KR20230017822A - 세포외 소포를 만들기 위한 방법 및 이들의 용도 - Google Patents

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제임스 토마스 쾨르버
용리안 선
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본원 발명은 세포외 소포(EV)를 만들기 위한 향상된 방법과 조성물에 관계한다. 본원 발명은 또한, 신규한 EV 기반 ELISA 검정 및 이런 검정을 수행하기 위한 키트뿐만 아니라 막-결합 항원을 포함하는 EV를 이용하여 특정 항원에 대한 항체를 생산하는 방법에 관계한다.

Description

세포외 소포를 만들기 위한 방법 및 이들의 용도
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2020년 6월 1일 자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 63/033,014에 우선권을 주장하고, 이것의 내용은 본원에서 참조로서 편입된다.
도입
본원 발명은 세포외 소포 (EV)를 만들기 위한 향상된 방법과 조성물에 관계한다. 본원 발명은 또한, 신규한 EV 기반 ELISA 검정 및 이런 검정을 수행하기 위한 키트뿐만 아니라 관심되는 막-결합 항원을 포함하는 EV를 이용하여 특정 항원에 대한 항체를 생산하는 방법에 관계한다.
배경
세포외 소포 (EV)는 지질 이중층에 의해 에워싸인 세포 유래된 막성 구조의 이질성 군이다. EV는 엑소솜, 마이크로소포, 바이러스 유사 입자 (VLP) 및 아폽토시스체 (> 1μm)를 포함한다 (Th
Figure pct00001
ry et al., "Membrane vesicles as conveyors of immune responses," Nat Rev Immunol. 2009;9(8):581-93; Andaloussi et al., "Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities," Nat Rev Drug Discov. 2013;12(5):347-357). EV는 EV 표면 상에서 선천적 입체형태의 막 단백질을 고도로 농축된 방식으로 디스플레이할 수 있다. 예를 들면, 막 단백질은 세포막에서보다 10 내지 100 배 높은 농도로 EV의 표면 상에 존재할 수 있다.
견실한 EV 생성 플랫폼의 특징은 단일통과와 다중통과 막 단백질 둘 모두를 재현적으로 통합하는 능력; 충분한 EV 수확량 (예를 들면, mg 수준)의 생성; 합리적인 규모 (예를 들면, 약 1L)로 쉽게 형질감염됨; 그리고 종 정합된 배경을 생성하는 능력 중에서 한 가지 이상을 포함한다. EV를 생산하는 선행 방법은 이들 요건 모두를 충족시킬 수는 없다.
요약
본원 발명은 세포외 소포 (EV)를 만들기 위한 향상된 방법과 조성물에 관계한다. 본원 발명은 또한, 신규한 EV 기반 ELISA 검정 및 이런 검정을 수행하기 위한 키트뿐만 아니라 관심되는 막-결합 항원을 포함하는 EV를 이용하여 특정 항원에 대한 항체를 생산하는 방법에 관계한다.
한 양상에서, 본원 발명은 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 (a) (i) 소포 인자에 노출된 세포에서 이종성 단백질을 발현하고, (ii) 상기 세포를 배지에 배양하고, (iii) 이종성 단백질을 포함하는 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리함으로써, 이종성 단백질을 포함하는 복수의 EV를 생산하되, 상기 소포 인자는 아실.Hrs (Acyl.Hrs), ARRDC1, ARF6 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 단계; (b) 복수의 EV를 동물에게 투여함으로써 상기 동물을 면역화하는 단계; 및 (c) 이종성 단백질에 결합하는 항체를 상기 동물로부터 단리하는 단계를 포함한다.
대안으로 및/또는 추가적으로, 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하기 위한 방법은 (a) (i) 이종성 단백질을 세포에서 발현하고, (ii) 상기 세포를 배지에 배양하고, (iii) 상기 단백질을 포함하는 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리함으로써, 이종성 단백질을 포함하는 복수의 EV를 생산하되, 상기 세포는 비부착성 세포인 단계; (b) 복수의 EV를 동물에게 투여함으로써 상기 동물을 면역화하는 단계; 및 (c) 이종성 단백질에 결합하는 항체를 상기 동물로부터 단리하는 단계를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 소포 인자, 예를 들면, 이종성 소포 인자, 예를 들면, MLGag, 아실.Hrs, ARRDC1, ARF6 또는 이들의 조합을 세포에서 발현하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 복수의 EV는 초원심분리에 의해 배지로부터 단리된다. 일정한 구체예에서, 복수의 EV는 0주 차, 2주 차 및 4주 차에 동물에게 투여된다. 일정한 구체예에서, 항체를 생산하기 위한 방법은 EV와 동시에 어쥬번트, 예를 들면, Ribi 어쥬번트를 동물에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, 항체를 생산하기 위한 방법은 동물에서 단백질에 대한 면역 반응을 증강하기 위해, 추가 접종(boost)을 동물에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, 추가 접종은 단백질, 상기 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원 발명은 본원 발명의 방법에 의해 생산된 항체를 더욱 제공한다. 일정한 구체예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일정한 구체예에서, 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 본원 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 부분 및 약학적으로 허용되는 운반체를 포함하는 약학적 조성물을 더욱 제공한다. 일정한 구체예에서, 약학적 조성물은 추가 치료제를 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 방법에 의해 생산된 항체, 또는 이의 약학적 조성물은 약제로서 이용될 수 있고, 질환을 치료하는 데 이용될 수 있고 및/또는 약제의 제조에서 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 방법은 본원에서 개시된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 이의 약학적 조성물의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원 발명은 본원에서 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 단리된 핵산, 그리고 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포를 더욱 제공한다. 본원 발명은 또한, 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건하에 배양하고, 그리고 임의적으로, 상기 항체를 상기 숙주 세포로부터 단리함으로써 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 복수의 EV를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 (a) 이종성 단백질을 세포에서 발현하는 단계; (b) 상기 세포를 배지에 배양하는 단계; 및 (c) 이종성 단백질을 포함하는 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리하는 단계를 포함하되, 상기 세포는 아실.Hrs, ARRDC1, ARF6 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 소포 인자에 노출되거나/노출되고 상기 세포는 비부착성 세포이다.
일정한 구체예에서, 이종성 단백질은 막 단백질, 예를 들면, 단일통과 막 단백질 또는 다중통과 막 단백질이다. 일정한 구체예에서, 막 단백질은 단백질 복합체의 구성원이다. 일정한 구체예에서, 막 단백질은 막경유 단백질이 아니지만, 막경유 단백질과의 복합체의 구성원이다. 일정한 구체예에서, 비부착성 세포는 293S 세포 또는 Expi293FTM 세포이다.
다른 양상에서, 본원 발명은 항체를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 상기 방법은 (a) 샘플을 포획 시약과 함께 인큐베이션하되, 상기 포획 시약은 막-결합 항원을 포함하는 복수의 EV를 포함하고, 그리고 상기 항체는 상기 막-결합 항원에 특이적으로 결합하는 단계; 및 (b) 포획 시약에 결합된 항체를 검출가능 항체와 접촉시켜, 결합된 항체를 검출하되, 상기 검출가능 항체는 상기 항체에 특이적으로 결합하는 단계를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 복수의 EV는 (i) 세포에서 막-결합 항원의 발현, (ii) 상기 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여, 막-결합 항원을 디스플레이하는 복수의 EV를 생산함 및 (iii) 막-결합 항원을 디스플레이하는 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리함에 의해 생성된다. 일정한 구체예에서, 세포는 아실.Hrs, ARRDC1, ARF6 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 소포 인자에 노출되고/되거나 세포는 비부착성 세포이다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 (c) (b)에서 검출된 항체의 양을 계측하되, 상기 양은 표준 곡선을 이용하여 정량되는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 샘플은 혈장, 혈청 또는 소변 샘플이다. 일정한 구체예에서, 포획 항체는 고체 지지체, 예를 들면, 마이크로역가 평판 상에 고정될 수 있다. 일정한 구체예에서, 검출가능 항체는 형광 표지화된다. 일정한 구체예에서, 막-결합 항원은 막 단백질 또는 이의 단편이다.
본원 발명은 샘플 내에서 항체를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 키트는 (a) 막-결합 항원을 포함하는 복수의 EV를 포함하는 포획 시약으로서, 여기서 검출되는 항체가 막-결합 항원에 특이적으로 결합하고; 및 (b) 검출되는 항체에 특이적으로 결합하는 검출가능 항체를 포함한다. 일정한 구체예에서, 복수의 EV가 고체 지지체 상에 고정된다. 일정한 구체예에서, 고체 지지체는 마이크로역가 평판이다. 일정한 구체예에서, 검출가능 항체는 형광 표지화된다. 일정한 구체예에서, 항원은 막 단백질 또는 이의 단편이다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 항체-생산 세포를 분류하기 위한 방법을 더욱 제공한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 항체-생산 세포를 복수의 EV와 함께 인큐베이션하되, 상기 복수의 EV는 (i) 막-결합 항원 및 첫 번째 검출가능 마커를 포함하는 EV의 첫 번째 모집단으로서, 여기서 상기 항체-생산 세포의 부분집합이 막-결합 항원에 특이적으로 결합하고; 및 (b) 막-결합 항원을 결여하지만, 첫 번째 마커와 구별 가능한 두 번째 검출가능 마커를 포함하는 EV의 두 번째 모집단을 포함하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 항체-생산 세포를 EV의 첫 번째 모집단, 또는 EV의 첫 번째 모집단 및 EV의 두 번째 모집단의 조합 중 어느 하나에 대한 그들의 결합에 근거하여 분류하는 단계를 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, EV의 첫 번째 모집단은 (i) 첫 번째 세포에서 막-결합 항원 및 첫 번째 검출가능 마커의 발현, (ii) 첫 번째 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여, 막-결합 항원을 디스플레이하는 복수의 EV를 생산함 및 (iii) 막-결합 항원을 디스플레이하는 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리함에 의해 생성된다. 일정한 구체예에서, EV의 두 번째 모집단은 (i) 두 번째 세포에서 두 번째 검출가능 마커의 발현, (ii) 두 번째 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여, 두 번째 검출가능 마커를 포함하는 복수의 EV를 생산함 및 (iii) 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리함에 의해 생성된다. 일정한 구체예에서, 세포는 아실.Hrs, ARRDC1, ARF6 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 소포 인자에 노출된다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 세포 및/또는 두 번째 세포는 비부착성 세포이다.
도면의 간단한 설명
도 1. 세포외 소포 (EV)의 형성을 보여주는 개략적 도면.
도 2a-2b. EV 형성을 위한 설계 원리. (2a) 일반적인 EV 형성기 및 아실.Hrs 소유 EV 설계. (2b) MLGag 및 ARRDC1 소유 EV 설계.
도 3. EV를 생산하는 작업 흐름을 보여주는 개략적 도면.
도 4. 웨스턴 블롯을 이용하여, MP-X를 발현하는 EV를 생산할 수 있는 소포 인자의 확인.
도 5. 균일한 소포 크기를 보여주는 동적 광 산란 (DLS).
도 6. 웨스턴 블롯은 소포 인자 MLGag, Acryl.Hrs 및 뮤린 ARRDC1 (mARRDC1)이 뮤린 세포에서 MP-X 발현 EV 형성을 유도한다는 것을 보여주었다.
도 7a-7b. EV 생산 과제: (7a) 효율적인 EV 정제 획득의 과제; 및 (7b) 충분한 수확량 획득의 과제.
도 8a-8c. MLGag를 소포 인자로서 갖는, 표적 단백질을 발현하는 EV를 생산하는 데 이용된 Expi293FTM 세포 및 293S 세포에서 수확 일에 EV의 평균 수확량 (8a, 8b) 및 세포 생존력 (8c)이 계측되었다.
도 9a-9c. Expi293FTM 세포 생산된 EV 및 293S 세포 생산된 EV 사이에 MP-7 (9a), MP-8 (9b), 또는 MP-4 (9c)의 발현 수준을 비교하기 위해 ELISA가 수행되었다.
도 10a-10c. (10a) 윤곽이 명확한 EV 입자가 생성되었다. (10b, 10c) EV 기반 ELISA는 단일통과 (10b) 및 다중통과 (10c) 막 단백질에 대한 FACS+ 항체를 검출할 수 있다.
도 11a-11d. Expi293FTM EV 면역화된 쥐와 생쥐를 선별검사하기 위한 세포주가 확인되었다. (11a) 개략적 도면은 동물 면역화 프로토콜을 보여준다. (11b) 세포에 항혈청 및 전채혈의 결합이 FACS에 의해 도시되었다. 쥐에서 EV 면역화로부터 획득된 pAb는 293 세포에는 결합하지만, RBA 세포에는 그렇지 않았다. 생쥐에서 EV 면역화로부터 획득된 pAb는 RBA 세포에는 결합하지만, 3T3 세포에는 그렇지 않았다. (11c, 11d) eGFP를 이용한 FACS는 RBA (11c) 및 3T3 (11d) 둘 모두 형질감염 가능하다는 것을 보여주었다.
도 12a-12c. Expi293FTM EV 면역화된 토끼와 라마/낙타를 선별검사하기 위한 세포주가 확인되었다. (12a) 개략적 도면은 동물 면역화 프로토콜을 보여준다. (12b) 세포에 항혈청 및 전채혈의 결합이 FACS에 의해 도시되었다. 토끼에서 EV 면역화로부터 획득된 pAb는 RK13 세포에 결합하지 않았다. 라마에서 EV 면역화로부터 획득된 pAb는 3T3 세포에는 결합하지만, Dubca 세포에는 결합하지 않았다. (12c) FACS는 RK13 세포 (왼쪽) 및 Dubca 세포 (오른쪽) 둘 모두 형질감염 가능하다는 것을 보여주었다.
도 13. 쥐 RBA 세포는 EV를 생산할 수 있지만, 수확량이 293S 세포와 비교하여 적었다.
도 14. 웨스턴 블롯은 전체 세포 용해물 및 EV에서 MP-1의 존재를 확증하였다.
도 15. 웨스턴 블롯은 MP-2가 EV 및 전체 세포 용해물 내에 존재한다는 것을 확증하였다.
도 16. 웨스턴 블롯은 MP-3이 ARF-6으로 형질감염된 세포로부터 생산된 ARF-6 소유 EV 내에는 존재하지만, MLGag에서는 그렇지 않다는 것을 확증하였다.
도 17. Gag 캡시드가 MP의 큰 세포내 도메인 (ICD)과의 통합을 입체적으로 차단한다는 것을 보여주는 개략적 도면.
도 18. 단백질 ELISA, EV 기반 ELISA, 그리고 FACS의 작동 기전을 보여주는 개략적 도면.
도 19a-19d. EV 기반 ELISA 역가 (19a)는 MP-4에 대한 FACS 역가 (19b)와 잘 상관되었다. FACS (19c) 및 EV 기반 ELISA (19d) 역가는 단백질 ELISA 역가와 잘 상관되지 않았다.
도 20a-20b. DNA 면역화를 이용하여 MP-5로 면역화된 생쥐로부터 항-MP-5 혈청이 수집되었다. EV 기반 ELISA 역가 (20a) 및 FACS 역가 (20b)가 도시된다.
도 21. EV 기반 ELISA는 항-MP5 항체를 검출하기 위한 FACS와 잘 상관되었다.
도 22a-22c. MP-6 EV의 초기 배치의 품질 관리 (QC) 분석. (22a) 웨스턴 블롯은 단리된 EV에서 MP-6의 존재를 보여주었다. (22b) 웨스턴 블롯은 단리된 EV에서 소포 인자의 존재를 보여주었다. (22c) 재조합 단백질 표준을 이용한 정량적 웨스턴 블롯이, 단리된 EV에서 MP-6을 정량하는 데 이용되었다.
도 23. MP-6 EV을 이용한 면역화 프로토콜.
도 24a-24d. (24a) 웨스턴 블롯은 EV로 면역화된 쥐로부터 수집된 항혈청에서 항-MP-6 및 항-Gag 항체의 존재를 보여주었다. (24b) FACS는 형질감염 대조 세포에 대해 항혈청의 어떤 유의미한 비특이적 결합도 없다는 것을 보여주었다. (24c, 24d) FACS는 DNA/단백질 추가 접종 전 (24c) 및 DNA/단백질 추가 접종 후 (24d), 수집된 항혈청에서 MP-6 발현 세포에 결합을 보여주었다.
도 25a-25b. 정제된 일차 항체 (25a) 및 혈청 (25b)은 유사한 FACS 결과를 보여주었다.
도 26. DNA 추가 접종이 EV 면역화된 쥐로부터 항-MP-6 역가를 선택적으로 증가시켰다.
도 27a-27c. 생쥐 항-MP-7 일차 항체가 MP-7 발현 EV로 면역화된 녹아웃 생쥐로부터 생성되었고, 그리고 FACS에 의해 선별검사되었다. 항-MP-7 항체가 마지막 추가 접종 전 (27a) 및 마지막 추가 접종 후 (27b), 수집된 혈청에서 검출되었다. 혈청이 3T3 대조 세포 (27c)에는 결합하지 않았다.
도 28. 생쥐 항-MP-7 하이브리도마가 FACS에 의해 선별검사되었다.
도 29. 생쥐 항-MP-7 하이브리도마가 FACS에 의해 선별검사되었다.
도 30. 일차 세포에서 FACS를 이용한, 생쥐 항-MP-7 mAb의 선별검사.
도 31a-31b. 쥐가 막 결합된 MP-1 또는 MP-1 DNA를 포함하는 EV로, 그리고 단백질 또는 DNA 추가 접종으로 면역화되었다. 추가 접종 전 (31a) 및 추가 접종 후 (31b), 이들 쥐로부터 수집된 항혈청이 FACS에 의해 선별검사되었다.
도 32. 쥐 항-MP-1 하이브리도마가 FACS에 의해 선별검사되었다.
도 33. 쥐가 단지 단백질, DNA, 또는 막 결합된 MP-8을 포함하는 EV로만 면역화되었다. 각 군에서 발견된 ELISA 양성 및 FACS 양성 항체의 수가 도시된다.
도 34. 쥐 및 토끼가 MP-9 및 MP-9 DNA를 포함하는 EV로 면역화되었다. GFP-표지화 MP-9 EV 및 RFP-표지화 빈 EV를 이용한 쥐 및 토끼 IgG+ B 세포의 염색이 도시된다.
도 35. 쥐 및 토끼가 MP-10 또는 MP-11을 포함하는 EV로 면역화되었다. RFP-표지화 MP EV 및 GFP-표지화 빈 EV를 이용한 토끼 IgG+ B 세포의 염색이 도시된다.
도 36a. 표면 발현을 위해 MP-14, MP-15, MP-16 및 MP-17 (공동수용체 "B"), 그리고 MP-12 및 MP-13 (수용체 "A")의 공동발현이 필요하다.
도 36b. MP-14, MP-15, MP-16 및 MP-17 (공동수용체 "B"), 그리고 MP-12 및 MP-13 (수용체 "A")의 공동발현은 EV 통합을 야기한다.
상세한 설명
본원 발명은 세포외 소포 (EV)를 만들기 위한 향상된 방법과 조성물에 관계한다. 본원 발명은 또한, 신규한 EV 기반 ELISA 검정 및 이런 검정을 수행하기 위한 키트뿐만 아니라 관심되는 막-결합 항원, 예를 들면, 막 단백질을 포함하는 EV를 이용하여 특정 항원에 대한 항체를 생산하는 방법에 관계한다. 본원 발명은 일정한 정제 단계, 소포 인자 및/또는 EV 생산 세포주를 채택함으로써, EV의 신속하고 높은 수확량 생성을 달성하는 것이 가능하다는 발견에 부분적으로 근거된다. 이것은 또한, 동물을 항원 제시 EV로 면역화하는 것이 도전적인 막 단백질 항원 및 복합체에 대한 기능적 항체의 개발을 가능하게 한다는 발견에 부분적으로 근거된다. 본원 발명의 무제한적 구체예가 본원에서 설명된다.
개시의 명료함을 위해, 하지만 제한 없이, 상세한 설명은 하기의 하위섹션으로 나눠진다:
I. 정의;
II. EV를 만드는 방법;
III. EV 기반 ELISA 검정 및 키트;
IV. EV를 이용하여 항체를 생산하는 방법;
V. 진단과 검출을 위한 방법과 조성물;
VI. 약학적 조성물;
VII. 치료 방법 및 투여 루트;
VIII. 제조 물품; 그리고
IX. 예시적인 구체예.
I. 정의
본원 발명에서 이용된 용어는 일반적으로, 당해 분야에서, 본원 발명의 맥락에서, 그리고 각 용어가 이용되는 특정한 맥락에서 그들의 통상적인 의미를 갖는다. 본원 발명의 조성물과 방법 및 이들을 만들고 이용하는 방법을 설명함에 있어서 실무자에게 추가 지침을 제공하기 위해, 일정한 용어가 아래에, 또는 본원 발명의 다른 곳에서 논의된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 청구항에서 및/또는 본 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 이용될 때 단어 "a" 또는 "an"의 이용은 "하나"를 의미할 수 있지만, 이것은 또한 "하나 이상," "적어도 하나," 그리고 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 부합한다. 더 나아가, 용어 "갖는," "포함하는," "내포하는" 및 "함유하는"은 교체 가능하고, 그리고 당업자는 이들 용어가 개방형 용어라는 것을 인식하고 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정될 때 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위 이내를 의미하는데, 이것은 상기 값이 어떻게 계측되거나 또는 결정되는지, 다시 말하면, 계측 시스템의 제한에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들면, "약"은 당해 분야에서 관례에 따라, 3 이내 또는 3보다 큰 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안으로, "약"은 소정의 값의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 더 바람직하게는 최대 5%, 그리고 더 바람직하게는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안으로, 특히, 생물학적 시스템 또는 과정에 대하여, 상기 용어는 값의 1 크기 자릿수 이내, 바람직하게는 5배 이내, 그리고 더 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다.
본원에서 "개체" 또는 "피험자"는 척추동물, 예컨대 인간 또는 비인간 동물, 예를 들면, 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비인간 영장류, 경작용 동물, 스포츠 동물, 설치류 및 애완동물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 비인간 동물 개체의 무제한적 실례는 설치류 예컨대 생쥐, 쥐, 햄스터 및 기니 피그; 토끼; 개; 고양이; 양; 돼지; 염소; 소; 말; 그리고 비인간 영장류 예컨대 유인원 및 원숭이를 포함한다. 일정한 구체예에서, 개체 또는 피험자는 인간이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "시험관내"는 인공 환경, 그리고 인공 환경에서 일어나는 과정 또는 반응을 지칭한다. 예시된 시험관내 환경에는 시험관 및 세포 배양액이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "생체내"는 자연 환경 (예를 들면, 동물 또는 세포), 그리고 자연 환경에서 일어나는 과정 또는 반응, 예컨대 배아 발달, 세포 분화, 신경관 형성 등을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "생물학적 샘플"은 생물학적 유체, 예를 들면, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도, 장관 및 비뇨생식기로의 유체, 누액, 타액, 모유, 림프계로부터 유체, 정액, 뇌척수액, 내부 기관계 유체, 복수, 종양 낭액, 양수, 기관지폐포액, 담즙액, 그리고 이들의 조합을 비롯하여, 개체로부터 획득된 생물학적 물질의 샘플을 지칭한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 그리고 항체 단편 (이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 실례는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들면, scFv); 그리고 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 반면 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 실제적으로 동질성 항체의 모집단으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 모집단을 구성하는 개별 항체는 예를 들면, 자연 발생 돌연변이를 내포하거나 또는 단일클론 항체 제조물의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체 (이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 대해 지향된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 동질성 모집단으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 표시하고, 그리고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본원 발명에 따른 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 디스플레이 방법, 그리고 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 내포하는 유전자도입 동물을 활용하는 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있는데, 이런 방법 및 단일클론 항체를 만들기 위한 다른 예시적인 방법은 본원에서 설명된다.
"나신 항체"는 이종성 모이어티 (예를 들면, 세포독성 모이어티) 또는 방사성 표지에 접합되지 않는 항체를 지칭한다. 나신 항체는 약학적 조성물 내에 존재할 수 있다.
항체의 "부류"는 이의 중쇄에 의해 소유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 그리고 이들 중에서 몇몇은 하위부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱 나눠질 수 있다. 일정한 구체예에서, 항체는 IgG1 아이소타입이다. 일정한 구체예에서, 항체는 Fc-영역 효과기 기능을 감소시키기 위한 P329G, L234A 및 L235A 돌연변이를 갖는 IgG1 아이소타입이다. 다른 구체예에서, 항체는 IgG2 아이소타입이다. 일정한 구체예에서, 항체는 IgG4 항체의 안정성을 향상시키기 위한, 힌지 영역에서 S228P 돌연변이를 갖는 IgG4 아이소타입이다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, γ, ε, γ 및 μ로 불린다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 두 가지 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (CDR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, CDR과 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기의 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 선천적 항체 구조와 실제적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본원에서 규정된 바와 같은 Fc 영역을 내포하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다.
"단리된" 항체는 이의 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 것이다. 일정한 구체예에서, 항체는 예를 들면, 전기이동 (예를 들면, SDS-PAGE, 등전위 초점 (IEF), 모세관 전기이동) 또는 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정될 때, 95% 또는 99%보다 높은 순도로 정제된다. 항체 순도의 사정을 위한 방법에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조한다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 유래된다. 일반적으로, 서열의 하위군은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), Vols. 1-3의 경우에서와 같은 하위군이다. 일정한 구체예에서, VL의 경우에, 하위군은 Kabat et al., 위와 같음의 경우에서와 같은 하위군 카파 I이다. 일정한 구체예에서, VH의 경우에, 하위군은 Kabat et al., 위와 같음의 경우에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화" 항체는 비인간 HVR로부터 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실제적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 HVR (예를 들면, CDR)의 전부 또는 실제적으로 전부가 비인간 항체의 것들에 상응하고, 그리고 FR의 전부 또는 실제적으로 전부가 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 임의적으로, 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역"은 서열에서 초가변성 ("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")이고 및/또는 구조적으로 규정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하고 및/또는 항원 접촉 잔기 ("항원 접촉")를 내포하는, 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 별도로 표시되지 않으면, CDR 잔기 및 가변 도메인에서 다른 잔기 (예를 들면, FR 잔기)는 본원에서 Kabat et al., 위와 같음에 따라서 넘버링된다. 일반적으로, 항체는 6개의 CDR: VH에서 3개 (H1, H2, H3), 그리고 VL에서 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 본원에서 예시적인 CDR은 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 그리고 96-101 (H3)에서 발생하는 초가변 루프 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 그리고 95-102 (H3)에서 발생하는 CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 그리고 93-101 (H3)에서 발생하는 항원 접촉 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 그리고
(d) CDR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 그리고 94-102 (H3)를 비롯한, (a), (b) 및/또는 (c)의 조합.
"면역접합체"는 세포독성 작용제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 한 가지 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 항체이다.
용어 "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 각 뉴클레오티드는 염기, 특이적으로 퓨린- 또는 피리미딘 염기 (다시 말하면, 시토신 (C), 구아닌 (G), 아데닌 (A), 티민 (T) 또는 우라실 (U)), 당 (다시 말하면, 데옥시리보오스 또는 리보오스), 그리고 인산염 기로 구성된다. 종종, 핵산 분자는 염기의 서열에 의해 설명되는데, 여기서 상기 염기는 핵산 분자의 일차 구조 (선형 구조)를 나타낸다. 염기의 서열은 전형적으로 5'에서 3'로 나타내진다. 본원에서, 용어 핵산 분자는 예를 들면, 상보성 DNA (cDNA) 및 유전체 DNA를 비롯한 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 특히 전령 RNA (mRNA), DNA 또는 RNA의 합성 형태, 그리고 이들 분자 중에서 두 가지 이상을 포함하는 혼성 중합체를 포괄한다. 핵산 분자는 선형 또는 환상일 수 있다. 이에 더하여, 용어 핵산 분자는 센스와 안티센스 가닥뿐만 아니라 단일 가닥과 이중 가닥 형태 둘 모두를 포함한다. 게다가, 본원에서 설명된 핵산 분자는 자연 발생 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 내포할 수 있다. 비-자연 발생 뉴클레오티드의 실례는 유도체화된 당 또는 인산염 중추 연쇄 또는 화학적으로 변형된 잔기를 갖는 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함한다. 핵산 분자는 또한, 시험관내에서 및/또는 생체내에서, 예를 들면, 숙주 또는 환자에서 본원 발명의 항체의 직접적인 발현을 위한 벡터로서 적합한 DNA와 RNA 분자를 포괄한다. 이런 DNA (예를 들면, cDNA) 또는 RNA (예를 들면, mRNA) 벡터는 변형되지 않거나 또는 변형될 수 있다. 예를 들면, mRNA는 mRNA가 개체 내로 주입되어 항체가 생체내에서 생성될 수 있도록, RNA 벡터의 안정성 및/또는 인코딩된 분자의 발현을 증강하기 위해 화학적으로 변형될 수 있다 (참조: 예를 들면, Stadler er al, Nature Medicine 2017, 2017년 6월 12일 온라인 공개됨, doi:10.1038/nm.4356 또는 EP 2 101 823 B1).
"단리된" 핵산은 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산에는 핵산 분자를 통상적으로 내포하는 세포에 내포된 핵산 분자가 포함되지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항체를 인코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄와 경쇄 (또는 이들의 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자, 단일 벡터 또는 별개의 벡터에서 이런 핵산 분자(들), 그리고 숙주 세포 내에 하나 이상의 위치에서 존재하는 이런 핵산 분자(들)를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 자신이 연관되는 다른 핵산을 증식할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기 복제 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 유전체 내로 통합된 벡터를 포함한다. 일정한 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 주동할 수 있다. 이런 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항원" 및 "면역원"은 그것으로 면역화된 동물에서 면역 반응 (바람직하게는 항체 반응)을 유도하는 분자 또는 물질을 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다. 항원은 단백질, 펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 다른 자연 발생 또는 합성 화합물일 수 있다. 일정한 구체예에서, 항원은 단백질이다. 일정한 구체예에서, 항원은 막 단백질 또는 이의 단편이다. 일정한 구체예에서, 항원은 단일통과 또는 다중통과 막 단백질 또는 이의 단편이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "이종성 단백질"은 이러한 이종성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입함으로써, 세포에서 발현되는 단백질을 지칭한다. 일정한 구체예에서, 이종성 단백질은 세포에 선천적이지 않다. 일정한 구체예에서, 이종성 단백질은 세포에 선천적이지만, 이러한 이종성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내로의 도입으로 인해 과다발현되는 단백질이다.
본원에서 교체가능하게 이용된 바와 같이, 용어 "막-결합 항원" 및 "막 항원"은 막에 직접적으로 또는 간접적으로 결합되는 항원을 지칭한다.
본원에서 교체가능하게 이용된 바와 같이, 용어 "막 결합된 단백질" 및 "막 단백질"은 막에 직접적으로 또는 간접적으로 결합되는 단백질을 지칭한다. 막 결합된 단백질의 무제한적 실례는 내재성 단백질, 지질 고정 단백질 및 외재성 단백질을 포함한다. 일정한 구체예에서, 막 단백질은 막경유 단백질, 예를 들면, 단일통과 또는 다중통과 막 단백질 또는 이의 단편이다. 일정한 구체예에서, 막 단백질은 막경유 단백질이 아니지만, 막경유 단백질과의 복합체의 일부 (예를 들면, 보조인자)이다. 본원의 실시예에서 이용된 바와 같이, 약어 "MP"는 막 단백질을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "막경유 항원"은 막에 적어도 한 번 걸치는 항원을 지칭한다. 막경유 항원의 무제한적 실례는 단일통과 항원, 예를 들면, 막에 한 번 걸치는 항원, 지질 고정 단백질, 또는 다중통과 항원, 예를 들면, 막에 적어도 두 번 걸치는 단백질을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "막경유 단백질"은 막에 적어도 한 번 걸치는 단백질을 지칭한다. 막경유 단백질의 무제한적 실례는 단일통과 단백질, 예를 들면, 막에 한 번 걸치는 단백질, 지질 고정 단백질, 또는 다중통과 단백질, 예를 들면, 막에 적어도 두 번 걸치는 단백질을 포함한다. 일정한 구체예에서, 막경유 단백질은 단일통과 또는 다중통과 막경유 단백질 또는 이의 단편이다. 일정한 구체예에서, 막경유 단백질은 다중통과 막경유 단백질 또는 이의 단편이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "면역화"는 항체가 동물에서 조성될 수 있도록 하나 이상의 항원을 동물에게 투여하는 단계 또는 단계들을 지칭한다. 일반적으로, 면역화는 항원 또는 항원들을 동물 내로 주입하는 단계를 포함한다. 면역화는 항원 또는 항원들의 1회 이상의 투여를 수반할 수 있다. 일정한 구체예에서, 항원은 이러한 항원을 발현하는 복수의 EV를 통해 동물에게 투여된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "다중클론 항체" 또는 "다중클론 항혈청"은 항원 또는 항원들로 면역화된 동물의 혈액으로부터 준비될 수 있는 하나 (일가 또는 특정한 항혈청) 또는 그 초과 (다가 항혈청)의 항원에 대해 특이적인 항체의 혼합물을 내포하는 면역 혈청을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "어쥬번트"는 면역 반응의 비특이적 자극제를 지칭한다. 어쥬번트는 하기 구성요소 (a) 항원(들)을 신속한 이화로부터 보호하는 침착물을 형성하도록 설계된 물질 (예를 들면, 광물성 오일, 백반, 수산화알루미늄, 리포솜 또는 계면활성제 [예를 들면, 플루로닉 폴리올]) 및 (b) 면역화된 숙주 동물의 면역 반응을 비특이적으로 자극하는 물질 (예를 들면, 그 안에서 림포카인 수준을 증가시킴으로써) 중에서 한 가지 또는 둘 모두를 포함하는 조성물의 형태일 수 있다. 림포카인 수준을 증가시키기 위한 분자의 무제한적 실례는 지질다당류 (LPS) 또는 이의 지질 A 부분, 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis), 백일해 독소, 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 그리고 무라밀 디펩티드 (MDP)를 포함한다. 어쥬번트의 무제한적 실례는 프로인드 어쥬번트 (프로인드 완전 어쥬번트 (FCA)를 형성하기 위해, 사멸된 미코박테리움 투베르쿨로시스 (M. tuberculosis)를 임의적으로 포함), 수산화알루미늄 어쥬번트, Ribi 어쥬번트, Titermax 어쥬번트, 스페콜 어쥬번트, 알루미늄 염 어쥬번트, 그리고 모노포스포릴 지질 A-합성 트레할로스 디코리노미콜레이트 (MPL-TDM)를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "치료" (및 이의 문법적 변이, 예컨대 "치료한다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체에서 질환의 자연 경과를 변경하려는 시도에서 임상적 개입을 지칭하고, 그리고 임상 병리의 예방을 위해 또는 임상 병리의 경과 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이 예방, 질환 진행의 속도 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 그리고 관해 또는 향상된 예후를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 늦추는 데 이용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는 데 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 선천적 항체의 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 (각각, VH와 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (CDR)을 포함한다. (참조: 예를 들면, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원 결합 특이성을 부여하는 데 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각, 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별검사하기 위해, 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 참조: 예를 들면, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "선별검사"는 하나 이상의 단일클론 항체 (예를 들면, 정제된 항체 및/또는 이러한 항체를 포함하는 하이브리도마 배양 상층액)에, 관심되는 항원에 결합하는 항체의 능력을 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정하는 하나 이상의 검정을 실행하는 것을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "마커"는 직접적인 또는 간접적인 검출을 가능하게 하는 조성물을 지칭한다. 마커는 형광 조성물, 발색 표지, 전자 밀도 표지, 화학발광 표지 및 방사성 표지를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 특이적 마커는 녹색 형광 단백질 ("GFP"), mCherry, dtTomato, 또는 당해 분야에서 알려진 다른 형광 단백질 (예를 들면, 본원에서 참조로서 편입된 Shaner et al., A Guide to Choosing Fluorescent Proteins, Nature Methods 2(12) 905-909 (December 2005), 32P、14C、125I、3H 및 131I, 형광발생소 (예컨대 희토류 킬레이트 또는 루시퍼 옐로우 및 이의 유도체), 로다민 (로다민) 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라아제 (예컨대 반딧불이 루시페라아제 및 세균 형광 단순 효소) (U.S. 특허 번호 4,737,456), 플루오레세인, 2,3-디히드로 프탈라진 디케톤뿐만 아니라 검출가능 신호를 발생시키는 효소, 예를 들면, 양고추냉이 과산화효소 (HRP), 알칼리성 인 신 효소, 베타 갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 탄수화물 옥시다아제 (예컨대 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제 및 글루코오스-6-인산염 탈수소효소 (G6PD)), 그리고 헤테로환상 옥시다아제 (예컨대 요산분해효소 및 크산틴 옥시다아제)이다.
본원에서 이용된 바와 같이, "부착성 세포"는 성장을 위해 표면에 부착을 필요로 하는 세포를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "비부착성 세포"는 현탁 상태로 배양되는 세포를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 비부착성 세포는 성장을 위해 표면에 부착을 필요로 하지 않는 세포이다.
II. EV를 만드는 방법
한 가지 양상에서, 본원 발명은 EV를 만드는 향상된 방법에 관계한다. 이것은 일정한 정제 단계, 소포 인자 및/또는 EV 생산 세포주를 채택함으로써, EV의 신속하고 높은 수확량 생성을 달성하는 것이 가능하다는 발견에 부분적으로 근거된다.
일정한 무제한적 구체예에서, EV를 생산하기 위한 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 관심되는 단백질, 예를 들면, 관심되는 이종성 단백질을 소포 인자에 노출된 세포에서 발현하는 단계; (b) 상기 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여 복수의 EV를 생산하는 단계; 및 (c) 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리하는 단계. 일정한 구체예에서, 세포를 소포 인자에 노출시키는 단계는 상기 소포 인자를 상기 세포에서 발현하는 단계를 포함한다.
일정한 구체예에서, 관심되는 단백질을 세포에서 발현하는 단계는 관심되는 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 상기 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, EV를 생산하기 위한 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 관심되는 단백질, 예를 들면, 관심되는 이종성 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 소포 인자에 노출된 세포에 도입하는 단계; (b) 상기 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여 복수의 EV를 생산하는 단계; 및 (c) 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리하는 단계. 일정한 구체예에서, 상기 세포는 관심되는 단백질을 세포에서 발현하기 위해 상기 폴리뉴클레오티드로 형질감염될 수 있다.
일정한 구체예에서, 세포를 소포 인자에 노출시키는 단계는 상기 소포 인자를 상기 세포에서, 예를 들면, 관심되는 단백질을 발현하는 동일한 세포에서 발현하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 소포 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입될 수 있다. 일정한 구체예에서, 소포 인자는 관심되는 단백질을 인코딩하는 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 대안으로, 관심되는 단백질 및 소포 인자는 2개의 상이한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 관심되는 단백질을 소포 인자에 노출된 세포에서 발현하는 단계는 상기 소포 인자를 인코딩하는 첫 번째 폴리뉴클레오티드 및 상기 관심되는 단백질을 인코딩하는 두 번째 폴리뉴클레오티드를 상기 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
일정한 무제한적 구체예에서, EV를 생산하기 위한 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) (i) 소포 인자 및 관심되는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 (ii) 소포 인자를 인코딩하는 첫 번째 폴리뉴클레오티드 및 관심되는 단백질을 인코딩하는 두 번째 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; (b) 세포를 폴리뉴클레오티드(들), 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 첫 번째 및 두 번째 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키는 단계; (c) 상기 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여 복수의 EV를 생산하는 단계; 및 (d) 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리하는 단계. 일정한 구체예에서, 첫 번째 폴리뉴클레오티드 및 두 번째 폴리뉴클레오티드는 단일 핵산에서 제공된다. 예시적인 EV 생성 작업 흐름은 도 3에서 도시된다.
일정한 구체예에서, 세포를 소포 인자에 노출시키는 단계는 소포 인자를, 관심되는 단백질을 발현하는 세포와 상이한 세포에서 발현하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, EV를 생산하는 방법은 관심되는 단백질을 세포, 예를 들면, 첫 번째 세포 내에서 발현하는 단계를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 관심되는 단백질은 관심되는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입함으로써 상기 세포에서 발현될 수 있다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 소포 인자를, 관심되는 단백질을 발현하는 세포, 예를 들면, 첫 번째 세포와 공동배양되는 상이한 세포, 예를 들면, 두 번째 세포 내에서 발현하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 관심되는 단백질을 발현하는 세포, 예를 들면, 첫 번째 세포를, 다른 세포, 예를 들면, 두 번째 세포에 의해 발현되는 소포 인자에 노출시켜, 관심되는 단백질을 디스플레이하는 EV를 생산하는 단계를 포함한다.
일정한 무제한적 구체예에서, EV를 생산하기 위한 방법은 관심되는 단백질을 소포 인자 없이 세포에서 발현하는 단계를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 관심되는 이종성 단백질을 세포에서 발현하는 단계; (b) 상기 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여 복수의 EV를 생산하는 단계; 및 (c) 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리하되, 상기 세포는 비부착성 세포인 단계. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원 발명의 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 관심되는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; (b) 세포를 상기 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키는 단계; (c) 상기 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여 복수의 EV를 생산하는 단계; 및 (d) 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리하는 단계.
일정한 구체예에서, EV를 생산하는 방법은 세포 내에서 단백질 복합체를 형성하는 두 개 이상의 단백질을 발현하는, 예를 들면, 세포 내에서 복합체를 형성하는 두 개 이상의 이종성 단백질을 발현하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명의 방법은 세포에서 단백질 복합체의 두 개 이상의 단백질, 예를 들면, 단백질 복합체의 세 개 이상의 단백질, 네 개 이상의 단백질, 다섯 개 이상의 단백질, 여섯 개 이상의 단백질, 일곱 개 이상의 단백질, 여덟 개 이상의 단백질 또는 아홉 개 이상의 단백질을 발현하는 단계를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 세포에서 발현된 단백질 복합체의 하나 이상의 단백질은 막경유 단백질일 수 있다. 일정한 구체예에서, 세포에서 발현된 단백질 복합체의 하나 이상의 단백질은 막경유 단백질이 아니다. 일정한 구체예에서, 세포에서 발현된 단백질 복합체의 하나 이상의 단백질은 외재성 막 단백질, 예를 들면, 막경유 단백질과 연관되는 단백질일 수 있다. 일정한 구체예에서, 두 개 이상의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 또는 이들 단백질을 인코딩하는 두 개 이상의 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써, 이들 단백질이 세포에서 발현될 수 있다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 예를 들면, 두 개 이상의 단백질의 복합체를 디스플레이하는 EV를 생산하기 위해, 예를 들면, 소포 인자를 세포 내에서 발현함으로써 상기 세포를 상기 소포 인자에 노출시키는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 대안으로 및/또는 추가적으로, 관심되는 단백질(들)은 소포 인자의 부재에서, 다수의 EV를 생산하는 세포, 예를 들면, 비부착성 세포에서 발현될 수 있다.
일정한 구체예에서, 소포 인자는 자연 소포 경로를 부양하거나 또는 소포 형성을 직접적으로 유도할 수 있는 후보 단백질이다 (도 1). 무제한의 예시적인 소포 인자 및 이들의 작동 기전은 표 1에서 도시된다. 일정한 구체예에서, 세포는 본원에서 개시된 소포 인자 중 한 가지 이상을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 일정한 구체예에서, 소포 인자는 MLGag, 아실.Hrs, ARRDC1, RhoA, 예를 들면, RhoA.F30L, ARF6, 예를 들면, ARF6.Q67L, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 소포 인자는 MLGag, 아실.Hrs, ARRDC1 및 ARF6, 예를 들면, ARF6.Q67L, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 소포 인자는 아실.Hrs, ARRDC1 및 ARF6, 예를 들면, ARF6.Q67L, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
표 1. 소포 인자 및 이들의 작동 기전.
기전 단백질
자가조립 VLP MLGag
자가조립 VLP ARRDC1, 아실.Hrs
내인성 경로를 증강한다 (예를 들면 엑소솜, 종양) RhoA.F30L, ARF6.Q67L, VPS4a, HAS3, CD9, CD63, CD81
아폽토시스체 구성적 활성 ROCK1
일정한 구체예에서, 소포 인자는 Gag 단백질, 예를 들면, 키메라 Gag 단백질이다. HIV 바이러스 Gag 단백질은, Tsg101/ESCRT 복합체에 결합하고 상기 복합체를 막으로 모집하여 바이러스 발아를 용이하게 하는 펩티드를 내포한다 (Pornillos et al., "HIV Gag mimics the Tsg101-recruiting activity of the human Hrs protein," J Cell Biol. 2003;162(3): 425-434). Gag 단독을 인코딩하는 cDNA를 인간 세포 내로 도입하는 것은 소포를 생성하는 것으로 밝혀졌다 (참조: 예를 들면, Qiu et al. J. Virol. 1999, 73(11):9145-9152; 및 Megede et al. J. Virol. 2000, 74(6):2628-2635). 하지만, 야생형 HIV Gag는 비인간 세포에서 효율적으로 발아하지 않는다. 키메라 Gag 단백질은 인간과 뮤린 세포 둘 모두에서 EV 생산을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (Hammarstedt et al., "Passive and active inclusion of host proteins in human immunodeficiency virus Type 1 Gag particles during budding at the plasma membrane," J Virol. 2004;78(11):5686-97; Chen et al., "Efficient assembly of an HIV-1/MLV Gag-chimeric virus in murine cells," Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(26):15239-44). 예시적인 키메라 Gag (MLGag)는 Chen et al., "Efficient assembly of an HIV-1/MLV Gag-chimeric virus in murine cells," Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(26):15239-44에서 개시되는데, 이의 내용은 온전히 참조로서 편입된다. 일정한 구체예에서, 키메라 Gag 단백질은 HIV Gag의 일부 및 상이한 레트로바이러스로부터 유래된 Gag의 일부를 포함한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 키메라 Gag는 이의 국지화를 주도하는 것으로 알려진 HIV Gag의 영역이 뮤린 레트로바이러스인 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV)로부터 유래된 기능적으로 상동한 영역으로 대체되는 HIV Gag를 포함한다. 일정한 구체예에서, HIV Gag의 대체된 영역은 본원에서 MLGag로서 지칭되는 키메라 Gag를 생성하는 기질 도메인 (MA)이다. 일정한 구체예에서, 키메라 및 전장 Gag 단백질은 예를 들면 Stocking et al. Cell Mol. Life Sci. 65(21):3383-3398 (2008)에서 설명된 바와 같이, 임의의 종으로부터 유래된 내인성 레트로바이러스 (ERV) 서열로부터 생성될 수 있는데, 이의 내용은 온전히 참조로서 편입된다. 일정한 구체예에서, 소포 인자는 MLGag이다.
일정한 구체예에서, 소포 인자는 아레스틴 도메인 내포 단백질 1 (ARRDC1)이다. 일정한 구체예에서, 소포 인자는 뮤린 ARRDC1 (mARRDC1)이다. 일정한 구체예에서, 소포 인자는 인간 ARRDC1 (hARRDC1)이다. ARRDC1은 보조 단백질의 테트라펩티드 PSAP 모티프이고, 그리고 EV 형성을 유도하는 숙주 단백질이다. ARRDC1의 과다발현은 증강된 마이크로소포 (MV) 형성을 야기하는 것으로 밝혀졌다. 이런 효과는 PSAP/PTAP 펩티드를 통한 Tsg101의 모집에 의해 매개된다. ATP아제 VPS4a의 과다발현은 MV 형성에서 추가 증강을 야기한다 (Nabhan et al., "Formation and release of arrestin domain-containing protein 1-mediated microvesicles (ARMMs) at plasma membrane by recruitment of TSG101 protein," Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(11):4146-51).
일정한 구체예에서, 소포 인자는 ADP 리보실화 인자-6 (ARF6)이다. ARF6은 종양 세포에서 마이크로소포 형성을 ERK 의존성 방식으로 주동하는 Rho GTP아제인 것으로 밝혀졌다 (Muralidharan-Chari et al., "ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles," Curr Biol. 2009;19(22):1875-85). 일정한 구체예에서, 소포 인자는 ARF6의 구성적 활성 형태이다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, ARF6의 구성적 활성 형태는 ARF6.Q67L이다 (예를 들면, Peters et al. J. Cell Biol 128(6):1003-1017 (1995)을 참조하는데, 이것은 본원에서 온전히 참조로서 편입된다).
일정한 구체예에서, 소포 인자는 종양 세포에서 마이크로소포 형성을 또한 주동할 수 있는 돌연변이체 RhoA/ROCK1이다 (Li et al., "RhoA triggers a specific signaling pathway that generates transforming microvesicles in cancer cells," Oncogene. 2012;31(45):4740-9). 일정한 구체예에서, 소포 인자는 RhoA의 구성적 활성 형태이다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, RhoA의 구성적 활성 형태는 RhoA.F30L이다 (예를 들면, Lin et al. JBC 274(33):23633-23641 (1999)을 참조하는데, 이것은 본원에서 온전히 참조로서 편입된다).
일정한 구체예에서, 소포 인자는 원형질막 (PM) 결합 도메인, 자가조립 도메인, 그리고 수송에 필요한 엔도솜 분류 복합체 (ESCRT) 모집 도메인을 포함한다 (도 2a). EV 형성을 위한 설계 원리는 새로운 EV 인자/화물의 신속한 생성을 가능하게 하는 것이다. PM 표적화 및 고차 소중합체화가 EV 통합을 주동하는 것으로 밝혀졌다 (Fang et al., "Higher-Order Oligomerization Targets Plasma Membrane Proteins and HIV Gag to Exosomes," PLoS Biol. 2007 Jun;5(6):e158). 일정한 구체예에서, 소포 인자는 아실화 태그의 PM 결합 도메인, 그리고 이중 코일의 자가조립 도메인 및 ESCRT 모집 도메인으로 구성되는 간세포 성장 인자 조절된 티로신 키나아제 기질 (Hrs)의 C 말단 도메인을 포함하는 아실.Hrs이다 (도 2a). 일정한 구체예에서, 소포 인자는 기질의 PM 결합 도메인, 캡시드의 자가조립 도메인, 그리고 p6의 ESCRT 모집 도메인을 포함하는 MLGag이다 (도 2b). 일정한 구체예에서, 소포 인자는 자가조립 도메인 및 ESCRT 모집 도메인을 포함한다. 일정한 구체예에서, 소포 인자는 아레스틴 도메인의 자가조립 도메인 및 ESCRT 모집 도메인을 포함하는 ARRDC1이다 (도 2b). 당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해, 추가 소포 인자가 확인될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, EV의 생산을 증가시키는 단일 유전자 또는 유전자의 조합을 확인하기 위해, 모든 단백질, 예를 들면, 인간 단백질의 cDNA 라이브러리의 스크린이 수행될 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, EV의 생산을 저해하는 단일 유전자 또는 유전자의 조합을 확인하기 위해, CRISPR 또는 RNAi 스크린이 수행될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법에 의해 생산된 EV는 소포 인자 및/또는 관심되는 단백질을 포함한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 소포 인자는 EV 내로 통합된다, 예를 들면, 생산된 EV의 내부에 상주한다. 일정한 구체예에서, 관심되는 단백질은 EV의 표면 상에 디스플레이된다, 예를 들면, 관심되는 단백질은 막에 한 번 이상 걸치는 단백질, 또는 막에 걸치는 단백질과 연관되는 단백질이다. 일정한 구체예에서, 개시된 방법에 의해 생산된 EV는 소포 인자, 예를 들면, MLGag, 아실.Hrs, ARRDC1 및/또는 ARF6, 예를 들면, ARF6.Q67L 및 관심되는 단백질을 포함한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원에서 개시된 방법에 의해 생산된 EV는 ARF6, 예를 들면, ARF6.Q67L 및 관심되는 단백질을 포함한다. 일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법에 의해 생산된 EV는 MLGag 및 관심되는 단백질을 포함한다. 일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법에 의해 생산된 EV는 아실.Hrs 및 관심되는 단백질을 포함한다. 일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법에 의해 생산된 EV는 ARRDC1 및 관심되는 단백질을 포함한다.
일정한 구체예에서, 소포 인자는 아실.Hrs, ARRDC1 및 ARF6 중에서 한 가지 이상이다. 일정한 구체예에서, 아실.Hrs, ARRDC1 및 ARF6 중 한 가지 이상의 이용이 유리한데, 그 이유는 소포 인자로서 Gag의 이용이 항-Gag 항체의 생성과 연관되었기 때문이다. 항-Gag 항체의 생산은 관심되는 단백질에 대한 항체를 생산하는 면역화된 동물의 면역계의 능력에 영향을 주어, 관심되는 단백질에 대한 항체의 감소된 역가를 잠재적으로 야기할 수 있다.
표 2에서 볼 수 있듯이, 아실.Hrs, ARRDC1 및 ARF6은 MLGag와 유사한 양의 EV를 생산하였다. 표 2에서 도시된 결과는 놀라운데, 그 이유는 Gag는 세포 표면으로부터 발아 바이러스의 맥락에서 진화하여 EV를 효율적으로 생산할 것으로 예상되는 반면, 다른 소포 인자, 예를 들면, 아실.Hrs, ARRDC1 및 ARF6은 이런 맥락에서 진화하지 않지만 여전히 EV의 높은 수확량을 야기하였기 때문이다.
일정한 구체예에서, 소포 인자, 예를 들면, 아실.Hrs, ARRDC1 및/또는 ARF6은 이러한 소포 인자의 발현에 의해 생산된 EV로 면역화되는 동일한 종으로부터 유래될 수 있다. 소포 인자의 발현에 의해 생산된 EV로 면역화되는 동일한 종으로부터 유래되는 소포 인자의 이용이 유리한데, 그 이유는 이것이 면역화된 동물에서 관심되는 단백질 이외의 소포 인자에 대한 면역 반응의 위험을 감소시킬 수 있기 때문이다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 만약 생쥐가 관심되는 단백질에 대한 항체를 생성하기 위해 면역화되면, 소포 인자, 예를 들면, 아실.Hrs, ARRDC1 및/또는 ARF6은 생쥐로부터 유래될 수 있다, 예를 들면, 생쥐 아실.Hrs, 생쥐 ARRDC1 및/또는 생쥐 ARF6이다. 일정한 구체예에서, 만약 쥐가 관심되는 단백질에 대한 항체를 생성하기 위해 면역화되면, 소포 인자, 예를 들면, 아실.Hrs, ARRDC1 및/또는 ARF6은 쥐로부터 유래될 수 있다, 예를 들면, 쥐 아실.Hrs, 쥐 ARRDC1 및/또는 쥐 ARF6이다. 일정한 구체예에서, 만약 토끼가 관심되는 단백질에 대한 항체를 생성하기 위해 면역화되면, 소포 인자, 예를 들면, 아실.Hrs, ARRDC1 및/또는 ARF6은 토끼로부터 유래될 수 있다, 예를 들면, 토끼 아실.Hrs, 토끼 ARRDC1 및/또는 토끼 ARF6이다. 일정한 구체예에서, 만약 라마가 관심되는 단백질에 대한 항체를 생성하기 위해 면역화되면, 소포 인자, 예를 들면, 아실.Hrs, ARRDC1 및/또는 ARF6은 라마로부터 유래될 수 있다, 예를 들면, 라마 아실.Hrs, 라마 ARRDC1 및/또는 라마 ARF6이다. 일정한 구체예에서, 만약 인간이 관심되는 단백질에 대한 항체를 생성하기 위해 면역화되면, 소포 인자, 예를 들면, 아실.Hrs, ARRDC1 및/또는 ARF6은 인간으로부터 유래될 수 있다, 예를 들면, 인간 아실.Hrs, 인간 ARRDC1 및/또는 인간 ARF6이다.
일정한 구체예에서, 세포는 소포 인자를 발현하도록 변형된다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 소포 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 소포 인자를 발현하기 위해 세포 내로 도입된다. 일정한 구체예에서, 세포는 소포 인자를 상기 세포에서 발현하기 위해 소포 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염된다.
일정한 구체예에서, 세포는 소포 인자의 발현에 적합한 조건하에 배양된다. 일정한 구체예에서, 세포는 EV의 생산에 적합한 조건하에 배양된다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 세포는 소포 인자의 발현 및/또는 EV의 생산을 위해 세포 배양 배지에서 배양된다.
일정한 구체예에서, 소포 인자를 발현하는 세포는 EV를 생산하기 위해 적절한 시간 동안 인큐베이션된다. 일정한 구체예에서, 소포 인자를 발현하는 세포는 EV를 생산하기 위해 약 12 시간 내지 약 72 시간 동안 인큐베이션된다. 일정한 구체예에서, 소포 인자를 발현하는 세포는 EV를 생산하기 위해 약 24 시간 내지 약 64 시간 동안 인큐베이션된다. 일정한 구체예에서, 소포 인자를 발현하는 세포는 EV를 생산하기 위해 약 48 시간 동안 인큐베이션된다.
일정한 구체예에서, 소포 인자를 발현하는 세포의 인큐베이션에 의해 생산된 EV는 차후에 정제된다. 일정한 구체예에서, EV는 세포 배양 배지로부터 정제된다. 일정한 구체예에서, EV의 정제는 완료까지 약 30 분 내지 약 24 시간이 소요된다. 일정한 구체예에서, EV의 정제는 완료까지 약 30 분 내지 약 12 시간이 소요된다. 일정한 구체예에서, EV의 정제는 완료까지 약 30 분 내지 약 5 시간이 소요된다. 일정한 구체예에서, EV의 정제는 완료까지 약 30 분 내지 약 4 시간, 예를 들면, 완료까지 약 1 시간 내지 약 4 시간이 소요된다. 일정한 구체예에서, EV의 정제는 완료까지 약 3 시간이 소요된다. 일정한 구체예에서, EV는 초원심분리를 이용하여 세포 배양 배지로부터 단리된다.
일정한 구체예에서, 소포 인자를 이용하여 EV를 생산하기 위한 본원에서 설명된 방법은 약 0.5 mg 이상, 예를 들면, 0.5-1.0 mg; 약 1.0 mg 이상, 예를 들면, 1.0-1.5 mg; 약 1.5 mg 이상, 예를 들면, 1.5-2.0 mg; 약 2.0 mg 이상, 예를 들면, 2.0-3.0 mg; 약 2.5 mg 이상, 예를 들면, 2.5-3.0 mg; 약 3.0 mg 이상, 예를 들면, 3.0-4.0 mg; 약 3.5 mg 이상, 예를 들면, 3.5-4.0 mg; 약 4.0 mg 이상, 예를 들면, 4.0-5.0 mg; 약 4.5 mg 이상, 예를 들면, 4.5-5.0 mg; 약 5.0 mg 이상, 예를 들면, 5.0-6.0 mg; 또는 약 5.5 mg 이상, 예를 들면, 5.5-6.0 mg의 정제된 EV를 생산할 수 있다. 일정한 구체예에서, 소포 인자를 이용하여 EV를 생산하기 위한 본원에서 설명된 방법은 약 3.0 mg 이상, 예를 들면, 3.0-5.0 mg의 정제된 EV를 생산할 수 있다. 일정한 구체예에서, 소포 인자를 이용하여 EV를 생산하기 위한 본원에서 설명된 방법은 이종성 단백질을 발현하는 세포를 배양하고 약 24-72 시간 이내에 전술된 양의 EV를 생산할 수 있다. 일정한 구체예에서, 소포 인자를 이용하여 EV를 생산하기 위한 본원에서 설명된 방법은 이종성 단백질을 발현하는 세포를 배양하고 약 24-48 시간 이내에 전술된 양의 EV를 생산할 수 있다. 일정한 구체예에서, 소포 인자를 이용하여 EV를 생산하기 위한 본원에서 설명된 방법은 이종성 단백질을 발현하는 세포를 배양하고 약 48-72 시간 이내에 전술된 양의 EV를 생산할 수 있다.
일정한 구체예에서, EV 생산을 위한 본원에서 개시된 방법에 이용하기 위한 세포는 포유류 세포이다. 일정한 구체예에서, 세포는 인간 세포이다. 일정한 구체예에서, 세포는 유전적으로 변형된 인간 세포이다. 일정한 구체예에서, 세포는 부착성 세포이다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 세포는 부착성으로 성장하는 HEK293 세포일 수 있다. HEK293은 조직 배양에서 성장된 인간 배아 신장 세포로부터 유래된 세포주이다. 일정한 구체예에서, 세포는 CHO 세포이다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 세포는 ExpiCHO™ 세포 (ThermoFisher Scientific)이다.
일정한 구체예에서, EV 생산을 위한 본원에서 개시된 방법에 이용되는 세포는 부착성 세포가 아니다. 일정한 구체예에서, EV 생산을 위한 본원에서 개시된 방법에 이용되는 세포는 비부착성 세포, 예를 들면, 현탁 상태로 성장하는 세포이다. 일정한 구체예에서, 비부착성 세포는 현탁 배양에 적응된 HEK293 세포이다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 세포는 현탁 배양에 적응된 HEK293 세포인 293S 세포이다. 일정한 구체예에서, 세포는 HEK293 세포로부터 유래되고 현탁 배양 상태로 유지되는 Expi293F™ 세포 (ThermoFisher Scientific)이다. 실시예 2에서 볼 수 있듯이, 비부착성 세포, 예를 들면, 293S 세포 및 Expi293F™ 세포는 부착성 세포, 예를 들면, HEK293 세포와 비교하여 가장 높은 수확량의 EV를 생산하였다.
EV 생산을 위해 비부착성 세포를 이용하는 것은 부착성 세포에 비하여 다수의 유익성이 있다. 예를 들면, 비부착성 세포의 이용은 EV 생산을 단순화하는 데, 그 이유는 동일한 양의 부착성 세포를 성장시키는 데 필요한 많은 수의 조직 배양 평판과 비교하여, 비부착성 세포를 단일 진탕 플라스크에서 성장시키는 것이 훨씬 용이하기 때문이다. 비부착성 세포는 또한, 부착성 세포와 비교하여 배양하는 것이 더 용이하고, 배양하는 데 더 적은 비용이 소모되며, 더 적은 소모성품목을 필요로 하고, 그리고 배지로부터 분리하는 것이 더 용이하다. 이에 더하여, 비부착성 세포주 예컨대 Expi293F™ 세포주의 이용은 놀랍게도, 소포 인자의 부재에서도 소포의 높은 수확량을 야기한다. 도 7b에서 도시된 바와 같이, 비부착성 세포주 예컨대 293S 세포주 및 Expi293F™ 세포주의 이용은 놀랍게도, 부착성 HEK293 세포주와 비교하여 EV의 더 높은 수확량을 야기하였다.
일정한 구체예에서, 비부착성 세포는 관심되는 단백질을 발현하도록 변형된다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 관심되는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심되는 단백질을 발현하기 위해 비부착성 세포 내로 도입된다. 일정한 구체예에서, 비부착성 세포는 관심되는 단백질을 상기 세포에서 발현하기 위해 관심되는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염된다.
일정한 구체예에서, 비부착성 세포는 관심되는 단백질의 발현에 적합한 조건하에 배양된다. 일정한 구체예에서, 비부착성 세포는 EV의 생산에 적합한 조건하에 배양된다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 비부착성 세포는 관심되는 단백질의 발현 및/또는 EV의 생산을 위해 세포 배양 배지에서 배양된다.
일정한 구체예에서, 관심되는 단백질을 발현하는 비부착성 세포는 EV를 생산하기 위해 적절한 시간 동안 인큐베이션된다. 일정한 구체예에서, 관심되는 단백질을 발현하는 비부착성 세포는 EV를 생산하기 위해 약 12 시간 내지 약 72 시간 동안 인큐베이션된다. 일정한 구체예에서, 관심되는 단백질을 발현하는 비부착성 세포는 EV를 생산하기 위해 약 24 시간 내지 약 64 시간 동안 인큐베이션된다. 일정한 구체예에서, 관심되는 단백질을 발현하는 비부착성 세포는 EV를 생산하기 위해 약 48 시간 동안 인큐베이션된다.
일정한 구체예에서, 관심되는 단백질을 발현하는 비부착성 세포의 인큐베이션에 의해 생산된 EV는 차후에 정제된다. 일정한 구체예에서, EV는 세포 배양 배지로부터 정제된다. 일정한 구체예에서, EV의 정제는 완료까지 약 30 분 내지 약 24 시간이 소요된다. 일정한 구체예에서, EV의 정제는 완료까지 약 30 분 내지 약 12 시간이 소요된다. 일정한 구체예에서, EV의 정제는 완료까지 약 30 분 내지 약 5 시간이 소요된다. 일정한 구체예에서, EV의 정제는 완료까지 약 30 분 내지 약 4 시간, 예를 들면, 완료까지 약 1 시간 내지 약 4 시간이 소요된다. 일정한 구체예에서, EV의 정제는 완료까지 약 3 시간이 소요된다. 일정한 구체예에서, EV는 초원심분리를 이용하여 배지로부터 단리된다.
일정한 구체예에서, 예를 들면, 소포 인자의 부재에서 비부착성 세포주를 이용하여 EV를 생산하기 위한 본원에서 설명된 방법은 약 0.1 mg 이상, 예를 들면, 0.1-1.0 mg, 0.1-2.0 mg, 0.1-3.0 mg, 0.1-4.0 mg, 0.1-5.0 mg 또는 0.1-6.0 mg; 약 0.2 mg 이상; 약 0.3 mg 이상; 약 0.4 mg 이상; 약 0.5 mg 이상; 약 0.6 mg 이상; 약 0.7 mg 이상; 약 0.8 mg 이상; 약 0.9 mg 이상; 약 1.0 mg 이상, 예를 들면, 1.0-2.0 mg, 1.0-3.0 mg, 1.0-4.0 mg, 1.0-5.0 mg 또는 1.0-6.0 mg; 약 1.1 mg 이상; 약 1.2 mg 이상; 약 1.3 mg 이상; 약 1.4 mg 이상; 약 1.5 mg 이상; 약 1.6 mg 이상; 약 1.7 mg 이상; 약 1.8 mg 이상; 약 1.9 mg 이상; 약 2.0 mg 이상, 예를 들면, 2.0-3.0 mg, 2.0-4.0 mg, 2.0-5.0 mg 또는 2.0-6.0 mg; 약 3.0 mg 이상, 예를 들면, 3.0-4.0 mg, 3.0-5.0 mg 또는 3.0-6.0 mg; 약 4.0 mg 이상, 예를 들면, 4.0-5.0 mg 또는 4.0-6.0 mg; 또는 약 5.0 mg 이상의 정제된 EV, 예를 들면, 5.0-6.0 mg을 생산할 수 있다. 일정한 구체예에서, 비부착성 세포주를 이용하여 EV를 생산하기 위한 본원에서 설명된 방법은 약 1.0 mg 이상 예를 들면, 1.0-6.0 mg의 정제된 EV를 생산할 수 있다. 일정한 구체예에서, 비부착성 세포주를 이용하여 EV를 생산하기 위한 본원에서 설명된 방법은 이종성 단백질을 발현하는 비부착성 세포를 배양하고 약 24-72 시간 이내에 전술된 양의 EV를 생산할 수 있다. 일정한 구체예에서, 비부착성 세포를 이용하여 EV를 생산하기 위한 본원에서 설명된 방법은 이종성 단백질을 발현하는 비부착성 세포를 배양하고 약 24-48 시간 이내에 전술된 양의 EV를 생산할 수 있다. 일정한 구체예에서, 비부착성 세포를 이용하여 EV를 생산하기 위한 본원에서 설명된 방법은 이종성 단백질을 발현하는 비부착성 세포를 배양하고 약 48-72 시간 이내에 전술된 양의 EV를 생산할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 EV, 예를 들면, 복수의 EV를 배지로부터 단리하는 단계를 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, EV는 초원심분리를 이용하여 배지로부터 단리된다. 일정한 구체예에서, EV는 PEG 침전을 이용하여 배지로부터 단리된다. 일정한 구체예에서, EV는 염 기반 침전을 이용하여 배지로부터 단리된다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, EV를 생산하기 위한 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 예를 들면, 소포 인자를 세포에서 발현함으로써, 관심되는 단백질을 소포 인자에 노출된 세포에서 발현하는 단계; (b) 상기 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여 복수의 EV를 생산하는 단계; 및 (c) EV를 초원심분리, PEG 침전 및/또는 염 기반 침전에 의해 상기 배지로부터 단리하는 단계. 일정한 구체예에서, EV를 생산하기 위한 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 예를 들면, 소포 인자를 세포에서 발현함으로써, 관심되는 단백질을 소포 인자에 노출된 세포에서 발현하는 단계; (b) 상기 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여 복수의 EV를 생산하는 단계; 및 (c) EV를 초원심분리에 의해 상기 배지로부터 단리하는 단계.
일정한 구체예에서, 세포는 EV의 단리에 앞서 적어도 12 시간, 적어도 24 시간, 적어도 36 시간 또는 적어도 48 시간 동안 배양된다. 일정한 구체예에서, 세포는 EV의 단리에 앞서 적어도 24 시간 동안 배양된다. 일정한 구체예에서, 세포는 EV의 단리에 앞서 적어도 48 시간 동안 배양된다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, EV를 생산하기 위한 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 예를 들면, 소포 인자를 세포에서 발현함으로써, 관심되는 단백질을 소포 인자에 노출된 세포에서 발현하는 단계; (b) 상기 세포를 시험관내에서 배지에 적어도 약 24 시간 또는 적어도 약 48 시간 동안 배양하여 복수의 EV를 생산하는 단계; 및 (c) EV를 초원심분리, PEG 침전 및/또는 염 기반 침전에 의해 상기 배지로부터 단리하는 단계.
일정한 구체예에서, 관심되는 단백질 또는 막-결합 항원, 예를 들면, 막 단백질은 엑소솜 표적화 폴리펩티드 또는 펩티드에 융합되지 않는다. 일정한 구체예에서, 관심되는 단백질 또는 막-결합 항원, 예를 들면, 막 단백질은 엑소솜 표적화 폴리펩티드 또는 펩티드에 교차연결되지 않는다.
일정한 구체예에서, 소포 인자는 Gag 단백질이 아니다. 일정한 구체예에서, 소포 인자는 MLV Gag 단백질이 아니다. 일정한 구체예에서, 소포 인자는 개열되지 않은 Gag 단백질이 아니다. 일정한 구체예에서, 소포 인자는 변형되지 않은 Gag 단백질이 아니다. 일정한 구체예에서, 소포 인자는 비키메라 Gag 단백질이 아니다.
일정한 구체예에서, 세포 배양액 또는 세포 현탁액은 Gag 단백질을 포함하지 않는다. 비부착성 세포를 이용하는 일정한 구체예에서, 이들 세포는 소포 인자의 부재에서, 예를 들면, Gag 단백질의 부재에서 배양된다. 일정한 구체예에서, 소포 인자를 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 비부착성 세포가 이용된다. 일정한 구체예에서, Gag 단백질을 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 비부착성 예컨대 293S 세포 또는 Expi293 세포가 이용되는데, 여기서 Gag 단백질은 MLV Gag 단백질, 개열되지 않은 Gag 단백질, 비키메라 Gag 단백질 또는 변형되지 않은 Gag 단백질이다.
III. EV 기반 ELISA 검정 및 키트
본원 발명은 또한, EV 기반 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 제공한다. 본원 발명의 EV 기반 ELISA 검정은 일정한 구체예에서, 샘플 내에 항체의 수준을 검출하는 이점을 갖는데, 여기서 상기 항체는 항원의 선천적 형태에 결합할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명은 샘플 내에 항체를 검출하기 위한 방법을 제공하는데, 이들 방법은 (a) 상기 샘플을 포획 시약과 함께 인큐베이션하여 상기 항체를 상기 포획 시약에 결합시키되, 상기 포획 시약은 복수의 항원 발현 EV를 포함하고, 그리고 상기 항체는 상기 항원에 특이적으로 결합하는 단계; 및 (b) 포획 시약에 결합된 항체를 검출가능 항체와 접촉시킴으로써 상기 결합된 항체를 검출하되, 상기 검출가능 항체는 상기 항체에 특이적으로 결합하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 (c) (b)에서 검출된 항체의 양을 계측하되, 상기 양은 표준 곡선을 이용하여 정량되는 단계를 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, 포획 시약은 고체상에 고정된다.
일정한 구체예에서, 항원은 막 단백질 또는 이의 단편이다. 일정한 구체예에서, 막 단백질은 단일통과 막 단백질이다. 일정한 구체예에서, 막 단백질은 지질 고정 단백질이다. 일정한 구체예에서, 막 단백질은 다중통과 막 단백질이다. EV를 생산하기 위한, 당해 분야에서 공지된 임의의 적합한 방법이 본원에서 개시된 검정과 함께 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 항원 제시 EV는 섹션 II에서 개시된 방법에 따라서 생산된다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원에서 개시된 EV 기반 ELISA 검정에 이용하기 위한 EV는 소포 인자, 예를 들면, MLGag, 아실.Hrs, ARRDC1 및/또는 ARF6, 예를 들면, ARF6.Q67L 및 항원을 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 포획 시약은 검정 전 고체상 위에 고정된다. 고정은 수불용성 매트릭스 또는 표면에 흡착 (U.S. 특허 번호 3,720,760)에 의해, 또는 비공유 또는 공유 연계 (예를 들면, U.S. 특허 번호 3,645,852에서 또는 Rotmans et al. J. Immunol. Methods 57:87-98 (1983)에서 설명된 바와 같이, 예를 들면, 질산 및 환원제를 이용한 지지체의 선행 활성화와 함께 또는 이것 없이, 글루타르알데히드 또는 카르보디이미드 교차연결을 이용)에 의해, 검정 절차 전 포획 시약을 불용화함으로써 달성될 수 있다. 고정은 검정 절차 후, 예를 들면, 면역침전에 의해 포획 시약을 불용화함으로써 달성될 수 있다.
고정에 이용된 고체상은 본질적으로 수불용성이고 면역계측 검정에서 유용한 임의의 비활성 지지체 또는 운반체일 수 있다. 비활성 지지체는 예를 들면, 표면, 입자, 다공성 매트릭스 등의 형태일 수 있다. 지지체의 무제한적 실례는 작은 시트, 세파덱스, 폴리염화비닐, 플라스틱 비드, 그리고 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 등으로부터 제조된 검정 평판 (예를 들면, 96 웰 마이크로역가 평판) 또는 시험관뿐만 아니라 미립자 물질 예컨대 필터지, 아가로오스, 교차연결된 덱스트란, 그리고 다른 다당류를 포함한다. 추가적으로, 반응성 수불용성 매트릭스 예컨대 브롬화시안 활성화 탄수화물 및 U.S. 특허 번호 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; 및 4,330,440에서 설명된 반응성 기질이 포획 시약 고정을 위해 본원 발명에서 이용될 수 있고, 그리고 이들의 내용은 온전히 참조로서 편입된다. 일정한 구체예에서, 고정된 포획 시약은 마이크로역가 평판 위에 코팅된다. 일정한 구체예에서, 고체상은 여러 샘플을 한꺼번에 분석하는 데 이용될 수 있는 다중웰 마이크로역가 평판이다. 일정한 구체예에서, 고체상은 96 웰 ELISA 평판이다.
일정한 구체예에서, 포획 시약은 코팅된 평판을 형성하기 위해, 필요에 따라 비공유 또는 공유 상호작용, 또는 물리적 연쇄에 의해 고체상 위에 연결된다. 부착을 위한 적합한 기술은 U.S. 특허 번호 4,376,110 및 그 안에 인용된 참고문헌에서 설명된 것들을 포함하고, 그리고 이들의 내용은 온전히 참조로서 편입된다.
일정한 구체예에서, 평판 또는 다른 고체상은 포획 시약을 고체상에 연결하기 위해, 포획 시약뿐만 아니라 교차연결 작용제와 함께 인큐베이션된다. 교차연결 작용제의 무제한적 실례는 예를 들면, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들면, 4-아지도살리실산을 포함하는 에스테르, 디숙신이미딜 에스테르 예컨대 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)를 비롯한 동종이중기능성 이미도에스테르, 그리고 이중기능성 말레이미드 예컨대 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄을 포함한다. 유도체화 작용제 예컨대 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트는 광의 존재에서 교차연결을 형성할 수 있는 광활성화가능 중간체를 산출한다.
일정한 구체예에서, 코팅된 평판은 이후, 결합 부위에 비특이적으로 결합하고 이들 부위를 포화시켜, 평판의 웰 상에서 과잉 부위에 자유 리간드의 원치 않는 결합을 예방하는 차단제로 처리된다. 적합한 차단제의 무제한적 실례는 젤라틴, 소 혈청 알부민, 난알부민, 카제인 및 탈지우유를 포함한다.
일정한 구체예에서, 샘플을 고정된 포획 시약과 함께 인큐베이션한 후, 고정된 포획 시약은 검출가능 항체와 접촉된다. 일정한 구체예에서, 검출가능 항체는 단일클론 항체이다. 일정한 구체예에서, 검출가능 항체는 다중클론 항체이다. 일정한 구체예에서, 검출가능 항체는 직접적으로 검출 가능하다. 일정한 구체예에서, 검출가능 항체는 형광측정 표지 또는 비색 표지를 포함한다. 일정한 구체예에서, 검출가능 항체는 비오틴화되고, 그리고 검출 수단은 아비딘 또는 스트렙타비딘-β-갈락토시다아제 및 MUG이다.
본원 발명은 또한, 본원에서 개시된 EV 기반 ELISA 검정을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 일정한 구체예에서, 샘플 내에 항체의 수준을 검출하기 위한 키트는 (a) 복수의 항원 제시 EV를 포함하는 포획 시약으로서, 여기서 상기 항원이 상기 항체에 특이적으로 결합하고; 및 (b) 포획된 항체에 결합하는 검출가능 항체를 포함한다.
일정한 구체예에서, 키트는 포획 시약을 위한 고체 지지체를 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, 고체 지지체는 별개 요소로서 제공된다. 일정한 구체예에서, 제공된 고체 지지체는 포획 시약에 의해 미리 코팅된다. 따라서, 키트에서 막-결합 항원을 포함하는 EV는 고체 지지체 위에 미리 고정될 수 있거나, 또는 이들은, 키트와 함께 포함되거나 또는 키트와는 별개로 제공되는 그와 같은 지지체 위에 고정될 수 있다. 일정한 구체예에서, 포획 시약은 마이크로역가 평판 위에 코팅된다. 일정한 구체예에서, 검출가능 항체는 직접적으로 검출될 수 있는 표지화된 항체이다. 일정한 구체예에서, 검출가능 항체는 상이한 종에서 조성된 상기 검출가능 항체를 향해 지향된 표지화된 항체에 의해 검출될 수 있는 표지화되지 않은 항체이다. 일정한 구체예에서, 표지는 효소이고, 그리고 키트는 상기 효소에 의해 요구되는 기질 및 보조인자를 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, 표지는 형광단이고, 그리고 키트는 검출가능 발색단을 제공하는 염료 전구체를 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, 검출가능 항체는 표지화되지 않고, 그리고 키트는 바람직하게는 형광측정 검출된 형식으로, 검출가능 항체에 대한 검출 수단, 예컨대 상기 표지화되지 않은 항체를 향해 지향된 표지화된 항체를 더욱 포함한다.
일정한 구체예에서, 키트는 검정을 실행하기 위한 사용설명서 및/또는 항체 표준 (예를 들면, 정제된 항체, 바람직하게는 재조합적으로 생산된 항체)뿐만 아니라 다른 첨가제 예컨대 안정제, 세척 및 인큐베이션 완충액 등을 더욱 포함한다.
일정한 구체예에서, 키트의 구성요소는 미리 결정된 비율로 제공되는데, 검정의 원하는 민감도를 획득하기 위해 다양한 시약의 상대적 양이 적절하게 변화된다. 일정한 구체예에서, 시약은 건성 분말로서 제공된다 (예를 들면, 동결 건조된다).
IV. EV를 이용하여 항체를 생산하기 위한 방법
다른 양상에서, 본원 발명은 항체 생산을 위한 방법을 제공한다. 일정한 항원, 예를 들면, 막-결합 항원에 대한 항체는 충분한 양의 적합하게 접힘된 항원을 생산하기 어렵기 때문에 만들기가 어려울 수 있는데, 이것은 이런 항원의 세포 독성, 낮은 발현 수율, 응집 및 부적합한 접힘에 부분적으로 기인할 수 있다. 참조: 예를 들면, Katzen et al. Trends Biotech. 27(8):455-460 (2009). 예를 들면, 이황화물-풍부한 (>2개의 이황화물) 단백질의 발현이 응집 및 이황화물 오대합으로 인해 제한될 수 있다 (참조: 예를 들면, Saez et al. Meth. Mol. Biol. 1586:155-180 (2017); Crook et al. Nat Comm. 8:2244 (2017)). 이에 더하여, 막 단백질 복합체 (예를 들면, 동종이합체, 이종이합체 및 동종삼합체 복합체)의 발현이 어려울 수 있는데, 그 이유는 복합체 내에 하나 이상의 단백질의 막경유 도메인이 고차 복합체를 종종 안정시키고 복합체의 단백질 사이의 상호작용이 약할 수 있기 때문이다. 게다가, 세정제에서 이런 막 단백질 복합체의 용해화가 혹독하거나, 선천적 복합체 상호작용을 교란하거나, 또는 지질 환경과의 핵심 상호작용을 제거할 수 있다 (참조: 예를 들면, Birnbaum, et al. PNAS 111(49):17576-17581 (2014); Henrich, et al. eLife 6:e20954 (2017)). 따라서, 이런 도전적인 항원을 인코딩하는 DNA, 이런 항원을 발현하는 세포, 대장균 (E. coli)에 의해 생산된 변성된 항원, 또는 CHO 세포에 의해 생산된 Fc 융합 항원으로 생쥐를 면역화하는 것을 비롯하여, 이런 항원에 대한 항체를 생산하기 위한 다양한 면역화 접근방식이 시험되었다. 본원 발명의 요부는 일정한 구체예에서, 도전적인 항원에 대한 바람직한 결합 특징을 갖는 항체의 생성을 야기할 수 있는, 막-결합 항원, 예를 들면, 다중통과 막 단백질을 포함하는 EV로 동물을 면역화하는 것에 관계한다.
일정한 무제한적 구체예에서, 본원 발명은 동물을 면역화하기 위한 방법을 제공하는데, 이들 방법은 막-결합 항원을 포함하는 복수의 EV를 동물에게 투여하여, 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 단계를 포함한다.
일정한 구체예에서, 항원은 막 단백질 또는 이의 단편이다. 일정한 구체예에서, 항원은 막 단백질의 단편이다. 일정한 구체예에서, 막 단백질은 단일통과 막 단백질, 지질 고정 단백질 또는 다중통과 막 단백질이다. 본원에서 개시된 방법에 이용될 수 있는 단백질의 부류의 무제한적 실례는 수용체, 예를 들면, G-단백질 연계된 수용체 (GPCR), GPI 고정된 단백질, 이온 통로, 다중막경유 단백질, 이황화물-풍부한 세포외 도메인 (ECD), 불안정한 ECD, 다중성분 복합체, 예를 들면, 동종이합체 단백질 복합체, 이종이합체 단백질 복합체, 다중단백질 복합체 등을 포함한다. 일정한 구체예에서, 항원은 막 단백질, 예를 들면, 다중단백질 복합체의 단백질 부분과 연관된 단백질일 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 막 단백질과 연관된 단백질은 보조인자일 수 있다.
일정한 구체예에서, 막 단백질은 다중통과 막 단백질이다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 막 단백질은 막에 적어도 약 2번, 적어도 약 3번, 적어도 약 4번, 적어도 약 5번, 적어도 약 6번, 적어도 약 7번, 적어도 약 8번, 적어도 약 9번, 적어도 약 10번, 적어도 약 11번 또는 적어도 약 12번 걸친다. 일정한 구체예에서, 막 단백질은 막에 적어도 7번 걸친다, 예를 들면, GPCR이다.
일정한 구체예에서, 막 단백질은 700개 이하의 아미노산, 650개 이하의 아미노산, 600개 이하의 아미노산, 550개 이하의 아미노산, 500개 이하의 아미노산, 450개 이하의 아미노산, 400개 이하의 아미노산, 350개 이하의 아미노산, 300개 이하의 아미노산, 250개 이하의 아미노산, 200개 이하의 아미노산, 150개 이하의 아미노산, 100개 이하의 아미노산, 95개 이하의 아미노산, 90개 이하의 아미노산, 85개 이하의 아미노산, 80개 이하의 아미노산, 75개 이하의 아미노산, 70개 이하의 아미노산, 65개 이하의 아미노산, 60개 이하의 아미노산, 55개 이하의 아미노산, 50개 이하의 아미노산, 45개 이하의 아미노산, 40개 이하의 아미노산, 35개 이하의 아미노산, 30개 이하의 아미노산, 25개 이하의 아미노산, 20개 이하의 아미노산, 15개 이하의 아미노산, 10개 이하의 아미노산 또는 5개 이하의 아미노산을 포함하는 세포내 도메인을 갖는다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 막 단백질은 400개 이하의 아미노산을 포함하는 세포내 도메인을 갖는다. 일정한 구체예에서, 만약 Gag, 예를 들면, MLGag, 소포 인자가 관심되는 막 단백질, 예를 들면, 관심되는 막 단백질을 디스플레이하는 EV를 생성하는 데 이용되면, 막 단백질은 700개 이하의 아미노산, 600개 이하의 아미노산, 500개 이하의 아미노산, 400개 이하의 아미노산, 300개 이하의 아미노산, 200개 이하의 아미노산 또는 100개 이하의 아미노산을 포함하는 세포내 도메인을 갖는다. 일정한 구체예에서, 만약 Gag, 예를 들면, MLGag, 소포 인자가 관심되는 막 단백질, 예를 들면, 관심되는 막 단백질을 디스플레이하는 EV를 생성하는 데 이용되면, 막 단백질은 200개 이하의 아미노산을 포함하는 세포내 도메인을 갖는다.
일정한 구체예에서, 막 단백질은 이온 통로이다. 일정한 구체예에서, 이온 통로는 양이온 통로이다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 막 단백질은 칼륨 이온 통로, 나트륨 이온 통로 또는 칼슘 이온 통로이다. 일정한 구체예에서, 이온 통로는 나트륨 이온 통로이다.
EV를 만들기 위한 당해 분야에서 공지된 방법이 본원에서 개시된 방법과 함께 이용될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 항원을 포함하는 관심되는 단백질을 디스플레이하는 EV를 만들기 위한 당해 분야에서 공지된 방법이 본원에서 개시된 항체 생성 방법과 함께 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, EV는 본원 발명의 섹션 II에서 개시된 방법을 이용하여 생산된다. 일정한 구체예에서, 항원은 EV의 막 상에 위치되는데, 여기서 상기 항원의 입체형태는 세포막 상에서 이의 입체형태, 예를 들면, 선천적 입체형태와 실제적으로 유사하다.
일정한 무제한적 구체예에서, 본원 발명은 관심되는 단백질에 대한 항체를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 항원, 예를 들면, 관심되는 단백질, 예를 들면, 관심되는 막 단백질을 포함하는 복수의 EV를 동물에게 투여함으로써 상기 동물을 면역화하여, 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 단계를 포함한다.
일정한 구체예에서, 동물을 면역화하는 단계는 EV를 동물 내로 주입하는 단계를 포함한다. 면역화는 동물에게 EV의 1회 이상의 투여를 수반할 수 있다. 일정한 구체예에서, 이들 방법은 동물에게 EV의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회, 또는 그 초과의 투여를 포함한다. 일정한 구체예에서, EV는 동물에게 약 3 내지 약 6 회 투여된다. 일정한 구체예에서, EV는 0주 차, 2주 차 및 4주 차에 동물에게 투여된다.
일정한 구체예에서, 동물의 면역화는 생성되는 표적 특이적 항체의 수준을 검출하기 위해 FACS에 의해 모니터링될 수 있다. 만약 적합한 역가가 검출되면 (예를 들면, 1:1000 혈청 희석에서 FACS 반응의 검출에 의해), 단일클론 항체의 생성이 본원에서 설명된 바와 같이, 예를 들면, B 세포 클로닝 또는 하이브리도마 생성에 의해 시작될 수 있다.
일정한 구체예에서, 이들 방법은 EV 투여 후 동물로부터 항혈청을 수집하되, 상기 항혈청은 상기 동물에 의해 생산된 항체를 포함하는 단계를 더욱 포함한다.
일정한 구체예에서, EV는 어쥬번트와 함께 동물에게 투여된다. 어쥬번트의 무제한적 실례는 프로인드 어쥬번트 (프로인드 완전 어쥬번트 (FCA)를 형성하기 위해 미코박테리움 또는 이의 성분을 임의적으로 포함), Ribi 어쥬번트, Titermax 어쥬번트, 스페콜 어쥬번트, 그리고 알루미늄 염 어쥬번트를 포함한다. 일정한 구체예에서, 어쥬번트는 Ribi 어쥬번트이다. Ribi 어쥬번트 수중유 유제이고, 여기서 항원 (예를 들면, 항원 제시 EV)이 Tween 80을 내포하는 식염수에서 유화되는 대사가능 오일 (스쿠알렌)과 혼합된다. 일정한 구체예에서, Ribi 어쥬번트는 또한, 면역자극제로서 작용하는 정제된 미코박테리아 산물 및 그람 음성 세균 산물 모노포스포릴 지질 A를 내포한다. 일정한 구체예에서, Ribi는 면역 세포의 막과 상호작용하여, 항원 흡수, 처리 및 제시를 증강하는 사이토킨 유도를 야기한다. 일정한 구체예에서, 관심되는 단백질에 대한 항체를 생산하기 위한 방법은 어쥬번트와 병용으로, 관심되는 단백질을 디스플레이하는 복수의 EV를 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
일정한 구체예에서, 이들 방법은 추가 접종을 동물에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 관심되는 단백질에 대한 항체를 생산하기 위한 방법은 추가 접종과 병용으로, 관심되는 단백질을 디스플레이하는 복수의 EV를 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가 접종은 동물에서 면역 반응을 증강할 수 있고, 따라서 상기 동물에 의해 생산된 항체의 양과 품질을 증가시킬 수 있다. 일정한 구체예에서, 추가 접종은 항원 또는 항원의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일정한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 일정한 구체예에서, 추가 접종은 항원 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 일정한 구체예에서, 추가 접종은 EV와 동시에 투여된다. 일정한 구체예에서, 추가 접종은 EV가 동물에게 투여된 후 약 1 일, 약 2 일, 약 3 일, 약 4 일, 약 5 일, 약 6 일, 약 7 일, 약 8 일, 약 9 일, 약 10 일, 약 11 일, 약 12 일, 약 13 일, 약 14 일, 약 15 일, 약 16 일, 약 17 일, 약 18 일, 약 19 일, 약 20 일, 약 21 일, 약 22 일, 약 23 일 약 24 일, 약 25 일, 약 26 일, 약 27 일, 약 28 일, 약 29 일 및/또는 약 30 일째에 투여된다. 일정한 구체예에서, 추가 접종은 EV의 첫 번째 용량이 동물에게 투여된 후 약 1 일, 약 2 일, 약 3 일, 약 4 일, 약 5 일, 약 6 일, 약 7 일, 약 8 일, 약 9 일, 약 10 일, 약 11 일, 약 12 일, 약 13 일, 약 14 일, 약 15 일, 약 16 일, 약 17 일, 약 18 일, 약 19 일, 약 20 일, 약 21 일, 약 22 일, 약 23 일 약 24 일, 약 25 일, 약 26 일, 약 27 일, 약 28 일, 약 29 일 및/또는 약 30 일째에 투여된다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 추가 접종은 EV, 예를 들면, EV의 첫 번째 용량이 동물에게 투여된 후 약 14 일째에 투여된다. 일정한 구체예에서, 추가 접종은 EV, 예를 들면, EV의 첫 번째 용량이 동물에게 투여된 후 약 21 일째에 투여된다. 일정한 구체예에서, EV는 어쥬번트 및 추가 접종과 병용으로, 동물에게 투여될 수 있다.
면역화 및 항체 생산을 위한 당해 분야에서 공지된 임의의 동물이 본원에서 개시된 방법에서 이용될 수 있다. 본원에서 개시된 방법에서 이용될 수 있는 동물의 무제한적 실례는 비인간 영장류 예컨대 긴꼬리원숭이 (예를 들면, 개코원숭이, 또는 붉은 털 원숭이 및 시노몰구스 원숭이를 비롯한 마카크, U.S. 특허 5,658,570을 참조한다), 조류 (예를 들면, 닭); 토끼, 염소, 양, 소, 말, 돼지, 당나귀, 라마, 알파카, 그리고 개를 포함한다. 일정한 구체예에서, 동물은 설치류이다. "설치류"는 태반이 있는 포유동물의 설치목 (Rodentia)에 속하는 동물이다. 본원에서 이용될 수 있는 설치류의 무제한적 실례는 생쥐, 쥐, 기니 피그, 다람쥐, 햄스터, 그리고 흰담비를 포함한다. 일정한 구체예에서, 면역화를 위한 동물은 생쥐이다.
막-결합 항원을 포함하는 EV는 예를 들면, 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 비장을 비롯한 동물 신체의 다양한 세포로, 또는 혈액의 세포로 전달될 수 있다. 막-결합 항원을 포함하는 EV의 투여는 특정 루트 또는 부위에 한정되지 않는다. 투여 루트의 무제한적 실례는 근육내, 피내, 표피, 귓바퀴내, 경구, 질, 그리고 코를 포함한다. 일정한 구체예에서, 막-결합 항원을 포함하는 EV는 동물에게 근육내, 피내 또는 표피 투여된다. 일정한 구체예에서, EV는 근육, 피부 또는 점막의 조직으로 전달된다.
일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 상기 개시된 면역화된 동물로부터 면역 세포를 획득하되, 상기 면역 세포는 다중클론 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 단계를 더욱 포함한다. 이런 면역 세포는 이후, 적합한 융합 작용제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 센다이 바이러스를 이용하여 골수종 세포와 융합되어, 하이브리도마 세포를 형성할 수 있다 (Godmg, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1986). 대안으로 또는 부가적으로, 본원에서 개시된 방법은 B 세포 배양 클로닝에 의해 또는 면역 파지 라이브러리의 생산에 의해 항체를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, Bazan et al. Hum. Vaccin. Immunother. 8(12):1817-1828 (2012); Carbonetti et al. J. Immunol. Methods 448:66-73 (2017)을 참조하는데, 이들의 내용은 본원에서 참조로서 편입된다.
이렇게 제조된 하이브리도마 세포는, 융합되지 않은, 부모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 한 가지 이상의 물질을 가급적 내포하는 적합한 배양 배지에서 파종되고 성장될 수 있다. 예를 들면, 부모 골수종 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 전달효소 (HGPRT 또는 HPRT)를 결여하면, 하이브리도마에 대한 배양 배지는 전형적으로, 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함하는데, 이것은 HGPRT-결함성 세포의 성장을 예방한다. 골수종 세포주의 무제한적 실례는 뮤린 골수종 라인, 예컨대 MOPC-21 및 MPC-11 생쥐 종양으로부터 유래된 것들, 그리고 P3X63AgU.l, SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포; 쥐 골수종 세포주 210-RCY3.Agl.2.3; 그리고 인간 골수종 및 생쥐-인간 헤테로골수종 세포주이다.
대안으로, 하이브리도마 세포주는 다른 방식으로, 예를 들면, 관심되는 단일클론 항체를 생산하는 영속화 세포주를 생산하기 위해 면역 세포를 바이러스 (예를 들면, 엡스타인 바르 바이러스)로 또는 종양유전자로 영속화함으로써, 면역화된 동물의 면역 세포로부터 제조될 수 있다. 면역화된 동물의 면역 세포를 이용하여 단일클론 항체를 제조하기 위한 또 다른 전략을 위해, 특이적 항체를 생산하는 단일 세포로부터 면역글로불린 cDNA을 클로닝함에 의한 단일클론 항체의 생산과 관련하여, Babcock et al. PNAS (USA), 93:7843-7848 (1996)을 또한 참조한다.
일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 각 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 단일클론 항체를 확인하기 위한 선별검사 단계를 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, 이들 방법은, 동물이 면역화된 항원에 결합하는 항체를 선별검사하는 단계를 더욱 포함한다. 일정한 구체예에서, 선별검사는 클로닝된 하이브리도마 세포로부터 획득된 배양 상층액 및/또는 정제된 항체를 이용하여 실행될 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성은 예를 들면, 면역검정에서 결정될 수 있다. 면역검정의 무제한적 실례는 ELISA, 방사면역검정 (RIA) 및 FACS 검정을 포함한다. 일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 EV 기반 ELISA가 항체 선별검사에 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법은 항체-생산 세포의 분류를 가능하게 한다. 예를 들면, 항체-생산 세포는 일정한 구체예에서, 복수의 EV와 함께 인큐베이션될 수 있는데, 여기서 복수의 EV는 (1) 막-결합 항원 및 첫 번째 검출가능 마커를 포함하는 EV의 첫 번째 모집단으로서, 여기서 상기 항체-생산 세포의 부분집합이 상기 막-결합 항원에 특이적으로 결합하고; 및 (2) EV의 첫 번째 모집단의 막-결합 항원을 결여하지만, 첫 번째 마커와 구별 가능한 두 번째 검출가능 마커를 포함하는 EV의 두 번째 모집단을 포함한다. 일정한 구체예에서, 항체-생산 세포는 이후, 첫 번째 마커를 포함하는 EV의 첫 번째 모집단, 또는 첫 번째 마커를 포함하는 EV의 첫 번째 모집단 및 두 번째 마커를 포함하는 EV의 두 번째 모집단의 조합 중 어느 하나에 그들의 결합에 근거하여 분류될 수 있다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 및 두 번째 검출가능 마커는 형광 마커이다. 일정한 구체예에서, 첫 번째 및 두 번째 형광 마커는 형광 단백질이다. 일정한 구체예에서, 분류는 FACS에 의해 수행된다. 일정한 구체예에서, 항체-생산 세포는 B 세포이다. 일정한 구체예에서, 항체-생산 세포는 하이브리도마 세포이다.
V. 진단과 검출을 위한 방법과 조성물
일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 항체, 예를 들면, 본원에서 개시된 방법에 의해 생성된 항체는 생물학적 샘플에서 항원의 존재를 검출하는 데 유용할 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다.
일정한 구체예에서, 진단 또는 검출의 방법에 이용하기 위한 항체, 예를 들면, 본원에서 개시된 방법을 이용하여 생성된 항체가 제공된다. 추가의 양상에서, 생물학적 샘플에서 항원의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 상응하는 항원에 항체의 결합을 허용하는 조건하에 생물학적 샘플을 본원에서 설명된 바와 같은 항체와 접촉시키는 단계, 그리고 상기 항체 및 연관된 항원 사이에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 이런 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 일정한 구체예에서, 항체는 예를 들면, 항원이 환자의 선별을 위한 바이오마커인 경우에, 항체를 이용한 요법에 적격인 개체를 선별하는 데 이용된다.
일정한 구체예에서, 표지화된 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대 형광, 색소생산, 전자 밀도, 화학발광 및 방사성 표지)뿐만 아니라 예를 들면, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 예시적인 표지는 염료 전구체를 산화시키는 과산화수소를 이용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토페록시다아제 또는 마이크로페록시다아제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정된 유리 라디칼 등과 연계된 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라아제, 예컨대 반딧불이 루시페라아제 및 세균 루시페라아제 (U.S. 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프타라진디온, 양고추냉이 과산화효소 (HRP), 알칼리 인산분해효소, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다아제, 예컨대 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제 및 글루코오스-6-인산염 탈수소효소, 헤테로환상 옥시다아제, 예컨대 요산분해효소 및 크산틴 옥시다아제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
VI. 약학적 조성물
추가의 양상에서, 본원 발명은 예를 들면, 임의의 하기 치료 방법에 이용하기 위한, 본원에서 개시된 임의의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 항체는 본원에서 개시된 방법을 이용하여 생성된다. 한 가지 양상에서, 약학적 조성물은 본원에서 제공된 임의의 항체 및 약학적으로 허용되는 운반체를 포함한다. 다른 양상에서, 약학적 조성물은 예를 들면, 아래에 설명된 바와 같이, 본원에서 제공된 임의의 항체 및 적어도 한 가지의 추가 치료제를 포함한다.
본원에서 설명된 바와 같은 항체의 약학적 조성물은 동결 건조된 조성물 또는 수성 용액의 형태에서, 원하는 정도의 순도를 갖는 이런 항체를 한 가지 이상의 임의적인 약학적으로 허용되는 운반체와 혼합함으로써 제조된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 약학적으로 허용되는 운반체는 일반적으로, 이용된 용량과 농도에서 수용자에게 비독성이고, 그리고 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 완충액, 예컨대 히스티딘, 인산염, 구연산염, 아세트산염, 그리고 다른 유기 산; 아스코르빈산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들면, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 운반체는 틈새 약물 분산 작용제, 예컨대 가용성 중성 활성 히알루론산분해효소 당단백질 (sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루론산분해효소 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX®, Halozyme, Inc.)을 더욱 포함한다. rHuPH20을 포함하는 일정한 예시적인 sHASEGP 및 이용 방법은 U.S. 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에서 설명된다. 한 가지 양상에서, sHASEGP는 한 가지 이상의 추가 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 병용된다.
예시적인 동결 건조된 항체 조성물은 U.S. 특허 번호 6,267,958에서 설명된다. 수성 항체 조성물은 U.S. 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에서 설명된 것들을 포함하는데, 후자 조성물은 히스티딘-아세트산염 완충액을 포함한다.
본원에서 약학적 조성물은 또한, 치료되는 특정 적응증에 대해 필요에 따라 한 가지 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 내포할 수 있다. 이런 활성 성분은 적절하게는, 의도된 목적에 효과적인 양에서 조합으로 존재한다.
활성 성분은 예를 들면, 액적형성 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐 내에, 예를 들면 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로유제, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로유제에서 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이런 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에서 개시된다.
지속된 방출을 위한 약학적 조성물이 제조될 수 있다. 지속된 방출 제조물의 적합한 실례는 항체를 내포하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하는데, 이들 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 이용되는 약학적 조성물은 일반적으로 무균이다. 무균은 예를 들면, 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
VII. 치료 방법 및 투여 루트
본원에서 제공된 임의의 항체는 치료 방법에서 이용될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명은 치료 방법에 이용하기 위한, 본원 발명의 방법에 의해 생성된 항체를 제공한다.
한 가지 양상에서, 약제로서 이용을 위한, 본원에서 개시된 항체, 예를 들면, 본원 발명의 방법에 의해 생성된 항체가 제공된다. 추가의 양상에서, 질환을 치료하는 데 이용하기 위한, 본원에서 개시된 항체, 예를 들면, 본원 발명의 방법에 의해 생성된 항체가 제공된다. 일정한 구체예에서, 치료 방법에 이용하기 위한, 본원에서 개시된 항체가 제공된다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법에 이용하기 위한, 본원에서 개시된 항체, 예를 들면, 본원 발명의 방법에 의해 생성된 항체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 본원에서 개시된 항체의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제 (예를 들면, 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 또는 6가지 추가 치료제)의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 약제의 제조 또는 준비에서, 본원에서 개시된 항체, 예를 들면, 본원 발명의 방법에 의해 생성된 항체의 용도를 제공한다. 일정한 구체예에서, 약제는 질환의 치료를 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 약제는 질환을 치료하는 방법에 이용하기 위한 것이고, 상기 방법은 상기 약제의 효과량을 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 이런 질환을 갖는 개체에게 본원에서 개시된 항체의 효과량을 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 적어도 한 가지 추가 치료제의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다.
임의의 상기 구체예에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 예를 들면, 임의의 상기 치료 방법에 이용하기 위한, 본원에서 제공된 임의의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일정한 구체예에서, 약학적 조성물은 본원에서 제공된 임의의 항체 및 약학적으로 허용되는 운반체를 포함한다. 일정한 구체예에서, 약학적 조성물은 예를 들면, 아래에 설명된 바와 같이, 본원에서 제공된 임의의 항체 및 적어도 한 가지의 추가 치료제를 포함한다.
본원 발명의 항체는 요법 동안 단독으로 이용되거나 또는 다른 작용제와 병용될 수 있다. 예를 들면, 본원 발명의 항체는 적어도 한 가지 추가 치료제와 공동투여될 수 있다.
전술된 이런 병용 요법은 병용 투여 (여기서 두 가지 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 약학적 조성물 내에 포함된다), 그리고 별개 투여를 포괄하고, 이러한 사례에서, 본원 발명의 항체의 투여는 추가 치료제 또는 치료제들의 투여에 앞서, 투여와 동시에 및/또는 투여 이후에 발생할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원에서 설명된 항체의 투여 및 추가 치료제의 투여는 서로 약 1 개월 이내에, 또는 약 1, 2 또는 3 주 이내에, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 일 이내에 일어난다. 일정한 구체예에서, 본원에서 설명된 항체 및 추가 치료제는 치료의 1일 자에 환자에게 투여된다. 본원 발명의 항체는 또한, 방사선요법과 병용될 수 있다.
본원 발명의 항체 (및 임의의 추가 치료제)는 비경구, 폐내 및 비내를 비롯한 임의의 적절한 수단에 의해, 그리고 국소 치료를 위해 원하는 경우에, 병소내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 투여가 단기 또는 장기인지에 부분적으로 따라서, 임의의 적합한 루트, 예를 들면, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 단회 투여 또는 다양한 시점에 걸쳐 복수 투여, 일시 투여, 그리고 펄스 주입을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 투약 일정이 본원에서 예기된다.
본원 발명의 항체는 모범 의료행위 지침과 일치하는 방식으로 조제되고, 투약되고, 투여될 것이다. 이러한 문맥에서 고려되는 인자는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여의 일정, 그리고 개업의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는 반드시 그러할 필요는 없지만, 문제되는 장애를 예방하거나 치료하는 데 현재 이용되는 한 가지 이상의 작용제와 함께 임의적으로 조제된다. 이런 다른 작용제의 효과량은 약학적 조성물 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 그리고 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 이들은 일반적으로, 본원에서 설명된 바와 동일한 용량에서 및 투여 루트로, 또는 본원에서 설명된 용량의 약 1 내지 99%에서, 또는 경험적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정되는 임의의 용량에서 및 임의의 루트에 의해 이용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위한, 본원 발명의 항체의 적절한 용량 (단독으로 이용되거나 또는 한 가지 이상의 다른 추가 치료제와 병용될 때)은 치료되는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 심각도와 경과, 항체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 그리고 주치의의 재량에 의존할 것이다. 상기 항체는 적합하게는, 한꺼번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다. 질환의 유형과 심각도에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들면, 0.1 mg/kg - 10 mg/kg)의 항체가 예를 들면, 1회 이상의 별개 투여에 의한, 또는 연속 주입에 의한 것인지에 상관없이, 환자에게 투여를 위한 초기 후보 용량일 수 있다. 한 가지 전형적인 일일량은 전술된 인자에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수도 있다. 수 일 이상에 걸쳐 반복된 투여의 경우에, 상태에 따라서, 치료는 일반적으로, 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 항체의 한 가지 예시적인 용량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위 안에 있을 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합) 중에서 한 가지 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이런 용량은 간헐적으로, 예를 들면 매주 또는 3 주마다 (예를 들면 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들면, 약 6회 용량의 상기 항체를 제공받도록) 투여될 수 있다. 초기 더 높은 부하 용량, 그 이후에 1회 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 예시적인 투약 섭생은 투여하는 단계를 포함한다. 하지만, 다른 투약 섭생이 유용할 수도 있다. 이러한 요법의 진행은 전통적인 기술과 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
VIII. 제조 물품
본원 발명의 다른 양상에서, 전술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 내포하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 결합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 단독으로, 또는 질환을 치료하는, 예방하는 및/또는 진단하는 데 효과적인 다른 조성물과 조합으로 조성물을 보유하고, 그리고 무균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백, 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있다).
조성물에서 적어도 한 가지 활성제는 본원 발명의 항체, 예를 들면, 본원 발명의 방법에 의해 생성된 항체이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택 질환을 치료하는 데 이용된다는 것을 지시한다. 게다가, 제조 물품은 (a) 조성물이 그 안에 내포된 첫 번째 용기 (여기서 상기 조성물은 본원 발명의 항체, 예를 들면, 본원 발명의 방법에 의해 생성된 항체를 포함한다); 및 (b) 조성물이 그 안에 내포된 두 번째 용기 (여기서 상기 조성물은 추가 세포독성제 또는 만약 그렇지 않으면 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본원 발명의 이러한 구체예에서 제조 물품은 조성물이 특정 질환을 치료하는 데 이용될 수 있다는 것을 표시하는 포장 삽입물을 더욱 포함할 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용되는 완충액, 예컨대 정균성 주사용수 (BWFI), 인산염-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 두 번째 (또는 세 번째) 용기를 더욱 포함할 수도 있다. 이것은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 비롯하여, 상업적 관점 및 이용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 더욱 포함할 수 있다.
IX. 예시적인 구체예
A. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은
(a) (i) 소포 인자에 노출된 세포에서 이종성 단백질을 발현하고, (ii) 상기 세포를 배지에 배양하고, (iii) 이종성 단백질을 포함하는 복수의 세포외 소포(EV)를 상기 배지로부터 단리함으로써, 이종성 단백질을 포함하는 복수의 EV를 생산하되, 상기 소포 인자는 아실.Hrs, ARRDC1, ARF6 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 단계;
(b) 복수의 EV를 동물에게 투여함으로써 상기 동물을 면역화하는 단계; 및
(c) 상기 단백질에 결합하는 항체를 상기 동물로부터 단리하는 단계를 포함한다.
A1. A의 앞서 말한 방법, 여기서 세포는 비부착성 세포이다.
A2. A 및 A1의 앞서 말한 방법, 여기서 소포 인자 및 단백질을 세포에서 발현하는 단계는 상기 소포 인자 및 상기 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 상기 세포에 도입하는 단계를 포함한다.
A3. A2의 앞서 말한 방법, 여기서 소포 인자 및 단백질은 단일 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
A4. A2의 앞서 말한 방법, 여기서 소포 인자는 첫 번째 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되고, 그리고 단백질은 두 번째 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
B. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 (a) (i) 이종성 단백질을 세포에서 발현하고, (ii) 상기 세포를 배지에 배양하고, (iii) 이종성 단백질을 포함하는 복수의 세포외 소포(EV)를 상기 배지로부터 단리함으로써, 이종성 단백질을 포함하는 복수의 EV를 생산하되, 상기 세포는 비부착성 세포인 단계; (b) 복수의 EV를 동물에게 투여함으로써 상기 동물을 면역화하는 단계; 및 (c) 이종성 단백질에 결합하는 항체를 상기 동물로부터 단리하는 단계를 포함한다.
B1. B의 앞서 말한 방법, 여기서 복수의 EV를 생산하는 단계는 이종성 소포 인자를 세포에서 발현하는 단계를 더욱 포함한다.
B2. B1의 앞서 말한 방법, 여기서 소포 인자는 MLGag, 아실.Hrs, ARRDC1, ARF6 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
B3. A-B2의 앞서 말한 방법, 여기서 이종성 단백질은 막 단백질이다.
B4. B3의 앞서 말한 방법, 여기서 막 단백질은 단일통과 막 단백질이다.
B5. B3의 앞서 말한 방법, 여기서 막 단백질은 다중통과 막 단백질이다.
B6. B3의 앞서 말한 방법, 여기서 막 단백질은 단백질 복합체의 구성원이다.
B7. B3의 앞서 말한 방법, 여기서 막 단백질은 막경유 단백질이 아니고 단백질 복합체의 구성원이다.
B8. A1-B7의 앞서 말한 방법, 여기서 비부착성 세포는 293S 세포 또는 Expi293FTM 세포이다.
B9. A-B8의 앞서 말한 방법, 여기서 EV는 초원심분리에 의해 배지로부터 단리된다.
B10. A-B9의 앞서 말한 방법, 여기서 복수의 EV는 0주 차, 2주 차 및 4주 차에 동물에게 투여된다.
B11. A-B10의 앞서 말한 방법, 여기서 상기 방법은 어쥬번트를 EV와 동시에 동물에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다.
B12. B11의 앞서 말한 방법, 여기서 어쥬번트는 Ribi 어쥬번트이다.
B13. A-B12의 앞서 말한 방법, 여기서 상기 방법은 동물에서 단백질에 대한 면역 반응을 증강하기 위해, 추가 접종(boost)을 동물에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다.
B14. B13의 앞서 말한 방법, 여기서 추가 접종은 단백질, 상기 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
B15. B14의 앞서 말한 방법, 여기서 추가 접종은 단백질을 포함한다.
B16. B14의 앞서 말한 방법, 여기서 추가 접종은 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
B17. A-B16의 앞서 말한 방법, 여기서 항체는 단일클론 항체이다.
B18. A-B17의 앞서 말한 방법, 여기서 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다.
C. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 A-B18 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
D. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 C의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
E. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 D의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
F. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 생산하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 방법은 E의 숙주 세포를 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계를 포함한다.
F1. F의 앞서 말한 방법, 여기서 상기 방법은 항체를 숙주 세포로부터 회수하는 단계를 더욱 포함한다.
G. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 C의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분 및 약학적으로 허용되는 운반체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
G1. G의 앞서 말한 약학적 조성물, 여기서 상기 조성물은 추가 치료제를 더욱 포함한다.
H. 약제로서 이용을 위한, C의 앞서 말한 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
I. 질환을 치료하는 데 이용하기 위한, C의 앞서 말한 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
J. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 약제의 제조에서 C의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 용도를 제공한다.
K. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 방법은 C의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
K1. K의 앞서 말한 방법, 여기서 상기 방법은 추가 치료제를 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다.
L. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 방법은 G 또는 G1의 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
M. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 샘플 내에서 항체를 검출하기 위한 방법을 제공하는데, 여기서 상기 방법은
(a) 샘플을 포획 시약과 함께 인큐베이션하되, 상기 포획 시약은 막-결합 항원을 포함하는 복수의 EV를 포함하고, 그리고 상기 항체는 상기 막-결합 항원에 특이적으로 결합하는 단계; 및
(b) 포획 시약에 결합하는 항체를 검출가능 항체와 접촉시켜, 결합된 항체를 검출하되, 상기 검출가능 항체는 상기 항체에 특이적으로 결합하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 복수의 EV는 (i) 세포에서 막-결합 항원의 발현, (ii) 상기 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여, 막-결합 항원을 디스플레이하는 복수의 EV를 생산함 및 (iii) 막-결합 항원을 디스플레이하는 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리함에 의해 생성되고, 그리고
여기서 상기 세포는 아실.Hrs, ARRDC1, ARF6 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 소포 인자에 노출되고/되거나 상기 세포는 비부착성 세포이다.
M1. M의 앞서 말한 방법, 여기서 (c) (b)에서 검출된 항체의 양을 계측하되, 상기 양은 표준 곡선을 이용하여 정량되는 단계를 더욱 포함한다.
M2. M 또는 M1의 앞서 말한 방법, 여기서 샘플은 혈장, 혈청 또는 소변 샘플이다.
M3. M-M2의 앞서 말한 방법, 여기서 포획 시약은 고체 지지체 위에 고정된다.
M4. M3의 앞서 말한 방법, 여기서 고체 지지체는 마이크로역가 평판이다.
M5. M-M4의 앞서 말한 방법, 여기서 검출가능 항체는 형광 표지화된다.
M6. M-M5의 앞서 말한 방법, 여기서 막-결합 항원은 막 단백질 또는 이의 단편이다.
N. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 항체-생산 세포를 분류하기 위한 방법을 제공하는데, 여기서 상기 방법은
(a) 항체-생산 세포를 복수의 EV와 함께 인큐베이션하되, 상기 복수의 EV는 i. 막-결합 항원 및 첫 번째 검출가능 마커를 포함하는 EV의 첫 번째 모집단으로서, 여기서 상기 항체-생산 세포의 부분집합이 막-결합 항원에 특이적으로 결합하고; 및 ii. 막-결합 항원을 결여하지만, 첫 번째 마커와 구별 가능한 두 번째 검출가능 마커를 포함하는 EV의 두 번째 모집단을 포함하는 단계; 및
(b) 항체-생산 세포를 EV의 첫 번째 모집단, 또는 EV의 첫 번째 모집단 및 EV의 두 번째 모집단의 조합 중 어느 하나에 대한 그들의 결합에 근거하여 분류하는 단계를 포함하고,
여기서 EV의 첫 번째 모집단은 (i) 첫 번째 세포에서 막-결합 항원 및 첫 번째 검출가능 마커의 발현, (ii) 첫 번째 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여, 막-결합 항원을 디스플레이하는 복수의 EV를 생산함 및 (iii) 막-결합 항원을 디스플레이하는 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리함에 의해 생성되고,
여기서 EV의 두 번째 모집단은 (i) 두 번째 세포에서 두 번째 검출가능 마커의 발현, (ii) 두 번째 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여, 두 번째 검출가능 마커를 포함하는 복수의 EV를 생산함 및 (iii) 두 번째 검출가능 마커를 디스플레이하는 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리함에 의해 생성되고, 그리고
여기서 (i) 첫 번째 세포 및/또는 두 번째 세포는 아실.Hrs, ARRDC1, ARF6 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 소포 인자와 접촉되고/되거나 (ii) 첫 번째 및/또는 두 번째 세포는 비부착성 세포이다.
N1. N의 앞서 말한 방법, 여기서 첫 번째 및 두 번째 검출가능 마커는 형광 마커이다.
N2. N1의 앞서 말한 방법, 여기서 첫 번째 및 두 번째 형광 마커는 형광 단백질이다.
N3. N-N2의 앞서 말한 방법, 여기서 분류는 형광 활성화 세포 분류에 의해 수행된다.
N4. N-N3의 앞서 말한 방법, 여기서 항체-생산 세포는 B 세포이다.
N5. N-N4의 앞서 말한 방법, 여기서 항체-생산 세포는 하이브리도마 세포이다.
O. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 이종성 단백질을 디스플레이하는 복수의 세포외 소포 (EV)를 생산하기 위한 방법을 제공하는데, 여기서 상기 방법은
(a) 이종성 단백질을 세포에서 발현하는 단계;
(b) 상기 세포를 배지에 배양하는 단계; 및
(c) 이종성 단백질을 포함하는 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 세포는 아실.Hrs, ARRDC1, ARF6 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 소포 인자에 노출되고/되거나 상기 세포는 비부착성 세포이다.
O1. O의 앞서 말한 방법, 여기서 이종성 단백질은 막 단백질이다.
O2. O1의 앞서 말한 방법, 여기서 막 단백질은 단일통과 막 단백질이다.
O3. O1의 앞서 말한 방법, 여기서 막 단백질은 다중통과 막 단백질이다.
O4. O1-O3의 앞서 말한 방법, 여기서 막 단백질은 단백질 복합체의 구성원이다.
O5. M-O4의 앞서 말한 방법, 여기서 비부착성 세포는 293S 세포 또는 Expi293FTM 세포이다.
O6. M-O5의 앞서 말한 방법, 여기서 복수의 EV는 초원심분리에 의해 배지로부터 단리된다.
P. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원에서 개시된 요부는 샘플 내에서 항체를 검출하기 위한 키트를 제공하는데, 여기서 상기 키트는
(a) 막-결합 항원을 포함하는 복수의 EV를 포함하는 포획 시약으로서, 여기서 검출되는 항체가 상기 항원에 특이적으로 결합하고; 및
(b) 검출되는 항체에 특이적으로 결합하는 검출가능 항체를 포함하고,
여기서 상기 복수의 EV는 (i) 세포에서 막-결합 항원의 발현, (ii) 상기 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여, 막-결합 항원을 디스플레이하는 복수의 EV를 생산함 및 (iii) 막-결합 항원을 디스플레이하는 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리함에 의해 생성되고, 그리고
여기서 상기 세포는 아실.Hrs, ARRDC1, ARF6 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 소포 인자에 노출되고/되거나 상기 세포는 비부착성 세포이다.
P1. P의 앞서 말한 키트, 여기서 복수의 EV는 고체 지지체 위에 고정된다.
P2. P 또는 P1의 앞서 말한 키트, 여기서 고체 지지체는 마이크로역가 평판이다.
P3. P-P2의 앞서 말한 키트, 여기서 검출가능 항체는 형광 표지화된다.
P4. P-P3의 앞서 말한 키트, 여기서 막-결합 항원은 막 단백질 또는 이의 단편이다.
실시예
본원에서 개시된 요부는 하기 실시예를 참조하면 더 잘 이해될 것인데, 이들 실시예는 본원에서 개시된 요부의 제한이 아닌, 예시로서 제공된다.
실시예 1: MP-X를 포함하는 소포를 생산하는 소포 인자의 확인
293T 세포가 표적 단백질 인간 G-단백질 연계된 수용체 (막 단백질 (MP)-X), 그리고 hARRDC1, 아실-Hrs, ARF6.Q67L, RhoA.F30L, 구성적 활성 ROCK, MemPro 및 MLGag에서 선택되는 소포 인자로 동시형질감염되었다. EV가 도 3에서 도시된 바와 같이 생성되었다. 표적 단백질 및 소포 인자의 발현을 검사하기 위해 세포 용해물이 수집되었다. 배양 배지가 수집되고 처리되었다. EV가 초원심분리에 의해 배양 배지로부터 수집되었다. 정제된 EV가 항-FLAG 항체를 이용한 웨스턴 블롯 (1:1000 희석 M2 Sigma F3165)에 의해 분석되었다.
도 4에서 도시된 바와 같이, 소포 인자 hARRDC1, 아실.Hrs, ARF6.Q67L, 또는 MLGag로 형질감염된 세포로부터 생산된 EV에서는 MP-X가 발현되지만, 소포 인자 RhoA.F30L, 구성적 활성 ROCK 및 MemPro로 형질감염된 세포로부터 생산된 EV에서는 그렇지 않았다. 이에 더하여, 동적 광 산란 (DLS)은 hARRDC1, 아실.Hrs, 또는 MLGag로 형질감염된 세포로부터 생산된 EV가 균일한 소포 크기를 갖는다는 것을 보여주었다 (도 5).
그 다음, EV를 유도하는 이들 소포 인자의 유용성이 뮤린 세포로 검사되었다. EV를 생산하기 위해, 뮤린 결장암 세포 MC38 및 뮤린 근모세포 C2C12가 MP-X, 그리고 MLGag, 아실.Hrs 및 mARRDC1에서 선택되는 소포 인자로 동시형질감염되었다. EV를 초원심분리기에 의해 배양 배지로부터 정제한 후, MP-X의 존재를 검출하기 위해 이들 EV가 웨스턴 블롯 (항-FLAG 일차 항체, 1:1000 희석 M2 Sigma F3165)에 의해 분석되었다. 도 6은 소포 인자 MLGag, 아실.Hrs, 또는 mARRDC1로 형질감염된 세포로부터 생산된 EV에서 MP-X 수준이 높다는 것을 보여주었다. 소포 인자로 형질감염되지 않은 세포로부터 생산된 EV에서는 MP-X가 검출되지 않았다.
실시예 2: 높은 수확량으로 신속한 EV 생성을 가능하게 하는 향상된 방법
EV 생산에서 한 가지 과제는 EV를 배양 배지로부터 효율적으로 정제하는 것이다 (도 7a). PEG 침전법은 회수율이 매우 불량하고, 명확한 펠렛 생산이 없으며, 하룻밤 단계를 필요로 한다. 염 기반 침전은 단지 1 시간만 필요하지만, 불용성 펠렛을 생산하였다. 본 연구는 초원심분리 정제가 3가지 방법 모두 중에서 가장 효율적인 정제 방법이고, 그리고 단지 3 시간만을 필요로 한다는 것을 밝혀냈다.
EV 생산에서 다른 과제는 충분한 수확량을 갖는 세포주를 선별하는 것이다. 다수의 세포주의 수확량을 비교한 후, 본 연구는 Expi293FTM 및 293S 세포가 4가지 세포주 모두 중에서 가장 높은 수확량을 생산한다는 것을 밝혀냈다 (도 7b). JetPEI가 형질감염 방법으로서 이용되었다.
본 연구는 또한, Expi293FTM 세포주 및 293S 세포주 사이에 EV 수확량 및 표적 단백질 (다시 말하면, 관심되는 단백질) 발현을 비교하였다. 도 8a-8b는 MLGag를 소포 인자로서 이용할 때, Expi293 세포주가 293S 세포주보다 더 높은 평균 수확량을 갖는다는 것을 보여주었다. 도 8c는 세포의 생존력이 293S 세포주에서보다 Expi293FTM 세포주에서 더 우수하다는 것을 보여주었다.
Expi293FTM 세포주 및 293S 세포주에 대한 배가 시간은 약 24 시간으로 매우 유사하였다. 형질감염후 세포 성장이 양쪽 세포주에서 감소하였다. 293S 세포주는 생산기 동안 배증될 수 있는 반면, Expi293FTM 세포주는 생산기 동안 몇 배로 배증되었다.
추가적으로, EV에서 각 표적 단백질의 존재가 ELISA를 이용하여 계측되었다. 도 9a-9c는 Expi293FTM 세포주로부터 획득된 EV가 293S 세포주로부터 획득된 EV보다 더 높은 표적 단백질 농도를 갖는다는 것을 보여주었다.
본 연구는 또한, 쥐 RBA 세포가 EV 생산에 이용될 수 있는지를 검사하였다. RBA 세포주는 SD 쥐로부터 유래된 유선 선암종 세포주이다. RBA 세포는 EV를 생산할 수 있지만, 293S 세포주와 비교할 때 수확량이 매우 낮은 것으로 밝혀졌다 (도 13).
실시예 3: EV는 복합적 막 단백질에 대한 FACS+ 항체의 ELISA 기반 검출을 가능하게 하였다
본 연구는 소포 인자 MLGag, 아실.Hrs, ARRDC1 및 ARF6이 Expi293FTM 세포주를 이용하여 윤곽이 명확한 입자 (184 ± 40 nm의 직경)를 생성하는 데 도움을 준다는 것을 밝혀냈다 (도 10a). 추가적으로, EV는 EV에 의해 통합된 단일통과 막 단백질 및 다중통과 막 단백질에 대한 FACS+ 항체를 이용한, 이들 단백질의 ELISA 기반 검출을 가능하게 하였다 (도 10b-10c).
실시예 4: Expi293F TM EV 면역화된 쥐, 토끼, 라마 및 생쥐로부터 항체를 선별검사하기 위한 세포주의 확인
본 연구는 형질감염 효율 및 EV 면역화된 쥐 또는 생쥐 항혈청에 대한 결합 능력에 대해 토끼, 라마/낙타, 쥐 및 생쥐 세포주를 선별검사하였다. SD 쥐, 토끼, 라마 및 생쥐가 0주 차, 2주 차 및 4주 차에 Expi293FTM 생산된 EV로 면역화되었다. 혈청 샘플이 면역화 전 (전채혈 샘플) 및 면역화 후 (항혈청 샘플), 이들 동물로부터 수집되었다 (도 11a, 도 12a). Expi293FTM 세포주, RK13 세포주, Dubca 세포주, RBA 세포주 및 3T3 세포주를 비롯한, 상이한 세포주에 대한 수집된 전채혈 및 항혈청 샘플의 결합이 FACS에 의해 계측되었다. 수집된 쥐 항혈청은 293 세포주에는 고도로 결합하지만, SD 쥐로부터 유래된 유선 선암종 세포주인 RBA 세포주에는 그렇지 않았다. 수집된 생쥐 항혈청은 RBA 세포주에는 고도로 결합하지만, Balb/c 생쥐로부터 유래된 배아 섬유모세포 세포주인 3T3 세포주에는 그렇지 않았다 (도 11b). RBA 세포는 고도로 형질감염 가능하였고 (도 11c), 그리고 3T3 세포 또한 합리적으로 형질감염 가능하였다 (도 11d). 수집된 토끼 항혈청은 RK13 세포에 결합하지 않았고, 그리고 수집된 라마 항혈청은 Dubca 세포에는 결합하지 않지만, 3T3 세포에는 결합하였다 (도 12b). RK13 세포 및 Dubca 세포 역시 형질감염 가능하였다 (도 12c). 따라서, RBA 세포주 및 3T3 세포주가 Expi293FTM EV 면역화된 SD 쥐와 생쥐로부터 항체를 선별검사하는 데 이용될 수 있고, 그리고 RK13 세포주 및 Dubca 세포주가 Expi293FTM EV 면역화된 토끼와 라마로부터 항체를 선별검사하는 데 이용될 수 있다.
실시예 5: EV 항원을 이용한 도전적인 막 단백질에 대한 기능적 단일클론 항체의 개발
Expi293FTM 세포주가 소포 인자 MLGag 및 막 단백질-1 (MP-1, 다중통과 막 단백질) 작제물로 4 일 동안 동시형질감염되었고, 그리고 EV가 배양 배지로부터 수집되었다. 웨스턴 블롯은 MP-1이 EV 및 전체 세포 용해물 내에 존재한다는 것을 확증하였다 (도 14).
Expi293FTM 세포주는 또한, 소포 인자 MLGag 또는 ARF6, 그리고 막 단백질-2 (MP-2, 110개 초과의 아미노산을 포함하는 세포내 도메인을 갖지 않는 다중통과 막 단백질) 작제물로 4 일 동안 동시형질감염되었다. 웨스턴 블롯은 MP-2가 EV 및 전체 세포 용해물 내에 존재한다는 것을 확증하였다 (도 15).
Expi293FTM 세포주는 또한, 소포 인자 MLGag 또는 ARF6, 그리고 막 단백질-3 (MP-3, 700개 초과의 아미노산을 포함하는 세포내 도메인을 갖는 다중통과 막 단백질) 작제물로 4 일 동안 동시형질감염되었다. 웨스턴 블롯은 ARF6으로 형질감염된 세포로부터 생산된 ARF6 소유 EV에는 MP-3이 존재하지만, MLGag에서는 그렇지 않다는 것을 확증하였다 (도 16). 특정 이론에 한정됨 없이, 이런 결과의 원인은 Gag 캡시드가 큰 세포내 도메인을 갖는 MP의 통합을 입체적으로 차단하기 때문일 수 있다 (도 17).
실시예 6: 선천적 형식의 항원에 대한 일차 항체를 선별검사하기 위한 EV 기반 ELISA
본 연구는 선천적 형태의 막 단백질에 대한 일차 항체를 선별검사하기 위해 EV 기반 ELISA를 이용하는 방법을 세포 기반 FACS를 이용하는 방법과 비교하였다. 단백질 ELISA, EV 기반 ELISA 및 FACS의 작동 기전은 도 18에서 도시되었다.
2가지 막 단백질, MP-4 및 MP-5가 본 연구를 위한 결합 항원으로서 이용되었다. MP-4는 단일통과 막 단백질이고, 그리고 MP-5는 다중통과 막 단백질이다.
단백질 면역화를 이용하여 MP-4로 면역화된 생쥐로부터 항-MP-4 하이브리도마가 생성되었다. EV 기반 ELISA를 위해 MLGag를 이용하여, 막 결합된 MP-4를 포함하는 EV가 생성되었다. 도 19a-19d는 MP-4의 경우에 EV 기반 ELISA 역가가 FACS 역가와 잘 상관되고, 그리고 EV 기반 ELISA 결과가 FACS 결과와 일치한다는 것을 보여주었다. 대조적으로, 단백질 기반 ELISA 및 EV 기반 ELISA 또는 FACS 중 어느 하나 사이의 상관은 상당히 불량하였다.
DNA 면역화를 이용하여 MP-5로 면역화된 생쥐로부터 항-MP-5 혈청 및 하이브리도마가 생성되었다. 유사하게, EV 기반 ELISA는 FACS와 잘 상관되었다 (도 20a-20b, 21).
이런 이유로, 본 연구는 EV가 복합적 막 단백질에 대한 항체의 ELISA 기반 검출을 가능하게 하고, 그리고 EV 기반 ELISA가 선천적 형식 항원에 대한 일차 항체를 선별검사하는 데 이용될 수 있다는 것을 보여주었다.
실시예 7: 도전적인 항원 MP-6에 대한 단일클론 항체 발견을 위한 항원 발현 EV의 이용
MP-6은 복수의 암에 대한 높은 가치 항체-약물 접합체 (ADC) 표적이고, 그리고 항-MP-6 항체를 개발하기 위한 도전적인 표적이다. 293S 세포를 MLGag, 아실.Hrs, ARF6 또는 ARRDC1의 소포 인자 및 MP-6 작제물로 동시형질감염시킴으로써, 막 결합된 MP-6을 포함하는 EV가 생산되었다. 초원심분리에 의해 EV가 단리되었다. EV의 수확량은 표 2에서 도시되었다. MP-6의 상대적 수준이 웨스턴 블롯에 의해 계측되었다.
표 2. 각 소포 인자로 형질감염된 세포에서 EV의 수확량
수확량 (mg) 상대적 MP-6 수준
MLGag 5.9 1.27
아실.Hrs 4.7 1
ARF6 4.46 0.58
ARRDC1 3.33 1.92
MP-6 EV의 초기 배치의 분석은 단리된 EV에서 MP-6이 발현된다는 것을 증명하였다 (도 22a). 추가적으로, 웨스턴 블롯 분석은 각각의 소포 인자가 또한 소포 내로 통합된다는 것을 확증하였다 (도 22b). 재조합 단백질 표준을 이용한 정량적 웨스턴 블롯이, 소포에 통합된 MP-6의 절대량을 계측하는 데 이용되었다 (도 22c).
SD 쥐가 DNA 또는 단백질 추가 접종과 함께, 생산된 EV로 면역화되었다. 면역화를 위한 EV는 PBS 또는 Ribi (어쥬번트)에서 제조되었다. 면역화 프로토콜은 도 23에서 도시되었다. DNA 또는 단백질 추가 접종 전후에 항혈청이 이들 쥐로부터 수집되었다. 항체가 250, 50, 10, 또는 2 μg/ml의 최종 농도로, 수집된 항혈청으로부터 정제되었다. 정제된 항체에서 항-MP-6 항체의 수준이 FACS 또는 웨스턴 블롯에 의해 계측되었다. RBA 세포가 리포펙타민 3000 (리포펙타민:DNA=3:1)을 이용하여, MP-6 발현 작제물과 함께 또는 이것 없이 2 일 동안 형질감염되었다. 이들 RBA 세포는 FACS 분석에 이용되었다.
웨스턴 블롯은 DNA 또는 단백질 추가 접종 후 이들 쥐로부터 수집된 항혈청에서 항-MP-6 항체 및 항-Gag 항체의 수준을 보여주었다 (도 24a). DNA 또는 단백질 추가 접종 후 이들 쥐로부터 수집된 항혈청은 RBA 세포에 대한 유의미한 결합이 없는 것으로 밝혀졌다 (도 24b). 본 연구는 또한, RBA 기반 FACS를 이용하여, 수집된 항혈청에서 항체 수준을 계측하였다. FACS 결과는 웨스턴 블롯 데이터와 잘 상관되었다 (도 24c 및 24d). 따라서, 이것은 면역화된 일차 항체가 RBA 세포에 대한 배경 결합을 보여주지 않고, 그리고 미경험 SD 쥐의 IgG가 MP-6으로 형질감염된 RBA에 결합하지 않는다는 것을 보여주었다. MP-6 발현 EV로 면역화된 쥐로부터 수집된 항체만 MP-6으로 형질감염된 RBA에 결합을 보여주었다. 따라서, RBA 기반 FACS는 EV 면역화된 쥐에 의해 생산된 MP-6 항체를 선별검사하는 데 이용될 수 있다.
본 연구는 DNA 추가 접종은 MP-6 발현 EV로 면역화된 쥐에서 항-MP-6 항체 역가를 증가시키지만, 단백질 추가 접종은 그렇지 않다는 것을 밝혀냈다 (도 24a-24d, 26). 추가적으로, 어쥬번트 (Ribi)를 면역화 과정에 통합하는 것 또한 항-MP-6 항체 역가를 증가시켰다 (도 24a-24d, 25a-25b).
상기 연구는 어쥬번트로서 Ribi가 항체 역가를 증가시키고, 그리고 아실.Hrs EV가 MLGag EV보다 약한 항체 반응을 생성한다는 것을 보여주었다 (도 25a). 도 25b는 혈청이 FACS에 의한 항체 역가 검사에 적합하고, 그리고 IgG 정제가 필요하지 않다는 것을 보여주었다.
실시예 8: MP-7에 대한 단일클론 항체 발견을 위한 항원 발현 EV의 이용.
본 연구는 다중통과 막 단백질인 막 단백질 MP-7에 대한 단일클론 항체를 발견하고 생성하기 위해, 실시예 7에서 개발된 면역화 방법을 이용하였다. 생쥐 항-MP-7 일차 항체가 MP-7을 포함하는 EV로 면역화된 녹아웃 생쥐로부터 생성되었고, 그리고 FACS에 의해 선별검사되었다. 항혈청이 FACS에서 MP-7 발현 세포에 유의미한 결합을 보여주는 생쥐로부터 항-MP-7 하이브리도마가 선별되었다 (도 27a-27c). 이들 하이브리도마는 COS7 안정된 세포 및 내인성 세포에서 MP-7에 강한 결합을 보여주는 항-MP-7 항체 클론을 선별하기 위해 FACS에 의해 더욱 선별검사되었다 (도 28-30).
실시예 9: MP-1에 대한 단일클론 항체 발견을 위한 항원을 포함하는 EV의 이용.
본 연구는 막 단백질 MP-1에 대한 단일클론 항체를 생산하기 위해, 실시예 7에서 개발된 면역화 방법을 이용하였다. 쥐가 단백질 또는 DNA 추가 접종과 함께, 막 결합된 MP-1 또는 MP-1 DNA를 포함하는 EV로 면역화되었다. MP-1이 파상풍 톡소이드로부터 유래된 보편적 T 세포 에피토프 (MP-8 TCE4)의 4개의 반복부에 융합되는 추가의 EV가 생성되었다 (Demotz et al. J Immunol 1989; 142). 이들 EV는 소포 인자로서 MLGag의 발현에 의해 생성되었다.
이들 쥐로부터 수집된 항혈청이 FACS에 의해 선별검사되었다 (도 31a-31b). 이것은 DNA 추가 접종이 항체 역가를 증가시키는 데 단백질 추가 접종보다 전반적으로 더 효과적이고, 그리고 T 세포 에피토프의 추가가 효과가 없다는 것을 보여주었다. 단백질 추가 접종은 DNA 면역화된 쥐에서 FACS 역가를 증가시켰는데, 이것은 단백질 추가 접종 및 세포 표면 MP-1 사이에 에피토프의 일부 중첩을 암시하였다. 쥐 항-MP-1 하이브리도마가 FACS에 의해 선별검사되었다 (도 32). RBA 세포가 리포펙타민 3000을 이용하여 MP-1 DNA로 1 일 동안 형질감염되었고, 이후 쥐 항-MP-1 하이브리도마 상층액, 그 이후에 AF647-항-쥐 IgG로 염색되었다.
실시예 10: MP-8에 대한 단일클론 항체 발견을 위한 막-결합 항원을 포함하는 EV의 이용.
본 연구는 단일통과 막 단백질인 막 단백질 MP-8에 대한 단일클론 항체를 발견하고 생성하기 위해, 실시예 7에서 개발된 면역화 방법을 이용하였다. 쥐가 단지 단백질, MP-8을 인코딩하는 DNA, 또는 막 결합된 MP-8을 포함하는 EV (MLGag를 소포 인자로서 이용함으로써 생성됨)로만 면역화되었다. ELISA 및 FACS 결과는 도 33에서 도시되었다. 이들 결과는 EV 면역화가 단백질 면역화와 비교하여 더 적은 ELISA+ 클론을 야기하긴 하지만, EV 면역화는 단백질 면역화와 비교하여 더 높은 백분율의 FACS+ 항체를 생성할 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 11: 면역화된 동물로부터 획득된 B 세포의 분류를 위한 막-결합 항원을 포함하는 형광 EV의 이용.
본 연구는 다중통과 막 단백질인 막 단백질 MP-9에 대한 단일클론 항체를 발견하고 생성하기 위해, 실시예 7에서 개발된 면역화 방법을 이용하였다. 쥐 및 토끼가 MP-9 및 MP-9 DNA를 포함하는 EV로 면역화되었다. 이들 EV는 소포 인자로서 MLGag의 발현에 의해 생성되었다.
PBMC가 쥐 및 토끼 둘 모두로부터 획득되었고, 그리고 GFP-표지화 MP-9 내포 EV 및 MP-9가 없는 RFP-표지화 EV로 염색되었다. IgG+ B 세포의 염색은 도 34에서 도시된다. 결과는 이들 EV로 염색되는 B 세포의 2가지 모집단을 보여준다. GFP/RFP+ 모집단은 EV에서 비-MP-9 단백질을 검출하는 B 세포를 나타낸다. 상자로 표시된 GFP 단독 표지화 모집단은 MP-9를 특이적으로 검출하는 B 세포를 나타낸다. 2가지 다른 MP (MP-10 및 MP-11)를 이용하면, 토끼 IgG+ B 세포가 RFP-표지화 MP EV 및 GFP-표지화 빈 EV로 염색될 수 있는 것으로 밝혀졌다 (도 35). 각 경우에, MP를 특이적으로 검출하는 RFP단독 표지화 B 세포의 명확한 모집단이 있다.
실시예 12: 단백질 복합체의 막 단백질에 대한 단일클론 항체를 생성하기 위한 EV의 이용.
본 연구는 단백질 복합체 내에 막 단백질에 대한 단일클론 항체를 발견하고 생성하기 위해, 실시예 7에서 개발된 면역화 방법을 이용하였다. 단백질 복합체는 6가지의 상이한 막 단백질 (MP-12, MP-13, MP-14의 2개 사본, MP-15, MP-16 및 MP-17의 2개 사본)을 포함한다. MP-12 및 MP-13은 이합체화하여 수용체 (본원의 도 36a-b에서 수용체 "A"로서 지칭됨)를 형성하고, 그리고 MP-14, MP-15, MP-16 및 MP-17은 MP-12 및 MP-13에 의해 형성된 수용체의 공동수용체로서 기능하는 복합체 (본원의 도 36a-b에서 공동수용체 "B"로서 지칭됨)를 형성한다. MP-12 및 MP-13 둘 모두, 또는 MP-14, MP-15, MP-16 및 MP-17 네 개 모두 중 어느 하나를 인코딩하는 2개의 폴리시스트론성 발현 벡터가 생성되었다. 세포 표면에서 복합체의 형성을 확증하기 위해, Expi293 세포가 (i) MP-12 및 MP-13-인코딩 cDNA, (ii) MP-14, MP-15, MP-16 및 MP-17-인코딩 cDNA, 또는 (i) 및 (ii) 둘 모두로 일시적으로 형질감염되었다. MP-14, MP-15, MP-16 및 MP-17의 발현, 그리고 MP-12 및 MP-13의 발현이, 모든 단백질이 공동발현될 때 유세포분석법에 의해 검출되어, 완전한 복합체의 조립이 확증되었다 (도 36a). 완전한 단백질 복합체를 내포하는 EV가 생성되었고, 그리고 통합이 ELISA에 의해 확증되었다 (도 36b). EV는 MLGag의 발현에 의해 생성되었다.
쥐가 6가지 막 단백질 (MP-12, MP-13, MP-14, MP-15, MP-16 및 MP-17)의 복합체를 포함하는 EV로 면역화되었다. 이들 쥐로부터 유래된 단일클론 항체의 후속 특징화는 복합체 내에 단백질, 예를 들면, MP-12/MP-13, MP-14, MP-14/MP-16 또는 MP-14/MP-15 중 어느 하나에 결합되는 FACS+ 항체의 성공적인 발견을 보여주었다 (표 3). 이들 데이터는 EV가 단백질 복합체 내에 존재하는 막 단백질에 대한 항체를 생성하는 데 이용될 수 있다는 것을 증명한다.
표 3. 복합체 특이적 결합 항체의 확인
특이성 MP-14/MP-16 또는 MP-14/ MP-15 단백질에서 ELISA+ 복합체를 내생적으로 발현하는 세포에서 FACS+
MP-12/ MP-13 데이터 없음 >50
MP-14 30 18
MP-14/ MP-16 20 1
MP-14/ MP-15 15 3
* * * * * * * *
비록 본원에서 개시된 요부 및 이의 이점이 상세하게 설명되긴 했지만, 본원 발명의 사상과 범위로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변화, 치환 및 변경이 본원에서 만들어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 게다가, 본 출원의 범위는 본 명세서에서 설명된 과정, 기계, 제조, 물질 조성물, 수단, 방법 및 단계의 특정한 구체예에 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 당업자는 본원에서 개시된 요부의 발명으로부터, 실제적으로 동일한 기능을 수행하거나 또는 실제적으로 동일한 결과를 달성하는 현재 존재하거나 또는 이후에 개발될 과정, 기계, 제조, 물질 조성물, 수단, 방법, 또는 단계를 쉽게 인지할 것인데, 그 이유는 본원에서 설명된 상응하는 구체예가 본원에서 개시된 요부에 따라서 활용될 수 있기 때문이다. 따라서, 첨부된 청구항은 그들의 범위 안에 이런 과정, 기계, 제조, 물질 조성물, 수단, 방법, 또는 단계를 포함하는 것으로 의도된다.
다양한 특허, 특허 출원, 간행물, 제품 설명, 프로토콜 및 서열 수탁 번호가 본 출원의 전반에서 인용되는데, 이들의 발명은 본원에서 모든 점에서 온전히 참조로서 편입된다.

Claims (59)

  1. 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하기 위한 방법이며,
    (a) (i) 소포 인자에 노출된 세포에서 이종성 단백질을 발현시키고,
    (ii) 상기 세포를 배지에 배양하고,
    (iii) 이종성 단백질을 포함하는 복수의 세포외 소포(EV)를 상기 배지로부터 단리하는 것
    에 의해 이종성 단백질을 포함하는 복수의 EV를 생산하는 단계이며,
    상기 소포 인자는 아실.Hrs, ARRDC1, ARF6 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것인 단계,
    (b) 복수의 EV를 동물에게 투여함으로써 상기 동물을 면역화하는 단계, 및
    (c) 이종성 단백질에 결합하는 항체를 상기 동물로부터 단리하는 단계
    포함하는 방법.
  2. 청구항 제1항에 있어서, 세포는 비부착성 세포인 방법.
  3. 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하기 위한 방법이며,
    (a) (i) 이종성 단백질을 세포에서 발현시키고,
    (ii) 상기 세포를 배지에 배양하고,
    (iii) 이종성 단백질을 포함하는 복수의 세포외 소포(EV)를 상기 배지로부터 단리하는 것
    에 의해 이종성 단백질을 포함하는 복수의 EV를 생산하는 단계이며,
    상기 세포는 비부착성 세포인 단계,
    (b) 복수의 EV를 동물에게 투여함으로써 상기 동물을 면역화하는 단계, 및
    (c) 이종성 단백질에 결합하는 항체를 상기 동물로부터 단리하는 단계
    를 포함하는 방법.
  4. 청구항 제3항에 있어서, 복수의 EV를 생산하는 단계는 세포에서 소포 인자를 발현시키는 것을 더 포함하는 것인 방법.
  5. 청구항 제4항에 있어서, 소포 인자는 MLGag, 아실.Hrs, ARRDC1, ARF6 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  6. 청구항 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 단백질은 막 단백질인 방법.
  7. 청구항 제6항에 있어서, 막 단백질은 단일통과 막 단백질인 방법.
  8. 청구항 제6항에 있어서, 막 단백질은 다중통과 막 단백질인 방법.
  9. 청구항 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 막 단백질은 단백질 복합체의 구성원인 방법.
  10. 청구항 제6항에 있어서, 막 단백질은, 막경유 단백질은 아니지만 막경유 단백질과의 복합체의 일부인 단백질인 방법.
  11. 청구항 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 비부착성 세포는 293S 세포 또는 Expi293FTM 세포인 방법.
  12. 청구항 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, EV는 초원심분리에 의해 배지로부터 단리되는 것인 방법.
  13. 청구항 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 EV는 0주 차, 2주 차 및 4주 차에 동물에게 투여되는 것인 방법.
  14. 청구항 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    어쥬번트를 EV와 동시에 동물에게 투여하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  15. 청구항 제14항에 있어서, 어쥬번트는 Ribi 어쥬번트인 방법.
  16. 청구항 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    동물에서 단백질에 대한 면역 반응을 증강하기 위해 추가 접종(boost)을 동물에게 투여하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  17. 청구항 제16항에 있어서, 추가 접종은 단백질, 상기 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  18. 청구항 제17항에 있어서, 추가 접종은 단백질을 포함하는 것인 방법.
  19. 청구항 제17항에 있어서, 추가 접종은 상기 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 단일클론 항체인 방법.
  21. 청구항 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체인 방법.
  22. 청구항 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  23. 청구항 제22항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 단리된 핵산.
  24. 청구항 제23항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  25. 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 생산하는 방법이며,
    청구항 제24항의 숙주 세포를 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계
    를 포함하는 방법.
  26. 청구항 제25항에 있어서,
    항체를 숙주 세포로부터 회수하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  27. 청구항 제22항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분 및
    약학적으로 허용되는 운반체
    를 포함하는 약학적 조성물.
  28. 청구항 제27항에 있어서,
    추가 치료제
    를 더 포함하는 약학적 조성물.
  29. 약제로 사용하기 위한, 청구항 제22항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  30. 질환을 치료하는 데 이용하기 위한, 청구항 제22항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  31. 약제의 제조에서 청구항 제22항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 용도.
  32. 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법이며,
    청구항 제22항의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  33. 청구항 제32항에 있어서,
    추가 치료제를 개체에게 투여하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  34. 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법이며,
    청구항 제27항 또는 28항의 약학적 조성물을 상기 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  35. 샘플 내에서 항체를 검출하기 위한 방법이며,
    (a) 샘플을 포획 시약과 함께 인큐베이션하는 단계이며,
    상기 포획 시약은 막-결합 항원을 포함하는 복수의 EV를 포함하고,
    상기 항체는 상기 막-결합 항원에 특이적으로 결합하는 것인 단계, 및
    (b) 포획 시약에 결합하는 항체를 검출가능 항체와 접촉시켜, 결합된 항체를 검출하는 단계
    를 포함하고,
    상기 검출가능 항체는 상기 항체에 특이적으로 결합하고,
    상기 복수의 EV는
    (i) 세포 내 막-결합 항원을 발현시키고,
    (ii) 상기 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여, 막-결합 항원을 디스플레이하는 복수의 EV를 생산하며,
    (iii) 막-결합 항원을 디스플레이하는 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리하는 것
    에 의해 생성되고,
    상기 세포는 아실.Hrs, ARRDC1, ARF6 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 소포 인자에 노출되고/되거나 상기 세포는 비부착성 세포인 방법.
  36. 청구항 제35항에 있어서,
    (c) 상기 (b)에서 검출된 항체의 양을 계측하는 단계
    를 더 포함하고,
    상기 양은 표준 곡선을 이용하여 정량되는 것인 방법.
  37. 청구항 제35항 또는 제36항에 있어서, 샘플은 혈장, 혈청 또는 소변 샘플인 방법.
  38. 청구항 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 포획 시약은 고체 지지체 상에 고정되는 것인 방법.
  39. 청구항 제38항에 있어서, 고체 지지체는 마이크로역가 평판인 방법.
  40. 청구항 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능 항체는 형광 표지화되는 것인 방법.
  41. 청구항 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 막-결합 항원은 막 단백질 또는 이의 단편인 방법.
  42. 항체-생산 세포를 분류하기 위한 방법이며,
    (a) 항체-생산 세포를 복수의 EV와 함께 인큐베이션하는 단계이며,
    상기 복수의 EV는
    i. 막-결합 항원 및 첫 번째 검출가능 마커를 포함하는 EV의 첫 번째 모집단이며, 상기 항체-생산 세포의 부분집합이 막-결합 항원에 특이적으로 결합하는 것인 첫 번째 모집단, 및
    ii. 막-결합 항원이 결여되어 있지만, 첫 번째 마커와 구별 가능한 두 번째 검출가능 마커를 포함하는 EV의 두 번째 모집단
    을 포함하는 것인 단계, 및
    (b) 항체-생산 세포를 EV의 첫 번째 모집단, 또는 EV의 첫 번째 모집단 및 EV의 두 번째 모집단의 조합 중 어느 하나에 대한 그들의 결합에 근거하여 분류하는 단계
    를 포함하고,
    EV의 첫 번째 모집단은
    (i) 첫 번째 세포에서 막-결합 항원 및 첫 번째 검출가능 마커를 발현시키고,
    (ii) 첫 번째 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여, 막-결합 항원을 디스플레이하는 복수의 EV를 생산하며,
    (iii) 막-결합 항원을 디스플레이하는 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리하는 것
    에 의해 생성되고,
    EV의 두 번째 모집단은
    (i) 두 번째 세포에서 두 번째 검출가능 마커를 발현시키고,
    (ii) 두 번째 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여, 두 번째 검출가능 마커를 포함하는 복수의 EV를 생산하며,
    (iii) 두 번째 검출가능 마커를 디스플레이하는 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리하는 것
    에 의해 생성되고,
    (i) 첫 번째 세포 및/또는 두 번째 세포는 아실.Hrs, ARRDC1, ARF6 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 소포 인자에 노출되고/되거나
    (ii) 첫 번째 및/또는 두 번째 세포는 비부착성 세포인 방법.
  43. 청구항 제42항에 있어서, 첫 번째 및 두 번째 검출가능 마커는 형광 마커인 방법.
  44. 청구항 제43항에 있어서, 첫 번째 및 두 번째 형광 마커는 형광 단백질인 방법.
  45. 청구항 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 분류는 형광 활성화 세포 분류에 의해 수행되는 것인 방법.
  46. 청구항 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 항체-생산 세포는 B 세포인 방법.
  47. 청구항 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 항체-생산 세포는 하이브리도마 세포인 방법.
  48. 단백질을 디스플레이하는 복수의 세포외 소포(EV)를 생산하기 위한 방법이며,
    (a) 이종성 단백질을 세포에서 발현시키는 단계,
    (b) 상기 세포를 배지에 배양하는 단계, 및
    (c) 이종성 단백질을 포함하는 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리하는 단계
    를 포함하고,
    상기 세포는 아실.Hrs, ARRDC1, ARF6 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 소포 인자에 노출되고/되거나 상기 세포는 비부착성 세포인 방법.
  49. 청구항 제48항에 있어서, 이종성 단백질은 막 단백질인 방법.
  50. 청구항 제49항에 있어서, 막 단백질은 단일통과 막 단백질인 방법.
  51. 청구항 제49항에 있어서, 막 단백질은 다중통과 막 단백질인 방법.
  52. 청구항 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 막 단백질은 단백질 복합체의 구성원인 방법.
  53. 청구항 제35항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 비부착성 세포는 293S 세포 또는 Expi293FTM 세포인 방법.
  54. 청구항 제35항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 EV는 초원심분리에 의해 배지로부터 단리되는 것인 방법.
  55. 샘플 내에서 항체를 검출하기 위한 키트이며,
    (a) 막-결합 항원을 포함하는 복수의 EV를 포함하는 포획 시약이며, 검출되는 항체가 상기 항원에 특이적으로 결합하는 것인 포획 시약, 및
    (b) 검출되는 항체에 특이적으로 결합하는 검출가능 항체
    를 포함하고,
    상기 복수의 EV는
    (i) 세포에서 막-결합 항원를 발현시키고,
    (ii) 상기 세포를 시험관내에서 배지에 배양하여, 막-결합 항원을 디스플레이하는 복수의 EV를 생산하며,
    (iii) 막-결합 항원을 디스플레이하는 복수의 EV를 상기 배지로부터 단리하는 것
    에 의해 생성되고,
    상기 세포는 아실.Hrs, ARRDC1, ARF6 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 소포 인자에 노출되고/되거나 상기 세포는 비부착성 세포인 키트.
  56. 청구항 제55항에 있어서, 복수의 EV는 고체 지지체 위에 고정되는 것인 키트.
  57. 청구항 제55항 또는 제56항에 있어서, 고체 지지체는 마이크로역가 평판인 키트.
  58. 청구항 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능 항체는 형광 표지화되는 것인 키트.
  59. 청구항 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 막-결합 항원은 막 단백질 또는 이의 단편인 키트.
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