JP5383189B2 - Rna依存性rnaポリメラーゼ、rnaを増幅するため及び/又は標識するための方法並びにキット - Google Patents
Rna依存性rnaポリメラーゼ、rnaを増幅するため及び/又は標識するための方法並びにキット Download PDFInfo
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Description
1.いわゆる転写酵素であるRNA依存性DNAポリメラーゼを介して、コピーDNA(cDNA)へとRNAを転写する工程。この工程ではプライマーが必要となる。プライマーは、増幅されるべき配列に特異的であるオリゴヌクレオチドである。プライマー及びRNA依存性DNAポリメラーゼは、DNAの形態ではあるが、遺伝物質の標的増幅を可能にする;
2.ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を介して前記cDNAを増幅する工程;
3.前記PCR生成物を精製する工程;
4.前記PCR生成物の配列を決定する工程;
が続く。
Chu et al. (1986), Nucleic Acids Research 14, 5591−5603 Lizardi et al. (1988), Biotechnology 6, 1187−1202
a.XXDYS
b.GXPSG
c.YGDD
d.XXYGL
e.XXXXFLXRXX
[ここで、これらは以下の意味:
D:アスパラギン酸
Y:チロシン
S:セリン
G:グリシン
P:プロリン
L:ロイシン
F:フェニルアラニン
R:アルギニン
X:任意のアミノ酸
を有する]
を含む、RNA依存性RNAポリメラーゼにより提供される。
− Mg2+又はMn2+依存性RNA依存性RNAポリメラーゼ活性(DNA非依存性である);
− 鋳型依存性;
− 鋳型としてホモポリマーRNA(それぞれ、ポリ(A)−RNA、ポリ(C)−RNA、ポリ(G)−RNA、又はポリ(U)−RNA)を用いた、対応するプライマー(すなわち、それぞれ、オリゴ(U)−RNA、オリゴ(G)−RNA、オリゴ(C)−RNA、又はオリゴ(A)−RNA)の存在下でのプライマー依存性RNA合成;
− 鋳型としてポリ(C)−RNAを用いた、高GTP濃度の存在下でのプライマー非依存性RNA合成;
− 鋳型としてヘテロポリマーRNAを用いたプライマー依存性又はプライマー非依存性RNA合成;
− 一本鎖RNA鋳型の3’端の標識を導く、UTP及びCTPについて優先性を有する末端トランスフェラーゼ活性、
を有する。
配列番号2は、サポウイルス−RdRPのアミノ酸配列である。
配列番号3は、ベシウイルス−RdRPのアミノ酸配列である。
配列番号5は、ヒスチジンマーカー(Hisタグ)を有するサポウイルス−RdRPのアミノ酸配列である。
配列番号6は、ヒスチジンマーカー(Hisタグ)を有するベシウイルス−RdRPのアミノ酸配列である。
a.オリゴヌクレオチドプライマー、例えばオリゴ−RNA−プライマー又はオリゴ−DNA−プライマーなどの存在又は不在下、RNA依存性RNAポリメラーゼをRNA鋳型と、それぞれ付着(attachment)又はアニーリングする工程;
b.前記RNA依存性RNAポリメラーゼにより、前記RNA鋳型をアンチセンスRNAへと転写する工程;
c.前記RNA/アンチセンスRNA二本鎖を一本鎖RNAへと分離する工程、
を含む、本発明のRNA依存性RNAポリメラーゼを用いたRNA増幅方法であり、かつ
a.本発明のRNA依存性RNAポリメラーゼ、
b.適した反応バッファー、
c.NTP、
d.任意選択でRNase阻害剤、
e.任意選択で反応停止液(stop solution)、
を含む、RNA増幅方法を実施するためのキットである。
a.150μmol/Lの組み換え的に生成された、配列番号1若しくは配列番号4によるノロウイルス−RdRP、及び/又は配列番号2若しくは配列番号5によるサポウイルス−RdRP、及び/又は配列番号3若しくは配列番号6によるベシウイルス−RdRP、
b.バッファーとして:50 mmol/LのHEPES、pH 8.0、3 mmol/Lの酢酸マグネシウム又は塩化マンガン(MnCl2)、4 mMのDTT、
c.10 mmol/LのATP、10 mmol/LのCTP、10 mmol/LのGTP、10 mmol/LのUTP、
d.RNase阻害剤、
e.反応停止液として:4 mol/Lの酢酸アンモニウム、100 mmol/LのEDTA、
を含む。
a.本発明のRNA依存性RNAポリメラーゼ、
b.適した反応バッファー、
c.NTP、
d.任意選択でRNase阻害剤、
e.任意選択で反応停止液、
f.プライマー、
を含むキットである。
a.150μmol/Lの組み換え的に生成された、配列番号1若しくは配列番号4によるノロウイルス−RdRP、及び/又は配列番号2若しくは配列番号5によるサポウイルス−RdRP、及び/又は配列番号3若しくは配列番号6によるベシウイルス−RdRP、
b.バッファーとして:50 mmol/LのHEPES、pH 8.0、3 mmol/Lの酢酸マグネシウム又は塩化マンガン(MnCl2)、4 mMのDTT、
c.10 mmol/LのATP、10 mmol/LのCTP、10 mmol/LのGTP、10 mmol/LのUTP、
d.RNase阻害剤、
e.反応停止液として:4 mol/Lの酢酸アンモニウム、100 mmol/LのEDTA、
f.0.1〜3μMのプライマー(15〜20塩基長を有する、ホモポリマー若しくはヘテロポリマーRNA−又はDNA−オリゴヌクレオチド)、
を含む。
a.本発明のRNA依存性RNAポリメラーゼ、
b.適した反応バッファー、
c.NTP、
d.任意選択でRNase阻害剤、
e.任意選択で反応停止液、
を含む、プライマー非依存性RNA増幅用キットである。
1.T7プロモータープライマーを用いたPCRにより、2つの相補的二本鎖DNAを合成し;
2.T7ポリメラーゼの助けを借りたDNAの転写後、得られた相補的RNA鎖の両方をハイブリダイズし;
3.ついで、両方の鎖をRNAse Iにより消化する。
a.標識されるべきRNAへとRNA依存性RNAポリメラーゼをアニーリングする工程;
b.標識されるべきRNAの3’端に少なくとも1つのヌクレオチドを添加する工程;
を含む方法であり、かつ本発明のRNA標識方法を実施するためのキットであって、
a.本発明のRNA依存性RNAポリメラーゼ、
b.適した反応バッファー、
c.CTP又はUTP又はATP又はGTP、
d.任意選択でRNase阻害剤、
e.任意選択で反応停止液、
を含む、キットである。
g.150μmol/Lの組み換え的に生成された、配列番号1若しくは配列番号4によるノロウイルス−RdRP、及び/又は配列番号2若しくは配列番号5によるサポウイルス−RdRP、及び/又は配列番号3若しくは配列番号6によるベシウイルス−RdRP、
h.バッファーとして:50 mmol/LのHEPES、pH 8.0、3 mmol/Lの酢酸マグネシウム又は塩化マンガン(MnCl2)、4 mMのDTT、
i.10 mmol/LのATP、10 mmol/LのCTP、10 mmol/LのGTP、10 mmol/LのUTP、
j.RNase阻害剤、
k.反応停止液として:4 mol/Lの酢酸アンモニウム、100 mmol/LのEDTA、
を含む。
[実施例1:組み換えノロウイルスRdRPの生成方法]
ノロウイルスRdRPのcDNAは、ノロウイルスクローンpUS−NorII(GenBankアクセッション番号:AY741811)からのPCRにより得た。これをpET−28b(+)ベクター(Novagen)にクローニングし、発現ベクターを配列決定して、E. coli CL21(DE3)pLysSに形質転換した。カナマイシン(50 mg/L)を含むLuria−Bertani媒体中、細胞を37℃で培養した。タンパク質発現は、最終濃度1 mMでイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加することにより、0.6の光学密度(OD600)で誘起した。ついで、培養物を25℃で一晩インキュベートした。250 mLの培養物から得た細胞ペレットを、4 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)及び1%のTriton X 100(sigma)で1回洗浄した。細胞をDNase(10 U/mL)で37℃、15分間処理し、氷上で超音波処理し、40 mLの結合バッファー(20 mMのTris/HCl、pH 7.9、500 mMのNaCl、5 mMのイミダゾール)中に再懸濁した。清澄な溶解物(cleared lysate)を、4300 rpm、4℃、40分間の遠心分離により得た。His6タグを備えるノロウイルスRdRPを、結合バッファーで前平衡化(preequilibrate)しておいたNi−ニトリロトリ酢酸(NTA)セファロースマトリックス(Novagen)と結合させた。結合タンパク質を、60 mMのイミダゾールを含む結合バッファーで洗浄し、1 Mのイミダゾールを含む結合バッファーで溶出した。溶出タンパク質を、バッファーA(25 mMのTris−HCl、pH 8.0、1 mMのβ−メルカプトエタノール、100 mMのNaCl、5 mMのMgCl2、10%のグリセリン、0.1%のTriton X)に対して透析した。タンパク質濃度は、Biuret反応に基づくBCAプロテインアッセイキット(Pierce)を用いて測定した。酵素は、50%グリセリン中、最終体積で再懸濁し、−20℃で貯蔵した。
反応混合物(50μL)は、0.5〜1μgのRNA鋳型、10μLの反応バッファー(250 mMのHEPES、pH 8.0、15 mMの酢酸マグネシウム、20 mMのDTT)、50 UのRNase阻害剤(RNAsin、Promega)、0.4 mMの各ATP、CTP、GTP、UTP、実施例1で調製した3μMのノロウイルス−RdRPからなる。反応は30℃で2時間実施する。50μLの反応停止液(4 Mの酢酸アンモニウム、100 mMのEDTA)を添加することにより反応を止める。精製は、フェノール/クロロホルム抽出によるか、又は製造者の指示に従ってMEGAclearキット(Ambion)を用いることにより実施する。転写生成物は、エチジウムブロマイド染色後、TBE−バッファーアガロースゲル上でのUVトランスイルミネーションを介して可視化される。ホルムアミドアガロースゲルを同様に用いてもよい。
反応混合物(50μL)は、0.5〜1μgのRNA鋳型、10μLの反応バッファー(250 mMのHEPES、pH 8.0、15 mMの酢酸マグネシウム、20 mMのDTT)、50 UのRNase阻害剤(RNAsin、Promega)、0.4 mMの各ATP、CTP、GTP、UTP、0.1〜1μMの遺伝子特異的RNAプライマー、実施例1で調製した3μMのノロウイルス−RdRPからなる。反応は30℃で2時間実施する。50μLの反応停止液(4 Mの酢酸アンモニウム、100 mMのEDTA)を添加することにより反応を止める。精製は、フェノール/クロロホルム抽出によるか、又は製造者の指示に従ってMEGAclearキット(Ambion)を用いることにより実施する。転写生成物は、エチジウムブロマイド染色後、TBE−バッファーアガロースゲル上でのUVトランスイルミネーションにより可視化される。ホルムアルデヒドアガロースゲル、又は尿素/ポリアクリルアミドゲルを用いてもよい。
反応混合物(50μL)は、0.5〜1μgのRNA鋳型、10μLの反応バッファー(250 mMのHEPES、pH 8.0、15 mMの酢酸マグネシウム、20 mMのDTT)、50 UのRNase阻害剤(RNAsin、Promega)、0.4 mMの各ATP、CTP、GTP、UTP、0.1〜1μMのポリ(U)20−プライマー、実施例1で調製した3μMのノロウイルス−RdRPからなる。反応は30℃で2時間実施する。50μLの反応停止液(4 Mの酢酸アンモニウム、100 mMのEDTA)を添加することにより反応を止める。精製は、フェノール/クロロホルム抽出によるか、又は製造者の指示に従ってMEGAclearキット(Ambion)を用いることにより実施する。転写生成物は、エチジウムブロマイド染色後、TBE−バッファーアガロースゲル上でのUVトランスイルミネーションにより可視化される。ホルムアルデヒドアガロースゲルを用いてもよい。
反応混合物(50μL)は、0.5〜1μgのRNA鋳型、10μLの反応バッファー(250 mMのHEPES、pH 8.0、15 mMの酢酸マグネシウム、20 mMのDTT)、50 UのRNase阻害剤(RNAsin、Promega)、0.4 mMの各ATP、CTP、GTP、UTP、実施例1で調製した3μMのノロウイルス−RdRPからなる。反応は30℃で2時間実施する。50μLの反応停止液(4 Mの酢酸アンモニウム、100 mMのEDTA)を添加することにより反応を止める。精製は、フェノール/クロロホルム抽出によるか、又は製造者の指示に従ってMEGAclearキット(Ambion)を用いることにより実施する。転写生成物は、エチジウムブロマイド染色後、TBE−バッファー10%ポリアクリルアミドゲル上でのUVトランスイルミネーションにより可視化される。ホルムアルデヒドアガロースゲルを用いてもよい。別法として、armored−RNAを用いてもよい。
反応混合物(50μL)は、0.5〜1μgのRNA鋳型、10μLの反応バッファー(250 mMのHEPES、pH 8.0、15 mMの酢酸マグネシウム、20 mMのDTT)、50 UのRNase阻害剤(RNAsin、Promega)、0.4 mMのATP又はCTP又はGTP又はUTP、実施例1で調製した3μMのノロウイルス−RdRPからなる。反応は30℃で2時間実施する。50μLの反応停止液(4 Mの酢酸アンモニウム、100 mMのEDTA)を添加することにより反応を止める。精製は、フェノール/クロロホルム抽出によるか、又は製造者の指示に従ってMEGAclearキット(Ambion)を用いることにより実施する。転写生成物は、エチジウムブロマイド染色後、TBE−バッファー10%ポリアクリルアミドゲル上でのUVトランスイルミネーションにより可視化される。ホルムアルデヒドアガロースゲルを用いてもよい。別法として、armored−RNAを用いてもよい。
反応混合物(50μL)は、0.5〜1μgのRNA鋳型、10μLの反応バッファー(250 mMのHEPES、pH 8.0、15 mMの酢酸マグネシウム、20 mMのDTT)、50 UのRNase阻害剤(RNAsin、Promega)、50μMのGTP、及び実施例1で調製した3μMのノロウイルス−RdRPからなる。反応は30℃で2時間実施する。50μLの反応停止液(4 Mの酢酸アンモニウム、100 mMのEDTA)を添加することにより反応を止める。精製は、フェノール/クロロホルム抽出によるか、又は製造者の指示に従ってMEGAclearキット(Ambion)を用いることにより実施する。転写生成物は、エチジウムブロマイド染色後、TBE−バッファー10%ポリアクリルアミドゲル上でのUVトランスイルミネーションにより可視化される。ホルムアルデヒドアガロースゲルを用いてもよい。別法として、armored−RNAを用いてもよい。
Claims (16)
- RNA依存性RNAポリメラーゼを用いたRNA増幅方法であって、以下の工程:
a.オリゴヌクレオチドプライマーの存在又は不在下、前記RNA依存性RNAポリメラーゼをRNA鋳型とアニーリングする工程;
b.前記RNA依存性RNAポリメラーゼにより、前記RNA鋳型をアンチセンス−RNAへと転写する工程;
c.前記RNA/アンチセンス−RNA二本鎖を個別の鎖へと分離する工程;
d.工程aからcを繰り返す工程
を含み、
前記RNA依存性RNAポリメラーゼが、「右手立体構造」を有しており、前記RNA依存性RNAポリメラーゼのアミノ酸配列が、以下の配列モチーフ:
a.XXDYS
b.GXPSG
c.YGDD
d.XXYGL
e.XXXXFLXRXX
[ここで、これらは以下の意味:
D:アスパラギン酸
Y:チロシン
S:セリン
G:グリシン
P:プロリン
L:ロイシン
F:フェニルアラニン
R:アルギニン
X:任意のアミノ酸
を有する]
を含むことを特徴とする、RNA増幅方法。 - 前記RNA依存性RNAポリメラーゼが、カリシウイルス科(Caliciviridae科)のウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼであることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記RNA依存性RNAポリメラーゼが、ノロウイルス、サポウイルス、ベシウイルス、又はラゴウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼであることを特徴とする、請求項2記載の方法。
- 前記RNA依存性RNAポリメラーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、又は配列番号6に従ったタンパク質であることを特徴とする、請求項3記載の方法。
- 前記RNA/アンチセンス−RNA二本鎖を個別の鎖へと分離する工程が、熱変性により、化学変性により、及び/又は酵素的に起こることを特徴とする、請求項1乃至4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RNA/アンチセンス−RNA二本鎖を個別のRNA鎖へと酵素的に分離する工程が、二本鎖RNAを一本鎖RNAへと分離できる酵素により実施されることを特徴とする、請求項5記載の方法。
- 前記酵素がヘリカーゼであることを特徴とする、請求項6記載の方法。
- 前記RNA鋳型の一部とハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを工程aで使用し、前記プライマーが、前記RNA依存性RNAポリメラーゼのアニーリング後に、前記RNA鋳型の配列に従って前記RNA依存性RNAポリメラーゼにより伸長されることを特徴とする、請求項1乃至7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーがヘテロポリマー若しくはホモポリマーRNAプライマー又はDNAプライマーであることを特徴とする、請求項8記載の方法。
- 前記ホモポリマープライマーがポリ−U−RNAであり、前記RNA鋳型が全部の細胞RNAであって、全部の細胞mRNAの特異的な増幅が達成されることを特徴とする、請求項9記載の方法。
- 前記プライマーがウイルスRNAの特異的部分と特異的にハイブリダイズするヘテロポリマープライマーであり、前記RNA鋳型が、患者材料から回収された全細胞RNAであることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記患者材料が、羊水、血液、血漿、および体液からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
- 前記RNA鋳型がポリシチジル化されており、工程aがオリゴヌクレオチドプライマーの不在下であるが、単一ヌクレオチドとしてGTPの存在下で実施され、前記RNA鋳型の配列に従って前記RNA依存性RNAポリメラーゼにより伸長されることを特徴とする、請求項1乃至7のいずれか一項記載の方法。
- in vitroでのsiRNAの生産のための、請求項1乃至7のいずれか一項に記載の方法。
- a.請求項1乃至4のいずれか一項で定義されたとおりのRNA依存性RNAポリメラーゼ;
b.適した反応バッファー;
c.NTP;
d.二本鎖RNAを一本鎖RNAへと分離できる酵素;
e.任意選択でプライマー;
f.任意選択でRNase阻害剤;
g.任意選択で反応停止液、
を含む、RNA増幅用キット。 - 前記二本鎖RNAを一本鎖RNAへと分離できる酵素がヘリカーゼである、請求項15に記載のキット
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