KR102281644B1 - 지연성 허혈 진단을 위한 insr 유전자 과메틸화 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 INSR(insulin receptor) 유전자의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 지연성 허혈 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 지연성 허혈 진단용 키트, 및 상기 조성물 및 키트를 이용한 지연성 허혈 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명의 지연성 허혈 진단용 조성물, 지연성 허혈 진단용 키트 및 지연성 허혈 진단을 위한 정보 제공 방법에 따르면, INSR 유전자의 업스트림의 원위 유전자간 영역의 메틸화 수준을 측정하여, 지주막하 출혈 후 발생하는 지연성 허혈의 발병 위험 예측 또는 진단에 이용할 수 있다.

Description

지연성 허혈 진단을 위한 INSR 유전자 과메틸화 마커 {INSR Gene hypermethylation marker for diagnosis of delayed cerebral ischemia}

본원은 INSR(insulin receptor) 유전자의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 지연성 허혈 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 지연성 허혈 진단용 키트, 및 상기 조성물 및 키트를 이용한 지연성 허혈 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

뇌동맥류 파열에 의한 지주막하 출혈(Subarachnoid hemorrhage, SAH)은 생명을 위협하는 질환으로서, 발병 후 30일 안에 45%의 사망률에 이르는 질병이다. 또한, 지연성 허혈(Delayed cerebral ischemia, DCI)은 지주막하 출혈 이후 30~40% 범위 내에서 발병할 수 있으며, 이는 사망률의 주요 원인과 관련이 있다. 지연성 허혈을 갖는 지주막하 출혈 환자의 경우, 지연성 허혈이 발병하지 않은 환자에 비해 폐렴, 심장 부정맥, 장출혈 및 요로 감염과 같은 다양한 합병증을 가질 가능성이 높고, 이로 인해 입원기간의 장기화 및 의료 비용 증가 등에 이를 수 있다. 이러한 지연성 허혈의 발병은 다양한 임상적 및 방사선학적 변수에 영향을 받는다. 잘 알려진 지연성 허혈의 임상적 위험인자는 여성 성별, 흡연 및 입원시의 낮은 임상 등급이다. 높은 Hunt-Hess-등급(Ⅳ 및 Ⅴ 등급) 또는 세계신경외과학회연맹(World Federation of Neurosurgical Societies, WFNS) 등급은 지연성 허혈의 발병 가능성을 증가시킨다.

지연성 허혈 발병과 관련하여, 단일염기다형성(single nucleotide polymorphisms, SNP) 또는 전장유전체 관련 분석(genome-wide association study, GWAS)과 같은 다양한 유전학적 연구가 이루어지고 있다. 그러나, 민감성 유전적 변이의 비율은 5 내지 10% 정도만 관찰되었으며, 이는 DNA 서열 스케일을 넘어서는 아직 알려지지 않은 다양한 유전적 변이가 있음을 암시한다.

상기 알려지지 않은 신규한 경로 중 하나로서, DNA 메틸화, 히스톤 변형 및 비-암호화 RNA 등을 포함하는 후생유전학적 메커니즘이 있다. 이 중, DNA 메틸화는 구아닌 앞의 시토신 뉴클레오타이드에 메틸기가 결합하는 과정으로서, 일반적으로 유전자 전사를 억제한다고 알려져 있다. 현재까지, 지주막하 출혈 환자에서 지연성 허혈에 따른 후생유전학적 프로파일을 확인하는 연구는 진행된 바 없었다.

이에 본 발명자들은 지주막하 출혈 후 발생하는 지연성 허혈의 발병 진단, 발병 위험 예측 및 예후 예측을 효율적이고 손쉽게 할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 특정 유전자 상의 메틸화 수준을 측정하거나, 유전자 발현 수준을 측정하여 지연성 허혈을 진단 또는 예측할 수 있는 진단용 조성물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

한국 공개특허 제10-2019-0008216호

본원은 INSR(insulin receptor) 유전자의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 지연성 허혈 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 지연성 허혈 진단용 키트, 및 상기 조성물 및 키트를 이용한 지연성 허혈 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하고자 한다.

본원의 목적들은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 본원의 다른 목적 및 장점들은 하기의 설명에 의해서 이해될 수 있고, 본 원의 실시예에 의해 보다 분명하게 이해될 것이다. 또한, 본원의 목적 및 장점들은 특허 청구 범위에 나타낸 수단 및 그 조합에 의해 실현될 수 있음을 쉽게 알 수 있을 것이다.

본원의 제 1 측면은, INSR(insulin receptor)의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 지연성 허혈 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본원의 제 2 측면은 INSR(insulin receptor)의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 지연성 허혈 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본원의 제 3 측면은, 상기 지연성 허혈 진단용 조성물을 포함하는, 지연성 허혈 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본원의 제 4 측면은, 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터, INSR(insulin receptor) 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지연성 허혈 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 지연성 허혈 진단용 조성물, 지연성 허혈 진단용 키트 및 지연성 허혈 진단을 위한 정보 제공 방법에 따르면, INSR 유전자의 메틸화 수준을 측정하여, 지주막하 출혈 후 발생하는 지연성 허혈의 발병 위험 예측 또는 진단에 이용할 수 있다.

도 1은 INSR 유전자의 과메틸화를 이용한 지연성 허혈 진단 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 지연성 허혈에 대한 전후생유전체 연관성 연구를 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 INSR 유전자의 과메틸화 영역의 염기서열과, 메틸화-특이적 PCR에 사용된 프라이머의 위치를 나타낸 도면이다.
도 4는 CDHR5 유전자의 과메틸화 영역의 염기서열과, 메틸화-특이적 PCR에 사용된 프라이머의 위치를 나타낸 도면이다.
도 5는 INSR 유전자 및 CDHR5 유전자의 메틸화-특이적 PCR 분석 결과를 나타낸 것으로서, 구체적으로 지연성 허혈 환자 및 비-지연성 허혈 환자 사이의 메틸화의 차이에 따른 계층적 클러스터링을 나타낸 도면이다.
도 6은 지주막하 출혈 후 발생된 지연성 허혈에 따른 INSR의 mRNA 발현 수준을 나타내는 도면이다.
도 7은 지주막하 출혈 후 발생된 지연성 허혈에 따른 CDHR5의 mRNA 발현 수준을 나타내는 도면이다.
도 8은 지주막하 출혈 후 발생된 지연성 허혈에 따른 INSR 및 CDHR5의 과메틸화수준을 나타낸 도면이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본원의 제 1 측면은, INSR(insulin receptor) 유전자의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 지연성 허혈 진단용 조성물을 제공한다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "지연성 허혈(delayed cerebral ischemia, DIC)”은 국소 신경 장애 (예컨대, 반신불완전마비, 언어상실증, 행위상실증, 반맹 또는 무시)의 발생, 또는 글래스고 혼수 척도 (전체 스코어 또는 이의 개별 구성요소 중 하나)의 감소를 의미하는 것으로서, 지연성 허혈의 발병은 다양한 임상적 및 방사선학적 변수에 의한 것일 수 있다. 본원에서, 상기 “지연성 허혈”은 “DIC”, "지연성 뇌허혈"과 혼용되어 명명될 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1을 포함하는 뉴클레오타이드의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "INSR"는 인슐린 수용체(insulin receptor)를 암호화하는 유전자로서, 상기 유전자의 스플라이싱에 의해 인슐린 수용체 A(IR-A) 및 B가(IR-B) 동형 단백질이 번역될 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물의 INSR 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 영역은 구체적으로 인간 19번 염색체의 7194868번째 내지 7195079번째 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 7194996번째일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예예 있어서, 상기 조성물은 CpG site ID: cg00441765 부분의 메틸화 수준을 측정하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 CDHR5(cadherin related family member 5) 유전자의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 2를 포함하는 뉴클레오타이드의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물의 CDHR5 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 영역은 구체적으로 인간 11번 염색체의 618990번째 내지 619260번째 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 619080번째일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "CDHR5(cadherin related family member 5)"는 카드헤린(cadherin) 슈퍼패밀리 중 하나로서, 모든 카드헤린에서 발견되는 칼슘-결합 모티프(calcium-binding motifs)를 암호화하는 서열을 포함하고 있으며, 스플라이싱에 의해 다양한 동형 단백질을 암호화하는 것으로 알려져 있다.

본원의 일 구현예예 있어서, 상기 조성물은 CpG site ID: cg11464053 부분의 메틸화 수준을 측정하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 CpG site ID: cg08969578, cg15090337, cg02180699, cg26306080, cg26826512, cg09217327, cg23222472, 및 cg19751670으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 부분의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 ILDR1, NOL4L, ZNF706, IR640, MAP3K13, ASCC2, LSMEM1 및 LOC389641으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "메틸화(methylation)"또는 "DNA 메틸화"는 DNA를 구성하는 염기에 메틸기가 부착되는 것을 의미하는 것으로서, 예를 들어, 상기 메틸화 여부는 특정 유전자의 특정 CpG(Cytosine phosphate Guanine) 부위의 사이토신에서 일어나는 메틸화 여부를 의미하는 것일 수 있다. 일반적으로, 메틸화 또는 과메틸화가 일어난 경우 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 억제될 수 있으며, 반대로, 비메틸화 또는 저메틸화가 일어나는 경우 특정 유전자의 발현이 증가하게 될 수 있다.

포유동물 세포의 게놈 DNA 에는 A, C, G 및 T 에 더하여, 사이토신 링의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸사이토신(5-methylcytosine, 5-mC)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-메틸사이토신의 메틸화는 CpG라고 불리는 CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에서만 일어나고, CpG의 메틸화는 alu 또는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 티민(T)이 되기 쉽기 때문에, CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후성유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "메틸화 수준의 측정"은 특정 유전자, 구체적으로 INSR 유전자 및/또는 CDHR5 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것으로서, 메틸화 특이적인 PCR, 예를 들어 메틸화 특이적 PCR(methylation-specific polymerase chain reaction, MSP), 실시간 메틸화 특이적 PCR(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 또는 정량 PCR 등을 통해 측정할 수 있다. 또는, 파이로시퀀싱, MS-HRM (Methylation-Sensitive High-Resolution Melting Analysis, 메틸화 특이- 고해상도 융해곡선 분석)과 메틸화 민감성 제한효소를 사용한 메틸화 여부 측정, DNA 칩 및 바이설파이트 시퀀싱과 같은 자동염기분석 등의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, "메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제"는 특정 DNA 영역의 메틸화 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 구체적으로 INSR 유전자 및/또는 CDHR5 유전자에 대한 메틸화-특이적 PCR을 수행하기 위한 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 메틸화 수준을 측정에 사용되는 프라이머는, 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있고, 상기 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "프라이머"는, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

상기 메틸화 수준을 측정에 사용되는 프로브는 혼성화 프로브를 의미하는 것일 수 있으며, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프로브는 메틸화 수준을 측정하여 지연성 허혈을 진단하기 위한 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다. 중요한 프로브는 검출할 수 있도록 표지 될 수 있으며, 예를 들면 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제는 메틸화-특이적 PCR에 이용할 수 있는 프라이머 세트일 수 있으며, 구체적으로 메틸화-특이적 프라이머 세트 및 비-메틸화 특이적 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, INSR 유전자의 메틸화 수준을 측정하기 위한 상기 메틸화-특이적 프라이머 세트는 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 것일 수 있고, 상기 비-메틸화 특이적 프라이머 세트는 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, CDHR5 유전자의 메틸화 수준을 측정하기 위한 상기 메틸화-특이적 프라이머 세트는 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머를 포함하는 것일 수 있고, 상기 비-메틸화 특이적 프라이머 세트는 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머를 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 실시예에 따르면, 메틸화-특이적 PCR을 이용하여 지연성 허혈 환자 및 비환자에서의 INSR 유전자의 메틸화 수준을 확인한 결과, 상기 메틸화 수준은 지연성 허혈 환자에서 더 높았음을 확인하였다. 따라서 상기 내용을 토대로 INSR 유전자의 메틸화 수준, 구체적으로 서열번호 1의 뉴클레오타이드를 포함하는 영역의 메틸화 수준을 확인하여, 지연성 허혈, 구체적으로 지주막하 출혈 후 발생한 지연성 허혈의 발병 여부를 진단하거나 발병 위험을 예측할 수 있다.

본원의 일 실시예에 따르면, 메틸화-특이적 PCR을 이용하여 지연성 허혈 환자 및 비환자에서의 CDHR5 유전자의 메틸화 수준을 확인한 결과, 상기 메틸화 수준은 지연성 허혈 환자에서 더 높았음을 확인하였다. 따라서 상기 내용을 토대로 CDHR5 유전자의 메틸화 수준, 구체적으로 서열번호 2의 뉴클레오타이드를 포함하는 영역의 메틸화 수준을 확인하여, 지연성 허혈, 구체적으로 지주막하 출혈 후 발생한 지연성 허혈의 발병 여부를 진단하거나 발병 위험을 예측할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 지연성 허혈 진단용 조성물은 서열번호 1을 포함하는 뉴클레오타이드의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 지연성 허혈 진단용 조성물은 서열번호 2를 포함하는 뉴클레오타이드의 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, INSR 유전자는 지연성 허혈 진단용 마커 조성물에 포함되는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, CDHR5 유전자는 지연성 허혈 진단용 마커 조성물에 포함되는 것일 수 있다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "마커(marker)"는 바이오마커를 의미하며 생명체의 변화를 탐지할 수 있어 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 지연성 허혈 진단용 조성물은 지연성 혀헐의 발병을 진단하거나, 지연성 허혈 발병 위험을 예측하거나 또는 지연성 허혈의 예후를 예측하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "진단"은, 특정 개인에 대하여 지연성 허혈이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "예측"은, 특정 개인에 대하여 지연성 허혈이 발병할 가능성이 있는지, 발병할 가능성이 있다면 지연성 허혈이 발병할 가능성이 불특정 다수인에 비하여 상대적으로 높은지 여부를 판별하는 것을 의미한다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 지연성 허혈은 지주막하 출혈 이후 발병하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 실시예에 따르면, 지연성 허혈이 발생한 환자에서의 상기 INSR 유전자는, 지연성 허혈이 발생하지 않은 환자에 비해 높은 메틸화 수준을 보여주는 바, INSR 유전자의 메틸화 수준 확인을 통해 지연성 허혈의 발병 여부, 지연성 허혈의 발병 가능성 등을 진단할 수 있음을 알 수 있다.

본원의 일 실시예에 따르면, 상기 조성물은 한국인 및 아시아인을 대상으로 지연성 허혈을 진단하기 위한 조성물일 수 있다.

본원의 제 2 측면은 INSR(insulin receptor)의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 지연성 허혈 진단용 조성물을 제공한다. 제1측면과 중복되는 내용은 제2측면의 지연성 허혈 진단용 조성물에도 공히 적용된다.

본원의 일 실시예에 따르면, INSR 유전자 영역이 과메틸화되고, 이로 인해 INSR의 발현 수준이 저하되어, 이로부터 지연성 허혈이 발병할 수 있음을 확인하였는 바, INSR 유전자의 메틸화 수준 및/또는 INSR의 발현 수준을 확인함으로써, 지연성 허혈, 구체적으로 지주막하 출혈로 인해 발생하는 지연성 허혈의 발병 여부를 진단하거나 발병 위험을 예측할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 CDHR5(cadherin related family member 5)의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 실시예에 따르면, CDHR5 유전자 영역이 과메틸화되고, 이로 인해 CDHR5의 발현 수준이 저하되어, 이로부터 지연성 허혈이 발병할 수 있음을 확인하였는 바, CDHR5 유전자의 메틸화 수준 및/또는 CDHR5의 발현 수준을 확인함으로써, 지연성 허혈, 구체적으로 지주막하 출혈로 인해 발생하는 지연성 허혈의 발병 여부를 진단하거나 발병 위험을 예측할 수 있다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "발현수준의 측정"은 특정 유전자 또는 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현 여부 또는 발현 정도를 측정하는 것으로서, 구체적으로 INSR 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현 수준을 측정하는 것일 수 있으며, 추가적으로 CDHR5 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현 수준을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Nothern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)인 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 단백질의 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏팅 (Western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radical immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법 (Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동 (rocket immunoeletrophoresis), 면역조직화학염색법 (immunohistochemical staining), 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (complenent Fixation Assay), 면역형광법 (immunofluorescence), 면역크로마토그래피법 (immunochromatography), FACS 분석법 (fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology)인 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, "발현 수준을 측정할 수 있는 제제"는 특정 유전자 또는 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현 수준을 확인하기 위하여 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 구체적으로 상기 유전자 또는 상기 단백질을 검출 및/또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "특정 유전자 또는 단백질을 검출할 수 있는 제제”는 상기 특정 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나, 검출하여 증폭시킬 수 있는 제제를 의미하고, “특정 유전자 또는 단백질을 증폭할 수 있는 제제”는 상기 특정 유전자 또는 단백질의 복제를 반복하여 그 수를 증가시킬 수 있는 제제를 의미하며, 예를 들어 상기 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 특이적으로 결합할 수 있는 프로브를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 INSR 유전자 또는 추가적으로 CDHR5 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드이거나, 또는 상기 유전자들에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유전자의 발현 수준을 측정에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 영역의 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 mRNA의 발현수준을 측정하기 위한 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)에 이용할 수 있는 프라이머 세트일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, INSR의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머를 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, CDHR5의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머를 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 실시예에 따르면, 정량적 실시간 PCR을 이용하여 지연성 허혈 환자 및 비환자의 INSR 및 CDHR5의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과, INSR 및 CDHR5의 mRNA 발현 수준은 지연성 허혈 환자에서 더 낮았음을 확인하였다. 따라서 상기 내용을 토대로 INSR 및/또는 CDHR5의 mRNA 발현 수준을 확인하여 지연성 허혈, 구체적으로 지주막하 출혈 후 발생한 지연성 허혈의 발병 여부를 진단하거나 발병 위험을 예측할 수 있다.

본원의 제 3 측면은, 상기 지연성 허혈 진단용 조성물을 포함하는, 지연성 허혈 진단용 키트를 제공한다. 제1측면 및 제2측면과 중복되는 내용은 제3측면의 지연성 허혈 진단용 키트에도 공히 적용된다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 키트는 PCR 키트, RT-PCR 키트, qRT-PCR 키트, 메틸화-특이적 PCR 키트, DNA 칩 키트, 웨스턴 블랏 키트, 또는 ELISA 키트 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 키트는 본원의 폴리뉴클레오티드, cDNA, mRNA, 폴리펩타이드 등뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 PCT 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 상기 유전자들 또는 메틸화 영역에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 DNA 칩 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으며, DNA 칩 키트는 상기 유전자들 또는 메틸화 영역에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브가 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 RT-PCR 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으며, RT-PCR 키트는, 상기 유전자들 또는 메틸화 영역에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

본원의 제 4 측면은, 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터, INSR(insulin receptor) 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지연성 허혈 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다. 제1측면 내지 제3측면과 중복되는 내용은 제4측면의 지연성 허혈 진단을 위한 정보제공 방법에도 공히 적용된다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터, 서열번호 1을 포함하는 뉴클레오타이드의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 본원의 지연성 허혈 진단은 지연성 허혈 발병을 진단하거나, 지연성 허혈 발병 위험을 예측하거나 또는 지연성 허혈의 예후를 진단하는 것일 수 있으며, 또한 상기 지연성 허혈은 지주막하 출혈 후에 발생한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "개체"는 지연성 허혈이 발병되거나 발병될 가능성이 있는 모든 생물체를 의미하며, 구체적인 예로, 마우스, 원숭이, 소, 돼지, 미니돼지, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "시료"는 지연성 허혈이 발병되거나 발병될 가능성이 있는 개체로부터 유래한 물질을 의미하며, 구체적으로 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 소변 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이들 시료로부터 유전자 시료를 얻을 수 있으며, 유전자 시료는 핵산, 예를 들어, DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA 등을 포함할 수 있으며, 이로부터 DNA 메틸화 수준 또는 특정 유전자/단백질의 발현수준을 확인할 수 있는 한, 그 종류는 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 개체는 인간일 수 있으며, 구체적으로 한국인 또는 아시아인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 개체의 위험 예측 또는 진단을 수행하기 위해, 비유전적(non-genetic) 정보를 분석하는 단계를 더 포함하고, 상기 비유전적 정보는 성별, 연령, 고혈압, 당뇨, 고지혈증, 흡연으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료로부터, INSR 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 개체 및 상기 대조군의 메틸화 수준을 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "대조군"은 지연성 허혈이 발병되지 않은 일반 개체 또는 비환자군을 의미하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 개체의 INSR 유전자의 메틸화 수준이 상기 대조군의 메틸화 수준보다 높은 경우, 상기 개체를 지연성 허혈이 발병한 것으로 진단하거나 발병 위험을 높은 수준으로 예측하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 CDHR5 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 개체의 CDHR5 유전자의 메틸화 수준이 상기 대조군의 메틸화 수준보다 높은 경우, 상기 개체를 지연성 허혈이 발병한 것으로 진단하거나 발병 위험을 높은 수준으로 예측하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본원의 제 5 측면은, 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터, INSR(insulin receptor)의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지연성 허혈 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다. 제1측면 내지 제4측면과 중복되는 내용은 제5측면의 지연성 허혈 진단을 위한 정보제공 방법에도 공히 적용된다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료로부터, INSR의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 개체 및 상기 대조군의 INSR의 발현수준을 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 개체의 INSR의 발현수준이 상기 대조군의 INSR의 발현수준보다 낮은 경우, 상기 개체를 지연성 허혈이 발병한 것으로 진단하거나 발병 위험을 높은 수준으로 예측하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 CDHR5의 발현수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료로부터, CDHR5의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 개체 및 상기 대조군의 상기 유전자들 및/또는 단백질들의 발현수준을 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 개체의 CDHR5의 발현수준이 상기 대조군의 CDHR5의 발현수준보다 낮은 경우, 상기 개체를 지연성 허혈이 발병한 것으로 진단하거나 발병 위험을 높은 수준으로 예측하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

[실시예]

이하 본원을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 코호트 수집 및 연구

본원을 수행하기 위한 코호트(cohort)는 춘천 성심병원 뇌졸중 데이터베이스로부터 유래되었다. 상기 데이터베이스에서, 본원의 실시예 및 실험예를 위한 지주막하 출혈 환자는 하기의 조건을 만족하였다: 1) 18세 초과의 성인, 및 2) 낭상형(saccular appearance)과 연관된 동맥류 파열로 인한 지주막하 출혈. 또한, 하기 조건을 갖는 환자는 제외하였다: 1) 추형, 해부학, 외상성, 및 전염성 동맥류, 2) 동정맥 기형(arteriovenous malformation) 또는 경막 동정맥루(dural arteriovenous fistula)와 같은 수반되는 뇌 혈관 질환,및 3) 혈관촬영도-네거티브(angiogram-negative) 지주막하 출혈. 본원은, 발견 단계 및 복제 단계의 2 단계로 수행되었다. 발견 단계에서는 전후성유전체 연관성 연구를 이용하여 40명의 지주막하 출혈 환자에서 감수성 후생유전학적 마커의 동정을 수행하였다. 또한, 복제 단계에서는 36명의 독립적인 코호트에서 메틸화-특이적 PCR을 수행하였다.

본원은 지주막하 출혈 후 지연성 허혈을 예측하기 위한 혈액 표현 잠재적 마커의 후생유전학적 패턴을 개발한 것이다. 지연성 허혈은 운동 장애, 감각 변화, 실어증 및 수반되는 뇌 혈관 경련을 갖는 감소된 수준의 의식 등을 포함하는 새로운 신경학적 결함으로 정의되었다. 방사선학적으로 검출된 성별, 연령, 고혈압(hypertension, HTN), 당뇨(diabetes mellitus, DM), 고지혈증 (hyperlipidemia), 흡연(smoking) 및 동맥류(aneurysms)에 관한 임상적 인구 통계가 검토되었다. 본원의 연구는 기관 감사 위원회에 의해 승인되었다(No. 2016-3 및 2017-9 및 2018-6).

실시예 2: 게놈 DNA의 추출 및 정량분석

게놈 DNA(gDNA)를 추출하기 위해, 전혈 샘플을 실온에서 4분동안 3000g로 원심분리하여 연막을 수득하였으며, 상기 연막 분획 샘플은 -80℃에서 보관하였다. gDNA는 제조사의 지침에 따라 FlexiGene DNA 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 연막으로부터 추출하였다. 추출한 gDNA의 농도 및 순도는 UV 분광광도계 Biospectrophotometer (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 흡광도 비(A260/A280)를 측정하여 확인하였다.

실시예 3: 전후생유전체 연관성 연구 (Epigenome-wide association study, EWAS)

게놈 규모의 DNA 메틸화 프로파일을 평가하기 위해, 하기의 실험을 수행하였다.

먼저, 게놈 DNA(genomic DNA)에 대한 Infinium MethylationEPIC 어세이를 수행하기 위해, EZ-96 DNA methylation kit(Zymo Research, CA, USA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라, 게놈 DNA를 아황수소나트륨으로 처리하였다. DNA 메틸화는 Infinium MethylationEPIC (EPIC) BeadChip (Illumina, CA, USA)을 이용하여 정량화하였다.

미가공 데이터 내의 잠재적으로 존재하는 원시 품질 프로브는 minfi package(version 1.24.0.)를 이용하여 필터링하였다. 먼저, 유의미하지 않은 평균 검출 P-값(> 0.05)을 갖는 샘플을 제외하였다. minfi package에서 시행된 Illumina 메틸화 마이크로어레이를 위한 기능적 정규화 알고리즘 (preprocessFunnorm)은 메틸화 마이크로어레이에 존재하는 대조군 프로브로 변동성을 되돌려 원하지 않은 변이를 제거하기 위해 사용되었다. 마지막으로, 차별적으로 메틸화된 CpG 부위(differentially methylated CpG sites, DMCpGs)는 minfi (dmfFinder)를 사용하여 0.00005의 q- 값 컷오프로 확인되었다. 메틸화 수준을 보고하기 위해, 메틸화 및 비-메틸화 신호를 이용하여 베타 값 및 M-값을 계산하였다.

실시예 4: 메틸화-특이적 PCR(Methylation-specific PCR)

EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여, 제조사의 지침에 따라, 약 2 μg의 DNA에 대해 아황산수소 변형을 수행하였다. 상기 과정을 간략히 설명하면, gDNA를 아황산수소 믹스 및 DNA 보호 버퍼와 혼합한 후, SimpliAmp Thermal cycler (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)로 전환 반응시켰다. 상기 전환 사이클링 조건은 하기와 같다: 95℃, 5분, 60℃, 25분 95℃, 5분, 60℃, 85분, 95℃, 5분, 및 60℃, 175분. 마지막으로, 아황산수소-변형된 DNA를 20 μl의 EB 버퍼를 이용하여 아황산수소 변형된 DNA를 수집하였다.

또한, 메틸화-특이적 PCR을 수행하기 위한 프라이머의 서열, PCR 산물의 크기 및 PCR에 의해 증폭되는 표적 영역은 표 1에 기재하였으며, 비-메틸화 및 메틸화 프라이머 모두에 대한 PCR 반응은 하기의 조건으로 45사이클로 수행하였다: 95℃, 15초, 55℃, 15초 및 72℃, 30초, 1.25 U Taq (iTaq, Intron Biotechnology, Seoul, Korea) 사용, 최종 부피 20 μl. 상기 반응으로 수득한 PCR 산물은 3% 아가로스 젤에서 전기영동하고 이를 UV에서 시각화하여 분석하였다.

프라이머	서열(5'-3')	생산물 크기(bp)	위치	서열번호
INSR-MF	GGATAATGTTAAATTTGGATGTTTC	233	chr19:7194868-7195079	3
INSR-MR	ACTAATACAAATATAAACCACCGCG			4
INSR-UF	GGATAATGTTAAATTTGGATGTTTT	231		5
INSR-UR	TAATACAAATATAAACCACCACACC			6
CDHR5-MF	TGGGTTTTGGATTAGTATTATTTTCGA	248	chr11:618990-619260	7
CDHR5-MR	CCACACCGAAAAACATCGAC			8
CDHR5-UF	TGGGTTTTGGATTAGTATTATTTTTGA	248		9
CDHR5-UR	TCCCACACCAAAAAACATCAAC			10

*a: U는 비메틸화된 대립형질에 대한 프라이머를 나타냄.

*b: M은 메틸화된 대립형질에 대한 프라이머를 나타냄

*c: qPCR의 프라이머 위치는 시작 코돈으로부터의 염기를 나타냄. 시작 코돈의 첫번째 뉴클레오타이드는 위치 1로 정의됨.

실시예 5: 정량적 실시간 PCR(Quantitative real-time PCR)

유전자 발현 수준을 측정하기 위해, Power SYBR Green PCR master Mix (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)를 이용하여, 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)을 수행하였다. qPCR 프라이머 서열은 하기 표 2에 기재하였으며, PCR 반응은 하기의 조건으로 45사이클로 수행하였다: 94℃, 15초, 55℃, 30초 및 70℃, 30초, Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Germany) 사용.

프라이머	서열(5'-3')	생산물 크기(bp)	서열번호
INSR-F	AGACGTCCCGTCAAATATTGC	341	11
INSR-R	ACTCGTTGACCGTCTTCACC		12
CDHR5-F	GAGGGAGAGGTTGTGCTGAC	281	13
CDHR5-R	CTCAGAGTTGTGCCAGAGGG		14

실시예 6: 통계적 분석

차별적으로 메틸화된 CpG 사이트(Differentially methylated CpG sites, DMCpGs)는 0.00005의 P-값으로 컷오프함으로서 조정하였다. 지연성 허혈 및 비-지연성 허혈 그룹사이에 메틸화 프로파일을 비교하기 위해, 프로브 메틸화 값에 대한 산점도 및 각 그룹의 게놈 특징에 대한 상자 플랏을 R 스크립트에 의해 생성하였다. 메틸화의 상대적 강도는 사분위수 범위를 갖는 중간값으로 표현하였다. 상대적인 메틸화 강도는 메틸화 정도를 메틸화 및 비메틸화의 결합된 강도로 나눈 값으로서 계산하였다. 상대적 메틸화 정도 및 mRNA 발현에 관한 데이터는 만-휘트니 U 검증(Mann-Whitney U test)을 사용하여 비교되었다. P-value < 0.05를 통계적으로 유의미한 것으로 고려하였으며, 상기 분석은 MedCalc software (Medcalc, Mariakerke, Belgium)를 이용하여 수행하였다.

실험예 1: 코호트 군의 임상적 특징 확인

실시예 1에 기재된 본원의 실험에 참여한 코호트의 임상적 특징은 구체적으로, 지연성 허혈에 있어서, 여성 성별, 고혈압, 당뇨, 고지혈증 및 흡연에 따른 유의미한 차이는 없었다. 다만, 발견 단계에서의 지주막하 출혈 환자는 복제 단계에서의 지주막하 출혈 환자보다 젊은 경향이 있었다.

발견 단계의 경우, 비-지연성 허혈에서보다 지연성 허혈에서 높은 H-H 등급이 더 빈번히 관찰되었으나, 통계적으로 유의미하지는 않았고(p=0.311), 대부분의 환자(80%)에서 코일 색전술을 시행하였으며, 13명의 지연성 허혈 환자 중 2명(15.4%)이 뇌혈관 경련을 역전시기키 위한 화학적 혈관형성술을 받았다.

복제 단계의 경우, 지연성 허혈 환자에서 더 높은 H-H 등급 및 Fisher 등급이 나타났으나, 통계적으로 유의미하지는 않았다 (각각, p=0.095, p=0.421).

또한, 대부분의 동맥류(81%)는 전대뇌 순환계에 위치하였다.

실험예 2: 발견 단계에서 차별적으로 메틸화된 유전자의 DNA 메틸화 및 mRNA 발현 수준 확인

40명의 지주막하 출혈 환자를 대상으로 지연성 허혈에 대한 전후생유전체 연관성 연구를 수행하였으며, 총 35개의 CpG 부위가 컷-오프를 통과했으며(도 2), 확인된 DMCpG 중에서, cg00441765 및 cg11464053은 비-지연성 허혈 환자와 비교하여 지연성 허혈 환자에서 과메틸화를 나타내는 상위 2 개의 CpG 부위로 확인되었다(표 3).

CpG site ID	P-value	Q-value	Chr	Position	Distance to TSS (bp)	Gene Name	Gene Description
cg00441765	8.55E-11	1.90E-05	chr19	7194996	99317	INSR	insulin receptor
cg11464053	1.01E-10	1.90E-05	chr11	619080	5986	CDHR5	cadherin related family member 5
cg08969578	3.16E-10	2.54E-05	chr3	121717880	23247	ILDR1	immunoglobulin like domain containing receptor 1
cg15090337	3.32E-10	2.54E-05	chr20	31165773	7102	NOL4L	nucleolar protein 4 like
cg02180699	4.02E-10	2.54E-05	chr8	102219149	-857	ZNF706	zinc finger protein 706
cg26306080	4.01E-10	2.54E-05	chr19	19550743	4871	MIR640	microRNA 640
cg26826512	5.05E-10	2.73E-05	chr3	185046528	-34308	MAP3K13	mitogen-activated protein kinase kinase kinase 13
cg09217327	9.73E-10	3.68E-05	chr22	30234641	-348	ASCC2	activating signal cointegrator 1 complex subunit 2
cg23222472	1.06E-09	3.68E-05	chr7	112135961	14895	LSMEM1	leucine rich single-pass membrane protein 1
cg19751670	8.56E-10	3.68E-05	chr8	23088262	5528	LOC389641	uncharacterized LOC389641

다음으로, 지연성 허혈 환자에서 DNA 메틸화의 차이에 기초한 CpG 부위의 계층적 클러스터링 결과, 상위 2 개의 CpG 부위인 cg00441765 및 cg11464053가 각각 INSR(insulin receptor)의 2번째 인트론 및 CDHR5(cadherin-related family member 5)의 엑손 13에 위치하고 있다는 것을 확인하였다(도 3 내지 5).

다음으로, 상기 표 3의 상위 10개 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 지연성 허혈 환자의 경우 비-지연성 허혈 환자와 비교하여 INSR의 mRNA 수준이 감소된 것이 확인되었다 (0.00020 [0.00012-0.00030] vs. 0.00050 [0.00030-0.00068]; p=0.006) (도 6). 또한, CDHR5의 경우에도 비-지연성 허혈 환자와 비교하여 지연성 허혈 환자의 경우 감소된 mRNA 수준이 확인되었다 (0.114 [0.053-0.143] vs. 0.170 [0.110-0.212]; p=0.010) (도 7). 또한, 메틸화 정도와 상응하는 mRNA 발현 사이의 연관성은 지연성 혀헐 발달에 따라 다른 유전자에서 반비례하지는 않았다.

상기 결과를 종합해보면, 지연성 허혈 환자의 경우, 비-지연성 허혈 환자와 비교하여 INSR 유전자 및 CDHR5 유전자의 일부 영역에서 과메틸화가 발생되며, mRNA 발현 수준은 감소된다는 것을 알 수 있는 바, INSR 유전자 또는 CDHR5 유전자의 메틸화 수준 및 mRNA 발현 수준을 토대로 지연성 허혈을 효과적으로 진단할 수 있음을 알 수 있다.

실험예 3: 발견 단계에서 차별적으로 메틸화된 유전자의 DNA 메틸화 및 mRNA 발현 수준 확인

상기 실험예 2에서 확인된 INSR 유전자 및 CDHR5 유전자의 메틸화가 지연성 허혈 환자와 비-지연성 허혈 환자 사이에서 차이가 있는지 확인하기 위해, Infinium MethylationEPIC 어세이에서 주석 처리된 것과 동일한 부위의 메틸화 상태를 36명의 지주막하 출혈 환자에서 메틸화 특이적 PCR을 사용하여 각각 측정하였다.

그 결과, 비-지연성 허혈 환자보다 지연성 허혈 환자에서 메틸화 수준이 높은 것을 확인하였다(도 8).

- INSR: 지연성 허혈 환자 0.855 (0,779-0.913); 비-지연성 허혈 환자 0.582 (0.565-0.689).

- CDHR5: 지연성 허혈 환자 0.786 (0.708-0.904); 비-지연성 허혈 환자 0.632 (0.610-0.679).

상기 결과를 토대로, 지연성 허혈 환자의 경우, 비-지연성 허혈 환자와 비교하여 INSR 유전자 및 CDHR5 유전자의 일부 영역에서 과메틸화가 일어남을 알 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 바람직한 실시 예를 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 본 발명을 구현할 수 있음을 이해할 것이다. 그러므로 상기 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 한다.

이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> INSR Gene hypermethylation marker for diagnosis of delayed cerebral ischemia <130> 1 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INSR <400> 1 aggacaatgc taaacctgga tgtctcgagg acaggggatg gggtttttgt gtcatctatg 60 ttctgatgct ttttcattta atacgagaac aggtttccta tgatttggca cactgggaca 120 ttcgacatgt gtttgttgaa tgaaaaaaag aaaaaagaga aatgctaaca atttgttgaa 180 tagtccataa aagagcaaag ctggcctggc gcggtggctc acacctgtac cagc 234 <210> 2 <211> 256 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDHR5 <400> 2 tgggccctgg accagcacca cttccgaggt ccccagaccc cctgagccct cccagggacc 60 ctccacgacc agctctgggg gaggcacagg ccctcatcca ccctctggca caactctgag 120 gccaccaacc tcgtccacac ccggggggcc cccgggtgca gaaaacagca cctcccacca 180 accagccact cccggtgggg acacagcaca gaccccaaag ccaggaacct ctcagccgat 240 gccccccggt gtggga 256 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INSR-MF <400> 3 ggataatgtt aaatttggat gtttc 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INSR-MR <400> 4 actaatacaa atataaacca ccgcg 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INSR-UF <400> 5 ggataatgtt aaatttggat gtttt 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INSR-UR <400> 6 taatacaaat ataaaccacc acacc 25 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDHR5-MF <400> 7 tgggttttgg attagtatta ttttcga 27 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDHR5-MR <400> 8 ccacaccgaa aaacatcgac 20 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDHR5-UF <400> 9 tgggttttgg attagtatta tttttga 27 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDHR5-UR <400> 10 tcccacacca aaaaacatca ac 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INSR-F <400> 11 agacgtcccg tcaaatattg c 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INSR-R <400> 12 actcgttgac cgtcttcacc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDHR5-F <400> 13 gagggagagg ttgtgctgac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDHR5-R <400> 14 ctcagagttg tgccagaggg 20

Claims (11)

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5. INSR(insulin receptor)의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 지연성 허혈 진단용 조성물.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 조성물은 CDHR5(cadherin related family member 5)의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 추가로 포함하는 것인, 지연성 허혈 진단용 조성물.
   
7. 제5항 또는 제6항의 조성물을 포함하는, 지연성 허혈 진단용 키트.
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