KR20230052721A - 뿌리혹병 저항성을 유도하는 BrEXLB1 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents
뿌리혹병 저항성을 유도하는 BrEXLB1 프로모터 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 배추 유래 뿌리혹병(Clubroot) 저항성 유전자를 포함하는 BrEXLB1 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 배추로부터 분리한 BrEXLB1(Expansin-like B1)프로모터가 도입되어 뿌리혹병에 대한 저항성이 발현된 형질전환 배추 및 배추과 작물의 뿌리혹병 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 BrEXLB1 프로모터는 뿌리혹병 저항성을 유도하는 목적 유전자를 발현시킬 수 있으며, 전신 후천성 저항성 반응(Systemic acquired resistance, SAR) 기능을 가지므로 식물의 전체 조직에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있어, 이를 이용하여 뿌리혹병 저항성 식물체의 개발에 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명의 BrEXLB1 프로모터는 뿌리혹병 저항성을 유도하는 목적 유전자를 발현시킬 수 있으며, 전신 후천성 저항성 반응(Systemic acquired resistance, SAR) 기능을 가지므로 식물의 전체 조직에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있어, 이를 이용하여 뿌리혹병 저항성 식물체의 개발에 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 배추 유래 뿌리혹병(Clubroot) 저항성 유전자를 포함하는 BrEXLB1 프로모터 및 이의 용도에 관한 것이다.
뿌리혹병(Clubroot)은 무사마귀병 또는 근류병이라고도 불리는 토양 전염병으로서, 반드시 살아있는 식물체 내에서만 증식이 가능한 절대 기생균의 일종인 플라스모디오포라 브라시캐(Plasmodiophora brassicae)에 의해 발병된다. 토양 곰팡이 병원균 Plasmodiophora brassicae 에 의해 작물의 뿌리에 큰 혹이 형성되므로 잔 뿌리가 없어져서 양분과 수분의 흡수가 부족하게 되고, 이로 인해 작물은 왜소해지고 말라 죽게되는 병으로 심각한 수율 감소를 유발한다.
이러한 뿌리혹병은 배추, 무, 양배추 등 십자화과를 재배하는 농가에 막대한 피해를 끼치나 뿌리혹병의 병원균은 휴면포자, 유주자, 변형체등의 형태로 토양내에 존재하여 그 퇴치가 어려우며 토양 중에 존재하는 병원균의 휴면포자는 기주식물없이 수년간 생존할 수 있고, 빗물, 흙바람, 농기구등에 의해서 멀리까지 전파될 수 있다.
뿌리혹병을 방제하기 위해서 토양에 석회를 넣어 pH를 높이는 방법, 배추과 작물 이외의 작물과 윤작 등이 있지만 현실적으로 이와 같은 방법으로는 방제가 어려운 실정이다. 또한, 플루아지남 등의 살균제를 이용하여 방제하는 화학적 방제 방법이 널리 이용되고 있지만, 토양 오염과 환경 독성 등의 문제로 인하여 오늘날에는 살균제를 사용하지 않거나 소량의 살균제를 사용하여 재배하는 뿌리혹병 저항성 배추 품종을 재배하는 방법을 선호하고 있다.
한편, 익스판신(expansine)은 세포벽의 신장을 위한 가장 중요한 인자로, 셀룰로오스 미세섬유(microfibril)와 매트릭스 폴리머 사이의 수소결합을 느슨하게 함으로써 세포벽의 변형을 야기하는 것으로 알려져 있다. 익스판신 유전자는 최초로 클로닝된 후(Shcherban T. Y. et al.,1995) 다양한 식물 종으로부터 많은 종류의 유전자들이 동정되었으며, 이들은 다중유전자족(multigene family)을 형성하는 것으로 알려져 있다(Cosgrove D. J., 1998).
본 발명자들은 배추의 53개 익스판신 패밀리(expansine family) 중 하나인 Expansin-like B1 단백질의 발현 조절을 통해 뿌리혹병에 저항성을 나타낼 수 있음을 확인하고 배추를 형질전환 시켜 본 발명을 완성하였다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 식물의 뿌리혹병 저항성을 유도하는 BrEXLB1(Expansin-like B1) 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체 및 상기 재조합 벡터로 식물을 형질전환시켜 뿌리혹병 저항성을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 식물의 뿌리혹병 저항 유도성 BrEXLB1(Expansin-like B1) 프로모터이다.
또한, 본 발명은 상기 BrEXLB1 프로모터와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 식물의 뿌리혹병 저항 유도성 재조합 벡터이다.
또한, 본 발명은 상기 식물의 뿌리혹병 저항 유도성 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움(Agrobacterium)이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터 또는 상기 아그로박테리움으로 형질전환된 형질전환 식물체이다.
상기 식물체는 배추, 양배추, 유채, 청경채, 겨자, 갓, 케일, 무, 브로콜리 및 콜라비로 이루어진 십자화과 작물군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물을 형질전환시켜 목적 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 식물체에 발현시키는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법이다.
상기 목적 단백질을 코딩하는 외래 유전자는 식물의 뿌리혹병 저항성을 유도할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진, 프라이머 세트이다.
본 발명의 BrEXLB1 프로모터는 뿌리혹병 저항성을 유도하는 목적 유전자를 발현시킬 수 있으며, 전신 후천성 저항성 반응(Systemic acquired resistance, SAR) 기능을 가지므로 식물의 전체 조직에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있어, 이를 이용하여 뿌리혹병 저항성 식물체의 개발에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 배추의 조직별 EXLB1 유전자의 발현을 나타낸 것이다. Lane 1:종자, 2:정단분열조직, 3:자엽, 4:하배축, 5:잎, 6:뿌리, 7:수술, 8:암술, 9:꼬투리를 나타낸다.
도 2는 뿌리혹병 현탁액 (1.0x106 spores/ml) 처리 시기별 BrEXLB1의 발현 양상을 나타낸 것이다.
도 3은 BrEXLB1 프로모터의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 4는 BrEXLB1 프로모터를 도입하기 위한 배추 형질전환용 벡터를 나타낸 것이다.
도 5는 BrEXLB1 프로모터가 도입된 배추 형질전환체에 뿌리혹병 현탁액을 처리한 후의 시기별 GUS 발현을 나타낸 것이다.
도 2는 뿌리혹병 현탁액 (1.0x106 spores/ml) 처리 시기별 BrEXLB1의 발현 양상을 나타낸 것이다.
도 3은 BrEXLB1 프로모터의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 4는 BrEXLB1 프로모터를 도입하기 위한 배추 형질전환용 벡터를 나타낸 것이다.
도 5는 BrEXLB1 프로모터가 도입된 배추 형질전환체에 뿌리혹병 현탁액을 처리한 후의 시기별 GUS 발현을 나타낸 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 발명자는 배추의 53개 익스판신 패밀리(expansine family) 중 하나인 Expansin-like B1 단백질의 발현 조절을 통해 뿌리혹병에 저항성을 나타낼 수 있음을 확인하고 배추에 형질전환을 수행하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 식물의 뿌리혹병 저항 유도성 BrEXLB1(Expansin-like B1) 프로모터이다.
본 발명에서 “프로모터”란 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription) 되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등으로 이루어져 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지해야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평상시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 조직 특이 프로모터(tissue specific promoter) 또는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉, 조직 특이 프로모터는 생물체의 발달 과정에서, 유도성 프로모터는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다.
본 발명의 BrEXLB1(Expansin-like B1) 프로모터는 식물의 뿌리혹병 저항 유도성 프로모터로, 서열번호 1의 염기서열을 가지나 상기 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열, 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 더 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서, 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 프로모터도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 “상동성”이란 야생형(wild type) 염기서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 염기서열 및 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
본 발명의 BrEXLB1 프로모터는 뿌리혹병균(Plasmodiophora brassicae) 처리 시에 식물체의 전체 조직에서 목적 단백질 내지 목적 유전자 RNA를 발현시킬 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터이다.
본 발명에서 “재조합 벡터”란 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다.
본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결(operably linked)되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 염기 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는, 이 기술 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 외부자극 저항 유도성 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.
상기 “작동 가능하게 연결(operably linked)”된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. “발현 조절 서열(expression control sequence)”이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.
상기 본 발명에 따른 발현 벡터로는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream) 쪽으로 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로는 다양한 클로닝 부위를 가지고 있는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드일 수 있고, 식물 바이러스 벡터일 수 있으며, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 벡터(binary vector) 또는 박테리아인공염색체(bacterial artificial chromosome, BAC)를 사용할 수도 있다. 그러나 이 기술 분야의 통상의 기술자라면 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 상기 목적 단백질은 본 발명의 프로모터에 의해 식물체 조직 특이적으로 발현되기를 원하는 외부 유래의 어떤 표적 단백질, 즉, 외인성 단백질이거나 또는 내인성 단백질 및 리포터 단백질일 수 있다. 상기 외인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하지 않는 단백질을 말하며, 상기 내인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하는 유전자에 의해 발현되는 단백질을 말한다. 또한, 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의해서 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다.
또한, 본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택할 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 청색 발색 유전자인 GUS가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 공지된 벡터에 서열번호 1의 염기서열을 가지는 본 발명의 BrEXLB1 프로모터를 GUS 유전자의 상류 부분에 작동 가능하게 연결한 재조합 벡터인 BrEXLB1 프로모터-GUS 발현 벡터를 제조하였다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체이고, 상기 형질전환체는 아그로박테리움이다.
본 발명에서 “형질전환(transformation)”이란 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 상기 서열번호 1로 표시되는 프로모터 도입에 의해 목적 유전자가 발현되는 것을 의미한다.
본 발명에서 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 또는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 관점은, 상기 재조합 벡터 또는 아그로박테리움으로 형질전환된 형질전환 식물체이다.
본 발명에서 “식물체”는 식물 또는 식물세포를 의미한다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다.
상기 식물체로는 배추, 양배추, 유채, 청경채, 겨자, 갓, 케일, 무, 브로콜리 및 콜라비로 이루어진 십자화과 작물군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 배추일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 BrEXLB1 프로모터를 포함한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 미생물 형질전환체인, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101을 배추에 접종하여 형질전환 배추 식물체를 제작하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 본 발명의 BrEXLB1 프로모터-GUS 벡터 삽입이 확인된 형질전환 배추를 뿌리혹병 현탁액(1.0x106 spores/㎖)을 포함하는 배지에 노출 시킨 후, 시기별(1, 3, 5, 7, 10일)로 식물체에서 GUS 염색을 분석한 결과, 뿌리혹병균 처리 3일째부터 GUS의 강한 발현이 확인되었으며, 식물체의 전제 조직에서 발현이 나타났다. 이는 뿌리혹병균의 국부적 노출 후에 전신 내성이 발생된 결과로, BrEXLB1 프로모터가 전신 후천성 저항성 반응(Systemic acquired resistance, SAR) 기능을 가지고 있음을 의미하며, 뿌리혹병 저항성 작물 개발에 유용하게 활용할 수 있음을 시사한다.
본 발명은 또 다른 관점에서 재조합 벡터로 식물을 형질전환시켜 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 식물체에 발현시키는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법이다.
또한, 상기 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자는 식물의 뿌리혹병 저항성을 유도할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 목적 단백질 특이적 발현용 프로모터 및 목적 단백질을 암호화하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 재조합 벡터를 제조하고, 상기 발현 벡터로 아그로박테리움 투메파시엔스를 형질전환시킨 후, 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스를 배추에 감염시켜 형질전환 배추의 전체 조직에서 목적 단백질이 발현되는 것을 확인하였다.
따라서 상기 형질전환은 구체적으로 발현 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스를 배추에 감염시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 BrEXLB1 프로모터를 증폭하기 위한 서열번호 6 및 7의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트이다. 상기 프라이머 세트를 이용하여 효율적으로 BrEXLB1 프로모터를 분리할 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
<실시예 1> 배추 유래
EXLB1
유전자 발현 분석
식물의 세포벽 발현 유전자로 성장과 발달에 관여하는 익스판신 계열(expansin family)의 유전자를 선발하였다. 배추에서 알려진 53개의 익스판신 유전자 중 BrEXLB1(expansin-like B1) 유전자의 발현을 분석하였다.
먼저, 배추를 조직별(종자, 정단분열조직, 자엽, 하배축, 잎, 뿌리, 수술, 암술, 꼬투리)로 시료를 준비하여 르니지 플랜트 미니 키트(RNeasy Plant Mini Kit; Qiagen)로 RNA를 분리한 다음, 1㎍의 RNA를 사용하여 cDNA(PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit, Takara)를 합성하였다. 그 다음 BrEXLB1 특이 프라이머[BrEXLB1-F : TTGAACGTCTTGCATCTTCTGC(서열번호 2), BrEXLB1-R : TCAAGTAAGTAGAATGTTGGAGTTGT(서열번호 3)]를 이용하여 실시간 유전자 증폭반응(RT-PCR)을 통해 cDNA의 BrEXLB1 유전자 발현을 분석하였다.
도 1은 배추의 조직별 EXLB1 유전자의 발현을 나타낸 것이다. Lane 1:종자, 2:정단분열조직, 3:자엽, 4:하배축, 5:잎, 6:뿌리, 7:수술, 8:암술, 9:꼬투리를 나타낸다. RT-PCR(95℃ 5분 1사이클, 95℃ 15초, 60℃ 30초 45 사이클, 멜팅 1 step) 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 BrEXLB1는 배추 조직 중 종자, 뿌리, 암술 등에서 강하게 발현되는 것을 확인하였다.
<실시예 2> 뿌리혹병 처리 배추에서의
EXLB1
유전자 발현 분석
뿌리혹병균(Plasmodiophora brassicae)이 처리된 배추를 이용하여 BrEXLB1 유전자의 발현을 분석하였다.
먼저, 배추 종자를 36공 포트에 파종하여 10일간 온실 배양하였다. 그 다음 뿌리혹병 현탁액(1.0x106 spores/㎖)을 처리하고 시기별(1, 3, 5, 7, 10일)로 시료를 채취하여, 르니지 플랜트 미니 키트(RNeasy Plant Mini Kit; Qiagen)로 RNA를 분리한 다음, 1㎍의 RNA를 사용하여 cDNA(PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit, Takara)를 합성하였다.
프라이머[Clubroot-BrEXLB1-F : TATGGAGAGGGACATGGCAC(서열번호 4), Clubroot-BrEXLB1-R : CCTCTGGTACTCAACGTCGA(서열번호 5)]를 이용하여 실시간 유전자 증폭반응(RT-PCR) 결과, 뿌리혹병균을 처리한 시기에 따라 처리 1일째에 BrEXLB1 유전자가 대조구에 비해 약 2.2배 이상 발현이 증가하였으며, 처리 10일째에도 2배 이상 발현이 증가한 것을 확인하였다(도 2).
<실시예3> 프로모터 영역 분리 및 유전적 특성 분석
실시예1 및 2에서 확인한 바와 같이, 배추 및 뿌리혹병 처리 배추에서 특이적 발현을 나타낸 BrEXLB1 유전자로부터 프로모터 영역을 분리하기 위해 배추 BAC clone을 이용하여 표 1의 프라이머를 설계하였다.
| 프라이머 | 염기서열 |
| Promoter-BrEXLB1-F (서열번호6) |
5'- GATAATGATTCATATTCCCAGCACT - 3' |
| Promoter-BrEXLB1-R (서열번호7) |
5'- CATATTGTTATATGTAACTATTGTA - 3' |
RT-PCR(95℃ 5분 1사이클, 95℃ 15초, 60℃ 30초 45사이클, 멜팅 1 step)을 통해 얻은 PCR 산물을 게이트웨이 벡터(gateway donor vector)에 클로닝하고 전체 염기서열(-2.46 kb, 서열번호 1)을 결정하였다.
표 2에 BrEXLB1 프로모터의 염기서열을 표기하였다.
| BrEXLB1 프로모터의 염기서열(서열번호 1) |
| cccgcagcgg gtcaaatggg gcgggccccg cggataatga ttcatattcc cagcactaac 60ttcttataat gcgcaatctg caagaaattg catagcctgg gatttgaact gtagacttgg 120 gtatagaagc ttttaaacct ttaactatga ttgaaaaact atggtttagt gacaagttta 180 gagtttttaa acggcaacct tttcatttta attaacggag aaggggtgta gaaaagtttc 240 gacattagag caccattaac catgggtgtt taaggggtgc ttagattttt ttaattaaaa 300 aaaaggaaag agaagaagaa gaagaagaag gagtgcttaa ttagacatca caaacacctg 360 ttgtttgcac tatttgcggg ccctactgac acgtgacgac ccgcgattga ttcttttttt 420 taatcaaaaa aaaaaccaaa aaaaaataaa taattaagca ccccaatgga gtgctagtga 480 tgctcttaag ggtagttagg aattgggtct tacgaaaaat tgtttagcta acgactgagg 540 taaaaaaaat tgtgtagtcc atcggtacgt gtagacatta gccgtgttcg tttgttaacc 600 gcaagacgct cccgctgcgg caagaaaaag cacggtgatt atgatcaaaa taatagaatc 660 cgaagctaaa gtaactgcca acgatttccg gagacacaaa aaacaagacg ctggtgctgc 720 taaaattttc agcgtctctt ctactgccct tgagtcatcg gtgttgcgtg ttgttaatcg 780 ccgctgcggt catgggtgtt gtgtgttgac gtgattcccg tttaattttt ggtcgttgcc 840 gctgcgtctt gcggctaaga aacgaacacg gctattatac gctattaccc caaagagtaa 900 ttgtgttagc aacgatgaat gaatgtgtat aaagtattaa cttttcatga aatgattatc 960 tcactcacaa gaatattata taaactatga caaagagaat ttttatagga agttaggaga 1020 ctaaaaatat cattataagt ggattacaac caaaccaaca acaaagaggg tttactatat 1080 atgaatctca ttttattaga cttatagaat cctttttgtc tttctcctcc tactcttaca 1140 ttatataaaa acgattaatt tattcaaata aagagcaagg ctgctaatca tataccctac 1200 cacccaatgt gttttattca catcactaaa aattatgaca tacataacaa ggattacgtg 1260 gtgtgtttat cttaatttga acatcaatga acaaacatat ttcgtgaaat actttagtca 1320 atttgtgaat tatataaagt aaaatgcttt ttttttcaat ttgccatatc tatcgatgcg 1380 cgcgatagta agttaaaatc aacgtgcgtg tgtttttata ggtttttgtt tacttcaatg 1440 tgtggcatgg aagaaaaatt tattcgtaag acaaccagcc gatcaaagtc agatactcca 1500 aatgaagatt tggactcgag tcactcgact gatcaagatt caagcaatat gaggaagaag 1560 aaaaaaaaaa ctcttctgcg ataatgacct aaactagatc atgttttgag gttcttccaa 1620 ccctctccaa tagcaagttc aatttgggag gatgtgaact gatatttttc caaactattt 1680 ccaaggcata aatagattgt atagaggtca taataaatta attataggtg aggcatgcat 1740 aaaacttgaa ctcaagacat aggtgtcaaa aaaaaagaag attttaacca tcattctcag 1800 cacaataata acatctgacc ccctccaacc aaaaaggctc cgccactggg tacaacttgc 1860 tagcccatat attttatcag atgatctttt tgttaatatt ttacacaatc tgaactacta 1920 aaatgctagt agtgaaaaac aatgaaaact ctgcgagtcc aaatagtagc acgcttggca 1980 tattctattg acttcgttca ctgattacac caaacaacta atcgtaagtc aatcttataa 2040 ctattaggtg tcatgaactt ctcgttttgg aggcacaacc tatctttctt taataattac 2100 tagaccccaa agatacaccc ccaccattgt attttgctgt attgggcaga cgatgtatat 2160 atgatataaa cattttattt aatacatttg accctctcaa gctaaactat caaatcgggt 2220 aatgcaatta cgcgttataa cttatatata gctagattac tttttgccaa gtggaaagaa 2280 aagaatagta acgatgctcg atcaaattgc atataatatt gtaatagaca cccatacctt 2340 caactataaa taccttgtta aacttctcct ctgtcttcac atatcttctg taacacatat 2400 ctatcttccc aaatcacttg ttaaaaataa tcttacaata gttacatata acaatatgaa 2460 gac |
PlantCare 데이터베이스를 이용하여 염기서열을 분석한 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, BrEXLB1 프로모터는 병 관련 도메인(TC-rich repeats, GTTTTCTTAC)과 뿌리 특이적 유도 염기서열인 GCCAC를 포함하고, 여러 개의 빛 반응요소(light responsive element)인 G-box, GT1-motif 및 옥신 반응요소인 TGA-element 등을 포함하고 있었다.
<실시예 4>
BrEXLB1
프로모터-GUS 발현벡터 및 형질전환 배추
BrEXLB1 프로모터의 기능을 확인하기 위해, GUS유전자를 리포터로 이용하고, 항생제 선발 마커로는 hygromycin 저항성 유전자(hpt)를 포함하는 배추 형질전환용 벡터를 구축하였다.
도 4는 BrEXLB1 프로모터를 도입하기 위한 배추 형질전환용 벡터를 나타낸 것이다. 도 4의 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101에 형질전환하고 카나마이신(kanamycin)을 이용하여 형질전환 박테리아를 선별하고 배추의 세포에 형질전환하였다. T0식물들은 하이그로마이신(hygromycin) 25㎍/㎖을 포함하는 MS배지에서 재분화된 개체들을 흙으로 옮겨 심었으며, 온실에서 2주간 배양한 후 종자 결실을 위해 약 40일간 저온처리하였다.
<실시예 5>
BrEXLB1
프로모터의 발현 분석
배추 형질전환체(T1 세대)를 36공 포트에서 10일간 성장시킨 다음 뿌리혹병 현탁액(1.0X106 spores/㎖)을 처리한 후 시기별(1, 3, 5, 7, 10일)로 채취하여 GUS 염색을 이용하여 분석하였다.
도 5는 BrEXLB1 프로모터가 도입된 배추 형질전환체에 뿌리혹병 현탁액을 처리한 후의 시기별 GUS 발현을 나타낸 것이다. 도 5를 참조하면, 뿌리혹병균 처리 3일째부터 GUS의 강한 발현을 확인하였으며, 전신 후천성 저항성 반응(systemic acquired resistance, SAR)효과로 배추의 전체 조직(whole plant)에서 발현을 확인할 수 있었다. 이는 배추 유래 BrEXLB1 프로모터가 SAR의 기능을 가지고 있음으로 뿌리혹병 저항성 배추과 작물 개발에 유용하게 이용될 수 있는 가능성을 시사한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> BrEXLB1 promoter inducing clubroot resistance and uses thereof
<130> 2021-0016-10-A_DP20210025
<160> 7
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 2463
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BrEXLB1-promoter
<400> 1
cccgcagcgg gtcaaatggg gcgggccccg cggataatga ttcatattcc cagcactaac 60
ttcttataat gcgcaatctg caagaaattg catagcctgg gatttgaact gtagacttgg 120
gtatagaagc ttttaaacct ttaactatga ttgaaaaact atggtttagt gacaagttta 180
gagtttttaa acggcaacct tttcatttta attaacggag aaggggtgta gaaaagtttc 240
gacattagag caccattaac catgggtgtt taaggggtgc ttagattttt ttaattaaaa 300
aaaaggaaag agaagaagaa gaagaagaag gagtgcttaa ttagacatca caaacacctg 360
ttgtttgcac tatttgcggg ccctactgac acgtgacgac ccgcgattga ttcttttttt 420
taatcaaaaa aaaaaccaaa aaaaaataaa taattaagca ccccaatgga gtgctagtga 480
tgctcttaag ggtagttagg aattgggtct tacgaaaaat tgtttagcta acgactgagg 540
taaaaaaaat tgtgtagtcc atcggtacgt gtagacatta gccgtgttcg tttgttaacc 600
gcaagacgct cccgctgcgg caagaaaaag cacggtgatt atgatcaaaa taatagaatc 660
cgaagctaaa gtaactgcca acgatttccg gagacacaaa aaacaagacg ctggtgctgc 720
taaaattttc agcgtctctt ctactgccct tgagtcatcg gtgttgcgtg ttgttaatcg 780
ccgctgcggt catgggtgtt gtgtgttgac gtgattcccg tttaattttt ggtcgttgcc 840
gctgcgtctt gcggctaaga aacgaacacg gctattatac gctattaccc caaagagtaa 900
ttgtgttagc aacgatgaat gaatgtgtat aaagtattaa cttttcatga aatgattatc 960
tcactcacaa gaatattata taaactatga caaagagaat ttttatagga agttaggaga 1020
ctaaaaatat cattataagt ggattacaac caaaccaaca acaaagaggg tttactatat 1080
atgaatctca ttttattaga cttatagaat cctttttgtc tttctcctcc tactcttaca 1140
ttatataaaa acgattaatt tattcaaata aagagcaagg ctgctaatca tataccctac 1200
cacccaatgt gttttattca catcactaaa aattatgaca tacataacaa ggattacgtg 1260
gtgtgtttat cttaatttga acatcaatga acaaacatat ttcgtgaaat actttagtca 1320
atttgtgaat tatataaagt aaaatgcttt ttttttcaat ttgccatatc tatcgatgcg 1380
cgcgatagta agttaaaatc aacgtgcgtg tgtttttata ggtttttgtt tacttcaatg 1440
tgtggcatgg aagaaaaatt tattcgtaag acaaccagcc gatcaaagtc agatactcca 1500
aatgaagatt tggactcgag tcactcgact gatcaagatt caagcaatat gaggaagaag 1560
aaaaaaaaaa ctcttctgcg ataatgacct aaactagatc atgttttgag gttcttccaa 1620
ccctctccaa tagcaagttc aatttgggag gatgtgaact gatatttttc caaactattt 1680
ccaaggcata aatagattgt atagaggtca taataaatta attataggtg aggcatgcat 1740
aaaacttgaa ctcaagacat aggtgtcaaa aaaaaagaag attttaacca tcattctcag 1800
cacaataata acatctgacc ccctccaacc aaaaaggctc cgccactggg tacaacttgc 1860
tagcccatat attttatcag atgatctttt tgttaatatt ttacacaatc tgaactacta 1920
aaatgctagt agtgaaaaac aatgaaaact ctgcgagtcc aaatagtagc acgcttggca 1980
tattctattg acttcgttca ctgattacac caaacaacta atcgtaagtc aatcttataa 2040
ctattaggtg tcatgaactt ctcgttttgg aggcacaacc tatctttctt taataattac 2100
tagaccccaa agatacaccc ccaccattgt attttgctgt attgggcaga cgatgtatat 2160
atgatataaa cattttattt aatacatttg accctctcaa gctaaactat caaatcgggt 2220
aatgcaatta cgcgttataa cttatatata gctagattac tttttgccaa gtggaaagaa 2280
aagaatagta acgatgctcg atcaaattgc atataatatt gtaatagaca cccatacctt 2340
caactataaa taccttgtta aacttctcct ctgtcttcac atatcttctg taacacatat 2400
ctatcttccc aaatcacttg ttaaaaataa tcttacaata gttacatata acaatatgaa 2460
gac 2463
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BrEXLB1-F
<400> 2
ttgaacgtct tgcatcttct gc 22
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BrEXLB1-R
<400> 3
tcaagtaagt agaatgttgg agttgt 26
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clubroot-BrEXLB1-F
<400> 4
tatggagagg gacatggcac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clubroot-BrEXLB1-R
<400> 5
cctctggtac tcaacgtcga 20
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Promoter-BrEXLB1-F
<400> 6
gataatgatt catattccca gcact 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Promoter-BrEXLB1-R
<400> 7
catattgtta tatgtaacta ttgta 25
Claims (8)
- 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 식물의 뿌리혹병 저항 유도성 BrEXLB1(Expansin-like B1) 프로모터.
- 제 1항의 프로모터와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 식물의 뿌리혹병 저항 유도성 재조합 벡터.
- 제 2항의 식물의 뿌리혹병 저항 유도성 재조합 벡터로 형질전환된, 아그로박테리움(Agrobacterium).
- 제 2항의 재조합 벡터 또는 제 3항의 아그로박테리움으로 형질전환된 형질전환 식물체.
- 제 4항에 있어서,
상기 식물체는 배추, 양배추, 유채, 청경채, 겨자, 갓, 케일, 무, 브로콜리 및 콜라비로 이루어진 십자화과 작물군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체. - 제 2항의 재조합 벡터로 식물을 형질전환시켜 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 식물체에 발현시키는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법.
- 제 6항에 있어서,
상기 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자는 식물의 뿌리혹병 저항성을 유도하는 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체의 제조방법. - 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어진, 제 1항의 BrEXLB1 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트.
Priority Applications (1)
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| KR1020210136083A KR20230052721A (ko) | 2021-10-13 | 2021-10-13 | 뿌리혹병 저항성을 유도하는 BrEXLB1 프로모터 및 이의 용도 |
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ID=86143717
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101815220B1 (ko) | 2015-10-02 | 2018-01-05 | 한국화학연구원 | 배추 뿌리혹병균의 레이스를 판별하는 신규한 방법 |
-
2021
- 2021-10-13 KR KR1020210136083A patent/KR20230052721A/ko unknown
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR101815220B1 (ko) | 2015-10-02 | 2018-01-05 | 한국화학연구원 | 배추 뿌리혹병균의 레이스를 판별하는 신규한 방법 |
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