KR20230056669A - Dna 분자의 조성물, 이의 제조 방법 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Dna 분자의 조성물, 이의 제조 방법 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20230056669A
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조엘 드 비어
모니크 마우러
니콜라스 메이어
라바니야 쿠날링암
마르셀로 클레리치
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안자리움 바이오사이언시스 아게
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Abstract

역위 반복, 발현 카세트 및 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 하나 이상의 제한 부위를 포함하는 이중 가닥 DNA 분자, 이의 사용 방법 및 이의 제조 방법이 본원에 제공된다.

Description

DNA 분자의 조성물, 이의 제조 방법 및 이의 사용 방법
우선권
본 출원은 2020년 7월 27일에 출원된 미국 일련 번호 63/057,179 및 2021년 1월 20일에 출원된 미국 일련 번호 63/139,486에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 2021년 7월 26일에 생성되고 크기가 134 킬로바이트인 "14497-005-228_Seqlisting.txt"라는 이름의 텍스트 파일로서 본 출원과 함께 제출된 서열 목록을 참조로 포함한다.
1. 분야
역위 반복, 발현 카세트 및 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 하나 이상의 제한 부위를 포함하는 이중 가닥 DNA 분자, 이의 사용 방법 및 이의 제조 방법이 본원에 제공된다.
2. 배경기술
유전자 요법은 유전자를 표적 세포에 도입하여 질환을 치료하거나 예방하는 것을 목표로 한다. 전사 카세트에 활성 유전자 산물(때때로 전이유전자로도 지칭됨)을 공급함으로써, 유전자 요법을 적용하면, 유전자 산물이 긍정적인 기능 효과를 얻을 수 있거나, 부정적인 기능 효과를 상실할 수 있거나, 예컨대 암을 앓고 있는 환자에서 세포 용해 효과를 가질 수 있는 또 다른 결과를 초래할 수 있으므로, 임상적 결과를 개선할 수 있다. 환자의 표적 세포에서 교정 유전자의 전달 및 발현은, 비-바이러스 전달(예를 들어, 리포좀) 또는 조작된 바이러스 및 바이러스 유전자 전달 벡터 사용을 포함하는 바이러스 전달 방법을 포함하여, 수많은 방법을 통해 수행될 수 있다. 바이러스 입자(예를 들어, 재조합 레트로바이러스, 재조합 렌티바이러스, 재조합 아데노바이러스 등)로도 알려진 이용가능한 바이러스 유래 벡터 중에서, AAV 시스템은 유전자 요법에서 다용도 벡터로서 인기를 얻고 있다.
그러나, 바이러스 입자를 유전자 전달 벡터로 사용하는 데 몇 가지 주요 결함이 있다. 하나의 주요 결점은 전사 카세트를 바이러스 입자로 패키징하기 위한 바이러스 수명 주기 및 바이러스 단백질에 대한 의존성이다. 그 결과, 바이러스 벡터의 사용은, 전이유전자의 크기(예를 들어, AAV에 대한 150,000 Da 미만의 단백질 코딩 능력) 또는 효율적인 복제 및 패키징(예를 들어, Rep-결합 요소)을 보장하기 위해 존재해야 하는 특정 바이러스 서열에 대한 요건의 측면에서 제한되었으며, 이들은 발현 카세트를 차례로 불안정하게 할 수 있다. 따라서, 큰 전이유전자(예를 들어, 150,000 Da보다 큰 단백질을 인코딩하는 전이유전자 또는 약 4.7 Kb보다 긴 전이유전자)를 전달하기 위해 하나 초과의 바이러스 입자가 필요할 수 있다. 2개 이상의 AAV 구성물의 사용은 AAV 게놈의 재활성화 위험을 증가시킬 수 있다. 또한, 바이러스 Rep 또는 비구조적 단백질 1 결합 요소를 사용하면 환자에서 벡터 가동화의 위험을 증가시킬 수 있다.
두 번째 결점은 유전자 요법에 사용되는 바이러스 입자가 종종 인구의 하위 집합이 평생 동안 노출된 적이 있는 야생형 바이러스로부터 유래된다는 것이다. 이러한 환자는 문헌 [Snyder, Richard O., and Philippe Moullier. Adeno-associated virus : methods and protocols. Totowa, NJ: Humana Press, 2011]에 추가로 기재된 바와 같이, 유전자 요법 효능을 차례로 저해할 수 있는 중화 항체를 갖는 것으로 밝혀졌다. 나머지 혈청음성 환자의 경우, 바이러스 벡터의 캡시드는 종종 면역원성이며, 초기 용량이 충분하지 않거나 요법이 중단될 경우 바이러스 벡터 요법을 환자에게 재투여하는 것을 방지한다.
이와 같이, 바이러스 입자에 대한 대안으로서 비-바이러스, 캡시드-미포함 AAV 기반 유전자 요법, 특히 큰 전이유전자의 전달을 필요로 하는 요법에 대한 미충족된 필요성이 있다. 또한, 원형 플라스미드 DNA와 비교하여 장기간 발현을 가능하게 하는, 세포 핵에 더 큰 안정성을 부여하기 위한 캡시드-미포함 AAV 벡터에 대한 필요성이 있다. 추가로, 이들에 대해 인코딩하는 이러한 바이러스 단백질 또는 바이러스 DNA 서열이 캡시드 미포함 바이러스 벡터의 단리된 DNA를 오염시킬 수 있기 때문에, 바이러스 복제 기구(예를 들어, AAV Rep 유전자)를 인코딩하는 플라스미드 또는 DNA 서열의 공동-존재 없이 숙주 세포에서 이러한 캡시드 미포함 벡터를 제조하는 방법에 대한 미충족된 필요성이 있다. 더욱이, 개선된 제조 및/또는 발현 특성을 갖는 재조합 DNA 벡터에 대한 중요한 미충족 필요성이 남아 있다. 또한, 효능 손실(예를 들어, 중화 항체로 인해) 또는 전이유전자-발현 세포의 손실 없이 반복 투여가 가능하여 항-바이러스(예를 들어, 바이러스 캡시드, 톨 유사 수용체 활성화 등) 면역 반응을 유발하지 않는 DNA 기반 벡터에 대한 미충족된 필요성이 있다.
하나의 양태에서,
a. 닉킹이 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제1 역위 반복 또는 이의 단편을 포함하는 상부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복;
b. 발현 카세트; 및
c. 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복 또는 이의 단편을 포함하는 상부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다.
이러한 양태의 특정 실시양태에서,
a. 제1 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
b. 제2 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
c. 제3 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
d. 제4 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고;
제1 닉 및 제4 닉은 상부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제1 닉은 상부 가닥의 5' 말단에 더 가까운 것이고, 제4 닉은 상부 가닥의 3' 말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉 및 제3 닉은 하부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제3 닉은 하부 가닥의 5'말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉은 하부 가닥의 3'말단에 더 가까운 것이다.
하나의 양태에서,
a. 닉킹이 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제1 역위 반복을 포함하는 하부 가닥 3' 오버행을 초래하도록 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복;
b. 발현 카세트; 및
c. 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복을 포함하는 하부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다.
이러한 양태의 특정 실시양태에서,
a. 제1 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
b. 제2 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
c. 제3 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
d. 제4 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고;
제1 닉 및 제4 닉은 상부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제1 닉은 상부 가닥의 5' 말단에 더 가까운 것이고, 제4 닉은 상부 가닥의 3' 말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉 및 제3 닉은 하부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제3 닉은 하부 가닥의 5'말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉은 하부 가닥의 3'말단에 더 가까운 것이다.
하나의 양태에서,
a. 닉킹이 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 상부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복;
b. 발현 카세트; 및
c. 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복을 포함하는 하부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다.
이러한 양태의 특정 실시양태에서,
a. 제1 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
b. 제2 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
c. 제3 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
d. 제4 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고;
제1 닉 및 제4 닉은 상부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제1 닉은 상부 가닥의 5' 말단에 더 가까운 것이고, 제4 닉은 상부 가닥의 3' 말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉 및 제3 닉은 하부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제3 닉은 하부 가닥의 5'말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉은 하부 가닥의 3'말단에 더 가까운 것이다.
하나의 양태에서,
a. 닉킹이 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제1 역위 반복을 포함하는 하부 가닥 3' 오버행을 초래하도록 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복;
b. 발현 카세트; 및
c. 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복을 포함하는 상부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다.
이러한 양태의 특정 실시양태에서,
a. 제1 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
b. 제2 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
d. 제3 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
e. 제4 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고;
제1 닉 및 제4 닉은 상부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제1 닉은 상부 가닥의 5' 말단에 더 가까운 것이고, 제4 닉은 상부 가닥의 3' 말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉 및 제3 닉은 하부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제3 닉은 하부 가닥의 5'말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉은 하부 가닥의 3'말단에 더 가까운 것이다.
특정 실시양태에서, 제1 닉, 제2 닉, 제3 닉 및/또는 제4 닉은 역위 반복 안에 있다. 특정 실시양태에서, 제1 닉, 제2 닉, 제3 닉 및/또는 제4 닉은 역위 반복 밖에 있다.
특정 실시양태에서, 이중 가닥 DNA 분자는 단리된 DNA 분자이다.
특정 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위는 모두 동일한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위이다.
특정 실시양태에서, 제1 및 제2 역위 반복은 동일하다. 특정 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 역위 반복은 파보바이러스의 ITR이다. 특정 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 역위 반복은 파보바이러스의 변형된 ITR이다. 특정 실시양태에서, 파보바이러스는 디펜도파보바이러스, 보카파보바이러스, 에리트로파보바이러스, 프로토파보바이러스 또는 테트라파보바이러스이다. 특정 실시양태에서, 변형된 ITR의 뉴클레오티드 서열은 파보바이러스의 ITR과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
특정 실시양태에서, 이중 가닥 DNA 분자는 플라스미드이다.
특정 실시양태에서, 플라스미드는 박테리아 복제 기점을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 플라스미드는 영역 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서 제한 효소 부위를 추가로 포함하고, 제한 효소 부위는 제1 역위 반복, 제2 역위 반복, 및 제1 및 제2 역위 반복 사이의 영역 중 어디에도 존재하지 않는다. 특정 실시양태에서, 제한 효소에 의한 절단이 제1 및/또는 제2 역위 반복의 어닐링에 알맞은 조건 하에서 검출가능한 수준으로 어닐링하지 않는 단일 가닥 오버행을 초래한다. 특정 실시양태에서, 플라스미드는 제한 효소를 인코딩하는 개방형 해독틀을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 제한 효소의 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다.
하나의 양태에서, 헤어핀-말단 DNA를 제조하기 위한 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은
a. 이전 단락에 기재된 이중 가닥 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 이중 가닥 DNA 분자의 증폭을 초래하는 조건 하에서 배양하는 단계;
b. 숙주 세포로부터 이중 가닥 DNA 분자를 방출하는 단계;
c. 4개의 닉을 초래하는 4개의 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 이중 가닥 DNA 분자를 항온처리하는 단계;
d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계;
e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 77.d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계;
f. 제한 효소와 단계 77.d로부터 생성된 이중 가닥 DNA 분자 또는 단편을 항온처리함으로써 이중 가닥 DNA 분자 또는 이중 가닥 DNA 분자의 단편을 절단하는 단계; 및
g. 엑소뉴클레아제와 이중 가닥 DNA 분자의 단편을 항온처리함으로써 단계 77.e로부터 생성된 단편을 제외한 이중 가닥 DNA 분자의 단편을 분해하는 단계
를 포함한다.
특정 실시양태에서, 플라스미드는 영역 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 및 제6 제한 부위를 추가로 포함하고, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 및 제6 제한 부위는, a. 대향하는 가닥에 있고; b. 파단의 단일 가닥 오버행이 제1 및/또는 제2 역위 반복의 어닐링에 알맞은 조건 하에 분자간 또는 분자내 검출가능한 수준으로 어닐링하지 않도록 이중 가닥 DNA 분자의 파단을 생성한다. 특정 실시양태에서, 제5 및 제6 닉은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드로 떨어져 있다. 특정 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 제한 부위는 모두 동일한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열이다. 특정 실시양태에서, 플라스미드는 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및/또는 제6 제한 부위를 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 개방형 해독틀을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제의 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 특정 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 및 제6 제한 부위를 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제는 Nt. BsmAI; Nt. BtsCI; N. ALwl; N. BstNBI; N. BspD6I; Nb. Mva1269I; Nb. BsrDI; Nt. BtsI; Nt. BsaI; Nt. Bpu10I; Nt. BsmBI; Nb. BbvCI; Nt. BbvCI; 또는 Nt. BspQI이다.
하나의 양태에서, 헤어핀-말단 DNA를 제조하기 위한 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은
a. 이전 단락에 기재된 이중 가닥 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 이중 가닥 DNA 분자의 증폭을 초래하는 조건 하에서 배양하는 단계;
b. 숙주 세포로부터 이중 가닥 DNA 분자를 방출하는 단계;
c. 4개의 닉을 초래하는 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 이중 가닥 DNA 분자를 항온처리하는 단계;
d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계;
e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 78.d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계;
f. 이중 가닥 DNA 분자의 파단을 초래하는 제5 및 제6 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 단계 78.d로부터 생성된 이중 가닥 DNA 분자 또는 단편을 항온처리하는 단계; 및
g. 엑소뉴클레아제와 이중 가닥 DNA 분자의 단편을 항온처리함으로써 단계 78.e로부터 생성된 단편을 제외한 이중 가닥 DNA 분자의 단편을 분해하는 단계
를 포함한다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제 부위는 내인성 닉킹 엔도뉴클레아제의 표적 서열이다.
특정 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 제한 부위를 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제는 Nt. BsmAI; Nt. BtsCI; N. ALwl; N. BstNBI; N. BspD6I; Nb. Mva1269I; Nb. BsrDI; Nt. BtsI; Nt. BsaI; Nt. Bpu10I; Nt. BsmBI; Nb. BbvCI; Nt. BbvCI; 또는 Nt. BspQI이다.
다양한 실시양태에서, 발현 카세트는 전사 단위에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 전사 단위는 개방형 해독틀을 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 전사후 조절 요소를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 폴리아데닐화 및 종결 신호를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트의 크기는 적어도 4 kb, 적어도 4.5 kb, 적어도 5 kb, 적어도 5.5 kb, 적어도 6 kb, 적어도 6.5 kb, 적어도 7 kb, 적어도 7.5 kb, 적어도 8 kb, 적어도 8.5 kb, 적어도 9 kb, 적어도 9.5 kb 또는 적어도 10 kb이다.
하나의 양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위한 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은
a. 상기 이중 가닥 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 이중 가닥 DNA 분자의 증폭을 초래하는 조건 하에서 배양하는 단계;
b. 숙주 세포로부터 이중 가닥 DNA 분자를 방출하는 단계;
c. 4개의 닉을 초래하는 4개의 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 이중 가닥 DNA 분자를 항온처리하는 단계;
d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계;
e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 76.d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계
를 포함한다.
본원에 기재된 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위한 방법의 특정 실시양태에서, 방법은 h. 리가아제로 닉을 보수하여 원형 DNA를 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위한 방법의 특정 실시양태에서, 단계는 실시양태에서 나타난 순서대로 수행된다.
본원에 기재된 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위한 방법의 특정 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA는 2개의 헤어핀-말단으로 구성된다.
본원에 기재된 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위한 방법의 특정 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA는 바이러스 게놈이다. 특정 실시양태에서, 바이러스 게놈은 파보바이러스 게놈이다. 특정 실시양태에서, 파보바이러스는 디펜도파보바이러스, 보카파보바이러스, 에리트로파보바이러스, 프로토파보바이러스 또는 테트라파보바이러스이다.
하나의 양태에서, 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 이는 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로
a. 제1 헤어핀화된 역위 반복;
b. 하부 가닥의 닉;
c. 발현 카세트;
d. 하부 가닥의 닉; 및
e. 제2 헤어핀화된 역위 반복
을 포함한다.
하나의 양태에서, 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 이는 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로
a. 제1 헤어핀화된 역위 반복;
b. 상부 가닥의 닉;
c. 발현 카세트;
d. 상부 가닥의 닉; 및
e. 제2 헤어핀화된 역위 반복
을 포함한다.
하나의 양태에서, 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 이는 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로
a. 제1 헤어핀화된 역위 반복;
b. 하부 가닥의 닉;
c. 발현 카세트;
d. 상부 가닥의 닉; 및
e. 제2 헤어핀화된 역위 반복
을 포함한다.
하나의 양태에서, 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 이는 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로
a. 제1 헤어핀화된 역위 반복;
b. 상부 가닥의 닉;
c. 발현 카세트;
d. 하부 가닥의 닉; 및
e. 제2 헤어핀화된 역위 반복
을 포함한다.
특정 실시양태에서, 이중 가닥 DNA 분자는 단리된 DNA 분자이다.
특정 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 역위 반복은 파보바이러스의 ITR이다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 역위 반복은 동일하다. 특정 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 역위 반복은 파보바이러스의 변형된 ITR이다. 특정 실시양태에서, 파보바이러스는 디펜도파보바이러스, 보카파보바이러스, 에리트로파보바이러스, 프로토파보바이러스 또는 테트라파보바이러스이다. 특정 실시양태에서, 변형된 ITR의 뉴클레오티드 서열은 파보바이러스의 ITR과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
다양한 실시양태에서, 발현 카세트는 전사 단위에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 전사 단위는 개방형 해독틀을 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 전사후 조절 요소를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 폴리아데닐화 및 종결 신호를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트의 크기는 적어도 4 kb, 적어도 4.5 kb, 적어도 5 kb, 적어도 5.5 kb, 적어도 6 kb, 적어도 6.5 kb, 적어도 7 kb, 적어도 7.5 kb, 적어도 8 kb, 적어도 8.5 kb, 적어도 9 kb, 적어도 9.5 kb 또는 적어도 10 kb이다.
특정 실시양태에서, 이중 가닥 DNA 분자는 엑소뉴클레아제로부터 보호된다. 특정 실시양태에서, 엑소뉴클레아제는 RecBCD 엑소뉴클레아제이다.
특정 실시양태에서, 이중 가닥 DNA 분자는 적어도 하나의 복제 관련 단백질 결합 서열(“RABS”)이 결여된다. 특정 실시양태에서, 이중 가닥 DNA 분자는 복제 관련 단백질(“RAP”) 인코딩 서열이 결여된다. 특정 실시양태에서, 이중 가닥 DNA 분자는 바이러스 캡시드 단백질 인코딩 서열이 결여된다. 특정 실시양태에서, 제1 역위 반복은 적어도 하나의 RABS가 결여된다. 특정 실시양태에서, 제2 역위 반복은 적어도 하나의 RABS가 결여된다. 특정 실시양태에서, 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 및 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 사이의 DNA 서열은 적어도 하나의 RABS가 결여된다. 특정 실시양태에서, 제1 역위 반복은 적어도 하나의 RABS가 결여되고, 제2 역위 반복은 적어도 하나의 RABS가 결여된다.
특정 실시양태에서, 이중 가닥 DNA 분자는 말단 분해 부위(TRS)가 결여된다. 특정 실시양태에서, 제1 역위 반복은 TRS가 결여된다. 특정 실시양태에서, 제2 역위 반복은 TRS가 결여된다. 특정 실시양태에서, 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 및 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 사이의 DNA 서열은 TRS가 결여된다. 특정 실시양태에서, 제1 역위 반복은 TRS가 결여되고, 제2 역위 반복은 TRS가 결여된다.
특정 실시양태에서, 숙주에 투여될 때 이중 가닥 DNA 분자의 가동화 위험은 적어도 하나의 RABS 및/또는 TRS를 가진 대조군 DNA 분자보다 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50%만큼 더 낮다.
이중 가닥 DNA 분자에 TRS가 결여된 특정 실시양태에서, 숙주에 투여될 때 이중 가닥 DNA 분자의 가동화 위험은 TRS를 가진 대조군 DNA 분자보다 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50%만큼 더 낮다.
이중 가닥 DNA 분자에 적어도 하나의 RABS가 결여되고 TRS가 결여된 특정 실시양태에서, 숙주에 투여될 때 이중 가닥 DNA 분자의 가동화 위험은 적어도 하나의 RABS 및 TRS를 가진 대조군 DNA 분자보다 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50%만큼 더 낮다.
하나의 양태에서, 본원에 기재된 단리된 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 단리된 이중 가닥 DNA 분자는 이중 가닥 DNA 분자의 단편이 없다.
하나의 양태에서, 본원에 기재된 단리된 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 이중 가닥 DNA 분자의 단편은 단리된 이중 가닥 DNA 분자의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 이하이다.
하나의 양태에서, 본원에 기재된 단리된 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 단리된 이중 가닥 DNA 분자는 이중 가닥 DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질이 없다.
하나의 양태에서, 본원에 기재된 단리된 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 이중 가닥 DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질은 단리된 이중 가닥 DNA 분자의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 미만이다.
하나의 양태에서, 본원에 기재된 단리된 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 단리된 이중 가닥 DNA 분자는 배큘로바이러스 DNA가 없다.
하나의 양태에서, 본원에 기재된 단리된 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 배큘로바이러스 DNA는 단리된 이중 가닥 DNA 분자의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 미만이다.
하나의 양태에서, 본원에 기재된 이중 가닥 DNA 분자를 포함하는 전달 비히클이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 전달 비히클은 하이브리도좀, 리포좀 또는 지질 나노입자를 포함한다.
3.1 예시적인 실시양태 세트 1:
실시양태 1.
a. 닉킹이 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제1 역위 반복 또는 이의 단편을 포함하는 상부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복;
b. 발현 카세트; 및
c. 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복 또는 이의 단편을 포함하는 상부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 2.
a. 닉킹이 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제1 역위 반복을 포함하는 하부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복;
b. 발현 카세트; 및
c. 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복을 포함하는 하부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 3.
a. 닉킹이 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제1 역위 반복을 포함하는 상부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복;
b. 발현 카세트; 및
c. 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복을 포함하는 하부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 4.
a. 닉킹이 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제1 역위 반복을 포함하는 하부 가닥 3' 오버행을 초래하도록 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복;
b. 발현 카세트; 및
c. 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복을 포함하는 상부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인 제2 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자는 단리된 DNA 분자인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위는 모두 동일한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 7. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 역위 반복은 동일한, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 8. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 제1 및/또는 제2 역위 반복은 파보바이러스의 ITR인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 9. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 제1 및/또는 제2 역위 반복은 파보바이러스의 변형된 ITR인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 10. 실시양태 8 또는 9에 있어서, 파보바이러스는 디펜도파보바이러스, 보카파보바이러스, 에리트로파보바이러스, 프로토파보바이러스 또는 테트라파보바이러스인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 11. 실시양태 9에 있어서, 변형된 ITR의 뉴클레오티드 서열은 파보바이러스의 ITR과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 적어도 99% 동일한, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 12. 실시양태 1 내지 5에 있어서,
a. 제1 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
b. 제2 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
c. 제3 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
d. 제4 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고;
제1 닉 및 제4 닉은 상부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제1 닉은 상부 가닥의 5' 말단에 더 가까운 것이고, 제4 닉은 상부 가닥의 3' 말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉 및 제3 닉은 하부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제3 닉은 하부 가닥의 5'말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉은 하부 가닥의 3'말단에 더 가까운 것인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 13. 실시양태 2 또는 5에 있어서,
a. 제1 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
b. 제2 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
c. 제3 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
d. 제4 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고;
제1 닉 및 제4 닉은 상부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제1 닉은 상부 가닥의 5' 말단에 더 가까운 것이고, 제4 닉은 상부 가닥의 3' 말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉 및 제3 닉은 하부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제3 닉은 하부 가닥의 5'말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉은 하부 가닥의 3'말단에 더 가까운 것인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 14. 실시양태 3 또는 5에 있어서,
a. 제1 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
b. 제2 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
c. 제3 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
d. 제4 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고;
제1 닉 및 제4 닉은 상부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제1 닉은 상부 가닥의 5' 말단에 더 가까운 것이고, 제4 닉은 상부 가닥의 3' 말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉 및 제3 닉은 하부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제3 닉은 하부 가닥의 5'말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉은 하부 가닥의 3'말단에 더 가까운 것인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 15. 실시양태 4 또는 5에 있어서,
a. 제1 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
b. 제2 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
c. 제3 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
d. 제4 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고;
제1 닉 및 제4 닉은 상부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제1 닉은 상부 가닥의 5' 말단에 더 가까운 것이고, 제4 닉은 상부 가닥의 3' 말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉 및 제3 닉은 하부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제3 닉은 하부 가닥의 5'말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉은 하부 가닥의 3'말단에 더 가까운 것인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 16. 실시양태 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 제1 닉, 제2 닉, 제3 닉 및/또는 제4 닉은 역위 반복 안에 있는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 17. 실시양태 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 제1 닉, 제2 닉, 제3 닉 및/또는 제4 닉은 역위 반복 밖에 있는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 18. 실시양태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자는 플라스미드인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 19. 실시양태 18에 있어서, 플라스미드는 박테리아 복제 기점을 추가로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 20. 실시양태 18에 있어서, 플라스미드는 영역은 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서 제한 효소 부위를 추가로 포함하고, 제한 효소 부위는 제1 역위 반복, 제2 역위 반복, 및 제1 및 제2 역위 반복 사이의 영역 중 어디에도 존재하지 않는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 21. 실시양태 20에 있어서, 제한 효소에 의한 절단은 제1 및/또는 제2 역위 반복의 어닐링에 알맞은 조건 하에서 검출가능한 수준으로 어닐링하지 않는 단일 가닥 오버행을 초래하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 22. 실시양태 20에 있어서, 플라스미드는 제한 효소를 인코딩하는 개방형 해독틀을 추가로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 23. 실시양태 22에 있어서, 제한 효소의 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 있는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 24. 실시양태 18에 있어서, 플라스미드는 영역 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 및 제6 제한 부위를 추가로 포함하고, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 및 제6 제한 부위는:
a. 대향하는 가닥에 있고;
b. 파단의 단일 가닥 오버행이 제1 및/또는 제2 역위 반복의 어닐링에 알맞은 조건 하에 분자간 또는 분자내 검출가능한 수준으로 어닐링하지 않도록, 이중 가닥 DNA 분자의 파단을 생성하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 25. 실시양태 24에 있어서, 제5 및 제6 닉은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드로 떨어져 있는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 26. 실시양태 24에 있어서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 제한 부위는 모두 동일한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 27. 실시양태 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제 부위는 내인성 닉킹 엔도뉴클레아제의 표적 서열인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 28. 실시양태 24 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 플라스미드는 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및/또는 제6 제한 부위를 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 개방형 해독틀을 추가로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 29. 실시양태 28에 있어서, 닉킹 엔도뉴클레아제의 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 있는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 30. 실시양태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 제한 부위를 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제는 Nt. BsmAI; Nt. BtsCI; N. ALwl; N. BstNBI; N. BspD6I; Nb. Mva1269I; Nb. BsrDI; Nt. BtsI; Nt. BsaI; Nt. Bpu10I; Nt. BsmBI; Nb. BbvCI; Nt. BbvCI; 또는 Nt. BspQI인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 31. 실시양태 24에 있어서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 및 제6 제한 부위를 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제는 Nt. BsmAI; Nt. BtsCI; N. ALwl; N. BstNBI; N. BspD6I; Nb. Mva1269I; Nb. BsrDI; Nt. BtsI; Nt. BsaI; Nt. Bpu10I; Nt. BsmBI; Nb. BbvCI; Nt. BbvCI; 또는 Nt. BspQI인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 32. 실시양태 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트는 전사 단위에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 33. 실시양태 32에 있어서, 전사 단위는 개방형 해독틀을 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 34. 실시양태 32 또는 33에 있어서, 발현 카세트는 전사후 조절 요소를 추가로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 35. 실시양태 32 또는 33에 있어서, 발현 카세트는 폴리아데닐화 및 종결 신호를 추가로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 36. 실시양태 32 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트의 크기는 적어도 4 kb, 적어도 4.5 kb, 적어도 5 kb, 적어도 5.5 kb, 적어도 6 kb, 적어도 6.5 kb, 적어도 7 kb, 적어도 7.5 kb, 적어도 8 kb, 적어도 8.5 kb, 적어도 9 kb, 적어도 9.5 kb 또는 적어도 10 kb인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 37.
a. 제1 헤어핀화된 역위 반복;
b. 하부 가닥의 닉;
c. 발현 카세트;
d. 하부 가닥의 닉; 및
e. 제2 헤어핀화된 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 38.
a. 제1 헤어핀화된 역위 반복;
b. 상부 가닥의 닉;
c. 발현 카세트;
d. 상부 가닥의 닉; 및
e. 제2 헤어핀화된 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 39.
a. 제1 헤어핀화된 역위 반복;
b. 하부 가닥의 닉;
c. 발현 카세트;
d. 상부 가닥의 닉; 및
e. 제2 헤어핀화된 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 40.
a. 제1 헤어핀화된 역위 반복;
b. 상부 가닥의 닉;
c. 발현 카세트;
d. 하부 가닥의 닉; 및
e. 제2 헤어핀화된 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 41. 실시양태 37 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 단리된 DNA 분자인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 42. 실시양태 37 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 제1 및/또는 제2 역위 반복은 파보바이러스의 ITR인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 43. 실시양태 37 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 역위 반복은 동일한, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 44. 실시양태 37 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 제1 및/또는 제2 역위 반복은 파보바이러스의 변형된 ITR인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 45. 실시양태 42 또는 44에 있어서, 파보바이러스는 디펜도파보바이러스, 보카파보바이러스, 에리트로파보바이러스, 프로토파보바이러스 또는 테트라파보바이러스인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 46. 실시양태 45에 있어서, 변형된 ITR의 뉴클레오티드 서열은 파보바이러스의 ITR과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 적어도 99% 동일한, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 47. 실시양태 37 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트는 전사 단위에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 48. 실시양태 47에 있어서, 전사 단위는 개방형 해독틀을 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 49. 실시양태 47 또는 48에 있어서, 발현 카세트는 전사후 조절 요소를 추가로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 50. 실시양태 47 또는 48에 있어서, 발현 카세트는 폴리아데닐화 및 종결 신호를 추가로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 51. 실시양태 37 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트의 크기는 적어도 4 kb, 적어도 4.5 kb, 적어도 5 kb, 적어도 5.5 kb, 적어도 6 kb, 적어도 6.5 kb, 적어도 7 kb, 적어도 7.5 kb, 적어도 8 kb, 적어도 8.5 kb, 적어도 9 kb, 적어도 9.5 kb 또는 적어도 10 kb인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 52. 실시양태 37 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자는 엑소뉴클레아제로부터 보호되는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 53. 실시양태 52에 있어서, 엑소뉴클레아제는 RecBCD 엑소뉴클레아제인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 54. 실시양태 1 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자는 적어도 하나의 복제 관련 단백질 결합 서열("RABS")이 결여된, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 55. 실시양태 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자는 복제 관련 단백질("RAP") 인코딩 서열이 결여된, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 56. 실시양태 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자는 바이러스 캡시드 단백질 인코딩 서열이 결여된, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 57. 실시양태 1 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 제1 역위 반복은 적어도 하나의 RABS가 결여된, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 58. 실시양태 1 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 제2 역위 반복은 적어도 하나의 RABS가 결여된, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 59. 실시양태 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 및 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 사이의 DNA 서열은 적어도 하나의 RABS가 결여된, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 60. 실시양태 1 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 제1 역위 반복은 적어도 하나의 RABS가 결여되고, 제2 역위 반복은 적어도 하나의 RABS가 결여된, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 61. 실시양태 1 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자는 말단 분해 부위(TRS)가 결여된, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 62. 실시양태 1 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 제1 역위 반복은 TRS가 결여된, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 63. 실시양태 1 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 제2 역위 반복은 TRS가 결여된, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 64. 실시양태 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 및 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 사이의 DNA 서열은 TRS가 결여된, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 65. 실시양태 1 내지 64 중 어느 하나에 있어서,
제1 역위 반복은 TRS가 결여되고 제2 역위 반복은 TRS가 결여된, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 66. 실시양태 53 및 56 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 숙주에 투여될 때 이중 가닥 DNA 분자의 가동화 위험은 적어도 하나의 RABS 및/또는 TRS를 가진 대조군 DNA 분자보다 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50%만큼 더 낮은, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 67. 실시양태 53 및 56 내지 64 중 어느 하나에 있어서, TRS가 결여되고, 숙주에 투여될 때 이중 가닥 DNA 분자의 가동화 위험이 TRS를 가진 대조군 DNA 분자보다 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50%만큼 더 낮은, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 68. 실시양태 53 및 56 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 RABS가 결여되고, TRS가 결여되고, 숙주에 투여될 때 이중 가닥 DNA 분자의 가동화 위험이 적어도 하나의 RABS 및 TRS를 가진 대조군 DNA 분자보다 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50%만큼 더 낮은, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 69. 실시양태 5 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 단리된 이중 가닥 DNA 분자는 이중 가닥 DNA 분자의 단편이 없는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 70. 실시양태 5 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자의 단편은 단리된 이중 가닥 DNA 분자의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 이하인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 71. 실시양태 5 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 단리된 이중 가닥 DNA 분자는 이중 가닥 DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질이 없는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 72. 실시양태 5 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질은 단리된 이중 가닥 DNA 분자의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 미만인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 73. 실시양태 5 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 단리된 이중 가닥 DNA 분자는 배큘로바이러스 DNA가 없는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 74. 실시양태 5 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 배큘로바이러스 DNA는 단리된 이중 가닥 DNA 분자의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 미만인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 75. 실시양태 37 내지 73 중 어느 하나의 이중 가닥 DNA 분자를 포함하는, 전달 비히클.
실시양태 76. 실시양태 74에 있어서, 하이브리도좀, 리포좀 또는 지질 나노입자를 포함하는, 전달 비히클.
실시양태 77. 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
a. 실시양태 1 내지 35 중 어느 하나의 이중 가닥 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 이중 가닥 DNA 분자의 증폭을 초래하는 조건 하에서 배양하는 단계;
b. 숙주 세포로부터 이중 가닥 DNA 분자를 방출하는 단계;
c. 4개의 닉을 초래하는 4개의 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 이중 가닥 DNA 분자를 항온처리하는 단계;
d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계;
e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 76.d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계
를 포함한다.
실시양태 78. 헤어핀-말단 DNA를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
a. 실시양태 20의 이중 가닥 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 이중 가닥 DNA 분자의 증폭을 초래하는 조건 하에서 배양하는 단계;
b. 숙주 세포로부터 이중 가닥 DNA 분자를 방출하는 단계;
c. 4개의 닉을 초래하는 4개의 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 이중 가닥 DNA 분자를 항온처리하는 단계;
d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계;
e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 77.d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계;
f. 제한 효소와 단계 77.d로부터 생성된 이중 가닥 DNA 분자 또는 단편을 항온처리함으로써 이중 가닥 DNA 분자 또는 이중 가닥 DNA 분자의 단편을 절단하는 단계; 및
g. 엑소뉴클레아제와 이중 가닥 DNA 분자의 단편을 항온처리함으로써 단계 77.e로부터 생성된 단편을 제외한 이중 가닥 DNA 분자의 단편을 분해하는 단계
를 포함한다.
실시양태 79. 헤어핀-말단 DNA를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
a. 실시양태 24의 이중 가닥 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 이중 가닥 DNA 분자의 증폭을 초래하는 조건 하에서 배양하는 단계;
b. 숙주 세포로부터 이중 가닥 DNA 분자를 방출하는 단계;
c. 4개의 닉을 초래하는 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 이중 가닥 DNA 분자를 항온처리하는 단계;
d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계;
e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 78.d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계;
f. 이중 가닥 DNA 분자의 파단을 초래하는 제5 및 제6 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 단계 78.d로부터 생성된 이중 가닥 DNA 분자 또는 단편을 항온처리하는 단계; 및
g. 엑소뉴클레아제와 이중 가닥 DNA 분자의 단편을 항온처리함으로써 단계 78.e로부터 생성된 단편을 제외한 이중 가닥 DNA 분자의 단편을 분해하는 단계
를 포함한다.
실시양태 80. 실시양태 76, 77 또는 78에 있어서, h. 리가아제로 닉을 보수하여 원형 DNA를 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시양태 81. 실시양태 76 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 단계가 실시양태에 나타난 순서대로 수행되는 것인, 방법.
실시양태 82. 실시양태 76 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 헤어핀-말단 DNA는 2개의 헤어핀-말단으로 구성되는 것인, 방법.
실시양태 83. 실시양태 76 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 헤어핀-말단 DNA는 바이러스 게놈인, 방법.
실시양태 84. 실시양태 82에 있어서, 바이러스 게놈은 파보바이러스 게놈인, 방법.
실시양태 85. 실시양태 83에 있어서, 파보바이러스는 디펜도파보바이러스, 보카파보바이러스, 에리트로파보바이러스, 프로토파보바이러스 또는 테트라파보바이러스인, 방법.
3.2 예시적인 실시양태 세트 2:
실시양태 1.
a. 닉킹이 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제1 역위 반복을 포함하는 상부 가닥 5' 오버행을 초래하도록 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복;
b. 발현 카세트; 및
c. 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복을 포함하는 상부 가닥 3' 오버행을 초래하도록 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 2.
a. 닉킹이 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제1 역위 반복을 포함하는 하부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복;
b. 발현 카세트; 및
c. 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복을 포함하는 하부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 3.
a. 닉킹이 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제1 역위 반복을 포함하는 상부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복;
b. 발현 카세트; 및
c. 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복을 포함하는 하부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 4.
a. 닉킹이 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제1 역위 반복을 포함하는 하부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복;
b. 발현 카세트; 및
c. 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복을 포함하는 상부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 단리된 DNA 분자인, DNA 분자.
실시양태 6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위는 모두 동일한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위인, DNA 분자.
실시양태 7. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 역위 반복은 동일한, DNA 분자.
실시양태 8. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 제1 및/또는 제2 역위 반복은 파보바이러스의 ITR인, DNA 분자.
실시양태 9. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 제1 및/또는 제2 역위 반복은 파보바이러스의 변형된 ITR인, DNA 분자.
실시양태 10. 실시양태 8 또는 9에 있어서, 파보바이러스는 디펜도파보바이러스, 보카파보바이러스, 에리트로파보바이러스, 프로토파보바이러스 또는 테트라파보바이러스인, DNA 분자.
실시양태 11. 실시양태 9에 있어서, 변형된 ITR의 뉴클레오티드 서열은 파보바이러스의 ITR과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 적어도 99% 동일한, DNA 분자.
실시양태 12. 실시양태 1 또는 5에 있어서,
a. 제1 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
b. 제2 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
c. 제3 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
d. 제4 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있는, DNA 분자.
실시양태 13. 실시양태 2 또는 5에 있어서,
a. 제1 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
b. 제2 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
c. 제3 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
d. 제4 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있는, DNA 분자.
실시양태 14. 실시양태 3 또는 5에 있어서,
a. 제1 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
b. 제2 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
c. 제3 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
d. 제4 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있는, DNA 분자.
실시양태 15. 실시양태 4 또는 5에 있어서,
a. 제1 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
b. 제2 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
c. 제3 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
d. 제4 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있는, DNA 분자.
실시양태 16. 실시양태 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 닉은 역위 반복 안에 있는, DNA 분자.
실시양태 17. 실시양태 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 닉은 역위 반복의 밖에 있는, DNA 분자.
실시양태 18. 실시양태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 플라스미드인, DNA 분자.
실시양태 19. 실시양태 18에 있어서, 플라스미드는 박테리아 복제 기점을 추가로 포함하는, DNA 분자.
실시양태 20. 실시양태 18에 있어서, 플라스미드는 영역 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서 제한 효소 부위를 추가로 포함하고, 제한 효소 부위는 제1 역위 반복, 제2 역위 반복, 및 제1 및 제2 역위 반복 사이의 영역 중 어디에도 존재하지 않는, DNA 분자.
실시양태 21. 실시양태 20에 있어서, 제한 효소에 의한 절단이 제1 및/또는 제2 역위 반복의 어닐링에 알맞은 조건 하에서 검출가능한 수준으로 어닐링하지 않는 단일 가닥 오버행을 초래하는, DNA 분자.
실시양태 22. 실시양태 20에 있어서, 플라스미드는 제한 효소를 인코딩하는 개방형 해독틀을 추가로 포함하는, DNA 분자.
실시양태 23. 실시양태 22에 있어서, 제한 효소의 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 있는, DNA 분자.
실시양태 24. 실시양태 18에 있어서, 플라스미드는 영역 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 및 제6 제한 부위를 추가로 포함하고, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 및 제6 제한 부위는
a. 대향하는 가닥에 있고;
b. 파단의 단일 가닥 오버행이 제1 및/또는 제2 역위 반복의 어닐링에 알맞은 조건 하에 분자간 또는 분자내 검출가능한 수준으로 어닐링하지 않도록 이중 가닥 DNA 분자의 파단을 생성하는, DNA 분자.
실시양태 25. 실시양태 24에 있어서, 제5 및 제6 닉은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드로 떨어져 있는, DNA 분자.
실시양태 26. 실시양태 24에 있어서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 제한 부위는 모두 동일한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열인, DNA 분자.
실시양태 27. 실시양태 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제 부위는 내인성 닉킹 엔도뉴클레아제의 표적 서열인, DNA 분자.
실시양태 28. 실시양태 24 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 플라스미드는 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및/또는 제6 제한 부위를 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 개방형 해독틀을 추가로 포함하는, DNA 분자.
실시양태 29. 실시양태 28에 있어서, 닉킹 엔도뉴클레아제의 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 있는, DNA 분자.
실시양태 30. 실시양태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 제한 부위를 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제는 Nt. BsmAI; Nt. BtsCI; N. ALwl; N. BstNBI; N. BspD6I; Nb. Mva1269I; Nb. BsrDI; Nt. BtsI; Nt. BsaI; Nt. Bpu10I; Nt. BsmBI; Nb. BbvCI; Nt. BbvCI; 또는 Nt. BspQI인, DNA 분자.
실시양태 31. 실시양태 24에 있어서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 및 제6 제한 부위를 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제는 Nt. BsmAI; Nt. BtsCI; N. ALwl; N. BstNBI; N. BspD6I; Nb. Mva1269I; Nb. BsrDI; Nt. BtsI; Nt. BsaI; Nt. Bpu10I; Nt. BsmBI; Nb. BbvCI; Nt. BbvCI; 또는 Nt. BspQI인, DNA 분자.
실시양태 32. 실시양태 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트는 전사 단위에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, DNA 분자.
실시양태 33. 실시양태 32에 있어서, 전사 단위는 개방형 해독틀을 포함하는, DNA 분자.
실시양태 34. 실시양태 32 또는 33에 있어서, 발현 카세트는 전사후 조절 요소를 추가로 포함하는, DNA 분자.
실시양태 35. 실시양태 32 또는 33에 있어서, 발현 카세트는 폴리아데닐화 및 종결 신호를 추가로 포함하는, DNA 분자.
실시양태 36. 실시양태 32 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트의 크기는 적어도 4 kb, 적어도 4.5 kb, 적어도 5 kb, 적어도 5.5 kb, 적어도 6 kb, 적어도 6.5 kb, 적어도 7 kb, 적어도 7.5 kb, 적어도 8 kb, 적어도 8.5 kb, 적어도 9 kb, 적어도 9.5 kb 또는 적어도 10 kb인, DNA 분자.
실시양태 37.
a. 제1 헤어핀화된 역위 반복;
b. 하부 가닥의 닉;
c. 발현 카세트;
d. 하부 가닥의 닉; 및
e. 제2 헤어핀화된 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 38.
a. 제1 헤어핀화된 역위 반복;
b. 상부 가닥의 닉;
c. 발현 카세트;
d. 상부 가닥의 닉; 및
e. 제2 헤어핀화된 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 39.
a. 제1 헤어핀화된 역위 반복;
b. 하부 가닥의 닉;
c. 발현 카세트;
d. 상부 가닥의 닉; 및
e. 제2 헤어핀화된 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 40.
a. 제1 헤어핀화된 역위 반복;
b. 상부 가닥의 닉;
c. 발현 카세트;
d. 하부 가닥의 닉; 및
e. 제2 헤어핀화된 역위 반복
을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 41. 실시양태 37 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 단리된 DNA 분자인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 42. 실시양태 37 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 제1 및/또는 제2 역위 반복은 파보바이러스의 ITR인, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 43. 실시양태 37 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 역위 반복은 동일한, 이중 가닥 DNA 분자.
실시양태 44. 실시양태 37 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 제1 및/또는 제2 역위 반복은 파보바이러스의 변형된 ITR인, DNA 분자.
실시양태 45. 실시양태 42 또는 44에 있어서, 파보바이러스는 디펜도파보바이러스, 보카파보바이러스, 에리트로파보바이러스, 프로토파보바이러스 또는 테트라파보바이러스인, DNA 분자.
실시양태 46. 실시양태 45에 있어서, 변형된 ITR의 뉴클레오티드 서열은 파보바이러스의 ITR과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 적어도 99% 동일한, DNA 분자.
실시양태 47. 실시양태 37 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트는 전사 단위에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, DNA 분자.
실시양태 48. 실시양태 47에 있어서, 전사 단위는 개방형 해독틀을 포함하는, DNA 분자.
실시양태 49. 실시양태 47 또는 48에 있어서, 발현 카세트는 전사후 조절 요소를 추가로 포함하는, DNA 분자.
실시양태 50. 실시양태 47 또는 48에 있어서, 발현 카세트는 폴리아데닐화 및 종결 신호를 추가로 포함하는, DNA 분자.
실시양태 51. 실시양태 37 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트의 크기는 적어도 4 kb, 적어도 4.5 kb, 적어도 5 kb, 적어도 5.5 kb, 적어도 6 kb, 적어도 6.5 kb, 적어도 7 kb, 적어도 7.5 kb, 적어도 8 kb, 적어도 8.5 kb, 적어도 9 kb, 적어도 9.5 kb 또는 적어도 10 kb인, DNA 분자.
실시양태 52. 실시양태 37 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 엑소뉴클레아제로부터 보호되는, DNA 분자.
실시양태 53. 실시양태 52에 있어서, 엑소뉴클레아제는 RecBCD 엑소뉴클레아제인, DNA 분자.
실시양태 54. 실시양태 1 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 복제(Rep) 단백질 결합 부위가 결여된, DNA 분자.
실시양태 55. 실시양태 37 내지 51 중 어느 하나의 DNA 분자를 포함하는, 전달 비히클.
실시양태 56. 실시양태 55에 있어서, 하이브리도좀, 리포좀 또는 지질 나노입자를 포함하는, 전달 비히클.
실시양태 57. 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
a. 실시양태 1 내지 35 중 어느 하나의 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 DNA 분자의 증폭을 초래하는 조건 하에서 배양하는 단계;
b. 숙주 세포로부터 DNA 분자를 방출하는 단계;
c. 4개의 닉을 초래하는 4개의 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 DNA 분자를 항온처리하는 단계;
d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계;
e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계
를 포함한다.
실시양태 58. 헤어핀-말단 DNA를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
a. 실시양태 20의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를 플라스미드의 증폭을 초래하는 조건 하에서 배양하는 단계;
b. 숙주 세포로부터 플라스미드를 방출하는 단계;
c. 4개의 닉을 초래하는 4개의 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 DNA 분자를 항온처리하는 단계;
d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계;
e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계;
f. 제한 효소와 단계 d로부터 생성된 플라스미드 또는 단편을 항온처리함으로써 플라스미드 또는 플라스미드의 단편을 절단하는 단계; 및
g. 엑소뉴클레아제와 플라스미드의 단편을 항온처리함으로써 단계 e로부터 생성된 단편을 제외한 플라스미드의 단편을 분해하는 단계
를 포함한다.
실시양태 59. 헤어핀-말단 DNA를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
a. 실시양태 24의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를 플라스미드의 증폭을 초래하는 조건 하에서 배양하는 단계;
b. 숙주 세포로부터 플라스미드를 방출하는 단계;
c. 4개의 닉을 초래하는 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 DNA 분자를 항온처리하는 단계;
d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계;
e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계;
f. 이중 가닥 DNA 분자의 파단을 초래하는 제5 및 제6 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 단계 d로부터 생성된 플라스미드 또는 단편을 항온처리하는 단계; 및
g. 엑소뉴클레아제와 플라스미드의 단편을 항온처리함으로써 단계 e로부터 생성된 단편을 제외하고 플라스미드의 단편을 분해하는 단계
를 포함한다.
실시양태 60. 실시양태 57, 58 또는 59에 있어서, h. 리가아제로 닉을 보수하여 원형 DNA를 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시양태 61. 실시양태 57 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 단계는 실시양태에 나타난 순서대로 수행되는 것인, 방법.
실시양태 62. 실시양태 57 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 헤어핀-말단 DNA는 2개의 헤어핀-말단으로 구성된 것인, 방법.
실시양태 63. 실시양태 57 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 헤어핀-말단 DNA는 바이러스 게놈인, 방법.
실시양태 64. 실시양태 63에 있어서, 바이러스 게놈은 파보바이러스 게놈인, 방법.
실시양태 65. 실시양태 64에 있어서, 파보바이러스는 디펜도파보바이러스, 보카파보바이러스, 에리트로파보바이러스, 프로토파보바이러스 또는 테트라파보바이러스인, 방법.
도 1은 다양한 예시적인 헤어핀의 구조 및 헤어핀의 구조적 요소를 도시한다.
도 2a 및 2b는 가닥 사이의 분자간 힘뿐만 아니라 오버행 내의 예시적인 가닥 형태 및 분자내 힘을 보여주는 선형 상호작용 플롯을 도시하고, 도 2c는 도 2a 및 2b의 예상되는 어닐링된 구조를 도시한다.
도 3은 헤어핀의 다양한 예시적인 배열 및 다양한 제한 부위의 위치뿐만 아니라 헤어핀의 1차 스템에서 II 형 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위를 도시한다.
도 4는 다양한 예시적인 헤어핀의 구조 및 인간 미토콘드리아 DNA OriL 및 OriL 유래 ITR의 구조적 요소를 도시한다.
도 5는 예시적인 압타머 및 압타머 ITR의 헤어핀의 구조를 도시한다.
도 6은 실시예 1에 기재된 바와 같은 방법 단계를 수행한 후 구성물 1 및 구성물 1로부터의 DNA 산물의 시각화를 도시한다.
도 7은 실시예 1에 기재된 바와 같은 방법 단계를 수행한 후 구성물 2 및 구성물 1로부터의 DNA 산물의 시각화를 도시한다.
도 8a-8c는 실시예 2에 기재된 다중 재생/변성 주기를 도시한다.
도 9a-9b는 실시예 3에 기재된 바와 같은 구성물 1의 등온 변성을 도시한다.
도 10은 다양한 DNA 벡터 양으로부터 루시퍼라아제의 발현 수준을 도시한다. 세포를 하이브리도좀 또는 지질 나노입자와 함께 상이한 농도의 DNA 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후 루시퍼라아제 활성을 결정하였다.
도 11a-11d는 섹션 6.5(실시예 5 분열 및 비-분열 세포에서의 발현)에 기재된 바와 같이 분열 및 비-분열 세포에서의 루시퍼라아제 발현을 도시한다. 도 11a 및 11b는 분열(11a) 및 비-분열(11b) 세포에서 비-분비된 터보루크(Turboluc)(구성물 1)의 발현을 도시한다. 비-분비된 터보루크(구성물 1)의 경우, 루시퍼라제 활성은 2일차에 분열 세포에서 최고조에 달하는 한편, 비-분열 세포에서 발현이 계속 증가한다. 도 11c 및 11d는 비-분열 세포(11c) 및 분열 세포(11d)에서 분비된 터보루크(구성물 2)의 발현을 도시한다. 분비된 터보루크(구성물 2)의 경우, 루시퍼라아제 활성은 2일차에 분열 세포에서 최고조에 달하는 한편, 비-분열 세포에서는 발현이 증가한 후 9일 동안 안정적으로 유지된다. 직접적인 비교로서, 도 11c 및 11d에서 볼 수 있듯이, 구성물 2를 인코딩하는 등몰량의 완전한 원형 플라스미드도 형질감염하였고, 일반적으로 더 낮은 루시퍼라아제 활성이 기록되었으며, 이는 접힌 ITR을 갖는 정제된 구성물 2의 개선된 핵 전달을 시사한다.
도 12는 헤어핀 인코딩 플라스미드의 드 노보(de novo) 합성을 위한 벡터 구성 전략을 도시한다.
도 13은 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제 인식 부위에 대한 인식 부위를 생성하기 위한 서열 변형을 강조하는 AAV1로부터 유래된 ITR의 서열 정렬을 도시한다.
도 14는 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제 인식 부위에 대한 인식 부위를 생성하기 위한 서열 변형을 강조하는 AAV2로부터 유래된 ITR의 서열 정렬을 도시한다.
도 15는 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제 인식 부위에 대한 인식 부위를 생성하기 위한 서열 변형을 강조하는 AAV3로부터 유래된 ITR의 서열 정렬을 도시한다.
도 16은 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제 인식 부위에 대한 인식 부위를 생성하기 위한 서열 변형을 강조하는 AAV4 좌측으로부터 유래된 ITR의 서열 정렬을 도시한다.
도 17은 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제 인식 부위에 대한 인식 부위를 생성하기 위한 서열 변형을 강조하는 AAV4 우측으로부터 유래된 ITR의 서열 정렬을 도시한다.
도 18은 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제 인식 부위에 대한 인식 부위를 생성하기 위한 서열 변형을 강조하는 AAV5로부터 유래된 ITR의 서열 정렬을 도시한다.
도 19는 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제 인식 부위에 대한 인식 부위를 생성하기 위한 서열 변형을 강조하는 AAV7 좌측으로부터 유래된 ITR의 서열 정렬을 도시한다.
도 20a 및 20b는 각각 모체 플라스미드뿐만 아니라 결찰된 구성물 및 비-결찰된 구성물을 캡슐화하는 하이브리도좀으로 형질감염된 비-분열 간세포에서의 DNA 구성물의 성공적인 결찰 및 해당하는 루시퍼라아제 발현을 보여주는 아가로스 겔을 도시한다.
도 21은 LNP 또는 하이브리도좀에 캡슐화된 분비된 루시퍼라제를 인코딩하는 등몰량의 헤어핀-말단 DNA 분자로 형질감염된 비-분열 세포에 의한 시간에 따른 루시퍼라아제의 발현을 도시한다.
도 22는 실시예 9에 기재된 바와 같이 지질 나노입자, 하이브리도좀 및 제트프라임(jetprime)에 의해 전달된 Cre 재조합효소를 인코딩하는 헤어핀-말단 DNA의 형질감염 72시간 후 RFP 양성 색 전환 HEK293 세포의 백분율을 도시한다.
도 23a 및 23b는 RBE가 도면에 도시된 해당하는 서열로 치환된 돌연변이체와 비교하여 야생형 AAV RBE를 갖는 우측 및 좌측 ITR을 포함하는 플라스미드로부터 헤어핀-말단 DNA의 성공적인 형성을 나타내는 아가로스 겔을 도시한다. 해당하는 ITR 서열로 형질감염된 비-분열 간세포에서의 루시퍼라아제 발현은 도 23b에 도시된다.
도 24a 및 24b는 본원에 개시된 바와 같은 헤어핀 역위 반복 DNA 분자가 실시예 11에 기재된 바와 같은 방법 단계를 수행함으로써 제조될 수 있는 플라스미드의 결과 맵(도 24b) 및 추가의 예시적인 클로닝 방법(도 24a)을 예시한다. 본 실시예에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 6개의 제한 부위는 영역 5' 내지 좌측 ITR 및 3' 내지 우측 ITR에 위치한다.
도 25a 및 25b는, 형질감염된 산물의 발광 판독값뿐만 아니라 아가로스 겔에 대한 도 24b에 도시된 플라스미드로부터 출발하여 닉킹, 변성/어닐링 및 엑소뉴클레아제 분해로부터의 산물을 도시하고 시각화한다.
도 26a 및 26b는 Hek293 세포의 상청액에서 분비된 터보루크의 발광 판독값뿐만 아니라 아가로스 겔에 대한 실시예 13에 기재된 바와 같은 OriL 유래 ITR을 갖는 구성물의 닉킹, 변성/어닐링 및 엑소뉴클레아제 분해로부터의 산물을 도시하고 시각화한다.
5. 상세한 설명
본원은 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 본원은 예를 들어, 유전자 요법을 위해 헤어핀-말단환 DNA 분자를 사용하는 것을 포함하는, 헤어핀-말단 DNA 분자를 사용하는 방법을 제공한다. 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하는 다양한 방법은 하기 섹션 5.2에서 추가로 기재된다. 헤어핀-말단 DNA 분자를 사용하는 다양한 방법은 하기 섹션 5.7에 기재된다. 이러한 방법에 의해 제조된 헤어핀-말단 DNA는 하기 섹션 5.4에 제공되고, 이는 2개 말단에 헤어핀화된 역위 반복 및 발현 카세트를 포함하며, 이들 각각은 하기에 추가로 기재된다. 일부 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA는 또한 하기 섹션 5.4에서 추가로 제공되는 바와 같이 1개 또는 2개의 닉을 포함한다. 헤어핀, 헤어핀화된 역위 반복 및 헤어핀화된 말단은 하기 섹션 5.4에 기재되고; 헤어핀화된 말단을 형성하는 역위 반복은 하기 섹션 5.3.1에 기재되고; 닉, 닉킹 엔도뉴클레아제 및 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위는 하기 섹션 5.3.2 및 5.4에 기재되고; 발현 카세트는 하기 섹션 5.3.3 및 5.4에 기재되고; 헤어핀-말단 DNA 분자의 기능적 특성은 하기 섹션 5.5에 기재된다. 이와 같이, 본원은 본원에 제공된 구성요소의 임의의 조합 또는 순열로 헤어핀-말단 DNA 분자, 이의 제조 방법, 이의 사용 방법을 제공한다.
또한, 본원은 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위한 방법에 사용되는 모 DNA 분자를 제공하며, 모 DNA 분자는 2개의 역위 반복, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 2개 이상의 제한 부위 및 발현 카세트를 포함하며, 이들 각각은 하기에 추가로 기재된다. 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위는, 닉킹 엔도뉴클레아제에 의한 닉킹 및 변성 시, 역위 반복 서열을 갖는 단일 가닥 오버행이 형성되고, 이는 그 후에 어닐링 시 접혀서 헤어핀을 형성하도록 배열되며, 각각의 단계는 섹션 5.2에 기재된다. 역위 반복은 하기 섹션 5.3.1에 기재되고; 닉, 닉킹 엔도뉴클레아제 및 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위는 하기 섹션 5.3.2에 기재되고; 발현 카세트는 하기 섹션 5.3.3에 기재된다. 이와 같이, 본원은 본원에 제공된 구성요소의 임의의 조합 또는 순열로 제조 방법에 사용되는 모 DNA 분자를 제공한다.
5.1 정의
본원에 사용된 바와 같이, DNA 분자와 관련하여 사용될 때 용어 "단리된"은,지칭된 DNA 분자가 자연, 천연 또는 합성 환경에서 발견되는 바와 같은 적어도 하나의 구성요소가 없음을 의미하도록 의도된다. 상기 용어는 자연, 천연 또는 합성 환경에서 발견되는 바와 같은 일부 또는 모든 다른 구성요소로부터 제거된 DNA 분자를 포함한다. DNA 분자의 자연, 천연 또는 합성 환경의 구성요소는 해당 환경에서 DNA 분자의 복제 및 유지에 필요하거나, 이에 사용되거나, 그렇지 않으면 이에 일조하는 자연, 천연 또는 합성 환경에서의 모든 것을 포함한다. 또한, DNA 분자의 자연, 천연 또는 합성 환경의 구성요소는, 예를 들어 세포, 세포 잔해, 세포 기관, 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 다당류, 지칭된 DNA 분자 이외의 핵산, 염, 세포 배양을 위한 영양분 및/또는 DNA 합성에 사용되는 화학물질을 포함한다. 본원의 DNA 분자는, 단리되거나, 합성적으로 제조되거나, 자연적으로 제조되거나, 재조합적으로 제조되는 이의 자연, 천연 또는 합성 환경의 모든 이들 구성요소 또는 임의의 다른 구성요소가 부분적으로, 완전히 또는 실질적으로 없을 수 있다. 단리된 DNA 분자의 특정 예는 부분적으로 순수한 DNA 분자 및 실질적으로 순수한 DNA 분자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전달 비히클"은, 전달될 작용제(들)이 있거나 없이, 하나 이상의 작용제를 세포, 조직 또는 대상체, 특히 인간 대상체에 투여하거나 전달하는 데 이용될 수 있는 물질을 지칭한다. 전달 비히클은 특정 하위 집합 또는 특정 종류의 세포에 작용제(들)를 우선적으로 전달할 수 있다. 전달 비히클에 의해 달성되는 선택적 또는 우선적 전달은 비히클의 특성, 또는 전달 비히클에 접합되거나, 이와 연합되거나, 이에 함유된 모이어티에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 모이어티는 세포의 특정 하위 집합에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다. 또한, 전달 비히클은 전달될 작용제의 생체내 반감기, 전달 비히클을 사용하지 않는 전달과 비교하여 작용제의 전달의 효율 및/또는 전달될 작용제의 생체이용률을 증가시킬 수 있다. 전달 비히클의 비제한적 예는 하이브리도좀, 리포좀, 지질 나노입자, 폴리머좀, 천연/합성 지질의 혼합물, 막 또는 지질 추출물, 엑소좀, 바이러스 입자, 단백질 또는 단백질 복합체, 펩티드 및/또는 다당류이다.
본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 A 및 B; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독)을 모두 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 다음과 같은 실시양태를 각각를 포함하도록 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
5.2 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하는 방법
하나의 양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위한 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은, a. 섹션 5.3에 기재된 바와 같은 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 DNA 분자의 증폭을 초래하는 조건 하에 배양하는 단계; b. 숙주 세포로부터 DNA 분자를 방출하는 단계; c. 4개의 닉을 초래하는 4개의 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 DNA 분자를 항온처리하는 단계; d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계; e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 헤어핀-말단 DNA를 제조하기 위한 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은, a. 섹션 5.3.5의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를 플라스미드의 증폭을 초래하는 조건 하에 배양하는 단계; b. 숙주 세포로부터 플라스미드를 방출하는 단계; c. 4개의 닉을 초래하는 4개의 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 DNA 분자를 항온처리하는 단계; d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계; e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계; f. 제한 효소와 단계 d로부터 생성된 플라스미드 또는 단편을 항온처리함으로써 플라스미드 또는 플라스미드의 단편을 절단하는 단계; 및 g. 엑소뉴클레아제와 플라스미드의 단편을 항온처리함으로써 단계 e로부터 생성된 단편을 제외한 플라스미드의 단편을 분해하는 단계를 포함한다.
추가적인 양태에서, 헤어핀-말단 DNA를 제조하기 위한 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은, a. 섹션 3.1의 실시양태 24에 기재된 바와 같은 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 플라스미드의 증폭을 초래하는 조건 하에 배양하는 단계; b. 숙주 세포로부터 플라스미드를 방출하는 단계; c. 4개의 닉을 초래하는 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 DNA 분자를 항온처리하는 단계; d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계; e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계; f. 이중 가닥 DNA 분자의 파단을 초래하는 제5 및 제6 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 단계 d로부터 생성된 플라스미드 또는 단편을 항온처리 하는 단계; 및 g. 엑소뉴클레아제와 플라스미드의 단편을 항온처리함으로써 단계 e로부터 생성된 단편을 제외한 플라스미드의 단편을 분해하는 단계를 포함한다.
하나의 양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위한 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은, a. 섹션 5.3에 기재된 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 DNA 분자의 증폭을 초래하는 조건 하에 배양하는 단계; b. 숙주 세포로부터 DNA 분자를 방출하는 단계; c. 4개의 닉을 초래하는 가이드 핵산에 대한 4개의 표적 부위를 인식하는 하나 이상의 프로그래밍 가능한 닉킹 효소와 DNA 분자를 항온처리하는 단계; d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계; e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 헤어핀-말단 DNA를 제조하기 위한 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은, a. 플라스미드의 증폭을 초래하는 조건 하에 5.3.5의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; b. 숙주 세포로부터 플라스미드를 방출하는 단계; c. 4개의 닉을 초래하는 가이드 핵산에 대한 4개의 표적 부위를 인식하는 하나 이상의 프로그래밍 가능한 닉킹 효소와 DNA 분자를 항온처리하는 단계; d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계; e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계; f. 제한 효소와 단계 d로부터 생성된 플라스미드 또는 단편을 항온처리함으로써 플라스미드 또는 플라스미드의 단편을 절단하는 단계; 및 g. 엑소뉴클레아제와 플라스미드의 단편을 항온처리함으로써 단계 e로부터 생성된 단편을 제외한 플라스미드의 단편을 분해하는 단계를 포함한다.
추가적인 양태에서, 헤어핀-말단 DNA를 제조하기 위한 방법이 본원에 제공되고, 상기 방법은, a. 플라스미드의 증폭을 초래하는 조건 하에 섹션 3.1의 실시양태 24에 기재된 바와 같은 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; b. 숙주 세포로부터 플라스미드를 방출하는 단계; c. 4개의 닉을 초래하는 가이드 핵산에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 표적 부위를 인식하는 하나 이상의 프로그래밍 가능한 닉킹 효소와 DNA 분자를 항온처리하는 단계; d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계; e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계; f. 이중 가닥 DNA 분자의 파단을 초래하는 가이드 핵산에 대한 제5 및 제6 표적 부위를 인식하는 프로그래밍 가능한 닉킹 효소와 단계 d로부터 생성된 플라스미드 또는 단편을 항온처리하는 단계; 및 g. 엑소뉴클레아제와 플라스미드의 단편을 항온처리함으로써 단계 e로부터 생성된 단편을 제외한 플라스미드의 단편을 분해하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단락의 단계 f는, 다음과 같은 단계 f로 대체될 수 있다: 이중 가닥 DNA 분자의 파단을 초래하는 2개의 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 단계 d로부터 생성된 플라스미드 또는 단편을 항온처리하는 단계.
특정 실시양태에서, (섹션 5.3에 기재된 바와 같이) 역위 반복이 측면에 있는 발현 카세트를 포함하는 DNA 분자는, 선행 단락에서 단계 a 및 b에 제공된 바와 같이, DNA 분자 또는 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 숙주 세포로부터 DNA 분자 또는 플라스미드를 방출함으로써 제공될 수 있다. 대안적으로, 이러한 DNA 분자는 무세포 시스템 또는 무세포 및 숙주 세포-기반 시스템의 조합으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 다양한 크기 및 서열의 DNA 단편 및 플라스미드의 화학적 합성이 당업계에 알려져 있고 널리 사용되며; 단편은 화학적으로 합성된 후 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 결찰되거나 숙주 세포에서 재조합될 수 있다. 다른 실시양태에서, DNA 분자 또는 플라스미드는 시험관내 복제에 의해 제공될 수 있다. 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 증폭을 포함하여, 다양한 방법이 시험관내 복제에 이용될 수 있다. 다양한 크기의 DNA 단편 또는 플라스미드를 복제하기 위한 PCR 방법은, 예를 들어 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition, by Michael Green and Joseph Sambrook, ISBN 978-1-936113-42-2(2012)]에 기재된 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있고 널리 사용되며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 일부 실시양태에서, 시험관내 복제 방법은 등온 DNA 증폭일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 a 및 b는 화학적 합성 또는 PCR에 의해 DNA 분자를 제공하는 단계로 대체될 수 있다. 다른 실시양태에서, 단계 a, b, c 및 d는 화학적 합성에 의해 DNA 분자를 제공함으로써 대체될 수 있다.
하나의 양태에서, 본원에 제공된 방법은 발현 카세트를 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위해 이용될 수 있고, 이에 따라 방법은, a. 섹션 5.3에 기재된 바와 같은 이중 가닥 DNA 분자를 제공하는 단계; b. 이중 가닥 DNA 분자의 닉킹을 초래하는 조건 하에 적어도 하나의 닉킹 효소와 DNA 분자를 항온처리함으로써, 적어도 2개의 화학양론적 DNA 단편을 생성하는 단계; c. DNA 단편을 변성시키는 단계; d. DNA 단편을 어닐링하고, 이에 따라 적어도 하나의 DNA 단편이 분자내 어닐링될 수 있는 단일 가닥 DNA 오버행 및 발현 카세트를 포함하고, 이에 따라 상기 DNA의 양쪽 말단에 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계; e. 적어도 하나의 엑소뉴클레아제와 DNA 단편을 항온처리함으로써, 단계 d로부터 생성된 발현 카세트를 포함하는 헤어핀-말단 단편을 제외하고, 단계 b의 화학양론적 DNA 단편을 분해하는 단계를 포함한다. 상기 단락에서 방법의 단계 b.는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6개 이상의 화학양론적 단편을 생성한다. 추가 실시양태에서, 상기 단락에서 방법의 단계 b.는 적어도 2개의 화학양론적 DNA 단편을 생성하여, 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편이 단계 a에서 제공된 DNA 분자와 화학양론적으로 등가이다. 일부 실시양태에서, 상기 단락에서 단계 e로부터 생성된 발현 카세트를 포함하는 분해 저항성 헤어핀-말단 단편은 단계 a에서 제공된 DNA 분자와 비교하여 대략 화학양론적으로 등가일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 발현 카세트를 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위해 이용될 수 있고, 이에 따라 방법은, a. 섹션 5.3에 기재된 바와 같은 이중 가닥 DNA 분자를 제공하는 단계; b. 이중 가닥 DNA 분자의 닉킹을 초래하는 조건 하에 적어도 하나의 닉킹 효소와 DNA 분자를 항온처리함으로써, 적어도 2개의 화학양론적 DNA 단편을 생성하는 단계; c. DNA 단편을 단일 가닥 DNA로 변성시키는 단계; d. 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편의 센스 및 안티센스 가닥을 어닐링하고, 이에 따라 센스 및/또는 안티센스 가닥이 분자내 어닐링될 수 있는 단일 가닥 DNA 오버행을 포함하고, 이에 따라 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편의 양쪽 말단에 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계; e. 적어도 하나의 엑소뉴클레아제와 DNA 단편을 항온처리함으로써, 단계 d로부터 생성된 발현 카세트를 포함하는 헤어핀-말단 단편을 제외하고, 단계 b의 화학양론적 DNA 단편을 분해하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 발현 카세트를 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위해 이용될 수 있고, 이에 따라 방법은, a. 섹션 5.3에 기재된 바와 같은 이중 가닥 DNA 분자를 제공하는 단계; b. 이중 가닥 DNA 분자의 닉킹을 초래하는 조건 하에 적어도 하나의 닉킹 효소와 DNA 분자를 항온처리하는 단계; c. 이중 가닥 DNA를 변성시킴으로써 적어도 2개의 화학양론적 DNA 단편을 생성하는 단계; d. DNA 단편을 어닐링하고, 이에 따라 적어도 하나의 DNA 단편이 분자내 어닐링될 수 있는 단일 가닥 DNA 오버행 및 발현 카세트를 포함하고, 이에 따라 상기 DNA 단편의 양쪽 말단에 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계를 포함한다.
추가적인 양태에서, 본원에 제공된 방법은 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위해 이용될 수 있고, 여기서 방법은, 순차적으로 (i) 닉킹 효소, (ii) 변성화제(예를 들어, 염기), (iii) 어닐링제(예를 들어, 산) 및 (iv) 엑소뉴클레아제가 첨가되는 수성 완충액에 섹션 5.3에 기재된 바와 같은 이중 가닥 DNA 분자를 포함하는 적어도 하나의 포트(예를 들어, 컨테이너, 용기, 웰, 튜브, 플레이트 또는 다른 그릇)를 포함한다. 본원에 제공된 방법을 원-포트(one-pot) 반응으로 수행하는 능력은, 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위한 방법이 임의의 중간체, 오염물질(예를 들어, 효소) 또는 또는 방법 단계 (i) 내지 (iv) 사이의 DNA 분해 부산물(즉, 뉴클레오티드, 올리고스(oligos) 또는 단일 가닥 DNA 단편)을 정제할 필요 없이 완료됨으로써, 비용 및 제조 실패 위험의 측면에서 (예를 들어, 정제 손실 최소화, 더 적은 출발 물질의 필요, 공정 변수의 엄격한 제어 등에 의해) 유리한 방법을 제공할 수 있는 점에서, 적어도 추가적인 이점을 제공할 수 있다.
추가 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위해 이용될 수 있고, 상기 방법은, a. 섹션 5.3에 기재된 바와 같은 이중 가닥 DNA 분자 및 적어도 하나의 닉킹 효소를 포함하는 하나의 포트(예를 들어, 컨테이너, 용기, 웰, 튜브, 플레이트 또는 다른 그릇)를 이중 가닥 DNA 분자의 닉킹을 초래하는 조건 하에 제공하는 단계, b. (예를 들어, 온도, pH 또는 완충액 조성을 변경함으로써) DNA를 변성시키고 어닐링하는 단계, 및 c. (예를 들어, 단계 a와 c 사이에) 임의의 중간체를 정제할 필요 없이 엑소 뉴클레아제를 첨가하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 단락의 방법에서 포트는; 단계 a.에서, 이중 가닥 DNA 분자의 적어도 1 종(예를 들어, 플라스미드 또는 이의 유도체), 닉킹 효소의 적어도 1 종 및 수성 완충액, 그리고 단계 c.에서 헤어핀-말단 DNA의 적어도 1 종, 닉킹 효소의 적어도 1 종, 엑소뉴클레아제의 적어도 1 종 및 DNA 분해 산물(예를 들어, dNMP, 디뉴클레오티드 및/또는 짧은 올리고스)을 포함하는 수성 완충액을 포함한다.
추가 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위해 이용될 수 있고, 이에 따라 상기 방법은, a. 적어도 하나의 포트(예를 들어, 컨테이너, 용기, 웰, 튜브, 플레이트 또는 다른 그릇)에서 섹션 5.3에 기재된 바와 같은 이중 가닥 DNA 분자 및 적어도 하나의 닉킹 효소를 이중 가닥 DNA 분자의 닉킹을 초래하는 조건 하에 제공하는 단계; b. DNA 분자를 변성시킴으로써 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 생성하는 단계; c. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 b로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계; d. 포트에 엑소뉴클레아제를 첨가함으로써 단계 c로부터 생성된 단편을 제외하고, 단계 b의 DNA 분자의 DNA 단편을 분해하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 발현 카세트를 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위해 이용될 수 있고, 이에 따라 방법은, a. 적어도 하나의 포트(예를 들어, 컨테이너, 용기, 웰, 튜브, 플레이트 또는 다른 그릇)에서 섹션 5.3에 기재된 바와 같은 이중 가닥 DNA 분자 및 적어도 하나의 닉킹 효소를 이중 가닥 DNA 분자의 닉킹을 초래하는 조건 하에 제공함으로써, 적어도 2개의 화학양론적 DNA 단편을 생성하는 단계; b. DNA 단편을 변성시키는 단계; c. DNA 단편을 어닐링하고, 이에 따라 적어도 하나의 DNA 단편이 분자내 어닐링될 수 있는 단일 가닥 DNA 오버행을 포함하고, 이에 따라 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편의 양쪽 말단에 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계; d. 포트에 적어도 하나의 엑소뉴클레아제를 첨가함으로써 단계 c로부터 생성된 발현 카세트를 포함하는 헤어핀-말단 DNA 단편을 제외하고, 단계 a의 DNA 단편을 분해하는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 단락에서 방법의 단계 a는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6개 이상의 화학양론적 단편을 생성한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 발현 카세트를 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위해 이용될 수 있고, 이에 따라 방법은, a. 적어도 하나의 포트(예를 들어, 컨테이너, 용기, 웰, 튜브, 플레이트 또는 다른 그릇)에서 섹션 5.3에 기재된 바와 같은 이중 가닥 DNA 분자를 제공하는 단계; b. 적어도 하나의 닉킹 효소를 포트에 이중 가닥 DNA 분자의 닉킹을 초래하는 조건 하에 첨가함으로써, 적어도 2개의 화학양론적 DNA 단편을 생성하는 단계; c. DNA 단편을 변성시키는 단계; d. DNA 단편을 어닐링하고, 이에 따라 적어도 하나의 DNA 단편이 분자내 어닐링될 수 있는 단일 가닥 DNA 오버행을 포함하고, 이에 따라 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편의 양쪽 말단에 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계; e. 단계 d로부터 생성된 발현 카세트를 포함하는 헤어핀-말단 단편을 제외하고, 단계 b의 화학양론적 DNA 단편을 분해하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 단락에서 방법의 포트는, 단계 a에서, 1 종의 DNA 분자 및 단계 a의 DNA 분자와 비교하여 단계 b에서 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6개 이상의 화학양론적 단편을 포함하고, 이에 따라 발현 카세트를 포함하는 단편은 단계 a에서 제공된 DNA 분자와 화학양론적으로 등가이다. 특정 실시양태에서, 상기 단락에서 방법의 단계b에서의 포트는, 단계 a의 DNA 분자와 비교하여 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6개 이상의 화학양론적 단편을 포함하고, 이에 따라 발현 카세트를 포함하는 단편은 단계 a에서 제공된 DNA 분자와 화학양론적으로 등가이다. 비-제한적인 예에서, 상기 단락에서 방법의 단계 b에서의 포트는, 3개의 화학양론적 DNA 단편; (i) 발현 카세트를 포함하는 1개의 단편 및 발현 카세트가 없는 2개의 단편을 포함하고, 이에 따라 발현 카세트를 포함하는 단편은 단계 a의 DNA 분자와 화학양론적으로 등가이다. 추가적인 특정 실시양태에서, 상기 단락에서 방법의 단계 e에서의 포트는 단계 a에서 제공된 DNA 분자와 비교하여 화학양론적으로 등가인 소정량의 분해 저항성 헤어핀-말단 DNA 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 단락에서 방법의 단계 e에서의 포트는, 단계 a에서 제공된 DNA 분자와 비교하여 화학량론적으로 대략 등가인, 많아야 소정량인 분해 저항성 헤어핀-말단 DNA 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 단락에서 방법의 단계 e에서의 포트는 단계 a에서 제공된 DNA 분자와 비교하여 화학량론적으로 대략 등가인, 많아야 소정양의 분해 저항성 헤어핀-말단 DNA 분자를 포함하며, 이에 따라 DNA 분자의 총 질량은, 단계 a에서 제공된 DNA 분자에 존재하는 뉴클레오티드로, 발현 카세트를 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자에 존재하는 뉴클레오티드를 나눈 비율로 대략 감소된다. 특정 실시양태에서, 상기 단락에서 방법의 단계 e에서의 포트는 단계 a에서 제공된 DNA 분자의 발현 카세트와 비교하여 화학양론적으로 대략 등가인 소정양의 분해 저항성 헤어핀-말단 DNA 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 발현 카세트를 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위해 이용될 수 있고, 이에 따라 방법은, a. 섹션 5.3에 기재된 바와 같은 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 DNA 분자의 증폭을 초래하는 조건 하에 배양하는 단계; b. 숙주 세포로부터 DNA 분자를 방출하는 단계; c. DNA 분자를 적어도 1개의 포트(예를 들어, 컨테이너, 용기, 웰, 튜브, 플레이트 또는 다른 그릇)에 첨가하는 단계; d. 적어도 하나의 닉킹 효소를 포트에 이중 가닥 DNA 분자의 닉킹을 초래하는 조건 하에 첨가함으로써, 적어도 2개의 화학양론적 DNA 단편을 생성하는 단계; e. DNA 단편을 변성시키는 단계; f. DNA 단편을 어닐링하고, 이에 따라 적어도 하나의 DNA 단편이 분자내 어닐링될 수 있는 단일 가닥 DNA 오버행 및 발현 카세트를 포함하고, 이에 따라 DNA 단편의 양쪽 말단에 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계; g. 적어도 하나의 엑소뉴클레아제를 포트에 첨가함으로써, 단계 f로부터 생성된 발현 카세트를 포함하는 헤어핀-말단 단편을 제외하고, 단계 f의 화학양론적 DNA 단편을 분해하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 단락에서 방법의 단계 g에서의 포트는 단계 c에서 제공된 DNA 분자와 비교하여 화학양론적으로 대략 등가인 소정양의 분해 저항성 헤어핀-말단 DNA 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 발현 카세트를 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하기 위해 이용될 수 있고, 이에 따라 방법은, a. 섹션 5.3에 기재된 바와 같은 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를 플라스미드의 증폭을 초래하는 조건 하에 배양하는 단계; b. 숙주 세포로부터 플라스미드를 방출하는 단계; c. 플라스미드를 적어도 1개의 포트(예를 들어, 컨테이너, 용기, 웰, 튜브, 플레이트 또는 다른 그릇)에 첨가하는 단계; d. 적어도 하나의 닉킹 효소를 포트에 플라스미드의 닉킹을 초래하는 조건 하에 첨가함으로써, 적어도 2개의 화학양론적 DNA 단편을 생성하는 단계; e. DNA 단편을 변성시키는 단계; f. DNA 단편을 어닐링하고, 이에 따라 적어도 하나의 DNA 단편이 분자내 어닐링될 수 있는 단일 가닥 DNA 오버행 및 발현 카세트를 포함하고, 이에 따라 DNA 단편의 양쪽 말단에 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계; g. 적어도 하나의 엑소뉴클레아제를 포트에 첨가함으로써, 단계 f로부터 생성된 발현 카세트를 포함하는 헤어핀-말단 단편을 제외하고, 단계 f의 화학양론적 DNA 단편을 분해하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 단락에서 방법의 단계 g에서의 포트는 단계 c에서 제공된 플라스미드와 비교하여 화학양론적으로 대략 등가인 소정양의 분해 저항성 헤어핀-말단 DNA 분자를 포함한다.
방법 단계의 순서는 예시의 목적을 위해 방법에 나열된다. 특정 실시양태에서, 방법 단계는 본원에 기재된 바와 같이 이들이 나타나는 순서대로 수행된다. 일부 실시양태에서, 방법 단계는 본원에 기재된 바와 같이 이들이 나타나는 순서와 다른 순서로 수행될 수 있다. 구체적으로, 일부 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하는 방법의 단계는 본원에 기재된 바와 같이 이들이 나타난 순서대로 또는 알파벳순으로 나열된 순서대로, a에서 e까지, 또는 a에서 g까지 수행될 수 있다. 대안적으로, 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하는 방법의 단계는, 이들이 본원에 기재된 바와 같이 나타난 순서대로 수행되지 않을 수 있다. 하나의 실시양태에서, 단계 c(4개의 닉을 초래하는 4개의 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 DNA 분자를 항온처리하는 단계)는, 숙주 세포가 자연적으로 발현하거나, 발현하도록 조작되거나, 그렇지 않으면 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제를 함유하는 경우, 단계 b(숙주 세포로부터 플라스미드를 방출하는 단계) 전에 수행될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 단계 f(단계 d로부터 생성된 단편 또는 플라스미드를 제한 효소와 항온처리하는 단계, 또는 단계 d로부터 생성된 단편 또는 플라스미드를 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 항온처리하는 단계)는 단계 d(2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계) 전 또는 단계 c(DNA 분자를 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 항온처리하는 단계) 전에 수행될 수 있다. 또한, 하나 이상의 단계는 개별 단계의 모든 작업을 수행하는 하나의 단계로 조합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단계 a(숙주 세포를 배양하는 단계)는, 숙주 세포가 자연적으로 발현하거나, 발현하도록 조작되거나, 그렇지 않으면 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제를 함유하는 경우, 단계 c(DNA 분자를 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 항온처리하는 단계)와 조합될 수 있다. 다른 실시양태에서, 단계 f(단계 d로부터 생성된 단편 또는 플라스미드를 제한 효소와 항온처리하는 단계, 또는 단계 d로부터 생성된 단편 또는 플라스미드를 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 항온처리하는 단계)는 단계 f 및 c에서 함께 인용된 닉킹 엔도뉴클레아제 또는 제한 효소와 함께 항온처리함으로써 단계 c(DNA 분자를 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 항온처리하는 단계)와 조합될 수 있다. 따라서, 본원은 단계들이 최신 기술에 따라 다양한 조합 및 순열로 수행될 수 있음을 제공한다.
모든 방법 단계 전, 모든 방법 단계 후 또는 임의의 방법 단계 사이에 추가 단계가 본원에 제공된 방법에 추가될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 리가아제로 닉을 보수하여 원형 DNA를 형성하는 단계 h.를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 리가아제로 닉을 보수하여 원형 DNA를 형성하는 단계 h는 본원에 기재된 모든 다른 방법 단계 후에 수행된다.
섹션 5.3.1 및 5.4에서 하기에 추가로 기재되는 바와 같이, DNA 분자의 말단에 형성된 헤어핀은 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위 사이의 오버행 특성에 의해 결정된다. 따라서, 섹션 5.3.1 및 5.4에 따라 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위 사이의 오버행의 서열 및 구조적 특성을 포함하는 특성을 디자인함으로써, 방법은 1, 2개 이상의 헤어핀화된 말단을 제조하기 위해 이용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 방법은 1개의 헤어핀-말단을 포함하는 헤어핀-말단 DNA를 제조한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 1개의 헤어핀-말단으로 구성된 헤어핀-말단 DNA를 제조한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 2개의 헤어핀-말단을 포함하는 헤어핀-말단 DNA를 제조한다. 추가 실시양태에서, 방법은 2개의 헤어핀-말단으로 구성된 헤어핀-말단 DNA를 제조한다.
본원에 제공된 방법은 인공 서열, 천연 DNA 서열 또는 천연 DNA 서열 및 인공 서열을 모두 갖는 서열을 포함하는 DNA 분자를 제조하기 위해 이용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 방법은 인공 서열을 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 천연 서열을 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 천연 서열 및 인공 서열을 모두 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자룰 제조한다. 특정 실시양태에서, 방법은 바이러스 역위 말단 반복(ITR)를 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 RABS가 결여된 헤어핀화된 역위 반복을 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 2개의 헤어핀화된 말단 반복을 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하고, 헤어핀화된 역위 반복 둘 모두는 RABS가 결여된다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 2개의 헤어핀화된 역위 반복을 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하고, 헤어핀화된 역위 반복 둘 모두는 TRS가 결여된다. 추가 실시양태에서, 방법은 2개의 헤어핀화된 역위 반복을 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하고, 헤어핀화된 역위 반복 둘 모두는 RABS 및 TRS가 결여된다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 2개의 헤어핀화된 역위 반복을 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 포함하고, 헤어핀화된 역위 반복 둘 모두 프로모터 활성(예를 들어, P5 프로모터 활성) 및 전사 활성(예를 들어, 전사 시작 부위 [TSS]). 또 다른 실시양태에서, 방법은 2개의 헤어핀화된 역위 반복을 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하고, 헤어핀화된 역위 반복 둘 모두는 RABS, 프로모터 활성(예를 들어, P5 프로모터 활성), 전사 활성(예를 들어, 전사 시작 부위 [TSS]) 및 TRS가 결여된다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 2개의 헤어핀화된 역위 반복을 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조하고, 헤어핀화된 역위 반복 둘 모두는 RABS가 결여된다. 추가 실시양태에서, 방법은 바이러스 게놈을 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자를 제조한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 게놈은 발현 카세트에서 하나 이상의 비-바이러스 유전자를 포함하는 조작된 바이러스 게놈이다. 특정 실시양태에서, 바이러스 게놈은 조작된 바이러스 게놈이고, 하나 이상의 바이러스 유전자는 녹아웃(knock out)되었다. 일부 구체적인 실시양태에서, 바이러스 게놈은 조작된 바이러스 게놈이고, 복제 관련 단백질("RAP," 즉, Rep 또는 NS1) 유전자, 캡시드(Cap) 유전자 또는 RAP 및 Cap 유전자 둘 모두는 녹아웃된다. 다른 실시양태에서, 바이러스 게놈은 파보바이러스 게놈이다. 또 다른 실시양태에서, 파보바이러스는 디펜도파보바이러스, 보카파보바이러스, 에리트로파보바이러스, 프로토파보바이러스 또는 테트라파보바이러스이다.
본원에 제공된 다양한 방법에서 수행되는 단계는 하기에서 추가로 상세히 기재된다. 숙주 세포 및 숙주 세포 배양 단계의 실시양태는 섹션 5.2.1에 기재되고; 숙주 세포로부터 DNA 분자를 방출하는 단계에 대한 실시양태는 섹션 5.2.2에 기재되고; DNA 분자를 변성시키는 단계에 대한 실시양태는 섹션 5.2.3에 기재되고; 어닐링 단계에 대한 실시양태는 섹션 5.2.5에 기재되고; 닉킹 엔도뉴클레아제 또는 제한 효소와 DNA 분자를 항온처리하는 단계에 대한 실시양태는 섹션 5.2.4에 기재되고; 엑소뉴클레아제와 항온처리하는 단계에 대한 실시양태는 섹션 5.2.6에 기재되고; 결찰 단계에 대한 실시양태는 섹션 5.2.7에 기재된다. 이와 같이, 본원은 본원에 기재된 단계의 다양한 실시양태의 조합 및 순열을 포함하는 방법을 제공한다.
5.2.1 숙주 세포 및 숙주 세포의 배양
본원은 DNA 분자를 증폭시키기 위해 다양한 숙주 세포가 배양될 수 있음을 제공한다. 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 숙주 세포는 진핵 숙주 세포, 원핵 숙주 세포, 또는 재조합 DNA 분자를 복제하거나 증폭할 수 있는 임의의 형질전환가능한 유기체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 미생물 숙주 세포일 수 있다. 추가 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아, 효모, 진균 또는 DNA 분자를 복제 또는 증폭하는 데 적용할 수 있는 임의의 다양한 다른 미생물 세포로부터 선택되는 숙주 미생물 세포일 수 있다. 박테리아 숙주 세포는 대장균(Escherichia coli), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 아나아에로비오스피릴룸 석시니시프로두센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens), 악티노바실러스 석시노제네스(Actinobacillus succinogenes), 만헤이미아 석시니시프로두센스(Mannheimia succiniciproducens), 리조비움 에틀리(Rhizobium etli), 바실러스 서프틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 글루코너박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 스트렙토미세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 슈도모나스 플루오레스센스(Pseudomonas fluorescens) 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로부터 선택되는 임의의 종의 것일 수 있다. 효모 또는 진균 숙주 세포는 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로미세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 리조푸스 아르히주스(Rhizopus arrhizus), 리조부스 오리자에(Rhizobus oryzae) 등으로부터 선택되는 임의의 종의 것일 수 있다. 대장균(E. coli)은 잘 특징화된 미생물 세포이고 분자 클로닝에 널리 사용되기 때문에 특히 유용한 숙주 세포이다. 다른 특히 유용한 숙주 세포는 사카로미세스 세레비지에와 같은 효모를 포함한다. 당업계에 알려진 바와 같이 임의의 적합한 미생물 숙주 세포를 사용하여 DNA 분자를 증폭시킬 수 있는 것으로 이해된다.
유사하게는, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 진핵 숙주 세포는 당업계에서 사용되고 알려진 바와 같이 재조합 DNA 분자를 복제 또는 증폭할 수 있는 임의의 진핵 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 숙주 세포는 포유류 숙주 세포일 수 있다. 추가 실시양태에서, 숙주 세포는 인간 또는 비-인간 포유류 숙주 세포일 수 있다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 곤충 숙주 세포일 수 있다. 일부 널리 사용되는 비-인간 포유류 숙주 세포는 CHO, 마우스 골수종 세포주(예를 들어, NS0, SP2/0), 래트 골수종 세포주(예를 들어, YB2/0) 및 BHK를 포함한다. 일부 널리 사용되는 인간 숙주 세포는 HEK293 및 이의 유도체, HT-1080, PER.C6 및 Huh-7을 포함한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 헬라(HeLa), NIH3T3, 저캇(Jurkat), HEK293, COS, CHO, Saos, SF9, SF21, High 5, NS0, SP2/0, PC12, YB2/0, BHK, HT-1080, PER.C6 및 Huh-7로 이루어진 군으로부터 선택된다.
숙주 세포는 각각의 숙주 세포가 당업계에 알려져 있고 배양되는 바와 같이 배양될 수 있다. 상이한 숙주 세포에 대한 배양 조건 및 배양 배지는 당업계에 알려져 있고 실시되는 바와 같이 상이할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 또는 다른 미생물 숙주 세포는 37℃에서 최대 300 rpm의 교반 속도로 강제 에어레이션(aeration)을 하거나 하지 않고 배양될 수 있다. 일부 곤충 숙주 세포는 일반적으로 25 내지 30℃에서, 최대 150 rpm의 교반 속도로 또는 교반 없이, 강제 에어레이션을 하거나 하지 않고 최적으로 배양될 수 있다. 일부 포유류 숙주 세포는 37℃에서 교반 없이 또는 최대 150 rpm의 교반 속도로 강제 에어레이션을 하거나 하지 않고 최적으로 배양될 수 있다. 또한, 다양한 숙주 세포를 배양하기 위한 조건은 당업계에 알려져 있고 실시되는 바와 같이, 다양한 조건 하에서 숙주 세포의 성장 곡선을 조사함으로써 결정될 수 있다. 일부 널리 사용되는 숙주 세포 배양 배지 및 배양 조건은 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition, by Michael Green and Joseph Sambrook, ISBN 978-1-936113-42-2(2012)]에 기재되며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
5.2.2 숙주 세포로부터 DNA 분자 방출
DNA 분자는 당업계에 알려져 있고 실시되는 다양한 방식에 의해 숙주 세포로부터 방출될 수 있다. 예를 들어, DNA 분자는 숙주 세포를 물리적, 기계적, 효소적, 화학적으로 부수거나, 물리적, 기계적, 효소적 및 화학적 작용의 조합에 의해 방출될 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 분자는 세포에 세포 용해 시약의 용액을 가함으로써 숙주 세포로부터 방출될 수 있다. 세포 용해 시약은 트리톤, SDS, 트윈(Tween), NP-40 및/또는 CHAPS와 같은 세제를 포함한다. 다른 실시양태에서, DNA 분자는 숙주 세포에 삼투압 농도 차이를 가함으로써, 예를 들어 숙주 세포에 저장성(hypotonic) 용액을 가함으로써 숙주 세포로부터 방출될 수 있다. 다른 실시양태에서, DNA 분자는 숙주 세포에 높거나 낮은 pH의 용액을 가함으로써 숙주 세포로부터 방출될 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 분자는 숙주 세포를 효소 처리함으로써, 예를 들어 리소자임에 의해 처리함으로써 숙주 세포로부터 방출될 수 있다. 일부 추가 실시양태에서, DNA 분자는 숙주 세포에 세제, 삼투압, 높거나 낮은 pH, 및/또는 효소(예를 들어, 리소자임)의 임의의 조합을 가함으로써 숙주 세포로부터 방출될 수 있다.
대안적으로, DNA 분자는 숙주 세포에 물리적 힘을 가함으로써 숙주 세포로부터 방출될 수 있다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자는, 예를 들어 웨어링 혼합기(Waring blender) 및 폴리트론(Polytron)을 사용함으로써 숙주 세포에 직접적으로 힘을 인가하여 숙주 세포로부터 방출될 수 있다. 웨어링 혼합기는 고속 회전 블레이드를 사용하여 세포를 부수고 폴리트론은 회전 블레이드를 포함하는 긴 샤프트로 조직을 끌어들인다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자는 숙주 세포에 전단 응력 또는 전단력을 인가함으로써 숙주 세포로부터 방출될 수 있다. 좁은 공간을 통해 숙주 세포에 힘을 가하도록 다양한 조직분쇄기(homogenizer)를 사용함으로써 세포막을 전단(shearing)할 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 분자는 액체 기반 균질화에 의해 숙주 세포로부터 방출될 수 있다. 하나의 구체적인 실시양태에서, DNA 분자는 다운스(Dounce) 조직분쇄기를 사용하여 숙주 세포로부터 방출될 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, DNA 분자는 포터-엘비엠(Potter-Elvehjem) 조직분쇄기를 사용하여 숙주 세포로부터 방출될 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, DNA 분자는 프렌치 프레스(French press)를 사용하여 숙주 세포로부터 방출될 수 있다. 숙주 세포로부터 DNA 분자를 방출하는 다른 물리적 힘은, 예를 들어 절구와 절구공이를 이용한 수동 그라인딩을 포함한다. 수동 그라인딩에서, 숙주 세포는 종종 예를 들어, 액체 질소에서 동결된 후, 절구와 절구공이를 사용하여 분쇄되며, 그 과정에서 세포벽의 셀룰로오스 및 다른 다당류의 인장 강도가 숙주 세포를 부순다.
또한, DNA 분자는 세포를 동결 및 해동 주기에 적용함으로써 숙주 세포로부터 방출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포의 현탁액은 동결된 후, 다수의 그러한 동결 및 해동 주기 동안 해동된다. 일부 실시양태에서, DNA 분자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20회의 동결 및 해동 주기를 숙주 세포에 적용함으로써 숙주 세포로부터 방출될 수 있다.
숙주 세포로부터 DNA 분자를 방출하기 위한 상기 기재된 방법은 상호 배타적이지 않다. 따라서, 본원은 DNA 분자가 이 섹션 5.2.2에서 제공하는 DNA 방출 방법의 임의의 조합에 의해 숙주 세포로부터 방출될 수 있음을 제공한다.
5.2.3 DNA 분자를 변성시키는 단계
DNA 분자는 당업계에 알려져 있고 실시되는 바와 같은 다양한 방식에 의해 변성될 수 있다. DNA 분자를 변성시키는 단계는 DNA 분자를 이중 가닥 DNA(dsDNA)로부터 단일 가닥 DNA(ssDNA)로 분리할 수 있다. 두 개의 DNA 가닥을 분리할 때 DNA가 풀리고 두 가닥을 함께 묶는 수소 결합이 약해지고 결국에는 파단될 때까지 온도가 증가될 수 있다. 이중 가닥 DNA를 단일 가닥으로 파단하는 과정이 DNA 변성 또는 DNA 변성화로 알려진다.
일부 실시양태에서, DNA 분자를 변성시키는 단계는 dsDNA 분자의 하나 이상의 세그먼트의 두 DNA 가닥을 분리하는 한편, DNA 분자의 다른 세그먼트(들)를 dsDNA로 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 분자를 변성시키는 단계는 dsDNA 분자의 하나 이상의 세그먼트의 모든 DNA 가닥을 ssDNA 가닥으로 분리할 수 있다. 일부 추가 실시양태에서, DNA 분자를 변성시키는 단계는 dsDNA를 DNA(예를 들어, 섹션 5.3에 기재된 DNA 분자)의 상부 및 하부 가닥 상의 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위 사이의 세그먼트에서 ssDNA로 분리하는 한편, DNA 분자의 다른 부분을 dsDNA로 유지할 수 있고, 이에 따라 제1 및 제2 제한 부위 사이에 오버행을 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 분자를 변성시키는 단계는 dsDNA를 DNA(예를 들어, 섹션 5.3에 기재된 DNA 분자)의 상부 및 하부 가닥 상의 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위 사이의 세그먼트에서 ssDNA로 분리하는 한편, DNA 분자의 다른 부분을 dsDNA로 유지할 수 있고, 이에 따라 제3 및 제4 제한 부위 사이에 오버행을 생성할 수 있다. 다른 실시양태에서, DNA 분자를 변성시키는 단계는 dsDNA를 DNA(예를 들어, 섹션 5.3에 기재된 DNA 분자)의 상부 및 하부 가닥 상의 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위 사이 및 제3 및 제4 제한 부위 사이의 세그먼트에서 ssDNA로 분리하는 한편, DNA 분자의 다른 부분을 dsDNA로 유지할 수 있고, 이에 따라 (1) DNA 분자를 두 개의 딸 DNA 분자로 파단시키고, (2) 제1 및 제2 제한 부위 사이의 오버행 및 제3 및 제4 제한 부위 사이의 오버행을 생성할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위 사이의 오버행은 상부 가닥 5' 오버행일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위 사이의 오버행은 하부 가닥 3' 오버행일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위 사이의 오버행은 상부 가닥 3' 오버행일 수 있다. 추가 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위 사이의 오버행은 하부 가닥 5' 오버행일 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 분자를 변성시키는 단계는 본원에 제공된 실시양태의 임의의 조합으로 DNA 분자를 분리할 수 있다.
오버행은 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위 사이의 거리에 따라 길이가 변할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 오버행은 길이 및/또는 서열이 동일할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 오버행은 길이 및/또는 서열이 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 길이가 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39, 적어도 40, 적어도 41, 적어도 42, 적어도 43, 적어도 44, 적어도 45, 적어도 46, 적어도 47, 적어도 48, 적어도 49, 적어도 50, 적어도 51, 적어도 52, 적어도 53, 적어도 54, 적어도 55, 적어도 56, 적어도 57, 적어도 58, 적어도 59, 적어도 60, 적어도 61, 적어도 62, 적어도 63, 적어도 64, 적어도 65, 적어도 66, 적어도 67, 적어도 68, 적어도 69, 적어도 70, 적어도 71, 적어도 72, 적어도 73, 적어도 74, 적어도 75, 적어도 76, 적어도 77, 적어도 78, 적어도 79, 적어도 80, 적어도 81, 적어도 82, 적어도 83, 적어도 84, 적어도 85, 적어도 86, 적어도 87, 적어도 88, 적어도 89, 적어도 90, 적어도 91, 적어도 92, 적어도 93, 적어도 94, 적어도 95, 적어도 96, 적어도 97, 적어도 98, 적어도 99 또는 적어도 100개의 뉴클레오티드일 수 있다. 다른 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 길이가 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75, 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 약 85, 약 86, 약 87, 약 88, 약 89, 약 90, 약 91, 약 92, 약 93, 약 94, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 약 99, 약 100개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드일 수 있다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 길이가 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39, 적어도 40, 적어도 41, 적어도 42, 적어도 43, 적어도 44, 적어도 45, 적어도 46, 적어도 47, 적어도 48, 적어도 49, 적어도 50, 적어도 51, 적어도 52, 적어도 53, 적어도 54, 적어도 55, 적어도 56, 적어도 57, 적어도 58, 적어도 59, 적어도 60, 적어도 61, 적어도 62, 적어도 63, 적어도 64, 적어도 65, 적어도 66, 적어도 67, 적어도 68, 적어도 69, 적어도 70, 적어도 71, 적어도 72, 적어도 73, 적어도 74, 적어도 75, 적어도 76, 적어도 77, 적어도 78, 적어도 79, 적어도 80, 적어도 81, 적어도 82, 적어도 83, 적어도 84, 적어도 85, 적어도 86, 적어도 87, 적어도 88, 적어도 89, 적어도 90, 적어도 91, 적어도 92, 적어도 93, 적어도 94, 적어도 95, 적어도 96, 적어도 97, 적어도 98, 적어도 99 또는 적어도 100개의 뉴클레오티드일 수 있다. 추가 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 길이가 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75, 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 약 85, 약 86, 약 87, 약 88, 약 89, 약 90, 약 91, 약 92, 약 93, 약 94, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 약 99, 약 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 길이가 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39, 적어도 40, 적어도 41, 적어도 42, 적어도 43, 적어도 44, 적어도 45, 적어도 46, 적어도 47, 적어도 48, 적어도 49, 적어도 50, 적어도 51, 적어도 52, 적어도 53, 적어도 54, 적어도 55, 적어도 56, 적어도 57, 적어도 58, 적어도 59, 적어도 60, 적어도 61, 적어도 62, 적어도 63, 적어도 64, 적어도 65, 적어도 66, 적어도 67, 적어도 68, 적어도 69, 적어도 70, 적어도 71, 적어도 72, 적어도 73, 적어도 74, 적어도 75, 적어도 76, 적어도 77, 적어도 78, 적어도 79, 적어도 80, 적어도 81, 적어도 82, 적어도 83, 적어도 84, 적어도 85, 적어도 86, 적어도 87, 적어도 88, 적어도 89, 적어도 90, 적어도 91, 적어도 92, 적어도 93, 적어도 94, 적어도 95, 적어도 96, 적어도 97, 적어도 98, 적어도 99 또는 적어도 100개의 뉴클레오티드일 수 있다. 다른 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 길이가 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75, 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 약 85, 약 86, 약 87, 약 88, 약 89, 약 90, 약 91, 약 92, 약 93, 약 94, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 약 99, 약 100개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 길이가 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39, 적어도 40, 적어도 41, 적어도 42, 적어도 43, 적어도 44, 적어도 45, 적어도 46, 적어도 47, 적어도 48, 적어도 49, 적어도 50, 적어도 51, 적어도 52, 적어도 53, 적어도 54, 적어도 55, 적어도 56, 적어도 57, 적어도 58, 적어도 59, 적어도 60, 적어도 61, 적어도 62, 적어도 63, 적어도 64, 적어도 65, 적어도 66, 적어도 67, 적어도 68, 적어도 69, 적어도 70, 적어도 71, 적어도 72, 적어도 73, 적어도 74, 적어도 75, 적어도 76, 적어도 77, 적어도 78, 적어도 79, 적어도 80, 적어도 81, 적어도 82, 적어도 83, 적어도 84, 적어도 85, 적어도 86, 적어도 87, 적어도 88, 적어도 89, 적어도 90, 적어도 91, 적어도 92, 적어도 93, 적어도 94, 적어도 95, 적어도 96, 적어도 97, 적어도 98, 적어도 99 또는 적어도 100개의 뉴클레오티드일 수 있다. 다른 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 길이가 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75, 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 약 85, 약 86, 약 87, 약 88, 약 89, 약 90, 약 91, 약 92, 약 93, 약 94, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 약 99, 약 100개, 또는 그 초과의 뉴클레오티드일 수 있다.
당업계에 알려져 있고 실시되는 바와 같이, DNA 분자는 열, DNA 분자의 환경에서 pH의 변화, 염 농도 증가, 또는 이들과 다른 알려진 수단의 임의의 조합에 의해 변성될 수 있다. 본원은, DNA의 상부 및 하부 가닥 상의 제1 및 제2 제한 부위 사이 및/또는 제3 및 제4 제한 부위 사이의 세그먼트에서, dsDNA를 ssDNA로 선택적으로 분리하는 한편, DNA 분자의 다른 부분을 dsDNA로 유지할 수 있는 변성 조건을 사용함으로써, DNA 분자가 상기 방법에서 변성될 수 있음을 제공한다. 일부 실시양태에서, 변성은 dsDNA를 ssDNA로 완전히 분리한다. dsDNA에서 ssDNA로의 이러한 선택적 분리는 변성 조건 및/또는 DNA 분자가 변성 조건의 영향을 받는 시간을 제어함으로써 수행될 수 있다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자는 적어도 70℃, 적어도 71℃, 적어도 72℃, 적어도 73℃, 적어도 74℃, 적어도 75℃, 적어도 76℃, 적어도 77℃, 적어도 78℃, 적어도 79℃, 적어도 80℃, 적어도 81℃, 적어도 82℃, 적어도 83℃, 적어도 84℃, 적어도 85℃, 적어도 86℃, 적어도 87℃, 적어도 88℃, 적어도 89℃, 적어도 90℃, 적어도 91℃, 적어도 92℃, 적어도 93℃, 적어도 94℃ 또는 적어도 95℃의 온도에서 변성된다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자는 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃, 약 80℃, 약 81℃, 약 82℃, 약 83℃, 약 84℃, 약 85℃, 약 86℃, 약 87℃, 약 88℃, 약 89℃, 약 90℃, 약 91℃, 약 92℃, 약 93℃, 약 94℃ 또는 약 95℃의 온도에서 변성된다. 하나의 구체적인 실시양태에서, DNA 분자는 약 90℃의 온도에서 변성된다.
열에 의한 변성 이외에, 본원에 제공된 섹션 또는 모든 DNA 분자는 구아니딘, 포름아미드, 나트륨 살리실레이트, 디메틸 설폭시드, 프로필렌 글리콜 및 우레아와 같은 다양한 화학 작용제의 첨가에 의해 변성 과정을 거칠 수 있다. 이러한 화학적 변성화제는 기존의 질소 염기 쌍과 수소 결합 공여체 및 수용체에 대해 경쟁하여 용융 온도를 낮추고 등온 변성을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 화학 작용제는 실온에서 변성을 유도할 수 있다. 일부 구체적인 실시양태에서, 알칼리제(예를 들어, NaOH)는 pH를 변화시키고 수소 결합 기여 양성자를 제거함으로써 DNA를 변성시키는 데 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자를 화학적으로 변성시키는 단계는 열에 의해 유도된 변성과 비교하여 DNA 안정성을 위한 더 완만한 절차일 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자를 화학적으로 변성 및 재생하는 것(예를 들어, pH를 변화시키는 것)은 가열하는 것보다 더 빠를 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원의 DNA는 박테리아에서 복제되고 닉킹될 수 있으며, 동시에 박테리아로부터 방출되는 동안(예를 들어, 알칼리 용해 단계) 변성될 수 있다.
하나의 실시양태에서, DNA 분자는 적어도 10, 적어도 10.1, 적어도 10.2, 적어도 10.3, 적어도 10.4, 적어도 10.5, 적어도 10.6, 적어도 10.7, 적어도 10.8, 적어도 10.9, 적어도 11, 적어도 11.1, 적어도 11.2, 적어도 11.3, 적어도 11.4, 적어도 11.5, 적어도 11.6, 적어도 11.7, 적어도 11.8, 적어도 11.9, 적어도 12, 적어도 12.1, 적어도 12.2, 적어도 12.3, 적어도 12.4, 적어도 12.5, 적어도 13, 적어도 13.5 또는 적어도 14의 pH에서 변성된다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자는 약 10, 약 10.1, 약 10.2, 약 10.3, 약 10.4, 약 10.5, 약 10.6, 약 10.7, 약 10.8, 약 10.9, 약 11, 약 11.1, 약 11.2, 약 11.3, 약 11.4, 약 11.5, 약 11.6, 약 11.7, 약 11.8, 약 11.9, 약 12, 약 12.1, 약 12.2, 약 12.3, 약 12.4, 약 12.5, 약 13, 약 13.5 또는 약 14의 pH에서 변성된다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자는 적어도 1M, 적어도 1.5M, 적어도 2M, 적어도 2.5M, 적어도 3M, 적어도 3.5M 또는 적어도 4M의 염의 염 농도로 변성된다. 추가 실시양태에서, DNA 분자는 약 1M, 약 1.5M, 약 2M, 약 2.5M, 약 3M, 약 3.5M 또는 약 4M의 염의 염 농도로 변성된다. 특정 실시양태에서, DNA 분자는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19 또는 적어도 20분 동안 변성 조건에 대한 영향을 받는다. 다른 실시양태에서, DNA 분자는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19 또는 약 20분 동안 변성 조건에 대한 영향을 받는다. 일부 실시양태에서, DNA 분자는 본원에 제공된 바와 같은 변성 조건 및 변성 지속 시간의 임의의 조합에 의해 변성될 수 있다.
변성 조건은 DNA의 상부 및 하부 가닥 상의 제1 및 제2 제한 부위 사이 및 제3 및 제4 제한 부위 사이의 세그먼트를 선택적으로 변성시키는 한편, DNA 분자의 다른 부분을 dsDNA로 유지하기 위한 방법 단계에 대해 결정될 수 있다. 이러한 선택적 변성 조건은 선택적으로 변성될 DNA 세그먼트의 특성에 따라 결정될 수 있다. DNA 이중 나선의 안정성은 DNA 세그먼트의 길이 및 G/C 함량의 백분율과 관련이 있다. 본원은 선택적 변성 조건이 선택적으로 변성될 DNA 세그먼트의 서열 또는 생성된 오버행의 서열에 의해 결정될 수 있음을 제공한다. 예를 들어, 선택적 변성을 위한 온도는, 선택적으로 변성될 DNA 서열에 대해 Tm = 2℃ × A-T 쌍의 수 + 4℃ × G-C 쌍의 수로, 대략적으로 결정될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Freier SM, et a., Proc Natl Acad Sci, 83, 9373-9377 (1986)]; [Breslauer KJ, et al., Proc Natl Acad Sci, 83, 3746-3750 (1986)]; [Panjkovich,A. and Melo,F. Bioinformatics 21:711-722 (2005)]; [Panjkovich,A., et al. Nucleic Acids Res 33:W570-W572 (2005)]에 기재된 바와 같이, Tm의 다른 보다 정확한 계산 또한 당업계에서 알려져 있고 사용되며, 이들 문헌 모두는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
오버행은 다양한 DNA 서열을 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 오버행은 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 오버행은 바이러스 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 바이러스 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 오버행은 섹션 5.3.1, 5.3.2, 5.3.3 및 5.4에 기재된 서열의 임의의 실시양태를 포함하거나 이로 구성된다. 추가 실시양태에서, 오버행은 섹션 5.3.1 및 5.4에 기재된 바와 같은 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시양태에서, 오버행은 섹션 5.3.4에 기재된 바와 같은 하나 이상의 바이러스 복제 관련 서열(예를 들어, RABS, RBE 또는 TRS)을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 오버행은 섹션 5.3.4에 기재된 바와 같은 하나 이상의 전사 활성 관련 서열(예를 들어, TSS 또는 CpG 모티프)을 포함하지 않는다.
5.2.4 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제 또는 제한 효소와 DNA 분자를 항온처리하는 단계
본원은 섹션 3 및 5.2에 기재된 바와 같이 DNA 분자를 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제 또는 제한 효소와 함께 항온처리하기 위한 하나 이상의 방법 단계를 제공한다. 이론에 얽매이지 않고, 닉킹 엔도뉴클레아제는, DNA 분자에서 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위를 인식하고, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위 내에 있거나 밖에 있는 부위에서 dsDNA의 하나의 가닥에서만 절단(예를 들어, 단일 DNA 가닥의 포스포디에스테르 결합을 가수분해)함으로써, dsDNA에서 닉을 생성한다. 반면에, 제한 효소는 제한 효소에 대한 제한 부위를 인식하고, dsDNA의 두 가닥 모두를 절단함으로써, 특정 제한 부위에서 또는 그 근처에서 DNA 분자를 절단한다.
본원에 제공된 조성물 및 방법의 다양한 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제는 메틸화-의존성, 메틸화-민감성 또는 메틸화-비민감성일 수 있다. 당업계에 알려져 있고 실시되는 다양한 닉킹 엔도뉴클레아제가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법에 대한 닉킹 엔도뉴클레아제는 Nb.Bsml, Nb.BbvCI, Nb.BsrDI, Nb.Btsl, Nt.BbvCI, Nt.Alwl, Nt. CviPII, Nt. BsmAI, Nt. Alwl 및 Nt.BstNBI를 포함하여, 5-메틸시토신 의존성이 아닌 자연 발생 닉킹 엔도뉴클레아제일 수 있다. 또한, 본원에 제공된 조성물 및 방법에 대한 닉킹 엔도뉴클레아제는 II형 제한 효소(예를 들어, Alwl, BpulOI, BbvCI, Bsal, BsmBI, BsmAI, Bsml, BspOJ, Mlyl, Mval269l 및 Sapl 등)로부터 조작될 수 있으며, 닉킹 엔도 뉴클레아제의 제조 방법은, 참조 문헌, 예를 들어 US 7,081,358; US 7,011,966; US 7,943,303; US 7,820,424, WO201804514에서 확인할 수 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
대안적으로, 닉킹 엔도뉴클레아제 대신 프로그래밍 가능한 닉킹 효소가 본원에 제공된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 상기 프로그래 가능한 닉킹 효소는, 예를 들어 Cas9 또는 이의 기능적 등가물(예컨대, 파이로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus) 아르고너트(PfAgo) 또는 Cpfl)을 포함한다. Cas9는 두 개의 촉매 도메인인 RuvC와 HNH를 함유한다. 이러한 도메인 중 하나를 비활성화하면 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 닉킹 엔도뉴클레아제를 대체할 수 있는 프로그래밍 가능한 닉킹 효소가 생성될 것이다. Cas9에서, RuvC 도메인은 위치 D10(예를 들어, D10A)에서 아미노산 치환에 의해 비활성화될 수 있고, HNH 도메인은 위치 H840(예를 들어, H840A), 또는 다른 Cas9 등가 단백질에서의 이러한 아미노산에 해당하는 위치에서 아미노산 치환에 의해 비활성화될 수 있다. 이러한 프로그래밍 가능한 닉킹 효소는 또한 하기 2개의 구성요소를 포함하는 II 형 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제 또는 아르고너트일 수 있다: 표적 DNA를 절단하는 닉킹 효소(예를 들어, D10A Cas9 닉킹 효소 또는 이의 변이체 또는 동원체(ortholog)), 및 표적 DNA 내의 특정 부위에 대해 닉킹 효소를 표적화하거나 프로그래밍하는 가이드 핵산, 예를 들어 가이드 DNA 또는 RNA(gDNA 또는 gRNA)(예를 들어, 문헌 [Hsu, et al., Nature Biotechnology 2013 31: 827-832]을 참조하고, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 또한, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소는, 특정한, 비-무작위 부위에서 작용하도록, 부위 특이적 DNA 결합 도메인(표적 도메인), 예컨대 DNA 결합 단백질의 DNA 결합 도메인(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제, 전사 인자, 징크-핑거(zinc-finger) 또는 비-무작위 위치에서 DNA에 결합하는 또 다른 도메인)을 닉킹 엔도뉴클레아제와 융합함으로써 제조될 수 있다. 전술한 내용으로부터 명확해지는 바와 같이, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 프로그래밍 가능한 절단은, 닉킹 효소 내 또는 닉킹 효소에 융합된 표적 도메인, 또는 어떤 부위는 표적 도메인 또는 가이드 분자를 변경함으로써 프로그래밍될 수 있는, 특정한, 비-무작위 부위로 닉킹 효소를 지향시키는 가이드 분자(gDNA 또는 gRNA)로부터 발생한다. 이러한 프로그래밍 가능한 닉킹 효소는 참조문헌, 예를 들어, US 7,081,358 및 WO2010021692A에서 확인할 수 있으며, 이들은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
적절한 가이드 핵산(예를 들어, gDNA 또는 gRNA) 서열 및 가이드 핵산에 대한 적절한 표적 부위는 당업계에 알려져 있고 널리 활용되고 있다. 가이드 핵산(예를 들어, gDNA 또는 gRNA)은, 관심 표적 DNA 영역을 인식하고 편집을 위해 프로그래밍 가능한 닉킹 효소(예를 들어, Cas 뉴클레아제)를 지향시키는 특이적 핵산(예를 들어, gDNA 또는 gRNA) 서열이다. 가이드 핵산(예를 들어, gDNA 또는 gRNA)은 종종 두 부분으로 구성된다: 표적 DNA에 상보적인 15-20개의 뉴클레오티드 서열인, 표적 핵산, 및 프로그래밍 가능한 닉킹 효소(예를 들어, Cas 뉴클레아제)에 대한 결합 스캐폴드로서 작용하는 스캐폴드 핵산. 가이드 핵산에 적합한 표적 부위는 프로그래밍 가능한 닉킹 효소의 표적 핵산에 대한 상보적 서열 및 인접한 프로토스페이서 인접 모티프(Protospacer Adjacent Motif, PAM)의 두 가지 구성요소를 가져야 한다. PAM은 프로그래밍 가능한 닉킹 효소(예를 들어, Cas 뉴클레아제)에 대한 결합 신호로 작용한다. 예를 들어, 둘 모두 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Daniel Gleditzsch et al., RNA Biol. 16(4): 504-517(April 2019)]; [Ryan T. Leenay et al., Mol Cell. 62(1): 137-147(Apr 7, 2016)]에서 논의된 바와 같이, 다양한 PAM이 당업계에 알려져 있고, 특징화되었으며, 활용되었다. AAV2 ITR의 1차 스템 서열을 표적화하는 예시적인 gRNA 및 gDNA 서열은 표 1에 열거된 것을 포함한다.
표 1: 예시적인 닉킹 엔도뉴클레아제 및 이의 해당하는 제한 부위:
Figure pct00001
당업계에 알져져 있고 사용되는 다양한 닉킹 엔도뉴클레아제가 본원에 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 본 방법에 사용하기 위한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 실시양태로서 제공된 닉킹 엔도뉴클레아제 및 닉킹 엔도뉴클레아제의 일부에 대한 해당하는 제한 부위의 예시적인 목록이 제한 효소 데이터베이스(REBASE로 당업계에 알려짐)에 기재되며, 이는 [www.rebase.neb.com/cgi-bin/azlist?nick]에서 이용가능하고, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 하나의 실시양태에서, 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 제한 부위를 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제는 모두 동일한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열에 대한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위는 2개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열이고, 이는 2개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제 표적 서열에 대한 4개의 부위를 배열하는 모든 가능한 조합을 포함한다(예를 들어, 제1 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위 및 제2 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 나머지, 제1 닉킹 엔도 뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위 및 제2 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 나머지 등). 또 다른 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위는 3개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열이고, 이는 3개의 상이한 엔도뉴클레아제 표적 서열에 대한 4개 부위를 배열하는 모든 가능한 조합을 포함한다. 추가 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위는 4개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열이다. 일부 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제는 표 2에 나열된 것들로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
표 2: 예시적인 닉킹 엔도뉴클레아제 및 이의 해당하는 제한 부위:
Figure pct00002
dsDNA의 한 가닥을 절단하기 위한 다양한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 조건은 본원에 제공된 다양한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대해 알려져 있고, 이는 온도, 염 농도, pH, 완충 시약, 특정 세제의 존재 또는 부재, 및 닉킹된 DNA 분자의 원하는 백분율을 달성하기 위한 항온처리 지속 시간을 포함한다. 이러한 조건은 닉킹 엔도뉴클레아제의 다양한 공급업체, 예를 들어, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs)의 웹사이트 또는 카탈로그로부터 쉽게 입수할 수 있다. 본원은 DNA 분자를 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 함께 항온처리하는 단계가 당업계에 알려져 있고 실시되는 항온처리 조건에 따라 수행됨을 제공한다. 일부 실시양태에서, DNA 분자를 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 항온처리하는 단계는 당업계에 알려진 방법에 의해 최적화된 항온처리 조건에 따른다.
당업계에 알려져 있고 사용되는 다양한 제한 효소가 본원에 제공된 방법에 사용될 수 있다. 본 방법에 사용하기 위한 제한 효소에 대한 실시양태로서 제공된 제한 효소 및 제한 효소에 대한 해당하는 제한 부위의 예시적인 목록은 뉴 잉글랜드 바이오랩스의 카탈로그에 기재되어 있고, 이는 [Neb.com/products/restriction-endonucleases]에서 이용가능하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. dsDNA를 절단하기 위한 다양한 제한 효소에 대한 조건은 본원에 제공된 다양한 제한 효소에 대해 알려져 있고, 이는 온도, 염 농도, pH, 완충 시약, 특정 세제의 존재 또는 부재, 및 닉킹된 DNA 분자의 원하는 백분율을 달성하기 위한 항온처리 지속 시간을 포함한다. 이러한 조건은 제한 효소 다양한 공급업체, 예를 들어, 뉴 잉글랜드 바이오랩스의 웹사이트 또는 카탈로그로부터 쉽게 입수할 수 있다. 본원은 DNA 분자를 제한 효소와 항온처리하는 단계가 당업계에 알려져 있고 실시되는 항온처리 조건에 따라 수행됨을 제공한다.
5.2.5 어닐링
본원에 제공된 방법에서 어닐링 단계는, ssDNA 오버행을 분자내로 선택적으로 어닐링함으로써, 상기한 바와 같이(섹션 5.2.3) 변성 단계로부터 생성된 DNA 단편(예를 들어, 섹션 5.3 및 5.4)의 1개의 말단에 헤어핀화된 역위 반복을 생성하기 위해 수행된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서 어닐링 단계는 ssDNA 오버행을 분자내로 선택적으로 어닐링함으로써, 상기한 바와 같이(섹션 5.2.3) 변성 단계로부터 생성된 DNA 단편(예를 들어, 섹션 5.3 및 5.4)의 2개의 말단에 헤어핀화된 역위 반복을 생성하기 위해 수행된다. 이론에 얽매이지 않거나 이에 의해 달리 제한되지 않고, ssDNA 오버행의 이러한 선택적 분자내 어닐링은, ssDNA 오버행 내의 분자내 상보적 서열이 ssDNA 오버행의 분자내 어닐링을 ssDNA 오버행의 분자간 어닐링보다 열역학적으로 및/또는 동역학적으로 유리하게 만들기 때문에 달성된다.
이론에 얽매이지 않거나 이에 의해 달리 제한되지 않고, 오버행의 특정 길이 및/또는 서열이 ssDNA 오버행의 분자내 어닐링을 ssDNA 오버행의 분자간 어닐링보다 열역학적으로 및/또는 동역학적으로 유리하게 만들 수 있음이 인식된다. 예를 들어, 오버행 내의 분자내 힘 및 가닥 사이의 분자간 힘뿐만 아니라 생성된 구조를 나타내는 선형 상호작용 플롯이 도 2a-c에 도시된다. ssDNA 오버행 어닐링의 열역학 및 동역학은 다른 인자들 중에서 엔탈피(ΔH) 및 엔트로피(ΔS)에 의해 결정된다. 본 발명자들은 자유 ssDNA 오버행에서 분자내 어닐링된 오버행으로의 이동 자유 손실이 자유 ssDNA 오버행으로부터 분자간 어닐링된 오버행으로의 이동 자유 손실보다 적기 때문에, 분자내 어닐링에서의 엔트로피 손실이 분자내 어닐링에서의 엔트로피 손실보다 적음을 인식한다. 반면에, 분자내 어닐링된 오버행에서의 상보적 뉴클레오티드 쌍의 수가 분자간 어닐링된 오버행에서의 상보적 뉴클레오티드 쌍의 수보다 적기 때문에(따라서 더 적은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 및 훅스틴(Hoogsteen) 유형 수소 결합), 분자내 어닐링에서의 엔탈피 증가는 분자내 어닐링에서의 엔탈피 증가보다 적을 수 있다. 본원은, 오버행의 분자내 어닐링의 자유 에너지 증가(ΔG= ΔH-TΔS)가 분자간 어닐링의 것보다 크고 이에 따라 분자내 어닐링을 분자간 어닐링보다 열역학적으로 유리하게 만들도록, 상보적 뉴클레오티드 쌍의 특정 길이, 개수 및 G-C 및 A-T 쌍의 백분율을 갖도록 디자인될 수 있음을 제공한다. 본 발명자들은 또한, ssDNA 오버행 내의 뉴클레오티드가 분자 운동에서 또 다른 ssDNA 오버행의 뉴클레오티드와 접촉하는 것보다 서로 접촉할 확률이 더 높기 때문에, ssDNA 오버행의 분자내 어닐링의 동역학이 분자간 어닐링의 것보다 높을 수 있음을 인식한다. 본원은 분자내 어닐링이 분자간 어닐링보다 열역학적으로 유리하지 않더라도, ssDNA 오버행의 분자내 어닐링의 우수한 동역학이 분자간 어닐링된 오버행보다 분자내 어닐링된 오버행의 형성으로 이어질 수 있음을 제공한다.
어닐링 단계는 분자간 어닐링보다 분자내 어닐링을 유리하게 하도록 다양한 온도에서 수행될 수 있다. 하나의 실시양태에서, ssDNA 오버행은 적어도 15℃, 적어도 16℃, 적어도 17℃, 적어도 18℃, 적어도 19℃, 적어도 20℃, 적어도 21℃, 적어도 22℃, 적어도 23℃, 적어도 24℃, 적어도 25℃, 적어도 26℃, 적어도 27℃, 적어도 28℃, 적어도 29℃, 적어도 30℃, 적어도 31℃, 적어도 32℃, 적어도 33℃, 적어도 34℃, 적어도 35℃, 적어도 36℃, 적어도 37℃, 적어도 38℃, 적어도 39℃, 적어도 40℃, 적어도 41℃, 적어도 42℃, 적어도 43℃, 적어도 44℃, 적어도 45℃, 적어도 46℃, 적어도 47℃, 적어도 48℃, 적어도 49℃, 적어도 50℃, 적어도 51℃, 적어도 52℃, 적어도 53℃, 적어도 54℃, 적어도 55℃, 적어도 56℃, 적어도 57℃, 적어도 58℃, 적어도 59℃ 또는 적어도 60℃의 온도에서 어닐링된다. 또 다른 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃ 또는 약 60℃의 온도에서 어닐링된다. 하나의 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 적어도 25℃의 온도에서 어닐링된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 25℃의 온도에서 어닐링된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 실온에서 어닐링된다.
또한, 어닐링 단계는 분자내 어닐링을 분자간 어닐링보다 유리하게 하는 다양한 지속 시간 동안 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, ssDNA 오버행은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39 또는 적어도 40분 동안 어닐링된다. 다른 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39 또는 약 40분 동안 어닐링된다. 하나의 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 적어도 20분 동안 어닐링된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 20분 동안 어닐링된다.
일부 실시양태에서, 어닐링은 센스 및 안티센스 서열 쌍의 계산된 용융 온도 미만으로 온도를 낮춤으로써 달성될 수 있다. 용융 온도는 특정 뉴클레오티드 염기 함량 및 사용되는 용액의 특성, 예를 들어 염 농도에 따라 달라진다. 임의의 주어진 서열 및 용액 조합에 대한 용융 온도는 당업계에서 실시되며 알려진 바와 같이 쉽게 계산된다.
일부 실시양태에서, 어닐링은 센스 및 안티센스 서열 쌍 사이의 상호작용을 가능하게 하기 위해 변성 화학 작용제의 양을 감소시킴으로써 등온적으로 달성될 수 있다. DNA 서열을 변성시키는 데 필요한 변성 화학 작용제의 최소 농도는 특정 뉴클레오티드 염기 함량 및 사용되는 용액의 특성, 예를 들어 온도 또는 염 농도에 따라 달라질 수 있다. 임의의 주어진 서열 및 용액 조합에 대해 변성을 야기하지 않는 화학적 변성화제의 농도는 당업계에 알려져 있고 실시되는 바와 같이 쉽게 확인된다. 또한, 화학적 변성화제의 농도는 당업계에 알려져 있고 실시되는 바와 같이 쉽게 변형될 수 있다. 예를 들어, 우레아의 양은 투석 또는 접선 유동 여과에 의해 낮아질 수 있거나, pH는 산 또는 염기의 부가에 의해 변경될 수 있다.
분자내 어닐링을 위한 어닐링 온도 및 어닐링 지속 시간은 ssDNA 오버행의 길이, 상보적 뉴클레오티드 쌍의 수, G-C 및 A-T 쌍의 백분율, 및 ssDNA 오버행의 서열(상보적 뉴클레오티드 쌍의 배열)과 관계 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법을 위해 제공된 ssDNA 오버행은 섹션 5.2.3에 기재된 바와 같이 임의 개수의 뉴클레오티드를 길이로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법을 위해 제공된 ssDNA 오버행은 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39, 적어도 40, 적어도 41, 적어도 42, 적어도 43, 적어도 44, 적어도 45, 적어도 46, 적어도 47, 적어도 48, 적어도 49 또는 적어도 50개의 분자내 상보적 뉴클레오티드 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법을 위해 제공된 ssDNA 오버행은 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49 또는 약 50개의 분자내 상보적 뉴클레오티드 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법을 위해 제공된 ssDNA 오버행은 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89% 또는 적어도 90%의 G-C 쌍을 분자내 상보적 뉴클레오티드 쌍 중에서 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법을 위해 제공된 ssDNA 오버행은 약 50%, 약 51%, 약 52%, 약 53%, 약 54%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89% 또는 약 90%의 G-C 쌍을 분자내 상보적 뉴클레오티드 쌍 중에서 포함한다.
또한, 본 발명자들은 오버행의 농도와 관계가 있는 DNA 분자의 농도가 오버행의 분자내 어닐링 및 분자간 어닐링의 평형 및 동역학에 영향을 미칠 수 있음을 인식한다. 이론에 얽매이지 않거나 달리 제한되지 않고, 오버행의 농도가 너무 높을 경우, 오버행 중 분자간 접촉 확률이 증가하고, 그 후 상기 논의된 바와 같이 더 낮은 농도에서 보이는 분자간 접촉에 비해 분자내 접촉의 동역학적 이점이 감소된다.
상기 논의된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 분자내 상호작용은 더 빠른 속도로 일어날 수 있는 반면 분자간 상호작용은 더 느린 속도로 일어난다. 일부 실시양태에서, 3개 이상의 분자(예를 들어, 3개의 상이한 가닥)를 수반하는 염기 쌍 상호작용이 가장 느린 속도로 일어난다. 일부 실시양태에서, 분자내 상호작용 대 분자간 상호작용의 운동 속도는 각각의 분자의 농도에 의해 지배된다. 일부 실시양태에서, DNA 가닥의 농도가 낮을 경우, 분자내 상호작용은 동역학적으로 더 빠르거나 분자내 힘은 더 크다.
개별적으로 볼 때, IR 또는 ITR의 각각의 상보적 도메인을 형성하는 절대 자유 에너지는 상이할 수 있으며, 이는 가닥이 변성 상태에서 어닐링된 상태로 전이함에 따라 더 일찍 국부적으로 접힐 수 있는 IR 또는 ITR의 영역으로 이어질 수 있다. 국부적으로 접힌 도메인(예를 들어, 이 섹션(섹션 5.3.1) 및 섹션 5.4의 다른 부분에 기재된 바와 같은 AAV2 ITR에서와 같은 중앙 헤어핀 또는 분지형 헤어핀)의 존재는 다른 가닥과 쌍을 이루는 데 이용가능한 염기의 양을 감소시킬 수 있고, 이에 따라 분자간 어닐링 또는 혼성화의 가능성을 감소시키며 평형을 분자간 어닐링에서 분자내 어닐링 또는 ITR 형성으로 이동시킬 수 있다.
따라서, 본원은 어닐링 단계가 분자간 어닐링보다 분자내 어닐링을 유리하게 하는 다양한 농도에서 수행될 수 있음을 제공한다. 일부 실시양태에서, ssDNA 오버행은 1 이하, 2 이하, 3 이하, 4 이하, 5 이하, 6 이하, 7 이하, 8 이하, 9 이하, 10 이하, 11 이하, 12 이하, 13 이하, 14 이하, 15 이하, 16 이하, 17 이하, 18 이하, 19 이하, 20 이하, 21 이하, 22 이하, 23 이하, 24 이하, 25 이하, 26 이하, 27 이하, 28 이하, 29 이하, 30 이하, 31 이하, 32 이하, 33 이하, 34 이하, 35 이하, 36 이하, 37 이하, 38 이하, 39 이하, 40 이하, 41 이하, 42 이하, 43 이하, 44 이하, 45 이하, 46 이하, 47 이하, 48 이하, 49 이하, 50 이하, 55 이하, 60 이하, 65 이하, 70 이하, 75 이하, 80 이하, 85 이하, 90 이하, 95 이하, 100 이하, 110 이하, 120 이하, 130 이하, 140 이하, 150 이하, 160 이하, 170 이하, 180 이하, 190 이하, 200 이하, 210 이하, 220 이하, 230 이하, 240 이하, 250 이하, 260 이하, 270 이하, 280 이하, 290 이하, 300 이하, 325 이하, 350 이하, 375 이하, 400 이하, 425 이하, 450 이하, 475 이하, 500 이하, 550 이하, 600 이하, 650 이하, 700 이하, 750 이하, 800 이하, 850 이하, 900 이하, 950 이하, 1000 ng/μl 이하의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 특정 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 210, 약 220, 약 230, 약 240, 약 250, 약 260, 약 270, 약 280, 약 290, 약 300, 약 325, 약 350, 약 375, 약 400, 약 425, 약 450, 약 475, 약 500, 약 550, 약 600, 약 650, 약 700, 약 750, 약 800, 약 850, 약 900, 약 950, 약 1000 ng/μl의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다.
유사하게는, 본원은 어닐링 단계가 분자간 어닐링보다 분자내 어닐링을 유리하게 하는 다양한 몰 농도로 수행될 수 있음을 제공한다. 일부 실시양태에서, ssDNA 오버행은 1 이하, 2 이하, 3 이하, 4 이하, 5 이하, 6 이하, 7 이하, 8 이하, 9 이하, 10 이하, 11 이하, 12 이하, 13 이하, 14 이하, 15 이하, 16 이하, 17 이하, 18 이하, 19 이하, 20 이하, 21 이하, 22 이하, 23 이하, 24 이하, 25 이하, 26 이하, 27 이하, 28 이하, 29 이하, 30 이하, 31 이하, 32 이하, 33 이하, 34 이하, 35 이하, 36 이하, 37 이하, 38 이하, 39 이하, 40 이하, 41 이하, 42 이하, 43 이하, 44 이하, 45 이하, 46 이하, 47 이하, 48 이하, 49 이하, 50 이하, 55 이하, 60 이하, 65 이하, 70 이하, 75 이하, 80 이하, 85 이하, 90 이하, 95 이하, 100 이하, 110 이하, 120 이하, 130 이하, 140 이하, 150 이하, 160 이하, 170 이하, 180 이하, 190 이하, 200 이하, 210 이하, 220 이하, 230 이하, 240 이하, 250 이하, 260 이하, 270 이하, 280 이하, 290 이하, 300 이하, 325 이하, 350 이하, 375 이하, 400 이하, 425 이하, 450 이하, 475 이하, 500 이하, 550 이하, 600 이하, 650 이하, 700 이하, 750 이하, 800 이하, 850 이하, 900 이하, 950 이하, 1000 nM 이하의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 특정 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 210, 약 220, 약 230, 약 240, 약 250, 약 260, 약 270, 약 280, 약 290, 약 300, 약 325, 약 350, 약 375, 약 400, 약 425, 약 450, 약 475, 약 500, 약 550, 약 600, 약 650, 약 700, 약 750, 약 800, 약 850, 약 900, 약 950, 약 1000 nM의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 일부 추가 실시양태에서, ssDNA 오버행은 1 이하, 2 이하, 3 이하, 4 이하, 5 이하, 6 이하, 7 이하, 8 이하, 9 이하, 10 이하, 11 이하, 12 이하, 13 이하, 14 이하, 15 이하, 16 이하, 17 이하, 18 이하, 19 이하, 20 μM 이하의 농도로 어닐링된다. 또 다른 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20 μM의 농도로 어닐링된다. 하나의 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 10 nM의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 20 nM의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 30 nM 의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 추가적인 특정 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 40 nM 의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 50 nM의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 60 nM의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 하나의 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 10 ng/μl의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 20 ng/μl의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 30 ng/μl의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 추가적인 특정 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 40 ng/μl의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 하나의 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 50 ng/μl의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 60 ng/μl의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 70 ng/μl의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 하나의 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 80 ng/μl의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 90 ng/μl의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, ssDNA 오버행은 약 100 ng/μl의 농도로 DNA 분자에 대해 어닐링된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법을 위해 제공된 ssDNA 오버행은 표 3에 나열된 임의의 서열을 포함한다.
표 3: ssDNA 오버행의 서열 및 어닐링 후 해당 구조.
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일부 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자의 구조는 2, 3, 4, 5, 10 또는 20 주기의 변성/재생(예를 들어, 섹션 5.2.3에 기재된 바와 같은 변성 및 이 섹션(섹션 5.2.5)에 기재된 바와 같은 재-어닐링) 후 동일하다. DNA 구조는 최소 에너지 또는 그 부근의 구조 앙상블(ensemble)에 의해 설명될 수 있다. 특정 실시양태에서, 앙상블 DNA 구조는 2, 3, 4, 5, 10 또는 20 주기의 변성/재생 후에 동일하다. 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 ITR 또는 IR로부터 형성된 접힌 헤어핀 구조는 2, 3, 4, 5, 10 또는 20 주기의 변성/재생 후에 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 접힌 헤어핀의 앙상블 구조는 2, 3, 4, 5, 10 또는 20 주기의 변성/재생 후에 동일하다.
5.2.6 엑소뉴클레아제와의 항온처리 단계
본원은 섹션 3에 기재된 바와 같이 엑소뉴클레아제와 함께 항온처리하는 단계를 제공한다. 엑소뉴클레아제는 DNA 분자의 말단(엑소)으로부터 뉴클레오티드를 절단한다. 엑소뉴클레아제는 5'에서 3' 방향, 3'에서 5' 방향 또는 양방향을 따라 뉴클레오티드를 절단할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 엑소뉴클레아제는 서열 특이성 없이 뉴클레오티드를 절단한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 엑소뉴클레아제는, 섹션 3에서 제공되는 바와 같이, 제5 및 제6 제한 부위를 인식하고 절단하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제 또는 플라스미드 또는 플라스미드의 단편을 절단하는 제한 효소에 의해 생성된 말단을 포함하는 DNA 단편을 분해한다.
당업계에 알려져 있고 사용되는 다양한 엑소뉴클레아제가 본원에 제공된 방법에 사용될 수 있다. 본 방법에 사용하기 위한 제한 효소에 대한 실시양태로서 제공된 엑소뉴클레아제의 예시적인 목록은, 뉴 잉글랜드 바이오랩스의 카탈로그에 기재되며, 이는 [neb.com/products/dna-modifying-enzymes-and-cloning-technologies/nucleases]에서 이용가능하고, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. DNA 분자를 분해하기 위한 다양한 엑소뉴클레아제에 대한 조건은 본원에 제공된 다양한 엑소뉴클레아제에 대해 알려져 있고, 이는 온도, 염 농도, pH, 완충 시약, 특정 세제의 존재 또는 부재, 분해의 원하는 백분율을 달성하기 위한 항온처리 지속 시간을 포함한다. 이러한 조건은 제한 효소의 다양한 공급업체, 예를 들어 뉴 잉글랜드 바이오랩스의 웹사이트 또는 카탈로그로부터 쉽게 입수할 수 있다. 본원은 DNA 분자를 제한 효소와 항온처리하는 단계가 당업계에 알려져 있고 실시되는 항온처리 조건에 따라 수행되는 것을 제공한다.
엑소뉴클레아제를 항온처리하는 단계는 헤어핀-말단 DNA 분자를 온전하게 남겨두는 한편, 하나 이상의 말단을 가진 DNA 분자를 선택적으로 분해한다. 섹션 5.2.5 및 5.4의 설명으로부터 명확한 바와 같이, 헤어핀-말단 DNA 분자는 0, 1, 2 이상의 닉을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 엑소뉴클레아제는 원형 ssDNA/dsDNA 분자 또는 말단이 없는 하나 이상의 닉을 포함하는 DNA 분자를 온전하게 남겨두는 한편, 하나 이상의 말단을 갖는 DNA 분자를 선택적으로 분해하는 엑소뉴클레아제일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 V(RecBCD)일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 VIII 또는 절단된 엑소뉴클레아제 VIII일 수 있다. 엑소뉴클레아제 V(RecBCD), 엑소뉴클레아제 VIII 및 절단된 엑소뉴클레아제 VIII는 이 단락에 기재된 선택성을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 엑소뉴클레아제는, DNA 분자의 선형 세그먼트를 선택적으로 분해하는 엑소뉴클레아제일 수 있고, 이는 하나 이상의 닉으로부터 개시하지만 접힌 헤어핀을 통해 진행할 수 없고, 헤어핀에서 분해를 종결하고, ssDNA를 뒤에 남긴다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 닉 및/또는 이중 가닥 파단에서 개시하도록 사용하기 위한 엑소뉴클레아제는 T7 엑소뉴클레아제일 수 있다. 또한, 다른 적합한 엑소뉴클레아제는, 예를 들어 뉴 잉글랜드 바이오랩스를 포함하는 엑소뉴클레아제의 다양한 공급업체의 웹사이트 또는 카탈로그에 기재된 바와 같이, 당업계에 알려져 있고 사용되며, 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 엑소뉴클레아제 처리 후, 본원의 DNA 분자는 임의의 원핵 백본 서열이 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 백본은 2개의 ITR 사이에서 발현 카세트를 포함하는 서열의 일부가 아닌 플라스미드 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 백본은 2개의 ITR 사이에서 발현 카세트를 포함하는 서열의 일부가 아닌 벡터 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원의 단리된 DNA 분자는 모체 플라스미드의 원핵 백본 서열이 100% 없거나, 99% 없거나 , 98% 없거나, 97% 없거나, 96% 없거나, 95% 없거나, 94% 없거나, 93% 없거나, 92% 없거나, 91% 없거나, 90% 없다.
5.2.7 리가아제로 닉을 보수하는 단계
본원은 섹션 3에 기재된 바와 같이 리가아제로 닉을 보수하는 선택적 단계를 제공한다. DNA 리가아제는 하나 이상의 새로운 공유 결합을 형성함으로써 DNA 분자의 두 말단의 연결에 촉매작용한다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 T4 DNA 리가아제는 DNA에서 병치된 5' 포스페이트 및 3' 하이드록실 말단 사이의 포스포디에스테르 결합의 형성에 촉매작용한다. 2개의 DNA 분자를 연결하기 위해 리가아제에 의해 촉매작용되는 새로운 공유 결합의 형성이 "결찰"로 지칭된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 DNA 리가아제는 서열 특이성 없이 뉴클레오티드를 결찰시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 DNA 리가아제는 섹션 5.4에 기재된 DNA 분자의 1개의 닉에서 2개의 말단을 결찰시킴으로써 상기 1개의 닉을 보수한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 DNA 리가아제는 섹션 5.4에 기재된 DNA 분자의 2개의 닉에서 2개의 말단의 각각의 쌍을 결찰시킴으로써 2개의 닉을 보수한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 DNA 리가아제는 섹션 5.4에 기재된 DNA 분자의 모든 닉에서 2개의 말단의 각각의 쌍을 결찰시킴으로써 DNA 분자의 모든 닉을 보수한다. 섹션 5.4에 기재된 DNA 분자의 모든 닉이 보수된 후, 섹션 5.4에 기재된 DNA 분자는 원형 DNA를 형성한다. 섹션 5.4에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 섹션 5.4에 기재된 DNA 분자는 2개의 닉으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 섹션 5.4에 기재된 DNA 분자는 2개의 닉을 포함한다. 다른 실시양태에서, 섹션 5.4에 기재된 DNA 분자는 하나의 닉으로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 섹션 5.4에 기재된 DNA 분자는 하나의 닉을 포함한다.
일부 실시양태에서, 리가아제로 닉을 보수하는 단계는 당업계에 알려져 있고 실시되는 항온처리 조건에 따라 수행될 수 있다.
당업계에 알려져 있고 사용되는 다양한 리가아제가 본원에 제공된 방법에 사용될 수 있다. 본 방법에 사용하기 위한 리가아제에 대한 실시양태로서 제공된 리가아제의 예시적인 목록은, 뉴 잉글랜드 바이오랩스의 카탈로그에 기재되며, 이는 [neb.com/products/dna-modifying-enzymes-and-cloning-technologies/dna-ligases/dna-ligases]에서 이용가능하고, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. DNA 분자를 분해하기 위한 다양한 리가아제에 대한 조건은 본원에 제공된 다양한 리가아제에 대해 알려져 있고, 이는 온도, 염 농도, pH, 완충 시약, 특정 세제의 존재 또는 부재, 분해의 원하는 백분율을 달성하기 위한 항온처리 지속 시간을 포함한다. 이러한 조건은 제한 효소의 다양한 공급업체, 예를 들어, 뉴 잉글랜드 바이오랩스의 웹사이트 또는 카탈로그로부터 쉽게 입수할 수 있다. 또한, 결찰 조건은 결찰될 2개의 DNA 말단의 이동의 자유와 관계가 있다. 2개의 DNA 말단이, 예를 들어 공통 DNA 가닥에 어닐링하는 양쪽 말단에 의해, 서로의 근위에 있게 될 수 있거나, 서로 근위에 있게 될 더 높은 가능성을 가질 수 있을 경우에, 결찰은 향상될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.2.7)에 제공된 방법 단계는 리가아제로 닉을 보수하여 원형 DNA를 형성하며, 여기서 섹션 5.4에 기재된 DNA 분자의 임의의 닉에서 2개의 DNA 말단은 공통 DNA 가닥에 어닐링하였다. 일부 실시양태에서, 리가아제로 닉을 보수하는 단계는 당업계에 알려져 있고 실시되는 항온처리 조건에 따라 수행된다.
특정 실시양태에서, 이 섹션 5.2에 제공된 방법을 사용하여 본원에 기재된 헤어핀-말단 DNA 분자를 높은 규모, 높은 수율 및/또는 높은 순도로 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단일 반응 용기에서 높은 규모, 높은 수율 및/또는 높은 순도가 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 높은 규모는 적어도 1 mg, 10 mg, 100 mg, 1 g, 10 g, 100 g, 1 kg 또는 적어도 10 kg이다. 특정 실시양태에서, 높은 수율은 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 적어도 99%의 수율이다(투입으로 사용된 플라스미드 사본의 수와 산물로서 헤어핀-말단 DNA 분자의 수를 비교함). 특정 실시양태에서, 높은 순도는 본원에 제공된 방법의 결과의 산물로서 헤어핀-말단 DNA 분자의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 적어도 99% 순도이다.
5.3 본 방법에 사용되는 DNA 분자
본원은 상기 섹션 3에 기재된 바와 같은 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 DNA 분자의 다양한 양태와 실시양태를 제공한다. 하나의 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재되거나 도 2a 및 2c에 도시된 바와 같음), 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
추가적인 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복을 포함하는 상부 가닥 3' 오버행을 초래하도록(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재되거나 도 2b 및 2c에 도시된 바와 같음), 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
하나의 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 및 제2 표적 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음), ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제3 및 제4 표적 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 및 제2 표적 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재되거나 도 2a 및 2c에 도시된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제3 및 제4 표적 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 및 제2 표적 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제3 및 제4 표적 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
추가적인 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 및 제2 표적 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재되거나 도 2b 및 2c에 도시된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제3 및 제4 표적 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 이 단락과 앞선 3개 단락에서 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 표적 부위는 모두 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 본 단락과 앞선 3개 단락에서 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 표적 부위 중 3개는 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 본 단락과 앞선 3개 단락에서 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 표적 부위 중 2개는 동일하다. 추가 실시양태에서, 본 단락과 앞선 3개 단락에서 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 표적 부위는 모두 상이하다.
본원에 제공된 DNA 분자는 섹션 3 및 이 섹션(섹션 5.3)의 선행 단락들에 기재된 바와 같이 다양한 특징을 포함하거나 다양한 실시양태를 가지며, 이러한 특징 및 실시양태는 하기 다양한 하위 섹션에서 추가로 기재된다: 제1 역위 반복 및/또는 제2 역위 반복을 포함하는 역위 반복에 대한 실시양태는 섹션 5.3.1에 기재되고, 제한 효소, 닉킹 엔도뉴클레아제 및 이들 각각의 제한 부위에 대한 실시양태는 섹션 5.3.2 및 5.2.4에 기재되고, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소 및 이들의 표적화 부위에 대한 실시양태는 섹션 5.2.4에 기재되고, 발현 카세트에 대한 실시양태는 섹션 5.3.3에 기재되고, 플라스미드 및 벡터에 대한 실시양태는 섹션 5.3.5에 기재되고, 닉킹 엔도뉴클레아제에 제한 부위를 4개 미만으로 포함하는 DNA 분자에 대한 실시양태는 섹션 5.3.6에 기재된다. 이와 같이, 본원은 본원에 기재된 DNA 분자의 다양한 실시양태 및 DNA 분자의 특징의 실시양태의 임의의 순열 및 조합을 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 추가 실시양태에서, ITR, 발현 카세트, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위 또는 제한 효소 및 프로그래밍 가능한 닉킹 효소 및 이들의 표적화 부위 간의 배열은 섹션 5.2.3, 5.2.4, 5.2.5, 5.3.1, 5.3.2, 5.3.3, 5.3.6 및 5.4에 기재된 바와 같은 임의의 배열일 수 있다.
하나의 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4, 5.3.2 및 5.3.4에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 바이러스 복제 불능(viral replication deficient) 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1 및 섹션 5.3.4에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 바이러스 복제 불능 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1 및 섹션 5.3.4에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 바이러스 복제 불능 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 바이러스 복제 불능 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 바이러스 복제 불능 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 바이러스 복제 불능 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 닉킹이 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같이 초래하도록 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 바이러스 복제 불능 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1 및 5.3.4에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재되거나 도 2a 및 2c에 도시된 바와 같음), 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 바이러스 복제 불능 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1 및 섹션 5.3.4에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 바이러스 복제 불능 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 바이러스 복제 불능 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 바이러스 복제 불능 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 바이러스 복제 불능 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 바이러스 복제 불능 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1 및 5.3.4에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 바이러스 복제 불능 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1 및 5.3.4에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 바이러스 복제 불능 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 바이러스 복제 불능 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 바이러스 복제 불능 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 바이러스 복제 불능 역위 반복을 포함한다.
추가적인 양태에서, i) 닉킹이 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같은 하부 가닥을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 바이러스 복제 불능 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1 및 5.3.4에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복을 포함하는 상부 가닥 3' 오버행을 초래하도록(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재되거나 도 2b 및 2c에 도시된 바와 같음), 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제2 바이러스 복제 불능 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1 및 섹션 5.3.4에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 바이러스 복제 불능 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 바이러스 복제 불능 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 바이러스 복제 불능 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 바이러스 복제 불능 역위 반복을 포함한다.
본원에 제공된 DNA 분자는 이의 태생 환경에서의 DNA 분자 또는 단리된 DNA 분자일 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 분자는 이의 태생 환경에서의 DNA 분자이다. 일부 실시양태에서, DNA 분자는 단리된 DNA 분자이다. 하나의 실시양태에서, 단리된 DNA 분자는 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20%, 적어도 21%, 적어도 22%, 적어도 23%, 적어도 24%, 적어도 25%, 적어도 26%, 적어도 27%, 적어도 28%, 적어도 29%, 적어도 30%, 적어도 31%, 적어도 32%, 적어도 33%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 37%, 적어도 38%, 적어도 39%, 적어도 40%, 적어도 41%, 적어도 42%, 적어도 43%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 47%, 적어도 48%, 적어도 49%, 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 순도의 DNA 분자일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 DNA 분자는 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 약 50%, 약 51%, 약 52%, 약 53%, 약 54%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 순도의 DNA 분자일 수 있다. 순도의 측면에서 본원에 제공된 단리된 DNA 분자의 다른 실시양태는 섹션 5.3.7에서 추가로 기재되며, 이는 이 단락에서 제공된 실시양태와의 임의의 적절한 조합으로 조합될 수 있다.
DNA 분자가 완전히 조작될 수 있기 때문에(예를 들어, 합성적으로 제조되거나 재조합적으로 제조됨), 섹션 3 및 이 섹션 5.3의 것을 포함하는 본원에 제공된 DNA 분자는 섹션 5.3.4에 추가로 기재된 바와 같은 특정 서열 또는 특징이 결여될 수 있다.
5.3.1 역위 반복
섹션 3 및 이 섹션(섹션 5.3.1)에 제공된 ITR 또는 IR은, 예를 들어 섹션 3, 5.2.3, 5.2.4 및 5.2.5에 기재된 방법 단계를 수행할 때 섹션 5.4에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자에서 헤어핀화된 ITR을 형성할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 섹션 3 및 이 섹션(섹션 5.3.1)에 제공된 ITR 또는 IR은 섹션 3 및 섹션 5.4에 제공된 IR 또는 ITR의 임의의 실시양태 및 이 섹션(섹션 5.3.1)에 제공된 추가 실시양태를, 임의의 조합으로 포함할 수 있다.
세포 내 대부분의 DNA는 왓슨-크릭 염기 쌍 형성에 관여하는 2개의 가닥을 포함하며, 이는 대부분의 작용기를 격리하고, 구조적 및 기능적 다양성을 제한한다. 이는 기능이 유전 정보를 저장하기 위한 것인 분자에 대한 바람직한 특성이지만, 단일 가닥화된 바이러스는 선형 단일 가닥화된 DNA(ssDNA)의 분자내 상호작용을 활용하여 또 다른 기능적 복잡성 층을 추가하는 2차 구조를 형성하도록 진화하였다. 하나의 주요 기여 요인은 이러한 ssDNA 바이러스 게놈이 둘로 접혀 헤어핀을 형성하는 단 하나의 가닥으로 구성된다는 것이다.
단일 가닥화된 DNA 분자의 2차 구조는 구성 뉴클레오티드 사이에 형성되는 상보적 염기-쌍 형성의 초기 DNA 서열에 기초한 패턴의 표시일 수 있다. 4개의 문자(각각의 뉴클레오티드 종에 대해 하나씩)의 문자열로 표시되는 서열은 일반적으로 열역학적 상호작용에 의해 지배되는 최소 자유 에너지를 갖는 다른 2차 구조를 형성하는 것으로 가정되는 뉴클레오티드로 구성된 단일 가닥이다.
"역위 반복" 또는 "IR"은 회문 서열 영역을 포함하는 단일 가닥화된 핵산 서열을 지칭한다. 이러한 회문 영역은 하기에 추가로 기재된 바와 같이 동일한 가닥 상에서, 뉴클레오티드 뿐만 아니라 이의 역상보의 서열, 즉 하기에 추가로 기재된 바와 같은 "회문 서열"을 포함한다. 염기 사이의 소수성 스태킹 인력(stacking attraction)이 파괴된 조건에서 의미하는 변성 상태에서, IR 핵산 서열은 무작위 코일 상태(예를 들어, 고온, 화학 작용제의 존재, 높은 pH 등)로 존재한다. 조건이 보다 생리학적이 됨에 따라, 상기 IR은 가장 바깥쪽 영역이 염기 쌍 형성에 의해 함께 비-공유적으로 유지되는 2차 구조로 접힐 수 있다. 일부 실시양태에서, IR은 ITR일 수 있다. 특정 실시양태에서, IR은 ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서 IR은 헤어핀화된 역위 반복일 수 있다. 특정 실시양태에서, 역위 반복은, 일단 둘로 접히면, 헤어핀 루프(스템 루프로도 알려짐)를 생성할 수 있으며, 여기서 DNA 가닥이 접히고 동일 가닥 중 또 다른 섹션과 염기 쌍을 형성할 때 단일 가닥화된 DNA의 쌍을 이루지 않은 루프가 생성된다. 접힐 때, 역위 반복은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 그러한 헤어핀 루프 구조를 포함할 수 있다.
"역위 말단 반복" "말단 반복", "TR" 또는 "ITR"은 단일 가닥 DNA 분자의 말단에 있거나 이에 근접한 역위 반복 영역, 또는 dsDNA 분자의 단일 가닥 오버행에 있거나 그것 내의 역위 반복을 지칭한다. ITR은 ITR 내의 회문 서열의 결과로서 둘로 접힐 수 있다. 하나의 실시양태에서, ITR은 ssDNA의 하나의 말단에 있거나, 이에 근접해 있다. 또 다른 실시양태에서, ITR은 dsDNA의 하나의 말단에 있거나, 이에 근접해 있다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 ITR 각각은 ssDNA의 2개의 각각의 말단에 있거나 이에 근접해 있다. 추가 실시양태에서, 2개의 ITR 각각은 dsDNA의 2개의 각각의 말단에 있거나 이에 근접해 있다. 일부 실시양태에서, ssDNA 또는 dsDNA의 비-ITR 부분은 ITR에 대해 이종이다. 특정 실시양태에서, ssDNA 또는 dsDNA의 비-ITR 부분은 ITR에 대해 동종이다. 염기 사이의 소수성 스태킹 인이 파괴된 조건에서 의미하는 변성 상태에서, 핵산 서열을 포함하는 ITR은 무작위 코일 상태(예를 들어, 고온, 화학 작용제의 존재, 높은 pH 등)로 존재한다. 일부 실시양태에서, 섹션 5.2.5에 기술재된 바와 같이 조건이 어닐링에 보다 적합해짐에 따라, ITR은 염기 쌍 형성에 의해 함께 비-공유적으로 유지되는 구조로 둘로 접힐 수 있는 한편 dsDNA의 이종 비-ITR 부분은 온전히게 유지되거나, ssDNA 분자의 이종 비-ITR 부분은 이종 DNA 분자의 역상보 서열을 포함하는 제2 ssDNA 분자와 혼성화할 수 있다. 2개의 혼성화된 DNA 가닥의 생성된 복합체는 3개의 별개의 영역인, 제2 접힌 단일 가닥화된 ITR에 차례로 공유 연결된 이중 가닥 DNA 영역에 공유 연결된 제1 접힌 단일 가닥화된 ITR을 포함한다. 특정 실시양태에서, ITR 서열은 섹션 3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위 중 하나에서 시작하고 dsDNA 앞의 마지막 염기에서 끝날 수 있다. 하나의 실시양태에서, 선형 이중 가닥 DNA 분자와 반대로, DNA 분자의 어느 하나의 말단에서 상부 및 하부 가닥의 5' 및 3' 말단에 존재하는 ITR은 접혀서 서로 마주할 수 있고(예를 들어, 3'에서 5', 5'에서 3'으로 또는 그 반대), 따라서 핵산 듀플렉스(duplex)의 어느 하나의 말단에서 자유 5' 또는 3' 말단을 노출하지 않는다. ITR이 둘로 접힐 때, 접힌 ITR에서 dsDNA는, 일부 실시양태에서 dsDNA 측면에 있는 닉을 생성하는, DNA 분자의 비-ITR 부분의 dsDNA 바로 옆에 있을 수 있거나, 접힌 ITR에서 dsDNA는, 다른 실시양태에서 dsDNA의 측면에 있는 "ssDNA 갭"을 생성하는, DNA 분자의 비-ITR 부분의 dsDNA로부터 이격된 하나 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 비-ITR DNA 서열이 측면에 있는 2개의 ITR은 "ITR 쌍"으로 지칭된다. 일부 실시양태에서, ITR이 접힌 상태를 가정할 때, 이는, 예를 들어 37℃에서 1시간 초과 동안 엑소뉴클레아제 분해(예를 들어, 엑소뉴클레아제 V)에 대해 저항성이다.
2차 구조로 접힌 ITR의 말단 염기와 DNA 혼성화된 듀플렉스의 말단 염기 사이의 경계는, 닉 또는 ssDNA 갭이 측면에 있는 염기 쌍 사이의 스태킹 상호작용(예를 들어, 동축 스태킹)에 의해 추가로 안정화될 수 있고, 이러한 상호작용은 서열 의존적이다. 닉을 닮은 구조의 경우, 두 가지 형태 사이의 평형이 존재할 수 있으며, 여기서 첫 번째 형태는 닉이 측면에 있는 염기 쌍 사이의 스태킹이 보존되는 온전한 이중 나선의 형태에 매우 가까운 반면, 다른 형태는, 닉 부위에서의 스태킹의 완전 손실에 해당하고, 이에 따라 DNA에 뒤틀림(kink)을 유발한다. 닉킹된 분자는 같은 크기의 온전한 분자보다 폴리아크릴아미드와 아가로스겔 전기영동 동안 다소 느리게 움직이는 것으로 알려져 있다. 일부 경우에, 이러한 지연은 더 높은 온도에서 향상된다. 닉의 스태킹/직선 형태 및 비스태킹/휘어진 형태 사이의 빠른 평형은 겔 전기영동 동안 DNA 분자의 이동성에 직접적으로 영향을 미치고, 이는 닉을 보유한 DNA 분자에 대한 차등 지연 특성으로 이어지는 것으로 여겨진다.
이론에 얽매이지 않고, 세포 단백질은 평행한 5' 및 3' 말단을 이중 가닥 파단으로 인식할 수 있고, 세포에서 DNA의 운명에 악영향을 미칠 수 있는 이들을 끌어들일 뿐만 아니라 이들을 처리할 수 있다고 여겨진다. 따라서, ITR은 섹션 3 및 5.4와 이 섹션(섹션 5.3.1)에 제공된 바와 같이 2개의 말단 중 하나 또는 둘 모두에서 ITR로 발현 카세트의 너무 이른, 원치 않는 저하를 방지할 수 있다.
닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위를 대향하는 가닥 및 역위 반복의 근처에 배치하고 후속해서 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부를 분리함으로써, 생성된 오버행은 둘로 접혀서 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 적어도 하나의 제한 부위를 함유하는 이중 가닥화된 말단을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 접힌 ITR은 바이러스 ITR의 2차 구조 형태를 닮았다. 하나의 실시양태에서, ITR은 하부 가닥의 5' 및 3' 말단 모두에 위치한다(예를 들어, 좌측 ITR 및 우측 ITR). 또 다른 실시양태에서, ITR은 상부 가닥의 5' 및 3' 말단 모두에 위치한다. 또 다른 실시양태에서, 하나의 ITR은 상부 가닥의 5' 말단에 위치하고, 다른 ITR은 하부 가닥의 반대쪽 말단에 위치한다(예를 들어, 상부 가닥 상의 5' 말단에서 좌측 ITR 및 하부의 5' 말단에서 우측 ITR). 또 다른 실시양태에서, 하나의 ITR은 상부 가닥의 3' 말단에 위치하고, 다른 ITR은 하부 가닥의 3' 말단에 위치한다.
일부 양태에서, 본원은 회문 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공한다. "회문 서열" 또는 "회문구조(palindrome)"는 분자내 어닐링을 유리하게 하는 조건 하에서 자가 상보적 영역에서 dsDNA의 스트레치(stretch)를 형성하기 위해 접힐 수 있는 자가 상보적 DNA 서열이다. 일부 실시양태에서, 회문 서열은 상보적 가닥에서 역방향으로 읽을 때와 정방향으로 읽을 때 동일한 폴리뉴클레오티드의 연속 스트레치를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 회문 서열은 상보적 가닥에서 역방향으로 읽을 때와 정방향으로 읽을 때 동일한 폴리뉴클레오티드의 스트레치를 포함하며, 이러한 스트레치는 비-회문 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 스트레치에 의해 중단된다. 또 다른 실시양태에서, 회문 서열은 상보적 가닥에서 역방향으로 읽을 때와 정방향으로 읽을 때, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드의 스트레치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 회문 서열은 상보적 가닥에서 역방향으로 읽을 때와 정방향으로 읽을 때, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드의 스트레치를 포함하고, 이러한 스트레치는 비-회문 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 스트레치에 의해 중단된다. 하나 이상의 회문 서열을 인코딩하는 ssDNA는 둘로 접혀서 2차 구조(예를 들어, 헤어핀 루프 또는 3-방향 접합)를 포함하는 이중 가닥화된 염기 쌍을 형성할 수 있다.
적절한 조건 하에서, 예를 들어 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.2.5에 기재된 바와 같이, 이 섹션(섹션 5.3.1)에 제공된 IR 또는 ITR은 이 섹션(섹션 5.3.1) 및 섹션 5.4에 기재된 바와 같이 접혀서 헤어핀 구조를 형성할 수 있고, 이는 스템, 1차 스템, 루프, 전환점, 벌지(bulge), 분지, 분지 루프, 내부 루프 및/또는 섹션 5.4에 기재된 구조적 특징의 임의의 조합 또는 순열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 IR 또는 ITR은 하나 이상의 회문 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 IR 또는 ITR은 1차 스템 도메인을 형성하는 것 외에 분지형 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 회문 서열 또는 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IR 또는 ITR은 임의의 개수의 분지형 헤어핀을 형성할 수 있는 회문 서열을 포함한다. 특정 구체적인 실시양태에서, IR 또는 ITR은 1 내지 30개, 또는 1 내지 30개 중 임의의 하위 범위로, 분지형 헤어핀을 형성할 수 있는 회문 서열을 포함한다. 일부 구체적인 실시양태에서, IR 또는 ITR은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 분지형 헤어핀을 형성할 수 있는 회문 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IR 또는 ITR은 3-방향 접합 도메인(T자형)으로 이어지는 2개의 분지형 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IR 또는 ITR은 4-방향 접합 도메인(또는 십자형 구조)으로 이어지는 3개의 분지형 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IR 또는 ITR은 T형이 아닌 헤어핀 구조, 예를 들어 U자형 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IR 또는 ITR은 일련의 벌지 및 염기 쌍 불일치를 포함하는 중단된 U자형 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분지형 헤어핀은 모두 동일한 길이의 스템 및/또는 루프를 갖는다. 일부 실시양태에서, 하나의 분지형 헤어핀은 다른 분지형 헤어핀보다 더 작다(예를 들어, 절단됨). 헤어핀 구조 및 헤어핀 구조의 구조적 요소의 일부 예시적인 실시양태가 도 1에 도시된다.
"헤어핀 폐쇄 염기 쌍"은 쌍을 이루지 않은 루프 서열을 따르는 첫 번째 염기 쌍을 지칭한다. 특정 스템 루프 서열은 선호되는 폐쇄 염기 쌍(예를 들어, AAV2 ITR에서 GC)를 갖는다. 하나의 실시양태에서, 스템 루프 서열은 폐쇄 염기 쌍으로서 G-C 쌍을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 스템 루프 서열은 폐쇄 염기 쌍으로서 C-G 쌍을 포함한다.
"ITR 폐쇄 염기 쌍"은 접힌 ITR에서 염기 쌍을 형성하는 첫 번째 및 마지막 뉴클레오티드를 지칭한다. 말단 염기 쌍은 일반적으로 DNA 분자의 비-ITR 서열(예를 들어, 발현 카세트)에 가장 근접한 1차 스템 도메인의 뉴클레오티드의 쌍이다. ITR 폐쇄 염기 쌍은 임의 종류의 염기 쌍(예를 들어, CG, AT, GC 또는 TA)일 수 있다. 하나의 실시양태에서, ITR 폐쇄 염기 쌍은 G-C 염기 쌍이다. 또 다른 실시양태에서, ITR 폐쇄 염기 쌍은 A-T 염기 쌍이다. 또 다른 실시양태에서, ITR 폐쇄 염기 쌍은 C-G 염기 쌍이다. 추가 실시양태에서, ITR 폐쇄 염기 쌍은 T-A 염기 쌍이다.
본원은 DNA 2차 구조가 당업계에 알려져 있고 실시되는 바에 따라 계산적으로 예측될 수 있음을 제공한다. DNA 2차 구조는 몇 가지 방식으로 나타낼 수 있다: 구불구불한 플롯, 그래프 표시, 점-괄호 표기법, 원형 플롯, 호(arc) 다이어그램, 마운틴 플롯, 점 플롯 등. 원형 플롯에서, 백본은 원으로 표시되고, 염기 쌍은 원 내부의 호로 부호화된다. 호 다이어그램에서, DNA 백본은 직선으로 그어지고 각각의 염기 쌍의 뉴클레오티드는 호로 연결된다. 원형 및 호 플롯 모두 2차 구조 유사점 및 차이점의 식별을 가능하게 한다.
DNA 2차 구조 예측을 위한 많은 방법 중 하나는 최근접 이웃 모델(nearest-neighbor model)을 사용하고 DNA 구조와 관련된 총 자유 에너지를 최소화한다. 최소 자유 에너지는 염기 쌍 스태킹, 헤어핀, 벌지, 내부 루프 및 다중-분지 루프로부터의 개별 에너지 기여를 합산함으로써 추정된다. 이러한 요소의 에너지 기여는 서열 및 길이 의존적이고, 실험적으로 결정되었다. 스템 루프 및 하위-스템으로의 서열 구분은, 예를 들어 구조를 그래프 플롯으로 표시함으로써 도시될 수 있다. 선형 상호작용 플롯에서, 각각의 잔기는 가로 좌표에 표시되고 반타원형 선은 서로 쌍을 이루는 염기를 연결한다(예를 들어, 도 2a 및 b).
일부 실시양태에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 장기 생존을 증진한다. 일부 실시양태에서, ITR은 (예를 들어, 세포의 전체 수명 동안) 세포의 핵에서 핵산 분자의 영구적인 생존을 증진한다. 일부 실시양태에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 안정성을 증진한다. 일부 실시양태에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 분해를 억제하거나 방지한다.
특정 실시양태에서, IR 또는 ITR은 임의의 바이러스 ITR을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, IR 또는 ITR은 반복의 최외측 정점(apex) 또는 전환점에서 5' 또는 3' 말단을 노출하지 않는 회문구조 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 합성 회문 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, ITR 폐쇄 염기 쌍의 하나의 뉴클레오티드에서 ITR 폐쇄 염기 쌍의 다른 뉴클레오티드까지 늘어진 단일 가닥화된 ITR 서열은 생리학적 조건 하의 풀림(unfolding)의 깁스 자유 에너지(ΔG)를 -10 kcal/mol 내지 -100 kcal/mol 범위로 갖는다. 하나의 실시양태에서, 선행 문장에 지칭된 풀림의 깁스 자유 에너지(ΔG)는, -10 이하(≤-10을 의미하고, 예를 들어, -20, -30 등을 포함함), -11 이하, -12 이하, -13 이하, -14 이하, -15 이하, -16 이하, -17 이하, -18 이하, -19 이하, -20 이하, -21 이하, -22 이하, -23 이하, -24 이하, -25 이하, -26 이하, -27 이하, -28 이하, -29 이하, -30 이하, -31 이하, -32 이하, -33 이하, -34 이하, -35 이하, -36 이하, -37 이하, -38 이하, -39 이하, -40 이하, -41 이하, -42 이하, -43 이하, -44 이하, -45 이하, -46 이하, -47 이하, -48 이하, -49 이하, -50 이하, -51 이하, -52 이하, -53 이하, -54 이하, -55 이하, -56 이하, -57 이하, -58 이하, -59 이하, -60 이하, -61 이하, -62 이하, -63 이하, -64 이하, -65 이하, -66 이하, -67 이하, -68 이하, -69 이하, -70 이하, -71 이하, -72 이하, -73 이하, -74 이하, -75 이하, -76 이하, -77 이하, -78 이하, -79 이하, -80 이하, -81 이하, -82 이하, -83 이하, -84 이하, -85 이하, -86 이하, -87 이하, -88 이하, -89 이하, -90 이하, -91 이하, -92 이하, -93 이하, -94 이하, -95 이하, -96 이하, -97 이하, -98 이하, -99 이하 또는 -100 kcal/mol 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 선행 문장에 지칭된 풀림의 깁스 자유 에너지(ΔG)는, 약 -10(≤-10을 의미하고, 예를 들어, -20, -30 등을 포함함), 약 -11, 약 -12, 약 -13, 약 -14, 약 -15, 약 -16, 약 -17, 약 -18, 약 -19, 약 -20, 약 -21, 약 -22, 약 -23, 약 -24, 약 -25, 약 -26, 약 -27, 약 -28, 약 -29, 약 -30, 약 -31, 약 -32, 약 -33, 약 -34, 약 -35, 약 -36, 약 -37, 약 -38, 약 -39, 약 -40, 약 -41, 약 -42, 약 -43, 약 -44, 약 -45, 약 -46, 약 -47, 약 -48, 약 -49, 약 -50, 약 -51, 약 -52, 약 -53, 약 -54, 약 -55, 약 -56, 약 -57, 약 -58, 약 -59, 약 -60, 약 -61, 약 -62, 약 -63, 약 -64, 약 -65, 약 -66, 약 -67, 약 -68, 약 -69, 약 -70, 약 -71, 약 -72, 약 -73, 약 -74, 약 -75, 약 -76, 약 -77, 약 -78, 약 -79, 약 -80, 약 -81, 약 -82, 약 -83, 약 -84, 약 -85, 약 -86, 약 -87, 약 -88, 약 -89, 약 -90, 약 -91, 약 -92, 약 -93, 약 -94, 약 -95, 약 -96, 약 -97, 약 -98, 약 -99 또는 약 -100 kcal/mol이다. 일부 실시양태에서, ITR 폐쇄 염기 쌍의 하나의 뉴클레오티드에서 ITR 폐쇄 염기 쌍의 다른 뉴클레오티드까지 늘어진 ITR 서열은 생리학적 조건 하에서 풀림의 깁스 자유 에너지(ΔG)를 -26 kcal/mol 내지 -95 kcal/mol의 범위로 갖는다. 일부 실시양태에서, ITR 폐쇄 염기 쌍의 하나의 뉴클레오티드에서 ITR 폐쇄 염기 쌍의 다른 뉴클레오티드까지 늘어진 ITR 서열은 생리학적 조건 하에서 ITR 서열에 대한 풀림의 모든 깁스 자유 에너지(ΔG)에 기여한다.
일부 실시양태에서, 접힌 상태에서, 단일 가닥화된 IR 또는 ITR은 대략 50% 내지 98%의 전체 왓슨-크릭 자가-상보성을 갖는다. 하나의 실시양태에서, 접힌 상태에서, 단일 가닥화된 IR 또는 ITR은 약 50%, 약 51%, 약 52%, 약 53%, 약 54%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 전체 왓슨-크릭 자가-상보성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 접힌 상태에서, 단일 가닥화된 IR 또는 ITR은 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 전체 왓슨-크릭 자가-상보성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 접힌 상태에서, IR 또는 ITR은 대략 60% 내지 98%의 전체 왓슨-크릭 상보성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단일 가닥화된 IR 또는 ITR은 대략 60-95%의 전체 GC 함량을 갖는다. 특정 실시양태에서, 단일 가닥화된 IR 또는 ITR은 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94% 또는 적어도 95%의 전체 GC 함량을 갖는다. 다른 실시양태에서, 단일 가닥화된 IR 또는 ITR은 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94% 또는 약 95%의 의 전체 GC 함량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단일 가닥화된 IR은 대략 60-91%의 전체 GC 함량을 갖는다.
표 4는 접힘 자유 에너지, GC 함량, 상보성 백분율, 예시적인 ITR의 길이를 나열하고, 표 5는 표 4의 ITR의 서열을 나열한다.
표 4: 폴딩 자유 에너지, GC 함량, 상보성 백분율, 예시적인 ITR의 길이
Figure pct00004
표 5: 표 4의 ITR의 서열
Figure pct00005
Figure pct00006
본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 DNA 분자는 다양한 기원의 IR 또는 ITR을 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자 내의 IR 또는 ITR은 바이러스 ITR이다. "바이러스 ITR"은 적어도 하나의 최소 요구 복제 기점 및 회문구조 헤어핀 구조를 포함하는 영역을 포함하는 임의의 바이러스 말단 반복 또는 합성 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 바이러스 ITR은 파보바이러스과로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에서, 파보바이러스과로부터 유래된 바이러스 ITR은 적어도 하나의 바이러스 복제 관련 단백질 결합 서열("RABS")을 포함하는 "최소 요구 복제 기점"을 포함한다. RABS는 파보파이러스과 유전자 Rep 및/또는 NS1에 의해 인코딩되는 바이러스 DNA 복제 관련 단백질("RAP") 또는 이의 동형(isoform)이 결합할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, RABS는 Rep 결합 서열("RBS")이다. 일부 실시양태에서 RABS는 Rep 결합 서열("RBS")을 포함하고, Rep는 ITR 내의 2개의 요소에 결합할 수 있다. 이것은 ITR의 스템 구조 내의 뉴클레오티드 서열(즉, 바이러스 핵산 분자의 복제를 위해 Rep 단백질에 의해 인식되는 뉴클레오티드 서열)에 결합할 수 있다. 이러한 RBS는 또한, RBE(Rep-결합 요소)로도 지칭된다. Rep는 또한 ITR 내에서 내부 헤어핀의 단일 팁을 포함하는 작은 회문구조를 형성하는 뉴클레오티드 서열에 결합함으로써, Rep와 ITR 사이의 연합을 안정화시킬 수 있다. 이러한 RBS는 RBE'로도 지칭된다. 또 다른 실시양태에서, 파보바이러스과로부터 유래된 바이러스 ITR은 복제-관련 바이러스 단백질 NS1이 결합할 수 있는 NS1-결합 요소("NSBE")를 포함하는 RABS를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, RABS는 복제-관련 바이러스 단백질 NS1이 결합할 수 있는 NS1-결합 요소("NSBE")이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 ITR은 파보바이러스과로부터 유래되고 바이러스 DNA 복제 관련 단백질 NS1 및/또는 Rep가 TRS에서 서열 내 엔도뉴클레올리틱(endonucleolytic) 닉을 수행할 수 있는 말단 분해 부위('TRS")를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 바이러스 ITR은 적어도 하나의 RBS 또는 NSBE 및 적어도 하나의 TRS를 포함한다. 바이러스 또는 재조합 RAP(즉, Rep 또는 NS1) 기반 바이러스 게놈 제조의 맥락에서, ITR은 복제 및 바이러스 패키징을 매개한다. 본원에 제공되고 본 발명자들에 의해 예상치 못하게 발견된 바와 같이, 바이러스 ITR과 유사한 ITR을 갖는 듀플렉스 선형 DNA 벡터는, Rep 또는 NS1 단백질을 필요로 하지 않고, 결과적으로 DNA 복제를 위한 RABS 또는 TRS 서열과 무관하게 제조될 수 있다. 따라서, RABS 및 TRS는 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열에서 선택적으로 인코딩될 수 있지만 요구되지는 않으며, ITR 디자인과 관련하여 유연성을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 ITR은 적어도 하나의 RABS(예를 들어, 1개 RABS, 2개 RABS 또는 2개 초과의 RABS)를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 ITR은 임의의 RABS를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 ITR은 적어도 하나의 RBS를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 ITR은 임의의 RBS를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 ITR은 RBE를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 ITR은 RBE'를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 ITR은 RBE 및 RBE'를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 ITR은 NSBE를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 ITR은 TRS를 포함하지 않는다. 추가 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 ITR은 적어도 하나의 RABS(예를 들어, 1개 RABS, 2개 RABS 또는 2개 초과의 RABS)를 포함하지 않고, TRS를 포함하지 않는다. 추가 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 ITR은 임의의 RABS를 포함하지 않고, TRS를 포함하지 않는다. 추가 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 ITR은 RBS(즉, RBE 및/또는 RBE'), TRS, 또는 RBS(즉, RBE 및/또는 RBE')와 TRS 둘 모두 포함한다. 추가 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 ITR은 NBSE, TRS, 또는 NBSE와 TRS 둘 모두 포함한다.
"ITR 쌍"은 단일 DNA 분자 내의 2개의 ITR을 지칭한다. 일부 실시양태에서, ITR 쌍의 2개의 ITR은 모두, 이들의 전체 길이에 걸쳐 역상보 서열을 갖는 야생형 바이러스 ITR(예를 들어, AAV2 ITR)로부터 유래된다. ITR은, 표준 자연 발생 서열로부터 벗어난 하나 이상의 뉴클레오티드를 갖더라도, 변경이 서열의 특성 및 전체 3차원 구조에 영향을 미치지 않는 한 야생형 서열로 간주될 수 있다. 본원은 일부 실시양태에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환이 바이러스 ITR의 전체 3차원 구조를 변경하지 않고 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위의 생성을 제공할 수 있음을 제공한다. 일부 양태에서, 이탈하는 뉴클레오티드는 보존적 서열 변화를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 ITR의 서열은, 표준 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가질 수 있고(예를 들어, BLAST를 기본 설정으로 사용하여 측정된 바와 같음), 또한 3D 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형태이도록 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위를 갖는다. 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 ITR의 서열은, 표준 서열에 대해 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 서열 동일성을 가질 수 있고(예를 들어, BLAST를 기본 설정으로 사용하여 측정된 바와 같음), 또한 3D 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형태이도록 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 DNA 분자는 wt-ITR의 쌍을 포함한다. 특정 구체적인 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 DNA 분자는 표 6에 나타낸 군으로부터 선택되는 wt-ITR의 쌍을 포함한다. 표 6은 동일한 혈청형 또는 상이한 혈청형 또는 상이한 파보바이러스 유래의 예시적인 ITR을 보여주며, 이들은 AAV 혈청형 1(AAV1), AAV 혈청형 2(AAV2), AAV 혈청형 3(AAV3), AAV 혈청형 4(AAV4), AAV 혈청형 5(AAV5), AAV 혈청형 6(AAV6), AAV 혈청형 7(AAV7), AAV 혈청형 8(AAV8), AAV 혈청형 9(AAV9), AAV 혈청형 10(AAV10), AAV 혈청형 11(AAV11) 또는 AAV 혈청형 12(AAV12); AAVrh8, AAVrhlO, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈(예를 들어, NCBI: NC 002077; NC 001401 ; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), 정온 동물 유래의 ITR(조류 AAV(AAAV), 소 AAV(BAAV), 개, 말 및 양 AAV), B19 파보바이러스 유래의 ITR(젠뱅크(GenBank) 수탁번호: NC 000883), 마우스의 미세 바이러스(Minute Virus from Mouse)(MVM)(젠뱅크 수탁번호. NC 001510); 거위: 거위 파보바이러스(젠뱅크 수탁번호. NC 001701); 뱀: 뱀 파보바이러스 1(젠뱅크 수탁번호. NC 006148)을 포함한다.
표 6: 예시적인 ITR 서열
Figure pct00007
Figure pct00008
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 DNA 분자는 파보바이러스 게놈의 전체 또는 일부를 포함한다. 파보바이러스 게놈은 크기가 3.9-6.3 kb인 선형이며, 코딩 영역은 헤어핀-유사 구조로 접힐 수 있는 말단 반복에 의해 일괄화되고, 이는 서로 다르거나(헤테로텔로메릭(heterotelomeric), 예를 들어, HBoV) 동일하다(호모텔로메릭(homotelomeric), 예를 들어, AAV2). 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 DNA 분자는 DNA 분자의 2개의 말단에 2개의 상이한 ITR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 DNA 분자는 DNA 분자의 2개의 말단에 2개의 동일한 ITR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 DNA 분자는 2개의 HBoV ITR에 대응하는 DNA 분자의 2개의 말단에 2개의 상이한 ITR을 포함한다. 추가 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 DNA 분자는 AAV2 ITR에 대응하는 DNA 분자의 2개의 말단에 2개의 동일한 ITR을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자에서 ITR은 AAV ITR일 수 있다. 다른 실시양태에서, ITR은 비-AAV ITR일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자에서 ITR은 AAV ITR 또는 비-AAV TR로부터 유래될 수 있다. 일부 구체적인 실시양태에서, ITR은 파보바이러스 및 디펜도바이러스(예를 들어, 개 파보바이러스, 소 파보바이러스, 마우스 파보바이러스, 돼지 파보바이러스, 인간 파보바이러스 B-19)를 포함하는 파보바이러스과 계열 중 어느 하나로부터 유래될 수 있다. 다른 특정 실시양태에서, ITR은 SV40 복제의 기점으로 작용하는 SV40 헤어핀으로부터 유래될 수 있다. 파보파이러스과 계열 바이러스는 2개의 아과로 구성된다: 척추동물을 감염시키는 파보바이러스아과, 및 무척추동물을 감염시키는 덴소바이러스아과. 이와 같이, 하나의 실시양태에서, ITR은 아과인 파보바이러스아과 중 어느 하나로부터 유래될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, ITR은 아과인 덴소바이러스아과 중 어느 하나로부터 유도될 수 있다.
T-형 AAV ITR과 비교하여, 인간 에리스로바이러스 B19는, 소수의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 갖는 긴 선형 듀플렉스로 접혀서, 일련의 작지만, 고도로 보존된, 불일치 벌지를 생성할 수 있는 불완전한 회문구조로 끝나는 ITR을 갖는다. 일부 실시양태에서, 임의의 파보바이러스 ITR은 본원에 제공된 DNA 분자(예를 들어, 야생형 또는 변형된 ITR)에 대한 ITR로 사용될 수 있거나, 본원에 제공된 DNA 분자에 변형 후 혼입을 위한 주형 ITR로 작용할 수 있다. 일부 구체적인 실시양태에서, DNA 분자의 ITR이 유래된 파보바이러스는 디펜도바이러스, 에리스로파보바이러스, 또는 보카파보바이러스이다. 다른 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자의 ITR은 AAV, B19 또는 HBoV로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자에 대해 선택된 AAV ITR의 혈청형은 혈청형의 조직 친화성(tropism)을 기반으로 할 수 있다. AAV2는 광범위한 조직 친화성을 갖고, AAV1은 우선적으로 신경 및 골격근을 표적으로 하고, AAV5는 우선적으로 신경, 망막 색소 상피 및 광수용체를 표적으로 한다. AAV6는 우선적으로 골격근 및 폐를 표적으로 한다. AAV8은 우선적으로 간, 골격근, 심장 및 췌장 조직을 표적으로 한다. AAV9는 우선적으로 간, 골격 및 폐 조직을 표적으로 한다. 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자의 ITR 또는 변형된 ITR은 AAV2 ITR을 기반으로 한다. 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자의 ITR 또는 변형된 ITR은 AAV1 ITR을 기반으로 한다. 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자의 ITR 또는 변형된 ITR은 AAV5 ITR을 기반으로 한다. 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자의 ITR 또는 변형된 ITR은 AAV6 ITR을 기반으로 한다. 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자의 ITR 또는 변형된 ITR은 AAV8 ITR을 기반으로 한다. 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자의 ITR 또는 변형된 ITR은 AAV9 ITR을 기반으로 한다.
하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 DNA 분자는 하나 이상의 비-AAV ITR을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 비-AAV ITR은 포유류 게놈에서 발견되는 헤어핀 서열로부터 유래될 수 있다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 상기 비-AAV ITR은 OriL 헤어핀 서열(서열번호:30:
Figure pct00009
)을 포함하는 미토콘드리아 게놈에서 발견되는 헤어핀 서열로부터 유래될 수 있고, 이는 스템 루프 구조를 취하고, 미토콘드리아 DNA의 DNA 합성을 개시하는 데 관여된다(Fuste et al., Molecular Cell, 37, 67-78, January 15, 2010을 참조하고, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 DNA 분자는 미러링되어 2개의 자가-상보성 회문 영역 및 헤어핀의 어느 한쪽의 정점에서 12-뉴클레오티드 루프를 갖는 T 접합부를 형성하는 OriL 서열로부터 유래된 ITR을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 DNA 분자는 쌍을 이루지 않은 벌지 및 GC-풍부 스템이 뒤따르는 OriL 헤어핀 루프를 유지하는 OriL 서열로부터 유래된 ITR을 포함한다. 미토콘드리아 OriL로부터 유래된 ITR의 일부 예시적인 실시양태는 도 2에 도시된다.
하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 DNA 분자는 압타머로부터 유래된 하나 이상의 비-AAV ITR을 포함한다. 바이러스 ITR과 유사하게 압타머는 3차원 구조로 접히는 ssDNA로 구성되며, 높은 친화도 및 특이성으로 생물학적 표적을 인식하는 능력을 갖는다. DNA 압타머는, 지수 풍부화에 의한 리간드의 체계적인 진화(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 일부 압타머가 인간 세포의 핵을 표적화할 수 있음이 이전에 밝혀졌다(Shen et al ACS Sens. 2019, 4, 6, 1612-1618을 참조하고, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 DNA 분자는 압타머 ITR 또는 이의 유도체를 표적화하는 핵을 포함하며, 여기서 압타머는 핵 단백질에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 압타머 ITR은, 예컨대 헤어핀뿐만 아니라 내부 루프 및 벌지 및 스템 영역을 포함할 수 있는 2차 구조로 접힌다. 압타머 또는 이로부터 유래된 ITR의 일부 예시적인 실시양태가 도 3에 도시된다.
일부 구체적인 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 DNA 분자는 하나 이상의 AAV2 ITR, 인간 에리스로바이러스 B19 ITR 구스 파보바이러스 ITR, 및/또는 이들의 임의의 유도체를 임의의 조합으로 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 DNA 분자는 AAV2 ITR, 인간 에리스로바이러스 B19 ITR 구스 파보바이러스 ITR 및 이들의 유도체로부터 선택된 2개의 ITR을 임의의 조합으로 포함한다. 일부 구체적인 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 DNA 분자는 하나 이상의 AAV2 ITR, 인간 에리스로바이러스 B19 ITR 구스 파보바이러스 ITR 및/또는 이들의 유도체를 임의의 조합으로 포함하고, 여기서 ITR은 이의 ITR의 회문 영역이 발현 카세트에 대한 5' 및 3' ITR 방향성에 있어서 정방향, 역방향 또는 임의의 가능한 조합의 여부에 관계 없이 기능을 유지한다(WO2019143885에 기재된 바와 같고, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자에서 변형된 IR 또는 ITR은, 이 섹션(섹션 5.3.1)에 기재된 바와 같이, 헤어핀 2차 구조 형성을 가능하게 하는 다양한 회문 서열 이외에 5'-GAGTC-3'과 같은 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위를 포함하는 합성 IR 서열이다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자에서 IR 또는 ITR은 이 섹션(섹션 5.3.1)에 기재된 IR 또는 ITR 서열과 다양한 서열 상동성을 갖는 IR 또는 ITR일 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자에서 IR 또는 ITR은 이 섹션(섹션 5.3.1)에 기재된 다양한 ITR 기원의 알려진 IR 또는 ITR 서열과 다양한 서열 상동성을 갖는 IR 또는 ITR일 수 있다(예를 들어, 바이러스 ITR, 미토콘드리아 ITR, 인공 또는 합성 ITR, 예컨대 압타머 등). 하나의 실시양태에서, 이 단락에 제공된 상기 상동성은 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 상동성일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이 단락에 제공된 상기 상동성은 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 상동성일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자에서 IR 또는 ITR은 다양한 순열 및 조합으로 이 섹션(섹션 5.3.1)에 기재된 임의의 하나 이상의 특징을 포함할 수 있다.
5.3.2 제한 효소, 닉킹 엔도뉴클레아제 및 이들의 각각의 제한 부위; 프로그래밍 가능한 닉킹 효소 및 이들의 표적 부위
섹션 5.2.4에 기재된 바와 같은 닉킹 엔도뉴클레아제, 제한 효소 및/또는 이들 각각의 제한 부위에 대한 다양한 실시양태가 본원에 제공된 DNA 분자에 대해 제공된다. 일부 실시양태에서, 섹션 3 및 이 섹션(섹션 5.3)에 기재된 바와 같이 DNA 분자에 대해 제공된 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위는 모두 동일한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 섹션 3 및 이 섹션(섹션 5.3)에 기재된 바와 같이 DNA 분자에 대해 제공된 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위는 4개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열일 수 있다. 다른 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위는 2개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열이고, 이는 2개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제 표적 서열에 대한 4개의 부위를 배열한 모든 가능한 조합을 포함한다(예를 들어, 제1 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위 및 제2 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 나머지, 제1 닉킹 엔도 뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위 및 제2 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 나머지 등). 특정 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위는 3개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열이고, 이는 3개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제 표적 서열에 대한 4개의 부위를 배열한 모든 가능한 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제 및 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위는 표 2를 포함하여 섹션 5.2.4에 기재된 것들로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 추가 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위의 각각은 표 2를 포함하여 섹션 5.2.4에 기재된 것들로부터 선택된 임의의 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 부위일 수 있다.
표 7 내지 표 16은 닉킹 엔도뉴클레아제 종별로 그룹화된, 동일한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 2개의 역평행 인식 부위를 보유한 예시적인 변형된 AAV ITR 서열을 보여준다. AAV1, AAV2, AAV3, AAV4 좌측, AAV4 우측, AAV5 및 AAV7의 야생형 및 ITR의 변형된 서열에 대한 상응하는 정렬이 도 13 내지 도 19에 도시된다.
표 7: 닉킹 엔도뉴클레아제 Nb.BvCI에 대한 역평행 인식 부위를 보유한 예시적인 AAV 유래 ITR:
Figure pct00010
Figure pct00011
표 8: 닉킹 엔도뉴클레아제 Nb.BsmI에 대한 역평행 인식 부위를 보유한 예시적인 AAV 유래 ITR:
Figure pct00012
Figure pct00013
표 9: 닉킹 엔도뉴클레아제 Nb.BsrDI에 대한 역평행 인식 부위를 보유한 예시적인 AAV 유래 ITR
Figure pct00014
Figure pct00015
표 10: 닉킹 엔도뉴클레아제 Nb.BssSi에 대한 역평행 인식 부위를 보유한 예시적인 AAV 유래 ITR
Figure pct00016
Figure pct00017
표 11: 닉킹 엔도뉴클레아제 Nb.BtsI에 대한 역평행 인식 부위를 보유한 예시적인 AAV 유래 ITR:
Figure pct00018
Figure pct00019
표 12: 닉킹 엔도뉴클레아제 Nt.AlwI에 대한 역평행 인식 부위를 보유한 예시적인 AAV 유래 ITR
Figure pct00020
Figure pct00021
표 13: 닉킹 엔도뉴클레아제 Nt.BbvCI에 대한 역평행 인식 부위를 보유한 예시적인 AAV 유래 ITR:
Figure pct00022
Figure pct00023
표 14: 닉킹 엔도뉴클레아제 Nt.BsmAI에 대한 역평행 인식 부위를 보유한 예시적인 AAV 유래 ITR:
Figure pct00024
Figure pct00025
표 15: 닉킹 엔도뉴클레아제 Nt.BspQI에 대한 역평행 인식 부위를 보유한 예시적인 AAV 유래 ITR:
Figure pct00026
Figure pct00027
표 16: 닉킹 엔도뉴클레아제 BstNBI에 대한 역평행 인식 부위를 보유한 예시적인 AAV 유래 ITR Nt:
Figure pct00028
Figure pct00029
표 17: 닉킹 효소 표적의 역상보
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위는 다양한 배열 형태로 배열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위는, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39, 적어도 40, 적어도 41, 적어도 42, 적어도 43, 적어도 44, 적어도 45, 적어도 46, 적어도 47, 적어도 48, 적어도 49, 적어도 50, 적어도 51, 적어도 52, 적어도 53, 적어도 54, 적어도 55, 적어도 56, 적어도 57, 적어도 58, 적어도 59, 적어도 60, 적어도 61, 적어도 62, 적어도 63, 적어도 64, 적어도 65, 적어도 66, 적어도 67, 적어도 68, 적어도 69, 적어도 70, 적어도 71, 적어도 72, 적어도 73, 적어도 74, 적어도 75, 적어도 76, 적어도 77, 적어도 78, 적어도 79, 적어도 80, 적어도 81, 적어도 82, 적어도 83, 적어도 84, 적어도 85, 적어도 86, 적어도 87, 적어도 88, 적어도 89, 적어도 90, 적어도 91, 적어도 92, 적어도 93, 적어도 94, 적어도 95, 적어도 96, 적어도 97, 적어도 98, 적어도 99, 적어도 100, 적어도 105, 적어도 110, 적어도 115, 적어도 120, 적어도 125, 적어도 130, 적어도 135, 적어도 140, 적어도 145, 적어도 150, 적어도 155, 적어도 160, 적어도 165, 적어도 170, 적어도 175, 적어도 180, 적어도 185, 적어도 190, 적어도 195 또는 적어도 200개의 뉴클레오티드로 떨어져 있다. 다른 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위는 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75, 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 약 85, 약 86, 약 87, 약 88, 약 89, 약 90, 약 91, 약 92, 약 93, 약 94, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 약 99, 약 100, 약 105, 약 110, 약 115, 약 120, 약 125, 약 130, 약 135, 약 140, 약 145, 약 150, 약 155, 약 160, 약 165, 약 170, 약 175, 약 180, 약 185, 약 190, 약 195 또는 약 200개의 뉴클레오티드로 떨어져 있다.
유사하게는, 특정 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위는 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39, 적어도 40, 적어도 41, 적어도 42, 적어도 43, 적어도 44, 적어도 45, 적어도 46, 적어도 47, 적어도 48, 적어도 49, 적어도 50, 적어도 51, 적어도 52, 적어도 53, 적어도 54, 적어도 55, 적어도 56, 적어도 57, 적어도 58, 적어도 59, 적어도 60, 적어도 61, 적어도 62, 적어도 63, 적어도 64, 적어도 65, 적어도 66, 적어도 67, 적어도 68, 적어도 69, 적어도 70, 적어도 71, 적어도 72, 적어도 73, 적어도 74, 적어도 75, 적어도 76, 적어도 77, 적어도 78, 적어도 79, 적어도 80, 적어도 81, 적어도 82, 적어도 83, 적어도 84, 적어도 85, 적어도 86, 적어도 87, 적어도 88, 적어도 89, 적어도 90, 적어도 91, 적어도 92, 적어도 93, 적어도 94, 적어도 95, 적어도 96, 적어도 97, 적어도 98, 적어도 99, 적어도 100, 적어도 105, 적어도 110, 적어도 115, 적어도 120, 적어도 125, 적어도 130, 적어도 135, 적어도 140, 적어도 145, 적어도 150, 적어도 155, 적어도 160, 적어도 165, 적어도 170, 적어도 175, 적어도 180, 적어도 185, 적어도 190, 적어도 195 또는 적어도 200개의 뉴클레오티드로 떨어져 있다. 추가 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위는 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75, 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 약 85, 약 86, 약 87, 약 88, 약 89, 약 90, 약 91, 약 92, 약 93, 약 94, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 약 99, 약 100, 약 105, 약 110, 약 115, 약 120, 약 125, 약 130, 약 135, 약 140, 약 145, 약 150, 약 155, 약 160, 약 165, 약 170, 약 175, 약 180, 약 185, 약 190, 약 195 또는 약 200개의 뉴클레오티드로 떨어져 있다.
본원은 섹션 3, 5.2(5.2.3 포함) 및 5.3(5.3.1 포함)에 기재된 오버행이 섹션 3 및 5.2(5.2.3 포함)에 기재된 바와 같이 닉킹 엔도뉴클레아제 및 변성에 의한 제1 및 제2 제한 부위에서의 닉킹의 결과일 수 있음을 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 제한 부위에서의 닉킹으로부터 생성된 오버행은 이 섹션(섹션 5.3.2)의 선행 단락에 기재된 바와 같이 제1 및 제2 제한 부위가 (뉴클레오티드의 개수로) 떨어져 있는 것과 동일한 길이일 수 있다. 닉킹 엔도뉴클레아제가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위 내부 또는 외부에서 DNA를 절단할 수 있기 때문에, 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 제한 부위에서의 닉킹으로부터 생성된 오버행은, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29 또는 적어도 30개의 뉴클레오티드로 떨어져 있는 제1 및 제2 제한 부위보다 길거나 짧을 수 있다. 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 제한 부위에서의 닉킹으로부터 생성된 오버행은, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29 또는 약 30개의 뉴클레오티드로 떨어져 있는 제1 및 제2 제한 부위보다 길거나 짧을 수 있다.
유사하게는, 본원은 섹션 3, 5.2(5.2.3 포함) 및 5.3(5.3.1 포함)에 기재된 오버행이 섹션 3 및 5.2(5.2.3 포함)에 기재된 바와 같이 닉킹 엔도뉴클레아제 및 변성에 의한 제3 및 제4 제한 부위에서의 닉킹의 결과일 수 있음을 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 제3 및 제4 제한 부위에서의 닉킹으로부터 생성된 오버행은 이 섹션(섹션 5.3.2)의 선행 단락에 기재된 바와 같이 제3 및 제4 제한 부위가 (뉴클레오티드의 개수로) 떨어져 있는 것과 동일한 길이일 수 있다. 닉킹 엔도뉴클레아제가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위 내부 또는 외부에서 DNA를 절단할 수 있기 때문에, 특정 실시양태에서, 제3 및 제4 제한 부위에서의 닉킹으로부터 생성된 오버행은, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29 또는 적어도 30개의 뉴클레오티드로 떨어져 있는 제3 및 제4 제한 부위보다 길거나 짧을 수 있다. 다른 실시양태에서, 제3 및 제4 제한 부위에서의 닉킹으로부터 생성된 오버행은, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29 또는 약 30개의 뉴클레오티드로 떨어져 있는 제3 및 제4 제한 부위보다 길거나 짧을 수 있다.
섹션 3 및 5.4 및 이 섹션(섹션 5.3)의 설명으로부터 명확한 바와 같이, 본원에 제공된 DNA 분자는 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 하나의 말단에서 닉킹 엔도뉴클레아제(들)에 대한 제1 및 제2 제한 부위 및 다른 말단에서 닉킹 엔도뉴클레아제(들)에 대한 제3 및 제4 제한 부위 사이에 위치한다. 다른 실시양태에서, 발현 카세트는 2개의 ssDNA 오버행을 제공하기 위해 섹션 5.2.3에 기재된 변성 단계를 포함하여, 섹션 3 및 5.2에 기재된 바와 같이 방법 단계 a 내지 d를 수행함으로써 제조된 DNA 분자의 dsDNA 세그먼트 내에 위치한다. 특정 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위는 이 단락에 기재된 dsDNA 세그먼트의 길이가 적어도 0.2 kb, 적어도 0.3 kb, 적어도 0.4 kb, 적어도 0.5 kb, 적어도 0.6, 적어도 kb, 적어도 0.7 kb, 적어도 0.8 kb, 적어도 0.9 kb, 적어도 1 kb, 적어도 1.5kb, 적어도 2 kb, 적어도 2.5 kb, 적어도 3 kb, 적어도 3.5 kb, 적어도 4 kb, 적어도 4.5 kb, 적어도 5 kb, 적어도 5.5 kb, 적어도 6 kb, 적어도 6.5 kb, 적어도 7 kb, 적어도 7.5 kb, 적어도 8 kb, 적어도 8.5 kb, 적어도 9 kb, 적어도 9.5 kb 또는 적어도 10 kb이도록 배열된다. 다른 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위는 이 단락에 기재된 dsDNA 세그먼트의 길이가 약 0.2 kb, 약 0.3 kb, 약 0.4 kb, 약 0.5 kb, 약 0.6, 약 kb, 약 0.7 kb, 약 0.8 kb, 약 0.9 kb, 약 1 kb, 약 1.5kb, 약 2 kb, 약 2.5 kb, 약 3 kb, 약 3.5 kb, 약 4 kb, 약 4.5 kb, 약 5 kb, 약 5.5 kb, 약 6 kb, 약 6.5 kb, 약 7 kb, 약 7.5 kb, 약 8 kb, 약 8.5 kb, 약 9 kb, 약 9.5 kb 또는 약 10 kb이도록 배열된다.
섹션 5.2.4에 기재된 바와 같이, 닉킹 엔도뉴클레아제를 이용한 항온처리는 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위에 해당하는 제1 닉, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제2 제한 부위에 해당하는 제2 닉, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 제한 부위에 해당하는 제3 닉, 및/또는 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제4 제한 부위에 해당하는 제4 닉을 생성할 것이다. 본원은 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 닉이 역위 반복에 대해 다양한 위치에 있을 수 있음을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 제1 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드 내에 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드 내에 있다. 또 다른 실시양태에서, 제2 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드 내에 있다. 추가 실시양태에서, 제2 닉은 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드 내에 있다. 하나의 실시양태에서, 제3 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드 내에 있다. 또 다른 실시양태에서, 제3 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드 내에 있다. 또 다른 실시양태에서, 제4 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드 내에 있다. 추가 실시양태에서, 제4 닉은 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드 내에 있다. 일부 실시양태에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 닉 중 임의의 것 또는 이들의 임의의 조합은 역위 반복 안에 있다. 특정 실시양태에서, 제1, 제2, 제3 및 제4 닉 중 임의의 것 또는 이들의 임의의 조합은 역위 반복 밖에 있다. 일부 추가 실시양태에서, 제1, 제2, 제3, 및 제4 닉은, 이 섹션(섹션 5.3.2)에 기재된 바와 같이, 임의의 조합 또는 순열로, 이들끼리, 이들 중 임의의 것과 역위 반복 사이, 및/또는 이들 중 임의의 것과 발현 카세트 사이에 임의의 상대 위치를 가질 수 있다. 일부 추가 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위는 이 섹션(섹션 5.3.2)에 기재된 바와 같이, 임의의 조합 또는 순열로, 이들끼리, 이들 중 임의의 것과 역위 반복 사이, 및/또는 이들 중 임의의 것과 발현 카세트 사이에 임의의 상대 위치를 가질 수 있다.
5.3.3 발현 카세트
섹션 3 및 5.4 및 이 섹션(섹션 5.3)의 설명으로부터 명확한 바와 같이, 본원에 제공된 DNA 분자는 발현 카세트를 포함한다. "발현 카세트"는 세포상 기구(cellular machinery)가 RNA와 단백질을 만들도록 지시하는 다른 정보 또는 서열을 함유하는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 일부이다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 프로모터 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 전사 단위를 포함한다. 또 다른 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 전사 단위에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 전사 단위는 개방형 해독틀(ORF)을 포함한다. 본원에 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용하기 위한 ORF에 대한 실시양태는 이 섹션(섹션 5.3.3)의 마지막 단락에 추가로 기재된다. 발현 카세트는 세포상 기구가 RNA 및 단백질을 만들도록 지시하는 특징을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 발현 카세트는 전사후 조절 요소를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 발현 카세트는 폴리아데닐화 및/또는 종결 신호를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 발현 카세트는 조절(ORF의 발현을 촉진, 억제 및/또는 켜기/끄기)하기 위해 당업계에 알려져 있고 사용되는 조절 요소를 포함한다. 이러한 조절 요소는, 예를 들어 5'-비번역 영역(UTR), 3'-UTR, 또는 5'UTR 및 3'UTR 둘 모두를 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 발현 카세트는 임의의 조합 또는 순열로 이 섹션(섹션 5.3.3)에 제공된 임의의 하나 이상의 특징을 포함한다.
발현 카세트는 ORF(센스 가닥)에 단백질 코딩 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 발현 카세트는 단백질 코딩 ORF(안티센스 가닥)의 상보적 서열 및 조절 구성요소 및/또는 센스 가닥 DNA/RNA 및 상응하는 단백질을 생성하기 위한 세포상 기구에 대한 다른 신호를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 인트론이 없는 단백질 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 발현 카세트는 인트론을 갖는 단백질 서열을 포함하고, 이는 전사 및 스플라이싱 시 제거된다. 발현 카세트는 또한 다양한 수의 ORF 또는 전사 단위를 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 발현 카세트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 ORF를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 발현 카세트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 전사 단위를 포함한다.
발현 카세트는 또한 하나 이상의 전사 조절 요소, 하나 이상의 전사후 조절 요소, 또는 하나 이상의 전사 조절 요소 및 하나 이상의 전사후 조절 요소 둘 모두를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는, 숙주 세포 또는 유기체로의 핵산 또는 이의 유도체 중 하나(예를 들어, mRNA)의 복제, 복사, 전사, 스플라이싱, 번역, 안정성 및/또는 수송을 포함하여, 핵산 분자의 기능적 조절을 허용, 기여 또는 조절하는 임의의 서열이다. 상기 조절 요소는, 비제한적으로 프로모터, 증폭자(enhancer), 폴리아데닐화 신호, 번역 중단 코돈, 리보솜 결합 요소, 전사 종결자, 선별 마커, 복제 기점 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 발현 카세트는 증폭자를 포함한다. 본원의 측면에서 당업자에게 알려진 임의의 증폭자 서열이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 증폭자 서열은 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 또는 바이러스 증폭자, 예컨대 CMV, HA, RSV 또는 EBV 유래의 것일 수 있다. 특정 구체적인 실시양태에서, 증폭은 우드척(Woodchuck) HBV 전사-후 조절 요소(WPRE), 인간 아포지질단백질(apolipoprotein) A1 전구체(ApoAI)로부터 유래된 인트론/엑손 서열, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 1형의 번역되지 않은 R-U5 도메인(HTLV-1) 긴 말단 반복(LTR), 스플라이싱 증폭자, 합성 래빗 β-글로빈 인트론, AAV의 P5 프로모터 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
상기한 바와 같이, 발현 카세트는 관심 단백질의 발현을 제어하기 위한 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 프로모터는 구성적, 유도성 또는 억제성일 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 원천으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 동종 프로모터(예를 들어, 동일한 유전적 원천으로부터 유래) 또는 이종 프로모터(예를 들어, 다른 유전적 원천으로부터 유래)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 유인원 바이러스 40(SV40) 유래의 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 프로모터, 예컨대 소 면역결핍 바이러스(BIV) 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, 몰로니(Moloney) 바이러스 프로모터, 조류 백혈병 바이러스(ALV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 즉시 초기 프로모터(CMV-IE), 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스(EBV) 프로모터, 또는 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터일 수 있다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 인간 메탈로티오네인과 같은 인간 유전자 유래의 프로모터일 수 있다. 추가 실시양태에서, 프로모터는 또한 조직 특이적 프로모터, 예컨대 천연 또는 합성의 근육 또는 피부 특이적 프로모터일 수 있다.
상기한 바와 같이, 발현 카세트는 폴리아데닐화, 종결 신호, 또는 폴리아데닐화 및 종결 신호 둘 모두를 포함할 수 있다. 본원의 측면에서 당업자에게 알려진 임의의 폴리아데닐화 신호가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호, AAV2 폴리아데닐화 신호(bp 4411-4466, NC_001401), 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 유전자로부터의 폴리아데닐화 신호, LTR 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리아데닐화 신호 또는 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 신호일 수 있다.
발현 카세트는 다양한 길이의 하나 이상의 ORF를 수용하기 위해 다양한 크기를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트의 크기는 적어도 0.2 kb, 적어도 0.3 kb, 적어도 0.4 kb, 적어도 0.5 kb, 적어도 0.6, 적어도 kb, 적어도 0.7 kb, 적어도 0.8 kb, 적어도 0.9 kb, 적어도 1 kb, 적어도 1.5kb, 적어도 2 kb, 적어도 2.5 kb, 적어도 3 kb, 적어도 3.5 kb, 적어도 4 kb, 적어도 4.5 kb, 적어도 5 kb, 적어도 5.5 kb, 적어도 6 kb, 적어도 6.5 kb, 적어도 7 kb, 적어도 7.5 kb, 적어도 8 kb, 적어도 8.5 kb, 적어도 9 kb, 적어도 9.5 kb, 적어도 10 kb, 적어도 15 kb, 적어도 20 kb, 적어도 25 kb, 적어도 30 kb, 적어도 35 kb, 적어도 40 kb, 적어도 45 kb, 적어도 50 kb, 적어도 55 kb, 적어도 60 kb, 적어도 65 kb, 적어도 70 kb, 적어도 75 kb 또는 적어도 80 kb이다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 적어도 4.5 kb이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 적어도 4.6 kb이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 적어도 4.7 kb이다. 추가적인 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 적어도 4.8 kb이다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 적어도 4.9 kb이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 적어도 5 kb이다. 다른 실시양태에서, 발현 카세트의 크기는 약 0.2 kb, 약 0.3 kb, 약 0.4 kb, 약 0.5 kb, 약 0.6, 약 kb, 약 0.7 kb, 약 0.8 kb, 약 0.9 kb, 약 1 kb, 약 1.5kb, 약 2 kb, 약 2.5 kb, 약 3 kb, 약 3.5 kb, 약 4 kb, 약 4.5 kb, 약 5 kb, 약 5.5 kb, 약 6 kb, 약 6.5 kb, 약 7 kb, 약 7.5 kb, 약 8 kb, 약 8.5 kb, 약 9 kb, 약 9.5 kb, 약 10 kb, 약 15 kb, 약 20 kb, 약 25 kb, 약 30 kb, 약 35 kb, 약 40 kb, 약 45 kb, 약 50 kb, 약 55 kb, 약 60 kb, 약 65 kb, 약 70 kb, 약 75 kb 또는 약 80 kb이다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 약 4.5 kb이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 약 4.6 kb이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 약 4.7 kb이다. 추가적인 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 약 4.8 kb이다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 약 4.9 kb이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 약 5 kb이다. 발현 카세트는 또한 다양한 수의 관심 유전자("전이유전자")를 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 발현 카세트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 전이유전자를 포함한다. 일부 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 하나의 전이유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전이유전자는 재조합 유전자이다. 일부 추가 실시양태에서, 전이유전자는 cDNA 서열을 포함한다(예를 들어, 전이유전자에 인트론 없음).
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자는 캡슐화된 AAV 벡터의 크기 제한을 갖지 않으므로, 대형 발현 카세트의 전달을 가능하게 하여 효율적인 전이유전자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자는 임의의 천연 AAV 게놈의 크기와 같거나 더 큰 발현 카세트를 포함한다.
발현 카세트는 역위 반복에 대해 다양한 위치를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 역위 반복으로부터 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39, 적어도 40, 적어도 41, 적어도 42, 적어도 43, 적어도 44, 적어도 45, 적어도 46, 적어도 47, 적어도 48, 적어도 49, 적어도 50, 적어도 51, 적어도 52, 적어도 53, 적어도 54, 적어도 55, 적어도 56, 적어도 57, 적어도 58, 적어도 59, 적어도 60, 적어도 61, 적어도 62, 적어도 63, 적어도 64, 적어도 65, 적어도 66, 적어도 67, 적어도 68, 적어도 69, 적어도 70, 적어도 71, 적어도 72, 적어도 73, 적어도 74, 적어도 75, 적어도 76, 적어도 77, 적어도 78, 적어도 79, 적어도 80, 적어도 81, 적어도 82, 적어도 83, 적어도 84, 적어도 85, 적어도 86, 적어도 87, 적어도 88, 적어도 89, 적어도 90, 적어도 91, 적어도 92, 적어도 93, 적어도 94, 적어도 95, 적어도 96, 적어도 97, 적어도 98, 적어도 99 또는 적어도 100개의 뉴클레오티드로 떨어져 있다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 역위 반복으로부터 적어도 0.2 kb, 적어도 0.3 kb, 적어도 0.4 kb, 적어도 0.5 kb, 적어도 0.6, 적어도 0.7 kb, 적어도 0.8 kb, 적어도 0.9 kb, 적어도 1 kb, 적어도 1.5kb 또는 적어도 2 kb로 떨어져 있다. 다른 실시양태에서, 발현 카세트는 역위 반복으로부터 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75, 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 약 85, 약 86, 약 87, 약 88, 약 89, 약 90, 약 91, 약 92, 약 93, 약 94, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 약 99 또는 약 100개의 뉴클레오티드로 떨어져 있다. 추가 실시양태에서, 발현 카세트는 역위 반복으로부터 약 0.2 kb, 약 0.3 kb, 약 0.4 kb, 약 0.5 kb, 약 0.6, 약 0.7 kb, 약 0.8 kb, 약 0.9 kb, 약 1 kb, 약 1.5kb 또는 약 2 kb로 떨어져 있다. 하나의 실시양태에서, 이 단락의 역위 반복은 섹션 3 및 5.3(5.3.1 포함)에 기재된 바와 같은 제1 역위 반복이다. 또 다른 실시양태에서, 이 단락의 역위 반복은 섹션 3 및 5.3(5.3.1 포함)에 기재된 바와 같은 제2 역위 반복이다. 또 다른 실시양태에서, 이 단락의 역위 반복은 섹션 3 및 5.3(5.3.1 포함)에 기재된 바와 같은 제1 및 제2 역위 반복 둘 모두이다.
하나의 양태에서, i) 제1 역위 반복의 안티센스 가닥으로부터 센스의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제1 역위 반복을 포함하는 센스 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 센스 발현 카세트; 및 iii) 제2 역위 반복의 안티센스 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제2 역위 반복을 포함하는 센스 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 센스 가닥의 5' 내지 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 안티센스 가닥으로부터 센스의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제1 역위 반복을 포함하는 안티센스 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 센스 발현 카세트; 및 iii) 제2 역위 반복의 안티센스로부터 센스의 분리 시 닉킹이 제2 역위 반복을 포함하는 안티센스 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 센스 가닥의 5' 내지 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 안티센스 가닥으로부터 센스의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제1 역위 반복을 포함하는 센스 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 센스 발현 카세트; 및 iii) 제2 역위 반복의 안티센스 가닥으로부터 센스의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제2 역위 반복을 포함하는 안티센스 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 센스 가닥의 5' 내지 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다.
추가적인 양태에서, i) 제1 역위 반복의 안티센스 가닥으로부터 센스의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제1 역위 반복을 포함하는 안티센스 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 센스 발현 카세트; 및 iii) 제2 역위 반복의 안티센스 가닥으로부터 센스의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재되거나 도 2b 및 2c에 도시된 바와 같음), 닉킹이 제2 역위 반복을 포함하는 센스 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 센스 가닥의 5' 내지 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다.
하나의 양태에서, i) 제1 역위 반복의 안티센스 가닥으로부터 센스의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제1 역위 반복을 포함하는 센스 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 및 제2 표적 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 센스 발현 카세트; 및 iii) 제2 역위 반복의 안티센스로부터 센스의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제2 역위 반복을 포함하는 센스 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제3 및 제4 표적 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 센스 가닥의 5' 내지 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 안티센스 가닥으로부터 센스의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음) 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제1 역위 반복을 포함하는 안티센스 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 및 제2 표적 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 센스 발현 카세트; 및 iii) 제2 역위 반복의 안티센스 가닥으로부터 센스의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제2 역위 반복을 포함하는 안티센스 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제3 및 제4 표적 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 센스 가닥의 5' 내지 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 안티센스 가닥으로부터 센스의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제1 역위 반복을 포함하는 센스 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 및 제2 표적 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 센스 발현 카세트; 및 iii) 제2 역위 반복의 안티센스 가닥으로부터 센스의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제2 역위 반복을 포함하는 안티센스 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제3 및 제4 표적 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 센스 가닥의 5' 내지 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다.
추가적인 양태에서, i) 제1 역위 반복의 안티센스 가닥으로부터 센스의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제1 역위 반복을 포함하는 안티센스 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 및 제2 표적 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 센스 발현 카세트; 및 iii) 제2 역위 반복의 안티센스 가닥으로부터 센스의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재되거나 도 2b 및 2c에 도시된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제2 역위 반복을 포함하는 센스 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제3 및 제4 표적 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 센스 가닥의 5' 내지 3' 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다.
발현 카세트는 또한 하나 이상의 전사 조절 요소(들), 하나 이상의 전사후 조절 요소(들), 또는 하나 이상의 전사 조절 요소(들) 및 하나 이상의 전사후 조절 요소(들) 둘 모두를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는, 숙주 세포 또는 유기체로의 핵산 또는 이의 유도체 중 하나(예를 들어, mRNA)의 복제, 복사, 전사, 스플라이싱, 번역, 안정성 및/또는 수송을 포함하여, 핵산 분자의 기능적 조절을 허용, 기여 또는 조절하는 임의의 서열이다. 상기 조절 요소는, 비제한적으로 프로모터, 증폭자, 폴리아데닐화 신호, 번역 중단 코돈, 리보솜 결합 요소, 전사 종결자, 선별 마커 및/또는 복제 기점을 포함한다.
발현 카세트는 다양한 길이의 하나 이상의 ORF를 수용하기 위해 다양한 크기를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트의 크기는 적어도 적어도 2 kb, 적어도 2.5 kb, 적어도 3 kb, 적어도 3.5 kb, 적어도 4 kb, 적어도 4.5 kb, 적어도 5 kb, 적어도 5.5 kb, 적어도 6 kb, 적어도 6.5 kb, 적어도 7 kb, 적어도 7.5 kb, 적어도 8 kb, 적어도 8.5 kb, 적어도 9 kb, 적어도 9.5 kb, 적어도 10 kb, 적어도 15 kb, 적어도 20 kb, 적어도 25 kb, 적어도 30 kb, 적어도 35 kb, 적어도 40 kb, 적어도 45 kb, 적어도 50 kb, 적어도 55 kb, 적어도 60 kb, 적어도 65 kb, 적어도 70 kb, 적어도 75 kb 또는 적어도 80 kb이다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 적어도 7.5 kb이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 적어도 7.6 kb이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 적어도 7.7 kb이다. 추가적인 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 적어도 7.8 kb이다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 적어도 7.9 kb이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 적어도 8 kb이다. 다른 실시양태에서, 발현 카세트의 크기는 약 약 2 kb, 약 2.5 kb, 약 3 kb, 약 3.5 kb, 약 4 kb, 약 4.5 kb, 약 5 kb, 약 5.5 kb, 약 6 kb, 약 6.5 kb, 약 7 kb, 약 7.5 kb, 약 8 kb, 약 8.5 kb, 약 9 kb, 약 9.5 kb, 약 10 kb, 약 15 kb, 약 20 kb, 약 25 kb, 약 30 kb, 약 35 kb, 약 40 kb, 약 45 kb, 약 50 kb, 약 55 kb, 약 60 kb, 약 65 kb, 약 70 kb, 약 75 kb 또는 약 80 kb이다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 약 7.5 kb이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 약 7.6 kb이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 약 7.7 kb이다. 추가적인 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 약 7.8 kb이다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 약 7.9 kb이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 약 8 kb이다. 발현 카세트는 또한 다양한 수의 관심 유전자("전이유전자")를 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 발현 카세트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 전이유전자를 포함한다. 일부 구체적인 실시양태에서, 발현 카세트는 하나의 전이유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전이유전자는 재조합 유전자이다. 일부 추가 실시양태에서, 전이유전자는 cDNA 서열을 포함한다(예를 들어, 전이유전자에 인트론 없음).
추가로, 발현 카세트는 적어도 4000개의 뉴클레오티드, 적어도 5000개의 뉴클레오티드, 적어도 10,000개의 뉴클레오티드, 적어도 20,000개의 뉴클레오티드, 적어도 30,000개의 뉴클레오티드, 적어도 40,000개의 뉴클레오티드 또는 적어도 50,000개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 약 4000 내지 약 10,000개의 뉴클레오티드, 약 10,000 내지 약 50,000개의 뉴클레오티드 또는 50,000개 초과의 뉴클레오티드를 임의의 범위로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 길이가 약 500 내지 약 50,000개의 뉴클레오티드의 범위에 있는 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 길이가 약 500 내지 약 75,000개의 뉴클레오티드의 범위에 있는 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 길이가 약 500 내지 약 10,000개의 뉴클레오티드의 범위에 있는 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 길이가 약 1000 내지 약 10,000개의 뉴클레오티드의 범위에 있는 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 길이가 약 500 내지 약 5,000개의 뉴클레오티드의 범위에 있는 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자는 캡슐화된 AAV 벡터의 크기 제한을 갖지 않으므로, 대형 발현 카세트의 전달을 가능하게 하여 효율적인 전이유전자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자는 임의의 천연 AAV 게놈의 크기와 같거나 더 큰 발현 카세트를 포함한다.
발현 카세트는 역위 반복에 대해 다양한 위치를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 역위 반복으로부터 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39, 적어도 40, 적어도 41, 적어도 42, 적어도 43, 적어도 44, 적어도 45, 적어도 46, 적어도 47, 적어도 48, 적어도 49, 적어도 50, 적어도 51, 적어도 52, 적어도 53, 적어도 54, 적어도 55, 적어도 56, 적어도 57, 적어도 58, 적어도 59, 적어도 60, 적어도 61, 적어도 62, 적어도 63, 적어도 64, 적어도 65, 적어도 66, 적어도 67, 적어도 68, 적어도 69, 적어도 70, 적어도 71, 적어도 72, 적어도 73, 적어도 74, 적어도 75, 적어도 76, 적어도 77, 적어도 78, 적어도 79, 적어도 80, 적어도 81, 적어도 82, 적어도 83, 적어도 84, 적어도 85, 적어도 86, 적어도 87, 적어도 88, 적어도 89, 적어도 90, 적어도 91, 적어도 92, 적어도 93, 적어도 94, 적어도 95, 적어도 96, 적어도 97, 적어도 98, 적어도 99 또는 적어도 100개의 뉴클레오티드로 떨어져 있다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 역위 반복으로부터 적어도 0.2 kb, 적어도 0.3 kb, 적어도 0.4 kb, 적어도 0.5 kb, 적어도 0.6, 적어도 kb, 적어도 0.7 kb, 적어도 0.8 kb, 적어도 0.9 kb, 적어도 1 kb, 적어도 1.5kb 또는 적어도 2 kb로 떨어져 있다. 다른 실시양태에서, 발현 카세트는 역위 반복으로부터 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75, 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 약 85, 약 86, 약 87, 약 88, 약 89, 약 90, 약 91, 약 92, 약 93, 약 94, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 약 99 또는 약 100개의 뉴클레오티드로 떨어져 있다. 추가 실시양태에서, 발현 카세트는 역위 반복으로부터 약 0.2 kb, 약 0.3 kb, 약 0.4 kb, 약 0.5 kb, 약 0.6, 약 kb, 약 0.7 kb, 약 0.8 kb, 약 0.9 kb, 약 1 kb, 약 1.5kb 또는 약 2 kb로 떨어져 있다. 하나의 실시양태에서, 이 단락의 역위 반복은 섹션 3 및 5.3(5.3.1 포함)에 기재된 바와 같은 제1 역위 반복이다. 또 다른 실시양태에서, 이 단락의 역위 반복은 섹션 3 및 5.3(5.3.1 포함)에 기재된 바와 같은 제2 역위 반복이다. 또 다른 실시양태에서, 이 단락의 역위 반복은 섹션 3 및 5.3(5.3.1 포함)에 기재된 바와 같은 제1 및 제2 역위 반복 둘 모두이다.
이 섹션(섹션 5.3.3)에서 상기에 기재된 바와 같이, 발현 카세트는 하나 이상의 ORF를 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, ORF는 인간 유전자의 유전적 돌연변이가 질환을 유발하는 것으로 알려진 인간 유전자의 ORF이다. 또 다른 실시양태에서, ORF는 인간 유전자의 유전적 돌연변이가 유전병을 유발하는 것으로 알려진 인간 유전자의 ORF이다. 또 다른 실시양태에서, ORF는 치료 단백질을 인코딩한다. 추가 실시양태에서, ORF는 효소를 인코딩한다. 특정 실시양태에서, ORF는 대사 효소를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, ORF는 효소를 인코딩하며, 효소는 인간에서 결함 있는 효소의 기능을 대체하거나 보충한다. 하나의 실시양태에서, ORF는 항체를 인코딩한다. 또 다른 실시양태에서, ORF는 치료 항체를 인코딩한다. 추가 실시양태에서, ORF는 사이토카인을 인코딩한다. 또 다른 실시양태에서, ORF는 RNA를 인코딩한다. 하나의 실시양태에서, ORF는 조절 RNA를 인코딩한다. 또 다른 실시양태에서, ORF는 안티센스 RNA를 인코딩한다. 또 다른 실시양태에서, ORF는 siRNA를 인코딩한다. 추가 실시양태에서, ORF는 shRNA를 인코딩한다. 하나의 실시양태에서, ORF는 miRNA를 인코딩한다. 또 다른 실시양태에서, ORF는 piRNA(PIWI-상호작용 RNA)를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 다양한 순열 및 조합으로 이 섹션(섹션 5.3.3)에 기재된 임의의 하나 이상의 특징을 포함한다.
닉킹 엔도뉴클레아제 및/또는 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위를 갖는 이 섹션(섹션 5.3.3)에 기재된 다양한 실시양태는 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의해 대체된 닉킹 엔도뉴클레아제 및 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 표적 부위에 의해 대체된 제한 부위와 함께 추가로 제공된다. 이 단락과 이 섹션(섹션 5.3.3)에 대한 프로그래밍 가능한 닉킹 효소 및 이의 표적 부위는 섹션 5.2.4에 제공되었다.
5.3.4 본원에 제공된 DNA 분자에 없는 바이러스 DNA 서열 특징
섹션 3, 5.2, 5.3.1, 5.3.2, 5.3.3, 5.3.5, 5.3.6 및 5.4에 추가로 기재된 바와 같이, 제공된 DNA 분자는 특정 서열 요소 또는 특징이 있거나 없이 합성 또는 재조합적으로 제조될 수 있다. 이와 같이, 특정 적합하고 원하는 서열 특징 또는 요소는 본원에 제공된 DNA 분자에 포함되거나 본원에 제공된 DNA 분자로부터 제외될 수 있다. 5.4에 기재된 다양한 DNA 분자를 제조할 수 있는, 5.3의 DNA 분자와 함께 5.2의 방법을 적용함으로써 기재된 바와 같이 서열 특징 또는 요소를 포함하거나 제외한 상기 DNA 분자를 제조하는 해당하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
섹션 3, 5.3.1, 5.5 및 6에 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 DNA 분자로부터 제외될 수 있는 상기 DNA 서열 요소 또는 특징은 바이러스 복제 관련 단백질 결합 서열("RABS")일 수 있고, 이는 파보파이러스과 유전자 Rep 또는 NS1에 의해 인코딩된 바이러스 DNA 복제 관련 단백질("RAP") 또는 이의 동형이 결합할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, RABS는 Rep 결합 서열("RBS")이다. Rep는 ITR 내의 2개의 요소에 결합할 수 있다. 이것은 ITR의 스템 구조에서 뉴클레오티드 서열(즉, 바이러스 핵산 분자의 복제를 위해 Rep 단백질에 의해 인식되는 뉴클레오티드 서열)에 결합할 수 있다. 이러한 RBS는 RBE(Rep-결합 요소)로 지칭된다. Rep는 또한 ITR 내에서 내부 헤어핀의 단일 팁을 포함하는 작은 회문구조를 형성하는 뉴클레오티드 서열에 결합함으로써 Rep와 ITR 사이의 연합을 안정화시킬 수 있다. 이러한 RBS는 RBE'로도 지칭된다. 다른 실시양태에서, RABS는 복제-관련 바이러스 단백질 NS1이 결합할 수 있는 NS1-결합 요소("NSBE")이다. 일부 실시양태에서, Rep는 ITR의 스템 구조 내의 뉴클레오티드 서열(즉, Rep 또는 NS1 단백질(바이러스 핵산 분자의 복제용), 및/또는 Rep 및/또는 NS1 단백질 및 뉴클레오티드 서열 사이의 특이적 상호작용의 부위에 의해 인식되는 뉴클레오티드 서열)에 결합할 수 있다. RABS는 5개의 뉴클레오티드 내지 300개의 뉴클레오티드의 서열일 수 있다. 이 섹션 5.3.4에서 제공된 것들을 포함하여 본원에 제공된 DNA 분자의 일부 실시양태에서, RABS는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100, 적어도 105, 적어도 110, 적어도 115, 적어도 120, 적어도 125, 적어도 130, 적어도 135, 적어도 140, 적어도 145, 적어도 150, 적어도 155, 적어도 160, 적어도 165, 적어도 170, 적어도 175, 적어도 180, 적어도 185, 적어도 190, 적어도 195, 적어도 200, 적어도 205, 적어도 210, 적어도 215, 적어도 220, 적어도 225, 적어도 230, 적어도 235, 적어도 240, 적어도 245, 적어도 250, 적어도 255, 적어도 260, 적어도 265, 적어도 270, 적어도 275, 적어도 280, 적어도 285, 적어도 290, 적어도 295, 적어도 300, 적어도 305, 적어도 310, 적어도 315, 적어도 320, 적어도 325, 적어도 330, 적어도 335, 적어도 340, 적어도 345, 적어도 350, 적어도 355, 적어도 360, 적어도 365, 적어도 370, 적어도 375, 적어도 380, 적어도 385, 적어도 390, 적어도 395 또는 적어도 400개의 뉴클레오티드의 서열일 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, RABS는 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 105, 약 110, 약 115, 약 120, 약 125, 약 130, 약 135, 약 140, 약 145, 약 150, 약 155, 약 160, 약 165, 약 170, 약 175, 약 180, 약 185, 약 190, 약 195, 약 200, 약 205, 약 210, 약 215, 약 220, 약 225, 약 230, 약 235, 약 240, 약 245, 약 250, 약 255, 약 260, 약 265, 약 270, 약 275, 약 280, 약 285, 약 290, 약 295, 약 300, 약 305, 약 310, 약 315, 약 320, 약 325, 약 330, 약 335, 약 340, 약 345, 약 350, 약 355, 약 360, 약 365, 약 370, 약 375, 약 380, 약 385, 약 390, 약 395 또는 약 400개의 뉴클레오티드의 서열일 수 있다. 일부 추가 실시양태에서, 이 단락에 기재된 RABS가 결여된 DNA 분자의 임의의 실시양태는 섹션 3, 5.2, 5.3, 5.4 및 6에 제공된 것들을 포함하여 본원에 제공된 임의의 방법 또는 DNA 분자와 조합될 수 있다.
대안적으로, 섹션 3, 5.2, 5.3, 5.4 및 6에 있는 것들을 포함하여 본원에 제공된 DNA 분자는, RABS가 Rep 단백질 또는 NS1 단백질에 대한 인식 및/또는 결합 부위로서 더 이상 작용할 수 없도록, 돌연변이, 삽입 및/또는 결실(부분적 결실 또는 절단 포함)로 DNA 분자에 존재하는 RABS 서열을 기능적으로 비활성화함으로써 기능적 RABS가 결여될 수 있다. 이와 같이, 섹션 3, 5.2, 5.3, 5.4 및 6에 있는 것들을 포함하여 본원에 제공된 DNA 분자의 일부 실시양태에서, DNA 분자는 기능적으로 비활성화된 RABS를 포함한다. 상기 기능적 비활성화는, Rep 또는 NS1 단백질 및 기능적으로 비활성화된 RABS를 포함하는 DNA 분자 사이의 결합을, Rep 또는 NS1 단백질 및 야생형(wt) RBS 또는 NSBE 서열을 포함하는 기준 분자(예를 들어, 동일한 DNA 분자이지만 wt RBS 또는 wt NSBE 서열을 가짐) 사이의 결합과 비교 및 측정함으로써 평가될 수 있다. 이러한 결합은, 분자 생물학 분야에 알려져 있고 사용되는 임의의 결합 측정, 예를 들어 문헌 [Matthew J. Guille & G. Geoff Kneale, Molecular Biotechnology 8:35-52(1997)]; [Bipasha Dey et al., Mol Cell Biochem. 2012 Jun;365(1-2):279-99]에 추가로 기재된 바와 같이, 염색질 면역침강(ChIP) 검정, DNA 전기영동 이동성 이동 검정(EMSA), DNA 풀다운 검정 또는 마이크로플레이트 포획 및 검출 검정에 의해 결정될 수 있고, 상기 문헌 모두 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자에서 기능적으로 비활성화된 RABS 및 RAP 사이의 결합은, 기준 DNA 분자(예를 들어, 동일한 DNA 분자이지만 야생형 RBS 또는 NSBE 서열을 가짐)에서 야생형 RBS 또는 NSBE 및 RAP 사이의 결합과 비교하여, 많아야 0.001%, 많아야 0.01%, 많아야 0.1%, 많아야 1%, 많아야 1.5%, 많아야 2%, 많아야 2.5%, 많아야 3%, 많아야 3.5, 많아야 4%, 많아야 4.5%, 많아야 5%, 많아야 5.5%, 많아야 6%, 많아야 6.5%, 많아야 7%, 많아야 7.5%, 많아야 8%, 많아야 8.5%, 많아야 9%, 많아야 9.5% 또는 많아야 10%이다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자에서 기능적으로 비활성화된 RABS 및 RAP 사이의 결합은, 기준 DNA 분자(예를 들어, 동일한 DNA 분자이지만 wt RBS 또는 NSBE 서열을 가짐)에서 야생형 RABS 및 RAP 사이의 결합과 비교하여, 약 0.001%, 약 0.01%, 약 0.1%, 약 1%, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 3.5, 약 4%, 약 4.5%, 약 5%, 약 5.5%, 약 6%, 약 6.5%, 약 7%, 약 7.5%, 약 8%, 약 8.5%, 약 9%, 약 9.5% 또는 약 10%이다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자에서 기능적으로 비활성화된 RABS 및 RAP 사이의 결합은, 기준 DNA 분자(예를 들어, 동일한 DNA 분자이지만 wt RBS 또는 NSBE 서열을 가짐)에서 야생형 RABS 및 RAP 사이의 결합과 비교하여, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 또는 10%이다.
더욱이, 섹션 3, 5.2, 5.3, 5.4 및 6에 있는 것들을 포함하여 본원에 제공된 DNA 분자는, RAP 또는 바이러스 캡시드 인코딩 서열이 Rep 단백질, NS1 단백질 또는 바이러스 캡시드 단백질을 더 이상 기능적으로 발현할 수 없도록, 돌연변이, 삽입 및/또는 결실(부분적 결실 또는 절단 포함)로 DNA 분자에 존재하는 Rep 단백질, NS1 또는 바이러스 캡시드 인코딩 서열을 기능적으로 비활성화함으로써 기능적 RAP 또는 바이러스 캡시드 인코딩 서열이 결여될 수 있다. 상기 기능적 비활성화 돌연변이, 삽입 또는 결실은, 예를 들어 돌연변이, 삽입 및/또는 결실을 이용하여 Rep 단백질, NS1 단백질 또는 바이러스 캡시드 인코딩 서열의 개방형 해독틀을 이동시키거나, 돌연변이, 삽입 및/또는 결실을 이용하여 시작 코돈을 제거하거나, 돌연변이, 삽입 및/또는 결실을 이용하여 프로모터 또는 전사 개시 부위를 제거하거나, 돌연변이, 삽입 및/또는 결실을 이용하여 RNA 중합효소 결합 부위를 제거하거나, 돌연변이, 삽입 및/또는 결실을 이용하여 리보솜 인식 또는 결합 부위를 제거하거나, 당업계에 알려져 있고 사용되는 다른 수단에 의해 달성될 수 있다.
하나의 실시양태에서, DNA 분자는 돌연변이에 의해 비활성화된 RBS를 포함한다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자는 RBS에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 10, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오티드의 돌연변이에 의해 비활성화된 RBS를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자는 RBS에서 뉴클레오티드의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 10%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% 또는 40%의 돌연변이에 의해 비활성화된 RBS를 포함한다. 추가 실시양태에서, DNA 분자는 RBS에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 10, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오티드의 결실에 의해 비활성화된 RBS를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자는 RBS에서 뉴클레오티드의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 10%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% 또는 40%의 결실에 의해 비활성화된 RBS를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선행 문장의 결실은 내부 결실, 5' 말단으로부터의 결실, 또는 3' 말단으로부터의 결실이다. 일부 실시양태에서, 이 단락의 결실은 내부 결실, 5' 말단으로부터의 결실 및/또는 3' 말단으로부터의 결실의 임의의 조합일 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 분자는 전체 RBS 서열의 결실에 의해 비활성화된 RBS를 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, DNA 분자는 RBS 서열의 부분적 결실에 의해 비활성화된 RBS를 포함한다.
하나의 실시양태에서, DNA 분자는 돌연변이에 의해 비활성화된 NBSE를 포함한다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자는 NSBE에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 10, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오티드의 돌연변이에 의해 비활성화된 NSBE를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자는 NSBE에서 뉴클레오티드의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 10%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% 또는 40%의 돌연변이에 의해 비활성화된 NSBE를 포함한다. 추가 실시양태에서, DNA 분자는 NSBE에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 10, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오티드의 결실에 의해 비활성화된 NSBE를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자는 NSBE에서 뉴클레오티드의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 10%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% 또는 40%의 결실에 의해 비활성화된 NSBE를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선행 문장의 결실은 내부 결실, 5' 말단으로부터의 결실, 또는 3' 말단으로부터의 결실이다. 일부 실시양태에서, 이 단락의 결실은 내부 결실, 5' 말단으로부터의 결실 및/또는 3' 말단으로부터의 결실의 임의의 조합일 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 분자는 전체 NSBE 서열의 결실에 의해 비활성화된 NSBE를 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, DNA 분자는 NSBE 서열의 부분적 결실에 의해 비활성화된 NSBE 를 포함한다.
유사하게는, DNA 서열 요소 또는 특징은 본원에 제공된 DNA 분자(섹션 5.3 및 5.4 포함)의 임의의 특정 영역 또는 본원에 제공된 방법(섹션 5.2 포함)에 사용된 DNA 분자의 임의의 특정 영역에 포함되거나 이로부터 제외될 수 있다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자는 Rep 단백질 인코딩 서열이 결여된다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자는 NS1 단백질 인코딩 서열이 결여된다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자는 바이러스 캡시드 단백질 인코딩 서열이 결여된다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 Rep 단백질 인코딩 서열이 결여된다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 NS1 단백질 인코딩 서열이 결여된다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 바이러스 캡시드 단백질 인코딩 서열이 결여된다. 추가 실시양태에서, DNA 분자는 RABS가 결여된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 역위 반복은 RABS가 결여된다. 하나의 실시양태에서, 제2 역위 반복은 RABS가 결여된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 및 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 사이의 DNA 서열은 RABS가 결여된다. RABS의 결여는 1개의 RABS의 결여, 2개의 RABS의 결여, 2개 초과의 RAB의 결여 또는 임의의 RABS의 결여일 수 있다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자는 기능적으로 비활성화된 Rep 단백질 인코딩 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자는 기능적으로 비활성화된 Rep 단백질 인코딩 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자는 기능적으로 비활성화된 NS1 단백질 인식 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자는 기능적으로 비활성화된 NS1 단백질 인코딩 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자는 기능적으로 비활성화된 바이러스 캡시드 단백질 인코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 기능적으로 비활성화된 Rep 단백질 인코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 기능적으로 비활성화된 NS1 단백질 인코딩 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 기능적으로 비활성화된 바이러스 캡시드 단백질 인코딩 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, DNA 분자는 기능적으로 비활성화된 RABS를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 역위 반복은 기능적으로 비활성화된 RABS를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 제2 역위 반복은 기능적으로 비활성화된 RABS를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 및 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 사이의 DNA 서열은 기능적으로 비활성화된 RABS를 포함한다. 1개, 2개 또는 그 초과의 RABS 또는 모든 RABS가 기능적으로 비활성화될 수 있음이 고려된다.
추가적으로, DNA 서열 요소 또는 특징은 본원에 제공된 DNA 분자(섹션 5.3 및 5.4 포함)의 임의의 특정 영역 또는 본원에 제공된 방법(섹션 5.2 포함)에 사용된 DNA 분자의 임의의 특정 영역의 임의의 조합으로부터 기능적으로 비활성화될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 제1 역위 반복은 기능적으로 비활성화된 RABS를 포함하고, 제2 역위 반복은 기능적으로 비활성화된 RABS를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 역위 반복은 기능적으로 비활성화된 RABS를 포함하고, 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 및 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 사이의 DNA 서열은 기능적으로 비활성화된 RABS를 포함한다. 추가 실시양태에서, 제2 역위 반복은 기능적으로 비활성화된 RABS를 포함하고, 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 및 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 사이의 DNA 서열은 기능적으로 비활성화된 RABS를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 역위 반복은 기능적으로 비활성화된 RABS를 포함하고, 제2 역위 반복은 기능적으로 비활성화된 RABS를 포함하고, 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 및 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 사이의 DNA 서열은 기능적으로 비활성화된 RABS를 포함한다. 1개, 2개 또는 그 초과의 RABS 또는 모든 RABS가 기능적으로 비활성화될 수 있음이 고려된다.
섹션 3, 5.3.1, 5.5 및 6에 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 DNA 분자로부터 제외될 수 있는 상기 DNA 서열 요소 또는 특징은 말단 분해 부위('TRS')일 수 있다. TRS는 RAP(바이러스 핵산 분자의 복제용)에 의해 인식되고, RAP 단백질의 엔도뉴클레아제 활성에 의해 가닥-특이적 절단의 부위인, DNA 분자의 역위 반복에 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. TRS는 또한 RAP와 뉴클레오티드 서열 사이의 특이적 상호작용의 부위이다. RAP 단백질의 엔도뉴클레아제 활성에 의한 특이적 절단의 보존된 부위의 뉴클레오티드 서열은, 분자 생물학 분야에 알려져 있고 사용되는 DNA 닉킹 검정, 예를 들어 문헌 [Xu P, et al 2019. Antimicrob Agents Chemother 63:e01879-18.]; US20190203229A에 추가로 기재된 바와 같이, 겔 전기영동, 형광단 기반 시험관내 닉킹 검정, 방사성 시험관내 닉킹 검정에 의해 결정될 수 있고, 이들 모두 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서 TRS는 Rep 단백질(바이러스 핵산 분자의 복제용)에 의해 인식되고, Rep 단백질의 엔도뉴클레아제 활성에 의한 가닥 특이적 닉킹의 부위인 DNA 분자의 역위 반복에 있는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. TRS는 또한 Rep 단백질의 엔도뉴클레아제 활성에 의한 특이적 절단의 부위일 수 있다. 하나의 실시양태에서, TRS는 NS1 단백질(바이러스 핵산 분자의 복제용)에 의해 인식되고, NS1 단백질의 엔도뉴클레아제 활성에 의한 가닥 특이적 닉킹의 부위인 DNA 분자의 역위 반복에 있는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, TRS는 또한 NS1 단백질과 뉴클레오티드 서열 사이의 특이적 상호작용 부위를 포함할 수 있다. TRS는 5개의 뉴클레오티드 내지 300개의 뉴클레오티드의 서열일 수 있다. 이 섹션 5.3.4에서 제공된 것들을 포함하여 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, TRS는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100, 적어도 105, 적어도 110, 적어도 115, 적어도 120, 적어도 125, 적어도 130, 적어도 135, 적어도 140, 적어도 145, 적어도 150, 적어도 155, 적어도 160, 적어도 165, 적어도 170, 적어도 175, 적어도 180, 적어도 185, 적어도 190, 적어도 195, 적어도 200, 적어도 205, 적어도 210, 적어도 215, 적어도 220, 적어도 225, 적어도 230, 적어도 235, 적어도 240, 적어도 245, 적어도 250, 적어도 255, 적어도 260, 적어도 265, 적어도 270, 적어도 275, 적어도 280, 적어도 285, 적어도 290, 적어도 295, 적어도 300, 적어도 305, 적어도 310, 적어도 315, 적어도 320, 적어도 325, 적어도 330, 적어도 335, 적어도 340, 적어도 345, 적어도 350, 적어도 355, 적어도 360, 적어도 365, 적어도 370, 적어도 375, 적어도 380, 적어도 385, 적어도 390, 적어도 395 또는 적어도 400개의 뉴클레오티드의 서열일 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, TRS는 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 105, 약 110, 약 115, 약 120, 약 125, 약 130, 약 135, 약 140, 약 145, 약 150, 약 155, 약 160, 약 165, 약 170, 약 175, 약 180, 약 185, 약 190, 약 195, 약 200, 약 205, 약 210, 약 215, 약 220, 약 225, 약 230, 약 235, 약 240, 약 245, 약 250, 약 255, 약 260, 약 265, 약 270, 약 275, 약 280, 약 285, 약 290, 약 295, 약 300, 약 305, 약 310, 약 315, 약 320, 약 325, 약 330, 약 335, 약 340, 약 345, 약 350, 약 355, 약 360, 약 365, 약 370, 약 375, 약 380, 약 385, 약 390, 약 395 또는 약 400개의 뉴클레오티드의 서열일 수 있다. 일부 추가 실시양태에서, 이 단락에 기재된 TRS의 임의의 실시양태는 섹션 3, 5.2, 5.3, 5.4 및 6에 제공된 것들을 포함하여 본원에 제공된 임의의 방법 또는 DNA 분자와 조합될 수 있다.
대안적으로, 섹션 3, 5.2, 5.3, 5.4 및 6에 있는 것들을 포함하여 본원에 제공된 DNA 분자는, TRS가 RAP(즉, Rep 및 NS1)에 대한 인식 및/또는 결합 부위로서 더 이상 작용할 수 없도록, 돌연변이, 삽입 및/또는 결실(부분적 결실 또는 절단 포함)로 DNA 분자에 존재하는 TRS 서열을 기능적으로 비활성화함으로써 기능적 TRS를 결여시킬 수 있다. 이와 같이, 섹션 3, 5.2, 5.3, 5.4 및 6에 있는 것들을 포함하여 본원에 제공된 DNA 분자의 일부 실시양태에서, DNA 분자는 기능적으로 비활성화된 TRS를 포함한다. 상기 기능적 비활성화는, RAP(즉, Rep 및 NS1) 및 기능적으로 비활성화된 TRS를 포함하는 DNA 분자 사이의 결합을, RAP 및 야생형(wt) TRS 서열을 포함하는 기준 분자(예를 들어, 동일한 DNA 분자이지만 wt TRS 서열을 가짐) 사이의 결합과 측정 및 비교함으로써 평가될 수 있다. 이러한 결합은, 분자 생물학 분야에 알려져 있고 사용되는 임의의 결합 측정, 예를 들어 문헌 [Matthew J. Guille & G. Geoff Kneale, Molecular Biotechnology 8:35-52(1997)]; [Bipasha Dey et al., Mol Cell Biochem. 2012 Jun;365(1-2):279-99]에 추가로 기재된 바와 같이, 염색질 면역침강(ChIP) 검정, DNA 전기영동 이동성 이동 검정(EMSA), DNA 풀-다운 검정 또는 마이크로플레이트 포획 및 검출 검정에 의해 결정될 수 있고, 상기 문헌 모두는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자에서 기능적으로 비활성화된 TRS 및 RAP(즉, Rep 및 NS1) 사이의 결합은, 기준 DNA 분자(예를 들어, 동일한 DNA 분자이지만 wt TRS 서열을 가짐)에서 야생형 TRS 및 RAP(즉, Rep 및 NS1) 사이의 결합과 비교하여, 많아야 0.001%, 많아야 0.01%, 많아야 0.1%, 많아야 1%, 많아야 1.5%, 많아야 2%, 많아야 2.5%, 많아야 3%, 많아야 3.5, 많아야 4%, 많아야 4.5%, 많아야 5%, 많아야 5.5%, 많아야 6%, 많아야 6.5%, 많아야 7%, 많아야 7.5%, 많아야 8%, 많아야 8.5%, 많아야 9%, 많아야 9.5% 또는 많아야 10%이다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자에서 기능적으로 비활성화된 TRS 및 RAP(즉, Rep 및 NS1) 사이의 결합은, 기준 DNA 분자(예를 들어, 동일한 DNA 분자이지만 wt TRS 서열을 가짐)에서 야생형 TRS 및 RAP(즉, Rep 및 NS1) 사이의 결합과 비교하여, 약 0.001%, 약 0.01%, 약 0.1%, 약 1%, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 3.5, 약 4%, 약 4.5%, 약 5%, 약 5.5%, 약 6%, 약 6.5%, 약 7%, 약 7.5%, 약 8%, 약 8.5%, 약 9%, 약 9.5% 또는 약 10%이다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자에서 기능적으로 비활성화된 TRS 및 RAP(즉, Rep 및 NS1) 사이의 결합은, 기준 DNA 분자(예를 들어, 동일한 DNA 분자이지만 wt TRS 서열을 가짐)에서 야생형 TRS 및 RAP(즉, Rep 및 NS1) 사이의 결합과 비교하여, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 또는 10%이다.
하나의 실시양태에서, DNA 분자는 돌연변이에 의해 비활성화된 TRS를 포함한다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자는 TRS에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 10, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오티드의 돌연변이에 의해 비활성화된 TRS를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자는 TRS에서 뉴클레오티드의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 10%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% 또는 40%의 돌연변이에 의해 비활성화된 TRS를 포함한다. 추가 실시양태에서, DNA 분자는 TRS에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 10, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오티드의 결실에 의해 비활성화된 TRS를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자는 TRS에서 뉴클레오티드의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 10%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% 또는 40%의 결실에 의해 비활성화된 TRS를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선행 문장의 결실은 내부 결실, 5' 말단으로부터의 결실, 또는 3' 말단으로부터의 결실이다. 일부 실시양태에서, 이 단락의 결실은 내부 결실, 5’ 말단으로부터의 결실 및/또는 3’ 말단으로부터의 결실의 임의의 조합일 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 분자는 전체 TRS 서열의 결실에 의해 비활성화된 TRS를 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, DNA 분자는 TRS 서열의 부분적인 결실에 의해 비활성화된 TRS를 포함한다.
유사하게는, DNA 서열 요소 또는 특징은 본원에 제공된 DNA 분자(섹션 5.3 및 5.4 포함)의 임의의 특정 영역 또는 본원에 제공된 방법(섹션 5.2 포함)에 사용된 DNA 분자의 임의의 특정 영역에 포함되거나 이로부터 제외될 수 있다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자는 TRS가 결여된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 역위 반복은 TRS가 결여된다. 또 다른 실시양태에서, 제2 역위 반복은 TRS가 결여된다. 추가 실시양태에서, 제1 역위 반복은 TRS가 결여되고 제2 역위 반복은 TRS가 결여된다.
대안적으로, TRS 서열 요소 또는 특징은 본원에 제공된 DNA 분자(섹션 5.3 및 5.4 포함)의 임의의 특정 영역 또는 본원에 제공된 방법(섹션 5.2 포함)에 사용된 DNA 분자의 임의의 특정 영역으로부터 기능적으로 비활성화될 수 있다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자는 기능적으로 비활성화된 TRS를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 역위 반복은 기능적으로 비활성화된 TRS를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제2 역위 반복은 기능적으로 비활성화된 TRS를 포함한다. 추가 실시양태에서, 제1 역위 반복은 기능적으로 비활성화된 TRS를 포함하고, 제2 역위 반복은 기능적으로 비활성화된 TRS를 포함한다.
본원에 제공된 DNA 분자에서 제외되거나 기능적으로 비활성화된 RABS는 하기 표에 나열된 RABS 서열 중 임의의 것, 또는 이의 전부 또는 임의의 개수의 임의의 조합일 수 있다.
표 18: 예시적인 RAP
Figure pct00043
RBS 서열이 결여된 DNA 분자에 대한 말단 반복의 추가적인 비제한적 예는 도 3 뿐만 아니라 해당하는 서열번호: 3, 4, 5, 8, 9 및 10에 예시되어 있다. 일부 구체적인 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자에서 제외되거나 기능적으로 비활성화된 RABS는 하기 표에 나열된 RABS 서열 중 임의의 것, 또는 이의 전부 또는 임의의 개수의 임의의 조합일 수 있다.
Figure pct00044
하나의 구체적인 실시양태에서, DNA 분자는 선행 단락의 표에 기재된 RAP 중 어느 하나 또는 이의 전부 또는 임의의 개수의 임의의 조합에 대한 인코딩 서열이 결여된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, DNA 분자는 선행 단락의 표에 기재된 RAP 중 어느 하나 또는 이의 전부 또는 임의의 개수의 임의의 조합에 대해 인코딩하는 기능적으로 비활성화된 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, DNA 분자는 선행 단락의 표에 기재된 RAP 중 어느 하나 또는 이의 전부 또는 임의의 개수의 임의의 조합에 대해 인코딩하는 기능적으로 비활성화된 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, DNA 분자는 선행 단락의 표에 기재된 RAP 중 어느 하나 또는 이의 전부 또는 임의의 개수의 임의의 조합에 대한 기능적으로 비활성화된 인식 서열을 포함한다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 1개 또는 둘 모두의 헤어핀화된 역위 반복은 다음의 RAPS 인식 서열이 결여된다:
Figure pct00045
적어도 하나 또는 임의의 RBS 서열이 결여된 DNA 분자에 포함될 수 있는 헤어핀화된 역위 반복의 추가적인 비-철저한 예는 실시예 10에 예시된다.
다른 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자에서 제외되거나 기능적으로 비활성화된 TRS는 하기 표에 나열된 TRS 서열 중 임의의 것 또는 이의 전부 또는 임의의 개수의 임의의 조합일 수 있다.
표 19: 예시적인 RAP
Figure pct00046
본원에 제공된 방법이 바이러스 복제 단계를 필요로 하지 않고 본원에 제공된 DNA 분자가 바이러스 수명 주기에서 제조되거나 복제될 필요가 없으므로, 본원은, 본원에 제공된 DNA 분자가 이 섹션(섹션 5.3.4)에 제공된 서열 또는 특징을 포함하여 다양한 DNA 서열 또는 특징이 결여될 수 있음을 제공하고 본원을 읽는 사람은 이를 이해할 것이다. RABS 및/또는 TRS가 결여된 DNA 분자 및 기능적으로 비활성화된 RABS 및/또는 기능적으로 비활성화된 TRS를 포함하는 DNA 분자는 이 섹션 5.3.4에 제공된 바와 같이, DNA 분자가 상기 RABS 및/또는 TRS 서열을 포함하는 DNA 분자와 비교할 때 환자에게 투여되면 가동화 또는 복제의 위험이 없거나 유의미하게 낮을 것인 점에서 주요 이점을 적어도 제공한다. 가동화의 위험 또는 가동화 위험은 DNA 분자가 투여된 숙주에서 바이러스 입자의 제조 또는 복제로 복귀하는 복제 결함 DNA 분자의 위험을 지칭한다. 이러한 가동화 위험은 DNA 분자가 투여된 동일한 숙주를 감염시킨 바이러스에 의해 발현되는 바이러스 단백질(예를 들어, Rep 단백질, NS1 단백질 또는 바이러스 캡시드 단백질)의 존재로부터 발생할 수 있다. 가동화 위험은, 예를 들어 문헌 [Liujiang Song, Hum Gene Ther, 2020 Oct;31(19-20):1054-1067(전체가 본원에 참조로 포함됨)]에 기재된 바와 같이 유전자 요법 벡터로서 복제 결함 바이러스 게놈을 사용하는 것에 대한 상당한 안전상 우려를 제기한다. RABS 및/또는 TRS가 결여된 이러한 DNA 분자는 RAP를 제공하기 위해 동일한 숙주에 다른 헬퍼 바이러스가 존재하더라도 복제를 시작하기 위한 바이러스 RAP에 대한 결합 부위가 없을 것이다. 이론에 얽매이지 않고, 존재 복제 개시는, 헤르페스바이러스 계열, 아데노바이러스 및 유두종바이러스로부터 바이러스를 포함할 수 있는 "헬퍼 바이러스"로 지칭되는, 보조 바이러스에 의한 숙주의 공동 감염에 의해 제공되는 헬퍼 인자를 필요로 할 수 있다고 생각된다.
따라서, 이 섹션 5.3.4에 있는 것을 포함하여 본원에 제공된 DNA 분자의 일부 실시양태에서, RABS 및/또는 TRS가 없는 DNA 분자는 RABS 및/또는 TRS를 가진 DNA 분자와 비교할 때 대상체 또는 환자에게 투여된 후 더 적은 가동화 위험을 갖는다. 본 섹션 5.3.4의 것을 포함하여 본원에 제공된 DNA 분자의 특정 실시양태에서, 기능적으로 비활성화된 RABS 및/또는 기능적으로 비활성화된 TRS를 포함하는 DNA 분자는 RABS 및/또는 TRS를 가진 DNA 분자와 비교할 때 대상체 또는 환자에게 투여된 후 더 적은 가동화 위험을 갖는다. 이러한 가동화 위험의 감소는 (Pm-Po)/Pm으로 결정될 수 있으며, 여기서 Pm은 (예를 들어, 동일한 숙주에서 RAP의 조작된 발현 또는 RAP를 포함하는 임의의 바이러스의 감염으로 인해) RAP가 존재할 때 RABS를 갖는 대조군 DNA 분자로부터 제조된 바이러스 입자의 수이고; Po는 RABS가 결여된 DNA 분자 또는 대조군 DNA 분자에 사용된 동일한 숙주에서 비슷한 조건 하에 본원에 제공된 바와 같이 기능적으로 비활성화된 것을 포함하는 DNA 분자로부터 제조된 바이러스 입자의 수이다. 대안적으로, 가동화 위험의 이러한 감소는 (Pm-Po)/Pm으로 결정될 수 있으며, 여기서 Pm은 (예를 들어, 동일한 숙주에서 RAP의 조작된 발현 또는 RAP를 포함하는 임의의 바이러스의 감염으로 인해) RAP가 존재할 때 TRS를 갖는 대조군 DNA 분자로부터 제조된 바이러스 입자의 수이고; Po는 TRS가 결여된 DNA 분자 또는 대조군 DNA 분자에 사용된 동일한 숙주에서 비슷한 조건 하에 본원에 제공된 바와 같이 기능적으로 비활성화된 TRS를 포함하는 DNA 분자로부터 제조된 바이러스 입자의 수이다. 추가로, 가동화 위험의 이러한 감소는 (Pm-Po)/Pm으로 결정될 수 있으며, 여기서 Pm은 (예를 들어, 동일한 숙주에서 Rep 단백질 또는 NS1 단백질의 조작된 발현 또는 Rep 단백질 또는 NS1 단백질을 포함하는 임의의 바이러스의 감염으로 인해) RAP가 존재할 때 RABS 및 TRS를 갖는 대조군 DNA 분자로부터 제조된 바이러스 입자의 수이고; Po는, 대조군 DNA 분자에 사용된 동일한 숙주에서 비슷한 조건 하에 본원에 제공된 바와 같이, (i) RABS가 결여되거나 기능적으로 비활성화된 RABS를 포함하고, (ii) TRS가 결여되거나 기능적으로 비활성화된 TRS를 포함하는, DNA 분자로부터 제조된 바이러스 입자의 수이다. 문헌 [Liujiang Song, Hum Gene Ther, 2020 Oct;31(19-20):1054-1067(전체가 본원에 참조로 포함됨)]에 기재된 바와 같이, 제조된 입자 수를 결정하기 위해 사용되는 숙주는 세포, 동물(예를 들어, 마우스, 햄스터, 래트, 개, 토끼, 기니피그 및 다른 적합한 포유동물), 또는 인간일 수 있다. 본원은 Pm 및 Po가 각각 이 단락에 기재된 바와 같이, 가동화의 절대적 또는 상대적 수준을 결정하는 데에도 사용될 수 있음을 추가로 제공하고, 본원을 읽는 당업자는 이를 이해할 것이다. 간략하게는, 이러한 검정에서, DNA 분자는 숙주 세포(예를 들어, HeK293 세포)로 형질감염되거나 DNA 분자를 포함하는 바이러스 입자로 감염시킴으로써 숙주 세포로 형질도입된다. 숙주 세포는 Rep 단백질, NS1 단백질로 추가로 형질감염되거나, Rep 단백질 또는 NS1 단백질을 발현하는 또 다른 바이러스(예를 들어, 야생형 바이러스)로 동시 감염된다. 그 후, 숙주 세포는 바이러스 입자를 제조하고 방출하기 위해 배양된다. 이어서, 48 내지 72시간(예를 들어, 65시간) 배양 후, 숙주 세포와 배양 배지를 모두 수집함으로써 비리온이 수확된다. 바이러스 입자(Pm 및 Po에 대한 프록시(proxy))에 대한 역가는 문헌 [Song et al., Cytotherapy 2013;15:986-998]에 기재된 바와 같이, 캡슐화되지 않은 DNA를 제거하기 위해 벤조나제(Benzonase) 처리 후 프로브-기반 정량적 PCR(qPCR) 분석에 의해 결정될 수 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로 포함된다. 이러한 검정의 예시적인 구현은 문헌 [Liujiang Song, Hum Gene Ther, 2020 Oct;31(19-20):1054-1067]에 제공되고, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
가동화 위험 및 가동화 위험 수준의 감소의 결정에 기초하여, 이 섹션 5.3.4에서 포함하는 본원에 제공된 DNA 분자의 일부 실시양태에서, DNA 분자의 가동화 위험은, 숙주에게 투여될 때, RABS 및/또는 TRS를 갖는 대조군 DNA 분자보다 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21% 또는 20%만큼 더 낮다. 특정 실시양태에서, DNA 분자의 가동화 위험은, 숙주에게 투여될 때, RABS 및/또는 TRS를 갖는 대조군 DNA 분자보다 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 89%, 적어도 88%, 적어도 87%, 적어도 86%, 적어도 85%, 적어도 84%, 적어도 83%, 적어도 82%, 적어도 81%, 적어도 80%, 적어도 79%, 적어도 78%, 적어도 77%, 적어도 76%, 적어도 75%, 적어도 74%, 적어도 73%, 적어도 72%, 적어도 71%, 적어도 70%, 적어도 69%, 적어도 68%, 적어도 67%, 적어도 66%, 적어도 65%, 적어도 64%, 적어도 63%, 적어도 62%, 적어도 61%, 적어도 60%, 적어도 59%, 적어도 58%, 적어도 57%, 적어도 56%, 적어도 55%, 적어도 54%, 적어도 53%, 적어도 52%, 적어도 51%, 적어도 50%, 적어도 49%, 적어도 48%, 적어도 47%, 적어도 46%, 적어도 45%, 적어도 44%, 적어도 43%, 적어도 42%, 적어도 41%, 적어도 40%, 적어도 39%, 적어도 38%, 적어도 37%, 적어도 36%, 적어도 35%, 적어도 34%, 적어도 33%, 적어도 32%, 적어도 31%, 적어도 30%, 적어도 29%, 적어도 28%, 적어도 27%, 적어도 26%, 적어도 25%, 적어도 24%, 적어도 23%, 적어도 22%, 적어도 21% 또는 적어도 20%만큼 더 낮다. 다른 실시양태에서, DNA 분자의 가동화 위험은, 숙주에게 투여될 때, RABS 및/또는 TRS를 갖는 대조군 DNA 분자보다 약 100%, 약 99%, 약 98%, 약 97%, 약 96%, 약 95%, 약 94%, 약 93%, 약 92%, 약 91%, 약 90%, 약 89%, 약 88%, 약 87%, 약 86%, 약 85%, 약 84%, 약 83%, 약 82%, 약 81%, 약 80%, 약 79%, 약 78%, 약 77%, 약 76%, 약 75%, 약 74%, 약 73%, 약 72%, 약 71%, 약 70%, 약 69%, 약 68%, 약 67%, 약 66%, 약 65%, 약 64%, 약 63%, 약 62%, 약 61%, 약 60%, 약 59%, 약 58%, 약 57%, 약 56%, 약 55%, 약 54%, 약 53%, 약 52%, 약 51%, 약 50%, 약 49%, 약 48%, 약 47%, 약 46%, 약 45%, 약 44%, 약 43%, 약 42%, 약 41%, 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21% 또는 약 20%만큼 더 낮다.
대안적으로, 하나의 실시양태에서, 이 섹션 5.3.4에서 포함하는 본원에 제공된 DNA 분자는 (예를 들어, 이 섹션 5.3.4에 제공된 Po의 측정에 기초하여) 검출가능한 가동화를 초래하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 이 섹션 5.3.4에서 포함하는 본원에 제공된 DNA 분자는, 기준 DNA 분자(예를 들어, 동일한 DNA 분자이지만 야생형 RABS 및/또는 야생형 TRS 서열을 가짐)로부터 초래된 가동화의 0.0001% 이하, 0.001% 이하, 0.01% 이하, 0.1% 이하, 1% 이하, 1.5% 이하, 2% 이하, 2.5% 이하, 3% 이하, 3.5% 이하, 4% 이하, 4.5% 이하, 5% 이하, 5.5% 이하, 6% 이하, 6.5% 이하, 7% 이하, 7.5% 이하, 8% 이하, 8.5% 이하, 9% 이하, 9.5% 또는 10% 이하의 가동화를 초래한다. 추가 실시양태에서, 이 섹션 5.3.4에서 포함하는 본원에 제공된 DNA 분자는, 기준 DNA 분자(예를 들어, 동일한 DNA 분자이지만 야생형 RABS 및/또는 야생형 TRS 서열을 가짐)로부터 초래된 가동화의 약 0.0001%, 약 0.001%, 약 0.01%, 약 0.1%, 약 1%, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 3.5, 약 4%, 약 4.5%, 약 5%, 약 5.5%, 약 6%, 약 6.5%, 약 7%, 약 7.5%, 약 8%, 약 8.5%, 약 9%, 약 9.5% 또는 약 10%의 가동화를 초래한다. 또 다른 실시양태에서, 이 섹션 5.3.4에서 포함하는 본원에 제공된 DNA 분자는, 기준 DNA 분자(예를 들어, 동일한 DNA 분자이지만 야생형 RABS 및/또는 야생형 TRS 서열을 가짐)로부터 초래된 가동화의 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 또는 10%의 가동화를 초래한다. 이러한 가동화의 백분율은 선행 단락(선행 2 단락 포함)에 추가로 기재된 바와 같이 결정된 Pm 및 Po를 사용함으로써 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자(예를 들어, 이 섹션 5.3.4에서와 같음)는 기능적으로 비활성화된 RABS 및/또는 기능적으로 비활성화된 TRS를 갖는 ITR을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자는 RABS 및/또는 TRS가 결여된 ITR을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 DNA 분자는 기능적 RABS 및/또는 기능적 TRS를 포함하는 DNA 분자와 비교할 때 대상체 또는 환자에게 투여된 후 더 적은 가동화 위험을 갖는다. 기능적으로 비활성화된 RABS 및/또는 기능적으로 비활성화된 TRS를 갖는 ITR은 "바이러스 복제 불능 역위 반복" 또는 "바이러스 복제 불능 역위 말단 반복"으로 상호교환적으로 지칭된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 어떠한 RABS도 필요로 하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자는 바이러스 수명 주기에서 제조 및/또는 복제될 필요가 없다. 당업자는 본원에 제공된 DNA 분자가, 예를 들어 이 섹션 5.3.4에서 논의된 서열 또는 특징을 포함하여, RABS 및/또는 바이러스 제조 또는 복제와 전통적으로 관련된 추가적인 특징이 결여될 수 있음을 이해할 것이다. 특정 실시양태에서, RBS가 결여된 DNA 분자 및/또는 본원에 제공된 기능적으로 비활성화된 RBS를 포함하는 DNA 분자(예를 들어, 섹션 5.3.4에서와 같음)는, DNA 분자의 말단 반복 서열이, 야생형 바이러스 ITR 서열을 가진 DNA 분자와 비교할 때 숙주 세포에서 한 때 감소된 내인성 프로모터 및/또는 전사 활성(예를 들어, RBS와 상동 서열을 공유하는 P5 AAV 프로모터)을 갖거나, 갖지 않을 수 있다는 점에서 적어도 추가적인 이점을 제공한다. 전사 활성 또는 내인성 프로모터 활성은 (예를 들어, 이들 서열이 하나 이상의 전사 시작 부위(TSS)을 함유할 때) 접힌 헤어핀 오버행 서열에서 시작하여 전이유전자 발현을 촉진하는 헤어핀-말단 DNA 분자의 능력을 지칭한다. 상기 전사 활성은 DNA 분자가 투여된 동일한 숙주를 감염시킨 바이러스에 의해 발현된 바이러스 단백질(예를 들어, Rep 단백질 또는 NS1 단백질)의 존재, 또는 숙주 세포에서 발현된 내인성 전사 인자의 결합으로부터 발생할 수 있다. TSS 및 프로모터 서열 또는 이의 단편(예를 들어, P5 프로모터)의 존재는, 치료 적용에서 의도된 전이유전자 발현을 혼란스럽게 하거나, 프로모터 선택과 무관한 전이유전자 발현 카세트에 영향을 미칠 수 있으며, 여기서 적절한 제어 요소(예를 들어, 조직 특이적 프로모터)에 의한 (예를 들어, 조직 특이적) 전이유전자 발현의 엄격한 제어가 매우 바람직하다. 일부 실시양태에서, ("ITR 전사 활성"으로 지칭되는) 헤어핀-말단 DNA 분자의 접힌 헤어핀 오버행 DNA 서열로부터 발생하는 전사 활성 및/또는 내인성 프로모터 활성의 존재 또는 수준은, (예를 들어, 5.3.3에 기재된 바와 같이 발현 카세트의 프로모터 서열을 결실 또는 비활성화시킴으로써) ORF의 업스트림에 cis-조절 요소(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같은 프로모터)가 결여된 본원에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자에 의해 숙주 세포에서 전이유전자 발현을 촉진하는 이러한 서열의 능력을 측정함으로써 (예를 들어, 리포트 유전자 발현, mRNA 전사물의 qPCR, 웨스턴 블롯 등을 검출함으로써) 결정될 수 있다.
추가 실시양태에서, ITR 전사 활성은, 상기 조직으로부터 유래되지 않은 숙주 세포에서 전이유전자 발현을 촉진하는, 조직 특이적 cis-조절 요소(예를 들어 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같은 조직 특이적 프로모터)를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 헤어핀-말단 DNA 분자의 잔류 능력을 측정함으로써 (예를 들어, 리포트 유전자 발현, mRNA 전사물의 qPCR, 웨스턴 블롯 등을 검출함으로써) 결정될 수 있다.
ITR 전사 활성 및 ITR 전사 활성 수준의 감소의 결정에 기초하여, 섹션 5.3.4에서 포함된 본원에 제공된 DNA 분자의 일부 실시양태에서, DNA 분자의 ITR 전사 활성은, 숙주에 투여될 때, 야생형 바이러스 ITR 및/또는 RABS를 갖는 대조군 DNA 분자보다 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21% 또는 20%만큼 더 낮다. 특정 실시양태에서, DNA 분자의 ITR 전사 활성은, 숙주에게 투여될 때, RABS 및/또는 야생형 바이러스 ITR를 갖는 대조군 DNA 분자보다 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 89%, 적어도 88%, 적어도 87%, 적어도 86%, 적어도 85%, 적어도 84%, 적어도 83%, 적어도 82%, 적어도 81%, 적어도 80%, 적어도 79%, 적어도 78%, 적어도 77%, 적어도 76%, 적어도 75%, 적어도 74%, 적어도 73%, 적어도 72%, 적어도 71%, 적어도 70%, 적어도 69%, 적어도 68%, 적어도 67%, 적어도 66%, 적어도 65%, 적어도 64%, 적어도 63%, 적어도 62%, 적어도 61%, 적어도 60%, 적어도 59%, 적어도 58%, 적어도 57%, 적어도 56%, 적어도 55%, 적어도 54%, 적어도 53%, 적어도 52%, 적어도 51%, 적어도 50%, 적어도 49%, 적어도 48%, 적어도 47%, 적어도 46%, 적어도 45%, 적어도 44%, 적어도 43%, 적어도 42%, 적어도 41%, 적어도 40%, 적어도 39%, 적어도 38%, 적어도 37%, 적어도 36%, 적어도 35%, 적어도 34%, 적어도 33%, 적어도 32%, 적어도 31%, 적어도 30%, 적어도 29%, 적어도 28%, 적어도 27%, 적어도 26%, 적어도 25%, 적어도 24%, 적어도 23%, 적어도 22%, 적어도 21% 또는 적어도 20%만큼 더 낮다. 다른 실시양태에서, DNA 분자의 ITR 전사 활성은, 숙주에게 투여될 때, RABS 및/또는 야생형 바이러스 ITR를 갖는 대조군 DNA 분자보다 약 100%, 약 99%, 약 98%, 약 97%, 약 96%, 약 95%, 약 94%, 약 93%, 약 92%, 약 91%, 약 90%, 약 89%, 약 88%, 약 87%, 약 86%, 약 85%, 약 84%, 약 83%, 약 82%, 약 81%, 약 80%, 약 79%, 약 78%, 약 77%, 약 76%, 약 75%, 약 74%, 약 73%, 약 72%, 약 71%, 약 70%, 약 69%, 약 68%, 약 67%, 약 66%, 약 65%, 약 64%, 약 63%, 약 62%, 약 61%, 약 60%, 약 59%, 약 58%, 약 57%, 약 56%, 약 55%, 약 54%, 약 53%, 약 52%, 약 51%, 약 50%, 약 49%, 약 48%, 약 47%, 약 46%, 약 45%, 약 44%, 약 43%, 약 42%, 약 41%, 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21% 또는 약 20%만큼 더 낮다.
특정 실시양태에서, 이 섹션 5.3.4에서 포함하는 본원에 제공된 DNA 분자는 (예를 들어, 이 섹션 5.3.4에서의 전이유전자 발현 방법의 측정에 기초하여) 검출가능한 ITR 전사 활성을 초래하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 이 섹션 5.3.4에서 포함하는 본원에 제공된 DNA 분자는, 기준 DNA 분자(예를 들어, 동일한 DNA 분자이지만 야생형 RABS 및/또는 야생형 ITR 서열을 가짐)로부터 초래된 ITR 전사 활성의 0.0001% 이하, 0.001% 이하, 0.01% 이하, 0.1% 이하, 1% 이하, 1.5% 이하, 2% 이하, 2.5% 이하, 3% 이하, 3.5 이하, 4% 이하, 4.5% 이하, 5% 이하, 5.5% 이하, 6% 이하, 6.5% 이하, 7% 이하, 7.5% 이하, 8% 이하, 8.5% 이하, 9% 이하, 9.5% 이하 또는 10% 이하의 ITR 전사 활성을 초래한다. 추가 실시양태에서, 또 다른 실시양태에서, 이 섹션 5.3.4에서 포함하는 본원에 제공된 DNA 분자는, 기준 DNA 분자(예를 들어, 동일한 DNA 분자이지만 야생형 RABS 및/또는 야생형 ITR 서열을 가짐)로부터 초래된 ITR 전사 활성의 약 0.0001%, 약 0.001%, 약 0.01%, 약 0.1%, 약 1%, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 3.5, 약 4%, 약 4.5%, 약 5%, 약 5.5%, 약 6%, 약 6.5%, 약 7%, 약 7.5%, 약 8%, 약 8.5%, 약 9%, 약 9.5% 또는 약 10%의 ITR 전사 활성을 초래한다. 또 다른 실시양태에서, 이 섹션 5.3.4에서 포함하는 본원에 제공된 DNA 분자는, 기준 DNA 분자(예를 들어, 동일한 DNA 분자이지만 야생형 RABS 및/또는 야생형 ITR 서열을 가짐)로부터 초래된 가동화 ITR 전사 활성의 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 또는 10%의 ITR 전사 활성을 초래한다. 이러한 ITR 전사 활성의 백분율은 선행 단락(선행 2 단락 포함)에 추가로 기재된 바와 같이 결정된 전이유전자 발현을 사용함으로써 결정될 수 있다.
이 섹션 5.3.4의 설명에서 명백한 바와 같이, 본원에 제공된 DNA 분자에서 제외된 DNA 서열 또는 특징은 본원에 제공된 임의의 방법(섹션 3, 5.2, 및 6 포함), 본원에 제공된 임의의 DNA 분자(섹션 3, 5.3 및 6 포함) 및 본원에 제공된 임의의 헤어핀-말단 DNA 분자(섹션 3, 5.4 및 6 포함)와 임의의 방식으로 조합될 수 있고, 본원에 제공된 DNA 분자(섹션 3, 5.5 및 6 포함)의 기능적 특성에 기여할 수 있다.
5.3.5 벡터, 예컨대 플라스미드
본원은 DNA 분자가 다양한 형태의 것일 수 있음을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본원의 방법 및 조성물을 위해 제공된 DNA 분자는 벡터이다. 벡터는 숙주 세포에서 복제 및/또는 발현될 수 있는 핵산 분자이다. 당업자에게 알려진 임의의 벡터가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드 및 인공 염색체(예를 들어, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체)일 수 있다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 벡터는 플라스미드이다. 설명으로부터 명백한 바와 같이, DNA 분자가 벡터(플라스미드 포함)의 형태일 때, 벡터는 섹션 3 및 이 섹션(섹션 5.3)에 기재된 것들을 포함하여, DNA 분자에 대해 본원에 기재된 모든 기능을 포함할 것이다.
일부 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.3.5)에 제공된 벡터는, 예를 들어 섹션 5.2에 제공된 방법 단계를 수행함으로써 섹션 3 및 5.4에 제공된 DNA 분자의 제조에 사용될 수 있다. 이와 같이, 이 섹션(섹션 5.3.5)에 제공된 벡터는, (1) 섹션 5.3.1 및 5.4에 기재된 바와 같이 헤어핀을 형성할 수 있는 IR 또는 ITR, 5.3.3에 기재된 바와 같은 발현 카세트 및 섹션 5.3.2, 5.2.4 및 5.3.6에 기재된 바와 같은 제한 효소 또는 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위를 포함하여, 섹션 3 및 5.4에 제공된 DNA 분자의 특징을 포함하고/하거나, (2) 섹션 5.3.4에 기재된 바와 같이 RABS 및/또는 TRS 서열이 결여된다. 따라서, 본원은 이 섹션(섹션 5.3.5)에 제공된 벡터가, (1) 섹션 5.3.1 및 5.4에 기재된 바와 같이 헤어핀을 형성할 수 있는 IR 또는 ITR, 5.3.3에 기재된 바와 같은 발현 카세트, 섹션 5.3.2, 5.2.4 및 5.3.6에 기재된 바와 같은 제한 효소 또는 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위 및 이 섹션(5.3.5)에 제공된 벡터에 대한 추가적인 특징의 실시양태의 임의의 조합을 포함할 수 있고/있거나, (2) 섹션 5.3.4에 기재된 바와 같이 RABS 및/또는 TRS 서열이 결여될 수 있음을 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 전사 방향으로 작동가능하게 연결된 구성요소로서 적어도 다음을 제공하도록 알려진 기술을 사용하여 구성될 수 있다: (1) 5' ITR 서열; (2) cis-조절 요소, 예를 들어 프로모터, 유도성 프로모터, 조절 스위치, 인핸서 등을 포함하는 발현 카세트; 및 (3) 3' IR 서열. 일부 실시양태에서, ITR이 측면에 있는 발현 카세트는 외인성 서열을 도입하기 위한 클로닝 부위를 포함한다.
구체적으로, 하나의 실시양태에서, DNA 분자는 플라스미드이다. 플라스미드는 플라스미드에서 DNA 분자를 복제하거나 발현하기 위한 벡터로서 당업계에 널리 알려져 있고 사용된다. 플라스미드는 종종 적합한 숙주 세포에서 자율 복제가 가능한 이중 가닥 및/또는 원형 DNA 분자를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 섹션 5.2에 기재된 방법을 위해 제공된 플라스미드는 제한 효소 분해에 의해 선형화되고/되거나 선형 형태로 존재할 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물을 위해 제공되는 플라스미드는 다양한 공급업체로부터 입수가능하고/하거나 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition, by Michael Green and Joseph Sambrook, ISBN 978-1-936113-42-2(2012)]에 기재된 바와 같이, 잘 알려진 숙주 세포(원핵 및 진핵 숙주 세포 모두 포함)에서 사용하기 위한 상업적으로 입수가능한 플라스미드를 포함하고, 상기 문헌은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 특정 실시양태에서, 플라스미드는 다중 클로닝 부위를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는, 예를 들어 항생제 저항성 유전자일 수 있는 선별 마커를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 복제 기점(ORI)을 추가로 포함한다. ORI는 복제가 개시되는 서열이며, 이는 플라스미드를 숙주 세포 내에서 복제할 수 있게 한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 위해 제공된 ORI는 박테리아 복제 기점일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 위해 제공된 ORI는 진핵 복제 기점일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물을 위해 제공된 ORI는 바이러스 복제 기점일 수 있다. 일부 구체적인 실시양태에서, ORI는 pBR322, F1, ColE1, pMB1, pUC, pSC101, R6K, 15A, EBV ORI 또는 SV40 ORI일 수 있다.
이 섹션(섹션5.3.5)에 기재된 플라스미드는 다른 특징을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 영역 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서 제한 효소 부위(예를 들어, 섹션 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같은 제한 효소)를 추가로 포함하고, 제한 효소 부위는 제1 역위 반복, 제2 역위 반복, 및 제1 및 제2 역위 반복 사이의 영역 중 어디에도 존재하지 않는다. 특정 실시양태에서, 이 단락에 기재된 제한 부위에서 제한 효소에 의한 절단은 제1 및/또는 제2 역위 반복의 어닐링에 알맞은 조건(예를 들어, 섹션 5.2.5에 기재된 바와 같은 조건)에서 검출가능한 수준으로 어닐링하지 않는 단일 가닥 오버행을 초래한다. 일부 다른 실시양태에서, 플라스미드는 이 단락에 기재된 제한 부위를 인식하고 절단하는 제한 효소를 인코딩하는 개방형 해독틀을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 제한 효소 부위 및 상응하는 제한 효소는 섹션 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 제한 효소 부위 및 이의 상응하는 제한 효소 중 어느 하나일 수 있다. 추가 실시양태에서, 이 단락에 기재된 제한 효소의 발현은 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시양태에서, 이 단락에 기재된 프로모터는 상기 섹션 5.3.3에 기재된 임의의 프로모터일 수 있다. 다른 실시양태에서, 기재된 프로모터는 유도성 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 유도성 프로모터는 화학적으로 유도성인 프로모터이다. 추가 실시양태에서, 유도성 프로모터는, 문헌 [Janina Kluge et al., Applied Microbiology and Biotechnology 102: 6357-6372(2018)]에 기재된 바와 같이, 테트라사이클린 ON(Tet-On) 프로모터, 음성 유도성 pLac 프로모터, alcA, amyB, bli-3, bphA, catR, cbhl, cre1, exylA, gas, glaA, gla1, mir1, niiA, qa-2, Smxyl, tcu-1, thiA, vvd, xyl1, xyl1, xylP, xyn1, 및 ZeaR로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이며, 상기 문헌은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
유사하게는, 특정 실시양태에서, 플라스미드는 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 및 제6 제한 부위(예를 들어, 섹션 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같은 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위)를 영역 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서 추가로 포함할 수 있고, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 및 제6 제한 부위는 a.) 대향하는 가닥에 있고; b.) 파단의 단일 가닥 오버행이 제1 및/또는 제2 역위 반복의 어닐링에 알맞은 조건(예를 들어, 섹션 5.2.5에 기재된 바와 같은 조건)에서 분자간 또는 분자내 검출가능한 수준으로 어닐링하지 않도록 이중 가닥 DNA 분자의 파단을 생성한다. 섹션 5.2.4의 설명으로부터 명확한 바와 같이, 닉킹 엔도뉴클레아제를 이용한 항온처리는 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 제한 부위에 대응하는 제5 닉 및 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제6 제한 부위에 대응하는 제6 닉을 생성할 것이다. 본원은 제5 및 제6 닉이 이들 사이에 다양한 상대 위치를 가질 수 있음을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 제5 및 제6 닉은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드로 떨어져 있다. 일부 실시양태에서, 제5 및 제6 닉 간의 ssDNA 오버행이 제1 및/또는 제2 역위 반복의 어닐링에 알맞은 조건에서 분자간 또는 분자내 검출가능한 수준으로 어닐링하지 않는 바, 제5 및 제6 닉으로부터 생성된 ssDNA 오버행은 섹션 5.2.3 및 5.3.2에 기재된 ssDNA 오버행보다 낮은 용융 온도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 제5 및 제6 닉으로부터 생성된 ssDNA 오버행은 섹션 5.2.3 및 5.3.2에 기재된 ssDNA 오버행보다 짧다. 다른 실시양태에서, 제5 및 제6 닉으로부터 생성된 ssDNA 오버행은 섹션 5.2.3 및 5.3.2에 기재된 ssDNA 오버행보다 G-C 함량을 더 낮은 백분율로 갖는다. 일부 구체적인 실시양태에서, 제5 및 제6 닉으로부터 생성된 ssDNA 오버행은 길이가 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드이다. 다른 특정 실시양태에서, 제5 및 제6 닉으로부터 생성된 ssDNA 오버행은 섹션 5.2.3 및 5.3.2에 기재된 ssDNA 오버행보다 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 적어도 95, 적어도 100, 적어도 105, 적어도 110, 적어도 115, 적어도 120, 적어도 125, 적어도 130, 적어도 135, 적어도 140, 적어도 145, 적어도 150, 적어도 155, 적어도 160, 적어도 165, 적어도 170, 적어도 175 또는 적어도 180개의 뉴클레오티드 만큼 더 짧다. 일부 구체적인 실시양태에서, 제5 및 제6 닉으로부터 생성된 ssDNA 오버행은 섹션 5.2.3 및 5.3.2에 기재된 ssDNA 오버행보다 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 105, 약 110, 약 115, 약 120, 약 125, 약 130, 약 135, 약 140, 약 145, 약 150, 약 155, 약 160, 약 165, 약 170, 약 175 또는 약 180개의 뉴클레오티드 만큼 더 짧다.
특정 실시양태에서, 플라스미드는 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ,17, 18, 19 이상의 제한 부위(예를 들어, 섹션 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같은 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위)를 영역 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서 추가로 포함할 수 있고, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 추가 제한 부위는 a.) on 대향하는 가닥에 있을 수 있고; b.) 파단의 단일 가닥 오버행이 제1 및/또는 제2 역위 반복의 어닐링에 알맞은 조건(예를 들어, 섹션 5.2.5에 기재된 바와 같은 조건)에서 분자간 또는 분자내 검출가능한 수준으로 어닐링하지 않도록 이중 가닥 DNA 분자의 파단을 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 영역 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서 닉은, 이들 사이에 다양한 상대 위치를 가질 수 있다. 실시양태에서, 영역 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서 닉은, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드로 떨어져 있다. 일부 실시양태에서, 영역 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서 닉 사이의 ssDNA 오버행이 제1 및/또는 제2 역위 반복의 어닐링에 알맞은 조건에서 분자간 또는 분자내 검출가능한 수준으로 어닐링하지 않는 바, 영역 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서의 닉으로부터 생성된 ssDNA 오버행은 섹션 5.2.3 및 5.3.2에 기재된 ssDNA 오버행보다 낮은 용융 온도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 영역 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서의 닉으로부터 생성된 ssDNA 오버행은 섹션 5.2.3 및 5.3.2에 기재된 ssDNA 오버행보다 짧다. 다른 실시양태에서, 영역 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서의 닉으로부터 생성된 ssDNA 오버행은 섹션 5.2.3 및 5.3.2에 기재된 ssDNA 오버행보다 G-C 함량을 더 낮은 백분율로 갖는다. 일부 구체적인 실시양태에서, 영역 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서의 닉으로부터 생성된 ssDNA 오버행은 길이가 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드이다.
섹션 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같이, 다양한 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위는 동일하거나 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열일 수 있다. 유사하게는, 특정 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 및 제6 제한 부위는 동일하거나 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 섹션 3 및 5.2.4 및 이 섹션 5.3에 기재된 바와 같은 DNA 분자에 대해 제공된 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 제한 부위는 모두 동일한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열에 대한 것일 수 있다. 대안적으로, 다른 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 제한 부위는 2개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열이며, 이는 2개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제 표적 서열에 대한 6개의 부위를 배열하는 모든 가능한 조합을 포함한다(예를 들어, 제1 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위 및 제2 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 나머지, 제1 닉킹 엔도 뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위 및 제2 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 나머지 등). 추가로, 특정 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 제한 부위 는 3개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열이며, 이는 3개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제 표적 서열에 대한 6개의 부위를 배열하는 모든 가능한 조합을 포함한다. 더욱이, 일부 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 제한 부위는 4개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열이며, 이는 4개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제 표적 서열에 대한 6개의 부위를 배열하는 모든 가능한 조합을 포함한다. 추가로, 일부 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 제한 부위는 5개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열이며, 이는 5개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제 표적 서열에 대한 6개의 부위를 배열하는 모든 가능한 조합을 포함한다. 더욱이, 일부 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 제한 부위는 6개의 상이한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열이다.
일부 실시양태에서, 선행 단락에 기재된 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제 부위는 내인성 닉킹 엔도뉴클레아제의 표적 서열이다. 일부 구체적인 실시양태에서, 플라스미드는 선행 단락을 포함하여 이 섹션(섹션 5.3.5)에 기재된 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 제한 부위 중 1개 이상을 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 ORF를 추가로 포함한다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 플라스미드는 선행 단락을 포함하여 이 섹션(섹션 5.3.5)에 기재된 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 제한 부위 중 2개 이상을 인식하는 2개의 닉킹 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 2개의 ORF를 추가로 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 플라스미드는 선행 단락을 포함하여 이 섹션(섹션 5.3.5)에 기재된 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 제한 부위 중 3개 이상을 인식하는 3개의 닉킹 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 3개의 ORF를 추가로 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 플라스미드는 선행 단락을 포함하여 이 섹션(섹션 5.3.5)에 기재된 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 제한 부위 중 4개 이상을 인식하는 4개의 닉킹 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 4개의 ORF를 추가로 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 플라스미드는 선행 단락을 포함하여 이 섹션(섹션 5.3.5)에 기재된 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 제한 부위 중 4개 이상을 인식하는 4개의 닉킹 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 4개의 ORF를 추가로 포함한다. 추기적인 특정 실시양태에서, 플라스미드는 선행 단락을 포함하여 이 섹션(섹션 5.3.5)에 기재된 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 제한 부위 중 5개 이상을 인식하는 5개의 닉킹 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 5개의 ORF를 추가로 포함한다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 플라스미드는 선행 단락을 포함하여 이 섹션(섹션 5.3.5)에 기재된 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 제한 부위를 각각 인식하는 6개의 닉킹 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 6개의 ORF를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 단락에 기재된 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제의 발현은 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시양태에서, 이 단락에 기재된 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제의 발현은 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시양태에서, 이 단락에 기재된 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제의 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 유도성 프로모터는 이 섹션(섹션 5.3.5)에서 위에 기재된 임의의 유도성 프로모터일 수 있다.
일부 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 제한 부위를 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제는 섹션 3, 5.3.4 및 5.3.2에 기재된 어느 하나일 수 있다. 특정 구체적인 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 제한 부위를 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제는 Nt. BsmAI; Nt. BtsCI; N. ALwl; N. BstNBI; N. BspD6I; Nb. Mva1269I; Nb. BsrDI; Nt. BtsI; Nt. BsaI; Nt. Bpu10I; Nt. BsmBI; Nb. BbvCI; Nt. BbvCI; 또는 Nt. BspQI이다. 일부 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 및 제6 제한 부위를 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제는 섹션 3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 어느 하나일 수 있다. 특정 구체적인 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 및 제6 제한 부위를 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제는 Nt. BsmAI; Nt. BtsCI; N. ALwl; N. BstNBI; N. BspD6I; Nb. Mva1269I; Nb. BsrDI; Nt. BtsI; Nt. BsaI; Nt. Bpu10I; Nt. BsmBI; Nb. BbvCI; Nt. BbvCI; 또는 Nt. BspQI이다.
추가로, 일부 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.3.5)에서 제공되는 플라스미드는 박테리아 배양에서 플라스미드의 제조에 사용하기 위한 선별가능한 마커 또는 선별 마커를 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 선별 마커는 3' ITR 서열의 다운스트림(예를 들어, 3')으로 삽입될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 선별 마커는 5' IR 서열의 업스트림(예를 들어, 5')으로 삽입될 수 있다. 이 섹션(섹션 5.3.5)에서 제공되는 플라스미드는 또한 안정한 발현 세포주의 제조에 사용하기 위한 IR 사이에 선별가능한 마커 또는 선별 마커를 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 선별 마커는 3' ITR 서열의 업스트림(예를 들어, 5')으로 삽입될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 선별 마커는 5' ITR 서열의 다운스트림(예를 들어, 3')으로 삽입될 수 있다. 적절한 선별 마커의 실시양태는 약물 저항성을 부여하는 것들을 포함한다. 특정 실시양태에서, 선별 마커는 블라스티시딘 S-저항성 유전자, 카나마이신, 제네티신 등일 수 있다. 특정 실시양태에서, 약물 선별 마커는 코람페니콜-저항성 유전자이다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 선별 마커를 인코딩하는 ORF를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 선별 마커는 항생제 저항성 유전자이다. 일부 구체적인 실시양태에서, 선별 마커는 카나마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 암피실린, 카르베니실린, 블레오마이신, 에리스로마이신, 폴리믹신 b, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 블라스티시딘, g418/제네티신, 하이그로마이신 B, 푸로마이신 및 제오신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 선별 작용제 대한 저항성을 제공하는 것이다.
추가 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.3.5)의 플라스미드는 섹션 5.3과 5.3.1의 제목 사이의 단락에 기재된 DNA 분자의 하나 이상의 사본을 포함할 수 있다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.3.5)의 플라스미드는 섹션 5.3과 5.3.1의 제목 사이의 단락에 기재된 DNA 분자의 하나의 사본을 포함할 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.3.5)의 플라스미드는 섹션 5.3과 5.3.1의 제목 사이의 단락에 기재된 DNA 분자의 2개의 사본을 포함할 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.3.5)의 플라스미드는 섹션 5.3과 5.3.1의 제목 사이의 단락에 기재된 DNA 분자의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 사본을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 DNA 분자(예를 들어, 섹션 3 및 이 섹션(섹션 5.3)에 제공된 바와 같음)는 선형, 비원형 DNA 분자일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 벡터는 다양한 순열 및 조합으로 이 섹션(섹션 5.3.5)에 기재된 임의의 하나 이상의 특징을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 플라스미드는 이 섹션(섹션 5.3.5)에 기재된 임의의 하나 이상의 특징을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물에 대한 플라스미드는 다양한 순열 및 조합으로 이 섹션(섹션 5.3.5)에 기재된 임의의 하나 이상의 특징을 포함한다.
닉킹 엔도뉴클레아제 및/또는 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위를 갖는 이 섹션(섹션 5.3.5)에 기재된 다양한 실시양태는 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의해 대체된 닉킹 엔도뉴클레아제 및 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 표적 부위에 의해 대체된 제한 부위와 함께 추가로 제공된다. 이 단락과 이 섹션(섹션 5.3.3)에 대한 프로그래밍 가능한 닉킹 효소 및 표적 부위는 섹션 5.2.4에서 제공되었다.
5.3.6 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위가 4개 미만인 DNA 분자 및 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 표적 부위가 4개 미만인 DNA 분자
하나의 추가 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹 및 제한 효소 절단이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제1 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단들에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹 및 제한 효소 절단이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제2 제한 부위 및 제한 효소에 대한 제2 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단들에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위보다 발현 카세트에 대해 더 원위에 있고, 제한 효소에 대한 제2 제한 부위가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제2 제한 부위보다 발현 카세트에 대해 더 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹 및 제한 효소 절단이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제1 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단들에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹 및 제한 효소 절단이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제2 제한 부위 및 제한 효소에 대한 제2 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단들에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위보다 발현 카세트에 대해 더 원위에 있고, 제한 효소에 대한 제2 제한 부위가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제2 제한 부위보다 발현 카세트에 대해 더 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹 및 제한 효소 절단이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제1 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단들에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹 및 제한 효소 절단이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제2 제한 부위 및 제한 효소에 대한 제2 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단들에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위보다 발현 카세트에 대해 더 원위에 있고, 제한 효소에 대한 제2 제한 부위가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제2 제한 부위보다 발현 카세트에 대해 더 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
추가적인 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹 및 제한 효소 절단이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제1 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단들에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹 및 제한 효소 절단이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제2 제한 부위 및 제한 효소에 대한 제2 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단들에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위보다 발현 카세트에 대해 더 원위에 있고, 제한 효소에 대한 제2 제한 부위가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제2 제한 부위보다 발현 카세트에 대해 더 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
추가로, 하나의 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹 및 제한 효소 절단이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 제한 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단들에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 제한 부위보다 발현 카세트에 대해 더 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹 및 제한 효소 절단이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 제한 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단들에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 제한 부위보다 발현 카세트에 대해 더 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 제한 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단들에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 제한 부위보다 발현 카세트에 대해 더 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
추가적인 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹 및 제한 효소 절단이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 제한 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단들에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 제한 부위보다 발현 카세트에 대해 더 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
추가로, 하나의 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹 및 제한 효소 절단이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제1 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단들에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제2 및 제3 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위보다 발현 카세트에 대해 더 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹 및 제한 효소 절단이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제1 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단들에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제2 및 제3 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위보다 발현 카세트에 대해 더 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹 및 제한 효소 절단이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제1 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단들에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제2 및 제3 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위보다 발현 카세트에 대해 더 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
추가적인 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹 및 제한 효소 절단이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제1 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단들에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제2 및 제3 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 제한 부위보다 발현 카세트에 대해 더 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
하나의 추가 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹 및 제한 효소 절단이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 표적 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제1 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹 및 제한 효소 절단이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제2 표적 부위 및 제한 효소에 대한 제2 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 표적 부위보다 발현 카세트에 대해 원위에 있고, 제한 효소에 대한 제2 제한 부위가 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제2 표적 부위보다 발현 카세트에 대해 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹 및 제한 효소 절단이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 표적 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제1 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹 및 제한 효소 절단이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제2 표적 부위 및 제한 효소에 대한 제2 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 표적 부위보다 발현 카세트에 대해 원위에 있고, 제한 효소에 대한 제2 제한 부위가 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제2 표적 부위보다 발현 카세트에 대해 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹 및 제한 효소 절단이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 표적 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제1 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹 및 제한 효소 절단이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제2 표적 부위 및 제한 효소에 대한 제2 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 표적 부위보다 발현 카세트에 대해 원위에 있고, 제한 효소에 대한 제2 제한 부위가 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제2 표적 부위보다 발현 카세트에 대해 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
추가적인 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹 및 제한 효소 절단이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 표적 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제1 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹 및 제한 효소 절단이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제2 표적 부위 및 제한 효소에 대한 제2 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 표적 부위보다 발현 카세트에 대해 원위에 있고, 제한 효소에 대한 제2 제한 부위가 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제2 표적 부위보다 발현 카세트에 대해 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
추가로, 하나의 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 및 제2 표적 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹 및 제한 효소 절단이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제3 표적 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제3 표적 부위보다 발현 카세트에 대해 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 5’ 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 및 제2 표적 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹 및 제한 효소 절단이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제3 표적 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제3 표적 부위보다 발현 카세트에 대해 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 및 제2 표적 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹 및 제한 효소 절단이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제3 표적 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제3 표적 부위보다 발현 카세트에 대해 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
추가적인 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 및 제2 표적 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열되는 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹 및 제한 효소 절단이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제3 표적 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단에 배열되는 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제3 표적 부위보다 발현 카세트에 대해 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
추가로, 하나의 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹 및 제한 효소 절단이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 표적 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제1 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제2 및 제3 표적 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 표적 부위보다 발현 카세트에 대해 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹 및 제한 효소 절단이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 표적 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제1 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제2 및 제3 표적 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 표적 부위보다 발현 카세트에 대해 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
또 다른 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음)프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹 및 제한 효소 절단이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 표적 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제1 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음),프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 5’ 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제2 및 제3 표적 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 표적 부위보다 발현 카세트에 대해 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 5' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 하부 가닥 5' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
추가적인 양태에서, i) 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹 및 제한 효소 절단이 제1 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제1 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 하부 가닥 3’ 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 표적 부위 및 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 제1 역위 반복의 근처에서 대향하는 말단에 배열된 것인, 제1 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음); ii) 발현 카세트(예를 들어, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같음); 및 iii) 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시(예를 들어, 섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.3.2에 기재된 바와 같음), 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 의한 닉킹이 제2 역위 반복 또는 이의 단편(예를 들어, 제2 역위 반복의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%)을 포함하는 상부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제2 및 제3 표적 부위가 제2 역위 반복의 근처에서 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공되고, 여기서 제한 효소에 대한 제1 제한 부위가 발현 카세트에 대해 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 가이드 핵산에 대한 제1 표적 부위보다 원위에 있다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하부 가닥 3' 오버행은 제1 역위 반복을 포함하고, 상부 가닥 3' 오버행은 제2 역위 반복을 포함한다.
이 섹션(5.3.6)에 제공된 DNA 분자는 이 섹션(섹션 5.3.6)에 기재된 바와 같이 다양한 특징을 포함하거나 다양한 실시양태를 가지며, 이러한 특징 및 실시양태는 하기 다양한 하위 섹션에서 추가로 기재된다: 제1 역위 반복 및/또는 제2 역위 반복을 포함하는 역위 반복에 대한 하나의 실시양태는 섹션 5.3.1에 기재되고, 제한 효소, 닉킹 엔도뉴클레아제 및 이들 각각의 제한 부위에 대한 하나의 실시양태는 섹션 5.3.2에 기재되고, 프로그래밍 가능한 닉킹 효소 및 이들의 표적화 부위에 대한 하나의 실시양태는 섹션 5.2.4에 기재되고, 발현 카세트에 대한 하나의 실시양태는 섹션 5.3.3에 기재되고, 플라스미드 및 벡터에 대한 하나의 실시양태는 섹션 5.3.5에 기재된다. 이와 같이, 본원은 본원에 기재된 DNA 분자의 다양한 실시양태 및 DNA 분자의 특징의 실시양태의 임의의 순열 및 조합을 포함하는 DNA 분자를 제공한다.
닉킹 엔도뉴클레아제와 함께 이 섹션(섹션 5.3.6)에 기재된 다양한 실시양태는 프로그래밍 가능한 닉킹 효소와 상호교환 가능하고, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위는 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 표적 부위와 상호교환 가능하다. 이와 같이, 닉킹 엔도뉴클레아제의 하나 이상의 요소를 프로그래밍 가능한 닉킹 효소로 대체하고/하거나 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위의 하나 이상의 요소를 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 표적 부위로 대체함으로써 생성된 임의의 조합의 추가 실시양태가 이 섹션(5.3.6)에서 본원에 제공된다. 이 단락과 이 섹션(섹션 5.3.3)에 대한 프로그래밍 가능한 닉킹 효소 및 표적 부위는 섹션 5.2.4에서 제공되었다.
5.3.7 단리된 DNA 분자
본원에 제공된 DNA 분자는, 엑소뉴클레아제 또는 다른 DNA 분해 효소에 대해 저항성이고, 이에 따라 섹션 5.2.6에 기재된 바와 같이, 상기 엑소뉴클레아제 또는 DNA 분해 효소로 처리되어 이러한 처리에 민감한 DNA 오염물질을 제거할 수 있기 때문에, 본원에 제공된 방법 및 DNA 분자의 이점 중 하나는 본원에 제공되고 상기 방법에서 제조된 단리된 DNA 분자의 순도이다. 섹션 5.3의 제목과 섹션 5.3.1의 제목 사이의 단락에 이미 기재된 바와 같이, 섹션 3, 5.2, 5.3, 5.4 및 6을 포함하여 본원에 제공된 DNA 분자는 다양한 순도의 단리된 DNA 분자일 수 있다. 또한, 본원은, 섹션 3, 5.2, 5.3, 5.4 및 6을 포함하여 본원에 제공된 DNA 분자에 특정 일반적인 DNA 오염물질이 없거나, 특정한 특이적 DNA 오염물질이 없거나, 특정 일반적인 DNA 오염물질 및 특정한 특이적 DNA 오염물질 둘 모두가 없을 수 있음을 제공하고, 당업자는 이를 이해할 것이다.
따라서, 하나의 실시양태에서, 단리된 DNA 분자는 DNA 분자의 단편이 없다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 DNA 분자는 DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질이 없다. 추가 실시양태에서, 단리된 DNA 분자는 배큘로바이러스 DNA가 없다. 하나의 실시양태에서, 단리된 DNA 분자는 DNA 분자의 단편이 없고, DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질이 없다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 DNA 분자는 DNA 분자의 단편이 없고, 배큘로바이러스 DNA가 없다. 추가 실시양태에서, 단리된 DNA 분자는 배큘로바이러스 DNA가 없고, DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질이 없다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 DNA 분자는 DNA 분자의 단편이 없고, 배큘로바이러스 DNA가 없고, DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질이 없다.
구체적으로, 하나의 실시양태에서, DNA 분자의 단편은 단리된 DNA 분자의 1% 이하, 2% 이하, 3% 이하, 4% 이하, 5% 이하, 6% 이하, 7% 이하, 8% 이하, 9% 이하, 10% 이하, 11% 이하, 12% 이하, 13% 이하, 14% 이하, 15% 이하, 16% 이하, 17% 이하, 18% 이하, 19% 이하, 20% 이하, 21% 이하, 22% 이하, 23% 이하, 24% 이하, 25% 이하, 26% 이하, 27% 이하, 28% 이하, 29% 이하, 30% 이하, 31% 이하, 32% 이하, 33% 이하, 34% 이하, 35% 이하, 36% 이하, 37% 이하, 38% 이하, 39% 이하, 40% 이하, 41% 이하, 42% 이하, 43% 이하, 44% 이하, 45% 이하, 46% 이하, 47% 이하, 48% 이하, 49% 이하 또는 50% 이하이다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자의 단편은 단리된 DNA 분자의 1% 미만, 2% 미만, 3% 미만, 4% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 10% 미만, 11% 미만, 12% 미만, 13% 미만, 14% 미만, 15% 미만, 16% 미만, 17% 미만, 18% 미만, 19% 미만, 20% 미만, 21% 미만, 22% 미만, 23% 미만, 24% 미만, 25% 미만, 26% 미만, 27% 미만, 28% 미만, 29% 미만, 30% 미만, 31% 미만, 32% 미만, 33% 미만, 34% 미만, 35% 미만, 36% 미만, 37% 미만, 38% 미만, 39% 미만, 40% 미만, 41% 미만, 42% 미만, 43% 미만, 44% 미만, 45% 미만, 46% 미만, 47% 미만, 48% 미만, 49% 미만 또는 50% 미만이다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자의 단편은 단리된 DNA 분자의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49% 또는 약 50%이다.
추가로, 하나의 실시양태에서, DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질은 단리된 DNA 분자의 1% 이하, 2% 이하, 3% 이하, 4% 이하, 5% 이하, 6% 이하, 7% 이하, 8% 이하, 9% 이하, 10% 이하, 11% 이하, 12% 이하, 13% 이하, 14% 이하, 15% 이하, 16% 이하, 17% 이하, 18% 이하, 19% 이하, 20% 이하, 21% 이하, 22% 이하, 23% 이하, 24% 이하, 25% 이하, 26% 이하, 27% 이하, 28% 이하, 29% 이하, 30% 이하, 31% 이하, 32% 이하, 33% 이하, 34% 이하, 35% 이하, 36% 이하, 37% 이하, 38% 이하, 39% 이하, 40% 이하, 41% 이하, 42% 이하, 43% 이하, 44% 이하, 45% 이하, 46% 이하, 47% 이하, 48% 이하, 49% 이하 또는 50% 이하이다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질은 단리된 DNA 분자의 1% 미만, 2% 미만, 3% 미만, 4% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 10% 미만, 11% 미만, 12% 미만, 13% 미만, 14% 미만, 15% 미만, 16% 미만, 17% 미만, 18% 미만, 19% 미만, 20% 미만, 21% 미만, 22% 미만, 23% 미만, 24% 미만, 25% 미만, 26% 미만, 27% 미만, 28% 미만, 29% 미만, 30% 미만, 31% 미만, 32% 미만, 33% 미만, 34% 미만, 35% 미만, 36% 미만, 37% 미만, 38% 미만, 39% 미만, 40% 미만, 41% 미만, 42% 미만, 43% 미만, 44% 미만, 45% 미만, 46% 미만, 47% 미만, 48% 미만, 49% 미만 또는 50% 미만이다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질은 단리된 DNA 분자의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49% 또는 약 50%이다.
또한, 하나의 실시양태에서, 배큘로바이러스 DNA는 단리된 DNA 분자의 1% 이하, 2% 이하, 3% 이하, 4% 이하, 5% 이하, 6% 이하, 7% 이하, 8% 이하, 9% 이하, 10% 이하, 11% 이하, 12% 이하, 13% 이하, 14% 이하, 15% 이하, 16% 이하, 17% 이하, 18% 이하, 19% 이하, 20% 이하, 21% 이하, 22% 이하, 23% 이하, 24% 이하, 25% 이하, 26% 이하, 27% 이하, 28% 이하, 29% 이하, 30% 이하, 31% 이하, 32% 이하, 33% 이하, 34% 이하, 35% 이하, 36% 이하, 37% 이하, 38% 이하, 39% 이하, 40% 이하, 41% 이하, 42% 이하, 43% 이하, 44% 이하, 45% 이하, 46% 이하, 47% 이하, 48% 이하, 49% 이하 또는 50% 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 배큘로바이러스 DNA는 단리된 DNA 분자의 1% 미만, 2% 미만, 3% 미만, 4% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 10% 미만, 11% 미만, 12% 미만, 13% 미만, 14% 미만, 15% 미만, 16% 미만, 17% 미만, 18% 미만, 19% 미만, 20% 미만, 21% 미만, 22% 미만, 23% 미만, 24% 미만, 25% 미만, 26% 미만, 27% 미만, 28% 미만, 29% 미만, 30% 미만, 31% 미만, 32% 미만, 33% 미만, 34% 미만, 35% 미만, 36% 미만, 37% 미만, 38% 미만, 39% 미만, 40% 미만, 41% 미만, 42% 미만, 43% 미만, 44% 미만, 45% 미만, 46% 미만, 47% 미만, 48% 미만, 49% 미만 또는 50% 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 배큘로바이러스 DNA는 단리된 DNA 분자의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49% 또는 약 50%이다.
이 섹션 5.3.7의 선행 단락에 기재된 바와 같은 특정 오염물질(예를 들어, DNA 분자의 단편, DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질 및/또는 배큘로바이러스)에 대한 다양한 순도의 본원에 제공된 단리된 DNA 분자의 다양한 실시양태는 상호 배타적이지 않고, 이에 따라 이 섹션 5.3.7의 선행 단락의 목록에 제공된 임의의 실시양태를 선택하고 조합함으로써 다양한 조합으로 조합될 수 있다. 더욱이, 이 섹션 5.3.7에 제공된 단리된 DNA 분자 및 섹션 5.3의 제목과 섹션 5.3.1의 제목 사이의 단락에 있는 것 또한 본원에 기재된 목록에 제공된 임의의 적합한 실시양태를 선택하고 조합함으로써 다양한 조합으로 조합될 수 있다.
5.3.8 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자
섹션 3, 5.2, 5.3, 5.4 및 6에 있는 것을 포함하여 본원에 제공된 DNA 분자는 바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 이러한 바이러스 입자는, 문헌 [Grieger JC, et al., Nat Protoc 2006;1:1412-1428]; 및 [Liujiang Song, Hum Gene Ther, 2020 Oct;31(19-20):1054-1067]에 기재된 바와 같이, DNA 분자를 적절한 숙주 세포(예를 들어, HEK 293)로 형질감염시키고, 바이러스 패키징에 필요한 다른 분자(예를 들어, 바이러스 캡시드(Cap) 단백질)로 숙주 세포를 공동-형질감염시킴으로써 패키징될 수 있으며, 상기 문헌 둘 모두는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 섹션 5.3.7에 제공된 바와 같은 다양한 순도의 단리된 DNA 분자가 숙주 세포로 형질감염되고/되거나 바이러스 입자에 패키징됨으로써, 패키징된 바이러스 입자에서 다양한 순도를 갖는 DNA 분자를 제공할 수 있기 때문에, 본원에 제공된 방법 및 DNA 분자의 이점 중 하나는, 바이러스 입자에 패키징되고 제조될 때의 본원에 제공된 DNA 분자의 순도이다. 따라서, 본원은 상기 DNA 분자가 바이러스 입자에 패키징될 때, 섹션 3, 5.2, 5.3, 5.4 및 6을 포함하여 본원에 제공된 DNA 분자에 특정 일반적인 DNA 오염물질이 없거나, 특정 특이적 DNA 오염물질이 없거나, 특정 일반적인 DNA 오염물질 및 특정 특이적 DNA 오염물질 양쪽 모두가 없을 수 있음을 제공하고, 당업자는 이를 이해할 것이다.
따라서, 하나의 실시양태에서, 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자는 DNA 분자의 단편이 없다. 또 다른 실시양태에서, 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자는 DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질이 없다. 추가 실시양태에서, 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자는 배큘로바이러스 DNA가 없다. 하나의 실시양태에서, 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자는 DNA 분자의 단편이 없고, DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질이 없다. 또 다른 실시양태에서, 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자는 DNA 분자의 단편이 없고, 배큘로바이러스 DNA가 없다. 추가 실시양태에서, 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자는 배큘로바이러스 DNA가 없고, DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질이 없다. 또 다른 실시양태에서, 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자는 DNA 분자의 단편이 없고, 배큘로바이러스 DNA가 없고, DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질이 없다.
구체적으로, 하나의 실시양태에서, DNA 분자의 단편은 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자의 1% 이하, 2% 이하, 3% 이하, 4% 이하, 5% 이하, 6% 이하, 7% 이하, 8% 이하, 9% 이하, 10% 이하, 11% 이하, 12% 이하, 13% 이하, 14% 이하, 15% 이하, 16% 이하, 17% 이하, 18% 이하, 19% 이하, 20% 이하, 21% 이하, 22% 이하, 23% 이하, 24% 이하, 25% 이하, 26% 이하, 27% 이하, 28% 이하, 29% 이하, 30% 이하, 31% 이하, 32% 이하, 33% 이하, 34% 이하, 35% 이하, 36% 이하, 37% 이하, 38% 이하, 39% 이하, 40% 이하, 41% 이하, 42% 이하, 43% 이하, 44% 이하, 45% 이하, 46% 이하, 47% 이하, 48% 이하, 49% 이하 또는 50% 이하이다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자의 단편은 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자의 1% 미만, 2% 미만, 3% 미만, 4% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 10% 미만, 11% 미만, 12% 미만, 13% 미만, 14% 미만, 15% 미만, 16% 미만, 17% 미만, 18% 미만, 19% 미만, 20% 미만, 21% 미만, 22% 미만, 23% 미만, 24% 미만, 25% 미만, 26% 미만, 27% 미만, 28% 미만, 29% 미만, 30% 미만, 31% 미만, 32% 미만, 33% 미만, 34% 미만, 35% 미만, 36% 미만, 37% 미만, 38% 미만, 39% 미만, 40% 미만, 41% 미만, 42% 미만, 43% 미만, 44% 미만, 45% 미만, 46% 미만, 47% 미만, 48% 미만, 49% 미만 또는 50% 미만이다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자의 단편은 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49% 또는 약 50%이다.
추가로, 하나의 실시양태에서, DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질은 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자의 1% 이하, 2% 이하, 3% 이하, 4% 이하, 5% 이하, 6% 이하, 7% 이하, 8% 이하, 9% 이하, 10% 이하, 11% 이하, 12% 이하, 13% 이하, 14% 이하, 15% 이하, 16% 이하, 17% 이하, 18% 이하, 19% 이하, 20% 이하, 21% 이하, 22% 이하, 23% 이하, 24% 이하, 25% 이하, 26% 이하, 27% 이하, 28% 이하, 29% 이하, 30% 이하, 31% 이하, 32% 이하, 33% 이하, 34% 이하, 35% 이하, 36% 이하, 37% 이하, 38% 이하, 39% 이하, 40% 이하, 41% 이하, 42% 이하, 43% 이하, 44% 이하, 45% 이하, 46% 이하, 47% 이하, 48% 이하, 49% 이하 또는 50% 이하이다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질은 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자의 1% 미만, 2% 미만, 3% 미만, 4% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 10% 미만, 11% 미만, 12% 미만, 13% 미만, 14% 미만, 15% 미만, 16% 미만, 17% 미만, 18% 미만, 19% 미만, 20% 미만, 21% 미만, 22% 미만, 23% 미만, 24% 미만, 25% 미만, 26% 미만, 27% 미만, 28% 미만, 29% 미만, 30% 미만, 31% 미만, 32% 미만, 33% 미만, 34% 미만, 35% 미만, 36% 미만, 37% 미만, 38% 미만, 39% 미만, 40% 미만, 41% 미만, 42% 미만, 43% 미만, 44% 미만, 45% 미만, 46% 미만, 47% 미만, 48% 미만, 49% 미만 또는 50% 미만이다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질은 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49% 또는 약 50%이다.
또한, 하나의 실시양태에서, 배큘로바이러스 DNA는 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자의 1% 이하, 2% 이하, 3% 이하, 4% 이하, 5% 이하, 6% 이하, 7% 이하, 8% 이하, 9% 이하, 10% 이하, 11% 이하, 12% 이하, 13% 이하, 14% 이하, 15% 이하, 16% 이하, 17% 이하, 18% 이하, 19% 이하, 20% 이하, 21% 이하, 22% 이하, 23% 이하, 24% 이하, 25% 이하, 26% 이하, 27% 이하, 28% 이하, 29% 이하, 30% 이하, 31% 이하, 32% 이하, 33% 이하, 34% 이하, 35% 이하, 36% 이하, 37% 이하, 38% 이하, 39% 이하, 40% 이하, 41% 이하, 42% 이하, 43% 이하, 44% 이하, 45% 이하, 46% 이하, 47% 이하, 48% 이하, 49% 이하 또는 50% 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 배큘로바이러스 DNA는 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자의 1% 미만, 2% 미만, 3% 미만, 4% 미만, 5% 미만, 6% 미만, 7% 미만, 8% 미만, 9% 미만, 10% 미만, 11% 미만, 12% 미만, 13% 미만, 14% 미만, 15% 미만, 16% 미만, 17% 미만, 18% 미만, 19% 미만, 20% 미만, 21% 미만, 22% 미만, 23% 미만, 24% 미만, 25% 미만, 26% 미만, 27% 미만, 28% 미만, 29% 미만, 30% 미만, 31% 미만, 32% 미만, 33% 미만, 34% 미만, 35% 미만, 36% 미만, 37% 미만, 38% 미만, 39% 미만, 40% 미만, 41% 미만, 42% 미만, 43% 미만, 44% 미만, 45% 미만, 46% 미만, 47% 미만, 48% 미만, 49% 미만 또는 50% 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 배큘로바이러스 DNA는 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49% 또는 약 50%이다.
본원은 이 섹션 5.3.8에 기재된 다양한 오염물질이, 예를 들어 차세대 서열분석(NGS) 또는 PCR에 의해 당업계에 알려져 있고 실시되는 다양한 방법에 의해 검출 및 결정될 수 있음을 제공한다.
이 섹션 5.3.8의 선행 단락에 기재된 바와 같은 특정 오염물질(예를 들어, DNA 분자의 단편, DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질 및/또는 배큘로바이러스 DNA)에 대한 다양한 순도의 본원에 제공된 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자의 다양한 실시양태는 상호 배타적이지 않고, 이에 따라 이 섹션 5.3.8의 선행 단락의 목록에 제공된 임의의 실시양태를 선택하고 조합함으로써 다양한 조합으로 조합될 수 있다. 더욱이, 이 섹션 5.3.8에 제공된 바이러스 입자에 패키징된 DNA 분자 및 섹션 5.3의 제목과 섹션 5.3.1의 제목 사이의 단락에 있는 것 또한 본원에 기재된 목록에 제공된 임의의 적합한 실시양태를 선택하고 조합함으로써 다양한 조합으로 조합될 수 있다.
5.4 헤어핀-말단 DNA 분자
본원은 이 섹션(섹션 5.4)의 헤어핀-말단 DNA 분자가 섹션 5.3에 제공된 DNA 분자에서 섹션 5.2(섹션 5.2.3, 5.2.4 및 5.2.5 포함)에 기재된 방법 단계를 수행함으로써 제조될 수 있음을 제공한다. 이와 같이, 이 섹션(섹션 5.4)의 헤어핀-말단 DNA 분자는, (1) 섹션 5.3.1 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같은 헤어핀을 형성할 수 있는 IR 또는 ITR, 섹션 5.3.1 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같은 IR 또는 ITR의 특정 서열, 기원 및 본질, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같은 발현 카세트, 섹션 5.3.2, 5.2.4 및 5.3.6에 기재된 바와 같은 제한 효소 또는 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위, 및 섹션 5.2.4에 기재된 바와 같은 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 표적 부위를 포함하여, 섹션 3 및 5.3에 제공된 DNA 분자의 다양한 특징을 포함할 수 있고/있거나, (2) 섹션 5.3.4에 기재된 바와 같은 RABS 및/또는 TRS 서열이 결여될 수 있다. 따라서, 본원은 이 섹션(섹션 5.4)의 헤어핀-말단 DNA 분자가 (1) 섹션 5.3.1 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같은 헤어핀을 형성할 수 있는 IR 또는 ITR, 섹션 5.3.1 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같은 IR 또는 ITR의 특정 서열, 기원 및 본질, 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같은 발현 카세트, 섹션 5.3.2, 5.2.4 및 5.3.6에 기재된 바와 같은 제한 효소 또는 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위, 섹션 5.2.4에 기재된 바와 같은 프로그래밍 가능한 닉킹 효소에 대한 표적 부위, 및 이 섹션(섹션 5.4)에 제공된 벡터에 대한 추가 특징의 실시양태의 임의의 조합을 포함할 수 있고/있거나, (2) 섹션 5.3.4에 기재된 바와 같은 RABS 및/또는 TRS 서열이 결여될 수 있음을 제공한다.
설명으로부터 명확한 바와 같이, 이 섹션(섹션 5.4)에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자에서 ITR 또는 헤어핀화된 ITR은, 예를 들어 섹션 3, 5.2.3, 5.2.4 및 5.2.5에 기재된 방법 단계 수행 시, 섹션 3 및 5.3.1에 상기 제공된 ITR 또는 IR로부터 형성될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.4)에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자에서 2개의 ITR 또는 2개의 헤어핀화된 ITR은, 섹션 3 및 5.3.1에 제공된 IR 또는 ITR의 임의의 실시양태 및 이 섹션(섹션 5.4)에 제공된 추가 실시양태를 임의의 조합으로 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, a.) 제1 헤어핀화된 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같음); b.) 하부 가닥의 닉(예를 들어, 섹션 5.2.4 및 5.3.2 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같음); c.) 발현 카세트(예를 들어, 5.3.3 및 이 섹션(5.4)에 기재된 바와 같음); d.) 하부 가닥의 닉(예를 들어, 섹션 5.2.4 및 5.3.2 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같음); 및 e.) 제2 헤어핀화된 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, a.) 제1 헤어핀화된 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같음); b.) 상부 가닥의 닉(예를 들어, 섹션 5.2.4 및 5.3.2 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같음); c.) 발현 카세트(예를 들어, 5.3.3 및 이 섹션(5.4)에 기재된 바와 같음); d.) 상부 가닥의 닉(예를 들어, 섹션 5.2.4 및 5.3.2 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같음); 및 e.) 제2 헤어핀화된 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, a.) 제1 헤어핀화된 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같음); b.) 하부 가닥의 닉(예를 들어, 섹션 5.2.4 및 5.3.2 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같음); c.) 발현 카세트 발현 카세트(예를 들어, 5.3.3 및 이 섹션(5.4)에 기재된 바와 같음); d.) 상부 가닥의 닉(예를 들어, 섹션 5.2.4 및 5.3.2 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같음); 및 e.) 제2 헤어핀화된 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다.
추가적인 양태에서, a.) 제1 헤어핀화된 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같음); b.) 상부 가닥의 닉(예를 들어, 섹션 5.2.4 및 5.3.2 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같음); c.) 발현 카세트 발현 카세트(예를 들어, 5.3.3 및 이 섹션(5.4)에 기재된 바와 같음); d.) 하부 가닥의 닉(예를 들어, 섹션 5.2.4 및 5.3.2 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같음); 및 e.) 제2 헤어핀화된 역위 반복(예를 들어, 섹션 5.3.1 및 이 섹션(섹션 5.4)에 기재된 바와 같음)을 상부 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 본원에 제공된다.
2차 구조는 염기 쌍 스태킹, 스템, 헤어핀, 벌지, 내부 루프 및 다중 분지 루프를 포함하는 형태(예를 들어, 도메인)에 기반하여 형성된다. IR의 도메인 수준 설명은 특정 뉴클레오티드 서열보다는 도메인의 측면에서 가닥 및 형성된 복합체를 나타낸다. 서열 수준에서, 각각의 도메인은 특정 뉴클레오티드 서열 또는 모티프가 할당되며, 이의 보체의 서열은 왓슨-크릭 염기 쌍 형성(Watson-Crick base pairing)에 의해 결정된다. 이것은 G-T 워블(wobble) 염기 쌍을 포함하여 상보적인 뉴클레오티드의 임의의 쌍 사이의 결합의 전체 범위에 걸쳐 있다. 결합된(예를 들어, 염기 쌍 형성됨) 및 결합되지 않은 도메인의 전체 세트는 일분자(unimolecular) 복합체를 형성하고, 다양한 2차 구조를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 헤어핀은 쌍을 이룬 염기의 스템 및 쌍을 이루지 않은 염기의 작은 루프를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열에서 짜여진(interweaved) 비-회문 폴리뉴클레오티드 섹션의 존재는 벌지로 알려진 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드로 이어질 수 있다. 벌지는 하나 이상의 뉴클레오티드를 가질 수 있으며 이들의 위치에 따라 다른 종류로 분류된다: 상부 가닥(벌지), 두 가닥(내부 루프) 또는 접합부. 이러한 염기 쌍의 무리는 3차원 구조에서 발생하는 DNA의 2차 구조를 구성한다.
또한, 본원에 제공된 DNA 분자에 대한 도메인 수준 설명은 특정 뉴클레오티드 서열보다는 도메인 측면에서 다중 가닥 및 이의 복합체를 나타내기 위해 제공된다. 일부 실시양태에서, 상호작용하는 단일 가닥화 DNA 가닥의 도메인(예를 들어, 서열 모티프)은 다른 DNA 가닥과 상호작용할 수 있는 단일 가닥 수준에서 특정한 2차 구조를 나타낼 수 있고, 일부 경우에, 제1 가닥이 제2 가닥의 상보적 도메인에 결합될 때 혼성화된 구조를 취하여 듀플렉스를 형성한다. 새로운 복합체 또는 2차 구조의 변화를 생성하는 상이한 DNA 가닥의 상호작용은 "반응"으로 볼 수 있다. 추가 일분자 및 이분자 반응도 서열 수준에서 가능하다. 불량한 서열 디자인은 본원에 제공된 하나 이상의 DNA 분자를 포함하는 시스템의 의도된 반응을 방해하는 서열 수준 구조 또는 상호작용(예를 들어, 발현 카세트에서 상보적인 다중 도메인)을 초래할 수 있다. 원하지 않는 상호작용은 디자인으로 피할 수 있고, 이는 신뢰할 수 있고 예측 가능한 2차 구조 형성으로 이어진다.
본원은 DNA의 2차 구조로 이어지는 기저 힘이 열역학적 법칙의 기초가 되는 소수성 상호작용에 의해 지배되고, 전반적인 형태가 물리화학적 조건에 의해 영향을 받을 수 있음을 제공한다. 평형 상태를 결정하는 인자의 예시적인 목록은 용매의 종류, 화학 작용제 과밀(crowding), 염 농도, pH 및 온도를 포함한다. 실험 문헌으로부터 도출된 자유 에너지 변화 매개변수 및 엔탈피 변화 매개변수가 형태 안정성의 예측을 가능하게 하지만, 통계 역학에서 일반적으로 IR 서열로부터 형성된 헤어핀의 전체 3차원 구조는 단지 하나의 형태가 아닌 분자 형태의 앙상블에 상응한다. 물리적 또는 화학적 조건(예를 들어, 염분, pH 또는 온도)이 순열됨에 따라 우세한 형태가 변천될 수 있다.
"스템 도메인" 또는 "스템"은 왓슨-크릭 염기 쌍을 형성할 오버행 가닥의 자가-상보적 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 스템은 주로 DNA 쌍의 두 역평행 스트레치 사이에 형성된 왓슨-크릭 염기 쌍을 포함하며, 우측-회전 나선일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 스템은 회문 서열에서 자가-상보적 DNA 서열의 스트레치를 포함한다.
"1차 스템 도메인" 또는 "1차 스템"은 DNA 분자의 발현 카세트 또는 비-ITR 서열에 가장 근접한 자가-상보적 또는 ITR의 역상보 뉴클레오티드 서열의 일부를 지칭한다. 하나의 실시양태에서, 1차 스템 도메인은 본원에 제공된 DNA 분자의 말단을 형성하고 ITR 측면에 있는 비-ITR 서열에 공유 연결되는 회문 서열의 자가 상보적 스트레치이다. 1차 스템은 IR 서열의 시작뿐만 아니라 말단을 모두 포함한다. 특정 실시양태에서, 1차 스템은 길이가 1 내지 100 bp 또는 그 초과의 bp이다. 1차 스템 영역의 길이는 변성/재생 동역학에 영향을 미친다. 일부 구체적인 실시양태에서, 1차 스템 영역은 열 안정성을 보장하기 위해 적어도 대략 4개 및 25개의 뉴클레오티드를 갖는다. 다른 특정 실시양태에서, 1차 스템 영역은 열 안정성을 보장하기 위해 약 4개 및 25개의 뉴클레오티드를 갖는다. 반면에, 역위 반복 도메인은 생리학적 조건에서 대략적인 3차원 구조를 유지하기에 충분한 임의의 길이일 수 있다.
"루프" 또는 "루프 도메인"은 전환점이 아니고 스템에 있지 않은 IR 또는 ITR에서 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 영역을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 루프 도메인은 IR 구조의 정점에서 발견된다. 루프 도메인은 DNA 가닥의 국소적 방향성이 역전되어 기원 스템의 2개의 역평행 가닥을 제공하는 영역으로 작용할 수 있다. 입체 반발력으로 인해, 특정 실시양태에서, 루프는 DNA 헤어핀에서 회전을 만들기 위해 최소 2개의 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 루프는 4개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 루프는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29 또는 적어도 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 추가 실시양태에서, 루프는 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29 또는 약 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 루프는 스템의 자가 상보적 서열을 따르고 추가 뉴클레오티드를 스템 도메인에 연결하도록 작용한다. 일부 실시양태에서, 루프는 ITR의 루프 서열 또는 다른 요소에서 다른 뉴클레오티드와 연속 듀플렉스 구조를 형성하지 않는 올리고뉴클레오티드의 서열을 포함한다(예를 들어, 루프는 유연한 단일 가닥 형태로 남아 있음). 하나의 실시양태에서, 루프 서열에서 다른 뉴클레오티드와 듀플렉스를 형성하지 않는 루프 서열은 일련의 동일한 염기(예를 들어, AAAAAAAA, CCCCCCCC, GGGGGGG 또는 TTTTTTTT)이다. 하나의 실시양태에서, 루프는 2 내지 30개의 뉴클레오티드를 함유한다. 추가 실시양태에서, 루프 도메인은 2 내지 15개의 뉴클레오티드를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 루프는 뉴클레오티드의 혼합물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "헤어핀"은 IR 또는 ITR 서열로부터 형성된 2차 또는 3차 구조를 포함하는 전체 DNA 구조뿐만 아니라 임의의 DNA 구조를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "헤어핀화" DNA 분자는 DNA 분자에 하나 이상의 헤어핀이 형성되어 있는 DNA 분자를 지칭한다. 하나의 실시양태에서, 헤어핀은 상보적인 스템 및 루프를 포함한다. 가장 단순한 형태의 헤어핀은 상보적 스템 및 루프로 구성된다. 스템과 루프를 포함하는 구조는 "스템-루프", "스템 루프" 또는 "SL"로 지칭된다. 또 다른 실시양태에서, 헤어핀은 상보적인 스템과 루프로 구성된다. "분지형 헤어핀"은 분지 구조(예를 들어, 도 1에 도시된 바와 같음)를 형성하는 다중 스템-루프를 갖는 헤어핀의 하위 집합을 지칭한다. 헤어핀을 형성한 후 IR 또는 ITR은 헤어핀화된 ITR 또는 IR로 지칭될 수 있다. "헤어핀-말단" DNA 분자는 DNA 분자의 한쪽 말단에 헤어핀이 형성되어 있거나 DNA 분자의 2 말단 각각에 헤어핀이 형성되어 있는 DNA 분자를 지칭한다.
"전환점" 또는 "정점"은 ITR의 공간 말단에 있는 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 영역을 지칭한다. 전환점은 DNA 가닥의 전반적인 방향성이 역전되어 기원 스템의 두 개의 역평행 가닥을 제공하는 영역으로 작용한다. 또한, 전환점은 IR 또는 ITR 서열이 반전되거나 역상보되는 지점을 표시한다.
일부 실시양태에서, 1차 스팀 도메인 이후 ITR 부분은, 정규 이중 가닥 DNA와 대조적으로, 워블 및 불일치, 구조적 결함 또는 미비점, 예컨대 벌지 및 내부 루프를 포함하여, 둘로 접힐 때, 비-왓슨-크릭 기반 구조 요소를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 인코딩할 수 있다(예를 들어, 도 1 참조). "벌지"는 하나의 가닥에서 하나 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 함유하는 반면, "내부 루프"는 상부 및 하부 가닥 모두에 하나 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 함유한다. 대칭 내부 루프는 나선을 비틀거나 구부릴 수 있는 벌지 및 비대칭 내부 루프보다 나선을 덜 왜곡하는 경향이 있다. 일부 실시양태에서, 스템에서 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드는 비표준 수소 결합 및 스태킹과 같은 다양한 구조적 상호작용에 관여할 수 있으며, 이는 추가적인 열역학적 안정성 및 기능적 다양성에 도움을 준다. 이론에 얽매이지 않고, IR 스템 및 루프의 구조적 다양성은 복잡한 2차 구조 및 기능적 다양성으로 이어지는 것으로 생각된다.
일부 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에 대한 헤어핀은 1차 스템을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에 대한 헤어핀은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 스템을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에 대한 헤어핀은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 루프를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에 대한 헤어핀은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 내부 루프를 포함한다. 추가 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에 대한 헤어핀은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 벌지를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에 대한 헤어핀은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 분지형 헤어핀을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에 대한 헤어핀은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50 정점을 포함한다. 추가 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에 대한 헤어핀은 임의의 수의 스템, 분지형 헤어핀, 루프, 벌지, 정점, 및/또는 내부 루프를, 임의의 조합으로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자의 헤어핀 구조는 대칭 오버행에 의해 형성된다. 대칭 오버행을 얻기 위해서, 5' 스템 영역에서의 변형은, 변형된 5' 위치(들)가 변형된 3' 위치(들)과 염기 쌍(들)을 형성할 수 있도록, 스템 영역의 해당 위치에서 동계(cognate) 3' 변형을 필요로 할 것이다. 대칭 오버행을 형성하기 위한 이러한 변형은 출원 당시의 최신 기술과 조합하여 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, 위치 23에서 A의 삽입에 의해 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 BstNBI 제한 부위를 생성함으로써, wt AAV2 ITR(예를 들어, 서열번호:162)에 대해 위치 105에서 T의 삽입을 필요로 할 것이다.
일부 실시양태에서, 헤어핀화된 ITR 쌍으로부터의 5' 및 3' 헤어핀화된 ITR은 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 역평행 제한 부위를 보유하도록 상이한 역상보 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있지만(예를 들어, 닉킹이 하부 가닥 5' 오버행을 초래하게 하는 5' ITR 및 닉킹이 하부 가닥 3' 오버행을 초래하게 하는 3' ITR), 여전히 동일한 3차원 공간 조직을 갖는 바, 두 ITR이 동일한 전체 3D 형태를 초래하는 돌연변이를 갖도록 한다.
일부 실시양태에서, 본원에 사용하기 위한 헤어핀화된 ITR은, 1차 스템 도메인, 스템, 분지형 헤어핀, 루프, 벌지 또는 내부 루프로부터 선택되는 영역 중 임의의 하나 이상에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드의 변형(예를 들어, 결실, 치환 또는 부가)을 포함할 수 있다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 우측 헤어핀화된 ITR에서 뉴클레오티드는 A에서 G, C 또는 T로 치환되거나, 결실되거나. 하나 이상의 뉴클레오티드가 부가될 수 있으며; 좌측 헤어핀화된 ITR에서 뉴클레오티드는 T에서 G, C 또는 A로 변경되거나, 결실되거나, 하나 이상의 뉴클레오티드가 부가될 수 있다.
일부 실시양태에서, CpG 모티프의 발생을 대체하거나 격감시킴으로써; (i) 바이러스 야생형 ITR과 비교하여 수용체의 톨 유사 패밀리(TLR)(예를 들어, TLR9)에 대한 이러한 변형된 헤어핀화된 ITR의 결합을 감소 또는 제거하고/하거나, (ii) 전사적으로 활성인 CpG 섬(CpG island)을 제거함으로써 ITR 전사 활성을 감소 또는 줄이기 위해서, 본원에 사용하기 위한 헤어핀화된 ITR은, 1차 스템 도메인, 스템, 분지형 헤어핀, 루프, 벌지 또는 내부 루프로부터 선택되는 영역 중 임의의 하나 이상에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드의 변형(예를 들어, 결실, 치환 또는 부가)을 포함할 수 있다. 전사적으로 활성인 CpG 섬은 통상적으로 문헌 [Gardiner-Garden M, Frommer M. CpG Islands in vertebrate genomes. J Mol Biol 1987;196:261-282]에 기재된 바와 같이, 50% 초과의 C + G 비율 및 60% 이상의 관찰 대 예상 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 서열로 정의된다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 우측 헤어핀화된 ITR에서 뉴클레오티드는 G 또는 C에서 A 또는 T로 치환되거나, 결실되거나, C와 G 사이 또는 G와 C 사이에 하나 이상의 뉴클레오티드가 부가될 수 있고; 좌측 헤어핀화된 ITR에서 뉴클레오티드는 C 또는 G에서 T 또는 A로 변경되거나, 결실되거나, C와 G 사이 또는 G와 C 사이에 하나 이상의 뉴클레오티드가 부가될 수 있다. 하나의 구체적인 실시양태에서 헤어핀화된 ITR은 하기 CpG 격감된 서열을 포함한다:
Figure pct00047
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자의 헤어핀화된 ITR은 1차 스템을 포함할 수 있고, 여기서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 그 초과의 상보적 염기 쌍은, 1차 스템 도메인이 더 짧으면서 더 낮은 접힘의 자유 에너지를 갖도록, 1차 스템 도메인의 각각으로부터 제거된다. 간략하게는, 이러한 실시양태에서, 1차 스템 도메인의 일부에서 염기가 제거되면, 1차 스템 도메인의 상보적 염기 쌍도 제거되어 전체 1차 스템 도메인이 단축된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자의 헤어핀화된 ITR은 1차 스템을 포함할 수 있고, 여기서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 그 초과의 상보적 염기 쌍은, 1차 스템 도메인이 더 길면서 더 높은 접힘의 자유 에너지를 갖도록, 1차 스템 도메인의 각각으로부터 도입된다. 간략하게는, 이러한 실시양태에서, 1차 스템 도메인의 일부에 염기가 도입되면, 1차 스템 도메인의 상보적 염기 쌍도 도입되어 전체 1차 스템 도메인이 길어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자의 헤어핀화된 ITR은 1차 스템을 포함할 수 있고, 여기서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 그 초과의 상보적 염기 쌍은, 1차 스템 도메인이 더욱 G/C 풍부하면서 더 높은 접힘의 자유 에너지를 갖도록, 1차 스템 도메인의 각각으로부터, A 또는 T에서 G 또는 C로 치환된다. 간략하게는, 이러한 실시양태에서, 1차 스템 도메인의 일부에 염기가 치환(예를 들어 T에서 G)되면, 1차 스템 도메인의 상보적 염기 쌍도 치환(예를 들어, A에서 C)되어 전체 1차 스템 도메인 G/C 함량이 증가한다.
추가 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자의 헤어핀화된 ITR은 1차 스템을 포함할 수 있고, 여기서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 그 초과의 상보적 염기 쌍은, 1차 스템 도메인이 CpG 모티프를 함유하지 않거나 덜 함유하면서, 기준 DNA(예를 들어, 동일한 DNA 분자이지만 CpG 모티프를 포함하는 변형되지 않은 1차 스템 서열을 가짐)와 비교하여 더 적은 전사적으로 활성인 CpG 섬 및/또는 바이러스 ITR보다 더 낮은 TLR9 결합 성향을 갖도록, 1차 스템 도메인의 각각으로부터, G 또는 C에서 A 또는 T로 치환되거나, 결실되거나, C 및 G 사이 또는 G 및 C 사이에 하나 이상의 뉴클레오티드가 부가된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자의 헤어핀화된 ITR은 1차 스템을 포함할 수 있고, 여기서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 그 초과의 상보적 염기 쌍은, RAP(예를 들어, Rep)가 더 이상 1차 스템 도메인에 효율적으로 결합할 수 없도록, 1차 스템 도메인의 각각으로부터 G 또는 C에서 A 또는 T로 치환된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자의 헤어핀화된 ITR은 1차 스템을 포함할 수 있고, 여기서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 또는 그 초과의 상보적 염기 쌍은, 1차 스템 도메인이 보다 G/C 풍부하면서 접힘의 더 높은 자유 에너지를 가져서 RAP(예를 들어, Rep 또는 NS1)가 더 이상 1차 스템 도메인에 효율적으로 결합할 수 없도록, 1차 스템 도메인의 각각으로부터 A 또는 T에서 G 또는 C로 치환된다.
일부 실시양태에서, 전체 wt ITR 서열이 여전히 벡터에 존재하는 한편, 본원에 제공된 DNA 분자에서 헤어핀화된 ITR 서열은 전장 WT 바이러스 ITR 서열에 비해 1 내지 40개의 뉴클레오티드 결실을 가질 수 있다. 예를 들어, AAV2 ITR과 같은 대칭 ITR에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위가 정점으로부터 각각 25개 염기로 떨어져 있는 경우, 오버행의 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위 이후의 부분은, 섹션 5.2.3 및 5.2.4에 기재된 바와 같이 닉킹 엔도뉴클레아제(또는 닉킹 엔도뉴클레아제 및 제한 효소)와 항온처리하고, 변성한 후 DNA 분자로부터 제거될 것인 바, wt IR 서열일 필요가 없다. 특정 실시양태에서, 전체 wt ITR 서열이 여전히 벡터에 존재하는 한편, 본원에 제공된 DNA 분자에서 헤어핀화된 ITR 서열은 전장 WT 바이러스 ITR 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 뉴클레오티드 결실을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위는 ITR 스템 영역에 존재하는 단리된 뉴클레오티드 서열의 예측된 용융 온도에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, 예상 용융 온도는 40-95℃ 사이이다. 추가 실시양태는 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위에 대한 것이며, 용융 온도를 고려한 실시양태는 상기 섹션 5.2.3, 5.2.4, 5.2.5 및 5.3.2에 기재되어 있다.
하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자에서 헤어핀화된 ITR의 스템 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 길이 및 GC 함량은, 온도가 약 4℃로 유지될 때 헤어핀이 형성되도록, 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 추가로 변형된다. 예를 들어, 구조 요소의 뉴클레오티드 서열은 바이러스 ITR의 야생형 서열과 비교하여 변형될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 스템의 길이 및 GC 함량은, 온도가 전체 ITR의 용융 온도보다 약 10℃ 이상 낮게 유지될 때, 헤어핀이 형성되도록, 디자인된다. 용융 온도가, 안정적인 보관을 보장하기 위해 헤어핀화된 ITR을 50℃ 초과로 접힌 상태로 유지할 수 있을 만큼 충분히 높도록, 헤어핀의 용융 온도는 GC 함량, 1차 스템에 가장 가까운 접합부(예를 들어, 도 1의 번호 4) 및 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위 사이의 거리, 또는 서열 불일치 또는 루프를 변경함으로써 디자인될 수 있다. 스템의 실제 최적 길이는 최신 기술의 조합으로 본원에 따라 결정될 수 있는 ITR의 분지, 루프 및 암(arm)과 같은 마이크로 도메인 및 ITR의 서열에 따라 달라질 수 있다.
일부 실시양태에서, 헤어핀화된 ITR의 스템 영역은 클래스 II 닉킹 엔도뉴클레아제(예를 들어, 5'의 NNNN 다운스트림)에 대한 제한 부위를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 스템 영역은 클래스 II 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위를 함유하지 않는다.
일부 실시양태에서, 헤어핀화된 ITR의 스템 영역은 클래스 I 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 헤어핀화된 ITR의 스템 영역은 클래스 III, IV 또는 V 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위를 인코딩한다. 도 4는 헤어핀의 1차 스템에서 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위의 다양한 예시적 배열을 도시한다.
일부 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에서 발현 카세트는 섹션 5.3.3에 기재된 발현 카세트의 임의의 실시양태일 수 있다. 특정 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에서 ITR은 섹션 5.3.1에 기재된 IR 또는 ITR의 임의의 실시양태일 수 있다. 추가 실시양태에서, ITR, 발현 카세트 및 제한 효소 또는 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위 간의 배열은 섹션 5.2.3, 5.2.4, 5.2.5, 5.3.1, 5.3.2, 5.3.3 및 5.3.6에 기재된 바와 같은 임의의 배열일 수 있다.
일부 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA는 3' ITR뿐만 아니라 5' ITR에 공유 연결된 상부 가닥을 포함하고, 발현 카세트가 제1 닉과 제2 닉 사이에 있도록, 일단 ITR이 접히면, 하부 가닥은 하부 가닥의 양쪽 말단에서 2개의 닉(제1 및 제2 닉)이 측면에 위치되고, 여기서 제1 닉은 상부 가닥 5' ITR 헤어핀의 결과로서 상부 가닥의 병치된 5' 말단 및 하부 가닥의 3'말단 사이에 형성되고, 제2 닉은 상부 가닥 3' ITR 헤어핀의 결과로서 상부 가닥의 병치된 3' 말단 및 하부 가닥의 5'말단 사이에 형성된다.
일부 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA는 3' ITR뿐만 아니라 5' ITR에 공유 연결된 하부 가닥을 포함하고, 발현 카세트가 제1 닉과 제2 닉 사이에 있도록, 일단 ITR이 접히면, 상부 가닥은 상부 가닥의 양쪽 말단에서 2개의 닉(제1 및 제2 닉)이 측면에 위치되고, 여기서 제1 닉은 하부 가닥 3' ITR 헤어핀의 결과로서 하부 가닥의 병치된 3' 말단 및 상부 가닥의 5'말단 사이에 형성되고, 제2 닉은 하부 가닥 3' ITR 헤어핀의 결과로서 하부 가닥의 병치된 5' 말단 및 상부 가닥의 3'말단 사이에 형성된다.
일부 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA는 5' ITR에 공유 연결된 상부 가닥을 포함하고, 하부 가닥은 5' ITR에 공유 연결되어, ITR이 접힐 때, 제1 닉은 상부 가닥 5' ITR 헤어핀의 결과로서 상부 가닥의 병치된 5' 말단 및 하부 가닥의 3'말단 사이에서 하부 가닥에 인접하여 형성되고, 제2 닉은 하부 가닥 5' ITR 헤어핀의 결과로서 하부 가닥의 병치된 5' 말단 및 상부 가닥의 3' 말단 사이에서 상부 가닥에 인접하여 형성되며, 여기서 발현 카세트는 제1 및 제2 닉이 측면에 위치된다.
일부 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA는 3' ITR에 공유 연결된 상부 가닥을 포함하고, 하부 가닥은 3' ITR에 공유 연결되어, ITR이 접힐 때, 제1 닉은 하부 가닥 3' ITR 헤어핀의 결과로서 하부 가닥의 병치된 3' 말단 및 상부 가닥의 5' 말단 사이에서 상부 가닥에 인접하여 형성되고, 제2 닉은 상부 가닥 3' ITR 헤어핀의 결과로서 상부 가닥의 병치된 3' 말단 및 하부 가닥의 5' 말단 사이에서 하부 가닥에 인접하여 형성되며, 여기서 발현 카세트는 제1 및 제2 닉이 측면에 위치된다.
일부 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.4) 및 선행 4개 단락에 기재된 바와 같은 2개의 닉을 포함하는 헤어핀-말단 DNA는 닉을 측면에 둔 2개의 뉴클레오티드 사이에 공유 결합을 형성함으로써 닉을 보수하기 위해 결찰될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.4) 및 선행 4개의 단락에 기재된 2개의 닉 중 하나는 변성될 때 DNA 분자가 선형 단일 가닥 DNA 분자가 되도록 결찰되고 보수될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.4) 및 선행 4개의 단락에 기재된 2개의 닉은 변성될 때 DNA 분자가 원형 단일 가닥 DNA 분자가 되도록 결찰되고 보수될 수 있다.
일부 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에서 2개의 측방 ITR 쌍은 동일한 DNA 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에서 2개의 측방 ITR 쌍은 상이한 DNA 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에서 ITR 중 하나는 동일한 헤어핀-말단 DNA 분자에서 다른 ITR과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된다. 또 다른 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에서에서 제1 ITR 및 제2 ITR은, 예를 들어 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 둘 다 변형된다. 또 다른 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자의 제1 ITR 및 제2 ITR은 상이한 DNA 서열을 포함하고, 둘 다 변형된다. 추가 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에서 제1 ITR 및 제2 ITR은 상이한 DNA 서열을 포함하고, 둘 다 변형되며, 여기서 2개의 ITR에 대한 변형은 상이하다. 또 다른 추가 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에서 제1 ITR 및 제2 ITR은 상이한 DNA 서열을 포함하고, 둘 다 변형되며, 여기서 2개의 ITR에 대한 변형은 동일하다. 하나의 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에서 제1 ITR 및 제2 ITR은 동일한 DNA 서열을 포함하고 둘 다 변형되며, 여기서 2개의 ITR에 대한 변형은 상이하다. 하나의 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자에서 제1 ITR 및 제2 ITR은 동일한 DNA 서열을 포함하고, 둘 다 변형되며, 여기서 2개의 ITR에 대한 변형은 동일하다. 하나의 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 에서 제1 ITR 및 제2 ITR은 둘 다 변형된 ITR이고, 2개의 변형된 ITR은 동일하지 않다. 일부 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자는 비대칭인 2개의 ITR을 포함하고, 여기서 비대칭은 다른 ITR에서 반영되지 않는 하나의 ITR에서의 임의의 변화의 결과일 수 있다. 특정 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자는 비대칭인 2개의 ITR을 포함하고, 여기서 ITR은 어떤 식으로든 서로에 대해 상이하다. 특정 실시양태에서, 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함하여, 이 단락에 제공된 변형은 이 섹션(섹션 5.4)에서 상기한 임의의 그러한 변형일 수 있다.
하나의 양태에서, 본원에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자는 5'에서 3' 방향으로: 제1 IR, 관심 뉴클레오티드 서열 및 제2 IR을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 관심 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 섹션 5.3.3에서 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 섹션 3 및 이 섹션(섹션 5.4)을 포함하여 본원에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자는 발현 카세트를 포함하며, 여기서 발현 카세트는 섹션 3 및 5.3.3에 기재된 임의의 실시양태일 수 있다.
헤어핀-말단 DNA 분자는 dsDNA 및 ssDNA의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.4)에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자의 특정 부분은 dsDNA이다. 일부 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.4)에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자의 dsDNA 부분은 발현 카세트, ITR의 스템 영역 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.4)에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자의 특정 부분은 ssDNA이다. 추가 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.4)에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자의 dsDNA 부분 하나의 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.4)에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자의 dsDNA 부분은 헤어핀-말단 DNA 분자의 90%를 초과하여 차지한다. 또 다른 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.4)에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자의 dsDNA 부분은 헤어핀-말단 DNA 분자의 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 차지한다. 또 다른 실시양태에서, 이 섹션(섹션 5.4)에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자의 dsDNA 부분은 헤어핀-말단 DNA 분자의 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%를 차지한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자는 세포의 핵으로 효율적으로 표적화되거나 수송될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자는 ITR에서 형성된 압타머 및 핵 단백질 사이의 결합에 의해 세포의 핵으로 효율적으로 표적화되거나 수송될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자는, 핵에서 헤어핀-말단 DNA 분자의 존재도가 세포질에서의 것보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 높도록, 세포의 핵으로 효율적으로 표적화되거나 수송될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자는 핵에서 헤어핀-말단 DNA 분자의 존재도가 세포질에서의 것보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30배 더 높도록, 세포의 핵으로 효율적으로 표적화되거나 수송될 수 있다.
섹션(섹션 5.4)을 포함하여 본원에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자의 다양한 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자는 섹션 5.3.4에 기재된 바와 같은 RABS 및/또는 TRS 서열이 결여된다. 섹션(섹션 5.4)을 포함하여 본원에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자의 다른 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자는 섹션 5.3.4에 기재된 바와 같은 DNA 서열, 요소 또는 특징의 임의의 것 또는 임의의 조합이 결여된다.
섹션(섹션 5.4)을 포함하여 본원에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자의 실시양태인, 일부 추가 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자는 섹션 5.3.7에 기재된 순도와 관련하여 임의의 실시양태에서 단리된 헤어핀-말단 DNA 분자일 수 있다.
5.5 헤어핀-말단 DNA 분자의 기능적 특성
일부 실시양태에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 장기 생존을 증진한다. 일부 실시양태에서, ITR은 (예를 들어, 세포의 전체 수명 동안) 세포의 핵에서 핵산 분자의 영구적인 생존을 증진한다. 일부 실시양태에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 안정성을 증진한다. 일부 실시양태에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 분해를 억제하거나 방지한다.
일부 실시양태에서, ITR이 접힌 상태를 가정할 때, 이는, 예를 들어 37℃에서 1시간 초과 동안 엑소뉴클레아제 분해(예를 들어, 엑소뉴클레아제 V)에 대해 저항성이다. 하나의 실시양태에서, ITR이 접힌 상태를 가정할 때, 이는, 예를 들어 37℃에서 1시간 초과 동안 엑소뉴클레아제 분해(예를 들어, 엑소뉴클레아제 V)에 대해 저항성이다. 하나의 실시양태에서,헤어핀-말단 DNA 분자는 엑소뉴클레아제 분해(예를 들어, 엑소뉴클레아제 V에 의한 분해)에 대해 저항성이다. 또 다른 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자는 엑소뉴클레아제 분해(예를 들어, 엑소뉴클레아제 V에 의한 분해)에 대해 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10시간 이상 동안 저항성이다. 또 다른 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA 분자는 엑소뉴클레아제 분해(예를 들어, 엑소뉴클레아제 V에 의한 분해)에 대해 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9 또는 약 10시간 동안 저항성이다.
본 발명자들에 의해 예상치 못하게 발견된 바와 같이, 바이러스 ITR과 유사한 ITR을 갖는 듀플렉스 선형 DNA 벡터는, RAP를 필요로 하지 않고, 결과적으로 게놈 복제를 위한 RABS 또는 TRS 서열과 무관하게 제조될 수 있다. 따라서, RABS 및 TRS는 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열에서 선택적으로 인코딩될 수 있지만 요구되지는 않으며, ITR을 디자인하는 것과 관련하여 유연성을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자는 RABS를 포함하지 않는 ITR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자는 TRS를 포함하지 않는 ITR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자는 RABS 또는 TRS를 포함하지 않는 ITR을 포함한다. 추가 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자는 RABS, TRS 또는 RABS 및 TRS 둘 모두를 포함하는 ITR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자는 숙주 세포에서 안정하다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자는 장기간 배양 동안 숙주 세포에서 안정하다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자는 숙주 세포에 효율적으로 전달될 수 있다.
본원에 제공된 DNA 분자는 상기한 엑소뉴클레아제 분해에 대한 저항성 뿐만 아니라 구조와 관련하여 우수한 안정성을 갖는다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자의 구조는 실온에서 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 동안 보관한 후에도 동일하게 남아 있다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자의 앙상블 구조는 실온에서 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 동안 보관한 후에도 동일하게 남아 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자의 구조는 2, 3, 4, 5, 10 또는 20 주기의 변성/재생(예를 들어, 섹션 5.2.3에 기재된 바와 같은 변성 및 섹션 5.2.5에 기재된 바와 같은 재-어닐링) 후 동일하다. DNA 구조는 최소 에너지 또는 그 부근의 구조 앙상블에 의해 설명될 수 있다. 특정 실시양태에서, 앙상블 DNA 구조는 2, 3, 4, 5, 10 또는 20 주기의 변성/재생 후에 동일하다. 하나의 실시양태에서, 본원에 제공된 ITR 또는 IR로부터 형성된 접힌 헤어핀 구조는 2, 3, 4, 5, 10 또는 20 주기의 변성/재생 후에 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 접힌 헤어핀의 앙상블 구조는 2, 3, 4, 5, 10 또는 20 주기의 변성/재생 후에 동일하다.
5.6 헤어핀-말단 DNA 분자를 포함하는 전달 비히클
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 USPN 10,561,610에 기재된 바와 같이 하이브리도좀을 통해 전달될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자는 하이브리도좀을 통해 전달될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자는 지질 나노입자를 포함하는 지질 입자를 통해 전달될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 헤어핀-말단 DNA 분자는 지질 나노입자를 통해 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 지질 나노입자는 이온화 가능한 지질, 비-양이온성 지질(예를 들어, 인지질), 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 및 페길화(PEGylated) 지질로부터 선택되는 임의의 하나 이상의 지질을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 지질 입자는 이온화 가능한 지질, 비-양이온성 지질(예를 들어, 인지질), 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 및 페길화 지질로부터 선택되는 임의의 하나 이상의 지질을 포함하고, 여기서, 지질의 몰비는 이온화 가능한 지질에 대해 20 내지 70몰% 또는 40 내지 60몰%의 범위이고, 비-양이온성 지질의 몰%는 0 내지 30 또는 0 내지 15의 범위이고, 스테롤의 몰%는 20 내지 70 또는 30 내지 50의 범위이고, 페길화 지질의 몰%는 1 내지 6 또는 2 내지 5의 범위이다. 또 다른 실시양태에서, 지질 입자는 이온화 가능한 지질, 비-양이온성 지질(예를 들어, 인지질), 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 및 페길화 지질로부터 선택되는 임의의 하나 이상의 지질을 포함하고, 여기서, 지질의 몰비는 이온화 가능한 지질에 대해 40 내지 60몰%의 범위이고, 비-양이온성 지질의 몰%는 0 내지 15의 범위이고, 스테롤의 몰%는 30 내지 50의 범위이고, 페길화 지질의 몰%는 2 내지 5의 범위이다. 또 다른 실시양태에서, 지질 입자는 이온화 가능한 지질, 비-양이온성 지질(예를 들어, 인지질), 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 및 페길화 지질로부터 선택되는 임의의 하나 이상의 지질을 포함하고, 여기서, 지질의 몰비는 이온화 가능한 지질에 대해 20 내지 70몰%의 범위이고, 비-양이온성 지질의 몰%는 0 내지 30의 범위이고, 스테롤의 몰%는 20 내지 70의 범위이고, 페길화 지질의 몰%는 1 내지 6의 범위이다.
본원은 낮은 pH에서 핵산 카고(nucleic acid cargo)를 농축하고 막 연합 및 융합성(fusogenicity)을 추진시키기 위해 이온화 가능한 지질이 사용될 수 있음을 제공한다. 이러한 이온화 가능한 지질은 본원에 제공된 DNA 분자의 조성물 및 방법을 위한 전달 비히클의 일부로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 산성 조건, 예를 들어 pH 6.5 이하에서 양전하를 띠거나 양성자화되는 적어도 하나의 아미노 기를 포함하는 지질이다. 일부 실시양태에서, 지질이 생리학적 pH(예를 들어, pH 7.4) 이하의 pH에서 양전하를 띠고, 예를 들어 생리학적 pH 이상의 제2 pH에서는 중성이도록, 이온화 가능한 지질은 적어도 하나의 양성자화 가능 또는 탈양성자화 가능한 기를 갖는다. 당업자는 pH의 함수로서 양성자의 첨가 또는 제거가 평형 과정이고, 전하를 띄거나 중성인 지질에 대한 기재는 우세한 종의 성질을 지칭하고, 모든 지질이 전하를 띄거나 중성인 형태로 존재할 필요가 없음을 이해할 것이다. 일반적으로, 이온화 가능한 지질은 약 4 내지 약 7 범위의 양성자화가능한 기의 pKa를 갖는다.
추가 예시적인 이온화 가능한 지질은 하기 PCT 특허 공개에 기재되어 있고, 이들 전부는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
Figure pct00048
일부 구체적인 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 MC3(6Z,9Z,28Z,3 lZ)-헵타트리아콘타-6,9,28,3 l-테트라엔-l9-일-4-(디메틸아미노) 부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다.
일부 구체적인 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 MC3(6Z,9Z,28Z,3 lZ)-헵타트리아콘타-6,9,28,3 l-테트라엔-l9-일-4-(디메틸아미노) 부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다.
일부 구체적인 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 (((4-하이드록시부틸)아자네디일) 비스(헥산-6,1-디일)비스(2-헥실데카노에이트)이다.
일부 구체적인 실시양태에서, 이온화 가능한 지질은 9-헵타데카닐 8-{(2-하이드록시에틸)[6-옥소-6-(운데실옥시)헥실]아미노}옥타노에이트이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자의 지질 나노입자 캡슐화는 디스테아로일-포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일-포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일-포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일-포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일-포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE) 및 디올레오일-포스파티디-l에탄올아민, 디팔미토일-포스파티딜-에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포-에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아리오일-2-올레오일-포스파티디에탄올 아민(SOPE) 및 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(트랜스DOPE)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지질을 포함한다.
본원에 제공된 전달 비히클은 본원에 제공된 DNA 분자를 세포로 전달하기 위한 것들을 포함하며, 이는 때때로 형질감염으로 지칭된다. 추가적인 유용한 형질감염 방법은 비제한적으로 지질-매개 형질감염, 양이온 중합체-매개 형질감염, 또는 인산칼슘 침전을 포함한다. 당업계에 잘 알려진 형질감염 시약이 본원에 제공되고, 비제한적으로 터보펙트(TurboFect) 형질감염 시약(서모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)), 프로-젝트(Pro-Ject) 시약(서모 피셔 사이언티픽), 트랜스패스(TRANSPASS)TM P 단백질 형질감염 시약(뉴 잉글랜드 바이오랩스), 채리엇(CHARIOT)TM 단백질 전달 시약(액티브 모티프(Active Motif)), 프로테오쥬스(PROTEOJUICE)TM 단백질 형질감염 시약(EMD 밀리포어(Millipore)), 293펙틴, 리포펙트 아민(LIPOFECT AMINE)TM 2000, 리포펙트 아민TM 3000(서모 피셔 사이언티픽), 리포펙트 아민TM(서모 피셔 사이언티픽), 리포펙틴(LIPOFECTIN)TM(서모 피셔 사이언티픽), DMRIE-C, 셀펙틴(CELLFECTIN)TM(서모 피셔 사이언티픽), 올리고펙트 아민(OLIGOFECT AMINE)TM(서모 피셔 사이언티픽), 리포펙트 에이스TM, 퓨젠(FUGENE)TM(스위스, 바젤, 로쉐(Roche)), 퓨젠TM HD(로쉐), 트랜스펙트 AMTM(위스콘신 매디슨, 프로메가(Promega), 트랜스펙탐(Transfectam)), TFX-10TM(프로메가), TFX-20TM(프로메가), TFX-50TM(프로메가), 트랜스펙틴(TRANSFECTIN)TM(캘리포니아, 허큘러스, 바이오라드(BioRad)), 사일런트펙트(SILENTFECT)TM(바이오라드), 이펙텐(Effectene)TM(캘리포니아, 발렌시아, 퀴아젠(Qiagen)), DC-콜(chol)(아반티 폴라 리피드(Avanti Polar Lipids)), 젠포터(GENEPORTER)TM(캘리포니아, 샌디에고, 젠 테라피 시스템즈), 다르마펙트(DHARMAFECT) 1TM(콜로라도, 라파예트, 다르마콘(Dharmacon)), 다르마펙트 2TM(다르마콘), 다르마펙트 3TM(다르마콘), 다르마펙트 4TM(다르마콘), 에스코트(ESCORT)TM III(미주리, 세인트루이스, 시그마(Sigma)) 및 에스코트TM IV(시그마 케미컬 코포레이션(Sigma Chemical Co.))를 포함한다.
일부 경우에서, 화학적 전달 시스템은, 예를 들어 양이온성 리포솜/미셀 또는 양이온성 중합체를 형성하기 위해 다중양이온성 화학물질에 의한 음전하를 띄는 핵산의 압밀(compaction)을 포함하는 양이온성 형질감염 시약을 사용함으로써 본원에 제공된 DNA 분자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 전달 방법에 사용되는 양이온성 지질은, 비제한적으로 1가 양이온성 지질, 다가 양이온성 지질, 구아니딘 함유 화합물, 콜레스테롤 유도체 화합물, 양이온성 중합체(예를 들어, 폴리(에틸렌이민), 폴리-L-라이신, 프로타민, 다른 양이온성 중합체) 및 지질-중합체 하이브리드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자는, 표적 세포로의 DNA 진입을 용이하게 하도록, 기계적, 전기적, 초음파, 유체역학 또는 레이저 기반 에너지를 인가함으로써 세포막에 일시적 침투를 만들어 전달된다. 예를 들어, 본원에 제공된 DNA 분자는 크기 제한 채널을 통해 세포를 압착함으로써 세포막을 일시적으로 파괴하거나 당업계에 알려진 다른 수단에 의해 전달될 수 있다.
본원은 본원에 제공된 DNA 분자가 약학 조성물로서 제조될 수 있음을 제공한다. 상기 조성물은 반드시 하나 이상의 활성 성분 및 대부분의 경우 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본원에 따른 약학 조성물 중 활성 성분(예를 들어, 대상체으로의 전이 또는 이식을 위해 본원에 제공된 DNA 분자 또는 본원에 제공된 DNA 분자를 포함하는 세포), 약학적으로 허용가능한 부형제, 및/또는 임의의 추가 성분의 상대적인 양은 치료되는 대상체의 신원, 크기 및/또는 상태에 따라 달라질 수 있고, 추가로 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 조성물은 0.1% 내지 99%(w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다. 예로서, 조성물은 0.1% 내지 100%, 예를 들어 0.5 내지 50%, 1-30%, 5-80%, 적어도 80%(w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
본원의 제형은 비제한적으로 식염수, 리포좀, 지질 나노입자, 중합체, 펩티드, 단백질, 본원에 제공된 DNA 분자를 포함하는 세포(예를 들어, 대상체으로의 전이 또는 이식용) 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제형은 엑소좀, 세포외 소포, 하이브리도좀 및 푸소좀(fusosome)을 포함할 수 있다.
내인성 핵산을 함유할 수 있는 바이러스 입자, 엑소좀 또는 하이브리도좀의 경우, DNA 분자의 정량화가 제형에 함유된 용량의 척도로 사용될 수 있다. 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 본원에 제공된 조성물의 DNA 분자 수를 결정할 수 있다. DNA 분자 수 적정을 수행하는 하나의 방법은 다음과 같다: 헤어핀-말단 DNA를 포함하는 바이러스 입자, 엑소좀 또는 하이브리도좀 조성물의 샘플을 먼저 디엔에이스로 처리하여 제조 공정에서 오염된 숙주 DNA를 제거한다. 그 후, 디엔에이스 저항성 입자를 열처리하여 캡시드로부터 게놈을 방출한다. 이어서, 방출된 게놈을 바이러스 게놈의 특정 영역(예를 들어, 폴리 A 신호)을 표적화 하는 프라이머/프로브 세트를 사용하여 실시간 PCR에 의해 정량화한다. 게놈 사본을 결정하기 위한 또 다른 적합한 방법은 정량적 PCR(qPCR), 특히 최적화된 qPCR 또는 디지털 액적 PCR이다.
본원에 기재된 약학 조성물의 제형은 약리학 분야에 알려져 있거나 이후에 개발될 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학 조성물"은 적어도 하나의 활성 성분 및 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물을 지칭한다.
일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 연합시키는 단계를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 어구 "활성 성분"은 일반적으로 본원에 제공된 DNA 분자 또는 본원에 제공된 DNA 분자를 포함하는 세포 또는 물질을 지칭한다.
본원에 기재된 DNA 분자 및 약학 조성물의 제형은 약리학 분야에 알려져 있거나 이후에 개발될 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 연합시킨 후, 필요하고/하거나 바람직할 경우, 생성물을 원하는 단일 또는 다중-용량 단위로 분할, 성형 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제형은 질환의 치료를 위한 발현 카세트에서 ORF의 발현을 위한 충분한 DNA 분자 또는 활성 성분을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원의 DNA 분자는 AAV Rep78과 같은 임의의 바이러스 단백질이 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 본원의 단리된 DNA 분자는 바이러스 단백질이 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 없다.
본원의 DNA 분자는, (1) 안정성을 증가시키고; (2) 세포 형질감염 또는 형질도입을 증가시키고; (3) 활성 성분의 지속 또는 지연 방출을 허용하고; (4) 생체 분포를 변경하고(예를 들어, DNA 분자 또는 DNA 분자를 포함하는 활성 성분을 특정 조직 또는 세포 종류에 대해 표적화); (5) 발현 카세트에서 ORF의 번역을 증가시키고; (6) 발현 카세트의 ORF에 의해 인코딩된 단백질의 방출 프로파일을 변경하고/하거나; (7) 발현 카세트의 ORF의 조절가능한 발현을 가능하게 하기 위해 하나 이상의 부형제 또는 희석제를 사용하여 제형화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 부형제는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 순수할 수 있다. 일부 실시양태에서, 부형제는 인간 및 수의학 용도로 승인된다. 일부 실시양태에서, 부형제는 미국 식품의약국에 의해 승인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 부형제는 약학적 등급의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 부형제는 미국 약전(USP), 유럽 약전(EP), 영국 약전 및/또는 국제 약전의 기준을 충족할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 부형제는, 비제한적으로 임의의 모든 용매, 분산 매질, 희석제 또는 다른 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 방부제 등을 원하는 특정 투여 형태에 적합한 바와 같이 포함한다. 약학 조성물을 제형화하기 위한 다양한 부형제 및 조성물을 제조하기 위한 기술은 당업계에 알려져 있다(참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 통상적인 부형제 매질의 사용은 임의의 통상적인 부형제 매질이 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생성하거나 그렇지 않으면 약학 조성물의 임의의 다른 구성요소(들)과 유해한 방식으로 상호작용하는 것과 같이, 물질 또는 이의 유도체와 양립할 수 없는 경우를 제외하고는 본원의 범위 내에서 고려될 수 있다.
예시적인 희석제는 당업계에 알려져 있고 사용되는 것들을 포함한다(참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006.)
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자를 위한 약학 조성물은 적어도 하나의 불활성 성분을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "불활성 성분"은 제형에 포함된 약학 조성물의 활성 성분의 활성에 기여하지 않는 하나 이상의 작용제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원의 제형에 사용된 모든 불활성 성분, 전혀 사용되지 않은 불활성 성분 또는 사용된 일부의 불활성 성분은 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인되고 당업계에서 사용되는 그러한 것들 중 어느 하나일 수 있다.
5.7 사용 방법
본원은 본원에 제공된 DNA 분자가 발현 카세트의 ORF 또는 전이유전자를 발현을 위한 세포로 전달하는 데 사용될 수 있음을 제공한다. 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같은 ORF 또는 전이유전자는 효율적으로 전달될 수 있다. 본원은 본원에 제공된 DNA 분자가 발현 카세트의 ORF 또는 전이유전자를 인간 대상체에게 전달하는 데 사용될 수 있음을 제공한다. 섹션 5.3.3에 기재된 바와 같은 임의의 ORF 또는 전이유전자는 효율적으로 전달될 수 있다.
하나의 구체적인 실시양태에서, 발현을 위해 관심 유전자를 세포로 전달하는 방법은 본원에 제공된 DNA 분자를 세포에 형질감염시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 인간 일차 세포다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 일차 인간 혈액 세포이다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자는 섹션 5.6에 기재된 임의의 전달 비히클을 통해 세포로 형질감염될 수 있다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 발현을 위해 인간 대상체에게 관심 유전자를 전달하는 방법은 본원에 제공된 DNA 분자를 세포에 형질감염시키고, 세포를 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 인간 일차 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 일차 인간 혈액 세포이다. 하나의 실시양태에서, DNA 분자는 섹션 5.6에 기재된 임의의 전달 비히클을 통해 세포로 형질감염될 수 있다.
일부 실시양태에서 본원에 제공된 DNA 분자는 선행 3개 단락에 기재된 바와 같이 발현 카세트의 질환 교정 유전자를 세포 또는 인간 대상체에 전달함으로써 유전자 요법에 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 DNA 분자는 당업계에 알려진 바와 같이 형질감염시키기 어려운 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 형질감염시키기 어려운 것으로 알려진 그러한 세포는 활발하게 분열하지 않는 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 예를 들어 인간 일차 혈액 세포, 인간 일차 간세포, 인간 일차 뉴런, 인간 일차 근육 세포, 인간 일차 심근세포를 포함하는 인간 일차 세포일 수 있다.
5.7.1 숙주 세포
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본원의 핵산 구성물 또는 헤어핀 말단 발현 벡터로 형질전환, 형질감염, 형질도입 등에 민감한 임의의 세포 종류를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 헤어핀-말단 벡터는 대상 숙주 세포로 발현 카세트를 전달한다. 일부 실시양태에서, 대상 숙주 세포는, 예를 들어 혈액 세포, 줄기 세포, 조혈 세포, CD34+ 세포, 간 세포, 암 세포, 혈관 세포, 근육 세포, 췌장 세포, 신경 세포, 안구 또는 망막 세포, 상피 또는 내피 세포, 수지상 세포, 섬유아세포를 포함하는 인간 숙주 세포, 또는 비제한적으로 헤파틱(즉, 간) 세포, 폐 세포, 심장 세포, 췌장 세포, 장 세포, 횡격막 세포, 신장(즉, 콩팥) 세포, 신경 세포, 혈액 세포, 골수 세포를 포함하는 포유류 장기의 임의의 다른 세포, 또는 유전자 요법이 고려되는 대상체의 임의의 하나 이상의 선택된 조직이다. 하나의 양태에서, 대상 숙주 세포는 인간 숙주 세포이다.
본원은 또한 본원에 개시된 바와 같은 헤어핀-말단 벡터를 포함하는 상기 언급된 바와 같은 숙주 세포에 관한 것이다. 따라서, 당업자에게 자명한 바와 같이 목적에 따라 다수의 숙주 세포를 사용할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트를 포함하는 발현용 헤어핀-말단 벡터는 공여 서열이 염색체 통합체로서 유지되도록 숙주 세포로 도입될 수 있다. 용어 숙주 세포는 복제 중에 발생하는 돌연변이로 인해 모 세포와 동일하지 않은 모 세포의 임의의 자손을 포함한다. 숙주 세포의 선택은 공여 서열과 그 원천에 따라 크게 달라질 수 있다.
숙주 세포는 또한 포유류, 곤충, 식물 또는 진균 세포와 같은 진핵생물일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 숙주 세포는 인간 세포(예를 들어, 일차 세포, 줄기 세포 또는 불멸성 세포주)이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는, 본원에 개시된 바와 같은 발현 카세트의 발현용 헤어핀-말단 벡터에 생체외 투여된 후, 유전자 요법 사례 후에 대상체에게 전달될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 세포 종류, 예를 들어 체세포 또는 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 또는 혈액 세포, 예를 들어 T-세포 또는 B-세포 또는 골수 세포일 수 있다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 동종 세포이다. 일부 실시양태에서, 유전자 변형된 숙주 세포, 예를 들어 골수 줄기 세포, 예를 들어 CD34+ 세포 또는 유도 만능 줄기 세포는 치료 단백질의 발현을 위해 환자에게 다시 이식될 수 있다.
5.7.2 헤어핀-말단 DNA 분자를 사용한 성공적 유전자 발현에 대한 테스트
당업계에 잘 알려진 검정을 사용하여 시험관내 및 생체내 모델 모두에서 헤어핀-말단 DNA 분자에 의한 발현 카세트의 유전자 전달 효율을 테스트할 수 있다. 일부 실시양태에서, 헤어핀-말단 DNA에 의해 인코딩된 단백질의 발현 수준은 단백질의 mRNA 및 단백질 수준을 측정함으로써 당업자에 의해 평가될 수 있다(예를 들어, 역전사 PCR, 웨스턴 블롯 분석 및 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA)). 하나의 실시양태에서, DNA는 예를 들어 형광 현미경 또는 발광 플레이트 판독기에 의해 리포터 단백질의 발현을 검사함으로써 발현 카세트의 발현을 평가하는 데 사용될 수 있는 리포터 단백질을 포함한다. 생체내 적용의 경우 단백질 기능 검정을 사용해 주어진 전사물의 기능을 테스트하여 유전자 발현이 성공적으로 발생했는지 결정할 수 있다. 당업자는 시험관내 또는 생체내에서 헤어핀-말단 DNA 분자에 의한 전사물의 기능성을 측정하기 위한 최상의 테스트를 결정할 수 있을 것이다.
세포 또는 대상체에서 헤어핀-말단 DNA로부터의 유전자 발현의 효과는 적어도 0.5개월, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 10개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년, 적어도 20년 동안 지속될 수 있거나, 영구적일 수 있음이 본원에 고려된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 헤어핀-말단 DNA 분자는 숙주 세포에 대해 최적화된 코돈일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "코돈 최적화됨" 또는 "코돈 최적화"는, 해당 척추동물의 유전자에서 보다 자주 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 갖는 천연 서열(예를 들어, 원핵 서열) 중 적어도 하나, 하나 초과 또는 상당한 수의 코돈을 대체함으로써, 관심 척추동물, 예를 들어 마우스 또는 인간(예를 들어, 인간화)의 세포에서 향상된 발현을 위해 핵산 서열을 변형하는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 전형적으로 코돈 최적화는 원래 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는다. 최적화된 코돈은 예를 들어 압타젠(Aptagen)의 젠 포지(Gene Forge)® 코돈 최적화 및 맞춤 유전자 합성 플랫폼(압타젠 주식회사) 또는 공개적으로 이용가능한 또 다른 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다.
모든 특허 출원, 간행물(특허 및 특허 출원, 과학 문헌 또는 임의의 다른 간행물), 특허, 젠뱅크 인용 및 다른 데이터베이스 인용, 웹 페이지 공개, 상업 카탈로그 및 본원에 인용된 다른 참고 문헌은 그 전체가 참조로 포함된다.
6. 실시예
다수의 실시양태가 기재되었다. 그럼에도 불구하고, 이 섹션(즉, 섹션 6)의 다양한 실시예는 단지 예시의 목적으로 본원의 특정 실시양태를 설명하고 청구범위 또는 개시내용에 기재된 바와 같은 범위를 한정하지 않음을 이해할 것이다. 본원에 제공된 것의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
6.1 실시예 1 - 벡터를 인코딩하는 플라스미드의 제조
벡터를 인코딩하는 핵산 서열을 인 실리코(in silico)로 디자인하였다. 구성물 1은 좌측 역위 반복, 미니 인간 PGK 프로모터, 터보루크 ORF, SV40 폴리 (a) 및 우측 역위 반복에 대해 인코딩하고(
Figure pct00049
서열번호: 174), 여기서 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 4개의 제한 부위는 5' 상부 가닥 및 3' 하부 가닥에서 ITR 오버행을 초래하도록 배열된다. 구성물 2는 변형된 좌측 ITR, 인간 PGK 프로모터, 분비된 터보루크 ORF, SV40 폴리 (a), 우측 ITR 및 우측 ITR의 닉킹 엔도뉴클레아제 115 염기 쌍 다운스트림에 대한 이중 제한 부위에 대해 인코딩한다(
Figure pct00050
서열번호: 175). 구성물 1 및 2는 상업용 DNA 합성 판매 회사에 의해 pUC57 백본(각각 플라스미드 1 및 플라스미드 2)으로 합성 및 클로닝되었다.
플라스미드 1 및 2를 형질전환하고, 이어서 NEB안정 또는 MDS-42 균주에서 밤새 증폭한 후 상업용 플라스미드 단리 키트(뉴클레오본드 엑스트라 맥시 플러스(Nucleobond Xtra Maxi Plus) EF(마체레이 나겔(Macherey Nagel))를 사용하여 플라스미드를 단리하고 뉴클레아제가 없는 물에 용해하였다.
구성물 1의 경우: 구성물 1에 닉을 유도하기 위해, 닉킹 엔도뉴클레아제 Nt.BstNBI(6.2 U/μg DNA)를 1x Neb3.1 완충액 중 단리된 구성물 1에 첨가하고, 55℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플라스미드 백본으로부터 ITR 측면 전이유전자를 분리하기 위해서 닉킹된 플라스미드를 함유하는 반응 혼합물을 10분 동안 열 진탕기에서 90℃로 가열한 후, 혼합물을 실온으로 냉각되도록 30분 동안 놔두어서 단일 가닥 오버행 말단에서 ITR 접힘을 가능하게 하였다. 이어서, 반응 혼합물을 제한 효소 PvuII 및 RecBCD 엑소뉴클레아제 V(각각 닉킹된 플라스미드의 μg당 0.157 U 및 0.625 U) 둘 모두 뿐만 아니라 아데노신 트리포스페이트(1 mM의 최종 농도)로 보충하였다. 이어서, 반응 혼합물을 37℃에서 120분 동안 진탕기에 놓고 제한 효소가 백본 단편을 절단하고 엑소뉴클레아제가 백본 단편을 분해하게 하였다. 엑소뉴클레아제는 일반적으로 헤어핀-말단에 의해 보호되는 선형 단편을 분해하지 않는다. 마지막으로, 반응 혼합물을 타카라 뉴클레오스핀 겔(Takara NucleoSpin Gel) 및 PCR 클린업 키트를 사용하여 정제하고, 나머지 ITR 측면 벡터를 제조업체의 지침에 따라 용리하였다.
구성물 2의 경우: 닉을 유도하고 구성물 2를 선형화하기 위해, 닉킹 엔도뉴클레아제 Nt.BstNBI(0.62 U/μg DNA)를 1x Neb3.1 완충액 중 단리된 구성물 2에 첨가하고, 55℃에서 120분 동안 항온처리하였다. 플라스미드 백본으로부터 ITR 측면 전이유전자를 분리하기 위해서 닉킹된 구성물 2를 함유하는 반응 혼합물을 열순환기에서 95℃로 3분 동안 가열한 후, 열순환기에서 0.05℃/초의 기울기로 40℃로 냉각시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 엑소뉴클레아제 V(2.5 U/μg의 DNA)뿐만 아니라 아데노신 트리포스페이트(1 mM의 최종 농도)로 보충하였다. 그 후, 반응 혼합물을 37℃에서 120분 동안 진탕기에 놓고 제한 효소가 백본 단편을 절단하고 엑소뉴클레아제가 백본 단편을 분해하게 하였다. 엑소뉴클레아제는 일반적으로 헤어핀-말단에 의해 보호되는 선형 단편을 분해하지 않는다. 마지막으로, 반응 혼합물을 타카라 뉴클레오스핀 겔 및 PCR 클린업 키트를 사용하여 정제하고 나머지 ITR 측면 벡터를 제조업체의 지침에 따라 용리하였다.
닉킹, 변성/재생 및 분해 저항성 DNA 산물을 천연 아가로스 겔 전기영동에 의해 시각화하였다.
구성물 1의 경우, 아가로스 겔(도 6)은 레인 3의 닉킹된 플라스미드, 레인 4의 변성/재생 DNA 산물 및 레인 8의 분해 저항성 벡터의 단일 밴드를 보여준다. 접힌 ITR의 형성을 추가로 입증하기 위해, 플라스미드뿐만 아니라 변성/재생된 DNA 산물을 벡터의 미니 PGK 프로모터 영역에 단일 절단 부위를 갖는 제한 효소 SpeI로 분해시켰다. 도 6에서 볼 수 있듯이, SpeI 분해는 벡터를 절단하여, 레인 5에서 낮은 밴드의 이동을 야기하고, 엑소뉴클레아제 V로 처리 시, 접힌 안티센스 ITR에 의해 분해로부터 보호되는 백본이 남아 있는 동안 벡터 단편을 분해하였다. 변성/재생된 DNA가 백본에 2개의 절단 부위를 갖는 제한 효소 PvuII로 분해되고 엑소뉴클레아제 V 처리 후 원하는 산물만 남을 경우에는 그 반대가 된다(레인 8). 또한, 구성물 1 시작 물질은 SpeI 또는 PvuII로 선형화되어, SpeI의 경우 선형 DNA 가닥을 방출하고, PvuII로 2개의 단편을 방출한다. 전반적으로, 이는 대향하는 가닥에 배열된 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위를 추가로 각각 포함하는 2개의 역위 반복이 측면에 있는 발현 카세트를 포함하는 이중 가닥 DNA 분자가 닉킹에 이어서 DNA의 변성/재생에 의해 형성됨을 입증하였다. 이러한 헤어핀-말단 DNA 분자의 형성은 추가로 엑소뉴클레아제 V 분해에 대해 저항성인 것으로 나타났다.
3' ITR의 닉킹 엔도뉴클레아제 다운스트림에 대해 근접한 이중 제한 부위를 함유하는 구성물 2의 경우, 닉킹 엔도뉴클레아제 BstNBI를 이용한 처리는 원형 플라스미드의 선형화로 이어진다. 도 7에서 볼수 있듯이, 아가로스 겔은 레인 2에서 선형화된 DNA를 보여준다. 변성/재생 후, DNA 산물은 레인 3에서 볼 수 있고, RecBCD 엑소뉴클레아제 V를 이용해 분해된 후 분해 저항성 벡터의 단일 밴드는 레인 5에서 볼 수 있다. 접힌 ITR의 형성 및 플라스미드의 선형화를 추가로 입증하기 위해, 재생/변성된 DNA 산물을 백본에서 2개의 절단 부위를 갖는 PvuII로 분해시켰다. 엑소뉴클레아제 V 분해 후 추가 밴드가 검출되지 않았다. 이는 5' ITR의 업스트림 또는 3' ITR의 다운스트림으로 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 근접 이중 제한 부위를 통합함으로써 백본이 동시에 단편화될 수 있는 반면 역위 반복 섹션이 닉킹되어, 구식의 제한 부위에 의해 백본의 추가 분해가 이루어짐을 보여준다.
6.2 실시예 2 DNA 구성물의 변성/재생 반복
DNA 구성물의 접힘의 안정성을 평가하기 위해, 닉킹된 구성물 1 및 해당하는 헤어핀화된 벡터를 변성 및 어닐링의 다중 주기에 적용하였다. 제1 단계에서, 100 ng의 총 DNA를 1 μM Sybr 그린 I 염료와 함께 NEB 완충액 3.1에서 항온처리하고, 384 웰 PCR 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 밀봉하고, 콴타스튜디오(Quantstudio) 5 실시간 PCR 기계에서 수행된 여러 70-98℃ 가열 주기에 걸쳐 Sybr 그린 형광을 계속 모니터링하였다. (제조 중 가열 주기 외에) 벡터에 대한 3회의 가열 주기 및 닉킹된 구성물에 대한 4회의 주기 후, 샘플을 천연 아가로스 겔 전기영동에 의해 시각화하였다. 도 8a에서 볼 수 있듯이, 레인 2의 벡터에 대해 하나의 밴드가 존재했을 뿐 아니라 벡터 및 백본에 대응하는 밴드를 라인 3에서 볼 수 있었다. 또한, 도 8b 및 도 8c에서 용융 곡선은 모든 주기 내내 매우 유사하게 유지되는 뚜렷한 용융 지문을 보여준다.
6.3 실시예 3 벡터의 등온 형성
열 에너지에 의해 닉킹된 플라스미드로부터 벡터를 분리하는 것 외에, 화학적 변성화제를 사용한 등온 변성의 가능성을 테스트하였다. 구체적으로, 실시예 1의 닉킹된 구성물을 분리시키는 변성화제로서 작용하는 NaOH의 능력을 테스트하였다. 먼저 닉킹된 구성물(100 ng의 총 DNA)를 이전에 1M NaOH로 해당하는 pH 값으로 조정된 NEB 완충액 3.1 중 0.2 μM SYBR 그린 I 염료와 혼합하였다. 형광 신호를 플레이트 판독기를 사용하여 해당하는 pH 값에서 검출하였다. 도 9b에서 볼 수 있듯이, pH가 증가하여, 백그라운드 조정된 형광이 감소하며, 이는 변성된 DNA의 분율이 증가했음을 나타낸다. 그 후, 변성된 DNA의 pH를 HCl을 이용해 pH 7.9로 되돌리고, 샘플을 아가로스 전기영동 겔에 로딩하였다. 도 9a에서 볼 수 있듯이, 10.3 초과의 pH에서 DNA 구성물이 분해하였고, 해당하는 벡터에 대한 밴드를 포함하는 예상된 밴드를 형성하였다. 열 에너지를 사용하여 재생/변성된 후에 동일한 밴드를 볼 수 있다.
6.4 실시예 4 LNP 및 하이브리도좀의 형질감염
제조업체의 지침에 따라 나노어셈블러(Nanoassemblr)TM 미세유체 시스템(프리시젼 나노시스템즈(Precision NanoSystems)에서 지질 나노입자를 제조하였다. 원하는 제형에 따라, 이온화 가능한 지질(예를 들어, MC3), 양쪽이온성 지질(예를 들어, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일글레세로포스포콜린(DOPC), 막 무결성을 제공하기 위한 구성요소(예컨대, 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤) 및 접합 지질 분자(예컨대, PEG-지질, 예를 들어, 2000의 평균 PEG 분자량을 갖는, 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤("PEG-DMG"))로 구성된 미리 형성된 소포 접근법과 유사한 에탄올 용액을 적절한 몰비(예를 들어, 40:40:18:2)로 10 mM 총 지질의 농도로 제조하였다. 또한, 약 14의 DNA 대 지질 중량/중량 비율을 갖는 DNA 수용액을 pH 4.0의 25 mM 아세테이트 완충액에서 제조하였다. 제조 총 부피에 따라, 12 ml/분의 총 유속으로 유입구 스트림을 생성하는 데 1 및 3 ml 주사기를 사용하였다. 각각의 제형의 경우, DNA 수용액을 실온에서 3:1(Aq:Et)의 유속 비율의 에탄올-지질 용액과 혼합하였다. 그 후, 산물을 PBS에 대해 투석하여 잔류 에탄올을 제거할 뿐 아니라 pH를 7.4로 높였다.
엑소좀 제조를 위해, 세포를 관류 방식의 교반된 생물반응기에서 성장시켰고, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는, 문헌 [Nordin et al Methods in Molecular Biology, vol 1953. Humana Press, New York, NY(2019)]에 기재된 바와 같이 접선 유동 여과에 이어서 캅토코어(Captocore) 700 액체 크로마토그래피에 의해 엑소좀 단리를 수행하였다.
인간 배아 신장 세포(HEK-293T)를 10% FCS가 보충된 DMEM에서 배양하였다. 세포를 5% CO2-가습 항온처리기에서 37℃에서 성장시켰다. 루시퍼라아제 발현을 테스트하기 위해, 세포(2x104/웰)를 96-웰 플레이트에 시딩하고, 터보루크를 코딩하는 DNA 벡터의 100 ng, 10 ng 및 1 ng(0.37 pmol, 0.031 pmol, 0.001 pmol 및 0.001 pmol)로 48시간 동안 형질감염시켰다. US15/112,180에 개략된 바와 같이 지질 나노입자와 엑소좀을 융합함으로써 생성된 하이브리도좀을 사용하여 형질감염을 매개하였다. 비교로서, 세포를 추가로 지질 나노입자로 형질감염시켰다.
나노라이트 테크놀로지(NanoLight Technology)의 글럭 글로우(Gluc Glow) 검정 키트를 사용하여 형질감염 48시간 후 루시퍼라아제 발현 수준을 결정하였다. 형질감염된 세포를 함유하는 웰에서 배지 150 μl를 제거하고(웰에 50 μl의 배지 남음), 세포 용해 완충액(나노라이트 테크놀로지) 중 50 μl 코엘렌테라진을 50 μM의 코엘렌테라진의 최종 농도로 첨가하였다. 그 후, 어둠 속에서 진탕하면서, 세포를 실온에서 5분 동안 항온처리하였다. 루시퍼라아제 기질을 함유하는 세포 용해물을 백색 96-웰 플레이트(브랜드(BRAND))로 옮겼다. 루시퍼라아제 활성을 시너지엠엑스(SynergyMX) 플레이트 판독기(바이오텍(BioTek))를 사용하여 발광을 측정함으로써 결정하였고, 도 10에 도시하였다.
6.5 실시예 5 분열 및 비-분열 세포에서 발현
터보루크 리포터 유전자를 인코딩하는 개방형 해독틀을 2개의 ITR이 측면에 있는 발현 카세트에 포함하도록 구성물을 생성하였다. 시간 경과에 따른 벡터로부터의 터보루크의 발현을 각 세포 배양에서의 루시퍼라아제 활성에 기초하여 결정하였고, 이는 루시페라아제 활성이 벡터로부터의 유전자 발현에 기인함을 확인한다.
상세하게는, 인간 배아 신장 세포(HEK-293T)를 DMEM(10% FCS, 1% pen/strep) 및 2 mM 안정한 글루타민에서 배양하였다. 조사된 마우스 배아 섬유아세포(C57BL/6, 서모 피셔)를 DMEM(10% FCS, 1% pen/strep), 2 mM 안정한 글루타민 및 1mM 피루브산나트륨에서 배양하였다.
세포를 5% CO2-가습 항온처리기에서 37℃에서 성장시켰다. 세포(6x104/웰)를 0.1% 젤라틴 용액으로 코팅된 96-웰 플레이트에 시딩하고 실시예 1의 접힌 ITR DNA 벡터 1의 100 ng(0.13 pmol)로 형질감염시켰다. 제조업체의 지침에 따라 제트프라임(폴리플러스(PolyPlus)) 형질감염 시약을 사용하여 형질감염을 수행하였다. 형질감염 3일 후 배양 배지를 교체하였다. 루시퍼라아제 발현 수준을 글럭 글로우 검정 키트(나노라이트 테크놀로지)를 사용하여 형질감염 1일 후 시작하여 형질감염 후 다른 일자에 결정하였다. 형질감염된 세포를 함유하는 웰의 배지를 포스페이트 완충 식염수(50 μl)로 교체하고 세포 용해 완충액(나노라이트 테크놀로지) 중 50 μl 코엘렌테라진을 최종 농도 50 μM 코엘렌테라진으로 첨가하였다. 그 후 세포를 어둠 속에서 진탕시키면서 실온에서 5분 동안 항온처리하였다. 루시퍼라아제 기질을 함유하는 세포 용해물을 백색 96-웰 플레이트로 옮겼다. 분비된 터보루크에 대해 인코딩하는 구성물 2의 경우, 50 ul 샘플 상청액을 다른 일자에 제거하고 완전한 배지를 교환하였다. 상청액 샘플을 최종 농도 50 μM의 코엘렌테라진으로 2분 동안 항온처리하였다. 루시퍼라아제 활성을 시너지엠엑스 플레이트 판독기(바이오텍)를 사용하여 발광을 측정함으로써 결정하였다. 배경 분석을 위해, 미처리 세포로부터의 생물발광을 상기 언급된 프로토콜에 따라 측정하였다. 도 11a 및 도 11b에서 볼 수 있듯이, 비-분비된 터보루크를 발현하는 구성물 1의 경우, 루시퍼라아제 활성은 2일차에 분열 세포에서 최고조에 달하는 한편, 비-분열 세포에서는 발현이 계속 증가한다. 도 11c 및 도 11d에서 볼 수 있듯이, 분비된 터보루크를 인코딩하는 구성물 2의 경우, 루시퍼라아제 활성은 2일차에 분열 세포에서 최고조에 달하는 반면, 비-분열 세포에서는 발현이 증가한 후, 9일 동안 안정적으로 유지된다. 직접적인 비교로서, 구성물 2를 인코딩하는 완전한 원형 플라스미드의 등몰량도 형질감염하였고, 도 11c 및 도 11d에서 볼 수 있듯이, 일반적으로 더 낮은 루시퍼라아제 활성이 기록되었고, 이는 접힌 ITR을 갖는 정제된 구성물 2의 개선된 핵 전달을 시사한다.
6.6 실시예 6 ITR을 함유하는 DNA 플라스미드의 구성물
상업적 DNA 합성 판매 회사에 의해 일상적으로 제공되는 올리고뉴클레오티드의 드 노보 무세포 합성은 맞춤형 벡터 및 벡터 라이브러리의 빠르고 경제적인 제조를 가능하게 하지만, 특히 유사한 역위 반복의 다중 섹션이 존재하는 경우(발현 카세트가 측면에 있는 좌측 ITR 및 우측 ITR에서와 같음), 긴 역위 반복을 함유하는 서열의 드 노보 합성은 시련이 될 수 있다. 따라서, 플라스미드를 함유하는 ITR의 조립을 가능하게 하는 전략이 고안되었다. 많은 바이러스 ITR은 각각의 ITR(즉, B19V ITR의 BssHII 또는 AAV2 ITR의 BsaHI)의 대략 중간에서 제한 효소 부위를 함유하고, 인공 ITR은 중앙 제한 부위를 수반하도록 디자인될 수 있다. 구성물의 제조가능성을 증가시키기 위해, ITR 서열은 ITR 특이적 제한 효소 부위에 가깝게 분할되고(즉, 좌측 ITR은 분할 L1 및 분할 L2이고, 우측 ITR은 분할 R1 및 분할 R2임), 별도로 제조된다. 다중 클로닝 부위 및 항생제 저항성 카세트 또는 복제 기점을 갖는, 하나가 분할 ITR R2를 인코딩하고, 다른 하나가 분할 ITR L2를 인코딩하는, 2개의 제1 유전자 단편을 생성함으로써, 도 12에 도시된 바와 같이, 드 노보 유전자 단편이 조립되고 결찰되어 증폭을 위해 변형된 원형 플라스미드를 만든다. 분할된 ITR(각각 R1 및 L1)의 나머지 절반뿐만 아니라 항생제 저항성 카세트 및 복제 기점을 함유하는 제3 유전자 단편을 합성한다. 분할 ITR R2 및 L2 뿐만 아니라 결합된 다중 클로닝 부위를 암호화하는 1단계에서 생성된 플라스미드뿐만 아니라 제3 단편 둘 모두는 그 후 ITR 특이적 제한 효소(즉, HBoV ITR의 BssHII 또는 AAV2 ITR의 BsaHI)에 의해 분해될 수 있고, 이어서 흠집 없이 원형화하여 ITR뿐만 아니라 다중 클로닝 부위를 모두 함유하는 플라스미드를 형성한다. 그 후, 맞춤형 발현 카세트는 다중 클로닝 부위에서 벡터로 클로닝될 수 있다.
6.7 실시예 7 결찰 및 비-결찰 구성물의 장기간 발현
구성물 3은 5' 상부 가닥 및 3' 하부 가닥에서 ITR 오버행을 초래하도록 배열된 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 4개의 제한 부위를 갖는 구성물이다. 구성물 3은 변형된 좌측 ITR, 절단된 SFFV 프로모터, 마우스 카파 IgG 리더, 터보루크 ORF, bGH 폴리 (A) 신호 (a), 우측 ITR의 닉킹 엔도뉴클레아제 115 염기 쌍 다운스트림에 대한 이중 제한 부위에 대해 인코딩한다(
Figure pct00051
Figure pct00052
서열번호: 334). 구성물 3을 실시예 1의 구성물 2와 동일한 방법으로 제조하였다. 겔 및 PCR 클린업 키트로 정제한 후, 정제된 벡터를 T4 리가아제 및 T4 결찰 완충액과 제조업체의 지침에 따라 혼합하고, 25℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 완전한 결찰을 확인하기 위해, 결찰된 구성물의 샘플 pH를 100 mM 트리스-HCl(pH 8.8)로 조정하고, T5 엑소뉴클레아제를 혼합물에 첨가한 후, 이를 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 결찰된 구성물의 샘플을 물에 희석함으로써 결찰을 추가로 확인한 후, 포름아미드 및 로딩 염료를 첨가하였다. 이 혼합물을 65℃에서 5분 동안 항온처리한 후, 아가로스 겔에 로딩할 때까지 얼음 위에서 유지하였다. 결찰 단계 후, 결찰된 구성물을 겔 및 PCR 클린업 키트를 사용하여 재-정제하였다.
결찰을 확인하기 위해, 아가로스 겔을 사용하여 결과를 분석하였다. 아가로스 겔(도 20a)은 레인 2의 정제된 구성물, 레인 3의 결찰 후 리가아제 및 구성물 혼합물, 레인 4의 T5 엑소뉴클레아제 처리된 이전에 결찰된 구성물, 레인 5의 포름아미드 변성된, 이전에 결찰된 구성물 및 레인 6의 생성 재-정제 결찰 구성물을 보여준다. 아가로스 겔의 후반부는 결찰 완충액(레인 7), T5 엑소뉴클레아제 처리(레인 8), 포름아미드 변성(레인 9) 및 재-정제(레인 10)에서 비-결찰 구성물을 보여준다.
후속하여, 정제된 결찰 구성물, 비-결찰 구성물 및 원형 모 플라스미드를 실시예 4에 약술된 바와 같이 하이브리도좀뿐만 아니라 LNP에 로딩하였다. 결찰 구성물, 비-결찰 구성물 또는 모 원형 플라스미드를 캘슐화한 하이브리도좀으로 비-분할 HepRG 세포를 형질감염한 후 분비된 터보루크의 발현을 시간이 지남에 따라 모니터링하였다(도 20b). 원형 플라스미드를 사용한 형질감염으로부터의 발현이 빠르게 감소하였지만, 결찰 구성물 및 비-결찰 구성물은 시간 경과에 따라 안정적으로 유지되었다. 놀랍게도, 비-결찰 구성물로부터의 발현은 결찰 구성물을 사용한 형질감염에서 보여진 수준보다 더 높은 수준으로 관찰되었다.
6.8 실시예 8 LNP 및 하이브리도좀으로 형질감염 후 장기간 발현
터보루크 리포터 유전자를 인코딩하는 개방형 해독틀을 2개의 ITR이 측면에 있는 발현 카세트에 포함시키도록 구성물을 생성하였다. 시간 경과에 따른 벡터로부터 분비된 터보루크의 발현을 루시퍼라아제 활성에 기초하여 결정하였다.
상세하게는, 분화된 비-분할 HepRG 세포를 HepaRGTM 유지/대사 배지에서 유지하고, 실시예 7에 약술된 바와 같이 이전에 제조된 LNP 및 하이브리도좀으로 형질감염시켰다. 발현 기간을 분석하기 위해 루시퍼라아제 발현 수준을 실시예 7에 기된 바와 같이 비-분열 세포(도 21a)에 대해 상이한 시점에서 결정하였다. 루시퍼라아제 활성을 시너지엠엑스 플레이트 판독기(바이오텍)를 사용하여 발광을 측정함으로써 결정하였다. 배경 분석을 위해, 미처리 세포로부터의 생물발광을 상기 실시예 1에 기재된 프로토콜에 따라 측정하였다. 도 21a에서 볼 수 있듯이, 분비된 터보루크를 인코딩하는 구성물로 형질감염된 비-분열 세포의 경우, 루시퍼라아제 활성은 2개월 동안 안정적으로 유지된다.
6.9 헤어핀-말단 DNA를 인코딩하는 Cre를 이용한 형질감염
좌측 ITR, 닉킹 부위를 제거하도록 변형된 EF1a 프로모터, Cre-재조합효소 ORF, bGH 폴리 (A) 신호(a), 우측 ITR 및 우측 ITR의 닉킹 엔도뉴클레아제 115 염기 쌍 다운스트림에 대한 이중 제한 부위를 인코딩하는 구성물을 인 실리코로 디자인하였다. 구성물을 pUC 미니 백본으로 합성되고 복제되도록 정렬하였다. 헤어핀-말단 DNA를 실시예 1에서와 같이 원형 플라스미드로부터 제조하였고, 그 후 정제된 DNA 분자를 실시예 4에 약술된 바와 같이 하이브리도좀뿐만 아니라 LNP에 로딩하였다. 단클론성으로 확장된 HEK293-loxP-GFP-RFP(젠타겟(GenTarget)) 안정 세포주를 사용하여 형질감염된 세포의 백분율을 모니터링하였다. 성공적인 형질감염 시, Cre 재조합효소 단백질은 세포에서 발현되고, 뉴클레아제에 진입하고, 플록스드(floxed) GFP-스톱을 절제하여, 세포를 GFP 양성에서 RFP 양성으로 전환한다. 제트프라임으로 형질감염된 벡터는 양성 대조군으로 작용하였다. HEK293-loxP-GFP-RFP 세포를 96웰 플레이트에 플레이팅하고, 4가지 상이한 용량의 DNA로 형질감염시켰다. 72시간 후, 세포를 트립신화하고, RFP 발현에 대해 유세포측정법으로 분석하였다. 도 22에서 볼 수 있듯이, 최고 용량에서 하이브리도좀은 세포의 >85%를 성공적으로 형질감염시킨 반면, LNP와 양성 대조군인 제트프라임은 세포 집단의 제한된 형질감염 효율을 나타내었다.
6.10 실시예 10 RABS 치환
공정 및 형질감염 효율에 대한 AAV RBE의 효과를 조사하기 위해서, 우측 ITR, pUC ori, 암피실린 저항성 및 좌측 ITR을 인코딩하는 드 노보 DNA 백본을 디자인하고 합성할 뿐만 아니라 상품 판매 회사에 의해 카나마이신 저항성 벡터로 클로닝하였다. 벡터를 분해하고 합성된 단편을 카나마이신 백본으로부터 절제하고, 겔 추출에 의해 단리하였다. 이어서, 합성된 백본 단편을 정제하고, 분비된 터보루크를 인코딩하는 실시예 7의 발현 카세트를 합성된 백본과 결찰하여 플라스미드를 원형화하였다. 발현 카세트 사이에서 아래에 나타낸 좌측 및 우측 ITR을 인코딩하는 5개의 백본을 제조하고, Stabl3 박테리아에서 증폭시켰다. 그 후, 플라스미드를 Nt.BstNBI로 닉킹하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 헤어핀-말단 DNA를 제조하였다. 헤어핀-말단 DNA의 제조는 도 23에 도시된 바와 같이 아가로스 겔을 실행하여 확인하였다. 겔은 산물 또는 수율에서 확연한 차이를 나타내지 않았다. 다음으로, HepRG 세포를 제조업체 지침에 따라 제트프라임을 사용하여 50 ng의 정제된 헤어핀-말단 DNA로 형질감염시키고, 분비된 터보루크의 수준을 실시예 7에 기재된 바와 같이 수일 동안 모니터링하였다.
Figure pct00053
6.11 실시예 11 이중 닉킹 부위를 갖는 헤어핀-말단 DNA의 제조
DNA 단편을 (i) 우측 ITR, pUC ori 사이, (ii) pUC ori 및 암피실린 저항성 사이, 뿐만 아니라 (iii) 암피실린 저항성 및 좌측 ITR 사이에 이중 닉킹 부위를 함유하도록 드 노보 디자인하고 합성할 뿐만 아니라 상품 판매 회사에 의해 카나마이신 저항성 벡터로 클로닝하였다. 실시예 10과 유사하게, 그 후 ITR 및 백본 단편을 절제하고, 겔 정제하여 도 24b에 도시된 바와 같이 파이어플라이 루시퍼라아제 발현 카세트와 결찰시켰다(아래 해당 서열). 플라스미드를 증폭하고, 0.5 mg의 플라스미드를 닉킹 완충액 중 500 ng/ul의 Nt.BspQI 효소 NEB(40 ul)로 닉킹하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 후, 닉킹된 플라스미드를 33 mM의 NaOH를 첨가하여 변성시킨 후 41.6 mM 트리스 pH 7.2로 어닐링하였다. 그 후, 어닐링된 DNA 단편을 엑소뉴클레아제 V로 분해하였다. 각각의 단계의 샘플을 아가로스 겔에 로딩하였고, 도 25a에서 볼 수 있는 바와 같이, 닉킹 후에 플라스미드는 3개의 예상 단편(A, B 및 C)으로 분할되며, 이들 모두 이중 가닥 말단을 갖는다. 변성 및 어닐링 시, A 밴드는 약간 더 낮은 A1 밴드뿐만 아니라 A2/A3로 표지된 새로운 희미한 밴드로 추가로 단편화된다. 이는 도 25a에 도시된 바와 같이 산물로부터 오버행의 방출에 해당한다. 분해 후 밴드 A1만이 분해에 대해 저항성이다. 이어서, 분해 저항성 헤어핀-말단 DNA를 실시예 1에 기재된 바와 같이 정제하고, HEK293T 세포를 제조업체의 지침에 따라 제트프라임을 사용하여 형질감염시켰다. 48시간 후, 시너지엠엑스 플레이트 판독기(바이오텍)에서 스테디-글로(Steady-Glo) 발광 검정을 사용하여 루시퍼라아제 발현을 기록하였고, 도 25b에 도시하였다.
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
서열번호: 335.
6.12 실시예 12 헤테로-텔로메릭 HBOV 유래 ITR을 갖는 헤어핀화된 역위 반복 DNA
DNA 단편을 (i) 우측 HBOV-유래 ITR, pUC ori 사이, (ii) pUC ori 및 암피실린 저항성 사이, 뿐만 아니라 (iii) 암피실린 저항성 및 좌측 HBOV-유래 ITR 사이에 이중 닉킹 부위를 함유하도록 드 노보 디자인하고, 합성할 뿐만 아니라 상품 판매 업자에 의해 카나마이신 저항성 벡터로 클로닝하였다. 그 후, 실시예 10과 유사하게, ITR 및 백본 단편을 절제하고 겔 정제하여 파이어플라이 루시퍼라아제 발현 카세트 단편과 결찰시키고, 이전 실시예에 기재된 바와 같이 원형화하였다. 플라스미드를 증폭시키고, 0.5 mg의 플라스미드를 닉킹 완충액 중 500 ng/ul의 Nt.BspQI 효소 NEB(40 ul)로 닉킹하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 후, 닉킹된 플라스미드를 33 mM의 NaOH를 첨가하여 변성시켜, 오버행을 방출시킨 후, 41.6 mM 트리스 pH 7.2로 오버행을 어닐링하였다. 그 후, 어닐링된 DNA 단편을 RecBDC로 분해하였다. 각각의 단계를 샘플을 아가로스 겔에서 시각화하여 벡터의 제조를 확인하였다.
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
(서열번호: 337).
6.13 실시예 13 OriL-유래 ITR의 제조 및 형질감염
각각 Nt.BspQI 닉킹 부위가 측면에 있는 인간 OriL 서열(서열번호 29 및 도 4)로부터 유래된 좌측 및 우측 역위 반복을 포함하는 플라스미드를 디자인하였다. 발현 카세트는 미니 인간 PGK 프로모터, 분비된 터보루크 ORF, SV40 폴리 (a)를 포함하였다. 플라스미드를 형질전환한 후 NEB안정 균주에서 밤새 증폭시키고, 이어서 상업용 플라스미드 단리 키트(뉴클레오본드 엑스트라 맥시 플러스 EF(마체레이 나겔))를 사용하여 플라스미드를 단리하고 뉴클레아제가 없는 물에 용해하였다.
플라스미드를 닉킹 엔도뉴클레아제 Nt.BstNBI(6.2 U/μg DNA)를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 닉킹하였다. 그 후, 닉킹된 플라스미드를 함유하는 반응 혼합물을 3분 동안 열 진탕기에서 92℃로 가열하여, OriL-유래 ITR 측면 전이유전자를 플라스미드 백본으로부터 분리한 후, 혼합물을 실온으로 냉각되도록 30분 동안 놔두어서 단일 가닥 오버행 말단에서 ITR 접힘을 가능하게 하였다. 이어서 반응 혼합물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제한 효소 PvuII 및 RecBCD로 분해하였다. 마지막으로, 반응 혼합물을 타카라 뉴클레오스핀 겔 및 PCR 클린업 키트를 사용하여 정제하고, 나머지 ITR 측면 벡터를 제조업체의 지침에 따라 용리하였다. 상이한 제조 단계로부터의 샘플을 아가로스 겔 상에서 시각화하였다(도 26). 분해 저항성 벡터의 단일 밴드가 레인 5에 제시된다. 레인 4의 세 번째 밴드는 열진탕기에 의한 불완전한 변성을 나타내며, 반응 혼합물에 닉킹된 플라스미드를 남긴다. PvuII 및 RecBCD 첨가 시, 닉킹된 플라스미드는 성공적으로 분해된 한편, 헤어핀-말단 DNA는 남아있었다. 제조업체 프로토콜에 따라 제트프라임을 사용하여 정제된 구성물로 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 나노라이트 테크놀로지의 글럭 글로우 검정 키트를 사용하여 형질감염 48시간 후 상청액 중 루시퍼라아제 발현 수준을 결정하였다.
전술의 내용으로부터, 예시의 목적으로 특정 실시양태가 본원에 기재되었지만, 본원에 제공된 것의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 상기 지칭된 모든 참조문헌은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> ANJARIUM BIOSCIENCES AG <120> COMPOSITIONS OF DNA MOLECULES, METHODS OF MAKING THEREFOR, AND METHODS OF USE THEREOF <130> 14497-005-228 <150> 63/057,179 <151> 2020-07-27 <150> 63/139,486 <151> 2021-01-20 <160> 338 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn.Site: Nb.BbvCI; Format: bl <400> 1 ttgcccactc cccctcagcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgctg agggggagtg 120 ggcaa 125 <210> 2 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn. Site: Nb.BbvCI; Format: tl <400> 2 ttgcccactc ccgctgaggg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgccctc agcgggagtg 120 ggcaa 125 <210> 3 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary ITR - ssDNA overhang <400> 3 gctcgactcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg 60 ggcggcctca gtgagcgagt cgagc 85 <210> 4 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary ITR - ssDNA overhang <400> 4 gctcgactca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg 60 gcctcagtga gtcgagc 77 <210> 5 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary ITR - ssDNA overhang <400> 5 cgctgactca ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct 60 gagtcagcg 69 <210> 6 <211> 125 <212> DNA <213> AAV serotype 4 (AAV4) <220> <223> AAV4 right wt <400> 6 ttggccacat tagctatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agagggagtg 120 gccaa 125 <210> 7 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary ITR - ssDNA overhang <400> 7 cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc 60 cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcg 89 <210> 8 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary ITR - ssDNA overhang <400> 8 tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc 60 tcagtgagcg a 71 <210> 9 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary ITR - ssDNA overhang <400> 9 actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagt 59 <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary ITR - ssDNA overhang <400> 10 aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc t 51 <210> 11 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1 Left ITR <400> 11 ttgcccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 ggcaa 125 <210> 12 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1 Right ITR <400> 12 ttgcccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 ggcaa 125 <210> 13 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2 Left ITR <400> 13 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaa 125 <210> 14 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2 Right ITR <400> 14 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaa 125 <210> 15 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV3 Left ITR <400> 15 ttggccactc cctctatgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgcat agagggagtg 120 gccaa 125 <210> 16 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV3 Right ITR <400> 16 ttggccactc cctctatgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgcat agagggagtg 120 gccaa 125 <210> 17 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4 Left ITR <400> 17 ttggccactc cctctatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agagggagtg 120 gccaa 125 <210> 18 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4 Right ITR <400> 18 ctatgcgcgc tcgctcactc actcggccct ggagaccaaa ggtctccaga ctgccggcct 60 ctggccggca gggccgagtg agtgagcgag cgcgcataga gggagtggcc aa 112 <210> 19 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5 (accession No. NC_006152) Left ITR <400> 19 ctctcccccc tgtcgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120 cgcgacaggg gggagag 137 <210> 20 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5 (accession No. NC_006152) Right ITR <400> 20 ctctcccccc tgtcgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120 cgcgacaggg gggagag 137 <210> 21 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7 (accession No. NC_006260) Left ITR <400> 21 ttggccactc cctctatgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcat agagggagtg 120 gccaa 125 <210> 22 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7 (accession No. NC_006260) Right ITR <400> 22 ttggccactc cctctatgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcat agagggagtg 120 gccaa 125 <210> 23 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBOV (accession No. JQ923422) Left ITR <400> 23 gtggttgtac agacgccatc ttggaatcca atatgtctgc cggctcagtc atgcctgcgc 60 tgcgcgcagc gcgctgcgcg cgcgcatgat ctaatcgccg gcagacatat tggattccaa 120 gatggcgtct gtacaaccac 140 <210> 24 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBOV (accession No. JQ923422) Right ITR <400> 24 ttgcttatgc aatcgcgaaa ctctatatct tttaatgtgt tgttgttgta catgcgccat 60 cttagtttta tatcagctgg cgccttagtt atataacatg catgttatat aactaaggcg 120 ccagctgata taaaactaag atggcgcatg tacaacaaca acacattaaa agatatagag 180 tttcgcgatt gcataagcaa 200 <210> 25 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hB19 (accession No. AY386330) Left ITR <400> 25 tgggccagct tgcttggggt tgccttgaca ctaagacaag cggcgcgccg cttgatctta 60 gtggcacgtc aaccccaagc gctggccca 89 <210> 26 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hB19 (accession No. AY386330) Right ITR <400> 26 tgggccagcg cttggggttg acgtgccact aagatcaagc ggcgcgccgc ttgtcttagt 60 gtcaaggcaa ccccaagcaa gctggccca 89 <210> 27 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary ITR - ssDNA overhang <400> 27 ccatgcatcc ggctttaaac gggcaactgc gtctcattca cgttagagac tacaaccgtc 60 ggatgcatgg 70 <210> 28 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary ITR - ssDNA overhang <400> 28 ttcaaacctg ccgggggaga agcggcgttt tttcccggcc gccgcttctc ttcttctccc 60 gccgccggga aaaaaggcgg gagaagcccc ggcaggtttg aa 102 <210> 29 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary ITR - ssDNA overhang <400> 29 gtccgggcca tgcttcaaac ctgccggggc ttctcccgcc ttttttcccg gcggcgggag 60 aagtagattt ctcgtacctg catggcccgg ac 92 <210> 30 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2 Right ITR <400> 30 cttctcccgc cgccgggaaa aaaggcggga gaagccccgg caggtttgaa 50 <210> 31 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary ITR - ssDNA overhang <400> 31 ccagcgcttg gggttgacgt gccactaaga tcaagcggcg cgcgcgcgcc gcttgtctta 60 gtgtcaaggc aaccccaagc aagctgg 87 <210> 32 <211> 113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary ITR - ssDNA overhang <400> 32 ggttgactct gggccagctt gcttggggtt gccttgacac taagacaagc ggcgcgcgcg 60 cgccgcttga tcttagtggc acgtcaaccc caagcgctgg cccagagtca acc 113 <210> 33 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary ITR - ssDNA overhang <400> 33 cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcca aaggcccgac gcccgggctt tgcccgggcg 60 gcctcagtga gcgagcgagc gcg 83 <210> 34 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary ITR - ssDNA overhang <400> 34 cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gtttcgggcg 60 gcctcagtga gcgagcgagc gcg 83 <210> 35 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary ITR - ssDNA overhang <400> 35 cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 60 gagcgcg 67 <210> 36 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV2; Recogn.Site: Nb.BbvCI; Format: bl <400> 36 ttggccactc cccctcagcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgctg agggggagtg 120 gccaa 125 <210> 37 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV2; Recogn.Site: Nb.BbvCI; Format: tl <400> 37 ttggccactc ccgctgaggg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgccctc agcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 38 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nb.BbvCI; Format: bl <400> 38 ttggccactc cccctcagcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgctg agggggagtg 120 gccaa 125 <210> 39 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nb.BbvCI; Format: tl <400> 39 ttggccactc ccgctgaggg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgccctc agcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 40 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nb.BbvCI; Format: bl <400> 40 ttggccactc cccctcagcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgctg agggggagtg 120 gccaa 125 <210> 41 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nb.BbvCI; Format: tl <400> 41 ttggccactc ccgctgaggg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgccctc agcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 42 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nb.BbvCI; Format: bl <400> 42 ttggccacat tacctcagcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgctg agggggagtg 120 gccaa 125 <210> 43 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nb.BbvCI; Format: tl <400> 43 ttggccacat tagctgaggg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgccctc agcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 44 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV5; Recogn.Site: Nb.BbvCI; Format: bl <400> 44 ctctcccctc agccgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120 cgcggctgag gggagag 137 <210> 45 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV5; Recogn.Site: Nb.BbvCI; Format: tl <400> 45 ctctccccgc tgaggcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120 cgcctcagcg gggagag 137 <210> 46 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV7; Recogn.Site: Nb.BbvCI; Format: bl <400> 46 ttggccactc cccctcagcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgctg agggggagtg 120 gccaa 125 <210> 47 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV7; Recogn.Site: Nb.BbvCI; Format: tl <400> 47 ttggccactc ccgctgaggg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgccctc agcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 48 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn.Site: Nb.BsmI; Format: bl <400> 48 ttgcccactc cctgaatgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcat tcagggagtg 120 ggcaa 125 <210> 49 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn.Site: Nb.BsmI; Format: tl <400> 49 ttgcccactc cctctctgcg cattcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gaatgcgcag agagggagtg 120 ggcaa 125 <210> 50 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV2; Recogn.Site: Nb.BsmI; Format: bl <400> 50 ttggccactc cctgaatgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcat tcagggagtg 120 gccaa 125 <210> 51 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV2; Recogn.Site: Nb.BsmI; Format: tl <400> 51 ttggccactc cctctctgcg cattcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gaatgcgcag agagggagtg 120 gccaa 125 <210> 52 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nb.BsmI; Format: bl <400> 52 ttggccactc cctgaatgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgcat tcagggagtg 120 gccaa 125 <210> 53 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nb.BsmI; Format: tl <400> 53 ttggccactc cctctatgcg cattcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gaatgcgcat agagggagtg 120 gccaa 125 <210> 54 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nb.BsmI; Format: bl <400> 54 ttggccactc cctgaatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat tcagggagtg 120 gccaa 125 <210> 55 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nb.BsmI; Format: tl <400> 55 ttggccactc cctctatgcg cattcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gaatgcgcat agagggagtg 120 gccaa 125 <210> 56 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nb.BsmI; Format: bl <400> 56 ttggccacat taggaatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat tcagggagtg 120 gccaa 125 <210> 57 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nb.BsmI; Format: tl <400> 57 ttggccacat tagctatgcg cattcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gaatgcgcat agagggagtg 120 gccaa 125 <210> 58 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV5; Recogn.Site: Nb.BsmI; Format: bl <400> 58 ctctccccga atgcgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120 cgcgcattcg gggagag 137 <210> 59 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV5; Recogn.Site: Nb.BsmI; Format: tl <400> 59 ctctcccccc tgtcgcattc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120 tgcgacaggg gggagag 137 <210> 60 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV7; Recogn.Site: Nb.BsmI; Format: bl <400> 60 ttggccactc cctgaatgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcat tcagggagtg 120 gccaa 125 <210> 61 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV7; Recogn.Site: Nb.BsmI; Format: tl <400> 61 ttggccactc cctctatgcg cattcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gaatgcgcat agagggagtg 120 gccaa 125 <210> 62 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn.Site: Nb.BsrDI; Format: bl <400> 62 ttgcccactc ccgcaatgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcat tgcgggagtg 120 ggcaa 125 <210> 63 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn.Site: Nb.BsrDI; Format: tl <400> 63 ttgcccactc cctcattgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcaa tgagggagtg 120 ggcaa 125 <210> 64 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV2; Recogn.Site: Nb.BsrDI; Format: bl <400> 64 ttggccactc ccgcaatgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcat tgcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 65 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV2; Recogn.Site: Nb.BsrDI; Format: tl <400> 65 ttggccactc cctcattgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcaa tgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 66 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nb.BsrDI; Format: bl <400> 66 ttggccactc ccgcaatgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgcat tgcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 67 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nb.BsrDI; Format: tl <400> 67 ttggccactc cctcattgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgcaa tgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 68 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nb.BsrDI; Format: bl <400> 68 ttggccactc ccgcaatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat tgcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 69 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nb.BsrDI; Format: tl <400> 69 ttggccactc cctcattgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcaa tgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 70 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nb.BsrDI; Format: bl <400> 70 ttggccacat tagcaatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat tgcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 71 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nb.BsrDI; Format: tl <400> 71 ttggccacat tagcattgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcaa tgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 72 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV5; Recogn.Site: Nb.BsrDI; Format: bl <400> 72 ctctccgcaa tgtcgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120 cgcgacattg cggagag 137 <210> 73 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV5; Recogn.Site: Nb.BsrDI; Format: tl <400> 73 ctctccccca ttgcgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120 cgcgcaatgg gggagag 137 <210> 74 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV7; Recogn.Site: Nb.BsrDI; Format: bl <400> 74 ttggccactc ccgcaatgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcat tgcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 75 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV7; Recogn.Site: Nb.BsrDI; Format: tl <400> 75 ttggccactc cctcattgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcaa tgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 76 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn.Site: Nb.BssSI; Format: bl <400> 76 ttgcccacga gctctctgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcag agagctcgtg 120 ggcaa 125 <210> 77 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn.Site: Nb.BssSI; Format: tl <400> 77 ttgcccactc cctcgtggcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcca cgagggagtg 120 ggcaa 125 <210> 78 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV2; Recogn.Site: Nb.BssSI; Format: bl <400> 78 ttggccacga gctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagctcgtg 120 gccaa 125 <210> 79 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV2; Recogn.Site: Nb.BssSI; Format: tl <400> 79 ttggccactc cctcgtggcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcca cgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 80 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nb.BssSI; Format: bl <400> 80 ttggccacga gctctatgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgcat agagctcgtg 120 gccaa 125 <210> 81 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nb.BssSI; Format: tl <400> 81 ttggccactc cctcgtggcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgcca cgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 82 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nb.BssSI; Format: bl <400> 82 ttggccacga gctctatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agagctcgtg 120 gccaa 125 <210> 83 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nb.BssSI; Format: tl <400> 83 ttggccactc cctcgtggcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcca cgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 84 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nb.BssSI; Format: bl <400> 84 ttggccacga gagctatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agagctcgtg 120 gccaa 125 <210> 85 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nb.BssSI; Format: tl <400> 85 ttggccacat tctcgtggcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcca cgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 86 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV5; Recogn.Site: Nb.BssSI; Format: bl <400> 86 ctcacgagcc tgtcgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120 cgcgacaggc tcgtgag 137 <210> 87 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV5; Recogn.Site: Nb.BssSI; Format: tl <400> 87 ctctccctcg tgtcgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120 cgcgacacga gggagag 137 <210> 88 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV7; Recogn.Site: Nb.BssSI; Format: bl <400> 88 ttggccacga gctctatgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcat agagctcgtg 120 gccaa 125 <210> 89 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV7; Recogn.Site: Nb.BssSI; Format: tl <400> 89 ttggccactc cctcgtggcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcca cgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 90 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn.Site: Nb.BtsI; Format: bl <400> 90 ttgcccactc ccgcagtgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcac tgcgggagtg 120 ggcaa 125 <210> 91 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn.Site: Nb.BtsI; Format: tl <400> 91 ttgcccactc cctcactgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcag tgagggagtg 120 ggcaa 125 <210> 92 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV2; Recogn.Site: Nb.BtsI; Format: bl <400> 92 ttggccactc ccgcagtgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcac tgcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 93 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV2; Recogn.Site: Nb.BtsI; Format: tl <400> 93 ttggccactc cctcactgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag tgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 94 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nb.BtsI; Format: bl <400> 94 ttggccactc ccgcagtgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgcac tgcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 95 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nb.BtsI; Format: tl <400> 95 ttggccactc cctcactgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgcag tgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 96 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nb.BtsI; Format: bl <400> 96 ttggccactc ccgcagtgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcac tgcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 97 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nb.BtsI; Format: tl <400> 97 ttggccactc cctcactgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcag tgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 98 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nb.BtsI; Format: bl <400> 98 ttggccacat tagcagtgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcac tgcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 99 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nb.BtsI; Format: tl <400> 99 ttggccacat tagcactgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcag tgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 100 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV5; Recogn.Site: Nb.BtsI; Format: bl <400> 100 ctctccgcag tgtcgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120 cgcgacactg cggagag 137 <210> 101 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV5; Recogn.Site: Nb.BtsI; Format: tl <400> 101 ctctccccac tgccgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120 cgcggcagtg gggagag 137 <210> 102 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV7; Recogn.Site: Nb.BtsI; Format: bl <400> 102 ttggccactc ccgcagtgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcac tgcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 103 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV7; Recogn.Site: Nb.BtsI; Format: tl <400> 103 ttggccactc cctcactgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcag tgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 104 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn.Site: Nt.AlwI; Format: bl <400> 104 ttgcccactc cctcgatccg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcggat cgagggagtg 120 ggcaa 125 <210> 105 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn.Site: Nt.AlwI; Format: tl <400> 105 ttgcccactg gatctctgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcag 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cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgcat agatccagtg 120 gccaa 125 <210> 110 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nt.AlwI; Format: bl <400> 110 ttggccactc cctcgatccg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcggat cgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 111 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nt.AlwI; Format: tl <400> 111 ttggccactg gatctatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agatccagtg 120 gccaa 125 <210> 112 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nt.AlwI; Format: bl <400> 112 ttggccacat tagcgatccg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcggat cgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 113 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nt.AlwI; Format: tl <400> 113 ttggccacag gatctatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agatccagtg 120 gccaa 125 <210> 114 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV5; Recogn.Site: Nt.AlwI; Format: bl <400> 114 ctctcccccc tgtcgcgatc cctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagggat 120 cgcgacaggg gggagag 137 <210> 115 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV5; Recogn.Site: Nt.AlwI; Format: tl <400> 115 ctctcccccg gatcgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120 cgcgatccgg gggagag 137 <210> 116 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV7; Recogn.Site: Nt.AlwI; Format: bl <400> 116 ttggccactc cctcgatccg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcggat cgagggagtg 120 gccaa 125 <210> 117 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV7; Recogn.Site: Nt.AlwI; Format: tl <400> 117 ttggccactg gatctatgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcat agatccagtg 120 gccaa 125 <210> 118 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn.Site: Nt.BbvCI; Format: bl <400> 118 ttgcccactc ccgctgaggg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgccctc agcgggagtg 120 ggcaa 125 <210> 119 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn.Site: Nt.BbvCI; Format: tl <400> 119 ttgcccactc cccctcagcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgctg agggggagtg 120 ggcaa 125 <210> 120 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV2; Recogn.Site: Nt.BbvCI; Format: bl <400> 120 ttggccactc ccgctgaggg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgccctc agcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 121 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV2; Recogn.Site: Nt.BbvCI; Format: tl <400> 121 ttggccactc cccctcagcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgctg agggggagtg 120 gccaa 125 <210> 122 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nt.BbvCI; Format: bl <400> 122 ttggccactc ccgctgaggg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgccctc agcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 123 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nt.BbvCI; Format: tl <400> 123 ttggccactc cccctcagcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgctg agggggagtg 120 gccaa 125 <210> 124 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nt.BbvCI; Format: bl <400> 124 ttggccactc ccgctgaggg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgccctc agcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 125 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nt.BbvCI; Format: tl <400> 125 ttggccactc cccctcagcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgctg agggggagtg 120 gccaa 125 <210> 126 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nt.BbvCI; Format: bl <400> 126 ttggccacat tagctgaggg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgccctc agcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 127 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nt.BbvCI; Format: tl <400> 127 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ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agtctcagtg 120 gccaa 125 <210> 135 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV2; Recogn.Site: Nt.BsmAI; Format: tl <400> 135 ttggccactc cgtctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agacggagtg 120 gccaa 125 <210> 136 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nt.BsmAI; Format: bl <400> 136 ttggccactg agactatgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgcat agtctcagtg 120 gccaa 125 <210> 137 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nt.BsmAI; Format: tl <400> 137 ttggccactc cgtctctgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgcag agacggagtg 120 gccaa 125 <210> 138 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nt.BsmAI; Format: bl <400> 138 ttggccactg agactatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agtctcagtg 120 gccaa 125 <210> 139 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nt.BsmAI; Format: tl <400> 139 ttggccactc cgtctctgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcag agacggagtg 120 gccaa 125 <210> 140 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nt.BsmAI; Format: bl <400> 140 ttggccacag agactatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agtctcagtg 120 gccaa 125 <210> 141 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nt.BsmAI; Format: tl <400> 141 ttggccacat tgtctctgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg 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Recogn.Site: Nt.BsmAI; Format: tl <400> 145 ttggccactc cgtctctgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcag agacggagtg 120 gccaa 125 <210> 146 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn.Site: Nt.BspQI; Format: bl <400> 146 ttgcccactc ccgaagagcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgctc ttcgggagtg 120 ggcaa 125 <210> 147 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn.Site: Nt.BspQI; Format: tl <400> 147 ttgcccactc ccgctcttcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgaag agcgggagtg 120 ggcaa 125 <210> 148 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV2; Recogn.Site: Nt.BspQI; Format: bl <400> 148 ttggccactc ccgaagagcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgctc ttcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 149 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV2; Recogn.Site: Nt.BspQI; Format: tl <400> 149 ttggccactc ccgctcttcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgaag agcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 150 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nt.BspQI; Format: bl <400> 150 ttggccactc ccgaagagcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgctc ttcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 151 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nt.BspQI; Format: tl <400> 151 ttggccactc ccgctcttcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgaag agcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 152 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nt.BspQI; Format: bl <400> 152 ttggccactc 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV5; Recogn.Site: Nt.BspQI; Format: bl <400> 156 ctctcccgaa gagcgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120 cgcgctcttc gggagag 137 <210> 157 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV5; Recogn.Site: Nt.BspQI; Format: tl <400> 157 ctctcccgct cttcgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120 cgcgaagagc gggagag 137 <210> 158 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV7; Recogn.Site: Nt.BspQI; Format: bl <400> 158 ttggccactc ccgaagagcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgctc ttcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 159 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV7; Recogn.Site: Nt.BspQI; Format: tl <400> 159 ttggccactc ccgctcttcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgaag agcgggagtg 120 gccaa 125 <210> 160 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn.Site: Nt.BstNBI; Format: bl <400> 160 ttgcccactc cctctctgcg cgactcgctc gctcggtggg gcctgcggac caaaggtccg 60 cagacggcag agctctgctc tgccggcccc accgagcgag cgagtcgcgc agagagggag 120 tgggcaa 127 <210> 161 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV1; Recogn.Site: Nt.BstNBI; Format: tl <400> 161 ttgccgagtc cctctctgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcag agagggactc 120 ggcaa 125 <210> 162 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV2; Recogn.Site: Nt.BstNBI; Format: bl <400> 162 ttggccactc cctctctgcg cgactcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc 60 ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagtcgcgc agagagggag 120 tggccaa 127 <210> 163 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV2; Recogn.Site: Nt.BstNBI; Format: tl <400> 163 ttggcgagtc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggactc 120 gccaa 125 <210> 164 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nt.BstNBI; Format: bl <400> 164 ttggccactc cctctatgcg cgactcgctc gctcggtggg gcctggcgac caaaggtcgc 60 cagacggacg tgctttgcac gtccggcccc accgagcgag cgagtcgcgc atagagggag 120 tggccaa 127 <210> 165 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV3; Recogn.Site: Nt.BstNBI; Format: tl <400> 165 ttggcgagtc cctctatgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gctttgcacg tccggcccca ccgagcgagc gagtgcgcat agagggactc 120 gccaa 125 <210> 166 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nt.BstNBI; Format: bl <400> 166 ttggccactc cctctatgcg cgactcgctc actcactcgg ccctggagac caaaggtctc 60 cagactgccg gcctctggcc ggcagggccg agtgagtgag cgagtcgcgc atagagggag 120 tggccaa 127 <210> 167 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 left; Recogn.Site: Nt.BstNBI; Format: tl <400> 167 ttggcgagtc cctctatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agagggactc 120 gccaa 125 <210> 168 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nt.BstNBI; Format: bl <400> 168 ttggccacat tagctatgcg cgactcgctc actcactcgg ccctggagac caaaggtctc 60 cagactgccg gcctctggcc ggcagggccg agtgagtgag cgagtcgcgc atagagggag 120 tggccaa 127 <210> 169 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV4 right; Recogn.Site: Nt.BstNBI; Format: tl <400> 169 ttggccagag tcgctatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agagactctg 120 gccaa 125 <210> 170 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV5; Recogn.Site: Nt.BstNBI; Format: bl <400> 170 ctctcccccc tgtcgcgact cgctcgctcg ctggctcgtt tgggggggtg gcagctcaaa 60 gagctgccag acgacggccc tctggccgtc gcccccccaa acgagccagc gagcgagcga 120 gtcgcgacag gggggagag 139 <210> 171 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV5; Recogn.Site: Nt.BstNBI; Format: tl <400> 171 ctctcccccg agtcgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60 agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120 cgcgactcgg gggagag 137 <210> 172 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV7; Recogn.Site: Nt.BstNBI; Format: bl <400> 172 ttggccactc cctctatgcg cgactcgctc gctcggtggg gcctgcggac caaaggtccg 60 cagacggcag agctctgctc tgccggcccc accgagcgag cgagtcgcgc atagagggag 120 tggccaa 127 <210> 173 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> source: AAV7; Recogn.Site: Nt.BstNBI; Format: tl <400> 173 ttggcgagtc cctctatgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcat agagggactc 120 gccaa 125 <210> 174 <211> 1636 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Construct 1 encodes for a left inverted repeat, a mini human PGK promoter, a turboluc ORF, SV40 poly a and a right inverted repeat <400> 174 tgcgcgactc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt 60 gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagtc gcgcagagag gttaaaacca actagacaac 120 tttgtatatc tagagttggg gttgcgcctt ttccaaggca gccctgggtt tgcgcaggga 180 cgcggctgct ctgggcgtgg ttccgggaaa cgcagcggcg ccgaccctgg gtctcgcaca 240 ttcttcacgt ccgttcgcag cgtcacccgg atcttcgccg ctacccttgt gggccccccg 300 gcgacgcttc ctgctccgcc cctaagtcgg gaaggttcct tgcggttcgc ggcgtgccgg 360 acgtgacaaa cggaagccgc acgtctcact agtaccctcg cagacggaca gcgccaggga 420 gcaatggcag cgcgccgacc gcgatgggct gtggccaata gcggctgctc agcagggcgc 480 gccgagagca gcggccggga aggggcggtg cgggaggcgg ggtgtggggc ggtagtgtgg 540 gccctgttcc tgcccgcgcg gtgttccgca ttctgcaagc ctccggagcg cacgtcggca 600 gtcggctccc tcgttgaccg aatcaccgac ctctctcccc aggcaagttt gtacaaaaaa 660 gcgcggccgc ggcaggctgc caccatggaa accgatacac tgctgctttg ggtacttttg 720 ctgtgggtgc ccggcagtac gggcgacgcc gcacaaccag ctaggagagc agtccggagc 780 ctggtcccct cttccgaggc cgaggctgaa cggggaaagc tgccaggcaa gaaactcccc 840 ttagaggttc tcatcgagct ggaagcaaac gcacgcaagg ccggttgcac taggggctgc 900 ctcatctgcc tcagcaagat caaatgtaca gcaaagatga agaagtatat tcctggccgc 960 tgtgcagact acggaggcga caaaaaaaca ggacaagctg gtatagttgg cgccatcgta 1020 gatatccccg agattagtgg gttcaaggaa atggagccaa tggagcaatt cattgcacag 1080 gttgatagat gtgcggattg cactactggt tgccttaagg gcttggcgaa tgtcaagtgt 1140 agtgatcttc tgaaaaagtg gctacccggc cggtgtgcca ccttcgctga caaaatacag 1200 agcgaagtcg acaatattaa aggacttgcc ggggactaat gatagtgaca caaagtgacg 1260 cgtcctagag ctcgcactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 1320 gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 1380 attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 1440 agcaaggggg aggattggga agagaatagc aggcatgctg gggagggcgc tagcgcagga 1500 acccctttta atggagttgg cgagtccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 1560 gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 1620 gcgcagagat cgactc 1636 <210> 175 <211> 1796 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Construct 2 encodes for a modified left ITR, a human PGK promoter, a secreted turboluc ORF, SV40 poly-A, a right ITR and a double restriction sites for nicking endonuclease 115 base pairs downstream of the right ITR <400> 175 tgcgcgactc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt 60 gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagtc gcgcagagag gttaaaacca actagacaac 120 tttgtatatc tagagttggg gttgcgcctt ttccaaggca gccctgggtt tgcgcaggga 180 cgcggctgct ctgggcgtgg ttccgggaaa cgcagcggcg ccgaccctgg gtctcgcaca 240 ttcttcacgt ccgttcgcag cgtcacccgg atcttcgccg ctacccttgt gggccccccg 300 gcgacgcttc ctgctccgcc cctaagtcgg gaaggttcct tgcggttcgc ggcgtgccgg 360 acgtgacaaa cggaagccgc acgtctcact agtaccctcg cagacggaca gcgccaggga 420 gcaatggcag cgcgccgacc gcgatgggct gtggccaata gcggctgctc agcagggcgc 480 gccgagagca gcggccggga aggggcggtg cgggaggcgg ggtgtggggc ggtagtgtgg 540 gccctgttcc tgcccgcgcg gtgttccgca ttctgcaagc ctccggagcg cacgtcggca 600 gtcggctccc tcgttgaccg aatcaccgac ctctctcccc aggcaagttt gtacaaaaaa 660 gcgcggccgc ggcaggctgc caccatggaa accgatacac tgctgctttg ggtacttttg 720 ctgtgggtgc ccggcagtac gggcgacgcc gcacaaccag ctaggagagc agtccggagc 780 ctggtcccct cttccgaggc cgaggctgaa cggggaaagc tgccaggcaa gaaactcccc 840 ttagaggttc tcatcgagct ggaagcaaac gcacgcaagg ccggttgcac taggggctgc 900 ctcatctgcc tcagcaagat caaatgtaca gcaaagatga agaagtatat tcctggccgc 960 tgtgcagact acggaggcga caaaaaaaca ggacaagctg gtatagttgg cgccatcgta 1020 gatatccccg agattagtgg gttcaaggaa atggagccaa tggagcaatt cattgcacag 1080 gttgatagat gtgcggattg cactactggt tgccttaagg gcttggcgaa tgtcaagtgt 1140 agtgatcttc tgaaaaagtg gctacccggc cggtgtgcca ccttcgctga caaaatacag 1200 agcgaagtcg acaatattaa aggacttgcc ggggactaat gatagtgaca caaagtgacg 1260 cgtcctagag ctcgcactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 1320 gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 1380 attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 1440 agcaaggggg aggattggga agagaatagc aggcatgctg gggagggcgc tagcgcagga 1500 acccctttta atggagttgg cgagtccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 1560 gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 1620 gcgcagagat cgactcctcg gccacttgga ggggccgggg ggacgacgca atctggagtg 1680 gaaagaaccc ccgtctatgc ggcttaaagc acggccaggg aatagtggat caagtgtact 1740 gacatgtgcc ggagtccctc catgcccaga tcgactccct cgagatatat ggatcc 1796 <210> 176 <211> 23 <212> DNA <213> AAV serotype 2 (AAV2) <220> <223> AAV2 wt gRNA for Nicking Cas9 <400> 176 agcgagcgag cgcgcagaga ggg 23 <210> 177 <211> 16 <212> DNA <213> AAV serotype 2 (AAV2) <220> <223> AAV2 wt gDNA for PfAgo <400> 177 gctcgctcgc tcggtg 16 <210> 178 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rep AAV1,2,7 <400> 178 gcgcgctcgc tcgctc 16 <210> 179 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rep AAV3 <400> 179 tgcgcactcg ctcgctc 17 <210> 180 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rep AAV4 <400> 180 gcgcgctcgc tcactc 16 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rep AAV5 <400> 181 gttcgctcgc tcgctggctc 20 <210> 182 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NS1-NSBE3 B19V <400> 182 ttccggtaca 10 <210> 183 <211> 104 <212> DNA <213> Human bocavirus (HBoV) <220> <223> HBoV (nucleotides 129-237 of wt genome) (Fig. 1) <400> 183 tcttggaatc caatatgtct gccggctcag tcatgcctgc gctgcgcgca gcgcgctgcg 60 cgcgcgcatg atctaatcgc cggcagacat attggattcc aaga 104 <210> 184 <211> 109 <212> DNA <213> B19 parvovirus <220> <223> B19 (nucleotides 139-227 on wt genome) (Fig. 1) <400> 184 gggttggctc tgggccagct tgcttggggt tgccttgaca ctaagacaag cggcgcgccg 60 cttgatctta gtggcacgtc aaccccaagc gctggcccag agccaaccc 109 <210> 185 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mtDNA OriL (Fig.4) <400> 185 ttcaaacctg ccggggcttc tcccgccttt tttcccggcg gcgggagaag 50 <210> 186 <211> 99 <212> DNA <213> Adeno-Associated Virus-1 (AAV1) <400> 186 aacgggtgag ggagagacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 187 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nb.BbvCI_BL <400> 187 aacgggtgag ggggagtcgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 188 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nb.BbvCI_TL <400> 188 aacgggtgag ggcgactccc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 189 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nb.BsmI_BL <400> 189 aacgggtgag ggacttacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 190 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nb.BsmI_TL <400> 190 aacgggtgag ggagagacgc gtaagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 191 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nb.BsrDI_BL <400> 191 aacgggtgag ggcgttacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 192 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nb.BsrDI_TL <400> 192 aacgggtgag ggagtaacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 193 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nb.BssSI_BL <400> 193 aacgggtgct cgagagacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 194 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nb.BssSI_TL <400> 194 aacgggtgag ggagcaccgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 195 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nb.BtsI_BL <400> 195 aacgggtgag ggcgtcacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 196 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nb.BtsI_TL <400> 196 aacgggtgag ggagtgacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 197 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nt.AlwI_BL <400> 197 aacgggtgag ggagctaggc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 198 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nt.AlwI_BL <400> 198 aacgggtgac ctagagacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 199 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nt.BbvCI_TL <400> 199 aacgggtgag ggcgactccc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 200 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nt.BbvCI_BL <400> 200 aacgggtgag ggggagtcgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 201 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nt.BsmAI_TL <400> 201 aacgggtgac tctgagacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 202 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nt.BsmAI_BL <400> 202 aacgggtgag gcagagacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 203 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nt.BspQI_TL <400> 203 aacgggtgag ggcttctcgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 204 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nt.BspQI_BL <400> 204 aacgggtgag ggcgagaagc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 205 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nt.BstNBI_TL <400> 205 aacgggtgag ggagagacgc gctgagcgag cgagccaccc cggacgcctg gtttccaggc 60 gtctgccgtc tcgagacgag acggccgggg tggctcgctc 100 <210> 206 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV1_Nt.BstNBI_BL <400> 206 aacggctcag ggagagacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctc 99 <210> 207 <211> 99 <212> DNA <213> Adeno-Associated Virus -2 (AAV2) <400> 207 aaccggtgag ggagagacgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 208 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nb.BbvCI_BL <400> 208 aaccggtgag ggggagtcgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 209 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nb.BbvCI_TL <400> 209 aaccggtgag ggcgactccc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 210 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nb.BsmI_BL <400> 210 aaccggtgag ggacttacgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 211 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nb.BsmI_TL <400> 211 aaccggtgag ggagagacgc gtaagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 212 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nb.BsrDI_BL <400> 212 aaccggtgag ggcgttacgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 213 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nb.BsrDI_TL <400> 213 aaccggtgag ggagtaacgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 214 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nb.BssSI_BL <400> 214 aaccggtgct cgagagacgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 215 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nb.BssSI_TL <400> 215 aaccggtgag ggagcaccgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 216 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nb.BtsI_BL <400> 216 aaccggtgag ggcgtcacgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 217 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nb.BtsI_TL <400> 217 aaccggtgag ggagtgacgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 218 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nt.AlwI_BL <400> 218 aaccggtgag ggagctaggc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 219 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nt.AlwI_BL <400> 219 aaccggtgac ctagagacgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 220 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nt.BbvCI_TL <400> 220 aaccggtgag ggcgactccc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 221 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nt.BbvCI_BL <400> 221 aaccggtgag ggggagtcgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 222 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nt.BsmAI_TL <400> 222 aaccggtgac tctgagacgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 223 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nt.BsmAI_BL <400> 223 aaccggtgag gcagagacgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 224 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nt.BspQI_TL <400> 224 aaccggtgag ggcttctcgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 225 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nt.BspQI_BL <400> 225 aaccggtgag ggcgagaagc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 226 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nt.BstNBI_TL <400> 226 aaccggtgag ggagagacgc gctgagcgag cgagtgactc cggcccgctg gtttccagcg 60 ggctgcgggc ccgaaacggg cccgccggag tcactcgctc 100 <210> 227 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2_Nt.BstNBI_BL <400> 227 aaccgctcag ggagagacgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctc 99 <210> 228 <211> 99 <212> DNA <213> Adeno-Associated Virus-3 (AAV3) <400> 228 aaccggtgag ggagatacgc gtgagcgagc gagccacccc ggaccgctgg tttccagcgg 60 tctgcctgca cgaaacgtgc aggccggggt ggctcgctc 99 <210> 229 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV3_Nb.BbvCI_BL <400> 229 aaccggtgag ggggagtcgc gtgagcgagc gagccacccc ggaccgctgg tttccagcgg 60 tctgcctgca cgaaacgtgc aggccggggt ggctcgctc 99 <210> 230 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV3_Nb.BbvCI_TL <400> 230 aaccggtgag ggcgactccc gtgagcgagc gagccacccc ggaccgctgg tttccagcgg 60 tctgcctgca cgaaacgtgc aggccggggt ggctcgctc 99 <210> 231 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV3_Nb.BsmI_BL <400> 231 aaccggtgag ggacttacgc gtgagcgagc gagccacccc ggaccgctgg tttccagcgg 60 tctgcctgca cgaaacgtgc aggccggggt ggctcgctc 99 <210> 232 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV3_Nb.BsmI_TL <400> 232 aaccggtgag ggagatacgc gtaagcgagc gagccacccc ggaccgctgg tttccagcgg 60 tctgcctgca cgaaacgtgc aggccggggt ggctcgctc 99 <210> 233 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV3_Nb.BsrDI_BL <400> 233 aaccggtgag ggcgttacgc gtgagcgagc gagccacccc 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aaccggtgag ggagtgacgc gtgagcgagc gagccacccc ggaccgctgg tttccagcgg 60 tctgcctgca cgaaacgtgc aggccggggt ggctcgctc 99 <210> 239 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV3_Nt.AlwI_BL <400> 239 aaccggtgag ggagctaggc gtgagcgagc gagccacccc ggaccgctgg tttccagcgg 60 tctgcctgca cgaaacgtgc aggccggggt ggctcgctc 99 <210> 240 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV3_Nt.AlwI_BL <400> 240 aaccggtgac ctagatacgc gtgagcgagc gagccacccc ggaccgctgg tttccagcgg 60 tctgcctgca cgaaacgtgc aggccggggt ggctcgctc 99 <210> 241 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV3_Nt.BbvCI_TL <400> 241 aaccggtgag ggcgactccc gtgagcgagc gagccacccc ggaccgctgg tttccagcgg 60 tctgcctgca cgaaacgtgc aggccggggt ggctcgctc 99 <210> 242 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV3_Nt.BbvCI_BL <400> 242 aaccggtgag ggggagtcgc gtgagcgagc gagccacccc ggaccgctgg tttccagcgg 60 tctgcctgca cgaaacgtgc aggccggggt ggctcgctc 99 <210> 243 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV3_Nt.BsmAI_TL <400> 243 aaccggtgac tctgatacgc gtgagcgagc gagccacccc ggaccgctgg tttccagcgg 60 tctgcctgca cgaaacgtgc aggccggggt ggctcgctc 99 <210> 244 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV3_Nt.BsmAI_BL <400> 244 aaccggtgag gcagagacgc gtgagcgagc gagccacccc ggaccgctgg tttccagcgg 60 tctgcctgca cgaaacgtgc aggccggggt ggctcgctc 99 <210> 245 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV3_Nt.BspQI_TL <400> 245 aaccggtgag ggcttctcgc gtgagcgagc gagccacccc ggaccgctgg tttccagcgg 60 tctgcctgca cgaaacgtgc aggccggggt ggctcgctc 99 <210> 246 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV3_Nt.BspQI_BL <400> 246 aaccggtgag ggcgagaagc gtgagcgagc gagccacccc ggaccgctgg tttccagcgg 60 tctgcctgca cgaaacgtgc aggccggggt ggctcgctc 99 <210> 247 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV3_Nt.BstNBI_TL <400> 247 aaccggtgag ggagatacgc gctgagcgag cgagccaccc cggaccgctg gtttccagcg 60 gtctgcctgc acgaaacgtg caggccgggg tggctcgctc 100 <210> 248 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV3_Nt.BstNBI_BL <400> 248 aaccgctcag ggagatacgc gtgagcgagc gagccacccc ggaccgctgg tttccagcgg 60 tctgcctgca cgaaacgtgc aggccggggt ggctcgctc 99 <210> 249 <211> 125 <212> DNA <213> Adeno-Associated Virus-4_left (AAV4_left) <400> 249 aaccggtgag ggagatacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgta tctccctcac 120 cggtt 125 <210> 250 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nb.BbvCI_BL <400> 250 aaccggtgag ggggagtcgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgac tccccctcac 120 cggtt 125 <210> 251 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nb.BbvCI_TL <400> 251 aaccggtgag ggcgactccc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgggag tcgccctcac 120 cggtt 125 <210> 252 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nb.BsmI_BL <400> 252 aaccggtgag ggacttacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgta agtccctcac 120 cggtt 125 <210> 253 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nb.BsmI_TL <400> 253 aaccggtgag ggagatacgc gtaagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg cttacgcgta tctccctcac 120 cggtt 125 <210> 254 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nb.BsrDI_BL <400> 254 aaccggtgag ggcgttacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgta acgccctcac 120 cggtt 125 <210> 255 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nb.BsrDI_TL <400> 255 aaccggtgag ggagtaacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgtt actccctcac 120 cggtt 125 <210> 256 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nb.BssSI_BL <400> 256 aaccggtgct cgagatacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgta tctcgagcac 120 cggtt 125 <210> 257 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nb.BssSI_TL <400> 257 aaccggtgag ggagcaccgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcggt gctccctcac 120 cggtt 125 <210> 258 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nb.BtsI_BL <400> 258 aaccggtgag ggcgtcacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgtg acgccctcac 120 cggtt 125 <210> 259 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nb.BtsI_TL <400> 259 aaccggtgag ggagtgacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgtc actccctcac 120 cggtt 125 <210> 260 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nt.AlwI_BL <400> 260 aaccggtgag ggagctaggc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgccta gctccctcac 120 cggtt 125 <210> 261 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nt.AlwI_BL <400> 261 aaccggtgac ctagatacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgta tctaggtcac 120 cggtt 125 <210> 262 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nt.BbvCI_TL <400> 262 aaccggtgag ggcgactccc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgggag tcgccctcac 120 cggtt 125 <210> 263 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nt.BbvCI_BL <400> 263 aaccggtgag ggggagtcgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgac tccccctcac 120 cggtt 125 <210> 264 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nt.BsmAI_TL <400> 264 aaccggtgac tctgatacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgta tcagagtcac 120 cggtt 125 <210> 265 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nt.BsmAI_BL <400> 265 aaccggtgag gcagagacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgtc tctgcctcac 120 cggtt 125 <210> 266 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nt.BspQI_TL <400> 266 aaccggtgag ggcttctcgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgag aagccctcac 120 cggtt 125 <210> 267 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nt.BspQI_BL <400> 267 aaccggtgag ggcgagaagc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcttc tcgccctcac 120 cggtt 125 <210> 268 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nt.BstNBI_TL <400> 268 aaccggtgag ggagatacgc gctgagcgag tgagtgagcc gggacctctg gtttccagag 60 gtctgacggc cggagaccgg ccgtcccggc tcactcactc gctcagcgcg tatctccctc 120 accggtt 127 <210> 269 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_left_Nt.BstNBI_BL <400> 269 aaccgctcag ggagatacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgta tctccctgag 120 cggtt 125 <210> 270 <211> 125 <212> DNA <213> Adeno-Associated Virus-4_Right (AAV4_Right) <400> 270 aaccggtgta atcgatacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgta tctccctcac 120 cggtt 125 <210> 271 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_Right_Nb.BbvCI_BL <400> 271 aaccggtgta atggagtcgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgac tccccctcac 120 cggtt 125 <210> 272 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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<220> <223> AAV4_Right_Nb.BsrDI_TL <400> 276 aaccggtgta atcgtaacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgtt actccctcac 120 cggtt 125 <210> 277 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_Right_Nb.BssSI_BL <400> 277 aaccggtgct ctcgatacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgta tctcgagcac 120 cggtt 125 <210> 278 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_Right_Nb.BssSI_TL <400> 278 aaccggtgta agagcaccgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcggt gctccctcac 120 cggtt 125 <210> 279 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_Right_Nb.BtsI_BL <400> 279 aaccggtgta atcgtcacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgtg acgccctcac 120 cggtt 125 <210> 280 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_Right_Nb.BtsI_TL <400> 280 aaccggtgta atcgtgacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgtc actccctcac 120 cggtt 125 <210> 281 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_Right_Nt.AlwI_BL <400> 281 aaccggtgta atcgctaggc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgccta gctccctcac 120 cggtt 125 <210> 282 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_Right_Nt.AlwI_BL <400> 282 aaccggtgtc ctagatacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgta tctaggtcac 120 cggtt 125 <210> 283 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_Right_Nt.BbvCI_TL <400> 283 aaccggtgta atcgactccc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgggag tcgccctcac 120 cggtt 125 <210> 284 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_Right_Nt.BbvCI_BL <400> 284 aaccggtgta atggagtcgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgac tccccctcac 120 cggtt 125 <210> 285 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_Right_Nt.BsmAI_TL <400> 285 aaccggtgtc tctgatacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgta tcagagtcac 120 cggtt 125 <210> 286 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_Right_Nt.BsmAI_BL <400> 286 aaccggtgta acagagacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgtc tctgcctcac 120 cggtt 125 <210> 287 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_Right_Nt.BspQI_TL <400> 287 aaccggtgta atcttctcgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgag aagccctcac 120 cggtt 125 <210> 288 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_Right_Nt.BspQI_BL <400> 288 aaccggtgta atcgagaagc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcttc tcgccctcac 120 cggtt 125 <210> 289 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_Right_Nt.BstNBI_TL <400> 289 aaccggtgta atcgatacgc gctgagcgag tgagtgagcc gggacctctg gtttccagag 60 gtctgacggc cggagaccgg ccgtcccggc tcactcactc gctcagcgcg tatctccctc 120 accggtt 127 <210> 290 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV4_Right_Nt.BstNBI_BL <400> 290 aaccggtctc agcgatacgc gcgagcgagt gagtgagccg ggacctctgg tttccagagg 60 tctgacggcc ggagaccggc cgtcccggct cactcactcg ctcgcgcgta tctctgagac 120 cggtt 125 <210> 291 <211> 137 <212> DNA <213> Adeno-Associated Virus-5 (AAV5) <400> 291 gagagggggg acagcgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcgctgtccc ccctctc 137 <210> 292 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nb.BbvCI_BL <400> 292 gagaggggag tcggcgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcgccgactc ccctctc 137 <210> 293 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nb.BbvCI_TL <400> 293 gagaggggcg actccgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcggagtcgc ccctctc 137 <210> 294 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nb.BsmI_BL <400> 294 gagaggggct tacgcgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcgcgtaagc ccctctc 137 <210> 295 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nb.BsmI_TL <400> 295 gagagggggg acagcgtaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 acgctgtccc ccctctc 137 <210> 296 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nb.BsrDI_BL <400> 296 gagaggcgtt acagcgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcgctgtaac gcctctc 137 <210> 297 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nb.BsrDI_TL <400> 297 gagagggggt aacgcgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcgcgttacc ccctctc 137 <210> 298 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nb.BssSI_BL <400> 298 gagtgctcgg acagcgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcgctgtccg agcactc 137 <210> 299 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nb.BssSI_TL <400> 299 gagagggagc acagcgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcgctgtgct ccctctc 137 <210> 300 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nb.BtsI_BL <400> 300 gagaggcgtc acagcgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcgctgtgac gcctctc 137 <210> 301 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nb.BtsI_TL <400> 301 gagaggggtg acggcgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcgccgtcac ccctctc 137 <210> 302 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nt.AlwI_BL <400> 302 gagagggggg acagcgctag ggagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcccta 120 gcgctgtccc ccctctc 137 <210> 303 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nt.AlwI_BL <400> 303 gagagggggc ctagcgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcgctaggcc ccctctc 137 <210> 304 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nt.BbvCI_TL <400> 304 gagaggggcg actccgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcggagtcgc ccctctc 137 <210> 305 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nt.BbvCI_BL <400> 305 gagaggggag tcggcgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcgccgactc ccctctc 137 <210> 306 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nt.BsmAI_TL <400> 306 gagagggggc tctgcgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcgcagagcc ccctctc 137 <210> 307 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nt.BsmAI_BL <400> 307 gagagggggc agagcgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcgctctgcc ccctctc 137 <210> 308 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nt.BspQI_TL <400> 308 gagagggctt ctcgcgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcgcgagaag ccctctc 137 <210> 309 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nt.BspQI_BL <400> 309 gagagggcga gaagcgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcgcttctcg ccctctc 137 <210> 310 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nt.BstNBI_TL <400> 310 gagagggggg acagcgctga gcgagcgagc gaccgagcaa acccccccac cgtcgagttt 60 ctcgacggtc tgctgccggg agaccggcag cgggggggtt tgctcggtcg ctcgctcgct 120 cagcgctgtc ccccctctc 139 <210> 311 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5_Nt.BstNBI_BL <400> 311 gagagggggc tcagcgcaag cgagcgagcg accgagcaaa cccccccacc gtcgagtttc 60 tcgacggtct gctgccggga gaccggcagc gggggggttt gctcggtcgc tcgctcgctt 120 gcgctgagcc ccctctc 137 <210> 312 <211> 125 <212> DNA <213> Adeno-Associated Virus-7 (AAV7) <400> 312 aaccggtgag ggagatacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgcgta tctccctcac 120 cggtt 125 <210> 313 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nb.BbvCI_BL <400> 313 aaccggtgag ggggagtcgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgcgac tccccctcac 120 cggtt 125 <210> 314 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nb.BbvCI_TL <400> 314 aaccggtgag ggcgactccc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgggag tcgccctcac 120 cggtt 125 <210> 315 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nb.BsmI_BL <400> 315 aaccggtgag ggacttacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgcgta agtccctcac 120 cggtt 125 <210> 316 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nb.BsmI_TL <400> 316 aaccggtgag ggagatacgc gtaagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg cttacgcgta tctccctcac 120 cggtt 125 <210> 317 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nb.BsrDI_BL <400> 317 aaccggtgag ggcgttacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgcgta acgccctcac 120 cggtt 125 <210> 318 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nb.BsrDI_TL <400> 318 aaccggtgag ggagtaacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgcgtt actccctcac 120 cggtt 125 <210> 319 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nb.BssSI_BL <400> 319 aaccggtgct cgagatacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgcgta tctcgagcac 120 cggtt 125 <210> 320 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nb.BssSI_TL <400> 320 aaccggtgag ggagcaccgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgcggt gctccctcac 120 cggtt 125 <210> 321 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nb.BtsI_BL <400> 321 aaccggtgag ggcgtcacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgcgtg acgccctcac 120 cggtt 125 <210> 322 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nb.BtsI_TL <400> 322 aaccggtgag ggagtgacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgcgtc actccctcac 120 cggtt 125 <210> 323 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nt.AlwI_BL <400> 323 aaccggtgag ggagctaggc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgccta gctccctcac 120 cggtt 125 <210> 324 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nt.AlwI_BL <400> 324 aaccggtgac ctagatacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgcgta tctaggtcac 120 cggtt 125 <210> 325 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nt.BbvCI_TL <400> 325 aaccggtgag ggcgactccc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgggag tcgccctcac 120 cggtt 125 <210> 326 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nt.BbvCI_BL <400> 326 aaccggtgag ggggagtcgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgcgac tccccctcac 120 cggtt 125 <210> 327 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nt.BsmAI_TL <400> 327 aaccggtgac tctgatacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgcgta tcagagtcac 120 cggtt 125 <210> 328 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nt.BsmAI_BL <400> 328 aaccggtgag gcagagacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgcgtc tctgcctcac 120 cggtt 125 <210> 329 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nt.BspQI_TL <400> 329 aaccggtgag ggcttctcgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgcgag aagccctcac 120 cggtt 125 <210> 330 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nt.BspQI_BL <400> 330 aaccggtgag ggcgagaagc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgcttc tcgccctcac 120 cggtt 125 <210> 331 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nt.BstNBI_TL <400> 331 aaccggtgag ggagatacgc gctgagcgag cgagccaccc cggacgcctg gtttccaggc 60 gtctgccgtc tcgagacgag acggccgggg tggctcgctc gctcagcgcg tatctccctc 120 accggtt 127 <210> 332 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV7_Nt.BstNBI_BL <400> 332 aaccgctcag ggagatacgc gcgagcgagc gagccacccc ggacgcctgg tttccaggcg 60 tctgccgtct cgagacgaga cggccggggt ggctcgctcg ctcgcgcgta tctccctgag 120 cggtt 125 <210> 333 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial ITR 333 <400> 333 ggccactccc gaagagcgcg ctcgctatct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg 60 acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagatagcga gcgcgctctt cgggagtggc 120 c 121 <210> 334 <211> 1656 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Construct 3 <400> 334 tgcgcgactc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt 60 gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagtc gcgcagagag gttaaaacca actagacaac 120 tttgtatatc tagagtaacg ccattttgca aggcatggaa aaataccaaa ccaagaatag 180 agaagttcag atcaagggcg ggtacatgaa aatagctaac gttgggccaa acaggatatc 240 tgcggtgagc agtttcggcc ccggcccggg gccaagaaca gatggtcacc gcagtttcgg 300 ccccggcccg aggccaagaa cagatggtcc ccagatatgg cccaaccctc agcagtttct 360 taagacccat cagatgtttc caggctcccc caaggacctg aaatgaccct gcgccttatt 420 tgaattaacc aatcagcctg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttctgctt cccgagctct 480 ataaaagagc tcacaacccc tcactcggcg cgccagtcct ccgattgact gagtgcggcc 540 gcggcaggct gccaccatgg aaaccgatac actgctgctt tgggtacttt tgctgtgggt 600 gcccggcagt acgggcgacg ccgcacaacc agctaggaga gcagtccgga gcctggtccc 660 ctcttccgag gccgaggctg aacggggaaa gctgccaggc aagaaactcc ccttagaggt 720 tctcatcgag ctggaagcaa acgcacgcaa ggccggttgc actaggggct gcctcatctg 780 cctcagcaag atcaaatgta cagcaaagat gaagaagtat attcctggcc gctgtgcaga 840 ctacggaggc gacaaaaaaa caggacaagc tggtatagtt ggcgccatcg tagatatccc 900 cgagattagt gggttcaagg aaatggagcc aatggagcaa ttcattgcac aggttgatag 960 atgtgcggat tgcactactg gttgccttaa gggcttggcg aatgtcaagt gtagtgatct 1020 tctgaaaaag tggctacccg gccggtgtgc caccttcgct gacaaaatac agagcgaagt 1080 cgacaatatt aaaggacttg ccggggacta atgatagtga cacaaagtga cgcgtcctag 1140 agctcgcact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc 1200 cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa 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atggcgtctg tacaaccacc gaagagcgga gtggccaaaa agtacccggc cagaaaggaa 420 ccgtaaaacc aactagacag ccggtgactt tgttccccag ctcggttcat tctcaagcct 480 cagacaggag aaccgggact agtatatgag ctccggtgcc cgtcagtggg cagagcgcac 540 atcgcccaca gtccccgaga agttgggggg aggggtcggc aattgaaccg gtgcctagag 600 aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga tgtcgtgtac tggctccgcc tttttcccga 660 gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg 720 gtttgccgcc agaacacagg taagtgccgt gtgtggttcc cgcgggcctg gcctctttac 780 gggttatggc ccttgcgtgc cttgaattac ttccacgccc ctggctgcag tacgtgattc 840 ttgatcccga gcttcgggtt ggaagtgggt gggagagttc gaggccttgc gcttaaggag 900 ccccttcgcc tcgtgcttga gttgaggcct ggcctgggcg ctggggccgc cgcgtgcgaa 960 tctggtggca ccttcgcgcc tgtctcgctg ctttcgataa gtctctagcc atttaaaatt 1020 tttgatgacc tgctgcgacg ctttttttct ggcaagatag tcttgtaaat gcgggccaag 1080 atcgatctgc acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg 1140 tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg 1200 gggtagtctc 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tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg 3780 tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc 3840 tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac cttccttccc 3900 gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc 3960 ggatctccct ttgggccgcc tccccgcacg cgtcctagag ctcgcactgt gccttctagt 4020 tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact 4080 cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat 4140 tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agagaatagc 4200 aggcatgctg gggagggcgc tagcgcaggg ggaccccaag tgacgattga accccgattc 4260 aggtacccat tggaaatttt aatggagtaa cataactgct ggagtagatg aagaacctct 4320 tggccactcc gttgcttatg caatcgcgaa actctatatc ttgctcttct taatgtgttg 4380 ttgttgtaca tgcgccatct tagttttata tcagctggcg ccttagttat ataacatgca 4440 tgttatataa ctaaggcgcc agctgatata aaactaagat ggcgcatgta caacaacaac 4500 acattaagaa gagcgccggg gggacgacgc aatctggagt ggaaagaacc cccgtctatg 4560 cggcttaaag cacggccagg gaatagtgga tcaagtgtac tgacatgtgc cggcaatgca 4620 ttgcgtcccg agtcacattc gcgactctcg acgctcttca gaagagcagc ttagcttcaa 4680 tagctcaatg atatcggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 4740 aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 4800 aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 4860 ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 4920 tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 4980 agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 5040 gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 5100 tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 5160 acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc 5220 tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 5280 caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 5340 aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 5400 aactcacgtt aaggggctct tcagaagagc gagtcacatt cgcgactctg caatgcattg 5460 ccatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 5520 aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 5580 aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 5640 tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 5700 gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 5760 agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 5820 aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 5880 gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 5940 caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 6000 cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 6060 ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 6120 ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 6180 gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 6240 cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 6300 gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 6360 caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 6420 tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 6480 acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 6540 aagta 6545 <210> 338 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer (Fig. 5) <400> 338 atccggcttt aaacgggcaa ctgcgtctca ttcacgttag agactacaac cgtcggat 58

Claims (101)

  1. a. 닉킹(nicking)이 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제1 역위 반복 또는 이의 단편을 포함하는 상부 가닥 5' 오버행(overhang)을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복;
    b. 발현 카세트; 및
    c. 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복 또는 이의 단편을 포함하는 상부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복
    을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  2. a. 닉킹이 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제1 역위 반복을 포함하는 하부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복;
    b. 발현 카세트; 및
    c. 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복을 포함하는 하부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복
    을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  3. a. 닉킹이 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제1 역위 반복을 포함하는 상부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복;
    b. 발현 카세트; 및
    c. 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복을 포함하는 하부 가닥 5' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복
    을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  4. a. 닉킹이 제1 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제1 역위 반복을 포함하는 하부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1 및 제2 제한 부위가 제1 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제1 역위 반복;
    b. 발현 카세트; 및
    c. 닉킹이 제2 역위 반복의 하부 가닥으로부터 상부의 분리 시 제2 역위 반복을 포함하는 상부 가닥 3' 오버행을 초래하도록, 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제3 및 제4 제한 부위가 제2 역위 반복에 근접하여 대향하는 가닥에 배열된 것인, 제2 역위 반복
    을 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중 가닥 DNA 분자가 단리된 DNA 분자인, 이중 가닥 DNA 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위가 모두 동일한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위인, 이중 가닥 DNA 분자.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및 제2 역위 반복이 동일한, 이중 가닥 DNA 분자.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및/또는 제2 역위 반복이 파보바이러스의 ITR인, 이중 가닥 DNA 분자.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및/또는 제2 역위 반복이 파보바이러스의 변형된 ITR인, 이중 가닥 DNA 분자.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    파보바이러스가 디펜도파보바이러스, 보카파보바이러스, 에리트로파보바이러스, 프로토파보바이러스 또는 테트라파보바이러스인, 이중 가닥 DNA 분자.
  11. 제9항에 있어서,
    변형된 ITR의 뉴클레오티드 서열이 파보바이러스의 ITR과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 적어도 99% 동일한, 이중 가닥 DNA 분자.
  12. 제1항 또는 제5항에 있어서,
    a. 제1 닉이 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
    b. 제2 닉이 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
    c. 제3 닉이 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
    d. 제4 닉이 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고;
    제1 닉 및 제4 닉이 상부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 제1 닉이 상부 가닥의 5' 말단에 더 가까운 것이고, 제4 닉이 상부 가닥의 3' 말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉 및 제3 닉이 하부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제3 닉이 하부 가닥의 5'말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉이 하부 가닥의 3'말단에 더 가까운 것인,
    이중 가닥 DNA 분자.
  13. 제2항 또는 제5항에 있어서,
    a. 제1 닉이 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
    b. 제2 닉이 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
    c. 제3 닉이 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
    d. 제4 닉이 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고;
    제1 닉 및 제4 닉이 상부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제1 닉이 상부 가닥의 5' 말단에 더 가까운 것이고, 제4 닉이 상부 가닥의 3' 말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉 및 제3 닉이 하부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제3 닉이 하부 가닥의 5'말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉이 하부 가닥의 3'말단에 더 가까운 것인,
    이중 가닥 DNA 분자.
  14. 제3항 또는 제5항에 있어서,
    a. 제1 닉이 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
    b. 제2 닉이 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
    c. 제3 닉이 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
    d. 제4 닉이 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고;
    제1 닉 및 제4 닉이 상부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제1 닉이 상부 가닥의 5' 말단에 더 가까운 것이고, 제4 닉이 상부 가닥의 3' 말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉 및 제3 닉이 하부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제3 닉이 하부 가닥의 5'말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉이 하부 가닥의 3'말단에 더 가까운 것인
    이중 가닥 DNA 분자.
  15. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    a. 제1 닉이 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
    b. 제2 닉이 제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 내에 있고/있거나;
    c. 제3 닉이 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 5' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고/있거나;
    d. 제4 닉이 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍의 3' 뉴클레오티드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 이내에 있고;
    제1 닉 및 제4 닉이 상부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제1 닉이 상부 가닥의 5' 말단에 더 가까운 것이고, 제4 닉이 상부 가닥의 3' 말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉 및 제3 닉이 하부 가닥에 생성된 2개의 닉이고, 여기서 제3 닉이 하부 가닥의 5'말단에 더 가까운 것이고, 제2 닉이 하부 가닥의 3'말단에 더 가까운 것인,
    이중 가닥 DNA 분자.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 닉, 제2 닉, 제3 닉 및/또는 제4 닉이 역위 반복 안에 있는, 이중 가닥 DNA 분자.
  17. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 닉, 제2 닉, 제3 닉 및/또는 제4 닉이 역위 반복 밖에 있는, 이중 가닥 DNA 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    플라스미드인, 이중 가닥 DNA 분자.
  19. 제18항에 있어서,
    플라스미드가 박테리아 복제 기점을 추가로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  20. 제18항에 있어서,
    플라스미드가 영역 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서 제한 효소 부위를 추가로 포함하고, 제한 효소 부위는 제1 역위 반복, 제2 역위 반복, 및 제1 및 제2 역위 반복 사이의 영역 중 어디에도 존재하지 않는, 이중 가닥 DNA 분자.
  21. 제20항에 있어서,
    제한 효소에 의한 절단이 제1 및/또는 제2 역위 반복의 어닐링(annealing)에 알맞은 조건 하에서 검출가능한 수준으로 어닐링하지 않는 단일 가닥 오버행을 초래하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  22. 제20항에 있어서,
    플라스미드가 제한 효소를 인코딩하는 개방형 해독틀을 추가로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  23. 제22항에 있어서,
    제한 효소의 발현이 유도성 프로모터의 제어 하에 있는, 이중 가닥 DNA 분자.
  24. 제18항에 있어서,
    플라스미드가 영역 5' 내지 제1 역위 반복 및 3' 내지 제2 역위 반복에서 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 및 제6 제한 부위를 추가로 포함하고,
    닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 및 제6 제한 부위는
    a. 대향하는 가닥에 있고;
    b. 파단의 단일 가닥 오버행이 제1 및/또는 제2 역위 반복의 어닐링에 알맞은 조건 하에 분자간 또는 분자내 검출가능한 수준으로 어닐링하지 않도록 이중 가닥 DNA 분자의 파단을 생성하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  25. 제24항에 있어서,
    제5 및 제6 닉이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드로 떨어져 있는, 이중 가닥 DNA 분자.
  26. 제24항에 있어서,
    닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 제한 부위가 모두 동일한 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 표적 서열인, 이중 가닥 DNA 분자.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제 부위가 내인성 닉킹 엔도뉴클레아제의 표적 서열인, 이중 가닥 DNA 분자.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    플라스미드가 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및/또는 제6 제한 부위를 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 개방형 해독틀을 추가로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  29. 제28항에 있어서,
    닉킹 엔도뉴클레아제의 발현이 유도성 프로모터의 제어 하에 있는, 이중 가닥 DNA 분자.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 제한 부위를 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제가 Nt. BsmAI; Nt. BtsCI; N. ALwl; N. BstNBI; N. BspD6I; Nb. Mva1269I; Nb. BsrDI; Nt. BtsI; Nt. BsaI; Nt. Bpu10I; Nt. BsmBI; Nb. BbvCI; Nt. BbvCI; 또는 Nt. BspQI인, 이중 가닥 DNA 분자.
  31. 제24항에 있어서,
    닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 제5 및 제6 제한 부위를 인식하는 닉킹 엔도뉴클레아제가 Nt. BsmAI; Nt. BtsCI; N. ALwl; N. BstNBI; N. BspD6I; Nb. Mva1269I; Nb. BsrDI; Nt. BtsI; Nt. BsaI; Nt. Bpu10I; Nt. BsmBI; Nb. BbvCI; Nt. BbvCI; 또는 Nt. BspQI인, 이중 가닥 DNA 분자.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    발현 카세트가 전사 단위에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  33. 제32항에 있어서,
    전사 단위가 개방형 해독틀을 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    발현 카세트가 전사 후 조절 요소를 추가로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  35. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    발현 카세트가 폴리아데닐화 및 종결 신호를 추가로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    발현 카세트의 크기가 적어도 4 kb, 적어도 4.5 kb, 적어도 5 kb, 적어도 5.5 kb, 적어도 6 kb, 적어도 6.5 kb, 적어도 7 kb, 적어도 7.5 kb, 적어도 8 kb, 적어도 8.5 kb, 적어도 9 kb, 적어도 9.5 kb 또는 적어도 10 kb인, 이중 가닥 DNA 분자.
  37. 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로,
    a. 제1 헤어핀화된(hairpinned) 역위 반복;
    b. 하부 가닥의 닉;
    c. 발현 카세트;
    d. 하부 가닥의 닉; 및
    e. 제2 헤어핀화된 역위 반복
    을 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  38. 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로,
    a. 제1 헤어핀화된 역위 반복;
    b. 상부 가닥의 닉;
    c. 발현 카세트;
    d. 상부 가닥의 닉; 및
    e. 제2 헤어핀화된 역위 반복
    을 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  39. 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로,
    a. 제1 헤어핀화된 역위 반복;
    b. 하부 가닥의 닉;
    c. 발현 카세트;
    d. 상부 가닥의 닉; 및
    e. 제2 헤어핀화된 역위 반복
    을 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  40. 상부 가닥의 5'에서 3' 방향으로,
    a. 제1 헤어핀화된 역위 반복;
    b. 상부 가닥의 닉;
    c. 발현 카세트;
    d. 하부 가닥의 닉; 및
    e. 제2 헤어핀화된 역위 반복
    을 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    단리된 DNA 분자인, 이중 가닥 DNA 분자.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및/또는 제2 역위 반복이 파보바이러스의 ITR인, 이중 가닥 DNA 분자.
  43. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및 제2 역위 반복이 동일한, 이중 가닥 DNA 분자.
  44. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및/또는 제2 역위 반복이 파보바이러스의 변형된 ITR인, 이중 가닥 DNA 분자.
  45. 제42항 또는 제44항에 있어서,
    파보바이러스가 디펜도파보바이러스, 보카파보바이러스, 에리트로파보바이러스, 프로토파보바이러스 또는 테트라파보바이러스인, 이중 가닥 DNA 분자.
  46. 제45항에 있어서,
    변형된 ITR의 뉴클레오티드 서열이 파보바이러스의 ITR과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 적어도 99% 동일한, 이중 가닥 DNA 분자.
  47. 제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    발현 카세트가 전사 단위에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  48. 제47항에 있어서,
    전사 단위가 개방형 해독틀을 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서,
    발현 카세트가 전사 후 조절 요소를 추가로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  50. 제47항 또는 제48항에 있어서,
    발현 카세트가 폴리아데닐화 및 종결 신호를 추가로 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자.
  51. 제37항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    발현 카세트의 크기가 적어도 4 kb, 적어도 4.5 kb, 적어도 5 kb, 적어도 5.5 kb, 적어도 6 kb, 적어도 6.5 kb, 적어도 7 kb, 적어도 7.5 kb, 적어도 8 kb, 적어도 8.5 kb, 적어도 9 kb, 적어도 9.5 kb 또는 적어도 10 kb인, 이중 가닥 DNA 분자.
  52. 제37항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중 가닥 DNA 분자가 엑소뉴클레아제로부터 보호되고, 선택적으로 엑소뉴클레아제가 RecBCD 엑소뉴클레아제이다.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 복제 관련 단백질 결합 서열("RABS")을 결여한, 이중 가닥 DNA 분자.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    복제 관련 단백질("RAP") 인코딩 서열을 결여한, 이중 가닥 DNA 분자.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이러스 캡시드 단백질 인코딩 서열을 결여한, 이중 가닥 DNA 분자.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 역위 반복이 적어도 하나의 RABS를 결여한, 이중 가닥 DNA 분자.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 역위 반복이 적어도 하나의 RABS를 결여한, 이중 가닥 DNA 분자.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 및 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 간의 DNA 서열이 적어도 하나의 RABS를 결여한, 이중 가닥 DNA 분자.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 역위 반복이 적어도 하나의 RABS를 결여하고, 제2 역위 반복이 적어도 하나의 RABS를 결여한, 이중 가닥 DNA 분자.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    말단 분해 부위(terminal resolution site, TRS)를 결여한, 이중 가닥 DNA 분자.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 역위 반복이 TRS를 결여한, 이중 가닥 DNA 분자.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 역위 반복이 TRS를 결여한, 이중 가닥 DNA 분자.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 및 제2 역위 반복의 ITR 폐쇄 염기 쌍 간의 DNA 서열이 TRS를 결여한, 이중 가닥 DNA 분자.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 역위 반복이 TRS를 결여하고, 제2 역위 반복이 TRS를 결여한, 이중 가닥 DNA 분자.
  65. 제53항 및 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    숙주에 투여될 때 이중 가닥 DNA 분자의 가동화 위험이 적어도 하나의 RABS 및/또는 TRS를 가진 대조군 DNA 분자보다 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50%만큼 더 낮은, 이중 가닥 DNA 분자.
  66. 제53항 및 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    TRS를 결여하며, 숙주에 투여될 때 이중 가닥 DNA 분자의 가동화 위험이 TRS를 가진 대조군 DNA 분자보다 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50%만큼 더 낮은, 이중 가닥 DNA 분자.
  67. 제53항 및 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 RABS를 결여하고, TRS를 결여하며, 숙주에 투여될 때 이중 가닥 DNA 분자의 가동화 위험이 적어도 하나의 RABS 및 TRS를 가진 대조군 DNA 분자보다 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50%만큼 더 낮은, 이중 가닥 DNA 분자.
  68. 제5항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    단리된 이중 가닥 DNA 분자가 이중 가닥 DNA 분자의 단편이 없는, 단리된 이중 가닥 DNA 분자.
  69. 제5항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중 가닥 DNA 분자의 단편이 단리된 이중 가닥 DNA 분자의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 이하인, 단리된 이중 가닥 DNA 분자.
  70. 제5항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
    단리된 이중 가닥 DNA 분자가 이중 가닥 DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질이 없는, 단리된 이중 가닥 DNA 분자.
  71. 제5항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중 가닥 DNA 분자의 단편이 아닌 핵산 오염물질이 단리된 이중 가닥 DNA 분자의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 미만인, 단리된 이중 가닥 DNA 분자.
  72. 제5항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    배큘로바이러스 DNA가 없는, 단리된 이중 가닥 DNA 분자.
  73. 제5항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서,
    배큘로바이러스 DNA가 단리된 이중 가닥 DNA 분자의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 미만인, 단리된 이중 가닥 DNA 분자.
  74. 제37항 내지 제73항 중 어느 한 항의 이중 가닥 DNA 분자를 포함하는 전달 비히클.
  75. 제74항에 있어서,
    하이브리도좀(hybridosome), 리포좀 또는 지질 나노입자를 포함하는, 전달 비히클.
  76. a. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 이중 가닥 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 이중 가닥 DNA 분자의 증폭을 초래하는 조건 하에 배양하는 단계;
    b. 숙주 세포로부터 이중 가닥 DNA 분자를 방출하는 단계;
    c. 4개의 닉을 초래하는 4개의 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 이중 가닥 DNA 분자를 항온처리하는 단계;
    d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계;
    e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계
    를 포함하는, 헤어핀-말단 DNA(hairpin-ended DNA) 분자를 제조하기 위한 방법.
  77. a. 이중 가닥 DNA 분자의 증폭을 초래하는 조건 하에 제20항의 이중 가닥 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계;
    b. 숙주 세포로부터 이중 가닥 DNA 분자를 방출하는 단계;
    c. 4개의 닉을 초래하는 4개의 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 이중 가닥 DNA 분자를 항온처리하는 단계;
    d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계;
    e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계;
    f. 제한 효소와 단계 d로부터 생성된 이중 가닥 DNA 분자 또는 단편을 항온처리함으로써 이중 가닥 DNA 분자 또는 이중 가닥 DNA 분자의 단편을 절단하는 단계; 및
    g. 엑소뉴클레아제와 이중 가닥 DNA 분자의 단편을 항온처리함으로써 단계 e로부터 생성된 단편을 제외한 이중 가닥 DNA 분자의 단편을 분해(digesting)하는 단계
    를 포함하는, 헤어핀-말단 DNA를 제조하기 위한 방법.
  78. a. 이중 가닥 DNA 분자의 증폭을 초래하는 조건 하에 제24항의 이중 가닥 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계;
    b. 숙주 세포로부터 이중 가닥 DNA 분자를 방출하는 단계;
    c. 4개의 닉을 초래하는 제1, 제2, 제3 및 제4 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 이중 가닥 DNA 분자를 항온처리하는 단계;
    d. 2개의 단일 가닥 DNA 오버행이 측면에 있고 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 변성시켜 생성하는 단계;
    e. 단일 가닥 DNA 오버행을 분자내 어닐링함으로써 단계 d로부터 생성된 DNA 단편의 양쪽 말단에서 헤어핀화된 역위 반복을 생성하는 단계;
    f. 이중 가닥 DNA 분자의 파단을 초래하는 제5 및 제6 제한 부위를 인식하는 하나 이상의 닉킹 엔도뉴클레아제와 단계 d로부터 생성된 이중 가닥 DNA 분자 또는 단편을 항온처리하는 단계; 및
    g. 엑소뉴클레아제와 이중 가닥 DNA 분자의 단편을 항온처리함으로써 단계 e로부터 생성된 단편을 제외한 이중 가닥 DNA 분자의 단편을 분해하는 단계
    를 포함하는, 헤어핀-말단 DNA를 제조하기 위한 방법.
  79. 제76항, 제77항 또는 제78항에 있어서,
    h. 리가아제로 닉을 보수(repairing)하여 원형 DNA를 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  80. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계들이 이들이 청구항에 나타난 순서대로 수행되는 것인, 방법.
  81. 제76항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
    헤어핀-말단 DNA가 2개의 헤어핀 말단으로 구성되는 것인, 방법.
  82. 제76항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서,
    헤어핀-말단 DNA가 바이러스 게놈인, 방법.
  83. 제82항에 있어서,
    바이러스 게놈이 파보바이러스 게놈인, 방법.
  84. 제83항에 있어서,
    파보바이러스가 디펜도파보바이러스, 보카파보바이러스, 에리트로파보바이러스, 프로토파보바이러스 또는 테트라파보바이러스인, 방법.
  85. DNA 분자가
    a. 임의의 기능적 RABS를 결여하고/하거나;
    b. 기능적 TRS를 결여하고/하거나;
    c. P5 AAV 프로모터 활성을 결여하거나 (적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 적어도 99.9%) 감소된 P5 AAV 프로모터 활성을 갖고/갖거나;
    d. 바이러스 복제에 요구되는 임의의 다른 요소를 결여한 것인,
    제1항 내지 제73항 중 어느 한 항의 DNA 분자, 제74항 및 제75항의 전달 비히클 또는 제76항 내지 제83항 중 어느 한 항의 방법.
  86. 제85항에 있어서,
    a. DNA 분자 내의 임의의 RABS가 기능적으로 비활성이도록 결실되거나 돌연변이화되고/되거나;
    b. DNA 분자 내의 임의의 TRS가 기능적으로 비활성이도록 결실되거나 돌연변이화되고/되거나;
    c. 임의의 P5 AAV 프로모터가 기능적으로 비활성이도록 결실되거나 돌연변이화되고/되거나;
    d. DNA 분자 내의 바이러스 복제에 요구되는 임의의 다른 요소가 기능적으로 비활성이도록 결실되거나 돌연변이화되고/되는, DNA 분자.
  87. 제86항에 있어서,
    결실이 RABS 및/또는 TRS 및/또는 임의의 P5 AAV 프로모터 및/또는 복제에 요구되는 임의의 다른 요소만의 것일 뿐, 전체 스템/루프 구조를 결실시키지 않는, DNA 분자.
  88. 제85항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 또한 DNA 분자의 ITR이 유래된 야생형 바이러스 및 헬퍼 바이러스로 감염된 경우 DNA 분자가 세포에서 검출가능하게 복제되지 않거나,
    DNA 분자의 능력이 그러한 검정에서 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 적어도 99.9%만큼 감소되는, DNA 분자.
  89. 제88항에 있어서,
    DNA 분자가 아데노 관련 바이러스로부터 유래되고 야생형 바이러스가 동일한 아데노 관련 바이러스인, DNA 분자.
  90. 제89항에 있어서,
    아데노 관련 바이러스가 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 또는 AAV9인, DNA 분자.
  91. 발현 카세트의 상부 가닥의 5' 말단이, 역위 반복의 3' 상부 가닥 말단으로부터, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75, 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 약 85, 약 86, 약 87, 약 88, 약 89, 약 90, 약 91, 약 92, 약 93, 약 94, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 약 99, 약 100개의 뉴클레오티드, 100개 초과의 뉴클레오티드, 적어도 150개의 뉴클레오티드, 적어도 200개의 뉴클레오티드, 적어도 300개의 뉴클레오티드 또는 적어도 400개의 뉴클레오티드로 떨어져 있는,
    제1항 내지 제73항 중 어느 한 항의 DNA 분자, 제74항 및 제75항의 전달 비히클 또는 제76항 내지 제83항 중 어느 한 항의 방법.
  92. 발현 카세트의 상부 가닥의 3' 말단이, 역위 반복의 5' 상부 가닥 말단으로부터, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75, 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 약 80, 약 81, 약 82, 약 83, 약 84, 약 85, 약 86, 약 87, 약 88, 약 89, 약 90, 약 91, 약 92, 약 93, 약 94, 약 95, 약 96, 약 97, 약 98, 약 99, 약 100개의 뉴클레오티드, 100개 초과의 뉴클레오티드, 적어도 150개의 뉴클레오티드, 적어도 200개의 뉴클레오티드, 적어도 300개의 뉴클레오티드 또는 적어도 400개의 뉴클레오티드로 떨어져 있는,
    제1항 내지 제73항 중 어느 한 항의 DNA 분자, 제74항 및 제75항의 전달 비히클 또는 제76항 내지 제83항 중 어느 한 항의 방법.
  93. 1, 2, 3개 또는 모든 닉(예컨대 닉킹 엔도뉴클레아제 분해로 인한 닉)이 결찰되는,
    제37항 내지 제73항 중 어느 한 항의 DNA 분자, 제74항 및 제75항의 전달 비히클 또는 제76항 내지 제83항 중 어느 한 항의 방법.
  94. 제1항, 제5항 내지 제37항 및 제40항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서,
    하부 가닥이 발현 카세트에서 개방형 해독틀에 대해 안티센스(anti-sense) 배향인, DNA 분자.
  95. 제2항, 제5항 내지 제36항, 제38항 및 제40항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서,
    상부 가닥이 발현 카세트에서 개방형 해독틀에 대해 안티센스 배향인, DNA 분자.
  96. 제77항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
    DNA 분자가 제94항 또는 제95항의 DNA 분자인, 방법.
  97. 제77항 내지 제84항 및 제96항 중 어느 한 항의 방법으로부터 생성된 DNA 분자.
  98. DNA 분자가
    a. 임의의 전사 활성을 결여한 제1 역위 반복을 포함하고/하거나;
    b. 임의의 전사 활성을 결여한 제2 역위 반복을 포함하고/하거나;
    c. (iii) P5 AAV 프로모터 활성을 결여하거나 (적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 적어도 99.9%) 감소된 P5 AAV 프로모터 활성을 갖는,
    제1항 내지 제73항 중 어느 한 항의 DNA 분자, 제74항 및 제75항의 전달 비히클 또는 제76항 내지 제83항 중 어느 한 항의 방법.
  99. DNA 분자가
    a. 전사 활성을 결여한 제1 역위 반복을 포함하고/하거나;
    b. 전사 활성을 결여한 제2 역위 반복을 포함하고/하거나;
    c. 전사적으로 활성인 역위 반복에서 임의의 다른 요소를 결여한,
    제1항 내지 제73항 중 어느 한 항의 DNA 분자, 제74항 및 제75항의 전달 비히클 또는 제76항 내지 제83항 중 어느 한 항의 방법.
  100. DNA 분자가
    a. 제1 역위 반복 내의 임의의 CpG 모티프가 전사적으로 비활성이도록 결실되거나 돌연변이화되고/되거나;
    b. 제2 역위 반복 내의 임의의 CpG 모티프가 전사적으로 비활성이도록 결실되거나 돌연변이화되고/되거나;
    c. 역위 반복 내의 전사 활성에 요구되는 임의의 다른 요소가 기능적으로 비활성이도록 결실되거나 돌연변이화된,
    제1항 내지 제73항 중 어느 한 항의 DNA 분자, 제74항 및 제75항의 전달 비히클 또는 제76항 내지 제83항 중 어느 한 항의 방법.
  101. DNA 분자가
    a. 제1 역위 반복 내의 임의의 CpG 모티프가 톨 유사 수용체 9 결합을 감소시키도록 결실되거나 돌연변이화되고/되거나;
    b. 제2 역위 반복 내의 임의의 CpG 모티프가 톨 유사 수용체 9 결합을 감소시키도록 결실되거나 돌연변이화되고/되거나;
    c. 역위 반복 내의 톨 유사 수용체 9 결합에 요구되는 임의의 다른 요소가 기능적으로 비활성이도록 결실되거나 돌연변이화된,
    제1항 내지 제73항 중 어느 한 항의 DNA 분자, 제74항 및 제75항의 전달 비히클 또는 제76항 내지 제83항 중 어느 한 항의 방법.
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AU (1) AU2021314809A1 (ko)
BR (1) BR112023001648A2 (ko)
CA (1) CA3189740A1 (ko)
IL (1) IL299925A (ko)
MX (1) MX2023001109A (ko)
WO (1) WO2022023284A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015110957A2 (en) 2014-01-21 2015-07-30 De Beer Joel Hybridosomes, compositions comprising the same, processes for their production and uses thereof
US20230272432A1 (en) 2020-07-27 2023-08-31 Anjarium Biosciences Ag Compositions of dna molecules, methods of making therefor, and methods of use thereof
WO2023192492A1 (en) * 2022-03-31 2023-10-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Modification-dependent enrichment of dna by genome of origin
WO2023201364A2 (en) * 2022-04-15 2023-10-19 Dyno Therapeutics, Inc. Capsid variants and methods of using the same

Family Cites Families (155)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0018120D0 (en) 2000-07-24 2000-09-13 Fermentas Ab Nuclease
US6660475B2 (en) 2000-12-15 2003-12-09 New England Biolabs, Inc. Use of site-specific nicking endonucleases to create single-stranded regions and applications thereof
US7081358B2 (en) 2001-08-23 2006-07-25 New England Biolabs, Inc. Method for engineering strand-specific, sequence-specific, DNA-nicking enzymes
US7011966B2 (en) 2003-04-16 2006-03-14 New England Biolabs, Inc. Method for cloning and expression of AcuI restriction endonuclease and AcuI methylase in E. coli
US7943303B2 (en) 2003-12-18 2011-05-17 New England Biolabs, Inc. Method for engineering strand-specific nicking endonucleases from restriction endonucleases
WO2005120152A2 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use
US7799565B2 (en) 2004-06-07 2010-09-21 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering RNA
US20060051405A1 (en) 2004-07-19 2006-03-09 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions for the delivery of therapeutic agents and uses thereof
WO2006012593A1 (en) 2004-07-22 2006-02-02 Shuang-Yong Xu Nicking endonuclease methods and compositions
KR101366482B1 (ko) 2004-12-27 2014-02-21 사일런스 테라퓨틱스 아게 코팅된 지질 복합체 및 이들의 용도
PT2816118T (pt) 2005-05-31 2018-11-28 Univ Colorado Regents Métodos para administração de genes
CA2665225C (en) 2006-10-03 2015-06-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid containing formulations
CA3044134A1 (en) 2008-01-02 2009-07-09 Arbutus Biopharma Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
DK2279254T3 (en) 2008-04-15 2017-09-18 Protiva Biotherapeutics Inc PRESENT UNKNOWN LIPID FORMS FOR NUCLEIC ACID ADMINISTRATION
WO2009132131A1 (en) 2008-04-22 2009-10-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Amino lipid based improved lipid formulation
EP2789691B1 (en) 2008-08-22 2018-08-08 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration
CN102245590B (zh) 2008-10-09 2014-03-19 泰米拉制药公司 改善的氨基脂质和递送核酸的方法
WO2010048536A2 (en) 2008-10-23 2010-04-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Processes for preparing lipids
US8709778B2 (en) 2008-10-28 2014-04-29 Xavier Danthinne Method of adenoviral vector synthesis
WO2010054384A1 (en) 2008-11-10 2010-05-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipids and compositions for the delivery of therapeutics
MX359674B (es) 2008-11-10 2018-10-05 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lipidos y composiciones novedosas para el suministro de terapeuticos.
US20120101148A1 (en) 2009-01-29 2012-04-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. lipid formulation
WO2010129709A1 (en) 2009-05-05 2010-11-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid compositions
CA2764609C (en) 2009-06-10 2018-10-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Improved cationic lipid of formula i
WO2011000106A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
IL292615B2 (en) 2009-07-01 2023-11-01 Protiva Biotherapeutics Inc Nucleic acid-lipid particles, preparations containing them and their uses
WO2011022460A1 (en) 2009-08-20 2011-02-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel cationic lipids with various head groups for oligonucleotide delivery
EP2480668A2 (en) 2009-09-23 2012-08-01 Protiva Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for silencing genes expressed in cancer
US20130022649A1 (en) 2009-12-01 2013-01-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Snalp formulations containing antioxidants
EP3296398A1 (en) 2009-12-07 2018-03-21 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
WO2011088081A1 (en) 2010-01-12 2011-07-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Restrictive inverted terminal repeats for viral vectors
EP2525781A1 (en) 2010-01-22 2012-11-28 Schering Corporation Novel cationic lipids for oligonucleotide delivery
WO2011141705A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel cationic lipids and methods of use thereof
US10077232B2 (en) 2010-05-12 2018-09-18 Arbutus Biopharma Corporation Cyclic cationic lipids and methods of use
DK2575767T3 (en) 2010-06-04 2017-03-13 Sirna Therapeutics Inc HOWEVER UNKNOWN LOW MOLECULAR CATIONIC LIPIDS TO PROCESS OIGONUCLEOTIDES
WO2012000104A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
WO2012016184A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
JP5981916B2 (ja) 2010-08-16 2016-09-07 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ アデノウイルスの構築方法
RS63949B1 (sr) 2010-08-31 2023-02-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
PL2480678T3 (pl) 2010-09-02 2014-08-29 Molmed Spa Stabilna produkcja wektorów lentiwirusowych
US9133481B2 (en) 2010-09-02 2015-09-15 Molmed S.P.A. Semi-stable production of lentiviral vectors
ES2888231T3 (es) 2010-09-20 2022-01-03 Sirna Therapeutics Inc Lípidos catiónicos de bajo peso molecular para el suministro de oligonucleótidos
AU2011307277A1 (en) 2010-09-30 2013-03-07 Merck Sharp & Dohme Corp. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
EP3485913A1 (en) 2010-10-21 2019-05-22 Sirna Therapeutics, Inc. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
EP3202760B1 (en) 2011-01-11 2019-08-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Pegylated lipids and their use for drug delivery
EP2673286B1 (en) 2011-02-12 2019-07-03 University of Iowa Research Foundation Therapeutic compounds
EP2500434A1 (en) 2011-03-12 2012-09-19 Association Institut de Myologie Capsid-free AAV vectors, compositions, and methods for vector production and gene delivery
WO2012162210A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Ring constrained cationic lipids for oligonucleotide delivery
JP2014520806A (ja) 2011-07-06 2014-08-25 ノバルティス アーゲー Ｒｎａ分子の送達のための有用なｎ：ｐ比を有するリポソーム
WO2013016058A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel bis-nitrogen containing cationic lipids for oligonucleotide delivery
LT2750707T (lt) 2011-08-31 2019-01-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegilintos liposomos, skirtos imunogeną koduojančios rnr pristatymui
CA2849476A1 (en) 2011-09-27 2013-04-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Di-aliphatic substituted pegylated lipids
US9061063B2 (en) 2011-12-07 2015-06-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
US9463247B2 (en) 2011-12-07 2016-10-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Branched alkyl and cycloalkyl terminated biodegradable lipids for the delivery of active agents
US20140308304A1 (en) 2011-12-07 2014-10-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipids for the delivery of active agents
EP2792367A4 (en) 2011-12-12 2015-09-30 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd LIPID NANOPARTICLES FOR A DRUG DELIVERY SYSTEM CONTAINING CATIONIC LIPIDS
WO2013116126A1 (en) 2012-02-01 2013-08-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel low molecular weight, biodegradable cationic lipids for oligonucleotide delivery
RU2718053C2 (ru) 2012-02-24 2020-03-30 Протива Байотерапьютикс Инк. Триалкиловые катионные липиды и способы их использования
US9446132B2 (en) 2012-03-27 2016-09-20 Sima Therapeutics, Inc. Diether based biodegradable cationic lipids for siRNA delivery
JP6449175B2 (ja) 2013-02-15 2019-01-09 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 眼の遺伝子関連疾患の治療のための方法及び組成物
EP2970966A4 (en) 2013-03-15 2016-10-26 Univ North Carolina SYNTHETIC ADENOASSOZED VIRUS INVERTED REPEAT SEQUENCES
EP3004343B1 (en) 2013-06-07 2018-10-10 The Regents of The University of California Cycle adenosine monophosphate-incompetent adenylyl cyclase and compositions and methods for treating heart failure and increasing cardiac function
EA201690576A1 (ru) 2013-10-22 2016-10-31 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Липидные композиции для доставки матричной рнк
US9593077B2 (en) 2013-11-18 2017-03-14 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for RNA delivery
EP3083579B1 (en) 2013-12-19 2022-01-26 Novartis AG Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
US10059655B2 (en) 2013-12-19 2018-08-28 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
WO2015110957A2 (en) 2014-01-21 2015-07-30 De Beer Joel Hybridosomes, compositions comprising the same, processes for their production and uses thereof
HUE060907T2 (hu) 2014-06-25 2023-04-28 Acuitas Therapeutics Inc Új lipidek és lipid nanorészecske formulációk nukleinsavak bevitelére
CN104095665B (zh) 2014-07-15 2016-06-08 中国人民解放军第二军医大学 膜式输尿管结石阻挡取出器
WO2016033338A1 (en) 2014-08-27 2016-03-03 The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Methods and compositions for treating leber congenital amaurosis
KR20230169197A (ko) 2014-11-14 2023-12-15 보이저 테라퓨틱스, 인크. 근위축성 측삭 경화증(als)을 치료하는 조성물 및 방법
DK3221293T3 (da) 2014-11-18 2023-04-03 Arcturus Therapeutics Inc Ioniserbar kationisk lipid til RNA-afgivelse
WO2016094783A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
EP3245221A4 (en) 2015-01-16 2018-06-13 Voyager Therapeutics, Inc. Central nervous system targeting polynucleotides
GB201502645D0 (en) 2015-02-17 2015-04-01 Touchlight Genetics Ltd Method
DK3313829T3 (da) 2015-06-29 2024-06-17 Acuitas Therapeutics Inc Lipider og lipide nanopartikelformuleringer til levering af nukleinsyrer
RS63030B1 (sr) 2015-09-17 2022-04-29 Modernatx Inc Jedinjenja i kompozicije za intracelularno isporučivanje terapeutskih sredstava
AU2016338565B2 (en) 2015-10-14 2021-11-18 Audentes Therapeutics, Inc. Nucleic acid molecules containing spacers and methods of use thereof
HUE061564T2 (hu) 2015-10-28 2023-07-28 Acuitas Therapeutics Inc Új lipidek és lipid nanorészecske készítmények nukleinsavak bevitelére
CA3007955A1 (en) 2015-12-10 2017-06-15 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of therapeutic agents
US20190022247A1 (en) 2015-12-30 2019-01-24 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
US11065347B2 (en) 2016-01-19 2021-07-20 The Regents Of The University Of California Methods for the treatment of Danon disease and other disorders of autophagy
US11066679B2 (en) 2016-03-03 2021-07-20 University Of Massachusetts Closed-ended linear duplex DNA for non-viral gene transfer
AU2017268382B2 (en) 2016-05-18 2023-09-28 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating Huntington's disease
US20190203229A1 (en) 2016-05-26 2019-07-04 University Of Iowa Research Foundation cis AND trans REQUIREMENTS FOR TERMINAL RESOLUTION OF HUMAN BOCAVIRUS 1
WO2018004514A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 Nokia Solutions And Networks Oy Duplex distance modification and blank nb-iot subcarriers
US20180020547A1 (en) 2016-07-13 2018-01-18 Alcatel-Lucent Canada Inc. Underlying recessed component placement
MX2019005235A (es) 2016-11-09 2019-12-05 Intrexon Corp Constructos de expresion de frataxina.
US11739346B2 (en) 2017-04-05 2023-08-29 University Of Massachusetts Minigene therapy
CA3059891A1 (en) 2017-04-14 2018-10-18 National Taiwan University Gene therapy for aadc deficiency
EP3619310A4 (en) 2017-05-05 2021-01-27 Voyager Therapeutics, Inc. MODULATORY POLYNUCLEOTIDES
CA3063907A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Therapeutics for glycogen storage disease type iii
CN109252337B (zh) * 2017-07-14 2021-06-04 重庆海尔滚筒洗衣机有限公司 一种滚筒洗衣机
EP3662060A2 (en) 2017-08-03 2020-06-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
KR20200035130A (ko) 2017-08-09 2020-04-01 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 핵산 분자 및 이의 용도
EP3665290A1 (en) 2017-08-09 2020-06-17 The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Closed-ended, linear, duplex adenoassociated virus dna, and uses thereof
CN111132699A (zh) 2017-09-08 2020-05-08 世代生物公司 修饰的封闭端dna(cedna)
CA3075180A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle formulations of non-viral, capsid-free dna vectors
KR20200060456A (ko) 2017-09-27 2020-05-29 리젠엑스바이오 인크. 완전-인간 번역후 변형된 항-VEGF Fab를 이용한 안구 질환의 치료
GB2568255A (en) 2017-11-08 2019-05-15 Evox Therapeutics Ltd Exosomes comprising RNA therapeutics
GB201718681D0 (en) 2017-11-13 2017-12-27 Evox Therapeutics Ltd Protein engineered extracellular vesicles
CN111527200A (zh) * 2017-12-06 2020-08-11 世代生物公司 使用修饰的封闭端DNA(ceDNA)的基因编辑
US11667941B2 (en) 2018-01-12 2023-06-06 Camena Bioscience Limited Compositions and methods for template-free geometric enzymatic nucleic acid synthesis
GB201800921D0 (en) 2018-01-19 2018-03-07 Evox Therapeutics Ltd Intracellular delivery of target silencing technology
CN111868242A (zh) 2018-01-19 2020-10-30 世代生物公司 能从无细胞合成中获得的封闭端DNA载体和用于获得ceDNA载体的方法
KR20200120649A (ko) 2018-02-14 2020-10-21 제너레이션 바이오 컴퍼니 비-바이러스 dna 벡터 및 항체 및 융합 단백질 생산을 위한 이의 용도
CN111886343A (zh) 2018-02-22 2020-11-03 世代生物公司 使用闭合端dna（cedna）载体控制转基因的表达
CA3092459A1 (en) * 2018-03-02 2019-09-06 Generation Bio Co. Closed-ended dna (cedna) vectors for insertion of transgenes at genomic safe harbors (gsh) in humans and murine genomes
US20210079406A1 (en) 2018-04-10 2021-03-18 President And Fellows Of Harvard College Aav vectors encoding clarin-1 or gjb2 and uses thereof
EP3790979A4 (en) 2018-05-08 2022-04-27 Neuracle Science Co., Ltd RELEASE OF ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV) FROM ANTI-FAM19A5 ANTIBODIES
US20210230632A1 (en) 2018-05-15 2021-07-29 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
EP3796893A1 (en) 2018-05-23 2021-03-31 Modernatx, Inc. Delivery of dna
JP2021528959A (ja) 2018-06-22 2021-10-28 アスクレピオス バイオファーマシューティカル， インコーポレイテッド 細胞内で存続する遺伝子送達のためのベクター
JP7371083B2 (ja) 2018-07-20 2023-10-30 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 遺伝子治療発現ベクターの眼内送達
EP3833746B1 (en) 2018-08-08 2023-03-29 Genethon Mini-gde for the treatment of glycogen storage disease iii
WO2020033863A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
WO2020077165A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
UY38407A (es) 2018-10-15 2020-05-29 Novartis Ag Anticuerpos estabilizadores de trem2
EP3870202A1 (en) 2018-10-24 2021-09-01 Bristol-Myers Squibb Company Miniaturized dystrophins and uses thereof
CN113316640A (zh) 2018-11-09 2021-08-27 世代生物公司 包含对称的被修饰的反向末端重复序列的被修饰的封闭端dna(cedna)
TW202043484A (zh) 2019-01-14 2020-12-01 英商卡美納生物科學公司 用於無模板幾何型酶催化性核酸合成之組成物和方法
KR20210119416A (ko) 2019-01-24 2021-10-05 제너레이션 바이오 컴퍼니 폐쇄-말단 dna (cedna), 및 유전자 또는 핵산 치료 관련 면역 반응을 감소시키는 방법에서의 이의 용도
US20220298494A1 (en) 2019-02-14 2022-09-22 Metagenomi Ip Technologies, Llc Enzymes with ruvc domains
EP3924491A4 (en) 2019-02-15 2022-12-14 Generation Bio Co. MODULATION OF REP PROTEIN ACTIVITY IN CLOSED-END DNA PRODUCTION
AU2020232790A1 (en) * 2019-03-06 2021-09-16 Generation Bio Co. Non-active lipid nanoparticles with non-viral, capsid free DNA
JP2022523806A (ja) 2019-03-06 2022-04-26 ジェネレーション バイオ カンパニー 閉端ｄｎａ（ｃｅｄｎａ）および免疫調節化合物
MX2021011039A (es) 2019-03-13 2021-12-15 Generation Bio Co Vectores de adn no virales y usos de estos para expresar agentes terapéuticos con fviii.
CN113874508A (zh) 2019-03-13 2021-12-31 世代生物公司 非病毒dna载体及其用于表达苯丙氨酸羟化酶(pah)治疗剂的用途
US20220184232A1 (en) 2019-03-25 2022-06-16 The Regents Of The University Of California Methods of treating tnni3-mediated cardiomyopathy
EP3956456A1 (en) 2019-04-17 2022-02-23 Codiak BioSciences, Inc. Compositions of exosomes and aav
WO2020214796A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 University Of Massachusetts Gene therapies for usher syndrome (ush2a)
US20220175967A1 (en) 2019-04-19 2022-06-09 University Of Massachusetts Gene therapies for usher syndrome (ush1b)
CA3137135A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 University Of Massachusetts Gene therapies for stargardt disease (abca4)
US20220315948A1 (en) 2019-04-26 2022-10-06 President And Fellows Of Harvard College Aav vectors encoding mini-pcdh15 and uses thereof
US20220168222A1 (en) 2019-04-26 2022-06-02 Genevant Sciences Gmbh Lipid nanoparticles
CN114206353A (zh) 2019-05-20 2022-03-18 马萨诸塞大学 小基因疗法
US20220243212A1 (en) 2019-06-21 2022-08-04 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Production of vectors using phage origin of replication
AU2020300519A1 (en) 2019-06-30 2022-02-24 John Fraser Wright Recombinant AAV vectors with altered immunogencity and methods of making the same
WO2021011842A1 (en) 2019-07-17 2021-01-21 Generation Bio Co. Synthetic production of single-stranded adeno associated viral dna vectors
US20220228171A1 (en) 2019-07-17 2022-07-21 Generation Bio Co. Compositions and production of nicked closed-ended dna vectors
JP2022542839A (ja) 2019-07-19 2022-10-07 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー リコンビナーゼ組成物及び使用方法
CA3147728A1 (en) 2019-08-12 2021-02-18 Generation Bio Co. Methods and compositions for reducing gene or nucleic acid therapy-related immune responses
BR112022002708A2 (pt) 2019-08-14 2022-05-31 Acuitas Therapeutics Inc Nanopartículas lipídicas aperfeiçoadas para a liberação de ácidos nucleicos
US20220280603A1 (en) 2019-08-15 2022-09-08 University Of Massachusetts Targeting of the cytoskeleton as a therapeutic approach for neurodegenerative disease
EP4025196A4 (en) 2019-09-06 2023-07-12 Generation Bio Co. LIPID-NANOPARTICLE COMPOSITIONS WITH CLOSED-END DNA AND CLEAVABLE LIPIDS AND METHODS OF USE
EP3792367A1 (en) 2019-09-11 2021-03-17 Universität Bielefeld Method for the production of raav and method for the in vitro generation of genetically engineered, linear, single-stranded nucleic acid fragments containing itr sequences flanking a gene of interest
CN115103710A (zh) 2019-09-30 2022-09-23 应用遗传科技公司 用于治疗遗传性听力损失的腺相关病毒(aav)***
EP4041317A4 (en) 2019-10-11 2024-05-22 University of Massachusetts RAAV-MEDIATED IN VIVO ADMINISTRATION OF ARNT SUPPRESSANTS
US20230183711A1 (en) 2019-10-15 2023-06-15 University Of Massachusetts Aav production strategy using a cell line expressing an inducible rep gene
WO2021076566A1 (en) 2019-10-16 2021-04-22 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Compositions and methods for treating liver disease
EP4061403A4 (en) 2019-11-19 2023-12-27 Spark Therapeutics, Inc. SECRETABLE PROTEIN-INDUCED IMMUNE TOLERANCE AND TREATMENT OF AUTOIMMUNE, ALLERGIC AND OTHER DISEASES AND DISORDERS
US20220370357A1 (en) 2019-11-22 2022-11-24 Generation Bio Co. Ionizable lipids and nanoparticle compositions thereof
JP2023502473A (ja) 2019-11-22 2023-01-24 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー リコンビナーゼ組成物及び使用方法
CN115335529A (zh) 2019-11-26 2022-11-11 马萨诸塞大学 用于递送kh902(康柏西普)的重组腺相关病毒及其用途
US20230272432A1 (en) 2020-07-27 2023-08-31 Anjarium Biosciences Ag Compositions of dna molecules, methods of making therefor, and methods of use thereof

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