KR20230069150A - Sh3yl1 항체, 이를 포함하는 조성물, 및 벡터 및 이의 용도 - Google Patents

Sh3yl1 항체, 이를 포함하는 조성물, 및 벡터 및 이의 용도 Download PDF

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KR20230069150A
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antibody
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안은정
유정연
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Abstract

본 개시내용은 SH3YL1 단클론 항체 및 SH3YL1 단클론 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 SH3YL1 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, SH3YL1 항체를 투여함을 포함하여, 면역 반응을 조절하는 방법, 당뇨병성 신증을 치료하는 방법, 및 비알콜성 지방증 간염을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 또한, SH3YL1 항체를 투여함을 포함하여, 급성 신장 손상을 치료하는 방법 및 염증성 장 질환을 치료하는 방법이 개시되어 있다.

Description

SH3YL1 항체, 이를 포함하는 조성물, 및 벡터 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 9월 14일에 출원된 미국 출원 제63/078,274호의 출원일의 이익을 주장하며, 이의 개시내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일(명칭: 2713-0001WO01 Sequence_Listing_ST25.txt; 크기: 59 KB; 및 작성일: 2021년 9월 13일)의 전자적으로 제출된 서열 목록의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 개시내용은 SH3YL1 단클론 항체 및 SH3YL1 단클론 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 SH3YL1 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, SH3YL1 항체를 투여함을 포함하여 면역 반응을 조절하는 방법, 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy)을 치료하는 방법, 및 비알콜성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis)을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 또한, SH3YL1 항체를 투여함을 포함하여 급성 신장 손상을 치료하는 방법 및 염증성 장 질환을 치료하는 방법이 개시되어 있다.
SH3YL1은 피부 각질형성세포로부터 처음 확인되었으며 모발 주기를 조절한다(J Invest Dermatol. 2000, 114, 1050-1056). 단백질은 두 개의 기능적 도메인으로 나뉜다. COOH-말단 영역은 PDGF에 반응하여 원형 등쪽 주름(circular dorsal ruffle)에서 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리포스페이트(PI(3,4,5)P3) 및 포스파티딜이노시톨 3,4,5-비스포스페이트(PI(3,4)P2)와 상호작용하는 SYLF(SH3YL1, Ysc84p/Lsb4p, Lsb3p, 및 식물 FYVE 단백질) 도메인을 함유하고, NH3-말단 영역은 프롤린 풍부 영역(PRR)과 상호작용하는 Src 상동성 3(SH3) 도메인을 갖는다(J Cell Biol. 2011, 193, 901-916; Biochem Soc Trans. 2015, 43, 111-116). 또한, SH3YL1은 Rac1 활성화를 통한 세포 이동을 자극하는 Rac GEF Dock4 단백질과 상호작용하는 것으로 나타났다(Cell Signal. 2014, 26, 1082-1088).
톨-유사 수용체(TLR)는 박테리아, 바이러스 및 곰팡이를 포함한 미생물의 병원체-관련 분자 패턴(PAMP)을 인식한다. 선천 면역은 침입하는 미생물을 사멸할 뿐만 아니라 패혈증 및 이의 관련 장기 부전으로 이어지는 급성 세포 반응을 유발한다(Alobaidi 외., 2015; Gluba 외., 2010; Kawai and Akira, 2011; Takeuchi and Akira, 2010).
본원에는 다음을 포함하는 단클론 항체가 개시되어 있다:
(a) 아미노산 서열 NYAMS (서열 번호 13)을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1),
아미노산 서열 VISSDNSSTYYADSVKG (서열 번호 14)을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
아미노산 서열 VWRHFDY (서열 번호 15)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(b) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNNVN (서열 번호 16)을 포함하는 경쇄 CDR1,
아미노산 서열 ADSHRPS (서열 번호 17)을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
아미노산 서열 ASWDSSLSGYV (서열 번호 18)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) 아미노산 서열 NYYMS (서열 번호 19)를 포함하는 중쇄 CDR1,
아미노산 서열 AISHNNSNTYYADSVKG (서열 번호 20)을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
아미노산 서열 KFSFFDY (서열 번호 21)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
(d) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVS (서열 번호 22)을 포함하는 경쇄 CDR1,
아미노산 서열 ANSHRPS (서열 번호 23)을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
아미노산 서열 GAWDSSLNGYV (서열 번호 24)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일부 실시양태에서, 항체는 다음을 포함한다:
(a) 아미노산 서열 NYAMS (서열 번호 13)을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1),
아미노산 서열 VISSDNSSTYYADSVKG (서열 번호 14)을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
아미노산 서열 VWRHFDY (서열 번호 15)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(b) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNNVN (서열 번호 16)을 포함하는 경쇄 CDR1,
아미노산 서열 ADSHRPS (서열 번호 17)을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
아미노산 서열 ASWDSSLSGYV (서열 번호 18)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(c) 아미노산 서열 NYYMS (서열 번호 19)을 포함하는 중쇄 CDR1,
아미노산 서열 AISHNNSNTYYADSVKG (서열 번호 20)을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
아미노산 서열 KFSFFDY (서열 번호 21)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(d) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVS (서열 번호 22)을 포함하는 경쇄 CDR1,
아미노산 서열 ANSHRPS (서열 번호 23)을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
아미노산 서열 GAWDSSLNGYV (서열 번호 24)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또한 본원에는 다음을 포함하는 단클론 항체가 개시되어 있다:
(a) 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1),
서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(b) 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(d) 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(e) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(f) 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(g) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(h) 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(i) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(j) 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(k) 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(l) 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(m) 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
(n) 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일부 실시양태에서, 단클론 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1),
서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(e) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(f) 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(g) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(h) 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(i) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(j) 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(k) 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(l) 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(m) 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(n) 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1 또는 5의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 31, 35, 39, 43, 47, 51, 또는 55의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 3 또는 7의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 33, 37, 41, 45, 49, 53, 또는 57의 아미노산 서열을 포함한다.
항체는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 인간 면역글로불린 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 경쇄 불변 영역은 인간 면역글로불린 IgGκ및 IgGλ로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 경쇄 불변 영역은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 불변 영역은 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함한다.
항체는 인간 항체일 수 있다. 항체는 단일 쇄 항체(scFv), Fab, 또는 dsFV일 수 있다.
본원에는 본원에 개시된 항체와 동일한 인간 SH3 도메인-함유 YSC84-유사 1(SH3YL1)의 에피토프에 결합하는 단클론 항체가 개시되어 있다.
본원에는 아미노산 서열 DSHFDWWE (서열 번호 25)를 포함하는 에피토프에서 인간 SH3 도메인-함유 YSC84-유사 1(SH3YL1)에 특이적으로 결합하는 단클론 항체가 개시되어 있다.
또한 본원에는 아미노산 서열 LYEILDSF (서열 번호 26)를 포함하는 에피토프에서 인간 SH3 도메인-함유 YSC84-유사 1(SH3YL1)에 특이적으로 결합하는 단클론 항체가 개시되어 있다.
또한 서열 번호 98, 99, 100, 또는 60의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에서 인간 SH3 도메인-함유 YSC84-유사 1(SH3YL1)에 특이적으로 결합하는 단클론 항체가 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 검출 가능한 표지를 추가로 포함할 수 있다.
본원에는 본원에 개시된 항체의 중쇄 가변 영역 또는 중쇄를 암호화하는 단리된 핵산 분자가 개시되어 있다. 본원에는 본원에 개시된 항체의 경쇄 가변 영역 또는 경쇄를 암호화하는 단리된 핵산 분자가 개시되어 있다. 본원에는 본원에 개시된 항체의 중쇄 가변 영역 또는 중쇄 및 본원에 개시된 항체의 경쇄 가변 영역 또는 경쇄를 암호화하는 단리된 핵산 분자가 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 1 또는 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 암호화한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 3 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 암호화한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 31, 35, 39, 43, 47, 51, 또는 55의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 암호화한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 33, 37, 41, 45, 49, 53, 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 암호화한다.
또한 본원에는 본원에 개시된 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 단리된 벡터가 개시되어 있다.
또한 본원에는 본원에 개시된 핵산 분자, 본원에 개시된 벡터 중 하나 이상을 포함하는 숙주 세포가 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 효모, CHO, YB/20, NS0, PER-C6, HEK-293T, NIH-3T3, HeLa, BHK, Hep G2, SP2/0, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 및 조직 배양물 중 인간 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본원에는 핵산 분자가 발현되고 항체가 생성되도록 본원에 개시된 숙주 세포를 배양함을 포함하여, 인간 SH3YL1에 결합하는 단클론 항체를 생산하는 방법이 개시되어 있다.
본원에는 인간 SH3YL1에 특이적으로 결합하고 본원에 개시된 단리된 핵산 분자 중 하나 이상에 의해 암호화되는 단클론 항체가 개시되어 있다.
본원에는 본원에 개시된 항체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 개시되어 있다.
본원에는 본원에 개시된 항체, 핵산 분자, 벡터, 또는 숙주 세포; 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 개시되어 있다.
본원에는 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법이 개시되어 있으며, 상기 방법은 본원에 개시된 항체, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 및/또는 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 면역 반응을 향상시키거나 유도한다.
본원에는 대상체에서 당뇨병성 신증을 치료하는 방법이 개시되어 있으며, 상기 방법은 본원에 개시된 항체, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 및/또는 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 로사르탄을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본원에는 대상체에서 비알콜성 지방증 간염을 치료하는 방법이 개시되어 있으며, 상기 방법은 본원에 개시된 항체, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 및/또는 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여함을 포함한다.
본원에는 샘플을 본원에 개시된 항체와 접촉시킴을 포함하여 샘플에서 SH3YL1을 검출하는 방법이 개시되어 있다.
또한 대상체에서 급성 신장 손상을 치료하는 방법이 개시되어 있으며, 상기 방법은 본원에 개시된 항체, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 및/또는 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여함을 포함한다.
본원에는 대상체에서 염증성 장 질환을 치료하는 방법이 개시되어 있으며, 상기 방법은 본원에 개시된 항체, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 및/또는 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여함을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
또한 본원에는 본원에 개시된 항체, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 및/또는 약제학적 조성물, 및 (a) 검출 시약, (b) SH3YL1 항원, (c) 인간 투여를 위한 사용 또는 판매 승인을 반영하는 통지, 또는 d) 이들의 조합을 포함하는 키트가 개시되어 있다.
본 개시내용의 특정 실시양태들의 상기 및 다른 측면들, 특징들, 및 이점들은 첨부된 도면들과 함께 취해진 다음의 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
도 1. SH3YL1 단백질의 분비는 고 글루코스(HG) 자극에 반응하여 MES13 혈관간막 세포(mesangial cell)에서 유도되었다. 마우스 혈관간막 세포주(MES13)를 9 및 24시간 동안 30mM의 HG와 함께 배양하였다. 세포 상청액을 농축시키고 SH3YL1에 대한 항체와 함께 면역블로팅에 적용하였다.
도 2. 건강한 사람에 비해 당뇨병성 신증 환자에서 혈청 SH3YL1 단백질이 유도되었다. 혈청 SH3YL1은 인간 SH3YL1 ELISA 키트를 사용하여 건강한 사람 및 DN에서 검출하였다.ㄴ
도 3. SH3YL1은 TLR5의 세포외 도메인과 상호작용하였다. SH3YL1과 TLR5의 엑토도메인의 상호작용은 TLR5-엑토-Fc(hTLR5-FC; Invivogen)를 사용한 면역침강(IP)에 의해 측정하였다. MES13을 24시간 동안 100ng/ml LPS로 자극하였다. 세포 상청액 및 세포 용해물을 TLR5-엑토-Fc 또는 음성 대조군으로서의 인간 대조군 IgG로 면역침강시켰다. 생성된 침전물을 SH3YL1에 대한 항체와 함께 면역블롯 분석에 적용하였다.
도 4. SH3YL1은 TLR5를 통해 pMMC에서 ROS 생성을 자극하였다. 야생형 및 TLR5 녹아웃 마우스로부터의 1차 혈관간막 세포(pMMC)를 SH3YL1 (1ug/ml)로 10분 동안 자극하였다. ROS(활성 산소종)의 생성을 PO-1 형광을 사용한 공초점 현미경으로 모니터링하였다(N=3, 데이터는 평균±SD로 표시됨, p<0.001, P<0.05 스튜던츠 t-검정에 의해 결정됨).
도 5. SH3YL1은 TLR5-의존성 NF-κB 활성화를 조절하였다. 야생형 및 TLR5 녹아웃 마우스로부터의 PMMC를 SH3YL1 (1ug/ml)로 1시간 또는 3시간 동안 자극하였다. IκB 인산화를 총 IκBα에 대한 항체 및 포스포-IκBα 항체로 면역블롯 분석에 적용하였다.
도 6. SH3YL1은 TLR5 KO 마우스로부터의 pMMC에서 전염증성 매개체의 생산을 자극하지 못했다. 야생형 및 TLR5 녹아웃 마우스로부터의 PMMC를 SH3YL1 (1ug/ml)로 24시간 동안 자극하였다. TNF-α, IL-1β, KC 및 MIP2 분비는 제조사의 지침에 따라 ELISA 키트를 사용하여 분석하였다.
도 7. db/db 마우스에 대한 SH3YL1 항체의 치료 효과. db/m 및 db/db 마우스(8주령)를 4개의 그룹으로 나누었다: (1) 대조군 db/m 마우스 (n=5), (2) 비히클로 처리된 대조군 db/db 마우스 (n=5), (3) CRB-A4로 처리된 db/db 마우스 (n=5), 및 (4) CRB-E10으로 처리된 db/db 마우스 (n=5). 항체를 12주 동안 1주당 10mg/kg의 용량으로 복강내 주사하였다. 공복 혈당은 4주마다 모니터링하였다. db/db 마우스에서 SH3YL1 항체 처리에 의한 뇨중 알부민 분비 감소. 뇨를 4주마다 수집하여 알부민 및 크레아티닌 수준을 측정하였다. 뇨에서 1일당 총 알부민 분비 및 알부민 대 크레아티닌 비(ACR)를 측정하였다.
도 8. db/db 마우스에서 SH3YL1 항체 처리에 의한 신장 혈관간막 확장의 감소. 신장 조직의 파라핀 절편을 PAS 염색에 적용하였다. 사구체 이미지를 현미경으로 촬영하였다. 사구체 용적, 다발 면적(tuft area) 및 분획 혈관간막 면적(PAS 양성 면적/다발 면적)은 Image Pro Plus 7 소프트웨어를 사용하여 평가하였다(그룹당 N=5, 데이터는 평균±SD로 표시됨, *P<0.005, **P<0.05 스튜던츠 t-검정에 의해 결정됨).
도 9. SH3YL1 항체 처리는 db/db 마우스에서 신장 섬유증으로부터 보호하였다. 신장 절편을 masson의 트리크롬 염색으로 염색하였다. 양성으로 염색된 콜라겐 영역은 Masson의 트리크롬 염색에서 어두운 색으로 표시되었다. 양성 염색 영역의 정량화는 Image Pro plus 7 프로그램을 사용하여 25-30개의 상이한 필드에서 수행하였다(그룹당 N=5, 데이터는 평균±SD로 표시됨, *P<0.005, **P<0.05 스튜던츠 t-검정에 의해 결정됨).
도 10. SH3YL1 항체 처리에 의한 섬유증 마커로서의 α-SMA 발현의 억제. 신장 절편을 α-SMA에 대한 항체로 IHC 염색하였다. IHC 염색의 양성으로 염색된 영역은 3,3'-디아미노벤지딘에 노출된 후 갈색으로 변했다. 양성 염색 영역의 정량화는 Image Pro plus 7 프로그램을 사용하여 20-25개 필드에서 수행하였다(그룹당 N=5, 데이터는 평균±SD로 표시됨, P<0.01, P<0.001 스튜던츠 t-검정에 의해 결정됨).
도 11. 분비된 SH3YL1 수준은 FFD NASH 모델의 혈청에서 유도되었다. 혈청 SH3YL1을 인간 SH3YL1 ELISA 키트를 사용하여 정상 식이(ND) 및 고지방 및 고프럭토스 식이(FFD) NASH 모델의 혈청에서 검출하였다.
도 12. 분비된 SH3YL1 수준은 NASH 환자의 혈청에서 유도되었다. 건강한 대조군(N=5) 및 NASH 환자(N=13)에서 혈청 SH3YL1을 인간 SH3YL1 ELISA 키트를 사용하여 검출하였다.
도 13. SH3YL1 항체로 처리하면 db/db 마우스에서 대식세포 침윤이 억제되었다. 간의 파라핀 절편을 대식세포 침윤을 위해 F4/80으로 염색하였다. 양성으로 염색된 영역은 DAB 적용으로 갈색으로 변했다.
도 14. SH3YL1 항체로 처리하면 db/db 마우스에서 간 섬유증이 억제되었다. 간 절편을 α-SMA에 대한 항체로 IHC 염색하였다. IHC 염색의 양성으로 염색된 영역은 3,3'-디아미노벤지딘에 노출된 후 갈색으로 변했다.
도 15. A3의 VH의 아미노산 서열 (서열 번호 1).
도 16. A3의 VH의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 2).
도 17. A3의 VL의 아미노산 서열 (서열 번호 3).
도 18. A3의 VL의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 4).
도 19. A4의 VH의 아미노산 서열 (서열 번호 5).
도 20. A4의 VH의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 6).
도 21. A4의 VL의 아미노산 서열 (서열 번호 7).
도 22. A4의 VL의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 8).
도 23. A3, A4, 및 S4A의 CH의 아미노산 서열 (서열 번호 9).
도 24. A3, A4, 및 S4A의 CL의 아미노산 서열 (서열 번호 10).
도 25. SH3YL1의 아미노산 서열 (서열 번호 11)
도 26. SH3YL1의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 12).
도 27. S4A의 VH의 아미노산 서열 (서열 번호 31).
도 28. S4A의 VH의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 32).
도 29. S4A의 VL의 아미노산 서열 (서열 번호 33).
도 30. S4A의 VL의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 34).
도 31. 4F9의 VH의 아미노산 서열 (서열 번호 35).
도 32. 4F9의 VH의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 36).
도 33. 4F9의 VL의 아미노산 서열 (서열 번호 37).
도 34. 4F9의 VL의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 38).
도 35. 4F10의 VH의 아미노산 서열 (서열 번호 39).
도 36. 4F10의 VH의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 40).
도 37. 4F10의 VL의 아미노산 서열 (서열 번호 41).
도 38. 4F10의 VL의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 42).
도 39. 5D5의 VH의 아미노산 서열 (서열 번호 43).
도 40. 5D5의 VH의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 44).
도 41. 5D5의 VL의 아미노산 서열 (서열 번호 45).
도 42. 5D5의 VL의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 46).
도 43. 4G4의 VH의 아미노산 서열 (서열 번호 47).
도 44. 4G4의 VH의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 48).
도 45. 4G4의 VL의 아미노산 서열 (서열 번호 49).
도 46. 4G4의 VL의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 50).
도 47. 3E11의 VH의 아미노산 서열 (서열 번호 51).
도 48. 3E11의 VH의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 52).
도 49. 3E11의 VL의 아미노산 서열 (서열 번호 53).
도 50. 3E11의 VL의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 54).
도 51. 4H7의 VH의 아미노산 서열 (서열 번호 55).
도 52. 4H7의 VH의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 56).
도 53. 4H7의 VL의 아미노산 서열 (서열 번호 57).
도 54. 4H7의 VL의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 58).
도 55a-55f. SH3YL1 항체는 시스플라틴-유도된 AKI 모델에서 신장 기능을 개선한다. 도 55a. SH3YL1 단백질의 분비는 시스플라틴 (20μg/ml) 자극에 반응하여 신장 관형 상피 세포에서 유도되었다. 신장 관형 상피 세포를 시스플라틴 (20μg/ml)과 함께 9 및 24시간 동안 배양 하였다. 세포 상청액을 농축시키고 SH3YL1에 대한 항체와 함께 면역블롯팅에 적용하였다. 도 55b 내지 도 55d. 혈청 크레아티닌, 혈중 요소 질소(BUN) 및 혈청 시스타틴 C는 혈청에서 "재료 & 방법"(실시예 3.1)에 기술된 지시된 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다(그룹당 N>9, 데이터는 평균±SEM로 표시됨, P<0.001, P<0.01, P<0.05 스튜던츠 t-검정에 의해 결정됨). 도 55e-55f. 뇨 알부민 및 알부민 대 크레아티닌 비 (ACR)를 뇨에서 측정하였다(그룹당 N>9, 데이터는 평균±SEM로 표시됨, P<0.001, P<0.005, P<0.01, 스튜던츠 t-검정에 의해 결정됨).
도 56a-56d. SH3YL1 항체의 처리는 신장 손상 마커의 증가를 감소시킨다. NGAL을 지시된 ELISA 키트를 사용하여 혈청(도 56a) 및 뇨(도 56b)에서 측정하였다(그룹당 N>9, 데이터는 평균±SEM로 표시됨, P<0.001, P<0.005, 스튜던츠 t-검정에 의해 결정됨). 혈청 KIM-1(도 56c) 및 뇨 KIM-1(도 56d)은 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다(그룹당 N>9, 데이터는 평균±SEM로 표시됨, P<0.001, P<0.005, N.S.는 유의하지 않음을 나타냄, 스튜던츠 t-검정에 의해 결정됨).
도 57a-57e. SH3YL1 항체의 처리는 시스플라틴 유도된 AKI 마우스에서 전염증성 사이토카인 생산을 약화시킨다. TNF-α (도 57a), IL-6 (도 57b), KC (도 57c), MIP2 (도 57d), MCP-1 (도 57e) mRNA 발현의 정량화. 결과는 18s에 의해 정규화되었다(그룹당 N=마우스 4마리, 데이터는 평균±SEM로 표시됨, P<0.001, P<0.005, N.S.는 유의하지 않음을 나타냄, 스튜던츠 t-검정에 의해 결정됨).
도 58a-58b. SH3YL1 항체의 처리는 시스플라틴 유도된 AKI 마우스 혈청에서 TNF-α 및 KC 분비를 약화시킨다. 혈청 TNF-α (도 58a), KC (도 58b)는 각각의 ELISA 키트를 사용하여 검출하였다(그룹당 N>9, 데이터는 평균±SEM로 표시됨, P<0.001, P<0.005, 스튜던츠 t-검정에 의해 결정됨).
도 59. SH3YL1 항체는 시스플라틴-유도된 관형 세포 손상으로부터 보호한다. 도 59a. 신장 절편을 헤마톡실린 및 에오신 용액으로 염색하였다. 도 59b. 관형 손상 점수로 인한 조직학적 변화는 다음과 같이 세포 괴사, 브러시 보더 손실, 캐스트 형성 및 세관 확장(tubule dilatation)을 나타내는 세관의 백분율에 의해 정량화하였다: 0, 없음; 1, 1-25%; 2, 26-50%; 3, >50%(그룹당 N>9, 데이터는 평균±SEM로 표시됨, P<0.001, 스튜던츠 t-검정에 의해 결정됨).
도 60a-60b. SH3YL1 항체는 시스플라틴-유도된 아폽토시스로부터 보호할 수 있다. (도 60a) 신장 절편을 TdT-UDP 닉 말단 표지로 염색하였다. TUNEL 양성 영역은 형광 현미경 (LSM880 airyscan, Carl Zeiss vison system)에 의해 시각화되었다 (도 60b) 각 신장의 5개 필드에서 TUNEL 양성 영역의 평균 형광 강도 (그룹당 N>9, 데이터는 평균±SEM로 표시됨, P<0.005, P<0.05, 스튜던츠 t-검정에 의해 결정됨).
도 61a-61b. DSS-유도된 결장염 모델 및 IBD 환자에서 혈청 SH3YL1의 수준. 도 61a. DSS-유도된 결장염 모델에서 혈청 SH3YL1의 수준. 도 61b. IBD 환자에서 혈청 SH3YL1의 수준.
도 62a-62c. DSS-유도된 결장염 모델에서 A4 항체의 예방적 효과. 도 62a. DSS-유도된 결장염 모델의 계획. 도 62b. H&E 염색을 사용한 결장 조직의 현미경 사진. 도 62c. 도 62b에서 H&E 염색된 슬라이드의 숫자 등급매김.
도 63a-63c. DSS-유도된 결장염 모델에 대한 A4 항체의 치료적 효과. 도 63a. DSS-유도된 결장염 모델의 계획. 도 63b. H&E 염색을 사용한 결장 조직의 현미경 사진. 도 63c. 도 63b에서 H&E 염색된 슬라이드의 숫자 등급매김.
도 64. 항체 A4, A3, S4A, 4F9, 5D5, 4F10, 4H7, 4G4 및 3E11의 웨스턴 블롯.
도 65. 항체 5D5, 3E11, 44F10, 4G4, 4F9, 4H7 및 S4A의 결합 친화도.
도 66. hTLR5-FC의 인간 TLR5 세포외 도메인 (aa 21-639)의 아미노산 서열 (서열 번호 59).
세포질 단백질은 NADPH 산화효소(Nox) 동질효소의 조절에 필요하다. SH3 도메인-함유 YSC84-like 1(SH3YL1)은 신규한 Nox4 세포질 조절인자로서 지질다당류(LPS)-유도된 H2O2 생성을 매개하여 급성 신장 손상을 유발한다. SH3YL1의 SYLF 영역 및 SH3 도메인은 Nox4-p22phox와 복합체를 형성하는데 기여한다. p22phox와 SH3YL1의 상호작용은 LPS에 의해 유발되었고, 복합체는 마우스 관형 상피 세포에서 H2O2 생성 및 전염증성 사이토카인 발현을 유도하였다. LPS 주사 후, SH3YL1 녹아웃 마우스는 WT 마우스에 비해 보다 낮은 수준의 급성 신장 손상 바이오마커, 전염증성 사이토카인의 감소된 분비, 대식세포의 감소된 침윤 및 감소된 관형 손상을 나타내었다. 결과는 SH3YL1이 LPS-유도된 AKI 마우스에서 신부전에 관여한다는 것을 강력하게 시사한다. 종합하면, H2O2 생성을 야기하는 p22phox-SH3YL1-Nox4의 삼원 복합체의 형성은 LPS-유도된 AKI 모델에서 심각한 신부전을 유도한다.
신장 조직으로부터 Nox4 조절인자를 확인하기 위해, Nox4의 COOH-말단 영역을 갖는 효모 2종 하이브리드 스크리닝 시스템을 미끼로서 수행하였다. 이러한 스크리닝 결과에 기초하여, SH3 도메인 함유 YSC84-like 1(SH3YL1)을 Nox4 조절인자로서 결정하였다. SH3YL1은 COOH-말단 영역에 SH3 도메인을 함유하고, NH3-말단 영역에 SYLF (SH3YL1, Ysc84p/Lsb4p, Lsb3p, 및 식물 FYVE 단백질) 도메인을 함유하였다. 두 개의 기능적 도메인은 세포 성장 및 이동을 포함한 세포 이벤트를 매개한다. 본원에는 패혈증-유도된 AKI에서 Nox4의 신규한 조절인자로서의 SH3YL1의 역할 및 SH3YL1-Nox4 축의 신규한 기능이 개시되어 있다.
이하에서는 실시양태들을 상세히 참조할 것이며, 이의 예는 첨부된 도면에 예시되어 있으며, 여기서 유사한 참조 부호는 전반에 걸쳐 유사한 요소를 지칭한다. 이와 관련하여, 본 실시양태는 상이한 형태를 가질 수 있으며, 본원에 제시된 설명에 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 따라서, 실시양태들은 도면을 참조함으로써, 본 설명의 측면을 설명하기 위해 이하에 기술될 뿐이다. 본원에 사용된 용어 "및/또는"은 연관된 열거된 항목들 중 하나 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함한다. "적어도 하나"와 같은 표현은, 요소의 목록 앞에 올 때, 요소의 전체 목록을 수식하며 목록의 개별 요소를 수식하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an," 및 "the"는 문맥상 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 복수 형태들도 포함하도록 의도된다. 또한, 용어 "포함하는(including)", "포함하다(includes)", "갖는(having)", "갖다(has)", "와(with)", "와 같은(such as)" 또는 이들의 변형이 명세서 및/또는 청구항에서 사용되는 한, 이러한 용어는 제한적이지 않으며, 용어 "포함하는(comprising)"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은, 숫자 값 또는 숫자 범위를 수식하는데 사용될 때, 값 또는 범위보다 5% 내지 10% 초과 및 5% 내지 10% 미만의 편차가 인용된 값 또는 범위의 의도된 의미 내에 있음을 나타낸다.
항체
본원에는 다음을 포함하는 단클론 항체가 개시되어 있다:
(a) 아미노산 서열 NYAMS (서열 번호 13)을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1),
아미노산 서열 VISSDNSSTYYADSVKG (서열 번호 14)을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
아미노산 서열 VWRHFDY (서열 번호 15)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(b) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNNVN (서열 번호 16)을 포함하는 경쇄 CDR1,
아미노산 서열 ADSHRPS (서열 번호 17)을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
아미노산 서열 ASWDSSLSGYV (서열 번호 18)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) 아미노산 서열 NYYMS (서열 번호 19)을 포함하는 중쇄 CDR1,
아미노산 서열 AISHNNSNTYYADSVKG (서열 번호 20)을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
아미노산 서열 KFSFFDY (서열 번호 21)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
(d) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVS (서열 번호 22)을 포함하는 경쇄 CDR1,
아미노산 서열 ANSHRPS (서열 번호 23)을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
아미노산 서열 GAWDSSLNGYV (서열 번호 24)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
(a) 일부 실시양태에서, 항체는 다음을 포함한다:
(e) 아미노산 서열 NYAMS (서열 번호 13)을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1),
아미노산 서열 VISSDNSSTYYADSVKG (서열 번호 14)을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
아미노산 서열 VWRHFDY (서열 번호 15)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(f) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNNVN (서열 번호 16)을 포함하는 경쇄 CDR1,
아미노산 서열 ADSHRPS (서열 번호 17)을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
아미노산 서열 ASWDSSLSGYV (서열 번호 18)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(g) 아미노산 서열 NYYMS (서열 번호 19)을 포함하는 중쇄 CDR1,
아미노산 서열 AISHNNSNTYYADSVKG (서열 번호 20)을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
아미노산 서열 KFSFFDY (서열 번호 21)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(h) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVS (서열 번호 22)을 포함하는 경쇄 CDR1,
아미노산 서열 ANSHRPS (서열 번호 23)을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
아미노산 서열 GAWDSSLNGYV (서열 번호 24)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
또한 본원에는 다음을 포함하는 단클론 항체가 개시되어 있다:
(a) 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1),
서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(b) 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(d) 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(e) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(f) 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(g) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(h) 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(i) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(j) 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(k) 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
(l) 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(m) 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
(n) 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일부 실시양태에서, 단클론 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1),
서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(d) 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(e) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(f) 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(g) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(h) 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(i) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(j) 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(k) 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(l) 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(m) 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(n) 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체의 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1 또는 5의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체의 경쇄 가변 영역은 서열 번호 3 또는 7의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체의 중쇄 가변 영역은 서열 번호 31, 35, 39, 43, 47, 51, 또는 55의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체의 경쇄 가변 영역은 서열 번호 33, 37, 41, 45, 49, 53, 또는 57의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체의 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1, 5, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 또는 55의 아미노산 서열을 포함하고, 본원에 개시된 항체의 경쇄 가변 영역은 서열 번호 3, 7, 33, 37, 41, 45, 49, 53 또는 57의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, 항체는 서열 번호 1 또는 5에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체는 서열 번호 31, 35, 39, 43, 47, 51 또는 55에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열 번호 3 또는 7에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 번호 3, 7, 33, 37, 41, 45, 49, 53 또는 57에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열 번호 1, 5, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 또는 55에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 3, 7, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 또는 57에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
항체는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 인간 면역글로불린 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 경쇄 불변 영역은 인간 면역글로불린 IgGκ및 IgGλ로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 경쇄 불변 영역은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 불변 영역은 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열 번호 9 또는 61에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및 서열번호 10 또는 62에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 각각 또는 이들의 임의의 조합으로 포함한다.
항체는 인간 항체일 수 있다. 항체는 단일쇄 항체(scFv), Fab, 또는 dsFV일 수 있다.
본원에는 본원에 개시된 항체와 동일한 인간 SH3 도메인-함유 YSC84-유사 1(SH3YL1)의 에피토프에 결합하는 단클론 항체가 개시되어 있다.
본원에는 아미노산 서열 DSHFDWWE (서열 번호 25)를 포함하는 에피토프에서 인간 SH3 도메인-함유 YSC84-유사 1(SH3YL1)에 특이적으로 결합하는 단클론 항체가 개시되어 있다.
또한 본원에는 아미노산 서열 LYEILDSF (서열 번호 26)를 포함하는 에피토프에서 인간 SH3 도메인-함유 YSC84-유사 1(SH3YL1)에 특이적으로 결합하는 단클론 항체가 개시되어 있다.
또한 서열 번호 98, 99, 100, 또는 60의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에서 인간 SH3 도메인-함유 YSC84-유사 1(SH3YL1)에 특이적으로 결합하는 단클론 항체가 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, SH3YL1의 아미노산 서열은 서열 번호 11로 제공되고, SH3YL1의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 12로 제공된다.
본원에 사용된 용어 "항체" 및 "항체들"은 당업계의 용어이며 본원에서 상호교환 가능하게 사용될 수 있고, 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 갖는 분자를 지칭한다. 항체는, 예를 들면, 재조합적으로 생산된 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 재표면화된 항체, 키메라 항체, 면역글로불린, 합성 항체, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄 분자를 포함하는 사량체 항체, 항체 경쇄 단량체, 항체 중쇄 단량체, 항체 경쇄 이량체, 항체 중쇄 이량체, 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍, 인트라바디, 이종접합체 항체, 단일 도메인 항체, 1가 항체, 단일쇄 항체 또는 단일쇄 Fv (scFv), (scFv)2, sc(Fv)2, 낙타화 항체, 애피바디, Fab 단편, Fv, F(ab')2 단편, 디설파이드-결합된 Fv(dsFv), 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 항-항-Id 항체 포함), 이중특이 항체, 다중특이 항체, 미니바디, 트리아바디, 테트라바디, 또는 항체-약물 접합체를 포함하는 단클론 항체를 포함할 수 있다.
항체는 면역글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 또는 IgY), 임의의 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 또는 IgA2), 또는 임의의 서브클래스 (예를 들어, IgG2a 또는 IgG2b)일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 IgG 항체, 또는 이의 클래스 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, 또는 IgG4) 또는 서브클래스이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 단클론 항체이다. 다른 실시양태에서, 항체는 인간 단클론 항체, 예를 들어, 면역글로불린인 항체이다.
본원에 사용된 용어 "항원-결합 도메인", "항원-결합 영역", "항원-결합 부위" 및 유사 용어는 항체 분자 상에 항원에 대한 이의 특이성을 부여하는 아미노산 잔기(예를 들어, 상보성 결정 영역(CDR))를 포함하는 항체의 부분을 지칭한다. 항원-결합 영역은 임의의 동물 종, 예를 들어 설치류(예를 들어, 마우스, 래트 또는 햄스터) 및 인간으로부터 유래될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 상호교환 가능하게 사용되며, 당업계에서 일반적이다. 가변 영역은 전형적으로 항체의 일부, 일반적으로는 경쇄 또는 중쇄의 일부, 전형적으로 성숙 중쇄 내의 약 아미노-말단 110 내지 120개 아미노산 및 성숙 경쇄 내의 약 90 내지 115개 아미노산을 지칭하며, 이들은 항체들 사이에서 서열에 있어 광범위하게 상이하고, 이의 특정 항원에 대한 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 서열의 가변성은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 영역에 집중되는 반면 가변 도메인에서 더 많이 보존된 영역을 프레임워크 영역(FR)이라고 한다. 임의의 특정 메커니즘 또는 이론에 결부시키고자 함이 없이, 경쇄 및 중쇄의 CDR이 항체와 항원의 상호작용 및 특이성에 대해 주로 책임이 있는 것으로 여겨진다. 특정 실시양태에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다. 특정 실시양태에서, 가변 영역은 설치류 또는 뮤린 CDR 및 인간 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 가변 영역은 영장류(예를 들어, 비인간 영장류) 가변 영역이다. 특정 실시양태에서, 가변 영역은 설치류 또는 뮤린 CDR 및 영장류(예를 들어, 비인간 영장류) 프레임워크 영역(FR)을 포함한다.
용어 "VL" 및 "VL 도메인"은 항체의 경쇄 가변 영역을 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용된다.
용어 "VH" 및 "VH 도메인"은 항체의 중쇄 가변 영역을 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용된다.
용어 "Kabat 넘버링" 및 유사 용어는 당업계에서 인식되며, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 또는 이의 항원-결합 부분의 아미노산 잔기를 넘버링하는 시스템을 지칭한다. 특정 측면에서, 항체의 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다(예를 들어, 참조; Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190:382-391 and Kabat EA 외., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Kabat 넘버링 시스템을 사용하여, 항체 중쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 31 내지 35(이는 임의로 35 뒤에 1개 또는 2개의 추가 아미노산을 포함할 수 있다(Kabat 넘버링 체계에서 35A 및 35B로 지칭됨)) (CDR1), 아미노산 위치 50 내지 65 (CDR2), 및 아미노산 위치 95 내지 102 (CDR3)에 존재한다. Kabat 넘버링 시스템을 사용하여, 항체 경쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 24 내지 34 (CDR1), 아미노산 위치 50 내지 56 (CDR2), 및 아미노산 위치 89 내지 97 (CDR3)에 존재한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 CDR은 Kabat 넘버링 체계에 따라 결정되었다.
본원에 사용된 용어 "불변 영역" 또는 "불변 도메인"은 상호교환 가능하며, 당업계에서 일반적인 의미를 갖는다. 불변 영역은 항체 부분, 예를 들어 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만 Fc 수용체와의 상호작용과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낼 수 있는 경쇄 및/또는 중쇄의 카복실 말단 부분이다. 면역글로불린 분자의 불변 영역은 일반적으로 면역글로불린 가변 도메인에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "중쇄"는 항체와 관련하여 사용될 때 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여 임의의 별개의 유형, 예를 들어 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ), 및 뮤 (μ)를 지칭할 수 있으며, 이는 각각 IgG의 서브클래스, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하여 항체의 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 클래스를 발생시킨다.
본원에 사용된 용어 "경쇄"는 항체와 관련하여 사용될 때 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여 임의의 별개의 유형, 예를 들어 카파 (κ) 또는 람다 (λ)를 지칭할 수 있다. 경쇄 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 구체적인 실시양태에서, 경쇄는 인간 경쇄이다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자의 단일 결합 부위 (예를 들어, 항체)와 이의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍 (예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 평형 해리 상수 (KD) 및 평형 회합 상수 (KA)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다수의 방식으로 측정 및/또는 표현될 수 있다. KD는 koff/kon의 몫으로부터 계산되는 반면 KA는 kon/koff의 몫으로부터 계산된다. kon은 예를 들어 항원에 대한 항체의 회합 속도 상수를 지칭하고, koff는 예를 들어 항원에 대한 항체의 해리를 지칭한다. kon 및 koff는 BIAcore® 또는 KinExA와 같이 당업계의 통상의 숙련가에게 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당업계에 정의되어 있다. 이러한 계열은 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체의 CDR(들) 내 또는 프레임워크 영역(들) 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "에피토프"는 당업계의 용어이며, 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국부적 영역을 지칭한다. 에피토프는, 예를 들어, 폴리펩티드의 인접 아미노산 (선형 또는 인접 에피토프)일 수 있거나, 에피토프는, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 2개 이상의 비-인접 영역으로부터 합쳐질 수 있다 (입체형태, 비-선형, 불연속, 또는 비-인접 에피토프). 특정 실시양태에서, 항체가 결합하는 에피토프는, 예를 들어, NMR 분광법, X선 회절 결정학 연구, ELISA 분석법, 질량 분광분석법과 결합된 수소/중수소 교환 (예를 들어, 액체 크로마토그래피 전기분무 질량 분광분석법), 어레이-기반 올리고-펩티드 스캐닝 분석, 및/또는 돌연변이유발 맵핑 (예를 들어, 부위-지향 돌연변이유발 매핑)에 의해 결정될 수 있다. X선 결정학의 경우, 결정화는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다(예를 들어, 참조; Giege R 외., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4):339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189:1-23; Chayen NE (1997) Structure 5:1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251:6300-6303). 항체:항원 결정은 잘 알려진 X선 회절 기술을 사용하여 연구할 수 있으며 X-PLOR (Yale University, 1992, Molecular Simulations, Inc.에 의해 배포됨; 예를 들어 참조; Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW 외.,; U.S. 2004/0014194), 및 BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1):37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A:361-423, ed Carter CW; Roversi P 외., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10):1316-1323)와 같은 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 정제할 수 있다. 돌연변이유발 맵핑 연구는 당업계의 숙련가에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 기술을 포함한 돌연변이유발 기술의 설명에 대해서는 문헌[Champe M 외., (1995) J Biol Chem 270:1388-1394 and Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244:1081-1085]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 항체의 에피토프는 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 연구를 사용하여 결정된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역특이적으로 결합한다", "면역특이적으로 인식한다", "특이적으로 결합한다" 및 "특이적으로 인식한다"는 항체의 맥락에서 유사한 용어이고, 항원에 결합하는 분자(예를 들어, 에피토프, 면역 복합체, 또는 항원-결합 부위의 결합 파트너)를 지칭하며, 이러한 결합은 당업계의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같다. 예를 들면, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 일반적으로, 예를 들어, 면역검정, BIAcore®, KinExA 3000 기기(Sapidyne Instruments, Boise, ID), 또는 당업계에 공지된 다른 검정에 의해 결정된 바와 같이 더 낮은 친화도로 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원에 면역특이적으로 결합하는 분자는 분자가 다른 항원에 결합할 때의 KA보다 적어도 2 로그, 2.5 로그, 3 로그, 4 로그 또는 그 이상의 KA로 항원에 결합한다.
다른 실시양태에서, 항원에 면역특이적으로 결합하는 분자는 유사한 결합 조건하에서 다른 단백질과 교차 반응하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항원에 면역특이적으로 결합하는 분자는 다른 단백질과 교차 반응하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에는 다른 비관련 항원보다 더 높은 친화도로 특정 항원에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본원에는, 예를 들어 방사면역검정, 표면 플라즈몬 공명, 또는 동역학 배제 검정에 의해 측정되는 바와 같이, 다른 비관련 항원에 비해 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상 더 높은 친화도로 특정 항원(예를 들어, 인간 SH3YL1)에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 비관련 단백질에 대한 본원에 기재된 항체의 결합 정도는, 예를 들어, 방사면역검정에 의해 측정된 바와 같이 특정된 항원에 대한 항체의 결합의 10%, 15%, 또는 20% 미만이다.
일부 실시양태에서, 본원에는 항원의 다른 종보다 더 높은 친화도로 인간 항원에 결합하는 단클론 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본원에는, 예를 들어 방사면역검정, 표면 플라즈몬 공명, 또는 동역학 배제 검정에 의해 측정된 바와 같이, 다른 종에 비해 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 그 이상 더 높은 친화도로 인간 항원(예를 들어, 인간 SH3YL1)에 결합하는 단클론 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 인간 항원(예를 들어, 인간 SH3YL1)에 결합하는 본원에 기재된 항체는, 예를 들어 방사면역검정, 표면 플라즈몬 공명, 또는 동역학 배제 검정에 의해 측정된 바와 같이, 인간 항원 단백질에 대한 항체의 결합의 10%, 15%, 또는 20% 미만으로 항원 단백질의 다른 종에 결합할 것이다.
특정 측면에서, 본원에 기재된 항체는 이의 VL 도메인 단독, 또는 이의 VH 도메인 단독, 또는 이의 3개의 VL CDR 단독, 또는 이의 3개의 VH CDR 단독에 의해 기술될 수 있다. 예를 들면, 인간 경쇄 또는 중쇄 라이브러리로부터 각각 상보성 경쇄 또는 중쇄를 확인하여 본래 항체의 친화도만큼 높거나 더 높은 친화도를 갖는 인간화 항체 변이체를 초래함으로써 마우스 항-αvβ3 항체의 인간화를 기술하는, 전문이 본원에 참고로 포함된 문헌[Rader C 외., (1998) PNAS 95:8910-8915]을 참조한다. 또한 특정 VL 도메인 (또는 VH 도메인)을 사용하여 특정 항원에 결합하는 항체를 생산하고 상보적 가변 도메인에 대한 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 기술하는, 전문이 본원에 참고로 포함된 문헌[Clackson T 외., (1991) Nature 352:624-628]을 참조한다. 또한 특정 VH 도메인을 사용하여 특정 항원에 결합하는 항체를 생산하고 상보적 VL 도메인에 대한 라이브러리(예를 들어, 인간 VL 라이브러리)를 스크리닝하는 방법을 기술하고; 선택된 VL 도메인이 차례로 추가의 상보적 (예를 들어, 인간) VH 도메인의 선택을 안내하는데 사용될 수 있음을 기술하는, 전문이 본원에 참고로 포함된 문헌[Kim SJ & Hong HJ, (2007) J Microbiol 45:572-577]을 참조한다.
특정 측면에서, 항체의 CDR은 면역글로불린 구조적 루프의 위치를 지칭하는 Chothia 넘버링 체계에 따라 결정될 수 있다(예를 들어, 참조; Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196:901-917; Al-Lazikani B 외., (1997) J Mol Biol 273:927-948; Chothia C 외., (1992) J Mol Biol 227:799-817; Tramontano A 외., (1990) J Mol Biol 215(1):175-82; 및 미국 특허 제7,709,226호). 전형적으로, Kabat 넘버링 규칙을 사용할 때, Chothia CDR-H1 루프는 중쇄 아미노산 26 내지 32, 33, 또는 34에 존재하고, Chothia CDR-H2 루프는 중쇄 아미노산 52 내지 56에 존재하고, Chothia CDR-H3 루프는 중쇄 아미노산 95 내지 102에 존재하는 반면, Chothia CDR-L1 루프는 경쇄 아미노산 24 내지 34에 존재하고, Chothia CDR-L2 루프는 경쇄 아미노산 50 내지 56에 존재하고, Chothia CDR-L3 루프는 경쇄 아미노산 89 내지 97에 존재한다. Kabat 넘버링 규칙을 사용하여 번호를 매길 때 Chothia CDR-H1 루프의 말단은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 다르다(이는 Kabat 넘버링 체계가 H35A 및 H35B에 삽입을 배치하기 때문이며; 35A 및 35B가 모두 존재하지 않으면, 루프는 32에서 끝나고; 35A만 존재하면, 루프는 33에서 끝나며; 35A 및 35B가 모두 존재하면, 루프는 34에서 끝난다).
특정 측면에서, 본원에는 SH3YL1에 특이적으로 결합하고 VL의 Chothia VL CDR을 포함하는 단클론 항체가 제공된다. 특정 측면에서, 본원에는 SH3YL1(예를 들어, 인간 SH3YL1)에 특이적으로 결합하고, VH의 Chothia VH CDR을 포함하는 단클론 항체가 제공된다. 특정 측면에서, 본원에는 SH3YL1(예를 들어, 인간 SH3YL1)에 특이적으로 결합하고, VL의 Chothia VL CDR을 포함하고, VH의 Chothia VH CDR을 포함하는 단클론 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, SH3YL1(예를 들어, 인간 SH3YL1)에 특이적으로 결합하는 단클론 항체는 하나 이상의 CDR을 포함하고, 여기서 Chothia 및 Kabat CDR은 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에는 SH3YL1(예를 들어, 인간 SH3YL1)에 특이적으로 결합하고, Kabat CDR 및 Chothia CDR의 조합을 포함하는 단클론 항체가 제공된다.
특정 측면에서, 항체의 CDR은 문헌[Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7:132-136 and Lefranc M-P 외., (1999) Nucleic Acids Res 27:209-212]에 기재된 바와 같이 IMGT 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. IMGT 넘버링 체계에 따르면, VH-CDR1은 위치 26 내지 35에 있고, VH-CDR2는 위치 51 내지 57에 있으며, VH-CDR3은 위치 93 내지 102에 있고, VL-CDR1은 위치 27 내지 32에 있으며, VL-CDR2는 위치 50 내지 52에 있고, VL-CDR3은 위치 89 내지 97에 있다.
특정 측면에서, 항체의 CDR은 문헌[MacCallum RM 외., (1996) J Mol Biol 262:732-745]에 따라 결정될 수 있다. 또한, 예를 들어 문헌[Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Dubel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)]을 참조한다.
특정 측면에서, 항체의 CDR은 AbM 넘버링 체계에 따라 결정될 수 있으며, 이는 Kabat CDR과 Chothia 구조 루프 사이의 절충안을 나타내는 AbM 초가변 영역을 지칭하고, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어(Oxford Molecular Group, Inc.)에 의해 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 VH(예를 들어, CDR1, CDR2, 또는 CDR3) 및/또는 VL(예를 들어, CDR1, CDR2, 또는 CDR3) 영역을 따라 하나 이상의 CDR의 위치는 항원에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한(예를 들어, 실질적으로 유지됨, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%) 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 위치만큼 변할 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 항체의 CDR을 정의하는 위치는 항원(들)에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한(예를 들어, 실질적으로 유지됨, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%), 본원에 기재된 항체의 CDR 위치에 대해 CDR의 N-말단 및/또는 C-말단 경계를 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산만큼 이동시킴으로써 변할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 VH(예를 들어, CDR1, CDR2, 또는 CDR3) 및/또는 VL(예를 들어, CDR1, CDR2, 또는 CDR3) 영역을 따라 하나 이상의 CDR의 길이는 항원(들)에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한(예를 들어, 실질적으로 유지됨, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%) 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 아미노산만큼 (예를 들어, 더 짧거나 길게) 변할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, 및/또는 VH CDR3은 항원(들)에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한(예를 들어, 실질적으로 유지됨, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%) 본원에 기재된 CDR 중 하나 이상보다 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 아미노산만큼 더 짧을 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, 및/또는 VH CDR3은 항원(들)에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한(예를 들어, 실질적으로 유지됨, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%) 본원에 기재된 CDR 중 하나 이상보다 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 아미노산만큼 더 길 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, 및/또는 VH CDR3의 아미노 말단은 항원(들)에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한(예를 들어, 실질적으로 유지됨, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%) 본원에 기재된 CDR 중 하나 이상에 비해 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 아미노산만큼 연장될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, 및/또는 VH CDR3의 카복시 말단은 항원(들)에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한(예를 들어, 실질적으로 유지됨, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%) 본원에 기재된 CDR 중 하나 이상에 비해 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 아미노산만큼 연장될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, 및/또는 VH CDR3의 아미노 말단은 항원(들)에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한(예를 들어, 실질적으로 유지됨, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%) 본원에 기재된 CDR 중 하나 이상에 비해 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 아미노산만큼 단축될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, 및/또는 VH CDR3의 카복시 말단은 항원(들)에 대한 면역특이적 결합이 유지되는 한(예를 들어, 실질적으로 유지됨, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%) 본원에 기재된 CDR 중 하나 이상에 비해 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 아미노산만큼 단축될 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 본원의 "실시예" 섹션에 기재된 결합 분석 및 조건이 항원(들)에 대한 면역특이적 결합이 유지되는지 여부를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
2개의 서열(예를 들어, 아미노산 서열 또는 핵산 서열) 간의 동일성 퍼센트의 결정은 또한 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 2개의 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 구체적이고 비제한적인 예는 문헌[Karlin S & Altschul SF (1993) PNAS 90:5873-5877]에서와 같이 수정된 문헌[Karlin S & Altschul SF (1990) PNAS 87:2264-2268]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul SF 외., (1990) J Mol Biol 215:403]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합된다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 본원에 기재된 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해 예를 들어 스코어=100, 단어길이=12에 대해 설정된 NBLAST 뉴클레오티드 프로그램 파라미터를 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본원에 기재된 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해 예를 들어 스코어 50, 단어길이=3으로 설정된 XBLAST 프로그램 파라미터를 사용하여 수행될 수 있다. 비교 목적을 위해 갭 정렬을 수득하기 위해서는, Gapped BLAST가 문헌[Altschul SF 외., (1997) Nuc Acids Res 25:3389 3402]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 대안적으로, PSI BLAST가 분자 사이의 먼 관계를 검출하는 반복 검색을 수행하는데 사용될 수 있다(Id.). BLAST, Gapped BLAST 및 PSI Blast 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다(예를 들어, 참조; 월드와이드 웹, ncbi.nlm.nih.gov에서 National Center for Biotechnology Information(NCBI)). 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 구체적이고 비제한적인 예는 문헌[Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11 17]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용할 때, PAM120 중량 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 페널티 4가 사용될 수 있다.
두 서열 사이의 동일성 퍼센트는 갭을 허용하거나 포함하지 않고서 전술한 것과 유사한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 동일성 퍼센트를 계산하는데 있어서, 전형적으로 정확한 일치만 계수한다.
본원에 사용된 바와 같이, "단리된" 항체는 항체의 천연 공급원(예를 들어, 마우스 또는 인간)에 존재하는 다른 항체로부터 분리되는 것이다. 더욱이, "단리된" 항체는 재조합 기술에 의해 생산될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 예를 들면, 언어 "실질적으로 없는"은 약 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만(특히 약 10% 미만)의 다른 물질, 예를 들어, 세포 물질, 배양 배지, 다른 항체, 화학적 전구체 및/또는 다른 화학물질을 갖는 항체의 제제를 포함한다.
항체는 검출 가능한 표지 또는 물질에 융합 또는 접합될 수 있다(예를 들어, 공유적으로 또는 비공유적으로 연결됨). 검출 가능한 표지 또는 물질의 예는 효소 표지, 예를 들어, 글루코스 옥시다제; 방사성 동위 원소, 예를 들어 요오드(125I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 삼중수소(3H), 인듐(121In) 및 테크네튬(99Tc); 발광 표지, 예를 들어 루미놀; 및 형광 표지, 예를 들어 플루오레세인 및 로다민, 및 비오틴을 포함한다. 이러한 표지된 항체는 항원 단백질을 검출하는데 사용될 수 있다.
항체 생산
본원에 개시된 항체는 항체의 합성을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 화학적 합성 또는 재조합 발현 기술에 의해 생산될 수 있다. 본원에 기재된 방법은, 달리 지시되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 유전자 분석, 재조합 DNA, 유기 화학, 생화학, PCR, 올리고뉴클레오티드 합성 및 변형, 핵산 혼성화, 및 당업계의 기술 내의 관련 분야에서 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술은, 예를 들어, 본원에 인용된 참고문헌에 기재되어 있고, 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[Maniatis T 외., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J 외., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J 외., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM 외. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B 외., (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는, 예를 들어, DNA 서열의 합성, 유전공학을 통한 생성을 수반하는 임의의 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체(예를 들어, 재조합 항체)이다. 특정 실시양태에서, 이러한 항체는 생체내에서 동물 또는 포유동물(예를 들어, 인간)의 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않는 서열(예를 들어, DNA 서열 또는 아미노산 서열)을 포함한다.
일부 측면에서, 본원에는 본원에 기재된 세포 또는 숙주 세포를 배양함을 포함하여 본원에 개시된 항체를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 본원에는 본원에 기재된 세포 또는 숙주 세포(예를 들어, 본원에 기재된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 또는 숙주 세포)를 사용하여 항체를 발현(예를 들어, 재조합적으로 발현)함을 포함하여 항체를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 단리된 세포이다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입되었다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 세포 또는 숙주 세포로부터 수득된 항체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
다클론 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 참조; Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM 외., eds., John Wiley and Sons, New York).
항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술의 사용, 또는 이들의 조합을 포함하는 당업계에 공지된 매우 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 단클론 항체는 당업계에 공지되고 예를 들면 문헌[Harlow E & Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling GJ 외., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981)]에 교시된 것을 포함하는 하이브리도마 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "단클론 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체로 제한되지 않는다. 예를 들어, 단클론 항체는 본원에 기재된 항체를 외인성으로 발현하는 숙주 세포로부터 재조합적으로 생산될 수 있다.
본원에 사용된 "단클론 항체"는 단일 세포(예를 들어, 재조합 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 숙주 세포)에 의해 생산된 항체이며, 여기서 항체는, 예를 들어 ELISA 또는 당업계에 또는 본원에 제공된 실시예에 공지된 다른 항원-결합 또는 경쟁적 결합 검정에 의해 결정된 바와 같이 항원(예를 들어, 인간 SH3YL1)에 면역특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 단클론 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 단클론 항체는 1가 항체 또는 다가(예를 들어, 2가) 항체이다. 특정 실시양태에서, 단클론 항체는 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편일 수 있다. 본원에 기재된 단클론 항체는, 예를 들어 문헌[Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256:495]에 기재된 바와 같은 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 예를 들어 본원에 기재된 기술을 사용하여 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 클론 세포주 및 이에 의해 발현된 단클론 항체의 제조를 위한 다른 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 참조; Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM 외., 상기 참조).
하이브리도마 기술을 사용하여 특정 항체를 생산하고 스크리닝하는 방법은 일상적이며 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들어 양, 염소, 토끼, 래트, 햄스터 또는 짧은 꼬리 원숭이를 면역화하여 면역화에 사용되는 항원(예를 들어, 인간 SH3YL1))에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 그후, 림프구를 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 추가적으로, RIMMS(반복 면역화 다중 부위) 기술을 사용하여 동물을 면역화시킬 수 있다(Kilpatrick KE 외., (1997) Hybridoma 16:381-9, 전문이 참고로 포함됨).
일부 실시양태에서, 마우스 (또는 다른 동물, 예를 들어 래트, 원숭이, 당나귀, 돼지, 양, 햄스터, 또는 개)를 항원(예를 들어, 인간 SH3YL1))으로 면역화시킬 수 있으며, 일단 면역 반응이 검출되면, 예를 들어, 항원에 특이적인 항체를 마우스 혈청에서 검출하고, 마우스 비장을 수확되고 비장세포를 단리한다. 그후, 비장세포를 임의의 적합한 골수종 세포, 예를 들어 American Type Culture Collection (ATCC®)(Manassas, VA)으로부터 입수 가능한 세포주 SP20으로부터의 세포에 잘 알려진 기술에 의해 융합시켜 하이브리도마를 형성한다. 하이브리도마를 제한 희석에 의해 선택하고 클로닝한다. 특정 실시양태에서, 면역화된 마우스의 림프절을 수확하고 NS0 골수종 세포와 융합시킨다.
이렇게 하여 제조된 하이브리도마 세포를 미융합된 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유할 수 있는 적합한 배양 배지에서 시딩 및 성장한다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우, 하이브리도마의 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이며, 이 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
특정 실시양태는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 골수종 세포를 사용한다. 이들 골수종 세포주 중에는 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어 NS0 세포주 또는 미국 캘리포니아주 샌디에고의 Salk Institute 세포 분포 센터로부터 입수 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것들, 및 미국 메릴랜드주 록빌에 소재한 American Type Culture Collection으로부터 입수 가능한 SP-2 또는 X63-Ag8.653 세포가 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 단클론 항체의 생산을 위해 기재되었다(Kozbor D (1984) J Immunol 133:3001-5; Brodeur 외., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대해 지시된 단클론 항체의 생산을 위해 분석한다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 결합 특이성은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 면역침강 또는 시험관내 결합 검정, 예를 들어 방사면역검정(RIA) 또는 효소-결합 면역흡수 검정(ELISA)에 의해 결정된다.
원하는 특이성, 친화도, 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝하고 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다(Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 상기 참조). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI 1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양(ascites tumor)으로서 생체내에서 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비되는 단클론 항체는, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
본원에 기재된 항체는 당업계의 숙련가들에게 공지된 임의의 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인(Fab 단편을 생산하기 위해) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 생산하기 위해)과 같은 효소를 사용하여, 면역글로불린 분자의 단백질분해 절단에 의해 생산될 수 있다. Fab 단편은 사량체 항체 분자의 2개의 동일한 팔 중 하나에 상응하고, 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 쌍을 이루는 완전한 경쇄를 함유한다. F(ab')2 단편은 힌지 영역에서 이황화 결합으로 연결된 사량체 항체 분자의 두 개의 항원-결합 팔을 포함한다.
또한, 본원에 기재된 항체는 또한 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 단백질은 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지닌 파지 입자의 표면에 표시된다. 특히, VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA 서열은 동물 cDNA 라이브러리(예를 들어, 이환된 조직의 인간 또는 뮤린 cDNA 라이브러리)로부터 증폭된다. VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA를 PCR에 의해 scFv 링커와 함께 재조합하고 파지미드 벡터로 클로닝한다. 벡터를 대장균(E. coli)에서 전기천공하고 대장균을 헬퍼 파지로 감염시킨다. 이러한 방법에 사용되는 파지는 전형적으로 fd 및 M13을 포함하는 사상 파지이고, VH 및 VL 도메인은 통상적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII에 재조합적으로 융합된다. 특정 항원에 결합하는 항체를 발현하는 파지는, 예를 들어 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 사용하여 항원을 선택 또는 동정할 수 있다. 본원에 기재된 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예는 문헌[Brinkman U 외., (1995) J Immunol Methods 182:41-50; Ames RS 외., (1995) J Immunol Methods 184:177-186; Kettleborough CA 외., (1994) Eur J Immunol 24:952-958; Persic L 외., (1997) Gene 187:9-18; Burton DR & Barbas CF (1994) Advan Immunol 57:191-280; 제PCT/GB91/001134호; 제WO90/02809호, 제WO91/10737호, 제WO92/01047호, 제WO92/18619호, 제WO93/11236호, 제WO95/15982호, 제WO95/20401호, 및 제WO97/13844호; 및 미국 특허 제5,698,426호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,750,753호, 제5,821,047호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5,516,637호, 제5,780,225호, 제5,658,727호, 제5,733,743호, 및 제5,969,108호]에 개시된 것들을 포함한다.
상기 참고문헌에 기재된 바와 같이, 파지 선택 후에, 파지로부터 항체 코딩 영역을 단리하고, 인간 항체를 포함한 항체를 생성하는데 사용할 수 있으며, 예를 들어 하기에 기술된 바와 같이, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함한 임의의 원하는 숙주에서 발현시킬 수 있다. Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편과 같은 항체를 재조합적으로 생산하는 기술은 또한 문헌[제WO92/22324호; Mullinax RL 외., (1992) BioTechniques 12(6):864-9; Sawai H 외., (1995) Am J Reprod Immunol 34:26-34; and Better M 외., (1988) Science 240:1041-1043]에 개시된 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 채용될 수 있다.
일부 측면에서, 항체를 생성하기 위해, VH 또는 VL 뉴클레오티드 서열, 제한 부위, 및 제한 부위를 보호하는 플랭킹 서열을 포함하는 PCR 프라이머가 주형, 예를 들어 scFv 클론으로부터 VH 또는 VL 서열을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 당업계의 숙련가들에게 공지된 클로닝 기술을 이용하여, PCR 증폭된 VH 도메인은 VH 불변 영역을 발현하는 벡터로 클로닝될 수 있고, PCR 증폭된 VL 도메인은 VL 불변 영역, 예를 들어, 인간 카파 또는 람다 불변 영역을 발현하는 벡터로 클로닝될 수 있다. VH 및 VL 도메인은 또한 필요한 불변 영역을 발현하는 하나의 벡터로 클로닝될 수 있다. 그후 중쇄 전환 벡터 및 경쇄 전환 벡터는 당업계의 숙련가들에게 공지된 기술을 사용하여 항체, 예를 들어 IgG를 발현하는 안정한 또는 일시적인 세포주를 생성하기 위해 세포주로 동시-형질감염된다.
키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래되는 분자이다. 예를 들어, 키메라 항체는 인간 항체의 불변 영역에 융합된 마우스 또는 래트 단클론 항체의 가변 영역을 함유할 수 있다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Morrison SL (1985) Science 229:1202-7; Oi VT & Morrison SL (1986) BioTechniques 4:214-221; Gillies SD 외., (1989) J Immunol Methods 125:191-202; 및 미국 특허 제5,807,715호, 제4,816,567호, 제4,816,397호, 및 제6,331,415호]을 참조한다.
인간화 항체는 소정의 항원에 결합할 수 있으며, 이는 실질적으로 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 및 실질적으로 비인간 면역글로불린(예를 들어, 뮤린 면역글로불린)의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 부분을 포함한다. 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 인간화 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 부류의 면역글로불린, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 인간화 항체는 CDR 그래프팅(제EP 239400호; 제WO91/09967호; 및 미국 특허 제5,225,539호, 제5,530,101호, 및 제5,585,089호), 베니어링 또는 재생(제EP 592106호 및 제EP 519596호; Padlan EA (1991) Mol Immunol 28(4/5):489-498; Studnicka GM 외., (1994) Prot Engineering 7(6):805-814; and Roguska MA 외., (1994) PNAS 91:969-973), 쇄 셔플링(미국 특허 제5,565,332호), 및 예를 들어, 문헌[미국 특허 제6,407,213호, 미국 특허 제5,766,886호, 제WO93/17105호; Tan P 외., (2002) J Immunol 169:1119-25; Caldas C 외., (2000) Protein Eng. 13(5):353-60; Morea V 외., (2000) Methods 20(3):267-79; Baca M 외., (1997) J Biol Chem 272(16):10678-84; Roguska MA 외., (1996) Protein Eng 9(10):895 904; Couto JR 외., (1995) Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s; Couto JR 외., (1995) Cancer Res 55(8):1717-22; Sandhu JS (1994) Gene 150(2):409-10 and Pedersen JT 외., (1994) J Mol Biol 235(3):959-73]에 개시된 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 또한 전문이 본원에 참고로 포함된 미국 제2005/0042664 A1호(2005년 2월 24일)를 참조한다.
단일 도메인 항체, 예를 들어 경쇄가 없는 항체는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 생산될 수 있다. 문헌[Riechmann L & Muyldermans S (1999) J Immunol 231:25-38; Nuttall SD 외., (2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3):253-263; Muyldermans S, (2001) J Biotechnol 74(4):277-302; 미국 특허 제6,005,079호; 및 제WO94/04678호, 제WO94/25591호 및 제WO01/44301호]을 참조한다.
또한, 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체는 차례로 당업계의 숙련가들에게 잘 알려진 기술을 사용하여 항원을 "모방"하는 항-이디오타입 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Greenspan NS & Bona CA (1989) FASEB J 7(5):437-444; and Nissinoff A (1991) J Immunol 147(8):2429-2438]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체와 동일한 관심 항원(예를 들어, 인간 SH3YL1)의 에피토프에 결합하는 본원에 기재된 항체는 인간 항체이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 중 임의의 하나가 SH3YL1(예를 들어, 인간 SH3YL1)에 결합하는 것을 경쟁적으로 (예를 들어, 용량 의존적 방식으로) 차단하는 본원에 기재된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 유전자이식 마우스가 사용될 수 있다. 특히, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 마우스 배아 줄기 세포 내로 랜덤하게 또는 상동 재조합에 의해 도입될 수 있다. 대안적으로, 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역은 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 이외에 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동성 재조합에 의해 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 별도로 또는 동시에 기능하지 않게 될 수 있다. 특히, JH 영역의 동형접합체 결실은 내인성 항체 생산을 방지한다. 변형된 배아 줄기 세포를 확장시키고 배반포에 미세주입하여 키메라 마우스를 생산한다. 그후 키메라 마우스를 사육하여 인간 항체를 발현하는 동형접합체 자손을 생산한다. 유전자이식 마우스를 선택된 항원, 예를 들어, 항원의 전부 또는 일부로 통상의 방식으로 면역화시킨다. 항원에 대해 지시된 단클론 항체는 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된 유전자이식 마우스로부터 수득할 수 있다. 유전자이식 마우스에 의해 보유된 인간 면역글로불린 이식유전자는 B 세포 분화 동안 재배열되고, 이어서 클래스 전환 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산할 수 있다. 인간 항체를 생산하기 위한 이러한 기술의 개요에 대해서는, 문헌[Lonberg N & Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13:65-93]을 참조한다. 인간 항체 및 인간 단클론 항체를 생산하기 위한 이러한 기술 및 이러한 항체를 생산하기 위한 프로토콜에 대한 상세한 논의를 위해, 예를 들어 제WO98/24893, 제WO96/34096호 및 제WO96/33735호; 및 미국 특허 제5,413,923호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,569,825호, 제5,661,016호, 제5,545,806호, 제5,814,318호 및 제5,939,598호를 참조한다. 인간 항체를 생산할 수 있는 마우스의 예는 XenomouseTM(Abgenix, Inc.; 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,184호), HuAb-MouseTM(Mederex, Inc./Gen Pharm; 미국 특허 제5,545,806호 및 제5,569,825호), Trans Chromo MouseTM(Kirin) 및 KM MouseTM(Medarex/Kirin)를 포함한다.
항원에 특이적으로 결합하는 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하여 상술한 파지 디스플레이 방법을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한 미국 특허 제4,444,887호, 제4,716,111호, 및 제5,885,793호; 및 제WO98/46645호, 제WO98/50433호, 제WO98/24893호, 제WO98/16654호, 제WO96/34096호, 제WO96/33735호, 및 제WO91/10741호를 참조한다.
일부 실시양태에서, 인간 항체는 마우스-인간 하이브리도마를 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 엡스타인-바 바이러스(EBV)로 형질전환된 인간 말초 혈액 림프구는 마우스 골수종 세포와 융합되어 인간 단클론 항체를 분비하는 마우스-인간 하이브리도마를 생성할 수 있으며, 이러한 마우스-인간 하이브리도마를 스크리닝하여 표적 항원에 면역특이적으로 결합하는 인간 단클론 항체를 분비하는 것을 결정할 수 있다. 이러한 방법은 공지되어 있으며 당업계에 기재되어 있다(예를 들어, 참조; Shinmoto H 외., (2004) Cytotechnology 46:19-23; Naganawa Y 외., (2005) Human Antibodies 14:27-31].
폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 세포
본원에는 본원에 개시된 항체의 중쇄 가변 영역 또는 중쇄를 암호화하는 단리된 핵산 분자가 개시되어 있다. 본원에는 본원에 개시된 항체의 경쇄 가변 영역 또는 경쇄를 암호화하는 단리된 핵산 분자가 개시되어 있다.
본원에는 본원에 개시된 항체의 중쇄 가변 영역 또는 중쇄 및 본원에 개시된 항체의 경쇄 가변 영역 또는 경쇄를 암호화하는 단리된 핵산 분자가 개시되어 있다.
본원에는 서열 번호 1 또는 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 단리된 핵산 분자가 개시되어 있다. 본원에는 서열 번호 3 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 분자를 추가로 포함하는 단리된 핵산 분자가 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 3 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 암호화한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 31, 35, 39, 43, 47, 51, 또는 55의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 암호화한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 33, 37, 41, 45, 49, 53, 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 암호화한다.
또한 본원에 개시된 핵산 분자를 포함하는 단리된 벡터가 개시되어 있다. 본원에 개시된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포가 추가로 개시된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 효모, CHO, YB/20, NS0, PER-C6, HEK-293T, NIH-3T3, HeLa, BHK, Hep G2, SP2/0, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 조직 배양물 중 인간 세포이다.
본원에는 본원에 개시된 핵산 분자가 발현되고 항체가 생성되도록 본원에 개시된 숙주 세포를 배양함을 포함하여 인간 SH3YL1에 결합하는 항체를 생산하는 방법이 개시되어 있다.
특정 측면에서, 본원에는 항원에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 가변 경쇄 영역 및/또는 가변 중쇄 영역)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 벡터, 예를 들어 숙주 세포에서 재조합 발현을 위한 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(예를 들어, 대장균 및 포유동물 세포)가 제공된다. 본원에는 본원에 제공된 임의의 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 이러한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 예를 들어 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 세포에서 이들의 효율적인 발현을 위한 발현 벡터가 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, "단리된" 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 공급원(예를 들어, 마우스 또는 인간)에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리되는 것이다. 더욱이, cDNA 분자와 같은 "단리된" 핵산 분자는 재조합 기술에 의해 제조될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없을 수 있거나, 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 예를 들어, 언어 "실질적으로 없는"은 약 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만(특히 약 10% 미만)의 다른 물질, 예를 들어, 세포 물질, 배양 배지, 다른 핵산 분자, 화학적 전구체 및/또는 다른 화학물질을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자의 제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체를 암호화하는 핵산 분자(들)는 단리 또는 정제된다.
특정 측면에서, 본원에는 항원 폴리펩티드(예를 들어, 인간 SH3YL1)에 면역특이적으로 결합하고 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 항체 뿐만 아니라 (예를 들어, 용량 의존적 방식으로) 항원 폴리펩티드에 결합하기 위해 이러한 항체와 경쟁하거나 이러한 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
특정 측면에서, 본원에는 본원에 기재된 항체의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 항체의 VL FR 및 CDR을 포함하는 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 항체의 VH FR 및 CDR을 포함하는 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에는 본원에 기재된 인간 SH3YL1에 대한 항체의 예를 들어 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 함유하는 3개의 VH 쇄 CDR 및 본원에 기재된 인간 SH3YL1에 대한 항체의 예를 들어 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 함유하는 3개의 VH 쇄 CDR을 포함하는 Fab을 포함하는 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
특정 실시양태에서, 본원에는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 3 또는 7)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 본원에 제공된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 항체는 SH3YL1(예를 들어, 인간 SH3YL1)에 면역특이적으로 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 1 또는 5)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 본원에 제공된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 항체는 SH3YL1(예를 들어, 인간 SH3YL1)에 면역특이적으로 결합한다.
특정 측면에서, 본원에는 경쇄 및 중쇄, 예를 들어, 분리된 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 경쇄와 관련하여, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드는 카파 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드는 람다 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드는 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄를 포함하는 본원에 기재된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드는 SH3YL1(예를 들어, 인간 SH3YL1)에 면역특이적으로 결합하는 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 항체는 경쇄를 포함하고, VL 도메인의 아미노산 서열은 서열 번호 3 또는 7에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 경쇄의 불변 영역은 인간 카파 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 인간 불변 영역 서열은 미국 특허 제5,693,780호에 기재된 것일 수 있다.
또한, 본원에는 예를 들어 코돈/RNA 최적화, 이종 신호 서열로의 치환, 및 mRNA 불안정성 요소의 제거에 의해 최적화된 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. mRNA 내에 코돈 변화를 도입하고/하거나 억제 영역을 제거함으로써 재조합 발현을 위해 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 경쇄, 중쇄, VH 도메인, 또는 VL 도메인)을 암호화하는 최적화된 핵산을 생성하는 방법은 이에 따라, 예를 들어, 미국 특허 제5,965,726호; 제6,174,666호; 제6,291,664호; 제6,414,132호; 및 제6,794,498호에 기재된 최적화 방법을 채택함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, RNA 내의 잠재적 스플라이스 부위 및 불안정성 요소(예를 들어, A/T 또는 A/U 풍부 요소)는 핵산 서열에 의해 암호화되는 아미노산을 변경하지 않고서 돌연변이되어 재조합 발현을 위한 RNA의 안정성을 증가시킬 수 있다. 변경은 예를 들어 동일한 아미노산에 대한 대체 코돈을 사용한 유전 암호의 축퇴를 이용한다. 일부 실시양태에서, 보존적 돌연변이, 예를 들어, 본래의 아미노산과 유사한 화학 구조 및 특성 및/또는 기능을 갖는 유사한 아미노산을 암호화하도록 하나 이상의 코돈을 변경하는 것이 바람직할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편(예를 들어, VL 도메인 또는 VH 도메인)을 암호화하는 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편(예를 들어, VL 도메인 또는 VH 도메인)을 암호화하는 최적화되지 않은 폴리뉴클레오티드 서열의 안티센스(예를 들어, 상보적) 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 단편을 암호화하는 최적화된 뉴클레오티드 서열은 높은 엄격성 조건하에서 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 최적화되지 않은 폴리뉴클레오티드 서열의 안티센스 폴리뉴클레오티드에 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 최적화된 뉴클레오티드 서열은 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 최적화되지 않은 뉴클레오티드 서열의 안티센스 폴리뉴클레오티드에 높은 엄격성, 중간 또는 더 낮은 엄격성 혼성화 조건하에서 혼성화한다. 혼성화 조건에 관한 정보가 기재되었으며, 예를 들어 본원에 참고로 포함된 미국 제2005/0048549호(예를 들어, 단락 72-73)을 참조한다.
폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있고 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 결정될 수 있다. 본원에 기재된 항체 및 이들 항체의 변형된 버전을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있으며, 즉 특정 아미노산을 암호화하는 것으로 알려진 뉴클레오티드 코돈은 항체를 암호화하는 핵산을 생성하도록 하는 방식으로 조립된다. 항체를 암호화하는 이러한 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있으며(예를 들어, 문헌[Kutmeier G 외., (1994), BioTechniques 17:242-246]에 기재되어 있음), 이는 간략하게, 항체를 암호화하는 서열의 일부를 함유하는 중첩된 올리고뉴클레오티드의 합성, 이들 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게이션에 이은 PCR에 의한 라이게이션된 올리고뉴클레오티드의 증폭을 포함한다.
대안적으로, 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법(예를 들어, PCR 및 다른 분자 클로닝 방법)을 사용하여 적합한 공급원(예를 들어, 하이브리도마)으로부터의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 공지된 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화 가능한 합성 프라이머를 사용하는 PCR 증폭은 관심 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 수득된 게놈 DNA를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 PCR 증폭 방법은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 수득하는데 사용될 수 있다. 이러한 PCR 증폭 방법은 항체의 가변 경쇄 영역 및/또는 가변 중쇄 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 수득하는데 사용될 수 있다. 증폭된 핵산은 숙주 세포에서의 발현 및 추가 클로닝을 위해, 예를 들어, 키메라 및 인간화 항체를 생성하기 위해 벡터로 클로닝될 수 있다.
특정 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 함유하는 클론이 이용가능하지 않지만, 항체 분자 또는 이의 단편의 서열이 공지되어 있는 경우, 면역글로불린 또는 단편을 암호화하는 핵산은 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화할 수 있는 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해 또는 예를 들어 항체를 암호화하는 cDNA 라이브러리로부터 cDNA 클론을 확인하기 위해 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 클로닝에 의해 화학적으로 합성되거나 적합한 공급원(예를 들어, 본원에 기술된 항체를 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포와 같이 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포로부터 단리된 핵산, 예를 들어 폴리 A+ RNA로부터 생성된 항체 cDNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리)으로부터 수득될 수 있다. 그후, PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 당업계에 잘 알려진 임의의 방법을 사용하여 복제 가능한 클로닝 벡터로 클로닝될 수 있다.
본원에 기재된 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리 및 서열분석될 수 있다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로서 작용할 수 있다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터에 넣은 다음 숙주 세포, 예를 들어 대장균 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포(예를 들어, CHO GS 시스템™(Lonza)로부터의 CHO 세포) 또는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 항체의 합성을 수득할 수 있다.
항체를 생성하기 위해, VH 또는 VL 뉴클레오티드 서열, 제한 부위, 및 제한 부위를 보호하기 위한 플랭킹 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 사용하여 scFv 클론에서 VH 또는 VL 서열을 증폭시킬 수 있다. 당업계의 숙련가들에게 공지된 클로닝 기술을 이용하여, PCR 증폭된 VH 도메인은 중쇄 불변 영역, 예를 들어, 인간 감마 4 불변 영역을 발현하는 벡터로 클로닝될 수 있고, PCR 증폭된 VL 도메인은 경쇄 불변 영역, 예를 들어, 인간 카파 또는 람다 불변 영역을 발현하는 벡터로 클로닝될 수 있다. 특정 실시양태에서, VH 또는 VL 도메인을 발현하기 위한 벡터는 EF-1α 프로모터, 분비 신호, 가변 도메인에 대한 클로닝 부위, 불변 도메인, 및 선택 마커, 예를 들어 네오마이신을 포함한다. VH 및 VL 도메인은 또한 필요한 불변 영역을 발현하는 하나의 벡터로 클로닝될 수 있다. 그후 중쇄 전환 벡터 및 경쇄 전환 벡터를 세포주로 공동-형질감염시켜 당업계의 숙련가들에게 공지된 기술을 사용하여 전장 항체, 예를 들어 IgG를 발현하는 안정한 또는 일시적 세포주를 생성한다.
DNA는 또한, 예를 들어, 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써, 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형될 수 있다.
또한 높은 엄격성, 중간 또는 더 낮은 엄격성 혼성화 조건하에서 본원에 기재된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 높은 엄격성, 중간 또는 더 낮은 엄격성 혼성화 조건하에서 본원에 제공된 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화한다.
혼성화 조건은 당업계에 기술되었으며, 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들어, 엄격한 조건하에서의 혼성화는 약 45℃에서 6x 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에서 필터-결합된 DNA로의 혼성화에 이은 약 50-65℃에서 0.2xSSC/0.1% SDS로 한 번 이상 세척을 포함할 수 있고; 매우 엄격한 조건하에서의 혼성화는 약 45℃에서 6xSSC에서 필터-결합된 핵산으로의 혼성화에 이은 약 68℃에서 0.1xSSC/0.2% SDS로 한 번 이상 세척을 포함할 수 있다. 다른 엄격한 혼성화 조건하에서의 혼성화는 당업계의 숙련가들에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Ausubel FM 외., eds., (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York at pages 6.3.1-6.3.6 and 2.10.3]에 참고로 기재되었다.
다른 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 번호 2 또는 6에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 4 또는 8에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 번호 32, 36, 40, 44, 48, 52, 또는 56에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 34, 38, 42, 46, 50, 54, 또는 58에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 1에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열 번호 3에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 암호화한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 5에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 암호화한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 1, 5, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 또는 55에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열 번호 3, 7, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 또는 57에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 각각 또는 이들의 임의의 조합으로 암호화한다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 임의의 유형의 세포, 예를 들어, 일차 세포, 배양물 중의 세포, 또는 세포주로부터의 세포일 수 있다. 실시양태에서, 용어 "숙주 세포"는 핵산 분자로 형질감염된 세포 및 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭한다. 이러한 세포의 자손은, 예를 들어, 후속 세대에서 발생할 수 있는 돌연변이 또는 환경적 영향 또는 숙주 세포 게놈 내로의 핵산 분자의 통합으로 인해, 핵산 분자로 형질감염된 모 세포와 동일할 수 없다.
특정 측면에서, 본원에는 SH3YL1(예를 들어, 인간 SH3YL1)에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체를 (예를 들어, 재조합적으로) 발현하는 세포(예를 들어, 숙주 세포) 및 관련 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터가 제공된다. 본원에는 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 세포에서 재조합 발현을 위한 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 또한 본원에는 본원에 기재된 항체(예를 들어, 인간 또는 인간화 항체)를 재조합적으로 발현하기 위한 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 또한, 본원에는 숙주 세포에서 이러한 항체를 발현시킴을 포함하여, 본원에 기재된 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 본원에 기재된 항체의 중쇄 또는 경쇄)의 재조합 발현은 항체 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 작제를 수반한다. 일단 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 항체 분자의 생산을 위한 벡터를 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하는 재조합 DNA 기술에 의해 생산할 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 경쇄 또는 중쇄)을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현함으로써 단백질을 제조하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 당업계의 숙련가들에게 잘 알려진 방법이 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 경쇄 또는 중쇄) 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 조절 신호를 함유하는 발현 벡터를 작제하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 또한 본원에 기재된 항체 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 항체의 중쇄 또는 경쇄, 항체 또는 이의 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 또는 프로모터에 작동가능하게 연결된 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함하는 복제가능한 벡터가 제공된다. 이러한 벡터는 예를 들어 항체 분자의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며(예를 들어, 제WO86/05807호 및 제WO89/01036호; 및 미국 특허 제5,122,464호 참조), 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄, 전체 경쇄, 또는 전체 중쇄와 경쇄 둘 다의 발현을 위해 이러한 벡터로 클로닝될 수 있다.
발현 벡터는 통상적인 기술에 의해 세포(예를 들어, 숙주 세포)로 전사될 수 있으며, 그후 생성된 세포는 통상적인 기술에 의해 배양되어 본원에 기재된 항체를 생산할 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 기재된 항체 분자를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심있는 코딩 서열이 생성되고 후속적으로 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염될 때, 제자리에서 본원에 기재된 항체 분자를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예를 들어, 대장균 및 바실러스 서브틸리스)와 같은 미생물; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스 피키아); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바쿨로바이러스)에 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템(예를 들어, 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)와 같은 녹조류); 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 작제물을 보유하는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS(예를 들어, COS1 또는 COS), CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa, 및 NIH 3T3, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20 및 BMT10 세포)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체(예를 들어, 항체 pab1949 또는 pab2044 중 어느 하나의 CDR을 포함하는 항체)를 발현하기 위한 세포는 CHO 세포, 예를 들어 CHO GS System™(Lonza)으로부터의 CHO 세포이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체를 발현하기 위한 세포는 인간 세포, 예를 들어, 인간 세포주이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 발현 벡터는 pOptiVEC™ 또는 pcDNA3.3이다. 일부 실시양태에서, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위해, 박테리아 세포, 예를 들어 대장균, 또는 진핵 세포(예를 들어, 포유동물 세포)가, 재조합 항체 분자의 발현을 위해 사용된다. 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중간 초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다(Foecking MK & Hofstetter H (1986) Gene 45:101-105; 및 Cockett MI 외., (1990) Biotechnology 8:662-667). 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 CHO 세포 또는 NS0 세포에 의해 생산된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현은 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
박테리아 시스템에서, 다수의 발현 벡터는 발현되는 항체 분자에 대한 의도된 용도에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 다량의 이러한 항체를 제조하고자 할 때, 항체 분자의 약제학적 조성물의 생성을 위해, 용이하게 정제되는 높은 수준의 융합 단백질 생성물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는 대장균 발현 벡터 pUR278(Ruether U & Mueller-Hill B (1983) EMBO J 2:1791-1794)을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 여기서 항체 코딩 서열은 융합 단백질이 생산되도록 lac Z 코딩 영역을 갖는 프레임 내의 벡터; pIN 벡터(Inouye S & Inouye M (1985) Nuc Acids Res 13:3101-3109; Van Heeke G & Schuster SM (1989) J Biol Chem 24:5503-5509); 등에 개별적으로 라이게이션될 수 있다. 예를 들어, pGEX 벡터는 또한 글루타티온 5-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 용해성이고, 매트릭스 글루타티온 아가로스 비드에 흡착 및 결합시킨 다음 유리 글루타티온의 존재하에 용리시킴으로써 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 산물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계된다.
곤충 시스템에서는, 예를 들어, 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 다면체 바이러스(AcNPV)가 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 사용될 수 있다. 바이러스는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 코딩 서열은 바이러스의 비필수 영역(예를 들어 다면체 유전자)에 개별적으로 클로닝되고 AcNPV 프로모터(예를 들어 다면체 프로모터)의 제어하에 있을 수 있다.
포유동물 숙주 세포에서는, 다수의 바이러스-기반 발현 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 관심있는 항체 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예를 들어, 후기 프로모터 및 삼자 리더 서열에 라이게이션될 수 있다. 그후 이러한 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역(예를 들어, 영역 El 또는 E3)에 삽입하는 것은 생존가능하고 감염된 숙주에서 항체 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 초래할 것이다(예를 들어, 참조; Logan J & Shenk T (1984) PNAS 81:3655-3659). 특정 개시 신호가 또한 삽입된 항체 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 필요할 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 원하는 코딩 서열의 판독 프레임과 일치해야 한다. 이러한 외인성 번역 조절 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 다양한 기원일 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 증강제 요소, 전사 종결제 등을 포함시킴으로써 향상될 수 있다(예를 들어, 참조; Bitter G 외., (1987) Methods Enzymol 153:516-544).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 원하는 특정 방식으로 유전자 산물을 변형 및 처리하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 처리(예를 들어, 절단)는 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 산물의 번역-후 처리 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 메커니즘을 갖는다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 처리를 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이를 위해, 유전자 산물의 1차 전사체의 적절한 처리, 글리코실화 및 인산화를 위한 세포 기계를 소유하는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포는 CHO, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0(임의의 면역글로불린 쇄를 내인적으로 생성하지 않는 뮤린 골수종 세포주), CRL7O3O, COS(예를 들어, COS1 또는 COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10 및 HsS78Bst 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체(예를 들어, CDR을 포함하는 항체)는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포에서 생산된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 푸코스 함량이 감소하거나 푸코스 함량이 없다. 이러한 항체는 당업계의 숙련가에게 공지된 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체는 푸코실화하는 능력이 결핍되거나 결여된 세포에서 발현될 수 있다. 특정 예에서, α1,6-푸코실트랜스퍼라제의 두 대립유전자의 녹아웃을 갖는 세포주를 사용하여 푸코스 함량이 감소된 항체를 생산할 수 있다. Potelligent® 시스템(Lonza)은 푸코스 함량이 감소된 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 이러한 시스템의 예이다.
재조합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위해, 안정한 발현 세포를 생성할 수 있다. 예를 들어, 항체를 안정적으로 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 세포는 본원에 기재된 항체(예를 들어, CDR을 포함하는 항체)를 형성하기 위해 회합하는 경쇄/경쇄 가변 도메인 및 중쇄/중쇄 가변 도메인을 안정적으로 발현한다.
특정 측면에서, 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기 보다는, 숙주 세포는 적절한 발현 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결제, 폴리아데닐화 부위 등), 및 선택가능한 마커에 의해 조절되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA/폴리뉴클레오티드의 도입 후, 조작된 세포는 농축 배지에서 1-2일 동안 성장한 다음 선택적 배지로 전환될 수 있다. 재조합 플라스미드에서 선택 가능한 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고 세포가 플라스미드를 이들의 염색체에 안정적으로 통합하고 성장하여 세포주로 복제 및 확장될 수 있는 병소를 형성하게 한다. 이 방법은 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편을 발현하는 세포주를 조작하는데 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 항체 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 조성물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(Wigler M 외., (1977) Cell 11(1):223-232), 하이포크산틴구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska EH & Szybalski W (1962) PNAS 48(12):2026-2034) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Lowy I 외., (1980) Cell 22(3):817-823) 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 선택 시스템이 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 사용될 수 있다. 또한, 항대사산물 내성이 다음 유전자에 대한 선택의 기초로서 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler M 외., (1980) PNAS 77(6):3567-3570; O'Hare K 외., (1981) PNAS 78:1527-1531); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan RC & Berg P (1981) PNAS 78(4):2072-2076); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Wu GY & Wu CH (1991) Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev P (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32:573-596; Mulligan RC (1993) Science 260:926-932; and Morgan RA & Anderson WF (1993) Ann Rev Biochem 62:191-217; Nabel GJ & Felgner PL (1993) Trends Biotechnol 11(5):211-215); 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre RF 외., (1984) Gene 30(1-3):147-156). 재조합 DNA 기술의 당업계에 통상적으로 공지된 방법은 원하는 재조합 클론을 선택하기 위해 일상적으로 적용될 수 있으며 이러한 방법은, 예를 들어, 전문이 본원에 참고로 포함된 문헌[Ausubel FM 외., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler M, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); and in Chapters 12 and 13, Dracopoli NC 외., (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colbere-Garapin F 외., (1981) J Mol Biol 150:1-14]에 기재되어 있다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(검토를 위해, 참조; Bebbington CR & Hentschel CCG, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)). 항체를 발현하는 벡터 시스템 내의 마커가 증폭 가능한 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제의 수준의 증가는 마커 유전자의 카피 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역이 항체 유전자와 관련되어 있기 때문에, 항체 생산도 증가할 것이다(Crouse GF 외., (1983) Mol Cell Biol 3:257-66).
숙주 세포는 본원에 기재된 2개 이상의 발현 벡터, 즉 중쇄 유래 폴리펩티드를 암호화하는 제1 벡터 및 경쇄 유래 폴리펩티드를 암호화하는 제2 벡터로 공동-형질감염될 수 있다. 2개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택 가능한 마커를 함유할 수 있다. 숙주 세포는 상이한 양의 2개 이상의 발현 벡터로 공동-형질감염될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 제1 발현 벡터 및 제2 발현 벡터의 하기 비율 중 어느 하나로 형질감염될 수 있다: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 또는 1:50.
대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다를 암호화하고 발현할 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 상황에서, 경쇄는 과량의 독성 유리 중쇄를 피하기 위해 중쇄 앞에 위치되어야 한다(Proudfoot NJ (1986) Nature 322:562-565; 및 Kohler G (1980) PNAS 77:2197-2199). 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 단일시스트론성 또는 다중시스트론성일 수 있다. 다중시스트론성 핵산 작제물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상, 또는 2-5, 5-10 또는 10-20개의 범위의 유전자/뉴클레오티드 서열을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 이중시스트론성 핵산 작제물은 다음 순서로 프로모터, 제1 유전자(예를 들어, 본원에 기재된 항체의 중쇄), 및 제2 유전자(예를 들어, 본원에 기재된 항체의 경쇄)를 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터에서, 두 유전자의 전사는 프로모터에 의해 구동될 수 있는 반면, 제1 유전자로부터의 mRNA의 번역은 캡-의존적 스캐닝 메커니즘에 의해 이루어질 수 있고, 제2 유전자로부터의 mRNA의 번역은 캡-비의존적 메커니즘에 의해, 예를 들어, IRES에 의해 이루어질 수 있다.
벡터는 SH3YL1에 결합하는 항원 결합 단편(Fab)을 암호화하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.
일단 본원에 기재된 항체 분자가 재조합 발현에 의해 생성되면, 이것은 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 후 특정 항원에 대한 친화도, 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도, 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 항체는 정제를 용이하게 하기 위해 본원에 기재되거나 달리 당업계에 공지된 이종성 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 단클론 항체는 단리되거나 정제된다. 일반적으로, 단리된 항체는 단리된 항체와는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 제제는 세포 물질 및/또는 화학적 전구체가 실질적으로 없다. 언어 "세포 물질이 실질적으로 없는"은 항체가 단리되거나 재조합적으로 생산되는 세포의 세포 성분으로부터 분리된 항체의 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 없는 항체는 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% (건조 중량 기준) 미만의 이종 단백질(본원에서 "오염 단백질"로도 지칭됨)을 갖는 항체의 제제 및/또는 항체의 변이체, 예를 들어 항체의 상이한 번역후 변형된 형태를 포함한다. 항체 또는 단편이 재조합적으로 생산되는 경우, 이것은 또한 일반적으로 배양 배지가 실질적으로 없으며, 즉, 배양 배지는 단백질 제제의 용적의 약 20%, 10%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만을 나타낸다. 항체 또는 단편이 화학적 합성에 의해 생산되는 경우, 이것은 일반적으로 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없으며, 즉, 이것은 단백질의 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된다. 따라서, 항체 또는 단편의 이러한 제제는 관심있는 항체 또는 단편 이외의 화학적 전구체 또는 화합물을 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만(건조 중량 기준)으로 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 단리되거나 정제된다.
조성물
본원에는 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 중에 원하는 정도의 순도를 갖는 본원에 기재된 항체를 포함하는 조성물이 제공된다(Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA). 또한 본원에는 본원에 기재된 항체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 개시되어 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 대상체에게 투여된 후 활성 성분의 속방출, 서방출 또는 지연 방출을 제공할 수 있고, 당업계의 숙련가들에게 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 환제, 산제, 향낭, 엘릭서, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사 가능한 용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 크실리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 검, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광유이다. 또한, 제형은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 선호제, 유화제, 보존제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 항체의 활성을 증강, 유도 또는 활성화시키고 질환 또는 병태, 예를 들어 자가면역 병태 또는 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 항체 및 부형제, 예를 들어, PBS 또는 물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 예를 들어 복강내 또는 정맥내 주사에 의한 주사에 적합하다. 일부 실시양태에서, 항체를 포함하는 조성물은 1주당 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 50 mg/kg, 1 mg/kg 내지 50 mg/kg, 5 mg/kg 내지 25 mg/kg, 10 mg/kg 내지 20 mg/kg 체중, 또는 그 안의 임의의 범위의 양으로 투여될 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 조성물은 멸균될 수 있다. 이는 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
사용 및 방법
본원에는 본원에 개시된 항체, 본원에 개시된 핵산 분자, 본원에 개시된 벡터, 또는 본원에 개시된 숙주 세포, 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여함을 포함하여 대상체, 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법이 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체의 면역 반응을 증강 또는 유도한다.
본원에는 본원에 개시된 항체, 본원에 개시된 핵산 분자, 본원에 개시된 벡터, 또는 본원에 개시된 숙주 세포, 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여함을 포함하여 대상체, 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에서 당뇨병성 신증을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 본원에는 본원에 개시된 항체, 본원에 개시된 핵산 분자, 본원에 개시된 벡터, 또는 본원에 개시된 숙주 세포, 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여함을 포함하여 대상체, 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에서 신장 섬유증을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 또는 항체는 대상체에서 신장의 염증을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 또는 항체는 뇨에서 알부민 분비를 감소시키고, 알부민 대 크레아티닌의 비를 감소시키고/시키거나 혈관간막 확장을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 로사르탄을 투여함을 추가로 포함한다.
본원에는 본원에 개시된 항체, 본원에 개시된 핵산 분자, 본원에 개시된 벡터, 또는 본원에 개시된 숙주 세포, 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여함을 포함하여 대상체, 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에서 비알콜성 지방증 간염을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 본원에는 본원에 개시된 항체, 본원에 개시된 핵산 분자, 본원에 개시된 벡터, 또는 본원에 개시된 숙주 세포, 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여함을 포함하여 대상체, 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에서 간 섬유증을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 또는 항체는 대상체에서 간의 염증을 감소시킬 수 있다.
급성 신장 손상(AKI)은 신장 배설 기능의 급속한 손실을 특징으로 하는 임상 증후군으로서 정의되며 전형적으로 질소 대사의 최종 생성물(우레아 및 크레아티닌) 축적에 의해 진단된다(1). 이것은 병원에 입원한 환자(모든 입원의 10%-15%)(2) 및 유병률이 때때로 50%를 초과할 수 있는 중환자실(ICU) 환자에서 중요한 합병증이다(3, 4). AKI는 신장 질환 전체 계획 AKI 지침에 요약된 바와 같이 위험, 부상, 부전, 손실 및 말기 신장 질환 (RIFLE)으로 알려진 분류 시스템에 따라 분류된다(5). AKI의 원인은 전통적으로 탈수, 출혈성 쇼크, 사구체신염 및 급성 중독으로 간주되며 최근에는 다른 질환에 의해 유발되는 것으로 또한 믿어진다(4). 신장은 다양한 화학 제제의 독성 효과에 대한 주요 표적이므로 약물-유도된 AKI는 임상 의학에서 빈번한 실체이다. 시스플라틴(시스-디아민디클로로플라튬(II), CDDP)은 특히 고형 악성 종양에서 널리 사용되는 항암제이다. 시스플라틴의 사용은 종종 신독성을 포함한 다수의 중요한 부작용에 의해 제한된다(7, 9). 시스플라틴-기반 치료를 받는 암 환자의 생존율을 높이기 위해서는 시스플라틴-유도된 AKI를 예방하는 것이 중요하다.
본원에는 본원에 개시된 항체, 본원에 개시된 핵산 분자, 본원에 개시된 벡터, 또는 본원에 개시된 숙주 세포, 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여함을 포함하여 대상체, 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에서 급성 신장 손상을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 또는 항체는 신장 손상 마커를 감소시키고, 신장 기능장애를 억제하고, 전염증성 사이토카인 생산을 약화시키고, 관형 세포 손상을 약화시키고/시키거나 신장 손상으로부터 보호할 수 있다.
궤양성 결장염(ulcerative colitis, UC) 및 크론병(Crohn 's disease, CD)을 포함한 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD)은 점막 완전성의 상실, 면역 세포의 침윤, 심한 염증 및 혈리(bloody diarrhea)를 특징으로 하는 만성 염증성 질환이다(1-3). 아미노살리실레이트 및 코르티코스테로이드를 포함하는 항염증제가 IBD에 대한 통상적인 치료제이다. 최근에, 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터루킨(IL)-12/23 또는 인테그린에 대한 단클론 항체를 포함한 생물학적 요법이 있다(1). 생물학적 요법이 수술 및 입원을 포함한 질환-관련 합병증의 위험을 감소시켰지만, 대부분의 환자(재발을 포함하여 최대 60%)는 치료에 반응하지 않았다. 이러한 임상 관찰은 IBD 관리를 위한 새로운 치료 표적을 시사한다.
본원에는 본원에 개시된 항체, 본원에 개시된 핵산 분자, 본원에 개시된 벡터, 또는 본원에 개시된 숙주 세포, 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여함을 포함하여 대상체, 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에서 염증성 장 질환을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 또는 항체는 점막층의 감소를 억제할 수 있다.
또한 본원에는 본원에 개시된 항체의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여함을 포함하여 대상체, 예를 들어 이를 필요로 하는 대상체에서 신장 질환, 당뇨병 합병증, 비알코올성 지방증 간염(non-alcoholic steatosis hepatitis), 및/또는 간 섬유증(liver fibrosis)을 치료하는 방법이 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 신장 질환은 급성 손상, ESKD, 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy, DN), 진성당뇨병성 신증(diabetes mellitus nephropathy, DMN), IgA 신염(IgA nephritis, IgAN), HIV-관련 신증, 비-당뇨병성 만성 신장 질환, 국소 분절성 사구체 경화증(focal segmental glomerulosclerosis, FSGS), 최소 변화 신증후군(minimal change nephrotic syndrome, MCD), 또는 크산틴 옥시다제 결핍증(xanthine oxidase deficiency)이다. 일부 실시양태에서, 당뇨병성 합병증은 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 당뇨병성 족부 궤양(diabetic foot ulcer), 또는 당뇨병성 신경병증성 통증(diabetic neuropathic pain)이다.
본원에 사용된 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환 가능하게 사용된다. 대상체는 치료를 필요로 할 수 있다. 대상체는 동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 비영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이 또는 인간), 또는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 시노몰구스 원숭이이다. 특정 실시양태에서, 이러한 용어는 비인간 동물(예를 들어, 돼지, 말, 소, 고양이, 또는 개와 같은 비인간 동물)을 의미한다. 일부 실시양태에서, 이러한 용어는 애완 동물 또는 농장 동물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 이러한 용어는 인간을 지칭한다.
본원에는 샘플을 본원에 개시된 항체와 접촉시킴을 포함하여 샘플에서 SH3YL1을 검출하는 방법이 개시되어 있다.
일부 측면에서, 본원에는 본원에 기재된 항체 또는 이의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여 대상체, 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에서 하나 이상의 면역 기능 또는 반응을 조절하는 방법이 개시되어 있다. 본원에는 항체 또는 이의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여 대상체, 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에서 하나 이상의 면역 기능 또는 반응을 활성화, 증강 또는 유도하는 방법이 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에는 본원에 기재된 항체 또는 이의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여 하나 이상의 면역 기능 또는 반응을 활성화 또는 증강시키는 것이 바람직한 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법이 제시되어 있다. 특정 실시양태에서, 본원에는 항체 또는 이의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여 자가면역 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 제시되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 당업계에 잘 알려진 검정, 예를 들어 ELISPOT, ELISA, 및 세포 증식 검정을 사용하여, 본원에 기재된 항체를 투여하지 않은 대상체의 면역 기능에 비해 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 45%, 적어도 35%, 적어도 30%, 적어도 25%, 적어도 20%, 또는 적어도 10%, 또는 10% 내지 25%, 25% 내지 50%, 50% 내지 75%, 또는 75% 내지 95%의 범위까지 대상체에서 하나 이상의 면역 기능 또는 반응을 활성화 또는 증강 또는 유도한다.
투여 경로 & 투여량
본 개시내용의 약제학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥내 및 근육내 투여 경로를 포함하는 다양한 투여 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체에 대한 요법의 투여의 맥락에서 용어 "유효량"은 원하는 예방적 또는 치료적 효과를 달성하는 요법의 양을 지칭한다. 병태의 치료 및/또는 예방에 효과적일 항체 또는 조성물의 양은 질환의 성질에 따라 좌우될 것이며 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다.
본 개시내용에 있어서, 실제로 투여되는 항체의 양은 치료하고자 하는 질환, 선택된 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 질환의 중증도, 및 유효성분으로서의 생활성 폴리펩티드의 유형을 포함한 다양한 관련 인자에 비추어 결정된다. 본 개시내용의 항체는 혈액 내에서 매우 우수한 지속성을 갖기 때문에, 본 개시내용의 융합 단백질을 포함하는 펩티드 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
조성물에 사용되는 정확한 투여량은 또한 투여 경로 및 질환의 중증도에 따라 좌우될 것이며, 의사의 판단 및 각 대상체의 상황에 따라 결정되어야 한다. 예를 들어, 유효 용량은 또한 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리적 상태(연령, 체중 및 건강 포함), 환자가 인간인지 동물인지 여부, 투여되는 다른 약물, 또는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지 여부에 따라 달라질 수 있다. 통상적으로, 환자는 인간이지만 유전자이식 포유동물을 포함하는 비인간 포유류도 치료될 수 있다. 치료 투여량은 안전성과 효능을 최적화하기 위해 최적으로 적정된다.
특정 실시양태에서, 시험관내 분석은 최적의 투여량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 사용된다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량 반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
일반적으로, 인간 항체는 외래 폴리펩티드에 대한 면역 반응으로 인해 다른 종으로부터의 항체보다 인체 내에서 더 긴 반감기를 갖는다. 따라서, 인간 항체의 더 낮은 투여량 및 덜 빈번한 투여가 종종 가능하다.
일부 실시양태에서, 조성물은 예를 들어 복강내 또는 정맥내 주사에 의한 주사에 적합하다. 일부 실시양태에서, 항체를 포함하는 조성물은 1주당 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 50 mg/kg, 1 mg/kg 내지 50 mg/kg, 5 mg/kg 내지 25 mg/kg, 10 mg/kg 내지 20 mg/kg 대상체 체중, 또는 그 안의 모든 범위의 양으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 1주당 10mg/kg 체중의 양으로 투여하기에 적합한, 본원에 개시된 항체 및 PBS를 포함한다.
키트
본원에는 본원에 기재된 하나 이상의 항체 또는 이들의 접합체를 포함하는 키트가 제공된다. 본원에는 본원에 개시된 항체, 본원에 개시된 핵산 분자, 본원에 개시된 벡터, 또는 본원에 개시된 숙주 세포, 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물, 및 (a) 검출 시약, (b) SH3YL1 항원, (c) 인간 투여를 위한 사용 또는 판매 승인을 반영하는 통지, 또는 d) 이들의 조합을 포함하는 키트가 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에는 본원에 제공된 하나 이상의 항체와 같은 본원에 기재된 약제학적 조성물의 성분 중 하나 이상으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 약제학적 조성물 및 본원에 기재된 것과 같은 임의의 예방적 또는 치료적 제제를 함유한다. 임의로 이러한 용기(들)와 관련된 것은 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지일 수 있으며, 이 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관의 승인을 반영한다. 또한 본원에는 상기 방법에서 사용될 수 있는 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 용기에 본원에 기재된 항체, 예를 들어 정제된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 키트는 대조군으로서 사용될 수 있는 실질적으로 단리된 항원(들)(예를 들어, 인간 SH3YL1)을 함유한다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 키트는 SH3YL1 항원과 반응하지 않는 조절 항체를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 키트는 SH3YL1 항원에 대한 항체의 결합을 검출하기 위한 하나 이상의 요소를 함유한다(예를 들어, 항체는 형광 화합물, 효소 기질, 방사성 화합물 또는 발광 화합물과 같은 검출 가능한 기질에 접합될 수 있거나, 또는 제1 항체를 인식하는 제2 항체가 검출 가능한 기질에 접합될 수 있다). 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 키트는 재조합적으로 제조되거나 화학적으로 합성된 SH3YL1 항원을 포함할 수 있다. 키트에 제공된 SH3YL1 항원은 또한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전술한 키트의 검출 수단은 SH3YL1 항원이 부착되는 고체 지지체를 포함한다. 이러한 키트는 또한 부착되지 않은 리포터-표지된 항-인간 항체 또는 항-마우스/래트 항체를 포함할 수 있다. SH3YL1 항원에 대한 항체의 결합에 있어서, 상기 리포터-표지된 항체의 결합에 의해 검출될 수 있다.
이하, 본 개시내용은 여러 실시양태 및 첨부된 도면을 참조하여 기재될 것이다. 하기 실시양태들 및 도면들은 단지 예시의 목적으로만 제공되며, 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 개시내용을 제한하기 위한 목적이 아니다.
실시예
실시예 1. 항-SH3YL1 단클론 항체 및 당뇨병성 신증
실시예 1.1. 재료 및 방법
뮤린 혈관간막 세포(MMC)의 제조
신장을 마우스로부터 단리하고, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 (Gibco)을 함유하는 PBS에서 유지하였다. 사구체는 1300 rpm에서 3분 동안 원심분리에 의해 75um 및 63um 체로부터 수집하였다. 단리된 사구체를 배양 접시에 도말하고 20% (v/v) 태아 소 혈청(FBS; 웰진) 및 1% 항생제-항진균 용액(Welgene)이 보충된 저 글루코스 둘베코 개질된 이글 배지(DMEM; Gibco)에서 5% CO2 조건하에 37℃에서 유지하였다. 단리된 사구체는 사구체 혈관간막 세포가 퍼질 때까지 방해받지 않고 그대로 두었다. 그후 세포를 배양 접시에 계대-배양하고 추가 실험에 사용하였다.
마우스 혈관간막 세포주(MES13) 배양
마우스 혈관간막 세포주(MES13)는 ATCC로부터 구입하였다. 세포를 5% FBS 및 1% 항생제-항진균 용액(Welgene)이 보충된 저 글루코스 DMEM(Gibco)에서 5% CO2 조건하에 37℃에서 성장시켰다.
동물
동물의 모든 절차는 이화여자대학교의 윤리적 지침 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되고 수행되었다.
6주령의 수컷 당뇨병 db/db 마우스(BKS.Cg-Dock7 m +/+Lepr db /J)는 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, USA)로부터 구입하였다. SH3YL1 항체(CRB-A4, CRB-E10)의 효과를 조사하기 위해, db/m 및 db/db 마우스(8주령)를 4개의 그룹으로 나누었다: (1) 대조군 db/m 마우스(n=5), (2) 비히클로 처리된 대조군 db/db 마우스(n=5), (3) CRB-A4로 처리된 db/db 마우스(n=5), 및 (4) CRB-E10으로 처리된 db/db 마우스(n=5). 항체를 12주 동안 1주당 10mg/kg의 용량으로 복강내 주사하였다. 체중, 혈당 수준, 뇨 용적은 4주마다 측정하였다. 혈당 수준은 혈당 측정기(glucometer)(Accucheck; Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 측정하였다. 마우스를 뇨 수집을 위해 24시간 동안 대사 케이지에서 개별적으로 분리하였다. 12주 후, 마우스를 희생시키고 추가 분석을 위해 심장 천자로 혈청을 수득하였으며, 신장을 파라핀/냉동 절편 또는 단백질/RNA 분석을 위해 신속하게 절개하였다.
대사 매개변수의 측정
뇨 알부민은 상업용 ELISA(ALPCO, Westlake, OH, USA)를 사용하여 측정하였다. 혈청 및 뇨 크레아티닌 수준은 효소적 비색 분석법(ARBOR ASSAYS, Ann Arbor, MI, USA)으로 결정하였다. 알부민 대 크레아티닌 비율(ACR)은 총 알부민과 뇨 크레아티닌을 사용하여 계산하였다. 크레아티닌 청소율(CCR)을 계산하기 위해 표준 공식을 사용하였다. 혈중 요소 질소(BUN)는 비색 분석 키트(ARBOR ASSAYS, Ann Arbor, MI, USA)로 측정하였다.
MIP2 및 KC ELISA
pMMC를 단리하고 35mm 플레이트(5x105)에서 배양하였다. pMMC를 4시간 동안 혈청 고갈시킨 다음 Flagellin(100ng/ml) 또는 SH3YL1(1ug/ml)과 함께 24시간 동안 배양한 다음 배지를 수집하였다. MIP2 및 KC 단백질 수준은 제조업체의 지침에 따라 ELISA 분석 키트에 의해 결정하였다(R&D systems, Minneapolis, MN, USA).
퍼옥시 오렌지-1에 의한 세포내 H2O2의 측정
융합 세포를 무혈청 배지로 밤새 고갈시켰다. 세포 배양 배지를 교체한 후, 세포를 Dulbecco의 PBS로 세척한 다음 세포를 37℃에서 10분 동안 PBS에서 SH3YL1(1ug/ml) 및 5um PO-1과 함께 배양하였다. 배양 후, 세포를 PBS로 다시 세척한 다음 540nm의 여기 파장에서 레이저 스캐닝 공초점 현미경 LSM 880 에어리스캔(Carl Zeiss vision system)으로 검사하였다. 5개 그룹의 세포를 각 샘플로부터 무작위로 선택하고, 상대 형광 강도를 측정한 다음 각 그룹에 대해 평균을 냈다. 모든 실험은 적어도 3회 반복하였다.
라이브러리 패닝
표적 분자에 대한 라이브러리의 패닝을 위해, 면역튜브(NUNC 470319, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 항원(PBS 중 10 μg/mL)으로 코팅하였다. 튜브를 37℃에서 1시간 동안 코팅하고, 이어서 RT에서 1시간 동안 PBST(0.05% Tween 20을 갖는 PBS, pH 7.4) 중의 3% 탈지유로 튜브를 채워 튜브를 차단하였다. 차단 용액을 제거하고, 파지 라이브러리를 항원-코팅된 면역튜브에 첨가하였다. 그후 튜브를 37℃에서 2시간 동안 진탕하면서 배양하고, 결합되지 않은 파지를 PBST로 3회 세척하였다. 결합된 파지를 RT에서 10분 동안 100mM TEA(트리에탄올아민) 1mL로 용리시키고, 용리된 파지 용액을 500μL의 1M Tris-HCl(pH 7.4)로 중화시켰다. 중화된 파지를 8.5mL 중간-로그 상 ER2537에 적용하고 120rpm에서 진탕하면서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 감염된 ER2537 세포를 2% (w/v) 글루코스를 갖는 암피실린-LB 아가로스 플레이트에 도말하고 37℃에서 밤새 성장시켰다. 다음날, 박테리아를 수확하고 파지 라이브러리를 구제하였다. 표적 펩티드에 특이적인 항체의 농축을 위해 동일한 패닝 단계를 3회 반복하였다(Kim, D.G. 외., Biomolecules 10:820 (2020)).
CHO 세포 배양 및 일시적 형질감염
ExpiCHO 발현 시스템(gibco)을 항체의 발현에 사용하였다. ExpiCHO-S 세포를 37℃ 및 125 rpm에서 가습된 8% CO2 중에서 ExpiCHO 발현 배지(Gibco)에서 배양하였다. 중쇄 및 경쇄는 1:2 비율로 일시적으로 형질감염시켰다. 항체 형질감염은 제조업체의 프로토콜(표준 프로토콜)에 따라 ExpiCHO 발현 시스템 키트(Gibco)를 사용하여 수행하였다.
항체 정제
IgG 항체는 단백질 G 세파로스® 4 패스트플로우(GE Healthcare)를 사용하여 정제하였다. 단백질 G 세파로스를 폴리-프렙 크로마토그래피 컬럼(Bio-rad)에 로딩한 다음 내독소 시험된 DPBS(Gibco)로 세척하였다. 동시에, 형질감염된 CHO 세포를 3000rpm에서 5분 동안 2회 원심분리하여 상청액을 수득하였다. 일시적으로 형질감염된 세포 상청액을 단백질 G 비드 컬럼 상에 로딩한 다음 중력 흐름에 의해 컬럼이 비워지도록 하였다. 그후 컬럼을 PBS(Welgene)로 세척하였다. 세척 단계 후, 항체를 100 mM 글리신, pH 2.0으로 용리시켰다. 용리 후, IgG를 1M Tris-HCl, pH 8.0을 사용하여 중성 pH로 되게 하였다. 그후 정제된 항체를 Amicon® 울트라 원심 필터 장치(밀리포어)를 사용하여 PBS와 완충액을 교환하고 0.22um 원심분리 튜브 필터(코닝)를 사용하여 여과하였다.
IgG 전환
scFv 라이브러리 패닝을 통해 선택된 클론을 IgG1로 전환시켰다. VH 및 VL 유전자를 PCR에 의해 증폭시키고, 인간 IgG 불변 영역 유전자를 함유하는 벡터에 클로닝하였다. VH 영역 전환을 위해, 정방향 프라이머(5'-TTC TCC AGC GCT TAT TCC GAG GTG CAG CTG TTG GAG-3') (서열 번호 27) 및 역방향 프라이머 (5'-CTT GGT GCT AGC TGA GCT CAC GGT GAC CAG-3') (서열 번호 28)를 사용하였다. VL 영역 전환을 위해, 정방향 프라이머 (5'-TTC TCC AGC GCT TAT TCC CAG TCT GTG CTG ACT CAG-3') (서열 번호 29) 및 역방향 프라이머 (5'-GGG CTG ACC TAG GAC CGT CAG CTT-3') (서열 번호 30)를 사용하였다.
에피토프 매핑
맞춤형 펩티드 마이크로어레이(Axxelera)를 항체의 에피토프 식별을 위해 사용하였다. 마이크로어레이는 SH3YL1의 펩티드 200,000개를 함유한다. 2차 및 대조군 IgG1 항체로 미리 염색하여 배경 신호를 감소시켰다. 펩티드 마이크로어레이를 1차 항체(A3 또는 A4 항체)와 함께 배양하고 PBS로 세척하였다. IgG1에 대한 2차 항체를 펩티드 어레이와 함께 배양한 다음 635nm 형광 채널을 사용하여 펩티드 마이크로어레이를 스캔하였다.
항체 친화도의 측정.
항원-항체의 친화도는 AR2G 센서를 갖는 Octet Red 96e system(ForteBio)에 의해 측정하였다. 친화성 측정 프로토콜은 제조업체의 권장 사항을 따랐다.
면역침강(IP)
MES13 세포를 30mm 배양 접시에 시딩하고 성장시켰다. 세포가 융합되도록 성장했을 때, 혈청을 4시간 동안 고갈시키고 24시간 동안 100mg/ml LPS로 자극하였다. 세포 상청액을 Amicon® 울트라 원심 필터 장치(Millipore)를 사용하여 농축시키고 세포를 NP40 용해 완충액(0.5 % NP40, 1% 트리톤 X-100, 50mM 트리스 (pH8.0), 1mM EDTA, 150 mM NaCl, 1ug/ml 아프로티닌, 1ug/ml 류펩틴)으로 용해시켰다. 농축된 상청액 및 세포 용해물을 연속 회전시키면서 4℃에서 밤새 IgG1 Fc 도메인(hTLR5-FC; Invivogen)에 융합된 인간 TLR5의 가용성 엑토도메인과 함게 배양하였다. 그후 연속 회전시키면서 4℃에서 2시간 동안 단백질 G 세파로즈(GE Healthcare)와 함께 배양하였다. 면역 복합체를 용해 완충액으로 세척하고 면역침강된 단백질을 2X SDS-PAGE 샘플 완충액과 혼합하고 95℃에서 10분 동안 비등시켰다. 침전물을 지시된 항체와 함께 웨스턴 블롯에 적용하였다.
웨스턴 블롯
세포를 NP40 용해 완충액(0.5% NP40, 1% Triton X-100, 50mM Tris (pH 8.0), 1mM EDTA, 150mM NaCl, 1ug/ml 아프로티닌, 1ug/ml 류펩틴)으로 용해시켰다. 용해물을 4℃에서 30분 동안 배양하고 14000rpm에서 30분 동안 원심분리를 수행하였다. 단백질 농도는 비신코닌산(BCA) 분석법(Pierce, Rockford, IL, USA)에 의해 결정하였다. 단백질을 95℃에서 10분 동안 5X 샘플 완충액으로 변성시키고, 단백질 샘플을 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE에 적용하고, 100V에서 1시간 동안 니트로셀룰로스(NC) 막(GVS, BO, 이탈리아) 상에서 전달하였다. 그후 전달된 블롯을 5% 탈지유에서 실온에서 30분 동안 차단하고, 지시된 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 블롯을 0.1% tween 20을 갖는 TBS-T 완충액으로 3회 세척한 다음 HRP-접합된 2차 항체와 함께 RT에서 1시간 동안 배양하였다. 0.1% TBS-T 완충액으로 3회 세척한 후, ECL 용액(Young In Frontier, Seoul, Republic of Korea)을 사용하여 블롯을 검출하고, Amersham Imager 680(GE Healthcare Life Sciences, Chicago, USA)에 의해 이미지를 획득하였다.
면역조직화학
신장 및 간을 10% 포르말린으로 고정하고 표준 기술을 사용하여 조직학 또는 면역염색을 위해 처리하였다. 신장의 4um 조직학적 절편을 α-SMA(Dako)로 염색하였고, 간의 3.5um 절편을 α-SMA 및 F4/80(Abcam)으로 염색하였다. 절편을 일련의 감소하는 알코올 농도(100%, 95%, 90%, 80%, 70%)로 재수화하였다. 항원 회복(antigen retrieval) 단계는 95-100℃에서 15분 동안 가열하면서 Tris-EDTA, pH9.0에 의해 수행하였다. 조직의 내인성 수소 퍼옥시다제 활성을 차단하기 위해, 3% H2O2를 실온에서 10분 동안 적용하였다. 그후 샘플을 RT에서 30분 동안 2.5% 정상 염소 혈청(α-SMA), dako 단백질 차단 용액(F4/80)으로 차단하고 슬라이드를 a-SMA 항체(Dako)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 그후 슬라이드를 PBS로 세척하고 HRP 접합된 2차 항체와 함께 RT에서 30분 동안 배양하였다. 그후 색 고정을 위해 DAB+ 기질 완충액과 DAB(3,3'-diaminobenzidine) (Dako; Agilent, Santa Clara, CA, USA) 크로모겐의 혼합물로 슬라이드를 처리한 다음 핵에 대한 Mayer의 헤마톡실린(Vector Lab, Burlingame, CA, USA) 대조염색을 수행하였다. 완전한 염색된 샘플을 탈수시키고 마운팅 용액(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)으로 마운팅하였다. 조직의 이미지는 ImagePro plus 7.0 소프트웨어를 사용하여 표시된 배율에 대해 적어도 20 내지 30개의 사구체 필드에서 분석하였다.
과요오드산-쉬프(PAS), masson의 트리크롬 염색
파라핀 포매 마우스 신장 절편을 4um 두께로 절단하고 과요오드산-쉬프(PAS) 및 masson의 트리크롬 염색을 수행하였다. PAS 염색은 표준 프로토콜로 과요오드산(Junser, Chuo-ku, Tokyo, Japan) 및 쉬프 시약(sigma, St/Louis, MO)을 사용하여 수행하였다. Masson의 트리크롬 염색(Polyscience)의 경우, 절편을 제조업체에서 제공한 프로토콜로 염색하였다.
통계 분석
모든 값은 평균 ±SD 또는 ± SEM으로 표현하였다. 그룹 간의 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었으며 모든 검정은 양측이었다.
실시예 1.2. 결과
TLR5는 SH3YL1 수용체로서 작용한다
SH3YL1 단백질의 분비는 고 글루코스(HG) 자극에 반응하여 MES13 혈관간막 세포에서 유도되었다(도 1). 마우스 혈관간막 세포주(MES13)를 9 및 24시간 동안 30mM의 HG와 함께 배양하였다. 세포 상청액을 농축시키고 SH3YL1에 대한 항체와 함께 면역블로팅에 적용하였다.
건강한 사람에 비해 당뇨병성 신증 환자에서 혈청 SH3YL1 단백질이 유도되었다(도 2). 혈청 SH3YL1을 인간 SH3YL1 ELISA 키트를 사용하여 건강한 사람 및 DN에서 검출하였다.
분비된 SH3YL1 단백질의 기능을 조사하기 위해, 수용체로 작용하는 통합 단백질을 스크리닝하였다. TLR5는 분비된 SH3YL1 단백질로서 확인되었다. TLR5의 엑토도메인은 SH3YL1에 결합하는 것으로 나타났다(도 3). 세포에서 SH3YL1-TLR5 기능을 검증하기 위해, TLR5 KO 마우스로부터의 일차 마우스 혈관간막 세포(pMMC)를 수득하였다. SH3YL1을 사용한 TLR5 KO pMMC의 자극은 WT pMMC에 비해 ROS 생성(도 4) 및 NFkB 활성화(도 5)를 유도하지 못했다. 또한, 분비된 SH3YL1 자극에 반응하는 전염증성 사이토카인 생산을 측정하였다. TLR5 KO pMMC를 SH3YL1과 함께 배양한 결과, IL-1β, TNF-α, KC 및 MIP2를 포함하는 전염증성 사이토카인 생산이 유의하게 감소하였다(도 6).
SH3YL1에 대한 단클론 항체의 생성
분비된 SH3YL1 단백질의 관찰 후, SH3YL1에 대한 치료 항체를 생성하였다. SH3YL1에 대한 치료 항체를 생성하기 위해, 단일 스캐폴드(15-아미노산 링커(GGGGS)3에 의해 연결된 인간 가변 중쇄 VH3-23(DP47) 및 인간 가변 경쇄 Vλ1g(DPL3)) 및 6개의 무작위 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 합성 인간 단일 쇄 가변 단편(scFv) 라이브러리를 사용하였다. 3회의 패닝 파지 라이브러리 후, 2개의 상이한 scFv 항체(A3 및 A4)를 수득하였다. 각각의 scFv 항체(A3 또는 A4)의 CDR을 결정하였다(각각 서열 번호 13, 14, 및 15 또는 서열 번호 16, 17, 및 18). scFv 항체(A3 또는 A4 클론)로부터 SH3YL1에 대한 인간 IgG1 항체를 수득하기 위해, A3 또는 A4의 각 scFv에서 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 각각 불변 경쇄 및 중쇄의 벡터로 서브클로닝하였다. 각 IgG1 항체(A3 또는 A4)의 친화도는 AR2G 센서를 갖는 ForteBio Octet를 사용하여 측정하였다. A3 또는 A4의 친화도는 1.0 x 10-12 또는 3.65 x 10-10인 것으로 밝혀졌다. 각 항체(A3 또는 A4 항체)의 에피토프를 결정하기 위해, 맞춤형 펩티드 마이크로어레이(Axxelera, Germany)를 적용하였다. A3 항체는 SH3YL1의 펩티드 317DSHFDWWE324(서열 번호 25)를 인식하고 A4의 에피토프는 SH3YL1의 203LYEILDSF210(서열 번호 26)인 것으로 밝혀졌다.
당뇨병성 신증 동물 모델로서의 db/db 마우스에서의 치료 항체 효능의 평가
SH3YL1 항체에 대한 치료 효능은 제2형 당뇨병성 신증 동물 모델로서 db/db 마우스에서 조사하였다. SH3YL1 항체(A4 및 E10, 12주 동안 10 mpk/주, i.p. 주사)를 db/db 마우스(N = 5) 또는 대조군으로서 db/m 마우스(N = 5)에 12주 동안 주사한 다음 희생시켰다. 대조군 PBS-주사된 마우스 및 SH3YL1 항체-주사된 db/db 마우스 둘 다는 높은 혈청 글루코스 수치를 보였으며, 이는 항체 주사가 db/db 마우스에서 당뇨병 상태에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 뇨 중의 알부민 분비량 및 알부민 대 크레아티닌의 비율은 SH3YL1 항체-주사된 db/db 마우스에서 유의하게 감소하였다(도 7). A4 항체는 E10 항체보다 높은 치료 효능을 보였다(도 7). 혈관간막 확대는 당뇨병성 신증에서 잘 알려진 매개변수이다. 따라서, 대조군 PBS-주사된 및 SH3YL1 항체-주사된 db/db 마우스에서 혈관간막 확대가 수행되었다. 사구체 용적, 다발 면적(tuft area) 및 혈관간막 면적은 대조군 PBS-주사된 db/db 마우스에서 증가하였다(도 8). 그러나, SH3YL1 항체-주사된 db/db 마우스는 대조군인 db/m 마우스와 비교하여 3개의 파라미터의 감소를 보였다(도 8). 다음으로, SH3YL1 항체가 신장에서 섬유증을 제어하는지 여부를 결정하였다. Masson의 트리크롬 및 α-SMA 염색을 대조군 PBS-주사된 및 SH3YL1 항체-주사된 db/db 마우스에서 섬유증 마커로서 수행하였다. Masson의 트리크롬 및 α-SMA 염색은 대조군 PBS-주사된 db/db 마우스에 비해 SH3YL1 항체-주사된 db/db 마우스에서 유의하게 감소하였다(도 9 및 도 10). A4 항체는 E10 항체보다 더 높은 섬유증 보호 활성을 보였다(도 8 내지 도 10). 종합하면, SH3YL1 항체 주사는 당뇨병성 신증에서 양호한 치료 효능을 보였다.
본원에 제공된 방법을 사용하여 확인된 추가의 항체는 5D5, 3E11, 44F10, 4G4, 4F9, 4H7, 및 S4A이다. 항체 A4, A3, S4A, 4F9, 5D5, 4F10, 4H7, 4G4, 및 3E11에 대한 웨스턴 블롯 결과는 도 64에 나타내어져 있다. 항체 5D5, 3E11, 44F10, 4G4, 4F9, 4H7, 및 S4A의 결합 친화도는 도 65에 나타내어져 있다.
하기에는 항체 A3, A4, S4A, 4F9, 4F10, 5D5, 4G4, 3E11, 및 4H7의 아미노산(AA) 및 뉴클레오티드(NT) 서열을 보여주는 표 1이 제공된다.
항체 가변 영역 AA: CDR1, 2, 및 3 서열 번호: 가변 영역 AA 서열 번호: 가변 영역 NT 서열 번호: 불변 영역 AA 서열 번호: SH3YL1 에피토프 AA 서열 번호:
A3 중쇄 13, 14, 15 1 2 9 25
A3 경쇄 16, 17, 18 3 4 10
A4 중쇄 19, 20, 21 5 6 9 26
A4 경쇄 22, 23, 24 7 8 10
S4A 중쇄 63, 64, 65 31 32 9 98
S4A 경쇄 66, 67, 68 33 34 10
4F9 중쇄 69, 70, 71 35 36 61 99
4F9 경쇄 72, 73, 74 37 38 62
4F10 중쇄 69, 75, 76 39 40 61 100
4F10 경쇄 77, 78, 79 41 42 62
5D5 중쇄 69, 80, 81 43 44 61 101
5D5 경쇄 82, 83, 84 45 46 62
4G4 중쇄 13, 85, 86 47 48 61 99
4G4 경쇄 87. 88. 74 49 50 62
3E11 중쇄 89, 90, 91 51 52 61 99
3E11 경쇄 92, 73, 74 53 54 62
4H7 중쇄 93, 94, 95 55 56 61 99
4H7 경쇄 96, 97, 74 57 58 62
실시예 2. 비알코올성 지방간염(NASH)
실시예 2.1. 재료 및 방법
동물
동물의 모든 절차는 이화여자대학교의 윤리적 지침 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되고 수행되었다.
6주령의 수컷 당뇨병 db/db 마우스(BKS.Cg-Dock7 m +/+Lepr db /J)는 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, USA)로부터 구입하였다. SH3YL1 항체(CRB-A4, CRB-E10)의 효과를 조사하기 위해, 8주령 마우스를 4개의 그룹으로 나누었다: (1) 대조군 db/m 마우스(n=5), (2) 비히클로 처리된 대조군 db/db 마우스(n=5), (3) CRB-A4로 처리된 db/db 마우스(n=5), 및 (4) CRB-E10으로 처리된 db/db 마우스(n=5). 항체를 12주 동안 1주당 10mg/kg의 용량으로 복강내 주사하였다. 체중, 혈당 수준, 뇨 용적은 4주마다 측정하였다. 혈당 수준은 혈당 측정기(Accucheck; Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 측정하였다. 마우스를 뇨 수집을 위해 24시간 동안 대사 케이지에서 개별적으로 분리하였다. 12주 후, 마우스를 희생시키고 추가 분석을 위해 심장 천자로 혈청을 수득하였으며, 신장을 파라핀/냉동 절편 또는 단백질/RNA 분석을 위해 신속하게 절개하였다.
고 지방 고 프럭토스 식이(FFD) 모델
8주령의 수컷 KO 및 야생형 마우스에 20주 동안 FFD(#D12079B, 연구용 식이, 식수 중 42g/L의 최종 농도로 고-프럭토스 옥수수 시럽 보충)를 공급하였다. 모든 동물은 온도와 습도가 조절되고 이화여자대학교(Seoul, Korea) 동물 대상 위원에 의해 허용되는 방에서 12시간-조명, 12시간-암흑 주기로 수용되었다.
다른 모든 방법은 위의 실시예 1에 기재된 바와 같다.
실시예 2.2. SH3YL1은 NASH 환자의 혈장에서 분비된다
비알코올성 지방간염(NASH) 동물 모델에서 SH3YL1의 분비를 측정하기 위해, 고-지방 고-프럭토스 식이(FFD) 모델을 사용하였다. FFD 모델에서 분비된 혈청의 SH3YL1 단백질 수준은 정상 식이(ND) 동물에서보다 높았다(도 11). NASH에 대한 SH3YL1의 임상적 의미를 평가하기 위해, SH3YL1 단백질 수준을 NASH 환자의 혈청에서 측정하였다. NASH 환자의 SH3YL1 수준은 건강한 기증자의 SH3YL1 수준보다 높았다(도 12).
실시예 2.3. 비알코올성 지방간염(NASH) 동물 모델로서 db/db 마우스에서의 치료 항체 효능의 평가
SH3YL1 항체가 NASH 동물 모델로서 db/db 마우스에서 간 섬유증 및 염증을 조절하는지 여부를 조사하였다. db/db 마우스의 염증에서 SH3YL1 항체의 보호 활성을 시험하기 위해, 대조군 PBS-주사된 및 SH3YL1 항체-주사된 db/db 마우스에서 F4/80 대식세포 침윤을 측정하였다. F4/80 대식세포 침윤은 대조군 PBS-주사된 db/db 마우스에 비해 SH3YL1 항체-주사된 db/db 마우스에서 유의하게 감소하였다(도 13). 다음으로, 대조군 PBS-주사된 및 SH3YL1 항체-주사된 db/db 마우스에서 α-SMA 발현을 측정하는 것으로 간 섬유증에서 SH3YL1 항체의 치료 효능을 평가하였다. PBS-주사된 db/db 마우스의 간 조직은 db/m 마우스에 비해 유의하게 증가된 α-SMA 발현을 보였다. 그러나, SH3YL1 항체-주사된 db/db 마우스는 α-SMA 발현을 검출하지 못했다(도 14). 종합하면, SH3YL1 항체 주사는 NASH 모델에서 양호한 치료 효능을 보였다.
실시예 2.4. 요약
세포내 SH3YL1은 고 글루코스 및 LPS를 포함하는 염증 자극에 의해 분비되었다. 분비된 SH3YL1은 TLR5와의 상호작용을 통해 전염증성 분자로서 작용하였다. 이러한 결과는 염증 신호가 SH3YL1의 분비를 유도하고 분비된 SH3YL1이 강력한 염증 활성을 나타내어 추가 염증을 유발하고 병원성 단계를 유발한다는 것을 시사하였다. SH3YL1 항체는 발달되어 DN 및 NASH 모델로서 db/db 마우스에 적용되었다. SH3YL1 항체는 DN 및 NASH 치료에서 양호한 치료 효능을 보인다.
도 66은 hTLR5-FC의 인간 TLR5 세포외 도메인(aa 21-639)의 아미노산 서열 (서열 번호 59)을 나타내며, 도 3에서 SH3Yl1이 TLR5 엑토도메인과 상호작용한다는 것을 뒤받침한다.
실시예 3. 시스플라틴-유도된 급성 신장 손상(AKI)
실시예 3.1. 재료 및 방법
시스플라틴-유도된 급성 신장 손상(AKI) 모델
급성 신장 손상을 유도하기 위해, 8주령 C57BL/6J 마우스에 10mg/kg의 시스플라틴(Sigma, St. Louis, MO)을 복강내 주사하였다. SH3YL1 항체(CRB-A4)의 효과를 조사하기 위해, 마우스를 세 그룹으로 나누었다: (1) 대조군 마우스(n=9), (2) 인간 대조군 IgG로 처리된 시스플라틴 주사된 마우스(n=13), (3) CRB-A4로 처리된 시스플라틴 주사된 마우스(n=12). 인간 대조군 IgG 및 SH3YL1 항체(CRB-A4)를 시스플라틴 주사 전에 10 mg/kg으로 정맥내 주사하였다. 주사 후 3일에 동물을 희생시키고 추가 분석을 위해 혈청 및 뇨를 수득하고, 파라핀/냉동 절편 또는 단백질/RNA 분석을 위해 신장을 신속하게 절개하였다.
신장 기능 및 신장 손상의 평가
뇨 알부민은 상업용 ELISA(ALPCO, Westlake, OH, USA)를 사용하여 측정하였다. 혈청 및 뇨 크레아티닌 수준은 효소적 비색 분석법(n=9)으로 결정하였다. 알부민 대 크레아티닌 비율(ACR)은 총 알부민과 뇨 크레아티닌을 사용하여 계산하였다. 혈중 요소 질소(BUN)는 비색 분석 키트(ARBOR ASSAYS, Ann Arbor, MI, USA)로 측정하였다. 혈청 시스타틴 C 수준은 제조업체의 지침에 따라 ELISA 분석 키트(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)로 결정하였다. NGAL 및 KIM-1은 제조업체의 지침에 따라 ELISA(R&D 시스템)에 의해 뇨 및 혈청에서 측정하였다.
전염증성 사이토카인 ELISA
시험관내 전염증성 사이토카인 수준을 결정하기 위해, 일차 마우스 혈관간막 세포(pMMC)를 단리하고 35 mm 플레이트(5 x105)에서 배양하였다. pMMC를 4시간 동안 혈청 고갈시킨 다음 SH3YL1 (1 μg/ml)과 함께 24시간 동안 배양한 다음 배지를 수집하였다. TNF-α, IL-1β, MIP2 및 KC 단백질 수준은 제조업체의 지침(R&D systems)에 따라 ELISA 분석 키트로 결정하였다. 시스플라틴-유도된 AKI 모델 마우스 혈청은 또한 ELISA 키트(R&D systems)를 사용하여 TNF-α 및 KC 수준을 결정하는데 사용되었다.
과요오드산-쉬프(PAS), 헤마톡실린 및 에오신(H&E), masson의 트리크롬 염색
파라핀 포매 마우스 신장 절편을 4 μm 두께로 절단하고 과요오드산-쉬프(PAS), 헤마톡실린 및 에오신(H&E), 및 masson의 트리크롬 염색을 수행하였다. PAS 염색은 표준 프로토콜로 과요오드산(Junsei, Chuo-ku, Tokyo, Japan) 및 쉬프 시약(sigma, St/Louis, MO)을 사용하여 수행하였다. H&E 염색은 표준 방법으로 헤마톡실린(Vector, Burlingame, CA, USA) 및 에오신(sigma)을 사용하여 수행하였다. Masson의 트리크롬 염색(Polyscience)의 경우, 절편을 제조업체에서 제공한 프로토콜로 염색하였다.
관형 손상 스코어링
신장 관형 손상의 정도를 결정하기 위해, H&E 염색을 수행하였다. 모든 조직학적 검사는 신장 병리학자에 의해 맹검 방식으로 수행되었다. 관형 손상 점수로 인한 조직학적 변화는 다음과 같이 세포 괴사, 브러시 보더 손실, 캐스트 형성 및 세관 확장을 나타내는 세관의 백분율에 의해 정량화하였다: 0, 없음; 1, 1-25%; 2, 26-50%; 3, >50%.
면역조직화학
신장을 10% 포르말린으로 고정하고 표준 기술을 사용하여 조직학 또는 면역염색을 위해 처리하였다. 신장의 4μm 조직학적 절편을 α-SMA(Dako; Agilent, Santa Clara, CA, USA)로 염색하였다. 절편을 일련의 감소하는 알코올 농도(100%, 95%, 90%, 80%, 70%)로 재수화하였다. 항원 회복 단계는 95℃-100℃에서 15분 동안 가열하면서 Tris-EDTA, pH 9.0에 의해 수행하였다. 조직의 내인성 수소 퍼옥시다제 활성을 차단하기 위해, 3% H2O2를 실온에서 10분 동안 적용하였다. 그후 샘플을 RT에서 30분 동안 2.5% 정상 염소 혈청(α-SMA)으로 차단하였다. 슬라이드를 α-SMA 항체(Dako)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 그후 슬라이드를 PBS로 세척하고 HRP 접합된 2차 항체와 함께 RT 동안 30분 배양하였다. 그후 색 고정을 위해 DAB+ 기질 완충액과 DAB(3,3'-diaminobenzidine)(Dako) 크로모겐의 혼합물로 슬라이드를 처리한 다음 핵에 대한 Mayer의 헤마톡실린(Vector Lab, Burlingame, CA, USA) 대조염색을 수행하였다. 완전한 염색된 샘플을 탈수시키고 마운팅 용액(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)으로 마운팅하였다. 조직의 이미지는 ImagePro plus 7.0 소프트웨어를 사용하여 표시된 배율에 대해 적어도 20 내지 30개의 사구체 필드에서 분석하였다.
TdT-UDP 닉 말단 표지(TUNEL) 염색
4 μm 두께로 절단된 파라핀 포매된 마우스 신장 절편을 사용하여 아폽토시스를 검출하였다. 특정 염색에 의해 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT)를 사용하여 게놈 DNA를 변형시킴으로써 아폽토시스 세포를 표지하도록 설계된 현장 아폽토시스 검출 키트(Merck)를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 슬라이드는 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Carl Zeiss vision system; LSM880 airyscan)을 사용하여 시각화하였다.
통계 분석
모든 값은 평균±SEM으로 표현하였다. 그룹 간의 통계적 유의성은 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었으며 모든 검정은 양측이었다.
실시예 3.2. 결과
SH3YL1 항체는 시스플라틴-유도된 신장 기능장애를 억제한다
신장 기능에 대한 SH3YL1 항체의 치료 효과를 조사하기 위해, 몇몇 마커를 측정하였다. 먼저, 신장 비대와 관련된 신장 대 체중 비율을 평가하였다(10). SH3YL1 항체의 처리는 시스플라틴 주사시 신장 대 체중 비율의 증가를 약화시켰다(도 55a). 혈청 크레아티닌, 혈중 요소 질소(BUN) 및 혈청 시스타틴 C는 AKI 뿐만 아니라 만성 신장 질환(CKD)에서도 신장 기능의 바이오마커로 사용된다(11-13). 시스플라틴 주사는 이들 마커의 수준을 향상시켰다(도 55b-55d). 그러나, SH3YL1 항체의 처리는 이들 마커의 수준을 억제하였다(도 55b-55d). 중증 관형 기능장애는 화학요법과 관련되었다(14, 15). 따라서, 알부민뇨 및 알부민 대 크레아티닌 비율(ACR)을 뇨 샘플에서 결정하였다. 시스플라틴에 의한 뇨 알부민 및 ACR의 유도는 SH3YL1 항체로의 처리에 반응하여 억제되었다(도 55e 및 55f). 많은 임상 연구에서는 뇨 및 혈장 호중구 젤라티나제-관련 리포칼린(NGAL) 및 신장 손상 분자-1(KIM-1)의 수준이 AKI에 대한 강력한 진단 마커인 것으로 나타났다(15-19). 신장 손상을 분석하기 위해, NGAL 및 KIM-1을 ELISA를 사용하여 혈청 및 뇨에서 측정하였다. 뇨 및 혈청 NGAL 및 KIM-1의 수준은 시스플라틴 주사에 대한 반응으로 상승하였다. 그러나, SH3YL1의 처리는 시스플라틴-유도된 뇨 및 혈청 NGAL 및 KIM-1 수준을 억제하였다(도 56a 내지 56d). 종합하면, SH3YL1 항체는 시스플라틴-유도된 신장 기능장애로부터 보호하는 것으로 나타났다.
SH3YL1 항체의 처리는 시스플라틴-유도된 AKI 마우스에서 전염증성 사이토카인 생산 및 관형 세포 손상을 약화시킨다
많은 연구에서는 TNF-α, IL-6, KC, MIP-2, MCP-1을 포함하는 전염증성 사이토카인의 증가하는 수준이 시스플라틴-유도된 AKI와 상관관계가 있는 것으로 나타났다(20-22). TNF-α, IL-6, KC, MIP-2 및 MCP-1 발현의 mRNA 수준은 시스플라틴-주사된 마우스로부터의 신장 조직에서 증가하였다. SH3YL1 항체-처리된 마우스는 사이토카인의 발현 수준을 감소시켰다(도 57a 내지 57e). 더욱이, SH3YL1 항체-처리된 마우스로부터의 혈청 중 TNF-α 및 KC의 단백질 수준은 대조군 마우스에 비해 억제되었다(도 58a 내지 58b).
시스플라틴-유도된 신장 손상은 광범위한 관형 괴사를 특징으로 하였다. 시스플라틴-유도된 신장 손상은 대조군 마우스에 비해 SH3YL1 항체-주사된 마우스에서 유의하게 억제되었다(도 59). 관형 손상의 중증도의 맹검 등급으로부터 정량적 조직학적 손상 스코어링을 수행하였다. 관형 손상 점수는 SH3YL1 항체 처리된 마우스에서 약화되었다(도 59). 관형 세포의 아폽토시스에서의 SH3YL1 항체의 치료 효과를 평가하기 위해, 신장 조직에서 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 말단 표지(TUNEL) 염색을 수행하였다. SH3YL1 항체의 처리는 관형 세포의 시스플라틴-유도된 아폽토시스를 억제하였다(도 60a-60b).
실시예 3.3. 요약
시스플라틴은 신장 관형 세포의 아폽토시스를 통해 심각한 신독성을 보였다. 시스플라틴-유도된 AKI 모델에서 혈청 SH3YL1 수준이 증가하였다. 따라서, 시스플라틴-유도된 AKI 모델에서 분비된 SH3YL1 단백질을 중화시키는 SH3YL1 항체의 치료 효과를 탐구하였다. 시스플라틴-유도된 AKI 마우스에 A4 SH3YL1 항체를 주사한 결과, 신장 손상 마커(NGAL, KIM-1) 및 전염증성 사이토카인 생산(TNF-α, KC)이 감소하였다. SH3YL1 항체는 시스플라틴 주사시 신장 손상(혈청 크레아티닌, 혈중 요소 질소, 혈청 시스타틴 C, 알부민뇨) 및 관형 세포의 아폽토시스로부터 보호한다. 따라서, SH3YL1 항체는 시스플라틴-유도된 AKI에서 양호한 치료 효능을 나타낸다.
실시예 4. 염증성 장 질환(IBD)
실시예 4.1. 재료 및 방법
마우스의 DSS-유도된 결장염 및 치료
급성 결장염 모델은 식수에 용해된 2.5% 덱스트란 황산나트륨(DSS, 분자량: 36-50kDa, MP Biomedicals, Solon, OH, USA)을 연속 7일 동안 C57BL/6 마우스에게 공급한 다음 3일 동안 담수로 교체함으로써 유도하였다. 마우스를 대조군, DSS, DSS + IgG1 및 DSS + A4 (10mg/kg)를 포함하는 4개의 그룹(그룹당 n = 7마리 마우스)으로 무작위로 나누었다. 항체 치료제를 정맥내 주사하였다.
결장염의 일반적인 평가 및 질병 활동성 지수(DAI)
질병 활동성 지수(DAI)는 체중 감소(0점 = 없음, 1점 = 10% 미만 체중 감소, 2점 = 10-20% 체중 감소, 3점 = 20% 초과 체중 감소)로 종합적으로 평가하였다. 체중은 격일로 측정하였다. 총 DAI 점수는 0(정상)에서 10(중증 IBD) 범위이다.
헤마톡실린 및 에오신(H&E)
파라핀 포매 마우스 결장을 4 μm 두께로 절단하였다. H&E 염색은 표준 방법으로 헤마톡실린(Vector, Burlingame, CA, USA) 및 에오신(sigma)을 사용하여 수행하였다.
실시예 4.2. 결과
혈청 SH3YL1의 수준은 IBD 모델 및 환자에서 증가하였다
SH3YL1 분비가 DSS-매개 IBD 모델에서 유도되는지 여부를 조사하였다. 7일 동안 DSS를 자극한 결과 혈청 SH3YL1이 증가하였다(도 61a). IBD 환자는 두 가지 하위 유형으로 분류된다: 궤양성 결장염(UC) 및 크론병(CD)(23-25). 45명의 UC 환자 및 50명의 CD 환자에서 혈청 SH3YL1을 평가하였다. UC 및 CD 환자에서 혈청 SH3YL1의 수준은 건강한 사람에서보다 높았다(도 61b).
DSS-유도된 IBD 모델에 대한 SH3YL1 항체의 억제 효과
DSS-유도된 IBD 모델에 대한 SH3YL1 항체의 예방 효과를 조사하기 위해(도 62a), 결장 조직의 H&E 염색을 IBD 모델에서 수행하였다. DSS의 처리 결과 점막 상피층이 파괴되었다(도 62b 및 62c). 그러나, SH3YL1 항체의 공동-처리는 점막층의 손실을 억제하였다(도 62b 및 62c). 다음으로, SH3YL1 항체의 치료 효과를 검증하였다. 상기 모델을 2일 동안 DSS로 사전-처리한 후 항체를 주사함으로써 치료 효과를 분석한다(도 63a). SH3YL1 항체의 처리는 점막층의 손실을 유의하게 억제하였으며, 이는 SH3YL1 항체가 양호한 치료 효과를 가짐을 나타낸다(도 63b 및 63c).
실시예 4.3. 요약
결과에 기초하여, 혈청 SH3YL1의 수준은 DSS-매개 IBD 모델 및 환자에서 유도된다. SH3YL1 항체는 DSS-유도된 IBD 모델에서 점막층의 손실을 억제하였다. 따라서, SH3YL1 항체는 IBD에 대해 양호한 치료 효과를 갖는다.
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특정 실시양태들에 대한 전술한 설명은 다른 사람들이, 당업계의 기량 내에서 지식을 적용함으로써, 본 발명의 일반적인 개념을 벗어나지 않으면서 다양한 적용을 위해 용이하게 수정 및/또는 적응할 수 있는 본 발명의 일반적인 특성을 충분히 나타낼 것이다. 따라서, 이러한 적응 및 수정은 본원에 제시된 교시 및 지침에 기초하여, 개시된 실시양태의 의미 및 등가의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본원의 어구 또는 용어는 설명의 목적을 위한 것이지 제한의 목적이 아니며, 본 명세서의 용어 또는 어구는 교시 및 지침에 비추어 숙련된 기술자에 의해 해석되어야 한다는 것을 이해해야 한다.
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Thr 130 135 140 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 145 150 155 160 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 165 170 175 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 180 185 190 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 195 200 205 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 210 215 220 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 225 230 235 240 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 245 250 255 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 260 265 270 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 275 280 285 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 290 295 300 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 305 310 315 320 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 62 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CL of 4F9, 4F10, 5D5, 4G4, 3E11, and 4H7 antibodies <400> 62 Arg Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 of S4A antibody <400> 63 Ser Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 of S4A antibody <400> 64 Trp Ile Ser Pro Asn Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 of S4A antibody <400> 65 Thr Pro Pro Gly Thr Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 of S4A antibody <400> 66 Ser Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His 1 5 10 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 of S4A antibody <400> 67 Ser Thr Ser Asn Lys His Ser 1 5 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 of S4A antibody <400> 68 Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Gly Thr Arg Val 1 5 10 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 of 4F9, 4F10, and 5D5 antibodies <400> 69 Asp Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 of 4F9 antibody <400> 70 Ala Ile Lys Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 of 4F9 antibody <400> 71 Ala Glu Tyr Glu Tyr Leu Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 of 4F9 antibody <400> 72 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp Leu Asn 1 5 10 <210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 of 4F9 and 3E11 antibodies <400> 73 Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 of 4F9, 4G4, 3E11, and 4H7 antibodies <400> 74 Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 of 4F10 antibody <400> 75 Ala Ile Tyr Ser Thr Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 of 4F10 antibody <400> 76 Val Gly Trp Tyr Leu Phe Asp Tyr 1 5 <210> 77 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 of 4F10 antibody <400> 77 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 78 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 of 4F10 antibody <400> 78 Ala Thr Ser Arg Leu Gln Ser 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 of 4F10 antibody <400> 79 Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 80 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 of 5D5 antibody <400> 80 Ser Ile Ser Ser Thr Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 of 5D5 antibody <400> 81 Val Leu Tyr Glu Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 of 5D5 antibody <400> 82 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Trp Leu Asn 1 5 10 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 of 5D5 antibody <400> 83 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 of 5D5 antibody <400> 84 Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 85 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 of 4G4 antibody <400> 85 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 of 4G4 antibody <400> 86 Ala Glu Tyr Ser Tyr Leu Tyr Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 87 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 of 4G4 antibody <400> 87 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Trp Leu Asn 1 5 10 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 of 4G4 antibody <400> 88 Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser 1 5 <210> 89 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 of 3E11 antibody <400> 89 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 90 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 of 3E11 antibody <400> 90 Ala Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 91 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 of 3E11 antibody <400> 91 Val Gly Ser Ala Gly Tyr Leu Tyr Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 92 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 of 3E11 antibody <400> 92 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ala Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 93 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 of 4H7 antibody <400> 93 Thr Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 94 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 of 4H7 antibody <400> 94 Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 of 4H7 antibody <400> 95 Val Ser Tyr Pro Gly Leu Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 96 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 of 4H7 antibody <400> 96 Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR2 of 4H7 antibody <400> 97 Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope in SH3YL1 for S4A antibody <400> 98 Ser His Phe Asp Trp Trp Glu 1 5 <210> 99 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope in SH3YL1 for 4F9, 4G4, 3E11, and 4H7 antibodies <400> 99 Asp Trp Trp Glu Gly Lys Leu 1 5 <210> 100 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope in SH3YL1 for 4F10 antibody <400> 100 Phe Asp Trp Trp Glu Gly Lys 1 5

Claims (46)

  1. (a) 아미노산 서열 NYAMS (서열 번호 13)을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1),
    아미노산 서열 VISSDNSSTYYADSVKG (서열 번호 14)을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    아미노산 서열 VWRHFDY (서열 번호 15)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    (b) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNNVN (서열 번호 16)을 포함하는 경쇄 CDR1,
    아미노산 서열 ADSHRPS (서열 번호 17)을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    아미노산 서열 ASWDSSLSGYV (서열 번호 18)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (c) 아미노산 서열 NYYMS (서열 번호 19)을 포함하는 중쇄 CDR1,
    아미노산 서열 AISHNNSNTYYADSVKG (서열 번호 20)을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    아미노산 서열 KFSFFDY (서열 번호 21)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
    (d) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVS (서열 번호 22)을 포함하는 경쇄 CDR1,
    아미노산 서열 ANSHRPS (서열 번호 23)을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    아미노산 서열 GAWDSSLNGYV (서열 번호 24)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 아미노산 서열 NYAMS (서열 번호 13)을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1),
    아미노산 서열 VISSDNSSTYYADSVKG (서열 번호 14)을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    아미노산 서열 VWRHFDY (서열 번호 15)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    (b) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNNVN (서열 번호 16)을 포함하는 경쇄 CDR1,
    아미노산 서열 ADSHRPS (서열 번호 17)을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    아미노산 서열 ASWDSSLSGYV (서열 번호 18)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (c) 아미노산 서열 NYYMS (서열 번호 19)을 포함하는 중쇄 CDR1,
    아미노산 서열 AISHNNSNTYYADSVKG (서열 번호 20)을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    아미노산 서열 KFSFFDY (서열 번호 21)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    (d) 아미노산 서열 SGSSSNIGSNYVS (서열 번호 22)을 포함하는 경쇄 CDR1,
    아미노산 서열 ANSHRPS (서열 번호 23)을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    아미노산 서열 GAWDSSLNGYV (서열 번호)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  3. (a) 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1),
    서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    (b) 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (c) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    (d) 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (e) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    (f) 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (g) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    (h) 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (i) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    (j) 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (k) 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    (l) 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (m) 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
    (n) 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론 항체.
  4. 제3항에 있어서,
    (a) 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1(CDR1),
    서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (c) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (d) 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (e) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (f) 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (g) 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (h) 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (i) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (j) 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (k) 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (l) 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (m) 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
    서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (n) 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및
    서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단클론 항체.
  5. 제2항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열 번호 1 또는 5의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  6. 제2항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열 번호 3 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  7. 제3항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 서열 번호 31, 35, 39, 43, 47, 51, 또는 55의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  8. 제3항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열 번호 33, 37, 41, 45, 49, 53, 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는, 항체.
  10. 제9항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 인간 면역글로불린 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항체.
  11. 제10항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  12. 제9항에 있어서, 중쇄 불변 영역이 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 불변 영역이 인간 면역글로불린 IgGκ및 IgGλ로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항체.
  14. 제13항에 있어서, 경쇄 불변 영역이 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  15. 제9항에 있어서, 경쇄 불변 영역이 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 항체인, 항체.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 단일 쇄 항체(scFv), Fab, 또는 dsFV인, 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체와 동일한 인간 SH3 도메인-함유 YSC84-유사 1(SH3YL1)의 에피토프에 결합하는 단클론 항체.
  19. 아미노산 서열 DSHFDWWE (서열 번호 25)를 포함하는 에피토프에서 인간 SH3 도메인-함유 YSC84-유사 1(SH3YL1)에 특이적으로 결합하는 단클론 항체.
  20. 아미노산 서열 LYEILDSF (서열 번호 26)를 포함하는 에피토프에서 인간 SH3 도메인-함유 YSC84-유사 1(SH3YL1)에 특이적으로 결합하는 단클론 항체.
  21. 서열 번호 98, 99, 100, 또는 101의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에서 인간 SH3 도메인-함유 YSC84-유사 1(SH3YL1)에 특이적으로 결합하는 단클론 항체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 표지를 추가로 포함하는, 항체.
  23. 제1항 내지 제5항 및 제7항 중 어느 한 항의 항체의 중쇄 가변 영역 또는 중쇄를 암호화하는 단리된 핵산 분자.
  24. 제1항 내지 제4항, 제6항 및 제8항 중 어느 한 항의 항체의 경쇄 가변 영역 또는 경쇄를 암호화하는 단리된 핵산 분자.
  25. 제1항 내지 제5항 및 제7항 중 어느 한 항의 항체의 중쇄 가변 영역 또는 중쇄 및 제1항 내지 제4항, 제6항 및 제8항 중 어느 한 항의 항체의 경쇄 가변 영역 또는 경쇄를 암호화하는 단리된 핵산 분자.
  26. 제23항 또는 제25항에 있어서, 핵산 분자가 서열 번호 1 또는 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 암호화하는, 단리된 핵산 분자.
  27. 제24항 또는 제26항에 있어서, 핵산 분자가 서열 번호 3 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 암호화하는, 단리된 핵산 분자.
  28. 제22항 또는 제24항에 있어서, 핵산 분자가 서열 번호 31, 35, 39, 43, 47, 51, 또는 55의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 암호화하는, 단리된 핵산 분자.
  29. 제23항 또는 제24항에 있어서, 핵산 분자가 서열 번호 33, 37, 41, 45, 49, 53, 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 암호화하는, 단리된 핵산 분자.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 단리된 벡터.
  31. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제30항의 벡터, 또는 제23항, 제26항 또는 제28항의 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 제24항, 제27항 또는 제29항의 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  32. 제31항에 있어서, 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 효모, CHO, YB/20, NS0, PER-C6, HEK-293T, NIH-3T3, HeLa, BHK, Hep G2, SP2/0, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 및 조직 배양물 중 인간 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 숙주 세포.
  33. 핵산 분자가 발현되고 항체가 생성되도록 제31항 또는 제32항의 숙주 세포를 배양함을 포함하여, 인간 SH3YL1에 결합하는 단클론 항체를 생산하는 방법.
  34. 인간 SH3YL1에 특이적으로 결합하고 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자에 의해 암호화되는 단클론 항체.
  35. 제1항 내지 제22항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  36. 제1항 내지 제22항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체, 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제30항의 벡터, 또는 제31항 또는 제32항의 숙주 세포; 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  37. 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제22항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체, 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제30항의 벡터, 또는 제31항 또는 제32항의 숙주 세포, 또는 제35항 또는 제36항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 대상체의 면역 반응을 향상시키거나 유도하는 방법인, 방법.
  39. 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제22항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체, 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제30항의 벡터, 또는 제31항 또는 제32항의 숙주 세포, 또는 제35항 또는 제36항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 대상체에서 당뇨병성 신증을 치료하는 방법.
  40. 제30항에 있어서, 대상체에게 로사르탄을 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
  41. 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제22항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체, 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제30항의 벡터, 또는 제31항 또는 제32항의 숙주 세포, 또는 제35항 또는 제36항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 대상체에서 비알콜성 지방증 간염을 치료하는 방법.
  42. 샘플을 제1항 내지 제22항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체와 접촉시킴을 포함하여, 샘플에서 SH3YL1을 검출하는 방법.
  43. 제1항 내지 제22항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체, 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제30항의 벡터, 또는 제31항 또는 제32항의 숙주 세포, 또는 제35항 또는 제36항의 약제학적 조성물, 및 (a) 검출 시약, (b) SH3YL1 항원, (c) 인간 투여를 위한 사용 또는 판매 승인을 반영하는 통지, 또는 (d) 이들의 조합을 포함하는 키트.
  44. 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제22항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체, 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제30항의 벡터, 또는 제31항 또는 제32항의 숙주 세포, 또는 제35항 또는 제36항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 대상체에서 급성 신장 손상을 치료하는 방법.
  45. 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제22항 및 제34항 중 어느 한 항의 항체, 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제30항의 벡터, 또는 제31항 또는 제32항의 숙주 세포, 또는 제35항 또는 제36항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 대상체에서 염증성 장 질환을 치료하는 방법.
  46. 제37항 내지 제41항, 제44항 및 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인, 방법.
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