KR20230087853A - 산모의 카드뮴 노출에 의한 조산 발생 가능성 예측을 위한 cg21010642 메틸화 바이오마커 - Google Patents

산모의 카드뮴 노출에 의한 조산 발생 가능성 예측을 위한 cg21010642 메틸화 바이오마커 Download PDF

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황승용
고은정
유소연
김승환
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한양대학교 에리카산학협력단
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Abstract

본 발명은 cg21010642 위치의 DNA 메틸화 패턴을 산모의 중금속 노출에 따른 조산 발생 가능성을 예측할 수 있는 바이오마커로 제공하여 임상적 진단이 어려운 조산을 조기에 예측할 수 있다. 본 발명의 바이오마커는 특정 위치의 CpG의 메틸화 패턴으로 DNA 메틸화 변화는 검출이 용이하고 종래 단백질이나 RNA 마커들에 비해 안정적이며 분석이 쉬운 장점이 있다.

Description

산모의 카드뮴 노출에 의한 조산 발생 가능성 예측을 위한 cg21010642 메틸화 바이오마커 {DNA methylation pattern of cg21010642 site as a biomarker for predicting preterm birth affected by maternal Cd exposure}
본 발명은 cg21010642 위치의 DNA 메틸화 패턴을 산모의 중금속 노출에 따른 조산 발생 가능성을 예측할 수 있는 바이오마커로 제공하고, 상기 CpG 영역의 DNA 메틸화 수준을 측정하여 산모의 중금속 노출에 따른 조산 발생 가능성을 예측할 수 있는 방법 등을 제공하는 것이다.
익스포좀(exposome)은 일생의 노출과 그 영향의 총체를 정의하며 외부 환경, 내부 환경, 건강 위험의 세 가지 요소로 구성된다. 익스포좀 연구는 다양한 외부 소스로부터의 환경성 노출이 체내 분자유전학적 조절 시스템을 어떻게 변화시키고 이러한 변화가 건강에 미치는 영향을 체계적으로 이해하는 것을 목표로 한다. 익스포좀의 개념은 등장한지 10년이 넘었지만, 아래 (1) 내지 (3)과 같이 단편적 연관성만을 고려한 연구가 대부분인 실정이다: (1) 환경성 노출과 건강 위험; (2) 환경성 노출 및 후성유전학적 조절; (3) 건강 위험 및 후성유전학적 조절.
환경성 노출에 따른 결과는 즉각적으로 나타나지 않기 때문에 그 영향이 쉽게 간과되는 경우가 많다. 예를 들면, 약 10년 전 한국에서 많은 사람들이 가정에서 일반적으로 사용되는 가습기 살균제의 독성 물질에 노출되는 사건이 있었다. 가습기 살균제를 사용할 당시에는 그 독성을 즉각적으로 체감할 수 없었지만, 결국에는 그 독성에 노출된 많은 사람들이 돌이킬 수 없는 질환에 걸리거나 목숨을 잃기도 하였다. 이렇듯 환경성 노출이 우리의 건강에 미치는 영향을 이해하는 것은 중요하다. 인간 현상의 대부분은 분자유전학적 조절을 통하기 때문에 이를 매개로 한 익스포좀 연구는 환경성 노출에 의한 건강 영향을 이해하기에 좋은 접근방법이다.
임산부와 태아는 익스포좀 연구의 주목할만한 대상이다. 임신 중 산모의 환경성 노출은 태아에게 쉽게 전달되며, 그 독성은 태아의 초기 발달을 비롯하여 생후 일생의 건강에 영향을 미칠 수 있다. 수은(Hg), 납(Pb), 카드뮴(Cd) 등의 중금속은 대표적인 환경독성물질로, 식이(특히 생선 섭취), 화장품, 흡연 및 호흡을 통해 노출되고 체내로 유입된 중금속은 잘 배출이 되지 않고 축적되며, 발달, 신경, 면역 관련 독성을 나타낸다. 산모의 중금속 노출은 태아에게 쉽게 전달되는데, 그 독성이 태아에게 미치는 영향의 한 예로 조산 또는 저체중아와 같은 출생 결과를 관찰할 수 있다. 조산은 임신 기간이 만 37주 미만인 출산을 정의하며, 세계보건기구(WHO)에 따르면 매년 전 세계적으로 전체 출생의 10%에 해당하는 1,500만명이 조산아로 태어난다고 보고되고 있다. 뿐만 아니라 한국의 인구 주택 총 조사에서도 2020년 국내 총 출생아의 8.5%가 조산아인 것으로 나타났으며, 그 비율은 지난 10년 동안 지속적으로 증가하고 있다. 조산의 주요 원인은 자궁 내 염증과 산화적 스트레스로 알려져 있으며 중금속 노출은 이러한 감염 또는 면역 반응을 유발할 수 있다. 조산은 자궁 내에서의 태아 발달이 불충분했음을 의미하므로, 이러한 미성숙 상태로의 출생은 일생에 걸친 생후 건강에 영향을 미칠 가능성이 높다.
한편, DNA 메틸화는 DNA 염기서열 자체는 변화시키지 않으면서 구조적인 변화를 통해 분자유전학적 현상을 조절하는 기작이다. 유전자 프로모터 영역의 약 70%는 DNA 메틸화가 일어나는 CpG 섬 근처에 위치한다는 점에서 DNA 메틸화와 유전자 발현은 밀접한 상관관계를 가지고 있다. 보통 DNA 메틸화는 전사 인자가 접근하기에 어려운 형태로 DNA 구조를 변형시키기 때문에 DNA 메틸화는 유전자 발현과 역의 상관관계를 가진다. DNA 메틸화는 환경성 노출과 같은 외부 요인에 쉽게 영향을 받으며, 이러한 조절은 유전자 발현, 단백질 코딩 및 표현형에 연속적으로 영향을 미쳐 좋지 않은 결과를 초래하여 만성적인 건강 문제 또는 질병의 발병의 결과로 나타난다.
이에, 본 발명자들은 산모의 중금속 노출에 의한 태아의 조산 발생 가능성을 확인하기 위한 생애 초기 익스포좀을 연구하였다. 한국의 대규모 출생 코호트 중 하나인 MOCEH(Mothers' and Children's Environmental Health) 연구 자료를 이용하여 산전 중금속 노출과 재태 연령 간의 연관성을 연구하여 본 발명을 완성하였다.
KR 10-1695347
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 환경성 노출, 특히 중금속 노출과 재태 연령 간의 연관성을 연구하여 cg21010642의 메틸화 패턴을 산모의 카드뮴 노출에 따른 조산 발생 가능성 예측을 위한 바이오마커로 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 cg21010642의 메틸화 패턴을 검출할 수 있는 제제를 포함하여 조산 발생가능성 예측용 조성물 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 cg21010642의 메틸화 패턴을 검출하여 조산 발생 가능성을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 cg21010642의 메틸화 패턴을 산모의 카드뮴 노출에 따른 조산 발생 가능성 예측을 위한 바이오마커로 제공한다.
본 발명에서 cg21010642는 6번 염색체 상에 JARID2 유전자의 open sea에 위치하는 CpG site이다.
또한, 본 발명은 cg21010642의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 조산 발생 가능성 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 조산 가능성 예측용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 (1) 산모의 제대혈 임상샘플에서 gDNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 gDNA에서 cg21010642의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (3) 상기 분리된 gDNA에서 cg21010642 위치에서 메틸화 수준이 카드뮴 노출 수준이 낮은 것으로 확인된 산모의 cg21010642 위치에서 메틸화 수준보다 높은 경우 조산 가능성이 있는 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 산모의 조산 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 cg21010642의 메틸화 수준을 측정하기 위한 제제는 메틸화된 CpG 섬 부위를 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 메틸화된 CpG 섬 부위와 혼성화할 수 있는 프로브, 메틸화된 CpG 섬 부위와 결합할 수 있는 메틸화 특이적 결합 단백질, 메틸화 특이적 결합 항체 또는 압타머, 메틸화 민감성 제한 엔도 뉴클라아제, 시퀀싱 프라이머로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 상기 검출을 위해서 PCR, 메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 항체 또는 압타머를 이용한 PCR, 마이크로어레이, 차세대 염기서열 분석법으로 구성된 군에서 선택되는 방법을 선택할 수 있다.
본 발명에서는 JARID2 유전자 부근의 염기서열과 상보적인 프로브로 cg21010642의 메틸화수준을 확인하였다. 상기 프로브는 서열번호 1로 이루어졌으며, cg21010642는 프로브의 61-62 번째 위치한 염기이다. 인간의 전장 유전체 상에서 서열번호 1의 염기서열이 위치하는 자리는 15,291,927-15,292,048이고, cg21010642는 15,291,987-15,291,988에 위치한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조산은 산모의 중금속 노출에 따른 조산일 수 있으며, 특히 카드뮴 노출에 따른 조산일 수 있다.
한편, 상기 정보제공방법에서 (1) 단계의 임상샘플은 제대혈 샘플일 수 있다.
또한, 본 발명의 조산은 한국인 산모의 조산인 것일 수 있다.
본 발명은 산모의 중금속 노출에 따른 조산 예측용 바이오마커를 제공하여 임상적 진단이 어려운 무증상 임산부에 대해서도 조산을 조기에 예측할 수 있도록 한다. 본 발명의 바이오마커는 특정 위치의 CpG의 메틸화 패턴으로 DNA 메틸화 변화는 검출이 용이하고 종래 단백질이나 RNA 마커들에 비해 안정적이며 분석이 쉬운 장점이 있다. 본 발명에서 제시하는 DNA 메틸화 마커는 조산에 특이적인 것일 수 있지만, 그 결과를 도출하기 위해 사용한 분석 방법은 산모의 카드뮴 노출 및 조산 발생에 국한되지 않는다.
도 1은 산모와 태아의 중금속 노출 수준 사이의 연관성을 확인한 결과이다.
도 2는 재태 연령에 따른 각 CpG 위치의 메틸화 변화의 유의 수준을 나타내는 맨해튼 플롯이다.
도 3은 산모의 카드뮴 노출 수준 또는 재태 연령과 cg21010642 위치의 차등 메틸화 패턴간과 연관성을 확인한 결과이다.
본 발명에서 용어, "메틸화" 또는 "메틸레이션"은 DNA를 구성하는 염기서열 중 사이토신에 메틸기가 부착되는 것을 말한다. 메틸화가 일어난 경우 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 억제되며, 반대로, 비메틸화 또는 저메틸화가 일어나는 경우 특정 유전자의 발현이 증가하게 된다.
포유동물 세포의 게놈 DNA에는 A, C, G 및 T 에 더하여, 사이토신 링의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸사이토신(5-methylcytosine, 5-mC)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-메틸사이토신의 메틸화는 CpG라고 불리는 CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에서만 일어나고, CpG의 메틸화는 alu 또는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 티민(T)이 되기 쉽기 때문에, CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다.
본 발명에서 용어, "메틸화 수준의 측정"은 지놈 상 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것으로서, 메틸화된 지역을 선별해 내어 그 부위를 정량적으로 검출하는 방법을 수반할 수 있다. 예를 들어 메틸화 특이적 PCR(methylation-specific polymerase chain reaction, MSP), 실시간 메틸화 특이적 PCR(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 또는 정량 PCR 등을 통해 측정할 수 있다. 또는, 파이로시퀀싱 또는 바이설파이트 시퀀싱과 같은 차세대 염기서열 분석법 등의 방법으로 측정하거나, DNA 메틸레이션 마이크로어레이 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머, 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머, 메틸화된 CpG 결합 도메인, 또는 메틸화 DNA에 특이적으로 결합하는 메틸화 DNA항체 (예를 들어, 메틸사이토신에 특이적으로 결합하는 항체) 등을 포함할 수 있다.
상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트일 수 있다. 바이설파이트 변환된 DNA는 서열분석 또는 메틸화 특이적 PCR 등 다양한 방법을 통하여 메틸화 수준을 측정할 수 있으며, 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 유전자의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, WO01/26536; US2003/0148326A1).
또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있다. 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 제한효소 인식부위의 C에서의 메틸화 또는 비메틸화에 따라 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지고 이를 PCR 또는 서던블롯(Southern Blot) 분석을 통해 검출할 수 있게 된다. 상기 제한효소 이외의 다른 메틸화 민감성 제한효소는 당 업계에 잘 알려져 있다.
개체의 유전자의 특정 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 대표적인 일예로서, 환자의 시료에서 게놈 DNA(genomic DNA: gDNA)를 수득하고, 수득한 gDNA에 메틸화되지 않은 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소를 처리한 후, 상기 처리된 DNA를 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시키고 그 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 것을 통해 측정할 수 있다.
따라서, 본 발명의 제제는 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역 전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다.
한편, 메틸화 DNA 항체란 DNA 중의 메틸화된 염기에 특이적으로 결합하는 항체를 말한다. 구체적으로는, 메틸 사이토신에 대한 항체와 같이, DNA 사슬 중 메틸화된 사이토신을 인식하여 결합하는 성질을 가진 항체를 들 수 있다. 또한, 시판되고 있는 메틸화 DNA 항체 중에서 본원에 기재된 메틸화 상태의 DNA를 특이적으로 인식하여 특이적으로 결합할 수 있는 항체일 수 있다.
메틸화 DNA 항체는 메틸화된 염기, 메틸화 DNA 등을 항원으로 하여 통상의 방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들어, 메틸사이토신 항체를 제조하기 위해서는, 5―메틸사이티딘, 5―메틸사이토신, 또는 5―메틸사이토신을 포함하는 DNA 등을 항원으로 하여 항체를 제조한 후 DNA 중의 메틸사이토신으로의 특이적인 결합을 지표로서 선별할 수 있다.
또한, 메틸화된 CpG 결합 도메인(CpG binding domain: MBD) 또는 메틸화 DNA 항체를 이용하여 메틸화 수준을 측정하는 경우, 이들을 이용하여 메틸화된 DNA를 면역침강시킨 후, 서던블롯, PCR, 마이크로어레이, 또는 서열분석(sequencing) 등을 통해 특정 CpG 부위를 확인할 수 있다. 또한, 항체의 면역학적 검출 또는 정량을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질 표지, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 사용할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광 물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있고, 그 외 방사성 동위원소 표지, 라텍스 비드 표지, 콜로이드 표지, 비오틴 표지 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물 및 키트에는 상기 제제 이외에도, 중합효소 아가로스, 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 상기 키트는 DNA 메틸화 마이크로어레이 형태로 구현될 수 있다.
또한, 본 발명은 개체로부터 획득된 생물학적 시료(즉, 임상샘플)로부터 게놈 DNA를 수득하여 cg21010642의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 상기 위치에서 메틸화 수준이 증가하는 경우 조산 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는 조산 발생 가능성 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 임상샘플에서 게놈 DNA의 수득은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법, CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
상기 정보제공방법에서 메틸화의 검출은 메틸화된 염기와 메틸화되지 않은 염기의 차이를 이용한, 제한효소 또는 바이설파이트를 이용하는 방법, 메틸화된 CpG 결합 도메인 또는 항-메틸사이토신 항체를 이용한 면역침강방법(예, MIRA, MeDIP)을 통해 메틸화된 염기서열을 선별해 낼 수 있으며, 이를 이용하여 메틸화 수준을 측정 내지 검출하기 위한 방법으로는 DNA 마이크로어레이 메틸화 특이적 중합효소반응(methylation-specific polymerase chain reaction), 실시간 메틸화 특이적 중합효소반응(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 파이로시퀀싱, 바이설파이트 시퀀싱, 면역침강 기반 차세대 염기서열 분석법 등이 있다.
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[실험 방법]
1. 샘플 준비
MOCEH(Mothers' and Children's Environmental Health) 연구는 산모의 환경성 노출이 태아의 생후 건강에 미치는 영향을 이해하기 위해 설립된 한국의 출생 코호트 중 하나이다. MOCEH 연구는 2006년부터 2010년까지 1,751명의 임산부를 모집했으며, 모든 참가자의 인체 시료 및 임상 정보는 사전 동의를 받은 후 수집되었다. 본 발명에서는 384명의 제대혈 gDNA와 그 대상자에 상응하는 메타데이터를 제공받았다. 메타데이터에는 산모의 혈액과 제대혈에서 측정한 혈중 중금속 농도와 재태 연령 등을 포함하고 있다. 샘플과 정보는 MOCEH 연구의 자원을 관리하는 국립환경과학원(NIER)에서 제공받아 사용하였다. 이하의 연구는 NIER의 생명윤리심의위원회의 승인을 받아 진행하였다.
2. DNA 메틸화 분석
1 μg의 gDNA를 EZ-96 DNA 메틸화 키트(Zymo Research, CA, USA)를 사용한 바이설파이트(bisulfite) 처리를 통해 메틸화되지 않은 사이토신을 티민으로 치환하고, 메틸화된 사이토신만을 그 자체로 남겼다. 바이설파이트 처리된 DNA를 Infinium MethylationEPIC Kit(Illumina, CA, USA)를 사용하여 순차적으로 증폭, 단편화 및 정제하였다. 준비된 DNA 단편을 850만 개 이상의 프로브가 집적된 HumanMethylationEPIC array chip에 로딩하였다. DNA 단편과 프로브의 혼성화에 의해 발하는 형광강도는 iScan System (Illumina)을 이용하여 이미지화 되어 .idat 포맷의 원시데이터(raw data)로 산출되었다.
3. Quality Control (QC) 진행
하위 분석에 앞서 384명의 개별 EPIC 어레이 원시 데이터에 대해 적절한 QC 기준을 사용하여 전처리하였다. 첫째, 메타데이터가 완전히 결측된 샘플은 분석에서 제외하였다. 그 이후의 샘플 QC 기준은 다음과 같다: (1) 바이설파이트 처리 효율이 낮은 샘플(< 0.85); (2) 검출 효율의 유의 수준 (p-value)이 0.001보다 높은 프로브가 하나 이상 존재하는 샘플; (3) 메타데이터를 통해 제공받은 성별과, EPIC 어레이에 집적되어 있는 특정 프로브의 강도로 예측된 성별이 서로 일치하지 않는 샘플. 마찬가지로 다음 기준에 해당하는 프로브는 분석에서 제외하였다: (1) 전체 샘플의 5% 이상에서 검출 효율의 유의 수준(p-value)이 10-16보다 높은 프로브, (2) 2개 이상의 CpG 부위에 대한 교차 반응성을 가지는 프로브, (3) 단일 염기 다형성(SNP) 또는 성염색체에 위치한 프로브.
필터링된 데이터는 메틸화 수준을 0~1의 상대적인 수치로 표현한 β 값으로 변환되었다. 샘플 전체에서 β 범위가 0.05 미만인 프로브는 외부 자극에 유의한 변화를 보이지 않는 것으로 간주하여 제거하였다. 마지막으로 β 값은 메틸화 및 비메틸화 비율을 log2로 치환한 M-값으로 변환하였다.
4. Data Correction
혈액을 구성하는 다수의 세포 종은 서로 상이한 DNA 메틸화 패턴을 가지므로, 분석에 교란 효과를 줄 수 있다. 따라서 EPIC 어레이에 집적되어 있는 특정 프로브의 세기와 제대혈 레퍼런스 패널을 사용하여 각 샘플의 7가지(CD8+T, CD4+T, 자연 살해 세포, B 세포, 단핵구 및 과립구, 유핵 적혈구)유형의 세포 조성을 계산하였다. 태아의 성별과 산모의 연령, BMI, 출산력, 및 흡연 여부를 포함하여 배치 효과, 세포 조성은 DNA 메틸화 분석에 영향을 주는 교란 변수로 간주되는 바, 상기 변수에 대한 데이터 보정을 실시하였다.
5. 생물정보 및 통계 분석
EPIC 어레이 원시 데이터의 전처리 및 EWAS(Epigenome-Wide Association Studies) 분석은 minfi (ver 1.36.0), wateRmelon (ver 1.34.0), maxprobes (ver 0.0.1), sva (ver 3.38.0), limma (ver 3.46.0) 및 DMRcate (ver 2.4.1)의 패키지와 본 발명에서 별도 작성한 코드를 이용하여 R (version 4.0.4) 환경에서 수행하였다. 차등 메틸화 위치(Differentially methylated positions: DMPs)는 p < 10-8, q < 10-5 의 통계적 기준으로 정의되었다.
[실험 결과]
1. 샘플 및 데이터 준비
384명의 피험자 중 8명의 데이터는 제거하였다. 4명은 메타데이터가 완전히 결측되었고, 다른 4명은 출생 체중, 재태 연령(GA), 산모의 혈중 Pb 농도 및 제대혈 중 Cd 농도 값에 대해 이상치를 가지고 있었다. 남은 376명의 메타데이터에서 일부 결측값을 보충(imputation)하였다. 앞서 기술된 전처리 과정을 통해서 242,378 개의 프로브와 9개 샘플이 제거되어 최종적으로 367개의 샘플과 623,481개 프로브로 정제되었다. 최종 367개 샘플의 정보는 아래 표 1과 같다.
Newborns (n = 367) Mothers (of 367 newborns)
Boys 186 Age (year) 30.4 ± 3.6
Girls 181 BMI (kg/m2) 22.9 ± 3.1
Gestational age (day) 275.4 ± 8.2 Smoker (yes / no) 38 / 329
Preterm birth (case/control) 5 / 362 Parity (0 / > 0) 209 / 158
Hg (μg/L) 5.9 ± 2.8 Hg (μg/L) 3.6 ± 1.9
Pb (μg/L) 10 ± 4.2 Pb (μg/L) 13.7 ± 5.7
Cd (μg/L) 0.7 ± 0.2 Cd (μg/L) 1.6 ± 0.4
2. 노출 평가 (Exposure Assessment)
산모의 혈중 및 제대혈 중 중금속 수치 (각 산모와 태아의 노출 수준)는 모두 정규 분포를 위해 로그 치환되었다. 산모 및 태아의 중금속 노출 수치의 상관관계와, 혈중 중금속 노출 수치와 재태 연령 간의 연관성은 선형 회귀 모델을 사용하여 평가하였다. Hg 및 Pb에 대한 산모와 태아의 노출 수준은 Pearson의 상관 계수(r)가 각각 0.748 및 0.508인 강한 양의 연관성을 보여주었으나, Cd는 양의 상관 관계가 강한 정도에 미치지 못했다(r = 0.130)(도 1). 재태 연령은 산모와 태아 모두에서 수은 노출 수준과 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났고, Pb 및 Cd 노출 수준과 음의 상관관계를 보였다. 그러나 상관관계는 통계적으로 유의하지 않았다(표 2).
F-statistics (p) Pearson's Coefficients
Maternal-Prenatal exposure
Hg 2.277 × 10-67 *** 0.750
Pb 3.773 × 10-25 *** 0.505
Cd 0.013 * 0.130
Exposure-Gestational age
Maternal Hg 0.924 0.005
Pb 0.199 -0.067
Cd 0.303 -0.054
Prenatal Hg 0.542 0.032
Pb 0.170 -0.072
Cd 0.983 -0.001
(* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001)
3. 중금속 노출 및 출생 결과에 대한 EWAS
367명의 피험자의 노출 수준과 재태 연령을 연속 변수로 사용하여 EWAS 분석을 수행하였다. 산모 및 태아의 노출 수준에 대해서는 앞서 설정한 통계적 유의 수준에 부합하는 차등 메틸화 패턴을 확인할 수 없었지만, 통계적 기준을 p < 10-5 로 낮추었을 때 산모의 Pb 및 Cd 노출 수준과 태아의 Pb 노출 수준에 따라 유의하게 변화하는 차등 메틸화 위치(DMP) 각 11, 4 및 46개를 확인하였다. 반면, 재태 연령에 따라서는 2,002 개의 DMP를 확인하였다(p < 10-8, q < 10-5)(도 2). 이들은 노출 수준과 재태 연령에 대한 연속 변수로 분석된 결과이므로, 노출 수준과 재태 연령에 대해 on-off 효과보다는 정량적 연관성이 있음을 시사한다.
한편, cg21010642는 산모의 Cd 노출 수준 및 재태 연령에 대해 공통적으로 차등 메틸화됨을 확인하였다. cg21010642의 메틸화 패턴은 산모의 Cd 노출과 양의 관계를, 재태 연령과는 역의 관계를 가지고 있었다(도 3, 표 3).
Differential methylation (β) Linear regression
p-value q-value p-value Correlation
Maternal Cd 8.6 × 10-6 0.14 1.07 × 10-5 0.2275
Gestational age 5.4 × 10-10 2.7 × 10-7 6.4 × 10-10 -0.3154
아래의 표 4는 case group(산모의 카드뮴 노출 수준이 높으면서 재태 연령이 낮은 그룹)과 control group(산모의 카드뮴 노출 수준이 낮으면서 재태 연령이 높은 그룹)에서 cg21010642 위치의 메틸화 수준을 측정한 값을 비교한 것이다. 앞서 기술한 바와 같이 전체적인 분석은 연속형 변수 형태로 진행되었기 때문에 case와 control 그룹은 전체 그룹 내에서 카드뮴 농도와 재태 연령의 상위 또는 하위 5% 기준으로 선정한 결과이다.
산모 카드뮴 농도 재태 연령 메틸화 값(β)
Case 2.17 ± 0.29 264 ± 2.65 0.912 ± 0.001
Control 1.04 ± 0.25 285 ± 4.56 0.904 ± 0.001
p-value 9.50 × 10-4 2.23 × 10-5 1.67 × 10-4
종합하면, 산모의 Cd 노출 증가는 cg21010642의 과메틸화를 일으키고 이는 재태 연령의 감소를 유발하여 조산 발생에 기여할 수 있음으로 연결지을 수 있었다. 산모의 Cd 수준과 재태 연령 사이에 역의 관계는 선형 회귀 모델의 결과에서도 확인이 가능하며, 이러한 DNA 메틸화 패턴은 환경성 노출과 건강 위험 간의 상관관계를 설명할 수 있다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> DNA methylation pattern of cg21010642 site as biomarker for predicting preterm birth affected by maternal Cd exposure <130> APC-2021-0815 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 122 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> GC_signal <222> (61)..(62) <400> 1 cataataaca aattttttga aacctctctc attgccatct tttctgaaac aaatgccctt 60 cgatttaggt ttcataatgg atgttgtagg tctgtgtgat taggcttttt ttttgagtct 120 tg 122

Claims (8)

  1. cg21010642의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 조산 가능성 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제제는 메틸화된 CpG 섬 부위를 포함하는 단편을 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 메틸화된 CpG 섬 부위와 혼성화할 수 있는 프로브, 메틸화된 CpG 섬 부위와 결합할 수 있는 메틸화 특이적 결합 단백질, 메틸화 특이적 결합 항체 또는 압타머, 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클라아제, 시퀀싱 프라이머로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조산은 산모의 카드뮴(Cd) 노출에 따른 조산인, 조성물.
  4. 제1항의 조성물을 포함하는 조산 예측용 키트.
  5. 하기 단계를 포함하는 산모의 조산 예측을 위한 정보제공방법:
    (1) 임상샘플에서 gDNA를 분리하는 단계;
    (2) 상기 분리된 gDNA에서 cg21010642의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
    (3) 상기 분리된 gDNA에서 cg21010642 위치에서 메틸화수준이
    카드뮴 농도가 1.04 이하로 확인된 산모의 cg21010642 위치에서 메틸화 수준보다 큰 경우 조산 고위험군으로 판별하는 단계.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 (2) 단계는 PCR, 메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 메틸화 DNA 특이적 결합 항체 또는 압타머를 이용한 PCR, 마이크로어레이, 차세대 염기서열 분석법으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것인, 정보제공방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 임상 샘플은 제대혈 샘플인 것인, 정보제공방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 조산은 산모의 카드뮴(Cd) 노출에 따른 조산인, 정보제공방법.
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