KR20230109119A - 줄기세포능을 증대시키기 위한 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

줄기세포능을 증대시키기 위한 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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KR20230109119A
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백아름
조성래
우진석
김리라
김대희
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주식회사 진켐
연세대학교 산학협력단
연세대학교 원주산학협력단
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Abstract

본 출원은 줄기세포의 줄기세포능을 증대시키는 시알릴올리고당 및 이의 용도에 관한 것으로서, 줄기세포의 줄기세포능을 증대시키기 위한 조성물, 시알릴올리고당을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 방법, 줄기세포의 줄기세포능을 증대시키는 방법, 상기 방법을 통해 수득한 줄기세포능이 증대된 줄기세포, 및 상기 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료용 조성물 등을 제공한다. 일 양상에 따른 조성물 또는 방법에 의하면, 줄기세포의 노화 억제되고, 줄기세포능을 유지하고 증대시킬 수 있다.

Description

줄기세포능을 증대시키기 위한 조성물 및 이의 용도{Compositions for enhancing stemness and uses thereof}
줄기세포능을 증대시키기 위한 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
세포 치료제로 활용하기 위하여 다양한 종류의 세포에 대한 연구 및 개발이 진행 중에 있으며, 상기 세포로는 분화적 위치에 따라 전분화능 줄기세포 (배아줄기세포, 유도만능줄기세포 등), 다분화능 줄기세포 또는 성체 줄기세포 (골수/지방 유래 줄기세포, 제대혈/탯줄 줄기세포, 태아 줄기세포 등), 그리고 체세포 등이 이용되고 있다. 이들 중에서도 인간 배아 줄기세포는 인간 생명체로 발생할 수 있는 배아로부터 만들어지기 때문에 많은 윤리적인 문제점이 있으며, 전분화능 줄기세포는 이의 분화 조절 기술이 아직 완전하지 못하여 세포 치료제로 개발되기까지에는 많은 시간이 더 소요될 것으로 알려져 있다. 또한, 체세포를 이용한 세포 치료제의 연구 개발이 많은 결실을 보여주긴 하였으나, 체세포가 태생적으로 지니고 있는 낮은 증식성과 원료 조직 확보의 어려움 등으로 인해 실용화에는 어려움이 있다. 따라서, 이러한 문제점들을 극복하기 위한 대안으로서 성체 줄기세포의 연구에 많은 관심이 집중되고 있다.
성체 줄기세포 중에서도 중간엽 줄기세포는 체세포에 비해 증식능이 우수하며 뼈, 연골, 지방 등으로 분화할 수 있는 다분화성 줄기세포로서, 배아줄기세포 등의 만능줄기세포에 비해 훨씬 유전적으로 안정화되어 있어 연골재생, 심근경색 치료, 이식편대숙주질환의 치료 등을 위한 세포 치료제로 개발되어 왔다. 중간엽 줄기세포가 체세포에 비해 높은 자가재생산 능력을 보이는 것은 사실이나, 체내에 있을 때와는 달리, 체외 배양 조건에서는 세포의 증식성을 유지하기 위한 최선의 조건을 구비하여야 하며, 생체의 조건에 가까운 영양분, pH, 온도, 삼투압 등의 환경 조건을 맞추어 주어야 하는 어려움이 있다. 특히, 체외 배양시 활성산소종 및 산화적 스트레스에 의해 노화가 유발되어 자가 증식 및 다분화능이 손실되는 문제가 있다. 이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제1980562호에서는 줄기세포능 향상을 위한 성분으로서 옥살산염을 개시하고 있다. 그러나, 이러한 노력에도 불구하고, 줄기세포능이 체외 배양시에도 유지되고 증대된 줄기세포를 제조할 수 있는 기술에 대한 수요가 여전히 존재하는 실정이다.
한편, 시알릴올리고당(sialyloligosaccharides)은 모유에 포함되어 있는 대표적인 HMO 성분으로서, 뇌 구성물의 핵심성분으로 유아의 뇌 기능 발달에 중요한 역할을 하고, 장 기능 개선을 위한 프리바이오틱 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 시알릴올리고당을 줄기세포의 배양 또는 줄기세포능 증대를 위해 사용하는 기술에 대해 전혀 알려진 바 없다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 줄기세포의 줄기세포능을 증대시킬 수 있는 기술을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 시알릴올리고당과 줄기세포의 줄기세포능간 유의적인 관련성을 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.
일 양상은 시알릴올리고당을 포함하는 줄기세포의 줄기세포능 증대용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 시알릴올리고당을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포를 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 시알릴올리고당을 줄기세포에 첨가하는 단계를 포함하는 줄기세포의 줄기세포능을 증대시키는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 줄기세포를 배양하는 방법을 통해 수득한 줄기세포능이 증대된 줄기세포를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 줄기세포능이 증대된 줄기세포 및 이의 희석액을 유효성분으로 포함하는 세포 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 시알릴올리고당을 포함하는 간 오가노이드 배양용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 발명자들은　줄기세포능을 유지하고, 줄기세포의 노화를 억제함으로써 세포 치료제로 적합한　줄기세포의 특성을 최대화하기 위해 예의 노력한 결과,　줄기세포에 시알릴올리고당을　처리함으로써　줄기세포의 노화가 억제되고, 줄기세포성 인자의 발현이 증가되고, 줄기세포의 세포 증식능이 증가되어, 줄기세포능이 유의적으로 증대되는 것을 확인하였으며, 이 뿐만 아니라, 간 오가노이드에 시알릴올리고당을　처리함으로써 증식 및/또는 성숙도를 증진시킬 수 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 시알릴올리고당(sialyloligosaccharides)을 포함하는 줄기세포의 줄기세포능 증대용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "줄기세포 (stem cell)"는 아직 분화되지 않은 미분화 세포로서, 자가 복제(self-renewability)를 통한 무한 증식(infinite proliferation)이 가능하고, 세포가 위치하는 환경의 영향을 받아 필요에 따라 적절한 신호가 주어질 경우 다양한 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전분화/다분화 능력(Pluri-potency 또는 Multi-potency)을 보유한 만능세포를 지칭한다.
상기 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 제한되지 않는다.
상기 줄기세포는 유도만능 줄기세포, 배아 줄기세포, 성체 줄기세포를 포함하며, 구체적으로는, 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포 (mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 성체 줄기세포는 제대, 제대혈, 활막, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로부터 유래된 줄기세포일 수 있으나, 이 역시 이에 제한되지 않는다. 일 구체예에 따르면, 상기 줄기세포는 인간 골수로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "유도만능 줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cells)"는 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서 역분화줄기세포라고도 한다. 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함한다. 유도만능 줄기세포는 배아 줄기세포와 거의 같은 특정을 가지며, 구체적으로는 비슷한 세포 모양을 보여주며, 유전자, 단백질 발현 패턴이 유사하며, 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 전분화능을 가지며, 테라토마(teratoma)를 형성하고, 마우스의 배반포(blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라(chimera) 마우스를 형성하고, 유전자의 생식선 전이(germline transmission)가 가능하다. 상기 유도만능 줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스, 토끼 등의 모든 유래의 유도만능 줄기세포를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "배아 줄기세포(Embryonic stem cell)"는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내부세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아 줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid bodies)도 포함할 수 있다. 상기 배아 줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스, 토끼 등의 모든 유래의 배아 줄기세포를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "성체 줄기세포(Adult stem cell)"는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은　성체 단계에서 나타나는　줄기세포를 지칭한다.　성체　줄기세포는 그 분화능이 일반적으로 특정 조직을 구성하는 세포로만 한정될 수 있고, 이러한　성체 줄기세포는 성인이 된 후에도 대부분의 장기에 남아 정상적으로 혹은 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하는 역할을 담당한다. 이는 조직 내 존재하는　줄기세포를 분리해 체외에서 배양한 것으로 다능성 (multipotency)을 가지는 세포를 의미할 수 있다. 상기 성체 줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스, 토끼 등의 모든 유래의 성체 줄기세포를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중간엽 줄기세포"는 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 줄기세포로서, 다양한 조직에서 유래할 수 있다. 특히, 제대 유래 중간엽 줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포, 근육 유래 중간엽 줄기세포, 신경 유래 중간엽 줄기세포, 피부 유래 중간엽 줄기세포, 양막 유래 중간엽 줄기세포 및 태반 유래 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 각 조직에서 줄기세포를 분리하는 기술은 당해 업계에 이미 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "시알릴올리고당(sialyloligosaccharides)"은 적어도 하나의 시알산(sialic acid) 모이어티를 포함한 올리고당을 지칭하며, 상기 올리고당(oligosaccharides)은 글루코스(glucose), 프럭토스(fructose), 갈락토스(galactose)와 같은 당이 2개 내지 8개 정도 결합한 당으로, 수용성의 결정성 물질이다. 상기 시알릴올리고당은 예를 들어, 3'-시알릴락토스(3'-sialyllactose), 6'-시알릴락토스(6'-sialyllactose), 3'-시알릴락토사민(3'-sialyllactosamine), 6'-시알릴락토사민(6'-sialyllactosamine), 3'-시알릴-3-푸코실락토스(3'-sialyl-3-fucosyllactose), 시알릴락토-N-테트라오스(sialyllacto-N-tetraose), 디시알릴락토스(disialyllactose) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있고, 예를 들어, 상기 시알릴올리고당은 미국 식품의약국(FDA)의 GRAS(Generally Recognized As Safe) 승인을 받은 안전한 물질인 3'-시알릴락토스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 조성물은 인간 모유에 포함되어 있는 올리고당, 즉, HMO (Human Milk Oligosaccharide)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 인간 모유 유래 올리고당은 예를 들어, 락토-N-테트라오스(lacto-N-tetraose), 2'-푸코실락토스(2'-fucosyllactose), 3-푸코실락토스(3-fucosyllactose), 락토-N-네오테트라오스(lacto-N-neotetraose), LS-테트라사카라이드 b(LS-Tetrasaccharide b), LS-테트라사카라이드 c(LS-Tetrasaccharide c), 디시알릴락토-N-테트라오스(Disialyllacto-N-tetraose), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 시알릴올리고당은 항균 및 항바이러스 기능이 뛰어난 면역 활성 물질로 알려져 있으나, 줄기세포의 배양, 구체적으로는 줄기세포능 유지 및 증대와 관련하여서는 그 기능 및 활성이 전혀 알려진 바 없다. 일 구체예에 따르면, 시알릴올리고당, 예를 들어, 시알릴락토스는 줄기세포의 줄기세포능과 밀접한 관련성이 있음을 규명하였다. 구체적으로, 시알릴락토스가 처리된 중간엽 줄기세포는 SOX2, OCT4, NANOG 등과 같은 줄기세포성 인자의 발현을 증가시키고, 세포 노화를 억제시키며, 세포 증식능을 증가시킴을 확인하였다. 따라서, 시알릴올리고당은 줄기세포의 줄기세포능을 유지 또는 증대시키기 위한 유효물질로 사용될 수 있다.
상기 시알릴올리고당은 줄기세포의 줄기세포능을 증대시키기는 목적에 부합하는 한, 목적하는 구체적인 세포의 종류에 따라 적절한 농도로 포함될 수 있다. 상기 시알릴올리고당은 예를 들어, 0.1 μM 내지 400 μM, 예를 들어, 0.1μM 내지 350 μM, 예를 들어, 0.1 μM 내지 200 μM, 예를 들어, 0.1 μM 내지 150 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 400 μM, 예를 들어, 1μM 내지 350 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 300 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 250 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 200 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 150 μM, 예를 들어, 10 μM 내지 250 μM, 예를 들어, 30 μM 내지 250 μM, 예를 들어, 50 μM 내지 250 μM, 예를 들어, 50 μM 내지 200 μM, 예를 들어, 50 μM 내지 150 μM로 포함될 수 있다. 상기 농도 범위를 초과하거나 그 미만인 경우, 생체 내 부작용을 수반하거나 줄기세포능 유지 또는 증대 효능이 발휘되지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "줄기세포능(stemness)"은 배아 줄기세포와 같이 모든 세포를 생성할 수 있는 능력이 있는 다능성(Pluripotency)과, 자기와 닮은 세포들을 무한정 만들어 낼 수 있는 자기생산능(self-renewal)을 총칭하는 의미로 당업계에서 통용되는 용어이다. 즉, 줄기세포능은 줄기세포의 특성을 유지하는 능력을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "줄기세포능 증대"는 줄기세포의 세포 노화를 억제시키거나, 줄기세포의 세포 증식능을 증가시키거나, 줄기세포의 기능성을 증가시키거나 줄기세포의 텔로머라제 활성을 증가시키거나, 줄기세포성 인자의 발현을 증가시키거나, 미분화 세포를 미분화 상태를 유지하면서 증식시키거나, 줄기세포에서 단백질 항상성을 증가시키거나, 또는 세포 이동 활성을 증가시키는 특징이 나타나는 것을 포함할 수 있다.
상기 용어, "줄기세포성 인자"는 줄기세포에서 많이 발현하고, 줄기세포의 전분화능, 즉 줄기세포의 특성을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 유전자로서, 예를 들어, SOX2, OCT4, NANOG, KLF4, C-MYC, Oct3/4, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA1-60, TRA1-81, Lin28, Fbx15　등이 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 상기 줄기세포성 인자 중 적어도 하나의 발현이 관찰되는 경우에는 미분화 줄기세포라고 판단할 수 있고, 이들의 발현이 많을수록 줄기세포의 전분화능이 높은 것으로 판단할 수 있다.
상기 용어, "기능성을 증가"는 기능적 성숙을 의미하며, 줄기세포에서 발현하고 줄기세포의 성숙된 기능적 특성을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 유전자로서, 예를 들어 CYP3A4, CYP3A7, ALB, AFP, TTR, CK19 등이 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 따라서 상기 줄기세포의 기능성을 증가시키는 인자 중 적어도 하나의 발현이 관찰되는 경우에는 줄기세포의 기능성을 증가시킬 수 있다고 판단할 수 있고, 이들의 발현이 많을수록 줄기세포의 기능성 증가능이 높은 것으로 판단할 수 있다.
상기 용어, "증식(proliferation)"은 세포 수의 증가를 의미하는 것으로 성장(growth)과 동일한 의미로 사용될 수 있다. 특히, 상기 용어, "미분화 증식(undifferentiated proliferation)"은 줄기세포가 특정 세포로 분화되지 않은 채 원래의 세포와 동일한 성질을 가지는 즉, 다능성(용어 "전분화능"과 혼용될 수 있음)을 가지는 세포로 증식하는 것을 의미한다. 상기 조성물은 줄기세포의 줄기세포능을 증대시키기 위하여, 시알릴올리고당을 포함하는 배지 조성물 형태로 제공될 수 있다. 상기 시알릴올리고당은 본 명세서에 개시된 줄기세포능 증대와 관련된 효과 달성을 위해 줄기세포 배양에 사용되는 통상의 배지에 첨가되어 사용될 수 있다. 일 구체예에 따르면, 줄기세포 배양 배지에 시알릴올리고당을 첨가하면 줄기세포의 노화가 억제되고, 세포 증식능이 향상되고, 줄기세포능이 유의적으로 증대됨을 확인하였다.
상기 배지 조성물은 셀레늄(selenium), 아스코르브산, 비타민 E, 카테킨, 라이코펜, 베타카로틴, 코엔자임 Q-10 (CoQ-10), 레스베라톨 (resveratrol), T-BHQ, oltipraz, 오리나무 추출물, EPA(eicosapentaenoic acid), DHA(docosahexaenoic acid), 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항산화제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 시알릴올리고당 및 상기 항산화제를 함유하는 배지 조성물에서 배양된 줄기세포는 형태나 활성의 변화 없이 세포의 증식능이 우수하게 나타날 수 있다.
상기 배지 조성물에 포함되는 시알릴올리고당; 또는 시알릴올리고당과 셀레늄, 아스코르브산, 비타민 E, 카테킨, 라이코펜, 베타카로틴, 코엔자임 Q-10, 레스베라톨, T-BHQ, oltipraz, 오리나무 추출물, EPA, DHA, 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항산화제는 당업계에서 줄기세포 배양에 적합하다고 알려져 있는 간단한 조성을 가지는 통상적인 배지(basal medium)와 함께 함유될 수 있다. 일반적으로 배양에 이용되는 기본 배지로는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 80% knockout DMEM, MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax Medium, 및 Chang's Medium MesemCult-XF Medium으로 구성된 군으로부터 선택되는 기본 배지일 수 있으며, 이 외에도 당업계에서 줄기세포의 배양에 이용되는 배지라면 비제한적으로 이용될 수 있다.
상기 배지 조성물은 NAC(N-acetyl-L-cysteine), 인슐린 또는 인슐린 유사인자, 하이드로코르티손, 덱사메타손, bFGF(basic fibroblast growth factor), 헤파란 황산(heparan sulfate), 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol), EGF(epidermal growth factor), B-27, 액티빈 A, BMP-4, OSM(oncostatin M), HGF(hepatocyte growth factor) 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 인슐린을 대체하는 성분으로 인슐린 유사인자를 함유할 수 있는데, 이는 포도당 대사와 단백질 대사를 향상시켜 세포성장을 촉진하는 역할을 한다. 특히 재조합 IGF-1(Insulin-like growth factor-1)을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 인슐린 유사인자의 바람직한 함량은 10 내지 50 ng/ml이며, 이의 성분이 10ng/ml 미만일 경우에는 세포자살(Apoptosis)을 초래하며, 50 ng/ml을 초과할 경우에는 세포독성 및 비용 증가의 문제점이 있을 수 있다. 또한, 예를 들어, 섬유아세포 증식인자(bFGF)를 함유할 수 있는데, 이는　in vivo　상태에서 다양한 형태의 세포증식을 야기할 수 있으며, 바람직하게는 재조합 단백질을 사용할 수 있다. 섬유아세포 증식인자의 바람직한 함량은 1 내지 100 ng/ml일 수 있다. 또한, 예를 들어, FBS(fetal bovine serum), 칼슘 및 EGF으로 구성된 군에서 선택되는 성분을 추가로 함유할 수 있는데, 상피세포 성장인자(EGF: Epidermal growth factor)는 바람직하기로는 재조합 단백질을 사용할 수 있고, 상피세포 성장인자의 바람직한 함량은 10 내지 50 ng/ml이며, 이의 함량이 10 ng/ml 미만이면 특별한 효과가 없으며, 50ng/ml을 초과하면 세포에 독성을 가질 수 있다.
상기 조성물은 병변 부위에 국소적으로 투여되는 것일 수 있다. 상기 조성물은 병변 부위에 국소적으로 투여되어, 병변 부위 또는 그 주변에 존재하는 줄기세포의 줄기세포능 및 세포 증식능을 현저히 증대시킬 수 있다. 또한, 상기 조성물은 체외에서 배양된 줄기세포와 함께 병용 투여될 수 있다. 예를 들어,　상기 조성물은 국소 투여를 위해, 바이오 폴리머 등의 유기물, 히드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 폴리머 또는 코폴리머, 폴리에틸렌글리콜 폴리머 또는 코폴리머 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시킬 수 있다.
상기 조성물은 주사제 형태로 제공되는 것일 수 있다. 상기 주사제 형태의 조성물은 정맥내　주사, 근육내　주사, 복강내　주사, 피하　주사　등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 국소적으로 투여하기에 용이하도록 주사제 형태로 제공되는 것일 수 있다. 상기 주사제 형태의 조성물에 유효성분으로 포함되는 시알릴올리고당은 약학적으로 허용되는 수용액 중에 용해되어 있거나 또는 용액 상태에서 동결될 수 있다.
상기 주사제 형태를 위한 무균 조성물은　주사용 증류수와 같은 비히클을 이용하여 통상의 제제 실시에 따라 처방될 수 있다.　주사용의 수용액으로서는, 예를 들어 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약(예를 들어, D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화 나트륨)을 포함하는 등장액을 들 수 있다. 적절한 용해 보조제로서는, 예를 들어 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80(TM), HCO-50 등)가 병용될 수 있다. 유성액으로서는 참기름, 대두유를 들 수 있고, 용해 보조제로서 벤조산 벤질 및/또는 벤질알코올도 병용될 수 있다. 또한, 완충제(예를 들어, 인산염 완충액 및 아세트산 나트륨 완충액), 무통화제(예를 들어, 염산 프로카인), 안정제(예를 들어, 벤질알코올 및 페놀), 산화 방지제와 배합될 수 있다. 조제된　주사액은 통상적으로 적절한 앰플에 충전될 수 있다.
다른 양상은 시알릴올리고당을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포를 배양하는 방법을 제공한다.
상기 줄기세포를 배양하는 방법에 있어서, "시알릴올리고당", 및 "줄기세포" 등에 대해서는 상기 언급한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "배지(media)"는 체외배양 조건에서 줄기세포의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배양액를 의미하고, 세포 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함할 수 있다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 세포 배양 최소 배지(CCMM: cell culture minimum medium)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.
상기 세포 배양 최소 배지는 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamycin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.
상기 배지는 시알릴올리고당을 유효 농도로 포함할 수 있다. 상기 용어, "유효 농도"는 줄기세포의 줄기세포능 증대에 충분한 양의 시알릴올리고당을 의미하며, 유효 농도 이하에서는 활성을 나타내지 않고, 유효 농도 이상에서는 세포에 독성을 나타낼 수 있으므로, 유효 농도 내에서 시알릴올리고당을 사용하도록 할 수 있다. 상기 시알릴올리고당은 예를 들어, 0.1 μM 내지 400 μM, 예를 들어, 0.1 μM 내지 350 μM, 예를 들어, 0.1 μM 내지 300 μM, 예를 들어, 0.1 μM 내지 250 μM, 예를 들어, 0.1 μM 내지 200 μM, 예를 들어, 0.1 μM 내지 150 μM, 1 μM 내지 400 μM, 예를 들어, 1μM 내지 350 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 300 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 250 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 400 μM, 예를 들어, 1μM 내지 350 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 300 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 250 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 200 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 150 μM, 예를 들어, 10 μM 내지 250 μM, 예를 들어, 30 μM 내지 250 μM, 예를 들어, 50 μM 내지 250 μM, 예를 들어, 50 μM 내지 200 μM, 예를 들어, 50 μM 내지 150 μM로 포함될 수 있다. 상기 농도 범위 이하에서는 줄기세포 유지 또는 증대 효능을 나타내지 않을 수 있다.
또한, 상기 배지는 인간 모유 유래 올리고당을 추가로 포함할 수 있다. 상기 인간 모유 유래 올리고당은 예를 들어, 락토-N-테트라오스, 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 락토-N-네오테트라오스, LS-테트라사카라이드 b, LS-테트라사카라이드 c, 디시알릴락토-N-테트라오스, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법은 줄기세포를 계대 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 줄기세포를 미분화 상태로 유지시킬 수 있으며, 구체적으로는, 계대 배양하는 동안 또는 그 이후에도 줄기세포를 미분화 상태로 유지시킬 수 있다. 상기 방법은 예를 들어, 3 내지 10 이상 계대 배양 후에도 줄기세포능을 유지할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "계대 배양"은 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양배지를 갈아주면서 세포의 대(代)를 계속 이어서 배양하는 방법을 의미한다. 상기 용어, "계대(passage)"는 배양 용기에서 초기 종배양부터 동일한 배양 용기에 세포가 왕성하게 자라는 시기(confluence)까지의 다능성 줄기세포로의 성장을 의미한다. 한정된 공간을 가진 배양용기 내에서 세포의 수가 늘어나면서 일정시간이 지나면 증식 영양분이 소비되거나 오염 물질이 쌓여 세포가 자연히 죽게 되므로, 건강한 세포의 수를 늘리기 위한 방법으로 사용되며, 통상적으로 한 차례 배지 (배양용기)를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대 (1 passage)라고 한다. 계대 배양의 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 기계적 분리 또는 효소적 분리로 수행될 수 있다.
줄기세포는 배양을 거듭하거나, 외부로부터 자극을 받을수록 세포의 형태나 크기 등이 미세하게 변형되거나 달라지며, 세포의 재생능과 활성(telomerase activity)이 낮아진다는 문제점, 즉 세포 노화가 진행된다는 문제점이 있다. 세포의 재생능과 활성 등의 특징은 세포를 어떤 배지에서 배양하는지에 따라 차이가 있으므로, 거듭되는 배양에도 불구하고 형태 등의 세포 특성에 큰 변화없이 재생능이나 활성도가 낮아지지 않도록 하는 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 것이 중요하다. 즉, 세포의 노화를 지연 또는 개선시키거나 초기 세포상태를 유지시키는 배지 조성물에서 줄기 세포를 배양하는 것이 중요하다. 그러나, 종래의 배지 조성물에서의 줄기세포 배양에 의하면, 높은 수율의 줄기세포를 얻기 위하여 계대 배양을 여러 차례 수행하여야 하므로 인력 및 시간이 많이 소요되며, 특히 계대 배양에 필요한 배지 성분 중 일부는 대단히 고가여서 경제적으로도 장점이 존재하지 않았다. 또한, 거듭되는 계대 배양에 의하여 세포의 재생능이 낮아진다는 문제점이 있었다. 상기 배지 조성물은 세포의 형태나 활성에 변화가 없으면서 세포의 재생능을 향상시킬 수 있는 배지 조성물을 제공하는 것이 가능하다. 따라서, 줄기세포능 유지 및 증대를 위해 시알릴올리고당을 유효성분으로 포함하는 배지 조성물을 제공한다.
상기 줄기세포의 미분화 상태의 유지는 ALP(alkaline phosphatase), OCT-4, SOX2, hTERT(human telomerase reverse transcriptase), TDGF(teratocarcinoma-derived growth factor), 또는 SSEA-4 등과 같은 유전자의 발현이 증가되는 것으로 확인할 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 따르면, 계대 배양 이후 시알릴락토스를 처리하지 않은 중간엽 줄기세포의 경우, 세포 노화 인자인 p16 및 p53의 발현이 증가하여 노화가 진행됨을 확인하였으나, 시알릴락토스를 처리한 중간엽 줄기세포의 경우, p16 및 p53의 발현이 유의적으로 감소되어 세포 노화가 억제됨을 확인하였다.
또한, 일 구체예에 따르면, 계대배양 이후 시알릴락토스를 처리하지 않은 중간엽 줄기세포의 경우, 세포 노화 표지인 SA-β-gal의 활성이 증가하여 세포 노화가 진행됨을 확인하였으나, 시알릴락토스를 처리한 중간엽 줄기세포의 경우, SA-β-gal의 활성이 유의적으로 감소되어 세포 노화가 억제됨을 확인하였다.
상기 줄기세포를 배양하는 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 줄기세포능 증대용 조성물에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
또 다른 양상은 시알릴올리고당을 줄기세포에 첨가하는 단계를 포함하는 줄기세포의 줄기세포능을 증대시키는 방법을 제공한다.
상기 줄기세포의 줄기세포능을 증대시키는 방법에 있어서, "시알릴올리고당", 및 "줄기세포" 등에 대해서는 상기 언급한 바와 같다.
상기 시알릴올리고당을 줄기세포에 첨가하는 단계는 체외(ex vivo) 또는 시험관 내(in vitro)에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 시알릴올리고당을 줄기세포에 첨가하는 단계는 배지에서 배양되는 줄기세포에 시알릴올리고당을 첨가하는 것을 의미할 수 있다.
상기 시알릴올리고당을 줄기세포에 첨가하는 단계는 일반 혈청 배지에서 수행되거나, 혈청 배지에서 계대 배양된 줄기세포를 무혈청 배지로 옮긴 후 수행되는 것일 수 있다. 무혈청 배지 중에서의 배양은 혈청 배지에서의 배양액을 제거하고, 세포를 인산염 완충용액으로 세척한 후에 수행될 수 있다.
상기 방법은 인간 모유 유래 올리고당을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 인간 모유 유래 올리고당을 첨가하는 단계는 상기 시알릴올리고당을 첨가하는 단계와 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 수행될 수 있고, 상기 인간 모유 유래 올리고당은 예를 들어, 락토-N-테트라오스, 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 락토-N-네오테트라오스, LS-테트라사카라이드 b, LS-테트라사카라이드 c, 디시알릴락토-N-테트라오스, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어, "무혈청 배지"는 동물의 조직이나 세포의 배양을 위해 혈청을 함유하지 않은 배양액과 배지를 의미한다. 예를 들어, 무혈청 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM(Endothelial differentiation medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, a-MEM(a-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 또는 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등일 수 있다.
상기 용어, "혈청"은 혈액이 완전 응고된 후 혈액으로부터 유리된 투명한 상층액을 의미한다. 또한, 동물세포의 배양에는 합성 배지에 혈청을 필수적으로 첨가해야 하며, 소나 말, 사람의 혈청을 사용하는데 소의 혈청이 가장 일반적이다. 채혈시기에 따라 소 태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 신생아 소혈청(newborn bovine serum), 송아지 혈청(calf serum), 어미소혈청(bovine serum) 등과 구별할 수 있다. 예를 들어, 소 태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 또는 송아지 혈청(bovine calf serum, BCS) 등일 수 있다.
상기 줄기세포의 줄기세포능을 증대시키는 방법에 의하면, 시알릴올리고당의 처리에 따라 줄기세포의 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 상에서 줄기세포의 노화가 억제되고, 세포 증식능이 유의적으로 증가시키고, 즉, 줄기세포능이 유의적으로 증대됨으로써 세포 치료제의 적합한 줄기세포의 특성을 가진 줄기세포를 제공할 수 있다.
상기 줄기세포능을 증대시키는 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 줄기세포능 증대용 조성물 또는 줄기세포의 배양 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물 또는 배양 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
또 다른 양상은 상기 줄기세포능을 증대시키는 방법을 통해 수득한 줄기세포능이 증대된 줄기세포를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 줄기세포능이 증대된 줄기세포 또는 이의 희석액을 포함하는 세포 치료제 조성물을 제공한다.
상기 시알릴올리고당을 줄기세포에 처리함에 따라, 줄기세포의 줄기세포능을 증대시킬 수 있다. 따라서, 시알릴올리고당을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포능을 증대시키는 방법을 통해 수득한 줄기세포는 줄기세포능이 유의적으로 증대됨으로써, 줄기세포를 이식에 적합한 상태로 활성화시키거나, 이의 특성을 인체에 적합하게 변형시키는 등, 세포 치료제의 유효 성분으로 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "세포 치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로부터 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 또는 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포 치료제는 세포의 분화 정도에 따라 크게 체세포 치료제, 및 줄기세포 치료제로 분류될 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 세포 치료제 조성물은 시알릴올리고당이 처리된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 치료제일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "줄기세포 치료제"는 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 세포를 체외에서 조작하여 이를 다시 인체 내로 주입하는 세포 치료제의 한 종류로, 불특정 다수를 대상으로 질병의 증상을 완화시키는데 목적을 둔 기존의 일반 의약품과는 달리, 조작 및 배양한 줄기세포를 환자에게 주입하여 질환을 근본적으로 치료하는 맞춤형 바이오 의약품을 지칭한다. 상기 줄기세포 치료제는 세포의 기원에 따라 배아의 초기 발달 단계에서 만들어 지는 배아 줄기세포 치료제, 성인의 다양한 조직에 제한적으로 존재하는 성체 줄기세포 치료제, 일반 체세포를 역분화시켜 초기 미분화 상태로 유도한 역분화줄기세포 치료제, 또는 배아 줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포에 유래되는 오가노이드 기반 세포치료제 등으로 구분되며, 치료 방법에 따라 환자 자신의 줄기세포를 이식하는 자가줄기세포 치료제, 타인의 줄기세포를 이식하는 동종유래줄기세포 치료제, 동물의 줄기세포를 이용하는 이종줄기세포 치료제 등으로 분류될 수 있다. 상기 줄기세포 치료제는 환자에게 직접 세포를 주입하여 손상된 세포의 기능이나 조직을 회복시킬 수 있으므로 인체 내 독성이 없고 인체 본래의 기능을 재생 및 유지시킴으로써 수술이나 약물요법이 할 수 없는 근원적인 치료 방법을 제시할 수 있다. 상기 줄기세포 치료제는 손상된 조직 및 세포의 재생 및 복구(Regeneration and Rejuvenation), 대체(Replacement), 회복(Repair)의 3R 전략을 통해 뇌경색, 심근경색, 퇴행성 관절염 및 골절 등의 다양한 세포손상질환 치료에 활용될 수 있다.
상기 줄기세포능이 증대된 줄기세포는 세포를 보호 및 유지하고, 목적하는 조직에 주사, 주입, 이식시 사용에 용이하도록 하는 하나 이상의 희석제를 포함하는 세포 조성물의 형태가 바람직할 수 있다. 상기 희석제는 생리식염수, PBS(Phosphate Buffered Saline), HBSS(Hank's balanced salt solution) 등의 완충용액, 혈장 또는 혈액성분 등이 있을 수 있다.
상기 세포 치료제 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예를 들어, 임상 투여시에 근육 또는 정맥 주사제와 같은 형태의 비경구 투여뿐만 아니라 직접 질환 부위에 투여될 수 있고, 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육 등의 경로로 투여될 수 있다.
상기 세포 치료제 조성물의 투여 용량은 개체의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 사람의 경우　세포 치료제의 통상적인 투여량은 104～1010　cells/body일 수 있고, 바람직하게는 106～108　cells/body, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다.
　상기 세포 치료제 조성물은 신경계 질환, 근육계 질환, 골 질환 또는 상피 관련 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다. 상기 신경계 질환은 퇴행성 신경계 질환을 포함할 수 있으며, 예를 들어 파킨슨병, 치매, 알츠하이머 병, 헌팅턴병, 근위축성 축삭경화증, 뇌졸중, 기억력 저하, 중증근무력증, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이소체 질환 및 픽병을 포함하는 다양한 신경계 질환이 포함될 수 있다. 상기 근육계 질환은 근위축증, 뇌성마비, 진행성골화성섬유이형성증, 피부근염, 구획증후군, 중증근무력증, 루게릭병, 미토콘드리아 근병증, 횡문근융해증, 다발성근염, 섬유근통, 근긴장증, 알코올성 간염, 비알코올성 지방간, 간염, 간경변 및 근막동통증후군 등이 포함될 수 있다. 상기 골 질환은 골다공증(osteoporosis),　골연화증(osteomalacia),　골감소증(osteopenia),　골위축(bone atrophy),　골관절염(osteoarthritis), 무혈성대퇴골괴사(Avascular necrosis of the Femoral Head) 또는 치주염(periodontal disease) 등이 포함될 수 있다. 상기 상피 관련 질환은 난치성 각막 질환 등이 포함될 수 있다. 상기 세포 치료제 조성물은 상기 질환 외에도　줄기세포의 이식을 통해 치료가 가능한 질환이라면 모두 적용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "치료"는 질환과 관련된 임상적 상황을 억제하거나 완화하거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 또한 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존율과 비교하여 증가된 생존을 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함할 수 있다.
상기 세포 치료제 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하여 제제화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 상기 세포 치료제 조성물이 적용될 수 있는 약학적 조성물에 대해 약학적으로 허용 가능한 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.　
상기 세포 치료제 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다. 세포 치료제 조성물은 질병부위로 이동을 유도할 수 있다면 어떠한 경로를 통해서든지 투여 가능하다. 경우에 따라서는　줄기세포를 병변으로 향하게 하는 수단을 구비한 비히클에 로딩하는 방안을 고려할 수도 있다. 따라서, 상기 세포 치료제 조성물은 국소 (협측, 설하, 피부 및 안내 투여를 포함), 비경구 (피하, 피내, 근육내, 점적, 정맥 내, 동맥 내, 관절 내 및 뇌척수액 내를 포함) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 통해 투여할 수 있으며, 바람직하게는 발병부위에 직접 투여할 수 있다.
일 양태로서,　줄기세포는 적합한 희석제에 약 현탁시켜 개체에 투여할 수 있는데, 이 희석제는 세포를 보호 및 유지하고, 목적하는 조직에 주입 시 사용에 용이하도록 하는 용도로 사용될 수 있다. 상기 희석제로는 생리식염수, 인산완충용액, HBSS 등의 완충용액, 뇌척수액 등이 있을 수 있다. 또한, 세포 치료제 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있도록 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 주사제일 수 있다. 주사제는 생리식염액, 링겔액, Hank 용액 또는 멸균된 수용액 등의 수성용제, 올리브 오일 등의 식물유, 에틸올레인산 등의 고급 지방산 에스테르 및 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 글리세린 등의 비수성용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 점막 투과를 위해, 통과할 배리어에 적합한 당업계에 공지된 비침투성제가 사용될 수 있으며, 변질방지를 위한 안정화제로 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등과, 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등의 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 등의 약학적 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 상기 세포 치료제 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 세포 치료제 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 세포 치료제 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "유효량"은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다. 상기 세포 치료제 조성물의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한　인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사　인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직할 수 있다.
상기 줄기세포 또는 이를 포함하는 세포 치료제 조성물에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 줄기세포능 증대용 조성물 또는 줄기세포의 배양 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물 또는 배양 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
또 다른 양상은 시알릴올리고당을 포함하는 간 오가노이드 배양용 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 시알릴올리고당을 간 오가노이드에 첨가하는 단계를 포함하는, 성숙된 간 오가노이드를 제조하는 방법/간 오가노이드의 성숙도를 증진시키는 방법을 제공한다.
상기 간 오가노이드 배양용 조성물 또는 성숙된 간 오가노이드를 제조하는 방법/간 오가노이드의 성숙도를 증진시키는 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 줄기세포능 증대용 조성물 또는 줄기세포의 배양 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물 또는 배양 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 구체예에 따르면, 제조된 간 오가노이드의 배양 과정에서 시알릴올리고당를 처리한 경우, 간 오가노이드의 증식이 유의적으로 증가되고, CYP3A4/CYP3A7 비율 및 ALB/AFP 비율이 증가됨으로써 간 오가노이드의 성숙도에도 영향을 미침을 확인하였다.
상기 용어 "오가노이드(Organoid)"는 줄기세포나 장기 기원 세포로부터 분리한 세포를 3D 배양법으로 다시 응집, 재조합하여 만들어진 세포집합체를 의미하는 것으로, 서스펜션 세포 배양물로부터 형성된　오가노이드　또는 세포 클러스터를 포함할 수 있다. 상기　오가노이드는 소형 유사 장기, 장기 유사체, 유사 장기로도 명명될 수 있다. 상기　오가노이드는 구체적으로 기관 또는 조직을 구성하는 여러 종류의 세포들 중 하나 이상의 세포 종류를 포함하며, 조직 또는 기관의 형태와 기능을 재현할 수 있어야 한다.
상기 용어 "오가노이드　배양"은　오가노이드를 생성하거나 유지시킬 수 있는 모든 행위를 포함한다. 예를 들면 줄기세포 또는 특정 조직으로부터 분리된 세포가 특정 기능을 갖는 조직이나 기관 세포로 분화시키는 것일 수 있으며, 및/또는　오가노이드를 생존, 성장 또는 증식시키는 것일 수 있다.
상기 조성물이 사용될 수 있는　오가노이드는 유도만능 줄기세포, 배아 줄기세포, 성체 줄기세포로부터 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게, 상기 오가노이드는 유도만능 줄기세포 또는 성체 줄기세포로부터 유래한 간 오가노이드일 수 있다.
상기 시알릴올리고당은 간 오가노이드를 배양 또는 성숙도를 증대시키기는 목적에 부합하는 한, 적절한 농도로 포함될 수 있다. 상기 시알릴올리고당은 예를 들어, 0.1 μM 내지 400 μM, 예를 들어, 0.1 μM 내지 350 μM, 예를 들어, 0.1 μM 내지 300 μM, 예를 들어, 0.1 μM 내지 250 μM, 예를 들어, 0.1 μM 내지 200 μM, 예를 들어, 0.1 μM 내지 150 μM, 1 μM 내지 400 μM, 예를 들어, 1μM 내지 350 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 300 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 250 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 400 μM, 예를 들어, 1μM 내지 350 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 300 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 250 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 200 μM, 예를 들어, 1 μM 내지 150 μM, 예를 들어, 10 μM 내지 250 μM, 예를 들어, 30 μM 내지 250 μM, 예를 들어, 50 μM 내지 250 μM, 예를 들어, 50 μM 내지 200 μM, 예를 들어, 50 μM 내지 150 μM로 포함될 수 있다.
일 양상에 따른 조성물 또는 방법에 의하면, 줄기세포성 인자의 발현을 유의적으로 증가시키고, 줄기세포의 노화를 억제하고, 줄기세포의 세포 증식능 또는 줄기세포의 세포 기능성을 유의적으로 증가시킬 수 있다.
일 양상에 따른 조성물 또는 방법은 종래 줄기세포의 체외 배양시 지적되었던 자가 증식능 및 다분화능이 손실되는 문제를 해소할 수 있고, 줄기세포능이 증대된 줄기세포를 이용함으로써 세포 치료제의 치료 효율을 향상시킬 수 있다.
일 양상에 따른 조성물 및 방법에 의한 줄기세포는 줄기세포능이 유의적으로 증대되어 세포 치료제의 유효성분으로 포함될 수 있다.
일 양상에 따른 세포 치료제 조성물은 줄기세포능이 유의적으로 증대된 줄기세포를 포함함으로써, 세포 치료제의 효율을 증대시킬 수 있다.
도 1은 시알릴락토스의 처리 농도에 따른 골수 유래 중간엽 줄기세포의 생존율에 미치는 영향을 CCK-8 assay를 통해 확인한 결과로서, 도 1의 A는 3'-시알릴락토스를 처리한 결과이고, 도 1의 B는 6'-시알릴락토스를 처리한 결과이고, 도 1의 C는 3'-시알릴락토스 및 6'-시알릴락토스 혼합물을 처리한 결과이다.
도 2는 시알릴락토스의 처리 농도에 따른 지방 유래 중간엽 줄기세포의 생존율에 미치는 영향을 CCK-8 assay를 통해 확인한 결과로서, 도 2의 A는 3'-시알릴락토스를 처리한 결과이고, 도 2의 B는 6'-시알릴락토스를 처리한 결과이고, 도 2의 C는 3'-시알릴락토스 및 6'-시알릴락토스 혼합물을 처리한 결과이다.
도 3은 시알릴락토스의 처리 농도에 따른 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 생존율에 미치는 영향을 CCK-8 assay를 통해 확인한 결과로서, 도 3의 A는 3'-시알릴락토스를 처리한 결과이고, 도 3의 B는 6'-시알릴락토스를 처리한 결과이고, 도 3의 C는 3'-시알릴락토스 및 6'-시알릴락토스 혼합물을 처리한 결과이다.
도 4는 시알릴락토스가 골수 유래 중간엽 줄기세포의 줄기세포능에 미치는 영향을 확인한 결과로서, 도 4의 A는 OCT4의 mRNA 수준을 확인한 결과이고, 도 4의 B는 SOX2의 mRNA 수준을 확인한 결과이고, 도 4의 C는 NANOG의 mRNA 수준을 확인한 결과이고, 도 4의 D는 OCT4, SOX2 및 NANOG의 단백질 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 5는 시알릴락토스가 지방 유래 중간엽 줄기세포의 줄기세포능에 미치는 영향을 확인한 결과로서, 도 5의 A는 OCT4의 mRNA 수준을 확인한 결과이고, 도 5의 B는 SOX2의 mRNA 수준을 확인한 결과이고, 도 5의 C는 NANOG의 mRNA 수준을 확인한 결과이고, 도 5의 D는 OCT4, SOX2 및 NANOG의 단백질 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 6은 시알릴락토스가 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 줄기세포능에 미치는 영향을 확인한 결과로서, 도 6의 A는 OCT4의 mRNA 수준을 확인한 결과이고, 도 6의 B는 SOX2의 mRNA 수준을 확인한 결과이고, 도 6의 C는 NANOG의 mRNA 수준을 확인한 결과이고, 도 6의 D는 OCT4, SOX2 및 NANOG의 단백질 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 7은 3'-시알릴락토스가 골수 유래 중간엽 줄기세포의 노화에 미치는 영향을 확인한 결과로서, 도 7의 A는 세포 노화 인자인 p16 및 p53의 mRNA 수준에서의 발현 변화를 확인한 결과이고, 도 7의 B는 p16 및 p53의 단백질 수준에서의 발현 변화를 확인한 결과이고, 도 7의 C는 SA-β-gal를 이용한 세포 노화 분석 결과이다.
도 8은 3'-시알릴락토스가 골수 유래 중간엽 줄기세포의 증식에 미치는 영향을 확인한 결과로서, 세포 주기 진행 및 증식과 관여하는 유전자인 CCNA2 및 CDK2의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 9는 3'-시알릴락토스가 골수 유래 줄기세포의 계대별 생존율에 미치는 영향을 CCK-8 assay를 통해 확인한 결과이다.
도 10은 시알릴락토스가 유도만능 줄기세포 유래 간 오가노이드 세포의 생존율에 미치는 영향을 확인한 결과로서, 생존율을 CCK-8 assay로 확인한 결과이다.
도 11은 시알릴락토스가 유도만능 줄기세포 유래 간 오가노이드 세포의 성숙도에 미치는 영향을 확인한 결과로서, CYP3A4와 CYP3A7의 발현량의 비율을 비교한 결과이다.
도 12는 시알릴락토스가 유도만능 줄기세포 유래 간 오가노이드 세포의 성숙도에 미치는 영향을 확인한 결과로서, ALB와 AFP의 발현량의 비율을 비교한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 줄기세포 배양
본 실시예에서는 골수 유래 중간엽 줄기세포(hBMSCs), 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포(hATMSCs) 및 제대혈 유래 중간엽(hCBMSC) 및 유도만능 줄기세포 유래 간 오가노이드를 실험에 사용하였다. 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포 및 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 배양 배지는 10% 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum, T&I, Gangwon, Korea), 1% 항생제 (페니실린/스트렙토마이신, Gibco, GrandIsland, NY, USA)를 포함한 DMEM 로우 글루코스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM Low Glucose, Hyclone, Logan, UT, USA)를 사용하였다. 한편, 100 μM의 3'-시알릴락토스(3'-sialyllactose, GeneChem), 6'-시알릴락토스(6'-sialyllactose, GeneChem) 및 3'-시알릴락토스와 6'-시알릴락토스의 mixture를 처리한 후, 3일에 한번씩 배양액을 교체하였다. 대조군은 3차 증류수를 배양액에 넣은 후 동일하게 실험을 진행하였다. 또한, 간 오가노이드 배양 배지는 endothelial cell growth medium-2(Lonza), 2.5% FBS, 100nM dexamethasone(Sigma-Aldrich), 20ng/ml OSM(R&D system), 10ng/ml HGF(PeproTech)을 포함한 Hepatocyte Culture Medium(Lonza)를 사용하였으며, 3일에 한번씩 배양액을 교체하였다.
실시예 2. 시알릴올리고당 처리에 따른 줄기세포의 세포 생존율 확인
본 실시예에서는 시알릴올리고당이 줄기세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 계대 배양된 줄기세포에 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 및 이들의 조합을 각각 0, 50, 100, 200, 또는 400 μM 농도로 처리하고, CCK-8 분석(Cell counting Kit-8 assay)를 통해 농도별 세포 생존율을 확인하였다. 구체적으로, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포, 인간 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 이후, 0, 50, 100, 200, 또는 400 μM 농도로 3'-시알릴락토스(GeneChem), 6'-시알릴락토스(GeneChem) 및 3'-시알릴락토스와 6'-시알릴락토스의 혼합물을 소태아혈청(T&I)이 없는 1% 항생제 (Gibco)를 포함한 DMEM 로우 글루코스 배지(Hyclone)에 처리하여 배양하였다. 이후, 배양된 세포의 생존율을 CCK-8(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) 분석을 통해 확인하였다.
도 1 내지 도 3은 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 3'-시알릴락토스와 6'-시알릴락토스의 혼합물을 농도별로 골수 유래 중간엽 줄기세포(도 1), 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포(도 2) 및 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(도 3)에 처리한 후, 각 줄기세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 그 결과, 모든 농도에 있어 세포 생존율에 부정적인 영향을 미치지는 않았으나, 시알릴락토스를 100 μM 농도로 처리한 경우에 세포 생존율이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 따라서, 이후 실험에서는 시알릴락토스를 100 μM 농도로 처리하여 실험을 진행하였다.
실시예 3. 시알릴올리고당 처리에 따른 줄기세포능 증가 확인
본 실시예에서는 시알릴올리고당이 줄기세포의 줄기세포능에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 중간엽 줄기세포에 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 및 이들의 조합을 각각 처리한 후, 상기 중간엽 줄세포의 줄기세포능 표지자인 OCT4, SOX2 및 NANOG의 mRNA 및 단백질 수준에서의 발현 변화를 각각 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR: quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction) 및 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1의 방법으로 세포 배양하여 수집한 세포로부터 총 RNA를 분리하고, Bioneer(Daejeon, Korea)에서 구입한 OCT4 프라이머, SOX2 프라이머(Bioneer, P200205) 및 NANOG 프라이머를 이용한 qRT-PCR을 통해 분리된 총 RNA의 mRNA 발현 변화를 확인하였다. 사용된 OCT4 및 NANOG 프라이머의 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
프라이머명 프라이머 서열(5'->3') 서열번호
OCT4 forward GCAAGCCCTCATTTCACCA 1
OCT4 reverse GCCCATCACCTCCACCAC 2
NANOG forward TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT 3
NANOG reverse AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG 4
도 4 내지 도 6은 시알릴락토스가 줄기세포의 줄기세포능에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 그 결과, 시알릴락토스 없이 배양된 줄기세포와 비교하여, 3'-시알릴락토스, 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 3'-시알릴락토스와 6'-시알릴락토스의 혼합물을 처리하여 배양된 골수 유래 중간엽 줄기세포(도 4), 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포(도 5) 및 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(도 6)는 줄기세포능을 확인할 수 있는 마커 유전자들인 OCT4, SOX2 및 NANOG의 mRNA 및 단백질 수준에서 발현이 모두 유의적으로 증가함을 확인하였다.
상기 실험 결과로부터 줄기세포의 배양 전, 배양 중, 또는 배양 후 과정에서 시알릴올리고당의 처리는 줄기세포의 줄기세포능을 유의적으로 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 3'-sialyllactose 처리에 따른 줄기세포의 노화 감소 확인
본 실시예에서는 시알릴올리고당이 줄기세포의 노화에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 골수 유래 중간엽 줄기세포에 3'-시알릴락토스를 처리하고, 계대배양 후의 세포 노화 인자인 p16 및 p53의 mRNA 및 단백질 수준에서의 발현 변화를 각각 qRT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1의 방법으로 세포 배양하여 수집한 세포로부터 총 RNA를 분리하고, Bioneer (Daejeon, Korea)에서 검증한 p16 프라이머(Bioneer, P260189) 및 p53 프라이머(Bioneer, P250999)를 이용한 qRT-PCR을 통해 분리된 총 RNA의 mRNA 발현 변화를 확인하였다.
도 7은 3'-시알릴락토스가 줄기세포의 노화에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 그 결과, 3'-시알릴락토스가 처리되지 않고 계대배양된 골수 유래 중간엽 줄기세포는 노화가 진행될수록 p16 및 p53의 mRNA 및 단백질 수준에서의 발현 증가하지만, 3'-시알릴락토스를 처리하여 계대배양된 줄기세포는 p16 및 p53의 mRNA 및 단백질 수준에서 매우 낮은 발현을 나타내어, p16 및 p53의 발현이 감소함을 확인하였다.
또한, 3'-시알릴락토스(GeneChem) 처리한 후의 줄기세포의 노화 정도를 확인하기 위해 100 μM의 3'-시알릴락토스를 처리한 10 계대의 골수 유래 중간엽 줄기세포(hBMSCs)에서 노화-관련 베타-갈락토시다아제 염색법을 수행하였다. 구체적으로, 세포를 포르말린에 고정시킨 후 PBS로 세척하고 베타-갈락토시다아제 염색 용액(β-gal staining solution,1 mg/mL X-Gal, 40 mM 시트르산-인산나트륨 완충액, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM 페로시안화 칼륨, 및 5 mM 페리시안화칼륨; pH 6.0; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)을 첨가하여 37℃에서 반응시켰다. 이후, Eclipse TS100; Nikon USA, Melville, NY, USA을 이용하여, 노화된 세포 (푸른색, 양성), 및 노화의 활성이 나타나지 않은 세포(음성)의 노화 활성 정도를 확인하였다.
SA-β-gal을 이용한 세포 노화 분석 결과, 3'-시알릴락토스 처리되지 않고 계대배양된 골수 유래 중간엽 줄기세포는 노화가 진행될수록 SA-β-gal의 활성이 증가하지만, 3'-시알릴락토스를 처리하여 계대배양된 줄기세포는 SA-β-gal의 낮은 활성을 나타내어, SA-β-gal의 활성이 감소함을 확인하였다.
상기 실험 결과로부터 줄기세포의 배양 전, 배양 중, 또는 배양 후 과정에서 시알릴올리고당의 처리는 줄기세포의 노화를 유의적으로 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 3'-sialyllactose 처리에 따른 줄기세포의 증식 증가 확인
본 실시예에서는 시알릴올리고당이 줄기세포의 증식에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 낮은 증식능을 가진 골수 유래 중간엽 줄기세포에 3'-시알릴락토스를 처리하고 세포 주기 진행 및 증식과 관여하는 유전자인 사이클린 A2 (CCNA2: cyclin A2) 및 사이클린-의존적 키나아제 2(CDK2: cyclin-dependent kinase 2)의 발현 변화를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1의 방법으로 세포 배양하여 수집한 세포로부터 총 RNA를 분리하고, Bioneer (Daejeon, Korea)에서 검증한 CCNA 프라이머(Bioneer, P212796) 및 CDK2 프라이머(Bioneer, P136765)를 이용한 qRT-PCR을 통해 분리된 총 RNA의 mRNA 발현 변화를 확인하였다.
도 8은 3'-시알릴락토스가 골수 유래 중간엽 줄기세포의 증식에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 그 결과, 3'-시알릴락토스가 처리되지 않은 줄기세포는 노화가 진행될수록 CCNA2 및 CDK2의 발현이 감소하지만, 3'-시알릴락토스가 처리된 줄기세포는 CCNA2 및 CDK2의 발현이 유의적으로 증가함을 확인하였다.
상기 실험 결과로부터, 줄기세포의 배양 전, 배양 중, 또는 배양 후 과정에서 시알릴올리고당의 처리는 줄기세포의 증식을 유의적으로 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 3'-sialyllactose 처리에 따른 계대수별 줄기세포의 생존율 증가 확인
본 실시예에서는 시알릴올리고당이 줄기세포의 세포 계대배양에 따른 생존율에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 4, 7, 10 및 12 계대 배양된 골수 유래 중간엽 줄기세포에 3'-시알릴락토스를 100μM 농도로 처리하고, CCK-8 분석(Cell counting Kit-8 assay)을 통해 세포 생존율을 확인하였다. 구체적으로, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 이후, 100μM 농도로 3'-시알릴락토스(GeneChem)를 소태아혈청(T&I)이 없는 1% 항생제 (Gibco)를 포함한 DMEM 로우 글루코스 배지(Hyclone)에 처리하여 배양하였다. 배양된 세포의 생존율을 CCK-8 분석을 통해 확인하였다.
도 9는 3'-시알릴락토스가 계대에 따른 줄기세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 그 결과, 3'-시알릴락토스를 처리하여 줄기세포를 배양한 경우에 세포 생존율이 유의적으로 증가함을 확인하였다.
상기 실험 결과로부터, 줄기세포의 지속적인 계대배양에 따라 자가 증식력이 저하되나, 시알릴올리고당의 처리는 계대배양에 따른 증식능 저하를 유의적으로 억제시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 7. sialyllactose 처리에 따른 오가노이드 생존율 증가 확인
본 실시예에서는 시알릴올리고당이 유도만능 줄기세포 유래 간 오가노이드의 생존율에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 간 오가노이드를 계대배양 후, hepatic medium(HM)에서 하루 동안 안정화시키고 3'-시알릴락토스 및 6'-시알릴락토스를 0, 0.1, 1, 10, 100 μM 농도로 6일간 처리한 후, 이로부터 7일째에 CCK분석을 통해 세포 생존율을 확인하였다.
도 10은 시알릴락토스가 유도 만능 줄기세포 유래 간 오가노이드의 세포 생존율에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 그 결과, 3'-시알릴락토스를 10, 100, 100 μM 농도, 6'-시알랄락토스를 0.1, 1, 10, 100 μM 농도로 처리한 경우, 간 오가노이드 내 세포 생존율이 유의적으로 증가함을 확인하였다.
상기 실험 결과로부터, 유도 만능 줄기세포 유래 간 오가노이드의 배양 과정에서 시알릴올리고당의 처리는 간 오가노이드의 증식을 유의적으로 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 8. sialyllactose 처리에 따른 오가노이드 성숙도 증가 확인
본 실시예에서는 시알릴올리고당이 유도만능 줄기세포 유래 간 오가노이드의 성숙도에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 간 오가노이드를 계대배양 후, hepatic medium(HM)에서 하루 동안 안정화시키고 3'-시알릴락토스 및 6'-시알릴락토스를 0, 0.1, 1, 10, 100μM 농도로 6일간 처리한 후, 이로부터 7일째에 간 오가노이드에서 총 RNA를 분리하고 대사 성숙도 표지자인 CYP3A4, CYP2A7, ALB, AFP의 mRNA 수준에서의 발현 변화를 각각 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR: quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)으로 측정하고 그 발현 비율을 비교해서 대사 성숙도를 확인하였다.
도 11 및 도 12는 시알릴락토스가 유도 만능 줄기세포 유래 간 오가노이드의 세포 성숙도에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 그 결과, 3'-시알릴락토스를 1, 10μM 농도로 처리한 경우 CYP3A4/CYP3A7의 비율, 3'-시알릴락토스를 10, 100, 100 μM 농도로 처리한 경우 ALB/AFP의 비율을 유의적으로 증가함을 확인하였고 6'-시알랄락토스는 0.1, 100μM 농도로 처리한 경우에 ALB/AFP의 비율을 유의적으로 증가함을 확인하였다.
상기 실험 결과로부터, 유도 만능 줄기세포 유래 간 오가노이드의 배양 과정에서 시알릴올리고당의 처리는 간 오가노이드의 대사 성숙도를 유의적으로 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (24)

  1. 시알릴올리고당(sialyloligosaccharides)을 포함하는 줄기세포의 줄기세포능 증대용 조성물로서,
    상기 시알릴올리고당은 3'-시알릴락토스(3'-sialyllactose), 6'-시알릴락토스(6'-sialyllactose), 3'-시알릴락토사민(3'-sialyllactosamine), 6'-시알릴락토사민(6'-sialyllactosamine), 3'-시알릴-3-푸코실락토스(3'-sialyl-3-fucosyllactose), 시알릴락토-N-테트라오스(sialyllacto-N-tetraose), 디시알릴락토스(disialyllactose) 또는 이들의 조합을 포함하는 것이며,
    상기 줄기세포능 증대는 줄기세포의 노화를 억제시키는 것, 줄기세포성 인자의 발현을 증가시키는 것, 및 미분화 상태를 유지하면서 줄기세포를 증식시키는 것으로부터 선택되는 적어도 어느 하나 이상인 것인, 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 인간 모유 유래 올리고당(Human milk oligosaccharide)을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 인간 모유 유래 올리고당은 락토-N-테트라오스, 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 락토-N-네오테트라오스, LS-테트라사카라이드 b, LS-테트라사카라이드 c, 디시알릴락토-N-테트라오스, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 유도만능 줄기세포, 배아 줄기세포, 또는 성체 줄기세포인 것인, 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 제대, 제대혈, 활막, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군으로부터 선택되는 조직으로부터 유래된 줄기세포인 것인, 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 자가, 동종, 또는 이종 유래인 것인, 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 0.1 μM 내지 400 μM 농도의 시알릴올리고당을 포함하는 것인, 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 배지 조성물 형태로 제공되는 것인 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 80% knockout DMEM, MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, Chang's Medium, 및 MesenCult-XF Medium으로 구성된 군으로부터 선택되는 기본 배지인 것인, 조성물.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 배지는 셀레늄(selenium), 아스코르브산, 비타민 E, 카테킨, 라이코펜, 베타카로틴, 코엔자임 Q-10 (CoQ-10), 레스베라톨 (resveratrol), T-BHQ, oltipraz, 오리나무 추출물, EPA(eicosapentaenoic acid), DHA(docosahexaenoic acid), 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항산화제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 배지는 NAC(N-acetyl-L-cysteine), 인슐린 또는 인슐린 유사인자, 하이드로코르티손, 덱사메타손, bFGF(basic fibroblast growth factor), 헤파란 황산(heparan sulfate), 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol), EGF(epidermal growth factor), B-27, 액티빈 A, BMP-4, OSM(oncostatin M), HGF(hepatocyte growth factor) 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 추가 성분을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 병변 부위에 국소적으로 투여되는 것인, 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 조성물은 주사제 형태로 제공되는 것인, 조성물.
  14. 시알릴올리고당을 포함하는 배지에서 줄기세포를 계대 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포를 배양하는 방법으로서,
    상기 시알릴올리고당은 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 3'-시알릴락토사민, 6'-시알릴락토사민, 3'-시알릴-3-푸코실락토스, 시알릴락토-N-테트라오스, 디시알릴락토스 또는 이들의 조합을 포함하고,
    상기 방법은 배양된 줄기세포능을 증대시키는 것이며,
    상기 줄기세포능을 증대시키는 것은 줄기세포의 노화를 억제시키는 것, 줄기세포성 인자의 발현을 증가시키는 것, 및 미분화 상태를 유지하면서 줄기세포를 증식시키는 것으로부터 선택되는 적어도 어느 하나 이상인 것인, 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 배지는 인간 모유 유래 올리고당을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 인간 모유 유래 올리고당은 락토-N-테트라오스, 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 락토-N-네오테트라오스, LS-테트라사카라이드 b, LS-테트라사카라이드 c, 디시알릴락토-N-테트라오스, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 방법.
  17. 청구항 14에 있어서, 상기 계대 배양하는 단계는, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 80% knockout DMEM, MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, Chang's Medium, 및 MesenCult-XF Medium으로 구성된 군으로부터 선택되는 기본 배지에서 배양하는 것인, 방법.
  18. 청구항 14에 있어서, 상기 계대 배양하는 단계는 0.1 μM 내지 400 μM 농도의 시알릴올리고당을 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 것인, 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 방법은 3 내지 12 계대 배양 후, 줄기세포능을 유지하는 것인, 방법.
  20. 시알릴올리고당을 줄기세포에 첨가하는 단계를 포함하는 줄기세포의 줄기세포능을 증대시키는 방법으로서,
    상기 시알릴올리고당은 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 3'-시알릴락토사민, 6'-시알릴락토사민, 3'-시알릴-3-푸코실락토스, 시알릴락토-N-테트라오스, 디시알릴락토스 또는 이들의 조합을 포함하는 것이며,
    상기 줄기세포능을 증대시키는 것은 줄기세포의 노화를 억제시키는 것, 줄기세포성 인자의 발현을 증가시키는 것, 및 미분화 상태를 유지하면서 줄기세포를 증식시키는 것으로부터 선택되는 적어도 어느 하나 이상인 것인, 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 단계는 인간 모유 유래 올리고당을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 인간 모유 유래 올리고당은 락토-N-테트라오스, 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 락토-N-네오테트라오스, LS-테트라사카라이드 b, LS-테트라사카라이드 c, 디시알릴락토-N-테트라오스, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 방법.
  23. 청구항 20에 있어서, 상기 첨가하는 단계는 체외(ex vivo) 또는 시험관 내(in vitro)에서 수행되는 것인 방법.
  24. 청구항 20에 있어서, 상기 첨가하는 단계는 0.1 μM 내지 400 μM 농도의 시알릴올리고당을 첨가하는 것인, 방법.
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