KR20230101952A - 면역글로불린 g (igg)의 개선된 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 별도의 분획화 공정을 통해 정상 플라스마 분획화 공정 동안 생산된 미사용된 폐기 침전물로부터 IgG를 추출하고, 이에 의해 혈장으로부터 IgG의 전체 수율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 면역글로불린 G (IgG)의 개선된 제조 방법에 관한 것이다.
배경
면역글로불린 G (IgG)는 인간에서 풍부한 항체 아이소타입이다. IgG는 바이러스, 박테리아 및 진균을 포함하여 병원체의 많은 상이한 종류에 결합하여, 감염으로부터 신체를 보호한다. 따라서, IgG는 면역계의 기능에서 중요 역할을 한다. 인간에서 4개의 IgG 서브클래스가 있다: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4. IgG1 및 IgG2는 IgG의 가장 보편적인 유형이고, 모든 IgG의 거의 90%를 차지한다. IgG가 언급되는, 본 문서에서, 참조의 편의를 위하여, 모든 4개의 유형, 뿐만 아니라 그들의 임의의 조합을 포함하는 의도이다. 용어 "IgG"는 IVIG (정맥내 면역글로불린), SCIG, (피하 면역글로불린) 및 IMIG (근육내 면역글로불린)을 추가로 포함하는 의도이다.
전술한 바와 같이, IgG는 면역계의 기능에서 중요 역할을 한다. 면역 및 자가면역 장애를 갖는 환자가 IgG를 이용한 치료의 이점을 얻을 수 있다. IgG로 치료될 수 있는 병태는, 중증 복합성 면역결핍 (SCID) 및 공통의 다양한 면역결핍 (CVID), 및 다른 병에서 비롯된 2차 면역결핍 (SID) 예컨대 만성적 림프구성 백혈병, 다발성 골수종 또는 소아 AIDS 또는 후속 골수 이식을 포함하여, 1차 면역결핍 (PID)을 포함한다. 치료받을 수 있는 다른 병태는 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 가와사키병, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 중증 근무력증, 만성적 염증성 탈수초 다발성신경병증 (CIDP), 및 다초점 운동 신경병증 (MMN)을 포함한다. IgG는 수많은 다른 류마티즘성, 혈액학적 및 피부과 병태의 치료에서 또한 사용된다.
IgG는 종래 분획화 공정을 이용하여 풀링된 인간 혈장으로부터 정상적으로 단리된다. 차가운 에탄올 분획화 공정은 인간 혈액으로부터 알부민을 정제하기 위해 1940년대 초반에 콘에 의해 개발되었다 (Cohn, E.J. et al., J. Am. Chem. Soc., 68: 459-475, (1946)). 이는 '콘(Cohn) 방법 6'으로서 또한 공지된다.
이 공정은 pH, 에탄올 농도, 온도, 이온성 강도 및 단백질 농도에 기반된 원하는 단백질의 차별적인 용해도에 기반된다. 콘 공정 동안, 에탄올 농도는 최대 40% 증가하고, pH는 중성부터 4.8까지 감소하고 온도는 분획화의 과정에 걸쳐 실온에서 -5℃까지 감소한다. 공정 동안 병태가 변화함에 따라, 상이한 플라스마 단백질은 용액에 잔류하는 다른 단백질과 함께 순차적으로 침전하여 나온다. 당해 정확한 단백질(들)에 따라, 각 분획화 단계로부터 침전물 및 상청액의 한쪽 또는 양쪽은 추가로 가공될 수 있다. 5개의 중요 콘 침전물 분획, 분획 I 내지 V가 있고, 각 분획은 상이한 단백질을 그의 중요 성분으로서 포함한다. 예를 들어, 알부민은 분획 V로부터 수득되고, 반면에 IgG는 분획 II+III으로부터 수득될 수 있다. 그 뒤에 콘 분획 II+III (콘 방법 6의 중간체)의 분획 II (더욱 정제된 IgG 침전물 분획)으로의 추가 하위-분획화 방법이 개발되었고 '온클레이 방법 9'로 지칭된다 (Oncley, J.L. et al., J. Am. Chem. Soc., 71, 541-550, (1949)).
Gerlough, Hink 및 Mulford 방법을 포함하여, 콘 공정에서 많은 변화가 있다. Kistler & Nitschmann 방법은 또 다른 공지된 변이체 (P. Kistler and Hs. Nitschmann, Vox Sang. 7: 414-424 (1962)). 이 방법에서, 침전물 A 내지 C는 콘 분획 II+III, III 및 V 각각을 대체한다. 더 빠른 가공 및 더 낮은 에탄올 용법의 이점으로, 콘 방법에서 보다 더 낮은 단계 전체를 포함하기 때문에 이 공정은 널리 허용되어 왔다.
IgG를 정제하기 위한 다른 방법은 이온교환 크로마토그래피 및 폴리에틸렌 글리콜 침전에 의해 콘 방법 6에서 플라스마 또는 플라스마 중간체 II+III으로부터 IgG의 직접적인 단리를 포함한다. 공정으로부터 수율은 상대적으로 높을 수 있다. 이들 방법의 일부는 순도 및 특히 혈액 매개 바이러스 예컨대 간염 및 HIV의 전이에 대해 걱정 속에서 중단되어 왔다. 그러나, 비록 복합성, 높은 자본비 및 높은 물/폐기 처리 요건이 이 옵션을 거의 최대 및 가장 널리 자금이 마련된 플라스마 분별기에 제한하여도, 특이적 바이러스 불활성화 단계의 도입은 최근에 크로마토그래피 공정에서 실질적인 투자를 이끌어 왔다.
콘 공정 (및 이의 변이체)은 모노머성 IgG를 실질적으로 생산한다. 이로써 대다수의 IgG 생성물이 모노머성이고, IgG의 20% 미만이 이량체 및 더 큰 응집물의 형태인 것을 의미한다. 일반적으로, 플라스마로부터 유도된 IgG를 받는 환자에서 원치않는 면역 반응에 연결되어짐에 따라, IgG 응집물의 존재는 요망되지 않는다. 임의의 정제 공정에 의해 수득된 IgG 생성물이 가능한 많은 모노머를 함유하는 것이 따라서 바람직하다.
IgG에 대한 요구가 1998년과 2006년 사이에서 2배 초과이었고, 요구는 계속해서 증가한다. 2008년에는, 플라스마 분획에 대하여 전면적인 시장이 US$120억으로 추정되었고, IgG의 거의 절반이었다. 현재는, 공급은 인간 공여체에 의해 증여된 플라스마로부터 나와야 한다. 플라스마의 한정적 공급이 있기 때문에, 결과적으로 개선된 수율을 갖는 IgG의 개선된 단리 공정이 당해 기술에서 필요하다. 그러나, 모든 임상 적용에 대하여, 예를 들어, 다른 프로테아제 또는 응고 인자, 또는 다른 오염 성분, 예컨대 혈액 매개 바이러스의 존재에서 비롯되는 임의의 요망되지 않는 부작용을 최소화하기 위해 매우 순수한 IgG를 갖는 것이 중요하다.
Immunol. Allergy Clin. N. Am. 28 (2008) 765-778에서 J. A. Hooper, 및 치료 용도를 위하여 플라스마 단백질의 생산의 13장 (John Wiley & Sons, Inc., 2013, Editors Joseph Bertolini, Neil Goss and John Curling)에서 Andrea Buchacher 및 Waltrud Kaar는 상업적 IgG 제형의 다양한 제조 공정을 기재한다. 사용을 허가받은 대다수의 IgG 생성물은 차가운 에탄올 분획화 (즉 콘/온클레이 공정 또는 그의 변이체) 그 다음 이온 교환 크로마토그래피를 이용한 정제에 의해 생산된다. IgG의 주요 손실이 콘/온클레이 (Kistler & Nitschmann) 분획화 공정의 후속의 분획 III (침전물 B) 단계에서 발생함에 따라 IgG 손실은 이온 교환 크로마토그래피용 개시 물질로서 I + II + III (또는 피브리노겐이 분획 I에서 조기 침전되면 II + III)의 사용에 의해 최소화된다.
표적 단백질이 임의의 원치않는 단백질 및 공정에서 그 다음 잉여로 간주되는 임의의 다른 원치않는 물질로부터 분리되는 것이 임의의 단백질 정제 반응식에서 고유하다. 상기 다른 물질은 표적 생성물에서 요망되지 않는 위험성 또는 병원성 물질을 포함하여 다른 화학 모이어티를 포함할 수 있다. 따라서, 단백질 정제 공정은 일반적으로 당해 단백질(들) 및 소위 "폐기" 또는 "부" 분획을 함유하는 "생성물 분획"을 생산한다. 그러나, 이들 소위 "폐기 분획"이 그럼에도 불구하고 다른 단백질 또는 성분 물질에 대하여 원료 물질로서 값을 가질 수 있기 때문에 상기 거부성 분류는 오도될 수 있다.
플라스마 단백질의 분야에서, 이 오도하는 명명법에 대한 증거는, 친화성 크로마토그래피에 의해 특이적 면역글로불린의 정제용 공급원료로서 "폐기 분획"의 사용을 기재하는, AU715427B2에서 발견되었다. 유사하게, JPS601134A는 구배 전기영동에 의해 면역글로불린의 정제용 공급원료로서 폐기 분획의 사용을 기재한다. WO2010/132686A1은 그 분획에 존재하는 응집된 면역글로불린을 정제하기 위해 IgG 분획화로부터 제거된 분획의 사용을 기재한다.
UA45557U는 C형 간염 병원체의 마커를 이용한 오염 때문에 "폐기물"로서 거절되는 플라스마 기증에 적용되는 정상적 플라스마 분획화 공정을 기재함으로써 용어 "폐기 분획"의 대안적인 사용을 입증한다.
콘/온클레이 공정 및 이의 변이체 (이후에 주요 공정 스트림으로 칭함)에서 IgG 수율이 플라스마에 존재하는 IgG의 총량 미만인 미해결된 문제가 남아있다. 이는 제조 공정 동안 단백질의 일부 변성을 반영할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 작은 잔류 양의 높은-품질 면역글로불린 (즉 비-응집된, 주로 모노머성 IgG)은 다량체 및 응집된 IgG를 포함하여 다른 성분을 또한 함유하는 분리된 및 제거된 "폐기" 분획에서 포착에 의해 주요 제조 분획화 경로로부터 분리될 수 있다. 이는 환자의 이익을 위한 치료적 생성물의 이용가능성에 대해 결과적으로 영향을 미치는 것과 동시에, 희귀한 플라스마 개시 물질 유래의 귀중한 면역글로불린의 효율적인 회수를 무력화시킨다.
본 출원의 맥락에서, 용어 "폐기 분획"은 원하는 "주요 생성물 분획"으로부터 분리되는 분획으로서 정의된다. 생성물 분획은 전형적으로 원하는 표적 단백질을 높은 순도로 함유할 것이다. 소위 폐기 분획은, 표적 단백질의 품질, 효능 또는 안전성을 타협할 수 있는 다른 성분과 조합이기는 하지만, 표적 단백질의 일부를 함유할 것이다. 폐기 분획은 사실상 표적 단백질 이외의 단백질의 공급원으로서 가치가 있을 수 있다. 본 출원에서, 표적 단백질은 면역글로불린 IgG이다.
따라서, IgG를 추출하기 위한 플라스마의 정제에서, 주요 공정 스트림은 IgG 생성물을 선도하는 것이다. 만일 주요 공정이 콘 분획화 공정이면, 그 다음 주요 생성물 분획은 콘 분획 II이다. IgG를 생산하기 위한 콘 분획화 공정에서, 상청액 A+I은 유의미한 양의 IgG를 함유하지 않음에 따라 "폐기물"인 것으로 고려될 것이다. 그러나, 도 1에서 입증된 바와 같이, 그와 같은 폐기 생성물은 다른 표적 단백질을 산출하기 위해 추가로 정제될 수 있다. 예를 들어, 상청액 A+I은 알부민을 함유한 콘 분획 V를 수득하기 위해 추가로 가공될 수 있다. 따라서, 플라스마 분획화 공정으로부터 당해 1차 단백질이 알부민 이외의 다른 것인 경우 상청액 A+I은 단지 "폐기 분획"이다.
콘/온클레이(Cohn/ Oncley) 공정 동안 생성된 폐기 분획(및 이의 변이체)이 유의미한 양의 IgG를 함유할 수 있음이 발견되었다. 폐기 분획이 개시 플라스마에서 IgG의 총량의 30% 만큼 함유할 수 있음이 보여지고 있다.
현재 이용가능한 공정보다 고수율을 가질 수 있으면서 높은 수준의 순도 및 안전성을 유지하면서, 그리고 부가의 착물 및 비싼 크로마토그래피 단계를 필요로 하지 않는 IgG의 개선된 생산 공정을 제공하는 것이 유리할 것이다.
발명의 요약
(예를 들면 85 wt.% 이상 모노머 및 다이머 및 10 wt.% 이하 폴리머 및/또는 응집물을 포함하는 정상 면역글로불린에 대하여 유럽 약전 논문 0338에 따르는) 높은 순도의 IgG가, 크로마토그래피 단계에 대한 필요성 없이, 및 특히 친화성 또는 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 대한 필요성 없이, IgG를 생산하기 위한 플라스마 분획화 공정 동안 "폐기" 분획으로서 앞서 고려되었던 침전물 분획으로부터 상대적으로 쉽게 수득될 수 있음이 이제 놀랍게도 발견되었다. 상기 폐기 분획으로부터 IgG를 추출시킴으로써, IgG의 전체 수율은 부가의 후속 정제 단계에 대한 필요성 없이 유의미하게 증가될 수 있다.
본 발명은 따라서 IgG의 공급원으로서 플라스마 분획화 동안 생산된 폐기 침전물 분획의 사용을 제공한다. 바람직하게는, 폐기 침전물 분획은 IgG를 함유한 액체 분획 (상청액)을 생산하기 위해 분획화 단계 동안 생산된다.
더욱 특이적으로, 본 발명은 플라스마 분획화 동안 생산된 및 주요 IgG 제조 공정 스트림으로부터 분리된 폐기 침전물 분획으로부터 IgG의 추출 방법을 제공하고, 상기 방법은 폐기 침전물을 적합한 용매와 접촉시켜 폐기 침전물로부터 IgG를 추출하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 폐기 침전물 분획은 IgG를 함유한 액체 분획 (상청액)을 생산하기 위해 분획화 단계 동안 생산된다. 특히, 본 발명의 방법은, 플라스마 분획화 동안 생산된 폐기 침전물 분획으로부터 IgG의 분리를 위하여, 임의의 크로마토그래피 단계, 예컨대 친화성 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 및 전기적 공정 없는, 예컨대 전기영동을 필요로 하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 IgG를 생산하기 위해 플라스마 분획화 동안 IgG의 수율 개선 방법을 제공하고, 상기 방법은, 적합한 용매를 이용하여, 플라스마 분획화 동안 생산된 및 주요 IgG 제조 가공 스트림으로부터 분리된 폐기 침전물 분획으로부터 IgG를 추출하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 폐기 침전물 분획은 IgG를 함유한 액체 분획 (상청액)을 생산하기 위해 분획화 단계 동안 생산된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 플라스마 또는 플라스마 분획으로부터 IgG의 분리 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 플라스마 또는 플라스마 분획을 분획화하여 플라스마 또는 플라스마 분획에서 대다수의 IgG를 함유한 액체 분획, 및 부가의 IgG를 함유한 폐기 침전물 분획을 생산하는 단계; 및
b) 적합한 용매를 이용하여 폐기 침전물 분획으로부터 부가의 IgG의 적어도 일부를 추출하는 단계.
바람직한 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 IgG의 제조 방법을 제공한다:
a) 변형된 Kistler 및 Nitschmann B+I 분획화 공정으로부터 침전물 및 상청액을 회수하는 단계;
b) 단계 a)에서 수득된 침전물을 균질화하고 그로부터 1 내지 3 시간 동안 0 ℃에서 수성 아세테이트/포스페이트 완충액내 17 vol.% 에탄올과 혼합에 의해 IgG를 추출하는 단계; 및 이후
c) 임의의 잔류 침전물로부터 추출된 IgG를 함유한 완충액을 분리하는 단계.
더욱 바람직하게는, 상기 방법은 추가로 단계 c)에서 수득된 추출된 IgG를 함유한 완충액을 단계 a)에서 수득된 변형된 Kistler 및 Nitschmann B+I 상청액과 조합하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 상기 기재된 방법에서, 단계 c)는 여과를 통해 수행되고 상기 방법은 추가로 Kistler 및 Nitschmann 분획 II 침전용 조건에 따른 수성 에탄올에서 추출된 IgG의 항온처리; 및 수득한 IgG-풍부한 분획 II 침전물의 회수를 포함한다.
본 발명의 모든 측면에서, 폐기 침전물 분획은 바람직하게는 실질적으로 콘 분획 III에 등가물이다. 더욱 바람직하게는, 콘 분획 III 또는 I+III, Kistler & Nitschmann 침전물 B 또는 B+I, 또는 변형된 Kistler & Nitschmann 침전물 B 또는 B+I이다.
본 발명의 모든 측면에서, 액체 분획은 바람직하게는 실질적으로 콘 상청액 III에 등가물이다. 더욱 바람직하게는, 콘 상청액 III 또는 I+III, 또는 Kistler & Nitschmann 상청액 B 또는 B+I, 또는 변형된 Kistler & Nitschmann 상청액 B 또는 B+I이다. 가장 바람직하게는, 액체 분획은 IgG의 전방 다운스트림 가공을 위하여 메인스트림 콘 상청액 III 또는 I+III 또는 변형된 Kistler & Nitschmann 상청액 B 또는 B+I속에 재도입될 수 있다. 임의의 적합한 후속의 단계에서 추가 다운스트림 가공 이후 또는 분획 II에서 메인스트림 속에 또한 재도입될 수 있고 별도의 하위-분획으로서 또한 전방 가공될 수 있다. 대안적으로, 액체 분획은 정제된 인간의 IgG 생성물을 통하여 완전히 독립적으로 처리될 수 있다.
본원에서 변형된 Kistler & Nitschmann 공정에 대한 임의의 참조는 공정 예컨대 Roberts et. al., Biologicals, Vol. 43(2), March 2015, p123-129에 기재된 것을 지칭한다.
도 1은 인간 IgG 및 알부민의 생산을 위하여 사용될 수 있는 변형된 Kistler & Nitschmann 차가운 에탄올 분획화 공정의 도식이다.
도 2는 본 발명의 공정이 변형된 Kistler & Nitschmann 차가운 에탄올 분획화 공정 속으로 통합될 수 있는 방법을 보여주는 도식이다.
도 3은 IgG의 생산을 위하여 변형된 Kistler & Nitschmann 차가운 에탄올 분획화 공정을 보여주는 도식이다.
도 4는, 공정 스트림 속으로 부가의 회수된 IgG의 재-도입을 위한 대안적인 단계와 함께, 본 발명의 부가의 분획 B+I 세정 단계를 편입하는 도 3의 변형된 Kistler & Nitschmann 차가운 에탄올 분획화 공정을 보여주는 도식이다.
도 5는, 공정 스트림 속으로 부가의 회수된 IgG의 재-도입을 위한 대안적인 단계와 함께, 본 발명의 부가의 분획 III/I+III 세정 단계를 갖는 콘/온클레이 분획화 공정을 보여주는 도식이다.
도 2는 본 발명의 공정이 변형된 Kistler & Nitschmann 차가운 에탄올 분획화 공정 속으로 통합될 수 있는 방법을 보여주는 도식이다.
도 3은 IgG의 생산을 위하여 변형된 Kistler & Nitschmann 차가운 에탄올 분획화 공정을 보여주는 도식이다.
도 4는, 공정 스트림 속으로 부가의 회수된 IgG의 재-도입을 위한 대안적인 단계와 함께, 본 발명의 부가의 분획 B+I 세정 단계를 편입하는 도 3의 변형된 Kistler & Nitschmann 차가운 에탄올 분획화 공정을 보여주는 도식이다.
도 5는, 공정 스트림 속으로 부가의 회수된 IgG의 재-도입을 위한 대안적인 단계와 함께, 본 발명의 부가의 분획 III/I+III 세정 단계를 갖는 콘/온클레이 분획화 공정을 보여주는 도식이다.
상세한 설명
하기에서, 용어 "액체 분획" 및 "상청액"은 용어 "침전물" 및 "분획"과 같이 등가물이다.
본원에서 기재된 방법에서 수득된 IgG 생성물은 최소 응집된 IgG를 갖는, 고 순도이고, 따라서 유럽 약전 논문 0338 (01/2015)에 설정된 순도에 대하여 최소 표준을 충족한다. 따라서, 본원에서 기재된 방법에 의해 직접적으로 수득된 IgG 생성물은 전기영동에 의해 결정된 바와 같이 적어도 90% 감마글로불린을 함유한다. 이들 방법에 의해 수득된 생성물은 또한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 바와 같이 10 wt.% 미만의 폴리머성 및 응집된 IgG와, 적어도 85 wt.% 모노머성 및 다이머성 IgG를 함유한다. HPLC는 또한 응집물 함량을 분석하기 위해 사용될 수 있다. 이는 본원에서 기재된 분획화 공정으로부터 수득된 생성물이 유럽 약전 표준을 충족하기 위한 충분한 순도 및 품질이고, 따라서 약학적 생성물을 형성하기 위해 임의의 추가 정제를 필연적으로 필요하지 않음을 의미한다. 물론, 본원에서 기재된 분획화 공정에 의해 수득된 IgG는 더 높은 품질 IgG 생성물을 수득하기 위해, 또는 예를 들면 대안적인 약학적 사용을 위한 상이한 생성물 프로파일을 수득하기 위해 임의의 적당한 수단에 의해 추가로 가공될 수 있다. 상기 추가 가공 방법은 당해 기술의 숙련가에 잘 알려지고, 특히 하나 이상의 바이러스 불활성화 단계를 포함할 수 있다.
차가운 에탄올 분획화는 혈장으로부터 IgG를 분리하기 위한 가장 널리 사용된 방법 중 하나이다. 일반적으로, 다중 공여체로부터 플라스마의 풀링된 배치는 냉동침전 처리되어 동결침전물로서 응고 인자 예컨대 인자 VIII을 제거한다. 동결침전물 상청액은 그 다음 하나 이상의 차가운 에탄올 분획화 단계를 거쳐 결국 주로 IgG를 포함한 침전물 분획을 생산한다. 모든 고전적 콘/온클레이 공정 및 Kistler & Nitschmann 방법에서, 이 IgG-풍부 분획은 분획 II 또는 침전물 II로 지칭된다. 이 침전물은 그 다음 추가로 정제 및 바이러스 불활성화 단계 처리되어 정맥내, 피하 또는 근육내 주입을 위하여 약학적으로 허용가능한 IgG 최종 생성물을 제공한다.
여기에 "정상 플라스마", "고면역 플라스마" (예컨대 고면역 항-D, 테타누스독소증 또는 B형 간염 플라스마) 또는 임의의 플라스마 등가물은 본원에서 기재된 차가운 에탄올 분획화 공정에서 사용될 수 있다.
콘 분획화 방법에서, 제1 분획화 단계는 주로 피브리노겐 및 파이브로넥틴을 포함하는 분획 I을 초래한다. 이 단계로부터 상청액은 추가로 가공되어 분획 II+III 및 그 다음 분획 III 및 II을 침전 제거한다. 전형적으로, 분획 II+III은 불순물 예컨대 피브리노겐, IgM, 및 IgA와 함께 대략 60% IgG를 함유한다. 대부분의 이들 불순물은 그 다음 분획 III에서 제거되어, 폐기 분획으로 고려되고 정상적으로 폐기된다. 상청액은 그 다음 처리되어 주요 IgG-함유 분획, 분획 II를 침전 제거하고, 이는 90% 초과 IgG를 함유할 수 있다. 상기 % 값은 IgG의 % 순도를 지칭한다. 순도는 당해 기술에 공지된 임의의 방법, 예컨대 겔 전기영동에 의해 측정될 수 있다.
Kistler & Nitschmann 방법에서, 분획 I은 콘 방법의 분획 I에 등가물이다. 다음 침전물/분획은 침전물 A (분획 A)로 지칭된다. 이 침전물은 비록 콘 분획 II+III과 동일하지 않아도, 광범위하게 등가물이다. 침전물은 그 다음 재용해되고 조건은 조정되어 침전물 B (분획 B)를 침전 제거하고, 이는 콘 분획 III에 등가물이다. 재차, 이는 폐기 분획인 것으로 고려되고, 정상적으로 폐기된다. 침전물 B 상청액은 그 다음 가공되어 추가로 침전물 II를 생산하고, 이는 콘 분획 II에 상응한다.
도 1에서 보이는, Kistler & Nitschmann 공정의 변형에서, 첫번째 2개 분획화 단계를 조합하는 것이 가능해져, 이로써 분획 I이 회수되지 않고, A+I로 지칭되는, 제1 침전물이 피브리노겐 및 파이브로넥틴을 포함한다. 이 침전물이 재현탁된 및 추가로 침전 단계 처리된 경우, B+I로 지칭될 수 있는, 형성된 침전물은 피브리노겐 및 파이브로넥틴 뿐만 아니라 IgM 및 IgA를 포함하는 다른 불순물을 함유한다. 이 침전 단계로부터 상청액은 그 다음 추가로 가공되어 IgG-풍부 분획, 분획 II를 생산한다. 이 공정에서 B+I 침전물은 또한 IgG 공정 스트림이 관련되는 한 폐기 분획인 것으로 고려된다.
원칙적으로, 본 발명의 방법은, 콘 분획 III 및 분획 I+III 및 Kistler & Nitschmann 침전물 B 또는 B+I을 포함하여, 분획 II의 생산에 앞서 차가운 에탄올 분획화 동안 생산된 임의의 침전물 분획에 적용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 분획화 공정에서 분획 II를 즉시 선행하는 침전물 분획에 적용되고, 이는 정상적으로 폐기 분획으로 고려된다. 바람직하게는, 폐기 침전물 분획은 콘 분획 III 또는 I+III, Kistler & Nitschmann 침전물 B 또는 B+I, 변형된 Kistler & Nitschmann 침전물 B 또는 B+I, 또는 여기에 실질적으로 등가물인 분획이다.
이들 폐기 침전물 분획이 개시 플라스마 풀로부터 유의미한 양, 일부 경우에서 25-30%만큼의 IgG를 함유할 수 있음이 발견되었다. 이는 침전물 분획에서 포획된 일부 상청액에 부분적으로 및 불순물 예컨대 IgM 및 IgA와 IgG의 공-침전에 기인하여 상정된다.
놀랍게도, 폐기 분획에 적용된 단순 세정 (추출) 공정을 통해 상대적으로 순수한 형태로 "손실" IgG의 상업적으로 유의미한 분율을 회수하는 것이 가능함을 발견하였다. 침전물에 존재하는 상대적으로 높은 수준의 다른 단백질이 제공되면 폐기 침전물로부터 IgG의 추출이 어려울 수 있다는 것, 및 추출될 수 있는 임의의 IgG가 (예를 들면 응집 및 다른 원치않는 단백질 종 또는 단백분해 활성에 관하여) 낮은 순도라는 것을 숙련된 사람이 기대함에 따라, 이 결과는 의외이다.
본 발명의 방법이 폐기 분획으로부터 추가로 IgG를 추출하기 위해 임의의 크로마토그래피 단계를 필요로 하지 않는 것을 주목하는 것이 중요하다. 따라서, 본 발명의 공정은 크로마토그래피에 대한 필요성 없이 폐기 분획으로부터 상대적으로 순수한 IgG 생성물을 제공한다.
세정 공정에 적합한 용매의 선택은 침전물에 존재하는 임의의 다른 단백질의 유의미한 추출 없이 폐기 침전물로부터 IgG의 추출을 허용하도록 발견되었고, 이는 IgG 정제가 관련되는 한 불순물로 고려된다. 따라서, 용매는 침전물로부터 원치않는 불순물의 동시 제거 없이 침전물로부터 IgG의 제거에 특이적이도록 선택되어야 한다.
폐기 침전물 분획은 생산된 직후 세정 공정 처리될 수 있다. 대안적으로, 폐기 분획은 후자 가공을 위하여 냉동된 형태로 보관될 수 있다. 세정 이전, 침전물은, 필요하면, 세정 공정이 수행될 온도로 평형화되어야 한다. 상기 평형은 일반적으로 정적, 즉 침전물의 임의의 진탕을 포함하지 않을 것이다.
세정 공정에 사용된 용매의 유형 및 양은 IgG의 회수가 회수된 IgG의 지나친 타협 없이 최대화될 정도로 선택되어야 한다. 폐기 침전물로부터 불순물의 추출 최소화 동안 IgG 회수를 최적화하기 위해, 세정/추출에 사용된 용매는 문제의 폐기 침전물을 생산했던 분획화 단계에서 사용된 용매와 바람직하게는 동일하다.
폐기 분획이 (변형된) Kistler & Nitschmann 침전물 B 또는 B+I, 또는 콘 분획 III 또는 I+III인 경우 바람직한 용매는 수성 에탄올 용액이다. 더욱 바람직하게는, 상기 에탄올 용액은 완충된다. 에탄올 농도, 온도 및 pH는 침전물로부터 추출된 IgG가 용액에 잔류하도록 제어되어야 한다.
에탄올의 바람직한 농도는 약 10 내지 약 20 vol.%의 범위이다. 더욱 바람직하게는 약 11 내지 약 19 vol.%의 농도 범위이고, 더더욱 바람직하게는 약 12 내지 약 19 vol.%의 농도 범위이고, 가장 바람직하게는 약 13 내지 약 17 vol.%의 농도 범위이다. 약 13 vol.% 및 약 17 vol.%가 가장 바람직하다. "약 13 vol.%"는 바람직하게는 13 ± 2 vol.%이고, 반면에 "약 17 vol.%"는 바람직하게는 17 ± 2 vol.% 이다.
세정 공정이 발생하는 온도는 또한 회수된 IgG의 양 및 순도에 영향을 미칠 것이다. 이상적으로, 세정 공정 동안 온도는 문제의 폐기 침전물을 생산했던 분획화 단계를 위하여 사용된 동일한 온도에서 유지된다. 최적의 온도 범위는 따라서 문제의 분획화 공정 및 분획에 의존할 것이다. 일반적으로 바람직한 것은 약 -3℃ 내지 약 -7℃를 포함하여, 약 -3℃ 내지 약 -8℃ 범위의 온도이다. 예를 들어, 폐기 분획이 (변형된) Kistler & Nitschmann 침전물 B 또는 B+I인 경우, 세정 추출 동안 온도는 바람직하게는 -5℃ ± 2.0℃이다. 폐기 분획이 콘 분획 III 또는 I+III인 경우, 바람직한 온도는 보통 약간 낮은, 바람직하게는 -6℃ ± 2.0℃이다.
일반적으로 바람직한 것은 약 -3℃ 내지 약 -7℃를 포함하여, 약 +3℃ 내지 약 -8℃ 범위의 온도이다. 예를 들어, 폐기 분획이 변형된 Kistler & Nitschmann 침전물 B 또는 B+I인 경우, 세정 추출 동안 온도는 바람직하게는 -2℃ ± 5℃이다. 폐기 분획이 콘 분획 III 또는 I+III인 경우, 바람직한 온도는 보통 약간 낮은, 바람직하게는 -3℃ ± 5.0℃이다.
최적의 pH 범위는 또한 분획에 의존할 것이다. 일반적으로 바람직한 것은 약 4.8 내지 약 5.3, 더욱 바람직하게는 약 5.1 내지 약 5.3 범위의 pH이다. 예를 들어, 폐기 분획이 (변형된) Kistler & Nitschmann 침전물 B 또는 B+I인 경우, pH 범위는 바람직하게는 5.1 ± 0.05이다. 폐기 분획이 콘 분획 III 또는 I+III인 경우, pH는 약간 더 높은, 바람직하게는 5.2 ± 0.05일 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 폐기 분획이 (변형된) Kistler & Nitschmann 침전물 B 또는 B+I인 경우, 용매는 17 ± 2 vol.% 수성 에탄올이고, 온도는 -5℃ ± 2.0℃이고 pH 범위는 5.1 ± 0.05이다.
특히 바람직한 구현예에서, 폐기 분획이 (변형된) Kistler & Nitschmann 침전물 B 또는 B+I인 경우, 용매는 17 ± 2 vol.% 수성 에탄올이고, 온도는 -2℃ ± 5℃이고 pH 범위는 5.1 ± 0.05이다.
또 다른 특히 바람직한 구현예에서, 폐기 분획이 콘 분획 III 또는 I+III인 경우, 용매는 17 ± 2 vol.% 수성 에탄올이고, 온도는 -6℃ ± 2.0℃이고 pH 범위는 5.2 ± 0.05이다.
또 다른 특히 바람직한 구현예에서, 폐기 분획이 콘 분획 III 또는 I+III인 경우, 용매는 17 ± 2 vol.% 수성 에탄올이고, 온도는 -3℃ ± 5℃이고 pH 범위는 5.2 ± 0.05이다.
또 다른 특히 바람직한 구현예에서, 폐기 분획이 고면역 플라스마, 또는 등가물 플라스마로부터 제조된 (변형된) Kistler & Nitschmann 침전물 B 또는 B+I인 경우, 용매는 13 ± 2 vol.% 수성 에탄올이고, 온도는 -5℃ ± 2.0℃이고 pH 범위는 5.1 ± 0.05이다.
또 다른 특히 바람직한 구현예에서, 폐기 분획이 고면역 플라스마, 또는 등가물 플라스마로부터 제조된 (변형된) Kistler & Nitschmann 침전물 B 또는 B+I인 경우, 용매는 13 ± 2 vol.% 수성 에탄올이고, 온도는 -2℃ ± 5℃이고 pH 범위는 5.1 ± 0.05이다.
또 다른 특히 바람직한 구현예에서, 폐기 분획이 고면역 플라스마, 또는 등가물 플라스마로부터 제조된 콘 분획 III 또는 I+III인 경우, 용매는 13 ± 2 vol.% 수성 에탄올이고, 온도는 -6℃ ± 2.0℃이고 pH 범위는 5.2 ± 0.05이다.
또 다른 특히 바람직한 구현예에서, 폐기 분획이 고면역 플라스마, 또는 등가물 플라스마로부터 제조된 콘 분획 III 또는 I+III인 경우, 용매는 13 ± 2 vol.% 수성 에탄올이고, 온도는 -3℃ ± 5℃이고 pH 범위는 5.2 ± 0.05이다.
용매는, 포스페이트 및 아세테이트를 포함하여, 공지된 완충액을 이용하여 완충될 수 있다.
일반적으로, 세정 단계는 용매내 폐기 분획의 현탁액을 포함한다. 현탁액은 이상적으로 균질화될 때까지 혼합되고, 그 다음 IgG에 대하여 충분한 기간 동안 남겨져서 용매 속으로 추출된다. 이는 도 2, 4 및 5에서 보이는 "추출" 및 "조건" 단계와 일치한다. 이 현탁/조건화/추출 단계에 대하여 특이적 상위 시한이 없다. 걸린 시간은 실제로 외부 인자 예컨대 공정 효율에 의해 제한될 것이다. 이러한 이유로, 추출 시간은 바람직하게는 1 내지 24 시간, 예를 들어 약 2 내지 약 10 시간이다. 약 2 시간, 예를 들면 90-150 분의 기간이 또한 적합할 수 있다.
바람직한 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 IgG의 제조 방법을 제공한다:
a) 변형된 Kistler 및 Nitschmann B+I 분획화 공정으로부터 침전물 및 상청액을 회수하는 단계;
b) 단계 a)에서 수득된 상기 침전물을 균질화하고 그로부터 1 내지 3 시간 동안 0 ℃에서 아세테이트/포스페이트 완충액내 17 vol.% 수성 에탄올과 혼합에 의해 IgG를 추출하는 단계; 및 이후
c) 임의의 잔류 침전물로부터 추출된 IgG를 함유한 상기 완충액을 분리하는 단계.
더욱 바람직하게는, 상기 방법은 단계 c)에서 수득된 추출된 IgG를 함유한 완충액을 단계 a)에서 수득된 변형된 Kistler 및 Nitschmann B+I 상청액과 조합하는 단계를 추가로 포함한다. 대안적으로, 상기 기재된 방법에서, 단계 c)는 여과를 통해 수행되고 상기 방법은 추가로 변형된 Kistler 및 Nitschmann 분획 II 침전에 대하여 조건에 따라 수성 에탄올에서 추출된 IgG의 항온처리; 및 수득한 IgG-풍부한 분획 II 침전물의 회수를 포함한다.
폐기 분획이 확립된 IgG 표적 단백질 제조 공정 스트림으로부터 침전된 및/또는 분리 제거된 경우 세정/추출 단계에 의해 생산된 IgG 풍부 용액은 바람직하게는 생산된 주요 IgG-함유 상청액과 동일한 또는 유사한 순도의 IgG를 함유한다.
IgG의 상업적 및 치료적 가치가 제공되면, 개시 플라스마로부터 IgG 수율의 임의의 개선은 잠재적으로 중요하고, 심지어 폐기 분획으로부터 IgG의 상대적으로 낮은 % 회수는 크게 귀중할 수 있다.
수득한 IgG 풍부한 용액은 잔류 침전물로부터 분리시키기 위해 당해 기술에 공지된 임의의 표준 방법, 예를 들어 원심분리 또는 여과에 의해 회수될 수 있다. 원심분리가 사용되면, 상청액은 IgG 풍부할 것이고 (즉 추출된 IgG를 함유할 것이고), 침전물은 폐기될 수 있고, 본 발명에 따라 재차 처리되어 추가로 IgG를 추출하고/하거나 다른 단백질의 추출을 위하여 사용될 수 있다. 여과가 사용되면, 여과물은 IgG 풍부할 것이고, 수득한 필터 케이크는 폐기될 수 있고, 추가로 플러싱되어 잔류 비말동반된 IgG를 회수하고, 본 발명에 따라 재차 처리되어 추가로 IgG를 추출하고/하거나 다른 단백질의 추출을 위하여 사용될 수 있다. 적합한 필터 매질은 당해 기술에 공지되어 있다. 실리케이트 여과 조제 예컨대 kieselghur, 예를 들어 셀라이트® 또는 Celpure®은 여과를 촉진시키기 위해 부가될 수 있다.
용매의 임의의 용적이 세정 공정에서 잠재적으로 사용될 수 있지만, 그러나 이용가능한 가공 장비에 대하여 이상적으로 최적화되어야 한다. 매우 낮은 용적이 사용되면, 수득한 현탁액은 쉽게 가공하기에 너무 점성일 수 있고 반면에 매우 높은 용적은 공정 비효율성을 초래할 수 있다. 공정 효율의 이유로, 따라서 용매의 용적을 상대적으로 낮게 유지하는 것이 일반적으로 바람직하다. 예를 들어, 폐기 분획 대 용매의 중량은 일반적으로 약 1:2 내지 약 1:10일 것이다. 바람직하게는, 용매의 중량은 폐기 분획의 중량의 대략 4배, 즉 폐기 분획 대 용매의 약 1:4의 중량 비율일 수 있다.
본 발명의 공정을 이용하여 수득된 IgG 풍부 용액은, 모든 US 및 유럽 약전에 의해 설정된 표준에 따라, 약제학적으로 허용가능한 IgG 생성물을 제공하기 위해 당해 기술에 공지된 방법에 의해 추가로 가공될 수 있다. 바람직하게는, 표준 조건은 용액으로부터 분획 II를 침전시키기 위해 사용되고, 그 다음 추가로 정제되어 약학적 생성물 예컨대 정맥내 면역글로불린 (IVIG) 또는 피하 면역글로불린 (SCIG)을 제공한다.
추가 정제는, IVIG 또는 SCIG의 바이러스 안전성을 확인하기 위해 적합한 단계와 조합된, 음이온 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피의 형태를 취할 수 있다 (Roberts et. al., Biologicals, Vol. 43(2), March 2015, p123-129).
폐기 분획으로부터 추출에서 비롯된 IgG 풍부 용액은 별도로 가공될 수 있거나, 동일한 폐기 분획의 다른 용매 추출과 조합될 수 있고/있거나 다른 공정 배치로부터 폐기 분획의 용매 추출과 조합될 수 있다. 그러나, 주요 표적 단백질 다운스트림 공정의 벌크 IgG 공정 중간체와 이들 용액을 조합하는 것이 일반적으로 더욱 효율적이다. 예를 들어, "폐기 분획"의 용매 추출로부터 IgG는 관련된 폐기 침전물을 생산하였던 분획화 단계로부터 IgG-풍부 상청액과 조합될 수 있다. 이는 동일한 분획화 배치, 또는 상이한 배치로부터 상청액일 수 있다.
대안적으로, 폐기 분획으로부터 추출된 IgG는 주요 IgG 공정에서 사용된 바와 같이 동일한 다운스트림 제조 단계의 하나 이상을 경험할 수 있고, 그 다음 다운스트림 공정 단계에서 벌크 IgG 중간체와 조합될 수 있다. 예를 들어, 침전물 B+I로부터 세정/추출에 의해 생산된 IgG 풍부 용액은 그 다음 추가로 최종 생성물로 가공되는 B+I 상청액과 조합될 수 있다. 대안적으로, 침전물 B+I로부터 세정/추출에 의해 생산된 IgG 풍부 용액은 다운스트림 공정 단계 예컨대 에탄올 침전을 통해 분획 II로 가공될 수 있고, 그 다음 B+I 상청액으로부터 가공된 주요 IgG 분획 II 중간체와 조합 및 최종 생성물로 가공될 수 있다. 제조 장비 및 관련된 물류의 이용가능한 규모에 의존하여, 한쪽 옵션이 바람직할 수 있다. 추출에 사용되는 최적의 용매는 임의의 의도된 후속의 가공 단계(들)에 부분적으로 의존할 수 있다.
추출된 IgG가 주요 IgG 공정 스트림과 재조합될 수 있는 다양한 대안적인 지점은 도 4 및 5에서 보여진다.
본 발명의 바람직한 특징은 임의의 방식으로 조합될 수 있다. 따라서, 명백하게 하기 위해, 별도의 구현예의 맥락에서 본원에서 기재된 어떤 특징은 임의의 방식으로 조합될 수 있다. 반대로, 간결하게 하기 위해, 단일 바람직한 특징의 맥락에서 기재된 다양한 특징은 별도로 또는 임의의 하위조합으로 또한 제공될 수 있다. 추가로, 범위로 언급된 값에 대한 참조는 그 범위 내의 각 및 모든 값을 포함한다.
일반적인 설명에서 상기 기재된 모든 활성이 필요한 것은 아니고, 특정한 활성의 부분이 필요 없을 수 있고, 그리고 하나 이상의 추가 활성이 기재된 것에 더하여 수행될 수 있음을 주목한다. 또한 추가로, 활성이 열거된 순서는 필연적으로 이들이 수행되는 순서가 아니다.
실시예
하기 비제한적 실시예는 추가로 본 발명을 예증한다.
하기 실시예/표에서, 침전물 및 상청액은 혼탁도측정 분석 플랫폼인 'SpaPlus' 오토-분석기 (The Binding Site, Birmingham, UK)를 이용하여 단백질 내용물에 대하여 분석되었다. 응고 인자 VII, IX, XI 및 XII은 (Universal Biologicals, Cambridge, UK에 의해 공급된) AssayPro ELISA 키트를 이용하여 분석되었다. 인자 XIa는 (Quadratech Diagnostics, Epsom, UK에 의해 공급된) Hyphen BioPhen 발색 검정 키트를 이용하여 측정되었다.
아래 표 1은 Kistler & Nitschmann 차가운-에탄올 분획화에 의해 생산된 폐기 분획 (콘/온클레이 분획 III에 등가물)인 B+I 침전물의 전형적인 조성물을 보여준다.
표 1
아래 기재된 실험용 개시 물질은, 표 1에서 보여준 것과 유사한 조성물을 가졌던, 침전물 B+I을 함유한 IgG이었다.
하기 실시예에서, 17 vol.% 에탄올 완충된 수용액은 아래와 같이 제조된다:
이나트륨 수소 포스페이트 디히드레이트 7.1 mM (1.27 g/L)
빙초산 12.8 mM (0.77 g/L)
포스페이트/아세테이트 완충액내 17 vol.% 에탄올: 858.4 g 포스페이트/아세테이트 완충액에 부가된 141.6 g의 96% 에탄올 (최종 pH는 ~5.0-5.1이다).
실시예 1
제1 실험에서, 97 g의 침전물 B+I은 약 -3℃ 내지 -7℃의 온도 범위에서 1,000 g의 17 vol.% 에탄올 완충된 수용액의 존재하에 4.8 내지 5.2의 pH에서 균질기에 의해 빠르게 재-현탁되어, 1:10의 완충액 비율로 침전물을 제공하였다. 완충액은 적절한 pH ("에탄올 완충액")로 조정된 포스페이트 및 아세테이트를 함유한 17 vol.% 수성 에탄올 용액으로 이루어졌다.
제2 실험에서, 99 g의 동일한 침전물 B+I은 약 -3℃ 내지 -7℃의 온도 범위에서 물내 1,000 g의 17 vol.% 에탄올 (즉 완충되지 않은 에탄올 용액)에서 동일한 방식으로 재-현탁되었다. 모든 재-현탁액은 그 다음 중간 정도의 진탕에 의해 계속해서 혼합되었고 침전물은 24 시간 넘게 언급된 조건 하에서 조건화되었다 (성숙되었다). 완충된 및 비-완충된 재-현탁액의 샘플은 IgG 풍부한 액체를 회수하기 위해 원심분리되었다. 사전-원심분리된 현탁액 및 상청액은 당해 몇 개의 다른 단백질 및 IgG의 존재에 대하여 분석되었다 (표 2).
표 2
완충된 및 완충되지 않은 17 vol.% 에탄올 수용액으로부터 재-현탁된 침전물 B+I 및 상청액 분획의 분석
a NQ = 정량화 불가능 - blank와 표준 라인의 최저 지점 사이에서 샘플 OD
NTU = 네팔로미터 혼탁도 비율 단위, NTU로 계산된 혼탁도미터를 이용하여 측정.
표 2로부터 포스페이트/아세테이트에서 완충된 17 vol.% 수성 에탄올 용액 ("에탄올 완충액")과 완충되지 않은 에탄올 용액 모두에서 재-현탁은 성공적으로 IgG를 추출할 것으로 보여질 수 있다. 완충되지 않은 에탄올 상청액 추출물이 완충된 상청액보다 더 높은 농도의 IgG를 함유하였지만, 그러나 완충된 에탄올 상청액 추출물은 더 높은 품질 및 훨씬 더 낮은 분율의 IgA 및 IgM을 갖는 IgG를 함유하였다. 프로테아제 활성, 인자 XI/XIa 및 인자 XII은 완충된 에탄올 상청액 추출물에서 또한 더 낮았다. 높은 속도의 혈전색전성 부작용은 IVIG 생성물에서 인자 XI 및 XIa와 관련되어 있고 따라서 상청액 분획 속으로 이들을 재-추출하지 않는 것이 매우 요망된다. 에탄올/물 추출물과 달리, 에탄올/완충액 추출물은 조성물에서 (분획 II에 계속하는) 상청액 B+I 분획과 유사하고 따라서 2개 분획의 혼합은 고수율의 IgG를 함유한 등가물 순도의 단일 분획 II를 발생하기 위해 가능하다.
포스페이트/아세테이트 완충된 수성 에탄올 상청액으로부터 IgG의 수율은 플라스마 리터 당 0.55 g의 IgG와 등가물이었고, 이는 IgG 최종 생성물의 10-20% 부가의 수율로 번역될 수 있는 플라스마 IgG의 ~10%의 수율 증가를 나타낸다.
실시예 2
실험의 제2 세트에서, 재-현탁 비율 감소의 효과는 전체 용적을 감소시키기 위해 조사되었다. 한 실험에서, 500 g의 B+I 침전물은 1000 g의 완충된 수성 에탄올 용액 (1 부 침전물 대 2 부 완충액)에서 재-현탁되었다. 또 다른 실험에서 250 g의 동일한 B+I 침전물은 1,000 g의 에탄올 완충액 (1 부 침전물 대 4 부 완충액)에서 재-현탁되었다. 샘플은 분석용 성숙 동안 간격으로 선택되었다 (표 3).
표 3
24 시간 넘게 B+I 현탁액의 품질에 관한 재-현탁 비율의 효과 (침전물: 에탄올 완충액)
표 3에서 데이터는 1:2 및 1:4의 비율이 침전물로부터 IgG의 추출을 가능하게 한다는 것 그리고 추출된 IgG의 수율 및 품질이 1:4 비율에서 더 높았다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 물질 품질의 총 표지자인, 1:4 상청액의 탁도는 등가물 1:2 재-현탁 상청액보다 두 자릿수 낮았다. 또한, 오염물질 예컨대 IgM, IgA 및 인자 XIa의 농도는 1:2 상청액에 비교된 1:4 상청액에서 유의미하게 감소되었다. 모든 실험 운전에서 데이터는 또한 IgG의 품질 및 수율이 대략 2 시간 이상의 성숙 시간을 이용하여 유지될 수 있음을 제안한다. 2 시간 성숙 이후 IgG의 수율은 1:4 및 1:2 상청액 각각에서 플라스마의 리터 당 IgG의 0.47 g 및 0.42 g이었다.
실시예 3
몇 개의 재-현탁액은 1:4 비율에서 수행되어 실시예 2의 결과를 확인하였다. 개시 물질의 상이한 배치는 6개의 재-현탁액에서 사용되었다. 각 경우에, 250 g의 B+I 침전물은 상기 기재된 바와 같이 1,000 g의 수성 에탄올 완충액에서 재-현탁되었다. 침전물 현탁액은 최소의 2 시간 동안 혼합하는 동안 -5℃에서 조건화되었다. 조건화의 마지막에, 재-현탁액은 원심분리되었다. 모든 재-현탁액 및 상청액은 분석되었다. 상청액의 IgG 농도 및 IgG 수율 (플라스마 등가물)은 계산되었다 (표 4).
표 4
확인용 B+I 재-현탁액의 IgG 함량 및 수율
IgG의 평균 수율은 플라스마의 리터 당 0.57 g IgG이었다. 주요 분획화 공정 스트림에 더하여, 이 수율은, 가공된 플라스마의 각 리터로부터 부가의 0.57 g IgG를 나타내는, 유의미한 수율 증가로 번역될 수 있다.
실시예 4
334 g의 B+I 침전물은 1,335 g의 17 vol.% 에탄올 완충액에서 재-현탁되었고 -5℃의 온도에서 2 시간 동안 혼합되었다. 액체상 ("제1 추출물")은 그 다음 원심분리에 의해 고체상으로부터 분리되었다.
274 g의 고체상 침전물은 1,096 g의 17 vol.% 에탄올 완충액에서 재-현탁되었고 -5℃의 온도에서 2 시간 동안 혼합되었다. 액체상 ("제2 추출물")은 그 다음 원심분리에 의해 고체상으로부터 분리되었다.
각 절차로부터 사전-원심분리된 현탁액 및 상청액은 IgG 및 당해 몇 개의 다른 단백질의 존재에 대하여 분석되었다 (표 5). 이는 B+I 침전물의 반복된 순차적인 추출이 용매 상청액상에서 IgG를 다른 단백질에서 등가물 감소와 함께 수득하였음을 확인하였다.
표 5
실시예 5
B+I 침전물의 추출물은 -5℃의 온도에서 2 시간 동안 4 부의 17 vol.% 에탄올 완충액와 1 부의 침전물을 혼합시킴으로써 준비되었다. 추출물은 그 다음 원심분리에 의해 잔류 침전물로부터 분리되었다.
B+I 침전물의 추출물은 그 다음 1:10 용적의 비율로 B+I 상청액과 조합되었다. B+I 상청액의 조성물은 조합된 B+I 상청액 및 B+I 침전물 추출물의 조성물과 비교되었다 (표 6). 이는 상청액이 허용가능한 IgG 순도 프로파일을 보유하면서 IgG 농도를 증가시키기 위해 침전물 추출물과 조합될 수 있음을 확인하였다.
표 6
실시예 6
변형된 Kistler 및 Nitschmann 방법에 따라 분획화된 플라스마로부터 250 kg의 B+I 침전물은 0℃ ± 2℃에서 조건화되었고 1000 kg 17 vol.% 에탄올 완충액의 존재하에 1 시간 동안 0℃ ± 2℃에서 균질화로 재현탁되었다. 혼합물은 그 다음 2 시간 동안 0℃ ± 2℃에서 성숙되었고, 그 후 pH는 5.14이었고 전도도는 0.6 mS/cm이었다. 상청액 추출물은 여과에 의해 또는 원심분리에 의해 침전물로부터 분리되었다. 한쪽 여과 또는 원심분리에 의한 이 추출 방법 및 회수는 B+I 침전물로부터 높은 순도의 IgG를 성공적으로 추출하였다 (표 7).
표 7
실시예 7
실시예 6으로부터 313kg의 상청액 추출물 여과물은 3.9 mS/cm의 이온성 강도로 조정되었고, 에탄올 농도는 25 vol.%까지 상승되었고, pH는 1M 수산화나트륨으로 적정에 의해 pH 6.9로 조정되었고 그 다음 6 시간 동안 -6.5℃에서 항온처리되어 원심분리에 의해 수집된 2.4 kg 분획 II 침전물을 산출하였다. 분획 II (Fr II) 침전물은 물에서 용해되었다 (FrII:물 = 1:2). 분석은 B+I 침전물의 상청액 추출물이 추가 다운스트림 정제와 양립가능하여 낮은 수준의 응집물을 갖는 IgG를 산출한다 (표 8).
표 8
추출된 B+I 침전물로부터 재용해된 분획 II 침전물의 조성물
실시예 8
-30℃ 미만에서 냉동 보관된 100 g의 B+I 침전물은 0℃로 제어된 용기 (옵션 (a))에서 또는 0℃로 제어된 17 vol.% 에탄올 완충액을 함유한 용기 (옵션 (b))에서 임의의 진탕 없이 0℃가 되었다. 온도는 냉동 이전 침전물에 배치된 프로브에 의해 측정되었다. 침전물 온도가 0℃ ± 1℃에 도달되면, 17 vol.% 에탄올 완충액이 옵션 (a)로부터 침전물에 부가되었고 모든 침전물은 IgG의 추출에 앞서 2 시간 이상 (성숙/조건화)동안 진탕하면서 용매 완충액 속에 균질화되었다. 상청액은 그 다음 잔류 침전물로부터 분리되었고 분석되었다. 완충액 있거나 없이 0℃로 조건화된 경우 침전물로부터 등가물 IgG 추출이었다 (표 9).
표 9
Claims (24)
- 차가운 에탄올 플라스마 분획화 동안 생산되고 IgG 제조 공정 스트림으로부터 분리되는 폐기 침전물 분획으로부터 IgG를 추출하는 방법으로서,
상기 폐기 침전물 분획을 용매로 균질화하여 상기 침전물로부터 IgG를 추출하는 단계를 포함하고,
상기 폐기 침전물 분획은 IgG를 함유한 액체 분획 (상청액)을 생산하기 위한 분획화 단계 동안 생산되고, 상기 액체 분획은 Kistler & Nitschmann 상청액 B+I 또는 변형된 Kistler & Nitschmann 상청액 B+I이고, 상기 폐기 침전물 분획은 Kistler & Nitschmann 침전물 B+I 또는 변형된 Kistler & Nitschmann 침전물 B+I이며;
상기 용매는 15 vol.% 내지 19 vol.% 에탄올을 함유한 수성 완충액이고;
상기 폐기 침전물 분획으로부터 IgG를 추출하는 방법은 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는, 방법. - IgG를 생산하기 위한 플라스마 분획화 동안 IgG 수율을 개선하기 위한 방법으로서,
용매를 이용하여, 차가운 에탄올 플라스마 분획화 동안 생산되고 IgG 제조 공정 스트림으로부터 분리되는, 폐기 침전물 분획으로부터 IgG를 추출하는 단계를 포함하고,
상기 방법은 상기 폐기 침전물 분획을 상기 용매로 균질화하여 상기 침전물로부터 IgG를 추출하는 단계를 포함하고,
상기 폐기 침전물 분획은 IgG를 함유한 액체 분획 (상청액)을 생산하기 위한 분획화 단계 동안 생산되고, 상기 액체 분획은 Kistler & Nitschmann 상청액 B+I 또는 변형된 Kistler & Nitschmann 상청액 B+I이고, 상기 폐기 침전물 분획은 Kistler & Nitschmann 침전물 B+I 또는 변형된 Kistler & Nitschmann 침전물 B+I이며;
상기 용매는 15 vol.% 내지 19 vol.% 에탄올을 함유한 수성 완충액이고;
상기 폐기 침전물 분획으로부터 IgG를 추출하는 방법은 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는, 방법. - 플라스마 또는 플라스마 분획으로부터 IgG를 분리하는 방법으로서,
a) 차가운 에탄올 분획화를 이용하여 상기 플라스마 또는 플라스마 분획을 분획화시켜 상기 플라스마 또는 플라스마 분획에 존재하는 대다수의 상기 IgG를 함유하는 액체 분획, 및 나머지 IgG를 함유하는 폐기 침전물 분획을 생산하는 단계; 및
b) 침전물로부터 Ig를 추출하기 위해 용매로 상기 폐기 침전물 분획을 균질화하여 상기 폐기 침전물 분획으로부터 상기 나머지 IgG의 적어도 일부를 추출하는 단계를 포함하고;
상기 폐기 침전물 분획은 IgG를 함유한 액체 분획을 생산하기 위한 분획화 단계 동안 생산되고, 상기 액체 분획은 Kistler & Nitschmann 상청액 B+I 또는 변형된 Kistler & Nitschmann 상청액 B+I이고, 상기 폐기 침전물 분획은 Kistler & Nitschmann 침전물 B+I 또는 변형된 Kistler & Nitschmann 침전물 B+I이며;
상기 용매는 15 vol.% 내지 19 vol.% 에탄올을 함유한 수성 완충액이고;
상기 폐기 침전물 분획으로부터 IgG를 추출하는 방법은 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는, 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용매가 17 vol.% 에탄올을 함유한 수성 완충액인, 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용매가 포스페이트 완충액, 아세테이트 완충액, 또는 이들의 조합을 이용하여 완충되는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용매는 4.8-5.3 범위의 pH를 갖는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 용매는 5.0-5.1 범위의 pH를 갖는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 용매는 5.1 ± 0.05의 pH를 갖는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출하는 동안의 온도는 -2℃ ± 5℃인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용매는 상기 폐기 침전물이 생성되는 분획화 단계에서 사용된 용매와 동일한 것인, 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 폐기 침전물 분획 대 용매의 비율이 1:2 내지 1:10인, 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 추출된 IgG를 함유한 상기 용매가 잔류 폐기 침전물 고체로부터 분리되는, 방법.
- 제 12 항에 있어서, 추출된 IgG를 함유한 상기 용매가 여과 또는 원심분리에 의해 잔류 폐기 침전물 고체로부터 분리되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출된 IgG가 상기 IgG 제조 공정 스트림으로부터 수득된 IgG와 혼합되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폐기 침전물로부터 수득된 상기 추출된 IgG가 추가로 가공되어 약학적 IgG 생성물을 생산하는, 방법.
- 제 15 항에 있어서, 약학적 IgG 생성물을 생산하기 위한 상기 추가 가공이 상기 용매로부터 상기 추출된 IgG의 침전을 포함하는, 방법.
- 제 16 항에 있어서, 상기 침전이 에탄올 농도, 온도 및 pH 중 하나 이상을 조정함으로써 달성되는, 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 침전이 Kistler & Nitschmann 분획 II를 산출하는, 방법.
- 제 16 항에 있어서, 상기 수득한 침전물이 상기 IgG 제조 공정 스트림으로부터 수득된 IgG 분획과 혼합되는, 방법.
- IgG의 제조 방법으로서,
a) 변형된 Kistler 및 Nitschmann B+I 분획화 공정으로부터 침전물 및 상청액을 회수하는 단계;
b) 단계 a)에서 수득된 상기 침전물을 균질화하고 그로부터 1 시간 내지 3 시간 동안 0 ℃에서 아세테이트 및 포스페이트를 함유하는 완충액 내 17 vol.% 수성 에탄올과 혼합함에 의해 IgG를 추출하는 단계; 및 이후
c) 잔류 침전물로부터 추출된 IgG를 함유한 상기 완충액을 분리하는 단계를 포함하는, 방법. - 제 20 항에 있어서,
d) 단계 c)에서 수득된 추출된 IgG를 함유한 상기 완충액을 단계 a)에서 수득된 상기 변형된 Kistler 및 Nitschmann B+I 상청액과 혼합하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제 20 항에 있어서, 단계 c)가 여과를 통해 수행되고 상기 방법이 추가로 하기 단계를 포함하는, 방법:
e) 변형된 Kistler 및 Nitschmann 분획 II 침전을 위한 조건에 따라 수성 에탄올에 상기 추출된 IgG를 항온처리하는 단계; 및
f) 상기 수득한 IgG-풍부한 분획 II 침전물을 회수하는 단계. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출된 IgG 생성물이 85 wt.% 이상의 모노머 및 다이머 그리고 10 wt.% 이하의 폴리머 및/또는 응집물을 포함하는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출된 IgG 생성물이 90% 이상의 감마글로불린의 순도를 포함하는, 방법.
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