA)与流式细胞术测试抗体与Axl的结合活性。再通过有限稀释法进行第二轮亚克隆后，选择出较高抗原结合活性的阳性克隆细胞18G7-C12与39F11-8A3，并对其进行抗体测序和体外抗体生产。通过protein-A亲和色谱法纯化培养基中的上清液，分别得到鼠源单克隆抗体18G7和鼠源单克隆抗体8A3。
实施例3：鼠源单克隆抗体18G7、8A3与AXL的结合
3.1ELISA-结合活性分析
将AXL-HIS用包被液(取0.2mol/L Na2CO38ml，0.2mol/L NaHCO317ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6)稀释到2μg/mL，并以50μL/孔的量包被到酶标板孔中，在37℃下孵育2hrs，去除液体后用洗涤液(PBST，PBS稀释液中加入0.05％吐温-20)洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入200μL封闭液，并在4℃过夜，去除液体后用洗涤液(PBST，PBS稀释液中加入0.05％吐温-20)洗涤(200μL/次，5次)；在酶标板上设置空白对照组、阳性对照组以及实验组，在阳性对照组的孔中加入阳性参照抗体10G5-mIgG2a(50μL，浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法用5倍浓度稀释为7个梯度，在实验组的孔中加入鼠源单克隆抗体18G7或8A3(50μL，浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法用5倍浓度稀释为7个梯度，将酶标板放置在37℃下孵育60mins，去除液体后用洗涤液(PBST，PBS稀释液中加入0.05％吐温-20)洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入Goat-anti-Mouse-IgG-Fc-Secondary-Antibody(Jackson，1:10000比例稀释)，去除液体后用洗涤液(PBST，PBS稀释液中加入0.05％吐温-20)洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入显色液(50μL/孔)，在37℃下孵育15mins后，加入H2SO4水溶液(50μL/孔，2mol/L)终止反应，并在酶标仪上读取OD450值。ELISA-结合活性分析结果如下表8、表9、与图1所示。
3.2FACS-结合活性分析
将对数生长期的人胶质瘤细胞U251细胞(武汉尚恩生物，SNL-095)或人***细胞HELA(南京科佰生物)细胞消化后计数，重悬于96孔板(每孔加入3E5细胞)，并用PBS洗涤(两次)；在96孔板上设置空白对照组、阳性对照组以及实验组，在阳性对照组的孔中加入阳性参照抗体10G5-mIgG2a(浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法用5倍浓度稀释为7个梯度，在实验组的孔中加入鼠源单克隆抗体18G7或8A3(浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法用5倍浓度稀释为7个梯度；将96孔板放置在4℃下孵育30mins，离心(1000rpm，2mins),去除板孔中的液体后用PBS洗涤(200μL/次，2次)；每个孔中加入PE-anti-Mouse-IgG-Fc-Secondary-Antibody(Jackson，1:10000比例稀释，50μL)，在4℃下孵育30mins，离心(1000rpm，2mins),去除液体后用PBS洗涤(200μL/次，2次)；每个孔中加入PBS(200μL/孔)，重悬细胞后，用流式细胞仪读数。FACS-结合活性分析结果如下表8、表9与图1所示：
表8、18G7在ELIAS水平和FACS水平上的EC50值
EC50(ng/mL) 18G7 10G5
ELIAS 16.34 10.03
FACS 72.78 117.6
表9、8A3在ELIAS水平和FACS水平上的EC50值
EC50(ng/mL) 8A3 10G5
ELIAS 12.32 7.910
FACS 38.83 7.537
从表8、表9与图1可以看出，ELISA-结合活性分析显示18G7、8A3的结合活性与阳性参照抗体10G5-mIgG2a相当；FACS-结合活性分析显示8A3的结合活性与阳性参照抗体10G5-mIgG2a相当，18G7的结合活性稍高于阳性参照抗体10G5-mIgG2a。
实施例4：鼠源单克隆抗体18G7、8A3对GAS6与AXL结合的阻断活性
4.1ELISA-阻断活性分析
将GAS-HIS用包被液(取0.2mol/L Na2CO38ml，0.2mol/L NaHCO317ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6)稀释到4μg/mL，并以50μL/孔的量包被到酶标板孔中，在37℃下孵育2hrs，去除液体后用洗涤液(PBST，PBS稀释液中加入0.05％吐温-20)洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入200μL封闭液，并在4℃过夜，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)；在酶标板上设置空白对照组、阳性对照组以及实验组，在阳性对照组的孔中加入阳性参照抗体10G5-mIgG2a(25μL，浓度为40μg/mL)并采用梯度稀释法用5倍浓度稀释为7个梯度，在实验组的孔中加入AXL-mFc(25μL)和鼠源单克隆抗体18G7或8A3并采用梯度稀释法用5倍浓度稀释为7个梯度，在37℃下孵育120mins，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入Goat-anti-Mouse-IgG-Fc-Secondary-Antibody(Jackson，1:10000比例稀释)，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入显色液(50μL/孔)，在37℃下孵育15mins后，加入H2SO4水溶液(50μL/孔，2mol/L)终止反应，并在酶标仪上读取OD450值。ELISA-阻断活性分析结果如下表10、表11、与图2A和图2B所示。4.2FACS-阻断活性分析
将对数生长期的人胶质瘤细胞U251细胞(武汉尚恩生物，SNL-095)或人***细胞HELA(南京科佰生物)细胞消化后计数，重悬于96孔板(每孔加入3E5细胞)，并用PBS洗涤(两次)；在96孔板上设置空白对照组、阳性对照组以及实验组，在阳性对照组的孔中加入阳性参照抗体10G5-mIgG2a(浓度为100μg/mL)并采用梯度稀释法用5倍浓度稀释为7个梯度，在实验组的孔中加入GAS6-HIS(浓度为2μg/mL，25μL)和鼠源单克隆抗体18G7或8A3(浓度为20μg/mL)并按照5倍浓度稀释为7个梯度；将96孔板放置在4℃下孵育30mins，离心(1000rpm，2mins),去除板孔中的液体后用PBS洗涤(200μL/次，2次)；每个孔中加入6xHis-Monoclonal-Antibody FITC(25μL，Invitrogen，按照1:100的比例稀释)，在4℃下孵育30mins，离心(1000rpm，2mins),去除液体后用PBS洗涤(200μL/次，2次)；每个孔中加入PBS(200μL/孔)，重悬细胞后，用流式细胞仪读数。FACS-结合活性分析结果如下表10、表11、与图2A和图2B所示：
表10鼠抗18G7在ELIAS以及FACS水平上的IC50值
IC50(ng/mL) 18G7 10G5
ELIAS 3886 18457
FACS 238.4 612.7
表11鼠抗18G7在ELIAS以及FACS水平上的IC50值
IC50(ng/mL) 8A3 10G5
ELIAS 1310 1124
FACS 139.0 34.86
从表10、表11与图2A和图2B可以看出，ELISA-阻断活性分析以及FACS-阻断活性分析均显示8A3的阻断活性略低于阳性参照抗体10G5-mIgG2a，18G7阻断活性稍高于阳性参照抗体10G5-mIgG2a。
实施例5：鼠源单克隆抗体序列的测定
采用RNAprep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(天根，DP430)对5×106个含有单克隆抗体的杂交瘤细胞18G7-C12以及5×106个含有单克隆抗体的杂交瘤细胞39F11-8A3进行RNA提取，然后用超微量分光光度计(Nanodrop)进行定量分析，用High CapacityRNA-to-cDNA Kit(Thermo fisher，4387406)进行反转录，用PCR扩增18G7-C12、39F11-8A3细胞系的重链与轻链的可变区，然后测试其核苷酸序列。将18G7-C12或39F11-8A3的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的核苷酸序列通过限制性内切酶分别连接到真核表达载体PHR-X-K和PHR-X-G表达载体中构建嵌合抗体18G7-CHI和8A3-CHI。采用ExpiCHO S细胞(Thermo Fisher)表达***进行蛋白表达。采用实施例1中所述的纯化方法(将预装柱替换为trap MabSelect SuRe(GE，#11-0034-93-GEC)Protein A预装柱)对嵌合抗体18G7-CHI的单克隆抗体以及8A3-CHI单克隆抗体进行纯化。嵌合抗体18G7-CHI以及8A3-CHI的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的氨基酸序列如表12所示：
表12 18G7-CHI以及8A3-CHI的VL和VH的氨基酸序列
实施例6：嵌合抗体18G7-CHI、8A3-CHI与AXL的结合
6.1ELISA-结合活性分析
将AXL-HIS用包被液(取0.2mol/L Na2CO38ml，0.2mol/L NaHCO317ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6)稀释到2μg/mL，并以50μL/孔的量包被到酶标板孔中，在37℃下孵育2hrs，去除液体后用洗涤液(PBST，PBS稀释液中加入0.05％吐温-20)洗涤(200μL/次，5次)；在酶标板的每个孔中加入200μL封闭液，在4℃过夜，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)；在酶标板上设置空白对照组、阳性对照组以及实验组，在阳性对照组的孔中加入阳性参照抗体10G5-hIgG1(50μL，浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法用5倍浓度稀释为7个梯度，在实验组的孔中加入嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI(50μL，浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法用5倍浓度稀释为7个梯度，在37℃下孵育60mins，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入Goat-anti-human-IgG-Fc-Secondary-Antibody(50μL，Jackson，1:10000比例稀释)，在37℃下孵育60mins，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入显色液(50μL/孔)，在37℃下孵育15mins后，加入H2SO4水溶液(50μL/孔，2mol/L)终止反应，并在酶标仪上读取OD450值。ELISA-结合活性分析结果如下表13、表14、与图3所示。
6.2 FACS-结合活性分析
将对数生长期的人胶质瘤细胞U251细胞(武汉尚恩生物，SNL-095)或人***细胞HELA(南京科佰生物)细胞消化后计数，重悬于96孔板(每孔加入3E5细胞)，并用PBS洗涤(两次)；在96孔板上设置空白对照组、阳性对照组以及实验组，在阳性对照组的孔中加入阳性参照抗体10G5-hIgG1(浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法用5倍浓度稀释为7个梯度，在实验组的孔中加入嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI(浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法用5倍浓度稀释为7个梯度；将96孔板放置在4℃下孵育30mins，离心(1000rpm，2mins),去除液体后用PBS洗涤(200μL/次，2次)；每个孔中加入PE-anti-human-IgG-Fc-Secondary-Antibody(50μL，Jackson，1:200比例稀释)，在4℃下孵育30mins，离心(1000rpm，2mins),去除液体后用PBS洗涤(200μL/次，2次)，离心(1000rpm，2mins)，每个孔中加入PBS(200μL/孔)，重悬细胞后，用流式细胞仪读数。FACS-结合活性分析结果如下表13、表14、与图3所示：
表13、18G7-CHI在ELIAS水平和FACS水平上的EC50值
EC50(ng/mL) 18G7-CHI 10G5-hIgG1
ELIAS 3.371 1.156
FACS 117.4 175.5
表14、8A7-CHI在ELIAS水平和FACS水平上的EC50值
EC50(ng/mL) 8A3-CHI 10G5-hIgG1
ELIAS 0.1633 0.1197
FACS 6.248 10.90
从表13、表14与图3可以看出，ELISA-结合活性分析显示18G7-CHI、8A3-CHI结合活性与阳性参照抗体10G5-hIgG1相当。FACS-结合活性分析显示18G7-CHI与8A3-CHI的结合活性均强于阳性参照抗体10G5-hIgG1。
实施例7：嵌合抗体18G7-CHI、8A3-CHI对GAS6与AXL结合的阻断活性
将GAS-HIS用包被液(取0.2mol/L Na2CO38ml，0.2mol/L NaHCO317ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6)稀释到4μg/mL，并以50μL/孔的量包被到酶标板孔中，在37℃下孵育2hrs，去除液体后用洗涤液(PBST，PBS稀释液中加入0.05％吐温-20)洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入200μL封闭液，并在4℃过夜，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)。将酶标板孔分为空白对照组、阳性对照组以及实验组，在阳性对照组的孔中加入阳性参照抗体10G5-hIgG1(浓度为40μg/mL)并采用梯度稀释法用5倍浓度稀释，得到7个梯度的阳性参照抗体10G5-hIgG1，在实验组的孔中加入嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI(浓度为40μg/mL)并采用梯度稀释法以5倍浓度稀释，得到7个梯度的18G7-CHI或8A3-CHI。在酶标板孔中加入AXL-mFc(25μL，4μg/mL)以及7个梯度对应浓度下的嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI(25μL)；在37℃下孵育120mins，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入Goat-anti-Mouse-IgG-Fc-Secondary-Antibody(Jackson，1:10000比例稀释)，在37℃下孵育60mins，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入显色液(50μL/孔)，在37℃下孵育15mins后，加入H2SO4水溶液(50μL/孔，2mol/L)终止反应，并在酶标仪上读取OD450值。ELISA-阻断活性分析结果如下表15、表16与图4所示。
19.2FACS-阻断活性分析
将人胶质瘤细胞U251细胞(武汉尚恩生物，SNL-095)或人***细胞HELA(南京科佰生物)细胞消化后计数，重悬于96孔板(每孔加入3E5细胞)，并用PBS洗涤(两次)；在96孔板上设置空白对照组、阳性对照组以及实验组，在阳性对照组的孔中加入阳性参照抗体10G5-hIgG1(浓度为100μg/mL)并采用梯度稀释法用5倍浓度稀释，得到7个梯度的阳性参照抗体10G5-hIgG1，在实验组的孔中加入嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI(浓度为40μg/mL)并采用梯度稀释法以5倍浓度稀释，得到7个梯度的嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI。在96孔板中加入GAS6-HIS(25μL，2μg/mL)以及7个梯度对应浓度下的嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI(25μL)；在4℃下孵育30mins，离心(1000rpm，2mins),去除孔板中的液体后用PBS洗涤(200μL/次，2次)。每个孔中加入6xHis-Monoclonal-Antibody FITC(50μL，Invitrogen，按照1:100的比例使用PBS稀释)，在4℃下孵育30mins，离心(1000rpm，2mins),去除液体后用PBS洗涤(200μL/次)，重复上述离心及洗涤操作2次。每个孔中加入PBS(200μL/孔)，重悬细胞后，用流式细胞仪读数。FACS-结合活性分析结果如下表15、表16与图4所示：
表15、18G7-CHI在ELISA水平以及FACS水平上的IC50值
IC50(ng/mL) 18G7-CHI 10G5-hIgG1
ELISA 4437 7664
FACS 640.7 689.9
表16、8A3-CHI在ELISA水平以及FACS水平上的IC50值
IC50(ng/mL) 8A3-CHI 10G5-hIgG1
ELISA 569.1 2603
FACS 640.7 689.9
从表15、表16及图4可以看出，在ELISA水平和FACS水平上，嵌合抗体18G7-CHI和8A3-CHI在阻断GAS6与AXL的结合活性上优于阳性参照抗体10G5-hIgG1，尤其是在ELISA水平，嵌合抗体18G7-CHI和8A3-CHI相较于阳性参照抗体10G5-hIgG1，在GAS6与AXL的结合的阻断活性上表现出更加明显的阻断活性。
实施例8：嵌合抗体的亲和力测定
采用表面等离子体共振技术测定18G7-CHI、8A3-CHI和阳性参照抗体10G5-hIgG1的亲和力。测试条件如下：测试仪器：Biacore X100仪器(GE Healthcare)；温度：25℃；固体相：涂布有200RU的rhAxl-Fc蛋白密度(R&DSystems，产品目录号154-AL)的传感器芯片CM5；流速：30μL/min。将溶解于HBS-EP缓冲液(Biacore，产品目录号BR-1001-88)的不同浓度(0.3至218.7nM)的10G5-hIgG1、18G7-CHI或8A3-CHI在3分钟内注射到测试仪器中，然后用缓冲液解离5分钟。每测试完一个样品后用再生液(glycine 1.5思拓凡，BR100354)以50μL/min的流速洗涤60s。使用BIA评估软件和1:1拟合模型计算动力学结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)。按照公式：平衡解离常数(KD)＝解离速率常数(kd)/结合速率常数(ka)计算得到KD值。10G5-hIgG1、18G7-CHI和8A3-CHI的具体亲和力数据参见下表17和图5。
表17、10G5-hIgG1、18G7-CHI和8A3-CHI的亲和力数据
抗体名称 ka(1/Ms) kd(1/Ms) KD(M)
8A3-CHI 4.1E+06 2.2E-0.4 5.4E-11
18G7-CHI 4.0E+06 1.6E-0.4 4.0E-11
10G5-hIgG1 1.3E+06 3.1E-0.4 2.3E-10
由表17及图5所示，嵌合抗体18G7-CHI(KD值为0.04nM)及8A3-CHI(KD值为0.054nM)相较于阳性参照抗体(KD值为0.23nM)表现出更强的亲和力。
实施例9：嵌合抗体18G7-CHI和8A3-CHI促进靶蛋白AXL内吞
以碳酸氢钠水溶液(10mM，500μL，pH 8.5)作为交换缓冲液，将购得的二抗Goat-anti-human-IgG-Fc-Secondary-Antibody(100μg，Jackson)放置于超滤管中，在4℃离心10mins，以交换购得的二抗中的缓冲液。重复上述操作两次后浓缩。将pHAb Reative Dyes(250μg，Promega，-80℃存储)溶解于DMSO与水的混合液(VDMSO:V水＝1:1，25μL)中，得到pHAb的反应性染料母液(10mg/mL)。将上述浓缩后得到的二抗与pHAb的反应性染料母液按照100μg:1.2μL的比例混合后，利用摇床在室温下结合60mins得到含有染料标记的二抗的混合液，测试该混合液中抗体浓度及二抗与染料的比例。将含有染料标记的二抗的混合液用脱盐柱(900g，2mins离心平衡)纯化(操作为抗体-染料混合液滴在脱盐柱斜面中心，斜面朝外离心2mins)以除去未反应的染料，同时检测得到的染料标记的二抗中抗体的浓度以及二抗和染料的比例。
将U251细胞按照3E5/孔放置于96孔板(U底)中，离心(1000rpm)2mins后用PBS洗涤(两次)；在96孔板上设置空白对照组、阳性对照组以及实验组，0℃条件下(冰上操作)，在阳性对照组的孔中加入阳性参照抗体10G5-hIgG1(50μL，浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法以5倍浓度稀释为7个梯度，在实验组的孔中加入嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI(50μL，浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法以5倍浓度稀释为7个梯度，在4℃下孵育30mins，离心(1000rpm)2mins，去除液体后用PBS洗涤(200μL/次，2次)；每个孔中加入50μL染料标记的二抗。作为对照，另准备一块96孔板，重复上述操作。将两块96孔板分别在37℃和4℃孵育4hrs后用PBS洗涤(两次)后，用PBS(200μL)重悬。用流式细胞仪检测得到如图6所示的荧光值数据。从图6中可知嵌合抗体18G7-CHI和8A3-CHI均能促进靶蛋白AXL内吞，且AXL内吞的速率高于阳性参照抗体10G5-hlgG1。
实施例10：嵌合抗体18G7-CHI和8A3-CHI介导AXL膜蛋白水平下调
将U251细胞按照3E5/孔放置于96孔板(U底)中，离心(1000rpm)2mins；在96孔板上设置阴性对照组、实验组以及阳性对照组，在阴性对照组的孔中、实验组的孔中以及阳性对照组的孔中对应加入50μL浓度为20μg/mL的lgG1、18G7-CHI或8A3-CHI、和10G5-hIgG1，并采用梯度稀释法分别以5倍浓度稀释得到7个梯度的lgG1、18G7-CHI或8A3-CHI、和10G5-hIgG1，培养4hrs(每隔1h震荡一下细胞)，离心去除上清液，加入胰酶(50μL，0.25％)消化细胞30s，加入PBSA终止反应，离心(1000rpm)2mins后用PBS清洗两次；随后在96孔板的每个孔上加入嵌合抗体18G7-CHI和8A3-CHI(20μg/mL)。
在4℃孵育30mins，离心(1000rpm)2mins，去除液体后用PBS洗涤(200μL/次，2次)；每个孔中加入第二抗体PE-anti-human-IgG-Fc-Secondary-Antibody(50μL/孔，使用PBS按照1:200的比例稀释)，在4℃孵育30mins，离心(1000rpm)2mins，去除液体后用PBS洗涤(200μL/次，2次)；每个孔加入缓冲液(PBS)，重悬细胞后，用流式细胞仪检测得到如图7的数据。从图7中可知嵌合抗体18G7-CHI和8A3-CHI介导了U251细胞上的AXL膜蛋白水平的下调。
实施例11：嵌合抗体18G7-CHI和8A3-CHI下调AXL总蛋白水平
通过蛋白质印迹分析检测经嵌合抗体18G7-CHI和8A3-CHI处理的非小细胞肺癌细胞株(A549(澳能)细胞)中AXL总蛋白的水平。
将A549细胞(澳能)接种在6孔板中(2×105个/孔)，贴壁后，在6孔板上设置阴性对照组、实验组以及阳性对照组，在正常培养条件下(10％FBS)或饥饿培养条件下(1％F BS)，阴性对照组的孔中、实验组的孔中以及阳性对照组的孔中对应加入浓度为1μg/mL的lgG1、18G7-CHI或8A3-CHI、和10G5-hIgG1，反应24hrs后加入RIPA-裂解缓冲液(150μL，碧云天)，在0℃(在冰上)裂解30mins；每个孔中加入loadingbuffer(含还原剂β-巯基乙醇(LifeTechnologies))，在95℃煮10分钟使蛋白变性；以Tris-SDS作为电泳缓冲液，将变性后的蛋白进行电泳实验(将变性蛋白上样到10％的PAGE预制凝胶(Genscript)的孔中)，电泳试验结束后，使用具有20％甲醇的转移缓冲液(Tris 3.03g，甘氨酸14.4g，水溶解后加入200mL甲醇，用水定容到1L)，将蛋白质转移到PVDF膜上，然后使用5％脱脂奶在室温下封闭该PVDF膜1小时；加入AXL抗体(Abcam，ab130218，稀释比例1:600)，在4℃下孵育过夜，用TBST洗涤(3次，每次持续10mins)；在室温下，每个孔加入山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP-缀合的二级抗体(1:3000的稀释倍数)，孵育1h，用TBST洗涤(3次，每次持续10mins)；在室温下，用ECL底物(生工，l115AA0118)反应1min。利用x射线摄影暗匣和医用X射线胶片(carestream)压片成像，再利用凝胶成像仪和Ima geLab软件使印迹可视化。可视化结果如图8所示。从图8中可知，与阴性对照组IgG1处理的细胞相比，用嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI处理的细胞中Axl蛋白显著降低，这表明嵌合抗体18G7-CHI和8A3-CHI能够更大程度的诱导Axl受体的内化和细胞内降解。
实施例12：嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI阻断配体诱导的Axl下游的信号传导
利用AKT信号通路检测试剂盒(THUNDERTM Phospho-AKT pan(S473)TR-FRET CellSignaling Assay Kit，Bioauxilium)测定AXL下游的AKT信号通路激活水平。
将生长至80％融合状态的胶质瘤细胞系U251用PBS洗涤，加入胰蛋白酶/EDTA(0.25％，Sigma)后，离心后重悬于培养基(DMEM 10％FBS)中。将重悬于培养基(DMEM 10％FBS)中的细胞接种于96孔板中(2×104个/孔)，在37℃孵育12hrs，用PBS洗涤，放置于饥饿培养基(DMEM/1％FBS)中孵育6hrs；将装有细胞的96孔板分类设置阴性对照组、实验组以及阳性对照组，在阴性对照组的孔中、实验组的孔中以及阳性对照组的孔中对应加入浓度为2μg/mL的lgG1、18G7-CHI或8A3-CHI；预孵育2hrs，然后加入Gas6-his刺激30mins，加入检测试剂盒中的裂解液(50μL/孔)，震荡(400rpm)30mins；将每孔移取的18μL混合液转到白底不透明板，随后加入Detection Buffer(6μL,含检测AKT-S473磷酸化荧光抗体和AKT蛋白抗体)，在常温避光条件下，反应1h，离心(1000rpm)2mins，使用TR-FRET酶标仪(PerkinElmer)检测，其中665nm波长处的吸光度代表抗-AKT-Pser473的信号强度，615nm波长处的吸光度代表抗-AKT的信号强度(作为参照)，665nm波长处的吸光度/615nm波长处的吸光度代表AKT磷酸化的相对水平。具体测试结果如图9所示。从图9可知，在U251细胞中，虽然结合AXL受体的GAS6配体能够激活其下游的AKT信号通路，但嵌合抗体18G7-CHI和8A3-CHI相对于阴性参照抗体lgG1以及阳性参照抗体10G5-hIgG1而言更有效的阻断GAS6诱导的Axl下游的信号传导。
实施例13：嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI的肿瘤细胞增殖实验
将消化后的细胞A549(100μL)或U251(100μL)接种于96孔板中(2000个/孔)，在DMEM完全培养基中培养过夜；去除96孔板中的培养基后，加入100μL用细胞完全培养基稀释到浓度为2μg/mL的lgG1、18G7-CHI或8A3-CHI、，在浓度为5％的CO2氛围以及温度为37℃的条件下，在培养箱中培养24hrs后，每孔加入10％的CCK8溶液(依照CCK8试剂盒(DOJinDOLaboratories)的说明配制得到)，避光孵育2hrs后，用酶标仪读取的数值如图10所示。从图10中可知，18G7-CHI与8A3-CHI对肿瘤细胞A549或U251的增殖均有较好的抑制作用。
实施例14：低剂量嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI能够肿瘤细胞的迁移实验
将消化后的肺癌细胞株(A549)接种于6孔板(1x106个/孔)中，培养过夜，去除上清液后用PBS清洗(3次)，加入无血清培养基，加入浓度为1μg/mL的阴性参照抗体(lgG1)、实验组抗体(嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI)、或阳性参照抗体(10G5-hIgG1)。然后将每个孔平行划3条线(用10μL枪头+直尺划线)并拍照(用显微镜拍照)，记录第0天、第1天、第2天的细胞迁移情况。用ImageJ软件分析细胞迁移的距离，再利用Graphpad软件作图，结果如图11所示。从图11中可知，嵌合抗体8A3-CHI与阳性参照抗体(10G5-hIgG1)相比显著抑制了肿瘤细胞A549的迁移。
实施例15：嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI抑制肿瘤细胞侵袭实验
将基质胶(Sigma公司)与预冷的无血清和抗生素(双无)的培养基F12K(gibco)按照体积比为1:3的比例铺在transwell小室(BIOFIL，直径12mm，孔径8μm，TCS003024)的上室面，注意操作过程中不能有气泡产生；将小室放置于24孔板中，在37℃下孵育30mins后，加入400μL的A549细胞悬液(用不含血清的培养基F12K重悬细胞得到细胞密度为2.5×105个/mL的单细胞悬液)；加入阴性参照抗体(lgG1)、实验组抗体(嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI)、或阳性参照抗体(10G5-hIgG1)。在下室即24孔板内加入600μL含20％FBS的培养基，在浓度为5％的CO2氛围以及温度为37℃的条件下，在培养箱中培养24hrs后，去除上室中的液体，并除去(用湿棉签擦拭)未穿过上室面的细胞，自然风干后，在培养箱内用乙醇固定细胞20mins。固定后的细胞先以苏木精染色20min，清水清洗一遍；再用伊红染色20min后清水清洗一遍。染色完毕后将小室自然风干，用手术刀片沿压痕将小室膜轻轻切下，置于载玻片上在显微镜下观察、计数。结果如图12所示。从图12中可知，相较于阳性参照抗体，嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI均显著抑制了A549细胞的侵袭能力。
实施例16：嵌合抗体18G7-CHI-AF、8A3-CHI-AF(脱岩藻糖基)的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)实验
利用CHO-K1(FUT8敲除)细胞系，表达去岩藻糖基化的嵌合抗体18G7-CHI-AF或8A3-CHI-AF，用以检测抗体18G7-CHI-AF或8A3-CHI-AF是否介导了抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。该实施例中使用的试剂盒为PERKINELMER(Lysis buffer，4005-0010；Eu-solution，C135-100；DELFIA BATDA reagent，C136-100)。
取对数生长期的U251细胞作为靶细胞，将其消化后计数，用培养基重悬，所得混悬液的细胞密度为1E6/mL；向2mL混悬液中加入BATDA(4μL)，在37℃下孵育20mins；去除液体后用1640+1％FBS培养基洗涤，离心(1000rpm，3mins)后去除液体，重复此操作4次后，用1640+1％FBS培养基重悬细胞，所得含有靶细胞的混悬液的细胞密度为5E4/mL，将含有靶细胞的混悬液接种至孔板中(V底或U底，100μL/孔)。取起始浓度为80μg/mL的18G7-CHI-AF或8A3-CHI-AF，并采用梯度稀释法以5倍浓度稀释，得到7个梯度的18G7-CHI-AF或8A3-CHI-AF。将每种抗体对应的接种有靶细胞的孔板设置为A组、B组和C组，将7个梯度的18G7-CHI-AF或8A3-CHI-AF加入到每种抗体的B组的对应孔中(每个梯度下的18G7-CHI-AF或8A3-CHI-AF为50μL)，并孵育45mins；
用含20％S-RPMI(小牛血清)培养基复苏外周血单个核细胞(PBMC，妙顺生物，PB025C，批次：P121061804C)30mins～1h，得到效应细胞(外周血单个核细胞)混悬液；
向每种抗体对应的A组孔中加入1640+1％FBS(100μL)；向每种抗体对应的B组孔中加入效应细胞混悬液(50μL)，将效应细胞密度调整至5E6，同时使效应细胞:靶细胞＝40:1；向每种抗体对应的C组孔中加入90μL培养基和10μL的细胞裂解液；
将孔板放入放置细胞培养箱内培养2hrs后，离心(500g，5mins)后，吸取20μL培养液至PE底透白板中，加试剂盒PERKINELMER中的Eu-solution(200μL)，避光震荡3-15mins，随后使用酶标仪(PerkinElmer)检测TRF。所得结果如图13所示。
从图13数据中可以看出，嵌合抗体18G7-CHI-AF或8A3-CHI-AF介导了抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
实施例17嵌合抗体18G7-CHI和8A3-CHI在人类非小细胞肺癌的鼠模型中抑制肿瘤生长
使用人非小细胞肺癌(NSCLC)的小鼠异种移植模型(BALB/c-nu，6周龄，雌性)评估嵌合抗体18G7-CHI和8A3-CHI的体内抗肿瘤活性。
以DMEM作为完全培养基，将人NSCLC A549细胞(ATCC#CCL-185)在体外作为单层培养物繁殖，将对数生长期的细胞消化后重悬于无血清培养基/Matrigel(1:1)中得到混悬液，以5×106个/只的接种量将含有A549细胞的混悬液注射在小鼠背部右侧皮下(s.c.)成瘤。当肿瘤尺寸为100mm3时，每种抗体需要随机分配三组小鼠：A组(对照组)、B组(单次4mg/kg剂量组)，和C组(单次12mg/kg剂量组)，A组中的每只小鼠腹膜内(i.p.)注射4mg/kg的载体(无菌PBS)进行治疗；B组中的每只小鼠腹膜内(i.p.)注射4mg/kg的载体(无菌PBS)和4mg/kg的嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI进行治疗；C组中的每只小鼠腹膜内(i.p.)注射12mg/kg的载体(无菌PBS)和12mg/kg的嵌合抗体18G7-CHI或8A3-CHI进行治疗，每周治疗两次，共持续三周。具体肿瘤抑制效果如图14所示。从图14数据中可以看出，嵌合抗体18G7-CHI和8A3-CHI在治疗四周后观察到约48％的抑制率，对A549肿瘤的生长具有明显抑制作用。
实施例18人源化抗体(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-427、8A3-428、8A3-438、8A3-439、8A3-440、8A3-441)与AXL的结合活性测试
18.1ELISA-结合活性分析
将AXL-HIS用包被液(取0.2mol/L Na2CO38ml，0.2mol/L NaHCO317ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6)稀释到2μg/mL，并以50μL/孔的量包被到酶标板孔中，在37℃下孵育2hrs，去除液体后用洗涤液(PBST，PBS稀释液中加入0.05％吐温-20)洗涤(200μL/次，5次)；在酶标板的每个孔中加入200μL封闭液，在4℃过夜，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)；每种抗体对应的酶标板上设置有空白对照组、阳性对照组以及实验组，在阳性对照组的孔中加入阳性参照抗体10G5-hIgG1(50μL，浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法用5倍浓度稀释，得到7个梯度的10G5-hIgG1，在实验组的孔中加入人源化抗体(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-427、8A3-428、8A3-438、8A3-439、8A3-440、8A3-441)(50μL，浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法用5倍浓度稀释，得到7个梯度的人源化抗体(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-427、8A3-428、8A3-438、8A3-439、8A3-440、8A3-441)。在37℃下孵育60mins，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入Goat-anti-human-IgG-Fc-Secondary-Antibody(50μL，Jackson，1:10000比例稀释)，在37℃下孵育60mins，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入显色液(50μL/孔)，在37℃下孵育15mins后，加入H2SO4水溶液(50μL/孔，2mol/L)终止反应，并在酶标仪上读取OD450值。ELISA-结合活性分析结果如图15及下表18所示。18.2FACS-结合活性分析
将对数生长期的A549细胞消化后计数，重悬于96孔板(每孔加入3E5细胞)，并用PBS洗涤(两次)；在96孔板上设置空白对照组、阳性对照组以及实验组，在阳性对照组的孔中加入阳性参照抗体10G5-hIgG1(浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法用5倍浓度稀释，得到7个梯度的10G5-hIgG1，在实验组的孔中加入人源化抗体(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-427、8A3-428、8A3-438、8A3-439、8A3-440、8A3-441)(浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法用5倍浓度稀释，得到7个梯度的(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-427、8A3-428、8A3-438、8A3-439、8A3-440、8A3-441)；将96孔板放置在4℃下孵育30mins，离心(1000rpm，2mins),去除液体后用PBS洗涤(200μL/次，2次)；每个孔中加入PE-anti-human-IgG-Fc-Secondary-Antibody(50μL，Jackson，1:200比例稀释)，在4℃下孵育30mins，离心(1000rpm，2mins),去除液体后用PBS洗涤(200μL/次，2次)，离心(1000rpm，2mins)，每个孔中加入PBS(200μL/孔)，重悬细胞后，用流式细胞仪读数。FACS-结合活性分析结果如图15及下表18所示：
表18、通过ELISA及FACS测得的人源化抗体(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-427、8A3-428、8A3-438、8A3-439、8A3-440和8A3-441)所对应的EC50值
从表18与图15可以看出，ELISA-结合活性分析显示人源化抗体(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-427、8A3-428、8A3-438、8A3-439、8A3-440或8A3-441)与Axl具有较强的结合活性。
实施例19人源化抗体(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-427、8A3-428、8A3-438、8A3-439、8A3-440或8A3-441)对GAS6与AXL结合的阻断活性测试
19.1ELISA-阻断活性分析
将GAS-HIS用包被液(取0.2mol/L Na2CO38ml，0.2mol/L NaHCO317ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6)稀释到4μg/mL，并以50μL/孔的量包被到酶标板孔中，在37℃下孵育2hrs，去除液体后用洗涤液(PBST，PBS稀释液中加入0.05％吐温-20)洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入200μL封闭液，并在4℃过夜，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)。将每种待测人源化抗体(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-427、8A3-428、8A3-438、8A3-439、8A3-440或8A3-441)(浓度分别为100μg/mL)采用梯度稀释法以5倍浓度稀释，得到7个梯度的(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-427、8A3-428、8A3-438、8A3-439、8A3-440或8A3-441)。在待测的每种人源化抗体对应的酶标板孔中加入AXL-mFc(25μL，4μg/mL)以及7个梯度对应浓度下的该人源化抗体(25μL)；在37℃下孵育120mins，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入Goat-anti-Mouse-IgG-Fc-Secondary-Antibody(Jackson，1:10000比例稀释)，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入显色液(50μL/孔)，在37℃下孵育15mins后，加入H2SO4水溶液(50μL/孔，2mol/L)终止反应，并在酶标仪上读取OD450值。ELISA-阻断活性分析结果如下表19与图16所示。
19.2FACS-阻断活性分析
将对数生长期的人胶质瘤细胞U251细胞(武汉尚恩生物，SNL-095)或人***细胞HELA(南京科佰生物)细胞消化后计数，重悬于96孔板(每孔加入3E5细胞)，并用PBS洗涤(两次)；将每种待测人源化抗体(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-427、8A3-428、8A3-438、8A3-439、8A3-440或8A3-441)(浓度分别为100μg/mL)采用梯度稀释法以5倍浓度稀释，得到7个梯度的(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-427、8A3-428、8A3-438、8A3-439、8A3-440或8A3-441)。在待测的每种人源化抗体对应的96孔板中加入GAS6-HIS(25μL，2μg/mL)以及7个梯度对应浓度下的该人源化抗体(25μL)；在4℃下孵育30mins，离心(1000rpm，2mins),去除孔板中的液体后用PBS洗涤(200μL/次，2次)。每个孔中加入6xHis-Monoclonal-Antibody FITC(50μL，Invitrogen，使用PBS按照1:100的比例稀释)，在4℃下孵育30mins，离心(1000rpm，2mins),去除液体后用PBS洗涤(200μL/次)，重复上述离心及洗涤操作2次。每个孔中加入PBS(200μL/孔)，重悬细胞后，用流式细胞仪读数。FACS-结合活性分析结果如下表19与图16所示：
表19通过ELISA及FACS测得的人源化抗体(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-427、8A3-428、8A3-438、8A3-439、8A3-440或8A3-441)所对应的IC50值
从表19与图16可以看出，在ELISA-阻断水平上，18G7-436、8A3-441、18G7-435、18G7-434、8A3-439对配体GAS6与AXL的结合具有较好的阻断活性；在FACS-阻断水平上，18G7-436、8A3-441、8A3-428、8A3-439、18G7-435对配体GAS6与AXL的结合具有较好的阻断活性。
实施例20人源化抗体(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-428、8A3-439和8A3-441)的亲和力测试
采用表面等离子体共振技术测定人源化抗体(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-428、8A3-439和8A3-441)的亲和力。测试条件如下：测试仪器：Biacore X100仪器(GEHealthcare)；温度：25℃；固体相：涂布有200RU的rhAxl-Fc蛋白密度(R&DSystems，产品目录号154-AL)的传感器芯片CM5；流速：30μL/min。将溶解于HBS-EP缓冲液(Biacore，产品目录号BR-1001-88)的不同浓度(0.3至218.7nM)的人源化抗体(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-428、8A3-439和8A3-441)在3分钟内注射到测试仪器中，然后用缓冲液解离5分钟。每测试完一个样品后用再生液(glycine 1.5思拓凡，BR100354)以50μL/min的流速洗涤60s。使用BIA评估软件和1:1拟合模型计算动力学结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)。按照公式：平衡解离常数(KD)＝解离速率常数(kd)/结合速率常数(ka)计算得到KD值。人源化抗体(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-428、8A3-439和8A3-441)的具体亲和力数据参见下表20和图17。
表20人源化抗体(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-428、8A3-439和8A3-441)的亲和力数据(ka、kd、KD)
抗体名称 ka(1/Ms) kd(1/Ms) KD(M)
18G7-434 1.1E+06 2.1E-0.4 2.0E-10
18G7-435 1.6E+06 2.1E-0.4 1.3E-10
18G7-436 4.3E+06 1.5E-0.4 3.6E-11
8A3-428 3.6E+06 3.9E-0.4 1.1E-10
8A3-439 3.3E+06 4.2E-0.4 1.3E-10
8A3-441 3.3E+06 4.5E-0.4 1.4E-10
实施例21人源化抗体(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-428、8A3-439和8A3-441)阻断配体诱导的Axl下游的信号传导
利用AKT信号通路检测试剂盒(THUNDERTM Phospho-AKT pan(S473)TR-FRET CellSignaling Assay Kit，Bioauxilium)测定AXL下游的AKT信号通路激活水平。
将生长至80％融合状态的星形胶质细胞系U251用PBS洗涤，加入胰蛋白酶/EDTA(0.25％，Sigma)后，离心后重悬于培养基(DMEM 10％FBS)中。将重悬于培养基(DMEM 10％FBS)中的细胞接种于96孔板中(2×104个/孔)，在37℃孵育6hrs，用PBS洗涤，放置于饥饿培养基(DMEM/1％FBS)中孵育6hrs；将装有细胞的96孔板分类设置阴性对照组、以及实验组，在阴性对照组的孔中、实验组的孔中对应加入浓度为2μg/mL的lgG1、人源化抗体(18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-428、8A3-439和8A3-441)；预孵育2hrs，然后加入Gas6-his刺激30mins，加入检测试剂盒中的裂解液(50μL/孔)，震荡(400rpm)30mins；将每孔移取的18μL混合液转到白底不透明板，随后加入Detection Buffer(6μL)，在常温避光条件下，反应1h，离心(1000rpm)2mins，使用TR-FRET酶标仪(PerkinElmer)检测。具体测试结果如图18所示。从图18可知，Axl特异性配体Gas6在U251细胞中诱导激活强的Axl信号传导(其使用下游的Ser473处的Akt磷酸化作为读数)，而人源化抗体18G7-434、18G7-435、18G7-436、8A3-428、8A3-439和8A3-441可使信号传导降低至信号激活前的水平，进一步地，18G7-435、8A3-441能够介导AKT磷酸化水平下调至低于未使用GAS6激活前的水平。
实施例22人源化抗体18G7-435和8A3-441促进靶蛋白AXL内吞
以碳酸氢钠水溶液(10mM，500μL，pH 8.5)作为交换缓冲液，将购得的二抗Goat-anti-human-IgG-Fc-Secondary-Antibody(100μg，Jackson)放置于超滤管中，在4℃离心(15000rpm，10mins)，以交换购得的二抗中的缓冲液。重复上述操作两次后浓缩得到浓缩后二抗。将pHAb Reative Dyes(250μg，Promega，-80℃存储)溶解于DMSO与水的混合液(VDMSO:V水＝1:1，25μL)中，得到pHAb的反应性染料母液(10mg/mL)。将上述浓缩后二抗与pHAb的反应性染料母液按照100μg:1.2μL的比例混合后，利用摇床在室温下结合60mins得到含有染料标记的二抗的混合液，测试该混合液中抗体浓度及二抗与染料的比例。将含有染料标记的二抗的混合液用脱盐柱(900g，使用前离心平衡2mins)纯化(操作为抗体-染料混合液滴在脱盐柱斜面中心，斜面朝外离心2mins)以除去未反应的染料，同时检测得到的染料标记的二抗中抗体的浓度以及二抗和染料的比例。
将U251细胞以3E5/孔的密度放置于96孔板(U底)中，离心(1000rpm)2mins后用PBS洗涤(两次)；将96孔板设置为空白对照组、阴性对照组、阳性对照组以及实验组，在0℃条件下(冰上操作)，在阴性对照组的孔和阳性对照组的孔中分别加入阴性参照抗体IgG1(浓度为20μg/mL)和阳性参照抗体10G5-hIgG1(浓度为20μg/mL)并分别采用梯度稀释法以5倍浓度稀释，分别得到7个梯度的阴性参照抗体IgG1和阳性参照抗体10G5-hIgG1，在实验组的孔中加入人源化抗体18G7-435或8A3-441(50μL，浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法以5倍浓度稀释，得到7个梯度的18G7-435或8A3-441，在4℃下孵育30mins，离心(1000rpm)2mins，去除液体后用PBS洗涤(200μL/次，2次)；每个孔中加入50μL染料标记的二抗。作为对照，另准备一块96孔板，重复上述操作。将两块96孔板分别在37℃和4℃孵育4hrs后用PBS洗涤(两次)后，用PBS(200μL)重悬，用流式细胞仪检测得到如图19所示的荧光值数据。从图19中可知人源化抗体18G7-435和8A3-441与阳性参照抗体10G5-hIgG1相比更能有效的促进靶蛋白AXL内吞。
实施例23人源化抗体18G7-435和8A3-441介导Axl膜蛋白水平实验
将U251细胞按照3E5/孔放置于96孔板(U底)中，离心(1000rpm)2mins；在96孔板上设置阴性对照组、阳性对照组以及实验组，在阴性对照组的孔中、阳性对照组的孔中和实验组的孔中对应加入50μL浓度为20μg/mL的lgG1、10G5-hlgG1、人源化抗体18G7-435或8A3-441，并采用梯度稀释法分别以5倍浓度稀释得到7个梯度的lgG1、7个梯度的10G5-hlgG1以及7个梯度的人源化抗体18G7-435或8A3-441，培养4hrs(每隔1h震荡一下细胞)，离心去除上清液，加入胰酶(50μL，0.25％)消化细胞30s，加入PBSA终止反应，离心(1000rpm)2mins后用PBS清洗两次；随后在96孔板的每个孔上加入人源化抗体18G7-435或8A3-441(20μg/mL)。
在4℃孵育30mins，离心(1000rpm)2mins，去除液体后用PBS洗涤(200μL/次，2次)；每个孔中加入第二抗体PE-anti-human-IgG-Fc-Secondary-Antibody(50μL/孔，Jackson，1:200稀释倍数)，在4℃孵育30mins，离心(1000rpm)2mins，去除液体后用PBS洗涤(200μL/次，2次)；每个孔加入缓冲液(PBS)，重悬细胞后，用流式细胞仪检测得到如图20的数据。从图20中可知人源化抗体18G7-435或8A3-441相较于阳性参照抗体10G5-hlgG1更好的介导了U251细胞上的AXL膜蛋白水平的下调。
实施例24人源化抗体18G7-435和8A3-441介导AXL总蛋白水平检测实验
通过蛋白质印迹分析检测经人源化抗体18G7-435或8A3-441处理的人胶质瘤细胞U251细胞(武汉尚恩生物，SNL-095)中AXL总蛋白的水平。
将U251细胞接种在6孔板中(2×105个/孔)，贴壁后，在6孔板上设置阴性对照组、阳性对照组以及实验组，在正常培养条件下(10％FBS)或饥饿培养条件下(1％FBS)，阴性对照组的孔中、阳性对照组的孔中和实验组的孔中对应加入浓度为1μg/mL的lgG1、10G5-hlgG1、人源化抗体18G7-435或8A3-441，反应24hrs后加入RIPA-裂解缓冲液(150μL，碧云天)，在0℃(在冰上)裂解30mins；每个孔中加入loadingbuffer(含还原剂β-巯基乙醇(LifeTechnologies))，在95℃煮10分钟使蛋白变性；以Tris-SDS作为电泳缓冲液，将变性后的蛋白进行电泳实验(将变性蛋白上样到10％的PAGE预制凝胶(Genscript)的孔中)，电泳试验结束后，使用具有20％甲醇的转移缓冲液，将蛋白质转移到PVDF膜上，然后使用5％脱脂奶在室温下封闭该PVDF膜1小时；加入Axl抗体(Abcam，ab130218，稀释比例1:600)，在4℃下孵育过夜，用TBST洗涤(3次，每次持续10mins)；在室温下，每个孔加入山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP-缀合的二级抗体(1:3000稀释倍数)，孵育1h，用T BST洗涤(3次，每次持续10mins)；在室温下，用ECL底物(生工，l115AA0118)反应1min。利用x射线摄影暗匣和医用X射线胶片(carestream)压片成像，再利用凝胶成像仪和ImageLab软件使印迹可视化。可视化结果如图21所示。从图21中可知，与阴性对照组IgG1处理的细胞相比，人源化抗体18G7-435或8A3-441处理的细胞中Axl蛋白显著降低，这表明人源化抗体18G7-435和8A3-441能够很高程度的诱导Axl受体的内化和细胞内降解。
实施例25人源化抗体18G7-435和8A3-441的肿瘤细胞增殖抑制实验
将对数生长期的细胞U251消化后接种于96孔板中(100μL，2000个/孔)，在DMEM完全培养基中培养过夜。用细胞完全培养基将lgG1及人源化抗体18G7-435或8A3-441分别稀释至2μg/mL、10μg/mL和50μg/mL。
去除96孔板中的培养基后，将96孔板设置为阴性对照组、阳性对照组和实验组，在阴性对照组的每个孔中分别加入浓度为2μg/mL、10μg/mL或50μg/mL的lgG1，在阳性对照组的每个孔中分别加入浓度为2μg/mL、10μg/mL或50μg/mL的10G5-hlgG1，在实验组的每个孔中分别加入浓度为2μg/mL、10μg/mL或50μg/mL的人源化抗体18G7-435或8A3-441。在浓度为5％的CO2氛围以及温度为37℃的条件下，在培养箱中培养24hrs后，去除96孔板中的培养基，每孔加入10％的CCK8溶液(100μL，依照CCK8试剂盒(DOJinDO Laboratories)的说明配制得到)，避光孵育2hrs后，用酶标仪读取的数值如图22所示。从图22中可知，相较于阳性参照抗体10G5-hlgG1，人源化抗体18G7-435和8A3-441对肿瘤细胞U251的增殖具有明显的抑制作用。
实施例26人源化抗体18G7-435和8A3-441对U251肿瘤细胞凋亡检测实验
利用Annexin V-FITC/7-AAD Apoptosis Detection Kit(义翘)检测人源化抗体18G7-435或8A3-441对U251肿瘤细胞的凋亡作用。
将U251细胞用0.25％的胰酶(gibco)消化后计数，用无血清培养基重悬，得到U251细胞密度为2E5/mL的混悬液。将所述混悬液接种至24孔板中(500μL/孔)。将96孔板设置为阴性对照组、阳性对照组和实验组，在阴性对照组的孔中加入浓度为5μg/mL的lgG1，在阳性对照组的孔中加入浓度为5μg/mL的10G5-hlgG1，在实验组的孔中加入浓度为5μg/mL的人源化抗体18G7-435或8A3-441，细胞培养箱中培养3天后收集阴性对照组的液体及实验组的液体分别放置在15mL离心管中，用PBS洗涤并将洗涤液对应收集于放置有阴性对照组的液体及实验组的液体的离心管中。在每个孔中加入胰酶(200uL)消化1min后，向阴性对照组和实验组的孔中分别加入对应离心管中的液体以终止消化。将每个孔中的液体分别转移至离心管中，离心(2000rpm，10mins，离心机为湘仪(Centrifuges-H2050R))，去除液体后用PBS洗涤(1ml/次，2次)，计数，每个孔加入1x Binding Buffer(100μL)重悬细胞。
加入5ul Annexin V-FITC及5ul 7-AAD，混匀后室温避光孵育15min，加入400uL 1×Binding Buffer(400μL)终止反应，用流式细胞仪(贝克曼，CytoFLEX A00-1-1102)进行测试，测试结果如图23所示。
从图23可知，相对于阴性对照组，经人源化抗体18G7-435或8A3-441处理过的U251细胞，活细胞比例下降约6％；同时人源化抗体18G7-435或8A3-441相较于阳性参照抗体10G5-hlgG1可以更加有效地促进肿瘤细胞U251的凋亡。
实施例27人源化抗体18G7-435和8A3-441对肿瘤细胞的迁移和侵袭实验
27.1细胞迁移能力的测试
将消化后的肺癌细胞株(A549)接种于6孔板(1x106个/孔)中，培养过夜，去除上清液后用PBS清洗(3次)，加入1％的血清培养基，加入浓度为2μg/mL的阴性参照抗体(lgG1)和实验组抗体(人源化抗体18G7-435和8A3-441)。然后将每个孔平行划3条线(用10μL枪头+直尺划线)并拍照(用显微镜拍照)，记录第0小时、第24小时、第48小时的细胞迁移情况。用ImageJ软件分析细胞迁移的距离，再利用Graphpad软件作图，结果如图24所示。从图24中可知，人源化抗体18G7-435和8A3-441处理细胞48小时后显著抑制了肿瘤细胞A549的迁移。
27.2细胞侵袭能力的测试
将基质胶(Sigma公司)与预冷的无血清和抗生素(双无)的培养基DMEM(gibco)按照体积比为1:3的比例(基质胶与培养基DMEM的总体积为30μL)铺在transwell小室(BIOFIL，直径12mm，孔径8μm，TCS003024)的上室面，注意操作过程中不能有气泡产生；将小室放置于24孔板中，在37℃下孵育30mins后，加入400μL的U251细胞悬液(用不含血清的DMEM培养基重悬细胞得到细胞密度为2.5×105个/mL的单细胞悬液)；加入阴性参照抗体(lgG1)、实验组抗体(人源化抗体18G7-435和8A3-441)。在下室即24孔板内加入600μL含20％FBS的培养基，在浓度为5％的CO2氛围以及温度为37℃的条件下，在培养箱中培养24hrs后，去除上室中的液体，并除去(用湿棉签擦拭)未穿过上室面的细胞，自然风干后，在培养箱内用乙醇固定细胞20mins。固定后的细胞先以苏木精染色20min，清水清洗一遍；再用伊红染色20min后清水清洗一遍。染色完毕后将小室自然风干，用手术刀片沿压痕将小室膜轻轻切下，置于载玻片上在显微镜下观察、计数。结果如图25所示。从图25中可知，人源化抗体18G7-435和8A3-441均显著抑制了U251细胞的侵袭能力。
实施例28嵌合抗体18G7-CHI、嵌合抗体8A3-CHI、人源化抗体18G7-435及人源化抗体8A3-441与鼠AXL的交叉反应
通过ELISA方法检测嵌合抗体18G7-CHI、嵌合抗体8A3-CHI、人源化抗体18G7-435及人源化抗体8A3-441与鼠Axl的交叉结合反应。
将鼠AXL(Sino Biological，50126-M08H)用包被液(取0.2mol/L Na2CO38ml，0.2mol/L NaHCO317ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6)稀释到2μg/mL，并以50μL/孔的量包被到酶标板孔中，在37℃下孵育2hrs，去除液体后用洗涤液(PBST，PBS稀释液中加入0.05％吐温-20)洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入200μL封闭液，并在4℃过夜，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)。在酶标板上设置空白对照组、阳性对照组以及实验组，在阳性对照组的孔中加入阳性参照抗体10G5-mIgG2a(50μL，浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法以5倍浓度稀释，得到7个梯度的10G5-mIgG2a，在实验组的孔中加入待测抗体(嵌合抗体18G7-CHI、嵌合抗体8A3-CHI、人源化抗体18G7-435或人源化抗体8A3-441)(50μL，浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法以5倍浓度稀释，得到7个梯度的待测抗体(嵌合抗体18G7-CHI、嵌合抗体8A3-CHI、人源化抗体18G7-435或人源化抗体8A3-441)，将酶标板放置在37℃下孵育60mins，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)。每个孔中加入第二抗体Goat-anti-human-IgG-Fc-Secondary-Antibody(Jackson，1:10000稀释)，在37℃下孵育60mins，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)。每个孔中加入显色液(50μL/孔)，在37℃下孵育15mins后，加入H2SO4水溶液(50μL/孔，2mol/L)终止反应，并在酶标仪上读取OD450值。测试结果如下图26所示。从图26中可知，嵌合抗体18G7-CHI及人源化抗体18G7-435与鼠Axl存在交叉反应。
实施例29嵌合抗体18G7-CHI、嵌合抗体8A3-CHI、人源化抗体18G7-435及人源化抗体8A3-441与食蟹猴AXL的交叉反应
通过ELISA方法检测嵌合抗体18G7-CHI、嵌合抗体8A3-CHI、人源化抗体18G7-435及人源化抗体8A3-441与灵长类动物食蟹猴Axl的交叉结合反应。
将食蟹猴AXL(Acro，AXL-C52H3)用包被液(取0.2mol/L Na2CO38ml，0.2mol/L NaHCO317ml混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6)稀释到4μg/mL，并以50μL/孔的量包被到酶标板孔中，在37℃下孵育2hrs，去除液体后用洗涤液(PBST，PBS稀释液中加入0.05％吐温-20)洗涤(200μL/次，5次)；每个孔中加入200μL封闭液，并在4℃过夜，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)。在酶标板上设置空白对照组、阳性对照组以及实验组，在阳性对照组的孔中加入阳性参照抗体10G5-hIgG1(50μL，浓度为20μg/mL)并采用梯度稀释法以5倍浓度稀释，得到7个梯度的10G5-hIgG1，在实验组的孔中加入待测抗体(嵌合抗体18G7-CHI、嵌合抗体8A3、人源化抗体18G7-435或人源化抗体8A3-441)(50μL，浓度为200μg/mL)并采用梯度稀释法以5倍浓度稀释，得到7个梯度的待测抗体(嵌合抗体18G7-CHI、嵌合抗体8A3、人源化抗体435或人源化抗体441)，将酶标板放置在37℃下孵育60mins，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)。每个孔中加入第二抗体Goat-anti-human-IgG-Fc-Secondary-Antibody(Jackson，1:10000稀释)，在37℃下孵育60m ins，去除液体后用洗涤液洗涤(200μL/次，5次)。每个孔中加入显色液(50μL/孔)，在37℃下孵育15mins后，加入H2SO4水溶液(50μL/孔，2mol/L)终止反应，并在酶标仪上读取OD450值。测试结果如下图27所示。从图27中可知，嵌合抗体18G7-CHI、嵌合抗体8A3-CHI、人源化抗体18G7-435及人源化抗体8A3-441与食蟹猴的Axl存在交叉反应。
应当理解，如果本发明引用了任何现有技术的出版物，应当理解：这种引用并不意味着在任何国家该出版物被承认为该领域公知知识的一部分。尽管为了清楚的理解，已经通过示例的方式详细描述了本发明，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，将做出某些改变和修改。因此，描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。应当理解，如果本发明引用了任何现有技术的出版物，应当理解：这种引用并不意味着在任何国家该出版物被承认为该领域公知知识的一部分。尽管为了清楚的理解，已经通过示例的方式详细描述了本发明，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，将做出某些改变和修改。因此，描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。

Claims (26)

1.一种Axl拮抗抗体或其抗原结合片段，其包含特异性结合AXL的可变区，所述可变区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，所述轻链可变区(VL)包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中：
所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3包含选自(i)、(ii)和(iii)中的一项或多项：(i)选自SEQID NO:1、2或3任一项所示的VH CDR1，(ii)选自SEQ ID NO:4、5或6任一项所示的VH CDR2，和(iii)选自SEQ ID NO:7或8任一项所示VH CDR3，和/或
所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含选自(iv)、(v)和(vi)中的一项或多项：(iv)SEQ IDNO:9或10所示的VL CDR1，(v)选自SEQ ID NO:11或12任一项所示的VL CDR2和(vi)选自SEQID NO:13或14任一项所示VL CDR3。
2.一种Axl拮抗抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中，
所述重链可变区(VH)包含如SEQ ID NO：52-60中任一项所示的氨基酸序列，或者与SEQID NO：52-60中任一项所示的氨基酸序列至少有80％序列同源性的氨基酸序列；和/或
所述轻链可变区(VL)包含如SEQ ID NO：61-66中任一项所示的氨基酸序列，或者与SEQID NO：61-66中任一项所示的氨基酸序列至少有80％序列同源性的氨基酸序列，
所述重链包含权利要求1-8中任一项所述的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，或包含权利要求9-42中任一项所述的重链可变区(VH)；
所述轻链包含权利要求1-8中任一项所述的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，或包含权利要求9-42中任一项所述的轻链可变区(VL)。
3.特异性结合AXL的抗体或其抗原结合片段，其包含重链框架区VH-FRs和轻链可变区框架区VL-FRs,其中，所述VH-FRs包含(i)-(iv)中的一项或多项:(i)选自SEQ ID NO:15、16、17、36和37、144和151任一项所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO:15、16、17、36和37任一项所示氨基酸序列的具有至少80％同源性的氨基酸序列的重链可变区框架区VH-FR1结构域(ii)选自SEQ ID NO:18、19、20、38、39和40任一项所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO:18、19、20、38、39和40、145和152任一项所示氨基酸序列的具有至少80％同源性的氨基酸序列的重链可变区框架区VH-FR2结构域，(iii)选自SEQ ID NO:21、22、23、24和25、41、42和43、146或153任一项所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO:21、22、23、24和25、41、42和43、146或153任一项所示氨基酸序列的具有至少80％同源性的氨基酸序列的重链可变区框架区VH-FR3结构域，或(iv)选自SEQ ID NO:26或27或147所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO:26、27或147任一项所示氨基酸序列的具有至少80％同源性的氨基酸序列的重链可变区框架区VH-FR4结构域；和/或，所述VL-FRs包含(v)-(viii)中的一项或多项:(v)选自SEQ ID NO:28、29、44或45、148或154任一项所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO:28、29、44或45、148或154任一项所示氨基酸序列的具有至少80％同源性的氨基酸序列的轻链可变区框架区VL-FR1结构域，(vi)选自SEQ ID NO:30、31、32、46、47和48任一项所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO:30、31、32、46、47和48、149或155任一项所示氨基酸序列的具有至少80％同源性的氨基酸序列的重链可变区框架区VL-FR2结构域，(vii)选自SEQ ID NO:33、34、49、50和51、150或156任一项所示氨基酸序列，或与SEQ ID NO:33、34、49、50和51、150或156一项所示氨基酸序列的具有至少80％同源性的氨基酸序列的重链可变区框架区VL-FR3结构域，和(viii)SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链可变区框架区VL-FR4结构域。
4.一种Axl拮抗抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段包含重链H和轻链L，
其中，所述轻链L包含：(i)SEQ ID NO:76、77、78、79、80或81任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:76、77、78、79、80或81任一项所示氨基酸序列的具有至少80％同源性的氨基酸序列；
和/或，所述重链H包含：(i)SEQ ID NO:67、68、69、70、71、72、73或74任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:76、77、78、79、80或81任一项所示氨基酸序列的具有至少80％同源性的氨基酸序列。
5.权利要求1-4任一项所述Axl拮抗抗体或抗原结合片段的变体，其中，所述变体包含一个或多个骨架区和/或一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸序列改变。
6.根据权利要求1-5任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，
所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv；和/或，
所述抗体选自下组中的任一项：单克隆抗体、单链抗体、鼠源抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、人源化抗体和全人源抗体、和异种缀合抗体；单可变结构域、结构域抗体、单链抗体、不含铰链区的单价抗体、微抗体、双抗体、三链抗体、κ(λ)抗体、BiTE、DVD-lg、SIP、SMIP或DART和TandabsTM；或优选地，所述抗体为完全人抗体；或更优选的，所述抗体是IgG1抗体。
7.根据权利要求1-6任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中：所述抗体为所述抗原结合片段为scFv抗体分子或单克隆抗体；或优选的，所述抗体为嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体；或优选地，所述抗体为完全人抗体；或更优选的，所述抗体是IgG1抗体。
8.权利要求1-7任一项5所述Axl拮抗抗体或其抗原结合片段的变体，其包含：
(i)在权利要求1-4任一项所述抗体中一个或多个框架区FRs或一个或多个CDR经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列；
(ii)和权利要求1-4任一项所述抗体中的氨基酸序列具有约至少80％同一性的氨基酸序列。
9.权利要求5-5任一项所述Axl拮抗抗体或其抗原结合片段的变体，其中，所述变体：(1)与权利要求1-8任一项所述的抗体的Axl结合结构域竞争结合Axl；(2)结合与权利要求1-8任一项所述的抗体相同的表位；(3)结合与权利要求1-8任一项所述的抗体结合的表位重叠的表位。
10.根据权利要求8或9所述的变体，其中，
其进一步包含：
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加；和
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换；
或优选地，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，更优选为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区，或进一步优选地，其是人IgG1或人IgG4重链恒定区；
或优选地，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区，或进一步优选地，其是人κ轻链恒定区。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或抗原结合片段或权利要求9或10所述的变体，其中，
其中所述抗体包括：(i)抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或一部分；(ii)全抗体；或(iii)抗原结合抗体片段。
12.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或抗原结合片段或权利要求9-11任一项的变体，其具有下述一项或多项功能：在结合细胞表面存在的人AXL的胞外域的Ig-like结构域、抑制和阻断AXL结合至Gas6、下调AXL受体的表达、增加AXL受体内化的速度、抑制AXL受体下游的信号传导和AKT的GAS6依赖性磷酸化、增加细胞死亡的速度和抑制肿瘤生长、抑制Axl自体磷酸化、减少纤维化标记物的表达，如减少α-SMA、Col1A1、MCP1和/或TGF-β的表达。
13.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或抗原结合片段或权利要求9-11任一项的变体，其中，所述抗体或抗原结合片段或变体具有如下所示的一个或多个特征：
以不大于5×10-11M的KD结合Axl，或以不大于1.5×10-11M的KD结合Axl；和/或
以不大于2×10-5s-1的k解离结合Axl，或以不大于3×10-6s-1的k解离结合Axl。
(1)以0.01nM～0.5nM的亲和常数KD(平衡解离常数)与人Axl结合；
(2)以0.0001μg/mL～0.1μg/mL的EC50与细胞上的人Axl结合；
(3)抑制Gas6与Axl的结合(例如人Axl)；
(4)下调Axl受体总蛋白水平程度至20％～80％，下调Axl受体膜蛋白水平程度至10％～90％；
(5)使Axl受体内化的速率增加1～15倍；
(6)使非小细胞肺癌以及胶质瘤中肿瘤细胞的凋亡率提高1～7倍；和/或
(7)抑制肿瘤细胞的增殖，肿瘤抑制率为20％～100％。
14.根据权利要求1-8任一项所述的抗体或权利要求9-13任一项的变体，其中所述Axl为灵长类AXL,或优选的，所述AXL为人Axl。
15.一种多聚核苷酸，其包含：(1)一个或多个编码选自权利要求1-8中任一项所述的Axl拮抗抗体或抗原结合片段或权利要求9-14任一项所述变体的核苷酸序列，(2)一个或多个编码(1)的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、或重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)中的任一项的核苷酸序列、(3)一个或多个编码(1)的重链(HC)、轻链(LC)、或重链(HC)和轻链(LC)的核苷酸序列。
16.一种表达载体，其包含权利要求15所述的多聚核苷酸。
17.一种抗体偶联药物，其中，所述的抗体偶联药物含有：
(a)权利要求1-8中任一项所述的Axl拮抗抗体或抗原结合片段或权利要求9-14任一项所述变体的核苷酸序列,，其任选地经由肽键或接头与效应分子缀合；
(b)与(a)所述抗体或其抗原结合片段或其变体偶联的效应分子，所述效应分子选自可检测标记、毒蛋白、化疗药物、小分子药物、核素，或其组合。
18.一种药物组合物，其中，所述组合物包含权利要求1-14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或权利要求14所述的抗体药物偶联物，以及至少一种药学上可接受的辅料。
19.权利要求1-8中任一项所述的Axl拮抗抗体或抗原结合片段或权利要求9-14任一项所述变体，其用作药物。
20.权利要求1-8中任一项所述的Axl拮抗抗体或抗原结合片段或权利要求9-14任一项所述变体，其用作治疗癌症、免疫病症、心血管病症、血栓形成、或糖尿病，和/或，其用于抑制细胞增殖、促进Axl下调、抑制转移、和/或抑制血管发生的药物。
21.权利要求1-8中任一项所述的Axl拮抗抗体或抗原结合片段或权利要求9-14任一项所述变体在制备预防或治疗的药物中的用途。
22.权利要求21所述的用途，，其中，该药物用于治疗癌症或肿瘤、免疫病症、心血管病症、血栓形成、或糖尿病，和/或，用于抑制细胞增殖、抑制血管发生、促进Axl下调、和/或抑制转移。
23.权利要求22所述的用途，，其中，其中，所述癌症或肿瘤是Axl介导的相关肿瘤或与Axl过表达相关的肿瘤；或优选的，，所述肿瘤选自乳腺癌、中枢神经***癌、子宫内膜癌、肾癌、大肠癌、肺癌、食道癌、舌癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、胃癌、间皮瘤、黑色素瘤、纤维肉瘤、膀胱癌、直肠癌、淋巴瘤、***、头颈癌、上呼吸消化道癌、结直肠癌、尿路癌或结肠癌；更优选地，每种癌症独立地选自腺癌、鳞状细胞癌、混合腺鳞癌、未分化癌；更优选地，所述卵巢癌包括高级别卵巢严重腺癌、卵巢粘液性囊腺癌或恶性卵巢布伦纳瘤；肾癌包括透明细胞肾细胞癌；舌癌包括舌鳞状细胞癌；肺癌包括肺腺癌、肺腺鳞癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、肺***状腺癌或非小细胞肺癌；胰腺癌包括胰腺腺癌或胰腺导管腺癌；食管癌包括食管鳞状细胞癌；间皮瘤包括双相间皮瘤；中枢神经***癌症包括神经胶质瘤、胶质母细胞瘤或多形性胶质母细胞瘤；胃癌包括胃腺癌；乳腺癌包括导管乳腺癌、乳腺癌或HR+乳腺癌；膀胱癌包括膀胱鳞状细胞癌；黑素瘤包括恶性黑素瘤；结肠癌包括结肠腺癌；头颈癌包括头颈小鳞状细胞癌。
24.一种治疗患有AXL异常高表达相关肿瘤或癌症的受试者的药盒套装，其使用包括可以治疗有效量给予该受试者的权利要求1-8中任一项所述的Axl拮抗抗体或抗原结合片段或权利要求9-14任一项所述变体、权利要求17所述的抗体药物偶联物、或权利要求18所述的药物组合物、权利要求18-20任一项所述的抗体或其抗原结合片段以预防或***；还包括包装插页；其中
在一些实施例中，所述肿瘤或癌症是Axl介导的相关肿瘤或癌症；
在一些实施例中，所述肿瘤或癌症是与Axl过表达相关的肿瘤；
在一些实施例中，所述肿瘤或癌症选自乳腺癌、中枢神经***癌、子宫内膜癌、肾癌、大肠癌、肺癌、食道癌、舌癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、胃癌、间皮瘤、黑色素瘤、纤维肉瘤、膀胱癌、直肠癌、淋巴瘤、***、头颈癌、上呼吸消化道癌、结直肠癌、尿路癌或结肠癌；更优选地，每种癌症独立地选自腺癌、鳞状细胞癌、混合腺鳞癌、未分化癌；更优选地，所述卵巢癌包括高级别卵巢严重腺癌、卵巢粘液性囊腺癌或恶性卵巢布伦纳瘤；肾癌包括透明细胞肾细胞癌；舌癌包括舌鳞状细胞癌；肺癌包括肺腺癌、肺腺鳞癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、肺***状腺癌或非小细胞肺癌；胰腺癌包括胰腺腺癌或胰腺导管腺癌；食管癌包括食管鳞状细胞癌；间皮瘤包括双相间皮瘤；中枢神经***癌症包括神经胶质瘤、胶质母细胞瘤或多形性胶质母细胞瘤；胃癌包括胃腺癌；乳腺癌包括导管乳腺癌、乳腺癌或HR+乳腺癌；膀胱癌包括膀胱鳞状细胞癌；黑素瘤包括恶性黑素瘤；结肠癌包括结肠腺癌；头颈癌包括头颈小鳞状细胞癌；
在一些实施例中，所述肿瘤或癌症选自乳腺癌、中枢神经***癌、子宫内膜癌、肾癌、大肠癌、肺癌、食道癌、舌癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、胃癌、间皮瘤、黑色素瘤、纤维肉瘤、膀胱癌、直肠癌、淋巴瘤、***、头颈癌、上呼吸消化道癌、结直肠癌、尿路癌或结肠癌；更优选地，每种癌症独立地选自腺癌、鳞状细胞癌、混合腺鳞癌、未分化癌；更优选地，所述卵巢癌包括高级别卵巢严重腺癌、卵巢粘液性囊腺癌或恶性卵巢布伦纳瘤；肾癌包括透明细胞肾细胞癌；舌癌包括舌鳞状细胞癌；肺癌包括肺腺癌、肺腺鳞癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、肺***状腺癌或非小细胞肺癌；胰腺癌包括胰腺腺癌或胰腺导管腺癌；食管癌包括食管鳞状细胞癌；间皮瘤包括双相间皮瘤；中枢神经***癌症包括神经胶质瘤、胶质母细胞瘤或多形性胶质母细胞瘤；胃癌包括胃腺癌；乳腺癌包括导管乳腺癌、乳腺癌或HR+乳腺癌；膀胱癌包括膀胱鳞状细胞癌；黑素瘤包括恶性黑素瘤；结肠癌包括结肠腺癌；头颈癌包括头颈小鳞状细胞癌。
25.在个体中抑制血管发生、抑制细胞增殖、促进Axl受体下调或抑制转移的药盒套装方法，包括可以有效量对该个体施用有效量的权利要求1-14任一项的抗体以抑制血管发生、抑制细胞增殖、促进Axl受体下调或抑制转移，或权利要求17的偶联物，或权利要求22的药物组合物，还包括提供使用方法的包装插页。
26.诊断试剂盒，其包含根据权利要求1至14任一项的抗原结合分子、抗原结合片段或变体，和允许测定所述组成部分与转移性癌细胞的结合的一种或多种试剂。
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