KR20230023727A - 나노지단백질-폴리펩티드 접합체 및 조성물, 시스템, 및 이의 사용 방법 - Google Patents

나노지단백질-폴리펩티드 접합체 및 조성물, 시스템, 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20230023727A
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휘트니 빈더
크레이그 디. 블량셰
마틴 에이. 다르위시
라미 한노우시
신신 가오
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 일반적으로 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 나노지단백질 입자 접합체 및 20-60개 아미노산 길이의 적어도 하나의 짧은 펩티드를 포함하는 나노지단백질 입자 접합체에 관한 것이다. 또한 관련 조성물 및 시스템, 이의 제조 및 사용 방법이 제공된다. 특히, 항원-결합 단편(Fab)을 갖는 나노지질단백질 입자(NLP) 접합체가 제공되며, 여기서 NLP는 스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 막-형성 지질의 이중층을 포함하고, Fab는 이중층 표면의 하나 또는 둘 모두에 접합된다. 일부 실시형태에서, (NLP) 접합체는 20-60개 아미노산 길이의 짧은 펩티드를 추가로 포함한다. 접합체 및 관련 조성물 및 시스템은 일반적으로 우수한 안정성 및 제조 가능성을 나타내고, 항원-결합 활성을 유지하고, 항원-결합 효능을 향상시킬 수 있어 Fab 및 Fab 기반 치료제 및 진단제의 전달을 위한 다목적 플랫폼을 제공할 뿐만 아니라 그 외 다른 치료제 및/또는 진단제를 전달하기 위한 안정적인 플랫폼을 제공할 수 있다.

Description

나노지단백질-폴리펩티드 접합체 및 조성물, 시스템, 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 6월 11일에 출원된 미국 가출원 63/038,075; 2021년 2월 19일에 출원된 미국 가출원 63/151,591의 우선권을 주장하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
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다음과 같은 ASCII 텍스트 파일 제출 내용은 그 전체가 본원에 참고문헌으로 포함된다: 컴퓨터 판독가능한 형태 (CRF)의 서열 목록 (파일명: 146392052840SEQLIST.TXT, 기록일자: 2021년 6월 7일, 크기: 1 KB).
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 적어도 하나의 접합된 폴리펩티드(예를 들어, 공유적으로 접합된 폴리펩티드)를 포함하는 나노지단백질 입자 접합체, 관련 조성물 및 시스템, 및 이를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다. 특히, 항원-결합 단편(Fab)을 갖는 나노지질단백질 입자(NLP) 접합체가 제공되며, 여기서 NLP는 스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 막-형성 지질의 이중층을 포함하고, Fab는 이중층 표면의 하나 또는 둘 모두에 접합된다. NLP-Fab 접합체 및 관련 조성물 및 시스템은 일반적으로 우수한 안정성 및 제조 가능성을 나타내고, 항원-결합 활성을 유지하고, 항원-결합 효능을 향상시킬 수 있어 Fab 및 Fab 기반 치료제 및 진단제의 전달을 위한 다목적 플랫폼을 제공할 뿐만 아니라 그 외 다른 치료제 및/또는 진단제를 전달하기 위한 안정적인 플랫폼을 제공할 수 있다. 본 발명은 또한 예를 들어, 접합된 폴리펩티드에 더하여, 또는 접합된 폴리펩티드 대신에 적어도 하나의 접합된 펩티드를 포함하는 나노지단백질 입자 접합체에 관한 것이다.
배경기술
지난 10년 동안 나노 기술 분야의 발전은 기존 약물 전달 시스템의 한계를 해결하기 위해 노력해 왔다. 무기 나노입자, 고분자 기반 나노입자, 고분자 미셀, 덴드리머, 리포좀, 바이러스 나노입자, 탄소 나노튜브 및 나노지단백 입자(NLP)를 비롯한 다양한 나노입자가 지난 수십 년 동안 개발되었다.
NLP는 일반적으로 양친매성 지질과 아포지질 단백질로 구성된 나노미터 크기의 입자들로서 자기조립(self-assemble)되어 디스크의 소수성 주변부가 아포지질 단백질에 결합하여 안정화되는 원반형 지질 이중층을 형성한다. 일부 응용 프로그램 및 약물 카고를 위한 NLP가 연구되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 어떠한 연구도 단편 항체(Fab)의 전달에 관해 이 플랫폼을 평가한 적이 없었다.
따라서, 항원-결합 폴리펩티드를 전달하고/하거나 다른 치료제 및 진단제를 표적화하기 위한 신규한 NLP 전달 플랫폼, 특히 양호한 제조가능성을 갖는 안정한 조성물 및 시스템에 대한 수요가 존재한다. 본 발명은 이들 및 다른 수요를 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 일반적으로 나노지단백질-폴리펩티드 접합체 및 조성물, 시스템, 및 이러한 접합체의 제조 및 사용 방법에 관한 것이며, 이때 나노지단백질 입자는 일부 실시형태들에서 폴리펩티드, 예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 또는 시스테인 매듭 펩티드 (CKP)에 접합되어, 놀라운 성질을 가지는 접합체를 제공한다. 본 발명의 접합체는 저독성, 저면역원성, 우수한 안정성(가교결합제 없음), 우수한 제조가능성(고농축이지만 점도가 낮은 제제의 실시가능한 생산 포함), 입자간 가교결합이 최소이거나 전혀 없음, 상대적으로 균질한 NLP 집단 및/또는 향상된 항원-결합 효능과 같은 장점 및 개선점을 제공할 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 스캐폴드 단백질, 막-형성 지질 및 항원-결합 폴리펩티드를 포함하는 접합체를 제공하며, 여기서 막-형성 지질은 지질 이중층으로 배열되고 스캐폴드 단백질은 이중층을 둘러싸며; 여기서 항원-결합 폴리펩티드는 하나 이상의 막-형성 지질 상의 작용기 및 상기 항원-결합 폴리펩티드 상의 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 통해 이중층의 한쪽 또는 양쪽 표면 상의 막-형성 지질 중 하나 이상에 접합된다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 Fab이다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 작용기화 기를 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서는 상보적 작용기를 항원-결합 폴리펩티드에 연결한다. 일부 실시예에서, 스페이서는 GSGS이다.
일부 실시형태에서, 작용기화 기는 말레이미드 유도체, 할로아세트아미드, 피리딜디티오-프로피오네이트, 티오설페이트, 및 이들 중 어느 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 일부 실시형태에서, 상보적 작용기는 시스테인 티올기와 같은 유리 티올기이고, 선택적으로 이때 시스테인은 항원-결합 폴리펩티드가 유래된 항체에서 힌지 이황화 결합을 형성한다(예를 들어, Kabat 넘버링에 따라 Cys-226 또는 Cys-227). 일부 실시형태들에서, 상기 스캐폴드 단백질은 (a) 아포지단백질 A, (b) 아포지단백질 B, (c) 아포지단백질 C, (d) 아포지단백질 D, (e) 아포지단백질 H, (f) 아포지단백질 E, (g) 상기 이중층을 안정화시킬 수 있는 (a)-(f)의 절단된 버전, 및 (h) (a)-(g) 중 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실(예를 들어, C16 지방-아실), DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC, 및 이들 중 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태들에서, 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고 그리고 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합된다.
일부 실시형태들에서, 스캐폴드 단백질, 막-형성 지질, 및 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드를 포함하는 접합체가 제공되며, 여기서 상기 막-형성 지질은 지질 이중층으로 배열되며 상기 스캐폴드 단백질은 상기 이중층을 둘러싸고; 및 여기서 상기 짧은 펩티드는 상기 이중층의 한쪽 또는 양쪽 표면에서 하나 이상의 상기 막-형성 지질에 접합된다. 일부 실시형태들에서, 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실(예를 들어, C16 지방-아실), DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC, 및 이들 중 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태들에서, 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고 그리고 상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합된다.
일부 실시형태들에서, 지방-아실은 C16 지방-아실이다. 일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드는 시스틴 매듭 펩티드이다CKP). 일부 실시형태에서, CKP는 EETI-II이다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드는 다음을 포함하는 CKP 변이체이다: (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서의 화학적 변형; 및/또는 (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형. 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 그의 N-말단에 추가적인 리신 잔기를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 야생형 CKP는 EETI-II이다.
일부 실시형태에서, 접합체(예를 들어, 짧은 펩티드 및 항원-결합 폴리펩티드를 포함하는 NLP 접합체)에서 짧은 펩티드의 활성은 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체에서의 펩티드의 활성보다 더 높다. 일부 실시형태들에서, 접합체 내의 펩티드의 활성은 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 2배 내지 10배 더 높다. 일부 실시형태들에서, 접합체 내의 펩티드의 활성은 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 약 5배 더 높다. 일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드는 생물학적 활성을 갖는 CKP 또는 CKP 변이체이고, 그리고 상기 활성의 80-90%, 90-95%, 또는 95-99%가 상기 접합체에서 유지된다. 일부 실시형태들에서, 상기 접합체는 상기 짧은 펩티드의 활성 또는 결합력을 증가시킨다. 일부 실시형태들에서, 접합체(예를 들어, 펩티드-NLP 접합체)는 하나 이상의 상기 막-형성 지질 상의 작용기화 기 및 상기 항원-결합 폴리펩티드 상의 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 통해 상기 이중층의 한쪽 또는 양쪽 표면 상의 하나 이상의 상기 막-형성 지질에 접합되는 항원-결합 폴리펩티드를 포함하고; 선택적으로 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서는 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결한다. 일부 실시형태들에서, 접합체는 1-100개의 상기 Fab 분자를 포함하고; 선택적으로 상기 접합체는 5-30, 10-25, 15-20, 또는 18개의 상기 펩티드 분자, 및 5-40, 10-35, 15-30, 20-25, 또는 23개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하고; 또는 선택적으로 상기 접합체는 3-30, 5-20, 10-15, 또는 13개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하고; 또는 선택적으로 상기 접합체는 20-80, 25-70, 30-60, 35-50, 또는 40개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab) 분자를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 접합체는 적어도 2개의 상이한 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체를 포함하고, 여기서 제1 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체는 제1 짧은 펩티드를 포함하고, 제2 펩티드-C4-28 지방-아실은 제1 짧은 펩티드와 상이한 제2 짧은 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 적어도 2개의 펩티드(예를 들어, 시스틴 매듭 펩티드)는 상이한 표적, 선택적으로 2, 3, 4 또는 8개의 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태들에서, 2개 이상의 짧은 펩티드는 2개의 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태들에서, 표적은 CD3 및 CD19; CD3 및 EpCAM; CD3 및 CEA; CD16 및 CD30; CD16 및 CD33; Ang-2 및 VEGF-A; 및 인자 X 및 인자 IXa로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍이다.
일부 실시형태들에서, 스캐폴드 단백질 및 상기 막-형성 지질은 몰비가 1:60 내지 1:100, 예를 들어, 1:80이다. 일부 실시형태들에서, 막-형성 지질의 20-35%, 예를 들어 20%는 작용기화 기를 보유한다. 항원-결합 폴리펩티드는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 단일 사슬 Fab(scFab), 단일 사슬 Fv(scFv), VH-VH 이량체, VL-VL 이량체, VH-VL 이량체, 단일 도메인, 디아바디, 선형 항체 및 이의 어느 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 항원-결합 폴리펩티드는 Fab 또는 Fab-유사 분자, 예를 들어, 인간 또는 인간화 Fab이다. 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)에 의해 결합된 항원은 OX40, DR4, GITR, Tie2, 인자 D, VEGF, MerTK, CD3 및/또는 림프톡신 베타 수용체일 수 있다.
상기 접합체는 다가 및/또는 다중-특이적 구조체에 관한 형식들을 제공할 수 있다. 예를 들어, 접합체는 2개 이상의 항원-결합 폴리펩티드 분자(예를 들어, 2개 이상의 Fab 분자), 예를 들어, 2-60, 2-32, 10-30, 또는 20개 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 스페이서는 PEG 또는 GSGS의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 접합체는 1-160, 10-120, 20-100, 40-80, 또는 60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자를 가지며; 여기서 상기 항원-결합 폴리펩티드는 Fab이고 상기 Fab는 PEG 스페이서에 의해 상기 막-형성 지질에 연결된다. 일부 실시형태들에서, PEG 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하며 1000-3000, 1500-2500, 1900-2200 또는 2000의 MW를 가진다.
이러한 형식은 항원-결합 폴리펩티드의 활성 및/또는 결합력, 이의 혈청 안정성 및/또는 이의 혈청 반감기를 (나노지단백질 입자(NLP)에 접합되지 않은 항원-결합 폴리펩티드에 비해) 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태들에서, 항원-결합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 2-20배, 5-15배, 또는 10배 증가된다. 일부 실시형태들에서, 상기 접합체는 5-60, 6-40, 또는 7-32개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자를 갖는다.
일부 실시형태에서, 접합체는 상이한 표적 또는 에피토프, 예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 8개의 상이한 표적 또는 에피토프에 결합하는 둘 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 둘 이상의 Fab)를 포함한다. 이러한 형식은, 예를 들어, 표적이 CD3 및 CD19; CD3 및 EpCAM; CD3 및 CEA; CD16 및 CD30; CD16 및 CD33; Ang-2 및 VEGF-A; 및 인자 X 및 인자 IXa로 구성된 그룹에서 선택된 쌍인 이중특이성 구조체를 제공할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 항원-결합 폴리펩티드는 Fab 또는 Fab-유사 분자, 선택적으로, 인간 또는 인간화 Fab이다.
본 발명의 접합체는 상기 접합체 및 약학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 약학 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 100-300 mg의 접합체를 포함하고 10-50 cP의 점도를 갖는 액체 제제와 같은 고농도, 저점도 액체 제제를 제공한다. 일부 실시형태들에서, 약학 조성물 또는 액체 제제는 피하로 또는 안구 전달을 통해 투여된다. 일부 실시형태에서, 접합체, 조성물 또는 제형은 트레할로스의 존재 하에서와 같이 동결건조되고; 선택적으로 재구성된다. 특정 실시형태에서, 동결건조는 80mM 트레할로스의 존재 하에; 및/또는 접합체 5 mg/mL의 농도에서 일어난다. 일부 실시형태들에서, 접합체는 접합체 당 18-20개의 Fab 분자를 포함한다. 유리하게는, 일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)의 항원-결합 활성의 80-90%, 90-95%, 또는 95-99%가 동결건조 및 재구성 후에 유지된다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명의 접합체를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 a) 스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 막-형성 지질의 지질 이중층을 포함하는 나노지단백질 입자의 조립을 허용하는 조건 하에서 상기 스캐폴드 단백질 및 상기 막-형성 지질을 제공하는 단계(여기서 하나 이상의 막-형성 지질은 입자의 한쪽 또는 양쪽 표면에 작용기화 기를 제공함); b) 4.5 내지 6.5 pH 범위의 낮은 pH에서 작용기화 기에 접합하는 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 갖는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)와 입자를 접촉하게 하는 단계; 및 c) 선택적으로 입자와 항원-결합 폴리펩티드의 접합체를 정제하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 b)는 조립되지 않은 막-형성 지질의 일부 또는 전부를 제거하는 중간 단계 없이 단계 a) 다음에 이어진다. 특정 실시형태에서, 작용기화 기는 말레이미드 유도체이고 작용기는 시스테인 티올기이며, 예를 들어, 여기서 시스테인은 항원-결합 폴리펩티드가 유래된 항체에서 힌지 이황화 결합을 형성한다(예를 들어, Kabat 넘버링에 따른 Cys-226 또는 Cys-227).
일부 실시예에서, 작용기화 기는 낮은 pH, 예를 들어, pH 5.5 내지 6.5, 5-6, 또는 pH 6에서 스캐폴드 단백질에 접합하지 않는다.
상기 방법의 일부 실시형태들에서, 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서는 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결한다. 일부 실시형태들에서, 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하는 PEG 스페이서이다. 일부 실시형태들에서, PEG 스페이서는 1000-3000, 1500-2500, 1900-2200, 또는 2000의 MW를 갖는다.
일부 실시형태들에서, 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고 그리고 상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합된다. 일부 실시형태들에서, 지방-아실은 C16 지방-아실이다. 일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드는 시스틴 매듭 펩티드(CKP)이다. 일부 실시형태에서, CKP는 EETI-II이다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드는 다음을 포함하는 CKP 변이체이다: (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서의 화학적 변형; 및/또는 (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형. 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 그의 N-말단에 추가적인 리신 잔기를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 야생형 CKP는 EETI-II이다. 일부 실시형태들에서, 막-형성 지질은 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체 및 DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC 중 적어도 하나 이상(예를 들어, 펩티드-C16 지방-아실 접합체 및 DOPC)을 1:3 내지 1:15, 또는 1:6 내지 1:12, 또는 1:9의 몰비로 포함하고; 및/또는 상기 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 상기 짧은 펩티드 분자를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 접합체 내의 짧은 펩티드의 활성은 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 더 높다. 일부 실시형태들에서, 접합체 내의 펩티드의 활성은 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 2배 내지 10배 더 높다. 일부 실시형태들에서, 접합체 내의 펩티드의 활성은 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 약 5배 더 높다. 일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드는 생물학적 활성을 갖는 CKP 또는 CKP 변이체이고, 그리고 상기 활성의 80-90%, 90-95%, 또는 95-99%가 상기 접합체에서 유지된다. .일부 실시형태들에서, 접합체는 1-100개의 상기 Fab 분자를 포함하고; 선택적으로 상기 접합체는 5-30, 10-25, 15-20, 또는 18개의 상기 펩티드 분자, 및 5-40, 10-35, 15-30, 20-25, 또는 23개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하고; 또는 선택적으로 상기 접합체는 3-30, 5-20, 10-15, 또는 13개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하고; 또는 선택적으로 상기 접합체는 20-80, 25-70, 30-60, 35-50, 또는 40개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab) 분자를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 접합체는 적어도 2개의 상이한 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체를 포함하고, 여기서 제1 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체는 제1 짧은 펩티드를 포함하고, 제2 펩티드-C4-28 지방-아실은 제1 짧은 펩티드와 상이한 제2 짧은 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 적어도 2개의 펩티드(예를 들어, 시스틴 매듭 펩티드)는 상이한 표적, 선택적으로 2, 3, 4 또는 8개의 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태들에서, 2개 이상의 짧은 펩티드는 2개의 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태들에서, 표적은 CD3 및 CD19; CD3 및 EpCAM; CD3 및 CEA; CD16 및 CD30; CD16 및 CD33; Ang-2 및 VEGF-A; 및 인자 X 및 인자 IXa로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍이다.
일부 실시형태들에서, 나노지단백질 입자와 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드 (예를 들어, 시스틴 매듭 펩티드)의 접합체를 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: ) a) 스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 막-형성 지질의 지질 이중층을 포함하는 나노지단백질 입자의 (자기)조립을 허용하는 조건하에서 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질을 제공하는 단계; (여기서 상기 막-형성 지질의 하나 이상은 C4-28 지방-아실 (예를 들어, C16 지방-아실)을 포함하고 지방-아실은 상기 짧은 펩티드에 접합됨); 그리고 선택적으로 펩티드 접합체를 정제하는 단계. 일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드는 시스틴 매듭 펩티드(CKP)이다. 일부 실시형태에서, CKP는 EETI-II이다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드는 다음을 포함하는 CKP 변이체이다: (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서의 화학적 변형; 및/또는 (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형. 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 그의 N-말단에 추가적인 리신 잔기를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 야생형 CKP는 EETI-II이다. 일부 실시형태들에서, 상기 막-형성 지질은 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체 및 DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC 중 적어도 하나 이상(예를 들어, 펩티드-C16 지방-아실 접합체 및 DOPC)을 1:3 내지 1:15, 또는 1:6 내지 1:12, 또는 1:9의 몰비로 포함하고; 및/또는 상기 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 상기 짧은 펩티드 분자를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 접합체는 적어도 2개의 상이한 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체를 포함하고, 여기서 제1 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체는 제1 짧은 펩티드를 포함하고, 제2 펩티드-C4-28 지방-아실은 제1 짧은 펩티드와 상이한 제2 짧은 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 적어도 2개의 펩티드(예를 들어, 시스틴 매듭 펩티드)는 상이한 표적, 선택적으로 2, 3, 4 또는 8개의 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태들에서, 2개 이상의 짧은 펩티드는 2개의 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태들에서, 상기 표적은 CD3 및 CD19; CD3 및 EpCAM; CD3 및 CEA; CD16 및 CD30; CD16 및 CD33; Ang-2 및 VEGF-A; 및 인자 X 및 인자 IXa로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍이다. 일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드는 생물학적 활성을 갖는 CKP 또는 CKP 변이체이고, 그리고 상기 활성의 80-90%, 90-95%, 또는 95-99%가 상기 접합체에서 유지된다. 일부 실시형태들에서, 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 상기 입자의 한쪽 또는 양쪽 표면에 직용기화 기를 제시하고; 그리고 다음 단계를 추가로 포함한다: b) 4.5 내지 6.5 pH 범위의 낮은 pH에서 상기 작용기화 기에 접합하는, C-말단에 위치한 상보적 작용기를 갖는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)와 상기 입자를 접촉시키는 단계; 이때 상기 단계 b)는 조립되지 않은 막-형성 지질의 일부 또는 전부를 제거하는 중간 단계 없이 및/또는 단계 a)의 펩티드 접합체를 농축시키는 중간 단계 없이 상기 단계 a)에 이어진다. 일부 실시형태들에서, 상기 작용기화 기는 말레이미드 유도체이고 상기 작용기는 시스테인 티올기이고, 선택적으로 상기 시스테인 아미노산 잔기는 항원-결합 폴리펩티드가 유래되는 항체에서 힌지 이황화 결합을 형성한다(예를 들어, Cys-226 또는 Cys-227). 일부 실시형태들에서, 상기 작용기화 기는 상기 낮은 pH에서 상기 스캐폴드 단백질에 접합되지 않는다. 일부 실시형태들에서, 상기 낮은 pH는 pH 5.5 내지 6.5, pH 5 내지 6, 또는 pH 6이다. 일부 실시형태들에서, 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서는 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결한다. 일부 실시형태들에서, 상기 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하는 PEG 스페이서이다. 일부 실시형태들에서, 상기 PEG 스페이서는 1000-3000, 1500-2500, 1900-2200, 또는 2000의 MW를 갖는다. 일부 실시형태들에서, 상기 접합체는 상기 짧은 펩티드의 활성 또는 결합력을 증가시킨다. 일부 실시형태들에서, 상기 접합체는 1-100개의 상기 Fab 분자를 포함하고; 선택적으로 상기 접합체는 5-30, 10-25, 15-20, 또는 18개의 상기 펩티드 분자, 및 5-40, 10-35, 15-30, 20-25, 또는 23개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하고; 또는 선택적으로 상기 접합체는 3-30, 5-20, 10-15, 또는 13개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하고; 또는 선택적으로 상기 접합체는 20-80, 25-70, 30-60, 35-50, 또는 40개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab) 분자를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 접합체 내의 짧은 펩티드의 활성은 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 더 높다. 일부 실시형태들에서, 접합체 내의 펩티드의 활성은 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 2배 내지 10배 더 높다. 일부 실시형태들에서, 접합체 내의 펩티드의 활성은 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 약 5배 더 높다.
또한 본원의 임의의 방법에 의한 접합체 생성물이 제공된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양상은 나노지단백질 입자와 항원-결합 폴리펩티드의 접합체를 제조함에 있어서 지질-스캐폴드 단백질 접합을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 a) 스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 막-형성 지질의 지질 이중층을 포함하는 나노지단백질 입자의 조립을 허용하는 조건 하에서 상기 스캐폴드 단백질 및 상기 막-형성 지질을 제공하는 단계(여기서 하나 이상의 막-형성 지질은 입자의 한쪽 또는 양쪽 표면에 작용기화 기를 제공함); b) 상기 입자를 스캐폴드 단백질에 대해서보다 작용기에 대한 작용기화 기의 접합을 선호하는 낮은 pH에서(예를 들어, 약 5.55 내지 약 6.5, 약 5 내지 약 6, 또는 약 6의 pH) C-말단에 위치한 상보적 작용기를 가지는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단계 b)는 조립되지 않은 막-형성 지질의 일부 또는 전부를 제거하는 중간 단계 없이 단계 a) 다음에 이어진다. 특정 실시형태에서, 작용기화 기는 말레이미드 유도체이고 작용기는 시스테인 티올기이며, 예를 들어, 여기서 시스테인은 항원-결합 폴리펩티드가 유래된 항체에서 힌지 이황화 결합을 형성한다(예를 들어, Kabat 넘버링에 따른 Cys-226 또는 Cys-227). 일부 실시형태들에서, 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고 그리고 상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합된다. 일부 실시형태들에서, 상기 지방-아실은 C16 지방-아실이다. 일부 실시형태들에서, 상기 짧은 펩티드는 시스틴 매듭 펩티드(CKP)이다. 일부 실시형태에서, CKP는 EETI-II이다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드는 다음을 포함하는 CKP 변이체이다: (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서의 화학적 변형; 및/또는 (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형. 일부 실시형태들에서, 상기 막-형성 지질은 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체 및 DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC 중 적어도 하나 이상(예를 들어, 펩티드-C16 지방-아실 접합체 및 DOPC)을 1:3 내지 1:15, 또는 1:6 내지 1:12, 또는 1:9의 몰비로 포함하고; 및/또는 상기 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 상기 짧은 펩티드 분자를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 (NLP에 접합되지 않은 경우 폴리펩티드의 결합력, 활성 및/또는 효능과 비교하여) 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)의 결합력, 활성 및/또는 효능을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 a) 스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 막-형성 지질의 지질 이중층을 포함하는 나노지단백질 입자의 (자가) 조립을 허용하는 조건 하에서 상기 스캐폴드 단백질 및 상기 막-형성 지질을 제공하는 단계(여기서 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 상기 입자의 한쪽 또는 양쪽 표면에 작용기화 기를 제공함); b) 4.5 내지 6.5 pH 범위의 낮은 pH에서 상기 작용기화 기에 접합하는 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 갖는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)와 상기 입자를 접촉하게 하는 단계; 및 c) 선택적으로 상기 입자와 상기 항원-결합 폴리펩티드의 접합체를 정제함으로써, 항원-결합 폴리펩티드의 결합력, 활성, 및/또는 효능을 (NLP에 접합되지 않은 경우 폴리펩티드의 결합력, 활성, 및/또는 효능에 비해) 증가시키는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 Fab 또는 Fab-유사 분자이고; 특정 실시형태에서, 접합체는 적어도 6개 분자, 예를 들어, 10-60, 15-30, 또는 20개의 항원-결합 폴리펩티드 분자를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 상기 항원-결합 폴리펩티드는 PEG 스페이서에 의해 상기 막-형성 지질에 연결된 Fab 또는 Fab-유사 분자이고; 및 상기 접합체는 1-160, 10-120, 20-100, 40-80, 또는 60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자를 포함한다. 일부 실시형태들에서, PEG 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하며 1000-3000, 1500-2500, 1900-2200 또는 2000의 MW를 가진다. 일부 실시형태들에서, 상기 접합체는 안정화된다. 일부 실시형태에서, 접합체, 예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드를 더 적게(예를 들어, 7 Fab 보다 더 적게) 포함하거나 전혀 포함하지 않는 접합체와 비교하여 7-60, 7-32, 40-60, 또는 50개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자를 포함하는 접합체는 안정화된다. 일부 실시형태에서, 접합체는 상이한 표적에 결합하는 하나 이상의 제2 항원-결합 폴리펩티드 분자를 추가로 포함하고; 및/또는 접합체는 100-300 mg의 상기 접합체를 포함하고 10-50 cP의 점도를 갖는 액체 제형으로 제공된다.
일부 실시형태들에서, 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고 그리고 상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합되며, 그리고 상기 방법은 짧은 펩티드의 결합력, 활성, 및/또는 효능을 증가시킨다. 일부 실시형태들에서, 상기 지방-아실은 C16 지방-아실이다. 일부 실시형태들에서, 상기 짧은 펩티드는 시스틴 매듭 펩티드(CKP)이다. 일부 실시형태들에서, CKP는 EETI-II이다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드는 다음을 포함하는 CKP 변이체이다: (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서의 화학적 변형; 및/또는 (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형. 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 그의 N-말단에 추가적인 리신 잔기를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 야생형 CKP는 EETI-II이다. 일부 실시형태들에서, 상기 막-형성 지질은 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체 및 DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC 중 적어도 하나 이상(예를 들어, 펩티드-C16 지방-아실 접합체 및 DOPC)을 1:3 내지 1:15, 또는 1:6 내지 1:12, 또는 1:9의 몰비로 포함하고; 및/또는 상기 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 상기 짧은 펩티드 분자를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 접합체는 적어도 2개의 상이한 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체를 포함하고, 여기서 제1 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체는 제1 짧은 펩티드를 포함하고, 제2 펩티드-C4-28 지방-아실은 제1 짧은 펩티드와 상이한 제2 짧은 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 상기 적어도 2개의 펩티드(예를 들어, 시스틴 매듭 펩티드)는 상이한 표적, 선택적으로 2, 3, 4 또는 8개의 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태들에서, 상기 2개 이상의 짧은 펩티드는 2개의 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태들에서, 상기 표적은 CD3 및 CD19; CD3 및 EpCAM; CD3 및 CEA; CD16 및 CD30; CD16 및 CD33; Ang-2 및 VEGF-A; 및 인자 X 및 인자 IXa로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍이다. 일부 실시형태들에서, 상기 접합체는 1-100개의 상기 Fab 분자를 포함하고; 선택적으로 상기 접합체는 5-30, 10-25, 15-20, 또는 18개의 상기 펩티드 분자, 및 5-40, 10-35, 15-30, 20-25, 또는 23개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하고; 또는 선택적으로 상기 접합체는 3-30, 5-20, 10-15, 또는 13개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하고; 또는 선택적으로 상기 접합체는 20-80, 25-70, 30-60, 35-50, 또는 40개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab) 분자를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 접합체 내의 짧은 펩티드의 활성은 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 더 높다. 일부 실시형태들에서, 접합체 내의 펩티드의 활성은 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 2배 내지 10배 더 높다. 일부 실시형태들에서, 접합체 내의 펩티드의 활성은 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 약 5배 더 높다.
본 발명의 또 다른 양상은 (NLP에 접합되지 않은 경우 폴리펩티드의 결합력, 활성 및/또는 효능과 비교하여) 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)의 안정성, 저장 수명, 및/또는 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다. 또한 (예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드, 예를 들어, Fab 또는 Fab 유사 분자에 접합되지 않은 경우 NLP의 증가하는 안정성, 저장 수명 및/또는 반감기와 비교하여) NLP의 안정성, 저장 수명 및/또는 반감기를 증가시키는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 a) 스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 막-형성 지질의 지질 이중층을 포함하는 나노지단백질 입자의 (자가) 조립을 허용하는 조건 하에서 상기 스캐폴드 단백질 및 상기 막-형성 지질을 제공하는 단계(여기서 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 상기 입자의 한쪽 또는 양쪽 표면에 작용기화 기를 제공함); b) 4.5 내지 6.5 pH 범위의 낮은 pH에서 상기 작용기화 기에 접합하는 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 갖는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)와 상기 입자를 접촉하게 하는 단계; 및 c) 선택적으로 상기 입자와 상기 항원-결합 폴리펩티드의 접합체를 정제함으로써, (더 적은 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 7개 미만의 Fab)를 가지는 NLP에 접합되지 않거나 접합된 경우 폴리펩티드의 안정성, 저장 수명, 및/또는 반감기와 비교하여) 항원-결합 폴리펩티드의 안정성, 저장 수명 및/또는 반감기를 증가시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 접합체는 5-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자를 포함한다. 특정 실시형태들에서, 항원-결합 폴리펩티드는 Fab 또는 Fab-유사 분자이고; 특정 실시형태들에서, 접합체는 7-32개의 항원-결합 폴리펩티드 분자를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 하나 이상의 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고 그리고 상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합된다. 일부 실시형태들에서, 상기 지방-아실은 C16 지방-아실이다.
또한 20-60개 아미노산 길이의 짧은 펩티드의 안정성, 저장 수명 및/또는 반감기를 증가시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 막-형성 지질의 지질 이중층을 포함하는 나노지단백질 입자의 (자기)조립을 허용하는 조건하에서 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질을 제공하는 단계; (여기서 상기 막-형성 지질의 하나 이상은 C4-28 지방-아실 (예를 들어, C16 지방-아실)을 포함하고 지방-아실은 상기 짧은 펩티드에 접합됨); 그리고 선택적으로 펩티드 접합체를 정제하는 단계; b) 상기 입자의 한쪽 또는 양쪽 표면에 작용기화 기를 제공하도록 하나 이상의 상기 막-형성 지질을 변형하는 단계, 및 c) 상기 입자를 4.5 내지 6.5 pH 범위의 낮은 pH에서 상기 작용기화 기에 접합하는 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 가지는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)와 접촉시키는 단계; 이때 상기 단계 c)는 조립되지 않은 막-형성 지질의 일부 또는 전부를 제거하는 중간 단계 없이 및/또는 단계 b)의 펩티드 접합체를 농축시키는 중간 단계 없이 상기 단계 b)에 이어진다..일부 실시형태들에서, 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서는 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결함으로써, 상기 짧은 펩티드의 안정성, 저장 수명, 및/또는 반감기를 증가시킨다. 일부 실시형태들에서, 지방-아실은 C16 지방-아실이다.
일부 실시형태들에서, 상기 짧은 펩티드는 시스틴 매듭 펩티드(CKP)이다.일부 실시형태들에서, CKP는 EETI-II이다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드는 다음을 포함하는 CKP 변이체이다: (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서의 화학적 변형; 및/또는 (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형. 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 그의 N-말단에 추가적인 리신 잔기를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 야생형 CKP는 EETI-II이다.
일부 실시형태들에서, 상기 막-형성 지질은 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체 및 DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC 중 적어도 하나 이상(예를 들어, 펩티드-C16 지방-아실 접합체 및 DOPC)을 1:3 내지 1:15, 또는 1:6 내지 1:12, 또는 1:9의 몰비로 포함하고; 및/또는 상기 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 상기 짧은 펩티드 분자를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 상기 항원-결합 폴리펩티드는 Fab 또는 Fab-유사 분자이고/이거나 상기 접합체는 5-60, 6-40, 7-32, 40-60 또는 50개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자(예를 들어, 상기 Fab)를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 접합체는 1-100개의 상기 Fab 분자를 포함하고; 선택적으로 상기 접합체는 5-30, 10-25, 15-20, 또는 18개의 상기 펩티드 분자, 및 5-40, 10-35, 15-30, 20-25, 또는 23개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하고; 또는 선택적으로 상기 접합체는 3-30, 5-20, 10-15, 또는 13개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하고; 또는 선택적으로 상기 접합체는 20-80, 25-70, 30-60, 35-50, 또는 40개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab) 분자를 포함한다.
결합력, 활성, 효능, 안정성, 저장 수명, 및/또는 반감기를 증가시키는 방법들의 일부 실시형태들에서, 접합체는 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제를 추가로 포함한다. 특정 실시형태들에서, 생물학적 활성제는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 빈데신, 방사성핵종, 디프테리아 독소, 리신, 젤다나마이신, 메이탄시노이드, 칼리케아마이신 또는 이의 어느 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포독성제이다. 일부 실시형태들에서, 검출가능한 작용제는 방사성 동위원소, 형광단, 화학발광 염료, 발색단, 효소, 금속 이온, 나노입자 및 이의 어느 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표지이다. 일부 실시형태들에서, 접합체는 액체 제형으로 제공되고, 상기 제형은 100-300 mg의 상기 접합체를 포함하고 10-50 cP의 점도를 갖는다.
본 발명의 다른 양상은 약제로서 사용하기 위한; 암 또는 안구 질환 치료에 사용하기 위한; 암 또는 안구 장애 치료용 약제의 제조에서; 및/또는 혈관신생 및/또는 종양 성장을 억제하기 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한, 본원에 제공된 바와 같은 접합체, 약학 조성물 또는 제형을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은 본원에 제공된 접합체, 약학 조성물 또는 제형의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab) 및/또는 짧은 펩티드로 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태들에서, 상기 방법은 또 다른 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 양상은 개체에게 투여하기 위한 본 발명의 접합체, 약학 조성물 또는 제형을 제공하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 개체에게 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 전달하는 방법을 제공한다. 유리하게는, 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)는 효능있고 안정한 액체 제형으로 전달될 수 있는데, 예를 들면, 접합체가 막-형성 지질 상의 작용기화 기 및 항원-결합 폴리펩티드 상의 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 통해 5-60개의 항원-결합 폴리펩티드 분자(예를 들어, 5-60개 Fab 분자)에 접합된 막-형성 지질을 포함하는 경우가 그러하다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 작용기화 기를 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서는 상보적 작용기를 항원-결합 폴리펩티드에 연결한다. 유리하게는, 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)는 10-50cP의 점도 및 접합체 100-300mg/mL 농도를 갖는 액체 제형과 같은 효능있고 낮은 점도의 제형으로 전달될 수 있다.
항원-결합 폴리펩티드를 전달하는 방법들의 일부 실시형태들에서, 항원-결합 폴리펩티드는 인자 D, VEGF, Tie2, DR4; 및 이의 어느 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 결합하는 Fab이고; 상기 제형은 안구 전달을 통해 투여된다. 항원-결합 폴리펩티드를 전달하는 방법들의 일부 실시형태들에서, 항원-결합 폴리펩티드는 OX40, DR4, GITR, Tie2, 인자 D, VEGF, MerTK, CD3, 림포톡신 베타 수용체, 및 이의 어느 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 결합하는 Fab이다. 특정 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)는 적어도 2개의 상이한 표적에 결합하며, 예를 들어, 여기서 2개의 상이한 표적은 CD3 및 CD19; CD3 및 EpCAM; CD3 및 CEA; CD16 및 CD30; CD16 및 CD33; Ang-2 및 VEGF-A; 및 인자 X 및 인자 IXa로 이루어진 그룹으로부터 선택된 쌍이다.
또한 본원은 20-60개 아미노산 길이의 짧은 펩티드를 강력하고 안정한 액체 제형으로 이를 필요로 하는 개체에게 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함하고:
상기 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 상기 Fab)와 나노지단백 입자의 접합체를 포함하는 액체 제제를 개체에게 투여하는 단계; 여기서 상기 나노지단백질 입자는 막-형성 지질의 빌리피드 층을 둘러싸는 스캐폴드 단백질을 포함하고; 이때 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고이때 상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합되고;여기서 상기 막-형성 지질은 상기 막-형성 지질 상의 작용기 및 상기 항원-결합 폴리펩티드 상의 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 통해 상기 5-100개 항원-결합 폴리펩티드 분자에 접합되고; 선택적으로 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서는 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결함으로써, 상기 항원-결합 폴리펩티드를 안정한 액체 제형으로 개체에게 전달한다.
또한 20-60개 아미노산 길이의 짧은 펩티드를 강력하고 낮은 점도의 제형으로 이를 필요로 하는 개체에게 전달하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함하고:
상기 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 상기 Fab)와 나노지단백 입자의 접합체를 포함하는 액체 제제를 개체에게 투여하는 단계; 여기서 상기 나노지단백질 입자는 막-형성 지질의 빌리피드 층을 둘러싸는 스캐폴드 단백질을 포함하고; 이때 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고이때 상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합되고;여기서 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 상기 하나 이상의 막-형성 지질 상의 작용기 및 상기 항원-결합 폴리펩티드 상의 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 통해 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자에 접합되고; 선택적으로 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서는 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결하고; 그리고 상기 액체 제형은 10-50 cP의 점도 및 상기 접합체 100-300 mg/mL의 농도를 가짐으로써, 상기 항원-결합 폴리펩티드를 낮은 점도의 제형으로 개체에게 전달한다.
상기 전달 방법의 일부 실시형태들에서, 상기 지방-아실은 C16 지방-아실이다. 일부 실시형태들에서, 상기 짧은 펩티드는 시스틴 매듭 펩티드(CKP)이다. 일부 실시형태들에서, CKP는 EETI-II이다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드는 다음을 포함하는 CKP 변이체이다: (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서의 화학적 변형; 및/또는 (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형. 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 그의 N-말단에 추가적인 리신 잔기를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 야생형 CKP는 EETI-II이다. 일부 실시형태들에서, 상기 막-형성 지질은 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체 및 DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC 중 적어도 하나 이상(예를 들어, 펩티드-C16 지방-아실 접합체 및 DOPC)을 1:3 내지 1:15, 또는 1:6 내지 1:12, 또는 1:9의 몰비로 포함하고; 및/또는 상기 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 상기 짧은 펩티드 분자를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 접합체 내의 짧은 펩티드의 활성은 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 더 높다. 일부 실시형태들에서, 접합체 내의 펩티드의 활성은 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 2배 내지 10배 더 높다. 일부 실시형태들에서, 접합체 내의 펩티드의 활성은 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 약 5배 더 높다. 일부 실시형태들에서, 상기 접합체는 1-100개의 상기 Fab 분자를 포함하고; 선택적으로 상기 접합체는 5-30, 10-25, 15-20, 또는 18개의 상기 펩티드 분자, 및 5-40, 10-35, 15-30, 20-25, 또는 23개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하고; 또는 선택적으로 상기 접합체는 3-30, 5-20, 10-15, 또는 13개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하고; 또는 선택적으로 상기 접합체는 20-80, 25-70, 30-60, 35-50, 또는 40개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab) 분자를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 상기 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하는 PEG 스페이서이다. 일부 실시형태들에서, PEG 스페이서는 1000-3000, 1500-2500, 1900-2200, 또는 2000의 MW를 갖는다. 일부 실시형태들에서, 상기 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab) 및 상기 짧은 펩티드는 각각 동일한 표적에 결합한다. 일부 실시형태들에서, 상기 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab) 및 상기 시스테인-매듭 펩티드는 각각 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태들에서, 상기 항원-결합 폴리펩티드는 인자 D, VEGF, Tie2, DR4; 및 이의 어느 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 결합하는 Fab이고; 상기 제형은 안구 전달을 통해 투여된다. 일부 실시형태들에서, 상기 짧은 펩티드는 인자 D, VEGF, Tie2, DR4 및 이의 어느 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 결합한다. 일부 실시형태들에서, 상기 항원-결합 폴리펩티드는 OX40, DR4, GITR, Tie2, 인자 D, VEGF, MerTK, CD3, 림포톡신 베타 수용체, 및 이의 어느 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 결합하는 Fab이다. 일부 실시형태들에서, 상기 짧은 펩티드는 OX40, DR4, GITR, Tie2, 인자 D, VEGF, MerTK, CD3, 림포톡신 베타 수용체 및 이들 중 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 결합한다. 일부 실시형태들에서, 상기 항원-결합 폴리펩티드는 적어도 2개의 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태들에서, 상기 2개의 상이한 표적은 CD3 및 CD19; CD3 및 EpCAM; CD3 및 CEA; CD16 및 CD30; CD16 및 CD33; Ang-2 및 VEGF-A; 및 인자 X 및 인자 IXa로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍이다. 일부 실시형태들에서, 상기 짧은 펩티드 및 상기 항원-결합 폴리펩티드는 적어도 2개의 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태들에서, 상기 2개의 상이한 표적은 CD3 및 CD19; CD3 및 EpCAM; CD3 및 CEA; CD16 및 CD30; CD16 및 CD33; Ang-2 및 VEGF-A; 및 인자 X 및 인자 IXa로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍이다.
또한 또 다른 양상은 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제를 안정한 액체 제형으로 치료를 필요로 하는 개체에게 전달하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 접합체와 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제를 포함하는 액체 제형을 개체에게 투여하는 단계를 포함하고, 이때 접합체는 막-형성 지질 상의 작용기화 기 및 항원-결합 폴리펩티드 상의 C-말단에 위치하는 상보적 작용기를 통해 5-60개 항원-결합 폴리펩티드 분자(예를 들어, 5-60개 Fab 분자)에 접합된 막-형성 지질을 포함하고; 그리고 이때 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제는 접합체의 스캐폴드 단백질, 막-형성 지질 및/또는 항원-결합 폴리펩티드에 접합된다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 작용기화 기를 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서는 상보적 작용기를 항원-결합 폴리펩티드에 연결한다.
또한 또 다른 양상은 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제를 낮은 점도의 제형으로 치료를 필요로 하는 개체에게 전달하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 접합체와 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제를 포함하는 액체 제형을 개체에게 투여하는 단계를 포함하고, 이때 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제는 접합체의 스캐폴드 단백질, 막-형성 지질, 및/또는 항원-결합 폴리펩티드에 접합되고; 그리고 이때 액체 제형은 10-50 cP의 점도 및 접합체 100-300 mg/mL의 농도를 가진다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 작용기화 기를 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서는 상보적 작용기를 항원-결합 폴리펩티드에 연결한다.
또한 또 다른 양상은 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제를 치료를 필요로 하는 개체의 뇌 또는 중추 신경계에 전달하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 접합체와 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제를 포함하는 액체 제형을 개체에게 전신 투여하는 단계를 포함하고, 이때 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제는 접합체의 스캐폴드 단백질, 막-형성 지질, 및/또는 항원-결합 폴리펩티드에 접합되고; 그리고 이때 접합체는 혈액-뇌 장벽을 가로질러 이동한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 작용기화 기를 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서는 상보적 작용기를 항원-결합 폴리펩티드에 연결한다. 특정 실시형태들에서, 스캐폴드 단백질은 apoE2 및/또는 apoE4이다. 특정 실시형태들에서, 액체 제형은 정맥내 투여된다.
일부 실시형태들에서, 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고 그리고 상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합된다. 일부 실시형태들에서, 상기 지방-아실은 C16 지방-아실이다. 일부 실시형태들에서, 상기 짧은 펩티드는 시스틴 매듭 펩티드(CKP)이다. 일부 실시형태들에서, CKP는 EETI-II이다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드는 다음을 포함하는 CKP 변이체이다: (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서의 화학적 변형; 및/또는 (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형. 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 그의 N-말단에 추가적인 리신 잔기를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 야생형 CKP는 EETI-II이다. 일부 실시형태들에서, 상기 막-형성 지질은 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체 및 DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC 중 적어도 하나 이상(예를 들어, 펩티드-C16 지방-아실 접합체 및 DOPC)을 1:3 내지 1:15, 또는 1:6 내지 1:12, 또는 1:9의 몰비로 포함하고; 및/또는 상기 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 상기 짧은 펩티드 분자를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 상기 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하는 PEG 스페이서이다. 일부 실시형태들에서, 상기 PEG 스페이서는 1000-3000, 1500-2500, 1900-2200, 또는 2000의 MW를 갖는다.
생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제를 전달하기 위한 방법의 일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 Fab 또는 Fab-유사 분자이다. 특정 실시형태들에서, 생물학적 활성제는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 빈데신, 방사성핵종, 디프테리아 독소, 리신, 젤다나마이신, 메이탄시노이드, 칼리케아마이신 또는 이의 어느 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포독성제이다. 일부 실시형태들에서, 검출가능한 작용제는 방사성 동위원소, 형광단, 화학발광 염료, 발색단, 효소, 금속 이온, 나노입자 및 이의 어느 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표지이다. 특정 실시형태에서, 막-형성 지질은 5-60개 항원-결합 폴리펩티드 분자에 접합된다. 유리하게는, 액체 제형은 10-50cP의 점도 및 접합체 100-300mg/mL의 농도를 가질 수 있다.
일부 실시형태들에서, 액체 제형은 정맥내로 투여된다. 일부 실시형태들에서, 상기 막-형성 지질은 상기 막-형성 지질 상의 작용기화 기 및 상기 항원-결합 폴리펩티드 상의 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 통해 5-100개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자에 접합된다. 일부 실시형태들에서, 상기 항원-결합 폴리펩티드는 Fab이고 상기 Fab는 PEG 스페이서를 통해 상기 막-형성 지질에 연결된다. 일부 실시형태들에서, 상기 PEG 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하며 1000-3000, 1500-2500, 1900-2200 또는 2000의 MW를 가진다. 일부 실시형태들에서, 상기 액체 제형은 10-50 cP의 점도 및 상기 접합체 100-300 mg/mL의 농도를 갖는다.
또 다른 양상은 본원에 기재된 방법을 수행하기 위한, 예를 들어 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 표적 세포에 전달하기 위한 시스템 또는 키트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 시스템 또는 키트는 시스템 또는 키트의 하나 이상의 구획에서 본원의 NLP-폴리펩티드 접합체 또는 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체, 본원의 약학 조성물 또는 본원의 제형을 제조하기 위한 하나 이상의 구성성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 접합체, 조성물 또는 제형을 제조하거나 항원-결합 폴리펩티드를 전달하는데 사용하기 위한 지침이 제공된다. 특정 실시형태들에서, 항원-결합 단백질은 Fab 또는 Fab-유사 분자이다.
또한 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드(예를 들어, 시스틴 매듭 펩티드)를 표적 세포에 전달하기 위한 시스템 또는 키트가 제공되며, 이러한 시스템 또는 키트는 본원의 펩티드-NLP 접합체를 제조하기 위한 하나 이상의 구성성분(여기서 상기 구성성분은 상기 키트 또는 시스템의 하나 이상의 구획에 제공됨), 본원의 약학 조성물, 또는 본원의 제형 및 선택적으로 상기 접합체 또는 조성물을 제조하기 위한 지침 및/또는 상기 짧은 펩티드(예를 들어, 상기 시스틴- 매듭 펩티드)를 전달하기 위한 지침을 포함한다.
관련 양상에서, 지질-기반 나노입자 표면에 부착된 짧은 펩티드의 생물학적 활성을 증가시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 표면에 부착된 짧은 펩티드를 포함하는 지질-기반 나노입자를 제공하는 단계, 여기서 지질-기반 나노입자의 하나 이상의 지질은 작용기화 기를 제시하고, 및 (b) 상기 작용기화 기의 작용기에 대한 접합이 유리한 조건하에서 상기 나노입자를 상기 작용기를 갖는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시형태들에서, 상기 방법은 지질-기반 나노입자, 짧은 펩티드 및 폴리펩티드를 포함하는 접합체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태들에서, 지질-기반 나노입자는 지질 이중층을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 지질-기반 나노입자는 리포좀, 고체 지질 나노입자(SLN) 또는 나노구조 지질 담체(NLC)이다. 일부 실시형태들에서, 스페이서는 상기 작용기화 기를 지질-기반 나노입자의 표면 상의 지질에 연결하고/하거나 스페이서는 상기 상보적 작용기를 상기 폴리펩티드에 연결한다. 일부 실시형태들에서, 폴리펩티드는 항원-결합 폴리펩티드이다. 일부 실시형태들에서, 항원-결합 폴리펩티드는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 단일 사슬 Fab(scFab), 단일 사슬 Fv(scFv), VH-VH 이량체, VL-VL 이량체, VH-VL 이량체, 단일 도메인, 디아바디, 선형 항체 및 이의 어느 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드는 다음을 포함하는 CKP 또는 CKP의 변이체이다: (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환; (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서의 화학적 변형; 및/또는 (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형. 일부 실시형태들에서, 폴리펩티드의 접합 후 짧은 펩티드의 활성은 지질-기반 나노입자에 대한 폴리펩티드의 접합 전 짧은 펩티드의 활성과 비교하여 지질-기반 나노입자에 대한 폴리펩티드의 접합 후 2배 내지 100배 더 높다.
도면의 간단한 설명
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도 1A-1D는 NLP 어셈블리에 대한 DOPE-MCC의 효과를 도시한다. 도 1A는 Fab의 DOPE-MCC NLP 어셈블리 및 접합의 개략도를 도시한다. 도 1B는 NLP SEC 피크에 걸친 MW 및 Rh의 MALS/QELS 분석을 NLP 중 DOPE-MCl 몰%의 함수로서 도시한다. 도 1C는 apoE422k 단독(원), pH 7.4에서 조립된 NLP(실선) 및 pH 6.0에서 조립된 NLP(삼각형)의 TIC 크로마토그램을 도시한다. 도 1D는 apoE422k 단독(원), pH 7.4에서 조립된 NLP(실선) 및 pH 6.0에서 조립된 NLP(삼각형)에 대해, 1D에 도시된 피크 TIC 스펙트럼의 디컨볼루션된 질량을 도시한다.
도 2A-2C는 Fab-NLP 접합, 정제 및 특성화를 도시한다. 도 2A는 20의 Fab 대 NLP 비율에서 접합 후 Fab-NLP의 SEC 정제를 도시한다. 첫 번째 피크는 Fab-NLP 접합체에 해당하고, 두 번째 피크는 Fab 이량체에 해당하며, 세 번째 피크는 유리 접합되지 않은 Fab에 해당한다. 삽입된 그림은 Fab-NLP 피크의 확대 버전을 보여주며 QELS로부터의 Rh가 피크를 가로질러 중첩되어 있다. 왼쪽 y축은 흡광도이고 오른쪽 y축은 피크를 가로지르는 Fab-NLP 접합체의 다른 분획의 Rh이다. 도 2B는 유리 Fab(원) 및 Fab-NLP 접합체(삼각형)의 TIC 크로마토그램을 보여준다. 도 2C는 유리 Fab(원) 및 Fab-NLP 접합체(삼각형)에 대한 도 2C에 도시된 피크 TIC 스펙트럼의 디컨볼루션된 질량을 보여준다.
도 3A-3D는 Fab 부하 최적화를 도시한다. 도 3A는 증가하는 Fab 농도로 조립된 Fab-NLP 접합체의 SEC 정제 크로마토그램을 도시한다. 도 3B는 NLP당 Fab(Fab:NLP)의 수를 접합 반응에서 Fab 농도의 함수로서 도시한다. 도 3C는 Fab-NLP 접합체의 MW를 NLP당 Fab(Fab:NLP)의 수의 함수로 도시한 것이다. 도 3D는 Fab-NLP 접합체의 Rh를 NLP당 Fab(Fab:NLP)의 수의 함수로 도시한 것이다.
도 4A-4B는 Fab-NLP 제형을 도시한다. 도 4A는 유리 Fab 단독(원), Fab-NLP 접합체(사각형) 및 Fab-PEG 접합체(삼각형)에 대한 점도와 Fab 농도 사이의 관계를 도시한다. 도 4B는 동결건조 전후의 Fab-NLP 접합체의 Rh 및 MW 분석을 도시한다. 왼쪽 y축과 회색 막대는 MW이고 오른쪽 y축과 검은색 막대는 Rh이다.
도 5A-5D는 Fab-NLP 활성을 도시한다. 도 5A는 항-인자 D Fab 단독(십자 표시), NLP에 접합된(Fab-NLP, 사각형), 동결건조 및 재구성 후 NLP에 접합된(삼각형) 및 인자 B 절단의 인자 D FRET 분석에서 음성 Fab 대조군(원)의 활성을 도시한다. 4회 중복의 평균 및 표준 편차가 표시되며, 데이터는 n=3의 독립적인 실험을 나타낸다. 도 5B는 항-OX40 fab 농도의 함수로서 플롯된 0 - 29.4 범위의 Fab 원자가에서 NLP 플랫폼에 접합되었을 때 항-OX40의 작용제 활성을 도시한다. 항-OX40 huIgG1을 음성 대조군으로 사용하였다. 3회 중복의 평균 및 표준 편차가 표시된다. 도 5C는 0 - 29.4 범위의 Fab 원자가에서 NLP 플랫폼에 접합되었을 때 항-OX40의 작용제 활성을 NLP 농도의 함수로서 플롯하여 도시한다. 항-OX40 huIgG1을 음성 대조군으로 사용하였다. 3회 중복의 평균 및 표준 편차가 표시된다. 도 5D는 서로 다른 Fab-NLP 원자가에서 도 5C의 곡선 핏으로부터 계산된 EC50 값을 도시한다.
도 6A-6B는 50% 혈청에서 Fab-NLP 접합체의 안정성을 도시한다. 도 6A는 50% 혈청에서 인큐베이션 후 다양한 시점에서 NLP의 SEC 궤적을 도시한다. 주요 NLP 피크의 왼쪽에 있는 숄더는 혈청의 배경 흡광도로 인한 것이었고 후속 분석에서 빼었다. 도 6B는 상이한 Fab 부하 밀도로 이루어진 Fab-NLP 접합체에 대한 Fab-NLP 분해를 시간의 함수로서 도시한다. 이 곡선은 0시간 시에 Fab-NLP 피크 면적에 대해 정규화하여 생성되었다.
도 7A-7B는 Fab-NLP 접합체의 단백질 조성을 정량화하는 것을 도시한다. 도 7A는 Fab-NLP 접합체의 HPLC 궤적을 도시한다. 2개의 피크가 4.95분 및 5.15분에 관찰되었으며, 각각 apoE422k 및 Fab에 해당한다. 도 7B는 서로 다른 주입량(왼쪽 패널) 및 해당 표준 곡선(오른쪽 패널)에서 apoE422k의 HPLC 궤적을 도시한다. apoE422k 표준 곡선을 사용하여 Fab-NLP 접합체의 apoE422k 농도를 결정하였다.
도 8A-8B는 NLP 어셈블리에 대한 DOPE-MCC의 효과를 도시한다. 도 8A는 증가하는 몰 농도의 DOPE-MCC로 조립된 NLP의 SEC 분석을 도시한다. 도 8B는 가교 조건(pH 7.4) 및 비가교 조건(pH 6) 하에서 조립된 NLP의 MW 및 Rh 분석을 도시한다.
도 9A-9D는 C16-EETI-II의 설계 및 생산을 도시한다. 도 9A는 야생형 EETI-II 및 C16-EETI-II의 아미노산 서열을 보여준다. 팔미트산은 N-말단 리신을 통해 EETI-II에 접합되었다. 도 9B는 C16-EETI-II 생산 공정의 흐름도를 제공한다. 도 9C는 EETI-II의 분석 RP-HPLC(왼쪽 패널) 및 LC-MS(오른쪽 패널)를 제공한다. LC-MS로 C18-EETI-II와 EETI-II를 식별하고 순도를 검증한다. 도 9D는 C16-EETI-II가 지방산 태그가 부가된 EETI-II보다 더 소수성임을 보여주는 분석 RP-HPLC(왼쪽 패널) 및 LC-MS(오른쪽 패널)를 제공한다(C16-EETI-II의 머무름 시간이 더 긴 것으로 나타남).
도 10A-10E는 CKP 부하된 NLP(NLP-CKP)의 조립을 도시한다. 도 10A는 CKP-NLP 어셈블리 및 CKP의 접합의 개략도를 도시한다. 도 10B는 CKP-NLP의 SEC 크로마토그램을 보여준다(점선은 추가 분석을 위해 풀링된 분획을 보여준다). 도 10C는 ELSD(증발 광산란 검출기)를 사용한 CKP-NLP의 RP-HPLC 크로마토그램을 도시한다. ApoE422k, CKP 및 DOPC에 해당하는 3개의 피크가 각각의 그림으로 표시된 바와 같이 관찰되었다. 도 10D는 MW의 SEC-MALS 분석을 도시한다(MW는 화살표로 표시됨). 280 nm에서의 흡광도는 오른쪽 축에 표시된다. 도 10E는 Rh의 SEC-MALS 분석을 도시한다(Rh(왼쪽 축)는 CKP-NLP 피크를 가로지르는 분산된 점으로 표시됨). 280 nm에서의 흡광도는 오른쪽 축에 표시된다.
도 11A 내지 11D는 NLP 크기 및 조성, 및 CKP 활성에 대한 CKP 부하의 효과를 도시한다. 도 11A는 증가하는 CKP-C16 몰%에서 조립된 CKP-NLP의 SEC 크로마토그램을 도시한다. 도 11B는 CKP-NLP 어셈블리에서 CKP-NLP SEC 피크 전반에 걸친 평균 Rh 분석을 CKP 몰%의 함수로서 도시한다. 도 11C는 정제 후 NLP당 CKP 분자 수의 HPLC 정량화를 자기조립 반응에 포함된 NLP당 CKP 분자 수의 함수로서 도시한다. 어셈블리는 이중으로 분석되었다. 도 11D는 다양한 수준의 CKP 통합(0 - 63 CKP/NLP)을 포함하는 CKP-NLP에 대한 CKP 활성 분석 결과를 보여준다. 분석을 3중 반복으로 수행하였다.
도 12A 내지 12B는 37℃의 50% 혈청에서 저장 후 상이한 시간에 NLP의 SEC 크로마토그램을 도시한다. 도 12A는 NLP가 AF488로 표지되고 SEC 궤적의 흡광도가 생물학적 매트릭스의 배경 신호를 제한하기 위해 A495에서 모니터링된 결과를 도시한다. 도 12B는 37℃의 50% 혈청에서 인큐베이션될 때 CKP-NLP의 정규화된 피크 면적을 시간의 함수로서 도시한다.
도 13A 내지 13D는 Fab-CKP-NLP 접합체의 조립 및 특성화를 도시한다. 도 13A는 Fab-CKP-NLP 접합체를 생성하는 전략의 개략도를 도시한다. CKP-NLPS는 반응성 DSPE-PEG-Mal 지질로 조립되고 조립된 CKP-NLP는 유리 시스테인을 통해 Fab에 접합된다. 도 13B는 접합이 완료된 후 Fab-CKP-NLP 접합체의 SEC 크로마토그램을 도시한다. Fab-CKP-NLP 접합체, Fab 이량체 및 접합되지 않은 Fab에 해당하는 3개의 피크가 관찰된다. 도 13C는 SEC 정제된 Fab-CKP-NLP 접합체의 HPLC 크로마토그램을 도시한다. Fab-CKP-NLP의 모든 구성성분들은 각각의 그림으로 표시된 바와 같이 검출되었다. 도 13D는 Fab-CKP-NLP 접합체 피크 전반에 걸친 MW(상단 패널) 및 Rh(하단 패널)의 SEC-MALS 분석을 도시한다.
도 14A 내지 14E는 Fab-CKP-NLP의 Fab 부하 및 안정성을 도시한다. 도 14A는 접합 단계 동안 상이한 Fab 대 CKP-NLP 비율(0-150)에서 생성된 Fab-CKP-NLP 접합체의 SEC 크로마토그램을 도시한다. Fab-CKP-NLP 접합체, Fab 이량체 및 접합되지 않은 Fab에 해당하는 3개의 피크가 관찰된다. 도 14B는 정제된 Fab-CKP-NLP 접합체에서 NLP당 Fab 수의 HPLC 분석을 저 CKP-NLP 및 고 CKP-NLP 모두에 대한 반응 중 Fab 비율의 함수로서 도시한다. 도 14C는 Fab-CKP-NLP의 Rh를 저 CKP-NLP 및 고 CKP-NLP 모두에 대한 Fab 부하의 함수로서 도시한다. 도 14D는 Fab-CKP-NLP에 대한 CKP 활성 분석의 결과를 저 CKP-NLP 및 고 CKP-NLP 모두에 대한 Fab 부하의 함수로서 도시한다. 분석을 3중 반복으로 수행하였다. 도 14E는 37℃의 50% 혈청에서 인큐베이션될 때 CKP-NLP 및 Fab-CKP-NLP의 정규화된 피크 면적을 시간의 함수로서 도시한다.
상세한 설명
I. 정의
용어는 하기에서 달리 정의되지 않는 한, 당업계에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 본원에서 사용된다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 단클론 항체, 다중클론 항체, 및 항체 단편을 포함하는 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 항체 구조를 포함한다. 따라서, 본 발명의 내용에서 용어 항체는 전체 면역글로불린 분자, 뿐만 아니라 이러한 면역글로불린 분자의 일부에 관한 것이다. 또한, 이 용어는 변형 및/또는 변경된 항체 분자, 특히 돌연변이된 항체 분자에 관한 것이다. 상기 용어는 또한 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된/합성된 항체에 관한 것이다. 본 발명의 내용에서 용어 항체는 용어 면역글로불린과 상호교환적으로 사용된다.
항체 단편은 온전한(intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 단일 도메인 항체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다(예를 들어, 나노바디, IgNAR)특정 항체 단편들에 대한 리뷰는 Hudson 등, Nat. Med. 9, 129-134 (2003)를 참조한다. scFv 단편들의 검토는 예로써, Pluckth
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n, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); WO 93/16185를 또한 참고한다. 디아바디는 2가 또는 이중 특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위가 있는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson 외, Nat. Med. 9, 129-134 (2003); 및 Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)를 참고하라. 트리아바디(Triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies)는 또한 Hudson 외. Nat. Med. 9, 129-134 (2003)에 설명되어 있다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다(Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 미국 특허 제 6,248,516 B1 참고). 다양한 항체 단편을 포함하는 항체 형식의 추가 예는 BiTE, BiTE-Fc, DART, DART-Fc, TriKE, 및 TandAb 형식을 포함하지만 이에 제한되지 않는다(검토를 위해, Suurs, F.V., 외, A review of bispecific antibodies and antibody constructs in oncology and clinical challenges, Pharmacology & Therapeutics, 201 (2019) 103-119 참조).항체 단편은 온전한 항체의 단백질분해 소화, 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 대장균 또는 파지)에 의한 제조를 포함한 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원-결합 폴리펩티드"는 가장 넓은 의미로, 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원-결합 폴리펩티드의 예는 항체, 면역글로불린 및 이의 유도체, 예를 들어 항체 단편이다. 항원-결합 폴리펩티드는 또한 예를 들어, 센티린(Centyrins), 아피머(Affimers), 애드넥틴(AdNectins), 아비머(Avimer), 노틴(Knottins), 모노바디(Monobody), 어피니티 클램프(Affinity clamp) 등과 같은 단백질 스캐폴드를 포함하는 다르핀 및/또는 단백질 결합제를 포함할 수 있다. 항원-결합 폴리펩티드는 항원 결정인자에 결합(즉, 특이적으로 결합)한다. 일부 실시형태들에서, 항원-결합 폴리펩티드는 표적 부위에, 예를 들어 항원 결정인자를 보유하는 특정 유형의 종양 세포 또는 종양 기질에 대해 그것이 부착되는 실체(예를 들어, 나노지단백질 입자)를 지시할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 항원-결합 폴리펩티드는 이의 표적 항원을 통해 신호전달을 활성화할 수 있으며, 예를 들어, 신호전달은 T 세포 상의 항원-결합 수용체에 대한 항원 결정인자의 결합 시에 활성화된다. 항원-결합 폴리펩티드는 전형적으로 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 항원-결합 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 당업계에 공지된 바와 같은 면역글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변 영역에는 5가지 아이소형: α, δ, ε, γ 또는 μ 중 하나가 포함된다. 유용한 경쇄 불변 영역에는 κ 및 λ의 두 가지 아이소형 중 하나가 포함된다. 특정 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 Fc 영역을 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 힌지 영역(또는 면역글로불린의 힌지 영역의 일부)을 포함하지만, Fc 영역은 포함하지 않거나, 또는 Fc 영역의 모두를 포함하지는 않는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 IgG Fc 도메인의 하나 이상의 서브유닛을 포함하지 않는다, 예를 들어, IgG CH2 불변 도메인을 포함하지 않으며; 및/또는 IgG CH3 불변 도메인을 포함하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합(펩티드 결합으로도 알려짐)에 의해 선형으로 연결된 단량체들(아미노산들)로 구성된 분자를 지칭한다. "폴리펩티드"라는 용어는 2개 이상의 아미노산들의 사슬을 지칭하며 특정 길이의 생성물을 지칭하지 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬" 또는 2개 이상의 아미노산 사슬을 지칭하는 데 사용되는 기타 용어들이 "폴리펩티드"의 정의에 포함되며, 용어 "폴리펩티드"는 이러한 용어를 대신하거나 이러한 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. "폴리펩티드"라는 용어는 또한 폴리펩티드의 발현 후 변형의 생성물을 지칭하는 것으로 하며, 당화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 또는 비-천연 발생 아미노산에 의한 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 출처로부터 유래되거나 재조합 기술에 의해 생성될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 이는 화학적 합성을 포함하여 어떤 방식으로든 생성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 3, 5, 10, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 500, 1,000, 또는 2,000개 아미노산의 크기일 수 있다.
"항원-결합 부위"는 항원과의 상호작용을 제공하는 항원-결합 폴리펩티드의 부위, 즉 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 수용체의 항원-결합 부위는 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 잔기를 포함한다. 천연 면역글로불린 분자는 전형적으로 2개의 항원-결합 부위를 갖고, Fab 또는 scFv 분자는 전형적으로 단일 항원-결합 부위를 갖는다.
용어 "항원-결합 도메인"은 항원에 특이적으로 결합하고 항원의 일부 또는 전부에 대해 상보적인 영역을 포함하는 항체 또는 항원-결합 수용체의 일부를 의미한다. 항원-결합 도메인은 예를 들어 하나 이상의 면역글로불린 가변 도메인(또한 가변 영역이라 칭함)에 의해 제공될 수 있다. 전형적으로, 항원-결합 도메인은 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL) 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 결합하는데 관여하는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄와 경쇄(차례로 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FRs)과 3개의 초가변 영역(HVR들)을 포함한다. 예를 들어, Kindt 외. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91 페이지 (2007)을 참고하라. 단일 VH 또는 VL 도메인은 보통 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분하다.
항원-결합 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 용어 "~에 결합"은 "항원-상호작용 부위"와 항원이 서로 결합(상호작용)하는 것을 정의한다. 용어 "항원-상호작용 부위"는 특정 항원 또는 특정 항원 그룹과의 특이적 상호작용 능력을 나타내는 폴리펩티드의 모티프를 정의한다. 상기 결합/상호작용은 또한 "특이적 인식"을 정의하는 것으로 이해된다. 용어 "특이적으로 인식하는"은 항원-결합 폴리펩티드가 항원과 특이적으로 상호작용 및/또는 결합할 수 있음을 의미한다. 특정 표적 항원 결정인자에 결합하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab 또는 scFv 도메인)의 능력은 당업계에 공지된 기술로 측정될 수 있다. 한 가지 기술은 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)을 포함한다. 당업자에게 친숙한 다른 기술에는, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명(SPR)(BIAcore 기기에서 분석됨)(Liljeblad 외, Glyco J 17, 323-329 (2000)), 및 전통적인 결합 분석(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))이 포함된다. 한 실시형태에서, 관련되지 않은 단백질/항원에 대한 항원-결합 폴리펩티드의 결합 정도는, 특히 SPR에 의해, 측정시 표적 항원에 대한 항원-결합 폴리펩티드의 결합의 10% 미만이다. 특정 실시형태들에서, 표적 항원에 결합하는 항원-결합 폴리펩티드는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 또는 그 미만, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (KD)를 갖는다. 항원-결합 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 용어 "결합" 또는 "특이적 결합"은 항원-결합 폴리펩티드가 표적 항원과 교차 반응하지 않거나 본질적으로 교차 반응하지 않는다는 것을 의미한다.
"친화도"는 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드)와 이의 결합 짝(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 강도를 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들(예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드와 항원, 및/또는 수용체와 이의 리간드) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 짝 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있으며, 이는 해리 및 결합속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비이다. 따라서, 균등한 친화도는 상기 속도 상수들의 비율이 동일하게 유지되는 한 상이한 속도 상수를 포함할 수도 있다. 친화도는 본 명세서에 기재된 것을 포함하여 당업계에 공지된 잘 확립된 방법에 의해 측정될 수 있다. 친화도의 바람직한 측정 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR)이고 바람직한 측정 온도는 25°C이다.
본원에서 사용된 용어 "CDR"은 당업계에 잘 알려진 "상보성 결정 영역"에 관한 것이다. CDR은 상기 분자의 특이성을 결정하고 특정 리간드와 접촉하는 면역글로불린 또는 항원-결합 수용체의 일부이다. CDR은 일반적으로 분자의 가장 가변적인 부분이며 이러한 분자의 항원 결합 다양성에 기여한다. 가변 도메인에는 3개의 CDR 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3이 있다. CDR-H는 가변 중쇄의 CDR 영역을 나타내고, CDR-L은 가변 경쇄의 CDR 영역에 관한 것이다. VH는 가변 중쇄를 의미하고 VL은 가변 경쇄를 의미한다. Ig 유래 영역의 CDR 영역은 문헌 "Kabat"(Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th edit. NIH Publication no. 91-3242 US Department of Health and Human Services(1991); Chothia J Mol.Biol.196(1987), 901-917) 또는 "Chothia"(Nature 342(1989), 877-883)에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변이고 및/또는 구조적으로 정의된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 지칭한다. 일반적으로 천연 4쇄 항체는 6개의 HVR을 포함한다: VH에 3개 (H1, H2, H3), 그리고 VL에 3개 (L1, L2, L3). HVR은 일반적으로 초가변 루프의 아미노산 잔기를 포함한다. VH의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 초가변 영역(HVR)은 또한 "상보성 결정 영역"(CDR)으로 지칭되며, 이들 용어는 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 부분들과 관련하여 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이 특정 영역은 Kabat 외, 미국 보건복지부의, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) 및 Chothia 외, J Mol Biol 196:901-917 (1987)에 의해 기술된 바 있으며, 여기서 정의는 서로 비교할 때 아미노산 잔기의 중복 또는 하위 집합을 포함한다. 상기 인용된 문헌에 의해 정의된 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 1에 제시되어 있다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 주어진 특정 CDR을 어떤 잔기들이 포함하는지를 관례적으로 결정할 수 있다.
표 1. CDR 정의1
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1 표 1의 모든 CDR 정의의 넘버링은 Kabat 외의 문헌에 제시된 넘버링 규칙에 따른다 (아래 참조).
2 표 1에 사용된 소문자 "b"가 있는 "AbM"은 Oxford Molecular의 "AbM" 항체 모델링 소프트웨어에 의해 정의된 CDR을 지칭한다.
Kabat 외의 문헌 또한 가변 영역 서열들에 대한 넘버링 체계를 정의했으며, 이는 모든 항체에 적용할 수 있다. 당업자는 상기 "Kabat 넘버링" 체계를 해당 서열 자체에서 벗어난 임의의 실험 데이터에 의존하지 않고 임의의 가변 영역 서열에 명확하게 할당할 수 있다. 본원에서 사용되는 "Kabat 넘버링"은 Kabat 등, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)에 제시된 넘버링 체계를 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 항원-결합 모이어티 가변 영역 내 특정한 아미노산 잔기 위치의 넘버링은 Kabat 넘버링 체계를 참조한다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기들 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인들로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열들은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 다음의 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"Fab" 또는 "Fab 분자"는 항원-결합 폴리펩티드의 중쇄의 VH 및 CH1 도메인("Fab 중쇄") 및 경쇄의 VL 및 CL 도메인("Fab 경쇄")으로 구성된 단백질을 지칭한다.
단일 사슬 Fv 단편(또는 scFv)은 펩티드 링커에 의해 연결된 항체 VH 도메인 및 VL 도메인으로 구성된 폴리펩티드이다.
단일 사슬 Fab 단편(또는 scFab)은 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 중쇄 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 링커로 구성된 폴리펩티드로서, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음 순서 중 하나를 가지며: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL, 여기서 상기 링커는 적어도 30개 아미노산, 바람직하게는 32 내지 50개 아미노산의 폴리펩티드이다. 단일 사슬 Fab 단편은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이의 자연 이황화 결합을 통해 안정화된다.
"교차" Fab 분자("crossFab" 또는 "교차 Fab 단편"이라고도 함)는 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환되는 Fab 분자를 의미한다, 즉, 교차Fab 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역으로 구성된 펩티드 사슬, 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역으로 구성된 펩티드 사슬을 포함한다. 따라서, 교차Fab 단편은 중쇄 가변부와 경쇄 불변부(VH-CL)로 구성된 중쇄 또는 경쇄와 경쇄 가변부와 중쇄 불변부(VL-CH1)로 구성된 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이와 대조적으로, "통상적인" Fab 분자는 천연 형태의 Fab 분자, 즉, 중쇄 가변 및 불변 영역(VH-CH1)으로 구성된 중쇄 및 경쇄 가변 및 불변 영역(VL-CL)으로 구성된 경쇄를 포함하는 Fab 분자를 의미한다.
"교차 단일 사슬 Fab 단편"은 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 중쇄 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 링커로 구성된 폴리펩티드로서, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음 순서 중 하나를 가지며: a) VH-CL-링커-VL-CH1 및 b) VL-CH1-링커-VH-CL, 여기서 VH 및 VL은 함께 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 형성한다. 전형적으로, 링커는 적어도 30개 아미노산, 예를 들어, 30-40개 아미노산 길이의 폴리펩티드이다.
본원에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역 경계는 약간 다를 수 있지만 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 Cys-226 또는 Pro-230으로부터 중쇄의 카르복실 말단까지 확장되는 것으로 정의된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys-447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 명시적으로 다른 언급이 없는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 EU 넘버링 체계, Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 소위 EU 인덱스에 따른다.
용어 "전장 항체"는 2개의 "전장 항체 중쇄" 및 2개의 "전장 항체 경쇄"로 구성된 항체를 나타낸다. "전장 항체 중쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 중쇄 도메인 1(CH1), 항체 힌지 영역(HR), 항체 중쇄 불변 도메인 2(CH2), 및 항체 중쇄 불변 도메인 3(CH3)으로, 그리고 서브클래스 IgE의 항체의 경우 선택적으로 항체 중쇄 불변 도메인 4(CH4)로 구성된 폴리펩티드로서, VH-CH1-HR-CH2-CH3로 약칭된다. 바람직하게는 "전장 항체 중쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 VH, CH1, HR, CH2 및 CH3으로 구성된 폴리펩티드이다. "전장 항체 경쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)으로 구성되는 폴리펩티드이며, VL-CL로 약칭된다. 항체 경쇄 불변 도메인(CL)은 κ(카파) 또는 λ(람다)일 수 있다. 2개의 전장 항체 사슬은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이 및 전장 항체 중쇄의 힌지 영역들 사이의 폴리펩티드간 이황화 결합을 통해 함께 연결된다. 전형적인 전장 항체의 예는 IgG(예를 들어, IgG 1 및 IgG2), IgM, IgA, IgD 및 IgE와 같은 천연 항체이다. 본 발명에 따라 사용되는 전장 항체는 단일 종, 예를 들어 인간으로부터 유래할 수 있거나 키메라화 또는 인간화 항체일 수 있다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물에는 가축 (예컨대, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예컨대, 인간 및 비인간 영장류, 가령, 원숭이), 토끼 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 래트)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특히, 개체 또는 대상체는 인간이며, 임상 환자/임상 시험 지원자일 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "약학 조성물"은 내부에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 제재를 지칭하며, 제제가 투여되는 대상체에게 허용불가능한 독성을 주는 추가 성분들은 포함하지 않는다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 유도체는 자연 환경에 있지 않은 폴리펩티드를 의미한다. 특정 수준의 정제가 필요하지 않다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 천연 또는 자연 환경으로부터 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생성된 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적합한 기술에 의해 분리, 분획화되거나, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드와 마찬가지로 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
본원에서 사용되는 용어 "시스틴 매듭 펩티드" 또는 "CKP"는 3개의 이황화 결합을 형성하는 6개의 보존된 시스테인 잔기를 함유하는 26-60개 아미노산 길이의 펩티드를 지칭한다. 이황화물 중 하나는 두 개의 다른 이황화물과 이들의 상호 연결 백본에 의해 형성된 거대고리를 관통하여, 다중 루프가 표면에 노출되어 있는 특징적인 매듭 토폴로지를 생성한다. 루프는 6개의 보존된 시스테인 잔기에 연접하는 아미노산 영역으로 정의되며 본질적으로 매우 가변적이다.
본원에서 사용되는 용어 "표적 항원"은 "표적 항원 결정인자", "표적 에피토프" 및 "표적 세포 항원"과 동의어이며 항원-결합 폴리펩티드가 결합하여 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 부위(예를 들어, 아미노산의 연속 신장부(stretch) 또는 비인접 아미노산들의 상이한 영역들로 구성된 입체형태 구성)를 지칭한다. 유용한 표적 항원들은 예를 들어 종양 세포의 표면, 바이러스에 감염된 세포의 표면, 다른 질환 세포의 표면, 면역 세포의 표면상에서, 혈청내 및/또는 세포외 기질(ECM) 중에서 자유롭게 발견될 수 있다. 본원에서 항원으로 지칭되는 단백질(예를 들어, 예를 들어, CD20, CEA, FAP, TNC)은 달리 지시가 없는 한, 임의의 척추동물 출처, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 천연 형태의 단백질일 수 있다. 특정 실시형태에서 표적 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특정 표적 단백질을 지칭하는 경우, 이 용어는 "전장"의, 비가공 표적 단백질, 뿐만 아니라 표적 세포에서 가공된 임의의 형태의 표적 단백질을 포함한다. 이 용어는 또한 표적 단백질의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 표적 항원은 CD20, CEA, FAP, TNC, MSLN, FolR1, HER1 및 HER2를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"암" 및 "암성"이라는 용어는 통상적으로 조절되지 않는 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 병태를 지칭한다. 양성 및 악성 암은 이러한 정의에 포함된다. 암의 예는, 비제한적으로, 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병을 포함한다. 이러한 암의 보다 구체적인 예는 편평 세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위내장 암을 포함하는 위장관 암 또는 위암, 췌장암, 교모세포종, 신경아교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암(예를 들어, 신장 세포 암종), 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 항문암종, 음경암종, 흑색종 및 각종 유형의 두경부암을 포함한다. "초기 단계 암"은 침습성 또는 전이성이 아니거나 0, 1, 또는 II기 암으로서 분류되는 암을 의미한다. "전암성"이라는 용어는 일반적으로 암에 선행하거나 암으로 발전하는 병태 또는 성장을 의미한다. "비-전이성"은 양성이거나 원발 부위에 남아 있고 림프계 또는 혈관계 또는 원발 부위 이외의 조직으로 침투하지 않은 암을 의미한다. 일반적으로, 비전이성 암은 0기, I기 또는 II기 암이며 경우에 따라 III기 암인 모든 암이다.
본원에 제공된 숫자 값은 정확한 숫자 값과 "약"이라는 용어로 한정되는 값을 모두 나타내는 것으로 이해된다. 용어 "약"은 사용되는 내용에서 당업자가 이해할 수 있는 범위, 예를 들어, 인용된 수치의 ±10%, ±5%, ±4%, ±3%, ± 2%, ±1%, ±0.5%, ±0.1%, ±0.05%, ±0.01% 등의 숫자 값을 말한다.
II. 폴리펩티드를 포함하는 나노지단백질 접합체
본 발명의 한 양상은 적어도 하나의 공유 접합된 폴리펩티드(즉, 스캐폴드 단백질 이외의 NLP-통합된 폴리펩티드)를 포함하는 나노지단백질 입자 접합체에 관한 것이다. 본원에 사용되는, "나노지단백질 입자" 또는 NLP는 지질 및 스캐폴드 단백질을 포함하는 초분자 복합체, 특히 아포지단백질과 같은 막-형성 지질 및 스캐폴드 단백질을 포함하는 초분자 복합체를 지칭한다. NLP는 또한 나노디스크 또는 재구성된 고밀도 지단백질(rHDL)로 지칭될 수 있으며 내인성 고밀도 지단백질(HDL)의 모사체로 설명되어 왔다(18). NLP는 일반적으로 자기조립 과정을 통해 형성되는데, 여기서 막-형성 지질은 원반 모양을 갖는 지질 이중층을 형성하고(19), 여기서 디스크의 소수성 주변부는 이중층 디스크를 둘러싸는 스캐폴드 단백질에 결합하여 안정화된다. 본 단락에 인용된 모든 참조문헌은 아래 실시예 5에서 찾을 수 있다.
"막-형성 지질"은 친수성 영역(극성 머리) 및 소수성 영역(하나 이상의 긴 탄화수소 꼬리)을 갖는 양친매성 지질 또는 극성 지질을 지칭한다. 막-형성 지질은 수성 환경에서 자기조립하여, 각 층의 소수성 지방산 꼬리는 서로 마주하고 극성 머리가 수성 환경에 노출되어 있는 지질 이중층을 형성한다. 극성 머리 그룹은 일반적으로 유도체화된 포스페이트 또는 당류 그룹이다. 막-형성 지질은 예를 들어 알킬포스포콜린, 에테르 지질, 당지질, 라이소스핑고지질, 라이소글리세로포스포리피드, 포스포리피드, 스핑고리피드 및 스테롤을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, NLP는 본원에 기재된 2개 이상의 막-형성 지질을 포함한다. 보다 구체적인 예는 인지질 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디올레오일포스포-에탄올아민(DOPE), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디올레오일포스포세린(DOPS) 및 디팔미토일-포스파티딜-콜린(DPPC)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 막-형성 지질은 DOPE 및/또는 DOPC이다. 일부 실시형태에서, 막-형성 지질은 디글리세롤 테트라에테르, 콜레스테롤, 에르고스테롤 등과 같은 비지질 양친매성 분자이다. 일부 실시형태에서, NLP는 막-형성 지질로서 C4-28 지방-아실(예를 들어, C16 지방-아실)을 포함한다(예를 들어 추가로 포함한다).
일부 실시형태에서, 막-형성 지질은 생물학적 분자, 즉 살아있는 유기체, 예를 들어 박테리아, 효모 또는 포유동물에 의해 생성된 분자이다.
NLP에서 막-형성 지질에 의해 형성된 이중층은 하나 이상의 스캐폴드 단백질에 의해 안정화된다. 본원에 사용된 "스캐폴드 단백질"은 지질 이중층의 소수성 코어를 (실질적으로) 에워싸거나 둘러싸는 것과 같은 수성 환경에서 막-형성 지질과 자기조립할 수 있는 양친매성 단백질이다. 스캐폴드 단백질은 일반적으로 여러 소수성 아미노산이 소수성 면을 형성하고 여러 친수성 아미노산이 반대쪽에서 친수성 면을 형성하는 알파 나선 2차 구조를 갖는다. 입자 자체는 수용성이 되므로, 예를 들어, 혈액 또는 림프에서 운반될 수 있다.
일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은, 예를 들어, 아포지단백질, 리포포린, 또는 이의 유도체 또는 단편 중 하나 이상, 특히, 막-형성 지질과 자기조립하는 능력을 유지하는 유도체 또는 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 합리적으로 설계된 단백질 또는 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 포유동물, 예를 들어 인간, 인간이 아닌 영장류, 래트, 마우스, 토끼 또는 기니아 피그와 같은 살아있는 유기체에 의해 생성된 생물학적 분자이다. 특정 실시예에서, 스캐폴드 단백질은 아포지단백질 A(예를 들어, apo AI, apo A-II, apo A-IV, apo AV), 아포지단백질 B(예를 들어, apo B48, apo B100), 아포지단백질 C(예를 들어, apo CI, apo C-II, apo C-HI, apo C-IV), 아포지단백질 D, 아포지단백질 H, 아포지단백질 E(예를 들어, apoE2, apoE4), 및/또는 리포포린 III 중 적어도 하나이다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은, 예를 들어, 소수성 면과 반대쪽 친수성 면을 갖는 막 이중층을 안정화할 수 있는 아포지단백질의 절단된 버전이다. 특정 예에서, 절단된 apo4E, 예를 들어 "ApoE422k"로 명명된 apoE4의 22Kd 단편이 사용된다. 일부 특정 실시예에서, 스캐폴드 단백질은 인간 유래 ApoE422k이다.
일부 실시형태에서, 아포지단백은 apoE3의 절단된 버전(예를 들어, apoE322k), apoE2의 절단된 버전(예를 들어, apoE222k), 또는 apoA1의 절단된 버전(예를 들어, Δ49ApoA1, MSP1, MSP1T2, MSP1E3D1)이다. 일부 실시예에서, 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질 성분은 둘 다 살아있는 유기체에 의해 생성된 생물학적 분자이고, 비생물학적 유래 물질이 없는 NLP를 형성한다.
당업자는 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질이 NLP 조립을 용이하게 하기에 적합한 몰비로 제공될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시예에서, 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질은 1:50에서 1:100까지; 1:60에서 1:90까지; 또는 1:70에서 1:80까지의 몰비로 존재한다. 일부 실시형태들에서, 스캐폴드 단백질 및 상기 막-형성 지질은 1:60, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 또는 1:100의 몰비로 존재한다. 특정 실시예에서, 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질은 1:80의 몰비이다. 일부 실시형태에서, 대부분의 또는 모든 막-형성 지질이 이중층으로 배열되고 조립되지 않은 상태로 남아 있는 것이 없거나 거의 없도록 하는 비율이 사용된다. 일부 실시형태에서, 조립되지 않은 상태로 남아있는 지질은 반응 용기 벽에 고착되어, 폴리펩티드의 작용기와 반응할 수 있는 것이 없거나, 거의 없거나, 극소수만 남게 된다.
본 발명에서, NLP는, 예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드 상의 상보적 작용기와의 상호작용을 위한 하나 이상의 작용기화 기를 제시할 것이다. 일부 실시형태에서, 작용기화 기는 폴리펩티드 상의 상보적 작용기와 반응하고 NLP의 다른 성분에 접합하지 않는다, 예를 들어, 스캐폴드 단백질(들)에 접합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 25% 미만 또는 20-25%, 20% 미만 또는 10-20%, 15% 미만 또는 10-15%, 10% 미만 또는 5-10%, 5% 미만 또는 3-5% 또는 0%의 작용기된 기가 본 발명의 접합체에서 스캐폴드 단백질에 접합된다. 일부 실시형태에서, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0%의 작용기된 기가 본 발명의 접합체에서 스캐폴드 단백질에 접합된다.
일반적으로 모든 막-형성 지질이 작용기화되는 것은 아니다. 당업자는 사용될 작용기화 기를 갖는 지질의 양이, 예를 들어, 작용기화 기 및/또는 막-형성 지질, 및/또는 이와 접합될 폴리펩티드의 실체(identity)에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 막-형성 지질의 60% 미만, 예를 들어, 50-60%; 50% 미만, 예를 들어 40-50%; 40% 미만, 예를 들어 30-40%; 30% 미만, 예를 들어 20-30% 또는 20% 미만, 예를 들어 10-20%가 작용기화된다. 특정 실시형태에서, 막-형성 지질의 10-40%, 15-35%, 20-35% 또는 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 35%가 작용기화된다. 특정 예에서, 막-형성 지질의 20%는 작용기화 기를 가지고 있다.
"작용" 또는 "작용기화" 기는 해당 구조의 특징적인 화학 반응을 일으키는 분자 구조 내의 원자 그룹을 지칭한다. 본원에서 간락히 하기 위해, "작용기화 기"라는 용어는 NLP의 막-형성 지질 상에 있는 또는 막-형성 지질에 스페이서에 의해 연결된 이러한 기들과 관련하여 사용된다. 용어 "작용기"는 막-형성 지질 상의 하나 이상의 상응하는 작용기화 기를 통해 NLP에 부착하기 위한 폴리펩티드, 예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드 상에 있는 또는 이에 스페이서에 의해 연결된 이러한 기들과 관련하여 사용된다. 작용기/작용기화 기의 예는 탄화수소, 이중 또는 삼중 결합을 갖는 기, 할로겐 함유 기, 질소 함유 기, 산소 함유 기 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 작용기화 기는 아지드, 아미노, 무수물, 알킨, 카르복시, 할로겐, 하이드록실, 티올 및 포스페이트 기로부터 선택된 적어도 하나의 기로부터 선택된다. 전형적으로, 상응하는 작용기 및 작용기화 기 사이의 반응은 결합 형성 및 각 그룹의 접합을 초래한다.
a. 폴리펩티드에 대한 NLP 접합
본원에서 사용되는 용어 "접합" 또는 "결합"은 작용기들 사이의 안정한 회합을 초래하는 매우 근접한 작용기들 사이의 상호작용을 지칭한다. 이러한 상호작용은 공유 및/또는 비공유 결합, 예를 들어, 정전기적 상호작용을 수반할 수 있다. 접합은 적절한 조건 하에서 성공적으로 접합하는 것으로 알려진 각각의 NLP 지질 및 항원-결합 폴리펩티드 상의 하나 이상의 작용기화 기/작용기 쌍들을 사용한, 임의의 수의 작용기화 전략을 사용하여 달성될 수 있다.
본원에 기술된 NLP에 대한 폴리펩티드의 성공적인 접합은 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 확인되거나 정량화될 수 있다. 본 발명의 접합체를 특성화하기 위한 기술의 예는 형광 상관 분광법, 푸리에 변환 적외선 분광법, 크기 배제 크로마토그래피, 표면 플라즈몬 공명, 라만 분광법, 내부 전반사 형광, 울트라스핀 여과를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다(예를 들어, 실시예 2, 도 8A 및 도 1B 참조).
도 1A는 본 발명의 NLP-Fab의 조립 및 접합의 개략도를 도시한다. 본 발명의 실시형태에서, 나노지단백질 입자는 적어도 하나의 폴리펩티드에 접합되며, 여기서 폴리펩티드는 NLP의 하나 이상의 구성성분들에 공유 부착되거나 다른 방식으로 결합되거나 연결되어 NLP-폴리펩티드 접합체를 형성한다. 폴리펩티드는 일반적으로 이중층의 한쪽 표면 또는 양쪽 표면 상의 극성 머리와 같은 막-형성 지질 상의 하나 이상의 작용기화 기들에 부착된다. 작용기화 기는 상기 언급된 바와 같이 폴리펩티드 상의 상응하거나 상보적 작용기에 접합할 수 있는 임의의 기일 수 있다. 작용기화된 막-형성 지질의 예는 아지드 함유 지질, 카르복실레이트 함유 지질, 말레이미드 함유 지질, 킬레이트 금속 함유 지질, 프로파길 함유 지질, 4차 아민 함유 지질, S-단백질 함유 지질 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, NLP 어셈블리 동안 사용되는 작용기화 막-형성 지질의 양은 비작용기화 막-형성 지질과 비교하여 NLP 이중층 표면에 접합될 폴리펩티드의 양을 결정한다.
작용기화 기/작용기의 접합 쌍의 예는 아민과 에스테르; 아민과 카르복실산; 아세틸렌과 아지드; 폴리히스티딘과 2가 금속(예를 들어, Ni2+, Co2+, Cu2+, Zn2+); 아민과 이소티오시아네이트; 비오틴과 아비딘; 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와 글루타티온; 할로세타마이드와 설프하이드릴; 피리딜 다이설파이드와 설프하이드릴; 티오설페이트와 설프하이드릴; 및 말레이미드(또는 말레이미드 유도체)와 설프하이드릴이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 당업자가 알고 있는 바와 같이 이들 구성성분들은 공지된 기술에 의해 합성될 수 있고/있거나 상업적으로 구입가능하다.
특정 실시형태에서, 작용기화 기는 말레이미드 유도체, 할로아세트아미드, 피리딜디티오-프로피오네이트 및 티오설페이트 중 하나 이상이고; 상보적 작용기는 유리티올기, 예를 들어, 환원된 설프하이드릴 모이어티이다. 특정 실시형태에서, 작용기화 기는 말레이미드이고 상보적 작용기는 환원된 시스테인 잔기이다. 말레이미드 함유 지질은 상업적으로 구입가능하거나 당업자에 의해 합성될 수 있다. 티올 반응성 막-형성 지질의 구체적인 예는 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[4-(p-말레이미도페닐)부티르아마이드](소듐 염)를 포함한다. (예를 들어, 실시예 1, 도 7A-7B 참조).
일부 실시형태에서, 작용기화 기는 막-형성 지질의 극성 머리에 또는 이의 화학 구조의 일부에 직접 위치한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 작용기화 기를 막-형성 지질에 연결한다. "스페이서" 또는 "링커"는 하나 이상의 링커 성분으로 구성될 수 있다. 예시적인 스페이서 성분은 6-말레이미도카프로일("MC"), 말레이미도프로파노일("MP"), p-아미노벤질옥시카르보닐("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트("SMCC"), 및 N-숙신이미딜(4-요오도-아세틸)아미노벤조에이트("SIAB")를 포함한다. 추가 스페이서 구성성분들은 당업계에 공지되어 있고 일부는 본원에 기술되어 있다. 또한 미국 특허 출원 공개공보 2005/0238649 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"를 참고하라.
일부 실시형태들에서, 스페이서는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예시적인 아미노산 스페이서 구성성분들은 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드를 포함한다. 예시적인 디펩티드에는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe)이 포함된다. 예시적인 트리펩티드에는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)이 포함된다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 길이의 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 2-6개 아미노산, 3-5개 아미노산, 또는 4개 아미노산이다. 스페이서는 일반적으로 가요성을 위해 글리신, 그리고 용해도를 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부하다. 일부 실시형태에서, 글리신-세린 스페이서, 예를 들어, (GS)n이 사용되며, 여기서 G=글리신, S=세린, 및 n=2, 3, 4 또는 5이다. 특정 실시형태에서, Fab 접합체에 사용되는 스페이서는 아미노산 서열 GSGS를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시예에서, GSGS 스페이서와 유사한 유연성 및 용해도를 제공하는 다른 스페이서가 사용된다.
b. 항원-결합 폴리펩티드 구성성분
본 발명의 NLP-폴리펩티드 접합체의 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 항원-결합 폴리펩티드는 NLP의 하나 이상의 성분에 공유 부착되거나 다른 방법으로 결합되거나 연결된다. 일반적으로, 폴리펩티드는 항체의 단편, 예를 들어 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 단일 사슬 Fab(scFab), 단일 사슬 Fv(scFv), VH-VH 이량체, VL-VL 이량체, VH-VL 이량체, 단일 도메인, 디아바디 또는 선형 항체와 같은 항원-결합 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 Fab이다. 일부 실시형태들에서, 항원-결합 폴리펩티드는 교차 Fab 이고 교차 단일 사슬 Fab이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 "Fab-유사 분자" 또는 "Fab-유사 폴리펩티드"이며, 이는 Fab와 유사한 크기 및/또는 입체 형태를 갖지만 반드시 항원에 결합할 수 있는 것은 아닌 폴리펩티드이다.
특정 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 힌지 영역(또는 면역글로불린의 힌지 영역의 일부)을 포함하지만, Fc 영역을 포함하지 않거나 Fc 영역 전체를 포함하지는 않는다. 특정 실시형태들에서, 항원-결합 폴리펩티드는 힌지 영역의 적어도 하나의 Cys 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시형태에서, Cys 잔기는 작용기를 제공한다, 즉, NLP 지질 상의 작용기화 기들과 접합하기 위한 유리 티올기를 제공한다. 특정 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드, 예를 들어 Fab는 힌지 영역의 Cys-226 및 Cys-227 중 적어도 하나를 포함한다. 특정 실시형태에서, Cys-227은 접합을 위한 유리 티올 그룹을 제공한다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 NLP-폴리펩티드 접합체의 폴리펩티드는 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기 상의 작용기에 의해 NLP에 공유 부착되거나 다른 방법으로 결합되거나 연결된다. 일부 실시형태들에서, 작용기는 C-말단에 위치한다. "C-말단에 위치"한다는 것은 작용기가 폴리펩티드의 C-말단 말단을 향하여 위치함을 의미한다. 예를 들어, 작용기는 N-말단에서 C-말단으로 간주되는 폴리펩티드 사슬의 마지막 아미노산 잔기에 위치할 수 있다. C-말단에 위치한 기들은 마지막에서 두 번째, 마지막에서 세 번째, 마지막에서 네 번째, 또는 마지막에서 다섯 번째 아미노산 잔기에, 또는 폴리펩티드의 C-말단에 있는 마지막 1-2, 1-3, 2-3, 1-4, 2-4, 1-5, 3-5, 1-6, 2-6, 3-6, 1-7, 3-7, 4-7, 1-8, 3-8, 5-8 또는 1-10개 아미노산 잔기에 위치할 수 있다.
일부 실시형태들에서, 작용기는 N-말단에 위치한다. "N-말단에 위치"한다는 것은 작용기가 폴리펩티드의 N-말단 단부 쪽에 위치함을 의미한다. 예를 들어, 작용기는 N-말단에서 C-말단으로 고려하여 폴리펩티드 사슬의 첫 번째 아미노산 잔기에 위치할 수 있다. N-말단에 위치한 기는 폴리펩티드의 N-말단에서 두 번째, 세 번째, 네 번째 또는 다섯 번째 아미노산 잔기 또는 처음 1-2, 1-3, 2-3, 1-4, 2-4, 1-5, 3-5, 1-6, 2-6, 3-6, 1-7, 3-7, 4-7, 1-8, 3-8, 5-8, 또는 1-10개 아미노산 잔기 중 어느 하나에 위치할 수 있다.
작용기는 NLP의 구성성분, 예를 들어 NLP의 막-형성 지질 상의 상응하는 또는 상보적 작용기화 기와 반응하도록 선택된다. 일부 실시형태들에서, 작용기는 말레이미드 유도체, 할로아세트아미드, 피리딜디티오-프로피오네이트 및 티오설페이트로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 상보적 작용기는 유리 티올기이다. 특정 실시형태들에서, 작용기는 시스테인 티올기와 같은 티올기이다. 일부 특정 실시형태에서, 시스테인 아미노산 잔기는 항원-결합 폴리펩티드가 유래된 항체에서 힌지 이황화 결합을 형성한 잔기이다. 예를 들어, 티올기는 Cys-226 및 Cys-227(Kabat 넘버링 기준)에서 선택된 적어도 하나일 수 있다. 특정 실시형태에서, C-말단 Cys-227, 예를 들어, Fab의 C-말단 Cys-227은 NLP 지질 상의 작용기화 기와 접합하기 위한 유리 티올 기를 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 작용기는 항원-결합 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 화학 구조 상에 직접적으로 위치하거나 화학 구조의 일부에 위치한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 전술한 바와 같이 작용기를 항원-결합 폴리펩티드에 연결한다. 어느 형식에서든 항원-결합 폴리펩티드, 예를 들어 Fab는 억제성 및 작용성 설정 중 하나에서 항원-결합 활성의 손실 없이 또는 실질적인 손실 없이 NLP에 접합된다. 또한 실시예 4, 도 5B를 보면, 여기서 부위-특이적 Fab 접합은 NLP 유체역학적 반경에 대한 영향을 최소화하면서 약 30 Fab/NLP에 도달하였으며, 이는 입자 크기가 NLP의 원반형 모양에 의해 크게 결정됨을 나타낸다.
항원-결합 펩티드는 일반적으로 하나 이상의 면역글로불린 분류의 항체 분자로부터 유래한다. 항체 또는 면역글로불린의 "분류"는 그 중쇄가 갖는 불변 영역 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 항체에는 5가지 주요 분류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들중 몇몇은 하위분류(아이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더욱 세분될 수 있다. 상이한 면역글로불린 분류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 차례로 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 IgG 분자, 예를 들어, IgG 분자의 Fab로부터 유래된다.
본 발명의 일부 양상에서, 항원-결합 폴리펩티드는 치료제이고 항원-결합 폴리펩티드에 대한 전달 플랫폼으로서의 접합체의 용도가 제공된다. 예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)는 표적을 중화시키거나 경로를 차단, 작용 또는 길항하는 작용을 하는 약물 카고 또는 생물학적 활성 분자로서 기능할 수 있다. 본 발명의 일부 양상에서, 항원-결합 폴리펩티드는 항원-표적화된 전달 플랫폼을 제공한다. 예를 들어, 표적화 Fab의 부착은 강화된 내재화를 통해 관심 기관 또는 조직에서 약물 전달을 풍부하게 할 수 있다(37, 38, 39). 예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)는 특정 세포 또는 질환 마커를 인식하여 접합체를 특정 표적으로 지시할 수 있다. NLP에 대한 항원-결합 폴리펩티드의 접합은 예를 들어 항원-결합 폴리펩티드 또는 추가적인 치료제 또는 진단제의 표적으로의 전달을 용이하게 하기 위해 NLP의 표적화를 매개할 수 있다. 본 단락에 인용된 모든 참조문헌은 아래 실시예 5에서 찾을 수 있다.
특정 실시형태들에서, 본 발명의 NLP-폴리펩티드 접합체는 치료 약물(9-12), 진단 영상화제(13), 및 백신 및 변역조절 치료제(14-17)의 생체내 전달을 위해 개발되었던 기존의 나노지단백질 접근법들의 단점을 해결한다. 지난 10년 동안 나노기술 분야에서는 비특이적 생체분포 및 표적화, 낮은 수용성, 제한된 경구 생체이용률 및 낮은 치료 지수를 비롯한 기존 약물 전달 시스템의 한계를 해결하기 위한 노력이 있었다(1). 일부 접근법은 무기 나노입자(2), 중합체 기반 나노입자(3), 중합체 마이셀(4), 덴드리머(5), 리포좀(6), 바이러스 나노입자(7) 및 탄소 나노튜브(6)의 사용을 포함한다. 다른 전략은 리포좀(33-35) 및 중합체 기반 나노입자(36)를 포함한다. 그러나, 본 발명의 NLP-접합체는 다른 나노입자 기반 전달 기술에 비해 낮은 독성 및 낮은 면역원성을 포함하는 몇 가지 뚜렷한 이점을 제공한다(20). 예를 들어, 일부 실시형태에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 자연적으로 생성되고/되거나 자연적으로 생성된 물질로부터 유도되는 지질, 스캐폴드 단백질 및 항원-결합 폴리펩티드를 포함하는 비생물학적으로 유도된 물질이 없으며, 따라서 비생물학적으로 유래된 구성성분을 필요로 하는 기존의 전달 플랫폼보다 낮은 면역 반응을 유도하고/하거나 독성이 적다. 본원에서 논의된 특정 실시형태에서 다른 이점들에는, 예를 들어 가교제를 사용하지 않는 우수한 안정성; 고농축이지만 점도가 낮은 제형의 실현 가능한 생산, 입자간 가교결합이 최소이거나 전혀 없는, 비교적 균질한 NLP-폴리펩티드 모집단을 비롯한 우수한 제작가능성 및/또는 강화된 항원-결합 효능을 포함한다. 본 단락에 인용된 모든 참조문헌은 아래 실시예 5에서 찾을 수 있다.
일부 실시형태들에서, 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab)는 하나 이상의 종양 특이적 항원, 또는 종양 마커에 결합하여 접합체를 종양으로 지시한다. 예를 들어, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 특정 종양 세포에 의해 과발현된다. EGFR을 과발현하는 생체 내 이종이식 종양 모델에서, 항-EGFR 면역리포좀은 주사 후 24시간 후에 측정시 단일 용량 후에 비표적화 리포좀보다 6배 더 많은 세포 흡수를 달성했다. 또한, 항-EGFR 면역리포좀-독소루비신(강력한 세포독소)은 독소루비신 단독 또는 표적화되지 않은 리포좀-독소루비신보다 더 큰 유의한 종양 퇴행을 보였다.
종양 세포의 표면에서 자연적으로 발생하는 종양 마커의 다른 예는 FAP(섬유아세포 활성화 단백질), CEA(암배아 항원), p95(p95HER2), BCMA(B-세포 성숙 항원), EpCAM(상피 세포 부착 분자), MSLN(메조텔린), MCSP(흑색종 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸), HER-1(인간 표피 성장 인자 1), HER-2(인간 표피 성장 인자 2), HER-3(인간 표피 성장 인자 3), CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD52Flt3, 엽산 수용체 1(FOLR1), 인간 영양막 세포 표면 항원 2(Trop-2) 암 항원 12-5(CA-12-5), 인간 백혈구 항원 - 항원 D 관련(HLA-DR), MUC-1(뮤신-1), A33-항원, PSMA(전립선 특이적 막 항원), FMS 유사 티로신 키나아제 3(FLT-3), PSMA(전립선 특이적 막 항원), PSCA(전립선 줄기 세포 항원), 트랜스페린-수용체, TNC(테나신), 탄소 탈수효소 IX(CA-IX) 및/또는 인간 주조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 펩티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
이러한 많은 종양 항원은 당업계에 공지되어 있거나 숙련된 기술자에 의해 용이하게 입수된다. 예를 들어, A33-항원, BCMA(B 세포 성숙 항원), 암 항원 12-5(CA-12-5), 탄소 탈수효소 IX(CA-IX), CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CEA(암배아 항원), EpCAM(상피 세포 부착 분자), FAP(섬유아세포 활성화 단백질), FMS 유사 티로신 키나아제 3(FLT-3), 엽산 수용체 1(FOLR1), HER-1(인간 표피 성장 인자 1), HER-2(인간 표피 성장 인자 2), HER-3(인간 표피 성장 인자 3), 인간 백혈구 항원-항원 D 관련(HLA-DR), MSLN(메조텔린), MCSP(흑색종 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸), MUC-1(뮤신-1), PSMA(전립선 특이적 막 항원), PSMA(전립선 특이적 막 항원), PSCA(전립선 줄기 세포 항원), p95(p95HER2), 트랜스페린-수용체, TNC(테나신), 인간 영양막 세포 표면 항원 2(Trop-2)의 (인간) 구성원들의 서열(들)은 UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스에서 이용가능하며 http://www.uniprot.org/uniprot/?query=reviewed%3Ayes에서 검색할 수 있다. 당업자는 게놈 DNA 뿐만 아니라 mRNA/cDNA도 포함할 수 있는 이러한 데이터뱅크 항목에서 이러한 (단백질) 서열의 관련 코딩 영역을 쉽게 추론할 수 있다.
(인간) FAP(섬유아세포 활성화 단백질)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 Q12884(항목 버전 168, 서열 버전 5)로부터 얻을 수 있고; (인간) CEA(암배아 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 P06731(항목 버전 171, 서열 버전 3)에서 얻을 수 있고; (인간) EpCAM(상피 세포 부착 분자)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 P16422(항목 버전 117, 서열 버전 2)로부터 얻을 수 있고; (인간) MSLN(메조텔린)의 서열(들)은 UniProt 항목 번호 Q13421(버전 번호 132; 서열 버전 2)로부터 얻을 수 있고; (인간) FMS 유사 티로신 키나아제 3(FLT-3)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 P36888(1차 참조 수탁 번호) 또는 Q13414(2차 수탁 번호)로부터 버전 번호 165 및 서열 버전 2로부터 얻을 수 있고; (인간) MCSP(흑색종 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸)의 서열은 UniProt 항목 번호 Q6UVK1(버전 번호 118; 서열 버전 2)로부터 얻을 수 있고; (인간) 엽산 수용체 1(FOLR1)의 서열(들)은 UniProt 항목 번호 P15328(1차 참조 수탁 번호) 또는 Q53EW2(2차 수탁 번호)로부터 버전 번호 153 및 서열 버전 3으로 얻을 수 있고; (인간) 영양막 세포-표면 항원 2(Trop-2)의 서열(들)은 UniProt 항목 번호 P09758 (1차 참조 수탁 번호) 또는 Q15658 (2차 수탁 번호)로부터 버전 번호 172 및 서열 버전 3으로 얻을 수 있고; (인간) PSCA(전립선 줄기 세포 항원)의 서열(들)은 UniProt 등록 번호 O43653(1차 참조 수탁 번호) 또는 Q6UW92(2차 수탁 번호)로부터 버전 번호 134 및 서열 버전 1로 얻을 수 있으며; (인간) HER-1(표피 성장 인자 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 P00533(항목 버전 177, 서열 버전 2)에서 얻을 수 있으며; (인간) HER-2(수용체 티로신-단백질 키나아제 erbB-2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 P04626(항목 버전 161, 서열 버전 1)에서 얻을 수 있으며; (인간) HER-3(수용체 티로신-단백질 키나아제 erbB-3)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 P21860(항목 버전 140, 서열 버전 1)에서 얻을 수 있으며; (인간) CD20(B-림프구 항원 CD20)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 P11836(항목 버전 117, 서열 버전 1)에서 얻을 수 있으며; (인간) CD22(B-림프구 항원 CD22)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 P20273(항목 버전 135, 서열 버전 2)에서 얻을 수 있으며; (인간) CD33(B-림프구 항원 CD33)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 P20138(항목 버전 129, 서열 버전 2)에서 얻을 수 있으며; (인간) CA-12-5(뮤신 16)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 Q8WXI7(항목 버전 66, 서열 버전 2)에서 얻을 수 있고; (인간) HLA-DR의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 Q29900(항목 버전 59, 서열 버전 1)에서 얻을 수 있고; (인간) MUC-1(뮤신-1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 P15941(항목 버전 135, 서열 버전 3)에서 얻을 수 있으며; (인간) A33(세포 표면 A33 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 Q99795(항목 버전 104, 서열 버전 1)에서 얻을 수 있고; (인간) PSMA(글루타메이트 카르복시펩티다제 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 Q04609(항목 버전 133, 서열 버전 1)에서 얻을 수 있고, (인간) 트랜스페린 수용체의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 Q9UP52(항목 버전 99, 서열 버전 1) 및 P02786(항목 버전 152, 서열 버전 2)에서 얻을 수 있으며; (인간) TNC(테나신)의 서열은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 P24821(항목 버전 141, 서열 버전 3)에서 얻을 수 있으며; 또는 (인간) CA-IX(탄산 탈수효소 IX)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 항목 Q16790(항목 버전 115, 서열 버전 2)에서 얻을 수 있다. 당업자는 게놈 DNA 뿐만 아니라 mRNA/cDNA도 포함할 수 있는 이러한 데이터뱅크 항목에서 이러한 (단백질) 서열의 관련 코딩 영역을 쉽게 추론할 수 있다.
본 발명의 접합체는 예를 들어 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드를 하기에 보다 상세히 기재된 다량체 및/또는 다가 형식으로 제공할 수 있다.
c. 다량체 형식
본원에 기술된 NLP에 대한 폴리펩티드(예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드)의 접합은 예를 들어 접합체가 2개 이상의 항원-결합 폴리펩티드 분자를 제공하는 경우, 즉, 동일한 분자의 다수의 사본이 NLP에 부착되는 경우, 항원-결합 폴리펩티드의 다량체화를 용이하게 할 수 있다. 이 형식은 소정의 방식으로 항원-결합 폴리펩티드의 활성 또는 결합력을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 특정 항체 치료 양식에서 원자가는 주요 제한 사항이 될 수 있으며 경로가 강력하게 작용 또는 길항되기 위해 2 이상의 원자가를 필요로 하는 알려진 mAb 표적에 새롭게 초점을 맞춘다. 이러한 표적의 예에는 활성화를 위해 수용체 클러스터링이 필요한 DR5 및 OX40과 같은 TNF 계열 구성원이 포함된다(41, 42). 예를 들어, 트리아바디, 테트라바디, 펜타바디 및 자기조립 헥사머 IgG 항체(43-45)와 같은, IgG-유사 및 비-IgG-유사 형식 모두를 사용하여 원자가를 2 이상으로 확장시키기 위한 다양한 조작 전략들이 개발되어 왔으나(41, 42), 이러한 형식에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 이전에 사용된 형식들은 약동학에 부정적인 영향을 미칠 수 있을 뿐만 아니라 3-6 이상의 원자가를 달성하지 못하므로(43), 많은 경우에 충분한 작용/길항 활성에 도달하지 못한다. 특정 양상에서, 본 발명은 특정 표적과 관련하여 임상적으로 관련된 치료 지수를 달성하는 데 필요한 생체내 효능을 가능하게 하는 고밀도의 항원-결합 폴리펩티드, 예를 들어 Fab를 전달하기 위한 플랫폼을 제공한다. 본 단락에 인용된 모든 참조문헌은 아래 실시예 5에서 찾을 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 본원에 기재된 접합체 플랫폼을 사용하여 항원-결합 폴리펩티드의 결합력, 활성, 또는 효능을 증가시키는 것에 관한 것이며, 여기서 본 발명의 NLP-폴리펩티드 접합체의 항원-결합 폴리펩티드는 2 이상의 원자가를 필요로 하는 표적에 대해 지시된다. 예를 들어, 표적은 TNF 계열 구성원, DR4, OX40, GITR, Tie2, 인자 D, VEGF, MerTK, CD3 및 림포톡신 베타 수용체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 특정 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 OX40에 결합하는 Fab이다. 특정 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 DR4에 결합하는 Fab이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 항-OX40, 항-GITR, 항-Tie2, 항인자 D, 항-VEGF, 항-MERTK, 항-CD3, 항-림포톡신 베타 수용체, 및 항-DR4 Fab로부터 선택되는 적어도 하나의 Fab이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 NLP-폴리펩티드 접합체는 항원-결합 폴리펩티드의 활성 또는 결합력을 증가시키기 위해 접합체 당 항원-결합 폴리펩티드, 예를 들어, Fab의 2개 이상의 분자, 예컨대, 2-60개 분자를 제공한다. 일부 실시형태에서, 접합체는 2-60, 3-50, 4-40, 5-35, 6-30, 또는 7-20개의 항원-결합 폴리펩티드, 예를 들어 Fab 분자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 접합체는 2-32, 6-32, 10-30, 10-60, 15-30, 또는 20개의 항원-결합 폴리펩티드, 예를 들어 Fab 분자를 포함한다(예를 들어, 실시예 2, 도 3A-3D 참조). 일부 특정 실시형태에서, 접합체는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 항원-결합 폴리펩티드, 예를 들어 Fab 분자를 포함한다. 이러한 실시형태들은 일반적으로 항원-결합 폴리펩티드의 활성 및/또는 결합력을 증가시킨다. 예를 들어, 4-8개의 항-OX40 Fab 분자를 갖는 접합체는 증가된 항-XO40 활성을 나타낸다(예를 들어, 실시예 4, 도 5B 참조).
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 NLP에 대한 폴리펩티드(예를 들어, Fab와 같은 항원-결합 폴리펩티드)의 접합은 항원-결합 폴리펩티드 및/또는 NLP의 안정성을 증가시킨다. 예를 들어, NLP에 대한 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab 또는 Fab 유사 분자)의 접합은 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab 또는 Fab 유사 분자)의 안정성을 시험관 내(예를 들어, 저장 수명 증가) 및/또는 생체내(혈청 반감기 개선)에서 향상시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자)에 대한 NLP의 접합은 NLP 입자의 안정성을 시험관 내에서(예를 들어, 저장 수명 증가); 및/또는 생체내에서(예를 들어, 혈청 반감기 개선) 향상시킨다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양상은 본원에 기재된 접합체 플랫폼을 사용하여 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자) 또는 나노지단백질 입자의 안정성 및/또는 반감기를 증가시키는 것에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 NLP에 대한 폴리펩티드(예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자와 같은 항원-결합 폴리펩티드)의 접합은 폴리펩티드-NLP 복합체(예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드-NLP 복합체)의 안정성을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드-NLP 복합체(예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드-NLP 복합체)의 안정성은 폴리펩티드(예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자와 같은 항원-결합 폴리펩티드)에 접합되지 않은 NLP와 비교하여 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80% 또는 80-90% 증가한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드-NLP 복합체(예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드-NLP 복합체)의 안정성은 NLP에 접합되지 않은 폴리펩티드(예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자와 같은 항원-결합 폴리펩티드)와 비교하여 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80% 또는 80-90% 증가한다. 일부 실시형태에서, NLP 및 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자)를 포함하는 접합체의 안정성은, 예를 들어 본원에서 측정할 때, 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 NLP와 비교하여 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 또는 80-90% 증가한다. 안정한 NLP-폴리펩티드 접합체는 일반적으로 접합체 당 5-60, 10-60, 15-30 또는 20개의 항원-결합 폴리펩티드 분자를 포함하며, 여기에는 접합체당 7-60, 7-40, 7-32 또는 8-30개의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)가 포함된다. 구체적인 예에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 6, 7, 8, 9 또는 10개의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 Fab 또는 Fab-유사 분자이다. 특정 예에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 접합체 당 7-32개의 Fab 분자를 포함한다. (예를 들어, 분석적 SEC에 의해 측정된, 생리학적 관련 온도(37℃의 복합 생물학적 매트릭스(50% 혈청)에서 Fab-NLP 안정성에 대한 Fab 부하의 효과를 입증하는 실시예 5, 도 6A-6B 참조, 여기서 Fab-NLP는 증가된 안정성을 입증하였는데, 이때 Fab-NLP의 >63%가 7 이상의 입자당 Fab 비율에서 24시간 후에 온전하게 남아 있었다).
따라서, 본 발명은 일부 실시형태에서 놀랍게도 안정하고 다른 나노입자 전달 플랫폼의 약동학적 문제를 극복하는 데 도움이 되는 NLP-폴리펩티드 접합체를 제공한다. 예를 들어, 나노입자의 생체내 반감기는 약 1-3일인 것으로 알려져 있고(실시예 5 아래 참고문헌 40 참조), 단일클론 항체 치료제는 종종 FcRn 재순환을 통해 반감기를 연장하기 위해 Fc-매개 약동학에 의존한다. 본 발명의 NLP-폴리펩티드 접합체는, 일부 실시형태에서, NLP 원반형 표면 상에 Fab 또는 Fab-유사 분자와 같은 폴리펩티드의 복수의 복제본의 통합에 기초하여, Fc-매개 약동학 없이 NLP 안정성을 놀랍게도 향상시킨다.
d. 다중특이성 형식
본 발명의 또 다른 양상은 2개 이상의 표적에 결합하는 다중특이성 구조체들, 즉, 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자)를 포함하는 NLP 접합체를 제공한다. 일부 실시형태들에서, 표적은 상이한 항원을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 표적은 동일한 항원을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 표적은 동일한 항원 상의 상이한 에피토프를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 접합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 상이한 항원 또는 에피토프에 결합하는, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 상이한 항원-결합 폴리펩티드, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 상이한 Fab를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합체는 10-12, 10-15, 10-20, 15-20, 15-25, 15-30, 또는 20-30개의 상이한 항원 또는 에피토프에 결합하는, 10-12, 10-15, 10-20, 15-20, 15-25, 15-30, 또는 20-30개의 상이한 항원-결합 폴리펩티드, 예를 들어, 10-12, 10-15, 10-20, 15-20, 15-25, 15-30, 또는 20-30개의 상이한 Fabs를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합체는 25-30, 25-50, 30-45, 30-50, 40-50, 30-60, 또는 40-60개의 상이한 항원 또는 에피토프에 결합하는, 25-30, 25-50, 30-45, 30-50, 40-50, 30-60, 또는 40-60개의 상이한 항원-결합 폴리펩티드, 예를 들어, 25-30, 25-50, 30-45, 30-50, 40-50, 30-60, 또는 40-60개의 상이한 Fab를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 NLP-폴리펩티드 접합체의 항원-결합 폴리펩티드는 2개의 상이한 표적에 대해 지시되어, 이중특이성 접합체를 제공한다. 이중특이성 항체에 대한 아이디어는 60년이 넘었지만 설계, 안정성 및 제조와 관련된 문제로 인해 개발이 지연되었다. 보다 최근에는 항체 공학 기술의 발전으로 이중특이성 양식에 대한 관심이 높아져 최근 FDA에서 세 가지 이중특이성 항체 치료제(EpCAM 및 CD3를 표적으로 하는 Removab, CD19 및 CD3를 표적으로 하는 Blincyto, 인자 IXa 및 인자 X를 표적으로 하는 Hemlibra(Chugai)), 뿐만 아니라 임상 시험에서 100개 이상의 다중 특이성 후보(예를 들어, VEGF-A 및 Ang-2를 표적으로 하는 Faricimab)가 승인되었다. 이중특이성 구조체는 면역 세포를 종양 세포에 결합시키고, 신호 경로를 차단하고/하거나 종양에 특이적으로 페이로드를 전달하는 것과 같은 독특한 작용 메커니즘을 촉진한다.
본원에 개시된 NLP-폴리펩티드 접합체는 신규하고 다용도인 이중특이성 플랫폼을 제공하며, 이는 다중특이성 형식 및/또는 높은 원자가로 쉽게 확장될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 2개의 상이한 Fab 각각의 하나의 분자를 포함하여, 2가, 이중특이성 접합체를 제공한다. 일부 실시형태에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 각각이 2개의 상이한 Fab로 된 2개 분자를 포함하여 4가, 이중특이성 접합체를 제공한다. 일부 실시형태에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 1개 분자의 제1 Fab 및 2개 분자의 제2 Fab를 포함하여 3가, 이중특이성 접합체를 제공한다. 일부 실시형태에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 각각이 2개의 상이한 Fab의 3개 복제본을 포함하여 6가, 이중특이성 접합체를 제공한다. 일부 실시형태에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 각각이 3개의 상이한 Fab의 2개 복제본을 포함하여 6가 삼중특이성 접합체를 제공한다. 일부 실시형태에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 제1 Fab의 2개 복제본 및 제2 Fab의 3개 복제본을 포함하여 5가, 이중특이성 접합체를 제공한다. 일부 실시형태에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 각각이 2개의 상이한 Fab의 4개 복제본을 포함하여 8가, 이중특이성 접합체를 제공한다. 특정 다중 원자가 및 다중 특이성을 제공하기 위한 추가적인 구성은 당업자에게 명백할 것이다.
일부 실시형태에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 한 쌍의 임상적으로 관련된 표적에 결합하는, 각각이 2개 항원-결합 폴리펩티드인 적어도 하나의 분자를 포함한다. "임상적으로 관련된 표적들의 쌍", "임상적으로 관련된 표적 항원들의 쌍", "임상적으로 관련된 쌍" 또는 본원에서 이와 유사한 표현은, 특정 질환의 병리생리학에서 역할을 하여, 이중특이성 항체 또는 다른 이중특이성 구조체에 의한 2개 표적에의 결합이 질환 치료에 유익한 효과를 가져올 수 있는 2개의 질환 매개체(예를 들어, 세포 표면 수용체, 가용성 리간드 또는 기타 단백질)를 지칭한다. 예를 들어, T 세포와 종양 세포 모두가, 예를 들어, 본 발명의 이중특이성 NLP-폴리펩티드 접합체에 의해 결합될 때, 세포용해성 시냅스가 형성되고, 여기서 T 세포는 기공 형성 퍼포린 및 세포독성 그랜자임-B를 방출하고, 차례로 표적 세포의 사멸을 초래한다. 또 다른 예로서, 본원에 기재된 이중특이성 NLP-폴리펩티드 접합체는 하나의 분자로 2개 표적의 신호전달 경로를 동시에 차단할 수 있으며, 이는 혈관신생과 같은 복잡한 경로를 억제하는데 유리하다.
일부 실시형태에서, 임상적으로 관련된 항원 쌍은 T 세포 마커 및 본원에 개시되고/되거나 당업계에 공지된 임의의 하나 이상의 종양 항원과 같은 종양 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 임상적으로 관련된 항원 쌍은 공동-자극 수용체 및 본원에 개시되고/되거나 당업계에 공지된 임의의 하나 이상의 종양 항원과 같은 종양 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 임상적으로 관련된 항원 쌍은 자연 살해(NK) 세포 마커 및 본원에 개시되고/되거나 당업계에 공지된 임의의 하나 이상의 종양 항원과 같은 종양 항원을 포함한다.
"T-세포 마커"는 항원-결합 모이어티를 대상체에 투여한 후 항원-결합 모이어티에 의해 인식될 수 있고, 그리고 항원-결합 모이어티를 대상체의 다른 세포 또는 조직보다 T-세포로 우선적으로 지시하는 임의의 표적을 지칭한다. 예시적인 T-세포 마커는 CD3을 포함한다. "NK 세포 마커"는 항원-결합 모이어티를 대상체에 투여한 후 항원-결합 모이어티에 의해 인식될 수 있고, 그리고 항원-결합 모이어티를 대상체의 다른 세포 또는 조직보다 T-세포로 우선적으로 지시하는 임의의 표적을 지칭한다. 예시적인 NK 세포 마커는 CD316A를 포함한다.
본원에 제공된 이중특이성 또는 다중특이성 접합체(예를 들어, NLP-Fab 접합체 또는 NLP-Fab 유사 분자 접합체)에 의해 표적화될 수 있는 분자의 추가 예는 사이토카인, 가용성 혈청 단백질 및 이들의 수용체 및 기타 막 결합 단백질(예를 들어, 접착체)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 실시형태에서, 이중- 또는 다중-특이적 접합체(예를 들어, NLP-Fab 접합체 또는 NLP-Fab 유사 분자 접합체)는, 8MPI, 8MP2, 8MP38 (GDFIO), 8MP4, 8MP6, 8MP8, CSFI (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGF1 (αFGF), FGF2 (βFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFN81, IFNG, IFNWI, FEL1, FEL1 (EPSELON), FEL1 (ZETA), IL 1A, IL 1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL 11, IL 12A, IL 12B, IL 13, IL 14, IL 15, IL 16, IL 17, IL 17B, IL 18, IL 19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBb3, LTA (TNF-β), LTB, TNF (TNF-α), TNFSF4 (OX40 리간드), TNFSF5 (CD40 리간드), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 리간드), TNFSF8 (CD30 리간드), TNFSF9 (4-1 BB 리간드), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, IL1R1, IL1R2, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, I10RA, IL10RB, IL 11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP (렙틴), PTN, 및 THPO로 구성된 그룹에서 선택된, 하나, 둘 또는 그 이상의 사이토카인, 사이토카인-관련 단백질, 및 사이토카인 수용체들에 결합한다.
일부 실시형태에서, 표적 항원은 케모카인, 케모카인 수용체 또는 케모카인 관련 단백질이다. 특정 구체예들에서, 이중- 또는 다중-특이적 접합체는 CCL1(1-309), CCL2 (MCP-1/MCAF), CCL3 (MIP-Iα), CCL4 (MIP-Iβ), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCL11 (에오탁신), CCL 13 (MCP-4), CCL 15 (MIP-Iδ), CCL 16 (HCC-4), CCL 17 (TARC), CCL 18 (PARC), CCL 19 (MDP-3b), CCL20 (MIP-3α), CCL21 (SLC/엑소두스-2), CCL22 (MDC/ STC-1), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2 /에오탁신-2), CCL25 (TECK), CCL26 (에오탁신-3), CCL27 (CTACK / ILC), CCL28, CXCLI (GROI), CXCL2 (GR02), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL 10 (IP 10), CXCL 11 (1-TAC), CXCL 12 (SDFI), CXCL 13, CXCL 14, CXCL 16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL 1 (SCYDI), SCYEI, XCLI (림포탁틴), XCL2 (SCM-Iβ), BLRI (MDR15), CCBP2 (D6/JAB61), CCRI (CKRI/HM145), CCR2 (mcp-IRB IRA), CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBII), CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), XCR1 (GPR5/CCXCR1), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Rα), IL8RB (IL8Rβ), LTB4R (GPR16), TCP10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5R1, CSF3, GRCC10 (C10), EPO, FY (DARC), GDF5, HDF1, HDF1α, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SL1T2, TLR2, TLR4, TREM1, TREM2, 및 VHL로 구성된 그룹에서 선택된 하나, 둘 또는 그 이상의 케모카인, 케모카인 수용체, 또는 케모카인-관련 단백질에 결합한다.
일부 실시형태들에서, 표적 항원은 CD 단백질이다. 특정 실시형태에서, 이중- 또는 다중-특이적 접합체(예를 들어, NLP-Fab 접합체 또는 NLP-Fab-유사 분자 접합체)는 ErbB 수용체 계열, 예를 들어, EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체의 CD3, CD4, CD5, CD16, CD19, CD20, CD34; CD64, CD200 구성원; 세포 부착 분자 예를 들어, LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 알파4/베타7 인테그린, 및 알파v/베타3 인테그린 (이의 알파 또는 베타 서브유닛들 (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18, 또는 항-CD11b 항체) 포함); 성장 인자, 예를 들어, VEGF-A, VEGF-C; 조직 인자 (TF); 알파 인터페론 (알파IFN); TNF알파, 인터루킨, 예를 들어, IL-1 베타, IL-3, IL-4, IL-5, IL-S, IL-9, IL-13, IL 17 AF, IL-1S, IL-13R 알파1, IL13R 알파2, IL-4R, IL-5R, IL-9R, IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mp1 수용체; CTLA-4; RANKL, RANK, RSV F 단백질, 단백질 C 등으로 구성된 하나, 둘 또는 그 이상의 CD 단백질에 결합한다.
특정 실시형태들에서, 다중-특이적 NLP-폴리펩티드 접합체(예를 들어, NLP-Fab 접합체 또는 NLP-Fab 유사 분자 접합체)는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질(LRP)-1 또는 LRP-8 또는 트랜스페린 수용체 및, 1) 베타-분비효소(BACE1 또는 BACE2), 2) 알파-분비효소, 3) 감마-분비효소, 4) 타우-분비효소, 5) 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 6) 사멸 수용체 6(DR6), 7) 아밀로이드 베타 펩티드, 8) 알파-시누클레인, 9) 파킨, 10) 헌팅틴, 11) p75 NTR 및 12) 카스파제-6으로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 하나의 표적에 결합한다.
특정 실시형태에서, 다중-특이적 NLP-폴리펩티드 접합체(예를 들어, NLP-Fab 접합체 또는 NLP-Fab-유사 분자 접합체)는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 임상적으로 관련된 쌍에 결합한다: IL-1 알파 및 IL-1 베타; IL-12 및 IL-1S; IL-13 및 IL-9; IL-13 및 IL-4; IL-13 및 IL-5; IL-5 및 IL-4; IL-13 및 IL-1베타; IL-13 및 IL-25; IL-13 및 TARC; IL-13 및 MDC; IL-13 및 MEF; IL-13 및 TGF; IL-13 및 LHR 작용제; IL-12 및 TWEAK; IL-13 및 CL25; IL-13 및 SPRR2a; IL-13 및 SPRR2b; IL-13 및 ADAMS; IL-13 및 PED2; IL17A 및 IL17F; CD3 및 CD19; CD138 및 CD20; CD138 및 CD40; CD19 및 CD20; CD20 및 CD3; CD3S 및 CD13S; CD3S 및 CD20; CD3S 및 CD40; CD40 및 CD20; CD-S 및 IL-6; CD20 및 BR3; TNF-알파 및 TGF-베타; TNF-알파 및 IL-1 베타; TNF-알파 및 IL-2; TNF-알파 및 IL-3; TNF-알파 및 IL-4; TNF-알파 및 IL-5; TNF-알파 및 IL-6; TNF-알파 및 IL8; TNF-알파 및 IL-9; TNF-알파 및 IL-10, TNF-알파 및 IL-11; TNF-알파 및 IL-12; TNF-알파 및 IL-13; TNF-알파 및 IL-14; TNF-알파 및 IL-15; TNF-알파 및 IL-16; TNF-알파 및 IL-17; TNF-알파 및 IL-18; TNF-알파 및 IL-19; TNF-알파 및 IL-20; TNF-알파 및 IL-23; TNF-알파 및 IFN-알파; TNF-알파 및 CD4; TNF-알파 및 VEGF; TNF-알파 및 MIF; TNF-알파 및 ICAM-1; TNF-알파 및 PGE4; TNF-알파 및 PEG2; TNF-알파 및 RANK lig및; TNF-알파 및 Te38; TNF-알파 및 BAFF; TNF-알파 및 CD22; TNF-알파 및 CTLA-4; TNF-알파 및 GP130; TNF-알파 및 IL-12p40; VEGF 및 HER2; VEGF-A 및 HER2; VEGF-A 및 PDGF; HER1 및 HER2; VEGFA 및 ANG2; VEGF-A 및 VEGF-C; VEGF-C 및 VEGF-D; HER2 및 DR5; VEGF 및 IL-8; VEGF 및 MET; VEGFR 및 MET receptor; EGFR 및 MET; VEGFR 및 EGFR; HER2 및 CD64; HER2 및 CD3; HER2 및 CD16; HER2 및 HER3; EGFR (HER I) 및 HER2; EGFR 및 HER3; EGFR 및 HER4; IL-14 및 IL-13; IL-13 및 CD40L; IL4 및 CD40L; TNFR1 및 IL-1R; TNFR1 및 IL-6R; TNFR1 및 IL-18R; EpCAM 및 CD3; MAPG 및 CD28; EGFR 및 CD64; CSPGs 및 RGM A; CTLA-4 및 BTN02; IGF1 및 IGF2; IGF1/2 및 Erb2B; MAG 및 RGM A; NgR 및 RGM A; NogoA 및 RGM A; OMGp 및 RGM A; POL-1 및 CTLA-4; 및 RGM A 및 RGM B.
본 발명의 다중-특이적 NLP-폴리펩티드 접합체(예를 들어, NLP-Fab 접합체 또는 NLP-Fab-유사 분자 접합체)에 의해 공동-표적화될 수 있는 추가의 임상적으로 관련된 쌍에는 CD63 및 CD95(사멸 수용체); HER2 및 CD63(리소좀 내재화에 관여하는 수용체); CD20 또는 CD19 및 CD47("Don't eat me" 신호전달 중단); LAG-3 및 PD1; CTLA4 및 PD1; 및 LAG-3 및 PD-L1이 포함된다.
특정 실시형태에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 CD3(일반 T-세포 마커)에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제1 Fab) 및 표적화 CD19(종양 항원)에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제1 Fab); 및 EpCAM(종양 항원)에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제1 Fab); 및 CEA에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 CD16A(NK 세포 마커)에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제1 Fab) 및 CD30 또는 CD33에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab); 및 선택적으로 IL-15에 결합하는 제3 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제3 Fab)를 포함한다.
하나의 특정 예에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 Ang-2에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제1 Fab); 및 VEGF-A에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함한다. 또 다른 특정 예에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 델타-유사 리간드 4에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제1 Fab); 및 VEGF에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함한다. 또 다른 특정 예에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 DR5에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제1 Fab); 및 FAP (섬유아세포 활성화 단백질)에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제1 Fab); 및 CD33, gp100, HER2, 글리피칸-3 및 TROP-2 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab); 및 선택적으로 IL-2, CD137 및 CD28로부터 선택되는 적어도 하나의 공동자극 분자에 결합하는 제3 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제3 Fab)를 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제1 Fab); 및 CD33, gp100, HER2, 글리피칸-3 및 TROP-2 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab); 및 선택적으로 PD1 및/또는 PD-L1에 결합하는 제3 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제3 Fab)를 포함한다. 특정 실시형태에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제1 Fab); CEA에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab); 및 PD1 및 PD-L1 중 적어도 하나에 결합하는 제3 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제3 Fab)를 포함한다.
일부 특정 실시형태들에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 CD28에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제1 Fab); 및 CD20에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함한다. 일부 특정 실시형태들에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 PD1에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제1 Fab); 및 CTLA4에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 2개의 상이한 HER2 에피토프에 결합하는 2개의 항원-결합 폴리펩티드를 포함한다.
d. 짧은 펩티드 구성성분
일부 실시형태들에서, NLP-폴리펩티드 접합체는 1-80, 10-70, 또는 20-60개 아미노산을 포함하는 짧은 펩티드 (예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)에 공유 부착된 적어도 하나의 C4-28 지방-아실을 포함한다(예를 들어, 추가로 포함한다).
일부 실시형태들에서, C4-28 지방-아실은 C16 지방-아실이다. 일부 실시형태들에서, C4-28 지방-아실은 작용기(예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 작용기)를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 작용기는 C4-28 지방-아실의 탄화수소 꼬리의 화학 구조의 일부 또는 바로 위에 위치한다. 일부 실시형태에서, 작용기는 짧은 펩티드의 (예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이) 하나 이상의 아미노산 잔기 상의 상응하는 또는 상보적 작용기와 반응한다. 일부 실시형태에서, 상응하거나 상보적 작용기는 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)의 C-말단에 위치한다. 일부 실시형태에서, 상응하거나 상보적 작용기는 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)의 N-말단에 위치한다. 일부 실시형태에서, C4-28 지방-아실은 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)의 N-말단에서 리신 측쇄의 엡실론 아미노기에 접합된다. 일부 실시형태들에서, 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 짧은 펩티드(예를 들어, 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 C4-28 지방-아실 분자, 각각은 짧은 펩티드, 예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체에 공유 부착됨)를 포함한다 (예를 들어, 추가로 포함한다). 일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드: NLP의 몰비는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60이다. 일부 실시형태들에서, NLP에서 짧은 펩티드: 항원-결합 폴리펩티드의 몰비는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 또는 40-60이다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드와 항원-결합 폴리펩티드를 모두 포함하는 NLP의 짧은 펩티드:항원-결합 폴리펩티드의 몰비는 약 1:60 내지 60:1(이러한 범위 내의 임의의 비율을 포함)이다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드와 항원-결합 폴리펩티드를 모두 포함하는 NLP의 짧은 펩티드:항원-결합 폴리펩티드의 몰비는 약 20이다. 일부 실시형태에서, NLP는 1-50개의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 폴리펩티드) 및 1-100개(예를 들어, 약 60개)의 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체는 5-30, 10-25, 15-20, 또는 18개의 짧은 펩티드 분자(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체), 및 5-40, 10-35, 15-30, 20-25, 또는 23개의 항원-결합 폴리펩티드 분자(예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자)를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체는 3-30, 5-20, 10-15, 또는 13개의 짧은 펩티드 분자(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체), 및 10-60개의 항원-결합 폴리펩티드 분자(예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자)를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체는 20-80, 25-70, 30-60, 35-50, 또는 40개의 짧은 폴리펩티드 분자(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체), 및 10-60개의 항원-결합 폴리펩티드 분자(예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자)를 포함한다. 일부 실시형태들에서, NLP에서 짧은 펩티드: 항원-결합 폴리펩티드의 몰비는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 또는 40-60이다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드와 항원-결합 폴리펩티드를 모두 포함하는 NLP의 짧은 펩티드:항원-결합 폴리펩티드의 몰비는 약 1:60 내지 60:1(이러한 범위 내의 임의의 비율을 포함)이다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드와 항원-결합 폴리펩티드를 모두 포함하는 NLP의 짧은 펩티드:항원-결합 폴리펩티드의 몰비는 약 20이다.
일부 실시형태에서, 펩티드-접합된 C4-28 지방-아실의 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체로의 통합은 예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드에 대해 상기 기재된 바와 같이 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)의 결합력, 활성 또는 효능을 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체는 2개 이상의 상이한 활성, 예를 들어, 상이한 표적 결합 특이성 및/또는 상이한 치료 활성을 나타내는 2개 이상의 상이한 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 상이한 짧은 펩티드, 예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)를 포함한다. 본원에 개시된 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체는 (상기 기재된) 항원-결합 폴리펩티드에 대하여 뿐만 아니라, 짧은 펩티드 (예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)에 대하여도 다중 특이성 형식 및/또는 높은 원자가로 확장될 수 있는 다중특이성 플랫폼을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 상이한 항원 또는 에피토프에 결합하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 상이한 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체), 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 상이한 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체는 10-12, 10-15, 10-20, 15-20, 15-25, 15-30, 또는 20-30개의 상이한 항원 또는 에피토프에 결합하는, 10-12, 10-15, 10-20, 15-20, 15-25, 15-30, 또는 20-30개의 상이한 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체), 예를 들어, 10-12, 10-15, 10-20, 15-20, 15-25, 15-30, 또는 20-30개의 상이한 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체는 25-30, 25-50, 30-45, 30-50, 40-50, 30-60, 또는 40-60개의 상이한 항원 또는 에피토프에 결합하는, 25-30, 25-50, 30-45, 30-50, 40-50, 30-60, 또는 40-60개의 상이한 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체), 예를 들어, 25-30, 25-50, 30-45, 30-50, 40-50, 30-60, 또는 40-60개의 상이한 펩티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체는 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체) 및 항원-결합 펩티드(예를 들어, Fab 또는 Fab 유사 분자)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드는 항원-결합 폴리펩티드와 동일한 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드는 항원-결합 폴리펩티드와 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드는 항원-결합 폴리펩티드의 활성(예를 들어, 치료 활성)에 상보적이거나 상승작용하는 활성(예를 들어, 치료 활성)을 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체는 2개의 상이한 항원에 결합하는 2개의 짧은 펩티드를 포함하고, 여기서 2개의 상이한 항원은 다음 쌍으로부터 선택된다: CD3 및 CD19; CD3 및 EpCAM; CD3 및 CEA; CD16 및 CD30; CD16 및 CD33; Ang-2 및 VEGF-A; 및 인자 X 및 인자 IXa. 일부 실시형태에서, 접합체는 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체) 및 항원-결합 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 짧은 펩티드 및 항원-결합 폴리펩티드는 2개의 상이한 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개의 상이한 항원은 다음 쌍으로부터 선택된다: CD3 및 CD19; CD3 및 EpCAM; CD3 및 CEA; CD16 및 CD30; CD16 및 CD33; Ang-2 및 VEGF-A; 및 인자 X 및 인자 IXa.
일부 실시형태들에서, 접합체는 OX40, DR4, GITR, Tie2, 인자 D, VEGF, MerTK, CD3, 및 림포톡신 베타 수용체로부터 선택된 표적에 결합하는 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 접합체는 전술한 표적들의 임의의 조합에 결합하는 적어도 2개의 상이한 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체), 또는 짧은 펩티드 (예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체) 및 항원-결합 펩티드 (예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자)를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 접합체는 인자 D, VEGF, Tie2, 및 DR4로부터 선택된 표적에 결합하는 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 접합체는 전술한 표적들의 임의의 조합에 결합하는 적어도 2개의 상이한 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체), 또는 짧은 펩티드 (예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체) 및 항원-결합 펩티드 (예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자)를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드는 시스테인-매듭 펩티드(CKP)이다. 시스틴 매듭 펩티드는 일반적으로 20 내지 60개의 아미노산 길이를 가지며 6개의 보존된 시스테인을 포함하는데, 이들은 시스틴 매듭 모티프, 즉, 2개의 이황화 결합들이 세 번째 이황화 결합에 의해 엮여 형성된 고리로 알려진 매듭 형태로 배열된 3개의 분자 내 이황화 결합을 형성한다(Craik 외, (2001) Toxicon 39(1): 43-60). 다양한 종의 펩티드 및 단백질에 존재하는 이러한 구조적 모티프는 열적, 화학적 및 효소적 분해에 대해 펩티드 프레임워크에 높은 안정성을 부여한다(Colgrave 외, (2004) Biochemistry 43, 5965-5975). 예시적인 CKP는, 예를 들어, EETI-II(UniProt 수탁 번호 P12071), 사이클로사이코트라이드 A(UniProt 수탁 번호 P56872), 사이클로비올라신 O1(Uniprot 수탁 번호 P82230), 사이클로비올라신 O12(UniProt 수탁 번호 P83836), 칼라타(예를 들어, 칼라타 B1(Uniprot 수탁 번호 P56254), 칼라타 B8(Uniprot 수탁 번호 P85175), 등), 팔리쿠레인(Uniprot 수탁 번호 P84645), 트리사이클론 A(Uniprot 수탁 번호 B6E617), 모모르디카 코??치넨시스 트립신 억제제, 예를 들어, MCoTI 1 (Uniprot 수탁 번호 P82408), 스피나시아 올레라세아 트립신 억제제, 예를 들어, SOTI 1 (Uniprot 수탁 번호 P84779), 서큘린 A(Uniprot 수탁 번호 P56871), 서큘린 B (Uniprot 수탁 번호56879), 사이클로사이코트라이드 (Uniprot 수탁 번호 P56872), 및 varv 펩티드 A(Uniprot 수탁 번호 P58446)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태들에서, CKP는 EETI-II이다. EETI-II의 아미노산 서열은 GCPRILMRCKQDSDCLAGCVCGPNGFCG(서열번호 1)이다.
CKP에서 보존된 시스테인 잔기에 연접하는 루프 영역에 존재하는 높은 아미노산 서열 다양성은 이러한 영역들에서 비천연 서열이 허용될 수 있음을 시사한다. CKP 백본은 천연 CKP와 상당히 다른 구조 및/또는 생물학적 활성을 가진 매우 안정적인 펩티드를 생성하기 위해 펩티드 이식 및 친화도 성숙을 위한 프레임워크로 사용되어 왔다. 예를 들어, 엑발리움 엘라테리움 트립신 억제제 II(EETI-II)는 이 트립신 결합 루프(PRILMR)를 엘라스타제, 트롬보포이에틴 및 인테그린과 같은 표적에 대해 이식된 생물학적 활성 펩티드로 합리적으로 대체함으로써 분자 스캐폴드로 사용되어 왔다. 예를 들어, Kimura 외, (2009) Proteins 77, 359-369; Gunasekera 외, (2008) J. Med. Chem. 51: 7697-7704; 　Krause 외, (2007) Proteins 77, 359-369; Hilpert 외, (2003) J. Biol. Chem. 278, 24986-24993; 및 Kimura 외, (2011) PLoS One 6, e16112)을 참고하라. 또한 VEGFA 및 LRP6과 같은 관심 표적에 결합하는 EETI-II의 펩티드 유도체는 친화도 성숙을 통해 생성되었다. WO 2017/ 049009를 참고하라. 일부 실시형태들에서, 펩티드는 CKP 변이체이다. 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열들에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 C 말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 화학적 변형을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, CKP 변이체는 (예를 들어, CKP 변이체의 N-말단에서 또는 그 근처에서, 또는 CKP 변이체의 C-말단 또는 그 근처에서) CKP 변이체에 대한 C4-28 지방-아실(예를 들어, C16 지방-아실)의 공유 접합을 허용하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, CKP 변이체는 이것이 유도된 야생형 CKP에 비해 그의 N-말단에 추가적인 리신 잔기를 추가로 포함한다(예를 들어, 추가로 포함하도록 변형되었다). 일부 실시형태에서, CKP 변이체는 이것이 유래된 야생형 CKP가 결합하는 표적과 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, CKP 변이체는 이것이 유래된 야생형 CKP가 결합하는 표적과 상이한 활성(예를 들어, 치료 활성)을 나타낸다. 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 EETI-TT(서열번호 1)로부터 유래된다.
일부 실시형태들에서, 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자) 및 짧은 펩티드를 포함하는 접합체(예를 들어, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체)에서 짧은 펩티드의 활성은 짧은 펩티드를 포함하는, 즉, 항원-결합 폴리펩티드가 없는 접합체(예를 들어, 펩티드-NLP 접합체)의 활성보다 더 높다, 예를 들어, 약 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 또는 10-배 중 어느 하나만큼 더 높다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드의 활성은 약 2배 내지 20배 더 높다, 예를 들어 약 5배 더 높다. 일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드는 CKP, 예를 들어, EETI-II이다. 일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드는 EETI-II로부터 유래한 CKP 변이체이다.
III. 짧은 펩티드를 포함하는 나노지단백질 접합체
본 발명의 또 다른 양상은 1-80, 10-70, 또는 20-60개의 아미노산을 포함하는 적어도 하나의 짧은 펩티드(즉, 스캐폴드 단백질 이외의 NLP-통합 펩티드)를 포함하는 나노지단백질 입자 접합체에 관한 것이다. 본원의 다른 부분에서 논의한 바와 같이, "나노지단백질 입자" 또는 NLP는 지질 및 스캐폴드 단백질을 포함하는 초분자 복합체, 특히 아포지단백질과 같은 막-형성 지질 및 스캐폴드 단백질을 포함하는 초분자 복합체를 지칭한다. NLP는 일반적으로 자기조립 과정을 통해 형성되는데, 여기서 막-형성 지질은 원반 모양을 갖는 지질 이중층을 형성하고(참고문헌 19 아래 실시예 5 참조), 여기서 디스크의 소수성 주변부는 이중층 디스크를 둘러싸는 스캐폴드 단백질에 결합하여 안정화된다. 일부 실시형태에서, 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실(예를 들어, C16 지방-아실)을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 막-형성 지질은 알킬포스포콜린, 에테르 지질, 당지질, 라이소스핑고지질, 라이소글리세로포스포리피드, 포스포리피드, 스핑고리피드 및/또는 스테롤을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시형태들에서, 막-형성 지질은 인지질 또는 상이한 인지질의 조합이다. 예시적인 인지질에는, 예를 들어, 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디올레오일포스포-에탄올아민(DOPE), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디올레오일포스포세린(DOPS) 및 디팔미토일-포스파티딜-콜린(DPPC) 및 이의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시형태에서, 막-형성 지질은 DOPE 및/또는 DOPC이다. 일부 실시형태에서, 막-형성 지질은 디글리세롤 테트라에테르, 콜레스테롤, 에르고스테롤 등과 같은 비지질 양친매성 분자이다.
일부 실시형태에서, 막-형성 지질은 생물학적 분자, 즉 살아있는 유기체, 예를 들어 박테리아, 효모 또는 포유동물에 의해 생성된 분자이다.
이러한 펩티드-NLP 접합체에서, 막-형성 지질에 의해 형성된 이중층은 하나 이상의 스캐폴드 단백질, 즉 본원의 다른 부분에서 설명된 스캐폴드 단백질에 의해 안정화된다. 일부 실시형태들에서, 스캐폴드 단백질은 아포지단백질이다. 일부 실시형태들에서, 스캐폴드 단백질은 아포지단백질 A, 아포지단백질 B, 아포지단백질 C, 아포지단백질 D, 아포지단백질 H, 아포지단백질 E, 또는 이들 중 어느 하나 이상의 조합이다. 일부 실시형태들에서, 스캐폴드 단백질은 상기 이중층을 안정화시킬 수 있는 기존의 아포지단백질 중 어느 하나의 절단된 버전이다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 apoE3의 절단된 버전(예를 들어, apoE322k), apoE2의 절단된 버전(예를 들어, apoE222k), 또는 apoA1의 절단된 버전(예를 들어, Δ49ApoA1, MSP1, MSP1T2, MSP1E3D1)이다. 일부 실시예에서, 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질 성분은 둘 다 살아있는 유기체에 의해 생성된 생물학적 분자이고, 비생물학적 유래 물질이 없는 NLP를 형성한다.
당업자는 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질이 펩티드-NLP 접합체 조립을 용이하게 하기에 적합한 몰비로 제공될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시예에서, 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질은 1:50에서 1:100까지; 1:60에서 1:90까지; 또는 1:70에서 1:80까지의 몰비로 존재한다. 일부 실시형태들에서, 스캐폴드 단백질 및 상기 막-형성 지질은 1:60, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 또는 1:100의 몰비로 존재한다. 특정 실시예에서, 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질은 1:80의 몰비이다. 일부 실시형태에서, 대부분의 또는 모든 막-형성 지질이 이중층으로 배열되고 조립되지 않은 상태로 남아 있는 것이 없거나 거의 없도록 하는 비율이 사용된다.
일부 실시예에서, 펩티드-NLP 접합체는 1-80, 10-70, 또는 20-60개 아미노산을 포함하는 짧은 펩티드에 공유 부착된 적어도 하나의 C4-28 지방-아실 막-형성 지질을 포함한다. 일부 실시형태들에서, C4-28 지방-아실은 C16 지방-아실이다. 일부 실시형태들에서, C4-28 지방-아실은 작용기(예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 작용기)를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 작용기는 C4-28 지방-아실의 탄화수소 꼬리의 화학 구조의 일부 또는 바로 위에 위치한다. 일부 실시형태에서, 작용기는 짧은 펩티드의 (예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이) 하나 이상의 아미노산 잔기 상의 상응하는 또는 상보적 작용기와 반응한다. 일부 실시형태에서, 상응하거나 상보적 작용기는 펩티드의 C-말단에 위치한다. 일부 실시형태에서, 상응하거나 상보적 작용기는 펩티드의 N-말단에 위치한다. 일부 실시형태에서, C4-28 지방-아실은 짧은 펩티드의 N-말단에서 리신 측쇄의 엡실론 아미노기에 접합된다. 일부 실시형태들에서, 펩티드-NLP 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 짧은 펩티드(예를 들어, 짧은 펩티드에 공유 부착된 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 C4-28 지방-아실 (예를 들어, C16 지방-아실) 막-형성 지질)을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드: NLP의 몰비는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60이다. 본원에 기재된, 짧은 펩티드의 NLP로의 성공적인 통합은 하기 실시예 6 및 7에 기재된 기술, 예를 들어 액체 크로마토그래피-질량 분석법, 겔 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 및 핵 자기 공명(NMR)을 사용하여 확인 및/또는 정량화될 수 있다. 도 10A는 짧은 펩티드를 포함하는 예시적인 NLP의 어셈블리의 개략도를 도시한다.
일부 실시형태에서, 펩티드-접합된 C4-28 지방-아실 막-형성 지질의 통합은 예를 들어 접합체가 2개 이상의 짧은 펩티드 분자를 제공하는 경우, 즉, 동일한 펩티드의 다중 복제본이 펩티드-NLP 접합체에 통합되는 경우, 짧은 펩티드의 다량체화를 용이하게 한다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 본원의 다른 부분에서 항원-결합 폴리펩티드에 대해 기재된 바와 같이 펩티드의 결합력, 활성 또는 효능이 증가된다.
일부 실시형태에서, 펩티드-NLP 접합체는 2개 이상의 상이한 활성, 예를 들어, 상이한 표적 결합 특이성 및/또는 상이한 치료 활성을 나타내는 2개 이상의 상이한 짧은 펩티드(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 상이한 짧은 펩티드)를 포함한다. 본원에 개시된 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체는 짧은 펩티드에 대하여 다중 특이성 형식 및/또는 높은 원자가로 확장될 수 있는 다중특이성 플랫폼을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, 펩티드-NLP 접합체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 상이한 항원 또는 에피토프에 결합하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 상이한 짧은 펩티드, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 상이한 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩티드-NLP 접합체는 10-12, 10-15, 10-20, 15-20, 15-25, 15-30, 또는 20-30개의 상이한 항원 또는 에피토프에 결합하는, 10-12, 10-15, 10-20, 15-20, 15-25, 15-30, 또는 20-30개의 상이한 짧은 펩티드, 예를 들어, 10-12, 10-15, 10-20, 15-20, 15-25, 15-30, 또는 20-30개의 상이한 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩티드-NLP 접합체는 25-30, 25-50, 30-45, 30-50, 40-50, 30-60, 또는 40-60개의 상이한 항원 또는 에피토프에 결합하는, 25-30, 25-50, 30-45, 30-50, 40-50, 30-60, 또는 40-60개의 상이한 짧은 펩티드, 예를 들어, 25-30, 25-50, 30-45, 30-50, 40-50, 30-60, 또는 40-60개의 상이한 펩티드를 포함한다.
짧은 펩티드에 대하여 특정 다중 원자가 및 다중 특이성을 제공하기 위한 구성은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 펩티드-NLP 접합체는 2개의 상이한 항원에 결합하는 2개의 짧은 펩티드를 포함하고, 여기서 2개의 상이한 항원은 다음 쌍으로부터 선택된다: CD3 및 CD19; CD3 및 EpCAM; CD3 및 CEA; CD16 및 CD30; CD16 및 CD33; Ang-2 및 VEGF-A; 및 인자 X 및 인자 IXa.
일부 실시형태들에서, 펩티드-NLP 접합체는 OX40, DR4, GITR, Tie2, 인자 D, VEGF, MerTK, CD3, 및 림포톡신 베타 수용체로부터 선택된 표적에 결합하는 짧은 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 접합체는 전술한 표적들의 임의의 조합에 결합하는 적어도 2개의 상이한 짧은 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 펩티드-NLP 접합체는 인자 D, VEGF, Tie2, 및 DR4로부터 선택된 표적에 결합하는 짧은 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 접합체는 전술한 표적들의 임의의 조합에 결합하는 적어도 2개의 상이한 짧은 펩티드를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드는 시스테인-매듭 펩티드(CKP)이다. 예시적인 CKP는, 예를 들어, EETI-II(UniProt 수탁 번호 P12071), 사이클로사이코트라이드 A(UniProt 수탁 번호 P56872), 사이클로비올라신 O1(Uniprot 수탁 번호 P82230), 사이클로비올라신 O12(UniProt 수탁 번호 P83836), 칼라타(예를 들어, 칼라타 B1(Uniprot 수탁 번호 P56254), 칼라타 B8(Uniprot 수탁 번호 P85175), 등), 팔리쿠레인(Uniprot 수탁 번호 P84645), 트리사이클론 A(Uniprot 수탁 번호 B6E617), 모모르디카 코??치넨시스 트립신 억제제, 예를 들어, MCoTI 1 (Uniprot 수탁 번호 P82408), 스피나시아 올레라세아 트립신 억제제, 예를 들어, SOTI 1 (Uniprot 수탁 번호 P84779), 서큘린 A(Uniprot 수탁 번호 P56871), 서큘린 B (Uniprot 수탁 번호56879), 사이클로사이코트라이드 (Uniprot 수탁 번호 P56872), 및 varv 펩티드 A(Uniprot 수탁 번호 P58446)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태들에서, CKP는 EETI-II이다. EETI-II의 아미노산 서열은 GCPRILMRCKQDSDCLAGCVCGPNGFCG(서열번호 1)이다.
일부 실시형태들에서, 펩티드는 CKP 변이체이다. 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열들에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 C 말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 화학적 변형을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, CKP 변이체는 (예를 들어, CKP 변이체의 N-말단에서 또는 그 근처에서, 또는 CKP 변이체의 C-말단 또는 그 근처에서) CKP 변이체에 대한 C4-28 지방-아실(예를 들어, C16 지방-아실)의 공유 접합을 허용하는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, CKP 변이체는 이것이 유래된 야생형 CKP가 결합하는 표적과 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, CKP 변이체는 이것이 유래된 야생형 CKP가 결합하는 표적과 상이한 활성(예를 들어, 치료 활성)을 나타낸다. 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 EETI-TT(서열번호 1)로부터 유래된다.
일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드를 포함하는 펩티드-NLP 접합체(예를 들어, NLP 접합체)에서 짧은 펩티드의 활성(예를 들어, 생물학적 활성)은, 유리된 짧은 펩티드, 즉, 펩티드-NLP 접합체에 통합되지 않은 펩티드의 활성보다 더 낮다, 예를 들어, 약 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 또는 10-배 중 어느 하나만큼 더 낮다. 일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드의 활성은 약 5배 더 낮다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드를 포함하는 펩티드-NLP 접합체에서 짧은 펩티드의 활성(예를 들어, 생물학적 활성)은 유리 펩티드 활성의 80-90%, 90-95%, 또는 95-99%이다. 일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드는 CKP, 예를 들어, EETI-II이다. 일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드는 EETI-II로부터 유래한 CKP 변이체이다.
NLP의 안정성(예를 들어, 시험관내 안정성 또는 생체내 반감기)을 증가시키는 방법은 당업계에 공지되어 있고 펩티드-NKP 접합체의 안정성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, Gilmore SF, Carpenter TS, Ingolfsson HI, Peters SKG, Henderson PT, Blanchette CD, Fischer NO "Lipid composition dictates serum stability of reconstituted high-density lipoproteins: implications for in vivo applications" Nanoscale, 2018, 10 (16):7420-7430; and Gilmore SF, Blanchette CD, Scharadin TM, Hura GL, Rasley A, Corzett M, Pan CX, Fischer NO, Henderson PT. "Lipid Cross-Linking of Nanolipoprotein Particles Substantially Enhances Serum Stability and Cellular Uptake" ACS Applied Material Interfaces, 2016, 8:32를 참고하라.
본 발명의 접합체, 예를 들어 펩티드-NLP 접합체, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체 및 NLP-폴리펩티드 접합체는 그 자체로 또는 약학 조성물의 일부로서 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 약학 조성물은 아래에서 논의된다.
IV. 약학 조성물 및 투여
또 다른 양상에서, 본 발명은 약학 조성물, 예를 들어 본 발명의 적어도 하나의 접합체(예를 들어, 펩티드-NLP 접합체, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체 및/또는 NLP-폴리펩티드 접합체) 및 약학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물은 또한 "약제" 또는 "제형"으로 지칭될 수 있다. 본 발명의 접합체(예를 들어, 펩티드-NLP 접합체, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체 및 NLP-폴리펩티드 접합체), 특히 NLP-Fab 접합체 또는 펩티드-NLP-Fab 접합체는 공지 기술에 기초하여 약학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 생리학적으로 허용되는 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 접합체는 약학적으로 허용되는 비히클 또는 담체와 조합되어 약학 조성물을 형성한다.
"약학적으로 허용되는 비히클" 또는 "약학적으로 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성이고 조성물의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않는 활성 성분 이외의 약학적 조성물 중의 성분을 의미한다. 일반적으로, 약학적으로 허용되는 비히클은 약학적 조성물에 통합되고 활성 성분(들)의 의도한 유익한 효과를 능가하는 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않고 대상체에게 투여된다. 약학적으로 허용되는 비히클은 완충제, 용매, 부형제, 안정화제, 희석제, 방부제 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 사용되는 비히클은 일반적으로 약학 조성물의 형태 및/또는 의도된 투여 경로에 따라 다르다. 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 바람직하게는 독성학적 및 제조 시험의 필수 표준을 충족하고/하거나 미국 식품의약국에서 준비한 비활성 성분 가이드에 포함되어 있다.
약학적 조성물은 정맥내 투여에 의해, 예를 들어 볼루스로서 또는 일정 기간에 걸쳐 연속 주입에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 약학적 조성물은 정맥내, 피내, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 관절내, 활액내 또는 피하 투여에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 기관내, 질, 경구, 설하 또는 안구 투여 경로에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 약학적 조성물은 뇌 또는 중추신경계에 투여된다.
본 발명의 조성물은 적절한 용량의 고체, 액체 또는 에어로졸의 형태로 대상체에게 투여될 수 있다. 고체 조성물의 예는 알약, 크림 및 이식 가능한 투여 단위를 포함한다. 알약은 경구 투여할 수 있다. 치료 크림은 국소적으로(topically) 투여할 수 있다. 이식가능한 투여량 단위는, 예를 들어, 종양 부위에 국소적으로 투여될 수 있거나, 약학 조성물의 전신 방출을 위해, 예를 들어, 피하로 이식될 수 있다. 액체 조성물의 예는 근육내, 피하, 정맥내, 동맥내 주사에 적합한 제형 및 국소 및 안구내 투여용 제형을 포함한다. 에어로졸 제형의 예는 폐에 투여하기 위한 흡입제 제형을 포함한다.
특정 실시형태에서, 약학 조성물은 전신 투여된다. 약학적 조성물은 비경구적으로 또는 경구적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여의 경우, 약학적 조성물은 일반적으로 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함할 것이다. 일부 실시형태에서, 용액 또는 현탁액은, 예를 들어, 동결건조 형태로 제공되는 분말화 조성물을 적합한 수성 액체(예를 들어, 증류수) 또는 비수성 용매에 용해시킴으로써 사용 시에 제조될 수 있다. 비수성 용매는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 수성 용매는 물, 알코올/수용액, 에멀젼 또는 현탁액(식염수 및 완충 매질 포함)에서 선택될 수 있다. 비경구 비히클에는 소듐 클로라이드 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 젖산 링거 또는 고정유가 포함된다. 예를 들어 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 방부제도 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 약학 조성물은, 예를 들어, 신경계 질환의 치료에서 뇌 또는 중추 신경계에 투여된다. 특정 실시형태에서, 접합체(예를 들어, NLP-Fab 접합체, NLP-Fab 유사 분자 접합체, 펩티드-NLP-Fab 접합체 또는 펩티드-NLP-Fab 유사 분자 접합체)는 혈액-뇌 장벽을 이동하여 국소 또는 전신 투여 후 뇌(뇌 실질) 또는 중추 신경계로의 전달, 예를 들어, 표적화된 전달을 가능하게 할 수 있다. 뇌 또는 중추 신경계로의 전달에 사용하기 위한 특정 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 아포지단백, 예컨대, 아포지단백 E, 특히 apoE2 및/또는 apoE4이고, 접합체는 전신, 예를 들어, 정맥 주사 전달 후 뇌 실질에 대한 생체내 분포를 보여준다.
a. 피하 및 안구 제제
일부 실시형태에서, 본 발명은 하기에 더 상세히 기재된 바와 같이 고농축이지만 저점도 제형으로 본 발명의 접합체를 제공한다. 이러한 제형은, 예를 들어 피하 및 안구 투여 경로의 경우와 같이 투여 경로가 전달될 수 있는 제형의 부피를 제한하는 경우에 유리하다.
피하 전달을 위한 약학적 조성물은 일반적으로 사카라이드 안정화제(예를 들어 수크로스 또는 트레할로스) 및/또는 계면활성제(예를 들어 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80) 및/또는 아미노산(예를 들어 히스티딘, 아르기닌, 글리신 및/또는 알라닌)을 포함하는 부형제를 포함한다. 피하 전달의 경우, 제제는 주사기(예를 들어, 사전 충전형 주사기); 자동주사기; 주입 장치(예를 들어, INJECT-EASETM 및 GENJECT™장치); 인젝터 펜(예를 들어, GENPENTM); 무바늘 장치(예를 들어, MediJectorTM 및 BioJectorTM); 피하 패치 전달 시스템, 또는 용액 또는 현탁액 제제를 피하 투여하기에 적합한 기타 장치를 통해 전달될 수 있다.
안구 전달을 위해, 약학적 조성물은 완충제, 안정제, 방부제 및/또는 증량제를 함유하도록 제형화되어 조성물을 환자에 대한 안구 투여에 적합하도록 만들 수 있다. 안구 전달을 위한 약학 조성물은 일반적으로 완충액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤잘코니움 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부탈 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르치놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 그리고 m-크레졸); 낮은 분자량의 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로블린; 친수성 중합체 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 그리고 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트 물질 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제재의 적합한 예들에는 상기 접합체를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 지속 방출 매트릭스가 포함되며, 이러한 매트릭스는 성형된 제품 형태, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐 형태로 존재한다. 본원에서 사용되는 지속 방출 매트릭스는 재료, 일반적으로 효소 또는 산/염기 가수분해 또는 용해에 의해 분해될 수 있는 중합체로 만들어진 매트릭스이다. 체내에 삽입되면 매트릭스는 효소와 체액에 의해 작용한다. 지속 방출 매트릭스는 바람직하게는 생체적합성 재료, 예를 들어, 리포좀, 폴리락타이드(폴리락타이드 산), 폴리글리콜라이드(글리콜산 중합체), 폴리락타이드 코글리콜라이드(락트산과 글리콜산의 공중합체), 폴리무수물, 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 히알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 설페이트, 카복실산, 지방산, 인지질, 다당류, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산, 예를 들어, 페닐알라닌, 티로신, 이소류신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘에 의해 선택된다. 지속 방출 매트릭스의 비제한적 예는 폴리에스터, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드 (미국 특허 제 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 가령, LUPRON DEPOT™(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로구), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시 부티르산을 포함한다.
특정 실시형태에서, 약학 조성물은 본 발명의 접합체가 각막에 침투하도록 허용하는 하나 이상의 투과성 증강제를 포함한다. 이러한 투과성 증강제의 예는, 예를 들어, 계면활성제, 담즙산, 킬레이트제, 방부제, 사이클로덱스트린(즉, 친유성 약물과 복합체를 형성하는 친수성 외부 표면 및 친유성 내부 표면을 갖는 원통형 올리고뉴클레오티드) 등을 포함한다. 이러한 투과성 증강제는 화학적 안정성과 생체이용률을 증가시키고 국소 자극을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 약학 조성물은 다양한 안구 구획에서 본 발명의 접합체의 흡수 및 분포를 증가시키는 제제를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 약학 조성물은 인시튜 겔화 시스템, 예를 들어, 조성물이 눈물액과 접촉할 때 특정 물리화학적 매개변수(이온 강도, 온도, pH 또는 용매 교환)의 변화로 인해 안구 표면에서 졸-겔 상전이를 나타내는 점성 중합체 기반 액체로서 제형화된다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 약학 조성물은 눈 스프레이로 제형화된다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 약학 조성물은 마이크로에멀전으로 제형화된다. 다양한 안과용 약학 제형에 관한 추가 세부 사항은, 예를 들어, Gaikwad 외, (2013) Indo Amer J Pharm Res. 3, 3216-3232; Achouri 외, (2012) Drug Dev Indust Pharm. 39, 1599-1617; Lu (2010) Recent Pat Drug Deliv Formul. 4, 49-57; Baranowski 외, (2014) Sci World J. doi.org/10.1155/2014/861904; Lang (1995) Adv Drug Deliv Rev. 16, 39-43; Short (2008) Toxicologic Path. 36, 49-62; 등에 제공되어 있다.
안구 전달을 위해, 접합체는 주사, 예를 들어 결막하 주사, 각막내 주사 또는 유리체내 주사로 투여될 수 있으며; 또는 예를 들어 점안제의 형태로 국소적으로 투여되거나; 또는 접합체를 눈에 지속적으로 전달하는 유리체강내 장치에 의해 투여된다.
b. 투여량
일반적으로, 약학적 조성물은 본원에 기술된 NLP 접합체의 유효량을 포함할 것이다. 제제(예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드 또는 다른 약물)의 "유효량"은 제제가 투여되는 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 일으키고, 전형적으로 약학적 조성물을 투여받는 대상체에 대해 유익한 효과를 생성하는 데 필요한 양을 말한다.
약학적 조성물의 투여량은 다양한 인자들, 예를 들어 치료되는 병태, 병태의 중증도 및 과정, 접합체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 기타 임상 요인들, 예를 들어, 대상체의 체중, 크기, 성별 및 일반적인 건강 상태, 투여할 특정 NLP 접합체, 동시에 투여되는 다른 약물, 투여 경로, 이전 요법, 대상체의 임상 병력 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다.
일반적으로, 약학적 조성물의 정기적인 투여 요법은 1일당 1μg 내지 5g 단위의 범위여야 한다. 정기적인 평가를 통해 진행 상황을 모니터링할 수 있다. 접합체는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 적절하게 투여될 수 있으며, 진단 이후 언제든지 대상체에게 투여될 수 있다. 접합체는 유일한 치료법으로서 또는 다른 치료제 또는 문제의 병태를 치료하는데 유용한 치료법 접근법과 병용하여 투여될 수 있다.
c. 저점도 제형
본 발명의 또 다른 양상은 본원에 기재된 하나 이상의 접합체를 포함하는 저점도 액체 제형에 관한 것이다. "점도"는 전단 응력 또는 인장 응력에 의해 변형되는 유체의 저항 측정치를 의미하며; 점도계 또는 유량계를 사용하여 평가할 수 있다. 달리 표시되지 않는 한 점도 측정(센티푸아즈, cP)은 25oC에서 수행된다.
놀랍게도, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 접합체(예를 들어, NLP-폴리펩티드 접합체 및/또는 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체)는 비교적 낮은 점도를 유지하는 고농도 액체 제형으로 제공될 수 있다. 일반적으로 단백질 농도가 높으면 단백질-단백질 간 상호작용으로 인해 점도가 증가한다. 대조적으로, 본 발명의 NLP 접합체(예를 들어, NLP-폴리펩티드 접합체 및/또는 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체)는 점도의 실질적인 증가가 있기 전에 예기치 않게 높은 단백질 농도를 허용한다(예를 들어, 실시예 3, 도 4A 참조, 여기서 농도/점도 관계에 대한 Fab 부하의 영향이 평가되었다). 이러한 관계는 중요한 화학합성, 공장생산 및 품질관리(CMC) 고려 사항이며, 특정 실시형태에서 본 발명의 NLP 접합체는 저점도 액체 제형에서 예기치 않게 높은 농도로 제공될 수 있다. 실제로, 대안적인 다가 형식(Fab-PEG 접합체)에 비해 Fab-NLP 접합체를 사용하여 상당히 더 높은 Fab 농도가 달성되었다.
"저점도 제형"(또는 "저점도 액체 제형")은 전형적으로 50cP 미만, 예를 들어 40-50cP; 또는 40 cP 미만, 예를 들어 30-40 cP; 또는 30 cP 미만, 예를 들어 20-30 cP; 또는 20 cP 미만, 예를 들어 10-20 cP의 점도를 가진다. 일부 실시형태들에서, 점도는 10-50 cP, 15-45 cP, 20-40 cP, 25-35 cP, 또는 30 cP이다. 일부 실시형태에서, 저점도 제제는 50 mg 이상의 접합체/mL, 예를 들어 50-75 mg/mL; 75 mg 이상의 접합체/mL, 예를 들어 75-100 mg/mL; 100 mg 이상의 접합체/mL, 예를 들어 100-150 mg/mL; 150 mg 이상의 접합체/mL, 예를 들어 150-200 mg/mL; 200 mg 이상의 접합체/mL, 예를 들어 200-250 mg/mL; 250 mg 이상의 접합체/mL, 예를 들어 250-300 mg/mL; 300 mg 이상의 접합체/mL, 예를 들어 300-350 mg/mL; 350 mg 이상의 접합체/mL, 예를 들어 350-400 mg/mL; 또는 400 mg 이상의 접합체/mL, 예를 들어 400-450 mg/mL의 농도를 가진다. 일부 실시형태에서, 저점도 제제의 농도는 100-200, 200-300, 또는 100-300 mg의 접합체/mL이다. 일부 실시형태에서, 접합체는 NLP-폴리펩티드 접합체 또는 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체이다. 특정 실시형태에서, 저점도 제형의 항원-결합 폴리펩티드는 Fab 또는 Fab-유사 분자이다.
일부 실시형태에서, 저점도 제제는 접합체 당 20-40, 25-35, 20-30, 25-40, 25-30, 또는 30개의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 갖는 접합체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 Fab 또는 Fab-유사 분자이다. 특정 실시형태에서, 접합체는 접합체 당 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35개의 항원-결합 폴리펩티드 분자, 예를 들어 Fab 또는 Fab 유사 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 저점도 제형 중의 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 짧은 펩티드를 추가로 포함한다. 예시적인 짧은 펩티드는 본원의 다른 곳에서 더 상세히 논의된다.
당업자는 저점도 제형에 고농도의 항원-결합 폴리펩티드를 제공하는 것이, 투여될 수 있는 부피가 제한적인 경로를 통해 유효량의 항원-결합 폴리펩티드의 전달을 용이하게 한다는 것을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 안구 전달의 경우 주입량은 일반적으로 100μl로 제한되며(58); 피하 투여의 경우 주입량은 일반적으로 1-2ml로 제한된다(59, 60). 따라서, 본 발명의 접합체(예를 들어, NLP-폴리펩티드 접합체 및/또는 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체)는 예를 들어, 용적-제한적 경로, 예를 들어, 안구 전달 및 피하 투여를 통한 투여를 위한 고 농도, 저 점도 제형에서 사용된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 피하 및 안구 제형, 즉, 각각 피하 또는 안구 전달을 통해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 본 발명의 약학적 조성물을 제공한다. 피하 또는 안구 제형은 유리하게는 본원에 기재된 저점도 제형에 따라 저점도 액체에 고농도의 접합체(예를 들어, NLP-폴리펩티드 접합체 및/또는 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체)를 포함한다. 본 단락에 인용된 모든 참조문헌은 아래 실시예 5에서 찾을 수 있다.
d. 동결건조 제형
일부 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물, 제형, 및 접합체 중 어느 하나는 동결건조되고 재구성될 수 있다. "동결건조"는 부패하기 쉬운 물질을 보존하고/하거나 운반을 더 쉽게 만드는 동결 건조 공정을 의미한다. 동결 건조는 재료를 얼린 다음 주변 압력을 낮추는 동시에 재료 내부의 얼어붙은 물이 기체 상태로 곧바로 승화되도록 온도를 높이는 것을 포함한다. 일반적으로 동결건조는 수분 함량이 5% 미만, 예를 들어 3-5% 또는 3% 미만, 예를 들어 2-3% 또는 2% 미만, 예를 들어 1-2 %이다. 동결건조된 제품은 종종 동결건조되어 보관되었던 동일한 용기 또는 바이알에서 사용 전에 재구성될 수 있다. 전형적으로, 생성물은 수성 액체, 예를 들어, 증류수 또는 수성 완충액을 첨가함으로써 재구성(재수화)된다. 또한, 동결건조 동안 치료제의 안정성 및 재구성 후 활성을 유지하는 능력은 화학합성, 공장생산 및 품질관리(CMC)에서 중요한 고려 사항이다. 예를 들어, Bjelosevic 외, "Excipients in Freeze-Dried Biopharmaceuticals: Contributions Toward Formulation Stability and Lyophilisation Cycle Optimisation" Int J Pharm 2020 Feb 25;576을 참고하라.
놀랍게도, 일부 실시형태에서, NLP 접합체(예를 들어, NLP-항원-결합 폴리펩티드 접합체 및/또는 펩티드-NLP-항원-결합 폴리펩티드 접합체)는 항원-결합 활성의 손실 없이 동결건조되고 재구성될 수 있다(예를 들어, 실시예 4, 도 4B 및 도 5A-5D 참조, 여기서 동결건조시 Fab-NLP 안정성은 Fab-NLP의 제조가능성의 평가로서 평가됨). 일부 실시형태에서, 항원-결합 활성의 적어도 80%, 예를 들어, 80-90%, 적어도 90%, 예를 들어, 90-95%, 또는 적어도 95%, 예를 들어, 95-99%가 동결건조 및 재구성 후에 유지된다. 일부 실시형태들에서, 항원-결합 활성의 98%, 99%, 또는 100%가 유지된다.
동결건조를 위해, 접합체(예를 들어, NLP-항원-결합 폴리펩티드 접합체 및/또는 펩티드-NLP-항원-결합 폴리펩티드 접합체)는 전형적으로 접합체를 포함하는 pH-완충 용액인 사전 동결건조된 제형으로 제공된다. pH는 4-8 또는 5-7일 수 있다. 예시적인 완충액은 히스티딘, 포스페이트, Tris, 시트레이트, 석시네이트 및 기타 유기산을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 동결보호제가 사전 동결건조된 제형에 첨가된다. 동결보호제의 비제한적 예는 수크로스 또는 트레할로스와 같은 비환원당을 포함한다. 특정 실시형태에서, 트레할로오스는 동결건조될 본 발명의 접합체를 함유하는 용액에 첨가된다. 사전 동결건조된 제형에서 동결보호제의 양은 일반적으로 재구성시 생성된 제제가 등장성이 되도록 하는 양이다. 그러나 고장성(hypertonic) 재구성 제형도 적합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 동결건조는 트레할로스의 존재 하에 발생하며, 예를 들어, 접합체는 40-200 mM 트레할로스의 존재 하에 존재한다. 특정 실시형태에서, 트레할로오스는 본 발명의 접합체, 예를 들어 항원-결합 폴리펩티드로서 Fab를 포함하는 접합체의 동결건조 동안 50-150mM, 60-100mM, 또는 70-90mM의 농도로 사용된다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 접합체가 Fab를 항원-결합 폴리펩티드로 포함하는 경우 동결건조는 60mM, 65mM, 70mM, 75mM, 80mM, 85mM, 90mM, 95mM 또는 100mM 트레할로스의 존재 하에 발생한다. 일부 실시형태들에서, 동결건조는 80mM 트레할로스의 존재하에 발생한다.
일부 실시형태에서, 동결건조는 접합체 1-10 mg/mL의 농도에서 발생한다. 특정 실시형태에서, 접합체는 항원 결합으로서 Fab를 포함하고, 접합체는 2-8 mg 접합체/mL, 3-6 mg 접합체/mL, 또는 5 mg 접합체/mL로 동결건조된다. 일부 실시형태에서, 접합체는 Fab를 포함하고, 동결건조는 70mM, 75mM, 80mM, 85mM, 또는 90mM 트레할로스의 존재 하에; 그리고 2-8 mg 접합체/mL, 3-6 mg 접합체/mL 또는 5 mg 접합체/mL에서 발생한다. 특정 실시형태에서, 접합체는 Fab를 포함하고, 동결건조는 80 mM 트레할로스의 존재 하에 5 mg 접합체/mL에서 발생한다.
일부 실시형태에서, 사전 동결건조된 제형에 계면활성제를 첨가하는 것이 바람직한 것으로 밝혀졌다. 대안적으로 또는 추가적으로, 계면활성제는 동결건조된 제형 및/또는 재구성된 제형에 첨가될 수 있다. 예시적인 계면활성제는, 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188); 트리톤; 소듐 도데실 설페이트(SDS); 소듐 라우렐 설페이트; 소듐 옥틸 글리코사이드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인(예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일- 또는 디소듐 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUAT™시리즈(Mona Industries, Inc., Paterson, NJ), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체(예를 들어, Pluronics, PF68 등)가 포함된다. 첨가되는 계면활성제의 양은 재구성된 접합체의 응집을 감소시키고 재구성 후 미립자의 형성을 최소화하는 양이다. 예를 들어, 계면활성제는 사전 동결건조 제형에 0.001-0.5%, 바람직하게는 0.005-0.05%의 양으로 존재할 수 있다.
특정 실시형태에서, 동결건조 보호제(예를 들어, 트레할로스)와 증량제(예를 들어, 만니톨 또는 글리신)의 혼합물이 사전 동결건조 제형의 제조에 사용된다. 증량제는 내부에 과도한 포켓 등이 없는 균질 동결건조 케이크의 생산을 가능하게 할 수 있다.
접합체, 완충제, 동결보호제 및 기타 선택적 성분을 함께 혼합한 후 제형을 동결건조시킨다. 이러한 목적을 위해 Hull50TM(Hull, USA) 또는 GT20TM(Leybold-Heraeus, 독일) 동결 건조장치와 같은 다양한 동결 건조장치를 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이동 단계를 없애기 위해 접합체의 재구성이 수행될 용기에서 접합체 제형을 동결건조하는 것이 바람직할 수 있다. 용기는 예를 들어 3, 5, 10, 20, 50 또는 100cc 바이알일 수 있다.
이후 원하는 시간에, 전형적으로 접합체를 환자에게 투여할 때, 동결건조된 제형은 재구성된 제형에서 원하는 접합체 농도, 예를 들어 본원에 제공된 임의의 접합체 농도를 제공하기 위해 희석제를 사용하여 재구성될 수 있다. 예를 들어, 원하는 농도는 50-75 mg/mL, 75-100 mg/mL, 100-150 mg/mL, 1500-200 mg/mL, 200-250 mg/mL; 250-300 mg/mL; 300-350 mg/mL; 350-400mg/mL; 또는 400-450 mg/mL일 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 재구성된 제형 내 이러한 높은 접합체 농도는 재구성된 제형을 피하 또는 안구 전달을 하고자 하는 경우에 특히 유용하다. 그러나, 정맥내 투여와 같은 다른 투여 경로의 경우, 재구성된 제형에서 보다 낮은 접합체 농도가 바람직할 수 있다(예를 들어, 5-50 mg/mL, 10-40 mg/mL).
재구성은 일반적으로 25oC의 온도에서 발생하여 수화를 촉진하지만 원하는 경우 다른 온도를 사용할 수 있다. 재구성에 필요한 시간은 예를 들어 희석제의 유형, 부형제(들) 및 접합체 성분의 양에 따라 달라진다. 예시적인 희석제는 멸균수, 주사용 정균수(BWFI), pH 완충 용액(예를 들어, 인산염 완충 식염수), 멸균 식염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 희석제는 선택적으로 방부제를 포함한다. 예시적인 방부제는 방향족 알코올(예를 들어, 벤질 또는 페놀 알코올)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 사용되는 방부제의 양은 접합체와의 상용성을 위해 상이한 방부제 농도들을 평가함으로써 결정될 수 있다.
V. 제조 방법
a. 항원-결합 폴리펩티드를 포함하는 나노지단백질 접합체의 제조 방법
본 발명의 또 다른 양상은 폴리펩티드(예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드)를 포함하는 접합체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 일반적으로 a) 스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 막-형성 지질의 지질 이중층을 포함하는 나노지단백질 입자의 조립(예를 들어, 자기조립)을 허용하는 조건 하에서 상기 스캐폴드 단백질 및 하나 이상의 상기 막-형성 지질을 제공하는 단계(여기서 하나 이상의 막-형성 지질은 입자의 한쪽 또는 양쪽 표면에 작용기화 기를 제공함); b) 낮은 pH에서 상기 작용기화 기에 접합하는 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 갖는 항원-결합 폴리펩티드와 입자를 접촉하게 하는 단계; 및 c) 선택적으로 상기 입자와 상기 항원-결합 폴리펩티드의 접합체를 정제하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실 (예를 들어, C16 지방-아실)을 포함한다. 일부 실시형태들에서, C4-28 지방-아실은 짧은 펩티드 (예를 들어, 본원에 기재된 짧은 펩티드)에 공유 부착된다. 이러한 펩티드-접합된 C4-28 지방-아실은 실시예 7에 기술된 바와 같이 생성될 수 있다. 펩티드-접합된 C4-28 지방-아실을 생산하는 다른 방법은 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시형태들에서, NLP(펩티드-NLP 포함)는 스캐폴드 단백질이 mRNA로부터 번역되는 동안 NLP의 자기조립이 달성되는 시험관내 번역 방법에 의해 조립된다. 이 과정에서, 발현 시스템 용해물은 막-형성 지질 및 스캐폴드 단백질을 인코딩하는 플라스미드 DNA와 혼합된다. 스캐폴드 단백질이 발현하는 동안 조립이 일어날 때까지(예를 들어, 대략 4-24시간 동안) 반응을 진행시킨다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 생성된 NLP(또는 펩티드-NLP)의 수율을 증가시키거나 크기 및 조성을 제어하기 위한 예정된 스캐폴드 단백질:지질 비율 및/또는 조건에서 수행된다. 예를 들어, 스캐폴드 단백질:지질 비율은 상기 기술된 비율을 갖는 NLP(또는 펩티드-NLP)를 제공하도록 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 펩티드 접합된 C4-28 지방-아실:다른 막-형성 지질의 예정된 몰비, 예를 들어 10%의 몰비(즉, 10% 펩티드 접합된 C4-28 지방-아실 및 90% 기타 막-형성 지질)로 수행된다.
본 발명의 접합체를 형성하기 위해, NLP(예를 들어, 짧은 펩티드에 접합된 NLP 또는 짧은 펩티드에 접합되지 않은 NLP) 및 항원-결합 폴리펩티드는 작용기화 지질과 항원-결합 폴리펩티드 작용기들 사이에 접합을 허용하는 시간 및 조건 하에서 접촉된다. 특정 실시형태에서, NLP는 말레이미드 작용기화 지질(1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-에탄올아민-N-[4-(p-말레이미도메틸)사이클로헥산-카복스아미드](소듐 염))(DOPE -MCC)을 C-말단 시스테인을 함유하는 Fab에 접합시켰다(예를 들어, 실시예 1-2, 도 2A-2C 및 도 8A-8B 참조). 또 다른 실시예에서, 펩티드-접합된 C4-28 지방-아실(예를 들어, 펩티드 접합된 C16 지방-아실)을 포함하는 NLP는 말레이미드 작용기화 지질(1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-에탄올아민- N-[4-(p-말레이미도메틸)사이클로헥산-카복스아미드](소듐 염))(DOPE-MCC)을 C-말단 시스테인을 함유하는 Fab에 접합시켰다. 실시예 10 및 도 13A를 참고하라.
전형적으로, 말레이미드(또는 말레이미드 유도체)는 예를 들어 pH 6.5 내지 0.5에서 1 내지 24시간 동안 티올이 없는 완충 수용액에서 설프히드릴과 반응하여 공유 티오에테르 결합을 형성한다. 그런 다음 말레이미드는 예를 들어 유리 티올의 첨가에 의해 반응이 완료될 때 퀀칭된다. 놀랍게도, 일부 실시형태에서, 본 방법은 유리 티올을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드를 말레이미드 작용기화 지질에 접합시키기 위해 낮은 pH를 이용한다. 낮은 pH는 4.5-6.5, 5.5-6.5, 5-6 또는 6일 수 있다. 낮은 pH는 NLP의 스캐폴드 단백질보다는 항원-결합 폴리펩티드에 대한 작용기화 지질의 접합을 촉진한다(예를 들어, 실시예 2, 도 1C-1D, 삼각형 참조). 실제로, 놀랍게도 말레이미드 반응성 지질은 NLP가 pH 7.4에서 조립될 때 아포지단백질에 접합된다(예를 들어, 실시예 2, 도 1B, 도 1C-1D(원) 및 도 8A 참조). 그러나 이러한 바람직하지 않은 반응은 pH 6에서 조립되었을 때 관찰되지 않았다. 이러한 조립 조건은 스캐폴드 단백질(예를 들어, apoE422k 단백질) 및 말레이미드 작용기화 지질(예를 들어, DOPE-MCC) 상의 유리 리신들 사이의 가교결합을 제한한다.
따라서, 상기 언급한 일부 실시형태에서, 작용기화 기는 폴리펩티드(예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드) 상의 상보적 작용기와 반응하고 NLP의 다른 성분에 접합하지 않는다, 예를 들어, 스캐폴드 단백질(들)에 접합하지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 기재된 바와 같은 낮은 pH(예를 들어, pH 4.5-6.5, 5.5-6.5, 5-6, 또는 6)를 사용하여, 25% 미만 또는 20-25%, 20% 미만 또는 10-20 %, 15% 미만 또는 10-15%, 10% 미만 또는 5-10%, 5% 미만 또는 3-5% 또는 0%의 작용기화 기들이 본 발명의 접합체를 형성할 때 스캐폴드 단백질에 접합됩니다. 일부 실시형태에서, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0%의 작용기된 기가 본 발명의 접합체를 형성함에 있어서 스캐폴드 단백질에 접합된다. 특정 실시예에서, 작용기화 기는 말레이미드 또는 말레이미드 유도체이고 작용기는 유리 티올기이다.
따라서, 일부 양상들에서, 본 발명은 나노지단백질 입자와 항원-결합 폴리펩티드의 접합체를 제조시 지질-스캐폴드 단백질 접합을 감소시키는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 항원-결합 폴리펩티드에 접합시키기 전에 미반응 구성성분들로부터 NLP를 분리할 필요가 없다. 즉, 단계 b) (낮은 pH에서 상기 작용기화 기에 접합하는 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 가지는 항원-결합 폴리펩티드에 상기 입자를 접촉시키는 단계)는 조립되지 않은 막-형성 지질의 일부 또는 전부 또는 조립되지 않은 스캐폴드 단백질의 일부 또는 전부를 제거하는 중간 단계 없이 단계 a)(스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 막-형성 지질의 지질 이중층을 포함하는 나노지단백질 입자의 조립을 허용하는 조건하에서 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질을 제공하는 단계, 여기서 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 상기 입자의 한쪽 또는 양쪽 표면 상에 작용기화 기를 제시함)에 후속될 수 있다. 놀랍게도 본원에 기재된, 특정 비율의 스캐폴드 단백질에 대한 작용기화된 막-형성 지질이 사용되는 경우, 작용기화된 막-형성 지질은 NLP로 조립되지 않은 상태로 거의 남지 않으며, 조립되지 않은 상태로 남아 있는 소수는 반응 용기 벽에 달라붙어, 항원-결합 폴리펩티드의 작용기와 반응할 수 있는 것이 전혀, 거의 또는 거의 매우 남지 않는다. 따라서, 상기 언급된 바와 같은 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질은 1:50 내지 1:100; 1:60 내지 1:90; 또는 1:70 내지 1:80의 몰비로 조합되고, 조립되지 않은 지질을 제거하는 단계는 필요없거나 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)에 접합하기 전에 수행된다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질은 1:60, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 또는 1:100의 몰비로 존재하고, 조립되지 않은 지질을 제거하는 단계는 필요 없거나 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)에 접합하기 전에 수행된다. 특정 실시형태에서, 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질은1:80의 몰비로 존재하고, 조립되지 않은 지질을 제거하는 단계는 필요없거나 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)에 접합하기 전에 수행된다.
NLP가 펩티드-접합된 C4-28 지방-아실을 포함하는 일부 실시형태에서, NLP-펩티드 접합체는 전술한 바와 같이 자가-조립 후 및 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)에 접합되기 전에, 예를 들어 크기-배제 크로마토그래피를 통해 정제된다.
b. 짧은 펩티드를 포함하는 나노지단백질 접합체의 제조 방법
관련 양상에서, 짧은 펩티드를 포함하는 접합체(즉, 펩티드-NLP 접합체)를 제조하는 방법이 제공된다. 또한 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드의 결합력, 활성 및/또는 효능을 증가시키는 방법이 제공된다. 일부 실시형태들에서, 상기 방법은 스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 막-형성 지질의 지질 이중층을 포함하는 나노지단백질 입자의 조립을 허용하는 조건하에서 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질을 제공하는 단계를 포함하고; 여기서 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 상기 짧은 펩티드(예를 들어, 20 내지 60개 아미노산 길이의 펩티드)에 접합된 C4-28 지방-아실 (예를 들어, C16 지방-아실)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 (예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피를 통해) 펩티드-NLP 접합체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드는 시스틴 매듭 펩티드(CKP), 예를 들어, 본원의 다른 부분에 기재된 CKP이다. 일부 실시형태들에서, 짧은 펩티드는 CKP 변이체이다. 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열들에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 C 말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 화학적 변형을 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시형태들에서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 막-형성 지질은 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체 및 DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC 중 적어도 하나 이상(예를 들어, 펩티드-C16 지방-아실 접합체 및 DOPC)을 1:3 내지 1:15, 또는 1:6 내지 1:12, 또는 1:9의 몰비로 포함한다. 일부 실시형태들에서, 상기 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 상기 짧은 펩티드 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접합체는 적어도 2개의 상이한 펩티드를 포함한다(예를 들어, 본원의 다른 부분에서 더 상세히 기재). 도 10A는 짧은 펩티드를 포함하는 예시적인 NLP의 어셈블리의 개략도를 도시한다.
일부 실시형태들에서, 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 상기 펩티드 접합체의 한쪽 또는 양쪽 표면 상에 직용기화 기를 제시하고, 그리고 상기 방법은 4.5 내지 6.5 pH 범위의 낮은 pH에서 상기 작용기화 기에 접합하는 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 가지는 펩티드 (예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드, 예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자)와 상기 펩티드-NLP 접합체를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩티드-NLP 접합체에 대한 폴리펩티드(예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드)의 접합은 조립되지 않은 막-형성 지질의 일부 또는 전부를 제거하는 중간 단계 없이 펩티드-NLP 접합체의 조립(예를 들어, 자기조립)이 후속된다. 일부 실시형태에서, 펩티드 접합체에 대한 항원-결합 폴리펩티드의 접합은 펩티드 접합체를 풍부하게 하는 중간 단계 없이 펩티드 접합체의 조립(예를 들어, 자기조립)이 후속된다. 일부 실시형태들에서, 작용기화 기는 말레이미드 유도체이고 상기 작용기는 시스테인 티올기이고, 선택적으로 상기 시스테인 아미노산 잔기는 항원-결합 폴리펩티드가 유래되는 항체에서 힌지 이황화 결합을 형성한다(예를 들어, Cys-226 또는 Cys-227). 일부 실시형태들에서, 상기 작용기화 기는 상기 낮은 pH에서 상기 스캐폴드 단백질에 접합되지 않는다. 일부 실시형태들에서, 상기 낮은 pH는 pH 5.5 내지 6.5, pH 5 내지 6, 또는 pH 6이다. 일부 실시형태들에서, 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서는 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결한다. 일부 실시형태들에서, 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하는 PEG 스페이서이다. 일부 실시형태들에서, PEG 스페이서는 1000-3000, 1500-2500, 1900-2200, 또는 2000의 MW를 갖는다.
본원의 본 발명의 방법은 본원에 기재된 바와 같은 접합체(예를 들어, 펩티드-NLP 접합체, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체 및 NLP-폴리펩티드 접합체)의 생산에서 산업상 이용가능성이 있다. 이러한 접합체는 예를 들어 시험관내, 생체외 및 생체내 치료 방법에서 사용된다. 본 발명의 접합체 중 하나 이상을 사용하는 것에 기초한 다양한 방법이 본원에서 제공된다.
VI. 치료 방법 및 용도
본 발명의 또 다른 양상은 치료를 위한 본원에 기재된 접합체(예를 들어, 펩티드-NLP 접합체, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체 및 NLP-폴리펩티드 접합체)의 용도에 관한 것이다. 치료될 질환, 장애, 병리학적 상태는 접합체에 사용하기 위한 항원-결합 폴리펩티드(들) 및/또는 짧은 펩티드의 선택을 알려줄 것이다. 보다 구체적으로, 특정 질환, 장애 또는 병태에서 다가 및/또는 다중 특이적 항원 결합 구조체 접합체(예를 들어, NLP-Fab 접합체, NLP-Fab 유사 분자 접합체, 펩티드-NLP-Fab 접합체, 또는 펩티드-NLP-Fab-유사 분자 접합체)를 사용하는 것이 필요하거나 바람직하다. 본 발명의 접합체(예를 들어, 펩티드-NLP 접합체, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체 및 NLP-폴리펩티드 접합체)는 상기 설명한 바와 같은 다가 및/또는 다중특이성 항원-결합 폴리펩티드 및/또는 짧은 펩티드에 대한 다목적 플랫폼을 제공하며, 이는 다양한 목적, 예를 들어, 치료, 예방, 전달 및 진단을 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 "치료"(및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)는 유익한 효과를 가져오기 위해 치료받는 대상체에서 질환의 자연 경과를 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 지칭하고, 예방적으로 또는 질환이 진행되는 동안 수행할 수 있다. 치료의 유익한 효과에는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상 완화, 질환의 직간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질환 진행률 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 퇴행, 예후 개선 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자 포함) 및/또는 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)를 포함하는 NLP 접합체가 질환의 발달을 지연시키기 위해 또는 질환의 진행을 늦추거나 질환의 재발 가능성, 빈도 및/또는 중증도를 줄이기 위해 사용된다.
일반적으로 접합체(예를 들어, 펩티드-NLP 접합체, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체 및/또는 NLP-폴리펩티드 접합체)는 이로부터 이익을 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량으로 제공된다. 예를 들어, 약학 조성물에서 제제의 "치료적 유효량"은 대상체에게 투여시 유효량의 제제(예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자), 및/또는 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체) 및/또는 다른 치료제 또는 진단제)를 표적 세포 또는 조직에 제공하여 세포 또는 조직에 생리학적 변화를 일으키고, 이로써 약학 조성물을 수용하는 대상체에게 유익한 효과를 생성하는 양을 말한다. 약학 조성물은 일반적으로 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위한 투여량으로 그리고 이를 위한 기간 동안 투여될 것이다.
a. 악성 질환의 치료
일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자)는 혈관신생 및/또는 종양 성장에 소정의 역할을 하는 표적에 결합하고; 접합체(예를 들어, NLP-폴리펩티드 접합체)는 악성 질환을 치료하기 위해 혈관형성 및/또는 종양 성장을 억제하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 및/또는 종양 성장을 억제하는데 사용되는 접합체는 혈관형성 및/또는 종양 성장에서 소정의 역할을 하는 표적에 결합하는 짧은 펩티드를 추가로 포함한다(즉, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체). 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드는 항원-결합 폴리펩티드와 동일한 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드는 항원-결합 폴리펩티드와 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, 짧은 펩티드는 항원-결합 폴리펩티드의 활성(예를 들어, 치료 활성)에 상보적이거나 상승작용하는 활성(예를 들어, 치료 활성)을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 악성 질환은 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액의 암으로부터 선택된다. 본 발명의 접합체는 전암성, 비전이성, 전이성 및 암성 종양(예를 들어, 초기 암)을 포함하는 종양의 치료 또는 암 발병 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있다. 추가 양상에서, 접합체의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)는 아래에서 자세히 논의되는, 표적화 또는 안정화 역할, 예를 들어, 안정화된 NLP-Fab 접합체 또는 안정화된 펩티드-NLP-Fab 접합체를 질환과 관련된 항원에 표적화하는 역할을 한다.
특정 실시형태에서, 암 또는 암종은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 구강암, 위암, 자궁경부암, B 및 T 세포 림프종, 골수성 백혈병, 난소암, 백혈병, 림프성 백혈병, 비인두 암종, 결장암, 전립선암, 신세포암, 두경부암, 피부암(흑색종), 비뇨생식기암, 예를 들어 고환암, 난소암, 내피암, 자궁경부암 및 신장암, 담관암, 식도암, 침샘암 및 갑상선암 또는 혈액학적 종양, 신경아교종, 육종 또는 골육종과 같은 기타 종양성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
종양(예를 들어, 암성 종양)의 경우, 제제의 치료적 유효량은 암 세포의 수를 감소시킬 수 있고; 원발성 종양 크기를 줄이고; 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 억제(즉, 어느 정도 늦추거나 중단)하고; 종양 전이를 억제(즉, 어느 정도 늦추거나 중단)하고; 종양 성장을 어느 정도 억제하고/하거나 장애와 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화한다. 암 요법의 경우, 생체내 효능은, 예를 들어, 생존 기간, 질환 진행까지의 시간(TTP), 반응률(RR), 반응 기간 및/또는 삶의 질을 평가하여 측정할 수 있다.
"감소시키거나 억제한다"는 예를 들어, 20%, 50%, 75%, 85%, 90%, 또는 95%의 전반적인 감소를 유발하는 능력을 의미한다. 감소시키거나 억제한다는 치료되는 장애의 하나 이상의 증상, 전이의 존재 또는 크기, 원발성 종양의 크기 또는 혈관신생 장애에서 혈관의 크기 또는 수에 대한 효과를 나타낼 수 있다.
종양은 고형 종양이거나 비고형 또는 연조직 종양일 수 있다. 연조직 종양의 예는 백혈병(예를 들어, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 성인 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 성숙 B 세포 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 전림프구성 백혈병, 또는 털상 세포 백혈병), 또는 림프종(예를 들어, 비호지킨 림프종, 피부 T 세포 림프종 또는 호지킨병)을 포함한다. 고형 종양에는 혈액, 골수 또는 림프계 이외의 신체 조직의 임의의 암이 포함된다. 고형 종양은 상피 세포 유래 종양과 비상피 세포 유래 종양으로 추가로 구분할 수 있다. 상피 세포 고형 종양의 예에는 위장관, 결장, 유방, 전립선, 폐, 신장, 간, 췌장, 난소, 두경부, 구강, 위, 십이지장, 소장, 대장, 항문, 담낭, 음순, 비인두, 피부, 자궁, 남성 생식기, 비뇨기, 방광 및 피부의 종양이 포함된다. 비상피 유래 고형 종양에는 육종, 뇌종양 및 골종양이 포함된다.
일부 실시형태에서, NLP 접합체는 상기 기재된 바와 같이 한 쌍의 임상적으로 관련된 표적에 결합하는 적어도 2개의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 하나 이상의 Fab 또는 Fab-유사 분자 포함)의 적어도 하나의 분자를 포함한다. 예를 들어, 임상적으로 관련된 쌍은 T 세포 마커, 공동 자극 수용체 또는 NK 세포 마커 중 적어도 하나; 및 종양 항원, 예를 들어, 본원에 개시되고/되거나 당업계에 공지된 임의의 하나 이상의 종양 항원을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, NLP 접합체는 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)를 포함한다(예를 들어 추가로 포함한다). 일부 실시형태에서 짧은 펩티드는 접합체 내의 항원-결합 폴리펩티드와 동일한 활성(예를 들어, 결합 활성 및/또는 치료 활성)을 나타낸다. 일부 실시형태에서 짧은 펩티드는 접합체 내의 항원-결합 폴리펩티드와 상이한(예를 들어, 상보적이거나 또는 상승작용하는) 활성(예를 들어, 결합 활성 및/또는 치료 활성)을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 접합체는 적어도 2개의 상이한 짧은 펩티드 각각의 적어도 하나의 분자를 포함한다.
구체적인 예에서, NLP 접합체는 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제1 Fab)를 포함하고; 및 급성 림프구성 백혈병의 치료에 사용하기 위한 표적화 CD19(종양 항원)에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함한다. 또 다른 구체적인 예에서, NLP 접합체는 결장, 직장, 난소, 위, 식도, 폐, 췌장, 유방, 두경부를 비롯한 다양한 유래 암종의 치료에 사용하기 위하여, CD3에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제1 Fab); 및 EpCAM(종양 항원)에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함한다.
특정 실시형태는, 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 구강암의 치료에 사용하기 위한, HER1, 바람직하게는 인간 HER1에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 위장암, 유방암, 및/또는 자궁경부암의 치료에 사용하기 위한, HER2, 바람직하게는 인간 HER2에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 위장암 및/또는 폐암의 치료에 사용하기 위한, HER3, 바람직하게는 인간 HER3에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액암의 치료에 사용하기 위한, CEA, 바람직하게는 인간 CEA에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액암의 치료에 사용하기 위한, p95, 바람직하게는 인간 p95에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액암의 치료에 사용하기 위한, BCMA, 바람직하게는 인간 BCMA에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액암의 치료에 사용하기 위한, MSLN, 바람직하게는 인간 MSLN에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액암의 치료에 사용하기 위한, MCSP, 바람직하게는 인간 MCSP에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액암의 치료에 사용하기 위한, CD19, 바람직하게는 인간 CD19에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, B-세포 림프종 및/또는 T 세포 림프종의 치료에 사용하기 위한, CD20, 바람직하게는 인간 CD20에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, B-세포 림프종 및/또는 T 세포 림프종의 치료에 사용하기 위한, CD22, 바람직하게는 인간 CD22에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액암의 치료에 사용하기 위한, CD38, 바람직하게는 인간 CD38에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액암의 치료에 사용하기 위한, CD52Flt3, 바람직하게는 인간 CD52Flt3에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액암의 치료에 사용하기 위한, FolR1, 바람직하게는 인간 FolR1에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 구강암의 치료에 사용하기 위한, Trop-2, 바람직하게는 인간 Trop-2에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 난소암, 폐암, 유방암 및/또는 위장관암의 치료에 사용하기 위한, CA-12-5, 바람직하게는 인간 CA-12-5에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 위장관암, 백혈병 및/또는 비인두 암종의 치료에 사용하기 위한, HLA-DR, 바람직하게는 인간 HLA-DR에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 결장암, 유방암, 난소암, 폐암 및/또는 췌장암의 암 치료에 사용하기 위한, MUC-1, 바람직하게는 인간 MUC-1에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 결장암의 치료에 사용하기 위한, A33, 바람직하게는 인간 A33에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 전립선암의 치료에 사용하기 위한, PSMA, 바람직하게는 인간 PSMA에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액암의 치료에 사용하기 위한, PSCA, 바람직하게는 인간 PSCA에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액암의 치료에 사용하기 위한, 전달 수용체(transferring-receptor), 바람직하게는 인간 전달 수용체에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 상피, 내피 또는 중피 기원의 암 및 혈액암의 치료에 사용하기 위한, 테나신, 바람직하게는 인간 테나신에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
특정 실시형태는, 신장암의 치료에 사용하기 위한, CA-IX, 바람직하게는 인간 CA-IX에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 선택적으로 NK 세포 마커, T-세포 마커 또는 공동 자극 수용체 중 적어도 하나에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 NLP 접합체를 제공한다.
본 발명의 접합체 (예를 들어, 펩티드-NLP 접합체, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체, 및/또는 NLP-폴리펩티드 접합체), 약학 조성물, 또는 제형은 단독으로 또는 다른 치료제 또는 검출가능한 작용제/표지와 함께 투여될 수 있다. "병용"이라는 용어는 치료 요법의 성분이 대상체에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 예를 들어, 약학 조성물 또는 약제는 다른 요법의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. "병용"은 또한 투여 사이의 시기를 제한하지 않는다. 따라서, 두 성분을 일시에 또는 동시에 투여하지 않는 경우, 투여는 1분, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간 또는 72시간 또는 당업자에 의해 쉽게 결정되고/되거나 본원에 기술된 임의의 적절한 시차로 분리될 수 있다.
추가적인 요법은 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 바와 같은 질환 또는 이의 증상의 치료 또는 예방에 적합한 하나 이상의 치료 프로토콜을 포함할 수 있다. 이러한 치료 프로토콜의 예는 진통제의 투여, 화학요법제의 투여, 질환 또는 이의 증상의 외과적 취급을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어 악성 질환을 치료하는 내용에서 본 발명의 접합체와 병용 투여하기 위한 추가 치료제의 예는 위장관계에 작용하는 약물, 세포증식억제제로 작용하는 약물, 고 요산혈증을 예방하는 약물, 면역 반응을 억제하는 약물(예를 들어, 코르티코스테로이드), 순환계에 작용하는 약물 및/또는 당업계에 공지된 T 세포 공동 자극 분자 또는 사이토카인과 같은 작용제를 포함한다.
본 발명은 또한 면역 이펙터 세포, 세포 증식 또는 세포 자극을 위한 활성화 신호를 제공할 수 있는 분자와의 공동-투여 프로토콜을 구성한다. 상기 분자는, 예를 들어, T 세포에 대한 1차 활성화 신호(예를 들어 공동자극 분자: B7 계열의 분자, Ox40L, 4.1 BBL, CD40L, 항-CTLA-4, 항-PD-1), 또는 사이토카인 인터류킨(예를 들어, IL-2) 일 수 있다.
b. 안구 질환의 치료
특정 실시형태에서, 본 발명의 접합체(예를 들어, 펩티드-NLP 접합체, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체 및/또는 NLP-폴리펩티드 접합체)는 대상체에서 안구 질환 또는 장애를 치료하는데 사용된다. 특정 실시형태에서, 대상체는 비정상적인 혈관신생 및/또는 비정상적인 혈관 투과성을 특징으로 하는 안구 질환 또는 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 것으로 의심된다. 특정 실시형태에서, 대상체는 비정상적인 혈관신생 및/또는 비정상적인 혈관 투과성을 특징으로 하는 안구 질환 또는 장애로 진단받았다.
일부 실시형태에서, 안구 질환 또는 장애는 안구 혈관 증식성 장애, 예를 들어, 당뇨병성 실명, 망막병증, 주로 당뇨병성 망막병증, 연령-관련 황반 변성(AMD), 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR), 미숙아 망막병증(ROP), 맥락막 혈관신생(CNV), 당뇨병성 황반 부종, 병적 근시, 폰 리펠-린다우병, 눈의 히스토플라스마증, 망막 정맥 폐색(분지형 망막 정맥 폐색(BRVO) 및 중앙 망막 정맥 폐색(CRVO) 모두), 각막 혈관신생, 망막 혈관신생, 및 루베오시스로 이루어진 군으로부터 선택되는 안구 혈관 증식성 질환이다. 특정 실시형태에서, 각막 혈관신생은 눈의 감염, 눈의 염증, 눈의 외상(화학적 화상 포함) 또는 윤부 선미 세포 장벽(limbal stern cell barrier)의 손실을 초래한다. 특정 실시형태에서, 각막 혈관신생은 헤르페스성 각막염, 트라코마 또는 사상충증(onchocerciasis)으로부터 발생한다.
특정 실시형태에서, 안구 질환 치료를 위한 접합체는 VEGF(바람직하게는 인간 VEGF), 인자 D(바람직하게는 인간 인자 D), Tie2(바람직하게는 인간 Tie2) 및 DR4(가급적 인간 DR4) 중 적어도 하나에 결합하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 포함한다. 보다 특정한 실시형태에서, 안구 질환 치료를 위한 접합체는 VEGF, 예를 들어 VEGF-A, 바람직하게는 인간 VEGF-A에 결합하는 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 포함한다. 훨씬 더 특정한 실시형태에서, 안구 질환 치료를 위한 접합체는 VEGF(예를 들어, VEGF-A, 바람직하게는 인간 VEGF-A)에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제1 Fab); 및 인자 D(바람직하게는 인간 인자 D), Tie2(바람직하게는 인간 Tie2) 및 DR4(바람직하게는 인간 DR4) 중 하나 이상에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함한다. 구체적인 예에서, 당뇨병성 황반 부종의 치료를 위한 접합체는 VEGF-A에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제1 Fab); 및 예를 들어, Ang-2에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 접합체는 상기 열거된 표적에 결합하는 적어도 하나의 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)를 포함한다(예를 들어, 추가로 포함한다). 일부 실시예에서, Fab 및 짧은 펩티드는 동일한 표적에 결합한다. 일부 실시예에서, Fab 및 짧은 펩티드는 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, Fab 및 짧은 펩티드는 상보적 또는 상승작용적 치료 활성을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 안구 질환 장애를 치료하기 위한 본 발명의 접합체는 제2 치료제와 병용 투여된다. 안구 질환 또는 장애가 염증 반응에 의해 유발되는 환자의 경우, 항염증제와의 병용 요법을 고려할 수 있다. 세균성, 바이러스성, 진균성 또는 극세포성 감염에 이차적인 안구 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자의 경우, 병용 요법은 항미생물제 및 선택적으로 항염증제의 투여를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 안구 질환 장애를 치료하기 위한 본 발명의 접합체는 제2 요법, 예를 들어, 레이저 광응고 요법(LPT) 및/또는 광역학 요법(PDT)과 병용 투여되며, 여기서 광 활성화 분자(예를 들어, 베르테포르핀)는 광 활성화에 의해 신생혈관 내피를 국소적으로 손상시키도록 만들어질 수 있다(예를 들어, WO 2014/033184 참조). 특정 실시형태에서, 제2 요법은 단극 투열 요법 유닛을 통해 응고 전류를 적용하거나 전기분해 바늘을 사용한 열 소작에 의해 혈관을 폐색시키는 투열 요법 및 소작이다.
c. 기타 질환의 치료
본 발명의 접합체는 또한 예를 들어, 치료 이점이 항원-결합 폴리펩티드의 다량체 및/또는 다중-특이적 형식(및, 일부 실시형태에서 짧은 펩티드), 특히, 안정한 고 결합력 형식을 사용하는 것을 필요로 하거나 이를 사용하여 강화되는 경우 및/또는 고농도의 항원-결합 폴리펩티드(및 일부 실시형태에서 짧은 펩티드)가 본원에 기술된 바와 같이 소량으로 투여되는 경우, 다른 질환의 치료에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 접합체는 알레르기성 또는 염증성 장애의 치료를 위해, 또는 자가면역 질환의 치료를 위해, 또는 알레르기성 또는 염증성 장애 또는 자가면역 질환이 발병할 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본원에서 제공되는 조성물을 제공받기 위한 후보인 다른 대상체는, 섬유혈관 조직의 비정상적인 증식, 여드름 주사, 후천성 면역 결핍 증후군, 동맥 폐색, 아토피성 각막염, 세균성 궤양, 베체트병, 혈액 매개 종양, 경동맥 폐쇄성 질환, 맥락막 혈관신생, 만성 염증, 만성 망막 박리, 만성 포도막염, 만성 유리체염, 콘택트렌즈 과다착용, 각막 이식 거부, 각막 신생혈관, 각막 이식 신생혈관, 크론병, Eales 질환, 유행성 각결막염, 진균성 궤양, 단순 헤르페스 감염, 헤르페스 조스터 감염, 과다점도 증후군, 카포시 육종, 백혈병, 지질 변성, 라임병, 변연 각질 용해, 무렌 궤양(Mooren ulcer), 나병 이외의 마이코박테리아 감염, 근시, 안구 신생혈관 질환, 시신경, 오슬러-베버 증후군(Osler-Weber-Rendu), 골관절염, 파제트병, 편평부염, 천포창(pemphigoid), 플릭텐증(phylectenulosis), 다발동맥염, 레이저 후 합병증, 원생동물 감염, 탄력섬유가황색종(pseudoxanthoma elasticum), 건성 각결막염, 요골 각막절개술, 망막 신생혈관형성, 미숙아 망막병증, 후수정체 섬유증식증, 유육종증, 공막염, 낫적혈구 빈혈, 쇼그렌 증후군, 고형 종양, 스타가르트병, 스티븐스 존슨병, 상윤부 각결막염(superior limbic keratitis), 매독, 전신 루푸스, 테리엔 변연변성, 톡소플라스마증, 유잉 육종의 종양, 신경모세포종 종양, 골육종 종양, 망막모세포종 종양, 횡문근육종 종양, 궤양성 대장염, 정맥 폐색, 비타민 A 결핍증, 베게너 유육종증, 당뇨병과 관련된 바람직하지 않은 혈관신생, 기생충 질환, 비정상적 상처 치유, 수술, 부상 또는 외상(예를 들어, 급성 폐 손상/ARDS) 후 비대, 모발 성장 억제, 배란 및 황체 형성 억제, 착상 억제, 자궁 내 배아 발달 억제를 가지거나 이들이 발병할 위험이 있다.
특정 실시형태는 혈우병, 예를 들어 혈우병 A를 치료하는데 사용하기 위한, 인자 IXa, 바람직하게는 인간 인자 IXa에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab) 및 인자 X에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하는 본 발명의 접합체를 제공한다. 혈우병 A는 환자가 응고촉진 보조인자 단백질인 인자 VIII의 결핍 또는 기능 장애로 인해 광범위한 출혈을 겪는 심각한 유전성 출혈 장애이다. 일부 실시형태에서, 인자 IXa 및 인자 X 모두에 대한 본 발명의 이중특이성 접합체의 결합은 활성화된 인자 VIII의 기능 중 일부를 모방하고, 상기 질환의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, Nogami 외, New therapies using nonfactor products for patients with hemophilia and inhibitors; Blood; 2019; 133(5):399-406를 참고하라. 일부 실시형태에서, 이러한 접합체는 상기 열거된 표적에 결합하는 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)를 포함한다(예를 들어, 추가로 포함한다). 일부 실시예에서, Fab 및 짧은 펩티드는 동일한 표적에 결합한다. 일부 실시예에서, Fab 및 짧은 펩티드는 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, Fab 및 짧은 펩티드는 상보적 또는 상승작용적 치료 활성을 나타낸다.
VII. 전달 방법 및 용도
본 발명의 또 다른 양상은 하나 이상의 추가 치료제 또는 진단제의 전달에 사용하기 위한 접합체(예를 들어, 펩티드-NLP 접합체, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체 및/또는 NLP-폴리펩티드 접합체)를 제공한다. 이러한 접합체는 조성물, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물로서 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 접합체는 저점도 제형으로 제공되어, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 고 농도의 NLP-폴리펩티드 접합체 또는 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는, 예를 들어, 짧은 펩티드, 및/또는 하나 이상의 다른 치료제 또는 진단제를 포함하는 접합체를 안정화시키는 안정화제로서 작용하여, 예를 들어 저장 수명 및/또는 혈청 반감기를 증가시키고, 특히, 예를 들어, 접합체의 동결건조를 (활성의 실질적인 손실 없이) 용이하게 하고; 및/또는 예를 들어, 상기 논의된 바와 같은 높은 접합체 농도를 포함하는 저점도 제형의 제조를 용이하게 한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 접합체는 혈액-뇌 장벽을 가로질러 특이적 또는 표적화된 전달을 가능하게 하여, 그 카고(예를 들어, 하나 이상의 짧은 펩티드 및/또는 하나 이상의 추가 치료제 또는 진단제)가 예를 들어, 상기 논의한 바와 같이 뇌 또는 중추 신경계의 표적들에 접근할 수 있게 한다. 특정 실시형태에서, 특정 치료제 또는 진단제를 전달하고 혈액-뇌 장벽의 이동을 수행하기 위한 본 발명의 접합체의 용도는 아래에 보다 상세히 기술된다.
a. 치료제 전달
일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 상기 기술된 바와 같은 치료제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 특정 항원에 대한 친화도에 기초하여 특정 세포 또는 조직에 접합체를 지시하는 표적화 모이어티로서 더 많이 작용하고, 접합체는 항원-결합 폴리펩티드 이외에도 하나 이상의 치료제 또는 진단제, 예를 들어, 각각 생물학적 활성 제제 또는 검출가능한 작용제를 추가로 포함한다. NLP는 가용화 막 단백질(21-26), 단백질 다공성 복합체 생성(27), 소수성 약물(14, 28, 29), 단백질(14, 20, 30, 31), 암 신생항원(32) 및 면역 조절 약물(17)의 안정화를 비롯한 응용분야 및 약물 카고를 선택하기 위해 연구되어 온 반면, 본 발명은, 본원에서 논의된 바와 같이, 생리학적 조건 하에서의 안정성, 우수한 제조가능성, 활성 손실 없이(또는 상당한 손실 없이) 동결건조되고 재구성될 수 있는 능력, 및 저점도 제형으로 농축될 수 있는 능력을 포함한 놀라운 특성들을 가지는 항원-결합 폴리펩티드(특히, Fab)와의 접합체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 접합체는 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)를 포함한다(예를 들어 추가로 포함한다). 일부 실시형태에서 짧은 펩티드는 접합체 내의 항원-결합 폴리펩티드와 동일한 활성(예를 들어, 결합 활성 및/또는 치료 활성)을 나타낸다. 일부 실시형태에서 짧은 펩티드는 접합체 내의 항원-결합 폴리펩티드와 상이한(예를 들어, 상보적이거나 또는 상승작용하는) 활성(예를 들어, 결합 활성 및/또는 치료 활성)을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 접합체는 적어도 2개의 상이한 짧은 펩티드 각각의 적어도 하나의 분자를 포함한다. 본 단락에 인용된 모든 참조문헌은 아래 실시예 5에서 찾을 수 있다.
따라서, 일부 양상에서 본 발명은 생물학적 활성제 및/또는 검출가능한 작용제를 추가로 포함하는 본 발명의 접합체를 포함하는 액체 제형을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제를 안정한 및/또는 저점도 액체 제형으로 이를 필요로 하는 개체에게 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)는 본원에 언급된 하나 이상의 기능을 한다, 예를 들어, 또 다른 치료제 또는 진단제와 함께 항원-결합 폴리펩티드를 포함하는 접합체에 대한 표적화제 및 안정화제 둘 모두로서 기능한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 Fab이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 폴리펩티드는 "Fab-유사 분자"이며, 이는 Fab와 유사한 크기 및/또는 입체 형태를 갖지만 반드시 항원에 결합할 수 있는 것은 아닌 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 접합체는 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)를 포함한다(예를 들어 추가로 포함한다). 일부 실시형태에서 짧은 펩티드는 접합체 내의 항원-결합 폴리펩티드와 동일한 활성(예를 들어, 결합 활성 및/또는 치료 활성)을 나타낸다. 일부 실시형태에서 짧은 펩티드는 접합체 내의 항원-결합 폴리펩티드와 상이한(예를 들어, 상보적이거나 또는 상승작용하는) 활성(예를 들어, 결합 활성 및/또는 치료 활성)을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 접합체는 적어도 2개의 상이한 짧은 펩티드 각각의 적어도 하나의 분자를 포함한다.
추가적인 치료제 또는 진단제는 공유 또는 비공유 회합에 의해 본원에 기술된 접합체와 회합할 것이다. 예를 들어, 소수성 치료제 또는 진단제는 지질 이중층의 비극성 영역과 회합할 수 있는 반면, 임의의 친수성 부분은 내부 및 외부 영역 중 하나 또는 둘 모두로 확장된다. 일부 실시형태에서, 치료제 또는 진단제는, 직접적으로 및/또는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 제제 및/또는 지질 상의 스페이서를 통해 NLP의 막-형성 지질 상의 동일하거나 상이한 작용기화 기와 상호작용하도록 작용기화된다(예를 들어, US 2009/0311276A1, US 2019/0142752A1, US 2018/0318218A1, US 2019/0307692A1, US 2010/0092567A1, 및 US 2011/0059549A1 참조). 일부 실시형태에서, 치료제 또는 진단제는, 직접적으로 및/또는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 스페이서를 통해 접합체의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)와 회합할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 접합체는 치료제 또는 진단제에 결합하는(또는 치료제 또는 진단제의 합텐에 결합하는) 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 추가로 포함하여 사전 표적화된 전달을 가능하게 할 수 있다. 사전 표적화된 전달에서, 본 발명의 접합체는 대상체에게 투여되며, 여기서 접합체는 종양 마커(예를 들어, CEA, CD38)에 결합하는 항원-결합 폴리펩티드를 포함하고, 이어서 치료제 또는 진단제를 포함한다. 접합체가 짧은 펩티드를 포함하는 일부 실시형태에서, 치료제 또는 진단제는 접합체의 짧은 펩티드와 회합할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 접합체(예를 들어, 펩티드-NLP 접합체, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체 및/또는 NLP-폴리펩티드 접합체)는 특정 유형의 암을 표적으로 한다. 예를 들어, 위장관암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 구강암은 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab) 및/또는 (종양 세포의 표면에서 자연적으로 발생하는 종양 특이적 항원으로서) (인간) EpCAM에 결합하는 하나 이상의 짧은 펩티드를 포함하는 접합체로 표적화될 수 있다. 위장관암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 구강암은 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab) 및/또는 HER1, 바람직하게는 인간 HER1 또는 Trop-2, 바람직하게는 인간 Trop-2에 결합하는 하나 이상의 짧은 펩티드를 포함하는 접합체로 표적화될 수 있다. 또한, 위장관암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 교모세포종 및/또는 구강암은 MCSP, 바람직하게는 인간 MCSP; FOLR1, 바람직하게는 인간 FOLR1; PSCA, 바람직하게는 인간 PSCA; EGFRvIII, 바람직하게는 인간 EGFRvIII; 또는 MSLN, 바람직하게는 인간 MSLN에 결합하는 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 포함하는 접합체로 표적화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 접합체는 상기 열거된 표적에 결합하는 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)를 포함한다(예를 들어, 추가로 포함한다). 일부 실시예에서, Fab 및 짧은 펩티드는 동일한 표적에 결합한다. 일부 실시예에서, Fab 및 짧은 펩티드는 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, Fab 및 짧은 펩티드는 상보적 또는 상승작용적 치료 활성을 나타낸다.
위암, 유방암 및/또는 자궁경부암은 HER2, 바람직하게는 인간 HER2에 결합하는 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 포함하는 접합체로 표적화될 수 있다. 위암 및/또는 폐암은 HER3, 바람직하게는 인간 HER3에 결합하는 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 포함하는 접합체로 표적화될 수 있다. B-세포 림프종 및/또는 T 세포 림프종은 CD20, 바람직하게는 인간 CD20 및/또는 CD22, 바람직하게는 인간 CD22에 결합하는 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 포함하는 접합체로 표적화될 수 있다. 골수성 백혈병은 CD33, 바람직하게는 인간 CD33에 결합하는 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 포함하는 접합체로 표적화될 수 있다. 난소암, 폐암, 유방암 및/또는 위장관암은 CA12-5, 바람직하게는 인간 CA12-5에 결합하는 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 포함하는 접합체로 표적화될 수 있다. 위장관암, 백혈병 및/또는 비인두 암종은 HLA-DR, 바람직하게는 인간 HLA-DR에 결합하는 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 포함하는 접합체로 표적화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 접합체는 상기 열거된 표적에 결합하는 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)를 포함한다(예를 들어, 추가로 포함한다). 일부 실시예에서, Fab 및 짧은 펩티드는 동일한 표적에 결합한다. 일부 실시예에서, Fab 및 짧은 펩티드는 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, Fab 및 짧은 펩티드는 상보적 또는 상승작용적 치료 활성을 나타낸다.
결장암, 유방암, 난소암, 폐암 및/또는 췌장암은 MUC-1, 바람직하게는 인간 MUC-1에 결합하는 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 포함하는 접합체로 표적화될 수 있다. 결장암은 A33, 바람직하게는 인간 A33에 결합하는 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 포함하는 접합체로 표적화될 수 있다. 전립선암은 PSMA, 바람직하게는 인간 PSMA에 결합하는 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 포함하는 접합체로 표적화될 수 있다. 위장관암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 구강암은 트랜스페린 수용체, 바람직하게는 인간 전달 수용체에 결합하는 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 포함하는 접합체로 표적화될 수 있다. 췌장암, 폐암 및/또는 유방암은 트랜스페린 수용체, 바람직하게는 인간 전달 수용체에 결합하는 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 포함하는 접합체로 표적화될 수 있다. 신장암은 CA-IX, 바람직하게는 인간 CA-IX에 결합하는 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)를 포함하는 접합체로 표적화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 접합체는 상기 열거된 표적에 결합하는 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)를 포함한다(예를 들어, 추가로 포함한다). 일부 실시예에서, Fab 및 짧은 펩티드는 동일한 표적에 결합한다. 일부 실시예에서, Fab 및 짧은 펩티드는 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, Fab 및 짧은 펩티드는 상보적 또는 상승작용적 치료 활성을 나타낸다.
예를 들어, 상기 제공된 바와 같은 표적 조직으로의 전달을 위한 치료제는 종양 세포를 사멸시키거나 억제하는 세포독성제 또는 세포증식억제제일 수 있으나(Syrigos and Epenetos, Anticancer Research 19:605-614 (1999); Niculescu-Duvaz and Springer, Adv. Drg. Del. Rev. 26:151-172 (1997); US Pat. No. 4,975,278), 이들 제제의 전신 투여는 정상 세포 뿐만 아니라 제거하고자 하는 종양 세포에 허용할 수 없는 수준의 독성을 초래할 수 있다. 상기 세포독성제는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신, 방사성핵종, 디프테리아 독소와 같은 세균 독소, 리신과 같은 식물 독소, 젤다나마이신, 메이탄시노이드, 칼리케아미신과 같은 저분자 독소로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제 억제를 포함한 메커니즘에 의해 세포 독성 및 세포 증식억제 효과에 영향을 미칠 수 있다.
세포독성 또는 세포증식억제제는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(녹농균 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, Aleurites fordii 단백질, 다이안틴 단백질, 미국 자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 커신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 제한효소, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 비롯한 효소적 활성 독소 및 이의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, WO 93/21232를 참고하라. 사용할 수 있는 방사성핵종의 예로는 212Bi, 125I, 131I, 131In, 90Y, 211At, 186Re, 188Re, 153Sm, 32P, 212Pb, Lu의 방사성 동위원소 등이 있다.
구체적인 예에서, 본 발명의 접합체는 CEA에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab); 및 예를 들어, 인듐-111의 사전 표적화된 전달을 위해 인듐-111-표지된 펩티드에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함한다. 또 다른 구체적인 예에서, 본 발명의 접합체는 CD38에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab); 및 예를 들어, 90Y의 사전 표적화된 전달을 위해 90Y 복합체에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함한다. 또 다른 구체적인 예에서, 본 발명의 접합체는 CD22에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab); 및 CD19에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 제2 Fab)를 포함하고; 그리고 제1 및/또는 제2 항원-결합 폴리펩티드에 직접 부착된 디프테리아를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 접합체는 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)를 포함한다(예를 들어, 추가로 포함한다). 일부 실시예에서, Fab 및 짧은 펩티드는 동일한 표적에 결합한다. 일부 실시예에서, Fab 및 짧은 펩티드는 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, Fab 및 짧은 펩티드는 상보적 또는 상승작용적 치료 활성을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 세포독성제는, 예를 들어, 공지된 단백질-커플링제를 사용하여 본 발명의 접합체의 하나 이상의 항원-결합 폴리펩티드(또는 존재하는 경우 하나 이상의 짧은 펩티드)에 부착된다. 단백질 커플링제의 예에는, 제한 없이, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용기 유도체(예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(파지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)이 포함된다. 한 실시형태에서, 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸-디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성핵종을 항원-결합 폴리펩티드에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트제이다. 예를 들어, WO 94/11026을 참고하라.
특정 실시형태에서, 세포독성제는 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 오로스타틴, 트리코테센 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 접합체에 사용될 수 있는 다른 항종양제는 미국 특허 5,053,394 및 5,770,710에 총칭하여 LL-E33288 복합체로 공지되어 있는 계열인, BCNU, 스트렙토조토신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 및 에스페라마이신(미국 특허 5,877,296)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 치료제는 뉴클레오티드, 예를 들어 siRNA, 간섭 RNA, CRISPR RNA, shRNA, 앱타머 또는 리보자임이다.
b. 진단제 전달
본 발명의 접합체(예를 들어, 펩티드-NLP 접합체, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체, 및/또는 NLP-폴리펩티드 접합체)는, 예를 들어, 진단 또는 기초 연구에 사용하기 위한, 치료제의 질환 과정 및/또는 효능을 모니터링하기 위한, 환자의 특정 하위 집단, 예를 들어, 치료제에 반응할 가능성이 더 높은 환자 등을 확인하기 위한 검출 가능한 제제를 포함할 수 있다.
검출 가능한 제제는 일반적으로 표지에서 방출되는 신호를 통해 제제가 전달된 세포 또는 조직에 국소화된 것으로 가시화되거나 다른 방법으로 검출될 수 있는 표지이다. 신호는, 예를 들어, 방사능, 형광, 화학발광, 효소 반응 결과로 화합물의 생성 등일 수 있다. 본 발명의 접합체와 함께 사용하기 위한 검출가능한 작용제의 예는, 제한없이, 방사성 동위원소, 형광단, 화학발광 염료, 발색단, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 염료, 금속 이온, 나노입자, 금속 졸, 리간드(예를 들어, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 합텐) 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방사성 원자는 예를 들어, 신티그래픽 연구에서 검출가능한 작용제로서 사용된다. 방사성 원자의 예는, 예를 들어, tc99m 또는 I123을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 핵 자기 공명(NMR) 영상 또는 자기 공명 영상(MRI)을 위한 검출 가능한 제제로서 스핀 라벨이 사용되며, 그 예로는, 다시 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철이 포함된다.
일부 실시형태들에서, 검출가능한 작용제는 형광단이다. 용어 "형광단"은 검출 가능한 영상에서 형광을 나타낼 수 있는 물질 또는 그 일부를 의미한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 막-지질, 예를 들어, (1-올레오일-2-[12-[(7-니트로-2-1,3-벤족사디아졸-4-일)아미노]도데카노일]-sn-글리세로-3-포스포콜린)은 형광 표지될 수 있다. 당업자는 이러한 실시형태에서 NLP 접합체 조립에 사용되는 형광 표지된 지질의 양에 의해 검출가능한 작용제로부터의 신호가 강화될 수 있음을 알고 있을 것이다.
검출가능한 작용제는 상기 기재된 바와 같이 또는 당업계에 공지된 다른 방식으로 접합체에 통합될 수 있다. 예를 들어, 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab)는, 예를 들어, 수소 대신 불소-19를 포함하는 아미노산 전구체를 사용하여 화학적 아미노산 합성에 의해 생합성되거나 합성될 수 있다. tc99m, 123I, 186Re, 188Re, 및 111In과 같은 검출 가능한 제제는 펩티드의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. IODOGEN 방법(Fraker 외, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57 (1978))을 사용하여 요오드-123을 통합시킬 수 있다. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy"(Chatal, CRC Press 1989)는 다른 방법을 자세히 설명한다. 추가로 또는 대안적으로, 이러한 변형은 짧은 펩티드에 이루어질 수 있으며, 여기서 접합체는 짧은 펩티드를 포함한다.
c. 혈액-뇌 장벽을 통한 전달
본 발명의 또 다른 양상은 예를 들어 신경계 질환을 치료함에 있어서 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제를 뇌 또는 중추 신경계에 전달하는 방법에 관한 것이다. 뇌와 CNS를 표적으로 하는 치료 방식은 특별한 문제에 직면해 있는데, 특히, 혈액-뇌 장벽(BBB)은 분자 트래킹을 조절하고 약물이 뇌 실질에 도달하는 것을 막을 수 있다. 따라서 BBB를 통과하는 약물의 능력이 뇌 질환의 약리학적 치료에서 가장 중요하다(Dal Margo, 외, "Artificial apolipoprotein corona enables nanoparticle brain targeting" Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 14 (2018) 429-438).
일부 실시형태에서, 본 발명은 뇌 또는 중추 신경계에 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제를 전달하기 위한 접합체, 약학 조성물, 제형, 방법, 시스템 및 키트를 제공한다. 일반적으로, 본 발명의 접합체는, 예를 들어, 정맥내 경로에 의해 개체에게 전신 투여되어 접합체를 순환시키고 결국 BBB를 이동시킨다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 비히클 및 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab 또는 Fab-유사 분자)의 접합체, 나노지단백 입자, 및 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제를 포함하는 액체 제형이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 접합체는 짧은 펩티드(예를 들어, CKP 또는 CKP 변이체)를 추가로 포함한다. 이러한 제형은 정맥내 주사 또는 다른 적절한 전신 또는 국소 경로에 의해 투여될 수 있다.
뇌/CNS 전달을 위해, 접합체의 나노지단백질은 BBB를 통한 접합체의 이동을 가능하게 하는 스캐폴드 단백질을 포함할 것이다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드 단백질은 아포지단백질, 특히, apoE4, apoE2, 이들 중 하나의 절단된 버전, 또는 apoE2, apoE2의 절단된 버전, apoE4, 및 apoE4의 절단된 버전 중 하나 이상의 조합일 것이다. 예를 들어 ApoE는 BBB를 통해 나노입자 결합 약물을 전달하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다 (Dal Margo, 외, "Artificial apolipoprotein corona enables nanoparticle brain targeting" Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 14 (2018) 429-438). 일부 실시형태에서, 약학 조성물은 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트 80을 추가로 포함한다. 접합체는 본 발명의 접합체에 결합되지 않은 경우(예를 들어, NLP-Fab 접합체 또는 NLP-Fab-짧은 펩티드 접합체와 결합/공유 결합되지 않은 경우)와 비교하여 BBB를 통한 이동 증가 및 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제의 뇌 또는 중추 신경계로의 전달 증가(예를 들어, 상당한 증가)를 나타낼 수 있다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 신경계 질환은 중추 및 말초 신경계의 임의의 질환을 포함한다. 비제한적 예에는 뇌, 척수, 뇌신경, 말초신경, 신경근, 자율신경계, 신경근 접합부 및 근육의 질환이 포함된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 접합체는 뇌 및 중추 신경계의 신경계 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 구체적인 예에서, 본 발명의 접합체는 예를 들어 알츠하이머병, 기타 치매, 뇌종양, 뇌혈관 질환, 간질, 편두통, 기타 두통 장애, 다발성 경화증, 신경 감염, 영양 실조로 인한 신경 장애, 파킨슨병, 뇌졸중, 두부 외상으로 인한 신경계의 외상성 장애 등을 치료하는 데 사용된다.
VIII. 시스템 및 키트
본 발명의 또 다른 양태는 시스템 및/또는 키트, 예를 들어 본원에 기술된 공정 또는 사용 방법 중 하나 이상을 수행하는 것을 용이하게 하도록 설계된 시스템 및 키트에 관한 것이다. 일반적으로, 시스템 또는 키트는 본 발명의 접합체(예를 들어, 펩티드-NLP 접합체, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체 및/또는 NLP-폴리펩티드 접합체), 약학 조성물 또는 제형, 및/또는 관련 성분을 포함하며, 여기서 접합체, 조성물 및 성분들은 상이한 구획 또는 용기에 제공된다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알(예를 들어, 이중 챔버 바이알), 주사기(예를 들어, 이중 챔버 주사기) 및 시험관을 포함한다. 용기는 다양한 재료들, 가령, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 구획은, 예를 들어, 별도의 상이한 구성성분들을 주어진 용기 내부에 유지시키기 위한 용기 내의 구획을 말하며, 용기와 동일하거나 상이한 재료를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 접합체를 제조하기 위한 지침과 함께, 막-형성 지질, 스캐폴드 단백질, 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 일부 실시형태에서, 펩티드-접합된 C4-28 지방-아실이 키트의 하나 이상의 상이한 구획 또는 용기에 제공된다. 지침은 약품 설명서에 포함될 수 있다. 약품 설명서는 또한 예를 들어 치료, 예방 또는 진단 적응증에 사용하기 위한 본 발명의 접합체에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 병용 요법, 금기 사항 및/또는 경고에 대한 정보를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, NLP 및 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, Fab), 및 일부 실시형태에서 펩티드-접합된 C4-28 지방-아실은 키트의 별도 구획 또는 용기에 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물을 제조하기 위한, 키트의 별도의 구획 또는 용기에 펩티드-NLP 접합체, 펩티드-NLP-폴리펩티드 접합체 및/또는 NLP-폴리펩티드 접합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 제공한다. 예를 들어, 키트는, 예를 들어, 낮은 부피의 고 농도 접합체의 피하 또는 안구 전달을 위해, 접합체의 저 점도 제형을 제조하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 접합체는 추가 치료제 또는 검출가능한 작용제(표지)를 추가로 포함하거나, 키트는, 선택적으로 접합체에 관한 사용 지침서와 함께 하나 이상의 추가 구획 또는 용기에 추가 치료제 및/또는 검출가능한 작용제(표지)를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 접합체는 키트에 동결건조된 제형으로 제공되며, 이때 키트는 선택적으로 재료의 재구성 및/또는 사용에 관한 지침을 포함한다. 예를 들어, 용기는 동결건조된 제형을 담을 수 있고 재구성 및/또는 사용에 대한 지침을 나타내는 라벨을 용기에 부착하거나 용기와 결합시킬 수 있다. 라벨은 동결건조된 제형이 상기 기재된 바와 같은 접합체 농도로 재구성됨을 나타낼 수 있다. 라벨은 제형이 피하 또는 안구 투여용으로 사용가능하거나 이를 위한 것임을 추가로 표시할 수 있다. 제형을 담는 용기는 재구성된 제형의 반복 투여(예를 들어, 2 내지 6회 투여)를 가능하게 하는 다용도 바이알일 수 있다. 키트는 적합한 희석제(예를 들어, BWFI)를 포함하는 제2 용기 또는 구획을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 사용 지침서가 있는 포장 삽입물을 비롯하여, 상업적 및 사용자 관점에서 필요한 다른 물질을 추가로 포함 할 수 있다.
IX. 나노입자 표면에 부착된 짧은 펩티드의 생물학적 활성을 증가시키는 방법.
또한 지질-기반 나노입자의 표면에 부착된 짧은 펩티드(예를 들어, 20-60개 아미노산 길이의 펩티드)의 활성(예를 들어, 생물학적 활성)을 증가시키는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 나노입자의 표면에 부착된(예를 들어, 공유 부착된) 짧은 펩티드를 포함하는 지질-기반 나노입자를 제공하는 단계(여기서 나노입자의 하나 이상의 지질은 직용기화 기를 제시하고), 및 상기 작용기화 기의 상기 작용기에 대한 접합을 선호하는 조건하에서 나노입자를 작용기를 갖는 폴리펩티드(예를 들어, Fab)에 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시형태들에서, 상기 방법은 지질-기반 나노입자, 짧은 펩티드 및 폴리펩티드를 포함하는 접합체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태들에서, 나노입자는 리포좀이다. 일부 실시형태들에서, 나노입자는 지질 이중층을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 지질-기반 나노입자는 고체 지질 나노입자(SLN)이다. 일부 실시형태들에서, 지질-기반 나노입자는 나노구조 지질 담체(NLC)이다. 일부 실시형태들에서, 스페이서는 상기 작용기화 기를 지질-기반 나노입자의 표면 상의 지질에 연결한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 상기 상보적 작용기를 상기 폴리펩티드에 연결한다. 폴리펩티드를 지질에 접합시키기 위한 예시적인 작용기화 기 및 상보적 작용기는 본원의 다른 부분에서 상세히 설명된다. 일부 실시형태들에서, 폴리펩티드는 항원-결합 폴리펩티드이다. 지질 이중층을 포함하는 나노입자 또는 리포좀 내의 지질에 접합시키기 위한 예시적인 항원-결합 폴리펩티드는 본원의 다른 부분에서 상세히 설명된다. 일부 실시형태들에서, 펩티드는 CKP이다. 일부 실시형태들에서, 펩티드는 CKP 변이체이다. 일부 실시형태에서, 나노입자에 대한 폴리펩티드의 접합은 짧은 펩티드의 활성(예를 들어, 생물학적 활성)을 폴리펩티드가 없는 지질-기반 나노입자 상의 짧은 펩티드의 활성(예를 들어, 생물학적 활성)과 비교하여 약 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 20-, 50-, 100- 또는 150배 중 어느 하나만큼 증가시킨다.
예를 들어, 본원에 개시된 모든 참고문헌, 간행물 및 특허 출원은 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예들이다. 다양한 다른 실시예가 전술한 일반적인 설명에 따라 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1: NLP-Fab 접합체의 생산
재료
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 및 DOPE-MCC는 Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL)사로부터 구입했다. 인간 혈청, Alexa Fluor 488 NHS 에스테르(AF488)는 Thermo Fisher(Carlsbad, CA)사로부터 구입했다. 다른 모든 시약은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)사에 주문했다.
apoE422k 및 Fab의 단백질 발현 및 정제
ApoE422k는 확립된 발현 플라스미드 및 방법(46, 47)을 사용하여 진탕 플라스크 조건하에 대장균 세포에서 생산되었다. 일단 수확되면, 세포를 파열시키고, 원심분리시키고, 상청액을 수집하였다. ApoE422k는 Ni-NTA 컬럼(XK16/20 3ml)에 이어 SEC(Superdex 75 16/60)로 정제되었다. Ni-NTA 정제를 위해 컬럼을 세척하고 단백질을 50mM 인산염 완충액, 200mM NaCl, 10mM 이미다졸, pH 8(완충액 A)에 결합시켰다. 단백질을 완충액 A + 0.2% Triton X114 + 0.2% Triton X100으로 광범위하게(20 컬럼 부피) 세척하고 50mM 인산염 완충액, 200mM NaCl, 400mM 이미다졸(pH 8)로 용리시켰다. 풀링된 분획을 여과하고 3kDa 분자량 컷오프 회전 농축기로 농축했다. 그런 다음 Tobacco Etch 바이러스 핵 포함-a 엔도펩티다제(TEV 프로테아제) 소화를 통해 His 태그를 제거했다(TEV 태그는 His 태그와 단백질 서열 사이의 N-말단에 추가됨). TEV 프로테아제를 단백질 중량 대 TEV 중량비가 100:1이 되도록 정제된 단백질에 첨가하였다. 절단된 단백질은, His 태그를 포함하는 TEV 프로테아제로부터 반응 혼합물을 Ni-NTA 컬럼(XK 16/20 3 ml)에 통과시켜 정제되었다. 풀링된 단백질을 농축시키고 PBS에서 SEC(Superdex 75 16/60)를 실시하였다. SEC 분획을 수집하고 질량 분석법을 사용하여 동일성에 대해 분석하고 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 응집을 분석했다. 정확한 분자량(MW)을 가지며 응집체 수준이 5% 미만인 분획을 모으고 280에서의 흡광도로 단백질 농도를 결정했다.
이 실험에서, NLP에 대한 부위 특이적 접합을 가능하게 하기 위해 C-말단 시스테인을 사용하여 Fab 구조체를 설계했다(간단히 Fab라고 함). Fab 접합 및 Fab-NLP 안정성에 대한 접합의 효과를 평가하기 위한 실험은 무관한 세포질 항원(cMET)에 특이적인 종 매칭된 비표적화 토끼 Fab를 사용하여 수행되었다. 토끼 Fab의 발현 및 정제는 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(47, 48). 접합 후 NLP 플랫폼에 대한 Fab 활성을 평가하기 위한 실험은 인간 항-OX40 Fab 및 인간 항-인자 D(AFD) Fab로 수행되었으며, 이들은 이전에 기술된 바와 같이 정제되었다(45). 모든 정제된 Fab를 20mM DTT를 사용하여 탈시스테인화시켜 시스테인 접합체를 감소시키고 6.5mM 글루타티온(GSH)으로 재산화시켰다. 그런 다음 샘플을 완충액 교환하고 세척하고 200mM 아르기닌 숙시네이트 pH 5에 저장하여 추가 시스테인화를 제한했다.
NLP 어셈블리
NLP는 이전에 보고된 절차에 따라 조립되었다(20). 모든 NLP 어셈블리의 경우, 전체 지질 대 apoE422k 몰비는 80:1이었고, 이는 이전에 비교적 동종의 NLP 모집단을 생성하는 것으로 나타났다(16, 19, 31, 46). NLP는 결과 섹션에 설명된 대로 DOPC 및 DOPE-MCC 지질을 조합하여 조립되었다. 이들 지질은 클로로포름 중에서 준비되거나 수득되어 유리 바이알에 분취시켰다. 클로로포름은 교반 하에 N2 스트림을 사용하여 제거되어 얇은 지질 필름을 형성했다. 지질을 PBS 완충액(137mM 소듐 클로라이드, 2.7mM 포타슘 클로라이드, 10mM 포스페이트 완충액, pH 7.4) 또는 50mM Na 포스페이트 완충액, pH 6.0, 150mM NaCl에서 80mM 소듐 콜레이트를 사용하여 용해시켰다. apoE422k(최종 어셈블리 부피 150μM)를 첨가한 후 샘플을 22°C에서 최소 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 콜레이트 제거를 위해 샘플을 바이오비드(Sigma-Aldrich)를 제거하는 세제와 함께 2시간 동안 500 μL costar 0.22 스핀 필터에서 흔들면서 인큐베이션했다. 2시간 동안 흔든 후 샘플을 200g에서 5분 동안 원심분리하고 NLP를 포함하는 여과액을 수집했다. 이후에 Fab 접합에 사용되지 않을 샘플은 AKTA Avant 시스템 및 S200 10/300 Increase 컬럼을 사용하여 SEC를 통해 정제되었다. 대조적으로, Fab에 접합될 샘플은 이 단계에서 정제되지 않았고 그 보다 아래에 설명된 바와 같이 즉시 접합되었다.
Fab-NLP 접합 및 정제
상기 설명한 투석 단계 후, DOPE-MCC를 포함하는 NLP에서 apoE422k 농도를 측정하고 NLP를 50mM Na 포스페이트 완충액, pH 6.0, 150mM NaCl에서 0 - 60 범위의 Fab:NLP 몰비로 인큐베이션하였다. 접합은 말레이미드의 가수분해를 제한하기 위해 NLP가 조립된 당일에 수행되었다. 샘플을 로커에 놓고 2-4시간 동안 인큐베이션했다. 2-4시간의 반응 인큐베이션 기간 후, n-아세틸시스테인(NAC)을 DOPE-MCC에 대해 2배 몰 과량으로 첨가하여 임의의 미반응 말레이미드를 퀀칭시켰다. 생성된 Fab-NLP 접합체를 AKTA Avant 시스템 및 S200 10/300 Increase 컬럼을 사용하여 정제했다. Fab-NLP 피크 전반에 걸친 각 분획을 아래에 설명된 바와 같이 SEC-MALS로 분석하고 분획들을 MW 및 유체역학적 반경(Rh) 분석을 기반으로 풀링하여 균일한 Fab-NLP 샘플을 생성했다.
실시예 1에 대한 결과 및 논의
Fab-NLP 접합 조건 최적화
이 연구는 NLP를 Fab 전달 비히클로 활용하는 것에 대한 적합성을 확립하였다. 도 1A는 Fab-NLP 접합체 생성을 위해 개발된 전략의 개략도를 보여준다. 대체로 이러한 접근 방식은 NLP를 이중층 형성 지질(헬퍼 지질) 및 작용기화 지질(작용기화 헤드기를 포함하는 지질)과 조립하여 직교 반응기를 포함하는 Fab 분자와 접합하는 것을 포함했다. 이들 실험에서 DOPC는 이전에 NLP를 포함하는 DMPC에 비해 더 안정한 입자를 형성하는 것으로 나타났기 때문에 헬퍼 지질로 선택되었다(20).
Fab를 NLP에 접합시키기에 적절한 작용기화 지질을 선택할 때 중요한 고려 사항은 apoE422k 스캐폴드 단백질에 존재하는 천연 작용기(예를 들어, 아미노 및 카르복실기)와의 반응성을 회피하기 위한 화학선택적 반응 쌍을 선택하는 것이었다. apoE422k 단백질에는 시스테인(티올 반응성 기)이 포함되어 있지 않기 때문에 우리는 Fab 접합을 위해 말레이미드 헤드기를 포함하는 지질, DOPE-MCC을 사용하는 티올-말레이미드 화학을 선택했다. Fab의 부위 특이적 접합은 Fab C-말단 잔기(본 실시예에서는 간단히 Fab라 함)로서 전장 IgG에서 사슬간 힌지 이황화 결합에 일반적으로 관여하는 잔기인 Cys-227을 유지시킴으로써 이루어졌다. 생성된 Fab는 유리 반응성 티올과 이러한 페어링되지 않은 Cys를 포함했다(48). 이 전략은 NLP 표면을 장식하는 말레이미드 반응성 기로 NLP를 조립한 다음 티올 반응성 Fab에 대한 부위 특이적 접합을 가능하게 하였다(도 1A).
실시예 2: NLP-Fab 접합체의 분석
NLP 및 Fab-NLP 접합체의 SEC-MALS/QELS 분석
MW 및 Rh는 다중 각도 광산란 시스템(MALS)(Wyatt Instruments)과 결합되고, 포스페이트 완충 식염수(PBS)가 등용매 구배된(추가 150mM NaCl 스파이크 포함) Acclaim SEC-1000 분석 SEC 컬럼(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 측정했다. 또한 확산 계수(D)는 99.0o 각도에서 단일 광자 계수 모듈을 사용하여 산란된 레이저 광의 강도 변동을 포착하는 준 탄성 광 산란법(QELS)을 사용하여 측정되었다. 구형을 가정하고 스톡스-아인슈타인 관계를 사용하여 D에서 Rh를 계산했다.
NLP 및 Fab-NLP 접합체의 LCMS 분석
NLP 및 NLP-Fab 접합체의 LCMS 분석은 Agilent 6230 ESI-TOF LC/MS를 사용하여 수행되었다. 80°C로 가열된 Kinetex 2.6μm XB-C18 컬럼(Phenomenex)을 사용하여 주입된 NLP 샘플을 분석했다. 용매는 30% 메탄올과 70% 물의 혼합물로부터 100% 2-프로판올까지의 구배로 전개되었다. 모든 용매에는 0.05% 트리플루오로아세트산이 있었다. ApoE422k 및 Fab 단독을 주입하여 기준선 질량을 제공했다.
NLP, Fab-NLP 및 Fab 부하의 HPLC 분석
Fab-NLP 접합체의 ApoE422k 및 Fab 농도는 HPLC 분석과 280nm에서의 흡광도를 조합하여 사용하여 분석되었다. apoE422k 농도는 상기 LCMS 분석에서 설명한 동일한 컬럼 및 구배를 사용하여 Agilent 1290 Infinity Bio-inert HPLC에서 결정되었다. NLP-Fab 접합체의 샘플 A280 HPLC 크로마토그램을 도 7A에 도시한다. apoE422k(4.95분) 및 DOPE-MCC에 접합된 Fab(~5.15분)에 해당하는 두 개의 피크가 관찰되었다. apoE422k 농도는 1-8μg의 apoE422k를 주입하고 곡선 아래 영역을 적분하여 생성된 표준 곡선을 기반으로 결정되었다(도 7B). 주로 지질과 단백질의 양립할 수 없는 용해도로 인해, Fab-DOPE-MCC 시약을 생성하는 데 어려움이 있는 경우, HPLC 표준 곡선이 아닌 apoE422k 농도와 A280 총 흡광도를 이용해 다음 방정식을 사용하여 Fab-DOPE-MCC 접합체를 정량화했다:
[Fab] = (Abs280 - [apoE422k]·εapoE422k)/εFab
여기서 [Fab], Abs280, [apoE422k], εapoE422k 및 εFab는 각각 Fab 농도, 280nm에서의 흡광도, HPLC 분석에 의해 결정된 apoE422k 농도, apoE422k의 흡광 계수 및 Fab의 흡광 계수이다.
실시예 2에 대한 결과 및 논의
Fab-NLP 접합 조건의 추가 최적화
말레이미드-티올 반응성을 통합시킨 영향을 평가하기 위해 NLP 어셈블리에 대한 DOPE-MCC의 효과를 평가했다. NLP를 PBS pH 7.4에서 다양한 DOPE-MCC 농도(0, 10, 20 및 30mol%)로 조립하고 SEC-MALS/QELS로 분석하였다(도 1B 및 8A). 측정된 MW 및 Rh(도 1B; 검은 점 MW, 회색 사각형 Rh)와 함께 다양한 DOPE-MCC 농도(도 8A)에 걸쳐 생성된 SEC 크로마토그램은 모두 거의 동일한 결과를 나타냈으며 이는 작용기 지질이 전반적인 NLP 모양 및 크기에 대해 그리 상당한 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 그러나 LCMS에 의한 추가 분석에서는 생성물 복잡성(도 1C - 1D)이 드러났으며, 이는 기본 분석에서 포착되지 않았었다. ~4.9분의 용리 시간에서 단일 TIC 피크가 apoE422k 단독에 대해 관찰된 반면(도 1C 원), apoE422k의 예상 질량과 일치하는 디컨볼루션된 질량(~22 kDa)의 경우(도 1D 원), pH 7.4 PBS에서 조립된 NLP에 대해 우세한 apoE4222k 피크는 관찰되지 않았다. 대신, 머무름 시간이 4.8 - 6.5분 범위인 다중 TIC 피크(도 1C 일반 선)가 모든 MCC 농도에 존재했으며(데이터는 표시되지 않음), 이 때 디콘볼루션 시 ~23 kDa, 24 kDa 및 25 kDa에서 세 개의 주요 피크 패턴이 관찰되었다(도 1D 일반 선).
흥미롭게도, 이러한 질량 부가는 DOPE-MCC 지질의 MW(960kDa)에 해당하며, 이는 pH 7.4의 PBS 완충액에서의 조립 및 정제 과정 동안 DOPE-MCC가 apoE422k 스캐폴드 단백질에 접합되어 이를 지질화시켰으며 23kDa , 24 kDa 및 25 kDa는 각각 1, 2 및 3개 지질에 접합된 apoE422k에 해당함을 시사하는 것이다. 티올에 대한 말레이미드 반응성은 6.5 - 7.5 사이의 pH 값에서 매우 특이적이지만 알칼리성 pH 값에서 단백질의 아미노기와의 반응성이 보고된 바 있었다(50). 노출된 리신 잔기에 매우 근접하게 위치한 고농도의 말레이미드 및 이 단계에서의 설프하이드릴의 부재는 이전에 관찰된 바와 같이 이러한 부반응이 진행될 기회를 증가시킨다(51).이 문제를 해결하기 위해 pH 6.0에서 반응을 수행했다. 이러한 조건은 말레이미드-티올 화학에 있어서는 덜 최적이며 Fab 접합을 위해 연장된 반응 시간을 필요로 하지만 양성자화되지 않은 친핵성 아민의 존재가능성을 감소시킨다. pH 6.0에서의 조립 또한 말레이미드 가수분해를 최소화하는 데 도움이 될 수 있으며, 말레이미드 가수분해는 더 높은 pH 값에서 더 빨리 발생하고 비가역적이고 비반응성인 말레산을 생성한다(52). 따라서, NLP는 pH 6.0에서 50mM Na 포스페이트 완충액, 150mM NaCl에서 20mol% DOPE-MCC와 함께 조립되었고 SEC 정제 후 LCMS로 분석되었다. 이러한 조립 조건을 사용하여 LC 크로마토그램에서 단일 피크만이 관찰되었으며(도 1C 삼각형) 이 피크는 apoE422k의 예상 질량(~22kDa)으로 디컨볼루션되었다(도 1D 삼각형). 이러한 조합 결과는 DOPE-MCC 지질이 apoE422k에서 노출된 리신에 접합하고 있음을 강력하게 시사한다.
흥미롭게도, 중요한 apoE422k - DOPE-MCC 접합이 감지된 임의의 어셈블리들에서는 응집이 없었으며(도 8A), 이는 가교가 입자간 이벤트가 아닌 입자내 이벤트일 수 있음을 시사한다. NLP 응집에 대한 apoE422k-DOPE-MCC 접합의 효과를 추가로 평가하기 위해, 동일한 조성(20mol% DOPE-MCC)의 NLP를 pH 7.4 및 6.0에서 제조하고 SEC-MALS로 분석하였다. 이전 관찰과 일관되게, pH 7.4에서 제조된 샘플의 광범위한 apoE422k 지질화에도 불구하고 두 샘플의 MW 및 Rh는 동일했다(도 8B). 이들 데이터는 DOPE-MCC:apoE422k 접합이 입자간 가교가 아니라 오히려 입자내 가교를 유발한다는 추가적인 증거를 제공한다.
우리는 지질 코어와의 스캐폴드 단백질 인터페이스에 상주하는 리신 잔기들이 이들의 pKa 변화를 경험하여, 이들을 pH 7.4에서 탈양성자화시키고 인접한 말레이미드와 반응할 수 있게 한다고 가정한다. apoE422k 단백질의 8개 리신 중 7개는 지질 이중층을 둘러싸는 나선형 도메인에 위치하며(53) 지질 이중층에서 DOPE-MCC에 쉽게 접근할 수 있다. 또한, 소수성 환경에서 리신 측쇄 pKa의 감소는 이전에 단백질과 DOPC 이중층에 포매된 리신 잔기로 보고된 바 있다(54, 55). 이들 연구에서, 물에 접근할 수 없는 리신 잔기들은 정상 pKa≥10 미만에서 각각 5.2 및 6만큼 낮은 저하된 pKa 값을 나타냈다. NLP 지질 이중층에 대면하는 리신 잔기들만의 선택적인 pKa 값의 감소는 관찰된 분자간 응집체의 부족을 설명할 수 있는데, 이는 친핵성 아민이 근처 NLP의 헤드기들과 상호작용할 수 없기 때문이다. DOPE-MCC에 의한 apoE422K 지질화의 검출은 LCMS와 같은 고급 분석 기술을 사용하여 새로운 치료 전달 플랫폼을 평가하는 것의 중요성을 강조한다. 공정 관련 불순물을 조기에 감지하고 플랫폼 문제를 확인하여 새로운 플랫폼 기술을 성공적으로 개발하도록 촉진할 수 있다. 이 가교 이벤트는 기존의 분석 SEC 방법을 사용하여서는 검출되지 않았을 것이며, 이 부산물이 안정성 또는 활성에 유의미한 차이를 초래하는지 여부는 불확실하지만 변동성은 제어될 수 없으며 이외에도 제조상의 어려움을 초래할 수 있다.
Fab-NLP 접합체 정제 및 Fab 부하
DOPE-MCC:apoE422k 가교결합이 최소 내지 전혀 없고 상대적으로 동종 NLP 모집단안 조립 조건이 확립되었을 때, Fab-NLP 접합 방법을 추가로 최적화하였다. 무관한 세포질 표적(cMET)에 특이적인 토끼 Fab 분자를 이들 실험을 위한 대용 시약으로 사용했다. Fab-NLP 접합체의 생산 및 정제는 순차적 NLP 조립 및 접합 단계를 사용하여 수행되었으며, Fab는 NLP 정제 단계 없이 NLP로부터 바이오비드 기반 콜레이트 제거 직후에 추가되었다. 이러한 프로토콜은 접합 전에 말레이미드 가수분해 가능성을 최소화하기 위해 선택되었다. 20-35mol% 범위의 작용기 지질 조성물에 대한 최대 결합 효율을 보고한 이전의 연구들에 기반하여 확장시키기 위해 20mol% DOPE-MCC를 선택했다(31). 정제 프로토콜은 처음에 20의 Fab:NLP 몰 반응 비율에서 개발되었다. Fab를 2-3시간 동안 NLP와 함께 인큐베이션하고 NAC를 DOPE-MCC에 대해 2배 몰 농도로 첨가하여 미반응 말레이미드를 퀀칭시키고 DOPE-MCC:apoE422k 가교결합을 방지하였다.
그런 다음 Fab-NLP를 S200 SEC 컬럼을 통해 정제하고 SEC 프로파일에서 다음과 같은 3개의 주요 피크를 관찰했다; NLP-Fab 접합체(rt ~10분), Fab 이량체(rt ~14분), 비접합 Fab(rt ~16분)(도 2A). Fab 이량체의 출현은 접합 단계 동안 Fab의 C-말단 티올에서 이황화물 형성을 통한 이량체화에 의해 유발되었다. 흥미롭게도, 출발 물질에는 Fab 이량체(데이터는 표시되지 않음)가 포함되어 있지 않았으므로 이는 접합 단계 중에 발생한 것으로 보이며 다른 Fab에서 일관되게 관찰되지 않았으므로, 이 현상을 유발하는 고유한 특성(로컬 PI)이 존재할 수 있음을 시사하는 것이다. 그럼에도 불구하고 우리는 NLP에 대한 Fab의 성공적인 접합을 입증할 수 있었다.
NLP 피크에서 SEC-MALS에 의한 심층 분석은 풀링 전략을 유도하였다(도 2A 삽입부). 일반적으로 NLP 피크는 비교적 대칭적이며 Rh 값은 피크 전체에서 약간만 변화했는데, 피크의 앞쪽 끝(9 - 9.5분 머무름 시간)에서 가장 큰 변동(12.9 - 10.5nm) 그리고 피크의 중간과 끝 부분(9.5 - 10.25분 머무름 시간)에 걸쳐 가장 작은 변동(10.3 - 9.6nm)이 있었다(도 2A 삽입부). 따라서 가장 균일한 NLP-Fab 제형을 생성하기 위해 9.5-10.25분 사이의 샘플 분획을 풀링하여 LCMS 분석을 수행했다. Fab 단독 LCMS 분석은 머무름 시간이 ~5.4분인 TIC 크로마토그램에서 단일 피크를 산출했다(도 2B 원). 이 피크의 디컨볼루션된 질량은 ~45.7kDa였으며, 이는 Fab의 예상 질량에 해당한다. 이러한 머무름 시간(도 2B 삼각형) 이내에서 NLP-Fab 접합체 풀의 TIC 크로마토그램에서 2개의 피크가 관찰되었으며, 여기서 이러한 피크의 디컨볼루션된 질량은 DOPE-MCC:Fab 접합체(~46.7kDa) 및 apoE422k(도 2C, 삼각형)에 상응한다. 종합하면, 이러한 결과는 Fab가 DOPE-MCC 지질을 통해 NLP에 성공적으로 접합되었음을 시사한다.
NLP 플랫폼의 Fab 부하 용량을 추가로 조사하기 위해, 재료 및 방법에 설명된 대로 NLP를 Fab 농도를 증가시키면서 접합시키고 정제 단계 후에 NLP당 Fab의 수를 측정했다. 이 실험에서 Fab 반응 농도는 0 - 270 μM에서 변화했으며 이는 0 - 50 Fabs/NLP에 해당한다. 도 3A에 도시된 바와 같이, NLP 피크는 Fab 농도가 증가함에 따라 점진적으로 216 μM의 포화 수준까지 증가하였다. Fab 이량체 및 접합되지 않은 Fab 피크의 점진적인 증가는 216μM의 포화점까지 관찰되었으며, 이후 더 높은 농도(270μM)에서 상당한 증가가 관찰되었는데, 이는 NLP에 대한 접합이 포화되었고 216 μM 이상으로 추가된 모든 추가 시약은 NLP에 접합되지 않았음을 나타내는 것이다.
각 조건하에서 접합된 Fab의 양은 상기 설명한 대로 정량화되었다(도 3B). 더 낮은 Fab 농도(0-200 μM)에서 0-30 Fab/NLP의 Fab 부하의 선형 증가가 관찰되었다. 그러나 이러한 경향은 더 높은 Fab 농도(>200 μM)에서 평평해졌으며 ~30 Fabs/NLP 이상에서 NLP에 추가 Fab를 부하할 수 없었다. 공개된 결정 구조에 기초하였을 때, 일반적인 Fab의 단면 직경은 ~4 nm(56)이며, 이는 표면적 ~12.6 nm2에 해당하는 반면, SEC-QELS 분석에 기초하였을 때 NLP의 Rh 는 ~ 7.5 nm인 것으로 결정되었으며, 이는 총 결합 표면적 350 nm2에 해당하여 ~30 Fabs/NLP가 된다. 이 최대 부하 용량은 우리의 결과를 확증하여 주며 Fab 및 NLP 결합 표면의 크기를 고려할 때 이론적 최대 부하 용량과 일치한다.
NLP 구조에 대한 Fab 부하의 영향을 추가로 특성화하기 위해, Fab-NLP 접합체의 MW 및 Rh를 Fab 부하의 함수로 측정했다. Fab-NLP 접합체 피크 전반에 걸친 MALS 분석에 기초하였을 때 Fab-NLP 접합체의 MW는 더 높은 Fab 부하에서 증가했으며, 여기서 MW는 0 Fab 부하에서 ~225 kDa으로부터 30의 Fab:NLP 비율에서 ~900 kDa까지 증가했다(도 3C). 흥미롭게도, 이러한 MW의 증가는 HPLC 분석과 비교할 때 ~16 Fabs/NLP의 보다 낮은 부하 용량을 의미한다. 이러한 불일치는 계산에 영향을 줄 수 있는 유리 Fab에 대한 Fab-NLP 접합체의 dn/dc 값의 변화로 인한 것일 수 있다. HPLC 방법이 apoE422k 및 Fab 농도의 독립적인 측정이라는 점을 감안할 때 우리는 이러한 값이 Fab 부하를 보다 정확하게 반영한다고 생각한다.
이러한 불일치에도 불구하고, MALS 분석은 예상대로 Fab 부하에 따라 MW의 선형 증가가 존재함을 분명히 나타낸다. MW 분석과 달리 Rh는 Fab 부하가 증가함에 따라 크게 변하지 않았다(도 3D). 이러한 결과는 NLP의 원반형 특성과 일치하며 NLP 표면적이 Fab 원자가를 제어하는 주요 인자임을 나타낸다. 이 현상은 구형 단백질들이 NLP에 접합된 이전의 2개 연구에서 관찰되었다(20, 31). 두 실시예 모두에서, His-태그된 단백질이 니켈-킬레이트 지질을 함유하는 NLP에 부착되었고 도달된 최대 부하는 단백질 크기 및 NLP 표면적에 기초한 이론적인 결합 능력과 일치하는 수치였다. Rh 분석이 구형 모양을 가정한다는 점은 주목할 가치가 있으며, 이는 이러한 추정된 원반형 나노입자에 대해 완전히 정확하지 않을 수 있다. 그러나 용액 중에서 NLP 모양은 동적이며 NLP는 구형 입자를 더 많이 반사하는 정적 원반 모양 이외의 다양한 형태를 채택할 수 있음이 이전에 보고된 바 있으므로(57); 우리는 상기 설명한 MALS 분석을 합리적으로 신뢰한다.
실시예 3: NLP-Fab 접합체의 제조가능성
Fab-NLP 접합체의 유동학 분석
점도는 CP20-0.5o 콘(cone) 및 플레이트(plate) 구성부가 있는 Anton Paar Physica MCR 501 회전식 레오미터(rheometer)를 사용하여 측정되었다. CP20-0.5 형상은 직경이 20mm이고 각도가 0.5°이다. 측정은 레오미터 온도 조절기(수조로부터 순환하는 유체가 있는 Peltier 플레이트)를 사용하여 25°C에서 수행되었다. 약 20 μL의 각 샘플을 측정을 위해 바닥 플레이트에 부하한 후 콘을 원하는 간격 너비까지 천천히 내렸다. 측정된 토크는 전단 응력을 결정했으며, 이러한 전단 응력으로부터 이전에 설명한 바와 같이 점도가 계산되었다.
NLP 및 Fab-NLP 접합체의 동결건조
Fab-NLP 접합체는 부형제로서 80mM 트레할로스를 사용하여 동결건조되었다. 이것은 단백질 및 리포좀 제형 모두에 일반적으로 사용되는 부형제이다. 이들 실험에서 Fab-NLP 접합체는 PBS에서 정제되었다. 최종 농도 80mM까지 트레할로오스를 첨가하였다. 냉동 전 Fab-NLP 단백질 농도는 2mg/ml였다. Fab-NLP 샘플 300μL를 드라이아이스에서 60분 동안 인큐베이션하여 동결했다. 그런 다음 샘플을 Labconco 동결건조기에서 밤새 동결건조시켰다. 동결건조가 완료된 후 샘플을 물에서 재구성하고 SEC로 분석했다.
실시예 3에 대한 결과 및 논의
Fab-NLP 제형
나노입자-단백질 접합체의 생산과 관련된 알려진 문제는 제조 중의 제형이다. 특히, 단백질 농도와 점도 사이의 관계는 의약품 제조의 중요한 파라미터에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 이는 주입 용량이 각각 100μl(58) 및 1-2ml(59, 60)로 제한되는 안구 전달 및 피하 투여와 같이, 용량 제한으로 인해 고농도 약물 또는 단백질 제제가 필요할 때 특히 중요하다. 높은 단백질 농도에서 단백질-단백질 상호 작용은 점도의 증가를 초래할 수 있으며, 이는 배제된 용량의 증가로 인하여 다른 접합된 모이어티들의 존재에 의해 악화될 수 있다(61). 따라서 NLP 기반 전달이 점도에 미치는 영향을 평가하기 위해, Fab 농도와 점도 사이의 관계를 네이키드 Fab, Fab-NLP 접합체 및 Fab-PEG 접합체 간에 비교하였다(47)(도 4A). 이들 실험은 개선된 번역성을 위해 생물학적 활성 인간 항-인자 D Fab를 사용하여 수행되었다. Fab 원자가의 양상에서 더 나은 직접적인 비교를 허용하기 위해, 상업적으로 이용 가능한 PEG 스캐폴드를 선택했는데, 여기서 이 스캐폴드는 8개의 Fab/PEG의 접합을 가능하게 하는 말레이미드 반응성 말단을 포함하는 8개의 PEG 팔을 가졌다. 8개 팔의 PEG 접합체를 생성하고 특성화하는 단계에 관한 세부 내용은 다른 문헌에 설명되어 있다(47). Fab-NLP 접합체의 경우, Fab 부하는 ~30 Fab/NLP였으며, 이는 NLP에서 Fab 밀도를 최대화하도록 선택되었다.
이들 실험에서, Fab 단독의 점도는 테스트된 농도 범위 전체에 걸쳐 비교적 일정하게 유지되었다(도 4A 원). 대조적으로, Fab-PEG 접합체의 점도 프로필은 Fab 농도가 80-100 mg/ml 사이에 도달했을 때 ~1000 cP로 갑자기 증가했다(도 4A 삼각형). 유사한 프로파일이 Fab-NLP 접합체에서 관찰되었지만, 점도의 기하급수적 증가가 발생했던 Fab 농도는 훨씬 더 높았다(> 300 mg/ml)(도 4A 사각형). 이러한 결과는 보다 전통적인 PEG 기반 접근법에 비해 NLP 플랫폼을 사용하여 훨씬 더 높은 Fab 제제 농도를 달성할 수 있음을 나타낸다. Fab가 NLP 제제에서 전체 약물 제품의 ~30 질량%만을 구성하는 반면 Fab-PEG 접합체에서 Fab 함량은 ~90 질량%라는 점을 감안할 때 이러한 발견은 놀라운 것이다. 이러한 현상이 관찰된 것에 대한 한 가지 가능한 이유는 NLP 표면의 Fab 정렬이다. 높은 단백질 농도에서의 점도는 분자내 단백질 상호작용과 단백질의 패킹 능력에 의해 유발되므로, NLP 표면에 대한 고밀도 Fab의 접합은 PEG 8량체 형식에서는 이루어질 수 없는 정렬을 유도하는 것이 타당하다.
고농도 제제와의 호환성 이외에도 Fab-NLP 접합체는 동결 건조 시 강력한 거동을 나타냈다. 이들 실험에서, Fab-NLP 접합체는 ~18 Fab/NLP의 Fab 부하에서 생성되었고, 5 mg/ml 농도의 80 mM 트레할로스의 존재 하에 동결건조되었고 SEC-MALS에 의해 분석되었다. 트레할로스는 리포좀 그리고 적혈구의 동결 건조에 널리 사용되어왔기 때문에 부형제로 선택되었다(62, 63). 도 4B에 도시된 바와 같이, 동결건조 전 및 후의 MW 및 Rh는 거의 변화를 나타내지 않았으며, 이는 Fab-NLP 접합체가 매우 안정적이라는 개념을 뒷받침한다. 동결건조 시의 안정성은 연장된 저장 수명 이외에도 확립된 제조 공정과의 호환성으로 인해 바람직한 제형 특성ㅇ;다(64). 이러한 결과는 트레할로오스가 지질-기반 나노입자 제제를 위한 우수한 부형제라는 이전 보고들과 일치하며 Fab-NLP 접합체가 동결건조 기반 제제를 필요로 하는 제조 공정과 호환될 수 있음을 확인시켜 준다.
실시예 4: NLP-Fab 접합체의 활성
항-인자 D Fab 차단 활성 분석
Fab-NLP 접합체의 활성은 이전에 기술된 바와 같이 인자 B 절단 TR-FRET 분석으로 결정되었다(47, 49). 접합체 몰농도는 Fab 억제 인자 D에 관한 예상 1:1 화학양론을 고려하여 다량체 MW 대신 Fab MW를 사용하여 계산되었다.
항-OX40 Fab 작용제 활성 분석
OX40 작용제 분석은 이전에 설명된 바와 같이 수행되었다(45). 요컨대, NFkB 루시퍼라제 리포터로 조작된 OX40 과발현 Jurkat 세포를 384-웰 조직 배양 플레이트(Corning Inc., cat# 3985BC)에서 10% FBS를 함유하는 20μl RPMI 1640 배지에 80,000개 세포/웰로 시딩하였다. 항-OX40 형식을 배지에서 4X 농도로 연속 희석하고 농축된 항체 10μl를 각 웰에 첨가했다. 모든 웰 부피를 40 μl로 만들고 37°C, 5% CO2의 CO2 인큐베이터에서 16-18시간 동안 배양했다. 그런 다음 Bright Glo(Promega cat# E2610) 40μl를 각 웰에 첨가하고 실온에서 10분 동안 진탕하면서 배양했다. 발광은 Perkin Elmer Envision 플레이트 판독기를 사용하여 검출되었다.
실시예 4에 대한 결과 및 논의
Fab-NLP 접합체의 억제 및 작용제 활성
경우에 따라 나노입자에 대한 단백질의 접합 및 고정화는 단백질 활성에 부정적인 영향을 미칠 수 있다(65, 66). 이러한 부정적인 영향은 접합 시 구조 변화, 거동의 자유 상실 및 단백질 변성을 포함한(그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 인자들에 기인할 수 있다. Fab-NLP 접합의 경우, 임의의 배향으로의 접합을 방지하기 위해 부위 특이적 화학을 사용하고 접합 핸들을 Fab의 활성 영역(중쇄 및 경쇄의 가변 도메인)의 반대쪽 단부(중쇄의 C-말단 영역)에 배치하여 이러한 문제를 완화하는 것을 목표로 했다. 그러나 이것은 Fab와 NLP의 접합이 활성에 어떠한 영향도 미치지 않는다는 것을 보장하지는 않는다. 따라서, Fab 접합의 효과를 평가하기 위해 보체 인자 D-의존성 인자 B 절단의 시간-분해된 형광 에너지 전달(TR-FRET) 분석법을 사용하여 항-인자 D Fab의 억제 활성을 측정하였다. 최대 TR-FRET 신호는 인자 D 활성이 없는 상태에서 인자 B가 온전한 상태로 남아 있을 때 발생한다. 본 분석에서는 항-인자 D Fab 단독, Fab-NLP 접합체 및 동결건조 및 재구성된 Fab-NLP 접합체에 의한 인자 D 억제를 측정했다(도 5A). 3가지 시약 모두에서 억제 활성의 유의한 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 접합 및 동결건조로 인한 억제 손실이 없음을 입증한다. 이러한 발견은 일반적으로 C-말단 시스테인 태그를 통한 Fab의 접합이 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역의 활성에 상당한 영향을 미치지 않을 것임을 나타낸다.
Fab의 억제 활성에 대한 접합의 효과를 평가하는 것 외에도 더 높은 원자가를 통해 작용제 Fab 활성을 향상시키기 위해 이 플랫폼을 사용할 가능성도 평가했다. TNF 계열 구성원을 포함하여 몇 가지 임상적으로 중요한 작용제 경로들은 강력한 활성을 위해 2 이상의 원자가를 필요로 한다(41, 42). mAb 분야에는 트리아바디, 테트라바디, 펜타바디 및 자기조립 헥사머 IgG1의 개발을 포함한 다양한 공학적 전략을 사용하여 이러한 한계를 해결하고자 하는 시도가 있어왔다(43-45). 그러나 이러한 공학적 전략은 PK에 부정적인 영향을 미치는 것으로 보고되었으며 3-6 이상의 원자가를 달성하기가 어려운데, 이는 관심 경로를 작용/길항하기에 충분하지 않을 수 있다(43).
따라서 우리는 다음으로 더 높은 원자가를 필요로 하는 것으로 알려진 경로를 작용시키기 위해 Fab-NLP 접합 플랫폼을 사용할 가능성을 테스트하고 싶었다. OX40 TNF 계열 수용체는 작용제 활성을 유도하기 위해 더 높은 원자가를 필요로 하는 것으로 보고된 바 있다. 최근 간행물에서, 원자가 4에 대해 중간 정도의 작용 활성이 보고되었으며 매우 강력한 활성은 12의 원자가를 갖는 6량체 IgG 형식에 대해서만 관찰되었다(45). 따라서 OX40 수용체는 작용제 활성에 대한 Fab-NLP 원자가의 효과를 평가하기 위한 모델 시스템으로 사용되었다. Fab-NLP 접합체는 0에서 30 범위의 OX40 Fab 대 NLP 몰비에서 생성되었고 작용제 활성은 OX40을 과발현하는 Jurkat NFkB 루시퍼라제 리포터 분석에서 측정되었다(도 5B). 전장 항-OX40 huIgG1 mAb(원자가 2)를 음성 대조군으로 사용했다. 예상한 바와 같이, 테스트된 전체 농도 범위에 걸쳐 항-OX40 huIgG 또는 NLP 단독에서는 활성이 관찰되지 않았다(도 5B - 각각 삼각형 및 십자 표시). Fab-NLP 접합체의 경우, 3.8의 Fab 원자가에서 낮은 수준의 작용제 활성이 관찰되었다(도 5B - 별표). 대조적으로, 원자가가 8.3 Fabs/NLP로 증가했을 때 매우 강력한 활성이 관찰되었으며(도 5B - 사각형) 그보다 높은 원자가에서는 약간의 활성 증가만이 관찰되었다. 이러한 결과는 강한 효능을 위한 최소 원자가가 약 8이고, 이는 원자가가 4와 12인 분자들의 작용제 활성을 비교하는 전술한 연구들과 일치하는 결과임 시사한다(45). 도 5B의 데이터는 NLP 농도가 아닌 Fab 농도와 관련하여 표시되었음에 주목할 필요가 있다. NLP 농도를 기반으로 데이터를 분석할 때 Fab 원자가가 3.8에서 29.4로 증가함에 따라 Fab/NLP 복합체의 곡선(도 5C) 및 상응하는 EC50(도 5D)이 ~4 계수만큼 감소했다. 이러한 발견은 Fab-NLP 접합체의 전반적인 효능이 원자가가 증가함에 따라 증가했음을 시사한다. 결론적으로 이러한 발견은 이 플랫폼을 성공적으로 사용하여, 조작된 mAb 플랫폼을 사용하여 달성할 수 없는 높은 원자가를 필요로 하는 경로를 강력하게 활성화할 수 있음을 입증한다.
실시예 5: NLP-Fab 접합체의 혈청 안정성
AF488로 NLP 및 Fab-NLP 표지화
NLP 및 Fab-NLP 접합체를 전술한 바와 같이 생성하였다. 네이키드 NLP 또는 Fab-NLP 접합체의 SEC 정제 전에 샘플을 5의 NHS-AF488: 총 단백질 비율에서 2-4시간 동안 NHS 활성화된 AF488과 함께 인큐베이션함으로써 유리 리신을 통해 AF488로 표지하였다. 이 인큐베이션 기간 후, 미반응 NHS-AF488은 반응에서의 총 NHS-AF488 대비 2X 몰 과량의 Tris를 첨가하여 퀀칭시켰다. AF488 표지된 NLP는 S200 10/300 Increase 컬럼을 사용하는 AKTA Avant 시스템에서 SEC에 의해 미반응 AF488로부터 정제되었다.
50% 혈청에서 NLP 및 Fab-NLP 접합체의 SEC 분석
AF488 표지된 NLP 및 Fab-NLP 접합체를 50% 혈청을 함유하는 PBS 완충액에서 인큐베이션하고 PBS 완충액에서 배양 후 다양한 시점에서 SEC(Acclaim SEC 1000, Thermo Fisher Scientific)로 분석했다. 표지된 NLP 샘플의 흡광도는 혈청 단백질 및 구성성분들의 흡광도 간섭을 피하기 위해 495nm의 파장에서 모니터링되었다. 6-9분 사이에서 관찰된 피크는 NLP 및 NLP-Fab 접합체로 인한 것이었으며 10-13분 사이의 피크는 NLP로부터 해리된 유리 비접합 Fab 또는 apoE422k로 인한 것이었다. 테스트된 다양한 시점에서 NLP 피크 아래 영역을 0시간에서의 피크 영역에 대해 정규화하고 이러한 정규화된 값을 사용하여 NLP 분해 동역학을 결정했다.
실시예 5에 대한 결과 및 논의
Fab-NLP 혈청 안정성
복잡한 생물학적 매트릭스에서 안정성이 낮은 다른 NLP 구조들에 대한 보고에도 불구하고 본 발명의 NLP 플랫폼은 생체 내 전달 수단으로 사용될 수 있다(20, 67, 68). 이전의 한 연구에서, 37°C, 50% 혈청에서 DOPC NLP의 반감기는 3-6시간으로 보고되었으며(20), 이는 나노입자의 전신 반감기(24-48시간)보다 유의하게 더 낮다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 이전 연구에서 전체 NLP 안정성에 대한 가교 가능한 지질 구성성분의 효과를 평가했으며 이중층 코어를 가교시키면 안정성이 크게 향상되었음을 입증했다(68). 보다 구체적으로, 100% 혈청에서 48시간 동안 NLP 분해가 관찰되지 않은 반면, 가교결합이 없는 경우 매우 빠른 분해(~10분)가 관찰되었다(68). 비록 유망하지만, 이 방법의 단점 중 하나는 알려진 자연 분해 또는 생체 변환 경로가 없는 비천연 가교 지질의 추가로 인해 안전성 위험이 증가한다는 것이다.
생체내 전달 비히클로서의 적용에서 NLP 안정성의 중요성을 고려하여, 토끼 Fab 대용 분자를 사용하여 생체내 조건을 모방하도록 선택된 50% 혈청에서 NLP-Fab 접합체 안정성을 평가하였다. NLP 안정성 및 무결성을 평가하기 위해, Fab-NLP 접합체를 AF488로 표지하고 495nm의 흡광도에서 SEC로 분석했는데, 이 흡광도는 혈청/NLP-Fab 샘플의 구성성분 및 혈청 단백질의 고유 흡광도와 중복되지 않는 분광광도 시그니처로 인해 선택되었다. NLP 단독의 예시 SEC 궤적을 도 6A에 도시한다. 온전한 NLP의 머무름 시간(~8분)은 해리된 NLP에서 방출된 유리 apoE422k(각각 8분 대 11.75분)와 구별되었으며, 따라서 NLP의 안정성과 무결성은 시간이 지남에 따라 SEC에 의해 쉽게 추적될 수 있다. ~6.25분의 머무름 시간에서 관찰된 경미한 숄더 피크는 혈청 내 응집으로 인한 것이었으며 분석을 위해 배경을 뺀 것이라는 점에 주목할 필요가 있다.
Fab 부하가 안정성에 미치는 영향을 평가하기 위해, 다양한 양의 Fab(0, 2, 7, 16 및 32 Fab/NLP)를 보유하는 Fab-NLP 접합체를 AF488로 표지하고 37°C에서 50% 혈청에서 인큐베이션하여 0 - 24시간 범위의 다양한 시점에서 SEC로 분석하였다. Fab-NLP SEC 피크 면적은 상이한 Fab-NLP 접합체 전반에 걸친 비교를 가능하게 위해 시간 0h에서의 피크 면적에 대해 정규화되었다. 이전에 발표된 연구(20, 67)와 일관되게, NLP 단독(도 6B 삼각형)은 빠르게 분해되어 처음에 3시간 후에 재료의 50%만 남았으며, 이후 나머지 24시간 인큐베이션 기간 동안은 보다 느리게 분해되었다. Fab:NLP 부하 밀도 2의 Fab-NLP 접합체에서도 매우 유사한 경향이 관찰되었다(도 6B 원). 그러나 Fab:NLP 부하 밀도가 7로 증가했을 때 NLP 안정성의 상당한 개선이 관찰되었는데(도 6B, 사각형), 이때 초기 시그니처의 빠른 안정성 감소는 관찰되지 않았으며 대신 느린 점진적 감소가 전체 24시간 동안 우세하였고, Fab-NLP의 63%는 37°C의 50% 혈청에서 인큐베이션 후 온전하게 남아 있었다. 16 및 32의 Fab:NLP 부하 밀도에서도 유사한 경향이 관찰되었으며(각각 도 6B 별 및 다이아몬드), 이때 안정성의 추가 증가가 검출되었고 24시간 인큐베이션 기간 종료시 Fab-NLP 접합체의 70% 이상이 온전하게 남아있었다.
Fab-NLP 접합체의 향상된 안정성은 NLP 표면에 대한 접근이 분해와 연결되어 있고 접합된 Fab가 NLP를 혈청 단백질로부터 보호할 수 있음을 시사한다. NLP의 소수성 지질 이중층 코어와 함께, 알부민과 같은 혈청 단백질 뿐만 아니라 천연 HDL 및 LDL 입자와의 상호 작용은 생체 내 또는 시험관 내 혈청 조건에서 NLP 분해의 주요 동인인 것으로 여겨진다. 이러한 상호 작용은 NLP를 조립된 상태로 그리고 온전하게 유지하는 지질-지질 및 지질-아포지단백 소수성 반 데르 발스 상호 작용을 방해하는 것으로 여겨진다. 이 가설은 지질 이중층 코어(68) 또는 아포지단백질(69)을 가교결합하면 NLP 안정성이 크게 개선되는 것으로 나타난 이전 연구에 의해 추가로 뒷받침된다. 이러한 결과에도 불구하고 혈청 프로테아제 활성이 NLP 안정성에 미치는 영향에 대해서는 덜 알려져 있다. 아포지단백질이 혈청 단백질에 의해 절단되어 나노입자 분해가 일어날 가능성이 있다. 그러나 NLP 표면에 대한 Fab 접합과 지질 이중층 코어 및 아포지단백의 가교결합이 안정성을 향상시키는 것으로 나타났음을 고려하면, NLP 분해의 주요 동인은 아포지단백질의 혈청 프로테아제 분해와 반대로 반 데르 발스 상호작용의 파괴인 것 같다. 놀랍게도, 상대적으로 낮은 Fab 밀도 7에서 상당한 안정성 개선이 관찰되었으며, 이는 ~25%의 표면적 커버리지에 해당한다(Fab 표면적을 ~2.2 nm2로 가정). 이러한 데이터는 최소한의 표면 보호 단백질이 NLP 안정성에 유의한 영향을 미치기에 충분하다는 것을 시사한다. 중요한 것은 이것이 비천연 가교제를 사용하지 않고 달성된다는 것이다.
생체 내 약물 전달 비히클로 NLP를 사용할 때 예상되는 어려움 중 하나는 혈청과 같은 복잡한 생물학적 매트릭스에서의 입자의 전반적인 안정성이었다. 그러나, 상기 설명한 결과에 기초할 때, 이 문제는 놀랍게도 ~ 7 Fabs:NLP의 임계값보다 높은 Fab 부하 밀도에서 Fab-NLP 접합체로서 조립될 때 완화되는 것으로 보인다. 따라서 Fab-NLP 접합체를 전달하는 동안 안정성을 달성하기 위해 추가적인 독성 문제를 일으킬 가능성이 있는 지질 가교와 같은 변형이 필요하지 않다.
요약 :
본 연구에서는 Fab-NLP 접합체의 개발, 최적화 및 특성화에 대해 설명한다. NLP는 C-말단 시스테인이 있는 Fab에 대한 접합을 위해 말레이미드 반응성 지질로 생성되었다. 말레이미드 반응성 지질은 pH 7.4에서 조립될 때 대부분 리신 잔기를 통해 아포지단백에 접합되는 것으로 나타났다. 그러나 이러한 바람직하지 않은 반응은 NLP가 pH 6에서 조립되었을 때 관찰되지 않았다. 부위 특이적 Fab 접합 조건이 최적화되었고 NLP당 최대 30개의 Fab 접합이 입증되었다. 흥미롭게도, 더 많은 수의 Fab의 접합은 NLP 유체역학적 반경(즉, NLP 직경)에 최소한의 영향을 미치고 NLP 분자량에 유의한 영향을 미쳤으며, 이는 입자 크기가 주로 NLP의 원반형 모양에 의해 결정됨을 나타내는 것이다.
Fab-NLP의 제조가능성을 평가하기 위해 Fab-NLP 점도 및 이의 동결건조시 안정성을 평가하였다. 즉, Fab-NLP 플랫폼과 확립된 제조 공정의 호환성을 다음 두 가지 방식에 의해 평가했다: 제조 중 관련된 Fab 농도 범위에 걸쳐 또 다른 다량체화 기술(Fab-PEG 8량체 접합체)과 이의 점탄성 거동을 비교하는 것 그리고 이의 동결 건조시 안정성을 평가하는 것. 또 다른 다원자가 형식(Fab-PEG 접합체)에 비해 유의하게 더 높은 Fab 농도가 Fab-NLP 접합체에서 구현되었고 동결건조는 어떠한 안정성 또는 활성 원인도 나타내지 않았다. 더욱이, NLP에 대한 Fab 접합은 억제제 및 작용제 설정에서 Fab 활성에 영향을 미치는 것으로 밝혀지지 않았으며, 효능을 위해 높은 원자가를 필요로 하는 작용제 경로를 활성화하기 위해 Fab 부하 용량을 활용할 수 있었다. 마지막으로, Fab-NLP 접합체의 안정성을 50% 혈청에서 평가하였었고 Fab-NLP는 Fab-NLP의 >63%가 7 이상의 입자당 Fab 비율에서 24시간 후에 온전하게 남아 있는 증가된 안정성을 입증했다. 우리의 발견은 Fab-NLP를 다원자가 형식의 Fab를 표적화 전달하기 위한 플랫폼으로 설정하고 Fab-NLP가 기존의 제조 공정과 호환가능함을 확인했다.
본 연구의 종합 결과는 NLP가 Fab 또는 Fab 유사 분자의 다량체화에 매우 적합한 잘 작동하는 다목적 플랫폼임을 입증한다. 이러한 결과는 NLP가 다원자가 형식의 Fab를 표적화 전달하는 데 놀랍도록 유용한 플랫폼이며 확립된 제조 공정과 호환가능함에 대한 증거가 된다.
실시예 1-5에 관한 참고문헌
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실시예 6: 실시예 7-11의 재료 및 방법
재료
실시예 7 내지 11에서 사용된 시약은 실시예 1에서 논의된 바와 같이 얻었다.
apoE422k 및 Fab의 단백질 발현 및 정제
ApoE422k는 확립된 발현 플라스미드 및 방법들을 사용하여 이전에 기재된 바와 같이 진탕 플라스크 조건하에 대장균 세포에서 발현되었다(아래 참고문헌 18 및 19 참조). 요약하면, 6x His 태그가 있는 apoE422k가 발현되었고 Ni-NTA 컬럼(XK16/20 3ml)에 이어 크기 배제 크로마토그래피(SEC)(Superdex 75 16/60)로 정제되었다. 컬럼을 세척하고 단백질을 50mM 인산염 완충액, 200mM NaCl, 10mM 이미다졸, pH 8(완충액 A)에 결합시켰다. 컬럼에 결합된 단백질을 완충액 A + 0.2% Triton X114 + 0.2% Triton X100으로 광범위하게(20 컬럼 부피) 세척하고 50mM 인산염 완충액, 200mM NaCl, 400mM 이미다졸(pH 8)로 용리시켰다. 용리된 피크로부터 수집된 분획들을 여과시키고 3kDa 분자량 컷오프 스핀 농축기로 농축시켰다. Tobacco Etch 바이러스 핵 포함-a 엔도펩티다제(TEV 프로테아제) 소화를 통해 His 태그를 제거했다(TEV 태그는 His 태그와 단백질 서열 사이의 N-말단에 추가됨). TEV 프로테아제를 100:1의 apoE422k:TEV 중량비로 첨가하였다. 절단된 단백질은, His 태그를 포함하는 TEV 프로테아제로부터 반응 혼합물을 Ni-NTA 컬럼(XK 16/20 3 ml)에 통과시켜 정제되었다. 풀링된 단백질을 농축시키고 PBS에서 SEC(Superdex 75 16/60)를 실시하였다. SEC 분획을 수집하고 단백질 동일성 및 응집에 대해 각각 질량 분석법 및 SEC로 분석했다. 정확한 분자량(MW) 및 응집 (<5%)을 가지는 분획을 모으고 280에서의 흡광도로 단백질 농도를 결정했다.
CKP-NLP에 대한 부위 특이적 접합을 가능하게 하기 위해 C-말단 시스테인을 사용하여 Fab 구조체를 설계했다(간단히 "Fab"라고 함). CKP-NLP에 대한 Fab 접합은 대용물로서 인간 항-인자 D(AFD) Fab를 사용하여 평가되었고, 이는 이전에 기술된 바와 같이 정제되었다(아래 참고문헌 18 참조). 모든 정제된 Fab를 20mM DTT를 사용하여 탈시스테인화시켜 시스테인 접합체를 감소시키고 6.5mM 글루타티온(GSH)으로 재산화시켰다. 그런 다음 샘플을 완충액 교환하고 세척하고 200mM 아르기닌 숙시네이트 pH 5에 저장하여 추가 시스테인화를 제한했다.
C16-EETI-II의 합성 및 특성화.
선형 EETI-II 또는 EETI-II-C16 펩티드는 아래 참고문헌 20에 기술된 바와 같이 고체 상에서 표준 9-플루오레닐메톡시카르보닐 프로토콜을 사용하여 화학적으로 합성되었다. 최적의 폴딩 조건은 소규모 폴딩 분석 및 LC-MS 분석을 사용하여 확인되었다. 얻어진 미정제 선형 펩티드를 0.5 mg/ml로 최적의 폴딩 완충액(0.1M 암모늄 바이카보네이트, pH 9.0, 2mM 환원된 글루타티온, 0.5mM 산화된 글루타티온, EETI-II에 대한 4% DMSO; 0.1M 암모늄 바이카보네이트, pH 9.0, 1mM 환원된 글루타티온, C16-EETI-II의 경우 50% DMSO)에서 실온에서 24시간 동안 진탕하면서 산화시켰다. C18 Sep-Pak(Waters, cat # WAT043345)을 사용하여 과량의 염을 제거하고 동결건조된 생성물을 EETI-II용 C18 컬럼(간단히 "CKP"라 함) 및 EETI-II-C16용 C4 컬럼(간단히 "CKP-C16"이라 함)을 사용하는 RP-HPLC(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)로 정제했다. 정제된 펩티드의 정체는 LC-MS 시스템(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 사용하여 확인되었고 순도는 > 95%인 것으로 확인되었다.
CKP-NLP 조립 및 정제
CKP가 NLP에 통합되도록 하기 위해 CKP에 C16 지방산 태그(CKP-C16)를 상기 설명한 바와 같이 부가하였다. 이전에 기술된 바와 같이, 소수성 태그로 합성된 분자를 이용한 NLP 통합은 분자를 NLP 표면에 효과적으로 고정시키는 지질 이중층의 코어 내부에서 소수성 태그의 분획화에 기반한다(아래 참고문헌 9, 10 참조). CKP-NLP는 이전에 설명된 대로 (약간 수정) 조립되었다(아래 참고문헌 9, 10, 18 참조). 간략하게, 조립하는 동안 총 지질 대 apoE422k 몰비는 80:1이었고, 이는 비교적 균질한 NLP 모집단을 생성하는 것으로 이전에 밝혀졌다(아래 참고문헌 6, 11, 19, 21 참조). CKP-NLP는 아래 실시예에 기재된 바와 같이 지시된 몰비의 DOPC 및 CKP-C16(Fab 접합 없음) 또는 DOPC, DSPE-PEG-Mal(Fab 접합) 및 CKP-C16으로 조립되었다. 이들 지질은 클로로포름 또는 메탄올에서 준비되거나 수득되고 에펜도르프 튜브에 분취량으로 저장되었다. 클로로포름은 N2 스트림하에 교반하면서 제거되어 얇은 지질 필름을 형성했다. 지질을 80mM 소듐 콜레이트를 사용하여 50mM 소듐 포스페이트 완충액, pH 6.0, 150mM NaCl에 용해시켰다. apoE422k(최종 어셈블리 부피 150μM)를 첨가한 후 샘플을 실온에서 최소 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 그런 다음 500μL costar 0.22μM 스핀 필터에서 2시간 동안 흔들면서 바이오비드(Sigma-Aldrich)와 함께 인큐베이션하여 콜레이트를 제거했다. 2시간 동안 흔든 후 샘플을 200g에서 5분 동안 원심분리하고 NLP를 포함하는 여과액을 수집했다. Fab 접합에 사용되지 않을 CKP-NLP는 AKTA Avant 시스템 및 S200 10/300 Increase 컬럼을 사용하여 SEC를 통해 정제되었다. Fab-CKP-NLP 접합체를 생성하는 데 사용될 CKP-NLP는 SEC 정제 전에 먼저 아래에 설명된 바와 같이 Fab에 접합되었다.
Fab-CKP-NLP 접합 및 정제
Fab는 이전에 기술된 바와 같이(약간 변형됨) CKP-NLP에 접합되었다(아래 참고문헌 18 참조). 간략하게, 콜레이트 제거 단계 후, CKP-NLP에 대한 apoE422k 농도를 아래 기재된 바와 같이 HPLC에 의해 결정하였다. 티올 함유 Fab는 50mM 소듐 포스페이트 완충액, pH 6.0, 150mM NaCl에서 0-160 범위의 Fab:NLP 몰비에서 말레이미드 작용기화된 CKP-NLP에 접합되었으며, 몰비는 apoE422k 농도 및 4 apoE422k/NLP 가정에 기반하여 계산되었다(아래 참고문헌 6 참조). 이 접합 완충액은 이전에 기술된 바와 같이 말레이미드와 apoE422k 간의 NLP내 가교결합을 제한하기 위해 선택되었다(아래 참고문헌 18 참조). 접합 반응은 말레이미드의 가수분해를 제한하기 위해 CKP-NLP가 조립된 당일에 항상 수행되었다. 2-4시간의 반응 인큐베이션 기간 후, n-아세틸시스테인(NAC)을 DSPE-PEG-MCC에 대해 2배 몰 과량으로 첨가하여 임의의 미반응 말레이미드를 퀀칭시켰다. 생성된 Fab-CKP-NLP 접합체를 AKTA Avant 시스템 및 S200 10/300 Increase 컬럼을 사용하여 정제했다. Fab-CKP-NLP 피크에 걸친 각 분획은 아래에 설명된 바와 같이 SEC-MALS에 의해 분석되었다. 가장 균질한 Fab-CKP-NLP 샘플을 얻기 위해 MW 및 유체역학적 반경(Rh) 분석에 기반하여 분획들을 풀링하였다.
CKP-NLP에 대한 부위 특이적 접합을 가능하게 하기 위해 C-말단 시스테인으로 조작된 인간 항-인자 D(AFD) Fab(간단히 "Fab"라 함)를 모델 Fab로 사용했다. Fab는 이전에 기재된 바와 같이 발현되고 정제되었다(아래 참고문헌 18, 22). 정제된 Fab를 20mM DTT로 환원시켜 발현 및 정제 동안 형성되는 시스테인 또는 GSH 접합체를 제거한 다음, 6.5mM 글루타티온(GSH)을 사용하여 재산화시켜 시스테인이 말레이미드 작용기화된 CKP-NLP에 접합되지 않도록 했다. 샘플을 완충액 교환하고 세척하고 200mM 아르기닌 숙시네이트 pH 5에 저장하여 추가 시스테인화를 제한했다.
CKP-NLP 및 Fab-CKP-NLP 접합체의 HPLC 분석
CKP-NLP 및 Fab-CKP-NLP 접합체의 ApoE422k, CKP 및 Fab 농도를 Agilent 1290 Infinity Bio-비활성 HPLC를 사용한 HPLC로 분석했다. 80°C로 가열된 Kinetex 2.6μm XB-C16 컬럼(Phenomenex)을 사용하여 주입된 NLP 샘플을 분석했다. 용매는 30% 메탄올, 70% 물 및 0% 2-프로판올의 혼합물로부터 100% 2-프로판올까지의 구배로 전개되었다. 모든 용매에는 0.05% 트리플루오로아세트산이 있었다. 구배는 모든 구성성분들을 분리할 수 있도록 최적화되었다. Fab-CKP-NLP 접합체의 경우, 이러한 구배 및 완충액 조건으로는 온전한 Fab가 유리 apoE422k로부터 분리될 수 없기 때문에 감소된 조건이 필요했다. ApoE422k, Fab 및 CKP-C16 농도는 각 구성성분 1-16μg을 주입하고 곡선 아래 영역을 적분하여 생성된 표준 곡선을 기반으로 결정되었다. A280 UV 신호와 증발 광산란 검출기(ELSD) 신호를 기반으로 표준 곡선을 생성했다.
CKP-NLP 및 Fab-CKP-NLP 접합체의 LCMS 분석
CKP-NLP 및 Fab-CKP-NLP 접합체의 LCMS 분석은 Agilent 6230 ESI-TOF LC/MS를 사용하여 수행되었다. 80°C로 가열된 Kinetex 2.6μm XB-C18 컬럼(Phenomenex, Torrance, CA)을 사용하여 주입된 NLP 샘플을 분석했다. 용매는 30% 메탄올과 70% 물의 혼합물로부터 100% 2-프로판올까지의 구배로 전개되었다. 모든 용매에는 0.05% 트리플루오로아세트산이 있었다.
CKP-NLP 및 Fab-CKP-NLP 접합체의 SEC-MALS/QELS 분석
MW 및 Rh는 이전에 기술된 바와 같이 결정되었다(아래 참고문헌 18). 간략하게, 다중 각도 광산란 시스템(MALS)(Wyatt Instruments, Santa Barbara, CA)과 결합되고, 포스페이트 완충 식염수(PBS)가 등용매 구배된(추가 150mM NaCl 포함) Acclaim SEC-1000 분석 SEC 컬럼(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에 샘플들을 주입하였다. 확산 계수(D)는 99.0o 각도에서 단일 광자 계수 모듈을 사용하여 산란된 레이저 광의 강도 변동을 포착하는 준 탄성 광 산란법(QELS)을 사용하여 측정되었다. 스톡스-아인슈타인 관계를 사용하여 D로부터 Rh를 계산하였다. 스톡스-아인슈타인 관계는 구형 모양을 가정하며 NLP는 TEM 및 AFM 분석에 의해 구형이 아닌 원반형이다(아래 참고문헌 6 참조). 따라서 추정된 Rh는 NLP와 동일한 확산 계수를 갖는 구에 해당한다. 그러나 용액에서의 NLP 모양은 매우 역동적인 것으로 최근 보고되었으며, 이때 NLP는 구형 입자를 더 많이 반사하는 정적 원반형 모양 이외에도 여러 다양한 형태를 채택할 수 있다(아래 참고문헌 18, 23). 이러한 이유로 본 분석에서 얻은 Rh 값은 정확하다고 추정된다.
트립신 효소 분석
분석은 이전에 기술한 바와 같이(약간 수정) 수행하였다(아래 참고문헌 2 참조). 간략하게, 펩티드 NLP 접합체를 지시된 농도에서 실온에서 30분 동안 트립신(2 nM)과 함께 인큐베이션하였다. 기질 L-아르기닌-7-아미도-4-메틸쿠마린(L-Arg-AMC)(75μM)을 혼합물에 첨가하고 단백질 분해 활성을 즉시 측정했다. 샘플을 3중으로 실험하고 2회 반복했다. KaleidaGraph 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석했다.
AF488로 CKP-NLP 및 Fab-CKP-NLP 접합체 표지화
CKP-NLP 및 Fab-CKP-NLP 접합체를 상기 기재된 바와 같이 생성하였고, SEC 정제 전(콜레이트 제거 후) 샘플들을 NHS-AF488: 총 단백질 비율 5에서 2-4시간 동안 NHS 활성화된 AF488과 함께 인큐베이션함으로써 유리 리신을 통해 AF488로 표지하였다. 이후 반응하지 않은 NHS-AF488은 반응에서의 총 NHS-AF488 대비 10X 몰 과량의 Tris-HCl 완충액(pH 8)을 첨가하여 퀀칭시켰다. AF488 표지된 NLP는 상기 기술한 바와 같이 S200 10/300 Increase 컬럼을 사용하는 AKTA Avant 시스템에서 SEC에 의해 미반응 AF488로부터 정제되었다.
50% 혈청에서 CKP-NLP 및 Fab-CKP-NLP 접합체의 SEC 분석
AF488 표지된 CKP-NLP 및 Fab-CKP-NLP의 분해를 이전에 기술된 바와 같이 분석하였다(아래 참고문헌 9, 18, 24 및 25 참조). AF488로 표지된 CKP-NLP 및 Fab-CKP-NLP 접합체를 50% 혈청을 함유하는 PBS 완충액(pH 7.4)에서 인큐베이션하고 SEC(Acclaim SEC 1000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)로 분석했다. 표지된 NLP 샘플의 흡광도는 혈청 단백질 및 구성성분들의 흡광도 간섭을 피하기 위해 495nm의 파장에서 모니터링되었다. 5-5.5분 사이에서 관찰된 피크는 CKP-NLP 및 Fab-CKP-NLP 접합체로 인한 것이었으며 6-6.5분 사이의 피크는 NLP로부터 해리된 유리 비접합 Fab 또는 apoE422k로 인한 것이었다. 테스트된 다양한 시점에서 NLP 피크 아래 영역을 0시간에서의 피크 영역에 대해 정규화하고 이러한 정규화된 값을 사용하여 CKP-NLP 및 Fab-CKP-NLP 분해 동역학을 결정했다.
실시예 7: CKP-NLP의 조립, 정제 및 특성화
시스틴 매듭 펩티드 EETI-II (엑발리움 엘라테리움 트립신 억제제-II)는 스쿼팅 오이에서 발견되는 강력한 트립신 억제제이다. CKP-NLP를 생성하기 위해, EETI-II의 N-말단에서 조작된 리신 측쇄의 엡실론 아미노기에 팔미트산이 접합된 EETI-II의 지방 아실화된 버전을 설계했다(도 9A). 먼저, 선형 C16-EETI-II는 고체상 펩티드 합성에 의해 생성되었다. 지방산은 펩티드 합성 동안 마지막 단계로서 통합된 후, 후속하여 수지로부터 펩티드 절단 및 탈보호시켰다. 수득된 선형 미정제 생성물을 상이한 완충액에서 스크리닝하고, 분석 LC-MS로 평가하여 3개의 이황화 결합된 생성물을 생성하기 위한 최적 폴딩 조건을 확인하였다. 이 생산 전략은 정제 공정을 단순화시킨다(CKP 폴딩 후 지방산을 접합시키는 대신). 도 9B를 참고하라. EETI-II-C16을 폴딩하고 거의 균질하게 정제하여 EETI-II-C16을 멀티 밀리그램 규모로 생성했다. EETI-II-C16의 정체와 순도는 LC-MS로 확인하였다(도 9C). 분석 RP-HPLC 궤적은 EETI-II-C16이 EETI-II보다 더 소수성임을 나타내며, 이는 천연 EETI-II에 비해 더 긴 머무름 시간으로 반영되었다(도 9D). 이것은 지방산 모이어티의 접합으로 인한 것이다. EETI-II-C16은 여전히 수성 완충액에서 가용성을 나타낸다(60mM 포스페이트 완충액, pH 7.4에서 > 0.5mM). 정제된 EETI-II-16은 N-말단의 화학적 변형이 EETI-II의 활성을 최소한으로 방해하여야 한다는 구조적 연구로부터 얻은 예측과 일관되게 트립신에 대한 억제 효능을 입증했다. 간단히, EETI-II 및 EETI-II-C16은 본원에서 각각 "CKP" 및 "CKP-C16"으로 지칭된다.
CKP-NLP는 도 10A에 도시된 개략도에서 보는 바와 같이 지질 가용화를 위한 콜레이트 및 헬퍼 지질로서 DOPC를 사용한 자발적 자기조립을 통해 생성되었다. 콜레이트 제거 시, 자기조립된 CKP-NLP를 SEC로 정제했다. CKP-NLP의 일반적인 SEC 크로마토그램은 도 10B에 도시되어 있다. 이 CKP-NLP 샘플은 DOPC에 대한 10%의 CKP-C16 몰비(예를 들어, 90mol% DOPC, 10mol% CKP-C16)로 조립되었으며, 이는 4개의 apoE422k 스캐폴드/NLP를 가정할 때 40 CKPs/NLP에 해당한다(아래 참고문헌 6 참조). SEC 피크의 중앙 컷에 해당하는 분획들을 수집하고 풀링하여 역상 HPLC 분석을 수행했다. 도 10C는 SEC 정제 후 10 mol% CKP-C16으로 조립된 CKP-NLP 샘플의 HPLC ELSD 크로마토그램을 보여준다.. 4.8, 5.3 및 8.5분에 해당하는 머무름 시간에서 3개의 피크가 관찰되었다. 표준 곡선 및 LC/MS 분석을 사용하여 4.8, 5.3 및 8.5분에서 관찰된 피크가 각각 apoE422k(22.3kDa), CKP-C16(3.7kDa) 및 DOPC(0.79kDa)에 해당하는지 확인했다. 이러한 결과는 상기 설명한 전략이 CKP-C16을 NLP에 통합시켰음을 보여준다. 각 구성성분에 대한 표준 곡선을 생성하고 이를 사용하여 정제된 CKP-NLP에 통합된 CKP-C16의 양을 계산하였다. 10mol% CKP-C16 샘플의 경우, CKP-C16의 통합은 8.4mol%로 계산되었으며, 이는 조립 및 정제 공정 동안 약간의 재료 손실이 있었음을 나타내는 것이다. CKP-NLP 조성물의 HPLC 분석에 추가하여 NLP 분자량도 SEC-MALS로 측정했다(도 10D-10E). CKP-NLP 피크의 MW는 200 내지 400kDa로 다양하였으며 피크 전체에 걸친 평균 MW는 266kDa이었다(머무름 시간 9-10분)(도 10D). 유사하게, CKP-NLP 피크의 유체역학적 크기(Rh)는 5.8-7.3 nm로 다양했으며, 피크 전체에 걸친 평균 Rh는 6.2 nm였다(머무름 시간 9-10분)(도 10E). 이러한 종합 결과는 CKP-NLP 입자가 다분산임을 시사한다. 이러한 결과는 벌크 및 단일 분자 측정 모두에서 NLP 크기를 평가하는 이전의 보고 내용과 일치한다. 예를 들어, 아래 목록의 참고문헌 6을 참고하라. 참고문헌 6은 NLP의 다분산 특성이 NLP에 회합된 apoE422k 스캐폴드 단백질의 수(4-7에서 달라질 수 있음)에 의해 결정되는 복수의 이산 NLP 크기에 의해 유도되는 것으로 밝혀졌으며, NLP 다분산성은 이들 이산 크기들의 확률적 가우시안 분포를 나타내었음을 보고한다. SEC 분석에 따르면 머무름 시간, Rh 및 MW는 평균 4개의 apoE422k/NLP를 포함하는 NLP와 일치한다. 이러한 결과를 종합하면 모델 지질화 펩티드인 CKP-C16에 의해 예시된 바와 같이 CKP-NLP는 성공적으로 생성, 정제 및 특성화될 수 있음을 입증한다.
실시예 8: NLP 크기, 부하 효율 및 CKP 활성에 대한 CKP 통합의 영향 분석
다음으로, CKP 통합이 NLP 크기에 미치는 영향을 다음과 같이 평가하였다. 전구체 유기상에서 0-40% 범위의 CKP-C16 mol%로 CKP-NLP를 조립하여 최대 CKP 부하를 측정했다. 0, 5%, 10%, 20% 및 40% CKP-C16으로 조립된 CKP-NLP에 대한 정규화된 분석 SEC 크로마토그램을 도 11A에 도시한다. CKP 함량이 0-20% 증가함에 따라 머무름 시간이 약간 증가하는 것이 관찰되었으며 이는 입자 크기가 약간 감소했음을 나타낸다. CKP-C16 농도를 20%에서 40%로 증가시키면 머무름 시간이 크게 증가함과 동시에 큰 피크가 나타나는 것이 관찰되었는데, 이는 유리 apoE422k 단백질에 해당한다. 이러한 결과는 SEC-MALS 궤적에서 CKP-NLP 피크의 Rh 분석에도 반영된다(도 11B). CKP가 없을 때 NLP의 Rh는 ~7nm였으며 5% CKP에서 ~6.3nm로 감소했다. CKP-C16 함량이 5%에서 20%로 증가함에 따라 Rh의 추가 변화는 관찰되지 않았으나; CKP-C16 농도가 40%로 증가했을 때 4.5nm로 급격한 감소가 관찰되었다. 상기 언급한 바와 같이, NLP의 크기 분포는 이산 크기가 apoE422k/NLP의 수에 의해 결정되는 이산 크기 NLP의 확률적 가우시안 분포에 의해 크게 좌우된다는 것이 이전에 보고되었다(아래 참고문헌 6 참조). 경험적 단일 분자 측정 및 분자 역학 시뮬레이션을 기반으로 NLP에 apoE422k 단백질을 추가하면 직경이 ~2.5nm 증가한다(아래 참고문헌 6 참조). 이론에 얽매이지 않고, CKP-C16 함량이 0%에서 20%로 증가했을 때 관찰된 ~0.7nm 직경 감소는 이러한 변화가 평균 apoE422k/NLP 수의 차이로 인한 것이 아님을 시사한다. 또한 특정 이산 크기의 NLP에 있어서 조성에 의해 좌우될 수 있는 NLP 크기에 어느 정도의 유연성이 있는 것으로 보고되었다(아래 참고문헌 6 참조). 이론에 얽매이지 않고, 이러한 약간의 NLP 크기 감소는 변경된 NLP 조성으로 인한 것일 수 있다. CKP-C16은 단일 지방 아실 사슬만 포함하고 DOPC보다 표면적이 작으며, CKP-C16 함량이 증가함에 따른 약간의 NLP 직경 감소는 DOPC에 비해 CKP-C16의 단면적이 더 작은 것으로 인한 것일 수 있다. 이러한 이론적 근거는 Rh의 급격한 감소와 40% CKP-C16 조성에서 관찰된 유리 apoE422k 피크의 출현을 설명하지 못할 수도 있다. 이러한 직경 변화는 apoE422k/NLP의 평균 수가 1만큼 감소할 때 예상되는 변화와 거의 일치한다(아래 참고문헌 6 참조). 이러한 결과는 CKP-C16 함량이 40%로 증가하면 더 이상 4개의 apoE422k/NLP를 수용할 수 있는 충분한 지질 함량/표면적이 없음을 시사하며, 이는 CKP-C16 함량이 더 낮은 NLP에서 관찰되었으며 이러한 입자들은 3개의 apoE422k/NLP로 구성된다. 그러나 이 경우 유리 apoE422k는 SEC 크로마토그램의 곡선 아래 면적을 기준으로 관찰되었던 50% 증가가 아니라, 25% 증가될 것으로 예상된다. 또 다른 설명은 CKP-NLP가 더 이상 형성되지 않을 수 있으며 CKP-C16-DOPC 혼합물이 구형 마이셀을 형성할 수 있다는 것이다. 더 높은 세제 비율로 이중층 형성 지질을 세제와 혼합하면 마이셀이 형성될 수 있다(아래 참고문헌 26 참조). CKP-C16 농도가 높을수록 CKP-NLP에서도 유사한 현상이 발생할 수 있다. CKP-C16은 더 대형의 극성 헤드 기와 단일 지방 아실 사슬을 가진 세제 분자와 유사한 구조를 가지고 있기 때문에, 더 높은 비율의 CKP-C16은 NLP 형성에 필요한 이중층이 아닌 마이셀 형성을 유도할 수 있다. 더 높은 CKP 몰비에서는 NLP의 기본 구조 및 생물물리학적 특성이 변경된다.
CKP가 NLP 플랫폼에 통합되는 효율성을 평가하기 위해, 정제된 CKP-NLP에 통합된 CKP의 양을 역상 HPLC로 정량화했다. 도 11C는 4개의 apoE422k/NLP로 가정할 때, 정제된 CKP-NLP에서 정량화된 CKP/NLP 비율(Y-축)을 CKP-NLP 조립 동안 첨가된 CKP 함량(X-축)의 함수로서 보여준다. 파선은 반응의 모든 CKP가 NLP에 통합된 경우 이론적 한계를 나타낸다. 낮은 CKP 농도(16 및 32 CKP/NLP, 각각 5 및 10몰% CKP에 해당)에서, 반응에 첨가된 거의 모든 CKP(각각 13.3 및 27.6 CKP/NLP)는 점들이 점선(이론적 한계)에 대해 얼마나 가까이에 존재하였는지에 의해 입증되었다. 그러나 더 높은 농도에서 CKP 부하 효율은 이론적 상한에서 벗어나기 시작한다(도 11C). 이론에 얽매이지 않고, 이러한 발견은 더 높은 CKP 농도에서 부하 효율의 반환이 감소함을 시사한다. NLP는 NLP 조립 공정에 영향을 미치지 않고 최대 ~60개의 CKP-C16 분자를 수용할 수 있었다. (도 11C). 이러한 결론에 도달하기 위해, 40% CKP 농도에서 4개의 apoE422k/NLP(128 CKP/NLP)가 있다고 가정했다. 그러나 더 높은 CKP 농도가 apoE422k/NLP의 수를 변경하거나 마이셀/NLP 하이브리드의 형성을 유도할 때에는 이 가정이 맞지 않을 수 있다. 이러한 잠재적 불일치에도 불구하고 이러한 결과들을 종합하면 더 높은 CKP 부하 조건에서 통합 효율이 감소함을 시사한다.
CKP-NLP에 CKP를 통합하는 것의 CKP 활성에 대한 효과를 다음과 같이 평가하였다. 본 분석을 위해, CKP 활성은 트립신 기반 분석을 사용하여 다양한 농도에서 다양한 CKP:NLP 몰비(0, 13.4, 28.6 및 63)의 유리 CKP, CKP-C16 및 CKP-NLP에 대하여 측정되었다(도 11D). NLP-CKP 어셈블리는 비교적 재현가능하지만 일반적으로 최종 조성들 간의 가변성이 관찰된다. 본 발명의 제제에 대한 CKP:NLP 몰비는 상기 기재된 샘플과 약간 상이하였다. 유리 CKP(삼각형, 도 11D) 및 CKP-C16(원, 도 11D) 분자는 거의 동등한 Ki app(0.16)로 동일한 효능을 가졌고 0 CKP를 갖는 CKP-NLP 샘플은 활성이 없었다(십자 표시, 도 11D). CKP-NLP는 또한 CKP 부하 밀도에 관계없이 거의 동등한 효능을 가졌다(별표 및 사각형, 도 11D). 그러나 CKP-NLP에서 CKP의 전체 효능은 유리 CKP 및 CKP-C16보다 약 5배 낮았다. 이론에 얽매이지 않고, 이것은 (Ki app ~0.4nM) 또는 NLP 표면에 CKP가 고정된 것으로 인한 입체 장애 효과 때문일 수 있다. 활성 리간드의 고정화가 입체 효과로 인해 활성에 영향을 줄 수 있다는 것은 잘 알려져 있다(아래 참고문헌 27, 28 참조). 또는 CKP-C16은 지질과 CKP-C16 사이의 화학적 포텐셜 차이로 인해 클러스터들로 상 분리되는 과정을 거칠 수 있으며 이러한 클러스터는 CKP 활성에 부정적인 영향을 미친다. 활성에 대한 이러한 부정적인 영향에도 불구하고 CKP는 NLP 플랫폼에 부하되었을 때 여전히 매우 효능이 있었다.
실시예 9: CKP-NLP 안정성에 대한 CKP 부하의 영향
약물 전달 플랫폼으로서 NLP의 주의 사항 중 하나는 복잡한 생물학적 환경에서의 낮은 안정성이다(아래 참고문헌 9, 24, 25 참조). 예를 들어, 37°C의 50% 혈청에서 DOPC NLP의 반감기는 3-6시간인 것으로 보고되었으며(아래 참고문헌 9 참조), 이는 나노입자의 잠재적인 전신 반감기(24-48 시간) 보다 낮다. 이중층 코어를 가교결합하면 안정성이 유의하게 향상될 수 있음이 최근 입증되었는데(아래 참고문헌 24 참조), 여기서 가교결합된 NLP의 경우 100% 혈청에서 48시간 동안 NLP 분해가 관찰되지 않았고 가교결합이 없는 경우에는 매우 빠른 분해(~10분)가 관찰되었다(아래 참고문헌 24 참조). 그러나, 이러한 접근법은 알려진 자연적 분해 또는 생물학적 변환 경로가 없는 비-천연 가교 지질의 첨가로 인해 증가된 안전성 위험과 관련될 수 있다. NLP 플랫폼에 대한 Fab의 접합이 NLP 안정성을 두드러지게 향상시키는 것으로 최근에 보고되었다(아래 참고문헌 18 참조). CKP NLP 안정성에 대한 CKP 통합의 효과를 다음과 같이 평가하였다. CKP-NLP의 안정성을 형광단 태그를 사용하여 50% 혈청에서 평가하여 분해를 시간의 함수로서 SEC로 모니터링하였다. 생체 내 조건을 모방하기 위해 50% 혈청을 선택했다. 이들 연구에서, AF488 표지된 CKP-NLP를 상이한 시간 간격으로 SEC에 주입하고 CKP-NLP 용리를 495 nm의 흡광도에서 모니터링하였다. 이러한 형광단 및 흡광도 시그니처는 혈청/CKP-NLP 샘플의 혈청 단백질 및 구성성분들의 고유 흡광도와 중복되지 않는 분광광도 시그니처로 인해 선택되었다. 도 12A는 서로 다른 시점에서 CKP가 없는 네이키드 NLP의 SEC 크로마토그램을 보여준다. 머무름 시간 5.25분에서 SEC 크로마토그램에서 관찰된 첫 번째 피크는 CKP-NLP에 해당하였으며 머무름 시간 7.1분에서의 세 번째 피크는 유리 apoE422k에 해당하였다. 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 CKP-NLP 피크의 감소와 유리 apoE422k 피크의 증가가 관찰되었다. NLP 피크의 감소는 NLP 분해의 직접적인 척도이며 곡선 아래 면적을 계산하여 정량화되었다. 모든 샘플에서 머무름 시간 6.2분에서 중간 피크가 관찰되었으며 이 피크는 인큐베이션 시간에 따라 변하지 않았다. 모든 샘플 및 시점에서 이 피크의 일관성을 고려할 때, 이 피크는 혈청의 바탕 오염 물질 때문일 수 있다.
CKP 부하가 안정성에 미치는 영향을 체계적으로 평가하기 위해 다양한 양의 CKP-C16(0, 10 및 36 CKP/NLP)을 포함하는 CKP-NLP로 이러한 실험을 수행했다. CKP-NLP SEC 피크 면적은 상이한 CKP-NLP 전반에 걸친 비교를 가능하게 위해 시간 0h에서의 피크 면적에 대해 정규화되었다. NLP에 대한 Fab 접합에 대해 보고된 효과와 대조적으로, CKP-C16의 통합은 전체 NLP 안정성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 12B). 모든 CKP-NLP 샘플은 초기에 빠르게 분해되어 37°C에서 2-4시간 후 재료의 50%만 남았고, 이후 나머지 24시간의 인큐베이션 기간 동안은 더 느리게 분해되었음을 나타내었다. 이러한 분해 패턴은 NLP에 대한 기존의 보고내용과 매우 일치한다(아래 참고문헌 18, 24 참조). 이러한 발견은 실시예 5에 기재된 바와 같이 NLP 표면에 대한 Fab 접합에서 이전에 관찰된 안정화 효과가 더 작은 크기의 분자로는 변환되지 않는다는 것을 시사한다(Fab는 ~45 kDa이고 CKP는 ~3 kDa임). 이론에 얽매이지 않고, Fab는 양친매성 나노입자를 불안정하게 만들 수 있는 혈청 단백질과의 상호작용을 방지하는 물리적 장벽을 형성할 수 있다(Darwish M, Shatz W, Leonard B, Loyet K, Barrett K, Wong JL, Li H, Abraham R, Lin M, Franke Y, Tam C, Mortara K, Zilberleyb I, Blanchette CD, "Nanolipoprotein Particles as a Delivery Platform for Fab Based Therapeutics" Bioconjugate Chemistry, 2020, 31, 8 1995-2007). Fab 접합의 안정화 효과를 관찰하기 전에 7몰의 Fab 부하가 필요한 것으로 이전에 보고되었으며, 이는 NLP 표면에 대한 ~315 kDa의 MW 부가에 해당한다. 대조적으로, 86 CKP/NLP의 가장 높은 CKP 부하는 ~260 kDa의 MW 부가만 구성했다. 따라서 Fab 접합으로 인한 안정화 증가가 주로 NLP 표면에 부가된 MW로 인한 것인 경우 해당 NLP를 안정화하는 데 필요한 MW의 양은 가장 높은 CKP 부하에서 조차도 도달되지 못했다. 이는 CKP 통합에서 안정화 효과가 관찰되지 않은 이유를 설명할 수 있다. 대안적으로, 안정화 효과는 부가된 MW, 뿐만 아니라 접합된 실체의 유체역학적 크기로 인해 발생한다. 전체 NLP 구조를 방해하지 않고 표면에 더 많은 CKP를 부하하는 것이 가능하다 하더라도 안정화 효과가 관찰되지 않았을 가능성이 있다. 이러한 결과들을 종합하면 CKP의 생체 내 전달을 위한 순환 반감기 및 안정성에 제한이 있을 것이며 질환 치료에 이 기술을 적용할 때 이러한 제한을 고려해야 함을 시사한다.
실시예 10: Fab-CKP-NLP 접합체의 조립, 정제 및 특성화
CKP와 Fab를 모두 NLP에 통합하면 하나 이상의 기능적 활성을 가지는 나노입자 플랫폼을 개발할 수 있다. 예를 들어, NLP는 표적화 활성을 나타내는 Fab(예를 들어, HER2, CD20 등) 및 치료 활성을 나타내는 CKP를 포함할 수 있다. 대안적으로, NLP는 상승작용적 치료 활성 또는 보완적 치료 활성을 나타내는 Fab 및 CKP를 포함할 수 있다. NLP에 CKP와 Fab를 통합할 가능성을 다음과 같이 평가하였다. CKP와 Fab를 모두 NLP 플랫폼에 통합하기 위해 개발된 전략이 도 13A에 기재되어 있다. 동일한 CKP-NLP 조립 방법이 사용되었으며, 기능적 반응성 태그를 포함하는 Fab에 대한 후속 접합을 위해 작용기화된 PEG 지질을 첨가하였다(도 13A). PEG 지질 헤드 기가 말단 반응성 말레이미드를 갖고 Fab가 C-말단 시스테인 아미노산을 함유하는 말레이미드-티올 생체접합 전략을 사용하여 Fab를 NLP에 접합시켰다(아래 참고문헌 18 참조). 말레이미도메틸 사이클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-MCC) 헤드 기으로 작용기화된 DOPE 지질을 사용한, 티올-말레이미드 화학을 통한 Fab의 접합 전략은 실시예 1에 기술되어 있다. 초기 파일럿 NLP 어셈블리는 DOPE-MCC 지질로 수행되었으며 CKP-C16이 지질 혼합물에 첨가되었을 때 침전이 일관되게 관찰되었으며 DSPE-PEG-Mal이 사용될 때는 관찰되지 않았다. 따라서 DSPE-PEG-Mal은 NLP 플랫폼에 대한 Fab 접합의 추가 최적화를 위해 사용되었다. NLP 표면에서 Fab 접합에 충분한 말레이미드 리간드 밀도를 보장하기 위해 CKP-NLP는 10% mol DSPE-PEG-Mal 지질로 조립되었다. C-말단 시스테인을 함유하는 인간 항-인자 D Fab는 이 분자가 이전에 티올-말레이미드 접합을 통해 PEG 폴리머 스캐폴드(아래 참고문헌 22 참조) 및 NLP(아래 참고문헌 18 참조)에 성공적으로 접합되었기 때문에 대용 Fab로 사용되었다. Fab는 바이오비드 기반 콜레이트 제거 단계 직후에 CKP-NLP 정제 단계 없이 말레이미드 작용기화된 CKP-NLP에 접합되었다. 이 접근법은 접합 전에 말레이미드 가수분해 가능성을 최소화하기 위해 사용되었다. 초기 파일럿 접합은 Fab:CKP-NLP 몰비 20에서 수행되었다. 이전에 기술된 바와 같이 Fab를 CKP-NLP와 함께 2-3시간 동안 인큐베이션하고 NAC를 DSPE-PEG-Mal 대비 2배 몰 농도로 첨가하여 미반응 말레이미드를 퀀칭시켜 DOPE-MCC:apoE422k 가교결합을 방지하였다(아래 참고문헌 16 참조). . Fab-CKP-NLP는 SEC에 의해 정제되었으며 SEC 크로마토그램에서 다음 3개의 주요 피크가 관찰되었다: Fab-CKP-NLP 접합체(rt ~10분), Fab 이량체(rt ~14분) 및 비접합 Fab(rt ~16분)(도 13B). 접합 반응 후 Fab 이량체의 존재는 이전에 기재된 바와 같이 접합 단계 동안 Fab의 C-말단 티올에서 이황화물 형성에 의한 이량체화로 인한 것이었다(아래 참고문헌 18 참조). NLP 피크의 중심을 가로지르는 분획들을 수집하고 풀링하여 HPLC 및 SEC-MALS 분석을 수행했다. 정제되고 환원된 Fab-CKP-NLP 샘플의 예시적인 HPLC 크로마토그램을 도 13C에 도시한다. 피크는 1.75, 2.05, 2.8, 3.1, 3.4 및 3.95분의 머무름 시간에서 관찰되었고 이는 각각 Fab 경쇄, DSPE-PEG-Mal, apoE422k, CKP-C16, Fab 중쇄-DSPE-PEG-Mal 접합체 및 DOPC에 해당한다. 각 구성성분들에 대한 표준 곡선을 생성하고 이를 사용하여 CKP-C16 통합 및 Fab 접합을 정량화하였다. 도 13C에 나타낸 예시적인 HPLC 크로마토그램은 18개 CKP/NLP 및 23개 Fab/NLP에 해당한다. CKP-NLP에 대해 기술된 바와 같이, 입자 크기 또한 SEC-MALS에 의해 측정되었다(도 13D-13E). Fab-CKP-NLP 피크의 MW 변동성(220kDa 내지 1500kDa, 평균 MW 700kDa)은 CKP-NLP(200 내지 400kDa, 피크 전반에 걸쳐 평균 MW 266kDa) 보다 유의하게 더 넓다(도 13D). Fab-CKP-NLP 피크 전반에 걸친 Rh의 변동성에서 유사한 경향이 또한 관찰되었다. 이론에 얽매이지 않고, Fab-CKP-NLP에 대한 MW 및 Rh의 증가된 가변성은 접합된 Fab/NLP의 수의 분포로 인한 것일 수 있다. 이 Fab-CKP-NLP 샘플의 HPLC 분석에 따르면, 평균 20개의 Fab/NLP가 있었으나; Fab/NLP의 분포는 가우시안이 될 것이며 Fab가 0(MW ~300 kDa)에서 최대 30(MW ~1500 kDa)까지 달라지는 CKP-NLP를 볼 것으로 예상된다. Fab-CKP-NLP 피크 전반에 걸친 Rh의 가변성(도 13E)은 CKP-NLP와 유사하였다(~2배)(도 10E). 이전에 보고된 바에 따르면, NLP에 대한 Fab와 단백질의 접합은 MW보다 Rh에 훨씬 영향을 적게 미쳤는데, 그 이유는 원반형 NLP의 크기가 이중층 높이가 아닌 직경에 의해 주로 결정되기 때문이며, 이는 NLP 표면에 대한 단백질 접합에 의해 가장 큰 영향을 받는다(아래 참고문헌 18 참조) . 이러한 결과는 이 가설과 일치한다.
실시예 11: 최대 Fab 접합, Fab-CKP-NLP 크기, CKP 활성 및 Fab-CKP-NLP 안정성에 대한 CKP 및 Fab 부하의 효과
CKP 부하 밀도 및 Fab 부하 밀도가 Fab-CKP-NLP 크기, 활성 및 혈청 안정성에 미치는 영향을 다음과 같이 조사했다. CKP-NLP는 2개의 CKP 부하 밀도, 12.7의 CKP/NLP("낮은 CKP-NLP"라 함) 및 40의 CKP/NLP("높은 CKP-NLP"라 함)의 10 mol% DOPE-PEG-Mal로 조립되었으며 상이한 Fab 대 CKP-NLP 비율로 Fab에 접합되었다. 도 14A는 0 내지 150 범위의 Fab 대 CKP-NLP 비율로 Fab에 접합된 낮은 CKP-NLP의 SEC 크로마토그램을 보여준다. 가장 높은 Fab:NLP 비율 150은 ~1의 Fab:1 DSPE-PEG-Mal에 해당한다. CKP-NLP 피크는 ~150의 포화 수준까지 Fab 농도가 증가함에 따라 점진적으로 증가했다. Fab 접합 비율이 증가함에 따라 Fab 이량체 및 접합되지 않은 Fab 피크의 점진적인 증가가 관찰되었다. 이것은 높은 CKP-NLP에서 반복되었고 접합된 Fab의 양은 실시예 6에 기술된 바와 같이 정량화되었다(도 14B). 두 CKP 조성물에서, 반응에서의 Fab:NLP 비율이 0-100에서 증가할 때 접합된 Fab 부하(NLP에 실제로 부착된 양)의 선형 증가가 관찰되었다. 그러나, Fab 부하의 최소 증가 내지 거의 증가하지 않음이 더 높은 비율에서 관찰되었고 NLP 표면에 접합된 Fab의 포화량은 ~50 Fab/NLP인 것으로 결정되었다(도 14B). 대조적으로, 10mol% DOPE-MCC-지질 조성에서 DOPE-MCC 지질을 통해 NLP 표면에 직접 접합될 때 최대 Fab 부하 용량은 이전에 30인 것으로 보고되었다. 이 최대 부하 용량은 이용가능한 NLP 표면적에 의해 유도되는 것으로 제안되었으며 NLP 표면적과 30 Fab가 차지하는 전체 표면적 사이에는 강한 상관관계가 있었다. CKP-NLP의 표면적은 문헌 Darwish M, Shatz W, Leonard B, Loyet K, Barrett K, Wong JL, Li H, Abraham R, Lin M, Franke Y, Tam C, Mortara K, Zilberleyb I, Blanchette CD, "Nanolipoprotein Particles as a Delivery Platform for Fab Based Therapeutics" Bioconjugate Chemistry, 2020, 31, 8 1995-2007에 기재된 것과 유사하였으므로, 증가된 Fab 부하는 증가된 표면적으로 인한 것이 아닐 수 있다. CKP가 없을 때 유사하게 증가된 Fab 결합 능력이 관찰되었으며, 이는 이러한 효과가 NLP 표면에 CKP가 존재하기 때문이 아님을 시사한다. 본 연구에서 Fab는 표면에 직접 접합되지 않고 NLP 표면에서 확장된 PEG2000 링커에 접합되었다. 따라서 NLP 표면에 대한 직접 접합과 비교할 때 스페이서가 전체 접합 부피를 증가시키고 입체 장애를 제한하여 더 많은 수의 Fab가 NLP에 접합되게 할 수 있다고 보는 것이 타당하다. CKP 밀도는 Fab 부하에 상당한 영향을 미치지 않았다(도 14B). 따라서, 이러한 결과는 더 높은 CKP 부하에서 더 큰 입체 장애 가능성을 고려할 때 예상치 못한 것이었다. 이론에 얽매이지 않고, PEG 링커는 NLP 표면과 Fab 부하를 위한 접합 핸들 사이에 스페이서를 생성하기 때문에 CKP로부터 임의의 입체적 영향을 제거할 수 있다.
NLP 크기에 대한 Fab 부하의 영향을 추가로 평가하기 위해, 높은 및 낮은 CKP NLP 모두에 대해 상이한 Fab 부하에서 Rh를 SEC-MALS로 측정하였다(도 14C). Fab 부하가 0에서 10 Fab/NLP로 증가할 때 Rh의 증가가 관찰되었고 Fab 부하가 10에서 50 Fab/NLP로 증가함에 따라 최소한의 증가만 관찰되었다. 이러한 결과는 이전 연구 결과(아래 참고문헌 9, 11, 18 참조)와 일치하며 Fab 접합이 NLP의 원반형 특성을 변경시키지 않으며 Fab 부하보다는 NLP 직경 및 표면적이 Rh의 동인임을 시사한다.
NLP 표면에 대한 Fab의 접합은 CKP와의 분석물 상호작용에 대한 잠재적인 물리적 장벽을 생성할 수 있다. 따라서, Fab 부하가 CKP 활성에 미치는 영향을 평가하기 위해, 다양한 Fab 밀도를 갖는 낮은 및 높은 CKP-NLP 모두에서 CKP 활성을 평가하였다(도 14D). Fab 밀도는 높은 및 낮은 CKP-NLP 제형 모두에서 CKP 활성에 영향을 미치지 않았으며 샘플 간의 기질 억제 상수(K i app) 차이는 분석 오차(0.3 - 0.05 nM) 이내였다. 대조적으로, 실시예 8에서 논의된 바와 같이, Fab 접합의 부재시 CKP 활성의 감소가 관찰되었다. Fab-CKP-NKP에서 관찰된 이러한 예상치 못한 결과는 매우 재현가능하였다. 이러한 결과는 Fab 부하가 1-50 Fab/CKP-NLP에서 안정적으로 제어될 수 있고, Fab 부하의 정도가 CKP 밀도에 의존하지 않으며, Fab 접합이 Fab 밀도에 관계없이 CKP 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타남을 나타낸다. 이론에 얽매이지 않고 Fab가 트립신에 비특이적으로 결합하여 NLP 표면에서 유효 트립신 농도를 증가시키는 것이 가능하다. CKP-C16이 패치로 상분리되어 Fab 접합 부재시 활성이 감소하는 경우 Fab 접합 후 이러한 효과가 완화되어 활성이 회복된다는 것 또한 그럴듯하다.
실시예 5에 기술된 바와 같이, Fab 접합은 아마도 혈청 단백질에 대한 입체 장벽을 제공함으로써 NLP 안정성에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 이러한 결과가 CKP-NLP 플랫폼으로 확장될 수 있는지 확인하기 위해 50% 혈청에서 Fab-CKP-NLP(50 Fab/NLP 및 20 CKP/NLP)의 안정성을 CKP-NLP(20 CKP/NLP)와 비교했다(도 14E). "빈" NLP(즉, CKP 및/또는 Fab가 부하되지 않은 NLP)에서 관찰된 바와 같이, Fab 접합은 CKP-NLP 안정성에 상당한 영향을 미쳤다. CKP-NLP는 빠르게 분해되어 처음 4시간 이내에 입자의 50% 이상이 분해되었다. 대조적으로, Fab-CKP-NLP는 놀라울 정도로 안정적이었고 물질의 75% 이상이 24시간 동안 손상되지 않은 상태로 유지되었다. 이론에 얽매이지 않고, 이러한 발견은 Fab가 PEG 스페이서를 통해 부착되고 NLP 표면에 추가적인 분자 펩티드 실체가 존재하는 경우에도 Fab 층의 안정화 효과가 유지됨을 시사한다.
실시예 7-11의 결론
실시예 7-11은 CKP-NLP 및 Fab-CKP-NLP 접합체 모두에 대한 개발 및 특성화를 기술한다. CKP 통합을 위해, CKP에 C16 탄화수소 꼬리가 부가되어 조립 공정 중에 이중층 코어로의 분획을 가능하게 하고 NLP 표면에 CKP를 표시하는 자기조립 전략이 개발되었다. NLP는 NLP 조립 공정에 영향을 미치지 않고 최대 ~60개의 CKP-C16 분자를 수용할 수 있었다. CKP-C16을 NLP에 통합하면 CKP 트립신 억제 활성이 약간 감소하지만 분자는 여전히 매우 강력하다(서브나노 몰 결합제). CKP-NLP 안정성은 NLP 단독에 비등한 것으로 밝혀졌으며 37°C의 50% 혈청에서 상대적으로 짧은 반감기를 가졌다(~1시간). 말레이미드기가 PEG 스페이서에 부착된 곳에 티올 반응성 말레이미드 지질을 도입함으로써 NLP 플랫폼에 대한 Fab 접합을 구현하였다. 이 접합 전략을 사용하여 Fab 부하는 1-50 Fab/CKP-NLP에서 안정적으로 제어될 수 있었고 Fab 부하 정도는 CKP 밀도에 의존적이지 않았다. Fab 접합은 또한 Fab 밀도에 관계없이 CKP 활성에 영향을 미치지 않았다. 마지막으로, Fab 접합은 CKP-NLP 안정성을 개선하는 데 지대한 영향을 미쳤으며 Fab-CKP-NLP의 75% 이상이 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한 후에도 그대로 남아있었다. 이러한 결과를 종합하면 NLP가 펩티드 유사 약물 후보의 잠재적인 전달을 위한 유망한 플랫폼임을 시사한다. 또한, CKP-NLP에 대한 표적화 또는 치료 Fab의 접합을 통해 표적화 또는 다중약물 전달이 구현될 수 있다.
실시예 6-11에 관한 참고문헌
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Claims (217)

  1. 접합체이며,
    스캐폴드 단백질,
    막-형성 지질, 및
    항원-결합 폴리펩티드
    를 포함하고,
    상기 막-형성 지질은 지질 이중층으로 배열되고,
    상기 스캐폴드 단백질은 상기 이중층을 둘러싸고,
    상기 항원-결합 폴리펩티드는 상기 하나 이상의 막-형성 지질 상의 작용기화 기(functionalized group) 및 상기 항원-결합 폴리펩티드 상의 C-말단에 위치한 상보적 작용기(complementary functional group)를 통해 상기 이중층의 한쪽 또는 양쪽 표면 상의 상기 막-형성 지질 중 하나 이상에 접합되고,
    선택적으로 스페이서가 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서가 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결하는 것인 접합체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 작용기화 기는 말레이미드 유도체, 할로아세트아미드, 피리딜디티오-프로피오네이트, 티오설페이트 및 이들 중 임의의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 상보적 작용기는 유리 티올기인 접합체.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 티올기는 시스테인 티올기이고,
    선택적으로 상기 시스테인 아미노산 잔기는 항원-결합 폴리펩티드가 유래된 항체에서 힌지 이황화 결합을 형성하는 (예를 들어, Cys-226 또는 Cys -227) 것인 접합체.
  4. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용기화 기는 상기 스캐폴드 단백질에 접합되지 않는 것인 접합체.
  5. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은
    (a) 아포지단백질 A,
    (b) 아포지단백질 B,
    (c) 아포지단백질 C,
    (d) 아포지단백질 D,
    (e) 아포지단백질 H,
    (f) 아포지단백질 E,
    (g) 상기 이중층을 안정화시킬 수 있는 상기 (a)-(f)의 절단된 버전, 및
    (h) 상기 (a)-(g) 중 임의의 하나 이상의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접합체.
  6. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실 (예를 들어, C16 지방-아실), DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC 및 이들 중 임의의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접합체.
  7. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고,
    상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합된 것인 접합체.
  8. 접합체이며,
    스캐폴드 단백질,
    막-형성 지질, 및
    20-60개 아미노산의 짧은 펩티드
    를 포함하고,
    상기 막-형성 지질은 지질 이중층으로 배열되고,
    상기 스캐폴드 단백질은 상기 이중층을 둘러싸고,
    상기 짧은 펩티드는 상기 이중층의 한쪽 또는 양쪽 표면에서 하나 이상의 상기 막-형성 지질에 접합되는 것인 접합체.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실 (예를 들어, C16 지방-아실), DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC 및 이들 중 임의의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접합체.
  10. 청구항 8 또는 9에 있어서,
    하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고,
    상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합된 것인 접합체.
  11. 청구항 7 또는 10에 있어서, 상기 지방-아실은 C16 지방-아실인 접합체.
  12. 청구항 7 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 짧은 펩티드는 시스틴 매듭 펩티드(CKP)인 접합체.
  13. 청구항 12에 있어서, CKP는 EETI-II, 서쿨린 A, 사이클로사이코트라이드 A, 사이클로비올라신 O1, 사이클로비올라신 O12, 칼라타 B1, 칼라타 B8, 팔리코우레인, 트리사이클론 A, MCoTI 1, SOTI 1, 서쿨린 B, 사이클로사이코트라이드, 또는 varv 펩티드 A인 접합체.
  14. 청구항 7 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 짧은 펩티드는
    (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열들에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 화학적 변형, 및/또는
    (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형
    을 포함하는 CKP 변이체인 접합체.
  15. 청구항 14에 있어서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 그의 N-말단에 추가적인 리신 잔기를 포함하는 것인 접합체.
  16. 청구항 14 또는 15에 있어서, 야생형 CKP는 EETI-II인 접합체.
  17. 청구항 7 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 접합체 내의 짧은 펩티드의 활성이 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 더 높은 것인 접합체.
  18. 청구항 17에 있어서, 접합체 내의 펩티드의 활성이 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 2배 내지 10배 더 높은 것인 접합체.
  19. 청구항 15에 있어서, 접합체 내의 펩티드의 활성이 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 약 5배 더 높은 것인 접합체.
  20. 청구항 12 내지 16 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 짧은 펩티드는 생물학적 활성을 갖는 CKP 또는 CKP 변이체이고,
    상기 활성의 80-90%, 90-95%, 또는 95-99%가 상기 접합체에서 유지되는 것인 접합체.
  21. 청구항 7 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 짧은 펩티드의 활성 또는 결합력을 증가시키는 접합체.
  22. 청구항 7 내지 21 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 막-형성 지질 상의 작용기화 기 및 상기 항원-결합 폴리펩티드 상의 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 통해 상기 이중층의 한쪽 또는 양쪽 표면 상의 하나 이상의 상기 막-형성 지질에 접합된 항원-결합 폴리펩티드
    를 추가로 포함하고,
    선택적으로 스페이서가 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서가 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결하는 것인 접합체.
  23. 청구항 7 내지 22 중 어느 한 항에 있어서,
    1 내지 100개의 상기 Fab 분자를 포함하고,
    선택적으로 5-30, 10-25, 15-20, 또는 18개의 상기 펩티드 분자, 및 5-40, 10-35, 15-30, 20-25 또는 23개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하거나, 또는
    선택적으로 3-30, 5-20, 10-15 또는 13개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하거나, 또는
    선택적으로 20-80, 25-70, 30-60, 35-50, 또는 40개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하는 것인 접합체.
  24. 청구항 7 내지 23 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 2개의 상이한 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체를 포함하고,
    제1 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체는 제1 짧은 펩티드를 포함하고,
    제2 펩티드-C4-28 지방-아실은 제1 짧은 펩티드와는 상이한 제2 짧은 펩티드를 포함하는 것인 접합체.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 적어도 2개의 펩티드 (예를 들어, 시스틴 매듭 펩티드)는 상이한 표적, 선택적으로 2, 3, 4 또는 8개의 상이한 표적에 결합하는 것인 접합체.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 2개 이상의 짧은 펩티드는 2개의 상이한 표적에 결합하는 것인 접합체.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 표적은 CD3 및 CD19, CD3 및 EpCAM, CD3 및 CEA, CD16 및 CD30, CD16 및 CD33, Ang-2 및 VEGF-A, 및 인자 X 및 인자 IXa로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍인 접합체.
  28. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스캐폴드 단백질 및 상기 막-형성 지질은 몰비가 1:60 내지 1:100, 예를 들어, 1:80이고/거나,
    상기 막-형성 지질의 20-35%, 예를 들어 20%는 작용기화 기를 보유하는 것인 접합체.
  29. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원-결합 폴리펩티드는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 단일 사슬 Fab(scFab), 단일 사슬 Fv(scFv), VH-VH 이량체, VL-VL 이량체, VH-VL 이량체, 단일 도메인, 디아바디, 선형 항체 및 이들 중 임의의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 특히, 상기 항원-결합 폴리펩티드는 Fab이고,
    선택적으로 상기 Fab는 OX40, DR4, GITR, Tie2, 인자 D, VEGF, MerTK, CD3, 림포톡신 베타 수용체 및 이들 중 임의의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 결합하는 것인 접합체.
  30. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자, 선택적으로 2-60, 2-32, 10-30, 또는 20개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자를 포함하는 접합체.
  31. 청구항 30에 있어서,
    1-160, 10-120, 20-100, 40-80, 또는 60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자를 갖고,
    상기 항원-결합 폴리펩티드는 Fab이고,
    상기 Fab는 PEG 스페이서에 의해 상기 막-형성 지질에 연결되는 것인 접합체.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 PEG 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하며 1000-3000, 1500-2500, 1900-2200 또는 2000의 MW를 갖는 것인 접합체.
  33. 청구항 30 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 폴리펩티드의 활성 또는 결합력을 증가시키는 접합체.
  34. 청구항 32에 있어서,
    상기 활성은 OX40 결합이고,
    상기 접합체는 4-8개의 상기 항원-결합 폴리펩티드, 예를 들어, Fab 분자를 갖는 접합체.
  35. 청구항 30 내지 34 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원-결합 폴리펩티드는 상기 접합체의 혈청 안정성 및/또는 혈청 반감기를 증가시키고,
    선택적으로 상기 혈청 반감기는 2-20배, 5-15배, 또는 10배 증가되는 것인 접합체.
  36. 청구항 35에 있어서, 5-60, 6-40, 또는 7-32개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자를 갖는 접합체.
  37. 청구항 30 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 항원-결합 폴리펩티드는 상이한 표적 또는 에피토프, 선택적으로 2, 3, 4 또는 8개의 상이한 표적 또는 에피토프에 결합하는 것인 접합체.
  38. 청구항 37에 있어서, 상기 2개 이상의 항원-결합 폴리펩티드는 2개의 상이한 표적 또는 에피토프에 결합하는 것인 접합체.
  39. 청구항 37에 있어서, 상기 표적은 CD3 및 CD19, CD3 및 EpCAM, CD3 및 CEA, CD16 및 CD30, CD16 및 CD33, Ang-2 및 VEGF-A, 및 인자 X 및 인자 IXa로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍인 접합체.
  40. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 폴리펩티드는 Fab 또는 Fab-유사 분자, 선택적으로 인간 또는 인간화 Fab인 접합체.
  41. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서는 PEG 또는 GSGS의 아미노산 서열을 포함하는 것인 접합체.
  42. 전술한 청구항 중 어느 한 항의 접합체 및
    약학적으로 허용되는 비히클
    을 포함하는 약학 조성물.
  43. 청구항 42에 있어서, 점도가 10-50 cP이고 농도가 상기 접합체 100-300 mg/mL의 액체 조성물인 약학 조성물.
  44. 청구항 1 내지 41 중 어느 한 항 또는 청구항 42 또는 43에 있어서, 피하로 또는 안구 전달을 통해 투여되는 접합체 또는 약학 조성물.
  45. 청구항 44에 있어서, 예를 들어, 트레할로스의 존재 하에 동결건조되고, 선택적으로 재구성되는 접합체 또는 약학 조성물.
  46. 청구항 45에 있어서,
    상기 접합체는 접합체 당 18-20개의 Fab 분자를 포함하고/하거나
    동결건조는 80mM 트레할로스의 존재하에 일어나고/거나
    동결건조는 접합체 5 mg/mL의 농도에서 일어나는 것인
    접합체 또는 약학 조성물.
  47. 청구항 45 또는 46에 있어서, 상기 항원-결합 폴리펩티드의 항원-결합 활성의 80-90%, 90-95% 또는 95-99%가 동결건조 및 재구성 후에 유지되는 것인 접합체 또는 약학 조성물.
  48. 청구항 1 내지 41 중 어느 한 항의 접합체 100-300 mg을 포함하고 점도가 10-50 cP인 액체 제제이며,
    선택적으로 피하 또는 안구 전달을 통해 투여되는 액체 제제.
  49. 나노지단백질 입자 및 항원-결합 폴리펩티드의 접합체를 제조하는 방법이며,
    a) 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질을, 상기 스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 상기 막-형성 지질의 지질 이중층을 포함하는 나노지단백질 입자의 (자기)조립을 허용하는 조건하에 제공하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 상기 입자의 한쪽 또는 양쪽 표면 상에 작용기화 기를 제시하는 것인 단계,
    b) 4.5 내지 6.5 pH 범위의 낮은 pH에서 상기 작용기화 기에 접합하는, C-말단에 위치한 상보적 작용기를 갖는 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab)와 상기 입자를 접촉시키는 단계, 및
    c) 선택적으로 상기 입자 및 상기 항원-결합 폴리펩티드의 접합체를 정제하는 단계
    를 포함하는 방법.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 단계 b)는 조립되지 않은 막-형성 지질의 일부 또는 전부를 제거하는 중간 단계 없이 상기 단계 a)에 후속하는 것인 방법.
  51. 청구항 49 또는 50에 있어서,
    상기 작용기화 기는 말레이미드 유도체이고,
    상기 작용기는 시스테인 티올기이고,
    선택적으로 상기 시스테인 아미노산 잔기는 항원-결합 폴리펩티드가 유래되는 항체에서 힌지 이황화 결합을 형성하는 (예를 들어, Cys-226 또는 Cys-227) 것인 방법.
  52. 청구항 49 내지 51 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용기화 기는 상기 낮은 pH에서 상기 스캐폴드 단백질에 접합되지 않는 것인 방법.
  53. 청구항 52에 있어서, 상기 낮은 pH는 pH 5.5 내지 6.5, pH 5 내지 6, 또는 pH 6인 방법.
  54. 청구항 49 내지 53 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서가 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서가 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결하는 것인 방법.
  55. 청구항 54에 있어서, 상기 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하는 PEG 스페이서인 방법.
  56. 청구항 55에 있어서, 상기 PEG 스페이서는 1000-3000, 1500-2500, 1900-2200 또는 2000의 MW를 갖는 것인 방법.
  57. 청구항 49 내지 56 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고,
    상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합된 것인 방법.
  58. 청구항 57에 있어서, 상기 지방-아실은 C16 지방-아실인 방법.
  59. 청구항 57 또는 58에 있어서, 상기 짧은 펩티드는 시스틴 매듭 펩티드(CKP)인 방법.
  60. 청구항 59에 있어서, CKP는 EETI-II, 서쿨린 A, 사이클로사이코트라이드 A, 사이클로비올라신 O1, 사이클로비올라신 O12, 칼라타 B1, 칼라타 B8, 팔리코우레인, 트리사이클론 A, MCoTI 1, SOTI 1, 서쿨린 B, 사이클로사이코트라이드, 또는 varv 펩티드 A인 방법.
  61. 청구항 57 또는 58에 있어서, 짧은 펩티드는
    (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열들에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 화학적 변형, 및/또는
    (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형
    을 포함하는 CKP 변이체인 방법.
  62. 청구항 61에 있어서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 그의 N-말단에 추가적인 리신 잔기를 포함하는 것인 방법.
  63. 청구항 61 또는 62에 있어서, 야생형 CKP는 EETI-II인 방법.
  64. 청구항 57 내지 63 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막-형성 지질은 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체 및 DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC 중 적어도 하나 이상 (예를 들어, 펩티드-C16 지방-아실 접합체 및 DOPC)을 1:3 내지 1:15, 또는 1:6 내지 1:12, 또는 1:9의 몰비로 포함하고/하거나
    상기 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 상기 짧은 펩티드 분자를 포함하는 것인 방법.
  65. 청구항 57 내지 64 중 어느 한 항에 있어서, 접합체 내의 짧은 펩티드의 활성이 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 더 높은 것인 방법.
  66. 청구항 65에 있어서, 접합체 내의 펩티드의 활성이 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 2배 내지 10배 더 높은 것인 방법.
  67. 청구항 66에 있어서, 접합체 내의 펩티드의 활성이 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 약 5배 더 높은 것인 방법.
  68. 청구항 57 내지 64 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 짧은 펩티드는 생물학적 활성을 갖는 CKP 또는 CKP 변이체이고,
    상기 활성의 80-90%, 90-95%, 또는 95-99%가 상기 접합체에서 유지되는 것인 방법.
  69. 청구항 57 내지 68 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접합체는 1 내지 100개의 상기 Fab 분자를 포함하고,
    선택적으로 상기 접합체는 5-30, 10-25, 15-20, 또는 18개의 상기 펩티드 분자, 및 5-40, 10-35, 15-30, 20-25 또는 23개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하거나, 또는
    선택적으로 상기 접합체는 3-30, 5-20, 10-15 또는 13개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하거나, 또는
    선택적으로 상기 접합체는 20-80, 25-70, 30-60, 35-50, 또는 40개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하는 것인 방법.
  70. 청구항 69에 있어서, Fab 및 짧은 펩티드는 2개의 상이한 표적에 결합하는 것인 방법.
  71. 청구항 57 내지 70 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 2개의 상이한 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체를 포함하고,
    제1 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체는 제1 짧은 펩티드를 포함하고,
    제2 펩티드-C4-28 지방-아실은 제1 짧은 펩티드와는 상이한 제2 짧은 펩티드를 포함하는 것인 방법.
  72. 청구항 71에 있어서, 상기 적어도 2개의 펩티드 (예를 들어, 시스틴 매듭 펩티드)는 상이한 표적, 선택적으로 2, 3, 4 또는 8개의 상이한 표적에 결합하는 것인 방법.
  73. 청구항 72에 있어서, 상기 2개 이상의 짧은 펩티드는 2개의 상이한 표적에 결합하는 것인 방법.
  74. 청구항 70 또는 73에 있어서, 상기 표적은 CD3 및 CD19, CD3 및 EpCAM, CD3 및 CEA, CD16 및 CD30, CD16 및 CD33, Ang-2 및 VEGF-A, 및 인자 X 및 인자 IXa로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍인 방법.
  75. 나노지단백질 입자 및 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드 (예를 들어, 시스틴 매듭 펩티드)의 접합체를 제조하는 방법이며,
    a) 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질을, 상기 스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 상기 막-형성 지질의 지질 이중층을 포함하는 나노지단백질 입자의 (자기)조립을 허용하는 조건하에 제공하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실 (예를 들어, C16 지방-아실)을 포함하고 지방-아실은 상기 짧은 펩티드에 접합되는 것인 단계, 및
    선택적으로 펩티드 접합체를 정제하는 단계
    를 포함하는 방법.
  76. 청구항 75에 있어서, 상기 짧은 펩티드는 시스틴 매듭 펩티드(CKP)인 방법.
  77. 청구항 76에 있어서, CKP는 EETI-II, 서쿨린 A, 사이클로사이코트라이드 A, 사이클로비올라신 O1, 사이클로비올라신 O12, 칼라타 B1, 칼라타 B8, 팔리코우레인, 트리사이클론 A, MCoTI 1, SOTI 1, 서쿨린 B, 사이클로사이코트라이드, 또는 varv 펩티드 A인 방법.
  78. 청구항 77에 있어서, 짧은 펩티드는
    (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열들에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 화학적 변형, 및/또는
    (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형
    을 포함하는 CKP 변이체인 방법.
  79. 청구항 78에 있어서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 그의 N-말단에 추가적인 리신 잔기를 포함하는 것인 방법.
  80. 청구항 78 또는 79에 있어서, 야생형 CKP는 EETI-II인 방법.
  81. 청구항 75 내지 80 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막-형성 지질은 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체 및 DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC 중 적어도 하나 이상 (예를 들어, 펩티드-C16 지방-아실 접합체 및 DOPC)을 1:3 내지 1:15, 또는 1:6 내지 1:12, 또는 1:9의 몰비로 포함하고/하거나,
    상기 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 상기 짧은 펩티드 분자를 포함하는 것인 방법.
  82. 청구항 75 내지 81 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 2개의 상이한 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체를 포함하고,
    제1 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체는 제1 짧은 펩티드를 포함하고,
    제2 펩티드-C4-28 지방-아실은 제1 짧은 펩티드와는 상이한 제2 짧은 펩티드를 포함하는 것인 방법.
  83. 청구항 82에 있어서, 상기 적어도 2개의 펩티드 (예를 들어, 시스틴 매듭 펩티드)는 상이한 표적, 선택적으로 2, 3, 4 또는 8개의 상이한 표적에 결합하는 것인 방법.
  84. 청구항 82에 있어서, 상기 2개 이상의 짧은 펩티드는 2개의 상이한 표적에 결합하는 것인 방법.
  85. 청구항 84에 있어서, 상기 표적은 CD3 및 CD19, CD3 및 EpCAM, CD3 및 CEA, CD16 및 CD30, CD16 및 CD33, Ang-2 및 VEGF-A, 및 인자 X 및 인자 IXa로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍인 방법.
  86. 청구항 75 내지 85 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 짧은 펩티드는 생물학적 활성을 갖는 CKP 또는 CKP 변이체이고,
    상기 활성의 80-90%, 90-95%, 또는 95-99%가 상기 접합체에서 유지되는 것인 방법.
  87. 청구항 75 내지 86 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 상기 막-형성 지질은 상기 입자의 한쪽 또는 양쪽 표면 상에 작용기화 기를 제시하고,
    b) 4.5 내지 6.5 pH 범위의 낮은 pH에서 상기 작용기화 기에 접합하는, C-말단에 위치한 상보적 작용기를 갖는 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab)와 상기 입자를 접촉시키는 단계
    를 추가로 포함하며,
    상기 단계 b)는 조립되지 않은 막-형성 지질의 일부 또는 전부를 제거하는 중간 단계 없이, 및/또는 단계 a)의 펩티드 접합체를 농축하는 중간 단계 없이 상기 단계 a)에 후속하는 것인 방법.
  88. 청구항 87에 있어서,
    상기 작용기화 기는 말레이미드 유도체이고,
    상기 작용기는 시스테인 티올기이고,
    선택적으로 상기 시스테인 아미노산 잔기는 항원-결합 폴리펩티드가 유래되는 항체에서 힌지 이황화 결합을 형성하는 (예를 들어, Cys-226 또는 Cys-227) 것인 방법.
  89. 청구항 87 또는 88에 있어서, 상기 작용기화 기는 상기 낮은 pH에서 상기 스캐폴드 단백질에 접합되지 않는 것인 방법.
  90. 청구항 89에 있어서, 상기 낮은 pH는 pH 5.5 내지 6.5, pH 5 내지 6, 또는 pH 6인 방법.
  91. 청구항 87 내지 90 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서가 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서가 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결하는 것인 방법.
  92. 청구항 91에 있어서, 상기 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하는 PEG 스페이서인 방법.
  93. 청구항 92에 있어서, 상기 PEG 스페이서는 1000-3000, 1500-2500, 1900-2200 또는 2000의 MW를 갖는 것인 방법.
  94. 청구항 87 내지 93 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 상기 짧은 펩티드의 활성 또는 결합력을 증가시키는 것인 방법.
  95. 청구항 87 내지 94 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접합체는 1 내지 100개의 상기 Fab 분자를 포함하고,
    선택적으로 상기 접합체는 5-30, 10-25, 15-20, 또는 18개의 상기 펩티드 분자, 및 5-40, 10-35, 15-30, 20-25 또는 23개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하거나, 또는
    선택적으로 상기 접합체는 3-30, 5-20, 10-15 또는 13개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하거나, 또는
    선택적으로 상기 접합체는 20-80, 25-70, 30-60, 35-50, 또는 40개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하는 것인 방법.
  96. 청구항 95에 있어서, Fab 및 짧은 펩티드는 2개의 상이한 표적에 결합하는 것인 방법.
  97. 청구항 96에 있어서, 상기 표적은 CD3 및 CD19, CD3 및 EpCAM, CD3 및 CEA, CD16 및 CD30, CD16 및 CD33, Ang-2 및 VEGF-A, 및 인자 X 및 인자 IXa로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍인 방법.
  98. 청구항 87 내지 97 중 어느 한 항에 있어서, 접합체 내의 짧은 펩티드의 활성이 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 더 높은 것인 방법.
  99. 청구항 98에 있어서, 접합체 내의 펩티드의 활성이 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 2배 내지 10배 더 높은 것인 방법.
  100. 청구항 99에 있어서, 접합체 내의 펩티드의 활성이 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 약 5배 더 높은 것인 방법.
  101. 청구항 49 내지 100 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 접합체.
  102. 항원-결합 폴리펩티드의 결합력, 활성 및/또는 효능을 증가시키는 방법이며,
    a) 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질을, 상기 스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 상기 막-형성 지질의 지질 이중층을 포함하는 나노지단백질 입자의 (자기)조립을 허용하는 조건하에 제공하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 상기 입자의 한쪽 또는 양쪽 표면 상에 작용기화 기를 제시하는 것인 단계,
    b) 4.5 내지 6.5 pH 범위의 낮은 pH에서 상기 작용기화 기에 접합하는, C-말단에 위치한 상보적 작용기를 갖는 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab)와 상기 입자를 접촉시키는 단계, 및
    c) 선택적으로 상기 입자 및 상기 항원-결합 폴리펩티드의 접합체를 정제하는 단계
    를 포함하고,
    이로써 상기 항원-결합 폴리펩티드의 결합력, 활성, 및/또는 효능을 증가시키는 방법.
  103. 청구항 102에 있어서,
    상기 항원-결합 폴리펩티드는 Fab 또는 Fab-유사 분자이고/이거나,
    상기 접합체는 10-60, 15-30 또는 20개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자를 포함하는 것인 방법.
  104. 청구항 103에 있어서,
    상기 항원-결합 폴리펩티드는 PEG 스페이서에 의해 상기 막-형성 지질에 연결된 Fab 또는 Fab-유사 분자이고,
    상기 접합체는 1-160, 10-120, 20-100, 40-80, 또는 60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자를 포함하는 것인 방법.
  105. 청구항 104에 있어서, 상기 PEG 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하며 1000-3000, 1500-2500, 1900-2200 또는 2000의 MW를 갖는 것인 방법.
  106. 청구항 102 내지 105 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접합체는 안정화되고,
    선택적으로 상기 접합체는 7-60, 7-32, 40-60, 또는 50개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자를 포함하는 것인 방법.
  107. 청구항 102 내지 106 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 상이한 표적에 결합하는 하나 이상의 제2 항원-결합 폴리펩티드 분자를 추가로 포함하는 것인 방법.
  108. 청구항 102 내지 107 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접합체는 액체 제제로서 제공되고,
    상기 제제는 100-300 mg의 상기 접합체를 포함하고 10-50 cP의 점도를 갖는 것인 방법.
  109. 청구항 102 내지 108 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고,
    상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합되고,
    상기 방법은 짧은 펩티드의 결합력, 활성 및/또는 효능을 증가시키는 방법.
  110. 청구항 109에 있어서, 상기 지방-아실은 C16 지방-아실인 방법.
  111. 청구항 109 또는 110에 있어서, 상기 짧은 펩티드는 시스틴 매듭 펩티드(CKP)인 방법.
  112. 청구항 111에 있어서, CKP는 EETI-II, 서쿨린 A, 사이클로사이코트라이드 A, 사이클로비올라신 O1, 사이클로비올라신 O12, 칼라타 B1, 칼라타 B8, 팔리코우레인, 트리사이클론 A, MCoTI 1, SOTI 1, 서쿨린 B, 사이클로사이코트라이드, 또는 varv 펩티드 A인 방법.
  113. 청구항 109 또는 110에 있어서, 짧은 펩티드는
    (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열들에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 화학적 변형, 및/또는
    (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형
    을 포함하는 CKP 변이체인 방법.
  114. 청구항 113에 있어서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 그의 N-말단에 추가적인 리신 잔기를 포함하는 것인 방법.
  115. 청구항 113 또는 114에 있어서, 야생형 CKP는 EETI-II인 방법.
  116. 청구항 109 내지 115 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막-형성 지질은 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체 및 DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC 중 적어도 하나 이상 (예를 들어, 펩티드-C16 지방-아실 접합체 및 DOPC)을 1:3 내지 1:15, 또는 1:6 내지 1:12, 또는 1:9의 몰비로 포함하고/하거나
    상기 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 상기 짧은 펩티드 분자를 포함하는 것인 방법.
  117. 청구항 109 내지 116 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 2개의 상이한 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체를 포함하고,
    제1 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체는 제1 짧은 펩티드를 포함하고,
    제2 펩티드-C4-28 지방-아실은 제1 짧은 펩티드와는 상이한 제2 짧은 펩티드를 포함하는 것인 방법.
  118. 청구항 117에 있어서, 상기 적어도 2개의 펩티드 (예를 들어, 시스틴 매듭 펩티드)는 상이한 표적, 선택적으로 2, 3, 4 또는 8개의 상이한 표적에 결합하는 것인 방법.
  119. 청구항 118에 있어서, 상기 2개 이상의 짧은 펩티드는 2개의 상이한 표적에 결합하는 것인 방법.
  120. 청구항 119에 있어서, 상기 표적은 CD3 및 CD19, CD3 및 EpCAM, CD3 및 CEA, CD16 및 CD30, CD16 및 CD33, Ang-2 및 VEGF-A, 및 인자 X 및 인자 IXa로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍인 방법.
  121. 청구항 109 내지 120 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접합체는 1 내지 100개의 상기 Fab 분자를 포함하고,
    선택적으로 상기 접합체는 5-30, 10-25, 15-20, 또는 18개의 상기 펩티드 분자, 및 5-40, 10-35, 15-30, 20-25 또는 23개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하거나, 또는
    선택적으로 상기 접합체는 3-30, 5-20, 10-15 또는 13개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하거나, 또는
    선택적으로 상기 접합체는 20-80, 25-70, 30-60, 35-50, 또는 40개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하는 것인 방법.
  122. 청구항 110 내지 121 중 어느 한 항에 있어서, 접합체 내의 짧은 펩티드의 활성이 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 더 높은 것인 방법.
  123. 청구항 122에 있어서, 접합체 내의 펩티드의 활성이 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 2배 내지 10배 더 높은 것인 방법.
  124. 청구항 123에 있어서, 접합체 내의 펩티드의 활성이 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 약 5배 더 높은 것인 방법.
  125. 항원-결합 폴리펩티드의 안정성, 저장 수명 및/또는 반감기를 증가시키는 방법이며,
    a) 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질을, 상기 스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 상기 막-형성 지질의 지질 이중층을 포함하는 나노지단백질 입자의 (자기)조립을 허용하는 조건하에 제공하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 상기 입자의 한쪽 또는 양쪽 표면 상에 작용기화 기를 제시하는 것인 단계,
    b) 4.5 내지 6.5 pH 범위의 낮은 pH에서 상기 작용기화 기에 접합하는, C-말단에 위치한 상보적 작용기를 갖는 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab)와 상기 입자를 접촉시키는 단계, 및
    c) 선택적으로 상기 입자 및 상기 항원-결합 폴리펩티드의 접합체를 정제하는 단계
    를 포함하고,
    이로써 상기 항원-결합 폴리펩티드의 안정성, 저장 수명 및/또는 반감기를 증가시키는 방법.
  126. 나노지단백질 입자의 안정성, 저장 수명 및/또는 반감기를 증가시키는 방법이며,
    a) 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질을, 상기 스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 상기 막-형성 지질의 지질 이중층을 포함하는 나노지단백질 입자의 (자기)조립을 허용하는 조건하에 제공하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 상기 입자의 한쪽 또는 양쪽 표면 상에 작용기화 기를 제시하는 것인 단계,
    b) 4.5 내지 6.5 pH 범위의 낮은 pH에서 상기 작용기화 기에 접합하는, C-말단에 위치한 상보적 작용기를 갖는 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab)와 상기 입자를 접촉시키는 단계, 및
    c) 선택적으로 상기 입자 및 상기 항원-결합 폴리펩티드의 접합체를 정제하는 단계
    를 포함하고,
    이로써 상기 나노지단백질 입자의 안정성, 저장 수명 및/또는 반감기를 증가시키는 방법.
  127. 청구항 125 또는 126에 있어서,
    하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고,
    상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합된 것인 방법.
  128. 청구항 127에 있어서, 상기 지방-아실은 C16 지방-아실인 방법.
  129. 20-60개 아미노산 길이의 짧은 펩티드의 안정성, 저장 수명 및/또는 반감기를 증가시키는 방법이며,
    a) 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질을, 상기 스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 상기 막-형성 지질의 지질 이중층을 포함하는 나노지단백질 입자의 (자기)조립을 허용하는 조건하에 제공하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실 (예를 들어, C16 지방-아실)을 포함하고 지방-아실은 상기 짧은 펩티드에 접합되고, 선택적으로 펩티드 접합체를 정제하는 단계,
    b) 하나 이상의 상기 막-형성 지질을 상기 입자의 한쪽 또는 양쪽 표면 상에 존재하는 작용기화 기로 변형시키는 단계, 및
    c) 4.5 내지 6.5 pH 범위의 낮은 pH에서 상기 작용기화 기에 접합하는, C-말단에 위치한 상보적 작용기를 갖는 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab)와 상기 입자를 접촉시키는 단계
    를 포함하고,
    상기 단계 c)는 조립되지 않은 막-형성 지질의 일부 또는 전부를 제거하는 중간 단계 없이, 및/또는 단계 b)의 펩티드 접합체를 농축하는 중간 단계 없이 상기 단계 b)에 후속하고,
    선택적으로 스페이서가 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서가 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결하고,
    이로써 상기 짧은 펩티드의 안정성, 저장 수명 및/또는 반감기를 증가시키는 방법.
  130. 청구항 127 내지 129 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지방-아실은 C16 지방-아실인 방법.
  131. 청구항 127 내지 130 중 어느 한 항에 있어서, 상기 짧은 펩티드는 시스틴 매듭 펩티드(CKP)인 방법.
  132. 청구항 131에 있어서, CKP는 EETI-II, 서쿨린 A, 사이클로사이코트라이드 A, 사이클로비올라신 O1, 사이클로비올라신 O12, 칼라타 B1, 칼라타 B8, 팔리코우레인, 트리사이클론 A, MCoTI 1, SOTI 1, 서쿨린 B, 사이클로사이코트라이드, 또는 varv 펩티드 A인 방법.
  133. 청구항 127 내지 130 중 어느 한 항에 있어서, 짧은 펩티드는
    (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열들에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 화학적 변형, 및/또는
    (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형
    을 포함하는 CKP 변이체인 방법.
  134. 청구항 133에 있어서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 그의 N-말단에 추가적인 리신 잔기를 포함하는 것인 방법.
  135. 청구항 133 또는 134에 있어서, 야생형 CKP는 EETI-II인 방법.
  136. 청구항 127 내지 135 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막-형성 지질은 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체 및 DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC 중 적어도 하나 이상 (예를 들어, 펩티드-C16 지방-아실 접합체 및 DOPC)을 1:3 내지 1:15, 또는 1:6 내지 1:12, 또는 1:9의 몰비로 포함하고/하거나,
    상기 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 상기 짧은 펩티드 분자를 포함하는 것인 방법.
  137. 청구항 125 내지 136 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원-결합 폴리펩티드는 Fab 또는 Fab-유사 분자이고/이거나,
    상기 접합체는 5-60, 6-40, 7-32, 40-60 또는 50개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, 상기 Fab) 분자를 포함하는 것인 방법.
  138. 청구항 127 내지 136 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접합체는 1 내지 100개의 상기 Fab 분자를 포함하고,
    선택적으로 상기 접합체는 5-30, 10-25, 15-20, 또는 18개의 상기 펩티드 분자, 및 5-40, 10-35, 15-30, 20-25 또는 23개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하거나, 또는
    선택적으로 상기 접합체는 3-30, 5-20, 10-15 또는 13개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하거나, 또는
    선택적으로 상기 접합체는 20-80, 25-70, 30-60, 35-50, 또는 40개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하는 것인 방법.
  139. 청구항 125 내지 138 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접합체는 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제를 추가로 포함하고,
    선택적으로 상기 생물학적 활성제는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 빈데신, 방사성핵종, 디프테리아 독소, 리신, 젤다나마이신, 메이탄시노이드, 칼리케아마이신 및 이들 중 임의의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포독성제이고/거나
    선택적으로 상기 검출가능한 작용제는 방사성 동위원소, 형광단, 화학발광 염료, 발색단, 효소, 금속 이온, 나노입자 및 이들 중 임의의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 표지인 방법.
  140. 청구항 125 내지 139 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접합체는 액체 제제로서 제공되고,
    상기 제제는 100-300 mg의 상기 접합체를 포함하고 10-50 cP의 점도를 갖는 것인 방법.
  141. 약제로서 사용하기 위한, 청구항 1 내지 41 및 101 중 어느 한 항의 접합체, 또는 청구항 42 내지 47 중 어느 한 항의 접합체 또는 약학 조성물, 또는 청구항 48의 제제.
  142. 암 또는 안구 장애의 치료에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 41 및 101 중 어느 한 항의 접합체, 또는 청구항 42 내지 47 중 어느 한 항의 접합체 또는 약학 조성물, 또는 청구항 48의 제제.
  143. 청구항 1 내지 41 및 101 중 어느 한 항의 접합체, 또는 청구항 42 내지 47 중 어느 한 항의 접합체 또는 약학 조성물, 또는 청구항 48의 제제의, 암 또는 안구 장애의 치료를 위한 약제의 제조에서의 용도.
  144. 청구항 1 내지 41 및 청구항 101 중 어느 한 항의 접합체, 또는 청구항 42 내지 47 중 어느 한 항의 접합체 또는 약학 조성물, 또는 청구항 48의 제제의, 혈관신생 및/또는 종양 성장을 억제하기 위한 약제의 제조에 있어서의 용도.
  145. 청구항 1 내지 41 및 101 중 어느 한 항의 접합체, 또는 청구항 42 내지 47 중 어느 한 항의 접합체 또는 약학 조성물, 또는 청구항 48의 제제의 유효량을 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab)를 이용한 개체의 치료 방법이며,
    선택적으로 추가 치료제를 개체에게 투여하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  146. 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab)를 이를 필요로 하는 개체에게 전달하는 방법이며,
    청구항 1 내지 41 및 101 중 어느 한 항의 접합체, 또는 청구항 42 내지 47 중 어느 한 항의 접합체 또는 약학 조성물, 또는 청구항 48의 제제를 제공하는 단계, 및
    상기 접합체, 조성물 또는 제제를 상기 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하고,
    이로써 상기 항원-결합 폴리펩티드를 상기 개체에게 전달하는 방법.
  147. 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab)를 이를 필요로 하는 개체에게 효능있고 안정한 액체 제제로서 전달하는 방법이며,
    상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, 상기 Fab) 및 나노지단백질 입자의 접합체를 포함하는 액체 제제를 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하고,
    상기 나노지단백질 입자는 막-형성 지질의 이중지질층을 둘러싸는 스캐폴드 단백질을 포함하고,
    상기 막-형성 지질은 상기 막-형성 지질 상의 작용기화 기 및 상기 항원-결합 폴리펩티드 상의 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 통해 5-100개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자에 접합되고,
    선택적으로 스페이서가 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서가 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결하고,
    이로써 상기 항원-결합 폴리펩티드를 개체에게 안정한 액체 제제로서 전달하는 방법.
  148. 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab)를 이를 필요로 하는 개체에게 효능있고 낮은 점도의 제제로서 전달하는 방법이며,
    상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, 상기 Fab) 및 나노지단백질 입자의 접합체를 포함하는 액체 제제를 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하고,
    상기 나노지단백질 입자는 막-형성 지질의 이중지질층을 둘러싸는 스캐폴드 단백질을 포함하고,
    하나 이상의 상기 막-형성 지질은 상기 하나 이상의 막-형성 지질 상의 작용기화 기 및 상기 항원-결합 폴리펩티드 상의 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 통해 상기 항원-결합 폴리펩티드에 접합되고,
    선택적으로 스페이서가 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서가 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결하고,
    상기 액체 제제는 10-50 cP의 점도 및 상기 접합체 100-300 mg/mL의 농도를 갖고,
    이로써 상기 항원-결합 폴리펩티드를 개체에게 낮은 점도의 제제로서 전달하는 방법.
  149. 청구항 147 또는 148에 있어서,
    하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고,
    상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합된 것인 방법.
  150. 20-60개 아미노산 길이의 짧은 펩티드를 이를 필요로 하는 개체에게 효능있고 안정한 액체 제제로서 전달하는 방법이며,
    상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, 상기 Fab) 및 나노지단백질 입자의 접합체를 포함하는 액체 제제를 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하고,
    상기 나노지단백질 입자는 막-형성 지질의 이중지질층을 둘러싸는 스캐폴드 단백질을 포함하고,
    하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고,
    상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합되고,
    상기 막-형성 지질은 상기 막-형성 지질 상의 작용기화 기 및 상기 항원-결합 폴리펩티드 상의 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 통해 5-100개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자에 접합되고,
    선택적으로 스페이서가 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서가 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결하고,
    이로써 상기 항원-결합 폴리펩티드를 개체에게 안정한 액체 제제로서 전달하는 방법.
  151. 20-60개 아미노산 길이의 짧은 펩티드를 이를 필요로 하는 개체에게 효능있고 낮은 점도의 제제로서 전달하는 방법이며,
    상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, 상기 Fab) 및 나노지단백질 입자의 접합체를 포함하는 액체 제제를 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하고,
    상기 나노지단백질 입자는 막-형성 지질의 이중지질층을 둘러싸는 스캐폴드 단백질을 포함하고,
    하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고,
    상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합되고,
    하나 이상의 상기 막-형성 지질은 상기 하나 이상의 막-형성 지질 상의 작용기화 기 및 상기 항원-결합 폴리펩티드 상의 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 통해 상기 항원-결합 폴리펩티드에 접합되고,
    선택적으로 스페이서가 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서가 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결하고,
    상기 액체 제제는 10-50 cP의 점도 및 상기 접합체 100-300 mg/mL의 농도를 갖고,
    이로써 상기 항원-결합 폴리펩티드를 개체에게 낮은 점도의 제제로서 전달하는 방법.
  152. 청구항 149 내지 151 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지방-아실은 C16 지방-아실인 방법.
  153. 청구항 149 내지 152 중 어느 한 항에 있어서, 상기 짧은 펩티드는 시스틴 매듭 펩티드(CKP)인 방법.
  154. 청구항 153에 있어서, CKP는 EETI-II, 서쿨린 A, 사이클로사이코트라이드 A, 사이클로비올라신 O1, 사이클로비올라신 O12, 칼라타 B1, 칼라타 B8, 팔리코우레인, 트리사이클론 A, MCoTI 1, SOTI 1, 서쿨린 B, 사이클로사이코트라이드, 또는 varv 펩티드 A인 방법.
  155. 청구항 149 내지 152 중 어느 한 항에 있어서, 짧은 펩티드는
    (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열들에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 화학적 변형, 및/또는
    (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형
    을 포함하는 CKP 변이체인 방법.
  156. 청구항 155에 있어서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 그의 N-말단에 추가적인 리신 잔기를 포함하는 것인 방법.
  157. 청구항 155 또는 156에 있어서, 야생형 CKP는 EETI-II인 방법.
  158. 청구항 149 내지 157 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막-형성 지질은 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체 및 DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC 중 적어도 하나 이상 (예를 들어, 펩티드-C16 지방-아실 접합체 및 DOPC)을 1:3 내지 1:15, 또는 1:6 내지 1:12, 또는 1:9의 몰비로 포함하고/하거나,
    상기 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 상기 짧은 펩티드 분자를 포함하는 것인 방법.
  159. 청구항 149 내지 158 중 어느 한 항에 있어서, 접합체 내의 짧은 펩티드의 활성이 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 더 높은 것인 방법.
  160. 청구항 159에 있어서, 접합체 내의 펩티드의 활성이 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 2배 내지 10배 더 높은 것인 방법.
  161. 청구항 160에 있어서, 접합체 내의 펩티드의 활성이 항원-결합 폴리펩티드를 포함하지 않는 접합체 내의 펩티드의 활성보다 약 5배 더 높은 것인 방법.
  162. 청구항 149 내지 161 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접합체는 1 내지 100개의 상기 Fab 분자를 포함하고,
    선택적으로 상기 접합체는 5-30, 10-25, 15-20, 또는 18개의 상기 펩티드 분자, 및 5-40, 10-35, 15-30, 20-25 또는 23개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하거나, 또는
    선택적으로 상기 접합체는 3-30, 5-20, 10-15 또는 13개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하거나, 또는
    선택적으로 상기 접합체는 20-80, 25-70, 30-60, 35-50, 또는 40개의 상기 펩티드 분자 및 10-60개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 분자를 포함하는 것인 방법.
  163. 청구항 147 내지 162 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하는 PEG 스페이서인 방법.
  164. 청구항 163에 있어서, 상기 PEG 스페이서는 1000-3000, 1500-2500, 1900-2200 또는 2000의 MW를 갖는 것인 방법.
  165. 청구항 149 내지 164 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 및 상기 짧은 펩티드는 각각 동일한 표적에 결합하는 것인 방법.
  166. 청구항 149 내지 164 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab) 및 상기 짧은 펩티드는 각각 상이한 표적에 결합하는 것인 방법.
  167. 청구항 147 내지 166 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원-결합 폴리펩티드는 인자 D, VEGF, Tie2, DR4 및 이들 중 임의의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 결합하는 Fab이고,
    상기 제제는 안구 전달을 통해 투여되는 것인 방법.
  168. 청구항 149 내지 167 중 어느 한 항에 있어서, 상기 짧은 펩티드는 인자 D, VEGF, Tie2, DR4 및 이들 중 임의의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 결합하는 것인 방법.
  169. 청구항 147 내지 166 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 폴리펩티드는 OX40, DR4, GITR, Tie2, 인자 D, VEGF, MerTK, CD3, 림포톡신 베타 수용체 및 이들 중 임의의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 결합하는 Fab인 방법.
  170. 청구항 150 내지 166 및 169 중 어느 한 항에 있어서, 상기 짧은 펩티드는 OX40, DR4, GITR, Tie2, 인자 D, VEGF, MerTK, CD3, 림포톡신 베타 수용체 및 이들 중 임의의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 결합하는 것인 방법.
  171. 청구항 147 내지 166 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 폴리펩티드는 적어도 2개의 상이한 표적에 결합하는 것인 방법.
  172. 청구항 171에 있어서, 상기 2개의 상이한 표적은 CD3 및 CD19, CD3 및 EpCAM, CD3 및 CEA, CD16 및 CD30, CD16 및 CD33, Ang-2 및 VEGF-A, 및 인자 X 및 인자 IXa로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍인 방법.
  173. 청구항 149 내지 164 중 어느 한 항에 있어서, 상기 짧은 펩티드 및 상기 항원-결합 폴리펩티드는 적어도 2개의 상이한 표적에 결합하는 것인 방법.
  174. 청구항 173에 있어서, 상기 2개의 상이한 표적은 CD3 및 CD19, CD3 및 EpCAM, CD3 및 CEA, CD16 및 CD30, CD16 및 CD33, Ang-2 및 VEGF-A, 및 인자 X 및 인자 IXa로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍인 방법.
  175. 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제를 이를 필요로 하는 개체에게 안정한 액체 제제로서 전달하는 방법이며,
    항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab), 나노지단백질 입자 및 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제의 접합체를 포함하는 액체 제제를 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하고,
    상기 나노지단백질 입자는 막-형성 지질의 이중지질층을 둘러싸는 스캐폴드 단백질을 포함하고,
    상기 막-형성 지질은 상기 막-형성 지질 상의 작용기화 기 및 상기 항원-결합 폴리펩티드 상의 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 통해 5-100개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자에 접합되고,
    상기 생물학적 활성제 또는 상기 검출가능한 작용제는 상기 스캐폴드 단백질, 상기 막-형성 지질 또는 상기 항원-결합 폴리펩티드 중 적어도 하나에 접합되고,
    선택적으로 스페이서가 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서가 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결하고,
    이로써 상기 생물학적 활성제 또는 상기 검출가능한 작용제를 이를 필요로 하는 개체에게 안정한 액체 제제로서 전달하는 방법.
  176. 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제를 이를 필요로 하는 개체에게 낮은 점도의 제제로서 전달하는 방법이며,
    항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab), 나노지단백질 입자 및 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제의 접합체를 포함하는 액체 제제를 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하고,
    상기 나노지단백질 입자는 막-형성 지질의 이중지질층을 둘러싸는 스캐폴드 단백질을 포함하고,
    하나 이상의 상기 막-형성 지질은 상기 하나 이상의 막-형성 지질 상의 작용기화 기 및 상기 항원-결합 폴리펩티드 상의 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 통해 상기 항원-결합 폴리펩티드에 접합되고,
    상기 생물학적 활성제 또는 상기 검출가능한 작용제는 상기 스캐폴드 단백질, 상기 막-형성 지질 또는 상기 항원-결합 폴리펩티드 중 적어도 하나에 접합되고,
    선택적으로 스페이서가 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서가 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결하고,
    상기 액체 제제는 10-50 cP의 점도 및 상기 접합체 100-300 mg/mL의 농도를 갖고,
    이로써 상기 생물학적 활성제 또는 상기 검출가능한 작용제를 이를 필요로 하는 개체에게 낮은 점도의 제제로서 전달하는 방법.
  177. 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제를 이를 필요로 하는 개체의 뇌 또는 중추 신경계에 전달하는 방법이며,
    항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab), 나노지단백질 입자 및 생물학적 활성제 또는 검출가능한 작용제의 접합체를 포함하는 액체 제제를 개체에게 전신 투여하는 단계
    를 포함하고,
    상기 나노지단백질 입자는 막-형성 지질의 이중지질층을 둘러싸는 스캐폴드 단백질을 포함하고,
    하나 이상의 상기 막-형성 지질은 상기 하나 이상의 막-형성 지질 상의 작용기화 기 및 상기 항원-결합 폴리펩티드 상의 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 통해 상기 항원-결합 폴리펩티드에 접합되고,
    상기 생물학적 활성제 또는 상기 검출가능한 작용제는 상기 스캐폴드 단백질, 상기 막-형성 지질 또는 상기 항원-결합 폴리펩티드 중 적어도 하나에 접합되고,
    선택적으로 스페이서가 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하고/하거나 스페이서가 상기 상보적 작용기를 상기 항원-결합 폴리펩티드에 연결하고,
    상기 접합체는 혈액-뇌 장벽을 가로질러 이동(translocate)하고,
    이로써 상기 생물학적 활성제 또는 상기 검출가능한 작용제를 이를 필요로 하는 개체의 뇌 또는 중추 신경계에 전달하는 방법.
  178. 청구항 175 내지 177 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질은 apoE2 및/또는 apoE4인 방법.
  179. 청구항 175 내지 178 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 폴리펩티드는 Fab 또는 Fab-유사 분자인 방법.
  180. 청구항 175 내지 179 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고,
    상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합된 것인 방법.
  181. 청구항 180에 있어서, 상기 지방-아실은 C16 지방-아실인 방법.
  182. 청구항 180 또는 181에 있어서, 상기 짧은 펩티드는 시스틴 매듭 펩티드(CKP)인 방법.
  183. 청구항 182에 있어서, CKP는 EETI-II, 서쿨린 A, 사이클로사이코트라이드 A, 사이클로비올라신 O1, 사이클로비올라신 O12, 칼라타 B1, 칼라타 B8, 팔리코우레인, 트리사이클론 A, MCoTI 1, SOTI 1, 서쿨린 B, 사이클로사이코트라이드, 또는 varv 펩티드 A인 방법.
  184. 청구항 180 또는 181에 있어서, 짧은 펩티드는
    (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열들에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 화학적 변형, 및/또는
    (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형
    을 포함하는 CKP 변이체인 방법.
  185. 청구항 184에 있어서, CKP 변이체는 야생형 CKP에 비해 그의 N-말단에 추가적인 리신 잔기를 포함하는 것인 방법.
  186. 청구항 184 또는 185에 있어서, 야생형 CKP는 EETI-II인 방법.
  187. 청구항 175 내지 186 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막-형성 지질은 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체 및 DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC 중 적어도 하나 이상 (예를 들어, 펩티드-C16 지방-아실 접합체 및 DOPC)을 1:3 내지 1:15, 또는 1:6 내지 1:12, 또는 1:9의 몰비로 포함하고/하거나,
    상기 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 상기 짧은 펩티드 분자를 포함하는 것인 방법.
  188. 청구항 175 내지 187 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하는 PEG 스페이서인 방법.
  189. 청구항 188에 있어서, 상기 PEG 스페이서는 1000-3000, 1500-2500, 1900-2200 또는 2000의 MW를 갖는 것인 방법.
  190. 청구항 175 내지 189 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성제는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 빈데신, 방사성핵종, 디프테리아 독소, 리신, 젤다나마이신, 메이탄시노이드, 칼리케아마이신 및 이들 중 임의의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포독성제인 방법.
  191. 청구항 175 내지 190 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진단제는 방사성 동위원소, 형광단, 화학발광 염료, 발색단, 효소, 금속 이온, 나노입자 및 이들 중 임의의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표지인 방법.
  192. 청구항 175 내지 191 중 어느 한 항에 있어서, 액체 제제는 정맥내로 투여되는 것인 방법.
  193. 청구항 175 내지 192 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막-형성 지질은 상기 막-형성 지질 상의 작용기화 기 및 상기 항원-결합 폴리펩티드 상의 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 통해 5-100개의 상기 항원-결합 폴리펩티드 분자에 접합되는 것인 방법.
  194. 청구항 175 내지 193 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원-결합 폴리펩티드는 Fab이고,
    상기 Fab는 PEG 스페이서에 의해 상기 막-형성 지질에 연결되고,
    선택적으로 상기 PEG 스페이서는 상기 작용기화 기를 상기 막-형성 지질에 연결하며 1000-3000, 1500-2500, 1900-2200 또는 2000의 MW를 갖는 것인 방법.
  195. 청구항 175 내지 194 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 제제는 10-50 cP의 점도 및 상기 접합체 100-300 mg/mL의 농도를 갖는 것인 방법.
  196. 표적 세포에 항원-결합 폴리펩티드를 전달하기 위한 시스템 또는 키트이며,
    청구항 1 내지 7, 및 청구항 11 내지 41 중 어느 한 항의 접합체, 또는
    청구항 42 내지 46 중 어느 한 항의 접합체 또는 약학 조성물, 또는
    청구항 47의 제제
    를 제조하기 위한 하나 이상의 구성성분이며, 상기 키트 또는 시스템의 하나 이상의 구획에 제공되는 구성성분, 및
    선택적으로 상기 접합체, 조성물 또는 제제를 제조하기 위한 지침서 및/또는 상기 항원-결합 폴리펩티드를 전달하기 위한 지침서
    를 포함하는 시스템 또는 키트.
  197. 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드 (예를 들어, 시스틴 매듭 펩티드)를 표적 세포에 전달하기 위한 시스템 또는 키트이며,
    청구항 8 내지 41 중 어느 한 항의 접합체, 또는
    청구항 42 내지 46 중 어느 한 항의 접합체 또는 약학 조성물, 또는
    청구항 47의 제제
    를 제조하기 위한 하나 이상의 구성성분이며, 상기 키트 또는 시스템의 하나 이상의 구획에 제공되는 구성성분, 및
    선택적으로 상기 접합체 또는 조성물을 제조하기 위한 지침서 및/또는 상기 짧은 펩티드 (예를 들어, 상기 시스틴 매듭 펩티드)를 전달하기 위한 지침서
    를 포함하는 시스템 또는 키트.
  198. 나노지단백질 입자 및 항원-결합 폴리펩티드의 접합체 제조시 지질-스캐폴드 단백질 접합을 감소시키는 방법이며,
    a) 스캐폴드 단백질 및 막-형성 지질을, 상기 스캐폴드 단백질에 의해 둘러싸인 상기 막-형성 지질의 지질 이중층을 포함하는 나노지단백질 입자의 조립을 허용하는 조건하에 제공하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 상기 막-형성 지질은 상기 입자의 한쪽 또는 양쪽 표면 상에 작용기화 기를 제시하는 것인 단계,
    b) 상기 스캐폴드 단백질에 대하여 보다는 상기 작용기에 대한 상기 작용기화 기의 접합이 유리한 낮은 pH에서 상기 입자를 C-말단에 위치한 상보적 작용기를 갖는 항원-결합 폴리펩티드 (예를 들어, Fab)와 접촉시키는 단계, 및
    c) 선택적으로 상기 입자 및 상기 항원-결합 폴리펩티드의 접합체를 정제하는 단계
    를 포함하는 방법.
  199. 청구항 198에 있어서, 상기 작용기화 기는 상기 낮은 pH에서 상기 스캐폴드 단백질에 접합되지 않는 것인 방법.
  200. 청구항 198 또는 199에 있어서, 상기 낮은 pH는 pH 5.5 내지 6.5, pH 5 내지 6, 또는 pH 6인 방법.
  201. 청구항 198 내지 200 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b)는 조립되지 않은 막-형성 지질의 일부 또는 전부를 제거하는 중간 단계 없이 상기 단계 a)에 후속하는 것인 방법.
  202. 청구항 198 내지 201 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 작용기화 기는 말레이미드 유도체이고,
    상기 작용기는 시스테인 티올기이고,
    선택적으로 상기 시스테인 아미노산 잔기는 항원-결합 폴리펩티드가 유래되는 항체에서 힌지 이황화 결합을 형성하는 (예를 들어, Cys-226 또는 Cys-227) 것인 방법.
  203. 청구항 198 내지 202 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 상기 막-형성 지질은 C4-28 지방-아실이고,
    상기 지방-아실은 20-60개 아미노산의 짧은 펩티드에 접합된 것인 방법.
  204. 청구항 203에 있어서, 상기 지방-아실은 C16 지방-아실인 방법.
  205. 청구항 203 또는 204에 있어서, 상기 짧은 펩티드는 시스틴 매듭 펩티드(CKP)인 방법.
  206. 청구항 203에 있어서, CKP는 EETI-II, 서쿨린 A, 사이클로사이코트라이드 A, 사이클로비올라신 O1, 사이클로비올라신 O12, 칼라타 B1, 칼라타 B8, 팔리코우레인, 트리사이클론 A, MCoTI 1, SOTI 1, 서쿨린 B, 사이클로사이코트라이드, 또는 varv 펩티드 A인 방법.
  207. 청구항 203 또는 204에 있어서, 짧은 펩티드는
    (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열들에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 화학적 변형, 및/또는
    (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형
    을 포함하는 CKP 변이체인 방법.
  208. 청구항 203 내지 207 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막-형성 지질은 펩티드-C4-28 지방-아실 접합체 및 DMPC, DOPC, DOPS, DOPE, DPPC 중 적어도 하나 이상 (예를 들어, 펩티드-C16 지방-아실 접합체 및 DOPC)을 1:3 내지 1:15, 또는 1:6 내지 1:12, 또는 1:9의 몰비로 포함하고/하거나
    상기 접합체는 1-100, 10-90, 20-80, 30-70, 40-60, 또는 60개의 상기 짧은 펩티드 분자를 포함하는 것인 방법.
  209. 지질-기반 나노입자 표면에 부착된 짧은 펩티드의 생물학적 활성을 증가시키는 방법이며,
    (a) 표면에 부착된 짧은 펩티드를 포함하는 지질-기반 나노입자를 제공하는 단계로서, 여기서 지질-기반 나노입자의 하나 이상의 지질은 작용기화 기를 제시하는 것인 단계, 및
    (b) 상기 나노입자를 작용기를 갖는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 작용기화 기의 상기 작용기에 대한 접합이 유리한 조건하에 접촉시키는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  210. 청구항 209에 있어서,
    지질-기반 나노입자, 짧은 펩티드 및 폴리펩티드를 포함하는 접합체를 정제하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  211. 청구항 209 또는 210에 있어서, 지질-기반 나노입자가 지질 이중층을 포함하는 것인 방법.
  212. 청구항 209 또는 210에 있어서, 지질-기반 나노입자는 리포좀, 고체 지질 나노입자(SLN) 또는 나노구조 지질 담체(NLC)인 방법.
  213. 청구항 209 내지 212 중 어느 한 항에 있어서,
    스페이서는 상기 작용기화 기를 지질-기반 나노입자의 표면 상의 지질에 연결하고/하거나
    스페이서는 상기 상보적 작용기를 상기 폴리펩티드에 연결하는 것인 방법.
  214. 청구항 209 내지 213 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 항원-결합 폴리펩티드인 방법.
  215. 청구항 214에 있어서, 항원-결합 폴리펩티드는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 단일 사슬 Fab(scFab), 단일 사슬 Fv(scFv), VH-VH 이량체, VL-VL 이량체, VH-VL 이량체, 단일 도메인, 디아바디, 선형 항체 및 이들 중 임의의 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  216. 청구항 209 내지 215 중 어느 한 항에 있어서, 짧은 펩티드는
    (a) 야생형 CKP의 상응하는 하나 이상의 루프 서열들에 비해 하나 이상의 루프 서열에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (b) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (c) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 및/또는 치환,
    (d) 야생형 CKP에 비해 N-말단에서 화학적 변형, 및/또는
    (e) 야생형 CKP에 비해 C-말단에서 화학적 변형
    을 포함하는 CKP 또는 CKP의 변이체인 방법.
  217. 청구항 209 내지 216 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드의 접합 후 짧은 펩티드의 활성은, 지질-기반 나노입자에 대한 폴리펩티드의 접합 전 짧은 펩티드의 활성과 비교하여 지질-기반 나노입자에 대한 폴리펩티드의 접합 후가 2배 내지 100배 더 높은 것인 방법.
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