KR20230075403A - 활성 및 열안정성이 증가된 역전사효소 돌연변이체 - Google Patents
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Abstract
본 개시 내용은 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV: Moloney murine leukemia virus) 역전사효소(RTase) 돌연변이체를 제공한다. 본 개시 내용은 돌연변이 유발을 위한 MMLV RTase 내의 적합한 아미노산 위치 및 RNA 주형으로부터 cDNA를 합성하기 위해 MMLV RTase 돌연변이체를 사용하기 위한 방법 및 키트를 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 35 U.S.C. §119(e) 하에 2020년 7월 20일자로 출원된 미국 가출원 제63/054,228호의 우선권을 주장한다. 상기 열거된 출원은 모든 목적에 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
전자 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 ASCII 형식의 텍스트 파일로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 이로써 그 전체가 참고로 포함된다. ASCII 텍스트 파일명은 "20-1076-WO_Sequence-Listing_ST25_FINAL.txt"이며, 2021년 7월 19일자로 생성되었으며, 크기는 492 킬로바이드이다.
본 개시 내용의 분야
본 개시 내용은 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV: Moloney murine leukemia virus) 역전사효소(RTase: reverse transcriptase) 돌연변이체에 관한 것이다. 본 개시 내용은 또한 돌연변이 유발을 위한 MMLV RTase 내의 적합한 아미노산 위치 및 RNA 주형으로부터 cDNA를 합성하기 위해 MMLV RTase 돌연변이체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
역전사효소(RTase) 효소는 분자 생물학에 혁명을 일으켰다. RTase는 RNA로부터 상보적 DNA(cDNA)를 생성할 수 있는 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)의 중요한 구성 요소이다. 역전사 반응에서 생성된 cDNA는 정량적 PCR, 유전자 발현 분석, 단리된 RNA 시퀀싱, 유전자 클로닝, 및 cDNA 라이브러리 생성을 포함한 광범위한 다운스트림 응용 분야에서 사용될 수 있다.
레트로바이러스로부터 처음 유래된 RTase는 RNA 의존성 중합효소와 RNA/DNA 이중체에서 RNA 절단을 촉매하는 비-서열특이적 엔도뉴클레아제 효소인 RNase H를 활용하여 RNA의 cDNA로의 역전사를 촉진한다. 그 결과 바이러스가 복제되고 바이러스 서열이 숙주 DNA로 통합되어 숙주 DNA와 함께 바이러스가 증식할 수 있다. 실험실 설정 내에서, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV), 조류 골수모세포증 바이러스(AMV: avian myeloblastosis virus), 및 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1: human immunodeficiency virus type 1)의 RTase가 cDNA 합성에 가장 일반적으로 사용되는 RTase이다.
연구 활용용 RTase는 대체로 실험실 절차에 최적화된 돌연변이된 다세대 MMLV 및 AMV RTase이다. RTase의 돌연변이는 열안정성, RTase 활성, 5' mRNA 커버리지 및 RNase H 활성을 포함한 효소의 특성을 변경한다.
AMV RTase는 열에 안정적이고 MMLV RTase보다 열분해에 덜 민감하며 강한 2차 구조를 가진 RNA에 선호된다. 또한, AMV RTase는 AMV RTase의 열 안정성 때문에 보통 5킬로베이스 이상의 RNA 분자와 함께 사용하기에 적합하다. 그러나 강한 2차 구조 또는 긴 RNA 가닥을 해결하는 데 필요한 고온은 RNA 무결성 및 전사 충실도에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. AMV는 또한 RNA/DNA 혼성체에서 RNA를 분해하는 고유한 RNase 활성을 가지고 있어 총 cDNA가 감소하고 전장 cDNA 수율이 감소할 수 있다.
MMLV RTase는 AMV RTase에 비해 낮은 RNase H 활성과 높은 충실도를 특징으로 한다. 감소된 RNase H 활성으로 인해 MMLV RTase는 긴 RNA(>5kb)의 역전사에 사용될 수 있다. 그러나 MMLV RTase의 RNase H 활성은 시험관 내에서 긴 cDNA를 합성하는 효율성을 제한한다. RNase H 활성을 감소시키기 위해 MMLV RTase의 돌연변이가 도입되었다. 또한, MMLV RTase 활성의 최적 온도는 ~37℃이기 때문에 효소는 강한 2차 구조를 가진 RNA를 효과적으로 역전사하는 능력이 부족하다. 높은 온도에서 MMLV RTase를 사용하면 효소 활성이 낮아져 cDNA 길이와 수율이 저하될 수 있다. 반응 혼합물에서 Mg2+를 Mn2+로 대체하는 MMLV RTase 돌연변이체는 이러한 한계를 극복하려고 시도하지만 비효율성과 오류가 특징이다.
따라서, AMV 및 MMLV RTase의 고유한 특성에도 불구하고 AMV 및 MMLV RTase의 유익한 특성을 결합한 RTase가 필요하다. 이와 일관되게, 본 출원은 MMLV RTase의 이론적 돌연변이 유발을 통해 단리된 MMLV RTase 돌연변이체로, 당업계에서 현재 이용 가능한 RNase H 마이너스 구축물을 포함하는 RTases와 비교하여 증가된 RTase 활성 및 열안정성을 나타내는 단리된 MMLV RTase 돌연변이체를 개시한다.
요약
본 개시 내용은 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소(RTase) 돌연변이체를 제공한다. 본 개시 내용은 또한 돌연변이 유발을 위한 MMLV RTase 내의 적합한 아미노산 위치 및 RNA 주형으로부터 cDNA를 합성하기 위해 MMLV RTase 돌연변이체를 사용하기 위한 방법 및 키트를 제공한다.
본 개시 내용의 한 측면은 서열 번호 637의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소(RTase) 돌연변이체를 제공하며, 여기서 MMLV RTase 돌연변이체의 아미노산 서열은 다음인 적어도 하나의 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌, 리신 또는 메티오닌으로의 치환(I61R, I61K 또는 I61M); (b) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌, 리신 또는 이소류신으로의 치환(Q68R, Q68K 또는 Q68I); (c) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌, 히스티딘 또는 이소류신으로의 치환(Q79R, Q79H 또는 Q79I); (d) 위치 99에서 류신의 아르기닌, 리신 또는 아스파라긴으로의 치환(L99R, L99K 또는 L99N); (e) 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산, 메티오닌 또는 트립토판으로의 치환(E282D, E282M 또는 E282W); 및/또는 (f) 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(R298A).
본 개시 내용의 또 다른 측면은 서열 번호 637의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소(RTase) 돌연변이체를 제공하며, 여기서 MMLV RTase 돌연변이체의 아미노산 서열은 다음인 적어도 2개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환(I61R); (b) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(Q68R); (c) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(Q79R); (d) 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환(L99R); (e) 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(E282D); 및/또는 (f) 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(R298A): (a) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(I61R/E282D); (b) 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(L99R/E282D); (c) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q68R/E282D); (d) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q79R/E282D); (e) 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환 및 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(E282D/R298A); (f) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환(I61R/L99R); (g) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(I61R/Q68R); (h) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(I61R/Q79R); (i) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(I61R/R298A); (j) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환(Q68R/L99R); (k) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환(Q79R/L99R); (l) 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(L99R/R298A); (m) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(Q68R/Q79R); (n) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(Q68R/R298A); 또는 (o) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(Q79R/R298A).
본 개시 내용의 또 다른 측면은 서열 번호 637의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소(RTase) 돌연변이체를 제공하며, 여기서 MMLV RTase 돌연변이체의 아미노산 서열은 다음인 적어도 3개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(Q68R); (b) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(Q79R); (c) 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환(L99R); 및/또는 (d) 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(E282D): (a) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산에서 아스파르트산으로의 치환(Q68R/L99R/E282D); (b) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q79R/L99R/E282D); (c) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산에서 아스파르트산으로의 치환(Q68R/Q79R/E282D); 또는 (d) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환(Q68R/Q79R/L99R).
본 개시 내용의 또 다른 측면은 서열 번호 637의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소(RTase) 돌연변이체를 제공하며, 여기서 MMLV RTase 돌연변이체의 아미노산 서열은 다음인 적어도 4개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌, 리신 또는 이소류신으로의 치환(Q68R, Q68K 또는 Q68I); (b) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌, 히스티딘 또는 이소류신으로의 치환(Q79R, Q79H 또는 Q79I); (c) 위치 99 에서 류신의 아르기닌, 리신 또는 아스파라긴으로의 치환 (L99R, L99K 또는 L99N); (d) 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산, 메티오닌 또는 트립토판으로의 치환(E282D, E282M 또는 E282W); (a) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q68R/Q79R/L99R/E282D); (b) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 리신으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q68R/Q79R/L99K/E282D); (c) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아스파라긴으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q68R/Q79R/L99N/E282D); (d) 위치 68에서 글루타민의 이소류신으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q68I/Q79R/L99R/E282D); (e) 위치 68에서 글루타민의 리신으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q68K/Q79R/L99R/E282D); (f) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 히스티딘으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q68R/Q79H/L99R/E282D); (g) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 이소류신으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q68R/Q79I/L99R/E282D); (h) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 메티오닌으로의 치환(Q68R/Q79R/L99R/E282M); (i) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 트립토판으로의 치환(Q68R/Q79R/L99R/E282W); (j) 위치 68에서 글루타민의 이소류신으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 히스티딘으로의 치환, 위치 99에서 류신의 리신으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 메티오닌으로의 치환(Q68I/Q79H/L99K/E282M).
본 개시 내용의 또 다른 측면은 서열 번호 637의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소(RTase) 돌연변이체를 제공하며, 여기서 MMLV RTase 돌연변이체의 아미노산 서열은 다음인 적어도 5개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) 위치 61에서 이소류신의 리신 또는 메티오닌으로의 치환(I61K 또는 I61M); (b) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌 또는 이소류신으로의 치환(Q68R 또는 Q68I); (c) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌 또는 히스티딘으로의 치환(Q79R 또는 Q79H); (d) 위치 99에서 류신의 아르기닌 또는 리신으로의 치환(L99R 또는 L99K); (e) 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산 또는 메티오닌으로의 치환(E282D 또는 E282M): (a) 위치 61에서 이소류신의 리신으로의 치환, 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(I61K/Q68R/Q79R/L99R/E282D); (b) 위치 61에서 이소류신의 메티오닌으로의 치환, 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(I61M/Q68R/Q79R/L99R/E282D); 또는 (c) 위치 61에서 이소류신의 메티오닌으로의 치환, 위치 68에서 글루타민의 이소류신으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 히스티딘으로의 치환, 위치 99에서 류신의 리신으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 메티오닌으로의 치환(I61M/Q68IR/Q79H/L99K/E282M).
본 개시 내용의 또 다른 측면은 서열 번호 637의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소(RTase) 돌연변이체를 제공하며, 여기서 MMLV RTase 돌연변이체의 아미노산 서열은 다음인 적어도 5개 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌, 리신 또는 이소류신으로의 치환(Q68R, Q68K 또는 Q68I); (b) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌, 히스티딘 또는 이소류신으로의 치환(Q79R, Q79H 또는 Q79I); (c) 위치 99에서 류신의 아르기닌, 리신 또는 아스파라긴으로의 치환(L99R, L99K 또는 L99N); (d) 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산, 메티오닌 또는 트립토판으로의 치환(E282D, E282M 또는 E282W); (e) 위치 299에서 글루타민의 글루탐산으로의 치환; (f) 위치 332에서 트레오닌에서 글루탐산으로의 치환; (g) 위치 433에서 발린에서 아르기닌으로의 치환; (h) 위치 593에서 이소류신의 글루탐산으로의 치환; (a) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산에서 아스파르트산으로의 치환, 위치 299에서 글루타민의 글루탐산으로의 치환, 위치 433에서 발린에서 아르기닌으로의 치환 및 위치 593에서 이소류신의 글루탐산으로의 치환(Q68R/Q79R/L99R/E282D/Q299E/V433R/I593E): (b) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 82에서 류신의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산에서 아스파르트산으로의 치환, 위치 299에서 글루타민의 글루탐산으로의 치환, 위치 433 에서 발린에서 아르기닌으로의 치환 및 위치 593에서 이소류신의 글루탐산으로의 치환 (Q68R/Q79R/L82R/L99R/E282D/Q299E/V433R/I593E); (c) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 82에서 류신의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환, 위치 299에서 글루타민의 글루탐산으로의 치환, 위치 332에서 트레오닌에서 글루탐산으로의 치환, 및 위치 593에서 이소류신의 글루탐산으로의 치환(Q68R/Q79R/L82R/L99R/E282D/Q299E/T332E/I593E); (d) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 82에서 류신의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환, 위치 299에서 글루타민의 글루탐산으로의 치환, 위치 332에서 트레오닌에서 글루탐산으로의 치환, 위치 433에서 발린에서 아르기닌으로의 치환, 및 위치 593에서 이소류신의 글루탐산으로의 치환(Q68R/Q79R/L82R/L99R/E282D/Q299E)/T332E/V433R/I593E).
본 개시 내용의 또 다른 측면은 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
본 개시 내용의 다른 측면은 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체를 포함하는 조성물 또는 키트를 제공한다.
본 개시 내용의 다른 측면은 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체를 사용하여 상보적 데옥시리보핵산(cDNA)을 합성하는 방법 또는 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행하는 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 실시 양태는 다음의 보다 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
[도 1a-1c]는 이론적 설계에 의한 역전사효소 돌연변이 유발 선택을 보여주는 개략도이다. 돌연변이 유발을 위한 아미노산 위치는 기질 결합 부위(도 1a 및 1b) 또는 기질 결합 부위 근처(도 1c)에서 선택되었다.
[도 2]는 TB 배지에서 MMLV RT에 대한 BL21(DE3) 세포의 테스트 유도 결과에 대한 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 레인 1 - Precision Plus Protein Unstained Standards(Bio Rad, 카탈로그 번호 161-0363), 레인 2 - 시간 = 0시간, 레인 3 - 시간 = 37℃에서 유도 후 3시간, 레인 4 - 시간 = 0시간, 레인 5 - 시간 = 18℃에서 유도 후 21시간.
[도 2]는 TB 배지에서 MMLV RT에 대한 BL21(DE3) 세포의 테스트 유도 결과에 대한 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 레인 1 - Precision Plus Protein Unstained Standards(Bio Rad, 카탈로그 번호 161-0363), 레인 2 - 시간 = 0시간, 레인 3 - 시간 = 37℃에서 유도 후 3시간, 레인 4 - 시간 = 0시간, 레인 5 - 시간 = 18℃에서 유도 후 21시간.
본 개시 내용은 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소(RTase) 돌연변이체에 관한 것이다. 본 개시 내용은 또한 돌연변이 유발을 위한 MMLV RTase 내의 적합한 아미노산 위치 및 RNA 주형으로부터 cDNA를 합성하기 위해 MMLV RTase 돌연변이체를 사용하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다.
적어도 부분적으로 MMLV RTase의 기본 구축물의 이론적 돌연변이 유발을 통해 확인되고 단리된 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체는 야생형 MMLV RTase 및 현재 당업계에서 이용 가능한 RNase H 마이너스 RTase를 포함하는 특정 MMLV RTase 돌연변이체에 비해 증가된 RTase 활성 및 열안정성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
이제 청구된 발명의 예시적인 실시 양태를 상세히 언급할 것이다. 청구된 발명이 예시적인 실시 양태와 관련하여 설명될 것이지만, 청구된 발명을 이들 실시 양태에 제한하려는 의도가 아님을 이해할 것이다. 반면, 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 청구된 발명의 취지 및 범위 내에 포함될 수 있는 대안, 변형 및 등가물을 포함하도록 의도된다.
당업자는 청구된 발명의 취지 또는 범위를 벗어나지 않고 본원에 기술된 실시 양태에 대한 변형 및 변경을 할 수 있다. 또한, 특정 방법 및 재료가 본원에 기술되어 있지만, 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 다른 방법 및 재료도 청구된 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다.
또한, 본원에서 제공, 개시 또는 기술된 임의의 조성물 또는 방법은 본원에서 제공, 개시 또는 기술된 임의의 다른 조성물 및 방법 중 하나 이상과 조합될 수 있다.
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 청구된 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정한 실시 양태를 설명하기 위한 것이며 청구된 발명을 제한하려는 의도가 아니다. 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 동일한 의미를 갖는다.
다음 참고 문헌은 (본원에서 달리 정의되지 않는 한) 본원에서 사용된 많은 용어의 일반적인 이해를 당업자에게 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 3rd ed. (Wiley, 2006); Walker, The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Cambridge University Press, 1990); Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th ed. (Springer Verlag, 1991); 및 Hale et al., Harper Collins Dictionary of Biology (HarperCollins Publishers, 1991). 일반적으로, 본원에 기술된 절차 또는 방법 등은 당업계에서 사용되는 일반적인 방법이다. 이러한 표준 기술은 예를 들어, 문헌[Green et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012), 및 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons Inc., 2004)]과 같은 참고 설명서에서 찾아볼 수 있다.
다음 용어는 달리 명시되지 않는 한 아래에 부여된 의미를 가질 수 있다. 그러나, 청구된 발명의 범위 내에서 당업자에 의해 공지되거나 이해되는 다른 의미도 가능하다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 언급되거나 논의된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 명시적으로 그 전체가 참고로 포함된다. 상충하는 경우 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법, 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수형 "a", "and" 및 "the"는 문맥상 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 언급 대상을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "또는"이라는 용어는 문맥상 달리 명백하게 나타내지 않는 한 "및/또는"이라는 용어를 의미하고 이와 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "포함하는"이라는 용어는 "포함하지만 이에 제한되지 않는"이라는 문구를 의미하고 이와 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "~와 같은"이라는 용어는 "예를 들어, ~와 같은" 또는 "~와 같으나 이에 제한되지 않는"이라는 문구를 의미하고 이와 상호교환적으로 사용된다.
문맥상 구체적으로 언급되거나 명백하지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 당업계의 일반적인 허용 오차 범위 이내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 이내로 이해된다. 약은 명시된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1 %, 0.05%, 또는 0.01% 이내로 이해될 수 있다. 문맥상 달리 명확하지 않은 한, 본원에서 제공된 모든 수치는 약이라는 용어로 수식될 수 있다.
본원에서 제공되는 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 속기인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 수, 수의 조합, 또는 부분 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드로 구성된 중합체 또는 큰 생체분자를 지칭한다. 용어 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 이들의 유사체를 포함한다. 핵산 분자의 비제한적 예에는 DNA(예를 들어, 게놈 DNA, cDNA), RNA 분자(예를 들어, mRNA, rRNA, cRNA, tRNA) 및 이들의 키메라가 포함된다. 핵산 분자는 클로닝 기술에 의해 얻어지거나 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 합성될 수 있다. DNA는 이중 가닥 또는 단일 가닥(코딩 가닥 또는 비코딩 가닥, 즉 안티센스)일 수 있다. 핵산 백본은 당-포스포디에스테르 연결, 펩티드-핵산 결합("펩티드 핵산"(PNA)으로 지칭됨), 포스포로티오에이트 연결, 메틸포스포네이트 연결, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 연결을 포함할 수 있다. 핵산의 당 모이어티는 리보스 또는 데옥시리보스, 또는 공지된 치환, 예를 들어 2' 메톡시 치환(2'-O-메틸리보푸라노실 모이어티 함유) 및/또는 2' 할라이드 치환을 갖는 유사한 화합물일 수 있다. 질소 염기는 통상적인 염기(아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C), 및 우라실(U)), 그의 공지된 유사체(예를 들어, 이노신), 퓨린 또는 피리미딘 염기의 공지된 유도체, 또는 백본이 하나 이상의 잔기에 대한 질소 염기를 포함하지 않는 "무염기" 잔기일 수 있다. 핵산은 RNA 및 DNA에서 발견되는 통상적인 당, 염기, 및 연결만을 포함할 수 있거나, 통상적인 구성요소 및 치환물(예를 들어, 메톡시 백본을 통해 연결된 통상적인 염기, 또는 통상적인 염기 및 하나 이상의 유사체를 포함하는 핵산) 모두를 포함할 수 있다. 당업자에 의해 일반적으로 이해되고 본원에서 사용되는 바와 같이, "단리된 핵산 분자"는 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로브"는 혼성화를 촉진하는 조건 하에서 핵산 또는 그의 상보체 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화함으로써 표적 서열 또는 그의 증폭된 핵산의 검출을 가능하게 하는 핵산 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 검출은 직접적(즉, 프로브가 표적 또는 증폭된 서열에 직접 혼성화하여 발생) 또는 간접적(즉, 프로브를 표적 또는 증폭된 서열에 연결하는 중간 분자 구조에 혼성화하는 프로브로부터 발생)일 수 있다. 프로브의 "표적"은 일반적으로 표준 수소 결합 또는 "염기 쌍 형성"에 의해 프로브 서열의 적어도 일부에 특이적으로 혼성화하는 증폭된 핵산 서열 내의 서열(즉, 증폭된 서열의 서브세트)을 지칭한다. "충분히 상보적인" 서열은 2개의 서열이 완전히 상보적이지 않더라도 표적 서열에 대한 프로브 서열의 안정한 혼성화를 허용한다. 프로브는 표지되거나 비표지될 수 있다. 프로브는 특정 DNA 서열의 분자 클로닝에 의해 생성되거나 합성될 수 있다. 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 프로브는 당업자에 의해 용이하게 설계되고 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프라이머"는 핵산 또는 그의 상보체 내의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하고, 주형-의존적 과정에서 초기 핵산의 합성을 프라이밍할 수 있는 핵산 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 프라이머는 이중 가닥 또는 단일 가닥 형태로 제공될 수 있다. 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 프라이머는 당업자에 의해 용이하게 설계되고 사용될 수 있다.
본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 프로브 또는 프라이머는 특정 분석 형식 및 특정 요구 및 사용된 표적화 서열에 따라 임의의 적합한 길이일 수 있다. 예를 들어, 본원에서 개시된 방법에 사용하기 위한 프로브 또는 프라이머는 적어도 10 뉴클레오티드 길이이거나, 적어도 15, 20, 25, 30 또는 30 뉴클레오티드 초과 이며, 특히 선택된 핵산 증폭 시스템 및/또는 사용된 혼성화 시스템에 대해 적합하도록 조정될 수 있다. 더 긴 프로브 및 프라이머도 본 개시 내용의 범위 내에 있다.
"전사된 폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드 전사물"은 본 개시 내용의 마커의 전사 및 존재하는 경우 RNA 전사물의 정상적인 전사 후 프로세싱(예를 들어, 스플라이싱), 및 RNA 전사물의 역전사에 의해 생성된 성숙한 mRNA의 전부 또는 일부에 대해 상보적이거나 높은 백분율의 동일성(예를 들어, 적어도 80% 동일성)을 갖는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA, hnRNA, cDNA, 또는 이러한 RNA 또는 cDNA의 유사체)이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "역전사효소", "RTase" 또는 "RT"는 "역전사"로 알려진 과정에서 RNA 주형으로부터 상보적 (cDNA)을 생성하는 데 사용되는 효소를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 역전사효소는 또한 역전사 활성을 나타내는 임의의 효소를 지칭한다. 역전사효소는 전사효소 활성을 나타내는 DNA 중합효소 및 레트로바이러스를 포함하는 바이러스를 하지만 이에 제한되지 않는 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 그러한 레트로바이러스는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV), 조류 골수모세포증 바이러스(AMV), 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
역전사효소 활성은 RNA 주형 및 데옥시뉴클레오티드를 포함하는 완충액에서 RTase를 인큐베이션하여 측정할 수 있다. 당업자는 역전사 반응을 수행하기 위해 광범위한 조건이 사용될 수 있고 역전사 동안 생성된 cDNA의 양을 측정하기 위한 다수의 방법이 존재함을 인지할 것이다.
본 개시 내용의 역전사효소는 본원에 기술된 특성 중 하나 또는 조합을 갖는 역전사효소를 포함한다. 이러한 특성에는 예를 들어 기본 구축물과 비교했을 때, 증가된 활성, 향상된 DNA 합성, 향상된 안정성 또는 향상된 열안정성, 감소된 또는 제거된 RNase H 활성, 감소된 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 활성, 증가된 정확도 또는 증가된 충실도, 증가된 특이성, 또는 변경된 반감기가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "기본 구축물"은 본 개시 내용의 RTase 돌연변이체가 제조되는 초기 RTase를 지칭한다(예를 들어, 야생형 RTase 또는 변형된 야생형 RTase).
본원에서 사용되는 바와 같이, "정확도" 및 "충실도"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며 RTase가 원하는 주형을 정확하게 복제하는 능력, 즉 RTase가 역전사 반응에서 cDNA 합성을 정확하게 수행하는 능력을 지칭한다. 역전사효소의 "충실도" 또는 "정확도"는 효소의 오류율이라 지칭될 수 있는, 합성된 cDNA 분자에 부정확한 뉴클레오티드 혼입 빈도를 결정함으로써 평가될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "증가된 충실도"라는 용어는 기본 구축물의 오류율보다 낮은 오류율을 나타내는 본 개시 내용의 RTase 돌연변이체를 지칭한다. 예를 들어, 본원에 개시된 RTase 돌연변이체는 RTase 기본 구축물의 오류율보다 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 200% 더 낮거나 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 또는 10배, 또는10배 이상 더 낮다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이성"은 cDNA 합성 동안 RTase에 의한 프라이밍 오류의 감소를 지칭한다. RTase 돌연변이체의 특이성은 특정 온도(더 높은 온도 포함)에서 역전사 반응을 수행하고 해당 반응의 프라이밍 오류량을 동일한 조건에서 야생형 RTase(또는 RTase 기본 구축물)로 수행된 반응의 프라이밍 오류량과 비교하여 평가될 수 있다.
본 개시 내용의 RTase 분자와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안정성" 및 "열안정성"은 상호교환적으로 사용되며 열 불활성화에 내성이 있고 37℃를 초과하는 온도(예를 들어, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 70℃, 또는 그 이상의 온도)에서 활성을 유지한다. 예를 들어, 한 실시 양태에서 본 개시 내용은 상승된 온도에서 기본 구축물 RTase의 반감기보다 더 긴 반감기를 갖는 활성을 갖는 RTase 돌연변이체를 제공한다. 따라서, "향상된 열안정성"을 갖는 RTase 돌연변이체는 기본 구축물 RTase와 비교하여 약 50℃ 내지 약 90℃의 온도에서 열안정성의 증가를 나타내는 본 개시 내용의 RTase 돌연변이체를 지칭할 수 있다. 일부 실시 양태에서, RTase 돌연변이체의 열안정성은 기본 구축물 RTase의 열안정성에 비교하여 적어도 1.5배 이상이다. 기본 구축물과 RTase 돌연변이체에 의해 생성된 cDNA의 비교는 기본 구축물과 RTase 돌연변이체 반응에 대해 동일한 반응 조건을 사용하여 비교된다. 반응 조건은 염 농도, 완충제 농도, pH, 2가 금속 이온 농도, 온도, 뉴클레오시드 트리포스페이트 농도, 주형 농도, RTase 농도, 프라이머 농도, 시간, 및 1-단계 PCR에서 정량적 PCR 프라이머 및 프로브 농도를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "향상된 DNA 합성"이라는 용어는 기본 RTase 구축물보다 더 많은 DNA(예를 들어, cDNA)를 생산하는 RTase 효소를 지칭한다. 일부 실시 양태에서, DNA 합성은 기본 구축물 RTase와 비교하여 표준 반응 조건에서 정량적 PCR에 의해 측정될 수 있다. 열안정성 평가와 일관되게, 유사하거나 동일한 반응 조건 하에서 정량적 비교를 수행하고 기본 구축물 RTase를 사용하여 합성된 cDNA의 양을 RTase 돌연변이체를 사용하여 생성된 cDNA의 양과 비교한다(표 4, 5, 6, 및 7 참조). 일부 실시 양태에서, DNA 합성이 향상된 본 개시 내용의 RTase 돌연변이체는 기본 구축물 RTase보다 약 5% 내지 약 200% 더 많은 cDNA를 생산할 수 있다. 일부 실시 양태에서, DNA 합성이 향상된 본 개시 내용의 RTase 돌연변이체는 RTase 기본 구축물 DNA 합성보다 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 200% 더 많은, 또는 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 또는 10배, 또는 10배 이상 더 많은 DNA 합성을 보인다.
역전사효소 활성은, 본원에 기술된 바와 같이, 1-단계 또는 2-단계 절차로 평가하였다. 1-단계 절차는 단일 반응에 역전사 및 정량적 PCR을 결합한다. 방법은 실시예 3에 기술된 바와 같이 Gene Expression Master Mix, RTase, RNA, 형광 프로브, 및 프라이머 및 프로브를 포함하여 수행한다. 2-단계 절차는 역전사 후 정량적 PCR을 포함한다. 역전사 단계에서, RNA, 유전자 특이적 프라이머, 제1 가닥 합성 완충액, 및 RNase를 포함하는 혼합물에 RTase를 추가한다. 그런 다음 생성된 cDNA를 cDNA가 Gene Expression Master Mix, 프라이머 및 프로브, 및 형광 마커와 결합되는 두 번째 단계에서 정량화한다. 1-단계 및 2-단계 절차에서 생산된 cDNA를 정량화하고 표 4, 5, 6 및 7에 나타낸 바와 같이 평균 및 표준 편차를 보고한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "RNase H 활성"은 5' 포스페이트 말단 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위한 가수분해 메커니즘을 통한 DNA-RNA 이중체에서 RNA의 절단을 지칭한다. RNase H 활성에는 단일 가닥 핵산, 이중체 DNA, 또는 이중 가닥 RNA의 분해가 포함되지 않는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "RNase H 활성이 실질적으로 결여된"이라는 문구는 야생형 효소 활성의 10%, 5%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만을 가짐을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "RNase H 활성이 결여된"이라는 문구는 검출할 수 없는 RNase H 활성을 갖거나 야생형 효소의 RNase H 활성의 약 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만을 갖는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "돌연변이"는 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 도입되어 단백질의 아미노산 서열을 바꾸는 변화를 지칭하며, 치환, 삽입, 결실, 점 돌연변이, 전위, 역위, 프레임 이동, 넌센스 돌연변이, 절두(truncation), 또는 기타 형태의 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 돌연변이는 식별할 수 있는 변화를 일으키지 않거나 돌연변이된 단백질의 새로운 속성, 기능, 또는 특성을 초래할 수 있다. 본 개시 내용의 RTase 돌연변이체는 RTase 돌연변이체를 코딩하는 핵산 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있어 RTase 돌연변이체의 아미노산 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 초래할 수 있다. 돌연변이는 하나 이상의 아미노산이 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 및/또는 Val을 포함하는 대체 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 생성된 아미노산 돌연변이는 증가된 활성, 향상된 DNA 합성, 향상된 안정성 또는 향상된 열안정성, 감소된 또는 제거된 RNase H 활성, 감소된 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 활성, 증가된 정확도 또는 증가된 충실도, 증가된 특이성, 또는 변경된 반감기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 RTase 돌연변이체에 변경된 기능적 및 생물학적 특성을 부여할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "검출하는", "검출", "결정하는" 등의 용어는 RTase 활성의 마커로서 cDNA 합성의 수량을 확인하기 위해 수행되는 분석을 지칭한다. 샘플에서 검출된 마커 발현 또는 활성의 양은 RTase 기본 구축물을 사용하여 검출된 마커 발현 또는 활성의 양과 비교하여 동일하거나, 감소하거나, 증가할 수 있다. 당업자는 cDNA의 양이 여러 기술을 사용하여 정량화될 수 있음을 이해할 것이다.
RTase 활성과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, "증가된"이라는 용어는 RTase 기본 구축물과 비교된 RTase 돌연변이체의 RTase 활성 수준을 나타낸다. RTase 돌연변이체는 합성된 cDNA의 수량에 의해 측정되거나 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 측정되는 RTase 활성의 수준이 RTase 기본 구축물 활성보다 큰 경우 "증가된" RTase 활성을 갖는다. 예를 들어, RTase 돌연변이체의 RTase 활성은 RTase 활성이 RTase 기본 구축물 활성보다 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 더 크거나, 적어도 2배, 3배, 4배, 5배 또는 10배, 10배 이상 더 크다.
RTase 활성과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, "감소된"이라는 용어는 RTase 기본 구축물과 비교된 RTase 돌연변이체의 RTase 활성 수준을 나타낸다. RTase 돌연변이체는 합성된 cDNA의 수량에 의해 측정되거나 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 측정되는 RTase 활성의 수준이 RTase 기본 구축물 활성보다 작은 경우 "감소된" RTase 활성을 갖는다. 예를 들어, RTase 돌연변이체의 RTase 활성은 RTase 활성이 RTase 기본 구축물 활성보다 적어도 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 더 작거나, 또는 적어도 2배, 3배, 4배, 5배 또는 10배, 10배 이상 더 작다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "증폭"은 표적 핵산 서열 또는 그의 상보체 또는 이들의 단편의 다중 카피를 얻기 위한 임의의 공지된 시험관 내 절차를 지칭한다. 시험관 내 증폭은 완전한 표적 영역 서열 또는 그의 상보체보다 적게 포함할 수 있는 증폭된 핵산의 생산을 의미한다. 공지된 시험관 내 증폭 방법으로는, 예를 들어 전사 매개 증폭, 레플리카아제 매개 증폭, 중합효소 연쇄 반응(PCR: Polymerase Chain Reaction) 증폭, 리가아제 연쇄 반응(LCR: Ligase Chain Reaction) 증폭, 및 다중 치환 증폭(SDA: Strand-Displacement Amplification, 다중 가닥 치환 증폭 방법(MSDA: multiple strand-displacement amplification method) 포함)이 포함된다. 레플리카제 매개 증폭은 자기 복제 RNA 분자, 및 Q-β-레플리카제와 같은 레플리카제를 사용한다. PCR 증폭은 DNA 중합효소, 프라이머, 및 열 순환을 사용하여 DNA 또는 cDNA의 2개의 상보적인 가닥의 여러 복사본을 합성한다. PCR은 이중 가닥 DNA 분자의 변성, 이어서 관심 서열에 대한 DNA 프라이머의 어닐링, 및 새로 형성된 DNA 가닥의 증폭/신장을 포함한다. LCR 증폭은 혼성화, 결찰, 및 변성의 여러 주기를 사용하여 표적 및 상보 가닥을 증폭하는 데에 최소 4개의 별개 올리고뉴클레오티드를 사용한다. SDA는 프라이머에 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위가 포함되어 엔도뉴클레아제가 표적 서열을 포함하는 반변형 DNA 이중체의 한 가닥에 닉(nick)을 형성하도록 허용하고, 일련의 프라이머 신장 및 가닥 치환 단계에서 증폭이 뒤따르는 방법이다. 당업계에 공지된 다른 가닥 치환 증폭 방법(예를 들어, MSDA)은 엔도뉴클레아제 닉 형성을 필요로 하지 않는다. 당업자는 본 개시 내용의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열이 중합효소에 의한 프라이머 신장에 기초한 임의의 시험관 내 증폭 방법에서 용이하게 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 선택된 조건 하에서 상보적 서열에 결합하도록 설계된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "실시간 PCR" 또는 "정량적 PCR"은 형성되는 생성물의 양이 형광 프로브를 사용하여 모니터링될 수 있고 역치 수준 이상으로 생성된 형광 신호를 추적함으로써 정량화될 수 있는 PCR 방법을 지칭한다. 실시간 PCR은 동시 반응(즉, 실시간 PCR 또는 RT-PCR)에서 역전사 단계를 포함하는 1-단계 반응 또는 역전사 단계와 PCR 단계가 연속적으로 실시되는 2-단계 반응으로 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상보적"은 2개의 핵산 가닥의 영역 사이 또는 동일한 핵산 가닥의 2개의 영역 사이의 서열 상보성의 넓은 개념을 의미한다. 두 영역이 역평행 방식으로 배열될 때 제1 영역의 적어도 하나의 뉴클레오티드가 제2 영역의 뉴클레오티드와 염기 쌍을 이룰 수 있는 경우 핵산의 제1 영역은 동일하거나 상이한 핵산의 제2 영역에 상보적이다. 일부 실시 양태에서, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고 제2 영역은 제2 부분을 포함하며, 이로써 제1 및 제2 부분이 역평행 방식으로 배열될 때 제1 부분의 뉴클레오티드의 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%는 제2 부분의 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성할 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 제1 부분의 모든 뉴클레오티드는 제2 부분의 뉴클레오티드와 염기 쌍을 이룰 수 있다.
폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열이 정렬될 수 있고, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 지정된 영역에서 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드의 백분율이 다른 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 결정될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 퍼센트 동일성은 각각, 기본 매개변수로 설정된 BLASTN 또는 BLASTP와 같은 적절한 알고리즘을 사용하여 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 정렬하고; 정렬된 부분에 대해 동일한 핵산 또는 아미노산의 수를 확인하고; 동일한 핵산 또는 아미노산의 수를 본 개시 내용의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 핵산 또는 아미노산의 총 수로 나눈 고; 그 다음 100을 곱하여 퍼센트 동일성을 결정함으로써 의해 결정된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "샘플" 및 "생물학적 샘플"이라는 용어에는 임의의 출처로부터 얻은 표본 또는 배양물이 포함된다. 생물학적 샘플은 뇌척수액, 누액, 혈액(전혈, 혈장, 혈청, 또는 특정 유형의 혈액 세포와 같은 임의의 혈액 산물 포함), 소변, 타액 등으로부터 얻을 수 있다. 생물학적 샘플에는 이전에 고정된(예를 들어, 포르말린 급속 냉동, 세포학적 처리) 생검 조직 또는 병리학적 조직과 같은 조직 샘플도 포함된다.
2.
역전사효소
본 개시 내용은 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소(RTase) 돌연변이체에 관한 것이다. 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체는 MMLV RTase 기본 구축물 (서열 번호 637)의 서열을 변형하여 제조된다. 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체는 서열 번호 637의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 MMLV RTase 돌연변이체의 아미노산 서열은 다음인 적어도 하나의 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌, 리신 또는 메티오닌으로의 치환(I61R, I61K 또는 I61M); (b) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌, 리신 또는 이소류신으로의 치환(Q68R, Q68K 또는 Q68I); (c) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌, 히스티딘 또는 이소류신으로의 치환(Q79R, Q79H 또는 Q79I); (d) 위치 99에서 류신의 아르기닌, 리신 또는 아스파라긴으로의 치환(L99R, L99K 또는 L99N); (e) 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산, 메티오닌 또는 트립토판으로의 치환(E282D, E282M 또는 E282W); 및/또는 (f) 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(R298A).
또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체는 서열 번호 637의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 MMLV RTase 돌연변이체의 아미노산 서열은 다음인 적어도 2개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환(I61R); (b) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(Q68R); (c) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(Q79R); (d) 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환(L99R); (e) 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(E282D); 및/또는 (f) 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(R298A): (a) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(I61R/E282D); (b) 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(L99R/E282D); (c) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q68R/E282D); (d) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q79R/E282D); (e) 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환 및 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(E282D/R298A); (f) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환(I61R/L99R); (g) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(I61R/Q68R); (h) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(I61R/Q79R); (i) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(I61R/R298A); (j) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환(Q68R/L99R); (k) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환(Q79R/L99R); (l) 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(L99R/R298A); (m) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(Q68R/Q79R); (n) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(Q68R/R298A); 또는 (o) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(Q79R/R298A).
또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체는 서열 번호 637의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 MMLV RTase 돌연변이체의 아미노산 서열은 다음인 적어도 3개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(Q68R); (b) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(Q79R); (c) 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환(L99R); 및/또는 (d) 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(E282D): (a) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산에서 아스파르트산으로의 치환(Q68R/L99R/E282D); (b) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q79R/L99R/E282D); (c) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산에서 아스파르트산으로의 치환(Q68R/Q79R/E282D); 또는 (d) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환(Q68R/Q79R/L99R).
또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체는 서열 번호 637의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 MMLV RTase 돌연변이체의 아미노산 서열은 다음인 적어도 4개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌, 리신 또는 이소류신으로의 치환(Q68R, Q68K 또는 Q68I); (b) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌, 히스티딘 또는 이소류신으로의 치환(Q79R, Q79H 또는 Q79I); (c) 위치 99 에서 류신의 아르기닌, 리신 또는 아스파라긴으로의 치환 (L99R, L99K 또는 L99N); (d) 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산, 메티오닌 또는 트립토판으로의 치환(E282D, E282M 또는 E282W); (a) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q68R/Q79R/L99R/E282D); (b) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 리신으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q68R/Q79R/L99K/E282D); (c) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아스파라긴으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q68R/Q79R/L99N/E282D); (d) 위치 68에서 글루타민의 이소류신으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q68I/Q79R/L99R/E282D); (e) 위치 68에서 글루타민의 리신으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q68K/Q79R/L99R/E282D); (f) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 히스티딘으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q68R/Q79H/L99R/E282D); (g) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 이소류신으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q68R/Q79I/L99R/E282D); (h) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 메티오닌으로의 치환(Q68R/Q79R/L99R/E282M); (i) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 트립토판으로의 치환(Q68R/Q79R/L99R/E282W); 또는 (j) 위치 68에서 글루타민의 이소류신으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 히스티딘으로의 치환, 위치 99에서 류신의 리신으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 메티오닌으로의 치환(Q68I/Q79H/L99K/E282M);
또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체는 서열 번호 637의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 MMLV RTase 돌연변이체의 아미노산 서열은 다음인 적어도 5개의 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) 위치 61에서 이소류신의 리신 또는 메티오닌으로의 치환(I61K 또는 I61M); (b) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌 또는 이소류신으로의 치환(Q68R 또는 Q68I); (c) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌 또는 히스티딘으로의 치환(Q79R 또는 Q79H); (d) 위치 99에서 류신의 아르기닌 또는 리신으로의 치환(L99R 또는 L99K); (e) 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산 또는 메티오닌으로의 치환(E282D 또는 E282M): (a) 위치 61에서 이소류신의 리신으로의 치환, 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(I61K/Q68R/Q79R/L99R/E282D); (b) 위치 61에서 이소류신의 메티오닌으로의 치환, 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(I61M/Q68R/Q79R/L99R/E282D); 또는 (c) 위치 61에서 이소류신의 메티오닌으로의 치환, 위치 68에서 글루타민의 이소류신으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 히스티딘으로의 치환, 위치 99에서 류신의 리신으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 메티오닌으로의 치환(I61M/Q68IR/Q79H/L99K/E282M).
또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체는 서열 번호 637의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 MMLV RTase 돌연변이체의 아미노산 서열은 다음인 적어도 5개 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다: (a) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌, 리신 또는 이소류신으로의 치환(Q68R, Q68K 또는 Q68I); (b) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌, 히스티딘 또는 이소류신으로의 치환(Q79R, Q79H 또는 Q79I); (c) 위치 99에서 류신의 아르기닌, 리신 또는 아스파라긴으로의 치환(L99R, L99K 또는 L99N); (d) 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산, 메티오닌 또는 트립토판으로의 치환(E282D, E282M 또는 E282W); (e) 위치 299에서 글루타민의 글루탐산으로의 치환; (f) 위치 332에서 트레오닌에서 글루탐산으로의 치환; (g) 위치 433에서 발린에서 아르기닌으로의 치환; (h) 위치 593에서 이소류신의 글루탐산으로의 치환; (a) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산에서 아스파르트산으로의 치환, 위치 299에서 글루타민의 글루탐산으로의 치환, 위치 433에서 발린에서 아르기닌으로의 치환 및 위치 593에서 이소류신의 글루탐산으로의 치환(Q68R/Q79R/L99R/E282D/Q299E/V433R/I593E): (b) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 82에서 류신의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산에서 아스파르트산으로의 치환, 위치 299에서 글루타민의 글루탐산으로의 치환, 위치 433 에서 발린에서 아르기닌으로의 치환 및 위치 593에서 이소류신의 글루탐산으로의 치환 (Q68R/Q79R/L82R/L99R/E282D/Q299E/V433R/I593E); (c) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 82에서 류신의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환, 위치 299에서 글루타민의 글루탐산으로의 치환, 위치 332에서 트레오닌에서 글루탐산으로의 치환, 및 위치 593에서 이소류신의 글루탐산으로의 치환(Q68R/Q79R/L82R/L99R/E282D/Q299E/T332E/I593E); (d) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환, 위치 82에서 류신의 아르기닌으로의 치환, 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환, 위치 299에서 글루타민의 글루탐산으로의 치환, 위치 332에서 트레오닌에서 글루탐산으로의 치환, 위치 433에서 발린에서 아르기닌으로의 치환, 및 위치 593에서 이소류신의 글루탐산으로의 치환(Q68R/Q79R/L82R/L99R/E282D/Q299E) /T332E/V433R/I593E).
한 실시 양태에서, RTase 돌연변이체 아미노산 서열은 표 3, 표 8, 표 9, 표 12, 또는 표 33으로부터 선택된 돌연변이체를 포함한다. 한 측면에서 RTase 돌연변이체 아미노산 서열은 서열 번호 638, 서열 번호 639, 서열 번호 640, 서열 번호 641, 서열 번호 642, 서열 번호643, 서열 번호 644, 서열 번호 645, 서열 번호 646, 서열 번호 647, 서열 번호 648, 서열 번호 649, 서열 번호 650, 서열 번호 651, 서열 번호 652, 서열 번호 653, 서열 번호 654, 서열 번호 655, 서열 번호 656, 서열 번호 657, 서열 번호 658, 서열 번호 659, 서열 번호 660, 서열 번호 661, 서열 번호 662, 서열 번호 663, 서열 번호 664, 서열 번호 665, 서열 번호 666, 서열 번호 667, 서열 번호 668, 서열 번호 669, 서열 번호 679, 서열 번호 671, 서열 번호 672, 서열 번호 673, 서열 번호 674, 서열 번호 675, 서열 번호 676, 서열 번호 677, 서열 번호 678, 서열 번호 679, 서열 번호 670, 서열 번호 671, 서열 번호 672, 서열 번호 673, 서열 번호 674, 서열 번호 675, 서열 번호 676, 서열 번호 677, 서열 번호 678, 서열 번호 679, 서열 번호 680, 서열 번호 681, 서열 번호 682, 서열 번호 683, 서열 번호 684, 서열 번호 685, 서열 번호 686, 서열 번호 687, 서열 번호 688, 서열 번호 689, 서열 번호 690, 서열 번호 691, 서열 번호 692, 서열 번호 693, 서열 번호 694, 서열 번호 695, 서열 번호 696, 서열 번호 697, 서열 번호 698, 또는 서열 번호 699 로부터 선택된 돌연변이체를 포함한다.
한 실시 양태에서 RTase 돌연변이체 아미노산 서열은 C-말단 연장부를 포함한다. 한 측면에서 C-말단 연장부는 펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 단리된 폴리펩티드는 C-말단 연장부를 갖는 RTase 돌연변이체를 코딩한다.
청구된 발명은 적어도 부분적으로 본원에 개시된 바와 같이 MMLV RTase 서열에 도입된 특정 단일 및 이중 아미노산 돌연변이가 증가된 또는 향상된 열안정성 및/또는 RTase 활성을 갖는 MMLV RTase를 생성한다는 발견에 기초한다. 따라서, MMLV RTase 돌연변이체를 합성하는 방법 및 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행하는 방법도 본원에서 제공된다. 단리된 MMLV RTase 단일, 이중, 삼중 이상의 돌연변이를 포함하는 키트가 추가로 제공된다.
특정 실시 양태에서, 돌연변이된 RTase는 레트로바이러스 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV)로부터 유래된다. 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 돌연변이된 RTase는 동일한 돌연변이를 다른 레트로바이러스로부터 얻은 RTase 기본 구축물에 도입함으로써 MMLV 이외의 레트로바이러스, 예컨대 조류 골수모세포증 바이러스(AMV) 및 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1)로부터 유래될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본 개시 내용의 RTase 돌연변이체는 당업계에 잘 알려진 유전 공학 기술에 의해 얻어진다. 예를 들어, 부위 지정 및 무작위 돌연변이 유발을 사용하여 본 발명의 RTase 돌연변이를 생성할 수 있다.
본 개시 내용의 한 실시 양태에서, 본 개시 내용의 RTase 돌연변이체는 조성물의 일부이다.
3. 돌연변이 유발
본 개시 내용의 RTase 돌연변이체는 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 제조될 수 있다. 한 실시 양태에서, RTase 염기 구축물의 핵산 서열(서열 번호 637)은 RTase 돌연변이체를 코딩하는 핵산 서열을 생성하기 위해 변형된다. 당업자는 적절한 균주가 있는 콜로니를 사용하여 관심의 RTase 돌연변이체를 배양하고 발현시킬 수 있으며, 세포 수거 및 단백질 단리 후에 RTase 돌연변이체를 cDNA 합성 기술에 사용할 수 있음을 인지할 것이다. 돌연변이 유발 및 cDNA 합성의 비제한적인 예는 본원의 실시예 1-3에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "돌연변이 유발"이라는 용어는 세포의 핵산 서열에 유전적 변화를 도입하는 것을 말하며, 여기서 변경은 이후 각 세포에 의해 유전된다. 당업자는 주어진 핵산 서열의 돌연변이가 다양한 방법을 사용하여 도입될 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 돌연변이 유발 방법이 표적 유전자 또는 표적 폴리뉴클레오티드를 돌연변이시키려고 한다는 것을 추가로 인지할 것이다. 표적 유전자는 임의의 하나 이상의 원하는 단백질을 코딩할 수 있다. 돌연변이 유발 방법은 일반적으로 원하는 서열 변형을 수반하는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드는 시험관 내 효소 DNA 합성을 사용하여 DNA 서열에 혼입되고 돌연변이 또는 야생형 박테리아에서 증식된다.
표적화된 돌연변이가 주형 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 원하는 위치에 도입되는 부위 지정 돌연변이 유발은 프라이머 신장 돌연변이 유발을 사용하여 달성될 수 있다. 이 기술은 주형 폴리뉴클레오티드에 대해 하나 이상의 원하는 돌연변이를 포함하는 특정 프라이머의 사용을 필요로 한다. 돌연변이 유발 프라이머는 합성 올리고뉴클레오티드 또는 PCR 산물일 수 있다. 돌연변이된 프라이머는 하나 이상의 치환, 결실, 첨가, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
돌연변이된 역전사효소는 또한 무작위 돌연변이 유발을 사용하여 생성될 수 있으며, 여기서 돌연변이는 합성 동안 돌연변이 유발 프라이머에 도입된다. 무작위 돌연변이된 올리고뉴클레오티드는 또한 돌연변이 유발 프라이머로 사용될 수 있다.
또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 돌연변이된 역전사효소는 오류가 발생하기 쉬운 롤링 서클 증폭(RCA: error-prone rolling circle amplification)을 사용하여 개발될 수 있다. 이 기술에서는 MnCl2의 존재 하에서 RCA를 수행하거나 입력 DNA의 양을 줄임으로써 DNA 중합 효소의 충실도가 감소한다.
4. cDNA 합성
본 개시 내용은 또한 본원에 개시된 MMLV RTase에 의해 생성된 cDNA의 수량으로 측정되는 MMLV RTase의 활성에 관한 것이다. cDNA는 1-단계 또는 2-단계 절차를 사용하여 제조될 수 있으며 다양한 주형 분자로부터 얻을 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "주형 분자"는 새로운 핵산 가닥을 만드는 데 사용하기 위한 유전자 코드를 운반하는 생물학적 분자를 지칭한다. 예를 들어, DNA 복제에서, 풀린 이중 나선과 각각의 단일 가닥 DNA 분자는 상보적 가닥을 합성하기 위한 주형으로 사용된다. 역전사는 RNA에서 cDNA를 생성한다. 당업자는 cDNA 분자가 다양한 핵산 주형 분자로부터 제조될 수 있음을 이해할 것이다. 한 실시 양태에서, 핵산 주형은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA일 수 있다. 한 실시 양태에서, RNA는 cDNA 합성에 사용될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체는 RTase 기본 구축물과 비교하여 증가된 또는 향상된 열안정성 및/또는 RTase 활성을 나타낸다. 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체는 변경된 반감기, 감소된 또는 제거된 RNase H 활성, 감소된 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 활성, 증가된 정확도 또는 충실도, 또는 증가된 특이성을 나타낸다.
본 개시 내용은 또한 단일 또는 이중 아미노산 돌연변이를 갖는 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체를 사용하여 cDNA를 합성하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체는 제1 가닥 cDNA 또는 제1 및 제2 가닥 cDNA를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 당업자는 제1 및 제2 가닥 cDNA가 전장 cDNA 서열 및 cDNA 라이브러리를 포함할 수 있는 이중 가닥 DNA 분자를 형성할 수 있음을 이해할 것이다.
본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체에 의해 역전사된 cDNA 분자는 단리될 수 있거나, cDNA 분자를 함유하는 반응 혼합물은 다운스트림 적용에서 또는 추가 분석 또는 조작을 위해 직접 사용될 수 있다. 본 개시 내용의 방법을 실시하는데 사용될 수 있는 증폭 방법은 본원에 기술되어 있고 당업계에 잘 알려져 있다. 역전사 반응은 고정된 올리고-dT 프라이머, 또는 무작위 서열 프라이머와 같은 비특이적 프라이머를 사용하거나, 각 유전자 프로브에 대해 RNA에 상보적인 표적 특이적 프라이머를 사용하거나, 열안정성 DNA 중합효소(예를 들어, AMV RTase 또는 MMLV RTase)를 사용하여 수행할 수 있다.
증폭 방법은 선택적 혼성화를 허용하는 조건 하에서 단리된 핵산과 접촉되는 관심의 특정 뉴클레오티드 서열에 상응하는 핵산에 선택적으로 혼성화하는 프라이머 쌍을 이용한다. 혼성화되면 핵산:프라이머 복합체는 주형 의존적 핵산 합성을 촉진하는 하나 이상의 효소와 접촉된다. 충분한 양의 증폭 산물이 생성될 때까지 "주기"라고도 하는 여러 라운드의 증폭이 수행된다. 다음으로 증폭 산물이 검출된다. 특정 방법에서, 검출은 가시적인 수단에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 검출은 화학발광, 혼입된 방사성 표지 또는 형광 표지의 방사성 신티그래피, 또는 심지어 전기 또는 열 임펄스 신호를 사용하는 시스템을 통한 생성물의 간접적으로 식별을 포함할 수 있다.
생성된 "디-올리고뉴클레오티드"의 서열을 갖는 핵산의 존재 하에 2개(또는 그 이상)의 올리고뉴클레오티드의 결찰에 기초한 방법, 이로써 디-올리고뉴클레오티드를 증폭시키는 방법이 또한 본 개시 내용의 증폭 단계에서 사용될 수 있다.
본 개시 내용의 일부 실시 양태에서, 검출 프로세스는, 예를 들어 특정 프라이머 또는 프로브를 선택하여 관심의 표적 바이오마커에 어닐링한 후 선택적 혼성화를 검출하는, 혼성화 기술을 이용할 수 있다. 당업계에 통상적으로 공지된 바와 같이, 표적화 서열과의 혼성화 융점을 고려하여 올리고뉴클레오티드 프로브 및 프라이머를 설계할 수 있다.
당업자는 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체를 사용하여 제조된 cDNA 분자가 다양한 추가 다운스트림 적용에 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 증폭 방법은 1-단계 PCR, 2-단계 PCR, 실시간 또는 정량 PCR, 핫-스타트 PCR, 네스티드 PCR, 터치다운 PCR, 차동 디스플레이 PCR(DDRT-PCR: differential display PCR), 마이크로어레이 기술, 역 PCR, PCR 말단의 신속한 증폭(RACE 또는 고정 PCR), 다중 PCR, 및 부위 지정 PCR 돌연변이 유발을 포함할 수 있다. 본 발명의 MMLV RTase 돌연변이체로 생성된 합성된 cDNA 및 cDNA 라이브러리는 추가 특성화를 위한 클로닝 및/또는 시퀀싱에 사용될 수 있다. 당업자는 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체로 제조된 cDNA를 사용한 핵산 증폭이 본원에 나열되지 않은 추가 기술을 포함할 수 있음을 인지할 것이다.
상기에 제시된 방법 하에서 혼성화가 가능하도록 하기 위해, 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브는 관심 서열의 일부에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함해야 한다.
5. 생물학적 샘플
본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체 및 연관된 방법은 RNA 또는 DNA가 단리될 수 있는 임의의 적합한 생물학적 샘플로 실시될 수 있다. 본 개시 내용의 일 실시 양태에서, 생물학적 샘플은 질환에 걸린 대상체 또는 건강한 대상체로부터 얻은 체액 또는 조직일 수 있다. 본 개시 내용의 일부 실시 양태에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 대변, 또는 소변을 포함하지만 이에 제한되지 않는 체액일 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 본 개시 내용의 방법은, 예를 들어 공지된 진단, 치료, 및/또는 결과 이력을 가진, 대상체로부터 신선하게 단리되거나 수집된 후 냉동 또는 보관된 임의의 적합한 샘플로 실시될 수 있다. 샘플은 예를 들어 미세 바늘 흡인 또는 바늘 생검과 같은 임의의 비침습적 수단에 의해, 또는 대안적으로 예를 들어 외과적 생검을 포함하는 침습적 방법에 의해 수집될 수 있다. 이러한 실시 양태에서, RNA 또는 DNA는 분석 전에 생물학적 샘플(예를 들어, 혈청)로부터 추출될 수 있다. RNA 및 DNA 추출 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
체액 또는 조직(예를 들어, 혈청)으로부터 RNA(즉, 총 RNA 또는 mRNA)를 추출하는데 사용하기 위한 다수의 키트가 당업계에 공지되어 있고 상업적으로 입수가능하다. 당업자는 특정 상황에 적합한 키트를 쉽게 선택할 수 있다.
본 개시 내용의 특정 실시 양태에서, 추출 후, mRNA는 증폭되고, cDNA로 전사되며, 이는 이후 적절한 RNA 중합효소에 의한 다수의 전사 라운드를 위한 주형으로 작용할 수 있다. 본 개시 내용의 방법을 실시하는데 사용될 수 있는 증폭 방법은 본원에 기술되어 있고 당업계에 잘 알려져 있다. 역전사 반응은 고정된 올리고-dT 프라이머 또는 무작위 서열 프라이머와 같은 비특이적 프라이머를 사용하거나, 모니터링되는 각 유전자 프로브에 대해 RNA에 상보적인 표적 특이적 프라이머를 사용하거나, 열안정성 DNA 중합효소, 예컨대 MMLV RTase 또는 본 개시 내용의 MMLV RTase 돌연변이체를 사용하여 수행될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 생물학적 샘플로부터 단리된 RNA(예를 들어, 증폭 및/또는 cDNA 또는 cRNA로의 전환 후)는 분석되기 전에 검출 가능한 물질로 표지된다. 검출 가능한 물질의 역할은 RNA 검출을 용이하게 하거나 혼성화된 핵산 단편(예를 들어, 어레이 기반 분석에서 유전자 프로브에 혼성화된 핵산 단편)의 가시화를 가능하게 하는 것이다. 일부 실시 양태에서, 검출 가능한 물질은 측정될 수 있고 그 강도가 분석되는 샘플에 존재하는 표지된 핵산의 양과 관련된 신호를 생성하도록 선택된다.
핵산 분자를 표지하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 표지 프로토콜 및 표지 검출 기술에 대한 리뷰는 문헌[Kricka, Ann. Clin . Biochem. 39: 114-29 (2002); van Gijlswijk et al., Expert Rev. Mol . Diagn. 1: 81-91 (2001); 및 Joos et al., J. Biotechnol. 35: 135-53 (1994)]에서 찾아볼 수 있다. 표준 핵산 표지 방법에는 방사성 물질의 혼입: 형광 염료 또는 효소의 직접 부착; 면역화학적으로 또는 다른 친화성 반응에 의해 검출 가능하게 만드는 핵산 단편의 화학적 변형; 및 효소 매개 표지 방법, 예컨대 무작위 프라이밍, 닉 번역, PCR, 및 말단 트랜스퍼라제를 사용한 테일링이 포함된다.
본 개시 내용의 방법을 실시하기 위해 임의의 다양한 검출 가능한 물질이 사용될 수 있다. 적합한 검출 가능한 물질은 다양한 리간드, 방사성핵종, 형광 염료, 화학발광제, 미립자(예를 들어, 양자점, 나노결정, 및 형광체), 효소(예를 들어, ELISA에 사용되는 것, 즉 양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제, 및 알칼리성 포스파타제), 비색 표지, 자기 표지, 비오틴, 디옥시제닌, 또는 항혈청, 또는 단클론 항체가 이용 가능한 기타 합텐 및 단백질을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
6.
키트
본 개시 내용은 또한 역전사 또는 관련 기술에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트에는 MMLV RTase 돌연변이 효소, 역전사효소 반응을 수행하기 위한 시약 및 완충제, 상자, 바이알, 튜브, 앰플 등 중 하나 이상이 포함된다. 키트는 또한 본원에 개시된 임의의 방법 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 실시하기 위한 키트 사용 지침서를 포함할 수 있다.
실시예
청구된 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시하며, 이는 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 당업자는 청구된 발명이 개시된 구조, 재료, 조성물, 및 방법의 변형으로 실시될 수 있고, 그러한 변형이 청구된 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 인식할 것이다.
본원에 기술된 RTase는 이. 콜라이(E. coli)에서 과발현하였고, 균질하게 정제하였으며, 역전사효소 정량 PCR(RT-qPCR)과 관련하여 RNA 검출을 향상시키는 능력에 대해 테스트하였다.
실시예
1. 부위 지정 돌연변이 유발에 의한
역전사효소
돌연변이체의 제조
a. 기본 구축물(
RNase
H 마이너스 구축물)에서 생성된
MMLV
RTase
돌연변이체의 클로닝
먼저 야생형, 또는 자연 발생 MMLV RTase의 아미노산 서열에 3개의 돌연변이(D524G, E562Q, 및 D583N)를 도입하여 MMLV RTase 기본 구축물(서열 번호 637)을 제조함으로써 MMLV RTase 돌연변이체를 제조하였다. SuperScript II RTase(Invitrogen)에 포함된 세 가지 돌연변이는 RNase H 활성을 감소시키는 것으로 나타났다(미국 특허 제5,405,776호 참조). MMLV RTase 기본 구축물은 이. 콜라이 발현에 최적화하였으며 gBlocks® Gene Fragments(Integrated DNA Technologies)로서 또는 적절한 정제 태그가 있는 맞춤형 유전자 합성에 의해 얻었다. 후속 유전자는 표준 PCR 조건 및 프라이머(표 1 참조)를 사용하여 증폭하였다. 증폭된 DNA는 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen, 카탈로그 번호 28104)를 사용하여 정제한 후, pET28b 발현 플라스미드 내로 유전자 단편 조립을 수행하였다. 이. 콜라이 세포 내로 형질전환 후 원하는 서열을 확인하기 위해 플라스미드 DNA를 단리하고 시퀀싱하였다. MMLV RTase 돌연변이는 이론적 설계에 의해 선택하였고(도 1a-1c) 표준 PCR 조건 및 프라이머(표 1 참조)를 사용하여 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 도입하였다. 생성된 플라스미드를 발현을 위해 이. 콜라이 BL21(DE3) 세포 내로 형질전환시켰다.
실시예
2:
증가된
활성 및
열안정성을
스크리닝하기 위한
역전사효소
돌연변이체의 제조
a.
MMLV
RTase
및 돌연변이
변이체의
과발현
최적의 배양 조건을 결정하기 위해 테스트 유도를 사용하였다. 적절한 균주가 있는 콜로니를 사용하여 카나마이신(0.05 mg/mL) 포함 Terrific Broth(TB) 배지(50 mL)에 접종하고 OD가 약 0.9에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 50 mL 배양액을 반으로 나누어 2개의 유도 온도를 제공하였다. IPTG(1M; 12.5 μL)를 사용하여 단백질 발현을 유도한 다음 2개의 유도 온도에서 21시간 동안 배양하였다. 분취량(OD 1.25로 정규화)을 3시간과 21시간에 취하여, 세포를 13,000 x g에서 1분 동안 수거하고, 수거한 세포를 -20℃에서 보관하였다. 세포를 1x SDS-PAGE 전개 완충액(270 μL) 및 5x SDS-PAGE 로딩 염료(70 μL)에 재현탁하였다. 샘플을 5분 동안 끓이고 초음파 처리하고 4-20% Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ 단백질 겔(Bio Rad, 카탈로그 번호 4568094)에 로딩하였다(15 μL). SDS-PAGE 이미지는 [도 2]에 제시한다.
b.
MMLV
RTase
및 돌연변이
변이체의
발현 및 정제
적절한 균주가 있는 콜로니를 사용하여 카나마이신(0.05mg/mL) 포함 TB 배지(1 mL, 96웰 깊은 웰 플레이트)에 접종하고 약 0.9의 OD가 달성될 때까지 37℃에서 배양한 다음 플레이트를 얼음 위에서 5분 동안 냉각시켰다. 100 mM IPTG(5 μL)를 첨가하여 단백질 발현을 유도한 후 18℃에서 21시간 동안 배양하였다. 샘플을 4,700 x g에서 10분 동안 회전시켜 세포를 수거하였다.
세포 펠릿을 용해 완충액(50 mM NaPO4, pH 7.8, 5% 글리세롤, 300 mM NaCl, 및 10 mM 이미다졸)에 재현탁하고 1x BugBuster®(Millipore Sigma, 카탈로그 번호 70921)를 첨가하고 엔드 오버 엔드 믹서에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 용해하였다. 용해물을 16,000 x g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다.
투명한 용해물을 HisPur™ Ni-NTA 스핀 플레이트(ThermoFisher, 카탈로그 번호 88230)에 적용하였다. 수지를 스크리닝 His-결합 완충액(50 mM NaPO4, pH 7.8, 5% 글리세롤, 300 mM NaCl, 및 10 mM 이미다졸)으로 평형화하고 샘플을 로딩하였다. 샘플을 스크리닝 His-세척 완충액(50 mM NaPO4, pH 7.8, 5% 글리세롤, 300 mM NaCl, 및 25 mM 이미다졸)으로 3회 세척하고 스크리닝 His-용출 완충액(50 mM NaPO4, pH 7.8, 5% 글리세롤, 300 mM NaCl, 및 250 mM 이미다졸)을 사용하여 용출하였다. 정제된 단백질은 테스트 목적으로 설정된 농도(100 nM)로 정규화하였다.
실시예
3:
역전사효소
돌연변이체의 평가
a.
RTase
돌연변이체의 DNA 합성 능력의 평가
정제된 총 RNA(DNas 처리, HeLa 세포로부터 단리됨)로부터 cDNA를 합성하는 돌연변이 RTase의 능력을 MMLV RTase 기본 구축물(RNase H 마이너스 구축물)과 비교하였다. 돌연변이 MMLV RTase는 두 가지 형식으로 테스트하였다. (1) 유전자 특이적 프라이머를 사용한 표준 2-단계 cDNA 합성 후 qPCR 및 (2) Integrated DNA Technologies PrimeTime® Gene Expression Master Mix(GEM)에서 RTase의 1-단계 추가 ).
b. 표준 2-단계 절차
RTase(2 μL, 100 nM)를 RNA(50 ng), dNTP(100 μM), 유전자 특이적 프라이머 세트(500 nM; 표 2 참조), 제1 가닥 합성 완충액(1x, 50 mM 트리스-HCl, pH 8.3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT) 및 SuperaseIN(0.17 U/μL)을 함유하는 반응 혼합물에 50 μL 부피로 첨가하였다. 반응을 50℃에서 15분 동안 진행하도록 둔 후, 80℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다.
RTase 돌연변이체에 의해 합성된 cDNA는 인간 세포에서 SFRS9 유전자를 식별하는 분석을 사용하여 qPCR 증폭에 의해 정량화하였다. 분석 마스터 믹스 조성물에는 GEM(1x), ROX(50 nM), SFRS9 프라이머 세트(500 nM; 표 2 참조), 및 SFRS9 프로브(250 nM; 표 2 참조)가 포함되었다. 분석 마스터 믹스와 합성된 cDNA를 최종 부피 20 μL에 대해 4:1 비율로 혼합하였다. 반응은 다음 주기 조건 하에서 40 주기 동안 qPCR(QuantStudio)에서 수행하였다: 95℃에서 3분 유지, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분.
c. GEM에서의 1-단계 절차
RTase(1 μL, 100 nM)를 RNA(10 ng), GEM(1x), ROX(50 nM), SFRS9 프라이머 세트(500 nM; 표 2 참조) 및 SFRS9 프로브(250 nM; 표 2 참조)를 포함하는 반응 혼합물에 최종 부피 20 μL으로 첨가하였다. 다음 주기 조건을 사용하여 qPCR 기기(QuantStudio)에서 40주기 동안 반응을 실행하였다: 60℃에서 15분 유지, 95℃에서 3분 유지, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분.
d.
MMLV
RTase
기본 구축물 및 단일 돌연변이
변이체
실시예 1에 기술된 바와 같이, 선택 돌연변이를 표준 PCR 조건 및 프라이머를 사용하여 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 MMLV RTase 기본 구축물에 도입함으로써 MMLV RTase 단일 돌연변이 변이체를 제조하였다. MMLV RTase 기본 구축물 및 단일 돌연변이 변이체의 서열은 표 3에 제시한다. 당업자는 서열 번호 637에 제시된 MMLV RTase 아미노산 서열이 야생형 또는 자연 발생 MMLV RTase의 전장 아미노산 서열의 절두된 형태라는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 메티오닌 잔기가 본 개시 내용의 MMLV RTase 기본 구축물 및 돌연변이체를 재조합적으로 생산하는 데 필요하고, 따라서 본원에 개시된 MMLV RTase 서열(예를 들어, 표 3, 8 및 9 참조)이 아미노산 서열의 N-말단에 메티오닌 잔기를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 그러나, 본 개시 내용과 관련하여, 그리고 돌연변이가 도입된 MMLV RTase 아미노산 서열 내의 잔기를 식별하고 넘버링하기 위해, 이 메티오닌 잔기를 아미노산 잔기 0으로 간주하고(즉, 카운트하지 않음), 두 번째 아미노산 잔기(예를 들어, 서열 번호 637에 제시된 MMLV RTase 기본 구축물의 트레오닌)를 아미노산 잔기 1로 간주한다.
e. 실험 결과
MMLV RTase 기본 구축물 및 MMLV RTase 단일 돌연변이 변이체에 대한 2-단계 및 1-단계 반응을 분석하고 표준 곡선을 기초로 하여 카피 수 출력으로 보고하였다(표 4 및 5 참조). 6개의 단일 돌연변이 MMLV RTase 변이체가 MMLV RTase 기본 구축물과 비교하여 전체 활성 및 열안정성에서의 증가를 나타내는 것으로 확인되었다. 6개의 단일 돌연변이 MMLV RTase 변이체는 다음과 같다: I61R, Q68R, Q79R, L99R, E282D, 및 R298A.
실시예
4:
역전사효소
단일 돌연변이체의 확장
실시예 3에서 확인된 MMLV RTase 단일 돌연변이체를 둘러싸는 아미노산 위치를 그 위치에서 가능한 모든 아미노산 치환을 포함하는 것으로 추가로 평가하였다. 단일 돌연변이체를 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 클로닝, 과발현, 및 정제하고, 실시예 3에 기술된 바와 같이 평가하였다. MMLV RTase 기본 구축물 및 MMLV RTase 이중 돌연변이 변이체에 대한 2-단계 및 1-단계 반응을 분석하고 표준 곡선에 기초하여 카피 수 출력으로 보고하였다(표 6 및 7 참조). 10개의 단일 돌연변이 MMLV RTase 변이체(표 8 참조)가 MMLV RTase 기본 구축물와 비교하여 전체 활성 및 열안정성에서의 증가를 나타내는 것으로 확인되었다. 10개의 단일 돌연변이 MMLV RTase 변이체는 다음과 같다: I61K, I61M, Q68I, Q68K, Q79H, Q79I, L99K, L99N, E282M 및 E282W.
실시예
5: 향상된 활성을 갖는
역전사효소
돌연변이체의 집적
a.
MMLV
RTase
이중 돌연변이체
실시예 3에서 확인된 MMLV RTase 단일 돌연변이체를 집적하여 MMLV RTase 기본 구축물(RNase H 마이너스 구축물)과 비교하여 정제된 총 RNA(DNase 처리, HeLa 세포로부터 단리됨)로부터 cDNA를 합성하는 MMLV RTase의 능력을 추가로 향상시켰다. 15개의 MMLV RTase 이중 돌연변이 변이체(표 9 참조)를 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 클로닝, 과발현, 및 정제하고 실시예 3에 기술된 바와 같이 평가하였다. MMLV RTase 기본 구축물 및 MMLV RTase 이중 돌연변이 변이체에 대한 1-단계 및 2-단계 반응을 분석하고 표준 곡선에 기초하여 카피 수 출력으로 보고하였다(표 10 및 11 참조).
15개의 MMLV RTase 이중 돌연변이 변이체 중 4개가 다른 MMLV RTase 이중 돌연변이 변이체와 비교하여 증가된 전체 활성 및 열안정성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 거의 모든 MMLV RTase 이중 돌연변이 변이체가 MMLV 기본 구출물과 비교하여 증가된 전체 활성 및 열안정성을 나타냈다. 가장 높은 전체 활성을 나타내는 것으로 확인된 4개의 MMLV RTase 이중 돌연변이 변이체는 E282D/L99R, L99R/Q68R, L99R/Q79R 및 Q68R/Q79R이었다.
b.
MMLV
RTase
삼중 이상의 돌연변이체의
클로닝
이중 돌연변이 변이체에 이어, MMLV RTase 단일 돌연변이체를 추가로 집적하여 MMLV RTase 기본 구축물(RNase H 마이너스 구축물)과 비교하여 정제된 총 RNA(DNas 처리, HeLa 세포로부터 단리)로부터 cDNA를 합성하는 MMLV RTase의 능력을 개선하였다. 17개의 MMLV RTase 삼중 이상의 돌연변이 변이체(표 12 참조)를 실시예 1에 기술된 바와 같이 클로닝하였다.
c.
MMLV
RTase
및 돌연변이
변이체의
발현 및 정제
적절한 균주가 있는 콜로니를 사용하여 카나마이신(0.05mg/mL) 포함 TB 배지(200 mL)를 접종하고 약 0.9의 OD가 달성될 때까지 37℃에서 배양한 다음 플라스크를 4℃에서 30분 동안 냉각시켰다. 1 M IPTG(100 μL)를 첨가하여 단백질 발현을 유도한 후, 18℃에서 21시간 동안 배양하였다. 샘플을 4,700 x g에서 10분 동안 회전시켜 세포를 수거하였다.
세포 펠릿을 용해 완충액(50 mM NaPO4, pH 7.8, 5% 글리세롤, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 5 mM DTT, 0.01% n-오실-β-D-글루코피라노시드, DNaseI, 10 mM CaCl2, 리소자임(1 mg/mL), 및 프로테아제 억제제)에 재현탁하였다. 4℃로 미리 냉각시킨 Avestin Emulsiflex C3에 15-20 kpsi로 3회 통과시켜 샘플을 용해하였다. 용해물을 16,000 x g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다.
투명한 용해물을 HisTrap HP 컬럼(Cytiva Life Sciences, 카탈로그 번호 17524701)에 적용하였다. 수지를 MMLV His-결합 완충액(50 mM NaPO4, pH 7.8, 5% 글리세롤, 0.3 M NaCl, 10 mM 이미다졸, 1 mM DTT 및 0.01% IGEPAL-CA)으로 평형화한 후, 샘플을 로딩하였다. 샘플을 MMLV His-결합 완충액, 이어서 25% B 세척액(B = MMLV His 용출 완충액 = 50 mM NaPO4, pH 7.8, 5% 글리세롤, 0.3 M NaCl, 250 mM 이미다졸, 1 mM DTT 및 0.01% IGEPAL-CA)로 세척하였다. 샘플을 45 mL 분획에 10 CV에 대해 100% B로 용출하였다.
정제된 단백질을 HiTrap Heparin HP 컬럼(Cytiva Life Sciences, 카탈로그 번호 17040601)에 적용하였다. 수지를 MMLV 헤파린 결합 완충액(트리스 HCl pH 8.5, 75 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% 글리세롤 및 0.01% IGEPAL-CA)으로 평형화한 후, 샘플을 로딩하였다. 샘플을 MMLV 헤파린 결합 완충액, 이어서 25% B 세척액(B = MMLV 헤파린 용출 완충액)으로 세척하였다. 샘플을 45 mL 분획에 10 CV에 대해 60% B로 용출하였다.
정제된 단백질을 Bio-Scale™ Mini CHT™ Cartridge(Bio-Rad Laboratories, 카탈로그 번호 7324322)에 적용하였다. 수지를 1 M NaOH로 세척한 다음, MMLV 헤파린 결합 완충액으로 평형화하고 샘플을 로딩하였다. 샘플을 MLV 헤파린 용출 완충액, 이어서 MMLV 헤파린 결합 완충액으로 세척하였다. 샘플을 5 mL 분획에 15 CV에 대해 100% B2(B2 = MMLV HA 용출 완충액 = 250 mM KPO4 pH 7.5, 1 mM DTT, 5% 글리세롤 및 0.01% IGEPAL-CA)로 선형 용출하였다.
정제된 단백질을 포함하는 분획을 모으고 MMLV 저장 완충액(50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 50%(v/v) 글리세롤)에서 투석하였다.
d. 정제된
MMLV
RTase
돌연변이
변이체의
유전자 특이적
프라이밍에
의한 DNA 합성 능력의 평가
MMLV RTase 기본 구축물 및 MMLV RTase 돌연변이체 변이체를 실시예 3에 기술된 바와 같이 평가하였다. 2-단계 반응 및 1-단계 반응 모두에 대해 온도를 각각 55℃ 및 60℃로 조정하였다. MMLV RTase 기본 구축물 및 MMLV RTase 돌연변이 변이체에 대한 2-단계 및 1-단계 반응을 분석하고 qPCR로부터의 Ct 출력으로 보고하였다(표 13 및 14 참조).
17개의 MMLV RTase 삼중 이상의 돌연변이 변이체 중 6개가 다른 MMLV RTase 집적 돌연변이 변이체와 비교하여 증가된 전체 활성 및 열안정성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 거의 모든 MMLV RTase 집적 돌연변이 변이체가 MMLV RTase 기본 구축물과 비교하여 증가된 전체 활성 및 열 안정성을 나타냈다. 가장 높은 전체 활성을 나타내는 것으로 확인된 6개의 MMLV RTase 돌연변이 변이체는 Q68R/L99R, Q68R/Q79R/L99R, Q68R/Q79R/L99R/E282D, Q68R/Q79R/L99K/E282D, Q68R/Q79R/L99R/E282W, I61M/Q68R/Q79R/L99R/E282D 및 Q68I/Q79H/L99K/E282M이었다.
e. 정제된
MMLV
RTase
돌연변이
변이체의
올리고-dT 또는 무작위
프라이밍에
의한 DNA 합성 능력의 평가
MMLV RTase 기본 구축물 및 MMLV RTase 돌연변이 변이체를 실시예 3에 기술된 바와 같이 평가하였다. 올리고-dT 또는 무작위 헥사머 프라이밍 조건을 2-단계 반응에 대해 조정하였고 RTase 농도는 31 nM로 정규화하였다. MMLV RTase 기본 구축물 및 MMLV RTase 돌연변이 변이체에 대한 2-단계 반응을 분석하고 qPCR로부터의 Ct 출력으로 보고하였다(표 15 및 16 참조).
17개의 MMLV RTase 삼중 이상 돌연변이 변이체 중 9개가 다른 MMLV RTase 집적 돌연변이 변이체와 비교하여 증가된 전체 활성 및 열안정성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 거의 모든 MMLV RTase 집적 돌연변이 변이체가 MMLV RTase 기본 구축물과 비교하여 증가된 전체 활성 및 열 안정성을 나타냈다. 가장 높은 전체 활성을 나타내는 것으로 확인된 9개의 MMLV RTase 돌연변이 변이체는 Q79R/L99R/E282D, Q68R/Q79R/L99R, Q68R/Q79R/L99R/E282D, Q68R/Q79R/L99K/E282D, Q68R/Q79R/L99N/E282D, Q68K/Q79R/L99R/E282D, Q68R/Q79R/L99R/E282M, I61K/Q68R/Q79R/L99R/E282D 및 I61M/Q68R/Q79R/L99R/E282D였다.
f. 광범위한 온도에 걸쳐 DNA를 합성하는 정제된
MMLV
RTase
돌연변이
변이체의
능력 평가
MMLV RTase 기본 구축물 및 MMLV RTase 돌연변이 변이체를 실시예 3에 기술된 바와 같이 평가하였다. 올리고-dT 또는 무작위 헥사머 프라이밍 조건 및 반응 온도를 2-단계 반응에 대해 조정하였고 RTase 농도는 31 nM로 정규화하였다. MMLV RTase 기본 구축물 및 MMLV RTase 돌연변이 변이체에 대한 2-단계 반응을 분석하고 qPCR로부터의 Ct 출력으로 보고하였다(표 17 및 18 참조).
9개의 MMLV RTase 삼중 이상 돌연변이 변이체 중 6개가 사용된 프라이밍 방법에 관계없이 37.0에서 65℃에 이르는 광범위한 온도에 걸쳐 다른 MMLV RTase 집적 돌연변이 변이체와 비교하여 높은 전체 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 모든 MMLV RTase 집적 돌연변이 변이체가 MMLV RTase 기본 구축물과 비교하여 증가된 전체 활성 및 열안정성을 나타냈다. 광범위한 온도에서 가장 높은 전체 활성을 나타내는 것으로 확인된 6개의 MMLV RTase 돌연변이 변이체는 Q68R/Q79R/L99R, Q68R/Q79R/L99R/E282D, Q68R/Q79R/L99K/E282D, Q68R/Q79R/L99N/E282D, I61K/Q68R/Q79R/L99R/E282D 및 I61M/Q68R/Q79R/L99R/E282D였다.
실시예
6: 올리고 dT 또는 무작위
프라이밍에
의한
역전사효소
돌연변이체의 평가
본 실시예는 MMLV RTase 기본 구축물과 비교하여 정제된 총 RNA(DNase 처리, HeLa 세포로부터 단리됨)로부터 cDNA를 합성하는 각 돌연변이 RTase의 능력을 평가하는 데 사용되는 절차를 보여준다. 돌연변이 MMLV RTase를 2가지 프라이밍 조건에 의해 테스트하였다: 실시예 5에 기술된 바와 같은 표준 2-단계 cDNA 합성을 사용한 올리고 dT 단독 및 무작위 헥사머 프라이밍. 반응을 분석하고 Ct 값으로 보고하였다(표 19 및 20). MMLV RTase의 4개의 돌연변이 변이체가 기본 구축물인 Q299E, T332E 및 V433R과 비교하여 올리고 dT 프라이밍을 사용하여 전체 활성의 증가를 보였다. MMLV RTase의 8개 돌연변이 변이체가 기본 구축물인 P76R, L82R, I125R, Y271A, L280A, L280R, T328R 및 V433R과 비교하여 무작위 프라이밍을 사용하여 전체 활성에서의 증가를 보였다.
실시예
7. 유전자 특이적
프라이밍에
의한
역전사효소
돌연변이체의 평가
본 실시예는 MMLV RTase 기본 구축물과 비교하여 정제된 RNA 울트라머(Integrated DNA Technologies)로부터 cDNA를 합성하는 각 돌연변이 RTase의 능력을 평가하는 데 사용되는 절차를 보여준다. 돌연변이 MMLV RTase는 실시예 5에 기술된 바와 같이 GEM에서 RTase의 1-단계 첨가로 테스트하였다. 반응을 분석하고 Ct 값으로 보고하였다(표 21). MMLV RTase의 12개 돌연변이 변이체가 기본 구축물인 H77A, D83E, D83R, Y271E, Q299E, G308E, F396A, V433R, I593E, I597A 및 I597R과 비교하여 전체 활성에서의 증가를 보였다.
실시예
8. 향상된 활성을 갖는
역전사효소
돌연변이체의 추가 집적.
본 실시예는 기본 구축물 및 돌연변이 Q68R/Q79R/L99R/E282D를 포함하는 이전에 발견된 돌연변이 MMLV RTase와 비교하여 정제된 총 RNA(DNase 처리, HeLa 세포로부터 단리됨)로부터 cDNA를 합성하는 MMLV RTase의 능력을 추가로 개선하기 위해 실시예 6-7에서 확인된 향상된 돌연변이체를 집적하는 데 사용되는 절차를 보여준다. 집적 돌연변이 MMLV RTase를 실시예 1-2에 기술된 바와 같이 클로닝, 과발현 및 정제하고 실시예 6-7에 기술된 바와 같이 테스트하였다. 2-단계 및 1-단계 반응 모두를 분석하고 Ct 값으로 보고하였다(표 22-24). MMLV RTase의 8개의 집적 돌연변이 변이체 중 6개가 기본 구축물인 Q68R/Q79R/L99R/E282D/V433R, Q68R/Q79R/L99R/E282D/I593E, Q68R/Q79R/L99R/E282D/Q299E, Q68R/Q79R/L99R/E282D/T332E, Q68R/L82R/L99R/E282D 및 Q68R/Q79R/L82R/L99R/E282D 와 비교하여 전체 활성 및 열안정성을 증가시켰다. 이어서, MMLV RTase의 6개의 집적 돌연변이 변이체 중 4개가 이전에 확인된 돌연변이 RTase(Q68R/Q79R/L99R/E282D), Q68R/Q79R/L99R/E282D/I593E, Q68R/Q79R/L99R/E282D/Q299E, Q68R/L82R/L99R/E282D 및Q68R/Q79R/L82R/L99R/E282D 와 비교하여 전체 활성 및 열 안정성을 증가시켰다.
이러한 집적 돌연변이 변이체에 이어, MMLV RTase 기본 구축물(RNase H 마이너스 구축물)과 비교하여 정제된 총 RNA(DNase 처리, HeLa 세포로부터 단리됨)로부터 cDNA를 합성하는 MMLV RTase의 능력을 향상시키기 위해 MMLV RTase 돌연변이를 추가로 집적하였다. 8개의 MMLV RTase 6중 이상의 돌연변이 변이체를 실시예 1에 기술된 바와 같이 클로닝하고 실시예 5에서와 같이 과발현 및 정제하였다.
MMLV RTase 기본 구축물 및 MMLV RTase 돌연변이 변이체는 실시예 3에 기술된 바와 같이 평가하였다. 2-단계 및 1-단계 반응 모두에 대해 온도를 각각 42/55 및 50/60℃로 조정하였다. 2-단계 제1 가닥 합성 완충액을 50 mM 트리스-히드로클로라이드, pH 8.3, 75 mM 염화칼륨, 3 mM 염화마그네슘 및 10 mM DTT에서 50 mM 아세트산칼륨, 20 mM 트리스-아세테이트, pH 7.0, 10 mM 아세트산마그네슘, 100 μg/ml 소 혈청 알부민 및 10 mM DTT로 변형시켰다. MMLV RTase 기본 구축물 및 MMLV RTase 돌연변이 변이체에 대한 2-단계 및 1-단계 반응을 분석하고 qPCR로부터의 Ct 출력으로 보고하였다(표 22-24).
11개의 MMLV RTase 6중 이상의 돌연변이 변이체 중 4개가 다른 MMLV RTase 집적 돌연변이 변이체와 비교하여 증가된 전체 활성 및 열안정성을 나타내는 것으로 나타났으며, 거의 모든 MMLV RTase 집적 돌연변이 변이체가 MMLV RTase 기본 구축물에 비해 증가된 전체 활성 및 열안정성을 나타냈다. 가장 높은 전체 활성을 나타내는 것으로 확인된 4개의 MMLV RTase 돌연변이 변이체는 Q68R/Q79R/L99R/E282D/Q299E/V433R/I593E, Q68R/Q79R/L82R/L99R/E282D/Q299E/V433R/I593E, Q68R/Q79R/L82R/L99R/E282D/Q299E/T332E/I593E 및 Q68R/Q79R/L82R/L99R/E282D/Q299E/T332E/V433R/I593E였다.
a. 광범위한 온도에 걸쳐 DNA를 합성하는 정제된
MMLV
RTase
돌연변이
변이체의
능력 평가
MMLV RTase 기본 구축물 및 MMLV RTase 돌연변이 변이체를 실시예 5에 기술된 바와 같이 평가하였다. 올리고-dT 또는 무작위 헥사머 프라이밍 조건 및 반응 온도를 2-단계 반응에 대해 조정하였고 RTase 농도는 31 nM로 정규화하였다. MMLV RTase 기본 구축물 및 MMLV RTase 돌연변이 변이체에 대한 2-단계 반응을 분석하고 qPCR로부터의 Ct 출력으로 보고하였다(표 25 및 26 참조).
5개의 MMLV RTase 돌연변이체가 사용된 프라이밍 방법에 관계없이 37.0에서 51℃에 이르는 광범위한 온도에 걸쳐 MMLV RTase 기본 구축물과 비교하여 높은 전체 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 모든 MMLV RTase 집적 돌연변이 변이체가 MMLV RTase 기본 구축물과 비교하여 증가된 전체 활성 및 열안정성을 나타냈다. 광범위한 온도에서 가장 높은 전체 활성을 나타내는 것으로 확인된 5개의 MMLV RTase 돌연변이 변이체는 Q68R/Q79R/L99R/E282D, Q68R/Q79R/L99R/E282D/Q299E/V433R/I593E, Q68R/Q79R/L82R/L99R/E282D/Q299E/V433R/I593E, Q68R/Q79R/L82R/L99R/E282D/Q299E/T332E/I593E 및 Q68R/Q79R/L82R/L99R/E282D/Q299E/T332E/V433R/I593E였다.
실시예
9:
역전사효소
단일 돌연변이체의 확장
실시예 6 및 7에서 확인된 MMLV RTase 단일 돌연변이체를 둘러싸는 아미노산 위치를 그 위치에서 가능한 모든 아미노산 치환을 포함하는 것으로 추가로 평가하였다. 단일 돌연변이체를 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 클로닝, 과발현, 및 정제하고, 실시예 6 및 7에 기술된 바와 같이 평가하였다. MMLV RTase 기본 구축물 및 MMLV RTase 이중 돌연변이 변이체에 대한 2-단계 및 1-단계 반응을 분석하고 qPCR로부터의 Ct 출력으로 보고하였다(표 27-29). 다수의 단일 돌연변이 MMLV RTase 변이체가 MMLV RTase 기본 구축물과 비교하여 전체 활성 및 열안정성의 증가를 나타내는 것으로 확인되었다. 이들 중 가장 일반적인 것은 L82F, L82K, L82T, L82Y, L280I, T332V, V433K, V433N 및 I593W였다.
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<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 1
ggtatatctc cttcttaaag ttaaacaaaa ttatttctag aggggaatga tccggctgct 60
aacaaagcc 69
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<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 3
ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tc 52
<210> 4
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 4
gcagccaact cagcttcctt tcgggctttg ttaaaaatgc tcgctagtgt agggagagc 59
<210> 5
<211> 54
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<220>
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<400> 5
aagcaccgtt gatcatcccg ttagcggcaa cgtctacacc tgtctctatc aaac 54
<210> 6
<211> 54
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<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<211> 54
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ccgttgatca tcccgttaaa ggcagaatct acacctgtct ctatcaaaca gtacccc 57
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atcatcccgt taaaggcaac gtctgcgcct gtctctatca aacagtaccc catgag 56
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atcatcccgt taaaggcaac gtctcgtcct gtctctatca aacagtaccc catgag 56
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atcatcccgt taaaggcaac gtctgaacct gtctctatca aacagtaccc catgag 56
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<220>
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ccgttaaagg caacgtctac acctgcgtct atcaaacagt accccatgag tcaagagg 58
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<211> 58
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<220>
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<211> 58
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<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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ccgttaaagg caacgtctac acctgaatct atcaaacagt accccatgag tcaagagg 58
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<211> 54
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<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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taaaggcaac gtctacacct gtctctgcga aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
<210> 18
<211> 54
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taaaggcaac gtctacacct gtctctcgta aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
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taaaggcaac gtctacacct gtctctgaaa aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
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<211> 51
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ggcaacgtct acacctgtct ctatccgtca gtaccccatg agtcaagagg c 51
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<211> 51
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ggcaacgtct acacctgtct ctatcgaaca gtaccccatg agtcaagagg c 51
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<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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ctgtctctat caaacagtac cccatgagtg cggaggcccg cctggg 46
<210> 24
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ctgtctctat caaacagtac cccatgagtc gtgaggcccg cctggg 46
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<211> 46
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ctgtctctat caaacagtac cccatgagtg aagaggcccg cctggg 46
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ggcccgcctg gggattcgtc cacatattca gcgcttgctg gacca 45
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
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cgcctgggga ttaagccaca tattcgtcgc ttgctggacc agggg 45
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cgcctgggga ttaagccaca tattgaacgc ttgctggacc agggg 45
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<212> DNA
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ccgtggaaca ccccccttga acccgtgaaa aagccaggta caaac 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 35
cacccccctt ctgcccgcga aaaagccagg tacaaacgat tatcgtcc 48
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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cacccccctt ctgccccgta aaaagccagg tacaaacgat tatcgtcc 48
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<220>
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cacccccctt ctgcccgaaa aaaagccagg tacaaacgat tatcgtcc 48
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cccccttctg cccgtggcga agccaggtac aaacgattat cgtcc 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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cccccttctg cccgtgcgta agccaggtac aaacgattat cgtcc 45
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<211> 45
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<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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cccccttctg cccgtggaaa agccaggtac aaacgattat cgtcc 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 41
cccccttctg cccgtgaaag cgccaggtac aaacgattat cgtccagtt 49
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<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 42
cccccttctg cccgtgaaac gtccaggtac aaacgattat cgtccagtt 49
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<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 43
cccccttctg cccgtgaaag aaccaggtac aaacgattat cgtccagtt 49
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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gcccgtgaaa aagccaggtg cgaacgatta tcgtccagtt caagatcttc g 51
<210> 45
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 51
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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gcccgtgaaa aagccaggtg aaaacgatta tcgtccagtt caagatcttc g 51
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<211> 52
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<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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cccgtgaaaa agccaggtac agcggattat cgtccagttc aagatcttcg cg 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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cccgtgaaaa agccaggtac acgtgattat cgtccagttc aagatcttcg cg 52
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<211> 52
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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cccgtgaaaa agccaggtac agaagattat cgtccagttc aagatcttcg cg 52
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<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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cgtgaaaaag ccaggtacaa acgatgcgcg tccagttcaa gatcttcgcg 50
<210> 51
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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cgtgaaaaag ccaggtacaa acgatcgtcg tccagttcaa gatcttcgcg 50
<210> 52
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 52
cgtgaaaaag ccaggtacaa acgatgaacg tccagttcaa gatcttcgcg 50
<210> 53
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 53
cgtgaaaaag ccaggtacaa acgattatgc gccagttcaa gatcttcgcg agg 53
<210> 54
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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cgtgaaaaag ccaggtacaa acgattatga accagttcaa gatcttcgcg agg 53
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<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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gccaggtaca aacgattatc gtccagcgca agatcttcgc gaggtcaaca aac 53
<210> 57
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 57
gccaggtaca aacgattatc gtccacgtca agatcttcgc gaggtcaaca aac 53
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<211> 53
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<220>
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gccaggtaca aacgattatc gtccagaaca agatcttcgc gaggtcaaca aac 53
<210> 59
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 59
agttcaagat cttcgcgagg tcaacgcgcg cgtagaagac atccatccga c 51
<210> 60
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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agttcaagat cttcgcgagg tcaaccgtcg cgtagaagac atccatccga c 51
<210> 61
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 61
agttcaagat cttcgcgagg tcaacgaacg cgtagaagac atccatccga c 51
<210> 62
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 62
gcgaggtcaa caaacgcgta gcggacatcc atccgactgt acctaatcc 49
<210> 63
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<212> DNA
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gcgaggtcaa caaacgcgta gatgacatcc atccgactgt acctaatcc 49
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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acgcgtagaa gacatccatc cggtggtacc taatccttat aatctgttat caggcctgc 59
<210> 66
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 66
acgcgtagaa gacatccatc cgcgtgtacc taatccttat aatctgttat caggcctgc 59
<210> 67
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 67
acgcgtagaa gacatccatc cggaagtacc taatccttat aatctgttat caggcctgc 59
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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cgtctgcccc agggctttgc gaacagcccc acattgttcg atgaa 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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cgtctgcccc agggctttcg taacagcccc acattgttcg atgaa 45
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<212> DNA
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cgtctgcccc agggctttga aaacagcccc acattgttcg atgaa 45
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<212> DNA
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
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agaaggtcaa cgttggctga ctcgtgcgcg taaggagacc gtaatg 46
<210> 73
<211> 46
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 73
agaaggtcaa cgttggctga ctgatgcgcg taaggagacc gtaatg 46
<210> 74
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gaaggtcaac gttggctgac tgaagtgcgt aaggagaccg taatggggc 49
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<211> 45
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<210> 79
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 79
gcgtaaggag accgtaatgg gggaacctac gcctaagacg ccacg 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 80
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<210> 81
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 81
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 82
gagaccgtaa tggggcagcc tgaacctaag acgccacgcc agttg 45
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<212> DNA
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gtaatggggc agcctacgcc tgaaacgcca cgccagttgc gtgaa 45
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<220>
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<400> 91
gcctacgcct aagacgccag aacagttgcg tgaatttttg ggcacag 47
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cctaagacgc cacgccagtt ggaagaattt ttgggcacag cggga 45
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<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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gcacccctgt accccttaac acgtacaggg acgcttttca actgg 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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gcacccctgt accccttaac agaaacaggg acgcttttca actgg 45
<210> 98
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<210> 99
<211> 54
<212> DNA
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<223> Synthetic oligonucleotide
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gtttgataga gacaggtgta gacgttgcac gtaacgggat gatcaacggt gctt 54
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<223> Synthetic oligonucleotide
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gtttgataga gacaggtgta gacgttgctt ctaacgggat gatcaacggt gctt 54
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<211> 57
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ggggtactgt ttgatagaga caggtgtaga acgtgccttt aacgggatga tcaacgg 57
<210> 103
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 103
ggggtactgt ttgatagaga caggtgtaga ttctgccttt aacgggatga tcaacgg 57
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<211> 56
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ctcatggggt actgtttgat agagacagga cgagacgttg cctttaacgg gatgat 56
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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<213> Artificial Sequence
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cctcttgact catggggtac tgtttacgag agacaggtgt agacgttgcc ttta 54
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 112
cctcttgact catggggtac tgtttttcag agacaggtgt agacgttgcc ttta 54
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 113
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<210> 114
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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gcctcttgac tcatggggta ctgttcgata gagacaggtg tagacgttgc c 51
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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ctgtctctat caaacagtac cccatgagtc gtgaggcccg cctggg 46
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<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 119
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<210> 120
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 120
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 121
tggtccagca agcgctgaat atgtggttca atccccaggc gggcc 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 122
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 123
cccctggtcc agcaagcgac gaatatgtgg cttaatcccc aggcg 45
<210> 124
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 124
cccctggtcc agcaagcgtt caatatgtgg cttaatcccc aggcg 45
<210> 125
<211> 45
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 125
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 126
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 127
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 128
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<211> 48
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 129
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<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 130
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 131
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<210> 132
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 132
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 133
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<210> 135
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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aactggacga taatcgtttg tacctggacg tttcacgggc agaaggggg 49
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<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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aactggacga taatcgtttg tacctggttc tttcacgggc agaaggggg 49
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 138
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<210> 139
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 139
cgaagatctt gaactggacg ataatcgttt tcacctggct ttttcacggg c 51
<210> 140
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 140
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<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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cgcgaagatc ttgaactgga cgataatcac gtgtacctgg ctttttcacg gg 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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cgcgaagatc ttgaactgga cgataatctt ctgtacctgg ctttttcacg gg 52
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 144
cgcgaagatc ttgaactgga cgacgatcgt ttgtacctgg ctttttcacg 50
<210> 145
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 145
cgcgaagatc ttgaactgga cgttcatcgt ttgtacctgg ctttttcacg 50
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 146
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<210> 147
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 147
cctcgcgaag atcttgaact ggtttataat cgtttgtacc tggctttttc acg 53
<210> 148
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 148
cctcgcgaag atcttgaact ggttcataat cgtttgtacc tggctttttc acg 53
<210> 149
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 149
gtttgttgac ctcgcgaaga tcttgcgctg gacgataatc gtttgtacct ggc 53
<210> 150
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 150
gtttgttgac ctcgcgaaga tcttgacgtg gacgataatc gtttgtacct ggc 53
<210> 151
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 151
gtttgttgac ctcgcgaaga tcttgttctg gacgataatc gtttgtacct ggc 53
<210> 152
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 152
gtcggatgga tgtcttctac gcgcgcgttg acctcgcgaa gatcttgaac t 51
<210> 153
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 153
gtcggatgga tgtcttctac gcgacggttg acctcgcgaa gatcttgaac t 51
<210> 154
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 154
gtcggatgga tgtcttctac gcgttcgttg acctcgcgaa gatcttgaac t 51
<210> 155
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 155
ggattaggta cagtcggatg gatgtccgct acgcgtttgt tgacctcgc 49
<210> 156
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 156
ggattaggta cagtcggatg gatgtcacgt acgcgtttgt tgacctcgc 49
<210> 157
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 157
ggattaggta cagtcggatg gatgtcatct acgcgtttgt tgacctcgc 49
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<210> 159
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 159
gcaggcctga taacagatta taaggattag gtacacgcgg atggatgtct tctacgcgt 59
<210> 160
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 160
gcaggcctga taacagatta taaggattag gtacttccgg atggatgtct tctacgcgt 59
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<400> 162
ttcatcgaac aatgtggggc tgttacgaaa gccctggggc agacg 45
<210> 163
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 163
ttcatcgaac aatgtggggc tgttttcaaa gccctggggc agacg 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<210> 165
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 165
cattacggtc tccttacgcg cacgagtcag ccaacgttga ccttct 46
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 166
cattacggtc tccttacgcg catcagtcag ccaacgttga ccttct 46
<210> 167
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 167
gccccattac ggtctcctta cgcacttcag tcagccaacg ttgaccttc 49
<210> 168
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 168
gccccattac ggtctcctta cgacgttcag tcagccaacg ttgaccttc 49
<210> 169
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 169
gccccattac ggtctcctta cgttcttcag tcagccaacg ttgaccttc 49
<210> 170
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 170
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<210> 171
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 171
cgtggcgtct taggcgtagg acgccccatt acggtctcct tacgc 45
<210> 172
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 172
cgtggcgtct taggcgtagg ttcccccatt acggtctcct tacgc 45
<210> 173
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 173
caactggcgt ggcgtcttag gcgcaggctg ccccattacg gtctc 45
<210> 174
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 174
caactggcgt ggcgtcttag gacgaggctg ccccattacg gtctc 45
<210> 175
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 175
caactggcgt ggcgtcttag gttcaggctg ccccattacg gtctc 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 176
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<210> 177
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 177
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<210> 178
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 178
ttcacgcaac tggcgtggcg tttcaggcgt aggctgcccc attac 45
<210> 179
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 179
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 180
aaaattcacg caactggcgt ggacgcttag gcgtaggctg cccca 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 181
aaaattcacg caactggcgt ggttccttag gcgtaggctg cccca 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 182
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<210> 183
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 183
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<210> 184
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 184
ctgtgcccaa aaattcacgc aactgttctg gcgtcttagg cgtaggc 47
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 185
tcccgctgtg cccaaaaatt ccgccaactg gcgtggcgtc ttagg 45
<210> 186
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 186
tcccgctgtg cccaaaaatt ctttcaactg gcgtggcgtc ttagg 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 187
tcccgctgtg cccaaaaatt cttccaactg gcgtggcgtc ttagg 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 189
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 190
ccagttgaaa agcgtccctg tttctgttaa ggggtacagg ggtgc 45
<210> 191
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 191
taaaggcaac gtctacacct gtctctggca aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
<210> 192
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 192
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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taaaggcaac gtctacacct gtctctctga aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
<210> 194
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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cctcttgact catggggtac tgtttcagag agacaggtgt agacgttgcc ttta 54
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<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 195
taaaggcaac gtctacacct gtctctgtga aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
<210> 196
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 196
cctcttgact catggggtac tgtttcacag agacaggtgt agacgttgcc ttta 54
<210> 197
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 197
taaaggcaac gtctacacct gtctctccga aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
<210> 198
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 198
cctcttgact catggggtac tgtttcggag agacaggtgt agacgttgcc ttta 54
<210> 199
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 199
taaaggcaac gtctacacct gtctctatga aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
<210> 200
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 200
cctcttgact catggggtac tgtttcatag agacaggtgt agacgttgcc ttta 54
<210> 201
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 201
taaaggcaac gtctacacct gtctctagca aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
<210> 202
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 202
cctcttgact catggggtac tgtttgctag agacaggtgt agacgttgcc ttta 54
<210> 203
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 203
taaaggcaac gtctacacct gtctctacca aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
<210> 204
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 204
cctcttgact catggggtac tgtttggtag agacaggtgt agacgttgcc ttta 54
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<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 205
taaaggcaac gtctacacct gtctcttgca aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
<210> 206
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 206
cctcttgact catggggtac tgtttgcaag agacaggtgt agacgttgcc ttta 54
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<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 207
taaaggcaac gtctacacct gtctctttta aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
<210> 208
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 208
cctcttgact catggggtac tgtttaaaag agacaggtgt agacgttgcc ttta 54
<210> 209
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 209
taaaggcaac gtctacacct gtctcttata aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
<210> 210
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 210
cctcttgact catggggtac tgtttataag agacaggtgt agacgttgcc ttta 54
<210> 211
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 211
taaaggcaac gtctacacct gtctctcata aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
<210> 212
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 212
cctcttgact catggggtac tgtttatgag agacaggtgt agacgttgcc ttta 54
<210> 213
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 213
taaaggcaac gtctacacct gtctcttgga aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
<210> 214
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 214
cctcttgact catggggtac tgtttccaag agacaggtgt agacgttgcc ttta 54
<210> 215
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 215
taaaggcaac gtctacacct gtctctgata aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
<210> 216
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 216
cctcttgact catggggtac tgtttatcag agacaggtgt agacgttgcc ttta 54
<210> 217
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 217
taaaggcaac gtctacacct gtctctaaca aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
<210> 218
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 218
cctcttgact catggggtac tgtttgttag agacaggtgt agacgttgcc ttta 54
<210> 219
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 219
taaaggcaac gtctacacct gtctctcaga aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
<210> 220
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 220
cctcttgact catggggtac tgtttctgag agacaggtgt agacgttgcc ttta 54
<210> 221
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 221
taaaggcaac gtctacacct gtctctaaaa aacagtaccc catgagtcaa gagg 54
<210> 222
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 222
cctcttgact catggggtac tgttttttag agacaggtgt agacgttgcc ttta 54
<210> 223
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 223
ctgtctctat caaacagtac cccatgagtg gcgaggcccg cctggg 46
<210> 224
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 224
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<210> 225
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 225
ctgtctctat caaacagtac cccatgagtc tggaggcccg cctggg 46
<210> 226
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 226
cccaggcggg cctccagact catggggtac tgtttgatag agacag 46
<210> 227
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 227
ctgtctctat caaacagtac cccatgagta ttgaggcccg cctggg 46
<210> 228
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 228
cccaggcggg cctcaatact catggggtac tgtttgatag agacag 46
<210> 229
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 229
ctgtctctat caaacagtac cccatgagtg tggaggcccg cctggg 46
<210> 230
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 230
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<210> 231
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 231
ctgtctctat caaacagtac cccatgagtc cggaggcccg cctggg 46
<210> 232
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 232
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<210> 233
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 233
ctgtctctat caaacagtac cccatgagta tggaggcccg cctggg 46
<210> 234
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 234
cccaggcggg cctccatact catggggtac tgtttgatag agacag 46
<210> 235
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 235
ctgtctctat caaacagtac cccatgagta gcgaggcccg cctggg 46
<210> 236
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 236
cccaggcggg cctcgctact catggggtac tgtttgatag agacag 46
<210> 237
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 237
ctgtctctat caaacagtac cccatgagta ccgaggcccg cctggg 46
<210> 238
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 238
cccaggcggg cctcggtact catggggtac tgtttgatag agacag 46
<210> 239
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 239
ctgtctctat caaacagtac cccatgagtt gcgaggcccg cctggg 46
<210> 240
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 240
cccaggcggg cctcgcaact catggggtac tgtttgatag agacag 46
<210> 241
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 241
ctgtctctat caaacagtac cccatgagtt ttgaggcccg cctggg 46
<210> 242
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 242
cccaggcggg cctcaaaact catggggtac tgtttgatag agacag 46
<210> 243
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 243
ctgtctctat caaacagtac cccatgagtt atgaggcccg cctggg 46
<210> 244
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 244
cccaggcggg cctcataact catggggtac tgtttgatag agacag 46
<210> 245
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 245
ctgtctctat caaacagtac cccatgagtc atgaggcccg cctggg 46
<210> 246
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 246
cccaggcggg cctcatgact catggggtac tgtttgatag agacag 46
<210> 247
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 247
ctgtctctat caaacagtac cccatgagtt gggaggcccg cctggg 46
<210> 248
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 248
cccaggcggg cctcccaact catggggtac tgtttgatag agacag 46
<210> 249
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 249
ctgtctctat caaacagtac cccatgagtg atgaggcccg cctggg 46
<210> 250
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 250
cccaggcggg cctcatcact catggggtac tgtttgatag agacag 46
<210> 251
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 251
ctgtctctat caaacagtac cccatgagta acgaggcccg cctggg 46
<210> 252
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 252
cccaggcggg cctcgttact catggggtac tgtttgatag agacag 46
<210> 253
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 253
ctgtctctat caaacagtac cccatgagta aagaggcccg cctggg 46
<210> 254
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 254
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<212> DNA
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 325
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<212> DNA
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<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 326
cattacggtc tccttacgcg ccacagtcag ccaacgttga ccttct 46
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<400> 327
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<212> DNA
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<220>
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cattacggtc tccttacgcg ccggagtcag ccaacgttga ccttct 46
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<210> 333
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<400> 342
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ct 62
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gattaagcca catattcagc gcttggagga ccaggggatc ttggtcc 47
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gcgtagaaga catccatccg actcgtccta atccttataa tctgttatca ggc 53
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gcgtagaaga catccatccg actgagccta atccttataa tctgttatca ggc 53
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<211> 49
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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cacttcaccg tgacttagca gaccgtcgta tccaacaccc agacttaatt c 51
<210> 431
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 431
cacttcaccg tgacttagca gacgagcgta tccaacaccc agacttaatt c 51
<210> 432
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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ttcaccgtga cttagcagac ttcgcgatcc aacacccaga cttaattctg tta 53
<210> 433
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 433
ttcaccgtga cttagcagac ttcaaaatcc aacacccaga cttaattctg tta 53
<210> 434
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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ttcaccgtga cttagcagac ttcgagatcc aacacccaga cttaattctg tta 53
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<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 435
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<210> 436
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 436
ccgtgactta gcagacttcc gtcgtcaaca cccagactta attctgttac ag 52
<210> 437
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 437
ccgtgactta gcagacttcc gtgagcaaca cccagactta attctgttac ag 52
<210> 438
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 438
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<210> 439
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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gtgacttagc agacttccgt atccgtcacc cagacttaat tctgttacag tat 53
<210> 440
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tacgcctaag acgccacgcg agttgcgtga atttttgggc acagc 45
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<211> 49
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gcgtgaattt ttgggcacag cggagttctg tcgtttatgg attcctggg 49
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gggcacagcg ggattctgtg agttatggat tcctgggttc gctga 45
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<211> 53
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 464
tgctgaaaga aggtcaacgt tgggagactg aagcgcgtaa ggagacc 47
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 470
ctgcacccct gtacccctta gagaaaacag ggacgctttt caactgg 47
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 472
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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cccctgtacc ccttaacaaa aacagagacg cttttcaact gggggcc 47
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 474
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 475
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 476
ctgtacccct taacaaaaac aggggagctt ttcaactggg ggccagac 48
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<210> 478
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<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 480
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<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 481
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 482
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<210> 483
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<210> 492
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 500
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<210> 501
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<210> 502
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<210> 503
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 503
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<210> 504
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 504
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<210> 505
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 505
agcggaggct cgtggaaacg agatggcgga ccaagctgcc c 41
<210> 506
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 506
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<210> 507
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 507
gtggaaaccg tatggcggac cgtgctgccc gtaaggcggc 40
<210> 508
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 508
gtggaaaccg tatggcggac gaggctgccc gtaaggcggc 40
<210> 509
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 509
tatggcggac caagctgccg cgaaggcggc gatcacagag ac 42
<210> 510
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 510
tatggcggac caagctgcca aaaaggcggc gatcacagag ac 42
<210> 511
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 511
tatggcggac caagctgccg agaaggcggc gatcacagag ac 42
<210> 512
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 512
gcaagcgctg aatatgtggc ttaatcgcca ggcgggcctc ttgactc 47
<210> 513
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 513
gcaagcgctg aatatgtggc ttaatacgca ggcgggcctc ttgactc 47
<210> 514
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 514
gcaagcgctg aatatgtggc ttaatctcca ggcgggcctc ttgactc 47
<210> 515
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 515
ggtccagcaa gcgctgaata tgcgccttaa tccccaggcg ggcc 44
<210> 516
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 516
ggtccagcaa gcgctgaata tgacgcttaa tccccaggcg ggcc 44
<210> 517
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 517
ggtccagcaa gcgctgaata tgctccttaa tccccaggcg ggcc 44
<210> 518
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 518
ctggtccagc aagcgctgaa tcgctggctt aatccccagg cgg 43
<210> 519
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 519
ctggtccagc aagcgctgaa tacgtggctt aatccccagg cgg 43
<210> 520
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 520
ctggtccagc aagcgctgaa tctctggctt aatccccagg cgg 43
<210> 521
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<210> 522
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 522
ggaccaagat cccctggtca cgcaagcgct gaatatgtgg cttaatc 47
<210> 523
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 523
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<210> 524
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 524
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<210> 525
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 525
catgggacca agatcccctg acgcagcaag cgctgaatat gtggc 45
<210> 526
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 526
catgggacca agatcccctg ctccagcaag cgctgaatat gtggc 45
<210> 527
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 527
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<210> 528
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 528
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<210> 529
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 529
attataagga ttaggtacag tcggatgctc gtcttctacg cgtttgttga cct 53
<210> 530
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 530
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 531
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<210> 538
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 538
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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tggatacgga agtctgctaa gtcctcgtga agtgcttcat cgaacaatgt g 51
<210> 542
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 562
cccaacgcgg gtgcggtctc caaagcttgt ttgatctcct gatacg 46
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 564
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 565
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 566
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<210> 567
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 568
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 570
cccaggaatc cataaacgac agaaacgcgc tgtgcccaaa aattcacgc 49
<210> 571
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 571
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 574
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<210> 576
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 580
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 582
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 583
ggcttggtta aatccggaag accctccgcg ggtgcggtca acaaa 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 584
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 592
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<210> 593
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 595
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<210> 596
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 596
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<210> 597
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 597
atatccctgt ttttcatcaa cgaacagacg aaagggcttg gttaaatccg gaag 54
<210> 598
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 598
atatccctgt ttttcatcaa cgaacagatc aaagggcttg gttaaatccg gaag 54
<210> 599
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 599
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<210> 600
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 600
cttttgcata tccctgtttt tcatcaacac gcagctcaaa gggcttggtt aaatc 55
<210> 601
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 601
cttttgcata tccctgtttt tcatcaacct ccagctcaaa gggcttggtt aaatc 55
<210> 602
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<210> 603
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 603
ttactcaagt aagcaacagg gcgtttccac gggcctaact tttggg 46
<210> 604
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 604
ttactcaagt aagcaacagg gcgctcccac gggcctaact tttggg 46
<210> 605
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 606
tctacagcat gtggagccaa gatacgtaag ggttgaccca tcgtcaact 49
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<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 607
tctacagcat gtggagccaa gatctctaag ggttgaccca tcgtcaact 49
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 609
gaagcaaagt agctggattc aaagcacgaa ctggtccaaa ttgtacacga tcc 53
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<211> 53
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 610
gaagcaaagt agctggattc aaagcctcaa ctggtccaaa ttgtacacga tcc 53
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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gtctctgtga tcgccgcctt tttggcagct tggtccgcca ta 42
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gtctctgtga tcgccgcctt ctcggcagct tggtccgcca ta 42
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<223> Synthetic oligonucleotide
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atgactttaa atattgagga tgagcatcgt ttacatgaga catcaaaaga acccgacgtg 60
agcttagggt caacgtggct ttctgacttc ccccaggcgt gggcggagac tggcggaatg 120
gggttagctg tccgccaagc accgttgatc atcccgttaa aggcaacgtc tacacctgtc 180
tctatcaaac agtaccccat gagtcaagag gcccgcctgg ggattaagcc acatattcag 240
cgcttgctgg accaggggat cttggtccca tgtcaatctc cgtggaacac cccccttctg 300
cccgtgaaaa agccaggtac aaacgattat cgtccagttc aagatcttcg cgaggtcaac 360
aaacgcgtag aagacatcca tccgactgta cctaatcctt ataatctgtt atcaggcctg 420
cccccatcgc accaatggta tacagtatta gacttgaaag acgcgttctt ttgcctgcgt 480
ctgcacccaa cgtctcagcc gctgtttgcg ttcgaatggc gtgatcctga aatgggaatt 540
tcgggtcagt taacctggac tcgtctgccc cagggcttta aaaacagccc cacattgttc 600
gatgaagcac ttcaccgtga cttagcagac ttccgtatcc aacacccaga cttaattctg 660
ttacagtatg ttgacgacct tttgttggcg gcaacgtctg aacttgactg tcagcaaggc 720
acacgcgcgt tattacaaac gttaggtaac ttaggatatc gtgcgtccgc gaaaaaggcg 780
caaatttgtc aaaaacaggt aaagtacctt gggtatttgc tgaaagaagg tcaacgttgg 840
ctgactgaag cgcgtaagga gaccgtaatg gggcagccta cgcctaagac gccacgccag 900
ttgcgtgaat ttttgggcac agcgggattc tgtcgtttat ggattcctgg gttcgctgaa 960
atggctgcac ccctgtaccc cttaacaaaa acagggacgc ttttcaactg ggggccagac 1020
cagcaaaagg cgtatcagga gatcaaacaa gctttgttga ccgcacccgc gttgggtctt 1080
ccggatttaa ccaagccctt tgagctgttc gttgatgaaa aacagggata tgcaaaagga 1140
gtattaaccc aaaagttagg cccgtggcgt cgccctgttg cttacttgag taaaaaattg 1200
gatcctgtcg cagcaggatg gccaccgtgc ttgcgtatgg tcgcggcaat tgccgttttg 1260
acaaaggatg caggtaagtt gacgatgggt caacccttag taatcttggc tccacatgct 1320
gtagaagcgt tagtaaagca gcccccagac cgctggcttt ctaatgcgcg catgacccac 1380
tatcaggcgc ttctgcttga tacggatcgt gtacaatttg gaccagttgt agctttgaat 1440
ccagctactt tgcttcccct tccagaagaa ggacttcagc acaattgttt agatattctg 1500
gccgaggcac atgggacgcg ccctgatttg acggatcagc cactgcctga tgccgaccat 1560
acatggtata ctggcggcag tagtcttctt caagaggggc aacgcaaggc gggagcagcc 1620
gtcactacgg agaccgaagt tatctgggcc aaagcgttac ccgcgggaac atccgcgcaa 1680
cgtgcacagt taatcgctct gacacaggcc ctgaagatgg cagagggcaa aaagttgaat 1740
gtctacacca actcacgtta tgcttttgca acagcgcata tccatggcga aatttaccgc 1800
cgccgtggtc tgctgactag tgagggtaag gaaattaaaa ataaagatga gattcttgcg 1860
ttgttaaaag ctttattctt accaaaacgc ctttcgatca ttcattgccc ggggcatcaa 1920
aagggtcact cagcggaggc tcgtggaaac cgtatggcgg accaagctgc ccgtaaggcg 1980
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agcgagcatt tttaa 2055
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Leu Val Ile Leu Ala Pro His Ala Val Glu Ala Leu Val Lys Gln Pro
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<220>
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Claims (16)
- 서열 번호 637의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV: Moloney murine leukemia virus) 역전사효소(RTase) 돌연변이체로서, MMLV RTase 돌연변이체의 아미노산 서열은
(a) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환(I61R);
(b) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(Q68R);
(c) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(Q79R);
(d) 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환(L99R);
(e) 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(E282D);
(f) 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(R298A);
(g) 위치 299에서 글루타민의 글루타민산으로의 치환(Q299E);
(h) 위치 332에서 트레오닌의 글루탐산으로의 치환(T332E);
(i) 위치 433에서 발린의 아르기닌으로의 치환(V433R); 및/또는
(j) 위치 593에서 이소류신의 글루탐산으로의 치환(I593E)
인 적어도 하나의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 것인 단리된 MMLV RTase 돌연변이체. - 제1항에 있어서, MMLV RTase 돌연변이체는 서열 번호 637-699 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 MMLV RTase 돌연변이체.
- 제2항에 있어서, MMLV RTase 돌연변이체는 서열 번호 674에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 MMLV RTase 돌연변이체.
- 서열 번호 637의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소(RTase) 돌연변이체로서, MMLV RTase 돌연변이체의 아미노산 서열은
(a) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(I61R/E282D);
(b) 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(L99R/E282D);
(c) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q68R/E282D);
(d) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환(Q79R/E282D);
(e) 위치 282에서 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환 및 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(E282D/R298A);
(f) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환(I61R/L99R);
(g) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(I61R/Q68R);
(h) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(I61R/Q79R);
(i) 위치 61에서 이소류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(I61R/R298A);
(j) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환(Q68R/L99R);
(k) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환(Q79R/L99R);
(l) 위치 99에서 류신의 아르기닌으로의 치환 및 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(L99R/R298A);
(m) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환(Q68R/Q79R);
(n) 위치 68에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(Q68R/R298A); 또는
(o) 위치 79에서 글루타민의 아르기닌으로의 치환 및 위치 298에서 아르기닌의 알라닌으로의 치환(Q79R/R298A)
인 적어도 2개의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 것인 단리된 MMLV RTase 돌연변이체. - 제4항에 있어서, MMLV RTase 돌연변이체는 서열 번호 637-699 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 MMLV RTase 돌연변이체.
- 제1항 또는 제4항에 있어서, MMLV RTase 돌연변이체는 RNase H 활성이 결여된 것인 MMLV RTase 돌연변이체.
- 제1항 또는 제4항에 있어서, MMLV RTase 돌연변이체는 하기 특징 중 적어도 하나를 갖는 것인 MMLV RTase 돌연변이체: 향상된 DNA 합성, 증가된 충실도, 또는 향상된 열안정성.
- 제1항 또는 제4항의 MMLV RTase 돌연변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
- 제1항 또는 제4항의 단리된 MMLV RTase 돌연변이체를 포함하는 조성물.
- 제9항에 있어서, 단리된 MMLV RTase 돌연변이체는 RNase H 활성이 결여된 것인 조성물.
- 제9항에 있어서, 단리된 MMLV RTase 돌연변이체는 하기 특징 중 적어도 하나를 갖는 것인 조성물: 향상된 DNA 합성, 증가된 충실도, 또는 향상된 열안정성.
- 제1항 또는 제4항의 단리된 MMLV RTase 돌연변이체를 포함하는 키트.
- 제12항에 있어서, 단리된 MMLV RTase 돌연변이체는 RNAse H 활성이 결여된 것인 키트.
- 제12항에 있어서, 단리된 MMLV RTase 돌연변이체는 다음의 특징 중 적어도 하나를 갖는 것인 키트: 향상된 DNA 합성, 증가된 충실도, 또는 향상된 열안정성.
- 상보적 데옥시리보핵산(cDNA)을 합성하는 방법으로서,
(a) 제1항 또는 제4항의 단리된 MMLV RTase 돌연변이체를 제공하는 단계; 및
(b) 단리된 MMLV RTase 돌연변이체를 핵산 주형과 접촉시켜 cDNA 합성을 허용하는 단계
를 포함하는, 상보적 데옥시리보핵산(cDNA)을 합성하는 방법. - 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하는 방법으로서,
(a) 제1항 또는 제4항의 단리된 MMLV RTase 돌연변이체를 제공하는 단계; 및
(b) 단리된 MMLV RTase 돌연변이체를 핵산 주형과 접촉시켜 핵산 주형을 복제 및 증폭하는 단계
를 포함하는, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하는 방법.
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