KR20230034333A - 트리뉴클레오티드 캡 유사체, 제조 및 이의 용도 - Google Patents

트리뉴클레오티드 캡 유사체, 제조 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본원은 일반적으로 트리뉴클레오티드 RNA 캡 유사체, 이의 사용 방법, 및 이를 포함하는 키트에 관련된 것이다. 특히, 본원에서 제공되는 트리뉴클레오티드 캡 유사체는 캡핑된 RNA 전사체의 시험관내에서의 용이한 검출 및/또는 분리 및 캡핑된 mRNA의 생체내에서의 번역을 가능하게 한다.

Description

트리뉴클레오티드 캡 유사체, 제조 및 이의 용도
기술분야
본원은 일반적으로 트리뉴클레오티드 RNA 캡 유사체, 이의 사용 방법, 및 이를 포함하는 키트에 관련된 것이다. 특히, 본원에서 제공되는 트리뉴클레오티드 캡 유사체는 캡핑된 RNA 전사체의 시험관내에서의 용이한 검출 및/또는 분리 및 캡핑된 mRNA의 생체내에서의 번역을 가능하게 한다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 2021년 6월 24일에 작성된 상기 ASCII 사본의 파일명은 LT01530PCT_SL.txt이고 크기는 195,611바이트이다.
진핵생물 mRNA는 5'-말단에 "캡" 구조를 가지고 있으며, 이는 번역에서 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다. 천연 캡 구조는 첫 번째 전사된 뉴클레오티드의 5'-말단에 트리포스페이트 가교를 통해 연결된 7-메틸 구아노신으로 구성되어, m7G(5')ppp(5')N(여기서, N은 임의의 뉴클레오티드임)을 생성한다. mRNA 캡은 유전자 발현에 중요한 역할을 한다. 이것은 엑소뉴클레아제에 의한 분해(degradation)로부터 mRNA를 보호하고, 핵으로부터 RNA를 세포질로 수송할 수 있게 하며, 번역 개시 복합체의 조립에 참여한다. m7G(5')ppp(5')G(mCAP) 형태의 디뉴클레오티드는, 5'-말단에 캡 구조를 갖는 RNA를 얻기 위해 시험관내에서 T7 또는 SP6 RNA 중합 효소를 사용한 전사에서 프라이머로서 사용되었다. 생체내에서 캡은 효소적으로 추가된다. 그러나, 지난 20여 년 동안에 걸쳐 수많은 연구는, 시험관내 합성된 mRNA로 보충된 시험관내 번역 추출물에서 단백질을 합성하는 것을 필요로 했다. 캡핑된 mRNA의 시험관내 합성을 위한 일반적인 방법은 mCAP를 전사 개시자로 사용한다. 의대칭(pseudosymmetrical) 디뉴클레오티드인 mCAP를 사용하는 것의 단점은, 항상 G 또는 m7G(m7Guo) 모이어티 중 하나의 3'-OH가 전사 신장을 위한 개시 친핵체 역할을 하여 캡핑된 RNA의 약 50%만 번역가능한 경향이 있었다. 이러한 단점은, 해당 위치로부터의 전사를 방지하기 위해 캡의 m7G 부분의 3'-OH 기가 차단된 변형된 캡 유사체(예를 들어, ARCA)를 제공함으로써 해결되었다.
캡은 세포내 효소 구아닐릴 트랜스퍼라제에 의해 RNA 분자에 추가될 수도 있지만, 캡은 초기에, 캡이 RNA 중합 효소용 프라이머로서 사용되는 시험관내 전사 동안 RNA에 추가된다. 5' 말단 뉴클레오시드는 일반적으로 구아닌이고, 모든 다른 뉴클레오티드, 즉, 5'Gppp5'GpNpNp...에 대해 역방향이고, 대부분의 경우, 상기 캡은 5'-5' 트리포스페이트 결합으로 연결된 두 개의 뉴클레오티드를 함유한다.
RNA의 전사는 일반적으로 뉴클레오시드 트리포스페이트(일반적으로 퓨린, A 또는 G)으로 시작된다. 시험관내에서 전사가 일어나는 경우, 이것은 일반적으로 파지(phage) RNA 중합 효소, 예컨대 T7, T3 또는 SP6, 파지 중합 효소 프로모터를 함유하는 DNA 주형, 뉴클레오티드(ATP, GTP, CTP 및 UTP) 및 마그네슘염을 함유하는 완충제를 포함한다. 5' 캡 구조는, 진핵생물의 리보솜을 결합하는 것을 돕고 적절한 AUG 개시자 코돈의 인식을 보장함으로써 mRNA의 번역을 향상시킨다. 이 기능은 번역 시스템에 따라 및 합성되는 특정 mRNA에 따라 달라질 수 있다.
번역 중에, 캡은 번역 개시 인자 eIF4E에 의해 결합되고, 캡-결합성 복합체(CBC)는 추가 개시 인자를 모집한다. 탈캡핑(decapping)은, 캡에 결합하는 eIF4E와 경쟁하는 단백질 dcp1 및 dcp2에 의해 촉진된다. 번역은 mRNA에 의해 암호화된 아미노산을 함께 결합시켜 펩티드를 형성하고, 개시, 신장 및 종결의 세 가지 과정으로 발생한다. 진핵생물에서의 개시는, 첫 번째 메티오닌 코돈에 대한 mRNA를 스캔하는 리보솜의 부착을 수반한다. 신장은 정지 코돈에 도달할 때까지 아미노산을 연속적으로 부가하고, 번역이 종결된다.
특정 유전자를 암호화하는 캡핑된 RNA는 진핵 세포 내로 형질감염되거나, 세포 또는 배아에서의 번역된 생성물의 효과를 연구하기 위해 세포 또는 배아에 미세 주입될 수 있다. 캡핑되지 않은 RNA를 사용하면 이러한 실험에서 RNA가 빠르게 분해되고 번역된 단백질의 수율이 크게 감소한다.
캡핑된 RNA는 또한 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 환자로부터 분리된 수지상(dendritic) 세포는 면역원을 암호화하는 캡핑된 RNA로 형질감염될 수 있다. 수지상 세포는 캡핑된 RNA를 이 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 단백질로 번역한다. 소규모 인간 연구에서, CEA 캡핑된 RNA로 로딩된 수지상 세포를 사용한 면역요법은 췌장 환자에게 안전하고 실행 가능한 것으로 나타났다(문헌[Morse et al., Int. J. Gastrointest. Cancer, 32, 1-6, (2002)]). 단일 캡핑된 RNA 종을 미성숙 수지상 세포에 도입하는 것이 특이적 T-세포 반응을 유도한다는 것이 또한 주목되었다(문헌[Heiser et al., J. Clin. Invest., 109, 409-417 (2002)]).
그러나, 당업계에 알려진 캡핑된 RNA는, 예를 들어 T7-RNA-중합 효소와 같은 기질을 사용한 시험관내 전사 효율뿐만 아니라 세포내 안정성과 관련하여 여전히 한계가 있다. 따라서, 5' 캡핑된 mRNA의 높은 수준의 캡핑 효율, 개선된 번역 효율 및 개선된 세포내 분자 안정성을 제공할 수 있는 mRNA 캡 유사체, 예컨대 잠금형(locked) 캡핑된 RNA에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
본 개시내용은 본원에서 정의되는 하기 화학식 (I)의 새로운 변형된 트리뉴클레오티드 캡 유사체에 관련된 것이다:
Figure pct00001
본원에 개시된 트리뉴클레오티드 캡 유사체는 높은 수준의 캡핑 효율 및 개선된 번역 효율을 제공할 수 있다. 적어도 하나의 양태에서, 본원에 개시된 트리뉴클레오티드 캡 유사체는 T7-RNA 중합 효소에 대한 개선된 기질이며, 우수한 전사 수율을 제공한다.
본원에 개시된 트리뉴클레오티드 캡 유사체는 5' 캡핑된 mRNA의 개선된 세포내 분자 안정성을 제공할 수 있다. 적어도 하나의 양태에서, 본원에 개시된 트리뉴클레오티드 캡 유사체는 백신에서 mRNA의 세포내 안정성을 증가시킨다.
적어도 하나의 양태에서, 본원에 개시된 트리뉴클레오티드 캡 유사체는 또한 리포터 모이어티로서 작용할 수 있다. 적어도 하나의 양태에서, 본원에 개시된 트리뉴클레오티드 캡 유사체는 특정 세포주 내로의 형질감염을 개선한다.
본 개시내용은 또한, 상기 캡 유사체를 포함하는 조성물, 본원에 기재된 캡 유사체가 공유 결합된 RNA를 포함하는 조성물, 이러한 유사체를 함유하는 mRNA 종을 사용하는 방법, 뿐만 아니라 상기 신규 캡 유사체를 함유하는 키트에 관련된 것이다.
제1 양태에서, 본 개시내용은 하기 화학식 (I)의 트리뉴클레오티드 캡 유사체에 관련된 것이다:
Figure pct00002
상기 식에서,
B3은 -OH, 할로겐, 염료, -OR1로부터 선택되고,
이때 R1은 프로파길, tert-부틸디메틸실릴, 및 4'C와의 메틸렌 가교로부터 선택되고;
B4는 -OH, 염료, 및 -OR2로부터 선택되며, 이때 R2는 프로파길 및 tert-부틸디메틸실릴로부터 선택되거나;
또는 R1이 R2와 결합하여 B3과 B4가 -2',3'-O-이소프로필리딘을 형성하고,
단, B3과 B4는 둘다 -OH일 수는 없고,
X는 -H 및 -CH3로부터 선택되고;
B1 및 B2는 각각 독립적으로 아데닌, 구아닌, 시토신, 및 우라실로부터 선택되고;
R은 H, 링커(linker)-결합된 세포-투과성 펩티드, 염료에 공유 결합된 링커-결합된 세포-투과성 펩티드, 및 링커-결합된 염료로부터 선택된다.
제2 양태에서, 본 개시내용은 화학식 (I)의 트리뉴클레오티드 캡 유사체 또는 본원에 기재된 그의 임의의 실시형태를 포함하는 조성물에 관련된 것이다.
제3 양태에서, 본 개시내용은 화학식 (I)의 트리뉴클레오티드 캡 유사체 또는 본원에 기재된 그의 임의의 실시형태를 갖는 RNA를 포함하는 조성물에 관련된 것이다.
제4 양태에서, 본 개시내용은 화학식 (I)의 트리뉴클레오티드 캡 유사체 또는 본원에 기재된 그의 임의의 실시형태; 뉴클레오티드 트리포스페이트 분자; 및 RNA중합 효소를 포함하는 키트에 관련된 것이다.
제5 양태에서, 본 개시내용은, 트리뉴클레오티드 캡핑된 RNA를 생성하기에 충분한 조건 하에서 그러한 시간 동안 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재 하에 핵산 기질을 RNA 중합 효소 및 화학식 (I)의 트리뉴클레오티드 캡 유사체 또는 본원에 기재된 그의 임의의 실시형태와 접촉시키는 것을 포함하는, 트리뉴클레오티드 캡핑된 RNA를 제조하는 방법에 관련된 것이다.
제6 양태에서, 본 개시내용은, 세포를 화학식 (I)의 트리뉴클레오티드 캡 유사체 또는 본원에 기재된 그의 임의의 실시형태와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관련된 것이다.
제7 양태에서, 본 개시내용은, 화학식 (I)에 따른 트리뉴클레오티드 캡 유사체 또는 본원에 기재된 그의 임의의 실시형태를 RNA 내로 혼입시키는 것을 포함하는, RNA의 세포내 안정성을 증가시키는 방법에 관련된 것이다.
제8 양태에서, 본 개시내용은, 세포를, 화학식 (I)에 따른 트리뉴클레오티드 캡 유사체 또는 본원에 기재된 그의 임의의 실시형태를 포함하는 본 개시에 따른 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, RNA를 세포 내로 도입하는 방법에 관련된 것이다. 일부 예에서, 세포는 수지상 세포, 종양 세포, 줄기 세포(iPSC, HSC, 성체 줄기 세포) 등이다.
제9 양태에서, 본 개시내용은, 세포를, 화학식 (I)에 따른 트리뉴클레오티드 캡 유사체 또는 본원에 기재된 그의 임의의 실시형태를 포함하는 본 개시내용에 따른 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서의 RNA 번역 억제를 위한 방법에 관련된 것이다.
또한 본원에서는 (a) 주형 가닥(strand)을 포함하는 전사 개시 부위를 포함하는 프로모터 영역을 포함하는 핵산 분자, 및 (b) 적어도 -1 및 +1 위치, +1 및 +2 위치, 또는 +2 및 +3 위치에서 상기 주형 가닥을 포함하는 전사 개시 부위에 혼성화된 2개 이상 (예를 들어, 약 2 내지 약 12개, 약 2 내지 약 10개, 약 2 내지 약 9개, 약 2 내지 약 8개, 약 2 내지 약 6개, 약 3 내지 약 8개, 등)의 염기를 포함하는 캡핑된 프라이머를 포함하는 전사 개시 복합체가 제공된다. 일부 경우에, 개시 부위의 비-주형 가닥의 하나 또는 둘 모두의 인접 위치(5' 및/또는 3' 위치)에 있는 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4개 등)의 뉴클레오티드는 전사 개시 차단 뉴클레오티드이다. 일부 경우에, 하나 이상의 전사 개시 차단 뉴클레오티드는 (A) 티미딘, (B) 시토신, (C) 아데노신, 및 (D) 화학적으로 변형된 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 개시 복합체는 상보적인 비-주형 가닥에 혼성화(예를 들어, 부분 혼성화)되는 주형 가닥을 포함할 수 있다. 또한, 주형 및/또는 비-주형 가닥은 -1 및/또는 +1의 위치에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 데옥시티미딘 잔기, 2'-데옥시시티딘 등)를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 프로모터 및 전사 개시 복합체의 비-주형 가닥의 -1, +1 및 +2의 위치는 A G T, A A T, A G C, A A C, A G A, A A A, G A T, G A C, G A A, G G T, G G C, G G A, A T T, A T C, 및 A T A로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
또한 본원에서는, (a) 주형 가닥을 포함하는 전사 개시 부위를 포함하는 프로모터 영역을 포함하는 핵산 분자, 및 (b) 적어도 -1 및 +1 위치, +1 및 +2 위치, 또는 +2 및 +3 위치에서 DNA에 혼성화된 3개 이상의 염기를 포함하는 비-천연성 캡핑된 프라이머를 포함하는 전사 개시 복합체가 제공된다. 또한, 본원에서 제시된 개시 복합체는, 본원에서 제시된 캡핑된 프라이머인 비-천연성 캡핑된 프라이머를 포함할 수 있다.
추가로, 본원에서는 프로모터를 포함하는 핵산 분자가 제공되며, 이때 프로모터는 TATY1 Y2Z의 비-주형 가닥 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이때 Y1은 -1 위치에 있고, Y2는 +1 위치에 있고, Z는 +2 위치에 있고, Z는 전사 개시 차단 뉴클레오티드이다. 추가로, Z는 아데노신, 시토신, 티미딘, 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 핵산 분자는 (a) 5' - T A T A G T - 3', (b) 5' - T A T A G C - 3', 및 (c) 5' - T A T A A C - 3'으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본원에서는 mRNA 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은, 전사 반응에 의한 mRNA 분자의 생성을 허용하는 조건 하에서 DNA 주형을 캡핑된 프라이머 및 RNA 중합 효소와 접촉시키는 것을 포함할 수 있으며, 이때 DNA 주형은 (a) 주형 가닥을 포함하는 전사 개시 부위를 포함하는 프로모터 영역을 포함하는 핵산 분자, 및 (b) 적어도 -1 및 +1 위치, +1 및 +2 위치, 또는 +2 및 +3 위치에서 상기 주형 가닥을 포함하는 전사 개시 부위에 혼성화된 2개 이상의 염기를 포함하는 캡핑된 프라이머를 포함하며, 이때 적어도, 개시 부위의 주형 가닥의 5' 인접 위치에 있는 뉴클레오티드는 전사 개시 차단 뉴클레오티드이다. 또한, 이러한 방법에 사용되는 RNA 중합 효소는 박테리오파지, 박테리아, 및 진핵생물(예를 들어, 포유동물) RNA 중합 효소를 포함한다. 일부 경우, T7 박테리오파지, T3 박테리오파지, SP6 박테리오파지, 또는 K11 박테리오파지 RNA 중합 효소 또는 그의 변이체와 같은 박테리오파지 RNA 중합 효소가 본원에서 제시된 방법에서 사용될 수 있다.
또한, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 mRNA 분자는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 mRNA 분자는 시험관내 또는 생체내 전사 반응에 의해 생성될 수 있다. 추가로, 본원에서 제시된 방법에 의해 생성된 mRNA 분자는 예를 들어 커플링된 전사/번역 시스템에 의해 번역되어 단백질을 생성할 수 있다.
많은 경우에, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 mRNA 분자의 적어도 70%(예를 들어, 약 70% 내지 약 100%, 약 75% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90%% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 98%, 약 80% 내지 약 98% 등)가 캡핑될 것이다.
많은 경우에, 본원에서 제시된 방법에 의해 생성된 mRNA 분자(예를 들어, 캡핑된 mRNA 분자)의 수율은 3 mg/반응 혼합물 ml를 초과할 것이다.
숙련된 기술자는 아래에 설명된 도면이 단지 예시 목적임을 이해할 것이다. 도면들은 어떤 식으로든 본 교시의 범위를 제한하려는 의도가 아니다.
도 1은 본원에 기재된 트리뉴클레오티드 캡 유사체에 대한 예시적인 합성 도식을 예시한다. 이 예시에서, 합성 도식은 7 메틸(LNA) 구아노신 5' 디포스페이트의 이미다졸리드 염(Imm7(LNA)GDP)(A)을 (B)와 조합하여 본 개시내용의 예시적인 트리뉴클레오티드 유사체(C)를 형성한다.
도 2는 도 1의 (A) 부분인 7 메틸(LNA) 구아노신 5' 디포스페이트의 이미다졸리드 염(Imm7(LNA)GDP)을 제조하기 위한 예시적인 합성 도식을 도시한다.
도 3은 도 1의 (B) 부분인 디뉴클레오티드 5' 포스페이트 디뉴클레오티드, 예컨대 pApG를 제조하기 위한 예시적인 합성 도식을 도시한다.
도 4는 본원에 기재된 3'-O-프로파길을 함유하는 트리뉴클레오티드 캡 유사체에 대한 예시적인 합성 도식을 예시한다. B 1 = G, A, U, 또는 C; B 2 = G, A, U, 또는 C
도 5는 도 4의 3'-O-프로파길을 함유하는 트리뉴클레오티드 캡 유사체에 대한 합성 도식에 사용되는 7 메틸 3'-O-프로파길 구아노신 5'-디포스페이트의 이미다졸리드 염(Imm7,3'-O-프로파길GDP)을 제조하기 위한 예시적인 합성 반응식을 도시한다.
도 6은 도 4의 3'-O-프로파길을 함유하는 트리뉴클레오티드 캡 유사체를 비롯한 트리뉴클레오티드 캡을 합성하는데 사용되는 디뉴클레오티드를 제조하기 위한 예시적인 합성 도식을 예시한다. B 1 = G, A, U, 또는 C; B 2 = G, A, U, 또는 C
도 7은 본원에 기재된 바와 같은 염료를 함유하는 트리뉴클레오티드 캡 유사체를 제조하기 위한 예시적인 합성 도식을 예시한다. B 1 = G, A, U, 또는 C; B 2 = G, A, U, 또는 C
도 8a 및 도 8b는 도 7의 염료를 함유하는 트리뉴클레오티드 캡 유사체에 대한 합성 반응식에 사용되는 Imm7GDP 함유 염료를 제조하기 위한 예시적인 합성 반응식을 예시한다.
도 9는 본원에 기재된 바와 같은 이소프로필리덴 모이어티를 함유하는 트리뉴클레오티드 캡 유사체를 제조하기 위한 예시적인 합성 도식을 예시한다. B 1 = G, A, U, 또는 C; B 2 = G, A, U, 또는 C
도 10은 본원에 개시된 바와 같은 링커-결합된 세포-투과성 펩티드를 함유하는 트리뉴클레오티드 캡 유사체의 예시적인 화학 구조를 예시한다.
도 11은 실시예 3에 기재되고 기술된 바와 같이 상이한 mRNA 캡 유사체의 존재 하에 수행된 IVT 반응의 mRNA 수율을 보여주는 막대 그래프이다.
도 12는 ARCA, GAG 캡 또는 LNA-변형된 GAG 캡으로 캡핑된 mRNA의 mRNA 캡핑 효율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 13은, 실시예 4에 기술된 바와 같이 무(no)-캡, ARCA, GAG 캡 또는 LNA-변형된 GAG 캡을 가진 조질(crude) 또는 HPLC 정제된 mRNA로 형질감염된 경우의, GFP 양성인 세포%를 나타내는 막대 그래프이다.
도 14는, 실시예 4에 기술된 바와 같이 무(no)-캡, ARCA, GAG 캡 유사체 또는 LNA-변형된 GAG 캡 유사체를 가진 "조질" 또는 "HPLC 정제된" mRNA 제제로 형질감염된 세포의 형광 강도의 중앙치(MFI)를 나타내는 막대 그래프이다.
도 15는 Cap 0(R1 = H) 및 Cap 1(R1 = CH3) 유형을 포함하는 예시적인 7-메틸구아노신 트리뉴클레오티드 캡 구조의 일반적인 구조를 보여준다. B1 및 B2는 동일하거나 상이할 수 있는 염기이다. R2는 개재 포스페이트에 의해 연결된 하나 이상의 추가 뉴클레오시드를 나타낸다.
도 16은 4개의 예시적인 야생형 박테리오파지 프로모터의 비-주형 가닥의 개략도이다. 이들 프로모터는 각각 길이가 23개 염기쌍이다. 또한, 각각의 프로모터는 AT 풍부 영역, 중합 효소 특이성 루프 영역, 풀림 영역(-4 내지 -1 위치) 및 개시 영역(+1 내지 +6 위치)을 함유한다. SP6 프로모터의 +5 위치에 있는 "N"은 임의의 뉴클레오티드일 수 있지만, 많은 경우에 G 또는 A일 것이다. 상단에서 하단으로 가면서 서열번호 591, 서열번호 592, 서열번호 593, 및 서열번호 594이다. "UTR"은 전사 mRNA 분자의 번역되지 않은 영역을 형성하는 DNA를 의미한다.
도 17은 전사 개시 부위에 결합하는 3개의 상이한 mRNA 캡의 개략도이다. CAP1은 두 염기가 모두 구아닌인 디뉴클레오티드 캡이다. CAP2는 2개의 염기가 구아닌이고 중간에 아데닌 염기가 있는 트리뉴클레오티드 캡이다. CAP3는 3개의 염기가 모두 구아닌인 트리뉴클레오티드 캡이다. 세 경우 모두에서 첫 번째 염기(구아닌)는 다른 염기 위에 표시되어 있는데, 그 이유는, 이 첫 번째 염기는 프로모터와 직접 상호 작용하지 않기 때문이다. 이 도면의 아래 부분은 프로모터 부분의 비-주형 가닥(5'에서 3') 및 주형 가닥(3'에서 5')을 도시하며, 여기서 풀림 영역의 4개 염기(밑줄 표시됨)가 전사 개시 부위와 만난다. 이 도면에서, CAP1, CAP2 및 CAP3은 개시 영역의 주형 가닥에 상보적인 위치에 배치된다(각 캡에 대해 각각 +1, -1 내지 +1, 및 +1 내지 +2). 도 17은 서열번호 595를 개시한다.
도 18은 도 17과 유사한 개략도이되, 차이점은, CAP4는 첫 번째 염기가 구아닌이고 두 번째 염기가 아데닌인 디뉴클레오티드 캡이고, CAP5는 첫 번째 염기가 구아닌이고 그 다음 두 염기가 아데닌인 트리뉴클레오티드 캡인 점이다. CAP2는 도 17에 나타낸 바와 동일하다. 또한, 비-주형 가닥의 +1 위치에 있는 염기는 구아닌이 아니라 아데닌이다. 도 18은 서열번호 596을 개시한다.
도 19 또한 도 17와 유사한 개략도이다. 이 도면은 개시 영역의 -1 내지 +1 위치와 관련된 CAP2를 도시한다(파선-표시된 박스 참조). 또한, 비-주형 가닥의 +2 위치에 있는 염기쌍은 티민(하향 화살표 참조)이고, 아데닌이 주형 가닥에 존재한다(도시되지 않음). 도 19는 서열번호 597을 개시한다.
도 20은 HB-WT, HB-MOD2, HB-MOD4, 및 HB-MOD29에 대한 상이한 프로모터 서열 및 -1 위치 개시로 생성된 RNA 수율을 보여준다. WT-MOD에는 AGG 캡과 +1 개시 부위가 사용되었다. HB-WT에 대한 주형은 +1 개시를 위해 설계되었지만 반응 혼합물에는 캡이 없었다. 이 도면을 생성하는 데 사용된 데이터는 표 5에 기재되어 있다. HB-GFP는, 인간 베타 글로빈 5' 및 3' 번역되지 않은 영역(UTR)으로 구성된 주형을 나타낸다.
서열 설명
표 1은 본 발명에서 사용된 서열 목록을 제공한다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
상세한 설명
본 개시내용은 부분적으로 트리뉴클레오티드 캡 유사체, 트리뉴클레오티드 캡 유사체를 포함하는 조성물, 및 이의 사용 방법, 예를 들어 전사에 사용하기 위한, 세포내 안정성에 사용하기 위한, 캡핑된 RNA의 검출 및 분리에 사용하기 위한, 그리고 시험관내 및 생체내 둘 모두의 번역에 생성된 단리된 RNA를 사용하기 위한 사용 방법에 관련된 것이다. 본원에 개시된 바와 같은 트리뉴클레오티드 캡 유사체는 T7-RNA 또는 다른 RNA 중합 효소에 대한 개선된 기질이라는 이점을 가질 수 있고, 다른 ARCA(역전사-방지 캡 유사체(anti-reverse cap analog)) 기질과 비교할 때, 더 우수한 시험관내 전사 수율, 5' 캡핑된 mRNA의 개선된 세포내 분자 안정성, 개선된 번역 효율, 및 특정 세포주로의 개선된 형질감염을 유도할 수 있다.
캡 자체 외에도, 본 개시내용은, 캡핑된 mRNA 분자를 생성하기 위한 조성물 및 방법에 관련된 것이다. 이러한 조성물 및 방법은, 캡이 개시 부위 뉴클레오티드 서열과 일치하도록 설계되고 제형(예를 들어, 시험관내 전사 제형)이 효율적인 mRNA(예를 들어, 캡핑된 mRNA) 생성을 촉진하도록 설계된 것을 포함한다. 이러한 효율적인 mRNA 생성은, mRNA 분자의 높은 백분율(예를 들어, 생성된 mRNA 분자의 총 수의 약 75% 내지 약 99%, 약 80% 내지 약 99%, 약 85% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 99%, 약 95% 내지 약 99%, 약 80% 내지 약 96%, 약 85% 내지 약 96%, 약 90% 내지 약 96% 등)이 캡핑된 mRNA이고 mRNA가 높은 수율로 생성되는(즉, 반응 혼합물 1 밀리리터당 RNA 3 밀리그램), mRNA 분자의 생성을 위한 조성물 및 방법을 포함한다.
RNA 수율(예를 들어, mRNA 수율)은, RNA를 생성하기 위해 사용된 반응 혼합물의 하나 이상의 성분의 양과 생성된 RNA의 양을 비교함으로써 결정될 수 있다. 사용될 수 있는 하나의 공식은, 특정 부피의 반응 혼합물에 대한 고정량의 단일 반응 혼합물 성분에 대해 생성된 RNA의 양이다. 예를 들어, CTP 농도가 7.5 mM인 20 μl의 반응 혼합물이 시험관내 전사에 사용된 경우, 80 μg 초과의 RNA 수율이 수득된다. 두 번째 예는, 캡 농도가 10 mM인 20 μl의 반응 혼합물이 사용되고 RNA 수율이 120 μg인 경우이다.
본원에서 제시된 조성물 및 방법은 40 μg/20 μl 초과 (예를 들어, 약 40 μg 내지 약 200 μg, 약 40 μg 내지 약 160 μg, 약 40 μg 내지 약 120 μg, 약 80 μg 내지 약 200 μg, 약 80 μg 내지 약 200 μg, 약 80 μg 내지 약 180 μg, 약 80 μg 내지 약 160 μg, 약 80 μg 내지 약 120 μg, 약 100 μg 내지 약 150 μg 등)의 RNA 생성을 허용한다.
RNA 수율은 또한 반응 혼합물 부피의 함수로서 생성된 RNA의 양으로 표현될 수 있다. 예를 들어, 20 μl에서 생성된 100 μg의 RNA는 1 밀리리터의 반응 혼합물에서 생성된 5 mg의 RNA이다. 부피에 대해 보정될 때, 본원에서 제시된 조성물 및 방법은 2 mg/ml 이상(예를 들어, 약 2 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 약 2 mg/ml 내지 약 16 mg/ml, 약 2 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 2 mg/ml 내지 약 7, mg/ml, 약 4 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 약 4 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 약 6 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 약 4 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 약 7 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 약 4 mg/ml 내지 약 16 mg/ml, 약 4 mg/ml 내지 약 18 mg/ml, 약 4 mg/ml 내지 약 14 mg/ml, 약 6 mg/ml 내지 약 16 mg/ml, 약 7 mg/ml 내지 약 19 mg/ml 등)의 RNA 생성을 허용한다.
한 양태에서 하기 화학식 (I)의 트리뉴클레오티드 캡 유사체가 제공된다:
Figure pct00020
상기 식에서,
B3은 -OH, 할로겐, 염료, -OR1로부터 선택되고,
이때 R1은 프로파길, tert-부틸디메틸실릴, 및 4'C와의 메틸렌 가교로부터 선택되고;
B4는 -OH, 염료, 및 -OR2로부터 선택되며, 이때 R2는 프로파길 및 tert-부틸디메틸실릴로부터 선택되거나;
또는 R1이 R2와 결합하여 B3과 B4가 -2',3'-O-이소프로필리딘을 형성하고,
단, B3과 B4는 둘다 -OH일 수는 없고,
X는 -H 및 -CH3로부터 선택되고;
B1 및 B2는 각각 독립적으로 아데닌, 구아닌, 시토신, 및 우라실로부터 선택되고;
R은 H, 링커-결합된 세포-투과성 펩티드, 염료에 공유 결합된 링커-결합된 세포-투과성 펩티드, 및 링커-결합된 염료로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, R은 서열번호 1 내지 583 중 임의의 것으로부터 선택된 링커-결합된 세포-투과성 펩티드로부터 선택되고, 이때 세포-투과성 펩티드에 결합된 링커는 시판되는 것들, 예를 들어 비오틴, 3' 말레이미도벤조산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 또는
Figure pct00021
로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, R은
Figure pct00022
이다. 일부 실시형태에서, R은 염료에 공유 결합된 링커-결합된 세포-투과성 펩티드로부터 선택되고, 이때 세포-투과성 펩티드는 서열번호 1 내지 583 중 임의의 것으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, R은 링커-결합된 염료이다.
일부 실시형태에서, 각각의 염료는 아조벤젠 염료, 나프탈렌 함유 염료, 시아닌 염료, 로다민 염료, 쿠마린, 및 피렌 염료로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 염료는 하기 식으로부터 독립적으로 선택된다:
Figure pct00023
일부 실시형태에서, B3은 -OR1이고 B4는 -OR2이고, 이때 R1은 R2와 결합하여 B3과 B4가 -2',3'-O-이소프로필리덴을 형성하고; X는 -CH3이고; R은 H이다. 일부 실시형태에서, B3은 -OR1이고 B4는 -OR2이고, 이때 R1은 R2와 결합하여 B3와 B4가 -2',3'-O-이소프로필리덴을 형성하고, R은
Figure pct00024
및 염료에 공유 결합된
Figure pct00025
로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, B3은 -OR1로부터 선택되고, 이때 R1은 프로파길 및 tert-부틸디메틸실릴로부터 선택되고; B4는 -OH이고; R은 H이다. 일부 실시형태에서, B3은 -OR1로부터 선택되고, 이때 R1은 프로파길 및 tert-부틸디메틸실릴로부터 선택되고; B4는 -OH이고; R은
Figure pct00026
및 염료에 공유 결합된
Figure pct00027
로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 염료는 아조벤젠 염료, 나프탈렌 함유 염료, 시아닌 염료, 로다민 염료, 쿠마린, 및 피렌 염료로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 염료는 하기 식으로부터 독립적으로 선택된다:
Figure pct00028
일부 실시형태에서, B3은 염료이고; B4는 -OH이고; R은 H이다. 일부 실시형태에서, B3은 염료이고; B4는 -OH이고; R은
Figure pct00029
및 염료에 공유 결합된
Figure pct00030
로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 염료는 아조벤젠 염료, 나프탈렌 함유 염료, 시아닌 염료, 로다민 염료, 쿠마린, 및 피렌 염료로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 염료는 하기 식으로부터 독립적으로 선택된다:
Figure pct00031
일부 실시형태에서, B3은 -OH이고; B4는 -OR2로부터 선택되고, 이때 R2는 프로파길 및 tert-부틸디메틸실릴로부터 선택되고; R은 H이다. 일부 실시형태에서, B3은 -OH이고; B4는 -OR2로부터 선택되고, 이때 R2는 프로파길 및 tert-부틸디메틸 실릴로부터 선택되고; R은
Figure pct00032
및 염료에 공유 결합된
Figure pct00033
로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, B3은 -OH이고; B4는 염료이고; R은 H이고; 및 X =-CH3이다. 일부 실시형태에서, B3은 -OH이고; B4는 염료이고; R은
Figure pct00034
및 염료에 공유 결합된
Figure pct00035
로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 염료는 아조벤젠 염료, 나프탈렌 함유 염료, 시아닌 염료, 로다민 염료, 쿠마린, 및 피렌 염료로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 염료는 하기 식으로부터 독립적으로 선택된다:
Figure pct00036
화학식 (I)의 트리뉴클레오티드 캡 유사체의 일부 실시형태에서, B3은 -OR1이고, R1은 4'C와 메틸렌 가교를 형성하여, 화학식 (I)의 트리뉴클레오티드 캡 유사체가 하기 화학식 (II)의 트리뉴클레오티드 캡 유사체가 되도록 한다:
Figure pct00037
일부 실시형태에서, R은 링커-결합된 세포-투과성 펩티드로부터 선택되고, 이때 세포-투과성 펩티드는 서열번호 1 내지 583 중 임의의 것으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, R은 염료에 공유 결합된 링커-결합된 세포-투과성 펩티드로부터 선택되고, 이때 세포-투과성 펩티드는 서열번호 1 내지 583 중 임의의 것으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, B4는 -OH이고 R은 H이다. 일부 실시형태에서, B4는 -OH이고; R은
Figure pct00038
및 염료에 공유 결합된
Figure pct00039
로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, B4는 염료이고; R은 H이다. 일부 실시형태에서, 각각의 염료는 아조벤젠 염료, 나프탈렌 함유 염료, 시아닌 염료, 로다민 염료, 쿠마린, 및 피렌 염료로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 염료는 하기 식으로부터 독립적으로 선택된다:
Figure pct00040
본 개시내용의 또 다른 양태는, 화학식 (I)의 트리뉴클레오티드 캡 유사체 또는 본원에 개시된 그의 임의의 실시형태를 포함하는 조성물이다.
본 개시내용의 또 다른 양태는, 화학식 (I)의 트리뉴클레오티드 캡 유사체 또는 본원에 개시된 그의 임의의 실시형태를 포함하는 조성물을 적어도 하나의 양이온성 지질, 선택적으로 하나 이상의 중성 지질, 및 선택적으로 응집(aggregation)을 방지하는 하나 이상의 접합된(conjugated) 지질(예를 들어, PEG 지질 및/또는 폴리글리콜 지질), 및 선택적으로 하나 이상의 세포-투과성 펩티드, 또는 이들의 임의의 조합물과 조합하는 것을 포함하는 지질 나노입자의 제조 방법이다.
본 개시내용의 또 다른 양태는, 화학식 (I)의 트리뉴클레오티드 캡 유사체 또는 본원에 개시된 그의 임의의 실시형태가 공유 결합되어 있는 RNA를 포함하는 조성물이다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 RNA 전달제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 RNA 전달제는 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 RNA 전달제는 적어도 하나의 중성 지질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 RNA 전달제는 세포-투과성 펩티드로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 양이온성 지질은 하기로부터 선택된다:
2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼민카복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 1,3-디올레오일옥시-2-(6-카복시-스퍼밀) 프로필아미드(DOSPER), 디옥타데실아미도-글리실스퍼민(DOGS), 테트라메틸테트라팔미틸스퍼민(TMTPS), 테트라메틸테트라팔미토일스퍼민(TMTOS), 테트라메틸테트라라우릴 스퍼민(TMTLS), 테트라메틸테트라미리스틸 스퍼민(TMTMS), 테트라메틸디올레일스퍼민(TMDOS), N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아올레오일옥시프로필)-2-히드록시프로판-1,3-디아민, N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아미리스틸옥시프로필)-2-히드록시프로판-1,3-디아민, N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아팔미틸옥시프로필)-2-히드록시프로판-1,3-디아민, N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아올레오일옥시프로필)-2-(3-아미노-2-히드록시프로필옥시)프로판-1,3-디아민, N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아미리스틸옥시프로필)-2-(3-아미노-2-히드록시프로필옥시)프로판-1,3-디아민, N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아팔미틸옥시프로필)-2-(3-아미노-2-히드록시프로필옥시)프로판-1,3-디아민, L-스페민-5-카복실-3-(DL-1,2-디팔미토일-디메틸아미노프로필-β-히드록시에틸아민, 3,5-(N,N-디-리실)-디아미노벤조일-글리실-3-(DL-1,2-디팔미토일-디메틸아미노프로필-β-히드록시에틸아민), L-리신-비스(O,O'-올레오일-β-히드록시에틸) 아미드 디히드로클로라이드, L-리신-비스-(O,O'-팔미토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 1,4-비스[(3-(3-아미노프로필)-알킬아미노)-2-히드록시프로필)피페라진, L-리신-비스-(O,O'-미리스토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, L-오르니틴-비스-(O,O'-미리스토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, L-오르니틴-비스-(O,O'-올레오일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 1,4-비스[(3-(3-아미노프로필)-올레일아미노)-2-히드록시프로필]피페라진, L-오르니틴-비스-(O,O'-팔미토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 1,4-비스[(3-아미노-2-히드록시프로필)-올레일아미노]-부탄-2,3-디올, 1,4-비스[(3-아미노-2-히드록시프로필)-팔미틸아미노]-부탄-2,3-디올, 1,4-비스[(3-아미노-2-히드록시프로필)-미리스틸아미노]-부탄-2,3-디올, 1,4-비스[(3-올레일아미노)프로필]피페라진, L-아르기닌-비스-(O,O'-올레오일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 비스[(3-(3-아미노프로필)-미리스틸아미노)-2-히드록시프로필]피 페라진, L-아르기닌-비스-(O,O'-팔미토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, L-세린-비스-(O,O'-올레오일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 1,4-비스[(3-(3-아미노프로필)-팔미틸아미노)-2-히드록시프로필]피페라진, 글리신-비스-(O,O'-팔미토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 사르코신-비스-(O,O'-팔미토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, L-히스티딘-비스-(O,O'-팔미토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 콜레스테릴-3β-카복실-아미도에틸렌트리메틸암모늄 요오다이드, 1,4-비스[(3-미리스틸아미노)프로필]피페라진, 1-디메틸아미노-3-트리메틸암모니오-DL-2-프로필-콜레스테릴 카복실레이트 요오다이드, 콜레스테릴-3β-카복시아미도에틸렌아민, 콜레스테릴-3β-옥시숙신아미도에틸렌트리메틸암모늄 요오다이드, 1-디메틸아미노-3-트리메틸암모니오-DL-2-프로필-콜레스테릴-3β-옥시숙시네이트 요오다이드, 2-[(2-트리메틸암모니오)-에틸메틸아미노]에틸-콜레스테릴-3β-옥시숙시네이트 요오다이드, 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 및 3β-[N-(폴리에틸렌이민)-카바모일]콜레스테롤, 1,4-비스[(3-팔미틸아미노)프로필]피페라진, L-오르니틸글리실-N-(1-헵타데실옥타데실)글리신아미드, N2,N5-비스 (3-아미노프로필)-L-오르니틸글리실-N-(1-헵타데실옥타데실)글리신아미드, 1,4-비스 [(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-알킬아미노)-2-히드록시프로필]피페라진, N2-[N2,N5-비스(3-아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디옥타데실-L-글루타민, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디옥타데실-L-α-글루타민, 1,4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-올레일아미노)2-히드록시프로필]피페라진, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디옥타데실-L-α-아스파라긴, N-[N2-[N2,N5-비스[(1,1-디메틸 에톡시)카보닐]-N2,N5-비스[3-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]아미노프로필]-L-오르니틸-N,N-디 옥타 데실-L-글루타미닐]-L-글루탐산, N2-[N2,N5-비스(3-아미노프로필)-L-오르니틸 ]-N,N-디올레일-L-글루타민, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디올레일-L-α-글루타민, 4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-미리스틸아미노)-2-히드록시프로필]피페라진, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디올레일-L-α-아스파라긴, N-[N2,N5-비스[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]-N2,N5-비스[3-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]아미노프로필]-L-오르니틸-N,N-디올레일-L-글루타미닐]-L-글루탐산, 1,4-비스[(3-(3-아미노프로필)-올레일아미노)프로필]피페라진, N2-[N2,N5-비스(3-아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디팔미틸-L-글루타민, N2-[N2,N5-비스 (아미노프로필)-L-오르니틸]-N--디팔미틸-L-α-글루타민, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디팔미틸-L-α-아스파라긴, N-[N2-[N2,N5-비스[(1,1-디메틸에톡시) 카보닐]-N2,N5-비스[3-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐] 아미노프로필]-L-오르니틸-N,N-디팔미틸-L-글루타미닐]-L-글루탐산, N2-[N2,N5-비스(3-아미노프로필)-L-오르니틸 ]-N,N-디아미리스틸-L-글루타민, N2-[N2,N5-비스 (아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디아미리스틸-L-α-글루타민, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디아미리스틸-L-α-아스파라긴, 1,4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-팔미틸아미노)-2-히드록시프로필]피페라진, N-[N2-[N2,N5-비스[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]-N2,N5-비스[3-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]아미노프로필]-L-오르니틸-N,N-디아미리스틸-L-글루타미닐]-L-글루탐산, 1,4-비스[(3-(3-아미노프로필)-미리스틸아미노)프로필]피페라진, N2-[N2,N5-비스(3-아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디라우릴-L-글루타민, N2-8N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디라우레일-L-α-글루타민, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디라우레일-L-α-아스파라긴, N-[N2-[N2,N5-비스[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]-N2,N5-비스[3-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]아미노프로필]-L-오르니틸-N--디라우레일-L-글루타미닐]-L-글루탐산, 3-[N',N"-비스(2-tert-부틸옥시카보닐아미노에틸)구아니디노]-N,N-디옥타덱-9-에닐프로피온아미드, 3-[N',N"-비스(2-tert-부틸옥시카보닐아미노에틸)구아니디노]-N,N-디팔미틸프로피온아미드, 3-[N',N"-비스(2-tert-부틸옥시카보닐아미노에틸)구아니디노]-N,N-디미리스틸프로피온아미드, 1,4-비스[(3-(3-아미노프로필)-팔미틸아미노)프로필]피페라진, 1,4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-올레일아미노)프로필]피페라진, N,N-(2-히드록시-3-아미노프로필)-N-2-히드록시프로필-3-N,N-디올레일아미노프로판, N,N-(2-히드록시-3-아미노프로필)-N-2-히드록시프로필-3-N,N-디팔미틸아미노프로판, N,N-(2-히드록시-3-아미노프로필)-N-2-히드록시프로필-3-N,N-디미리스틸아미노프로판, 1,4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-미리스틸아미노)프로필]피페라진, [(3-아미노프로필)-비스-(2-테트라데실옥시에틸)]메틸 암모늄 브로마이드, [(3-아미노프로필)-비스(2-올레일옥시에틸)]메틸 암모늄 브로마이드, [(3-아미노프로필)-비스-(2-팔미틸옥시에틸)]메틸 암모늄 브로마이드, 올레오일-2-히드록시-3-N,N-디메틸아미노프로판, 2-디데카노일-1-N,N-디메틸아미노프로판, 팔미토일-2-히드록시-3-N,N-디메틸아미노프로판, 1,2-디팔미토일-1-N,N-디메틸아미노프로판, 미리스토일-2-히드록시-3-N,N-디메틸아미노프로판, 1,2-디미리스토일-1-N,N-디메틸아미노프로판, (3-아미노-프로필)->4-(3-아미노-프로필아미노)-4-테트라데실카바모일-부틸카밤산 콜레스트릴 에스테르, (3-아미노-프로필)->4-(3-아미노-프로필아미노-4-카바모일부틸카밤산 콜레스트릴 에스테르, (3-아미노-프로필)->4-(3-아미노-프로필아미노)-4-(2-디메틸아미노-에틸카바모일)-부틸카밤산 콜레스트릴 에스테르, 스퍼민-5-카복시글리신(N'-스테아릴-N'-올레일)아미드테트라트리플루오로아세트산 염, 스퍼민-5-카복시글리신(N'-스테아릴-N'-엘라이딜)아미드테트라트리플루오로아세트산 염, 아그마티닐 카복시콜레스테롤아세트산 염, 5-카복시-β-알라닌 콜레스테릴 에스테르 테트라트리플루오로아세트산 염, 2,6-디아미노헥사노오일 β-알라닌 콜레스테릴 에스테르 비스트리플루오로아세트산 염, 2,4-디아미노부티로일 β-알라닌 콜레스테릴 에스테르 비스트리플루오로아세트산 염, N,N-비스(3-아미노프로필)-3-아미노프로피오닐 β-알라닌 콜레스테릴 에스테르 트리스트리플루오로아세트산 염, [N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에틸]아미노카복시 콜레스테릴 에스테르, 스테아릴 카르니틴 에스테르, 팔미틸 카르니틴 에스테르, 미리스틸 카르니틴 에스테르, 스테아릴 스테아로일 카르니틴 에스테르 클로라이드 염, L-스테아릴 스테아로일 카르니틴 에스테르, 스테아릴 올레오일 카르니틴 에스테르 클로라이드, 팔미틸 팔미토일 카르니틴 에스테르 클로라이드, 미리스틸 미리스토일 카르니틴 에스테르 클로라이드, L-미리스틸 미리스토일 카르니틴 에스테르 클로라이드, 1,4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-팔미틸아미노)프로필]피페라진, N-(3-아미노프로필)-N,N'-비스-(도데실옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N,N'-비스-(올레일옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N,N'-비스-(팔미틸옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N,N'-비스-(미리스틸옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N'-메틸-N,N'-(비스-2-도데실옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N'-메틸-N,N'-(비스-2-올레일옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N'-메틸-N,N'-(비스-2-팔미틸옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N'-메틸-N,N'-(비스-2-미리스틸옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드. 상기 조성물 및 방법에 유용한 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린(DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디운데카노일-sn-글리세로-포스포콜린(DUPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디-O-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:0 디에테르 PC), 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린 (C16 Lyso PC), 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(ME 16.0 PE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤)나트륨염(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올 아민(DSPE), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민(SOPE), 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜콜린(SOPC), 스핑고미엘린, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딘산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민(LPE),
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
으로 이루어진 비제한적 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 중성 지질은 콜레스테롤, 올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 및 디피타노일포스파티딜에탄올아민(DDhPE)으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는, 화학식 (I)의 트리뉴클레오티드 캡 유사체뿐만 아니라 본원에서 제시된 조성물의 임의의 성분(예를 들어, 하나 이상의 RNAse 억제제 등); 뉴클레오티드 트리포스페이트 분자; 및 RNA 중합 효소를 포함하는 키트이다.
본 개시내용의 또 다른 양태는, 트리뉴클레오티드 캡핑된 RNA를 생성하기에 충분한 조건 하에서 그러한 시간 동안 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재 하에, 핵산 기질을 RNA 중합 효소 및 화학식 (I)의 트리뉴클레오티드 캡 유사체 또는 본원에 개시된 그의 임의의 실시형태와 접촉시키는 것을 포함하는, 트리뉴클레오티드 캡핑된 RNA를 제조하는 방법이다.
본 개시내용의 추가 양태는, 세포를, 화학식 (I)의 트리뉴클레오티드 캡 유사체 또는 본원에 개시된 그의 임의의 실시형태를 포함하는 트리뉴클레오티드 캡 유사체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 RNA의 세포내 안정성을 증가시키기 위한 것으로, 본원에 개시된 화학식 (I)에 따른 트리뉴클레오티드 캡 유사체 또는 그의 임의의 실시형태를 RNA 내로 혼입시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은, 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 내로 RNA를 도입하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 세포에서의 RNA 번역 억제를 위한 것이다.
본원 내용을 이해하기 위해 하기 정의가 적용될 것이며, 적절한 경우, 단수형으로 사용된 용어는 복수형도 포함하고 그 반대도 마찬가지이다. 아래에 설명된 정의가 다른 문서에서 해당 단어의 사용과 상충하는 경우, (예를 들어, 그 용어가 원래 사용된 문서를 해석할 때) 반대적인 의미가 명확하게 의도되지 않는 한, 본 명세서 및 관련 청구범위를 해석할 목적으로는 아래에 설명된 정의가 항상 우선할 것이다. 본원에서 "또는"의 사용은, 달리 명시되지 않거나 "및/또는"의 사용이 명백히 부적절한 것이 아니라면, "및/또는"을 의미한다. 본원에서 단수형 용어의 사용은 달리 명시되지 않는 한 또는 "하나 이상"의 사용이 명백히 부적절한 것이 아니라면, "하나 이상"을 의미한다. "포함한다", "포함하는", "비롯한", "함유하는"의 사용은 상호교환가능하며 제한하려는 의도가 아니다.
본원에 사용된 "모이어티" 및 "기"라는 용어는, 일반적으로 특정의 기능적 또는 구조적 특징부를 갖는 분자의 부분, 예를 들어 연결 기(분자의 2개의 다른 부분을 연결하는 그 분자의 일부), 또는 에틸 모이어티 (에탄과 밀접하게 관련된 구조를 가진 분자의 일부)를 지칭하기 위해, 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 "Me"는 "CH3"과 동일하며; "OCH3" 또는 "OMe"는 메틸기에 결합된 산소 원자를 나타내고; "CHO"는 수소 원자 H에 결합되고 산소 원자 O에 이중 결합된 탄소 원자 C를 나타내고(O=CH-); "Et"는 "C2H5"를 나타낸다.
본원에서 사용되는 염기명인 아데닌, 구아닌, 시토신, 및 우라실은 각각 대문자 이니셜 "A", "G", "C" 및 "U"와 상호교환 가능하다.
본원에서 사용되는 용어 "캡"은, 일반적으로 m7GpppG 또는 m7GpppA 구조를 갖는 RNA 전사체의 5' 말단에 혼입될 때, RNA 전사체의 번역 또는 편재화를 촉진하고/하거나 분해를 방지하는 비-연장성 디뉴클레오티드(본원에서 "이량체"라고도 함)를 지칭한다. 캡은 일반적으로, 3개의 포스페이트기를 통해 분자의 나머지 부분에 반대 방향(3′에 대해 5'가 아닌 5′에 대해 5′)으로 연결된 변형된 염기 7-메틸구아노신의 성질로 구성된다 (즉, PI-구아노신-5'-일 P3-7-메틸구아노신-5'-일 트리포스페이트(m7G5'ppp5'G)).
본원에서 사용되는 용어 "캡 유사체"는, 단일 요소와 거의 다르지 않을 수 있는 RNA 캡의 구조적 유도체를 의미한다. 캡 유사체는 트리뉴클레오티드(본원에서 "삼량체"라고도 함)뿐만 아니라 오량체 및 더 긴 다량체(예를 들어, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 뉴클레오티드 길이의 핵산 다량체)일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "캡핑된 올리고뉴클레오티드" 또는 "캡핑된 프라이머"는 프라이머의 5'-말단에 Cap 0, Cap 1, Cap 2 또는 2,2,7-트리메틸구아노신(TMG)-캡 구조를 포함하는 전사 개시 프라이머를 지칭한다. 캡핑된 프라이머는 일반적으로, 변형되지 않거나 개방된 3'-OH 기를 가질 것이며, 프라이머의 3'-말단 상에 NTP를 혼입하는 것을 통해 RNA 중합 효소에 의해 연장될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 전사 시스템에서 프로모터의 제어 하에 시험관내 전사를 개시할 수 있을 것이다. 용어 "캡핑된 올리고뉴클레오티드" 또는 "캡핑된 프라이머"는, 전사에 의해 캡핑된 RNA 분자를 생성하는데 사용될 수 있는 본원에서 제시된 것과 같은 캡 (예를 들어, 도 9에 제시된 작업 흐름도에서 생성된 캡 유사체 참조)을 포함한다. 또한 본원에서 사용되는 "개시 프라이머" 또는 "개시 올리고뉴클레오티드 프라이머"는, RNA 합성(예를 들어, 주형 지향된(directed) RNA 합성)의 개시 시에 RNA 중합 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있는 말단 3'-OH 기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들어, 전사에 의해 RNA 분자에 추가될 수 있는 천연 캡은 캡 프라이머이다. 따라서, 캡 프라이머는, 본원에 기재된 캡 또는 캡 유사체와 같은 천연 캡 또는 캡 유사체를 포함할 수 있다.
본원에서 언급되는 "뉴클레오티드"라는 용어는 달리 나타내지 않는 한 천연 뉴클레오티드, 합성 뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
용어 "트리뉴클레오티드 캡 유사체"는 3개의 뉴클레오티드를 포함하는 캡 또는 캡 유사체를 지칭한다. 예를 들어, 도 9에 제시된 작업 흐름도에서 생성된 캡 유사체는, 첫 번째 뉴클레오티드(왼쪽)가 3개의 포스페이트기에 의해 다른 2개의 뉴클레오티드(오른쪽)와 분리되는 트리뉴클레오티드 캡 유사체이다. 오른쪽에 있는 두 개의 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 일반적으로 개시 부위에 혼성화되고 RNA 중합 효소에 의해 구동되는 프라이머 전사에 작용하도록 설계될 것이다. 본원에 제시되고 사용된 캡 및 캡 유사체는 3개 뉴클레오티드보다 길 수도 있다. 예를 들어, 도 9의 오른쪽 편에 있는 것과 유사한 뉴클레오티드가 2개 초과로 존재할 수도 있다. 특히, 캡 및 캡 유사체는 4개 내지 20개의 뉴클레오티드를 함유할 수 있고, 이들 뉴클레오티드 중의 3개 내지 19개(예를 들어, 약 3개 내지 약 16개, 약 3개 내지 약 12개, 약 4개 내지 약 16개, 약 4개 내지 약 10개, 약 5개 내지 약 10개 등)는 개시 부위에 혼성화되어 RNA 중합 효소에 의해 구동되는 프라이머 전사에 작용할 수 있다.
본원에서 사용되는 "프로모터"라는 용어는, RNA 중합 효소에 의해 인식되어 작동가능하게 연결된 핵산 영역에 대한 개시 주형으로 작용하여 작동가능하게 연결된 핵산 영역의 일부 또는 모두를 전사시킬 수 있는 핵산 영역을 의미한다. 프로모터는 진핵생물, 원핵생물, 바이러스 또는 소기관으로부터 유래된 것일 수 있다. 추가로, 프로모터는 천연, 변형된 천연, 또는 합성된 것(예를 들어, 2개의 천연 프로모터의 융합체 또는 천연 프로모터의 컨센서스 서열로부터 설계된 프로모터)일 수 있다. 프로모터의 한 범주는 "T7 유사" 프로모터, 예를 들어 도 16에 제시된 것이다.
많은 경우에, 프로모터는 주형 가닥과 비-주형 가닥으로 구성된 이중 가닥 핵산일 것이다. 도 16은 4개의 상이한 프로모터의 비-주형 가닥을 나타내고, 도 17은 박테리오파지 프로모터 부분의 주형 가닥 및 비-주형 가닥을 모두 보여준다.
일부 경우에, 프로모터는 주형 가닥 또는 비-주형 가닥으로 구성된 단일 가닥 핵산일 것이다. 그러한 프로모터의 예는 RNA 및 DNA 단일 가닥 바이러스(예를 들어, 알파바이러스, 한타바이러스 및 플라비바이러스)의 프로모터이다.
프로모터는 전형적으로, 전사될 핵산에 바로 인접하여(또는 부분적으로 중첩되어) 위치한다. 프로모터의 뉴클레오티드 위치는 일반적으로 전사 시작 부위에 대해 지정되며, 보통 야생형 시스템에서 +1 위치(도 16 참조)로 지칭된다. 개시 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, mRNA 캡 또는 캡 유사체)의 적어도 하나의 염기는, 전사의 개시에 사용되는 프로모터 서열의 개시 부위 (예를 들어, 도 16에 제시된 바와 같은 +1 위치, -1 및 +1 위치, 또는 +1 및 +2 위치)의 주형 가닥에 대해 상보적이다.
본원에서 "개시 복합체"라는 용어는, RNA 중합 효소에 의한 RNA 분자의 전사 개시를 허용하는 조건 하에서 프라이머와 핵산 분자의 주형 가닥의 결합(association)을 의미한다. 많은 경우에, 프라이머는 캡 유사체(예를 들어, 본원에서 제공된 mRNA 캡 유사체)일 것이다. 예시적인 캡 유사체 RNA 개시 복합체 구조는 도 17에 개략적으로 제시되어 있다.
본원에서 용어 "개시 부위"는, 캡핑된 프라이머가 RNA 전사의 개시를 위해 결합하는 프로모터의 주형 가닥 상의 염기 또는 염기들을 지칭한다. 많은 경우에, 개시 부위는 비-주형 가닥의 뉴클레오티드 서열에 의해 식별될 것이다(예를 들어, 도 16 참조). 개시 부위 및 주변 핵산 모두에 대한 본원의 수치 값은 본래의(native) 개시 부위를 기준으로 한 것이다(예를 들어, 도 16 참조). 따라서, 참고로, 도 17에서, GG 캡핑된 프라이머(CAP3)를 갖는 T7 프로모터에 기반한 천연 전사 개시는 일반적으로 +1 위치에서 시작하는 것으로 여겨진다. 따라서, 도 17의 -1 및 +1 위치에서 AG 캡핑된 프라이머(CAP2)의 혼성화는, 캡핑된 프라이머가 "TATA box" 중의 하나의 염기에 천연 개시 부위인 +1 위치에서 혼성화됨을 의미한다. 이러한 경우 전사 개시는 -1 위치에서 시작된다. 또한, 캡핑된 프라이머가 -1 및 +1 위치에 혼성화되는 경우, 개시 부위는 -1 및 +1 위치에 위치한다.
본원에서 사용되는 용어 "시험관내 전사 및 번역(IVTT)"은 메신저 RNA(mRNA) 분자의 생성 및 이들 mRNA 분자로부터의 단백질의 생성을 지칭한다. 일반적으로 IVTT는, 전사 및 번역 "기구(machinery)"(예를 들어, 리보솜, tRNA 합성 효소, 하전된 및 비-하전된 tRNA 분자, RNA 중합 효소 등)를 포함하는 세포 추출물을 사용할 것이다. 이들은 전사 및 번역 반응을 수행할 수 있는 세포 성분이다. IVTT는, T7 RNA 중합 효소 및 뉴클레오티드를 포함하는 전사 성분과 함께, 정제된 DNA 분자 형태로 공급되는 유전자를 전사하고 번역할 수 있다. IVTT 반응에 사용되는 세포 성분은 본질적으로 모든 세포 유형에 대해 얻을 수 있으며, 다양한 시약(예를 들어, 완충제, 아미노산, tRNA 분자 등)으로 보충될 수 있다.
IVTT 반응은 (1) 시험관내 전사"(IVTr 또는 IVT) 및 (2) "시험관내 번역"(IVTl)의 두 가지 하위 구성 요소로 구성된다. 이들 공정은 단일 반응 혼합물에서 발생하거나 별도의 반응 혼합물에서 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "양이온성 지질"은 생리학적 조건 하에서 적어도 하나의 양전하를 갖는 지질을 의미한다.
용어 "ARCA" 또는 역전사-방지 캡 유사체는, -m7G의 3'-OH 기 또는 2'-OH 기가 변형된, 변형된 캡 유사체를 의미한다. 이 변형은 RNA 중합 효소가 캡의 G 잔기에 남아 있는 -OH 기로써 전사를 개시하도록 하여 전적으로 올바른 방향으로 캡핑된 RNA 전사체를 합성한다. 따라서, 본원에서 제공되는 캡 유사체의 사용은, 캡 유사체의 절반만이 올바른 배향으로 혼입되는 전통적인 캡 유사체를 사용하는 전사 반응과 대조적으로, 100% 기능성인 캡핑된 RNA의 합성을 가능하게 한다. 본원에서 제공되는 캡핑된 mRNA는, 망상적혈구 용해물(reticulocyte lysates), 밀 배아 용해물 및 기타 시험관내 시스템에서의 단백질 합성에 사용되거나, 또는 예를 들어 생체내 연구를 위해 세포 또는 유기체에 미세주입, 전기천공 또는 형질감염될 수 있다. 또한 이것은 RNA 스플라이싱 및 안정성 연구에도 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "세포-투과성 펩티드"는, 예를 들어 막(membrane)으로부터 세포질 및 핵으로 카고(cargo) 분자의 전달을 촉진함으로써, RNA의 세포 흡수(uptake)를 돕는 변형된 펩티드 또는 기타 실체(entity)를 의미한다. 본원에 개시된 실시형태에 유용한 적합한 세포-투과성 펩티드의 비제한적 예는 표 2에 열거된 펩티드 및 염료에 선택적으로 공유 결합된 표 2에 열거된 펩티드를 포함한다.
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본원에 사용된 용어 "링커-결합된 세포-투과성 펩티드"는, 예를 들어 막으로부터 세포질 및 핵으로의 카고 분자의 전달을 촉진함으로써 RNA의 세포 흡수를 보조하는 변형된 펩티드 또는 기타 실체로서, 세포-투과성 펩티드가 본원에 기재된 트리뉴클레오티드 캡 유사체에 접합 또는 부착되도록 하는 연결 모이어티(linking moiety)에 결합된 것을 지칭한다. 당업자는 세포-투과성 펩티드에 결합된 링커가 시판되는 것들, 예를 들어 비오틴, 3' 말레이미도벤조산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 및
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로부터 선택될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 세포-투과성 펩티드는 본원에 개시된 RNA 캡에 공유 결합될 수 있다. 예로서, 일부 실시형태에서, 세포-투과성 펩티드는 본원에 개시된 RNA 캡에 부착된 형광 표지(label) 내에 혼입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포-투과성 펩티드는 본원에 개시된 RNA 캡에 공유 결합되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포-투과성 펩티드와 함께 본원에 기재된 바와 같은 캡을 갖는 RNA 분자를 포함하는 조성물이 제공된다.
본원에서 사용되는 용어 "클릭" 또는 "클릭 화학"은 1,2,4-트리아졸을 형성하기 위한 아지드와 알킨 사이의 휘스겐(Huisgen) 고리화부가 또는 1,3-쌍극자 고리화부가를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "효소적으로 혼입가능한"은 뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드 사슬의 말단, 예를 들어 3' 말단 상에 효소적으로 혼입될 수 있거나 내부적으로 폴리뉴클레오티드 사슬의 틈-번역을 통해, 주형-의존형 또는 주형-독립형 중합 효소의 작용을 통해 혼입될 수 있음을 의미한다. 뉴클레오티드-5'-트리포스페이트는 효소적으로 혼입가능한 뉴클레오티드의 예이다.
본원에서 사용되는 용어 "효소적으로 연장가능한" 또는 "3' 연장가능한"은 효소 작용에 의해 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 부가될 수 있는 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 3' 히드록실 기를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 효소적으로 연장가능한 폴리뉴클레오티드의 예이다.
본원에서 사용되는 용어 "할로겐"은 불소(F), 염소(Cl), 브롬(Br), 요오드(I) 및 아스타틴(At)을 포함하는 원소 주기율표의 7A족 비금속 원소를 의미한다. 할로겐은 1가이며 쉽게 음이온을 형성하고, 화합물 또는 이온으로 발생한다.
본원에서 사용되는 "세포내 분자 안정성" 및 "세포내 안정성"이라는 용어는, 기능 손실을 초래하는 분해 없이, RNA가 세포에 존재하는 능력을 지칭한다. 따라서 세포내 안정성이 증가한다는 것은 RNA가 세포에 존재하는 기간이 증가한다는 것을 의미한다. 비제한적 예로서, 캡핑되지 않은 RNA는 평균 4 내지 6시간 동안 세포 내에 존재할 수 있는 반면, 캡핑된 RNA는 캡에 따라 평균 10 내지 48시간 동안 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "잠금형 핵산"(LNA)은 2'O와 4'C 메틸렌 비시클로뉴클레오티드 단량체 사이의 가교를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "핵염기"는 질소 함유 헤테로사이클 모이어티 핵염기를 의미한다. 적합한 핵염기의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 우라실, 5-프로피닐-우라실, 2-티오-5-프로피닐-우라실, 5-메틸시토신, 슈도이소시토신, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-아미노퓨린, N9-(2-아미노-6-클로로퓨린), N9-(2,6-디아미노퓨린), 하이포잔틴, N9-(7-데아자-구아닌), N9-(7-데아자-8-아자-구아닌) 및 N8-(8-아자-7-데아자아데닌).
본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오시드"는 리보스 당 또는 그의 유사체의 C-1'탄소에 연결된 핵염기로 구성된 화합물을 지칭한다. 리보스 또는 유사체는 치환되거나 비치환될 수 있다. 치환된 리보스 당은, 탄소 원자의 하나 이상, 바람직하게는 3'-탄소 원자가 동일하거나 상이한 치환기, 예를 들어 -R, -OR, -NRR 또는 할로겐(예를 들어, 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 요오도) 중 하나 이상(이때 각 R기는 독립적으로-H, C1-C6 알킬 또는 C3-C14 아릴임)으로 치환된 리보스류를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특히, 리보스류는 리보스, 2'-데옥시리보스, 2',3'-디데옥시리보스, 3'-할로리보스(3'-플루오로리보스 또는 3'-클로로리보스 등) 및 3'-알킬리보스이다. 전형적으로, 핵염기가 A 또는 G일 때, 리보스 당은 핵염기의 N9-위치에 결합된다. 핵염기가 C, T 또는 U일 때, 펜토스 당은 핵염기의 N1-위치에 결합된다(문헌[Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed., Freeman, San Francisco, CA, (1992)]). 리보스 유사체의 예는 아라비노스, 2'-O-메틸 리보스 및 잠금형 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, WO 99/14226 참조)를 포함하지만, 많은 다른 유사체도 당업계에 알려져 있다.
본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드"는 단량체 단위로서의 또는 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오시드의 포스페이트 에스테르를 의미한다.
본원에서 사용되는 "뉴클레오티드 트리포스페이트"라는 용어는 5' 위치에 트리포스페이트 에스테르 기가 있는 뉴클레오티드를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 교시의 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드는 "천연 당"(즉, 리보스, 2'-데옥시리보스 등) 또는 당 유사체를 포함할 수 있다.
"리포터 모이어티" 및 "리포터"라는 용어는 상호교환가능하고, 검출가능한 모이어티를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 리포터는 친화성 모이어티에 의해 특이적으로 결합된다. 일부 실시형태에서, 리포터 모이어티와 친화성 모이어티의 상호작용은 리포터 모이어티에 부착된 1,4-트리아졸-유도체화된 RNA의 단리를 제공한다. 예는 비오틴 또는 이미노비오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 리포터 모이어티의 하위 군은, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 의해 인식되고 특이적으로 결합되는 태그를 지칭하는 "에피토프 태그"이다. 다른 리포터에는 태그(친화성 파트너 포함), 에피토프 태그(항체 포함) 및 효소 기질(효소 포함)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 리포터 모이어티는 캡핑된 RNA의 정제를 위한 고체 지지체에 대한 부착을 허용할 수 있다. 리포터는 예를 들어 염료, 비오틴 또는 펩티드일 수 있다. 리포터 모이어티를 포함할 수 있는 비오틴 분자의 예는 C5-C20 O-비오틴, SS-비오틴, XX-비오틴((6-((6-((비오틴오일)아미노)헥사노일)아미노)헥산산 석신이미딜 에스테르) 및 NHS 에스테르를 포함한다. 본원의 특정 방법에서 사용하기 위해, 리포터는 "클릭" 기술에서 사용할 수 있도록 아지드 기를 포함한다.
본원에서 사용되는 "당 유사체"라는 용어는 당 리보스의 유사체를 의미한다. 예시적인 리보스 당 유사체는 5개보다 적거나 많은 고리 원자를 갖는 치환된 또는 비치환된 푸라노스, 예를 들어 에리트로스 및 헥소스, 및 치환된 또는 비치환된 3-6 탄소 비고리형 당을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 전형적인 치환된 푸라노스 및 비고리형 당은 하나 이상의 탄소 원자가 하나 이상의 동일하거나 상이한 -R, -OR, -NRR 또는 할로겐 기로 치환된 것이며, 이때 각 R은 독립적으로 -H, (C1-C6)알킬 또는 (C1-C14) 아릴이다. 5개의 고리 원자를 갖는 치환된 푸라노스의 예는 2'-데옥시리보스, 2'-(C1-C6)알킬리보스, 2'-(C1-C6)알콕시리보스, 2'-(C5-C14)아릴옥시리보스, 2',3'-디데옥시리보스, 2',3'-디데히드로리보스, 2'-데옥시-3'-할로리보스, 2'-데옥시-3'-플루오로리보스, 2'-데옥시-3'-클로로리보스, 2'-데옥시-3'-아미노리보스, 2'-데옥시-3'-(C1-C6)알킬리보스, 2'-데옥시-3'-(C1-C6) 알콕시리보스, 2'-데옥시-3'-(C5-C14) 아릴옥시리보스, 3'-(C1-C6)알킬리보스-5'-트리포스페이트, 2'-데옥시-3-'-(C1-C6) 알킬리보스-5'-트리포스페이트, 2'-데옥시-3'-(C1-C6)알콕시리보스-5'-트리포스페이트, 2'-데옥시-3'-(C5-C14)아틸옥시리보스-5'-트리포스페이트, 2'-데옥시-3'-할로리보스-5'-트리포스페이트, 2'-데옥시-3'-아미노리보스-5'-트리포스페이트, 2',3'-디데옥시리보스-5'-트리포스페이트 또는 2',3'-디데히드로리보스-5'-트리포스페이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가 당 유사체는 또한 구조
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를 갖는 소위 잠금형 핵산(LNA), 및 Wengel 등의 국제공개 WO 99/14226호에 기술된 것들을 포함한다.
본원에서 사용되는 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 인터뉴클레오티드 포스포디에스테르 결합인 결합에 의해 연결된 리보뉴클레오티드(RNA) 및 2'-데옥시리보뉴클레오티드(DNA)를 포함하는 뉴클레오티드 단량체의 단일 가닥 및 이중 가닥 중합체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 전적으로 데옥시리보뉴클레오티드로, 전적으로 리보뉴클레오티드로, 또는 이들의 키메라 혼합물로 구성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "종결자"는 생성된 폴리뉴클레오티드 사슬에 대한 뉴클레오티드의 후속 혼입을 방지하여 중합 효소-매개된 연장을 정지시키는 효소적으로 혼입가능한 뉴클레오티드를 의미한다. 전형적인 종결자는 3'-히드록실 치환기가 없으며, 2',3'-디데옥시리보스, 2',3'-디데히드로리보스 및 2',3'-디데옥시-3'-할로리보스, 예를 들어 3'-데옥시-3'-플루오로리보스 또는 2',3'-디데옥시-3'-플루오로리보스를 포함한다. 대안적으로, 리보푸라노스 유사체, 예를 들어 2',3'-디데옥시-β-D-리보푸라노실, β-D-아라비노푸라노실, 3'-데옥시-β-D-아라비노푸라노실, 3'-아미노-2', 3'-디데옥시-β-D-리보푸라노실, 및 2',3'-디데옥시-3'-플루오로-β-D-리보푸라노실이 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Chidgeavadze et al., Nucleic Acids Res., 12:1671-1686 (1984)], 및 문헌[Chidgeavadze et al., FEB. Lett., 183:275-278 (1985)] 참조). 뉴클레오티드 종결자는 또한 가역적 뉴클레오티드 종결자를 포함한다(문헌[Metzker et al., Nucleic Acids Res., 22(20):4259 (1994)]).
본원에서 사용되는 용어 "TBDMS"는 tert-부틸디메틸실릴을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "RNA 전달제"는, (시험관내에서 또는 생체내에서) 세포에 의한 RNA 분자(예컨대, 본원에 기재된 캡핑된 RNA 분자)의 흡수를 촉진하는 하나 이상의 화합물(예를 들어, 지질, 펩티드 등)을 지칭한다. RNA 전달제의 비제한적 예는, 선택적으로 하나 이상의 중성 지질, 하나 이상의 PEG 지질, 또는 이들의 임의의 조합물과 조합되는, 양이온성 지질 및 세포-투과성 펩티드를 포함한다.
본원에 개시된 실시형태에 유용한 예시적인 양이온성 지질은 비제한적으로 하기를 포함한다: 2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼민카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 1,3-디올레오일옥시-2-(6-카복시-스퍼밀) 프로필아미드(DOSPER), 디옥타데실아미도-글리실스퍼민(DOGS), 테트라메틸테트라팔미틸스퍼민(TMTPS), 테트라메틸테트라팔미토일스퍼민(TMTOS), 테트라메틸테트라라우릴 스퍼민(TMTLS), 테트라메틸테트라미리스틸 스퍼민(TMTMS), 테트라메틸디올레일스퍼민(TMDOS), N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아올레오일옥시프로필)-2-히드록시프로판-1,3-디아민, N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아미리스틸옥시프로필)-2-히드록시프로판-1,3-디아민, N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아팔미틸옥시프로필)-2-히드록시프로판-1,3-디아민, N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아올레오일옥시프로필)-2-(3-아미노-2-히드록시프로필옥시)프로판-1,3-디아민, N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아미리스틸옥시프로필)-2-(3-아미노-2-히드록시프로필옥시)프로판-1,3-디아민, N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아팔미틸옥시프로필)-2-(3-아미노-2-히드록시프로필옥시)프로판-1,3-디아민, L-스퍼민-5-카복실-3-(DL-1,2-디팔미토일-디메틸아미노프로필-β-히드록시에틸아민, 3,5-(N,N-디-리실)-디아미노벤조일-글리실-3-(DL-1,2-디팔미토일-디메틸아미노프로필-β-히드록시에틸아민), L-리신-비스(O,O'-올레일 -β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, L- 리신 -비스-(O,O'-팔미토일-β- 히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 1, 4-비스[(3-(3-아미노프로필)-알킬아미노)-2-히드록시프로필)피페라진, L-리신-비스-(O,O'-미리스토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, L-오르니틴-비스-(O,O'-미리스토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, L-오르니틴-비스-(O,O'-올레오일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 1,4-비스[(3-(3-아미노프로필)-올레일아미노)-2-히드록시프로필]피페라진, L-오르니틴-비스-(O,O'-팔미토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 1,4-비스[(3-아미노-2-히드록시프로필)-올레일아미노]-부탄-2,3-디올, 1,4-비스[(3-아미노-2-히드록시프로필)-팔미틸아미노]-부탄-2,3-디올, 1,4-비스[(3-아미노-2-히드록시프로필)-미리스틸아미노]-부탄-2,3-디올, 1,4-비스[(3-올레일아미노)프로필]피페라진, L-아르기닌-비스-(O,O'-올레오일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 비스[(3-(3-아미노프로필))-미리스틸아미노)2-히드록시프로필]피페라진, L-아르기닌-비스-(O,O'-팔미토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, L-세린-비스-(O,O'-올레오일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 1,4-비스[(3-(3-아미노프로필)-팔미틸아미노)-2-히드록시프로필]피페라진, 글리신-비스-(O,O'-팔미토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 사르코신-비스-(O,O'-팔미토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, L-히스티딘-비스-(O,O'-팔미토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 콜레스테릴-3β-카복실-아미도에틸렌트리메틸암모늄 요오다이드, 1,4-비스[(3-미리스틸아미노)프로필]피페라진, 1-디메틸아미노-3-트리메틸암모니오-DL-2-프로필-콜레스테릴 카복실레이트 요오다이드, 콜레스테릴-3β-카복시아미도에틸렌아민, 콜레스테릴-3β-옥시숙신아미도에틸렌트리메틸암모늄 요오다이드, 1-디메틸아미노-3-트리메틸암모니오-DL-2-프로필-콜레스테릴-3β-옥시숙시네이트 요오다이드, 2-[(2-트리메틸암모니오)-에틸메틸아미노]에틸-콜레스테릴-3β-옥시숙시네이트 요오다이드, 3β[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤, 및 3β-[N-(폴리에틸렌이민)-카바모일]콜레스테롤, 1,4-비스[(3-팔미틸아미노)프로필]피페라진, L-오르니틸글리실-N-(1-헵타데실옥타데실)글리신아미드, N2,N5-비스 (3-아미노프로필)-L-오르니틸글리실-N-(1-헵타데실옥타데실)글리신아미드, 1,4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필))-알킬아미노)2-히드록시프로필]피페라진, N2-[N2,N5-비스(3-아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디옥타데실-L-글루타민, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디옥타데실-L-α-글루타민, 1,4-비스[(3-(3-a 미노-2-히드록시프로필)-올레일아미노) 2-히드록시프로필]피페라진, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디옥타데실-L-α-아스파라긴, N2-[N2-[N2,N5-비스[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]-N2,N5-비스[3-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]아미노프로필]-L-오르니틸-N,N-디옥타데실-L-글루타미닐]-L-글루탐산, N2-[N2,N5-비스(3-아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디올레일-L-글루타민, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디올레일-L-α-글루타민, 4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-미리스틸아미노)-2-히드록시프로필]피페라진, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디올레일-L-α-아스파라긴, N2-[N2,N5-비스[(1,1-디메틸에톡시)카보닐 ]-N2,N5-비스[3-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐] 아미노프로필]-L-오르니틸-N,N-디올레일-L-글루타미닐]-L-글루탐산, 1,4-비스[(3-(3-아미노프로필)-올레일아미노)프로필]피페라진, N2-[N2,N5-비스(3-아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디팔미틸-L-글루타민, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N--디팔미틸-L-α-글루타민, N2-[N2,N5-비스 (아미노프로필)-L-o 메틸]-N,N-디팔미틸-L-α-아스파라긴, N-[N2-[N2,N5-비스[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]-N2,N5-비스[3-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]아미노프로필]-L-오르니틸-N,N-디팔미틸-L-글루타미닐]-L-글루탐산, N2-[N2,N5-비스(3-아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디아미리스틸-L-글루타민, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디아미리스틸-L-α-글루타민, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디아미리스틸-L-α-아스파라긴, 1,4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-팔미틸아미노)-2-히드록시프로필]피페라진, N-[N2-[N2,N5-비스[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]-N2,N5-비스[3-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]아미노프로필]-L-오르니틸-N,N-디아미리스틸-L-글루타미닐]-L-글루탐산, 1,4-비스[(3-(3-아미노프로필)-미리스틸아미노)프로필]피페라진, N2-[N2,N5-비스(3-아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디라우레일-L-글루타민, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디라우레일-L-α-글루타민, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디라우레일-L-α-아스파라긴, N-[N2-[N2,N5-비스 [(1,1-디메틸에톡시)카보닐]-N2,N5-비스[3-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]아미노프로필]-L-오르니틸-N--디라우레일-L-글루타미닐]-L-글루탐산, 3-[N',N"-비스(2-tert-부틸옥시카보닐아미노에틸)구아니디노]-N,N-디옥타덱-9-에닐프로피온아미드, 3-[N',N"-비스(2-tert-부틸옥시카보닐아미노에틸)구아니디노]-N,N-디팔미틸프로피온아미드, 3-[N',N"-비스(2-tert-부틸옥시카보닐아미노에틸)구아니디노]-N,N-디미리스틸프로피온아미드, 1,4-비스[(3-(3-아미노프로필)-팔미틸아미노)프로필]피페라진, 1,4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-올레일아미노)프로필]피페라진, N,N-(2-히드록시-3-아미노프로필)-N-2-히드록시프로필-3-N,N-디올레일아미노프로판, N,N-(2-히드록시-3-아미노프로필)-N-2-히드록시프로필-3-N,N-디팔미틸아미노프로판, N,N-(2-히드록시-3-아미노프로필)-N-2-히드록시프로필-3-N,N-디미리스틸아미노프로판, 1,4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-미리스틸아미노)프로필]피페라진, [(3-아미노프로필)-비스-(2-테트라데실옥시에틸)]메틸 암모늄 브로마이드, [(3-아미노프로필)-비스-(2-올레일옥시에틸)]메틸 암모늄 브로마이드, [(3-아미노프로필)-비스-(2-팔미틸옥시에틸)] 메틸 암모늄 브로마이드, 올레오일-2-히드록시-3-N,N-디메틸아미노프로판, 2-디데카노일-1-N,N-디메틸아미노프로판, 팔미토일-2-히드록시-3-N,N-디메틸아미노프로판, 1,2-디팔미토일-1-N,N-디메틸아미노프로판, 미리스토일-2-히드록시-3-N,N-디메틸아미노프로판, 1,2-디미리스토일-1-N,N-디메틸아미노프로판, (3-아미노-프로필)->4-(3-아미노-프로필아미노)-4-테트라데실카바모일-부틸카밤산 콜레스트릴 에스테르, (3-아미노-프로필)->4-(3-아미노-프로필아미노-4-카바모일부틸카밤산 콜레스트릴 에스테르, (3-아미노-프로필)-> 4-(3-아미노-프로필아미노)-4-(2-디메틸아미노-에틸카바모일)-부틸카밤산 콜레스트릴 에스테르, 스퍼민-5-카복시글리신(N'-스테아릴-N'-올레일)아미드 테트라트리플루오로아세트산 염, 스퍼민-5-카복시글리신(N'-스테아릴-N'-엘라이딜)아미드 테트라트리플루오로아세트산 염, 아그마티닐 카복시콜레스테롤아세트산 염, 스퍼민-5-카복시-β-알라닌 콜레스테릴 에스테르 테트라트리플루오로아세트산 염, 2,6-디아미노헥사노오일 β-알라닌콜레스테릴에스테르비스트리플루오로아세트산 염, 2,4-디아미노부티로일 β-알라닌 콜레스테릴 에스테르 비스트리플루오로아세트산 염, N,N-비스(3-아미노프로필)-3-아미노프로피오닐 β-알라닌 콜레스테릴 에스테르 트리스트리플루오로아세트산 염, [N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에틸]아미노카복시 콜레스테릴 에스테르, 스테아릴 카르니틴 에스테르, 팔미틸 카르니틴 에스테르, 미리스틸 카르니틴 에스테르, 스테아릴 스테아로일 카르니틴 에스테르염화물, L-스테아릴 스테아로일 카르니틴 에스테르, 스테아릴 올레오일 카르니틴 에스테르 클로라이드, 팔미틸 팔미토일 카르니틴 에스테르 클로라이드, 미리스틸 미리스토일 카르니틴 에스테르 클로라이드, L-미리스틸 미리스토일 카르니틴 에스테르 클로라이드, 1,4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-팔미틸아미노)프로필]피페라진, N-(3-아미노프로필)-N,N'-비스-(도데실옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N,N'-비스-(올레일옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N,N'-비스-(팔미틸옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N,N'-비스-(미리스틸옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N'-메틸-N,N'-(비스-2-도데실옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N'-메틸-N,N'-(비스-2-올레일옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N'-메틸-N,N'-(비스-2-팔미틸옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N'-메틸-N,N'-(비스-2-미리스틸옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드. 상기 조성물 및 방법에 유용한 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린(DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디운데카노일-sn-글리세로-포스포콜린(DUPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디-O-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:0 디에테르 PC), 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린(C16 Lyso PC), 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(ME 16.0 PE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤)나트륨염(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민(SOPE), 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜콜린(SOPC), 스핑고미엘린, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딘산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민(LPE),
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
으로 이루어진 비제한적 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 RNA 전달제는 하나 이상의 중성 또는 하전되지 않은 지질을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 실시형태에 유용한 중성 지질은 예를 들어 콜레스테롤, 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 및 디피타노일포스파티딜에탄올아민(DDhPE) 페코스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 토마티딘, 토마틴, 우르솔산, 알파-토코페롤 또는 이들의 조합물을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 RNA 전달제는 지질/RNA 입자의 응집을 억제하는 하나 이상의 제제를 포함할 수 있다. 지질/RNA 입자의 응집을 억제하는 예시적인 작용제는 예를 들어 문헌[Fiedl, et al. (2020) Nanomedicine 15(19), 1829-1841]에 기술된 바와 같은 PEG 지질, 또는 PEG화된 지질, 또는 폴리글리세랄 지질을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 RNA 전달제는 하나 이상의 PEG 지질을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "PEG 지질" 또는 "PEG화된 지질"은 폴리에틸렌 글리콜 성분을 포함하는 지질을 의미한다. PEG 지질은 PEG-변형 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형 포스파티딘산, PEG-변형 세라마이드(PEG-CER), PEG-변형 디알킬아민, PEG-변형 디아실글리세롤(PEG-DEG), PEG-변형 디알킬글리세롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 비제한적 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, PEG 지질은 PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC 또는 PEG-DSPE 지질일 수 있다.
RNA는 번역될 세포로 세포내로 형질감염될 수 있다. 형질감염 방법은 당업자에게 알려져 있고, 미세주입, 전기천공, 형질감염, 화학적 처리 등을 포함한다. 일부 양태에서, 본원에서 제공된 RNA 조성물은 시험관내에서 세포로 전달된다. 일부 양태에서, 본원에서 제공된 RNA 조성물은 mRNA의 세포로의 생체외 전달을 위해 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 본원에서 제공된 RNA 조성물은, 예를 들어 mRNA 백신 등의 맥락에서, mRNA의 세포로의 생체내 전달을 위해 사용될 수 있다. 생체내 번역에 사용하기 위한 세포는 관심 단백질을 발현하고자 하는 임의의 환자 세포를 포함한다. 본원에 개시된 실시형태에 유용한 세포의 비제한적 예는 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 대식세포 등), 간 세포, 폐 세포, 췌장 세포, 골수 세포, 조직 배양 세포, 생식 세포, 줄기 세포 예컨대 유도된 만능 줄기 세포(iPSC), 인간 배아 줄기 세포(hESC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 지방(adipose)-유도된 줄기 세포(ADSC) 등을 포함한다.
사용하기에 적합한 염료는 당업자에게 알려져 있고, 쿠마린, 시아닌, 벤조푸란, 퀴놀린, 퀴나졸리논, 인돌, 벤자졸, 보라폴리아자인다센 및 잔텐, 예컨대 플루오레세인, 로다민 및 로돌, 뿐만 아니라 문헌[RICHARD P. HAUGLAND, MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS((11th edition, January 2010)]에 기술된 다른 염료도 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 형광 염료는, 제한 없이, 하기 화합물들을 포함한다: 피렌(미국 특허 제5,132,432호 및 제8,039,642호에 개시된 상응하는 유도체 화합물 중 임의의 것 포함), 안트라센, 나프탈렌, 아크리딘, 스틸벤, 인돌 또는 벤즈인돌, 옥사졸 또는 벤족사졸, 티아졸 또는 벤조티아졸, 4-아미노-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸(NBD), 시아닌(미국 특허 제6,977,305호, 제6,974,873호, 제6,664,047호, 제4,981,977호, 제5,268,486호, 제5,569,587호, 제5,569,766호, 제5,486,616호; 제5,627,027호; 제5,808,044호; 제5,877,310호; 제6,002,003호; 제6,004,536호; 제6,008,373호; 제6,043,025호; 제6,127,134호; 제6,130,094호; 제6,133,445호; 제7,446,202호; 제7,598,390호; 제7,776,529호; PCT 국제공개 WO 02/26891호, WO 97/40104호, WO 99/51702호, WO 01/21624호, WO 2018/085449호; 및 유럽 특허출원 공개 제1 065 250 A1호에 기재된 임의의 상응 화합물 포함), 벤조시아닌(미국 특허 제9,249,307호; 제9,751,868호; 제10,000,467호; 제10,053,447호; 제10,125,120호; 제10,351,551호; 제10,526,317호 및 미국 특허출원공개 US 2017/0158858호에 기재된 임의의 상응 화합물 포함); 카보스티릴, 포피린, 살리실레이트, 안트라닐레이트, 아줄렌, 페릴렌, 피리딘, 퀴놀린, 보라폴리아자인다센(미국 특허 제4,774,339호; 제5,187,288호; 제5,248,782호; 제5,274,113호; 및 제5,433,896호에 개시된 임의의 상응 화합물 포함), 잔텐(미국 특허 제6,162,931호; 제6,130,101호; 제6,229,055호; 제6,339,392호; 제5,451,343호 및 제6,716,979호에 개시된 임의의 상응 화합물 포함), 옥사진(미국 특허 제4,714,763호에 개시된 임의의 상응 화합물 포함) 또는 벤족사진, 카바진(미국 특허 제4,810,636호에 개시된 임의의 상응 화합물 포함), 페날레논, 쿠마린(미국 특허 제5,696,157호, 제5,459,276호, 제5,501,980호 및 제5,830,912호에 개시된 상응 화합물 포함), 벤조푸란(미국 특허 제4,603,209호 및 제4,849,362호에 개시된 상응 화합물 포함) 및 벤즈페날레논(미국 특허 제4,812,409호에 개시된 임의의 상응 화합물 포함) 및 이들의 유도체. 본원에 사용된 "옥사진"은 레소루핀(미국 특허 제5,242,805호에 개시된 임의의 상응 화합물 포함), 아미노옥사지논, 디아미노옥사진 및 이들의 벤조-치환된 유사체를 포함한다.
염료가 잔텐인 경우, 염료는 선택적으로 플루오레세인, 로돌(미국 특허 제5,227,487호 및 제5,442,045호에 개시된 임의의 상응 화합물 포함) 또는 로다민(미국 특허 제5,798,276호; 제5,846,737호; 제6,562,632호; 제7,256,292호; 제7,985,602호; 제8,729,267호; 제9,040,674호; 제9,315,859호; 제9,745,336호; 제9,783,560호; 제9,790,544호; 제10,131,936호에 개시된 상응 화합물 포함)이다.
전형적으로 형광 염료는 하나 이상의 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 함유하고, 이는, 비제한적으로 할로겐, 니트로, 시아노, 알킬, 퍼플루오로알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴알킬, 아실, 아릴 또는 헤테로아릴 고리 시스템, 벤조, 또는 당업계에 알려진 형광 염료 상에 전형적으로 존재하는 다른 치환기를 포함하는 다양한 치환기에 의해 1회 이상 선택적으로 치환된다.
캡들/캡 유사체 및 프로모터
본원에서는, (1) RNA 캡 및 캡 유사체 및 (2) 프로모터가 작용하여 캡핑된 RNA, 예컨대 메신저 RNA(mRNA)를 생성하는 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 예에서, 이들 조성물 및 방법은, 캡핑된 RNA의 생성을 가능하게 하는 방식으로 특정 프로모터(예를 들어, 변형된 천연 프로모터)와 상호작용하는 mRNA 캡 또는 캡 유사체에 관한 것이다.
일부 경우, 본원에서 제공된 조성물 및 방법은, 높은 캡핑 효율로 mRNA의 고수율 생성을 달성하는 방식으로 상호작용하도록 설계될 것이다. 본원에서 사용된 "mRNA의 고수율 생성"은 3 mg/ml(60 μg/20 μl) 이상의 RNA를 의미한다. 본원에서 사용된 "RNA 캡핑 효율"은 조성물에 존재하는 캡 함유 RNA의 백분율을 의미한다. 예로서, 캡핑되지 않은 RNA 분자 집단이 이들 분자에 캡 또는 캡 유사체를 첨가하는 과정을 거치는 경우, 캡핑 효율은 생성 조성물에서의 캡 함유 RNA 분자의 백분율에 의해 결정될 것이다. 유사하게, 캡핑된 mRNA가 전사에 의해 형성되는 경우, 캡핑 효율은 역시 생성 조성물에서의 캡 함유 RNA 분자의 백분율로 결정될 것이다. 높은 캡핑 효율은, 캡핑되지 않은 RNA 분자(예를 들어, 표적 RNA 분자)에 대한 캡핑된 RNA 분자(예를 들어, 표적 RNA 분자)의 백분율이 70% 이상(예를 들어, 약 75% 내지 약 99%, 약 80% 내지 약 99%, 약 85% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 99%, 약 95% 내지 약 99%, 약 75% 약 95% 내지 약 75% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 75% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 95% 내지 약 100% 등)인 RNA 집단(population)의 생성을 의미한다. 용어 "표적 RNA 분자"는 캡핑 공정의 원하는 대상인 RNA 분자를 지칭한다. 예를 들어, 커플링된 전사/번역 시스템이 사용되는 경우, 번역을 위해 존재하는 리보솜 RNA 분자는 "표적 RNA 분자"로 간주되지 않는다. 달리 말하면, 캡핑 효율은, 반응 혼합물 내의 다른 RNA 분자는 포함하지 않는, 캡핑되도록 의도된 RNA 분자(예를 들어, 특정 단백질을 코딩하는 RNA 분자)와 관련된 것이다.
도 15는 예시적인 7-메틸구아노신 트리뉴클레오티드 캡 유사체의 구조를 나타내며, 이는 본원에 기술된 많은 경우에 캡핑된 프라이머로서 기능할 수 있다. 이 캡 유사체 개략도는 염기가 B1 및 B2에 위치할 수 있는 위치를 나타낸다. 이 캡 유사체의 3개 염기는 동그라미 숫자 ①, ② 및 ③으로 표지되어 있다. 물론, 임의의 수의 캡 유사체 변형이 조성물에 존재할 수 있고, 본원에 기술된 방법에 사용될 수 있다.
캡 및 캡 유사체들은 뉴클레오티드 서열 면에서 실질적으로 다를 수 있다. 설명의 목적으로, 도 15에 제시된 캡 유사체 구조를 사용하면, 동그라미 숫자 ①로 표지된 첫 번째 염기는 일반적으로 G일 것이다. 동그라미 숫자 ② 및 ③으로 표지된 다른 두 염기는 일반적으로, 전사가 요구되는 반응 혼합물 내의 핵산 분자의 개시 부위에서 하나 이상의 염기에 대해 상보적일 것이다. 또한, 개시 부위는, 예를 들어 도 16에서 표시된 위치와 다를 수 있다.
하나의 예시적인 캡핑된 프라이머의 뉴클레오티드 서열이 도 19에 GAG로서 도시되어 있다. 이 캡핑된 프라이머의 이 AG 부분(캡 유사체 위치 2 및 3)은 도시된 주형 가닥의 개시 영역의 -1 및 +1 위치에 대해 상보적이다. 이 경우, 개시 영역의 -1 및 +1 위치는 본원에서 개시 부위로 지칭된다. 예시적인 캡핑된 프라이머 뉴클레오티드 서열 및 이들이 상보적인 개시 부위가 표 3에 제시되어 있다.
Figure pct00074
본원에서 제시된 조성물에 함유될 수 있고 본원에서 제시된 방법에 사용될 수 있는 RNA 캡 및 캡 유사체는 본원에서 제시된 것을 포함하고, 구체적으로는 시판되는 삼량체 캡 및 캡 유사체, 예를 들어 TriLink Biotechnologies (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 판매하는 것들(예를 들어, CLEANCAP® Reagent GG, 카탈로그 번호 N-7133; CLEANCAP® Reagent AU, 카탈로그 번호 N-7114; CLEANCAP® Reagent GG (3' OMe), 카탈로그 번호 N-7433; CLEANCAP® Reagent AG (3' OMe), 카탈로그 번호 N-7413; 및 CLEANCAP® Reagent AG, 카탈로그 번호 N-7113)을 포함한다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 3개 초과의 뉴클레오티드를 함유하는 캡핑된 프라이머가 본원에 기재된 발명 주제의 실시에 사용될 수 있다. 이러한 캡 및 캡 유사체는 약 3개 내지 약 20개(예를 들어, 약 3개 내지 약 19개, 약 3개 내지 약 18개, 약 3개 내지 약 15개, 약 3개 내지 약 12개, 약 3개 내지 약 10개, 약 3개 내지 약 8개, 약 3개 내지 약 6개, 약 3개 내지 약 4개, 약 4개 내지 약 10개, 약 4개 내지 약 8개 등)의 염기를 함유할 수 있다. 또한, 이러한 캡 및 캡 유사체는 프로모터 개시 부위의 주형 가닥에 대해 서열 상보성을 가질 수 있다.
도 16은 T7, T3, SP6 및 K11 파지의 4개의 박테리오파지 프로모터의 비교를 보여준다. 도 16에 도시된 각각의 박테리오파지 프로모터는 길이가 19개의 뉴클레오티드이고, -4 내지 +6 위치에 있는 10개의 뉴클레오티드 개시 영역을 포함한다. 뉴클레오티드 +1 내지 +6은, 본원에서, 전형적으로 +1 위치에서 개시가 시작하는 전사 개시 영역으로 지칭된다. 박테리오파지 프로모터에서 +1 위치는 G로 보존되고 +2 내지 +5 위치는 퓨린(A 및 G)으로 보존된다. 따라서 피리미딘(T 및 C)은 일반적으로 이러한 위치에서 발견되지 않는다. 또한, 도 16은 -1 내지 +5 위치에 단지 퓨린 염기만 존재함을 보여준다. 또한, +6 위치에 퓨린(즉, C)을 함유하는 것으로 도시된 프로모터는 유일하게 K11 프로모터이다.
프로모터의 -5 내지 -12 위치는 단백질의 카복실 말단 근처에 위치한 T7 RNA 중합 효소 구조 도메인과 상호 작용한다. AT 풍부 영역(-17 내지 -13 위치)은 단백질의 아미노 말단 근처에 위치한 T7 RNAP 구조 도메인과 상호 작용할 것으로 여겨진다.
도 17은 전사 개시 영역 또는 그 근처에서 서열 상보성을 갖도록 설계된 3개의 상이한 캡을 보여준다. CAP1은 전사 개시 영역의 +1 위치에 대한 서열 상보성을 갖는 디뉴클레오티드 캡이다. CAP2는 전사 개시 영역의 -1 및 +1 위치에 대한 서열 상보성을 갖는 트리뉴클레오티드 캡이다. CAP3은 전사 개시 영역의 +1 및 +2 위치에 대한 서열 상보성을 갖는 트리뉴클레오티드 캡이다.
문헌[Ishikawa et al., "Preparation of eukaryotic mRNA having differently methylated adenosine at the 5'-terminus and the effect of the methyl group in translation", Nucleic Acids Symposium Series No. 53, pages 129130 Oxford University Press (2009)]을 참조하면, 도 17에 도시된 CAP2와 유사한 여러 상이한 mRNA 캡을 사용하여 연구를 수행하였으며, 이들 캡이 주형 +1 및 +2 위치에서 2'-데옥시시티딘 잔기로 주형 상에서 전사를 개시할 수 있음을 보여주었다("CC" template; 문헌[Nucleic Acids Symposium Series No. 53: 129 (2009)]). 저자는 "m7G5'pppG를 사용한 경우와 상이한 결과는 m7G5'pppN1pG 내의 추가적인 아데노신(N1)과 -1 위치에 있는 T7 프로모터 내의 2'-데옥시티미딘 사이의 염기쌍으로부터 야기된 것일 수 있다"고 언급했다.
도 18은 도 17과 유사하지만, 개시 영역의 +1 위치에 있는 염기쌍이 G/C에서 A/T로 변경되었다. 역시, CAP4, CAP5 및 CAP2는 그들의 동족 상보성 혼성화 개시 서열 위에 위치한다.
도 19는 도 17 및 18과 유사하지만, 단지 단일 mRNA 캡인 CAP2, 및 -1 및 +1 위치에서의 이의 동족 상보적 혼성화 개시 서열을 도시한다. 또한, 개시 영역은, 개시 영역에 혼성화된 캡의 2개의 염기 중 어느 것도 -2 및 +2 위치에서 바로 옆에 있는 염기에 대해 상보적이지 않도록 구조화되어 있다.
다수의 프로모터 및 변형된 프로모터가 본원에서 제공된 조성물에 존재할 수 있고 본원에서 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 도 16의 개략도를 참고로 사용하면, 본원에서 제공된 조성물에 존재하고 본원에서 제공된 방법에 사용되는 프로모터는 야생형 프로모터일 수 있거나 임의의 방식으로 변형된 것일 수 있다. 이러한 변형은 (1) 5' 및 3' 절단(truncation) 및/또는 (2) 내부 치환 및/또는 결실(deletion)이 포함된다.
-1 또는 +1 위치에서의 전사 개시를 원하는 경우, 그러한 개시를 용이하게 하도록 프로모터를 설계할 수 있다. 예를 들어, 트리뉴클레오티드 캡핑된 프라이머가 -1 위치에서의 개시를 위해 사용되는 경우, TATY1 Y2Z의 비-주형 가닥 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터가 사용될 수 있으며, 여기서 Y1은 -1 위치에 있고, Y2는 +1 위치에 있고, Z는 개시 부위의 +1 말단에 "인접한" +2 위치에 있다. "인접한"은 염기가 개시 부위 전 및/또는 후에 첫 번째 염기로서 위치함을 의미한다. 또한, 트리뉴클레오티드 캡핑된 프라이머가 +1 위치에서 개시에 사용되는 경우, TATA Y1Y2Z의 비-주형 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터가 사용될 수 있으며, 이 경우, Y1 및 Y2는 트리뉴클레오티드 캡핑된 프라이머의 두 번째 및 세 번째 염기와 동일한 염기이다. 따라서, 주형 가닥은 트리뉴클레오티드 캡핑된 프라이머의 염기에 상보적인 Y1 및 Y2에 해당하는 위치에 염기들을 포함할 것이다. 또한, Z는 전사 차단 뉴클레오티드 (이의 염기는 독립적으로 A, T 또는 C일 수 있음)뿐만 아니라 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다.
예시로서, GAG 프라이머가 -1 위치에서 개시를 위해 사용되는 경우, 적합한 프로모터는 하기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 포함한다: (1) 5'-TATA GA-3', (2) 5'-TATA GT-3', 및 (3) 5'-TATA GC-3'.
+2 위치에서의 전사 개시를 원하는 경우, 그러한 개시를 용이하게 하도록 프로모터가 또한 설계될 수 있다. 예를 들어, 트리뉴클레오티드 캡핑된 프라이머가 개시에 사용되는 경우, TATA X1Y1Y2X2의 비-주형 가닥 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터가 사용될 수 있으며, 여기서 (+2 및 +3 위치에 위치된) Y1 및 Y2은 트리뉴클레오티드 캡핑된 프라이머의 두 번째 및 세 번째 염기와 동일하다. 또한, X1 및 X2는 (+1 및 +4 위치에 위치된) 전사 차단 뉴클레오티드(이의 염기는 독립적으로 A, T 또는 C일 수 있음)이거나 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다. 이 문맥에서, Y1은 +2 위치에 있고, Y2는 +3 위치에 있으며, +1 및 +4 위치에 있는 X1 및 X2는 +2/+3 개시 부위의 각각의 말단에 "인접한" 것으로 언급된다. 추가로, 일부 경우에, X1은 전사 차단 뉴클레오티드 일 수 있고, X2는 전사 차단 뉴클레오티드가 아니다.
예시로서, GAG 프라이머가 +2 위치에서 전사 개시에 사용되는 경우, 적합한 프로모터는 하기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 포함한다: (1) 5'-TATA TAGA-3', (2) 5'-TATA TAGT-3', (3) 5'-TATA TAGC-3', (4) 5'-TATA AAGA-3', (5) 5'-TATA AAGT-3', (6) 5'-TATA CAGC-3'및 (7) 5'-TATA CAGA-3'.
자연적인 +1 전사 개시 위치 이외의 위치에서 전사 개시가 일어나는 RNA의 생성을 위한 조성물 및 이러한 조성물을 사용하는 방법이 본원에서 제공된다. 예를 들어 -2/-1, -1/+1, +2/+3, -1/+1/+2, -1/+1/+2/+3 또는 +2/+3/+4 위치에서 개시가 발생할 수 있다. 많은 경우에, 염기 A, T 또는 C는 개시 부위의 한쪽 또는 양쪽 말단에 인접한 한쪽 또는 양쪽 위치에 위치할 수 있다. 또한, 상이한 전사 개시 차단 뉴클레오티드가 동일한 위치에 위치할 수도 있다.
또한, 3개 이상의 뉴클레오티드(예를 들어, 약 3개 내지 약 10개, 약 3개 내지 약 8개, 약 3개 내지 약 7개, 약 3개 내지 약 5개, 약 3개 내지 약 4개, 약 4개 내지 약 8개의 뉴클레오티드 등)를 포함하는 다량체 캡핑된 프라이머, 및 주형 가닥이 상기 캡핑된 프라이머의 염기에 상보적인 전사 개시 부위를 포함하는 프로모터를 포함하는 조성물 및 이러한 조성물을 사용하는 방법이 본원에서 제공된다. 많은 경우에, 캡핑된 프라이머는 +1/+2 위치와 다른 위치에 또는 +1/+2 위치에 더하여 추가의 위치에 위치한 전사 개시 부위로 혼성화하도록 설계될 것이다. 많은 추가적인 경우에, 염기 A, T 또는 C는 개시 부위에 인접한 위치(예를 들어, +2/+3 개시 부위가 사용될 때 +1 및 +4 위치) 중 하나 또는 둘 모두에 위치할 것이다. 삼량체 캡, 및 위치 +3의 염기가 A, T 또는 C인 +1/+2 전사 개시 부위를 포함하는 프로모터를 포함하는 조성물, 및 이러한 조성물을 사용하는 방법이 추가로 본원에서 제공된다.
추가로, 3개 초과의 뉴클레오티드 길이를 사용하는 캡핑된 프라이머를 사용한 전사 개시용 조성물 및 이러한 조성물을 사용하는 방법이 본원에서 제공된다. 예시적인 사량체 캡핑된 프라이머의 프라이머는 뉴클레오티드 서열 GAGG를 갖는다. 이 캡핑된 프라이머가 +1/+2/+3 위치에서 전사를 개시하는 데 사용되는 경우, 전사 개시에 사용되는 프로모터는 하기 뉴클레오티드 서열 중 하나를 포함할 수 있다: (1) 5'-TATA AGGA-3', (2) 5'-TATA AGGT-3', (3) 5'-TATA AGGC-3', (4) 5'-TATA GAGGT-3', (5) 5'-TATA GAGGA-3', 및 (6) 5'-TATA GAGGC-3'.
일부 양태에서, 전사 개시 부위의 가까이에 전사 개시 차단 뉴클레오티드를 함유하는 프로모터가 본원에서 제공된다. "전사 개시 차단 뉴클레오티드"는 그들이 위치한 위치에서 전사 개시에는 바람직하지 않은 뉴클레오티드이다. 예를 들어, T7 RNA 중합 효소 프로모터와 관련하여, 비-주형 가닥 내에 염기 티민을 사용하여, GAG 캡핑된 프라이머가 RNA 캡핑에 사용되는 경우, +2 위치에 위치할 때 서열 AG에 의해 진행되는 캡핑 효율을 증가시킬 수 있다. 이 경우 +2 위치의 티미딘이 전사 개시 차단 뉴클레오티드이다.
전사 개시 차단 뉴클레오티드는, 원하는 개시 부위에서 전사 개시에 유의적으로는 영향을 미치지 않으면서 전사 개시에 불리한 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 전사 개시 차단 뉴클레오티드는 사용되는 프로모터, 캡핑된 프라이머, 및 반응 조건과 조합되어 작용한다. 일부 경우에, 전사 개시 차단 뉴클레오티드는 데옥시티미딘, 티미딘, 시티딘, 아데노신, 구아노신, 및/또는 우리딘일 수 있다. 전사 개시 차단 뉴클레오티드는 또한 화학적으로 변형된 것일 수 있다. 또한, 그러한 화학적 변형은 염기, 당, 포스페이트 결합, 또는 이들의 조합에 의한 것일 수 있다.
전사 개시 차단 뉴클레오티드의 사용은 캡핑 효율을 적어도 20%(예를 들어, 약 20% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 180%, 약 20% 내지 약 150%, 약 20% 내지 약 120%, 약 20% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 150%, 약 30% 내지 약 60% 등) 증가시킬 수 있다. 증가된 캡핑 효율을 측정하기 위한 하나의 예시적인 검정은 2개의 상이한 조건 하에서 캡핑 효율을 비교하는 것이다. 이러한 예시적인 조건 하에서 GAG 캡핑된 프라이머를 사용하여 2개의 상이한 프로모터로 캡핑된 mRNA를 생성한다. 하나의 프로모터의 비-주형 가닥은 뉴클레오티드 서열 TATA AGG를 포함하고, 다른 프로모터는 뉴클레오티드 서열 TATA AGT를 포함한다(양자의 차이점은 +2 위치에 T가 존재한다는 것임).
전사 개시 차단 뉴클레오티드는 많은 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 이에 따라, 전사 개시 차단 뉴클레오티드의 위치와 수는 다양할 수 있다. 예를 들어, 하나 초과(예를 들어, 1, 2, 3개 등)의 전사 개시 차단 뉴클레오티드가 전사 개시 부위의 한쪽 또는 양쪽 말단에 인접할 수 있다. 하나의 예시적인 프로모터 서열은 5'-TATA TAGTT-3'이며, 이때 AG가 개시 부위이다. 이 경우, 하나의 전사 개시 차단 뉴클레오티드는 개시 부위의 5' 말단에 인접하고 2개의 전사 개시 차단 뉴클레오티드는 개시 부위의 3' 말단에 인접한다.
전사 반응 혼합물
캡핑된 mRNA 수율 및 캡핑 효율에 영향을 미칠 수 있는, RNA 분자에 대한 캡 및 캡 유사체 및 프로모터 이외의 추가되는 변수는, RNA 생성 공정(예를 들어, mRNA 생성 공정)에 사용되는 반응 혼합물의 조성을 포함한다.
캡핑된 프라이머를 사용하여 캡핑된 mRNA를 생성하기 위한 일부 종래 방법은, 존재하는 GTP의 양이 캡 및 나머지 3개의 NTP의 양보다 적은 시약 혼합물을 사용한다. 그 이유는, G로써 +1 위치에서 전사를 시작하는 이량체 캡의 경우 고농도의 GTP가 사용되면 GTP가 Kd(2 mM)에 가까운 NTP 농도에서 +1 뉴클레오티드로부터 개시를 하는 이량체 캡과 효율적으로 경쟁하여 pppG로 시작하는 많은 양의 RNA를 생성하기 때문이다. GTP 농도를 낮추면 캡핑 효율이 높아지지만, 캡핑된 mRNA 수율도 낮아진다. 높은 수율 및 높은 캡핑 효율 둘 다로 캡핑된 RNA 분자의 생성을 위한 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다.
본원에서 제공된 일부 양태는, 존재하는 RNA 분자의 높은 백분율이 캡핑되는(즉, 높은 캡핑 효율을 갖는) mRNA 집단의 생성에 기여하는 IVT 반응 혼합물에 관련된 것이다. 일부 양태에서, 본원에서 제시된 IVT 반응 혼합물 및 방법은 RNA의 고수율 생성을 제공하도록 설계될 수 있다. 추가 양태에서, 본원에 기재된 IVT 반응 혼합물 및 방법은 높은 캡핑 효율 및 높은 수율의 RNA 생성을 제공하도록 설계될 수 있다.
높은 캡핑 효율 및 높은 수율의 RNA 생성을 제공하기 위해 사용될 수 있는 반응 혼합물은, 예를 들어 mRNA의 생성을 향상시키고/시키거나 반응 혼합물에 존재하는 RNA를 안정화시키고/시키거나 번역 증가 또는 면역원성 감소를 위해 설계된 화학적으로 변형된 RNA 성분을 포함할 수 있다.
IVT 반응 혼합물은 일반적으로 하기 성분을 함유할 것이다: (1) 하나 이상의 RNA 중합 효소, (2) 하나 이상의 캡(예를 들어, 하나 이상의 캡핑 프라이머), (3) 모두 4개의 표준 뉴클레오티드 트리포스페이트(즉, GTP, ATP, CTP 및 UTP), 및 (4) 하나 이상의 핵산 주형(예를 들어, 하나 이상의 DNA 주형, 하나 이상의 RNA 주형, 하나 이상의 DNA 주형과 하나 이상의 RNA 주형의 조합물, 등).
본원에서 제시된 방법에 사용되는 IVT 반응 혼합물은 또한 하기 성분 중 하나 이상을 함유할 수 있다: (1) 하나 이상의 완충제(예를 들어, 포스페이트, 히스티딘, 시트레이트, 말레에이트, 타트레이트, 아세테이트, 트리스-(히드록시메틸)-아미노메탄(트리스), 및 비카보네이트 등), (2) 하나 이상의 2가 금속 이온(예를 들어, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Co2+, Ni2+ 등), (3) 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 트리포스페이트(예를 들어, 슈도우리딘(ψ) 트리포스페이트, 1-메틸슈도우리딘(m1ψ) 트리포스페이트, 5-메톡시우리딘(mo5U) 트리포스페이트, 5-메틸시티딘(m5C) 트리포스페이트, α-티오-구아노신 트리포스페이트, α-티오-아데노신 트리포스페이트 등), (4) 하나 이상의 폴리아민(예를 들어, 스퍼미딘, 스퍼민, 트리스(2-아미노에틸)아민, 디에틸렌트리아민 등), (5) 하나 이상의 환원제(예를 들어, DTT(2,3 디히드록시부탄-1,4-디티올/"디티오트레이톨"이라고도 함), DTE(2,3 디히드록시부탄-1,4-디티올), 티오글리콜레이트, 시스테인, 설파이트, 비설파이트, 설파이드, 비설파이드, TCEP(트리스(2-카복시에틸)포스핀), 2-머캅토에탄올 등), (6)하나 이상의 비이온성 세제(예를 들어, 옥틸 페녹시폴리에톡시에탄올(nonidet P-40)); 폴리옥시에틸렌 글리콜 소르비탄 알킬 에스테르, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80; 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 블록 공중합체(폴록사머(Poloxamer)), 예컨대 폴록사머 407; 폴리에톡실화 탈로우 아민(POEA) 염; 노녹시놀, 예컨대 노녹시놀(Nonoxynol)-9; 트리톤(Triton) X-100; 트윈(Tween) 80 등), (7) 하나 이상의 크라우딩제(crowding agent)(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란 및 피콜 등) 및/또는 (8) 하나 이상의 RNAse 억제제(예를 들어, 하나 이상의 바나딜 리보뉴클레오시드 복합체(VRC), 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체, SUPERASE-IN™(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 AM2696), RNASEOUT ™(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 10777019), 무기 피로포스파타제(예를 들어, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 EF0221) 등).
IVT 반응 혼합물에 존재하는 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 캡 유사체의 농도는 다양할 수 있다. 일부 실시형태에서, NTP 및 캡 유사체는 등몰 농도로 반응에 존재한다. 일부 실시형태에서, 반응에서 캡 유사체(예를 들어, 트리뉴클레오티드 캡) 대 뉴클레오시드 트리포스페이트의 몰비는 1 초과:1이다. 예를 들어, 반응에서 캡 유사체 대 임의의 하나의 뉴클레오시드 트리포스페이트(예를 들어, ATP)의 몰비는 약 1.1:1 내지 약 25:1, 약 2:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 25:1, 약 5:1 내지 약 25:1, 약 1.1:1 내지 약 15:1, 약 2:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 15:1, 약 6:1 내지 약 15:1, 약 8:1 내지 약 15:1, 약 1.1:1 내지 약 10:1, 약 2:1 내지 약 10:1, 약 3:1 약 10:1 내지 약 4:1 내지 약 10:1, 또는 약 2:1 내지 약 6:1일 수 있다. 많은 경우에, 반응에서 캡 유사체 대 임의의 하나의 뉴클레오시드 트리포스페이트(예를 들어, ATP)의 몰비는 약 1:1 내지 약 10:1(예를 들어, 약 1.5:1 내지 약 8:1, 약 2:1 내지 약 8:1, 약 2:1 내지 약 6:1, 약 2:1 내지 약 5:1, 약 1.5:1 내지 약 5:1, 약 2:1 내지 약 4:1 등)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 반응에서 캡 유사체 (예를 들어, 트리뉴클레오티드 캡) 대 임의의 하나의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 몰비는 1 미만:1이다. 예를 들어, 캡 유사체(예를 들어, 트리뉴클레오티드 캡) 대 뉴클레오시드 트리포스페이트의 몰비는 약 1:1.1 내지 약 1:25, 약 1:2 내지 약 1:25, 약 1:4 내지 약 1:25, 약 1:5 내지 약 1:25, 약 1:1.1 내지 약 1:10, 약 1:2 내지 약 1:10, 약 1:4 내지 약 1:10, 약 1:2 내지 약 1:6, 또는 약 1:3 내지 약 1:6 일 수 있다.
IVT 반응에 존재하는 개별 NTP(예를 들어, "표준" NTP(ATP, UTP, CTP, GTP))의 농도도 다양할 수 있다. 또한, 이러한 변동은 캡 뉴클레오티드 서열, 개시 부위 서열 및/또는 "비표준" NTP(예를 들어, 슈도우리딘(ψ) 트리포스페이트, 1-메틸슈도우리딘(m1ψ) 트리포스페이트, 5-메톡시우리딘(mo5U) 트리포스페이트 등)의 존재와 같은 인자에 기인될 수 있다.
예시를 위해, IVT 반응에 이량체 캡이 사용되는 경우, 개시 부위의 +1 위치에서 혼성화될 수 있는 NTP의 농도는 반응 혼합물 내의 다른 NTP보다 낮을 수 있다. 따라서, 3개의 표준 NTP가 등몰량으로 존재하고 1개의 표준 NTP가 더 적은 양으로 존재하는 조성물 및 방법이 본원에서 제공된다. 특정 예시를 위해 도 17의 프로모터 서열을 사용하면, 주형 가닥의 +1 위치에 있는 염기는 C이다. 따라서 일부 그러한 경우에, IVT 반응 혼합물은 등몰량의 ATP, UTP, 및 CTP를 포함하지만 GTP의 양은 더 적다. 또한, 3개의 다른 NTP 대 GTP의 비율은 약 1:0.1 내지 약 1:0.95(예를 들어, 약 1:0.1 내지 약 1:0.9, 약 1:0.2 내지 약 1:0.9, 약 1:0.25 내지 약 1:0.9, 약 1:0.3 내지 약 1:0.9, 약 1:0.4 내지 약 1:0.9, 약 1:0.2 내지 약 1:0.7, 약 1:0.25 내지 약 1:0.6, 약 1:0.15에서 약 1:0.6 등)일 수 있다. 또한, 예를 들어 이량체 캡에 뉴클레오티드 서열 G-A가 있는 경우, 전사 반응 혼합물에 존재하는 ATP의 양은 다른 3개의 NTP보다 적을 수 있다.
일부 경우, GTP, CTP, 및 UTP가 전사 반응 혼합물에서 ATP를 초과하는 양으로 사용될 수 있다. 비제한적 예로서, IVT 반응은 7.5 밀리몰의 GTP, 7.5 밀리몰의 CTP, 7.5 밀리몰의 UTP, 및 3.75 밀리몰의 ATP를 포함할 수 있다. 동일한 IVT 반응 혼합물은 3.75 밀리몰의 캡 유사체(예를 들어, 삼량체 캡)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, G:C:U:A:캡의 몰비는 1:1:1:0.5:0.5, 1:1:0.5:1:0.5, 1:0.5:1:1:0.5, 0.5: 1:1:1 :0.5, 0.9:0.9:1:1:0.5, 0.9:0.9:1:0.5:0.5일 수 있다. 일부 경우에, 동족 염기(GTP 및 CTP)와 3개의 수소 결합을 형성하는 NTP 중 하나 또는 둘 모두의 비율이, 2개의 수소 결합을 형성하는 NTP(ATP 및 UTP)에 비해 더 낮은 비율일 수 있다. 또한, IVT 반응 혼합물에 존재하는 ATP/UTP 대 CTP/UTP의 비율이 1.5:1 내지 1.1:1일 수 있다.
화학적으로 변형된 RNA 분자
일부 경우, 하나 이상의 화학적 변형을 포함하는 RNA 분자를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 이 문맥에서, 화학적 변형은, 4개의 표준 NTP를 포함하는 IVT 시스템에서 생성된 RNA에서 일반적으로 발견되지 않는 화학적 변형을 의미한다. 따라서, 화학적 변형에는 N 6-메틸아데노신(m6A), 슈도우리딘, 3-메틸시티딘(m3C), 및 2'-O-메틸 변형과 같은 100가지가 훨씬 넘는 천연 RNA의 화학적 변형이 포함된다.
예를 들어, 본원에서 제공된 바와 같은 IVT 반응에서, RNA의 생성을 위해 사용되는 천연 뉴클레오티드의 예는, 아데노신 트리포스페이트(ATP), 구아노신 트리포스페이트(GTP), 시티딘 트리포스페이트(CTP), 우리딘 트리포스페이트(UTP), 및 5-메틸우리딘 트리포스페이트(m5UTP)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 디포스페이트(ADP), 구아노신 디포스페이트(GDP), 시티딘 디포스페이트(CDP), 및/또는 우리딘 디포스페이트(UDP)가 사용된다. 화학적 변형을 포함하는 RNA 분자(예를 들어, mRNA 분자)를 생성하는 하나의 방법은 IVT 반응 혼합물에 화학적으로 변형된 뉴클레오시드 또는 기타 성분을 포함시키는 것에 의한다.
본원에 기재된 조성물을 사용하여 IVT 반응에서 사용될 수 있는 뉴클레오티드 유사체의 예는 항바이러스 뉴클레오티드 유사체, 포스페이트 유사체(가용성 또는 고정화된(immobilized) 가수분해가능하거나 또는 가수분해가능하지 않은 것), 디뉴클레오티드, 트리뉴클레오티드, 테트라뉴클레오티드, 예를 들어 캡 유사체, 또는 효소적 캡핑을 위한 전구체/기질(백시니아 또는 리가제), 캡 또는 5' 모이어티의 결찰/접합을 용이하게 하는 작용기로 표지된 뉴클레오티드(IRES), 캡 또는 5' 모이어티의 결찰을 용이하게 하는 5' PO4로 표지된 뉴클레오티드, 또는 화학적으로 또는 효소적으로 절단될 수 있는 작용기/보호기로 표지된 뉴클레오티드를 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 항바이러스 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체의 예는 간시클로비르, 엔테카비르, 텔비부딘, 비다라빈, 및 시도포비르를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
변형된 뉴클레오티드는 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 RNA 전사체(예를 들어, mRNA 전사체)는 슈도우리딘(ψ), 1-메틸슈도우리딘(m1ψ), 1-에틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디히드로슈도우리딘, 2-티오-디히드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디히드로슈도우리딘, 5-메틸우리딘, 5-메톡시우리딘 (mo5U) 및 2'-O-메틸 우리딘 중에서 선택된 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA 전사체(예를 들어, mRNA 전사체)는 전술한 변형된 핵염기 중 적어도 2개(예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 조합을 포함한다.
본원에서 제공되는 뉴클레오시드 트리포스페이트(NTP)는 변형되지 않은 또는 변형된 ATP, 변형된 또는 변형되지 않은 UTP, 변형된 또는 변형되지 않은 GTP 및/또는 변형된 또는 변형되지 않은 CTP를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, IVT 반응의 NTP는 변형되지 않은 ATP를 포함한다. 일부 실시형태에서, IVT 반응의 NTP는 변형된 ATP를 포함한다. 일부 실시형태에서, IVT 반응의 NTP는 변형되지 않은 UTP를 포함한다. 일부 실시형태에서, IVT 반응의 NTP는 변형된 UTP를 포함한다. 일부 실시형태에서, IVT 반응의 NTP는 변형되지 않은 GTP를 포함한다. 일부 실시형태에서, IVT 반응의 NTP는 변형된 GTP를 포함한다. 일부 실시형태에서, IVT 반응의 NTP는 변형되지 않은 CTP를 포함한다. 일부 실시형태에서, IVT 반응의 NTP는 변형된 CTP를 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA 전사체(예를 들어, mRNA 전사체)는 슈도우리딘(ψ), 1-메틸슈도우리딘(m1ψ), 5-메톡시우리딘(mo5U), 5-메틸시티딘(m5C), α-티오-구아노신 및 α-티오-아데노신으로부터 선택되는 변형된 핵염기를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA 전사체(예를 들어, mRNA 전사체)는 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개 이상)의 변형된 핵염기, 예컨대 본원에 기재된 변형된 핵염기의 조합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA 전사체(예를 들어, mRNA 전사체)는 슈도우리딘(ψ)을 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA 전사체(예를 들어, mRNA 전사체)는 1-메틸슈도우리딘(m1ψ)을 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA 전사체(예를 들어, mRNA 전사체)는 5-메톡시우리딘(mo5U)을 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA 전사체(예를 들어, mRNA 전사체)는 5-메틸시티딘(m5C)을 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA 전사체(예를 들어, mRNA 전사체)는 α-티오-구아노신을 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA 전사체(예를 들어, mRNA 전사체)는 α-티오-아데노신을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드(예를 들어, RNA 폴리뉴클레오티드, 예컨대 mRNA 폴리뉴클레오티드)는 특정 변형을 위해 균일하게 변형(예를 들어, 완전 변형, 전체 서열에 걸쳐 변형)된다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 1-메틸슈도우리딘(m1ψ)으로 균일하게 변형될 수 있으며, 이는 mRNA 서열의 모든 우리딘 잔기가 1-메틸슈도우리딘(m1ψ)으로 대체됨을 의미한다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드는, 상기 제시된 것과 같은 변형된 잔기로 대체하는 것에 의해, 서열에 존재하는 임의의 유형의 뉴클레오시드 잔기에 대해 균일하게 변형될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA 폴리뉴클레오티드와 같은 RNA 폴리뉴클레오티드)는 균일하게 변형되지 않을 수 있다(예를 들어, 부분적으로 변형되거나 서열의 일부가 변형된다).
캡핑된 RNA 제조
특정 이론에 구애됨이 없이, 캡핑된/캡핑되지 않은 RNA의 비율이 높은 캡핑된 RNA(예를 들어, 캡핑된 mRNA 분자) 제제의 사용은, 캡핑된/캡핑되지 않은 RNA 비율이 더 낮은 제제에 비해 증가된 발현을 제공할 수 있다. 따라서, 많은 경우에, 캡핑된 RNA 분자를 세포에 도입하기 전에 캡핑된 RNA 분자 (예를 들어, 캡핑된 mRNA 분자)를 캡핑되지 않은 RNA(예를 들어, 캡핑되지 않은 mRNA 분자)로부터 분리하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 분리는, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 전기영동과 같은 방법에 의한 캡핑된 RNA(예를 들어, 캡핑된 mRNA 분자)의 정제 및/또는 캡핑되지 않은 RNA 분자의 선택적 분해를 비롯한 수많은 방법에 의해 수행할 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은, 본원에 기재된 바와 같은 캡 유사체를 포함하는 RNA를 제조하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 캡 유사체를 사용한 IVT 반응에서 생성된 mRNA의 효율은 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 이상 또는 이들 사이의 임의의 값일 수 있다. 상기 mRNA의 효율은, 본원에 기재된 바와 같은 캡 유사체를 포함하는 것을 제외하고는 동일한 조건 하에서 IVT 반응에서 생성된 mRNA의 수율이다.
본원에서 제공된 방법 및 조성물은, IVT에서 생성된 총 mRNA 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 이상, 또는 이들 사이의 임의의 값이 본원에 기재된 캡 유사체로 캡핑된 RNA를 제조하는 방법을 제공한다. 다시 말해서, 캡핑 효율은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상(예를 들어, 약 50% 내지 약 99%, 약 60% 내지 약 99%, 약 70% 내지 약 99%, 약 80% 내지 약 99%, 약 85% 내지 약 99%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 96% 등)이다.
본원에서 제공된 캡을 포함하는 RNA 제제를 제조하기 위한 본원에서 제공된 방법은 유리하게는, 캡핑되지 않은 RNA를 분해하는 것에 의해 캡핑된 RNA 종을 정제 또는 풍부화하는 단계를 포함할 수 있다. 캡핑되지 않은 RNA의 제거는 당업자에게 알려진 임의의 수단, 예컨대 효소 소화에 의해 달성될 수 있으며, 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, RNA 제제는 RNA 5' 폴리포스파타제로 처리될 수 있으며, 이는 5' 트리포스포릴화된 RNA에서 파이로포스페이트를 제거하여 모노포스페이트 5' 말단을 남긴다. 제제는 이후에 5' → 3' 엑소리보뉴클레아제로 처리될 수 있으며, 이는 기질로서 5' 모노포스페이트 RNA를 필요로 한다. 그러한 효소의 한 범주는 XRN 5'→3' 엑소리보뉴클레아제이다(문헌[Nagarajan et al., "XRN 5'→3' exoribonucleases: Structure, mechanism and functions", Biochim Biophys Acta., 1829:590-603 (2013)]). 따라서, 이 두 효소로 처리하는 것은 캡핑되지 않은 RNA를 선택적으로 분해하여 캡핑된 RNA를 온전히 남긴다.
본원에 기재된 방법은 캡핑되지 않은 RNA 분자(예를 들어, mRNA 분자)가 캡핑된 RNA 분자(예를 들어, 캡핑된 mRNA 분자) 보다 우선적으로 분해되는 방법뿐만 아니라 이러한 방법을 수행하는 데 사용되는 조성물을 포함한다. 이러한 방법은 캡핑되지 않은 RNA의 우선적 분해 전에 반응 혼합물에 존재하는 RNA를 처리하거나 처리하지 않고 수행될 수 있다. 분해를 위한 RNA 분자(예를 들어, 캡핑되지 않은 RNA 분자)의 소집단을 제조하기 위해 반응 혼합물을 처리할 때, 이 제조는 5' → 3' 엑소리보뉴클레아제로 RNA를 분해하기 전에 또는 동시에 수행될 수 있다. 따라서, 5' → 3' 엑소리보뉴클레아제에 의한 분해를 위한 RNA 분자의 제조 및 RNA 분자의 분해는 서로 다른 시간대에 또는 동시에 동일한 반응 혼합물에서 발생할 수 있다. 일부 경우, 분해하기를 원하는 RNA 분자의 5' 말단을 변형시켜 5' → 3' 엑소리보뉴클레아제가 말단에 작용할 수 있도록 할 필요가 있다. 이에 대한 한 가지 예는, XRN1 엑소리보뉴클레아제를 캡핑되지 않은 RNA 분자의 분해에 사용하는 경우이다.
XRN1은, 단일 5' 포스페이트기를 포함하는 RNA 분자의 말단을 분해하는 진행성 XRN1 엑소리보뉴클레아제이다. 하나의 시판되는 XRN1 엑소리보뉴클레아제는 New England Biolabs(카탈로그 번호 M0338S)에서 입수할 수 있다. 분해하고자 하는 존재하는 RNA 분자의 일부 또는 전부가 하나 초과의 5' 포스페이트기를 포함하는 경우, 일반적으로 포스페이트기의 수를 하나로 줄이는 것이 바람직할 것이다. 이들 기의 효소적 제거를 위해 포스파타제를 사용하는 방법을 비롯하여, RNA로부터 5' 포스페이트기를 제거하기 위해 수많은 방법이 사용될 수 있다. 그러한 효소의 한 카테고리는 RNA 5' 폴리포스파타제(예를 들어, Lucigen, 카탈로그 번호 RP8092H)이다.
본원에서 제시된 방법은 캡핑된 RNA의 양이 캡핑되지 않은 RNA에 비해 적어도 50%(예를 들어, 적어도 약 50% 내지 약 500%, 약 100% 내지 약 500%, 약 150% 내지 약 500% 내지 약 200% 내지 약 500%, 약 250% 내지 약 500%, 약 300% 내지 약 500%, 약 50% 내지 약 1,000%, 약 150% 내지 약 1,000%, 약 300% 내지 약 1,000%, 약 400% 내지 약 1,000% 등) 증가하는 것을 포함한다. 하기 내용은 백분율 증가를 계산할 수 있는 방법의 예이다. 샘플에 100 mg의 캡핑된 RNA와 50 mg의 캡핑되지 않은 RNA가 있다고 가정한다. 캡핑되지 않은 RNA의 양이 25 mg으로 감소하면 캡핑되지 않은 RNA의 총량은 절반으로 줄어든다. 또한, 캡핑된 RNA 대 캡핑되지 않은 RNA의 비율은 2:1에서 4:1로 갈 것이고, 캡핑된 RNA의 양은 캡핑되지 않은 RNA에 비해 21% 증가할 것이다.
본원에 기재된 바와 같은 트리뉴클레오티드 캡핑된 RNA를 포함하는 조성물은 예를 들어 시험관내 전사, 시험관내 번역 및 생체내 번역에 사용될 수 있다. 시험관내, 동일반응계 및 생체내 단백질 생성을 위한 현재의 생명공학 분야의 노력은 또한 이러한 방법 및 조성물로부터 이익을 얻을 것이다. 또한, 본원에서 제공되는 조성물은 치료 목적에 유용하다. 예를 들어, 본 기술은 감염성 질환 또는 암에 대한 백신, 단백질 대체 요법 등에 유용할 수 있다. 당업자는 본원에 기재된 캡핑 기술 및 조성물이 일반적으로 mRNA 백신에 사용될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다. 예를 들어, 본원에 기술된 RNA 캡은 백신에 유용한 RNA 서열 내로 혼입될 수 있는데, 그의 예는, 비제한적으로, 하기 기술된 서열이다: 미국 특허출원공개 US20180318409A1호, 미국 특허출원공개 US20190351040호, 미국 특허출원공개 US20180271970호, 미국 특허출원공개 US20190054112호, 미국 특허출원공개 US20190336595호, 미국 특허출원공개 US20180311336호, 미국 특허출원공개 US20180303929호, 국제공개 WO2017/070601호, 국제공개 WO2019/202035호, 국제공개 WO2020/002525호, 국제공개 WO2019/193183호, 국제공개 WO2019/115635호, 국제공개 WO2019/038332호, 국제공개 WO2019/008001호, 국제공개 WO2018/167320호, 국제공개 WO2018/115527호, 국제공개 WO2018/115525호 국제공개 WO2018/115507호, 국제공개 WO2018/104538호, 국제공개 WO2018/104540호.
알킨-유도체화된 캡핑된 RNA는 면역원을 암호화하는 RNA를 포함하는 바이러스의 비감염성 입자를 생성하는 데 사용할 수 있다. 이러한 비복제성 바이러스 입자는 인간에게 주입될 수 있으며, 여기서 숙주 세포에 들어갈 수 있다. 숙주 세포에 들어가면 바이러스 입자는 해리되고 면역원을 암호화하는 mRNA가 단백질로 번역된다. 이 단백질은 면역 반응을 유도할 수 있다.
RNA-기반 백신은 바이러스, 예를 들어 코로나 바이러스(예를 들어, MERS, SARS-CoV 및 SARS-CoV-2), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 고양이 면역결핍 바이러스, 유형 16 인간 유두종 바이러스, 종양, 라사(lassa) 바이러스, 에볼라(Ebola) 바이러스, 마버그(Marburg) 바이러스, 탄저균(Bacillus anthraces)으로부터의 탄저균 독소 및 보툴리눔 독소와 같은 감염원에 대한 예방접종에 사용될 수 있다. 따라서, RNA 백신이 사용될 수 있는 바이러스의 비제한적 예는 다음을 포함할 수 있다: 아데노(Adeno)-관련 바이러스, 아이치(Aichi) 바이러스, 호주 박쥐 리사바이러스(Australian bat lyssavirus), BK 폴리오마바이러스(BK polyomavirus), 반나(Banna) 바이러스, 바마 포레스트(Barmah forest) 바이러스, 부냠웨라(Bunyamwera) 바이러스, 부냐바이러스 라크로스(Bunyavirus La Crosse), 부냐바이러스 스노우슈 토끼(Bunyavirus snowshoe hare), 세르코피테신 헤르페스바이러스(Cercopithecine herpesvirus), 칸디푸라(Chandipura) 바이러스, 치쿤군야(Chikungunya) 바이러스, 코사바이러스 A(Cosavirus A), 우두바이러스(Cowpoxvirus), 콕사키에바이러스(Coxsackievirus), 크리민-콩고 출혈열(Crimean-Congo hemorrhagic fever) 바이러스, 뎅기열(Dengue) 바이러스, 도리(Dhori) 바이러스, 둑베(Dugbe) 바이러스, 두벤하게(Duvenhage) 바이러스, 동부 말 뇌염(Eastern equine encephalitis) 바이러스, 에볼라바이러스, 에코바이러스(Echovirus), 뇌심근염(Encephalomycarditis) 바이러스, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스, 유럽 박쥐 리사바이러스(European bat lyssavirus), GB 바이러스 C/간염 G형 바이러스, 한탄(Hantaan) 바이러스, 헨드라(Hendra) 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, E형 간염 인간 헤르페스바이러스 1, s, 델타 간염 바이러스, 마두(Horsepox) 바이러스, 인간 아데노바이러스, 인간 아스트로바이러스(astrovirus), 인간 코로나바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 인간 헤르페스바이러스 1, 인간 헤르페스바이러스 2, 인간 헤르페스바이러스 6, 인간 헤르페스바이러스 7, 인간 헤르페스바이러스 8, 인간 면역 결핍 바이러스, 인간 유두종(papilloma) 바이러스 1, 인간 유두종 바이러스 2, 인간 유두종 바이러스 16,18, 인간 파라인플루엔자(parainfluenza), 인간 파로바이러스B19(parovirus B19), 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 리노바이러스(rhino) , 인간 SARS 코로나바이러스, 인간 스푸마레트로바이러스(spumaretrovirus), 인간 T-림프친화성(T-lymphotropic) 바이러스, 인간 토로(toro) 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 이스파한(Isfahan) 바이러스, JC 폴리오마바이러스(polyomavirus), 일본 뇌염(Japanese encephalitis) 바이러스, 주닌 아레나바이러스(Junin arenavirus), KI 폴리오마바이러스(KI polyomavirus), 쿤진(Kunjin) 바이러스, 라고스 박쥐(Lagos bat) 바이러스, 레이크 빅토리아 마버그바이러스(Lake Victoria Marburgvirus), 랑갓(Langat) 바이러스, 라사바이러스(Lassavirus), 로드데일(Lordsdale) 바이러스, 루핑병(Louping ill) 바이러스, 림프구 맥락수막염(Lymphocytic choriomeningitis) 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스, 마야로(Mayaro) 바이러스, MERS 코로나바이러스, 홍역(Measles) 바이러스, 멩고 뇌심근염(Mengo encephalomyocarditis) 바이러스, 메르켈 세포 폴리마(Merkel cell polyma) 바이러스, 모콜라(Mokola) 바이러스, 전염성 물렁종(Molluscum contagiosum) 바이러스, 몽키폭스(Monkeypox) 바이러스, 볼거리(Mumps) 바이러스, 머레이 밸리 뇌염(Murray valley encephalitis) 바이러스, 뉴욕 바이러스, 니파(Nipah) 바이러스, 노워크(Norwalk) 바이러스, 오녕녕(O'nyong-nyong) 바이러스, 오르프(Orf) 바이러스, 오로푸케(Oropouche) 바이러스, 피친데(Pichinde) 바이러스, 폴리오바이러스(Poliovirus), 푼타 토로 피에보(Punta toro phiebo) 바이러스, 푸말라(Puumala) 바이러스, 광견병(Rabies) 바이러스, 리프트 밸리 열(Rift valley fever) 바이러스, 로자바이러스 A(Rosavirus A), 로스 리버(Ross river) 바이러스, 로타바이러스 A(Rotavirus A) , 로타 바이러스 B, 로타 바이러스 C, 풍진(Rubella) 바이러스, 사기야마(Sagiyama) 바이러스, 살리바이러스 A(Salivirus A) , 샌드플라이 열 시칠리아(Sandfly fever Sicilian) 바이러스, 삿포로(Sapporo) 바이러스, SARS 코로나바이러스 2, 셈리키 숲(Semliki forest) 바이러스, 서울(Seoul) 바이러스, 유인원 폼(Simian foam) 바이러스, 유인원 바이러스 5, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 사우샘튼(Southampton) 바이러스, 세인트루이스 뇌염(St. louis encephalitis) 바이러스, 틱-본 포와싼(Tick-borne Powassan) 바이러스, 토크 테노(Torque teno) 바이러스, 토스카나(Toscana) 바이러스, 우크니에미(Uukuniemi) 바이러스, 백시니아(Vaccinia) 바이러스, 바리셀라-조스터(Varicella-zoster) 바이러스, 바리올라(Variola) 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염(Venezuelan equine encephalitis) 바이러스, 수포성 구내염(Vesicular stomatitis) 바이러스, 웨스턴 말 뇌염바이러스(Western equine encephalititsvirus), 우 폴리오마바이러스(WU polyomavirus), 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 야바 원숭이 종양(Yaba monkey tumor) 바이러스, 야바-유사 질병(Yaba-like disease) 바이러스, 황열병(Yellow fever) 바이러스, 지카(Zika) 바이러스.
이러한 백신 전략은 많은 양의 캡핑된 RNA를 필요로 할 수 있다. 본 발명의 방법은 캡핑된 RNA의 이러한 합성 및 후속 정제를 용이하게 하여 이들 백신을 상업적으로 실현가능하게 만든다. 또한, 인간 사용을 위해서는 일반적으로 고순도 성분이 필요하기 때문에, 전사 반응에서 전체 길이 캡핑된 RNA의 백분율을 증가시켜 보다 균일한 제품을 유도해내는 전략이 백신 산업에서 선호될 것이다. 또한 연구자들은 실험에서 변수의 수를 최소화하기 위해 가능한 한 순수한 제품을 사용하는 것을 선호한다. 또한, 제품은 순수할수록 더 강력하다.
추가의 실시형태는, 일반적으로 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 제형화된 활성 성분(예를 들어, 트리뉴클레오티드 캡핑된 RNA)을 포함하는 조성물의 투여에 관련된다. 부형제는 예를 들어 당, 전분, 셀룰로오스, 검, 및 단백질을 포함할 수 있다. 다양한 제형이 일반적으로 알려져 있으며 최신판 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing, Easton Pa.)]에 자세히 논의되어 있다. 이러한 조성물은 신규 캡 유사체, 신규 캡 유사체에 대한 항체, 및 신규 캡 유사체의 모방체, 효능제, 길항제, 또는 억제제를 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물, 예컨대 약학 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 척수강내, 심실내, 폐, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장, 국소, 설하, 또는 직장 수단을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 수의 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 개시내용의 실시형태는 하기 실시예에 비추어 더 이해될 수 있으며, 이는 어떠한 방식으로든 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
당업자는 많은 변형, 대안 및 등가물이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 이러한 모든 변형, 대안 및 등가물은 여기에 포함되는 것으로 의도된다.
실시예
하기 실시예는 트리뉴클레오티드 캡 유사체를 제조하는 방법을 제공한다.
시약: 달리 명시되지 않는 한, 시약 및 용매는 추가 정제 없이 그대로 사용된다. 3'-O-프로파길 구아노신은 Chemgenes(미국)에서 구입했고, 1H NMR 및 31P NMR 스펙트럼은 Burker 400 MHz 장비에서 D2O 중에서 기록되었다. ESI 질량 스펙트럼은 Applied Biosystems/Sciex API 150 모델에서 기록되었다. HPLC는 음이온 교환 컬럼을 사용하여 waters 2996(Waters Corporation)에서 실행되었다. 이온 교환 크로마토그래피는 DEAE Sepharose 컬럼을 사용하여 AKTA 정제기(Amersham Biosciences, GE Healthcare)에서 수행되었다. 겔 이동 분석은 pTri β 액틴 주형을 사용하여 수행되었고, IVT 반응은 선형화된 AmbLuc poly(A) DNA 주형과 MEGASCRIPT 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다. 관심 있는 겔 밴드에서의 복사선은 인광이미지화 장치(GE Healthcare)로 정량화되었다. MEGACLEAR 키트(Life Technologies Corporation)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 이러한 전사 반응에서 RNA의 정제를 수행하였다. 96-웰 플레이트의 광도계(POLARstar OPTIMA. BMG Labtech)를 제조업체의 프로토콜에 따라 루시퍼라제 검정 판독값에 사용했다.
실시예 1: 중간체 합성 반응식
트리뉴클레오티드 합성에 사용되는 중간체를 얻기 위한 예시적인 합성 경로가 하기에 제시된다.
중간체 반응식 A: Imm 7 (LNA)GDP(8)의 합성:
Figure pct00075
중간체 실시예 1: DMF-보호된 LNA 구아노신(2)의 합성:
디클로로메탄 중 3% 트리클로로아세트산의 교반 용액 50 mL에 5'-DMT-N-DMF LNA 구아노신 1 (5.00 g, 7.48 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 회전식 증발기에서 증발 건조시켰다. 생성된 주황색 고체에 디에틸 에테르 50 mL를 첨가하고 실온에서 30분 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 여과하고 진공 건조하여 백색 고체 2를 얻었다 (수율: 2.67 g, 95%). 이 조질 물질을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
중간체 실시예 2: LNA 구아노신(3)의 합성:
수성 40% 메틸 아민과 28% 수산화암모늄의 1:1 혼합물의 교반 용액 40 mL에 DMF-보호된 LNA 구아노신 2 (2.67 g, 7.04 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 회전 증발기에서 증발시켜 백색 고체 3을 얻었다 (수율, 1.98 g, 95%). 이 조질 물질을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
중간체 실시예 3: LNA-GMP(4)의 합성:
0℃에서 아르곤 분위기 하에서 POCl3(1.69 g, 11.19 mmol) 및 (MeO)3P(15.0 mL)의 교반 용액에 LNA 구아노신 6 (1.10 g, 3.72 mmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 0℃에서 4시간 동안 교반하였다. 4시간 후, 50.0 mL의 물을 반응 혼합물에 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(2 X 50 mL)로 세척하여 포스포릴화제를 제거하였다. 수집된 수용액을 pH 1.5로 조정하고 4℃에서 15시간 동안 교반하였다. 15시간 후, 수용액을 pH 5.5로 조정하고 DEAE Sepharose 컬럼에 로딩하였다. 원하는 생성물을 0 내지 1 M TEAB(트리에틸 중탄산암모늄, pH 7.5)의 선형 구배를 사용하여 용출하고, 생성물을 함유하는 분획을 모으고, 증발시키고, 진공 데시케이터에서 오산화인 상에서 건조하여 미세한 백색 분말 4를 얻었다(수율: 1.43 g, 78%). 4에 대한 데이터. 1H NMR (D2O, 400 MHz) δ 8.01 (s, 1H), 5.91 (s, 1H), 4.63 (s, 1H), 4.58 (s, 1H), 4.16 (m, 3H), 4.03 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.20 (q, J = 7.6 Hz, 6H), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 9H); 31P NMR (D2O, 162 MHz) δ -5.40 (s, 1P); MS (m/z): 374 [M-H]-.
중간체 실시예 4: ImLNA-GMP(5)의 합성:
20 mL의 무수 DMF 중의 LNA-GMP TEA 염 4 (1.35 g, 2.84 mmol)의 교반 용액에, 이미다졸(0.97 g, 14.24 mmol), 트리페닐 포스핀(1.50 g, 5.70 mmol), 알드리티올(1.25 g, 5.70 mmol) 및 트리에틸아민(0.29 g, 2.84 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 아르곤 분위기 하에 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 0℃에서 원심분리기 튜브에서 아세톤 100 mL 중 과염소산나트륨(2 g) 용액에 상기 반응 혼합물을 5분 동안 천천히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 고체를 새로운 분획의 아세톤(100 mL)으로 그라인딩하고, 냉각하고, 다시 원심분리했다. 이 과정을 2회 더 반복하고 생성된 고체를 진공 데시케이터에서 P2O5 상에서 건조하여 백색 분말 5를 얻었다(수율: 1.05 g, 83%). MS (m/z): 424 [M-H]-.
중간체 실시예 5: LNA-GDP(6)의 합성:
10.0 mL의 무수 DMF 중의 ImLNA-GMP 5(1.00 g, 2.23 mmol) 및 염화아연(0.61 g, 4.46 mmol)의 교반 용액에, DMF 중의 1M 트리스(트리부틸암모늄) 포스페이트 15 mL를 아르곤 분위기 하에서 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 5시간 후, 반응 혼합물을 50.0 mL의 물로 희석하였다. 생성된 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(2 X 50 mL)로 세척하여 포스포릴화제를 제거하였다. 수집된 수용액을 pH 5.5로 조정하고 DEAE Sepharose 컬럼에 로딩하였다. 원하는 생성물을 0 내지 1 M TEAB의 선형 구배를 사용하여 용출하고, 생성물을 함유하는 분획을 모으고, 증발시키고, 진공 데시케이터에서 오산화인 상에서 건조하여 미세한 백색 분말 6을 얻었다(수율 1.10 g, 75%). 6에 대한 데이터. 1H NMR (D2O, 400 MHz) δ 8.00 (s, 1H), 5.95 (s, 1H), 4.63 (s, 2H), 4.37 (m, 2H), 4.14 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.20 (q, J = 7.2 Hz, 12H), 1.28 (t, J = 7.6 Hz, 18H); 31P NMR (D2O, 162 MHz) δ -8.94 (d, J = 20.9 Hz, 1P), 9.99 (d, J = 21.3 Hz, 1P); MS (m/z): 454 [M-H]-.
중간체 실시예 6: m 7(LNA) GDP (7)의 합성:
20.0 mL의 물 중의 LNA-GDP 6 (1.00 g, 1.52 mmol)의 교반 용액에 아세트산을 천천히 첨가하여 용액의 pH를 4.0으로 조정하였다. 이 혼합물에 디메틸 설페이트 (2.0 mL)을 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 메틸화가 진행됨에 따라 pH는 약 2.0으로 낮아졌고, 1 M NaOH 용액을 사용하여 pH를 다시 4.0으로 재조정했다. 5시간 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(3 X 50 mL)로 추출하여, 반응하지 않은 과량의 디메틸 설페이트를 제거하였다. 수집된 수용액을 pH 5.5로 조정하고 DEAE Sephadex 컬럼에 로딩하였다. 원하는 생성물을 0 내지 1 M TEAB의 선형 구배를 사용하여 용출하고, 생성물을 함유하는 분획을 모으고, 증발시키고, 진공 데시케이터에서 오산화인 상에서 건조하여 미세한 백색 분말 7을 얻었다(수율 0.70 g, 68%). 7에 대한 데이터. 1H NMR (D2O, 400 MHz) δ 6.05 (s, 1H), 4.73 (s, 1H), 4.55 (s, 1H), 4.42 (m, 1H), 4.32 (m, 1H), 4.13 (s, 3H), 4.11 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 4.00 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.20 (q, J = 7.2 Hz, 12H), 1.28 (t, J = 7.2 Hz, 18H); 31P NMR (D2O, 162 MHz) δ -6.18 (d, J = 23.0 Hz, 1P), -9.56 (d, J = 22.8 Hz, 1P); MS (m/z): 468 [M-H]-.
중간체 실시예 7: Imm 7(LNA) GDP (8)의 합성:
15 mL의 무수 DMF 중의 m7(LNA)GDP TEA 염 7(0.65 g, 0.96 mmol)의 교반 용액에, 이미다졸(0.33 g, 4.84 mmol), 트리페닐 포스핀(0.51 g, 1.93 mmol), 알드리티올(0.43 g, 1.93 mmol) 및 트리에틸아민(0.10 g, 0.96 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 아르곤 분위기 하에 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 0℃에서 원심분리기 튜브에서 아세톤 100 mL 중의 과염소산나트륨(2 g) 용액에 상기 반응 혼합물을 5분 동안 천천히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 원심분리하고 상청액을 제거하였다. 고체를 새로운 분획의 아세톤(100 mL)으로 그라인딩하고, 냉각하고, 다시 원심분리했다. 이 과정을 2회 더 반복하고, 생성된 고체를 진공 데시케이터에서 P2O5 상에서 건조하여 백색 분말 8을 얻었다(수율: 0.42 g, 80%). MS (m/z): 517 [M-H]-.
중간체 반응식 B: 디뉴클레오티드 pAmpG(13)의 합성:
Figure pct00076
중간체 실시예 8: 디뉴클레오티드 pAmpG(13)의 합성:
전형적인 반응으로, MMT-2'-O-메틸아데노신 (n-bz) CED 포스포르아미다이트 9(2.0 mmol) 및 2',3'-디아세틸 구아노신(n-ibu) 10(2.0 mmol)을 4.5몰 당량의 활성화제(테트라졸)를 함유하는 20 mL의 아세토니트릴 중에서 반응시킨다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 중간체 생성물을 요오드/피리딘/THF/물로 P(III)에서 P(V) 상태로 산화시키고, 디클로로메탄(400 mL) 및 염수(400 mL)로 추출하였다. 생성된 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 증발시켜 고체 형태 중간체 11을 얻었다.
5'-MMT 기를 제거하기 위해, 중간체 11을 80% 아세트산 20mL에 용해시키고 생성된 반응 혼합물을 실온에서 약 2~3시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 혼합물을 증발시키고 메탄올(6x60 mL)과 함께 공증발시켜 아세트산을 제거하였다. 미정제 5'-OH 이량체 12를 분리하고 용리액으로 디클로로메탄 중 5% 메탄올을 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다.
5'-OH 이량체 12(2.0 mmol)를, 4 당량의 비스-시아노에틸-N,N-디이소프로필-포스포르아미다이트 및 4 당량의 활성화제(20 mL 아세토니트릴 중 테트라졸)로 포스피틸화하였다. 실온에서 45분 동안 교반한 후, 5'-포스피틸화된 이량체를 요오드/피리딘/THF/물을 사용하여 P(III)에서 P(V) 상태로 산화시키고, 디클로로메탄(300 mL) 및 염수(300 mL)로 추출하였다. 유기층을 증발시켜 오일성 잔사를 남기고, 이를 메탄올(2x60 mL)과 함께 공증발시키고, 25 mL의 메탄올에 용해시키고, 여기에 농축된 암모니아(25 mL)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을, pAmpG 이량체 13의 탈보호가 완료될 때까지 48시간 이상 동안 실온에서 유지하였다. 혼합물을 증발시키고 메탄올과 함께 공증발시키고 생성된 이량체를 LC/MS (MS(m/z): 705 [M-H]-)로 특성규명하고, 트리뉴클레오티드 캡 유사체를 합성하기 위한 추가 접합에 사용하였다.
실시예 2: LNA 트리뉴클레오티드 캡 유사체(14)의 합성:
하기의 일반적인 트리뉴클레오티드 반응식은 본원에 기재된 예시적인 트리뉴클레오티드 캡 유사체에 도달하기 위한 중간체 반응식 (A) 및 중간체 반응식 (B)로부터의 중간체의 조합을 예시한다. 이 예시에서, 본 개시내용의 트리뉴클레오티드 유사체(14)는 잠금형(locked) 캡 유사체이다.
Figure pct00077
트리뉴클레오티드 캡 유사체 실시예 1 - LNA 트리뉴클레오티드 캡 유사체(14)의 합성:
10.0 mL의 무수 DMF 중의 Imm7(LNA)GDP 8(0.10 g, 0.18 mmol) 및 pAmpG N,N-디메틸 이소프로필 암모늄 염 13(0.14 g, 0.18 mmol)의 교반된 용액에, 염화아연(0.15 g, 1.10 mmol)을 아르곤 분위기 하에서 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 80시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 물 100.0 mL 중의 EDTA 이나트륨(0.55 g, 1.48 mmol)의 용액에 첨가하였다. 생성된 수용액을 pH 5.5로 조정하고, DEAE Sephadex 컬럼에 로딩하였다. 원하는 생성물을 0 내지 1 M TEAB의 선형 구배를 사용하여 용출하고, 생성물을 함유하는 분획을 모으고, 증발시키고, 14의 TEA 염 10.0mL로 농축시켰다. 생성물의 TEA 염을 물(5 mL)에 용해시킨 다음, 아세톤(50 mL) 중의 과염소산나트륨(2.0 g) 용액에 부었다. 생성된 혼합물을 원심분리하고 상청액은 버렸다. 얻어진 고체를 아세톤(2x50 mL)으로 세척하고 진공에서 건조하여 LNA 트리뉴클레오티드 캡 유사체의 나트륨 염 14를 얻었다. (수율: 0.12 g, 55%) 14에 대한 데이터. 1H NMR (D2O, 400 MHz) δ 8.39 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 6.01 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 5.87 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 5.55 (s, 1H), 4.83 (m, 1H), 4.43 (m, 4H), 4.31 (m, 2H), 4.23 (m, 4H), 4.10 (m, 3H), 3.99 (m, 1H), 3.93 (m, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.29 (s, 3H); 31P NMR (D2O, 162 MHz) δ -0.92 (s, 1P), -11.11 (d, J = 19.4 Hz, 1P), -10.42 (d, J = 17.8 Hz, 1P), -22.91 (t, J = 17.8 Hz, 1P); MS (MALDI, m/z): 1156 [M-H]-.
실시예 3: LNA 트리뉴클레오티드 캡 유사체에 의한 시험관내 전사
하기 실시예는 본원에서 기술된 합성 캡이 시험관내에서 mRNA에 혼입될 수 있음을 입증한다. 간략하게, T7 프로모터의 제어 하에 GFP에 대한 코딩 서열을 포함하는 선형화된 DNA를, MMESSAGE MMACHINE™ T7 키트(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 AM1344)로부터의 완충제와 효소, 및 NTP/캡 혼합물을 사용한 시험관내 전사 반응에 사용하였다. NTP/캡 혼합물은 NTP와, 무-캡(no cap), ARCA 캡 유사체(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 AM8045), GAG 캡 유사체(CLEANCAP™ AG, Trilink Biotechnologies, 카탈로그 번호 N-7113), 또는 본원에 기재된 바와 같은 화합물(14)와의 혼합물을 포함하였다. ARCA을 사용한 반응 또는 캡을 사용하지 않은 반응은, GGG 시작부를 함유하는 야생형 T7 프로모터를 포함하는 DNA 주형을 사용하여 수행되었다. AGG 시작부를 포함하는 변형된 T7 프로모터를 포함하는 DNA 주형이 GAG Cap 캡 유사체 또는 LNA-변형된 GAG Cap 캡(화합물 14)과의 반응에 사용되었다. ARCA에 의한 반응을 제외한 모든 반응에서 각 NTP와 캡의 농도는 5 mM이었다. ARCA를 사용한 반응은 하기 캡/NTP 농도를 포함했다: 6 mM의 ARCA, 1.5 mM의 GTP 및 각각 7.5 mM의 ATP, CTP 및 UTP. 제조업체의 지침에 따라 반응을 진행했다. 각 반응은, 대략 120 nt 폴리(A) 테일을 포함하여 약 1000개의 뉴클레오티드인 전장(full-length) RNA 전사체를 생성했다. RNA 전사체는 MEGACLEAR™ RNA 정제 키트(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 AM1908)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 정제하였고, RNA 수율은 NANODROP™ 2000C 분광기(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 ND-2000C)에서 260 nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량화하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, LNA 캡 유사체를 포함하는 반응에서의 RNA 수율이 ARCA 캡 반응보다 더 우수하였다.
실시예 4: LNA 캡 유사체에 의한 캡핑 효율
LNA 캡 유사체의 캡핑 효율을 무-캡 대조군, ARCA 캡 유사체 및 CLEANCAP™ 캡 유사체와 비교했다. 간략하게, 실시예 3에 기술된 바와 같이 시험관내 전사 반응을 수행하였다. 예를 들어 Bioanalyzer 상에서, 캡핑되지 않은 mRNA와 캡핑된 mRNA를 분리(resolve)할 수 있도록 하기 위해, 상기 시험관내 전사 반응으로부터의 1-2 μg RNA 샘플을, 5 μl의 200 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1 μl의 10 μM DNAzyme 올리고뉴클레오티드 TTGAGGTTGCTAGTGAAGGCTAGCTACAACGAACAGTTGTGTCAGAAGC(서열번호 584) 및 총 부피가 16 μl가 되도록 하는 양의 물을 포함하는 반응에서, DNAzyme 올리고뉴클레오티드로 처리하여, RNA를 5' 말단으로부터, 30개 뉴클레오티드 길이(무-캡), 31개 뉴클레오티드 길이(ARCA, GAG-캡(GpppAG), LNA 캡 유사체(LNA-변형된 GAG 캡))로 트리밍하였다. 혼합물을 85℃에서 30초 동안 예열하고 37℃에서 5분 동안 평형화하였다. 4 μl의 50 mM MgCl2를 혼합물에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응을 중단시키기 위해, 2 μl의 TURBO™ DNAse(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 AM2238)를 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 소형 RNA 분석 키트(Agilent, 카탈로그 번호 5067-1548)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 1-2 μl의 반응물을 Bioanalyzer 칩(미국 캘리포니아주 산호세 소재의 Agilent)에 로딩하였다. 캡핑되지 않은 mRNA 분자는, ARCA 또는 LNA-캡 유사체로 성공적으로 캡핑된 mRNA 종 각각보다 1개 염기만큼 더 짧았다. 캡핑 효율은 캡핑된 또는 캡핑되지 않은 종에 상응하는 피크 아래 면적을 측정함으로써 캡핑된 mRNA/총 mRNA의 양으로 계산되었다.
도 13에 도시된 바와 같이 LNA 캡 유사체의 캡핑 효율은 ARCA 캡 유사체 및 GAG 캡 유사체 보다 더 낮다.
실시예 5: LNA 캡 유사체로 캡핑된 mRNA의 형질감염 효율 및 발현 효율
LNA 캡 유사체의 형질감염 효율 및 발현 효율을 캡핑되지 않은 mRNA, ARCA 캡 유사체, 및 GAG 캡(CLEANCAP™) 캡 유사체와 비교하였다. JAWSII 뮤린 불멸화(immortalized) 수지상 세포주를 분석에 사용했다. "조질(crude)" mRNA 또는 "HPLC 정제된 mRNA"로 형질감염을 수행하였다. "조질" mRNA의 경우, 실시예 3에 기재된 바와 같이 MEGACLEAR™ RNA 정제 키트를 사용하여 정제한 후 바로 전사체를 사용하였다. "HPLC 정제된" mRNA의 경우, 10 ug mRNA를 20 단위의 RNA 5' 폴리포스파타제(Lucigen, 카탈로그 RP8092H)(이는, 캡핑되지 않은 것이지만 캡핑시키지 않은 mRNA를 탈인산화하여 모노포스페이트 5' 말단을 남김)와 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써, 캡핑되지 않은 mRNA를 제거하였다. GeneJET RNA Cleanup 및 Concentration Microkit™(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 K0842)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 RNA 전사체를 정제했다. 이 정제된 mRNA를 2 단위의 XrnI(New England Biolabs, 카탈로그 M0338S, 진행성 5'-> 3' 엑소리보뉴클레아제)(이는, 기질로서 5' 모노포스페이트를 필요로 함)에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. mRNA 전사체는 GeneJET RNA Cleanup and Concentration Microkit™ (Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 K0842)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 정제했다. 캡핑되지 않은 전사체의 제거는, 실시예 4에 설명된 캡핑 분석을 수행함으로써 확인했다. 65℃로 설정된 Clarity® 5 μm Oligo-RP 150 x 4.6 mm 컬럼이 장착된 Agilent Technologies 시리즈 1260 Infinity HPLC를 사용하여, 상기 처리된 샘플에서 이중 가닥 RNA (dsRNA)를 제거하였다. 완충제 A(0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트, pH 7.0) 중의 38%에서 70%로 완충제 B (0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트, pH 7.0 및 25% 아세토니트릴)의 선형 구배가 1ml/분으로 10분 동안 적용되었다. 수집된 분획으로부터 GeneJET RNA Cleanup 및 Concentration Microkit™를 사용하여 RNA를 회수하였다. 회수된 mRNA의 농도는 Nanodrop에 의해 결정되었고, dsRNA의 고갈은, 항-dsRNA J2 항체로 도트 블롯을 수행함으로써 확인되었다. RNA Nano 6000 키트가 구비된 Bioanalyzer를 사용하여 전사체의 품질을 또한 확인했다.
이어서, 조질 및 HPLC 정제된 mRNA를 사용하여 JAWS II 세포를 형질감염시켰다. 세포는 American Tissue Cell Collection(ATCC) 기관에서 약술한 프로토콜에 따라 배양되었다. 50,000개의 세포를 96웰 플레이트에 시딩하여 세포가 다음날(형질감염 당일) 70 내지 90% 컨플루언트가 되도록 했다. 세포는 LIPOFECTAMINE™ MESSSENGERMAX™ 형질감염 시약(Thermo Fisher, 카탈로그 LMRNA001)을 사용하여 형질감염시켰다. 25 ng의 조질 또는 HPLC 정제된 mRNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 0.3 μL의 MESSENGERMAX™ 형질감염 시약과 혼합하고, 혼합물을 세포에 첨가하고 37℃에서 인큐베이션했다. 형질감염시킨 지 24시간 후, 현탁액 세포를 포함하는 배지를 제거하고 깨끗한 플레이트에 가한 후, 부착 세포를 50 μL의 TRYPLE™ Express Enzyme(Thermo Fisher 카탈로그 번호 12604013)로 제조업체의 프로토콜에 따라 분리했다. 분리된 세포를 현탁 세포가 들어 있는 플레이트로 옮겼다. 이 세포 혼합물은 ATTUNE NxT™ 유세포 분석기(flow cytometer)(Thermo Fisher 카탈로그 번호 A29004)를 통해 실행되었고, 각 샘플에 대해 10,000개의 세포에 대한 GFP 형광값이 측정되었다. 세포는 전방 및 측면 산란을 기반으로 살아있는 단일 세포에 게이팅되었다. GFP에 대한 게이팅은 GFP가 없는 세포를 사용하여 결정되었다. 형질감염 효율은 GFP-양성 게이트에서 세포의 백분율을 결정하여 측정하였고, GFP 발현은 GFP-양성 게이트에서 각 샘플에 대한 형광 강도의 중앙치(MFI)를 취하여 정량화하였다. 데이터는 FLOWJO™ 소프트웨어를 사용하여 분석했다.
도 13에 나타낸 바와 같이, LNA 캡 유사체로 캡핑된 mRNA 전사체는 캡핑되지 않은 mRNA, ARCA 캡 유사체로 캡핑된 mRNA 및 GAG-캡(CLEANCAP™ AG) 캡 유사체로 캡핑된 mRNA와 비교할 때 상당히 더 높은 형질감염 효율을 나타냈다. 또한, 도 14는, LNA 캡 유사체로 캡핑된 mRNA의 발현 효율이, 캡핑되지 않은 mRNA 전사체, ARCA 캡 유사체로 캡핑된 mRNA 전사체 및 GAG-캡(CLEANCAP™ AG) 캡으로 캡핑된 mRNA 전사체에 비해 4배 초과로 더 컸음을 보여준다.
실시예 6:
시험관내 전사 주형의 제조
PLATINUM™ SUPERFI™ II Green PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 12369010)를 사용하여 야생형(WT) T7 프로모터, 5'-UTR, eGFP 및 3'-UTR 서열을 포함하는 DNA 플라스미드로 PCR을 통해 다양한 시험관내 전사(IVT) 주형을 제조했다. 정방향(forward) 프라이머를 통한 부위-지정 돌연변이유발에 의해 변형된 T7 프로모터를 가하였다 (표 4). PURELINK™ PCR 정제 키트(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 K310001)를 사용하여 PCR 산물을 정제하고 물에 100 ng/μL로 희석했다.
시험관내 전사 반응
500 ng의 DNA 주형, 10 μL의 2X NTP/캡 혼합물(아래에 설명됨), 2 μL의 10X T7 반응 완충제 및 2 μL의 T7 효소 혼합물로 20 마이크로리터(20 μL)의 IVT 반응을 수행하였다. 상기 반응 완충제와 효소 혼합물은 MMESSAGE MMACHINE™ T7 Ultra 키트(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 AMB13455)에서 입수하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여 RNA 전사체를 합성했다. 반응이 종결되면, 1 μL의 TURBO™ DNase (Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 AM2239)를 첨가하고, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 DNA 주형을 분해했다. RNA 전사체를, MEGACLEAR™ Transcription Clean-Up 키트(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 AM1908)로 정제했다. NANODROP™ 분광광도계(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 ND-2000C)를 사용하여 정제된 RNA 샘플의 농도를 측정했다.
2X NTP/캡 혼합물은 사용된 캡에 따라 달리 제조되었다. ARCA:GTP 비율이 4:1인 ARCA 혼합물은 각각 3 mM의 GTP, 15 mM의 ATP/CTP/UTP 및 12 mM의 ARCA로 구성되었다. CLEANCAP® 혼합물은 각각 10 mM의 GTP/ATP/CTP/UTP 및 10 mM의 CLEANCAP® (TriLink Biotechnologies, 카탈로그 번호 N-7113)을 함유했다. 상이한 CLEANCAP®:NTP 비율의 시험을 위해, CLEANCAP® 농도를 NTP 농도와 관련하여 변경시켰다(예를 들어, 4:1 CLEANCAP®:NTP 비율은, 2X NTP/캡 혼합물이 10 mM의 각각의 GTP/ATP/CTP/UTP 및 40 mM의 CLEANCAP®를 포함함을 의미한다). 무-캡 반응은 10 mM의 각 NTP를 포함하는 2X NTP 혼합물을 사용했다.
캡핑 효율 분석
예상되는 전사 개시 부위로부터 RNA 전사체 30개 뉴클레오티드를 절단하도록 10-23 DNAzyme이 설계되었다(문헌[Cairns et al., "Optimisation of the 10-23 DNAzyme-substrate pairing Interaction enhanced RNA cleavage activity at purine-cytosine target sites", Nucleic Acids Res. 31(11): 2883-2889 (2003)]). DNAzyme 반응은 50 mM Tris-HCl(pH 7.5)에 1 내지 2 μg의 RNA 및 0.5 μM의 DNAzyme을 포함하는 20 μl 반응으로 수행하였다. 반응 혼합물을 85℃에서 30초 동안 예열하고 37℃에서 5분 동안 평형화하고, 염화마그네슘을 10 mM로 첨가하여 총 부피가 20 μL가 되도록 하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고 2 μL의 TURBO DNase를 첨가하여 반응 중단시키고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션했다.
상기 DNAzyme 반응 혼합물을 2X NOVEX™ TBE-Urea 샘플 완충제(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 LC6876)과 혼합하고 70℃에서 2분 동안 가열하여 겔 분석을 위해 제조했다. 이 샘플을 NOVEX™ 15% TBE-Urea 겔(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 EC68855BOX)에 로딩하고, 15V, 15mA에서 1시간 40분 동안 또는 브로모페놀 블루 염료가 겔의 바닥부로 이동할 때까지 실행했다. 겔을 카세트에서 꺼내어 물로 세척하고 SYBR™ Gold 핵산 겔 스테인 (Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 S11494)으로 5-10분 동안 염색했다. 물로 살짝 씻은 후 겔을 UV 광 위에서 시각화하고 IBRIGHT™ 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 이미지를 캡처했다. 캡핑 효율은, ALPHAVIEW™ 소프트웨어(ProteinSimple)를 사용하여 빠르게 이동하는 전사체와 느리게 이동하는 전사체(캡핑된 전사체가 캡핑되지 않은 전사체보다 길고, 이에 따라 캡핑되지 않은 전사체가 더 빨리 이동함)의 밴드 강도를 측정함으로써 결정되었다.
결과
다수의 실험으로부터의 결과가 도 20 및 표 6 내지 8에 제시되어 있다.
Figure pct00078
표 4는 다양한 프로모터 변형으로 GFP 주형을 생성하는 데 사용되는 PCR 정방향 및 역방향 프라이머를 나열한다.
Figure pct00079
표 5는 변형된 프로모터 및 그 서열을 나열한다. 서열에서 공백 뒤의 염기가 천연 +1 위치이다.
Figure pct00080
표 6은 1:1의 NTP 대 캡 비율을 사용할 때의 다양한 변형된 프로모터에 대한 IVT 수율 및 캡핑 효율을 나열한다. -1 개시 프로모터, HB-MOD2, HB-MOD4, 및 HB-MOD29는 높은 수율과 높은 캡핑 효율을 제공한다.
Figure pct00081
Figure pct00082
변형된 프로모터와 함께 캡:NTP 비율은 각각 표 7 및 8에 나타낸 바와 같이 IVT 수율 및 캡핑 효율에 영향을 미친다.
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SEQUENCE LISTING <110> LIFE TECHNOLOGIES CORPORATION <120> TRINUCLEOTIDE CAP ANALOGS, PREPARATION AND USES THEREOF <130> LT01530PCT <140> <141> <150> 63/197,607 <151> 2021-06-07 <150> 63/047,465 <151> 2020-07-02 <160> 597 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Gly Tyr Ser Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp Pro 1 5 10 15 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Gly Tyr Ser Thr Pro Pro Lys Thr Arg Arg Arg Pro 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Gly Tyr Ser Thr Pro Gly Arg Lys Lys Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" 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Unknown: K11 phage sequence" <400> 594 aattagggca cactataggg aac 23 <210> 595 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 595 tatagggaga 10 <210> 596 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 596 tataaggaga 10 <210> 597 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 597 tatagtgaga 10

Claims (68)

  1. 하기 화학식 (I)의 트리뉴클레오티드 캡 유사체:
    Figure pct00083

    상기 식에서,
    B3은 -OH, 할로겐, 염료, -OR1로부터 선택되고,
    이때 R1은 프로파길, tert-부틸디메틸실릴, 및 4'C와의 메틸렌 가교로부터 선택되고;
    B4는 -OH, 염료, 및 -OR2로부터 선택되며, 이때 R2는 프로파길 및 tert-부틸디메틸실릴로부터 선택되거나;
    또는 R1이 R2와 결합하여 B3과 B4가 -2',3'-O-이소프로필리딘을 형성하고,
    단, B3과 B4는 둘 다 -OH일 수는 없고,
    X는 -H 및 -CH3로부터 선택되고;
    B1 및 B2는 각각 독립적으로 아데닌, 구아닌, 시토신, 및 우라실로부터 선택되고;
    R은 H, 링커(linker)-결합된 세포-투과성 펩티드, 염료에 공유 결합된 링커-결합된 세포-투과성 펩티드, 및 링커-결합된 염료로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, R은
    (a) 서열번호 1 내지 583 중 임의의 것으로부터 선택되는 링커-결합된 세포-투과성 펩티드;
    (b) 염료에 공유 결합된, 서열번호 1 내지 583 중 임의의 것으로부터 선택되는 링커-결합된 세포-투과성 펩티드; 및
    (c) 링커-결합된 염료로부터 선택되는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 염료가 아조벤젠 염료, 나프탈렌 함유 염료, 시아닌 염료, 로다민 염료, 쿠마린, 및 피렌 염료로부터 독립적으로 선택되는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 염료가 하기로부터 독립적으로 선택되는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체:
    Figure pct00084
  5. 제1항에 있어서,
    B3은 -OR1이고 B4는 -OR2이고, 이때 R1이 R2와 결합하여 B3과 B4가 -2',3'-O-이소프로필리덴을 형성하고;
    X는 -CH3이고;
    R은 H인, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  6. 제1항에 있어서,
    B3은 -OR1이고 B4는 -OR2이고, 이때 R1이 R2와 결합하여 B3과 B4가 -2',3'-O-이소프로필리덴을 형성하고,
    R은
    Figure pct00085
    및 염료에 공유 결합된
    Figure pct00086
    로부터 선택되는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  7. 제1항에 있어서,
    B3은 -OR1로부터 선택되며, 이때 R1은 프로파길 및 tert-부틸디메틸실릴로부터 선택되고;
    B4는 -OH이고;
    R은 H인, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  8. 제1항에 있어서,
    B3은 -OR1로부터 선택되며, 이때 R1은 프로파길 및 tert-부틸디메틸실릴로부터 선택되고;
    B4는 -OH이고;
    R은
    Figure pct00087
    및 염료에 공유 결합된
    Figure pct00088
    로부터 선택되는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  9. 제1항에 있어서,
    B3은 염료이고;
    B4는 -OH이고;
    R은 H인, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  10. 제1항에 있어서,
    B3은 염료이고;
    B4는 -OH이고;
    R은
    Figure pct00089
    및 염료에 공유 결합된
    Figure pct00090
    로부터 선택되는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  11. 제6항 및 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 염료가 아조벤젠 염료, 나프탈렌 함유 염료, 시아닌 염료, 로다민 염료, 쿠마린, 및 피렌 염료로부터 독립적으로 선택되는 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  12. 제6항 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 염료가 하기로부터 독립적으로 선택되는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체:
    Figure pct00091
  13. 제1항에 있어서,
    B3은 -OH이고;
    B4는 -OR2로부터 선택되고, 이때 R2는 프로파길 및 tert-부틸디메틸실릴로부터 선택되고;
    R은 H인, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  14. 제1항에 있어서,
    B3은 -OH이고;
    B4는 -OR2로부터 선택되고, 이때 R2는 프로파길 및 tert-부틸디메틸실릴로부터 선택되고;
    R은
    Figure pct00092
    및 염료에 공유 결합된
    Figure pct00093
    로부터 선택되는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  15. 제1항에 있어서,
    B3은 -OH이고;
    B4는 염료이고;
    R은 H이고;
    X는 -CH3인, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  16. 제1항에 있어서,
    B3은 -OH이고;
    B4는 염료이고;
    R은
    Figure pct00094
    및 염료에 공유 결합된
    Figure pct00095
    로부터 선택되는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 염료가 아조벤젠 염료, 나프탈렌 함유 염료, 시아닌 염료, 로다민 염료, 쿠마린, 및 피렌 염료로부터 독립적으로 선택되는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 염료가 하기로부터 독립적으로 선택되는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체:
    Figure pct00096
  19. 제1항에 있어서, B3이-OR1이고, R1이 4'C와 메틸렌 가교를 형성하여 트리뉴클레오티드 캡 유사체가 하기 화학식 (II)을 갖도록 하는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체:
    Figure pct00097
  20. 제19항에 있어서, R이
    a. 서열번호 1 내지 583 중 임의의 것으로부터 선택되는 링커-결합된 세포-투과성 펩티드;
    b. 염료에 공유 결합된, 서열번호 1 내지 583 중 임의의 것으로부터 선택되는 링커-결합된 세포-투과성 펩티드로부터 선택되는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 각각의 염료가 아조벤젠 염료, 나프탈렌 함유 염료, 시아닌 염료, 로다민 염료, 쿠마린, 및 피렌 염료로부터 독립적으로 선택되는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 염료가 하기로부터 독립적으로 선택되는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체:
    Figure pct00098
  23. 제19항에 있어서,
    B4는 -OH이고 R은 H인, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  24. 제19항에 있어서,
    B4는 -OH이고; R은
    Figure pct00099
    및 염료에 공유 결합된
    Figure pct00100
    로부터 선택되는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  25. 제19항에 있어서,
    B4는 염료이고; R은 H인, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 각각의 염료가 아조벤젠 염료, 나프탈렌 함유 염료, 시아닌 염료, 로다민 염료, 쿠마린, 및 피렌 염료로부터 독립적으로 선택되는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 염료가 하기로부터 독립적으로 선택되는, 트리뉴클레오티드 캡 유사체:
    Figure pct00101
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 트리뉴클레오티드 캡 유사체를 포함하는 조성물.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 트리뉴클레오티드 캡 유사체가 공유 결합되어있는 RNA를 포함하는 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 적어도 하나의 RNA 전달제를 추가로 포함하는 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 적어도 하나의 RNA 전달제가 하나 이상의 양이온성 지질을 포함하는, 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 적어도 하나의 RNA 전달제가 하나 이상의 중성 지질을 추가로 포함하는, 조성물.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 전달제가 세포-투과성 펩티드로부터 선택되는, 조성물.
  34. 제31항에 있어서, 적어도 하나의 양이온성 지질이, 2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼민카복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 1,3-디올레오일옥시-2-(6-카복시-스퍼밀) 프로필아미드(DOSPER), 디옥타데실아미도-글리실스퍼민(DOGS), 테트라메틸테트라팔미틸스퍼민(TMTPS), 테트라메틸테트라팔미토일스퍼민(TMTOS), 테트라메틸테트라라우릴 스퍼민(TMTLS), 테트라메틸테트라미리스틸 스퍼민(TMTMS), 테트라메틸디올레일스퍼민(TMDOS), N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아올레오일옥시프로필)-2-히드록시프로판-1,3-디아민, N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아미리스틸옥시프로필)-2-히드록시프로판-1,3-디아민, N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아팔미틸옥시프로필)-2-히드록시프로판-1,3-디아민, N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아올레오일옥시프로필)-2-(3-아미노-2-히드록시프로필옥시)프로판-1,3-디아민, N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아미리스틸옥시프로필)-2-(3-아미노-2-히드록시프로필옥시)프로판-1,3-디아민, N-1-디메틸-N-1-(2,3-디아팔미틸옥시프로필)-2-(3-아미노-2-히드록시프로필옥시)프로판-1,3-디아민, L-스페민-5-카복실-3-(DL-1,2-디팔미토일-디메틸아미노프로필-β-히드록시에틸아민, 3,5-(N,N-디-리실)-디아미노벤조일-글리실-3-(DL-1,2-디팔미토일-디메틸아미노프로필-β-히드록시에틸아민), L-리신-비스(O,O'-올레오일-β-히드록시에틸) 아미드 디히드로클로라이드, L-리신-비스-(O,O'-팔미토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 1,4-비스[(3-(3-아미노프로필)-알킬아미노)-2-히드록시프로필)피페라진, L-리신-비스-(O,O'-미리스토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, L-오르니틴-비스-(O,O'-미리스토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, L-오르니틴-비스-(O,O'-올레오일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 1,4-비스[(3-(3-아미노프로필)-올레일아미노)-2-히드록시프로필]피페라진, L-오르니틴-비스-(O,O'-팔미토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 1,4-비스[(3-아미노-2-히드록시프로필)-올레일아미노]-부탄-2,3-디올, 1,4-비스[(3-아미노-2-히드록시프로필)-팔미틸아미노]-부탄-2,3-디올, 1,4-비스[(3-아미노-2-히드록시프로필)-미리스틸아미노]-부탄-2,3-디올, 1,4-비스[(3-올레일아미노)프로필]피페라진, L-아르기닌-비스-(O,O'-올레오일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 비스[(3-(3-아미노프로필)-미리스틸아미노)-2-히드록시프로필]피 페라진, L-아르기닌-비스-(O,O'-팔미토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, L-세린-비스-(O,O'-올레오일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 1,4-비스[(3-(3-아미노프로필)-팔미틸아미노)-2-히드록시프로필]피페라진, 글리신-비스-(O,O'-팔미토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 사르코신-비스-(O,O'-팔미토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, L-히스티딘-비스-(O,O'-팔미토일-β-히드록시에틸)아미드 디히드로클로라이드, 콜레스테릴-3β-카복실-아미도에틸렌트리메틸암모늄 요오다이드, 1,4-비스[(3-미리스틸아미노)프로필]피페라진, 1-디메틸아미노-3-트리메틸암모니오-DL-2-프로필-콜레스테릴 카복실레이트 요오다이드, 콜레스테릴-3β-카복시아미도에틸렌아민, 콜레스테릴-3β-옥시숙신아미도에틸렌트리메틸암모늄 요오다이드, 1-디메틸아미노-3-트리메틸암모니오-DL-2-프로필-콜레스테릴-3β-옥시숙시네이트 요오다이드, 2-[(2-트리메틸암모니오)-에틸메틸아미노]에틸-콜레스테릴-3β-옥시숙시네이트 요오다이드, 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 및 3β-[N-(폴리에틸렌이민)-카바모일]콜레스테롤, 1,4-비스[(3-팔미틸아미노)프로필]피페라진, L-오르니틸글리실-N-(1-헵타데실옥타데실)글리신아미드, N2,N5-비스 (3-아미노프로필)-L-오르니틸글리실-N-(1-헵타데실옥타데실)글리신아미드, 1,4-아미노-2-히드록시프로필)-알킬아미노)-2-히드록시프로필]피페라진, N2-[N2,N5-비스(3-아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디옥타데실-L-비스[(3-(3-글루타민, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디옥타데실-L-α-글루타민, 1,4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-올레일아미노)2-히드록시프로필]피페라진, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디옥타데실-L-α-아스파라긴, N-[N2-[N2,N5-비스[(1,1-디메틸 에톡시)카보닐]-N2,N5-비스[3-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]아미노프로필]-L-오르니틸-N,N-디 옥타 데실-L-글루타미닐]-L-글루탐산, N2-[N2,N5-비스(3-아미노프로필)-L-오르니틸 ]-N,N-디올레일-L-글루타민, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디올레일-L-α-글루타민, 4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-미리스틸아미노)-2-히드록시프로필]피페라진, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디올레일-L-α-아스파라긴, N-[N2,N5-비스[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]-N2,N5-비스[3-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]아미노프로필]-L-오르니틸-N,N-디올레일-L-글루타미닐]-L-글루탐산, 1,4-비스[(3-(3-아미노프로필)-올레일아미노)프로필]피페라진, N2-[N2,N5-비스(3-아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디팔미틸-L-글루타민, N2-[N2,N5-비스 (아미노프로필)-L-오르니틸]-N--디팔미틸-L-α-글루타민, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디팔미틸-L-α-아스파라긴, N-[N2-[N2,N5-비스[(1,1-디메틸에톡시) 카보닐]-N2,N5-비스[3-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐] 아미노프로필]-L-오르니틸-N,N-디팔미틸-L-글루타미닐]-L-글루탐산, N2-[N2,N5-비스(3-아미노프로필)-L-오르니틸 ]-N,N-디아미리스틸-L-글루타민, N2-[N2,N5-비스 (아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디아미리스틸-L-α-글루타민, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디아미리스틸-L-α-아스파라긴, 1,4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-팔미틸아미노)-2-히드록시프로필]피페라진, N-[N2-[N2,N5-비스[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]-N2,N5-비스[3-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]아미노프로필]-L-오르니틸-N,N-디아미리스틸-L-글루타미닐]-L-글루탐산, 1,4-비스[(3-(3-아미노프로필)-미리스틸아미노)프로필]피페라진, N2-[N2,N5-비스(3-아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디라우릴-L-글루타민, N2-8 N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디라우레일-L-α-글루타민, N2-[N2,N5-비스(아미노프로필)-L-오르니틸]-N,N-디라우레일-L-α-아스파라긴, N-[N2-[N2,N5-비스[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]-N2,N5-비스[3-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]아미노프로필]-L-오르니틸-N--디라우레일-L-글루타미닐]-L-글루탐산, 3-[N',N"-비스(2-tert-부틸옥시카보닐아미노에틸)구아니디노]-N,N-디옥타덱-9-에닐프로피온아미드, 3-[N',N"-비스(2-tert-부틸옥시카보닐아미노에틸)구아니디노]-N,N-디팔미틸프로피온아미드, 3-[N',N"-비스(2-tert-부틸옥시카보닐아미노에틸)구아니디노]-N,N-디미리스틸프로피온아미드, 1,4-비스[(3-(3-아미노프로필)-팔미틸아미노)프로필]피페라진, 1,4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-올레일아미노)프로필]피페라진, N,N-(2-히드록시-3-아미노프로필)-N-2-히드록시프로필-3-N,N-디올레일아미노프로판, N,N-(2-히드록시-3-아미노프로필)-N-2-히드록시프로필-3-N,N-디팔미틸아미노프로판, N,N-(2-히드록시-3-아미노프로필)-N-2-히드록시프로필-3-N,N-디미리스틸아미노프로판, 1,4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-미리스틸아미노)프로필]피페라진, [(3-아미노프로필)-비스-(2-테트라데실옥시에틸)]메틸 암모늄 브로마이드, [(3-아미노프로필)-비스(2-올레일옥시에틸)]메틸 암모늄 브로마이드, [(3-아미노프로필)-비스-(2-팔미틸옥시에틸)]메틸 암모늄 브로마이드, 올레오일-2-히드록시-3-N,N-디메틸아미노프로판, 2-디데카노일-1-N,N-디메틸아미노프로판, 팔미토일-2-히드록시-3-N,N-디메틸아미노프로판, 1,2-디팔미토일-1-N,N-디메틸아미노프로판, 미리스토일-2-히드록시-3-N,N-디메틸아미노프로판, 1,2-디미리스토일-1-N,N-디메틸아미노프로판, (3-아미노-프로필)->4-(3-아미노-프로필아미노)-4-테트라데실카바모일-부틸카밤산 콜레스트릴 에스테르, (3-아미노-프로필)->4-(3-아미노-프로필아미노-4-카바모일부틸카밤산 콜레스트릴 에스테르, (3-아미노-프로필)->4-(3-아미노-프로필아미노)-4-(2-디메틸아미노-에틸카바모일)-부틸카밤산 콜레스트릴 에스테르, 스퍼민-5-카복시글리신(N'-스테아릴-N'-올레일)아미드테트라트리플루오로아세트산 염, 스퍼민-5-카복시글리신(N'-스테아릴-N'-엘라이딜)아미드 테트라트리플루오로아세트산 염, 아그마티닐 카복시콜레스테롤아세트산 염, 5-카복시-β-알라닌 콜레스테릴 에스테르 테트라트리플루오로아세트산 염, 2,6-디아미노헥사노오일 β-알라닌 콜레스테릴 에스테르 비스트리플루오로아세트산 염, 2,4-디아미노부티로일 β-알라닌 콜레스테릴 에스테르 비스트리플루오로아세트산 염, N,N-비스(3-아미노프로필)-3-아미노프로피오닐 β-알라닌 콜레스테릴 에스테르 트리스트리플루오로아세트산 염, [N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에틸]아미노카복시 콜레스테릴 에스테르, 스테아릴 카르니틴 에스테르, 팔미틸 카르니틴 에스테르, 미리스틸 카르니틴 에스테르, 스테아릴 스테아로일 카르니틴 에스테르 클로라이드 염, L-스테아릴 스테아로일 카르니틴 에스테르, 스테아릴 올레오일 카르니틴 에스테르 클로라이드, 팔미틸 팔미토일 카르니틴 에스테르 클로라이드, 미리스틸 미리스토일 카르니틴 에스테르 클로라이드, L-미리스틸 미리스토일 카르니틴 에스테르 클로라이드, 1,4-비스[(3-(3-아미노-2-히드록시프로필)-팔미틸아미노)프로필]피페라진, N-(3-아미노프로필)-N,N'-비스-(도데실옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N,N'-비스-(올레일옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N,N'-비스-(팔미틸옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N,N'-비스-(미리스틸옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N'-메틸-N,N'-(비스-2-도데실옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N'-메틸-N,N'-(비스-2-올레일옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N'-메틸-N,N'-(비스-2-팔미틸옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드, N-(3-아미노프로필)-N'-메틸-N,N'-(비스-2-미리스틸옥시에틸)-피페라지늄 브로마이드로부터 선택되고, 상기 조성물 및 방법에 유용한 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린(DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디운데카노일-sn-글리세로-포스포콜린(DUPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디-O-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린(18:0 디에테르 PC), 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린 (C16 Lyso PC), 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(ME 16.0 PE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-rac-(1-글리세롤)나트륨염(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올 아민(DSPE), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민(SOPE), 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜콜린(SOPC), 스핑고미엘린, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딘산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민(LPE),
    Figure pct00102

    Figure pct00103

    Figure pct00104

    Figure pct00105

    Figure pct00106

    Figure pct00107

    Figure pct00108

    Figure pct00109
    으로 구성된 비제한적 군으로부터 선택될 수 있는, 조성물.
  35. 제32항에 있어서, 적어도 하나의 중성 지질이 콜레스테롤, 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 및 디피타노일포스파티딜에탄올아민(DDhPE)으로부터 선택되는, 조성물.
  36. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  37. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 트리뉴클레오티드 캡 유사체;
    뉴클레오티드 트리포스페이트 분자; 및
    RNA 중합 효소를 포함하는 키트.
  38. 트리뉴클레오티드 캡핑된 RNA를 제조하는 방법으로서,
    핵산 기질을 RNA 중합 효소 및 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 트리뉴클레오티드 캡 유사체와 접촉시키는 것을 포함하며,
    이때 접촉은 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재 하에 수행되고,
    접촉은 트리뉴클레오티드 캡핑된 RNA를 생성하기에 충분한 조건 및 시간 동안 수행되는, 방법.
  39. 세포를 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 트리뉴클레오티드 캡 유사체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  40. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 트리뉴클레오티드 캡 유사체를 RNA 내로 혼입시키는 것을 포함하는, RNA의 세포내 안정성을 증가시키는 방법.
  41. 제28항의 조성물을 하나 이상의 양이온성 지질, 선택적으로 하나 이상의 중성 지질, 및 선택적으로 하나 이상의 PEG 지질, 및 선택적으로 하나 이상의 세포-투과성 펩티드, 또는 이들의 임의의 조합물과 조합하는 것을 포함하는, 지질 나노입자의 제조 방법.
  42. 세포를 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, RNA를 세포에 도입하는 방법.
  43. 세포를 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서의 RNA 번역 억제 방법.
  44. 백신 제조에 있어서의 제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  45. 전사 개시 복합체로서,
    a. 주형 가닥을 포함하는 전사 개시 부위를 포함하는 프로모터 영역을 포함하는 핵산 분자, 및
    b. 주형 가닥을 포함하는 전사 개시 부위에 적어도 -1 및 +1 위치, +1 및 +2 위치, 또는 +2 및 +3 위치에서 혼성화된 2개 이상의 염기를 포함하는 캡핑된 프라이머를 포함하며,
    개시 부위의 비-주형 가닥의 인접 위치에 있는 적어도 하나의 뉴클레오티드가 전사 개시 차단 뉴클레오티드인, 전사 개시 복합체.
  46. 제45항에 있어서, 하나 이상의 전사 개시 차단 뉴클레오티드가 개시 부위의 3' 및 5' 말단 모두에 인접한, 전사 개시 복합체.
  47. 제44항 또는 제45항에 있어서, 하나 이상의 전사 개시 차단 뉴클레오티드가 (A) 티미딘, (B) 시토신, (C) 아데노신, 및 (D) 화학적으로 변형된 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 전사 개시 복합체.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 가닥이 상보적인 비-주형 가닥에 부분적으로 혼성화되는, 전사 개시 복합체.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 가닥이 -1 위치 및/또는 +1 위치에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 함유하는, 개시 복합체.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 가닥이 -1 위치 및/또는 +1 위치에 2'-데옥시티미딘 잔기 및/또는 2'-데옥시시티딘 잔기를 함유하는, 전사 개시 복합체.
  51. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 주형 가닥의 -1 위치, +1 위치, 및 +2 위치가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 전사 개시 복합체:
    a. A G T,
    b. A A T,
    c. A G C,
    d. A A C,
    e. A G A,
    f. A A A,
    g. G A T,
    h. G A C,
    i. G A A,
    j. G G T,
    k. G G C,
    l. G G A,
    m. A T T,
    n. A T C, 및
    o. A T A.
  52. a. 주형 가닥을 포함하는 전사 개시 부위를 포함하는 프로모터 영역을 포함하는 핵산 분자, 및
    b. 적어도 뉴클레오티드의 -1 및 +1 위치 또는 +2 및 +3 위치에서 DNA 주형에 혼성화된 3개 이상의 염기를 포함하는 비-천연성 캡핑된 프라이머를 포함하는, 전사 개시 복합체.
  53. 제52항에 있어서, 비-천연성 캡핑된 프라이머가 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 캡 유사체를 포함하는, 전사 개시 복합체.
  54. 프로모터를 포함하는 핵산 분자로서, 상기 프로모터는 TATY1 Y2Z의 비-주형 가닥 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    이때 Y1은 -1 위치에 있고, Y2는 +1 위치에 있고, Z는 +2 위치에 있고,
    Z는 전사 개시 차단 뉴클레오티드인, 핵산 분자.
  55. 제54항에 있어서, Z는 아데노신, 시토신, 또는 티미딘인, 핵산 분자.
  56. 제54항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 (a) 5' - T A T A G T - 3', (b) 5' - T A T A G C - 3', 및 (c) 5' - T A T A A C - 3'로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
  57. mRNA 분자의 생성 방법으로서, 전사 반응에 의한 mRNA 분자의 생성을 허용하는 조건 하에서 DNA 주형을 캡핑된 프라이머 및 RNA 중합 효소와 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 DNA 주형은
    a. 주형 가닥을 포함하는 전사 개시 부위를 포함하는 프로모터 영역을 포함하는 핵산 분자, 및
    b. 주형 가닥을 포함하는 전사 개시 부위에 적어도 -1 및 +1 위치, +1 및 +2 위치, 또는 +2 및 +3 위치에서 혼성화된 2개 이상의 염기를 포함하는 캡핑된 프라이머를 포함하고,
    적어도 상기 개시 부위의 주형 가닥의 5' 인접 위치에 있는 뉴클레오티드는 전사 개시 차단 뉴클레오티드인, 방법.
  58. 제57항에 있어서, RNA 중합 효소가 박테리오파지 RNA 중합 효소인, 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 박테리오파지 RNA 중합 효소가 T7 박테리오파지, T3 박테리오파지, SP6 박테리오파지, 또는 K11 박테리오파지 RNA 중합 효소 또는 그의 변이체인, 방법.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 분자가 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 반응이 시험관내에서 일어나는, 방법.
  62. 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질을 생성하기 위한 mRNA 분자의 번역을 추가로 포함하는 방법.
  63. 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 분자의 번역이 시험관내에서 또는 생체내에서 일어나는, 방법.
  64. 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 분자의 번역이, 커플링된 전사/번역 시스템에서 시험관내에서 일어나는, 방법.
  65. 제57항 내지 제64항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득될 수 있는 RNA 분자.
  66. 제57항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 mRNA 분자의 적어도 70%가 캡핑되는, 방법.
  67. 제57항 내지 제64항 및 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 캡핑된 mRNA 분자의 수율이 3 mg/반응 혼합물 ml를 초과하는, 방법.
  68. 제37항에 있어서, RNase 억제제, 무기 피로포스파타제, Mg2+, 크라우딩제(crowding agent), 완충제 또는 이들의 임의의 조합물 중 하나 이상을 추가로 포함하는 키트.
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