KR20230042596A - Flt3 리간드 융합 단백질 및 이용 방법 - Google Patents

Flt3 리간드 융합 단백질 및 이용 방법 Download PDF

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트래비스 윌리엄 바인브릿지
이레이즈 호쎄이니
그레고리 앨런 라자르
시반 코헨
크리스토퍼 찰스 켐볼
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Abstract

본원 발명은 효과기 결여 면역글로불린 Fc 단백질, Flt3 리간드에 효과기 결여 Fc 단백질의 융합, 그리고 이들을 이용하는 방법을 제공한다.

Description

FLT3 리간드 융합 단백질 및 이용 방법
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2020년 8월 7일 자 제출된 U.S. 가출원 일련 번호 63/062,713에 우선권을 주장하고, 이것의 내용은 온전히 참조로서 편입된다.
서열 목록
본 출원은 2021년 7월 28일 자에 작성되고, ASCII 사본으로 전자적으로 제출되며, 본원에서 온전히 참조로서 편입되고, P36298-WO_SL.txt로 명명되며, 그리고 크기에서 128,413 바이트인 서열 목록을 내포한다.
발명의 분야
본원 발명은 Flt3 리간드 융합 단백질 및 이들을 이용하는 방법에 관계한다.
배경
다수의 연구는 암 진행에서 면역계 성분의 차별적 존재의 중요성을 뒷받침한다 (Jochems and Schlom, Exp Biol Med, 236(5): 567-579 (2011)). 임상 데이터는 높은 밀도의 종양 침윤 림프구가 향상된 임상 결과와 연결된다는 것을 암시한다 (Mlecnik et al., Cancer Metastasis Rev.; 30: 5-12, (2011)). 종양 면역 침윤물은 종양 세포에 의해 발현된 항원의 인식 및 T 세포에 의한 이들 종양 세포의 후속 파괴에 대해 일차적으로 책임을 지는 대식세포, 수지상 세포 (DC), 비만 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 미경험 및 기억 림프구, B 세포 및 효과기 T 세포 (T 림프구)를 포함한다.
암 세포에 의한 항원의 제시 및 종양 세포에 대항하여 잠재적으로 반응할 수 있는 면역 세포의 존재에도 불구하고, 많은 경우에 면역계는 활성화되지 않거나 또는 확정적으로 억제된다. 종양은 항종양 면역 반응을 회피하는 다수의 면역조절 기전을 개발한다. 전체적인 결과는 손상된 T 세포 반응 및 CD8+ 세포독성 T 세포의 아폽토시스 또는 감소된 항종양 면역 능력의 유도이다. 항원 제시 기능 및 수지상 세포 (DC)의 저해가 항종양 면역성의 회피에 추가적으로 기여한다 (Gerlini et al. Am. J. Pathol. 165(6), 1853-1863 (2004).
추가적으로, 종양 미세환경의 국부 면역억제성은 표적 항원을 발현하지 않는 암 세포 하위모집단의 탈출을 야기할 수 있다. 따라서, 면역계의 항종양 활성의 보존 및/또는 복구를 증진할 접근방식을 발견하는 것은 치료적으로 상당히 유익할 것이다.
면역 관문은 항종양 면역성의 종양 매개 하향조절에 연루되었다. T 세포 기능장애는 CD28 패밀리 수용체의 구성원인 저해 수용체, CTLA-4 및 예정된 사멸 1 폴리펩티드 (PD-1)의 유도된 발현과 동시에 발생하는 것으로 증명되었다. 하지만, 최근에 광범위한 연구에도 불구하고, 임상 환경에서 면역요법의 성공은 제한적이었다. 극소수의 치료제만 규제 당국에 의해 승인되었고, 그리고 이들 중에서, 대부분의 환자가 유익성을 경험하는 치료제는 없다. 최근에, 면역 관문이 항종양 면역성의 하향조절에 연루되었고 치료 표적으로서 이용되었다. 이들 관찰 결과는 암에 대항하여 면역계를 활용하기 위한 신규한 치료적 접근방식의 개발에 대한 필요성을 부각시킨다.
골수 세포의 증식을 자극하는 I형 막경유 단백질인 인간 Flt3L (Fms 유사 티로신 키나아제 3 리간드)은 1994년에 클로닝되었다 (Lyman et al., 1994). 골수 이식 준비를 위한 줄기 세포 동원, 수지상 세포 확대와 같은 암 면역 요법뿐만 아니라 백신 어쥬번트를 비롯한 다양한 전임상과 임상 환경에서 가용성 hFlt3L의 이용이 탐색되었다. 하지만, Flt3L에 기반한 어떤 약학적 조성물도 클리닉에서 임상 2상 단계를 통과하지 못하였다.
한 가지 과제는 Flt3L 리간드에 대한 노출을 최적화하고, 그리고 불리한 부작용 또는 잠재적인 불리한 면역학적 효과를 최소화하면서 최적 투약 섭생을 확인하는 것이다. 노출을 조정하는 것은 예를 들면, 투약 섭생을 변경하거나, 투약량을 변경하거나, 또는 치료 분자의 약물동력학적 및/또는 약력학적 특성을 변화시킴으로써 수행될 수 있다. 암 환자에 대한 면역요법을 증강하는 데 유익한 PK/PD 특성을 갖는 Flt3L-Fc 융합 단백질이 본원에서 제공된다.
요약
본원 발명은 효과기 결여 Fc 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 융합 단백질 (효과기 결여 면역글로불린 Fc 단백질에 융합된 활성 Flt3 리간드 (Flt3L)를 포함하는 Flt3 리간드 융합 단백질 포함), 그리고 이들을 이용하는 방법을 제공한다. 효과기 결여 Fc 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 융합 단백질, 그리고 Flt3L-Fc 융합 단백질의 이용을 위한 방법은 암의 치료, 특히 관문 면역요법을 제공받는 환자에서 암의 치료를 포함한다. 본원 발명은 효과기 결여 IgG Fc 단백질을 더욱 제공한다.
한 가지 양상에서, 서열 번호:13의 잔기와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 효과기 결여 Fc 단백질이 제공되는데, 여기서 서열 번호:13의 잔기 13-17은 아미노산 서열 PVAGP (서열 번호:20)를 포함하거나 또는 서열 번호:13의 잔기 76은 글리신이다. 다른 구체예에서, 효과기 결여 IgG1 Fc 영역은 서열 번호:13과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는데, 여기서 서열 번호:13의 잔기 13-17은 아미노산 서열 PVAGP (서열 번호:20)를 포함하고 서열 번호:13의 잔기 76은 글리신이다. 또 다른 구체예에서, 효과기 결여 IgG1 Fc 영역은 서열 번호:13과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 명료함을 위해, 서열 번호:13의 잔기 13-17이 PVAGP (서열 번호:20)를 포함하는 일부 구체예에서, 이것은 본원에서 PVA# 변이체를 포괄하는 것으로 지칭될 수 있고, 그리고 서열 번호:13의 잔기 76이 글리신인 일부 구체예에서, 이것은 본원에서 N297G 돌연변이로서 지칭될 수 있고, 여기서 297은 항체의 EU 넘버링을 지칭한다.
일부 구체예에서, 효과기 결여 Fc 단백질은 서열 번호: 2, 4, 5, 6, 13, 또는 15의 단백질 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 효과기 결여 IgG1 Fc 단백질은 서열 번호:12를 포함하는 야생형 IgG1 Fc 영역에 비하여 약화된다.
일부 양상에서, 서열 번호:13의 잔기와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 항체가 제공되는데, 여기서 서열 번호:13의 잔기 13-17은 아미노산 서열 PVAGP (서열 번호:20)를 포함하거나 또는 서열 번호:13의 잔기 76은 글리신이다.
일부 구체예에서, 항체는 Flt3L 수용체에 결합한다.
일부 구체예에서, 항체는 관문 저해제 단백질에 결합한다. 다른 구체예에서, 관문 저해제 단백질은 PD-L1, PD-1 및/또는 CTLA-4이다. 일부 구체예에서, 항체는 이중특이적 항체이다.
일부 양상에서, 본원 발명 의 효과기 결여 Fc 단백질 및 두 번째 단백질을 포함하는 이종이합체성 단백질이 제공된다. 일부 구체예에서, 효과기 결여 Fc 단백질 및 두 번째 단백질은 서로 공유 연결된다. 다른 구체예에서, 효과기 결여 Fc 단백질 및 두 번째 단백질은 이황화 결합에 의해 연결된다.
일부 양상에서, 본원 발명 의 효과기 결여 Fc 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 항체 및/또는 본원에서 및 상기에서 설명된 바와 같은 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 이종이합체성 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예에서, 단리된 핵산은 서열 번호: 2, 4, 5, 6, 13, 또는 15의 단백질 서열을 인코딩한다. 다른 구체예에서, 단리된 핵산은 효과기 결여 Fc 단백질의 N-말단 단부에서 신호 서열을 추가로 인코딩한다. 바람직한 실례에서, 단리된 핵산은 서열 번호:13의 단백질 서열을 인코딩한다.
일부 양상에서, 본원 발명 의 효과기 결여 Fc 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 융합 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 항체 및/또는 본원에서 및 상기에서 설명된 바와 같은 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 이종이합체성 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
일부 양상에서 본원 발명 의 효과기 결여 Fc 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 융합 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 항체 및/또는 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 이종이합체성 단백질을 생산하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 각각의 단백질이 생산되도록, 본원 발명 의 효과기 결여 Fc 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 융합 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 항체 및/또는 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 이종이합체성 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 본원 발명 의 효과기 결여 Fc 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 융합 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 항체 및/또는 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 이종이합체성 단백질을 숙주 세포로부터 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포이다. 다른 구체예에서, 진핵 세포는 CHO 세포이다.
일부 양상에서, 본원 발명 의 효과기 결여 Fc 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 융합 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 항체 및/또는 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 이종이합체성 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
일부 양상에서 본원 발명 의 효과기 결여 Fc 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 융합 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 항체 및/또는 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 이종이합체성 단백질을 생산하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 본원 발명 의 효과기 결여 Fc 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 융합 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 항체 및/또는 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 이종이합체성 단백질이 생산되도록, 본원 발명 의 효과기 결여 Fc 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 융합 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 항체 및/또는 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 이종이합체성 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 본원 발명 의 효과기 결여 Fc 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 융합 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 항체 및/또는 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 이종이합체성 단백질을 숙주 세포로부터 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포이다. 다른 구체예에서, 진핵 세포는 CHO 세포이다.
한 가지 양상에서, 효과기 결여 Fc 단백질 (서열 번호:13 또는 이의 변이체) 및 두 번째 단백질을 포함하는, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 융합 단백질이 제공되는데, 여기서 두 번째 단백질은 표적 단백질에 대한 리간드이다. 일부 구체예에서, 리간드는 표적 단백질에 대한 리간드의 결합 시에 표적 단백질을 조정한다. 일부 구체예에서, 두 번째 단백질은 Flt3L이다. 다른 구체예에서, 표적 단백질은 Flt3L 수용체이다. 바람직한 구체예에서, 두 번째 단백질은 효과기 결여 Fc 단백질의 N-말단에 있다.
일부 구체예에서, 융합 단백질은 서열 번호:13과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 Fc 단백질을 포함하는데, 여기서 서열 번호:13의 잔기 13-17은 아미노산 서열 PVAGP (서열 번호:20)를 포함하거나 또는 서열 번호:13의 잔기 76은 글리신이다. 다른 구체예에서, 효과기 결여 IgG1 Fc 영역은 서열 번호:13과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는데, 여기서 서열 번호:13의 잔기 13-17은 아미노산 서열 PVAGP (서열 번호:20)를 포함하고 서열 번호:13의 잔기 76은 글리신이다. 또 다른 구체예에서, 효과기 결여 IgG1 Fc 영역은 서열 번호:13과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 명료함을 위해, 서열 번호:13의 잔기 13-17이 PVAGP (서열 번호:20)를 포함하는 일부 구체예에서, 이것은 본원에서 PVA# 변이체를 포괄하는 것으로 지칭될 수 있고, 그리고 서열 번호:13의 잔기 76이 글리신인 일부 구체예에서, 이것은 본원에서 N297G 돌연변이로서 지칭될 수 있고, 여기서 297은 항체의 EU 넘버링을 지칭한다.
한 가지 양상에서, 융합 단백질은 Flt3 리간드 (Flt3L) 및 효과기 결여 IgG1 Fc 영역을 포함하는데, 여기서 Flt3L-Fc 융합 단백질은 서열 번호:12를 포함하는 야생형 IgG1 Fc 영역에 비하여 약화되는 효과기 기능을 갖는다.
Flt3L-Fc 융합 단백질의 일부 구체예에서, Flt3L은 서열 번호:21의 잔기 27-167과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함한다. 다른 구체예에서, Flt3L은 서열 번호:21의 아미노산 서열을 포함하는데, 여기서 상기 아미노산 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는다. 다른 구체예에서, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환은 FcRn 단백질에 결합하는 Flt3L의 영역 내에 존재하지 않는다. 다른 구체예에서, Flt3L 단백질은 서열 번호:22의 서열을 포함한다.
Flt3L-Fc 융합 단백질의 일부 구체예에서, Flt3L은 서열 번호:21의 아미노산 27-167, 27-168, 27-169, 27-170, 27-171, 27-172, 27-173, 27-174, 27-175, 27-176, 27-177, 27-178, 27-179, 27-180, 27-181, 27-182, 27-183, 27-184, 또는 27-185를 포함하는 단백질을 포함한다. Flt3L-Fc 융합 단백질의 바람직한 구체예에서, Flt3L은 서열 번호:21의 아미노산 27-167 또는 서열 번호:21의 아미노산 27-168로 구성되는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질의 Flt3L은 서열 번호:21의 168-235, 169-235, 170-235, 171-235, 172-235, 173-235를 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질의 Flt3L은 아미노산 서열 PWSPRPLEATAPTAPQPP (서열 번호:48), WSPRPLEATAPTAPQPP (서열 번호:49), SPRPLEATAPTAPQPP (서열 번호:50), PRPLEATAPTAPQPP (서열 번호:51), RPLEATAPTAPQPP (서열 번호:52), 또는 PLEATAPTAPQPP (서열 번호:53)를 포함하지 않는다.
Flt3L-Fc 융합 단백질의 일부 구체예에서, Flt3L은 서열 번호:21의 아미노산 27-167, 27-168, 27-169, 27-170, 27-171, 27-172, 27-173, 27-174, 27-175, 27-176, 27-177, 27-178, 27-179, 27-180, 27-181, 27-182, 27-183, 27-184, 또는 27-185를 포함하는 단백질과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 단백질을 포함한다.
Flt3L-Fc 융합 단백질의 일부 구체예에서, Flt3L은 서열 번호:21의 아미노산 24-167, 25-167, 26-167, 24-168, 25-168, 26-168, 24-169, 25-169, 또는 26-169를 포함하는 단백질과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단백질을 포함한다.
Flt3L-Fc 융합 단백질의 일부 구체예에서, 효과기 결여 IgG1 Fc 영역은 서열 번호:13과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는데, 여기서 서열 번호:13의 잔기 13-17은 아미노산 서열 PVAGP (서열 번호:20)를 포함하거나 또는 서열 번호:13의 잔기 76은 글리신이다. 다른 구체예에서, 효과기 결여 IgG1 Fc 영역은 서열 번호:13과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는데, 여기서 서열 번호:13의 잔기 13-17은 아미노산 서열 PVAGP (서열 번호:20)를 포함하고 서열 번호:13의 잔기 76은 글리신이다. 또 다른 구체예에서, 효과기 결여 IgG1 Fc 영역은 서열 번호:13과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 명료함을 위해, 서열 번호:13의 잔기 13-17이 PVAGP (서열 번호:20)를 포함하는 일부 구체예에서, 이것은 본원에서 PVA# 변이체를 포괄하는 것으로 지칭될 수 있고, 그리고 서열 번호:13의 잔기 76이 글리신인 일부 구체예에서, 이것은 본원에서 N297G 돌연변이로서 지칭될 수 있고, 여기서 297은 항체의 EU 넘버링을 지칭한다.
일부 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질은 서열 번호:26과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질은 서열 번호:26의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질은 서열 번호:26과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는데, 여기서 서열 번호:26의 잔기 154-158은 아미노산 서열 PVAGP (서열 번호:20)를 포함하고 서열 번호:26의 잔기 217은 글리신이다.
일부 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질은 서열 번호:25와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는데, 여기서 서열 번호:25의 잔기 155-159는 아미노산 서열 PVAGP (서열 번호:20)를 포함하고 서열 번호:25의 잔기 218은 글리신이다.
일부 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질은 서열 번호:32와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는데, 여기서 서열 번호:32의 잔기 153-157은 아미노산 서열 PVAGP (서열 번호:20)를 포함하고 서열 번호:32의 잔기 216은 글리신이다.
일부 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질은 서열 번호:33과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는데, 여기서 서열 번호:33의 잔기 152-156은 아미노산 서열 PVAGP (서열 번호:20)를 포함하고 서열 번호:33의 잔기 215는 글리신이다.
일부 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질은 서열 번호:34와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는데, 여기서 서열 번호:34의 잔기 151-154는 아미노산 서열 PVAGP (서열 번호:20)를 포함하고 서열 번호:34의 잔기 214는 글리신이다.
일부 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질은 서열 번호:27 내지 서열 번호:31 및 서열 번호:35 내지 서열 번호:44로 구성된 군에서 선택되는 단백질과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질은 시험관내 분석에서 야생형 IgG1 Fc (서열 번호:12)에 융합된 야생형 Flt3L을 포함하는 Flt3L-Fc 융합 단백질에 의한 활성 수준의 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 미만인 활성 수준에서 시험관내 분석에서 항체 의존성 세포 식균작용 (ADCP)을 활성화한다. 다른 구체예에서, ADCP 시험관내 분석은 효과기 세포로서 일차 대식세포 및 표적 세포로서 Flt3L 수용체를 발현하는 세포주의 이용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 일차 대식세포는 건강한 인간 공여자로부터 단핵구 유래된 대식세포이다. 또 다른 구체예에서, 표적 세포는 인간 급성 림프모구성 백혈병 세포, 임의적으로, SEM 세포주 세포이다. 일부 구체예에서, 활성은 식균작용 퍼센트 (% ADCP)로서 계측되는데, 여기서 식균작용은 표적 세포로부터 시각 마커의 흡수를 계측함으로써 결정된다.
일부 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질은 융합 단백질이 투여된 개체에서 DC 확대를 활성화한다. 다른 구체예에서, DC 확대는 개체의 전혈에서 계측된다. 또 다른 구체예에서, DC 확대는 유세포분석 또는 FACS에 의해 계측된다. 일부 구체예에서, DC 확대는 이종성 단백질에 융합되지 않는 Flt3L 단백질의 투여로부터 발생하는 DC 확대보다 적어도 5배, 10배, 15배, 20배, 50배, 100배, 500배, 1000배, 2000배, 5000배, 또는 10,000배 크다. 다른 구체예에서, 이종성 단백질은 야생형 인간 IgG Fc 단백질이다. 또 다른 구체예에서, 야생형 인간 IgG Fc 단백질은 야생형 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 단백질이다. 일부 구체예에서, Flt3L 단백질은 야생형 IgG1 Fc 단백질 또는 인간 혈청 알부민 단백질에 융합되지 않는다. 일부 구체예에서, 개체는 설치류, 토끼, 시노몰구스 원숭이, 또는 인간이다. 다른 구체예에서, 설치류는 생쥐 또는 쥐이다.
일부 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질은 서열 번호:14를 갖는 Flt3L-Fc 융합 단백질의 열안정성과 비교하여 증가된 열안정성을 갖는다. 다른 구체예에서, 열안정성은 시차 주사 형광측정법을 이용하여 계측된다. 또 다른 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질은 서열 번호:14를 갖는 Flt3L-Fc 융합 단백질의 용융 온도 (Tm)보다 적어도 1.5°C, 2℃, 3℃, 4℃ 또는 5℃ 높은 Tm을 갖는다.
일부 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질은 Flt3L 도메인에서 단일 아미노산 치환을 내포한다. 다른 구체예에서, 이러한 치환은 생체내 면역원성을 감소시키지만, 기능 활동을 10%, 20% 또는 30% 초과하여 감소시키지 않는다. 다른 구체예에서, 기능 활동 검정은 동물에서 수지상 세포의 확대이다.
일부 양상에서, 본원에서 및 상기에서 설명된 바와 같은 Flt3L-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예에서, 단리된 핵산은 서열 번호: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 또는 44의 단백질 서열을 인코딩한다. 다른 구체예에서, 단리된 핵산은 Flt3L-Fc 융합 단백질의 N-말단 단부에 있는 신호 서열을 추가로 인코딩한다. 바람직한 실례에서, 단리된 핵산은 서열 번호:45의 단백질 서열을 인코딩한다.
일부 양상에서, 본원에서 및 상기에서 설명된 바와 같은 Flt3L-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
일부 양상에서 Flt3L-Fc 융합 단백질을 생산하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 Flt3L-Fc 융합 단백질이 생산되도록, 효과기 결여 Flt3L-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 Flt3L-Fc 융합 단백질을 숙주 세포로부터 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포이다. 다른 구체예에서, 진핵 세포는 CHO 세포이다.
일부 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 Flt3L-Fc 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 운반체를 포함하는 약학 제제가 제공된다.
일부 구체예에서, 약학 제제는 추가 치료제를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 추가의 약학적 작용제는 어쥬번트, 수지상 세포 성숙 인자 및/또는 관문 저해제이다.
일부 양상에서, Flt3L-Fc 융합 단백질이 투여된 개체에서 수지상 세포 (DC)의 수를 확대하기 위한 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, DC는 cDC1 및/또는 cDC2 세포이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 본원 발명의 Flt3L-Fc 융합 단백질을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 약 0.1 mg/kg 내지 50 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 40 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 25 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 15 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg, 1 mg/kg 내지 50 mg/kg, 1 mg/kg 내지 40 mg/kg, 1 mg/kg 내지 25 mg/kg, 1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 1 mg/kg 내지 15 mg/kg, 또는 1 mg/kg 내지 10 mg/kg 용량의 Flt3L-Fc 융합 단백질을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 Flt3L 융합 단백질을 대략 하루 1 회, 주 1회, 주 2회, 2 주마다 1회, 3 주마다 1회, 월 1회, 또는 2 개월마다 1회 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 정맥내 투여, 비경구 투여, 근육내 주사, 또는 피하 주사에 의해, Flt3L 융합 단백질을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 암을 치료하기 위한 방법이 제공되는데, 여기서 상기 방법은 본원에서 설명된 바와 같은 Flt3L-Fc 융합 단백질을 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 Flt3L-Fc 융합 단백질의 치료 효과량을 투여하고 면역 관문 저해제의 치료 효과량을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 면역 관문 저해제는 PD-1 또는 PD-L1의 효과를 억제하거나 또는 저해한다. 또 다른 구체예에서, 면역 관문 저해제는 펨브로리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, BMS 936559, 아테졸리주맙, 또는 아벨루맙이다. 다른 구체예에서, 관문 저해제는 Flt3L-Fc 융합 단백질의 투여 전, 투여와 동시에, 또는 투여 후 투여된다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 수지상 세포 (DC) 성숙 인자를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, DC 성숙 인자는 폴리IC (polyIC), 폴리-ICLC, CD40 효현제, 방사선요법 및 화학요법에서 선택된다. 다른 구체예에서, DC 성숙 인자는 Flt3L-Fc 융합 단백질의 투여에 앞서, 투여와 동시에 및/또는 투여 후 개체에게 투여된다. 특정한 구체예에서, DC 성숙 인자는 방사선요법이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체가 DC 성숙 인자를 제공받은 후, Flt3L-Fc 융합 단백질을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 개체가 DC 성숙 인자를 제공받기 전, Flt3L-Fc 융합 단백질을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 개체가 DC 성숙 인자를 제공받은 거의 동일한 시점에, Flt3L-Fc 융합 단백질을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 암은 비소세포 폐암 (NSCLC), 소세포 폐암 (SCLC), 흑색종, 췌장 관 선암종, (PDAC), 삼중 음성 유방암 (TNBC), 비호지킨 림프종 (NHL), 결장직장암 (CRC), 유방암, 방광암, 신장암, 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 개체는 관문 저해제로 이전에 치료를 받았다. 다른 구체예에서, 개체는 관문 저해제 요법에 반응하지 않았는데, 여기서 관문 저해제 요법은 적어도 또는 약 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 1 년, 1.5 년, 또는 2 년의 기간에 걸쳐 투여되었다.
일부 구체예에서, 개체는 방사선요법으로 치료를 받았는데, 여기서 방사선요법은 적어도 또는 약 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 1 년, 1.5 년, 또는 2 년의 기간에 걸쳐 투여되었다.
일부 구체예에서, 개체는 화학요법으로 치료를 받았는데, 여기서 화학요법은 적어도 또는 약 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 1 년, 1.5 년, 또는 2 년의 기간에 걸쳐 투여되었다.
일부 구체예에서, 개체에서 암은 면역 결핍 종양을 포함하는 것으로 특징화되었다. 다른 구체예에서, 암은 반응성, 염증성 종양 ("뜨거운 종양")에 비하여 감소된 염증을 갖는 종양 ("차가운 종양")을 포함하는 것으로 특징화되었다.
도면의 간단한 설명
도 1은 야생형 또는 변이체 Fc 도메인을 갖는 항-Her2 항체에 의한 상이한 수준의 ADCP 활성을 보여준다. 일차 M1 대식세포가 SkBr3 표적 세포와 함께 인큐베이션되었다. x 축은 항체 농도를 보여주고 y 축은 식균작용 퍼센트를 보여준다.
도 2a-2e는 야생형 또는 변이체 Fc 도메인을 갖는 항-Her2 항체가 일차 M1 대식세포 및 SkBr3 표적 세포와 함께 인큐베이션될 때, 식세포에 의한 사이토킨 방출을 보여준다. x 축은 항체 농도를 보여주고 y 축은 pg/ml 사이토킨을 보여준다. 도 2a: G-CSF; 도 2b: GM-CSF; 도 2c: IL-10; 도 2d: IL-1ra; 도 2e: IL-6.
도 2f-2j는 야생형 또는 변이체 Fc 도메인을 갖는 항-Her2 항체가 일차 M1 대식세포 및 SkBr3 표적 세포와 함께 인큐베이션될 때, 대식세포에 의한 사이토킨 방출을 보여준다. x 축은 항체 농도를 보여주고 y 축은 pg/ml 사이토킨을 보여준다. 도 2f: IL-8; 도 2g: MIP-1알파; 도 2h: MIP-1베타; 도 2i: RANTES; 도 2j: TNF알파.
도 2k는 야생형 및 변이체 Fc 단백질을 갖는 항-CD20 항체의 ADCC 활성을 보여준다.
도 2l은 야생형 및 변이체 Fc 단백질을 갖는 항-Her2 항체의 ADCC 활성을 보여준다.
도 3a-3c는 응집 및 이황화 결합 특성에 대하여 Flt3L-FcNG2LH 융합 단백질의 식별점을 보여준다. CHO 세포 및 HEK293 세포에서 발현된 단백질의 hFLT3L.S163.no.힌지.hIgG1.NG.PVA# 응집 및 이합체 형성의 분석은 SDS-PAGE (도 3a) 및 SEC-HPLC (도 3b: 293 세포 및 (도 3c: HEK297 세포)에 의해 도시된다. 도 3b-3c의 경우에, x 축은 시간이고 y 축은 mAU이다.
도 3d-3f는 응집 및 이황화 결합 특성에 대하여 Flt3L-FcNG2LH 융합 단백질의 식별점을 보여준다. CHO 세포 및 HEK293 세포에서 발현된 단백질의 hFLT3L.P167.5aa.힌지.hIgG1.NG.PVA# 응집 및 이합체 형성의 분석은 SDS-PAGE (도 3d) 및 SEC-HPLC (도 3e: 293 세포 및 도 3f: HEK297 세포)에 의해 도시된다. 도 3e-3f의 경우에, x 축은 시간이고 y 축은 mAU이다.
도 4a-4b는 Flt3L이 시험관내에서 OCI-AML5 세포의 증식을 유도한다는 것을 보여준다. 도 4a는 hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH 및 gCDX-301의 용량 반응 곡선을 보여준다. 도시된 데이터는 삼중 값의 평균 ± SD이다. 데이터는 최대 (100%) 반응으로서 10 ug/mL hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH에 대해 정규화되었다. 도 4b는 hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH 및 gCDX-301의 EC50 효능을 보여준다. 결과는 5번의 독립된 실험으로부터, 평균 ± SEM을 표시하는 선으로 도시된다.
도 5는 0.1 mg/kg, 1 mg/kg 또는 10 mg/kg 융합 단백질이 투약된 동물에서 검출된 Flt3L-Fc (서열 번호:28) 융합 단백질의 혈청 농도를 보여준다.
도 6a-6b는 0.1 mg/kg, 1 mg/kg 또는 10 mg/kg 융합 단백질이 투여된 동물에서 단핵구 (도 6a) 및 DC (도 6b)의 용량 의존성 세포 확대를 보여준다. 항-gD는 음성 대조 인간화 IgG 항체이다.
도 7은 0.1 mg/kg, 1 mg/kg 또는 10 mg/kg 융합 단백질이 투여된 동물에서 Flt3L-Fc(NG2LH)의 혈장 농도를 보여준다. 항-gD는 음성 대조 인간화 IgG 항체이다.
도 8a-8c는 0.1 mg/kg, 1 mg/kg 또는 10 mg/kg 융합 단백질이 투여된 동물에서 단핵구 (도 8a), cDC1 세포 (도 8b) 및 cDC2 세포 (도 8c)의 용량 의존성 세포 확대를 보여준다. 항-IgD는 음성 대조 인간화 IgG 항체이다.
도 9a는 선택된 Fc 내포 단백질의 면역원성을 보여준다.
도 9b는 선택된 Fc 내포 단백질의 면역원성을 보여준다.
도 10은 다양한 Flt3L-Fc 단백질의 ADCP 활성을 비교하는, 실시예 10에서 설명된 바와 같은 한 가지 대표적인 시험관내 ADCP 검정으로부터 결과를 보여준다.
본원 발명의 구체예에 관한 상세한 설명
I. 정의
"친화성"은 분자 (예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 파트너 (예를 들면, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 별도로 표시되지 않으면, 본원에서 이용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 (예를 들면, 항체와 항원) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리 상수 (Kd)에 의해 표현될 수 있다. 친화성은 본원에서 설명된 것들을 비롯한, 당해 분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 계측될 수 있다. 결합 친화성을 계측하기 위한 특정한 예시적이고 모범적인 구체예는 하기에서 설명된다.
"Flt3L"로서 또한 지칭되는 용어 "Flt3 리간드"는 단백질이 Flt3 수용체 (Flt3R)를 표적으로 하는 데 있어서 진단 시약 및/또는 치료제로서 유용할 만큼 충분한 친화성으로 Flt3 수용체에 결합할 수 있는 단백질을 지칭한다. 한 구체예에서, 관련 없는 비-Flt3 단백질에 Flt3 리간드의 결합의 정도는 예를 들면, 방사면역검정 (RIA)에 의해 계측될 때 Flt3에 대한 상기 단백질의 결합의 약 10%보다 적다. 일정한 구체예에서, Flt3R에 결합하는 단백질은 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 일정한 구체예에서, Flt3L은 상이한 종으로부터 유래된 Flt3R 사이에서 보존되는 Flt3R에 결합한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "Flt3L"은 개열된, 가용성 Flt3L (예를 들면, 서열 번호:21의 대략 잔기 27-185)을 지칭하지만, 그러나 또한 별도로 표시되지 않으면, 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들면, 인간) 및 설치류 (예를 들면, 생쥐와 쥐)를 비롯한, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 선천적 Flt3L을 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 처리되지 않은 Flt3L뿐만 아니라 세포에서 처리, 예를 들면, 신호 펩티드 (리더 서열)의 제거 또는 TM 도메인으로부터 개열로부터 발생하는 Flt3L의 임의의 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한, Flt3L의 자연 발생 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다. 내인성 신호 서열을 갖는 예시적인 인간 Flt3L의 아미노산 서열은 서열 번호:21에서 도시되고 GenBank 수탁 기록 P49771에서도 제공되며, 반면 다른 구체예에서, 외인성 리더 서열이 없는 성숙 Flt3L 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호:21의 잔기 27-167로서 제공된다. Flt3L의 기능 및/또는 활성 (예를 들면, Flt3 수용체 (GenBank 수탁 번호 NP_004110)에 결합)에 영향을 주지 않는 Flt3L의 소수 서열 변이, 특히 보존성 아미노산 치환 또한 본원 발명에 의해 예기된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "Flt3L-Fc 융합 단백질" 또는 대안으로, "Fc-효과기 결여 Flt3L-Fc 융합 단백질"은 Flt3L 폴리펩티드가 변이체 IgG Fc 영역에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되는 융합 단백질을 지칭하는데, 여기서 상기 변이체 Fc 영역은 이의 대응물 야생형 Fc 영역에 비하여 약화된 효과기 기능을 갖는다. 주의할 점은 용어 "효과기 결여 Flt3L-Fc 융합 단백질"의 임의의 이용에 대해 용어 "효과기 결여"가 상기 융합 단백질의 Fc 부분에 적용된다는 것이다. 일정한 바람직한 구체예에서, 본원 발명의 Flt3L-Fc 융합 단백질은 인간 IgG Fc 영역에 연결된 인간 Flt3L 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일정한 구체예에서, 인간 Flt3L 단백질은 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함한다. 하지만, Flt3L 또는 본원 발명 의 효과기 결여 Flt3L-Fc 융합 단백질 (예를 들면, 서열 번호:26)의 기능 및/또는 활성에 현저한 영향을 주지 않는 Flt3L 또는 Fc의 소수 서열 변이, 예컨대 삽입, 결실, 치환, 특히 보존성 아미노산 치환 또한 본원 발명에 의해 예기되는 것으로 이해된다. 본원 발명 의 효과기 결여 Flt3L-Fc 융합 단백질은 Flt3 수용체 단백질에 결합할 수 있는데, 이것은 Flt3 수용체 하류 신호전달을 야기할 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, CDX-301은 서열 번호:23의 아미노산 서열을 갖는 Flt3L을 지칭한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 그리고 항체 단편 (이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 실례는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들면, scFv); 그리고 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
항체의 "부류"는 이의 중쇄에 의해 소유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 그리고 이들 중에서 몇몇은 하위부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, γ, ε, γ 및 μ로 불린다.
"효과기 기능"은 항체의 Fc 영역, 단리된 Fc 영역, 또는 다른 단백질에 융합된 Fc 영역에 기인한 생물학적 활성을 지칭하는데, 여기서 상기 Fc 영역은 공급원 항체의 아이소타입에 따라서 변한다. 항체 효과기 기능의 실례는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 항체 의존성 세포 식균작용 (ADCP); 세포 표면 수용체 (예를 들면, B 세포 수용체)의 하향조절; 그리고 B 세포 활성화. 일정한 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질은 임의의 효과기 기능 또는 임의의 검출가능 효과기 기능을 전시하지 않는다. 일정한 다른 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질은 서열 번호:12를 갖는 야생형 Fc 단백질에 융합된 본원 발명의 Flt3L 단백질을 포함하는 융합 단백질에 비하여 실제적으로 감소된 효과기 기능, 예를 들면, 약 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 감소된 효과기 기능을 전시한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "수지상 세포 확대," "수지상 세포의 확대" 또는 "수지상 세포의 수에서 증가"는 시험관내 분석에서 또는 생체내 실험에서 계측될 때 수지상 세포의 수에서 증가를 지칭한다.
작용제, 예를 들면, 약학 제제의 "효과량"은 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는 데 필요한 용량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 내포하는, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 규정하는 데 이용된다. 상기 용어는 선천적 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226으로부터 또는 Pro230으로부터 카르복실 말단까지 걸친다. 하지만, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 별도로 특정되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 바와 같이, EU 색인으로 또한 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
본원에서 이용된 바와 같이, "T 세포 활성화"는 증식, 분화, 사이토킨 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 그리고 활성화 마커의 발현에서 선택되는, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 한 가지 이상의 세포 반응을 지칭한다. 본원 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 T 세포 활성화를 유도할 수 있다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양액"은 교체가능하게 이용되고, 그리고 외인성 핵산이 도입된 세포 및 이런 세포의 자손을 지칭한다. 숙주 세포에는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"가 포함되는데, 이들은 계대 (passage)의 횟수에 상관없이, 일차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 부모 세포와 완전하게 동일하지 않을 수도 있으며 돌연변이를 내포할 수도 있다. 최초 형질전환된 세포에 대해 선별검사되거나 또는 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손은 본원에 포함된다.
"개체" 또는 "피험자"는 포유동물이다. 포유동물은 순치된 동물 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼, 그리고 설치류 (예를 들면, 생쥐와 쥐)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 구체예에서, 개체 또는 피험자는 인간이다.
"단리된" 단백질 또는 폴리펩티드는 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 것이다. 일부 구체예에서, 단백질은 예를 들면, 전기이동 (예를 들면, SDS-PAGE, 등전위 초점 (IEF), 모세관 전기이동) 또는 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정될 때, 95% 또는 99%보다 높은 순도로 정제된다. 항체 순도의 사정을 위한 방법에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조한다.
"단리된" 핵산은 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산에는 핵산 분자를 통상적으로 내포하는 세포에 내포된 핵산 분자가 포함되지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"Flt3L-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산"은 Flt3L-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자, 단일 벡터 또는 별개의 벡터에서 이런 핵산 분자(들), 그리고 숙주 세포 내에 하나 이상의 위치에서 존재하는 이런 핵산 분자(들)를 지칭한다.
참조 폴리펩티드 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하면, 갭을 도입한 후에, 그리고 임의의 보존성 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 참조 폴리펩티드 서열 내에 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내에 아미노산 잔기의 백분율로서 규정된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당해 분야의 기술 범위 안에 있는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 하지만, 본원에서 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 저술되었고, 그리고 소스 코드가 사용자 문서로 U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559에 제출되었는데, 여기서 이것은 U.S. Copyright 등록 번호 TXU510087하에 등록된다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc., South San Francisco, California로부터 공개적으로 가용하거나, 또는 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 체계에 이용하기 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 세팅되고 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 이용되는 상황에서, 소정의 아미노산 서열 B에 대한 소정의 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (이것은 대안으로, 소정의 아미노산 서열 B에 대해 일정한 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)은 아래와 같이 계산된다:
100 곱하기 분율 X/Y
여기서 X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해, 상기 프로그램의 A와 B의 정렬에서 동일한 정합으로서 채점된 아미노산 잔기의 숫자이고, 그리고 여기서 Y는 B에서 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않은 경우에, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동등하지 않을 것으로 인지될 것이다. 별도로 특정되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 직전 단락에서 설명된 바와 같이 획득된다.
용어 "약학 제제"는 그 안에 내포된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 그런 형태이고, 그리고 이러한 제제가 투여될 개체에게 받아들이기 어려울 정도로 독성인 추가 성분을 내포하지 않는 제조물을 지칭한다.
"약학적으로 허용되는 운반체"는 개체에게 비독성인, 약학 제제에서 활성 성분 이외의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 운반체는 완충액, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, "치료" (및 이의 문법적 변이, 예컨대 "치료한다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연 경과를 변경하려는 시도에서 임상적 개입을 지칭하고, 그리고 임상 병리의 예방을 위해 또는 임상 병리의 경과 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이 예방, 질환 진행의 속도 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 그리고 관해 또는 향상된 예후를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 본원 발명의 융합 단백질은 질환의 발달을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 늦추는 데 이용된다.
관용구 "치료 효과량"은 (i) 특정 질환, 상태 또는 장애를 치료하거나 예방하는, (ii) 특정 질환, 상태 또는 장애의 한 가지 이상의 증상을 약화하거나, 개선하거나 또는 제거하는, 또는 (iii) 본원에서 설명된 특정 질환, 상태 또는 장애의 한 가지 이상의 증상의 개시를 예방하거나 또는 지연시키는 본원 발명의 단백질의 양을 의미한다. 암의 경우에, 본원에서 설명된 바와 같은 치료제 또는 작용제의 조합의 치료 효과량은 암 세포의 숫자를 감소시키고; 종양 크기를 감소시키고; 주변 장기 내로 암 세포 침윤을 저해하고 (다시 말하면, 얼마간 늦추고, 바람직하게는 중단시키고); 종양 전이를 저해하고 (다시 말하면, 얼마간 늦추고, 바람직하게는 중단시키고); 종양 성장을 얼마간 저해하고; 및/또는 암과 연관된 증상 중에서 한 가지 이상을 얼마간 완화할 수 있다. 본원에서 설명된 바와 같은 치료제 또는 작용제의 조합은 성장을 예방하고 및/또는 기존의 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지, 정균성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 요법의 경우에, 효능은 예를 들면, 질환 진행까지 시간 (TTP)을 사정하고 및/또는 반응률 (RR)을 결정함으로써 계측될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로, 조절되지 않은 세포 성장에 의해 특징되는, 포유동물에서 생리학적 상태를 지칭하거나 또는 설명한다. "종양"은 한 가지 이상의 암성 세포를 포함한다. 종양은 고형과 액형 종양을 포함한다. 암의 실례는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 골수종, 그리고 백혈병 또는 림프성 악성종양을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 이런 암의 더 특정한 실례는 편평상피 세포 암 (예를 들면, 상피 편평상피 세포 암), 소세포 폐암, 비소세포 폐암 ("NSCLC"), 폐의 선암종 및 폐의 편평상피 암종을 비롯한 폐암, 복막의 암, 간세포암, 위장관암을 비롯한 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 악성 뇌 종양, 흑색종, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 두경부암뿐만 아니라 급성 골수성 백혈병 (AML)을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "차가운 종양" 또는 "면역 결핍"은 저면역원성이거나 또는 종양 특이적 면역성의 불충분한 유발 및 면역원성 세포독성에 내성에 의해 특징화되는 암성 종양을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 자신이 연관되는 다른 핵산을 증식할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 상기 용어는 자기 복제 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 벡터를 포함한다. 일정한 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 주동할 수 있다. 이런 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
II. 조성물 및 방법
A. 효과기 결여 Fc 단백질
한 가지 양상에서, 본원 발명은 놀랍게도 감소된 효과기 활성을 갖는 신규한 효과기 결여 IgG1 Fc 단백질을 제공한다. 본원에서 설계되고 설명된 Fc 단백질은 서열 번호:2의 아미노산 서열을 포함하고 본원에서 "FcNG2LH" 또는 "Fc NG PVA#"로서 또한 지칭된다. 본원에서 나타나 있는 바와 같이, FcNG2LH Fc 단백질은 야생형 IgG1 Fc 도메인을 갖는 단백질과 비교하여 유의미하게 감소된 ADCP 활성 (참조: 예를 들면, 적어도 실시예 1 및 10)뿐만 아니라 대식세포에 의한 사이토킨 방출의 감소된 활성화 (참조: 예를 들면, 실시예 1) 및 감소된 ADCC 활성을 갖는다. N297G 돌연변이만을 내포하는 IgG1 Fc 도메인의 열안정성에 비하여 FcNG2LH 단백질의 열안정성에서 놀라운 증가 역시 주목할 만하다.
효과기 결여 IgG1 Fc 도메인 단백질의 설계는 본원에서 설명된 바와 같은 Flt3L-Fc 융합 단백질에서 용도에 더하여, 많은 치료 분자의 맥락에서 유용성을 갖는다. 예를 들면, 두 개 이상의 분자 (예를 들면, 세포 표면 수용체)를 함께 가교화함으로써 분자에 결합하고 이를 활성화하도록 설계된 항체, 관문 저해제를 표적으로 하는 항체, 결합하여 ADCC 및/또는 ADCP 활성을 유도하는 적어도 하나의 팔을 갖는 이중특이적 또는 다중특이적 항체. 당업자는 효과기 결여 Fc 단백질이 두 번째 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에, 그리고 효과기 결여 Fc 단백질의 C-말단 및/또는 N-말단에 각각 연결되는 (예를 들면, 아미노산 결합을 통해) 융합 단백질의 생성을 위한 본원에서 설명된 효과기 결여 Fc 단백질의 용도를 인지할 것이다. 두 번째 단백질은 바람직하게는, 원하는 치료 기능을 갖는 것이다. 효과기 결여 Fc 도메인은 IgG Fc 수용체의 결합에 의해 유발되는 유해 반응 예컨대 중성구증가증을 예방할 수 있다. Fc 효과기 기능의 제어를 정밀화하기 위한 방식을 끊임없이 개발하는 것이 치료 단백질의 분야에서 요구된다.
한 가지 양상에서, 본원 발명은 중쇄 불변 도메인이 서열 번호:2의 FcNG2LH 단백질을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 Flt3L-Fc 융합 단백질은 면역글로불린 및 항체를 포함한다. 당업자는 NG2LH 돌연변이의 존재 및 효과기 기능의 결과적인 결여 또는 감소를 수용하고 이들로부터 유익성을 얻을 수 있는 다양한 항원 특이적 항체의 형식을 쉽게 구상할 수 있다. 예를 들면, 본원 발명의 인간 IgG1 FcNG2LH는 단일클론 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체, 또는 다중특이적 항체의 일부일 수 있다. 다시 말하면, IgG1 Fc 도메인을 포함하거나 또는 포함할 수 있는 임의의 면역글로불린 구조.
B. 예시적인 Flt3L-Fc 융합 단백질
한 가지 양상에서, 본원 발명은 Flt3 수용체 (Flt3R)에 결합하는 Flt3L-Fc 융합 단백질을 제공하는데, 여기서 상기 Fc 단백질은 야생형 Fc 단백질과 비교하여 효과기 기능을 거의 갖지 않거나 또는 크게 감소된 효과기 기능을 갖는다. 이들 융합 단백질은 특히, 환자가 관문 저해제 면역요법에 반응하지 않거나 또는 관문 저해제 면역요법에 대해 제한된 반응을 갖는 경우에, 다양한 암 면역요법 치료 프로토콜을 통해 암의 치료에 유용하다. "차가운 종양" 또는 "면역 결핍"에서 항종양 면역 반응의 결여는 불충분한 항종양 T 세포 반응 또는 이의 결여에 적어도 부분적으로 기인하는 것으로 생각된다. 효과적인 항종양 T 세포 반응은 수지상 세포 (DC)에 의한 종양 항원의 교차 제시를 필요로 한다.
따라서, 암 면역요법의 효능을 증가시키는 한 가지 수단은 종양 내에 항원 제시 DC의 수를 증가시키는 것이다. Flt3L은 선조 세포의 증식, 분화, 발달 및 동원을 통해, 개체에서 DC를 증가시키는 데 부분적으로 기능하는 것으로 널리 알려져 있다. 건강한 개체에게 투여된 Flt3L 단백질이 DC 및 조혈 줄기 세포를 실제로 확대할 수 있는 것으로 증거되긴 하지만 (예를 들면, Anandasabapathy et al., 2015, Bone Marrow Transplant., 50:924-930), 한 가지 우려 사항은 더 낮은 치료 효능 및/또는 너무 빈번한 투약에 대한 필요성을 야기할 수 있는, 혈액 내에서 재조합 Flt3L의 상대적으로 짧은 반감기이다.
치료 단백질의 혈청 반감기를 연장하기 위한 널리 확립된 전략은 이것을 면역글로불린 Fc 도메인에 연결하거나 또는 융합하는 (예를 들면, 펩티드 결합을 통해, 바람직하게는 Fc 단백질의 N-말단에서) 것이다 (예를 들면, Czajkowsky et al., 2012, EMBO, 4:1015-1028; Ha et al., 2016, Front Immunol, 7:394). 하지만, 예를 들면, 암 면역요법에 이용하기 위한 Flt3L-Fc 융합 단백질의 경우에는, 많은 예측할 수 없는 면역학적 또는 염증 과정을 원지에서 활성화할 수 있는 기능적 Fc 도메인을 갖는 것이 불리할 수 있다. 실제로, 사이토킨 폭풍 또는 사이토킨 방출 증후군 (CRS)을 야기하는 투여의 위험을 최소화하는 것이 중요하다. 추가적으로, Flt3L-Fc 융합 단백질 도메인의 야생형 Fc 및 면역 효과기 세포 상에서 Fc 수용체 사이의 상호작용은 Flt3L-Fc 융합 단백질에 의해 결합된 DC의 식균 파괴를 야기할 수 있다. Fc 영역에 의해 부여되는 이점을 유지하면서, Flt3L-Fc 융합 단백질의 Fc 영역의 효과를 최소화하여 이들을 제어하는 것이 중요할 수 있다. 본원에서 "Fc-NG2LH" 또는 "Fc-PVA# N297G"로서 지칭되는, 새로운 효과기 결여 IgG Fc 영역이 본원에서 설명되는데, 이것은 특히, 예를 들면, 야생형 IgG1 Fc, IgG1 Fc-N297G 및 IgG4 Fc 영역과 비교할 때 놀랍도록 낮은 효과기 기능 (참조: 예를 들면, 실시예 7)을 갖는 것으로 밝혀졌다. 게다가, 실시예 8에서 나타나 있는 바와 같이, NG2LH 변이체의 도입은 Fc 도메인의 열안정성에서뿐만 아니라 동물의 혈청 내에서 반감기에 대한 효과에서 예상치 못한 증가를 야기하였다.
Flt3L-Fc 융합 단백질 변이체의 추가 특징화는 Flt3L W144를 치환하는 것이 시험관내 T 세포 증식 검정에서 결정될 때 면역원성을 유의미하게 증가시킨다는 것을 보여주는데, 이것은 Flt3L (서열 번호:21)의 위치 149에서 잠재적인 산화 책임을 제거하는 것이 치료적 효과기 결여 Flt3L-Fc 융합 단백질 산물에 유해할 수 있다는 것을 암시한다. 대조적으로, 하지만, 실시예 9는 위치 149 및 151에서 잠재적인 글리코실화 부위의 치환이 시험관내 T 세포 증식 검정에 의해 결정될 때 면역원성을 증가시키지 않았다는 것을 보여주는데, 이것은 이들 및 다른 위치에서 돌연변이가 Flt3L-Fc 융합 단백질의 제조에 순응할 수 있다는 것을 암시한다.
중요하게는, 본원에서 개시된 바와 같은 변하는 용량의 효과기 결여 Flt3L-Fc 융합 단백질의 생체내 투여는 수지상 세포의 큰 확대를 발생시켰다 (참조: 예를 들면 실시예 5). 게다가, DC 확대의 수준은 등가 용량의 CDX-301로 관찰되었던 것보다 틀림없이 훨씬 크다.
Flt3L-Fc 융합 단백질은 IgG1 Fc 영역에 연결된 Flt3 리간드 (Flt3L) 단백질을 포함하는데, 여기서 IgG1Fc는 야생형 IgG1 Fc Fc에 융합된 동일한 Flt3L에 비하여 감소된 효과기 기능을 갖거나 또는 효과기 기능이 없다. Flt3L-Fc 융합 단백질의 Flt3L 부분은 세포 표면 Flt3 수용체 (Flt3R)에 결합할 수 있다. Flt3L 단백질의 서열은 길이에서 235개 아미노산의 단백질로서 GenBank 수탁 번호 P49771 (본원에서 서열 번호:21로서 제공됨)에서 설명되는데, 신호 펩티드가 대략 잔기 1-26에 걸쳐 있고 막경유 도메인이 대략 잔기 185-205에 걸쳐 있다. 잔기 29-159는 GenBank 기록에서는 Flt3 리간드로서 설명되고, 반면 Savvides et al. (Nat Struct Bio, 7:486-491)에서는 잔기 27-160 단독이 생물활성에 충분한 것으로 밝혀졌다고 진술한다. 일부 구체예에서, 본원 발명은 N-말단이 서열 번호:21의 24부터 30까지 임의의 아미노산 잔기이고 C-말단이 서열 번호:21의 위치 167-190에서 임의의 아미노산 잔기인, 서열 번호:21의 잔기를 포함하는 Flt3 리간드 도메인을 구상한다. Savvides et al. (상게서)은 잔기 27-160 단독을 포함하는 (및 이합체로서 설정된) 폴리펩티드가 리간드의 기능 활동에 충분하다는 것을 보여준 반면, 아래의 실시예 2에서 설명된 연구는 서열 번호:21의 잔기 167의 N-말단에서 종결되는, 예를 들면, Fc N-말단 잔기 (서열 번호:13의)에 공유적으로 연결되는 Flt3L 단백질을 이용하는 것을 보여준다. Flt3L의 변이체, 예컨대 서열 번호:21의 잔기 27-167에 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 단백질 서열을 포함하는 성숙 Flt3L 단백질 또한 본원 발명에서 구상되는 것으로 이해된다. 본원에서 (예를 들면, 아래의 실시예 3에서), Fc 단백질에 융합되는 Flt3의 단편 크기는 융합 단백질의 응집에 대한 유의미한 효과를 가질 수 있는 것으로 밝혀진다.
한 가지 양상에서, 본원 발명은 서열 번호:21의 잔기 27-167과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Flt3L 단백질 및 서열 번호:13과 적어도 95% 동일한 IgG Fc 분자를 포함하는 Flt3L-Fc 융합 단백질을 제공한다. IgG Fc 분자는 야생형 IgG1 Fc 폴리펩티드 (서열 번호:12)에 비하여 약화된 Fc 효과기 기능을 갖는데, 여기서 Fc 효과기 기능은 CDC, ADC, ADCC 및/또는 ADCP에서 선택된다. 일부 구체예에서, IgG Fc 분자는 야생형 IgG1 Fc 폴리펩티드에 비하여 약화된 ADCP 활성을 갖는다. 이론에 한정됨 없이, Fc(NG2LH) 단백질의 낮은 효과기 기능 내지 이의 부재는 Fc(NG2LH) 단백질의 하부 힌지에서 N297G 돌연변이 (서열 번호:13의 위치 76에서) 및 아미노산 PVAGP (서열 번호:13의 잔기 13-17) 둘 모두의 고유한 조합의 존재에 기인하는 것으로 고려된다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
일정한 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 단백질 변이체가 제공된다. 보존성 치환은 "바람직한 치환"의 표제하에 표 2에서 도시된다. 더 실제적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제하에 표 1에서 제공되고, 그리고 아미노산 측쇄 부류에 관하여 아래에 더욱 설명된다. 아미노산 치환은 관심되는 융합 단백질 내로 도입될 수 있고, 그리고 산물은 원하는 활성, 예를 들면, 감소된 면역원성 또는 감소된 ADCP에 대해 선별검사될 수 있다.
표 1
본래
잔기 		예시적인
치환 		바람직한
치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
아미노산은 공통 측쇄 특성에 따라 군화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존성 치환은 이들 부류 중에서 한 가지의 구성원을 다른 부류로 교체하는 것을 수반할 것이다.
아미노산 서열 삽입은 1개 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 내포하는 폴리펩티드까지의 길이 범위에서 변하는 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 복수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 실례는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 Flt3L-Fc 융합 단백질을 포함한다. Flt3L-Fc 융합 단백질 분자의 다른 삽입 변이체는 Flt3L-Fc 융합 단백질의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (예를 들면, ADEPT의 경우) 또는 폴리펩티드에 대한 Flt3L-Fc 융합 단백질의 N 또는 C-말단에 융합을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
일정한 구체예에서, 본원에서 제공된 Flt3L-Fc 융합 단백질은 Flt3L-Fc 융합 단백질이 글리코실화되는 정도가 증가하거나 또는 감소하도록 변형된다. Fc 도메인에 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 창출되거나 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변형함으로써 편의하게 달성될 수 있다.
Fc 영역에 대하여, 거기에 부착된 탄수화물은 변형될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생산된 선천적 항체는 전형적으로, Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연쇄에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 바이안테나리 올리고당류를 포함한다. 참조: 예를 들면, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). 올리고당류는 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스 및 시알산뿐만 아니라 바이안테나리 올리고당류 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원 발명의 Flt3L-Fc 융합 단백질에서 올리고당류의 변형은 일정한 향상된 특성을 갖는 효과기 결여 Fc 변이체를 창출하기 위해 만들어질 수 있다.
한 구체예에서, Fc 영역에 부착된 (직접적으로 또는 간접적으로) 푸코오스를 결여하는 탄수화물 구조를 갖는 Fc 융합 변이체가 제공된다. 예를 들면, 푸코오스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코오스의 양은 예를 들면, WO 2008/077546에서 설명된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 계측될 때, Asn 297에 부착된 모든 당구조의 총합 (예를 들면, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노오스 구조)에 비하여, Asn297에서 당 사슬 내에 푸코오스의 평균량을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역 내에 대략 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에서 위치된 아스파라긴 잔기를 지칭한다; 하지만, Asn297은 또한, 항체에서 경미한 서열 변이로 인해, 위치 297의 대략 ± 3개 아미노산 상류 또는 하류에, 다시 말하면, 위치 294 및 300 사이에 위치될 수 있다. 이런 푸코실화 변이체는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 참조: 예를 들면, US 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). "탈푸코실화된" 또는 "푸코오스-결함성" 항체 변이체에 관련된 간행물의 실례는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). 탈푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 실례는 단백질 푸코실화에서 결함성인 Lec13 CHO 세포 (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO 2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11), 그리고 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (참조: 예를 들면, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107)를 포함한다.
Fc 변이체는 양분된 올리고당류가 더욱 제공되는데, 예를 들면, 여기서 융합 단백질의 Fc 영역에 부착된 바이안테나리 올리고당류는 GlcNAc에 의해 양분된다. 이런 Fc 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이런 항체 변이체의 실례는 예를 들면, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에서 설명된다. 올리고당류 내에 적어도 하나의 갈락토오스 잔기가 Fc 영역에 부착되는 Flt3L-Fc 융합 단백질 변이체 역시 제공된다. 이런 Flt3L-Fc 융합 단백질 (및 이런 이유로 Fc) 변이체는 향상된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이런 항체 변이체는 예를 들면, WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에서 설명된다.
c) 단백질 유도체
일정한 구체예에서, 본원에서 제공된 효과기 결여 Fc 단백질, 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 항체 또는 융합 단백질, 또는 Flt3L-Fc 융합 단백질은 당해 분야에서 공지되고 쉽게 가용한 추가의 비단백질성 모이어티를 내포하도록 더욱 변형될 수 있다. Flt3L-Fc 융합 단백질의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 무제한적 실례는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 그리고 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤릴프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 그리고 이들의 혼합물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서 안정성으로 인해, 제조 시에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 그리고 분지되거나 또는 분지되지 않을 수 있다. Fc-융합 단백질에 부착된 중합체의 숫자는 변할 수 있고, 그리고 하나 초과의 중합체가 부착되면, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용되는 중합체의 숫자 및/또는 유형은 향상되는 Flt3L-Fc 융합 단백질의 특정 특성 또는 기능, Flt3L-Fc 융합 단백질 유도체가 규정된 조건하에 요법에서 이용될 것인지의 여부 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 고려 사항에 근거하여 결정될 수 있다.
다른 구체예에서, 방사선에 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 Flt3L-Fc 융합 단백질 및 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 구체예에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 그리고 일상적인 세포를 훼손하지 않지만 비단백질성 모이어티를 융합 단백질-비단백질성 모이어티 근위의 세포가 사멸되는 온도까지 가열하는 파장을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
C. 재조합 방법과 조성물
Flt3L 융합 단백질은 당업자에게 쉽게 공지된 재조합 방법과 조성물을 이용하여 생산될 수 있다. 한 구체예에서, 본원에서 설명된 Flt3L-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이런 핵산은 Flt3L-Fc 융합 단백질의 Flt3L 및 Fc 부분을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다. 추가의 구체예에서, 이런 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들면, 발현 벡터)가 제공된다. 추가의 구체예에서, 이런 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 숙주 세포는 (1) 본원 발명에 따른, Flt3L 폴리펩티드 및 Fc 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다 (예를 들면, 이것으로 형질전환되었다). 바람직한 구체예에서, Flt3L 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 Fc 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 상류에 있다. 게다가, 이들 2개의 핵산은 단일 오페론 내에 있다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들면, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구양 세포 (예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 구체예에서, Flt3L-Fc 융합 단백질을 만드는 방법이 제공되는데, 여기서 상기 방법은 Flt3L-Fc 융합 단백질의 발현에 적합한 조건하에, 상기 제시된 바와 같은 Flt3L-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 그리고 임의적으로, Flt3L-Fc 융합 단백질을 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 단계를 포함한다.
Flt3L-Fc 융합 단백질의 재조합 생산의 경우에, 예를 들면, 전술된 바와 같은 Flt3L-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산이 단리되고, 그리고 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 이런 핵산은 전통적인 절차를 이용하여 (예를 들면, 융합 단백질을 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 쉽게 단리되고 염기서열결정될 수 있다.
효과기 결여 Fc 단백질, 상기 Fc 단백질을 내포하는 항체 또는 융합 단백질, 또는 예를 들면, Flt3L-Fc 융합 단백질-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 본원에서 설명된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들면, Flt3L-Fc 융합 단백질은 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않을 때 세균에서 생산될 수 있다. 세균에서 폴리펩티드의 발현에 대해, 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. (대장균 (E. coli)에서 항체 단편의 발현을 설명하는, Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254를 또한 참조한다). 발현 후, Flt3L-Fc 융합 단백질은 가용성 분획물에서 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 더욱 정제될 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어, 부분적으로 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 Flt3L-Fc 융합 단백질의 생산을 야기하는 균류 및 효모 균주를 비롯한, 실모양 균류 또는 효모가 Flt3L-Fc 융합 단백질-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참조: Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
글리코실화된 Flt3L-Fc 융합 단백질의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 생물체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 실례는 식물과 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 이용될 수 있는 다양한 바쿨로바이러스 계통이 확인되었다.
식물 세포 배양액 또한, 숙주로서 활용될 수 있다. 참조: 예를 들면, US 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (유전자도입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 설명).
척추동물 세포 또한, 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 현탁 상태에서 성장하도록 적응되는 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 실례는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)에서 설명된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 생쥐 세르톨리 세포 (예를 들면, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)에서 설명된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 생쥐 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들면, Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에서 설명된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포를 비롯한, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 그리고 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 일정한 포유류 숙주 세포주에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참조한다.
D. 검정
본원에서 제시된 바와 같이 DC의 확대를 가능하게 할 수 있는 Flt3L-Fc 융합 단백질은 당해 분야에서 공지된 다양한 검정에 의해, 그들의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인되거나, 선별검사되거나, 또는 특징화될 수 있다.
E. 면역접합체
본원 발명은 또한, 한 가지 이상의 세포독성 작용제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 저해제, 독소 (예를 들면, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성 독소, 또는 이들의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본원에서 Flt3L-Fc 단백질을 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 구체예에서, Flt3L-Fc 단백질의 면역접합체는 항체-약물 접합체 (ADC)의 생성과 유사한 방식으로 생성되는데, 여기서 항체는 메이탄시노이드 (참조: U.S. 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP0425235B1); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸라우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (참조: U.S. 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588 및 7,498,298); 돌라스타틴; 칼리키아마이신 또는 이의 유도체 (참조: U.S. 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 및 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer. Res. 58:2925-2928 (1998)); 안트라사이클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (참조: Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); 및 U.S. 특허 번호 6,630,579); 메토트렉사트; 빈데신; 탁산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 약물에 접합된다.
다른 구체예에서, 면역접합체는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (녹농균 (Pseudomonas aeruginosa)으로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모디카 차란티아 (momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 효소적으로 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된 본원에서 설명된 바와 같은 Flt3L-Fc 단백질을 포함한다.
다른 구체예에서, 면역접합체는 방사접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에서 설명된 바와 같은 Flt3L-Fc 단백질을 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사접합체의 생산에 가용하다. 실례는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사접합체가 검출에 이용될 때, 이것은 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들면, tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상법, mri로서 또한 알려져 있음)를 위한 스핀 표지, 예컨대 요오드-123 어게인, 요오드-131, 인듐-111, 플루오르-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
Flt3L-Fc 단백질 및 세포독성 작용제의 접합체는 다양한 이중기능성 단백질 연계 작용제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피온산염 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실산염 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중기능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베르산염), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)에서 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지화된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "개열가능한 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정 링커, 펩티드분해효소-민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 이황화물-내포 링커 (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); U.S. 특허 번호 5,208,020)가 이용될 수 있다.
본원에서 면역접합체는 상업적으로 가용한 (예를 들면, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A로부터) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 그리고 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 교차연결제 시약으로 제조된 이와 같은 접합체를 명시적으로 예기하지만, 이들에 한정되지 않는다.
F. 약학 제제
본원에서 설명된 바와 같은 Flt3L-Fc 융합 단백질의 약학 제제는 동결 건조된 제제 또는 수성 용액의 형태에서, 원하는 정도의 순도를 갖는 이런 단백질을 한 가지 이상의 임의적인 약학적으로 허용되는 운반체와 혼합함으로써 제조된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 약학적으로 허용되는 운반체는 일반적으로, 이용된 용량과 농도에서 수용자에게 비독성이고, 그리고 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 완충액, 예컨대 인산염, 구연산염, 그리고 다른 유기 산; 아스코르빈산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들면, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 운반체는 틈새 약물 분산 작용제, 예컨대 가용성 중성 활성 히알루론산분해효소 당단백질 (sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루론산분해효소 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는 일정한 예시적인 sHASEGP 및 이용 방법은 US 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에서 설명된다. 한 가지 양상에서, sHASEGP는 한 가지 이상의 추가 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 병용된다.
본원에서 제제는 또한, 치료되는 특정 적응증에 대해 필요에 따라 한 가지 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 내포할 수 있다. 예를 들면, 수지상 세포 성숙 인자 및/또는 어쥬번트를 더욱 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이런 활성 성분은 적절하게는, 의도된 목적에 효과적인 양에서 조합으로 존재한다.
활성 성분은 예를 들면, 액적형성 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐 내에, 예를 들면 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로유제, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로유제에서 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이런 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에서 개시된다.
지속된 방출 제조물이 제조될 수 있다. 지속된 방출 제조물의 적합한 실례는 Fc 융합 단백질을 내포하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하고, 여기서 이들 매트릭스는 성형된 물품, 예컨대 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 이용되는 제제는 일반적으로 무균이다. 무균은 예를 들면, 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본원에서 제공된 임의의 Flt3L-Fc 단백질이 치료 방법에서 이용될 수 있다.
한 가지 양상에서, 약제로서 이용하기 위한 Flt3L-Fc 단백질이 제공된다. 추가의 양상에서, 암에 이용하기 위한 Flt3L-Fc 단백질이 제공된다. 일정한 구체예에서, 치료 방법에 이용하기 위한 Flt3L-Fc 단백질이 제공된다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 Flt3L-Fc 단백질의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 겪는 개체를 치료하는 방법에 이용하기 위한 Flt3L-Fc 단백질을 제공한다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 상기 방법은 예를 들면, 아래에 설명된 바와 같은 적어도 한 가지 추가 치료제의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 구체예에서, 본원 발명은 수지상 세포를 확대하는 데 이용하기 위한 Flt3L-Fc 단백질을 제공한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 수지상 세포를 확대하는 데 효과적인 Flt3L-Fc 단백질을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 수지상 세포를 확대하는 방법에 이용하기 위한 Flt3L-Fc 단백질을 제공한다. 임의의 상기 구체예에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 약제의 제조 또는 준비에서 Flt3L-Fc 단백질의 용도를 제공한다. 한 구체예에서, 약제는 암의 치료를 위한 것이다. 추가의 구체예에서, 약제는 암을 치료하는 방법에 이용하기 위한 것이고, 상기 방법은 상기 약제의 효과량을 암을 겪는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 상기 방법은 예를 들면, 아래에 설명된 바와 같은 적어도 한 가지 추가 치료제의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 구체예에서, 약제는 수지상 세포를 확대하기 위한 것이다. 추가의 구체예에서, 약제는 개체에서 수지상 세포를 확대하기 위한 방법에 이용하기 위한 것이고, 상기 방법은 수지상 세포를 확대하기 위한 약제의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 임의의 상기 구체예에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 Flt3L-Fc 단백질의 효과량을 이런 암을 겪는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 상기 방법은 아래에 설명된 바와 같은 적어도 한 가지 추가 치료제의 효과량을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 구체예에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 개체에서 수지상 세포를 확대하기 위한 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 수지상 세포를 확대하기 위한 Flt3L-Fc 단백질의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, "개체"는 인간이다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 예를 들면, 임의의 상기 치료 방법에 이용하기 위한 본원에서 제공된 임의의 Flt3L-Fc 단백질을 포함하는 약학 제제를 제공한다. 한 구체예에서, 약학 제제는 본원에서 제공된 임의의 Flt3L-Fc 단백질 및 약학적으로 허용되는 운반체를 포함한다. 다른 구체예에서, 약학 제제는 본원에서 제공된 임의의 Flt3L-Fc 단백질 및 예를 들면, 아래에 설명된 바와 같은 적어도 한 가지 추가 치료제를 포함한다.
본원 발명의 Flt3L-Fc 단백질은 요법 동안 단독으로 이용되거나 또는 다른 작용제와 병용될 수 있다. 예를 들면, 본원 발명의 Flt3L-Fc 단백질은 적어도 한 가지 추가 치료제와 병용 투여될 수 있다.
전술된 이런 병용 요법은 병용 투여 (여기서 두 가지 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 제제 내에 포함된다), 그리고 별개 투여를 포괄하고, 이러한 사례에서, 본원 발명의 Flt3L-Fc 단백질의 투여는 추가 치료제 또는 치료제들의 투여에 앞서, 투여와 동시에 및/또는 투여 이후에 발생할 수 있다. 한 구체예에서, Flt3L-Fc 단백질의 투여 및 추가 치료제의 투여는 서로 약 1 개월 이내에, 또는 약 1, 2 또는 3 주 이내에, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 일 이내에 일어난다. 본원 발명의 Flt3L-Fc 단백질은 또한, 방사선요법과 병용될 수 있다.
본원 발명의 Flt3L-Fc 융합 단백질 (및 임의의 추가 치료제)는 비경구, 폐내 및 비내를 비롯한 임의의 적절한 수단에 의해, 그리고 국소 치료를 위해 원하는 경우에, 병변내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 임의의 적합한 루트에 의할 수 있다, 예를 들면, 부분적으로 투여가 단기 또는 장기인지에 따라서, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 단회 투여 또는 다양한 시점에 걸쳐 복수 투여, 일시 투여, 그리고 펄스 주입을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 투약 일정이 본원에서 예기된다.
본원 발명의 Flt3L-Fc 융합 단백질은 모범 의료행위 지침과 일치하는 방식으로 조제되고, 투약되고, 투여될 것이다. 이러한 문맥에서 고려되는 인자는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여의 일정, 그리고 개업의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. Flt3L-Fc 융합 단백질은 반드시 그러할 필요는 없지만, 문제되는 장애를 예방하거나 치료하는 데 현재 이용되는 한 가지 이상의 작용제와 함께 임의적으로 조제된다. 이런 다른 작용제의 효과량은 제제 내에 존재하는 Flt3L-Fc 융합 단백질의 양, 장애 또는 치료의 유형, 그리고 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 이들은 일반적으로, 본원에서 설명된 바와 동일한 용량에서 및 투여 루트로, 또는 본원에서 설명된 용량의 약 1 내지 99%에서, 또는 경험적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정되는 임의의 용량에서 및 임의의 루트에 의해 이용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위한, 본원 발명의 Flt3L-Fc 융합 단백질의 적절한 용량 (단독으로 이용되거나 또는 한 가지 이상의 다른 추가 치료제와 병용될 때)은 치료되는 질환의 유형, Flt3L-Fc 융합 단백질의 유형, 질환의 심각도와 경과, Flt3L-Fc 융합 단백질이 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 상기 융합 단백질에 대한 반응, 그리고 주치의의 재량에 의존할 것이다. Flt3L-Fc 융합 단백질은 적합하게는, 한꺼번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다. 질환의 유형과 심각도에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들면, 0.1 mg/kg - 10 mg/kg)의 Flt3L-Fc 융합 단백질이 예를 들면, 1회 이상의 별개 투여에 의한, 또는 연속 주입에 의한 것인지에 상관없이, 환자에게 투여를 위한 초기 후보 용량일 수 있다. 한 가지 전형적인 일일량은 전술된 인자에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수도 있다. 수일 이상에 걸쳐 반복된 투여의 경우에, 상태에 따라서, 치료는 일반적으로, 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. Flt3L-Fc 융합 단백질의 한 가지 예시적인 용량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위 안에 있을 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합) 중에서 한 가지 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이런 용량은 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3 주마다 (예를 들면, 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들면, 약 6회 용량의 융합 단백질을 제공받도록) 투여될 수 있다. 초기 더 높은 부하 용량, 그 이후에 1회 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 하지만, 다른 투약 섭생이 유용할 수도 있다.
임의의 상기 제제 또는 치료 방법은 Flt3L-Fc 융합 단백질 대신에 또는 이것에 더하여 본원 발명의 면역접합체를 이용하여 실행될 수 있는 것으로 이해된다.
H. 제조 물품
본원 발명의 다른 양상에서, 전술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 내포하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 결합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 단독으로, 또는 질환을 치료하는, 예방하는 및/또는 진단하는 데 효과적인 다른 조성물과 조합으로 조성물을 보유하고, 그리고 무균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백, 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물에서 적어도 한 가지 활성제는 본원 발명의 Fc 융합 단백질이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택 질환을 치료하는 데 이용된다는 것을 지시한다. 게다가, 제조 물품은 (a) 조성물이 그 안에 내포된 첫 번째 용기 (여기서 상기 조성물은 본원 발명의 Fc 융합 단백질을 포함한다); 및 (b) 조성물이 그 안에 내포된 두 번째 용기 (여기서 상기 조성물은 추가 세포독성제 또는 만약 그렇지 않으면 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본원 발명의 이러한 구체예에서 제조 물품은 조성물이 특정 질환을 치료하는 데 이용될 수 있다는 것을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용되는 완충액, 예컨대 정균성 주사용수 (BWFI), 인산염-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 두 번째 (또는 세 번째) 용기를 추가로 포함할 수도 있다. 이것은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 비롯하여, 상업적 관점 및 이용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수도 있다.
임의의 상기 제조 물품은 Flt3L-Fc 융합 단백질 대신에 또는 이것에 더하여 본원 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
III. 실시예
다음은 본원 발명의 방법과 조성물의 실시예이다. 앞서 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 구체예가 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1. 효과기 결여 Fc 단백질의 설계
용어 "NG2LH"는 IgG1 N297G 치환을 포함하고, 그리고 IgG1의 하부 힌지 잔기 233-236 (ELLG, 서열 번호:19)을 인간 IgG2의 잔기 233-236 (PVA; 위치 236에서 아미노산 없음, 본원에서 "PVA#"로서 또한 지칭됨)과 "교환하는" 인간 IgG1 Fc 도메인을 지칭하는데, 여기서 위치는 Kabat에서 설명된 바와 같은 EU 색인에 따라서 넘버링된다. NG2LH Fc 변이체 단백질 (본원에서 "PVA# NG"로서 또한 지칭됨)의 효과기 결여 성격은 먼저, 아래의 표 2에서 규정된 바와 같이, 전장 항체의 맥락에서 및 야생형, N297G 및 다른 Fc 변이체 IgG1뿐만 아니라 IgG2 및 IgG4 항체와 비교하여 도시되었다.
표 2
서열 번호: 중쇄 불변 영역 (CH1 - CH3)에 관한 설명 치환(들) (EU 넘버링)
2 IgG1 NG PVA#로도 알려진 IgG1 NG2LH N297G/E233P/L234V/L235A/G236#
3 IgG1 NG N297G
4 IgG1 PVA# E233P/L234V/L235A/G236#
5 IgG1 NG PVA# G N297G/E233P/L234V/L235A/G236#/A327G
6 IgG1 NG PVA# GSS N297G/E233P/L234V/L235A/G236#/A327G/A330S/P331S
7 IgG1 PG P329G
8 IgG1 LALA L234A/L235A
9 IgG1 LALAPG L234A/L235A/P329G
항-Her2 항체 (트라스투주맙 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, Calif., USA) (U.S. 특허 번호 6,407,213 및 Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93에서 또한 지칭됨; 본원에서 서열 번호:47로서)의 경쇄와 중쇄 가변 및 도메인을 인코딩하는, 표 2에서 열거된 중쇄 불변 영역 (CH1-CH3)을 포함하는 전장 항체가 작제되었다. 이들 항-Her2 항체에 대한 경쇄는 선천적 인간 C 카파 불변 영역을 포함하였다. 전장 경쇄 및 다양한 전장 중쇄를 인코딩하는 핵산이 pRK 포유류 발현 벡터 내로 클로닝되었다 (Eaton et al., 1986, Biochemistry 25:8343-47). 경쇄와 중쇄 핵산 벡터가 CHO 세포에서 공동발현되었고, 그리고 항체가 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 그 이후에 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제되었다.
이들 항체는 이후, 일차 대식세포 및 Her2를 과다발현하는 SK-BR-3 인간 유방암 세포주 (ATCC® HTB-30)를 이용하여, 항체 의존성 세포 식균작용 (ADCP) 및 항체 의존성 사이토킨 방출 (ADCR)에 대한 그들의 효과에 대해 검사되었다. 항-gD 항체가 음성 대조 항체로서 이용되었다. 단핵구가 공여자 PBMC로부터 단리되고, 25 ng/ml 인간 MCSF-1로 자극되고, T-175 조직 배양 플라스크에서 5-7 일 동안 대식세포로 분화하도록 허용되었다. ADCP 및 사이토킨 방출 실험의 전날에, 모든 대식세포가 M1 대식세포로 분화하기 위해 50 ng/ml IFNγ (R&D Systems 285-IF-100/CF)로 자극되었다. 대식세포 및 SK-BR-3 GFP 세포가 아쿠타아제 (Millipore SCR005) 처리에 의해 수확되었다. 이탈된 대식세포 및 SK-BR-3 세포가 각각, 2x106개 및 0.5x106개 세포/ml의 농도로 배지 (X-Vivo 10; Lonza 04-743Q, 10% HI FBS; Gibco 10438-026)에서 재현탁되었다. 검사 조건 (항체 변이체 및 처리 농도)을 결정하기 위해 96 웰 평판 지도가 설계되었다. 항체 변이체 각각의 2X 연속 희석액이 배지에서 제조되었다 (6 포인트 10배 연속 희석: 2000, 200, 20, 2, 0.2, 0.02 ng/ml). 평판 지도에 따라서, 50 ul의 대식세포 및 50 ul의 SK-BR-3이 각 웰에 첨가되어, 각 웰에서 100k 대식세포 및 25k SK-BR-3 세포가 야기되었다. 100 uL의 2X 항체 연속 희석된 용액이 평판 지도에 따라서 96 웰 평판의 웰에서 통합되었다. 최종 항체 처리 농도는 1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01 ng/ml이었다. 100 uL의 배지가 "배지 단독" 대조 처리로서, 대식세포 및 SK-BR-3 세포를 내포하는 3개의 웰에 첨가되었다. 이들 96 웰 평판은 20 x g에서 2 분 동안 원심분리되고, 이후 37℃에서 약 24 시간 동안 인큐베이션되었다. 세포가 400 x g에서 4 분 동안 원심분리되었고, 그리고 상층액이 Luminex Reader Millipore Multiplex에 의한 ADCR 분석을 위해 수집되었다. 세포가 아쿠타아제 처리에 의해 웰로부터 이탈되었다. 각 웰에서 세포가 200 ul의 FACS 완충액 (BD, 554657)으로 1회 세척되었다. 염색 용액이 Alexa 647 (Invitrogen, Alexa Fluor 647 항체 표지화 키트, A20186)과 접합된 항-CD11b (BD, 555385) 및 항-CD14 (BD, 555396) (FACS 완충액에서 1:100 항체 접합체)로 제조되었다. 50 uL의 염색 용액이 모든 웰에 첨가되고 4 ℃에서 30 - 60 분 동안 인큐베이션되었다. 세포가 FACS 완충액 (웰마다 200 ul)으로 2회 세척되었다. 각 웰에서 세포가 50 ul의 FACS 완충액에서 재현탁되었다. 세포의 한 평판이 ADCP 효율에 대해 FACS에 의해 분석되었다. FACS 데이터가 소프트웨어 FlowJo로 분석되었다. 세포가 전방 및 측면 산란 플롯에서 게이팅되고, 이후 Y 축에서 GFP-발현 및 X 축에서 Alexa 647에 관해 플로팅되었다. 각 사분면에서 세포 백분율이 계산되었다. SK-BR-3 세포는 주로 사분면 1 (Q1, GFP 양성)에 있었고, 그리고 대식세포는 주로 사분면 3 (Q3, Alexa 647 양성)에 있었다. 각 웰의 식균작용 %가 아래와 같이 계산되었다:
식균작용 % = 100% - (각 웰의 Q1)/(3개의 배지 단독 대조 웰의 평균 Q1)
그래프 상에 플로팅된, 항체 처리 농도에 대하여 항체 변이체의 식균작용 %.
2개의 평판이 Luminex (Luminex Corp)에 의해 분석되었다. 도 1에서 도시된 바와 같이, 증가하는 농도의 LALAPG 또는 NGLH2 Fc 항-Her2 항체의 존재에서 식균작용이 거의 관찰되지 않았다. 가장 높은 수준의 ADCP가 IgG1 야생형 및 IgG4 항체 변이체로 관찰되었다. 중간 수준의 식균작용이 IgG2 야생형 Fc 및 IgG1 PVA# Fc에 대해 관찰되었다. 따라서, 도 1은 IgG1 NG2LH 및 IgG1 LALAPG Fc 도메인이 시험관내 분석에서 ADCP 활성을 결여한다는 것을 보여준다. 상기 실험은 IgG1 NG PVAG 및 IgG1 NG PVA# GSS의 존재에서 ADCP 활성의 유사한 결여를 증명한다 (데이터 제시되지 않음).
ADCP 검정으로부터 사이토킨 방출 프로필의 결과는 도 2a-2j에서 제공된다. 식균작용 데이터와 일관하게, 이들 결과는 선천적 IgG1, IgG4 및 정도가 덜하긴 하지만 N297G와는 대조적으로, NG2LH 변이체가 표적 세포의 존재에서 대식세포에 의한 ADCR을 매개하지 않는다는 것을 증명한다.
이들 데이터는 야생형 IgG1 Fc와 비교하여 이들 변이체의 ADCC 리포터 검정으로부터 데이터와 대조적이다. 오크렐리주맙 (항-CD20) 또는 트라스투주맙 (항-Her2)으로부터 유래된 가변 도메인이 전술된 야생형 및 변이체 도메인에 융합되고 ADCC 검정에서 검사되었다. 이러한 검정에서, NK 세포가 NFAT-RE-루시페라아제 리포터 세포로서 조작되고, RcγRIIIa 결합이 판독되고, 이후 WIL2S CD20+ 세포 또는 SkBr3 Her2+ 세포의 존재에서 검정되었다. 야생형 또는 변이체 도메인을 갖는 항-CD20 및 항-Her2 작제물 둘 모두의 경우에, 모든 비-야생형 Fc 분자는 야생형 IgG1 Fc와 비교하여 최소 활성을 가졌다 (참조: 도 2k 및 2l).
실시예 2. Flt3L Fc 융합 단백질의 설계
Flt3L-Fc 융합 단백질이 일과적인 핵산 클로닝, 단백질 발현 및 단백질 정제 기술을 이용하여 생성되었다.
PCR이 원하는 키메라 Flt3L-Fc 단백질의 Flt3L 및 Fc 부분을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 내포하는 cDNA를 증폭하는 데 이용되었다 (참조: 표 3, 서열 번호:10-31). 표 3에서 설명된 Flt3L-Fc 단백질 (표 10에서 제공된 서열)의 발현과 생산을 위해, 인간 Flt3L의 선천적 신호 서열 (GenBank 수탁 번호 P49771의 잔기 1-27; 서열 번호:21)을 포함하는 cDNA가 생성되었다. 실례로서, hFLT3L.P167.5aa.힌지.hIgG1.NG.PVA# 단백질의 발현을 위해 생성된 cDNA는 표 10에서 서열 번호:45로서 제공된 바와 같은 Flt3L 신호 서열을 갖는 융합 단백질을 인코딩하는 cDNA 서열을 포함하였다.
표 3
서열 번호: 작제물 명칭
25 hFLT3L.P168.5aa.힌지.hIgG1.NG.PVA#
26 hFLT3L.P167.5aa.힌지.hIgG1.NG.PVA#
27 hFLT3L.P167.5aa.힌지.hIgG1
28 hFLT3L.P167.5aa.힌지.hIgG1.NG
29
hFLT3L.P167.5aa.힌지.hIgG1.PVA#
30 hFLT3L.P167.5aa.힌지.hIgG1.LALAPG
31 hFLT3L.P167.7aa.힌지.hIgG4
32 hFLT3L.P166.5aa.힌지.hIgG1.NG.PVA#
33 hFLT3L.L165.5aa.힌지.hIgG1.NG.PVA#
34 hFLT3L.L164.5aa.힌지.hIgG1.NG.PVA#
35 hFLT3L.C158.5aa.힌지.hIgG1.NG.PVA#
36 hFLT3L.P179.hIgG1.N297G
37 hFLT3L.Q159.hIgG1.N297G
38 hFTL3L.C158.3aa.힌지.hIgG1.NG.PVA#
39 hFTL3L.C158.no.힌지.hIgG1.NG.PVA#
40 hFTL3L.D161.no.힌지.hIgG1.NG.PVA#
41 hFTL3L.S163.no.힌지.hIgG1.NG.PVA#
42 Hs_FLT3LG.M1-L165.W144D.O.pRK-5aa.hIgG1.NG2LH
43 Hs_FLT3LG.M1-L165.S151D.O.pRK-5aa.hIgG1.NG2LH
44 Hs_FLT3LG.M1-L165.S151E.O.pRK-5aa.hIgG1.NG2LH
46 Flt3L-Fc(IgG4)
Flt3L-Fc 융합을 인코딩하는 cDNA가 포유류 발현 벡터 pRK5 (Gorman, et al., DNA and Protein Engineering Techniques 2:1 (1990); U.S. 특허 번호 6,232,117) 내로 하위클로닝되고 CMV 프로모터의 제어하에 발현되었다.
CHO 또는 HEK293 세포 중 어느 하나가 원하는 발현 작제물로 일시적으로 형질감염되고, 적합한 배양 배지에서 각각 10 일 또는 6 일 동안 성장되고, 그리고 정제를 위해 수확되었다.
Flt3L-Fc 융합 작제물의 정제가 HiTrap MabSelect SuRe 친화성 포획 크로마토그래피 (GE), 그 이후에 Superdex 200 SEC, 그리고 최종적으로 투석을 통한 농축 및 완충액 교환을 이용하여 달성되었다.
실시예 3. Flt3L-Fc 융합 단백질의 특징화
실시예 2에서 설명된 바와 같이 생성된 융합 단백질이 용해 상태에서 응집에 대한 감수성뿐만 아니라 이황화 결합의 환원 및 상실의 관점에서 특징화되었는데, 이들은 각각 SDS-PAGE (웰마다 3-5 ug) 및 HPLC SEC (SuperDex 200; 평형화 완충액: 200 mM 아르기닌, 137 mM 숙신산, pH 5.0)에 의해 분석되었다. CHO 세포 배양액으로부터 정제된 Flt3L-Fc 융합 단백질을 이용하여 수행된 실험으로부터 획득된 데이터는 아래의 표 4에서 요약되는데, CHO 세포 및 HEK293 세포에서 발현되고 이들로부터 정제된 Flt3L-Fc 융합 작제물 hFLT3L.S163.no.힌지.hIgG1.NG.PVA# (서열 번호:41)로부터 예시적인 데이터는 도 3a-3c에서 도시되고, 그리고 CHO 세포 및 HEK293 세포에서 발현되고 이들로부터 정제된 Flt3L-Fc 융합 작제물 hFLT3L.P167.5aa.힌지.hIgG1.NG.PVA# (서열 번호:26)로부터 데이터는 도 3d-3f에서 도시된다.
표 4
서열 번호: 작제물 응집 % 불완전 힌지 이황화물
25 hFLT3L.P168.5aa.힌지.hIgG1.NG.PVA# 24 ND*
26 hFLT3L.P167.5aa.힌지.hIgG1.NG.PVA# 26 ND
32 hFLT3L.P166.5aa.힌지.hIgG1.NG.PVA# 26 +
33 hFLT3L.L165.5aa.힌지.hIgG1.NG.PVA# 33 ++
34 hFLT3L.L164.5aa.힌지.hIgG1.NG.PVA# 35 +++
35 hFLT3L.C158.5aa.힌지.hIgG1.NG.PVA# 86 ++++
38 hFTL3L.C158.3aa.힌지.hIgG1.NG.PVA# 90 +++
39 hFTL3L.C158.no.힌지.hIgG1.NG.PVA# 77 ++
41 hFTL3L.S163.no.힌지.hIgG1.NG.PVA# 85 ++++
* ND = 검출되지 않음
상기 표 4에서 요약된, 이들 변이체의 데이터 분석은 Flt3L 분자의 마지막 시스테인 및 Fc(NG2LH) 분자의 첫 번째 시스테인 사이에 존재하는 아미노산 잔기의 수 (접합부 길이)가 응집 및/또는 이황화 결합 형성의 수준에 영향을 줄 수 있다는 것을 보여주었다. 접합부 길이가 14개 잔기보다 작을 때, 각 작제물 중 30%까지가 분자간 힌지 이황화물을 결여하는 것으로 보인다. 5개 아미노산 잔기 이하의 접합부 길이는 매우 높은 응집을 야기하였다. 가장 낮은 수준의 응집이 서열 번호 24, 26, 32, 33 및 34의 융합 단백질에 대해 관찰되었다. 가장 낮은 수준의 불완전 힌지 이황화 결합이 서열 번호 25, 26 및 32의 융합 단백질에 대해 관찰되었고, 서열 번호 33 및 39 또한, 상대적으로 낮은 수준의 불완전 힌지 이황화물을 가졌다. 여기에서 관찰된 데이터는 Flt3L 및 Fc 단백질 둘 모두의 구조가 충분히 특징화되고 독립된 도메인으로서 접힐 수 있는 것으로 밝혀졌다는 점을 고려하면, 다소간 예상치 못한 것이었다. 하지만, 주의할 점은 각 단백질 도메인이 이황화 결합 및 구조 건전성에 중요한 시스테인 잔기를 내포한다는 것이다. 따라서, 이들 데이터는 Flt3L-Fc(NG2LH) 융합 분자의 설계가 충분한 공유 Fc-이합체화 및 최소한의 응집 또는 응집의 결여를 담보하기 위해 단백질 산물의 세심한 사정을 필요로 한다는 것을 증명한다.
실시예 4. Flt3L 활성에 대한 시험관내 기능 분석
Flt3L 단백질 (Fc 융합 없음; 서열 번호:23)의 기능과 비교하여 Flt3L-Fc 융합 단백질의 기능적 특성을 사정하기 위해 시험관내 분석이 수행되었다. 여기에서 설명된 바와 같이 수행된 시험관내 분석은 Flt3 수용체를 발현하는 인간 세포주의 증식을 유도하는 Flt3L 단백질의 효능을 계측하는 데 이용될 수 있다.
Costar 96 웰 편평 바닥 평판 (Cat#3610 Thermo Fisher)이 실온에서 100 uL의 폴리-L-오르니틴 (Cat#A-004-C EMD Millipore)으로 하룻밤 동안 코팅되고, PBS로 3x 세척되고, 건조되도록 허용되었다. 인간 OCI-AML5 세포 (No. ACC 247, DSMZ)가 100 uL의 검정 배지 (5% 열 비활성화 FBS, 1X 글루타맥스를 내포하는 RPMI 1640)에서 웰마다 3000개 세포로 파종되었다. Flt3L 검사 물품이 검정 배지에서 20 ug/mL로 희석되고 연속으로 1:10 희석되었다. 10 ug/mL의 최종 시작 농도를 달성하기 위해, 100 uL의 희석된 검사 물품이 각 웰에 첨가되었다 (삼중으로). 최대와 최소 대조 웰은 10 ug/mL hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH (서열 번호:26) 또는 검정 배지 단독을 포함하였다. 검정 평판이 37℃, 5% CO2에서 7 일 동안 인큐베이션되었다. 100 uL의 상층액이 각 웰로부터 제거되었고, 이후 100 uL의 세포 역가 Glo (Cat#PR-G7572 Thermo Fisher)가 각 웰에 첨가되었고, 그리고 평판이 어둠하에 8-10 분 동안 인큐베이션되었다. 발광이 SpectraMax i3 평판 판독기 (Molecular Devices)로 계측되었다. 미가공 값이 최대와 최소 대조 웰에 대해 정규화되었다. 각 검사 물품의 용량 반응이 XLfit (IDBS)로 플로팅되었고, 그리고 EC50 값이 4 파라미터 로지스틱 곡선을 이용하여 결정되었다. 도 4a-4b에서 도시된 그래프가 GraphPad Prism 7로 생성되었다.
이들 데이터는 hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH 및 gCDX-301 둘 모두 OCI-AML5 세포의 용량 의존성 증식을 시험관내에서 유도하였다는 것을 증명한다. 평균 EC50 효능 값은 비슷하였다: hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH의 경우에 2.5±0.5 pM; gCDX-301의 경우에 2.3±0.5 pM. 게다가, hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH 및 gCDX-301은 시험관내에서 적어도 동등한 효능으로, OCI-AML5 세포의 증식을 유도할 수 있다.
실시예 5. 생쥐에서 PKPD 연구
면역계의 복잡성을 고려할 때, 이러한 인간 Fc 분자에 대한 정보를 제공할 수 있는, 포유류 개체에서 약력학을 보여주는 것이 중요할 수 있다. PK/PD 연구가 여기에서 설명된 바와 같이, 생쥐로 수행되었다.
상기 연구는 Genentech의 동물실험윤리위원회에 의해 승인되었고 SCID 생쥐를 이용하여 수행되었다. 동물이 3개의 군으로 분할되었다. 군 1, 2 및 3에서 동물은 각각, 0.1, 1.0 및 10 mg/kg의 FLT3L-Fc (서열 번호:37--Flt3L.Q159.Fc.NG)가 제공되었다. 전혈이 FACS에 의한 세포 모집단 계수를 위해, 선택된 시점에서 수집되었다. 혈장이 수집되었고, 그리고 각 샘플에서 검사 물품의 양을 결정하기 위해 huFlt3L ELISA를 이용하여 검정되었다.
집단 평균 PK 파라미터는 아래의 표 5에서 요약된다.
표 5
명목 용량 C max (ug/mL) C max /용량 (ug/mL)/(mg/kg) AUC inf (ug/ml*일) AUC inf /용량 (ug/mL*일)/(mg/kg) CL (mL/일/kg)
0.1 mg/kg 2.68 26.8 4.42 22.6 22.6
1 mg/kg 27.9 27.9 77.9 77.9 12.8
10 mg/kg 273 27.3 768 76.8 13
표 5에서 보고된 NCA 파라미터는 Cmax (첫 번째 투약 후 관찰된 최대 혈청 농도); Cmax/용량 (용량 정규화된 Cmax); AUCinf (0일 자부터 무한대까지 혈청 농도 시간 곡선 아래 면적); AUCinf/용량 (용량 정규화된 AUC); 및 CL (혈청 농도 시간 곡선을 이용하여 계산된 청소율)을 포함한다.
이들 결과는 도 5에서 그래픽적으로 제시된다.
군 1-3에서, Cmax는 거의 용량 비례적으로 증가하였다. AUC에서 용량-비례 초과의 증가가 관찰되었는데, 이것은 표적 매개 약물 기질 (TMDD)이 모든 투약군에서 PK 프로필에 영향을 준다는 것을 암시하였다. 이에 더하여, 총 청소율 (CL)이 용량 의존성인 것으로 관찰되었는데, 이것은 표적 매개 CL을 암시하였다.
말초혈 샘플로부터 평균 단핵구 및 DC 수치는 도 6a (단핵구) 및 도 6b (DC)에서 도시된다. 3개의 군 모두에서, 0.1-10 mg/kg에서 견실한 용량 의존성 세포 확대가 말초혈에서 확인되었다. DC 확대의 초기 동역학은 용량 전체에 대하여 유사한 반면, 확대의 지속 기간은 용량/노출 의존성이었다.
실시예 6. 시노몰구스 원숭이에서 PKPD 연구
cyno에게 투여된 변하는 용량의 Flt3L-Fc (NG2LH) 단백질 (서열 번호:26)을 이용하여, 추가의 PKPD 연구가 수행되었다. 상기 연구는 미경험, 시노몰구스 원숭이를 이용하여 Charles River Laboratories (Reno, NV)에서 수행되었다. 동물이 4개의 군 (2마리 수컷 및 1마리 암컷/군)으로 분할되었다. 군 1에서 동물은 항-gD (N297G 돌연변이를 갖는 항-당단백질 D 인간 IgG1 항체)가 10 mg/kg으로 제공되었고, 반면 군 2, 3 및 4에서 동물은 FLT3L-Fc가 각각 0.1, 1.0 및 10 mg/kg으로 제공되었다. 군 2에서 동물은 단회 투약을 제공받은 반면, 다른 군에서 동물은 2회 투약 (연구 1일 자 및 22일 자)이 집행되었다. 전혈이 FACS에 의한 세포 모집단 계수를 위해, 선택된 시점에서 수집되었다. 혈청이 수집되었고, 그리고 각 혈청 샘플에서 검사 물품의 양을 결정하기 위해 항-huFlt3L-huFc ELISA를 이용하여 검정되었다.
아래의 표 6A는 각 동물 군의 투약을 상술한다. 집단 평균 PK 파라미터는 표 6B에서 요약된다.
표 6A
군 명목 용량 치료
1 10 mg/kg 항-gD (N297G)
2 0.1 mg/kg FLT3L-Fc(NG2LH)
3 1 mg/kg FLT3L-Fc(NG2LH)
4 10 mg/kg FLT3L-Fc(NG2LH)
표 6B
군 Cmax (ug/ml) Cmax/용량 (ug/ml)/(mg/kg) AUC 0-21 (ug/ml*일) AUC 0-21 /용량 (ug/ml*일)/(mg/kg) CL 0-14 * (ml/일/kg)
1 286 ± 26.6 28.6 2140 ± 45.9 214 3.65
2 2.63 ± 0.189 26.3 6.4 ± 0.285 64 13.7
3 29.2 ± 0.413 29.2 141 ± 16.7 141 6.83
4 280 ± 33.1 28 1630 ± 386 163 4.92
이들 결과는 도 7에서 그래픽적으로 제시된다.
군 2-3에서, Cmax 증가는 거의 용량-비례하였다. 14일 자에 또는 그 후에 항약물-항체 (ADA)가 모든 투약된 동물에서 검출되었고, 그리고 높은 ADA 역가를 갖는 동물에서 노출이 영향을 받았다. 첫 번째 투약 후 AUC0-21에서 용량-비례 초과의 증가가 관찰되었는데, 이것은 표적 매개 약물 기질 (TMDD)이 특히 ≤ 1 mg/kg에서 PK 프로필에 영향을 준다는 것을 암시하였다. 이에 더하여, 총 청소율 (CL)이 용량 의존성인 것으로 관찰되었는데, 이것은 표적 매개 CL을 암시하였다. 10 mg/kg에서, 항-GD 및 FLT3L-Fc 군은 유사한 PK 프로필을 가졌고, 그리고 FLT3L-Fc에 대한 총 CL이 4.92 mL/일/kg이었다.
4개의 군 모두에 대한 평균 단핵구, cDC1 및 cDC2 수치는 도 8a-8c에서 도시된다. FLT3L-Fc 치료된 동물의 경우에, 0.1-1 mg/kg으로 1차 투약 후 견실한 용량 의존성 세포 확대 (단핵구, cDC1 및 cDC2)가 말초혈에서 확인되었다. 10 mg/kg에서는, 더 적은 확대가 관찰되었다. 이론에 한정됨 없이, 가능한 설명은 높은 농도의 Flt3 리간드가 증식과 분화를 위해 필요한 수용체 이합체화를 예방한다는 것일 수 있다. 1-10 mg/kg에서, 2차 투약 후 더 적지만 지속된 세포 확대가 관찰된다 (아마도 ADA의 영향으로 인해).
실시예 7. Fc(NG2LH)의 FcγR 및 FcRn 결합
Fc 도메인의 효과기 기능은 도메인 내에 일정한 아미노산 변화에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, FcγR 및 FcRn 수용체에 Fc(NG2LH)의 결합이 Biacore에 의해 계측되었다. 이들 검정을 위해, FcγR이 항-His 항체를 통해 Biacore 칩 상에 포획되거나 또는 FcRn이 칩 상에 직접적으로 고정되었다. 데이터가 주입 (연관 단계)의 종료 시점에서 수집되었고, 그리고 상대적 결합 활성 (%)이 표준의 값에 의해 나눗셈된 샘플의 값을 정규화함으로써 계산되었다.
PTD Biocore 데이터의 요약은 아래의 표 7에서 제공된다. 이들 값은 10 ug/ml에서 상대적 결합 수준 (%)을 보여준다.
표 7
항체 FcγRI FcγRI FcγRIIIa V158 FcRn
αCD20 αHer2 αCD20 αHer2 αCD20 αHer2 αCD20 αHer2
IgG1 야생형 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
IgG1 LALAPG 1.74 1.92 -0.34 -0.62 1.36 1.58 95.93 97.86
IgG1 PVA# 2.69 2.51 25.11 26.77 5.16 5.57 104.45 102.81
IgG1 NG 4.50 6.12 0.06 0.385 2.12 2.95 86.73 86.27
IgG1 NG PVA#
(NG2LH)		 2.79 2.58 0.09 -0.21 2.09 2.02 94.17 94.72
IgG1 NG PVA# G 2.77 2.17 0.59 -0.40 2.16 1.74 94.65 91.12
IgG1 NG PVA# GSS 4.00 1.99 0.81 -0.47 2.24 1.46 92.92 93.24
IgG2 야생형 2.43 2.10 179.04 157.56 3.85 3.33 99.42 95.35
IgG4 SP 70.59 63.59 14.82 18.22 3.41 3.12 66.49 65.08
실시예 8. Fc(NG2LH)의 열안정성
FLT3L 리간드 융합 단백질의 열안정성은 치료적 생물제제 개발의 한 가지 중요한 양상이다. 효과기 결여 Fc(NG2LH) 단백질의 설계 후, Fc 단백질의 열안정성에 대한 아미노산 변화의 효과를 이해하기 위해 시차 주사 형광측정법 (DSF)이 수행되었다. DSF는 형광 염료의 존재에서 단백질의 열 풀림을 모니터링하고, 그리고 전형적으로, 실시간 PCR 기기 (예를 들면, Bio-Rad CFX)를 이용함으로써 수행된다. SYPRO 오렌지 염료 (Invitrogen, 카탈로그 번호 S6650)가 PBS에서 1:20 희석된다. 1 ul의 희석된 염료가 웰에서 24 ul Fab 단백질 (~100 ug/ml)에 첨가된다. 온도가 실시간 PCR 기기 (Bio-Rad CFX)에서 20℃에서 100℃로 증가함에 따라서, 형광 강도가 플로팅되고 전이 곡선 (Tm)의 변곡점이 예를 들면, 볼츠만 방정식을 이용하여 계산된다. 참조: Nature Protocols, 2007, 2:2212-2221.
변이체 Fc 단백질이 전장 항체의 맥락에서, 특이적으로, 오크렐리주맙으로부터 유래된 항-CD20 항체로서 및 트라스투주맙으로부터 유래된 항-Her 항체로서 분석되었다. 이들 변이체 항체에 대한 안정성 데이터는 아래의 표 8에서 제공된다. 이에 더하여, 변이체 Fc 단백질은 또한, 표 2에서 설명된 서열을 포함하지만 CH1 도메인이 부재하여 N-말단이 힌지 서열 DKTHT에서 시작되는 단리된 Fc 영역의 맥락에서 검사되었다. 이들 변이체 Fc 단백질에 대한 안정성 데이터는 아래의 표 9에서 제공된다.
표 8
작제물 중쇄 불변 영역 서열 번호 a-CD20 IgG (℃) a-Her2 IgG (℃) 평균
(℃) 		Δ IgG1 (℃)
IgG2 야생형 (wt) 8 57 57 57 -4.3
IgG4 SP 9 59 59 59 -2.3
IgG1 wt 1 61.2 61.4 61.3 0
IgG1 LALAPG 7 59.7 59.7 59.7 -1.6
IgG1 PVA# 4 61.9 61.95 61.9 +0.6
IgG1 NG 3 52.8 53.2 53 -8.3
IgG1 NG PVA# 2 55.2 55.6 55.4 -5.9
IgG1 NG PVA# G 5 54.4 54.2 54.3 -7.0
IgG1 NG PVA# GSS 6 50.4 50 50.2 -11.1
표 9

작제물
서열 번호 		Tm
(℃)
Δ IgG1 (℃)
Fc N297G 14 59.3 -7.1
Fc NG2LH 13 61.6 -4.8
Fc PG 16 63.4 -3.0
Fc LALAPG 18 65.5 -0.9
Fc wt 12 66.4 0.0
LALA 17 67.0 +0.6
Fc PVA# 15 68.5 +2.1
이들 데이터는 전장 IgG 및 단리된 Fc 단백질 둘 모두에 대해, PVA# 변이체를 N297G 치환과 조합하는 것이 N297G 돌연변이 단독을 갖는 Fc 작제물의 열안정성에 비하여 약 2℃의 열안정성에서 증가를 야기한다는 것을 증명하는데, 이것은 예상치 못한 것이었다.
실시예 9. 효과기 결여 Flt3L-Fc 융합 단백질의 변이체
다양한 Flt3L-Fc 융합 단백질의 면역원성을 사정하기 위해 실험이 수행되었다. 구체적으로, 일정한 단백질의 면역원성이 T 세포 증식 검정에서 검사되었다. 도 9a에서 도시된 바와 같이, Flt3L.P167.Fc.NG2LH (서열 번호:26) 또는 Flt3L.L165.Fc.NG2LH (서열 번호:33) 중 어느 것도 검출 가능한 면역원성을 갖지 않았다. 예상치 않게, Flt3L W144D 돌연변이 (서열 번호:42)가 도입되면, 유의미한 면역원성이 검출되었다.
다른 실험은 Flt3L 단백질의 글리코실화 변이체의 면역원성을 사정하였다. 도 9a에서 도시된 바와 같이, N149E, S151D 또는 S151E 돌연변이의 도입은 CD4 T 세포 증식에서 어떤 검출 가능한 증가도 야기하지 않았다. N149E, S151D 및 S151E는 서열 번호:21에 상대적인 아미노산 변화와 위치를 표시한다.
실시예 10. ADCP 검정에서 효과기 결여 Flt3L-Fc 융합 단백질
인간 재조합 단백질 Flt3L-Fc 작제물의 3가지 변이체: 1) Flt3L-Fc-야생형 IgG1 (서열 번호:27), hIgG1.NG2LH의 Fc를 갖는 Flt3L (서열 번호:26) 및 3) hIgG1.N297G를 갖는 Flt3L (서열 번호:28)의 항체 의존성 세포 식균작용 (ADCP) 활성을 비교하기 위한 실험이 수행되었다. 항-Flt3 단일클론 항체인 EB10.hIgG1 (Piloto et al., 2006, Cancer Res. 66:4843-4851)이 양성 대조로서 이용되었다. 효과기 세포로서 건강한 인간 공여자로부터 획득된 일차 단핵구 유래된 대식세포 및 표적 세포로서 SEM, 인간 급성 림프모구성 백혈병 세포를 이용하여, ADCP 검정이 실행되었다. 간단히 말하면, 일차 인간 대식세포가 양성 선택 (Miltenyi Biotec Inc, Auburn, California)에 의해 건강한 인간 PBMC로부터 CD14 양성 세포를 단리함으로써 생성되고 37 ℃에서 5% CO2를 갖는 가습된 인큐베이터 내에 대식세포 분화 배지 (RPMI 1640, 10% FBS, 1% 글루타맥스, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 그리고 20 ng/mL M-CSF (R&D Systems, Minneapolis, MN))에서 배양되었다. 3일 자에, 세포가 50ng/mL의 M-CSF로 자극되고 4 일 더 배양되었다. 7일 자에, 대식세포가 10 μM Cell Trace Violet (Thermo Fisher Scientific, Eugene, OR)으로 염색되고, ADCP 검정 배지 (IMDM, 10% FBS, 1% 글루타맥스, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에서 1 x 106개 세포/mL로 희석되고, 그리고 96 웰 낮은 부착성 U-바닥 평판 (Costar, Corning, NY)에 50 uL/웰로 첨가되었다. 표적 SEM 세포가 ADCP 검정 배지에서 2 x 106개 세포/mL로 희석되고, pHrodo (Thermo Fisher Scientific, Eugene, OR)로 전표지화되고, 그리고 대식세포를 내포하는 검정 평판에 첨가되었다 (50 uL/웰). 이후 검사 항체의 100 uL의 연속 희석액 (표 1)이 대식세포 및 SEM 세포를 내포하는 각 웰에 첨가되었고, 그 이후에 37 ℃에서 5% 이산화탄소와 함께 4.5 시간 동안 인큐베이션되었다. 검사 항체마다 총 11개의 샘플에 대한 3배 연속 희석 이후에, 항체의 최종 농도는 0.457-3000 ng/mL의 범위 안에 있었다. 인큐베이션 후, 세포가 1200 rpm에서 5 분 동안 원심분리되고, 그리고 4 ℃에서 10 분 동안 4% 파라포름알데히드에서 고정되기 전 PBS에서 세척되었다. 이들 세포는 유세포분석기 (BD Biosciences FACSCanto IVD 10)로 분석되었다. 식균작용이 FlowJo (Tree Star, Inc.; Ashland, OR)를 통해 분석되었다. Cell Trace Violet 형광이 샘플 모집단 내에 대식세포를 게이팅하는 데 이용되었다. 식균작용이 pHrodo 그린 양성 대식세포의 백분율을 계측함으로써 결정되었다. 식균작용의 정도가 대조 조건 (어떤 항체도 존재하지 않음)으로부터 pHrodo 그린 양성 대식세포 퍼센트를 차감함으로써 정규화되었다. 모든 데이터 포인트는 이중으로 수집되었다. 식균작용 퍼센트 (%ADCP)가 항체 농도와 반대로 플로팅되고, 그리고 GraphPad Prism (LaJolla, CA)을 이용한 4-파라미터 모형에 적합되었다. 이러한 절차는 3명의 공여자를 이용한 독립된 실험에서 수행되었다.
본 연구에서, Flt3 발현 SEM 세포가 표적 세포로서 이용되었다. SEM 표적 세포는 산성 pH에서 밝게 발광하는 pHrodo AM으로 전표지화되었다. 표적 세포를 내포하는 식포가 점점 더 산성을 띰에 따라서, pHrodo 그린 형광 신호가 증가하는데, 이것은 유세포분석기에서 검출될 수 있다. hIgG1.NG2LH의 Fc를 갖는 Flt3L (서열 번호:26, 5.1 mg/mL), hIgG1.N297G를 갖는 Flt3L (서열 번호:28, 1.92 mg/mL), WT IgG1을 갖는 Flt3L (서열 번호:27, 2.5 mg/mL) 및 EB10.hIgG1 (3.17 mg/mL)에 의해 유도된 ADCP 활성이 조사되고, 그리고 3명의 상이한 공여자로부터 획득된 단핵구 유래된 대식세포를 이용한 3번의 독립된 실험에서 비교되었다.
모든 데이터 포인트는 이중으로 수집되었고, 그리고 식균작용 % (%ADCP)의 평균이 검사된 분자의 농도 (약물 농도: 3 ug/mL-0.457 ng/mL)에 대하여 플로팅되었다. 이들 데이터는 4-파라미터 모형으로 적합되었다. 대표적인 용량 반응 ADCP 곡선은 도 10에서 도시된다. ADCP 검정의 내재하는 한계에 따라, 3번의 실험 모두에서 WT IgG1을 갖는 Flt3L 및 EB10.hIgG1에 의해 유도된 ADCP 활성이 Flt3 발현 세포에서 관찰되었다. 이에 더하여, FLT3L-Fc-IgG-N297G는 상대적으로 낮은 ADCP를 유도한 반면, FLT 3L-Fc-IgG NG2LH에서는 ADCP 활성이 거의 검출되지 않았다.
Fc NG2LH (서열 번호:13)를 포함하는 추가의 Flt3L-Fc 융합 단백질, 예컨대 Flt3L 부분에서 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 내포하는 Flt3L-Fc 융합 단백질의 ADCP 활성을 계측하기 위한 추가의 연구가 수행될 수 있다. 이런 연구는 ADCP 활성이 거의 없지만 생체내에서 DC의 확대를 활성화할 수 있는 추가의 Flt3L-Fc 융합 단백질을 보여줄 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
비록 전술된 발명이 이해의 명료함을 위해 예시와 실례로서 일부 상세하게 설명되긴 했지만, 이들 설명과 실례는 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에서 인용된 모든 특허와 과학 문헌의 개시는 명시적으로 온전히 참조로서 편입된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. <120> FLT3 LIGAND FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE <130> P36298-WO <140> <141> <150> 63/062,713 <151> 2020-08-07 <160> 53 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr 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Ala 100 105 110 Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser 115 120 125 Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp 130 135 140 Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro 145 150 155 160 Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 165 170 175 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 180 185 190 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 195 200 205 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 210 215 220 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 225 230 235 240 Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 245 250 255 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 260 265 270 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 275 280 285 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 290 295 300 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 305 310 315 320 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 325 330 335 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 340 345 350 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 355 360 365 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 370 375 380 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390 <210> 46 <211> 385 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 46 Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 1 5 10 15 Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 20 25 30 Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 35 40 45 Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 50 55 60 Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 65 70 75 80 Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 85 90 95 Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 100 105 110 Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 115 120 125 Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser 130 135 140 Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Arg 145 150 155 160 Ser Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 165 170 175 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 180 185 190 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 195 200 205 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 210 215 220 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 225 230 235 240 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 245 250 255 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 260 265 270 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 275 280 285 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 290 295 300 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 305 310 315 320 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 325 330 335 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 340 345 350 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 355 360 365 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 370 375 380 Lys 385 <210> 47 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 47 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 52 Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro 1 5 10 <210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 53 Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro 1 5 10

Claims (45)

  1. Flt3 리간드(Flt3L) 단백질 및 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 Fc 융합 단백질이며,
    상기 효과기 결여 Fc 단백질은 서열 번호:13의 잔기와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고,
    서열 번호:13의 잔기 13-17은 아미노산 서열 PVAGP(서열 번호:20)를 포함하고,
    서열 번호:13의 잔기 76은 글리신인 Fc 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, Flt3L 단백질은
    PWSPRPLEATAPTAPQPP (서열 번호:48),
    WSPRPLEATAPTAPQPP (서열 번호:49),
    SPRPLEATAPTAPQPP (서열 번호:50),
    PRPLEATAPTAPQPP (서열 번호:51),
    RPLEATAPTAPQPP (서열 번호:52), 또는
    PLEATAPTAPQPP (서열 번호:53)
    의 아미노산 서열을 포함하지 않는 것인 Fc 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Flt3L은 서열 번호:22와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함하는 것인 Fc 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Flt3L은 서열 번호:22의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함하는 것인 Fc 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Flt3L은 서열 번호:21의 아미노산 27-167, 27-168, 27-169, 27-170, 27-171, 27-172, 27-173, 27-174, 27-175, 27-176, 27-177, 27-178, 27-179, 27-180, 27-181, 27-182, 27-183, 27-184, 또는 27-185를 포함하는 단백질과 적어도 약 90% 동일한 단백질을 포함하는 것인 Fc 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 결여 Fc 단백질의 N-말단은 펩티드 결합을 통해 Flt3L 단백질의 C-말단에 연결되는 것인 Fc 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호:26과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고,
    서열 번호:13과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Fc 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호:12를 포함하는 야생형 IgG1 Fc 영역의 Fc 효과기 기능에 비하여 약화된 Fc 효과기 기능을 갖는 Fc 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Fc-효과기 결여 Flt3L-Fc 융합 단백질은 시험관내 분석에서의 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP)을, 야생형 IgG1 Fc(서열 번호:12)에 융합된 야생형 Flt3L을 포함하는 Flt3L-Fc 융합 단백질에 의한 시험관내 분석 활성 수준의 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 이하인 활성 수준으로 활성화하는 것인 Fc 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산.
  11. 제10항에 있어서, Fc 융합 단백질의 N-말단 단부에서 신호 서열을 추가로 인코딩하는 단리된 핵산.
  12. Flt3L-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산이며,
    상기 Flt3L-Fc 융합 단백질은 서열 번호:45를 포함하는 것인 단리된 핵산.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  14. 제13항의 숙주 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는, Fc 융합 단백질을 생산하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 숙주 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포인 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 숙주 세포는 대장균(E. coli)인 방법.
  17. 제14항 또는 제15항에 있어서, 숙주 세포는 CHO 세포인 방법.
  18. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 Fc 융합 단백질 및
    약학적으로 허용되는 운반체
    를 포함하는 약학 제제.
  19. 제18항에 있어서,
    두 번째 치료제
    를 추가로 포함하는 약학 제제.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 두 번째 치료제는 어쥬번트, 수지상 성숙 인자 및/또는 관문 저해제인 약학 제제.
  21. 개체에서 수지상 세포(DC)의 수를 확대하기 위한 방법이며,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 Flt3L-Fc 융합 단백질을 상기 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    약 0.1 mg/kg 내지 50 mg/kg 용량의 Flt3L-Fc 융합 단백질을 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  23. 암을 치료하기 위한 방법이며,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 Flt3L-Fc 융합 단백질 또는 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 약학 제제를 암 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    약 0.1 mg/kg 내지 50 mg/kg 용량의 Flt3L-Fc 융합 단백질을 상기 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    두 번째 치료제를 상기 개체에게 투여하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 두 번째 치료제는 어쥬번트, 수지상 성숙 인자 및/또는 관문 저해제인 방법.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    DC 성숙 인자를 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, DC 성숙 인자는 폴리IC, 폴리ICLC, DC40, 방사선요법, 및 화학요법에서 선택되는 것인 방법.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 관문 저해제를 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 관문 저해제는 Fc-효과기 결여 Flt3L-Fc 융합 단백질의 투여 전, 투여와 동시에, 또는 투여 후 투여되는 것인 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 면역 관문 저해제는 펨브로리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙, BMS 936559, 아테졸리주맙 및 아벨루맙으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  32. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 비소세포 폐암(NSCLC), 소세포 폐암(SCLC), 흑색종, 췌장 관 선암종(PDAC), 삼중 음성 유방암(TNBC), 비호지킨 림프종(NHL), 결장직장암(CRC), 유방암, 방광암, 신장암, 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  33. 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 관문 저해제로 이전에 치료를 받았던 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 개체는
    관문 저해제 요법에 반응하지 않았고/거나
    관문 면역요법의 최종 용량을 제공받은 후 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 1 년, 1.5 년, 또는 2 년보다 긴 기간 동안 관문 저해제 요법에 반응하지 않았던 것인 방법.
  35. 제21항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에서 암은 면역 결핍 종양을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
  36. 서열 번호:13의 잔기와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열
    을 포함하는 효과기 결여 Fc 단백질이며,
    서열 번호:13의 잔기 13-17은 아미노산 서열 PVAGP(서열 번호:20)를 포함하거나, 또는
    서열 번호:13의 잔기 76은 글리신인 효과기 결여 Fc 단백질.
  37. 제36항에 있어서,
    서열 번호:13의 잔기 13-17은 아미노산 서열 PVAGP(서열 번호:20)를 포함하고,
    서열 번호:13의 잔기 76은 글리신인 효과기 결여 Fc 단백질.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 서열 번호:13과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 효과기 결여 Fc 단백질.
  39. 서열 번호: 2, 4, 5, 6, 13 또는 15와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 효과기 결여 Fc 단백질.
  40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호:12를 포함하는 야생형 IgG1 Fc 영역에 비하여 약화된 효과기 결여 Fc 단백질.
  41. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 효과기 결여 Fc 단백질을 포함하는 항체.
  42. 제40항에 있어서, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 단일클론 항체인 항체.
  44. 제41항 또는 제42항에 있어서, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체인 항체.
  45. 제41항 또는 제42항에 있어서, 이중특이적 또는 다중특이적 항체인 항체.
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