KR20230011435A - 단백질-단백질 상호작용 특징화 및 조작 방법 - Google Patents

단백질-단백질 상호작용 특징화 및 조작 방법 Download PDF

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Abstract

특이적으로 상호작용하는 임의의 두 단백질 사이의 계면에서의 결합 역학의 특징화는 무수한 생의학 응용 분야에서 중요한 역할을 한다. 본원에 개시된 방법은 두 단백질 결합 파트너 사이의 계면에서의 특이적인 상호작용의 고처리량 특징화, 및 두 단백질 결합 파트너 중 하나 또는 그 둘 모두의 기능상 중요한 돌연변이 확인을 제공한다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법은, 다른 생의학 응용 분야 중에서도 특히 신규한 요법, 백신, 진단법의 발견 및 개발에 유용한 항체-항원 쌍의 에피토프 및 파라토프 맵핑에 유용할 수 있다.

Description

단백질-단백질 상호작용 특징화 및 조작 방법
관련 출원
본 출원은 2020년 6월 1일 출원된 미국 특허 가출원 시리얼 번호 63/033,176을 우선권 주장하며, 상기 가출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
에피토프 맵핑은 항체의 그의 표적 항원에 대한 결합 부위의 아이덴티티, 아미노산 조성 및 입체형태 구조를 특징화하는 실험 과정이다. 에피토프 맵핑은 다른 생의학 응용 분야 중에서도 특히 신규한 요법, 백신, 진단법의 발견 및 개발에 유용할 수 있다. 에피토프 맵핑은 또한 예를 들어, 신규한 치료 항체의 지적 재산권 (IP) 보호를 확보하는 데에도 유용할 수 있다. 신규한 항체의 에피토프의 아미노산 아이덴티티 및 입체형태 구조에 대한 철저한 특징화는 항체의 신규성, 항체의 불명확성을 정의하는 데 도움이 되며, 신규한 항체 개시에 필요한 서면 설명 지원을 제공할 수 있다. 예를 들어, 여러 약물이 이미 존재하는 치료 표적과 같은 복잡한 IP 공간은 동일한 표적에 대해 신규한 항체와 이전에 개시된 항체를 구별할 수 있는 능력을 필요로 한다.
유사하게, 파라토프 맵핑은 그의 항원에 대한 특이성을 부여하는 항체의 특성, 예를 들어, 아미노산 조성, 전하 및 3차원 입체형태의 특징화이다. 에피토프 및 파라토프 맵핑에 의한 항체-항원 상호작용의 철저한 특징화는 항체와 항원 사이의 특이적 결합의 메커니즘 및 역학을 이해하는 데 유용하며, 결합 계면에 대한 구조적 통찰력을 얻는 데 사용될 수 있다. 에피토프 및 파라토프 맵핑 방법으로는 그 중에서도 특히 어레이 기반 올리고-펩티드 스캐닝, 부위 지정 돌연변이유발 맵핑, 고처리량 샷건 돌연변이유발 맵핑, 가교 결합 커플링 질량 분석법 등을 포함한다.
더욱 광범위하게는, 특이적으로 상호작용하는 임의의 두 단백질 사이의 계면에서의 결합 역학의 특징화는 무수한 생의학 응용 분야에서 중요한 역할을 한다. 본원에 개시된 방법은 두 단백질 결합 파트너 사이의 계면에서의 특이적인 상호작용의 고처리량 특징화를 제공할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 비용면에서 효과적인 신속한 검정법에서 동시에 두 단백질 결합 파트너의 상호작용 표면을 포괄적으로 특징화하기 위해 철저한 부위 포화 돌연변이유발 및 고처리량 스크리닝의 조합을 이용한다. 본원에 개시된 방법은 임의의 두 단백질 결합 파트너의 특징화, 예컨대, 항체 및 그의 항원의 동시 에피토프 및 파라토프 맵핑을 위해 이용될 수 있다.
예시적인 구현예에 대한 상기의 일반적인 설명 및 그에 대한 하기의 상세한 설명은 단지 본 개시내용의 교시의 예시적인 측면일 뿐이며, 제한적이지 않다.
일부 구현예에서, 본 발명은
단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리를 제공하는 단계로서, 단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리는 제1 야생형 폴리펩티드 및 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계;
단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리를 제공하는 단계로서, 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리는 제2 야생형 폴리펩티드 및 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계;
단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너와 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너 사이의 관찰된 친화도 값을 측정하는 단계;
단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너와 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너 사이의 관찰된 친화도 값에 기초하여, 그의 각 관찰된 친화도 값이 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값과 실질적으로 상이한 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍을 확인하는 단계를 포함하는,
두 단백질 결합 파트너 사이의 보상적 돌연변이를 확인하기 위한 신규한 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은
제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리를 제공하는 단계로서, 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 제1 야생형 폴리펩티드 및 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계;
제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리를 제공하는 단계로서, 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 제2 야생형 폴리펩티드 및 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계;
제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너와 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너 사이의 관찰된 친화도 값을 측정하는 단계; 및
제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너와 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너 사이의 각 관찰된 친화도 값에 기초하여,
(i) 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드, 및
(ii) 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드를 포함하는 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍을 확인하는 단계로서,
여기서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍의 각 쌍의 관찰된 친화도 값은 단백질 결합 파트너의 각 쌍 사이의 각 예측된 친화도 값과 실질적으로 상이하고,
여기서, 주어진 단백질 결합 파트너 쌍에 대한 예측된 친화도 값은
a) 주어진 쌍의 제1 야생형 폴리펩티드와 주어진 쌍의 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값, 및
b) 주어진 쌍의 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 주어진 쌍의 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값에 기초하여 계산되는 것인 단계를 포함하는,
두 단백질 결합 파트너 사이의 보상적 돌연변이를 확인하기 위한 신규한 방법을 제공한다.
본 명세서에 통합되고, 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부 도면은 하나 이상의 실시양태를 예시하고, 설명과 함께 이들 실시양태를 설명한다. 첨부 도면은 반드시 축척에 맞게 도시될 필요는 없다. 첨부된 그래프 및 도면에 예시된 값 치수는 단지 예시 목적인 것이며, 실제 또는 바람직한 값 또는 치수를 나타내거나, 나타내지 않을 수 있다. 해당되는 경우, 기본 특징에 대한 설명을 돕기 위해 일부 또는 모든 특징이 설명되지 않을 수 있다. 도면에서:
도 1은 AlphaSeq™ 방법의 라이브러리별 스크리닝 용량을 보여주는 일련의 차트를 도시한 것이다.
도 2a는 제1 단백질 결합 파트너는 항체일 수 있고, 제2 단백질 결합 파트너는 항원일 수 있는 복합체에서 상호작용하는 두 단백질 결합 파트너의 개략도이다. 단백질-단백질 계면에서 두 단백질 결합 파트너 상의 잔기는 넘버링되었다.
도 2b는 단백질 결합 파트너 사이의 상호작용의 AlphaSeq에 의한 라이브러리별 강도 측정을 도시한 것이다. 하나의 단백질 결합 파트너에 대해 19번 위치 및 다른 단백질 결합 파트너에서는 32번 위치에서 부위 포화 돌연변이유발을 수행하였다. 인레이는 두 위치에서 모든 단일 아미노산 돌연변이 사이의 측정된 상호작용을 보여주는 것이다.
도 3a는 오르토고날 결합을 나타내는 두 단백질 결합 파트너 사이의 상호작용을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3b는 수용체-특이적 결합을 나타내는 두 단백질 결합 파트너 사이의 상호작용을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3c는 리간드-특이적 결합을 나타내는 두 단백질 결합 파트너 사이의 상호작용을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 AlphaSeq 플랫폼을 이용한 라이브러리별 단백질-단백질 상호작용 스크린의 워크플로우를 도시한 것이다.
도 5는 AlphaSeq 플랫폼을 이용하여 측정된 항체-항원 상호작용을 나타내는 AlphaSeq 단백질 상호작용 데이터 플롯이다.
도 6은 8개의 항체 변이체에 대한 8개의 항원 변이체를 스크리닝하여 64개의 상호작용의 검출 및 정량화를 얻은 AlphaSeq 실험 결과를 도시한 것이다.
도 7은 야생형 pembro scFv (항체)에 대한 PD-1 부위 포화 돌연변이유발 라이브러리의 스크린 결과를 나타내는 히트맵이다. 주어진 PD-1 잔기와 가장 가까운 pembro 잔기 사이의 잔기 거리 또한 제시되어 있다.
도 8은 PD-1/펨브롤리주맙 계면의 결정 구조 내의 특정 잔기를 강조하여 도시한 도이다.
도 9는 야생형 PD-1 (항원)에 대한 pembro scFv 부위 포화 돌연변이유발 라이브러리의 스크린 결과를 나타내는 히트맵이다.
도 10은 PD-1/펨브롤리주맙 scFv 계면의 결정 구조를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 PD-1/펨브롤리주맙 계면의 구조를 도시한 도이다.
도 12a는 특히 돌연변이에 대해 불내성인 것으로 밝혀진 펨브롤리주맙 아미노산 잔기를 나타내는 히트맵이다.
도 12b는 PD-1/펨브롤리주맙 계면의 결정 구조를 도시하고, 특히 돌연변이에 대해 불내성인 것으로 밝혀진 아미노산 잔기를 강조한 모델이다.
도 13은 단일 검정으로부터 AlphaSeq 방법에 의해 확인된 보상적 돌연변이 쌍의 표이다.
도 14는 항체-항원 계면의 결정 구조를 그래프로 나타냄과 동시에 PD-1 및 펨브롤리주맙 돌연변이에 대한 친화도 강도 데이터를 나타낸 것이다. 일부 아미노산 위치는 계면에 있지만, 돌연변이에 대해 고도의 내성을 나타낸다.
도 15는 pembro scFv (항체)와 PD-1 (항원) 사이의 라이브러리별 스크린에서 상대 AlphaSeq 신호를 측정함으로써 보상적 돌연변이를 검출할 수 있는 AlphaSeq 플랫폼의 능력을 도시하는 다이어그램이다.
도 16은 보상적 돌연변이의 시그니처를 나타내는 3쌍의 돌연변이체 단백질 결합 파트너의 플롯을 보여주는 것이다.
도 17은 보상적 돌연변이의 시그니처를 나타내는 2쌍의 돌연변이체 단백질 결합 파트너의 플롯을 보여주는 것이다.
도 18은 pembro scFv (항체) 돌연변이체 및 PD-1 (항원) 돌연변이체의 라이브러리 사이의 라이브러리별 스크린에서 상대 AlphaSeq 신호를 측정함으로써 검출된 보상적 돌연변이 쌍을 강조하는 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 19는 표적화된 돌연변이유발에 의한 에피토프 맵핑 방법을 도시한 것이다.
도 20은 본원에 개시된 방법을 사용한 에피토프 맵핑을 위한 라이브러리별 스크린을 도시한 것이다.
도 21은 항체 라이브러리에 대한 PD-1 변이체의 스크린 결과를 나타내는 히트맵이다.
도 22는 라이브러리별 스크린 결과를 보여주는 강화/고갈 히트맵이다.
도 23은 보상적 돌연변이가 제1 단백질 결합 파트너와 제2 단백질 결합 파트너 사이에 확인되는 단백질 결합 파트너를 도시한 개략도이다.
도 24a는 본원에 개시된 방법을 사용한 에피토프 맵핑을 위한 라이브러리별 스크린을 도시한 것이다.
도 24b는 PD-1 돌연변이체의 라이브러리와 펨브롤리주맙 돌연변이체의 라이브러리 사이의 쌍별 상호작용 데이터를 나타내는 히트맵이며, 여기서, 줌된 인레이는 단일 아미노산 잔기에 돌연변이를 보유하는 20개의 PD-1 변이체 및 단일 아미노산 잔기에 돌연변이를 보유하는 20개의 펨브롤리주맙 변이체에 대한 강도 데이터, 또는 본원에 개시된 방법에 의해 측정된 400개의 총 단백질-단백질 상호작용을 보여주는 것이다.
도 24c는 단일 PD-1 돌연변이체와 단일 펨브롤리주맙 변이체 사이의 특정 쌍별 상호작용을 강조한 것이다.
도 24d는 야생형 및 돌연변이체 PD-1 및 펨브롤리주맙의 조합 사이의 4개의 쌍별 상호작용을 그래프로 나타낸 것이다.
도 25는 본원에 개시된 방법을 사용하여 평가된, 두 단백질 결합 파트너 사이의 예측 및 관찰된 상호작용 강도의 제1 플롯 및 항체-항원 단백질 결합 파트너 사이의 예측된 상호작용 강도 대 관찰된 상호작용 강도의 제2 플롯을 도시한 것이다.
도 26은 단백질 결합 파트너 사이의 아미노산 잔기 간의 거리에 대한 예측된 상호작용 강도 대비 관찰된 상호작용 강도의 비를 나타낸 플롯이다.
도 27은 PD-1 (항원)과 펨브롤리주맙 (항체) 사이의 계면의 x선 결정 구조에 기초한 3차원 모델이다.
첨부된 도면과 관련하여 하기 기재되는 설명은 개시된 주제의 다양한 예시적인 실시양태를 설명하기 위한 것으로 의도된다. 특정 특징 및 기능은 각각의 예시적인 실시양태와 관련하여 설명되지만; 개시된 실시양태는 각각의 특정 특징 및 기능 없이도 실시될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
명세서 전체에 걸쳐 "하나의 실시양태" 또는 "한 실시양태" 또는 "하나의 구현예" 또는 "한 구현예"에 대한 언급은 실시양태 또는 구현예와 관련하여 기술된 특정 특징, 구조 또는 특성이 개시된 주제의 적어도 하나의 실시양태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 명세서 전체에 걸쳐 다양한 곳에서 "한 실시양태에서" 또는 "한 실시양태에서"라는 어구의 출현은 반드시 동일한 실시양태를 지칭하는 것은 아니다. 추가로, 특정 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시양태에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다. 추가로, 개시된 주제의 실시양태는 그 수정 및 변형을 포함하도록 의도된다.
명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바, "하나"라는 단수 형태는 문맥상 달리 분명하게 명시되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의하여야 한다. 즉, 달리 분명하게 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바, "하나"라는 단어 등은 "하나 이상"의 의미를 가진다. 추가로, 본원에서 사용될 수 있는 "좌측," "우측," "상단," "하단," "전면," "후면," "측면," "높이," "길이," "너비," 본원에서 사용될 수 있는 "상부," "하부," "내장," "외장," "내부," "외부" 등은 단지 참조점을 설명하는 것이며, 본 개시내용의 실시양태를 임의의 특정 배향 또는 구조로 반드시 제한하는 것은 아님을 이해하여야 한다. 추가로, 예컨대, "제1," "제2," "제3" 등과 같은 용어는 단지 본원에 개시된 바와 같은 다수의 부분, 구성요소, 단계, 작동, 기능 및/또는 참조점 중 하나를 식별할 뿐이며, 마찬가지로 본 개시내용의 실시양태를 임의의 특정 구조 또는 배향으로 반드시 제한하는 것은 아니다.
추가로, "대략," "약," "근접한," "작은 변동"이라는 용어 및 유사한 용어는 일반적으로 20%, 10% 또는 바람직하게는 5% 범위 내에서, 및 특정 실시양태에서, 그 사이의 임의의 값 범위 내에서 확인되는 값을 포함하는 범위를 지칭한다.
한 실시양태와 관련하여 기술된 모든 기능은 분명하게 언급된 경우 또는 특징 또는 기능이 추가 실시양태와 양립하지 않는 경우를 제외하면, 하기 기술되는 추가의 실시양태에 적용가능한 것으로 의도된다. 예를 들어, 주어진 특징 또는 기능이 하나의 실시양태와 관련하여 분명하게 기술되었지만, 대안적 실시양태와 관련해서는 분명하게 언급되지 않은 경우, 본 발명자들은 그 특징 또는 기능이 대안적 실시양태와 양립한다면, 대안적 실시양태와 관련하여 전개, 활용 또는 구현될 수 있음을 이해해야 한다.
본원에 설명된 기술의 실행은 달리 명시되지 않는 한, 관련 기술분야의 통상의 기술자의 기술 범위 내에 있는, 유기 화학, 중합체 기술, 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 세포 생물학, 세포 배양, 생화학, 단백질 조작, 및 시퀀싱 기술에 대한 통상적인 기술 및 설명을 사용할 수 있다. 상기 통상적인 기술로는 박테리아, 진균 및 포유동물 세포 배양 기술 및 스크리닝 분석을 포함한다. 적합한 기술의 구체적인 예시는 본원 실시예를 참조할 수 있다. 그러나, 다른 등가의 통상적인 방법도 물론 사용될 수 있다. 이러한 통상적인 기술 및 설명은 예컨대, 문헌 [Green, et al., Eds. (1999), Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV)]; [Weiner, Gabriel, Stephens, Eds. (2007), Genetic Variation: A Laboratory Manual]; [Dieffenbach, Dveksler, Eds. (2003), PCR Primer: A Laboratory Manual]; [Bowtell and Sambrook (2003), DNA Microarrays : A Molecular Cloning Manual]; [Mount (2004), Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis]; [Sambrook and Russell (2006), Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual]; 및 [Sambrook and Russell (2002), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press)]; [Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, New York N.Y.]; [Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London]; [Nelson and Cox (2000), Lehninger , Principles of Biochemistry 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.]; [Berg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N.Y.] (상기 문헌들은 모두 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다)와 같은 표준 실험실 매뉴얼에서 살펴볼 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌은 기술된 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 장치, 방법, 및 세포 집단을 기술하고, 개시하기 위한 목적으로 참조로 포함된다.
본원에서 사용되는 바, "상보적인 뉴클레오티드"라는 용어는 뉴클레오티드 간의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성을 지칭하며, 구체적으로, 뉴클레오티드가 서로 수소 결합된 것으로, 여기서, 티민 또는 우라실 잔기는 2개의 수소 결합에 의해 아데닌 잔기에 연결되고, 시토신 및 구아닌 잔기는 3개의 수소 결합에 의해 연결된다. 일반적으로, 핵산은 특정된 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 "상보성(%)" "상동성(%)"을 갖는 것으로 기술된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 특정된 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 80%, 90% 또는 100% 상보성을 가질 수 있으며, 이는 서열의 10개 중 8개, 10개 중 9개 또는 10개 중 10개의 뉴클레오티드가 특정된 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이라는 것을 나타낸다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 3'-TCGA-5'는 뉴클레오티드 서열 5'-AGCT-3'에 대해 100% 상보적이며; 뉴클레오티드 서열 3'-TCGA-5'는 뉴클레오티드 서열 5'-TTAGCTGG-3'의 영역에 100% 상보적이다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2개의 펩티드 사이, 또는 보다 흔히는 본 개시내용의 맥락에서는 두 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 용어 "상동성 영역" 또는 "상동성 아암"은 표적 게놈 DNA 서열과 특정 정도의 상동성을 갖는 공여자 DNA 상의 영역을 지칭한다. 상동성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교되는 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유될 때, 이때 분자는 그 위치에서 상동성이다. 서열 간의 상동성 정도는 서열이 공유되는 매칭되거나, 또는 상동성인 위치의 개수의 함수이다.
"작동가능하게 연결된"은 요소, 예를 들어, 바코드 서열, 유전자 발현 카세트, 코딩 서열, 프로모터, 인핸서, 전사 인자 결합 부위의 배열로서, 여기서, 상기 기술된 구성요소는 그들의 통상적인 기능을 수행하도록 구성된 것을 지칭한다. 따라서, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제어 서열은 코딩 서열의 전사, 및 일부 경우에는 번역에 영향을 미칠 수 있다. 제어 서열은 코딩 서열의 발현을 지시하는 기능을 하는 한, 코딩 서열과 인접해 있을 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 번역되지 않지만 전사되는 개입 서열은 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 그대로 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다. 실제로, 상기 서열은 동일한 인접 DNA 분자 (즉, 염색체)에 상주할 필요가 없으며, 변경된 조절을 발생시키는 상호작용을 여전히 그대로 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "선별가능한 마커"는 인공 선택에 적합한 형질을 부여하는 세포 내로 도입된 유전자를 지칭한다. 일반적인 용도의 선별가능한 마커는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예컨대, 암피실린/카르베니실린, 카나마이신, 클로람페니콜, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 겐타마이신, 블레오마이신, 스트렙토마이신, 퓨로마이신, 히그로마이신, 블라스티시딘 및 G418과 같은 약물 선별가능한 마커가 사용될 수 있다. 선별가능한 마커는 또한 영양요구성 선별가능한 마커일 수도 있으며, 여기서, 선별되는 세포 균주는 필수 영양소를 합성할 수 없도록 하는 돌연변이를 보유한다. 그러한 균주는 결핍된 필수 영양소가 성장 배지에 공급되는 경우에만 성장할 것이다. 예를 들어, 효모 돌연변이체 균주의 필수 아미노산 영양요구성 선별은 일반적이고, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 바, "선별 배지"는 선별가능한 마커에 대해 선별하거나, 이에 대해 선별하는 화학적 화합물 또는 생물학적 모이어티가 첨가된 세포 성장 배지 또는 필수 영양소가 결핍되고, 영양요구성 균주에 대해 선별되는 배지를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "벡터"는 세포로 전달하고/거나, 세포에서 발현시키고자 하는 원하는 서열 또는 서열들을 포함하는 다양한 핵산 중 임의의 것이다. 벡터는 전형적으로 DNA로 구성되지만, RNA 벡터도 이용가능하다. 벡터는 그 중에서도 특히 플라스미드, 포스미드, 파지미드, 바이러스 게놈, BAC, YAC, PAC, 합성 염색체 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "친화도"는 단일 생체분자와 그의 리간드 또는 결합 파트너 사이의 결합 상호작용의 강도이다. 친화도는 일반적으로 평형 해리 상수, K D 를 사용하여 측정되고 설명된다. K D 값이 낮을수록 단백질과 그의 결합 파트너 사이의 친화도가 크다. 친화도는 수소 결합, 정전기 상호작용, 결합 파트너 간의 소수성 및 반 데르 발스 힘, 또는 다른 분자, 예컨대, 결합 효능제 또는 길항제의 존재에 의해 영향을 받을 수 있다.
일부 구현예에서, 친화도는 임의의 단위를 사용하여 기술될 수 있으며, 여기서, 검정 내 특정 결합 친화도, 예를 들어, 두 야생형 단백질 결합 파트너 사이, 또는 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종 사이의 결합 친화도는 임의 단위 1.0으로 설정되고, 다른 단백질 결합 파트너 쌍에 대한 결합 친화도, 예를 들어, 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종 및 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종에 대한 결합 친화도는 상기 특정 결합 친화도에 비례하여 상대적으로 측정된다.
본원에서 사용되는 바, "부위 포화 돌연변이유발" (SSM)은 단백질 공학 및 분자 생물학에서 사용되는 무작위 돌연변이유발 기술을 지칭하며, 여기서, 코돈 또는 코돈 세트는 폴리펩티드의 위치에 있는 모든 가능한 아미노산으로 치환된다. 대안적으로, SSM은 주어진 위치에 있는 아미노산 잔기를 상기 위치에서 가능한 아미노산 치환의 서브세트 중 하나로 변이시키는 것, 예를 들어, 시스테인을 제외한 모든 가능한 아미노산으로 치환시키는 것으로 기술할 수 있다. SSM은 하나의 코돈, 여러 코돈 또는 단백질의 모든 위치에 대해 수행될 수 있다. 그 결과는 폴리펩티드의 하나, 여러 또는 모든 아미노산 위치에서 가능한 아미노산의 전체 상보체를 나타내는 돌연변이체 단백질 라이브러리이다.
본원에서 사용되는 바, "사용자 지정 돌연변이유발"은 사용자가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 임의의 기술에 의해 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변형시키는 임의의 과정을 지칭한다. 폴리펩티드는 정의된 방식으로 하나 이상의 아미노산 잔기에서 변형될 수 있고, 예컨대, 알라닌 잔기는 아르기닌 잔기로 변이될 수 있거나, 또는 폴리펩티드 서열은 무작위 방식으로, 즉, 축퇴 프라이머 및 무작위 PCR 증폭을 사용하여 변이될 수 있다. 폴리펩티드는 하나의 아미노산 잔기 또는 다수의 아미노산 잔기에서 사용자 지정 돌연변이유발에 의해 변형될 수 있다. 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입 및/또는 결실을 포함하도록 사용자 지정 돌연변이유발에 의해 변형될 수 있거나, 또는 폴리펩티드 서열은 사용자 지정 돌연변이유발에 의해 말단절단될 수 있다. 폴리펩티드는 천연 또는 비천연 아미노산으로의 삽입 또는 치환을 포함하도록 사용자 지정 돌연변이유발에 의해 변형될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "파라토프"는 항체의 상응하는 항원을 특이적으로 인식하고, 그에 결합하는 항체의 일부이다. 파라토프는 또한 항원 결합 부위로도 공지되어 있다. 파라토프는 항체 폴리펩티드의 대략 15개나 되는 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 그 중 대략 5개의 아미노산 잔기는 전형적으로 파라토프에 결합 에너지의 대부분을 제공한다. 파라토프를 구성하는 아미노산은 항체 단백질 구조의 폴리펩티드 쇄 내의 아미노산 잔기의 연속 서열일 수 있거나, 또는 항체 단백질 구조의 3차원 구조에 입체형태 특이성을 부여하는 불연속 아미노산 잔기일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "파라토프 맵핑"은 항체 단백질 구조 내에서 파라토프의 조성을 실험적으로 확인하고, 특징화하는 과정이다. 파라토프 맵핑은 파라토프의 3차원 구조인 파라토프의 아미노산 서열을 정의할 수 있고, 항체와 그의 항원의 상호작용을 정의하는 작용 메커니즘에 대한 정보를 제공할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "에피토프"는 항체에 의해 특이적으로 인식되고, 결합되는 항원의 일부이다. 에피토프는 항원 폴리펩티드의 대략 15개나 되는 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 그 중 대략 5개의 아미노산 잔기는 전형적으로 에피토프에 결합 에너지의 대부분을 제공한다. 에피토프를 구성하는 아미노산은 항원 단백질의 폴리펩티드 쇄 내의 아미노산 잔기의 연속 서열일 수 있거나, 또는 폴딩된 항원 단백질 구조의 3차원 구조에 입체형태 특이성을 부여하는 불연속 아미노산 잔기일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "에피토프 맵핑"은 항원 단백질 내에서 에피토프의 조성을 실험적으로 확인하고, 특징화하는 과정이다. 에피토프 맵핑은 에피토프의 3차원 구조인 에피토프의 아미노산 서열을 정의할 수 있고, 항원과 그의 항체의 상호작용을 정의하는 작용 메커니즘에 대한 정보를 제공할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "수용체"는 그의 고유의 생리학적 맥락에서 생물학적 시스템과 관련된 신호를 수신하고, 전달하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 화학 구조이다. 수용체는 다양한 부류의 단백질이며, 막관통 수용체, 세포내 수용체, 세포질 수용체, 핵 수용체 등을 포함할 수 있다. 막관통 수용체는 원형질막에 위치하고, 이에 의해 수용체의 일부가 세포 외부로부터 신호를 수신하기 위해 세포외에 위치한다. 수용체는 리간드 개폐 이온 채널, G-단백질 커플링 수용체, 키나제 연결 수용체에 의해, 또는 핵 외피를 가로지르는 수용체의 이동에 의해 전달되는 신호를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 메커니즘을 통해 신호를 수신하고, 전달한다. 수용체는 일반적으로 특정 리간드에 결합하고, 리간드는 그의 상응하는 수용체의 효능제, 부분 효능제, 길항제, 역 효능제 또는 알로스테릭 조정제일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "리간드"는 수용체에 결합하여 신호를 생성하는 분자이다. 리간드 분자는 폴리펩티드, 무기 분자 또는 유기 분자일 수 있다. 일부 경우에서, 수용체 단백질에의 리간드 결합이 단백질의 입체형태를 변경하여 신호를 생성하고, 세포를 가로질러 또는 세포 내에서 전달한다. 리간드는 다른 분자 중에서 특히 기질, 억제제, 활성제, 신호전달 지질, 신경전달물질을 포함할 수 있다. 다수의 경우에서, 그의 상응하는 수용체에의 리간드 결합은 높은 결합 친화도로 특이적이다.
본원에서 사용되는 바, "야생형 단백질 결합 파트너"는 생리학적 맥락에서 서로 특이적으로 상호작용하는 두 폴리펩티드 중 하나이다. 본원에서 사용되는 바, "야생형 단백질 결합 상호작용"은 두 야생형 단백질 결합 파트너 사이의 상호작용이다. 야생형 단백질 결합 파트너는 전장 인간 단백질; 임의의 다른 동물 종의 전장 단백질; 임의의 동물 종의 말단절단된 단백질; 임의의 동물 종의 단백질 부분; 식물 단백질, 진균 단백질, 바이러스 단백질, 바이러스 단백질, 신생 단백질 또는 임의의 공급원의 단백질의 말단절단된 종을 포함할 수 있다. 야생형 단백질 결합 파트너는 합성 펩티드, 글리코실화된 폴리펩티드, 또는 다른 합성 또는 자연적으로 발생된 번역 후 변형을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 야생형 단백질 결합 파트너는 조작된 폴리펩티드, 예를 들어, 치료 효과를 생성하도록 조작된 항체의 일부일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 야생형 단백질 결합 파트너는 코딩 뉴클레오티드 서열에서 SNP 또는 indel로 인한 자연적으로 발생된 변이체를 비롯한, 동물 폴리펩티드 서열의 자연적으로 발생된 변이를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "돌연변이체 단백질 결합 파트너"는 비변형된이 생물학적 맥락에서 서로 특이적으로 상호작용하는 두 변형된 폴리펩티드 중 하나이다. 야생형 단백질 결합 상호작용에서 하나 또는 두 단백질 결합 파트너 모두 돌연변이체 단백질 결합 파트너를 생성하도록 변형될 수 있다. 돌연변이체 단백질 결합 파트너는 그의 상응하는 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 상호작용하거나, 또는 상호작용하지 않을 수 있다. 돌연변이체 단백질 결합 파트너는 야생형 단백질 결합 상호작용의 두 단백질 결합 파트너 모두가 변형되어 제1 돌연변이체 단백질 결합 파트너 및 제2 돌연변이체 단백질 결합 파트너를 생성하는 경우 상호작용하거나 상호작용하지 않을 수 있다. 야생형 단백질 결합 파트너는 돌연변이체 단백질 결합 파트너를 생성하기 위해 사용자 지정 돌연변이유발 또는 부위 포화 돌연변이유발에 의해 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 제1 단백질 결합 파트너 및 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리를 포함한다. 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 단백질의 복수의 사용자 지정 또는 무작위로 부가된 돌연변이체 및 야생형 단백질을 포함한다. 단백질의 복수의 사용자 지정 또는 무작위로 부가된 돌연변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 갖는 단백질의 변이체를 포함할 수 있다. 아미노산 치환은 단백질에 전하 변화 또는 단백질에 입체형태 구조 변화를 도입하도록 선택될 수 있고, 야생형 아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 부위 포화 돌연변이유발(SSM)에 의해 생성될 수 있고, 이에 의해 단백질 결합 파트너의 SSM 라이브러리가 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 알라닌 스캐닝에 의해 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 오류 유발 PCR과 같은 무작위 돌연변이 유발, 또는 발현된 단백질의 아미노산 서열에 변이를 도입하는 또 다른 방법에 의해 생성될 수 있다. 제1 단백질 결합 파트너 및 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 결합 친화도에 대해 검정되고, 이에 의해 친화도는 병렬화된 고처리량 방식으로 제1 단백질 결합 파트너와 복수의 사용자 지정 돌연변이체 각각 그 사이의 상호작용에 대해 개별적으로 측정된다. 야생형 표적 단백질 및 제1 단백질 결합 파트너의 결합 친화도보다 높거나, 또는 낮은 제1 단백질 결합 파트너와의 결합 친화도를 갖는 것으로 밝혀진 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 구성원을 확인하고, 추가 연구를 위해 선택한다.
제1 단백질 결합 파트너 및 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리가 결합 친화도에 대해 검정되는 일부 구현예에서, 검정법은 파지 디스플레이, 효모 표면 디스플레이 또는 또 다른 병렬화된 고처리량 방법일 수 있다.
다른 구현에서, 본 방법은 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리 및 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리를 포함한다. 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 단백질의 복수의 사용자 지정 또는 무작위로 부가된 돌연변이체 및 야생형 단백질을 포함한다. 단백질의 복수의 사용자 지정 또는 무작위로 부가된 돌연변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 갖는 표적화 단백질의 변이체를 포함할 수 있다. 아미노산 치환은 단백질에 전하 변화 또는 단백질에 입체형태 구조 변화를 도입하도록 선택될 수 있고, 야생형 아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 부위 포화 돌연변이유발(SSM)에 의해 생성될 수 있고, 이에 의해 단백질 결합 파트너의 SSM 라이브러리가 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 알라닌 스캐닝에 의해 생성될 수 있다. 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 단백질의 복수의 사용자 지정 또는 무작위로 부가된 돌연변이체 및 야생형 단백질을 포함한다. 단백질의 복수의 사용자 지정 또는 무작위로 부가된 돌연변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 갖는 표적 단백질의 변이체를 포함할 수 있다. 아미노산 치환은 단백질에 전하 변화 또는 단백질에 입체형태 구조 변화를 도입하도록 선택될 수 있고, 야생형 아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 부위 포화 돌연변이유발(SSM)에 의해 생성될 수 있고, 이에 의해 단백질 결합 파트너의 SSM 라이브러리가 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 알라닌 스캐닝에 의해 생성될 수 있다. 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리 및 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 결합 친화도에 대해 검정되고, 이에 의해 친화도는 복수의 돌연변이체 제1 단백질 결합 파트너 각각 및 복수의 돌연변이체 제2 단백질 결합 파트너 각각, 그들 사이의 상호작용에 대하여 쌍별로 개별적으로 병렬화된 고처리량 방식으로 측정된다. 야생형 제1 단백질 결합 파트너 및 야생형 제2 단백질 결합 파트너의 결합 친화도보다 높거나, 또는 낮은 결합 친화도를 갖는 것으로 밝혀진, 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리로부터 선택된 구성원 및 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리로부터 선택된 구성원을 포함하는 쌍을 확인하고, 추가 연구를 위해 선택한다.
제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리가 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리에 대한 결합 친화도에 대하여 검정되는 일부 구현예에서, 검정법은 효모 2-하이브리드 시스템, AlphaSeq 시스템, 또는 또 다른 병렬화된 고처리량 라이브러리별 스크리닝 방법일 수 있다. 야생형 단백질 결합 파트너 사이의 결합 친화도 대비 돌연변이체 단백질 결합 파트너 사이의 상호작용에 대한 결합 친화도는 효모 2-하이브리드 스크리닝, 생물층 간섭측정법, ELISA, 정량적 ELISA, 표면 플라즈몬 공명, FACS 기반 농축 방법, 합성 효모 응집, AlphaSeq 플랫폼 또는 임의의 다른 단백질 상호작용 강도 측정을 비롯한, 단백질 결합 친화도를 정량화하는 다수의 방법에 의해 측정될 수 있다. AlphaSeq 방법은 미국 특허 출원 시리얼 번호 15/407,215 (US 2017-0205421 A1) (이는 그 전문이 본원에서 모든 목적을 위해 포함된다)에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 단백질 결합 파트너의 쌍은 관련 기술분야에 널리 공지된, 단백질-단백질 복합체를 특징화하는 다른 방법들 중에서도 특히, 예컨대, 결정학법, 저온 전자 현미경법, 미세 전자 회절, 질량 분석법, 컴퓨터 모델링에 의해 추가로 특징화된다. 단백질 결합 파트너 또는 돌연변이체 단백질 결합 파트너의 쌍은 개별적으로 또는 두 파트너 사이의 단백질-단백질 복합체의 맥락에서 추가로 특징화될 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 결합 파트너 및 제2 단백질 결합 파트너는 전장 단백질이다. 다른 구현예에서, 제1 결합 파트너 및 제2 단백질 결합 파트너는 말단절단된 단백질이다. 다른 구현예에서, 제1 결합 파트너 및 제2 단백질 결합 파트너는 융합 단백질이다. 다른 구현예에서, 제1 결합 파트너 및 제2 단백질 결합 파트너는 태그부착된 단백질이다. 태그부착된 단백질은 관련 기술분야에 공지된 다른 것들 중에서도 특히 에피토프 태그부착된 단백질, 예컨대, FLAG-태그부착된, HA-태그부착된, His-태그부착된, Myc-태그부착된 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 파트너는 전장 단백질 및 제2 단백질 결합 파트너는 말단절단된 단백질이다. 제1 단백질 결합 파트너 및 제2 단백질 결합 파트너는 각각 하기 중 임의의 것일 수 있다: 전장 단백질, 말단절단된 단백질, 융합 단백질, 태그부착된 단백질, 또는 그의 조합.
일부 구현예에서, 제1 결합 파트너는 항체 또는 항체 폴리펩티드의 말단절단된 부분이다. 다른 구현예에서, 제1 결합 파트너의 라이브러리는 항체, 말단절단된 항체 폴리펩티드의 라이브러리, 또는 부위 포화 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 방법에 의해 생성된 항체 돌연변이체의 라이브러리이다. 면역글로불린으로도 공지된 항체는 고유한 분자 또는 분자들을 특이적으로 인식하고 결합하는 비교적 큰 다중 단위 단백질 구조이다. 대부분의 항체의 경우, 대략 50 kDA의 두 중쇄 폴리펩티드와 대략 25 kDA의 두 경쇄 폴리펩티드가 이황화 결합에 의해 연결되어 더 큰 Y자형 다중 단위 구조를 형성한다. Y자형 구조의 끝에 있는 아미노산 서열 가변성을 나타내는 가변 및 초가변 영역은 주어진 항체가 그의 표적을 인식하는 특이성을 부여한다.
일부 구현예에서, 제1 결합 파트너는 짧은 링커 펩티드에 의해 연결된 면역글로불린의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 가변 영역의 융합 단백질인 단일 쇄 가변 단편 (scFv)이다. 일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 scFv의 라이브러리, 또는 부위 포화 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 방법에 의해 생성된 scFv 돌연변이체의 라이브러리이다.
일부 구현예에서, 제1 결합 파트너는 항원에 결합하는 항체의 영역인 항원-결합 단편 (Fab)이다. Fab는 중쇄 및 경쇄 각각의 하나의 불변 도메인 및 하나의 가변 도메인을 포함할 수 있고, 항체의 파라토프 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 Fab의 라이브러리, 또는 부위 포화 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 방법에 의해 생성된 Fab 돌연변이체의 라이브러리이다.
일부 구현예에서, 제1 결합 파트너는 단일 도메인 항체, 또는 중쇄 단독 항체의 항원-결합 단편인 VHH의 일부일 수 있다. VHH는 중쇄 항체의 하나의 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 VHH의 라이브러리, 또는 부위 포화 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 방법에 의해 생성된 VHH 돌연변이체의 라이브러리이다.
일부 구현예에서, 제2 결합 파트너는 항원이다. 다른 구현예에서, 제2 결합 파트너의 라이브러리는 항원의 라이브러리, 또는 다른 방법들 중에서도 부위 포화 돌연변이유발에 의해 생성된 항원의 라이브러리이다. 항원은 항체에 의해 표적화되는 분자 또는 분자 구조이다. 항원은 전형적으로 특정의 상응하는 항체에 의해 표적화되는 단백질, 폴리펩티드 또는 다당류이다. 항원은 항원의 상응하는 항체에 의해 인식되고, 그에 대한 특이성을 부여하는 항원 부분인 에피토프를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 파트너가 항체, scFv, Fab, 또는 FHH이고, 제2 단백질 결합 파트너가 항원인 단백질 결합 파트너 쌍의 경우, 야생형 항체 scFv, Fab, 또는 FHH는 항원 돌연변이체가 항체와 항원 사이의 친화도에 미치는 효과를 결정하기 위해 돌연변이체 항원의 라이브러리에 대하여 스크리닝될 수 있다. 다른 구현예에서, 야생형 항체, scFv, Fab, 또는 FHH는 에피토프 맵핑을 위해, 즉, 에피토프의 아미노산 서열, 에피토프의 3차원 구조를 정의하기 위해 돌연변이체 항원의 라이브러리에 대해 스크리닝될 수 있고, 에피토프와 항체 사이의 상호작용을 정의하는 작용 메커니즘에 대한 정보를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 파트너가 항체, scFv, Fab, 또는 FHH이고, 제2 단백질 결합 파트너가 항원인 단백질 결합 파트너 쌍의 경우, 돌연변이체 항체, scFv, Fab, 또는 FHH의 라이브러리는 항체, scFv, Fab, 또는 FHH 돌연변이체가 항체, scFv, Fab, 또는 FHH와 항원 사이의 친화도에 미치는 효과를 결정하기 위해 야생형 항원에 대하여 스크리닝될 수 있다. 다른 구현예에서, 돌연변이체 항체, scFv, Fab, 또는 FHH의 라이브러리는 파라토프 맵핑을 위해, 즉, 파라토프의 아미노산 서열, 파라토프의 3차원 구조를 정의하기 위해 야생형 항원에 대해 스크리닝될 수 있고, 파라토프와 항원 사이의 상호작용을 정의하는 작용 메커니즘에 대한 정보를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 파트너가 항체, scFv, Fab, 또는 FHH이고, 제2 단백질 결합 파트너가 항원인 단백질 결합 파트너 쌍의 경우, 돌연변이체 항체, scFv, Fab, 또는 FHH의 라이브러리는 항체, scFv, Fab, 또는 FHH 돌연변이체 및 항원 돌연변이체가 항체, scFv, Fab, 또는 FHH와 항원 사이의 친화도에 미치는 효과를 동시에 질의하여 정보를 얻기 위해 돌연변이체 항원의 라이브러리에 대하여 스크리닝될 수 있다. 다른 구현예에서, 돌연변이체 항체, scFv, Fab, 또는 FHH의 라이브러리는 에피토프 및 파라토프 맵핑을 위해, 즉, 에피토프 및 파라토프의 아미노산 서열, 에피토프 및 파라토프의 3차원 구조를 정의하기 위해 돌연변이체 항원의 라이브러리에 대해 스크리닝될 수 있고, 항체와 항원 사이의 상호작용을 정의하는 작용 메커니즘에 대한 정보를 제공할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "~과 실질적으로 상이한"이란, 두 정량적 결합 친화도 값이 서로 크기가 약 5%, 10%, 20%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300% 내지 약 500% 이상 상이하다는 것을 지칭한다. 정량적 결합 친화도 값은 K D 단위로 측정될 수 있거나, 또는 특정 단백질 결합 파트너 쌍의 결합 친화도를 임의 단위 1.0으로 정규화하고, 임의 단위 1.0으로 정규화된 특정 단백질 결합 파트너 쌍 대비의 임의 단위로 복수의 다른 단백질 결합 파트너의 결합 친화도를 측정함으로써 정량화될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "~과 실질적으로 동일한"이란, 두 정량적 결합 친화도 값은 그 값이 약 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 내지 약 0.1% 범위 내에 있다는 것을 지칭한다. 정량적 결합 친화도 값은 K D 단위로 측정될 수 있거나, 또는 특정 단백질 결합 파트너 쌍의 결합 친화도를 임의 단위 1.0으로 정규화하고, 임의 단위 1.0으로 정규화된 특정 단백질 결합 파트너 쌍 대비의 임의 단위로 복수의 다른 단백질 결합 파트너의 결합 친화도를 측정함으로써 정량화될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "~보다 실질적으로 더 높은"이란, 하나의 정량적 결합 친화도 값이 또 다른 정량적 결합 친화도 값보다 약 5%, 10%, 20%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300% 내지 약 500% 이상으로 더 높다는 것을 지칭한다. 정량적 결합 친화도 값은 K D 단위로 측정될 수 있거나, 또는 특정 단백질 결합 파트너 쌍의 결합 친화도를 임의 단위 1.0으로 정규화하고, 임의 단위 1.0으로 정규화된 특정 단백질 결합 파트너 쌍 대비의 임의 단위로 복수의 다른 단백질 결합 파트너의 결합 친화도를 측정함으로써 정량화될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "~보다 실질적으로 더 낮은"이란, 하나의 정량적 결합 친화도 값이 또 다른 정량적 결합 친화도 값의 약 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 내지 약 5% 이하라는 것을 지칭한다. 정량적 결합 친화도 값은 K D 단위로 측정될 수 있거나, 또는 특정 단백질 결합 파트너 쌍의 결합 친화도를 임의 단위 1.0으로 정규화하고, 임의 단위 1.0으로 정규화된 특정 단백질 결합 파트너 쌍 대비의 임의 단위로 복수의 다른 단백질 결합 파트너의 결합 친화도를 측정함으로써 정량화될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 단백질 결합 파트너의 보상적 돌연변이를 확인할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 본원에 개시된 방법을 사용하여 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리에 대해 스크리닝될 수 있고, 이에 의해 친화도는 복수의 제1 단백질 결합 파트너 각각 및 제2 단백질 결합 파트너 각각, 그들 사이의 상호작용에 대하여 병렬화된 고처리량 방식으로 측정된다. 단백질 결합 파트너의 두 개별 종 사이의 주어진 상호작용에 대해 하기와 같은 친화도 관계가 동시에 검출되는 경우가 발생할 수 있다: (a) 본원에 개시된 방법에 의해 검출된 바, 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종 및 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종이 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종 사이의 것보다 더 낮은 결합 친화도를 갖는 경우; (b) 본원에 개시된 방법에 의해 검출된 바, 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종 및 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종이 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종 사이의 것보다 더 낮은 결합 친화도를 갖는 경우; 및 (c) 본원에 개시된 방법에 의해 검출된 바, (a)에 기술된 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종, 및 (b)에 기술된 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종이 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종 사이의 것보다 더 강력하거나, 그와 등가이거나, 또는 대략적으로 등가인 결합 친화도를 갖는 경우. 상기 기술된 관계를 보이는 단백질 결합 파트너 쌍의 두 돌연변이는, 도 15에 도시된 바와 같이, 두 돌연변이가 동시에 발생할 때, 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이가 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이의 친화도 감소 영향을 보상하여 두 단백질 결합 파트너 사이의 야생형 친화도 수준을 회복시키는 것인, 보상적 돌연변이로서 지칭될 수 있다. 이 시나리오는 두 돌연변이체 잔기 사이의 근접성을 시사할 것이며, 구조 결정 및/또는 단백질 조작에 유용할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 단백질 결합 파트너의 두 개별 종 사이의 주어진 상호작용에 대해 하기와 같은 대안적 친화도 관계가 동시에 검출되는 경우가 발생할 수 있다: (a) 본원에 개시된 방법에 의해 검출된 바, 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종 및 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종이 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종 사이의 것보다 더 낮은 결합 친화도를 갖는 경우; (b) 본원에 개시된 방법에 의해 검출된 바, 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종 및 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종이 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종 사이의 것보다 더 강력하거나, 그와 등가이거나, 또는 대략적으로 등가인 결합 친화도를 갖는 경우; 및 (c) 본원에 개시된 방법에 의해 검출된 바, (a)에 기술된 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종, 및 (b)에 기술된 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종이 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종 사이의 것보다 더 강력하거나, 또는 유의적으로 더 강력한 결합 친화도를 갖는 경우. 상기 기술된 관계를 보이는 단백질 결합 파트너 쌍의 두 돌연변이는 또한 단백질 결합 파트너의 돌연변이가 함께 두 보상적 돌연변이 중 어느 하나가 단독으로 부여한 것보다 더 큰 추가의 결합 친화도를 부여하는 것인 보상적 돌연변이로서 지칭될 수 있다. 이 시나리오는 도 16에 항원 PD-1의 K54I 돌연변이와 모노클로날 항체 펨브롤리주맙 (pembro)의 단쇄 가변 단편 (scFv)의 Y101K 돌연변이 사이의 것으로 제시되어 있다. 이 시나리오는 두 돌연변이체 잔기 사이의 근접성을 시사할 것이며, 구조 결정, 단백질 조작, 또는 IP 보호 목적에서 유용할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 단백질 결합 파트너의 두 개별 종 사이의 주어진 상호작용에 대해 하기와 같은 대안적 친화도 관계가 동시에 검출되는 경우가 발생할 수 있다: (a) 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종 및 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종이 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종 사이의 것보다 더 강력하거나, 그와 등가이거나, 또는 대략적으로 등가인 결합 친화도를 갖는 경우; (b) 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종 및 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종이 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종 사이의 것보다 더 낮은 결합 친화도를 갖는 경우; 및 (c) 본원에 개시된 방법에 의해 검출된 바, (a)에 기술된 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종, 및 (b)에 기술된 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종이 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종 사이의 것과 등가이거나, 또는 대략적으로 등가인 결합 친화도를 갖는 경우. 상기 기술된 관계를 보이는 단백질 결합 파트너 쌍의 두 돌연변이는 두 돌연변이가 동시에 발생할 때, 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이가 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이의 친화도 감소 영향을 보상하여 두 단백질 결합 파트너 사이의 야생형 친화도 수준을 회복시키는 것인, 보상적 돌연변이로서 지칭될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 단백질 결합 파트너의 두 개별 종 사이의 주어진 상호작용에 대해 하기와 같은 대안적 친화도 관계가 동시에 검출되는 경우가 발생할 수 있다: (a) 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종 및 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종이 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종 사이의 것보다 더 강력하거나, 그와 등가이거나, 또는 대략적으로 등가인 결합 친화도를 갖는 경우; (b) 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종 및 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종이 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종 사이의 것보다 더 강력하거나, 그와 등가이거나, 또는 대략적으로 등가인 결합 친화도를 갖는 경우; 및 (c) 본원에 개시된 방법에 의해 검출된 바, (a)에 기술된 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종, 및 (b)에 기술된 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종이 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종 사이의 것보다 더 낮은 결합 친화도를 갖는 경우. 상기 기술된 관계를 보이는 단백질 결합 파트너 쌍의 두 돌연변이는 단백질-단백질 계면에서 서로 매우 근접하게 위치하는 아미노산을 확인하는 데 유용할 수 있으며, 특히 두 단백질 결합 파트너 사이의 결합 친화도를 매개하는 데 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, "예측된 결합 친화도" 또는 "예측된 상호작용 강도"는 돌연변이화된 단백질 결합 파트너 쌍에 대해 정의 및 예측될 수 있다. 일부 구현예에서, 예측된 결합 친화도는 항체 돌연변이체 종 및 항원 돌연변이체 종의 쌍형성에 대해 정의될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 예측된 결합 친화도는 각 돌연변이체가 상응하는 야생형 단백질 결합 파트너에 미치는 관찰된 영향에 기초하여 두 돌연변이체 단백질 결합 파트너 사이에서 관찰될 것으로 예상되는 친화도로서 정의된다. 예측된 결합 친화도는 (1) 야생형별 결합 친화도를 1.0으로 정규화하고, (2) 그의 야생형 단백질 결합 파트너와 각각의 돌연변이체 단백질 결합 종 상호작용에 대한 상대적 결합 친화도를 계산하여 제1 돌연변이체 단백질 결합 친화도 및 제2 돌연변이체 단백질 결합 친화도를 수득하고, (3) 제1 돌연변이체 단백질 결합 친화도 및 제2 돌연변이체 단백질 결합 친화도를 곱하여 두 단백질 결합 파트너 서로의 상호작용에 대한 예측된 결합 친화도를 수득함으로써 계산한다.
예를 들어, 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종의 상호작용의 관찰된 결합 친화도는 임의 단위 1.0으로 정규화되고; 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종의 상호작용의 관찰된 결합 친화도는 야생형 단백질 결합 상호작용의 친화도 대비 0.5이고; 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종과 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종의 상호작용의 관찰된 결합 친화도는 야생형 단백질 결합 상호작용 대비 0.5이고; 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종과 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종의 상호작용의 예측된 결합 친화도는 0.25인 것으로 계산된다.
일부 구현예에서, "관찰된 결합 친화도"는 본원에 개시된 방법에 따라 돌연변이체 단백질 결합 파트너 사이의 다수의 상호작용 각각에 대해 결정될 수 있다. 하나의 구현예에서, 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종 사이의 상호작용의 관찰된 친화도 값은 임의 단위 1.0으로 정규화된다. 다른 단백질 결합 파트너 쌍의 관찰된 결합 친화도, 예컨대, 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종과 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 종 사이의 결합 친화도는 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 종과 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 종 사이의 상호작용에 할당된 1.0이라는 값 대비로 비례하여 측정되고, 정량화된다. 돌연변이체 단백질 결합 파트너 쌍에 대한 관찰된 결합 친화도는 예측된 결합 친화도와 비교될 수 있고, 이에 의해 관찰된 결합 친화도 대 예측된 결합 친화도의 비가 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 및 일부 단백질 결합 파트너 쌍의 경우, 관찰된 결합 친화도 대 예측된 결합 친화도의 비는 약 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 내지 약 10:1, 또는 10:1 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 및 일부 단백질 결합 파트너 쌍의 경우, 관찰된 결합 친화도 대 예측된 결합 친화도의 비는 약 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 내지 1:10, 또는 약 1:10 미만일 수 있다.
제1 단백질 결합 파트너가 항체이고, 제2 단백질 결합 파트너가 항원이고, 항체 및 항원의 보상적 돌연변이가 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 단백질 결합 파트너 쌍의 경우, 상기 보상적 돌연변이 쌍에 관여하는 아미노산 잔기는 항원/항체 계면에서 공간적으로 가깝기 때문에 일측 단백질 결합 기반 방법을 사용할 때 이용할 수 없는 단백질-단백질 계면에 대한 고유한 정보를 얻을 수 있다. 본원에 개시된 방법에 의해 검출된 바, 단백질 결합 파트너 사이의 보상적 돌연변이의 예는 구조적 근접성의 지표이다. 다른 구조적 데이터의 부재하에서, 보상적 돌연변이 쌍은 단백질-단백질 상호작용의 컴퓨터 모델을 구축할 때 거리 제약으로 유용할 수 있다. 단백질 결합 파트너 쌍에 대한 보상적 돌연변이를 확인함으로써 단백질-단백질 계면에서의 상호작용 잔기의 근접성에 대한 고유한 정보를 수득할 수 있다. 이러한 거리 제약은 또한 단백질 조작 및 구조 결정에, 또는 제약 및 생명공학 산업에서 신규한 항체 또는 항원에 대한 지적 재산권 보호 노력을 알리는 데 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 제1 단백질 결합 파트너는 수용체이고, 제2 단백질 결합 파트너는 리간드인 단백질 결합 파트너 사이의 보상적 돌연변이를 확인할 수 있다. 상기 보상적 돌연변이 쌍에 관여하는 아미노산 잔기는 수용체/리간드 계면에서 공간적으로 가깝기 때문에 일측 단백질 결합 기반 방법을 사용할 때 이용할 수 없는 단백질-단백질 계면에 대한 고유한 정보를 얻을 수 있다. 본원에 개시된 방법에 의해 검출된 바, 단백질 결합 파트너 사이의 보상적 돌연변이의 예는 구조적 근접성의 지표이다. 다른 구조적 데이터의 부재하에서, 보상적 돌연변이 쌍은 단백질-단백질 상호작용의 컴퓨터 모델을 구축할 때 거리 제약으로 유용할 수 있다. 단백질 결합 파트너 쌍에 대한 보상적 돌연변이를 확인함으로써 단백질-단백질 계면에서의 상호작용 잔기의 근접성에 대한 고유한 정보를 수득할 수 있다. 이러한 거리 제약은 또한 단백질 조작, 구조 결정에, 또는 제약 및 생명공학 산업에서 신규한 수용체 및 리간드에 대한 합리적 디자인 노력을 알리는 데 유용할 수 있다. 수용체-리간드 단백질 결합 파트너에 대해 확인된 보상적 돌연변이를 사용하여 예를 들어, 세포 요법, 암 치료, 면역 요법과 같은 생의학 응용 분야에 유용한 수용체-리간드 상호작용 사이의 특이적인 거동을 맞춤 디자인할 수 있다. 일부 구현예에서, 보상적 돌연변이는 보상적 돌연변이를 포함하는 수용체-리간드 단백질 결합 파트너가 단백질 결합 파트너의 야생형 종 사이의 것보다 더 높은 친화도를 보이는 것인 수용체-리간드 단백질 결합 파트너 사이에서 확인될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 상기 시너지 상호작용을 확인하는 데, 즉, 두 단백질 결합 파트너 사이, 예컨대, 수용체와 그의 리간드 사이의 결합 친화도를 증진시키는 돌연변이를 확인하는 데 독특하게 유리하다. 이전에 이용가능한 방법, 예컨대, 통상의 일측 스크리닝 방법을 사용하여 단백질 결합 파트너 간의 이러한 시너지 보상적 돌연변이를 확인하는 것은 매우 어렵거나, 또는 불가능하였다.
추가로, 본원에 개시된 방법은 예를 들어 세포 표면 수용체와 그의 리간드 사이의 오르토고날 단백질 상호작용을 확인하고 조작하는 데 유용할 수 있고, 여기서, 조작된 수용체, 조작된 리간드 및 내인성 야생형 리간드 (예컨대, 가용성 성장 인자 또는 시토카인) 사이의 상호작용은 치료 맥락에서 원하는 결과를 위해 고유하게 조정가능하다. 예를 들어, 도 3b에 도시된 단백질 상호작용은 야생형 수용체가 야생형 리간드에 결합하고, 그에 의해 활성화되지만, 돌연변이체 리간드에는 그렇지 않은 반면, 돌연변이체 리간드는 야생형 리간드 및 돌연변이체 리간드, 둘 모두에 결합하고, 그에 의해 활성화되는 일측 오르토고날 결합 관계를 나타낸다. 본원에 개시된 방법을 통해 가능하게는 수용체 및 리간드에 단 소수의 고도한 영향력이 있는 돌연변이를 도입함으로써 수용체-리간드 상호작용에 상기 특성을 부여할 수용체 및 리간드 모두의 돌연변이를 확인할 수 있다.
도 3b에 도시된 일측 오르토고날 결합 관계는 세포 요법, 예를 들어, CAR-T 세포 요법 맥락에서 특히 유용할 수 있고, 여기서, 환자 내의 CAR-T 세포의 수와 존재비를 조절하는 것이 요법의 효능에 중요할 수 있다. 본원에 개시된 방법을 사용하여, 수용체에 대한 보상적 돌연변이을 확인할 수 있고, 이에 의해 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 보상적 돌연변이를 보유하는 맞춤화된 세포 표면 수용체를 발현하도록 CAR-T 세포를 조작할 수 있다. 유사하게, 가용성 성장 인자 또는 시토카인을 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 보상적 돌연변이를 발현하도록 조작할 수 있고, 이에 의해 CAR-T 세포 표면 수용체 및 가용성 성장 인자 또는 시토카인은 도 3b에 도시된 일측 오르토고날 친화도 관계를 나타낸다. 가능하게는 세포 표면 수용체 및 가용성 성장 인자 또는 시토카인 각각에 단 소수의 고도한 영향력이 있는 보상적 돌연변이를 도입함으로써 CAR-T 세포 표면 수용체는 조작된 성장 인자 또는 시토카인, 및 환자의 생리학적 환경에 고유한 야생형 성장 인자 또는 시토카인, 둘 모두에 결합하고, 그에 의해 활성화될 수 있다. 역으로, 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 보상적 돌연변이를 보유하는 조작된 가용성 성장 인자 또는 시토카인은 오직 조작된 CAR-T 세포 표면 수용체에만 결합하고, 그를 활성화할 것이며, 환자의 생리에 고유한 복수의 또는 야생형 세포 표면 수용체에는 영향을 미치지 않을 것이다. 본원에 개시된 방법을 이용하는 맞춤형 오르토고날 단백질-단백질 상호작용의 상기와 같은 패턴은 다수의 질환 및 장애를 치료하기 위한 세포 요법, 면역요법 및 생물학적 제제를 조작하는 데 유용할 것이다.
도 1은 AlphaSeq 방법의 라이브러리별 스크리닝 용량을 보여주는 일련의 차트이다. 각각의 차트에서, 광범위한 친화도 범위에 걸쳐 생물층 간섭측정법에 의해 측정된 친화도를 갖는 단백질 상호작용의 서브세트를 AlphaSeq 강도와 비교하여 주어진 네트워크 크기에서 AlphaSeq 방법의 감도 및 정량적 정확도를 보여준다. 차트 (100)은 100개의 결합 파트너로 이루어진 제2 라이브러리에 대한 100개의 결합 파트너로 이루어진 제1 라이브러리의 상호작용을 스크리닝하고, 10,000개의 상호작용을 측정하는 것을 도시한 것이다. 차트 (102)는 1,000개의 결합 파트너로 이루어진 제2 라이브러리에 대한 1,000개의 결합 파트너로 이루어진 제1 라이브러리의 상호작용을 스크리닝하고, 1,000,000개의 상호작용을 측정하는 것을 도시한 것이다. 차트 (104)는 10,000개의 결합 파트너로 이루어진 제2 라이브러리에 대한 10,000개의 결합 파트너로 이루어진 제1 라이브러리의 상호작용을 스크리닝하고, 100,000,000개의 상호작용을 측정하는 것을 도시한 것이다. 차트 (106)은 10,000개의 상호작용에 대한 AlphaSeq 강도와 단백질-단백질 친화도 (K D ) 사이의 상관관계를 보여주는 것이다. 차트 (108)은 1,000,000개의 상호작용에 대한 AlphaSeq 강도와 단백질-단백질 친화도 (K D ) 사이의 상관관계를 보여주는 것이다. 차트 (110)은 100,000,000개의 상호작용에 대한 AlphaSeq 강도와 단백질-단백질 친화도 (K D ) 사이의 상관관계를 보여주는 것이다.
도 2a는 두 단백질 결합 파트너 사이의 계면 및 두 단백질 결합 파트너 (200) 및 (204)의 부위 포화 돌연변이유발 (SSM) 스크린을 강조하는, 제1 단백질 결합 파트너 (200)이 항체이고, 제2 단백질 결합 파트너 (204)가 항원인, 복합체로 상호작용하는 두 단백질 결합 파트너의 개략도이다. 단백질 결합 파트너 (200)의 아미노산 잔기 (202)는 단백질 결합 파트너 (204)의 아미노산 잔기 (203)에 상응한다. 단백질 결합 파트너 (200)의 아미노산 잔기 (202)는 자연적으로 발생 또는 인공의 이용가능한 추가 아미노산 잔기 중 어느 하나에 의해 치환될 수 있으며, 단백질 결합 파트너 (204)의 아미노산 잔기 (203)의 치환의 유사한 라이브러리에 대한 상호작용에 대해 스크리닝될 수 있다.
상기 라이브러리별 SSM 스크린의 결과는 도 2b에 제시되어 있다. 히트맵 (206)은 단백질-단백질 계면을 정의하는 모든 아미노산 잔기에서 SSM 돌연변이를 보유하는 단백질 결합 파트너 사이의 상호작용에 대한 AlphaSeq에 의한 라이브러리별 강도 측정을 도시한 것이다. 더 어두운 음영은 더 높은 AlphaSeq 강도를 나타내고, 더 밝은 음영은 더 낮은 AlphaSeq 강도를 나타낸다. 예를 들어, 삽도 (208)은 아미노산 (212) 치환의 SSM 라이브러리에 대해 측정된 아미노산 (210) 치환의 SSM 라이브러리에 대한 라이브러리별 AlphaSeq 강도를 강조 표시한 것이다. 데이터가 히트맵 (206)에 의해 제시된 라이브러리별 스크린의 경우, 아미노산 잔기 (210)은 모든 이용가능한 자연적으로 발생된 아미노산 잔기 (G, A, V, L, M, I, S, T C, P, N, Q, F, Y, W, K, R, H, D, E)로 돌연변이화된다. 아미노산 잔기 (210)에 상응하여, 아미노산 잔기 (212)는 유사하게 모든 이용가능한 자연적으로 발생된 아미노산 잔기 (G, A, V, L, M, I, S, T C, P, N, Q, F, Y, W, K, R, H, D, E)로 돌연변이화된다. 아미노산 잔기 (210) 및 아미노산 잔기 (212)의 변이체의 쌍별 상호작용에 대한 강도 데이터는 히트맵 삽도 (208)로 제시되어 있다. 예컨대, 도 2b에 포함된 히트맵(들)의 컬러 버전은 미국 특허상표청(United State Patent and Trademark Office: USPTO) 미국 특허 출원 정보 검색 시스템(Patent Application Information Retrieval system: PAIR, 하기 링크를 통해 접속가능: https://portal.uspto.gov/pair/PublicPair, 미국 출원 번호 63/033,176, 보충 콘텐츠(Supplemental Content) 탭)을 통해 이용가능하다.
도 3a-3c는 도 2a-2b에 제시된 데이터에 의해 검출된 단백질-단백질 상호작용의 서브세트를 그래프로 나타낸 것이고, 야생형 단백질 결합 파트너와 돌연변이체 단백질 결합 파트너의 상대적 친화도 및 단일 아미노산 치환이 두 단백질 결합 파트너 사이의 친화도에 미치는 효과를 검출하는 본원에 개시된 방법의 능력을 도시한 것이다. 도 3a는 야생형 단백질 결합 파트너가 고친화도로 상호작용하고, 돌연변이체 단백질 결합 파트너가 고친화도로 상호작용하지만, 제1 또는 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체는 나머지 다른 단백질 결합 파트너의 야생형 형태와 상호작용하지 않는다는 시나리오를 도시한 것이다. 본 결과는 각각 야생형으로부터의 단일 아미노산 변이를 갖는, 야생형에 대하여 오르토고날로 결합하는 돌연변이체 쌍이다. 도 3b는 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 및 돌연변이체 형태, 둘 모두가 제2 단백질 결합 파트너의 야생형 형태와 상호작용하지만, 야생형 제1 단백질 결합 파트너는 돌연변이체 제2 단백질 결합 파트너와 상호작용하지 않고, 즉, 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이가 야생형 제1 단백질 결합 파트너와의 상호작용을 제거한다는 시나리오를 도시한 것이다. 도 3c는 제1 단백질 결합 파트너의 야생형 및 돌연변이체 형태, 둘 모두가 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이체 형태와 상호작용하지만, 돌연변이체 제1 단백질 결합 파트너는 야생형 제2 단백질 결합 파트너와 상호작용하지 않고, 즉, 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이는 야생형 제2 단백질 결합 파트너와의 상호작용을 제거한다는 시나리오를 도시한 것이다.
도 4는 AlphaSeq를 사용한 라이브러리별 단백질-단백질 상호작용 스크린의 워크플로우를 도시한 것이다. 단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리 (400) 및 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리 (402)는 부위 포화 돌연변이유발에 의해 생성되고, 효모에서 발현된다. 두 라이브러리 집단은 혼합되고, 단백질 결합 파트너는 상호작용 단계 (404)에서 결합한다. 상호작용한 단백질 결합 파트너를 발현하는 세포는 융합 단계 (406)에서 메이팅한다. 제1 라이브러리와 제2 라이브러리 사이의 단백질-단백질 상호작용은 측정 단계 (408)에서 검출되고, 정량화된다.
도 5는 항체-항원 상호작용이 AlphaSeq 플랫폼으로 측정될 수 있다는 것을 도시한 것이다. 관련 기술분야에 널리 공지된, 특징이 잘 규명된 항체-항원 쌍에 대해 AlphaSeq 워크플로우를 적용하였다. 본 시스템은 동족 결합 파트너를 갖는 세포 쌍을 정확하게 확인하고, 비-동족 쌍 중 교차 반응을 검출하지 못했다. 플롯 (500)은 huCTLA-4 및 이필리무맙 scFv의 검출된 상호작용 및 상대적 AlphaSeq 신호를 보여주는 것이다. 플롯 (502)는 huTNFα 및 아달리무맙 scFv의 검출된 상호작용을 보여주는 것이다.
도 6은 8개의 항체 변이체에 대한 8개의 항원 변이체를 스크리닝하여 64개의 상호작용을 검출하고, 정량화한, AlphaSeq 실험의 결과를 도시한 것이다. 연결 라인의 두께는 메이팅 빈도 신호의 크기를 나타낸다. 유의 라인 (600)은 앞서 문헌 [Maute et al. (Maute RL, Gordon SR, Mayer AT, McCracken MN, Natarajan A, Ring NG, Kimura R, Tsai JM, Manglik A, Kruse AC, Gambhir SS, Weissman IL, Ring AM. Engineering high-affinity PD-1 variants for optimized immunotherapy and immuno-PET imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Nov 24;112(47):E6506-14. doi: 10.1073/pnas.1519623112. Epub 2015 Nov 10. PMID: 26604307; PMCID: PMC4664306.)] (상기 문헌은 전문이 모든 목적을 위해 참조로 포함된다)에 의해 보고되고, 특징화된 인간 프로그램된 세포 사멸 리간드-1 (huPD-L1)과 조작된 프로그램된 세포 사멸 단백질-1 (PD-1) 엑토도메인 사이의 상호작용을 나타낸 것이다. AlphaSeq 플랫폼에 의해 검출된 바와 같은 상기 상호작용의 유의성을 통해 본원에 개시된 방법이, 상호작용이 두 단백질 결합 파트너 중 하나 또는 그 둘 모두의 변형에 의하여 야생형 상호작용에 비해 강화된 단백질 결합 파트너 사이의 상호작용을 검출할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.
도 7은 야생형 pembro scFv (항체)에 대한 60개의 PD-1 변이체 (항원 변이체)의 스크린 결과를 나타내는 히트맵이다. 돌연변이유발을 위해 60개의 PD-1 표면 잔기를 선택하였고, 생성된 SSM 라이브러리에 대해 AlphaSeq 워크플로우를 적용하였다. AlphaSeq 신호는 히트맵 포맷으로 제시되고, 여기서, 다양한 패턴으로 어둡게 음영표시된 사각형은 높고, 낮은 메이팅 빈도를 나타낸다. 도면 하단의 막대는 항체 내의 임의의 원자까지의 잔기간 최단 거리를 나타낸다. PD-1 잔기 54 및 61에 상응하는 잔기 (700) 및 (702)는 특히 치환에 대해 불내성이고, 공지된 x선 구조에 기초하면 공간상 항체에 가깝게 위치한다. 예컨대, 도 7에 포함된 히트맵(들)의 컬러 버전은 USPTO PAIR (접속 63/033,176, 보충 콘텐츠 탭)을 통해 이용가능하다.
도 8은 도 7에서 제시된 데이터에 의해 확인된, PD-1/펨브롤리주맙 계면의 결정 구조 내의 특정 잔기를 강조하여 도시한 도이다. PD-1 잔기 K54 및 D61은 특히 치환에 대해 불내성이고, 항체-항원 계면 내에서 공간상 가깝게 위치한다.
도 9는 야생형 PD-1 (항원)에 대한 33개의 pembro scFv 변이체 (항체 변이체)의 스크린 결과를 나타내는 히트맵이다. 펨브롤리주맙 scFv 내의 33개의 위치를 SSM을 사용하여 돌연변이화하고, 야생형 PD-1에 대한 AlphaSeq 워크플로우를 생성된 라이브러리에 대해 적용하였다. AlphaSeq 신호는 히트맵 포맷으로 제시되고, 여기서, 다양한 패턴으로 어둡게 음영표시된 사각형은 높고, 낮은 메이팅 빈도를 나타낸다. 도면 하단의 막대는 항체 내의 임의의 원자까지의 잔기간 최단 거리를 나타낸다. 음영표시된 컬럼 (900) 및 음영표시된 박스 (902)에 의해 표시된 바와 같이, 펨브롤리주맙 scFv 잔기 99는 특히 치환에 대해 불내성이고, 항체-항원 계면 내에서 공간상 가깝게 위치한다. 예컨대, 도 9에 포함된 히트맵(들)의 컬러 버전은 USPTO PAIR (접속 63/033,176, 보충 콘텐츠 탭)을 통해 이용가능하다.
도 10은 항체-항원 계면의 특정 잔기를 강조한, PD-1/펨브롤리주맙 scFv 계면의 결정 구조를 그래프로 나타낸 것이다. 특정 실시양태에서, PD-1 D61 및 pembro scFv R99는 생산적인 항원-항체 복합체의 형성에 기능상 중요한 것으로 보이고, AlphaSeq 검정법에서 어느 부위에서든 치환은 메이팅 빈도를 크게 감소시킨다. 예컨대, 도 10에 포함된 히트맵(들)의 컬러 버전은 USPTO PAIR (접속 63/033,176, 보충 콘텐츠 탭)을 통해 이용가능하다.
도 11은 앞서 강조 표시된 D61-R99 잔기 쌍 주위에 밀집된 상호작용 네트워크를 강조한, PD-1/펨브롤리주맙 계면의 구조를 도시한 것이다. 돌연변이와 관련하여 불내성인 PD-1 및 펨브롤리주맙 scFv의 잔기가 제시되어 있다.
도 12a-12b는 도 9에 제시된 동일한 데이터세트를 나타낸 것이다. 특히 아미노산 치환에 대해 불내성인 것으로서 펨브롤리주맙 scFv 잔기 D104 및 S230이 강조 표시되어 있다. 이들 잔기는 VH-VL 계면을 통해 서로 상호작용하여 항체 구조 내에서 VH 및 VL 도메인의 상대적 위치화를 안정화시키는 상호작용을 형성한다. 돌연변이에 의한 이러한 특이적인 상호작용 파괴는 AlphaSeq에 의해 생성된 메이팅 빈도 점수 하락으로 판독되는 바와 같이, 결합 손실을 일으킨다. 펨브롤리주맙 scFv 잔기 230에서 알라닌의 치환은 내성을 나타내는 반면, 대부분의 다른 치환은 그렇지 않다는 것이 주목할 만하다. 알라닌 스캐닝 단독으로는 상기 부위가 돌연변이와 관련하여 감수성인 것으로 확인되지 못했을 것이며, 이는 부위 포화 돌연변이유발 및 AlphaSeq 플랫폼에 의해 생성된 전체 돌연변이 스펙트럼을 이용할 수 있는 이점을 강조하는 것이다. 예컨대, 도 12a에 포함된 히트맵(들)의 컬러 버전은 USPTO PAIR (접속 63/033,176, 보충 콘텐츠 탭)을 통해 이용가능하다.
도 13은 pembro scFv (항체)와 PD-1 (항원) 사이의 라이브러리별 스크린에서 측정 된 효모 메이팅 효율에 기초한 AlphaSeq 상대 강도 데이터에 의해 확인된 보상적 돌연변이 쌍의 표이다. 열 (1300)은 PD-1 돌연변이체 단백질 결합 파트너를 기술하고, 열 (1302)는 쌍형성한 pembro scFv 돌연변이체 단백질 결합 파트너를 기술하고, 열 (1304)는 열 (1300)과 열 (1302)의 쌍형성한 돌연변이체 잔기 사이의 최소 거리 (단위 Å)를 기술한다. 보상적 돌연변이를 보유하는 잔기 쌍은 항체-항원 계면 내에서 공간상 가깝게 위치한다. 회색으로 강조 표시된 행은 그에 대한 상대 강도가 하기 기술되는, 도 16-17에 플롯팅되어 있는 것인 돌연변이체 단백질 결합 파트너를 나타낸다.
도 14는 도 7의 히트맵에 제시된 것과 동일한 데이터세트를 나타낸 것으로, 항체-항원 계면의 결정 구조를 그래프로 나타낸 것이다. 상기 데이터는 공간 에피토프 맵핑이 단독으로는 위양성 신호를 줄 수 있다는 것을 시사한다. 예를 들어, PD-1 위치 107의 리신 잔기는 거리 히트맵에 의해 밝혀진 바와 같이 항체와 공간상 가깝고, VL 도메인 중의 E194를 비롯한, 항체 잔기와 함께 잘 정의된 상호작용 세트를 만든다. 그러나, 두 잔기 모두 어떤 영향도 미치지 않으면서 돌연변이화될 수 있으며, 따라서, 공간 에피토프 맵핑에 의해 밝혀진 바와 같은 상기 상호작용은 AlphaSeq 돌연변이 분석에 의해 입증된 바와 같이, 그는 기능적으로는 중요하지 않기 때문에 위양성인 것으로 간주될 수 있다. 예컨대, 도 14에 포함된 히트맵(들)의 컬러 버전은 USPTO PAIR (접속 63/033,176, 보충 콘텐츠 탭)을 통해 이용가능하다.
도 15는 pembro scFv (항체)와 PD-1 (항원) 사이의 라이브러리별 스크린에서 상대 AlphaSeq 신호를 측정함으로써 보상적 돌연변이를 검출할 수 있는 AlphaSeq 플랫폼의 잠재능을 도시하는 다이어그램이다. 라이브러리별 분석은 플롯팅된 AlphaSeq 신호 시그니처를 보여주는 비교적 드문 상호작용 서브세트를 확인할 수 있다. 상기 시그니처를 보이는 보상적 돌연변이를 통해 야생형 유사 메이팅 빈도가 두 돌연변이체 중 적어도 하나, 또는 그 둘 모두 동족 야생형 형태와의 상호작용을 약화시킨 돌연변이체 쌍에 대해서도 관찰될 수 있다. 야생형 복합체의 x선 구조를 조사함으로써, 상기 보상적 돌연변이를 보유하는 잔기는 공간상 가깝게 위치하는 것으로 밝혀졌다.
도 16은 관련된 잔기가 강조 표시된 항체-항원 계면의 결정 구조를 그래프로 나타낸 것과 함께, 보상적 돌연변이의 시그니처를 나타내는 3쌍의 돌연변이체 단백질 결합 파트너의 플롯을 보여주는 것이다.
도 17은 관련된 잔기가 강조 표시된 항체-항원 계면의 결정 구조를 그래프로 나타낸 것과 함께, 보상적 돌연변이의 시그니처를 나타내는 2쌍의 돌연변이체 단백질 결합 파트너의 플롯을 보여주는 것이다.
도 18은 pembro scFv (항체) 돌연변이체 및 PD-1 (항원) 돌연변이체의 라이브러리 사이의 라이브러리별 스크린에서 상대 AlphaSeq 신호를 측정함으로써 검출된 보상적 돌연변이 쌍을 강조하는 것을 그래프로 나타낸 것이다. 7개의 항체 잔기와 6개의 항원 잔기를 포함하는 총 10개의 고유한 잔기 대 잔기의 상호작용이 제시되어 있으며, 여기서, 모든 보상적 쌍은 항원/항체 계면에서 공간상 가깝게 위치한다. 상기 보상적 돌연변이를 통해 일측 결합 기반 방법을 사용하였을 때 이용이 불가능한 단백질-단백질 계면에 관한 고유한 정보를 얻는다.
도 19는 표적화된 돌연변이유발에 의해 에피토프를 맵핑하기 위한 이전 방법을 도시한 것이다. 이전에 공지된 종래의 에피토프 맵핑 방법에서, 표적 단백질의 표면 잔기를 하나씩 알라닌 (알라닌 스캐닝) 또는 또 다른 아미노산으로 개별적으로 돌연변이화시키고, 항체에 의한 표적의 결합을 평가하였다. 표적에 대한 항체의 결합을 파괴시킨 돌연변이는 특정 실시양태에서, 결합에 중요한 것으로 추정되었고, 에피토프를 포함하는 것으로 추정되었다. 각각의 항체-표적 돌연변이체 상호작용을 개별적으로 평가하였거나, 또는 표적 돌연변이체를 배치하고, 한 번에 하나의 항체를 에피토프 맵핑하였기 때문에 상기 접근법은 진행이 느리고, 고가였다. 예를 들어, 항체 (1904)에 대한 에피토프를 맵핑하기 위해 표적 단백질 (1900)에 대해 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 적용시킬 수 있다. 돌연변이체 표적 (1902)는 단백질의 위치 17에서 아미노산 잔기의 돌연변이 (1906)을 포함한다. 돌연변이 (1906)은 돌연변이체 표적 (1902)와 항체 (1904) 사이의 결합을 파괴시키며, 이는 표적의 에피토프가 위치 17에서 아미노산 잔기의 근처에 있다는 것을 시사한다.
도 20은 본원에 개시된 방법을 사용하여 에피토프 맵핑하기 위한 라이브러리별 스크린을 도시한 것이다. 일부 구현예에서, 표적 단백질 (2000)에 대해 단백질의 모든 아미노산 위치에 걸쳐 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 적용시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 표적 단백질 (2000)에 대해 전체 부위 포화 돌연변이유발을 적용시켜 단백질의 각각의 아미노산 위치가 모든 이용가능한 아미노산 변이체로 돌연변이화되어 돌연변이체 표적 단백질의 라이브러리를 생성할 수 있다. 항체 라이브러리, 예를 들어, 항체 (2002)와 같은 항체를 제공하고, 본원에 개시된 방법에 따라 돌연변이화된 표적 단백질 라이브러리에 대해 스크리닝하여 표적 단백질 라이브러리와 항체 라이브러리 사이의 모든 결합 상호작용을 평가한다. 항체 라이브러리의 각 항체에 대해, 결합 상호작용을 평가하고, 표적 단백질 에피토프는 야생형 결합과 비교하여 결합을 파괴하는 돌연변이의 위치로부터 추정될 수 있다.
도 21은 도 20에 도시된 라이브러리별 스크린에 의해 생성된 데이터를 그래프로 나타낸 것이다. 데이터는 항체 라이브러리 (항체)에 대한 PD-1 변이체 (항원 변이체)의 스크린 결과를 나타내는 히트맵으로 제시되어 있다. 돌연변이유발을 위해 모든 PD-1 표면 잔기를 선택하였고, 생성된 SSM 라이브러리에 대해 AlphaSeq 워크플로우를 적용시켰다. AlphaSeq 신호는 히트맵 포맷으로 제시되고, 여기서, 다양한 패턴으로 어둡게 음영표시된 사각형은 높고, 낮은 메이팅 빈도를 나타낸다. 10개의 항체를 PD-1 표면 위치의 부위 포화 돌연변이유발 라이브러리에 대해 스크리닝하였다. PD-1 표면 위치는 축 (2100)을 따라 왼쪽에서 오른쪽으로 도시되어 있고, 시험 항체 및 대조군은 축 (2102)를 따라 도시되어 있다. 예컨대, 도 21에 포함된 히트맵(들)의 컬러 버전은 USPTO PAIR (접속 63/033,176, 보충 콘텐츠 탭)을 통해 이용가능하다.
도 22는 도 21에 도시된 항체 중 2개를 추가로 나타낸 것이다. 도 21로부터의 항체 9 및 10에 대한 데이터는 라이브러리별 스크린의 결과를 보여주는 강화/고갈 히트맵으로서 도 22에 재구성되어 있다. 히트맵 (2204)는 PD-1 표면 잔기 변이체 (항원 변이체)의 라이브러리에 대한 펨브롤리주맙 (항체)의 스크린에 대한 데이터를 나타낸 것이고, 히트맵 (2206)은 PD-1 표면 잔기 변이체 (항원 변이체)의 라이브러리에 니볼루맙 (항체)의 스크린에 대한 데이터를 나타낸 것이다. AlphaSeq 신호는 히트맵 포맷으로 제시되고, 여기서, 다양한 패턴으로 어둡게 음영표시된 사각형은 높고, 낮은 메이팅 빈도를 나타낸다. PD-1 표면 위치는 축 (2200)을 따라 왼쪽에서 오른쪽으로 도시되어 있고, 각 PD-1 표면 위치에 대한 개별 아미노산 변이체는 축 (2202)를 따라 도시되어 있다. 예컨대, 도 22에 포함된 히트맵(들)의 컬러 버전은 USPTO PAIR (접속 63/033,176, 보충 콘텐츠 탭)을 통해 이용가능하다.
도 23은 보상적 돌연변이가 제1 단백질 결합 파트너와 제2 단백질 결합 파트너 사이에 확인되는, 본원에 개시된 방법의 가능한 출력결과를 도시한 것이다. 야생형 단백질 (2300) 및 야생형 단백질 (2302)는 제1 및 제2 단백질 결합 파트너로서 상호작용한다. 본원에 개시된 방법에 따른 라이브러리별 전체 부위 포화 돌연변이유발 스크린을 통해 위치 (2308), (2310) 및 (2312)로서 제1 및 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이를 확인하였고, 이에 의해 각 돌연변이에 대하여 돌연변이화된 단백질 결합 파트너는 야생형 상호작용과 유사한 방식으로 상호작용하지만, 돌연변이화된 단백질 결합 파트너는 야생형 단백질 결합 파트너와는 상호작용하지 않는다. 예를 들어, 돌연변이체 단백질 결합 파트너 (2304)는 돌연변이체 단백질 결합 파트너 (2306)과는 강력하게 상호작용하지만, 위치 (2308), (2310) 및 (2312)의 돌연변이로 인해 야생형 단백질 결합 파트너 (2302)와는 상호작용하지 않는다. 조작된 항체, 합성 수용체/리간드 쌍 조작을 비롯한 적용을 위해, 또는 예컨대, 조작된 효소 스캐폴드와 같은 합성 생물학 도구를 위해 상기 오르토고날 단백질 결합 상호작용을 확인하고, 디자인하는 것이 유용할 수 있다.
도 24a는 본원에 개시된 방법을 사용한 에피토프 맵핑을 위한 라이브러리별 스크린을 도시한 것이다. PD-1 (항원) 표면 잔기 돌연변이체의 부위 포화 돌연변이유발 라이브러리와 펨브롤리주맙 (항체) 돌연변이체의 부위 포화 돌연변이유발 라이브러리 사이에 라이브러리별 스크린을 수행하였다. 돌연변이유발을 위해 PD-1의 19개의 아미노산 위치를 선택하였고, 돌연변이유발을 위해 펨브롤리주맙의 33개의 아미노산 위치를 선택하였다. 단백질-단백질 결합 계면 근처에 위치하는 항원 및 항체의 아미노산 잔기를 선택하였다. AlphaSeq 플랫폼을 사용하여 220,000개 초과의 쌍별 상호작용을 포함하는, 항원 및 항체 단백질 결합 파트너의 부위 포화 돌연변이유발 라이브러리 사이의 모든 쌍별 상호작용을 측정하였다. 히트맵 (2400)은 야생형 PD-1과 야생형 펨브롤리주맙 사이의 결합 친화도 대비 PD-1 돌연변이체의 라이브러리와 펨브롤리주맙 돌연변이체의 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 AlphaSeq에 의한 쌍별 라이브러리별 강도 측정을 도시한 것으로, 여기서, 더 밝은 음영은 야생형 결합 친화도를 나타내고, 더 어두운 음영은 감소된 결합 친화도를 나타낸다.
도 24b는 도 24a의 히트맵 (2400)에 제시된 데이터의 서브세트의 점점 더 상세하게 보여주는 도면을 도시한 것이다. 히트맵 삽도 (2402)는 위치 54에 돌연변이를 보유하는 20개의 PD-1 변이체 및 위치 54에 돌연변이를 보유하는 20개의 펨브롤리주맙 변이체 사이의 쌍별 상호작용에 대한, 또는 본원에 개시된 방법에 의해 측정된 총 400개의 단백질-단백질 상호작용에 대한 데이터를 나타낸 것이다. 단일 AlphaSeq 검정법에서, 결합 친화도 데이터는 33개의 선택된 펨브롤리주맙 위치 및 19개의 선택된 PD-1 위치의 모든 쌍별 조합에 대해 측정되고, 두 단백질 결합 파트너 사이의 야생형 결합 친화도 대비로 평가된다.
도 24c는 단일 PD-1 돌연변이체와 단일 펨브롤리주맙 변이체 사이의 특정 쌍별 상호작용을 강조하여 나타낸 것이다. 히트맵 (2412)는 야생형 PD-1과 야생형 펨브롤리주맙 사이의 결합 친화도 대비 PD-1 돌연변이체의 라이브러리와 펨브롤리주맙 돌연변이체의 라이브러리 사이의 상호작용에 대한 AlphaSeq에 의한 쌍별 라이브러리별 강도 측정을 도시한 것으로, 여기서, 더 밝은 음영은 야생형 결합 친화도를 나타내고, 더 어두운 음영은 감소된 결합 친화도를 나타내고, 두 특정 돌연변이: PD-1 K54F 및 펨브롤리주맙 Y33P는 강조 표시되어 있다. 사각형 표시 (2404)는 야생형 PD-1 및 야생형 펨브롤리주맙에 대한 결합 친화도를 나타내고, 히트맵의 음영에 따라 흰색이다. 사각형 표시 (2406)은 야생형 PD-1과 펨브롤리주맙 Y33P 사이의 결합 친화도를 나타내고, 어둡게 음영표시되어 있으며, 이는 야생형 대비 결합 친화도가 유의적으로 감소되었음을 시사하는 것이다. 사각형 표시 (2408)은 PD-1 K54F와 야생형 펨브롤리주맙 사이의 결합 친화도를 나타내고, 어둡게 음영표시되어 있으며, 이는 야생형 대비 결합 친화도가 유의적으로 감소되었음을 시사하는 것이다. 사각형 표시 (2410)은 PD-1 K54F와 펨브롤리주맙 Y33P 사이의 결합 친화도를 나타내고, 흰색으로 음영표시되어 있으며, 이는 결합 친화도가 야생형과 유사하다는 것을 시사하는 것이다. 즉, 상기 개별 돌연변이체의 경우, 각 돌연변이는 단독으로 제1과 제2 단백질 결합 파트너 사이의 결합 친화도를 유의적으로 감소시켰지만, 돌연변이가 동시에 존재할 경우, 결합 친화도는 야생형 결합 친화도와 유사한 수준으로 회복된다. 제1 단백질 결합 파트너의 돌연변이는 제2 단백질 결합 파트너의 돌연변이에 의해 유발된 결합 결핍을 보상하고, 야생형 결합 친화도와 유사한 결합 친화도를 촉진시킨다. 예컨대, 도 24a-24c에 포함된 히트맵(들)의 컬러 버전은 USPTO PAIR (접속 63/033,176, 보충 콘텐츠 탭)을 통해 이용가능하다.
도 24d는 도 24c의 히트맵 (2412)에 제시된 데이터를 그래프로 나타낸 것이다. 야생형 및 돌연변이체 PD-1 및 펨브롤리주맙의 조합 사이의 4개의 쌍별 상호작용이 제시되어 있다. 야생형 PD-1과 야생형 펨브롤리주맙 사이의 결합 친화도가 1.0으로 세팅되도록 그래프를 정규화하고, 상기 돌연변이체 단백질 결합 파트너의 쌍별 상호작용을 1.0 대비로 정량화한다. 도 24c와 관련하여 기술된 바와 같이, 상기 돌연변이는 각 돌연변이가 단독으로 발휘한 결합 친화도에 미친 악영향을 보상하는 고유한 예상 밖의 특성을 보이며, 이에 의해 PD-1 K54F 및 펨브롤리주맙 Y33P는 야생형 단백질 결합 파트너 사이의 결합 친화도와 유사한 결합을 나타낸다.
도 25는 본원에 개시된 방법을 사용하여 평가된, 두 단백질 결합 파트너 사이의 예측 및 관찰된 상호작용 강도의 제1 플롯 및 항체-항원 단백질 결합 파트너 사이의 예측된 상호작용 강도 대 관찰된 상호작용 강도의 제2 플롯을 도시한 것이다. 예측된 상호작용 강도는 야생형과 돌연변이화된 제1 단백질 결합 파트너의 상대적 결합 친화도에 야생형과 돌연변이화된 제2 단백질 결합 파트너의 상대적 결합 친화도를 곱함으로써 정의될 수 있다. 즉, PD-1 K54F와 펨브롤리주맙 Y33P 사이의 상호작용의 예측된 상호작용 강도는 PD-1 K54F와 야생형 펨브롤리주맙 사이의 상대적 친화도에 펨브롤리주맙 Y33P와 야생형 PD-1사이의 상대적 친화도를 곱함으로써 정의될 수 있다. 플롯 (2500)에 제시된 바와 같이, PD-1 K54F와 펨브롤리주맙 Y33P 사이의 예측된 상호작용 강도는 각 개별 돌연변이와 그의 상응하는 야생형 단백질 결합 파트너의 결합 친화도가 실질적으로 감소하였기 때문에 거의 0에 가까운 값이다. 그러나, PD-1 K54F와 펨브롤리주맙 Y33P 사이의 관찰된 상호작용 강도는 상기 돌연변이의 예상 밖의 보상적 효과에 기인하여 야생형 PD-1과 야생형 펨브롤리주맙 사이의 상호작용 강도와 거의 동일하다. 플롯 (2502)는 관찰된 상호작용 강도에 대하여 플롯팅된 예측된 상호작용 강도를 도시한 것이고, 밝은 회색으로 표시된 것은 보상적 돌연변이를 나타내고, 그를 강조 표시한 것이다. 상기 보상적 돌연변이는 돌연변이의 예상 밖의 보상적 효과에 기인하여 관찰된 상호작용 강도가 예측된 상호작용 강도를 유의적으로 초과하는 돌연변이체 단백질 결합 파트너 쌍이다.
도 26은 단백질 결합 파트너 사이의 아미노산 잔기 간의 거리에 대한 예측된 상호작용 강도 대비 관찰된 상호작용 강도의 비를 나타낸 플롯이다. 관찰된 상호작용 강도가 예측된 상호작용 강도보다 실질적으로 더 높은 보상적 돌연변이는 밝은 회색으로 강조 표시되어 있다. 플롯은 보상적 돌연변이로 확인된 아미노산 잔기 쌍이 단백질-단백질 계면에 서로 물리적으로 매우 근접한 위치에 존재한다는 것을 입증한다. 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 보상적 돌연변이는 모두 공지된 x선 결정 구조에 따르면 단백질-단백질 계면에서 7 Å 미만으로 떨어져 있었다.
도 27은 PD-1 (항원)과 펨브롤리주맙 (항체) 사이의 계면의 x선 결정 구조에 기초하여 3차원 모델이다. 그에 대한 보상적 돌연변이가 확인된 아미노산 잔기는 밝은 회색으로 강조 표시되어 있다. 본 모델은 보상적 돌연변이인 것으로 확인된 아미노산 잔기가 모두 단백질-단백질 계면에 서로 물리적으로 매우 근접한 위치에 존재한다는 것을 입증한다.
일부 구현예에서, 본 발명은
제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리를 제공하는 단계로서, 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 제1 야생형 폴리펩티드 및 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계;
제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리를 제공하는 단계로서, 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 제2 야생형 폴리펩티드 및 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계;
제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너와 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너 사이의 관찰된 친화도 값을 측정하는 단계; 및
제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너와 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너 사이의 각 관찰된 친화도 값에 기초하여,
(i) 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드, 및
(ii) 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드를 포함하는 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍을 확인하는 단계로서,
여기서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍의 각 쌍의 관찰된 친화도 값은 단백질 결합 파트너의 각 쌍 사이의 각 예측된 친화도 값과 실질적으로 상이하고,
여기서, 주어진 단백질 결합 파트너 쌍에 대한 예측된 친화도 값은
a) 주어진 쌍의 제1 야생형 폴리펩티드와 주어진 쌍의 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값, 및
b) 주어진 쌍의 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 주어진 쌍의 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값에 기초하여 계산되는 것인 단계를 포함하는,
두 단백질 결합 파트너 사이의 보상적 돌연변이를 확인하기 위한 신규한 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너는 제1 복수의 효모 세포 중 하나의 표면 상에서 발현되고, 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너는 제2 복수의 효모 세포 중 하나의 표면 상에서 발현된다.
일부 구현예에서, 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너와 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 복수의 효모 세포와 제2 복수의 효모 세포 사이의 합성 응집에 의해 측정된다.
일부 구현예에서, 단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너는 항체, scFv, Fab, 또는 VHH 종이다.
일부 구현예에서, 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너는 항원 종이다.
일부 구현예에서, 단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너는 수용체 종이다.
일부 구현예에서, 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너는 리간드 종이다.
일부 구현예에서, 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 각각 및 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 각각이 사용자 지정 돌연변이유발에 의해 생성된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍의 각 쌍에 대한 관찰된 친화도 값은 단백질 결합 파트너 쌍의 예측된 친화도 값보다 실질적으로 더 높다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍의 각 쌍에 대한 관찰된 친화도 값은 단백질 결합 파트너 쌍의 예측된 친화도 값보다 2배 초과만큼 더 높다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍의 각 쌍에 대한 관찰된 친화도 값은 단백질 결합 파트너 쌍의 예측된 친화도 값보다 실질적으로 더 낮다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍의 각 쌍에 대한 관찰된 친화도 값은 단백질 결합 파트너 쌍의 예측된 친화도 값보다 2배 초과만큼 더 낮다.
일부 구현예에서, 본 발명은
단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리를 제공하는 단계로서, 단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리는 제1 야생형 폴리펩티드 및 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계;
단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리를 제공하는 단계로서, 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리는 제2 야생형 폴리펩티드 및 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계;
단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너와 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너 사이의 관찰된 친화도 값을 측정하는 단계;
단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너와 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너 사이의 관찰된 친화도 값에 기초하여, 그의 각 관찰된 친화도 값이 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값과 실질적으로 상이한 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍을 확인하는 단계를 포함하는,
두 단백질 결합 파트너 사이의 보상적 돌연변이를 확인하기 위한 신규한 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍은 하기 조건을 충족시킨다:
a. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값보다 실질적으로 더 낮음;
b. 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값보다 실질적으로 더 낮음; 및
c. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값과 실질적으로 동일하거나, 또는 그보다 실질적으로 더 높음.
일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍은 하기 조건을 충족시킨다:
a. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값과 실질적으로 동일하거나, 또는 그보다 실질적으로 더 높음;
b. 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값보다 실질적으로 더 낮음; 및
c. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값과 실질적으로 동일함.
일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍은 하기 조건을 충족시킨다:
a. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값보다 실질적으로 더 낮음;
b. 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값과 실질적으로 동일하거나, 또는 그보다 실질적으로 더 높음; 및
c. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값과 실질적으로 동일하거나, 또는 그보다 실질적으로 더 높음.
일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍은 하기 조건을 충족시킨다:
a. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값과 실질적으로 동일하거나, 또는 그보다 실질적으로 더 높음;
b. 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값과 실질적으로 동일하거나, 또는 그보다 실질적으로 더 높음; 및
c. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 복수의 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값보다 실질적으로 더 낮음.
일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍은 하기 조건을 충족시킨다:
a. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값, 또는 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값보다 실질적으로 더 낮음;
b. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값또는 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값보다 실질적으로 더 높음.
일부 구현예에서, 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드의 돌연변이는 항체, scFv, Fab, 또는 VHH 종의 파라토프를 정의하고/거나, 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드의 돌연변이는 항원 종의 에피토프를 정의한다.
일부 구현예에서, 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드의 돌연변이 및 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드의 돌연변이는 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 오르토고날 결합 관계를 발생시키며, 이에 따라
a. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드는 제2 야생형 폴리펩티드 및 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드에 결합하고,
b. 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드는 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드에는 결합하지만, 제2 야생형 폴리펩티드에는 결합하지 않는다.
일부 구현예에서,제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드의 돌연변이 및 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드는 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 오르토고날 결합 관계를 발생시키며, 이에 따라
a. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드는 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드에는 결합하지만, 제2 야생형 폴리펩티드에는 결합하지 않고,
b. 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드는 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드에는 결합하지만, 제1 야생형 폴리펩티드에는 결합하지 않는다.
일부 구현예에서, 친화도 결합 데이터는 본원에 개시된 방법에 의해 측정된 친화도 결합 데이터는 디지털 디스플레이 장치로 출력될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 측정된 야생형 및 돌연변이체 단백질 결합 파트너에 대한 친화도 결합 데이터를 수치 및 그래프로 나타낸 것은 디스플레이 장치 상에 돌연변이체 단백질 결합 파트너 쌍이 보상적 돌연변이로서 확인된 돌연변이를 보유한다는 것을 시사하는 표기로 표시될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 보상적 돌연변이로서 확인된 하나 이상의 돌연변이를 보유하는 돌연변이체 단백질 결합 파트너의 경우, 돌연변이는 상기에서 상세하게 논의된 오르토고날 결합 친화도 특성을 갖는 단백질 상호작용을 조작하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 보상적 돌연변이는 생산 숙주 유기체에 이종성인 효소를 포함하는 조작된 대사 경로를 구축하는 데, 예컨대, 유용한 2차 대사산물을 생산하는 데 사용될 수 있으며, 여기서, 경로 성분 효소의 상호작용 및 역가는 보상적 돌연변이의 사용에 의해 미세 조정될 수 있다. 추가로, 이종성 대사 경로 성분은 그렇지 않으면 이종성 대사 경로의 활성을 손상시키거나, 또는 감소시킬 수 있는 숙주 유기체 내의 단백질 및 효소와 상호작용하지 않도록 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 보상적 돌연변이를 사용하여 조작될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 수용체에 대한 보상적 돌연변이는 보상적 돌연변이를 보유하는 맞춤화된 세포 표면 수용체를 발현하도록 CAR-T 세포의 조작을 허용하는 본원에 개시된 방법에 의해 확인될 수 있다. 유사하게, 가용성 성장 인자 또는 시토카인은 CAR-T 세포 표면 수용체 및 가용성 성장 인자 또는 시토카인이 일측 오르토고날 친화도 관계를 나타내도록 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 보상적 돌연변이를 발현하도록 조작될 수 있다. 각각의 세포 표면 수용체 및 가용성 성장 인자 또는 시토카인에 가능한 한 소수의 고도한 영향력이 있는 보상적 돌연변이를 도입함으로써 CAR-T 세포 표면 수용체는 조작된 성장 인자 또는 시토카인, 및 환자의 생리학적 환경에 고유한 야생형 성장 인자 또는 시토카인, 둘 모두에 결합하고, 그에 의해 활성화될 수 있다. 역으로, 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 보상적 돌연변이를 보유하는 조작된 가용성 성장 인자 또는 시토카인은 오직 조작된 CAR-T 세포 표면 수용체에만 결합하고, 활성화할 것이며, 환자의 생리에 고유한 복수의 또는 야생형 세포 표면 수용체에는 영향을 미치지 않을 것이다. 본원에 개시된 방법을 이용하는 맞춤형 오르토고날 단백질-단백질 상호작용의 상기와 같은 패턴은 다수의 질환 및 장애를 치료하기 위한 세포 요법, 면역요법 및 생물학적 제제를 조작하는 데 유용할 것이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 보상적 돌연변이는 항체 기반 면역요법의 합리적 디자인에 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 항체, scFv , Fab 또는 VHH 종은 그의 항원에 대한 그의 친화도 및 특이성이 조정가능하고, 맞춤화될 수 있도록 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 보상적 돌연변이를 보유하도록 조작될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 항체, scFv, Fab, 또는 VHH 종이 야생형 항체, scFv, Fab, 또는 VHH 종의 에피토프와 상이한 신규한 에피토프에 특이적으로 결합하도록 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 보상적 돌연변이를 보유하도록 조작될 수 있다.
실시예 1
본원에 개시된 AlphaSeq 플랫폼 (예컨대, 실시예 2 및 또한 US 2017-0205421 A1 참조) 및 방법을 사용하여 예컨대, 다른 암들 중에서도 특히 흑색종, 폐암, 호지킨 림프종 치료를 위해 암 면역요법에서 사용되는 인간화 항체인 모노클로날 항체 펨브롤리주맙 (pembro)의 단쇄 가변 단편 (scFv)의 돌연변이체의 라이브러리에 대한, T 세포 및 프로-B 세포 상에서 발현된 세포 표면 수용체인 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1)의 돌연변이체의 라이브러리를 스크리닝하였다. pembro scFv 돌연변이체의 라이브러리는 폴리펩티드의 위치 30에서 위치 235까지 여러 도메인에 걸쳐 있는 33개 아미노산 잔기의 포괄적인 부위 포화 돌연변이유발 라이브러리를 포함하였다. PD-1 돌연변이체의 라이브러리는 폴리펩티드의 위치 5에서 위치 115까지 여러 도메인에 걸쳐 있는 60개의 아미노산 잔기의 포괄적인 부위 포화 돌연변이유발 라이브러리를 포함하였다. 라이브러리별 AlphaSeq 스크린을 통해 쌍별 방식으로 각 PD-1 돌연변이체 및 각 pembro scFv 돌연변이체 사이의 친화도를 질의할 수 있었다.
결과가 도 7에 제시된, 야생형 pembro scFv에 대한 PD-1 돌연변이체 라이브러리를 스크리닝하는 이전의 실험을 통해 PD-1 잔기 K54는 특히 아미노산 치환에 대해 불내성인 것으로 확인되었는데, 이는 상기 위치에서의 광범위한 아미노산 치환에 걸친 낮은 메이팅 빈도가 반영된 것이었다. PD-1과 pembro scFv 돌연변이체의 라이브러리별 스크린을 통해 두 단백질 결합 파트너의 보상적 돌연변이 쌍의 서브세트를 확인하였다. 보상적 돌연변이의 서브세트에 대한 결과는 도 16에 플롯팅되어 있다. 예를 들어, 야생형 pembro scFv와 PD-1 돌연변이체 K54F의 친화도는 두 단백질 결합 파트너의 야생형 대 야생형의 상호작용 대비 0.05였다 (n = 3; 표준 편차 = 0.03). 야생형 PD-1과 pembro scFv 돌연변이체 Y33P의 친화도는 두 단백질 결합 파트너의 야생형 대 야생형의 상호작용 대비 0.33이었다 (n = 3; 표준 편차 = 0.08). 그러나, pembro scFv 돌연변이체 Y33P와 PD-1 돌연변이체 K54F의 친화도는 두 단백질 결합 파트너의 야생형 대 야생형의 상호작용 대비 1.19였고 (n = 3; 표준 편차 = 0.38), 즉, 단백질 결합 파트너의 상기 두 돌연변이체의 상호작용은 야생형 대 야생형의 상호작용과 대략적으로 등가였고, 이는 두 단백질 결합 파트너의 보상적 돌연변이 쌍을 시사하는 것이다. 두 결합 파트너 사이의 친화도의 유사한 시그니처가 PD-1 돌연변이체 K54M 및 pembro scFv 돌연변이체 Y33P에 대하여 관찰되었다. 제3의 돌연변이체 단백질 결합 파트너 쌍의 경우, 야생형 pembro scFv와 PD-1 돌연변이체 K54I의 친화도는 두 단백질 결합 파트너의 야생형 대 야생형의 상호작용 대비 0.40이었고 (n = 3; 표준 편차 = 0.22), 야생형 PD-1과 pembro scFv 돌연변이체 Y101K의 친화도는 두 단백질 결합 파트너의 야생형 대 야생형의 상호작용 대비 1.06이었고 (n = 3; 표준 편차 = 0.18), 이는 pembro scFv 돌연변이체 Y101K가 친화도에는 어떤 영향도 미치치 않는다는 것을 시사한 것이다. 그러나, pembro scFv 돌연변이체 Y101K와 PD-1 돌연변이체 K54I의 친화도는 두 단백질 결합 파트너의 야생형 대 야생형의 상호작용 대비 1.87이었고 (n = 3; 표준 편차 = 0.35), 즉, 단백질 결합 파트너의 상기 두 돌연변이체의 상호작용은 야생형 대 야생형의 상호작용보다 실질적으로 더 높은 친화도를 가졌고, 이는 두 단백질 결합 파트너의 보상적 돌연변이 쌍을 시사하는 것이다. 본 실험에 의해 확인된 보상적 돌연변이는 항원/항체 계면에서 공간상 가깝게 위치하는 항원 및 항체의 아미노산 잔기에 상응한다.
실시예 2
단백질-단백질 상호작용 및 단백질 상호작용 네트워크를 스크리닝 및/또는 측정하기 위한 효모-메이팅 검정법 (AlphaSeq)의 구축.
유세포 분석 검정법을 이용하여 MATa, MAT알파 및 이배체 세포를 구별할 수 있다. 천연 효모 유성 응집소는 표면에 디스플레이된 결합제 (SAP)로 대체되었으며, 유세포 분석법을 이용하여 메이팅 효율을 측정하였다. 차세대 시퀀싱을 사용하여 대규모 라이브러리에서 특정 결합제 쌍의 메이팅 빈도를 평가할 수 있도록 이배체 염색체 전좌 시스템을 개발하여 단일 염색체 상의 두 결합제 모두의 유전자를 조합하였다.
단백질 라이브러리와 단일 표적 사이의 세포외 결합을 분석하기 위한 세포 기반 검정법이 다수 존재하지만, 단일 검정법에서 전체 단백질 상호작용 네트워크를 특징화하기 위한 무세포 접근법만이 개발되었다. 이는 네트워크에서 각 단백질 성분의 정제 및 라벨링을 포함하는 라이브러리 제조 단계가 시간 소모적이고 비용이 많이 드는 고가라는 것을 의미한다. 본 실시예는 효모 표면 디스플레이와 유성 응집을 조합하여 단백질 결합을 S. 세레비시아에(S. cerevisiae)의 메이팅과 연관시키는 단백질 상호작용의 라이브러리-온-라이브러리 특징화를 위한 쌍별 효모 표면 디스플레이 (PYSD) 검정법을 입증한다. 특히, 본 실시예는 천연 응집 단백질을 녹아웃시키고, 대신 MATa 및 MAT알파 효모 세포의 표면 상에 상보적인 결합 단백질 (합성 응집 단백질, SAP)을 디스플레이함으로써 유성 응집이 고도로 조작가능하다는 것을 입증한다. 본 실시예는 메이팅 효율이 표면 발현 단백질의 결합 친화도 및 발현 수준에 크게 의존한다는 것을 보여준다. 염색체 전좌 방식을 통해 차세대 시퀀싱으로 단백질-단백질 상호작용 네트워크를 분석할 수 있고, 조작된 두 단백질 상호작용 네트워크 분석에 적용될 수 있게 되었다.
결합 친화도 및 특이성, 둘 모두에 대한 단백질 상호작용 네트워크의 특징화는 세포 기능을 이해하고, 치료 후보물질을 스크리닝하고, 조작된 단백질 네트워크를 평가하는 데 중요하다. 예를 들어, 단백질 "인터엑톰" 맵핑은 생물학적 시스템 및 질환 상태에 대한 이해를 확장시켰고, 특정 단백질 상호작용의 적절한 매개 또는 파괴를 위한 치료 약물 후보물질을 평가하는 데 사용할 수 있다. 추가로, 합성 시스템의 구축은 종종 세포 거동을 적절하게 제어하기 위해 매우 특이적이고 오르토고날인 단백질 상호작용을 필요로 한다. 임의의 단백질 상호작용 네트워크의 구축을 허용하는 조작된 단백질 결합 도메인은 매우 복잡한 생물학적 시스템의 맥락에서 신중한 특징화를 필요로 한다.
단백질 라이브러리와 단일 단백질 표적 사이의 결합 분석을 위한 많은 접근법이 존재한다. 효모 표면 디스플레이 (YSD)는 부분적으로 라이브러리 구축의 용이성에 기인하여 널리 사용되고 있다. 그러나, 단백질 네트워크를 분석하기 위해서는 가능한 모든 단백질 쌍 사이의 결합을 스크리닝해야 한다. YSD는 가용성 형광 태그부착된 표적과의 인큐베이션 후 세포 형광을 보이는 결합을 측정하기 때문에, 이 접근법은 표적 단백질 라이브러리에 대한 스크리닝을 허용하지 않는다. 최근 개발된 접근법은 원-포트 라이브러리-온-라이브러리 특징화를 위해 DNA 바코드 단백질을 사용하지만, 네트워크의 각 구성 단백질을 정제해야 하기 때문에 대규모 네트워크 분석에 막대한 시간과 비용이 소비된다. 본 개시내용은 단일 포트에서 전체 단백질 상호작용 네트워크를 특징화할 수 있는 고처리량 검정법과 YSD 라이브러리 생성의 용이성을 조합하는 신규한 방법을 제공한다.
쌍별 효모 표면 디스플레이 (PYSD) 플랫폼은 일대일, 다수-대-일 또는 다수-대-다수 단백질 상호작용 특징화에 사용된다. 일대일 스크린의 경우, 하나는 형광 마커 (예컨대, mCherry)를 구성적으로 발현하는 MATa이고, 하나는 제2 형광 마커 (예컨대, mTurquoise)를 구성적으로 발현하는 MAT알파인 것인 두 동종 디스플레이어 균주는 각각 Aga2에의 융합물 (Aga2-myc)로서 그의 표면 상에 합성 접착 단백질 (SAP)을 발현한다. 이어서, 메이팅 검정법을 이용하여 상기 특정 SAP를 디스플레이하는 것이 메이팅 효율에 미치는 효과 (17시간 후 이배체 세포의 비율(%)로서 보고)를 결정한다. 반수체 및 이배체는 유세포 분석 검정법에서 그의 mCherry 및 mTurquoise 발현에 기초하여 구별된다. 각 SAP의 표면 발현 강도는 유세포 분석법 이전에 FITC 접합된 항-myc 항체와 함께 혼합 배양물을 배양함으로써 결정된다.
다수-대-일 또는 다수-대-다수 스크린의 경우, 두 동종 디스플레이어 균주 중 하나 또는 그들 모두는 디스플레이 라이브러리, 또는 각각 고유한 SAP를 발현하는 디스플레이어 세포의 라이브러리로 대체된다. 짧은 메이팅 기간 후, 세포를 오직 이배체 세포만을 선택하는 데 사용되는 리신 및 류신이 결여된 배지로 옮긴다. 다수-대-다수 스크린의 경우, 메이팅된 이배체에서 CRE 레콤비나제 발현을 유도하기 위해 β-에스트라디올 (βE) 또한 첨가한다. 레콤비나제 발현은 SAP 통합이 플랭킹된 lox66/lox71 부위에서 전좌를 일으키며, 그 결과로 SAP 유전자가 염색체 III의 하나의 카피 상에 병치된다. lox66/71 레콤비나제 부위 쌍의 편향된 성질 때문에 집단의 대다수는 이제 전좌된 이배체로 구성된다. 전좌 후, 세포 용해는 더 이상 특정 이배체 세포에서 SAP 쌍을 분리하지 않는다. 다수-대-일 및 다수-대-다수 스크린 둘 모두, 이배체 집단의 콜로니 PCR을 차세대 시퀀싱으로 분석하여 검정에 포함된 다른 모든 가능한 SAP 쌍과 비교하여 각 SAP 쌍의 메이팅 빈도를 결정한다.
물질 및 방법:
플라스미드 구축: 제1 실시예 (실시예 A)에 사용된 플라스미드는 표 1에 열거되어 있다. 각각의 구축물을 위해, 백본 및 인서트 단편을 PCR로 증폭시키고, 겔 추출하고, 깁슨(Gibson) 반응을 사용하여 플라스미드로 어셈블리하였다. 모든 부분 사이의 표준 링커는 클로닝의 효율성과 일관성을 증가시켰다. 높은 카피의 복제 기점 및 암피실린 내성으로 이루어진 모든 백본은 용이한 선형화 및 효모 염색체로의 통합을 위해 Pme1 제한 부위와 플랭킹시켰다. 모든 플라스미드는 표적 유전자좌의 상류 및 하류에 대략 500개의 염색체 상동성 염기를 포함한다. 녹아웃 (KO) 플라스미드는 상류 및 하류 염색체 상동성을 함유하지만, 유전자 카세트는 함유하지 않는다. 각 프로모터, 오픈 리딩 프레임, 터미네이터 및 염색체 상동성의 서열을 생어(Sanger) 시퀀싱으로 검증하였다.
표 1. 실시예 A에서 사용된 플라스미드
Figure pct00001
효모 균주 구축 및 성장 조건: 제2 실시예 (실시예 B)에 사용된 S. 세레비시아에 균주는 표 2에 열거되어 있다. EBY100a 및 W303αMOD를 초기 모체 균주로 사용하였다. EBY100α는 상기 두 모체 균주의 메이팅 후 포자 형성 및 적절한 선별가능한 마커에 대한 사분 스크리닝을 통해 생성하였다. 다른 모든 균주는 주어진 플라스미드를 Pme1 제한 분해로 선형화하고 표준 LiAc 형질전환 절차를 수행하여 염색체 통합으로 구축하였다. 주어진 영양요구성 마커가 결핍된 배지 또는 진핵 항생제가 보충된 배지를 사용하여 형질전환체의 선별을 수행하였다. 적절한 유전자좌로의 통합을 확인하기 위해 각각의 형질전환 후에 진단 콜로니 PCR을 수행하였다. 모든 효모 검정법은 30℃에서 표준 효모 배양 배지 및 성장을 사용한다. 모든 액체 배양 성장은 3 mL의 YPD 액체 배지에서 275 RPM에서의 진탕하에 수행된다.
표 2. 실시예 B에 사용된 효모 균주
Figure pct00002
Figure pct00003
메이팅 검정: 액체 배양물 중에서 임의의 두 효모 균주 사이의 메이팅 효율을 평가하기 위해, 반수체 균주를 처음에 신선한 YPD 플레이트 상의 동종 콜로니로부터 포화될 때까지, 또는 대략 18시간 동안 성장시켰다. 이어서, MATa 균주 밀도가 100개의 세포/㎕이고, MATα 균주 밀도가 600개의 세포/㎕가 되도록 각각의 반수체를 신선한 3 mL YPD 액체 배양물 중에서 조합하였다. 시작 농도의 이러한 차이는 메이팅 인자에 대하여 관찰된 불균일한 성장 반응에 대한 조정이었다. 세포를 또한 그의 표면 발현 강도를 개별적으로 평가하기 위해 신선한 YPD 중에서 각각 별개로 성장시켰다. 17시간의 성장 후, 2.5 ㎕의 메이팅 배양물을 1 mL의 분자 등급 물에 첨가하고, 유세포 분석기에서 판독하였다. MATa, MATalpha 및 이배체 세포를 mCherry 및 mTurquoise의 형광 강도에 기초하여 구별하였다. 본원에 기술된 실험을 위해, 밀테니(Miltenyi) MACSQUANT® VYB를 사용하였다. Y2 채널 (561 nm 여기 레이저 및 615 nm 방출 필터)을 사용하여 mCherry 발현을 측정하고, V1 채널 (405 nm 여기 레이저 및 450 nm 방출 필터)을 사용하여 mTurquoise 발현을 측정하였다. 17시간 후 전체 세포 집단 대비 비율(%)로서의 이배체 세포 집단을 메이팅 효율의 척도로서 사용하였다. 표면 발현 강도는 1 mL의 물로 세척한 후 PBSF에서 FITC 접합된 항-myc 항체와 함께 15분 동안 각각 개별적으로 성장한 세포주 10 ㎕를 인큐베이션시켜 측정하였다. 이어서, 세포를 다시 세척하고, 1 mL의 물 중에 재현탁시켰다. 이어서, 유세포 분석법을 수행하였다. 표면 발현 강도를 측정하기 위해, ACCURI™ C6 세포측정기를 사용하였다. FL1.A 채널 (488 nm 여기 레이저 및 533 nm 방출 필터)을 사용하여 세포에 대한 FITC 결합을 측정하였다. FLOWJO™는 모든 세포측정 분석에 사용된다.
일대다 배치 메이팅 검정을 위해, Aga2에 융합된 단일 SAP를 발현하는 재조합 MATa 효모 균주를 신선한 3 mL YPD 배양물 중에서 Aga2에 융합된 별개의 SAP를 발현하는 다수의 재조합 MAT알파 효모 균주와 함께 조합한다. MATa 균주를 100개 세포/㎕의 밀도로 첨가하고, MAT알파 균주는 600개 세포/㎕의 총 밀도에 대해 동일한 농도로 첨가한다. 6시간 성장 후, 히그로마이신을 100 ng/㎕로 첨가한다. 초기 배양 접종 20시간 후, 1 mL의 세포를 펠릿화한다. 2 ㎕의 세포를 펠릿으로부터 제거하고, 0.2% SDS로 용해시키고, 스핀 다운시켜 모든 세포 파편을 제거하고, 물에 희석시킨다. 이어서, 용해물을 차세대 시퀀싱을 위한 오버행을 포함하는 표준 프라이머와 함께 PCR의 주형으로 사용하고, 대략 350개의 염기인 것으로 예측되는 PCR 생성물을 겔 슬라이스로부터 정제한다. 이어서, 단일 판독 차세대 시퀀싱을 수행한다. 특정 바코드가 전체 리드 개수 대비로 관찰되는 빈도는 상기 특정 바코드와 연관된 SAP로 인해 발생한 메이팅 수에 대한 상대적인 척도를 제공한다.
다수-대-다수 (실시예 6 또한 참조) 배치 메이팅 검정을 위해, 각 메이팅 타입의 다수의 반수체 효모 균주를 신선한 3 mL YPD 배양물에서 조합한다. 재조합 MATa 효모 균주를 100개의 세포/㎕의 총 밀도에 대해 동일한 농도로 첨가하고, 재조합 MAT알파 효모 균주는 600개 세포/㎕의 총 밀도에 대해 동일한 농도로 첨가한다. 6시간 성장 후, 히그로마이신을 100 ng/㎕로 첨가하고, β-에스트라디올 (βE)을 200 ng/㎕로 첨가한다. 초기 배양 접종 20시간 후, 1 mL의 세포를 펠릿화한다. 2 ㎕의 세포를 펠릿으로부터 제거하고, 0.2% SDS로 용해시키고, 스핀 다운시켜 모든 세포 파편을 제거하고, 물에 희석시킨다. 이어서, 용해물을 차세대 시퀀싱을 위한 오버행을 포함하는 표준 프라이머와 함께 PCR의 주형으로 사용하고, 650개의 염기인 것으로 예측되는 PCR 생성물을 겔 슬라이스로부터 정제한다. 이어서, 페어드 엔드(paired-end) 차세대 시퀀싱을 수행한다. 특정 바코드 쌍이 전체 리드 개수 대비로 관찰되는 빈도는 상기 두 특정 바코드와 연관된 SAP 쌍으로 인해 발생한 메이팅 수에 대한 상대적인 척도를 제공한다.
결과
필수 유성 응집소 단백질이 결여된 S. 세레비시아에 반수체 세포의 경우, 액체 배양물 중에서 응집 및 메이팅의 회복을 위한 결합은 충분하다. 1차 MAT알파 유성 응집소 단백질인 Sag1은 응집에 필수적이다. Sag1이 녹아웃되면, MAT알파 세포는 난류 액체 배양물에서 야생형 MATa 세포와 메이팅할 수 없다. 그러나, 상보적인 SAP가 디스플레이 쌍에서 발현되면, 메이팅은 회복된다. 비상보적인 SAP는 메이팅을 회복할 수 없다.
임의의 두 디스플레이 세포 사이의 메이팅 이벤트의 빈도는 그의 SAP 쌍 사이의 결합 친화도 및 각 SAP의 표면 발현 강도에 의존한다. 결과는 결합 친화도와 관찰된 메이팅 효율이 양의 상관관계가 있다는 것을 입증한다. 그러나, 각 SAP의 발현 수준에 대한 메이팅 효율을 조정하여 상관관계를 개선시킬 수 있다.
친화도가 공지된 7개의 SAP 쌍을 메이팅 효율에 대해 평가하였다 (표 3 참조). 각 쌍의 메이팅 효율을 4회 시험하고, 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 각 반수체 디스플레이 균주의 표면 발현 강도 (SES) 또한 물질 및 방법에 기술된 바와 같이 측정하였다. 표면 발현 강도의 차이에 대한 메이팅 효율을 조정하는 "메이팅 점수"는 평균 메이팅 효율을 두 반수체 디스플레이어 균주 모두의 표면 발현 강도의 곱으로 나누어 계산하였다.
표 3: 메이팅 효율에 대해 평가된, 친화도가 공지된 SAP 쌍의 결과.
Figure pct00004
배치 메이팅으로부터 단일 검정법에서 다수의 단백질 간의 상대적인 상호작용 강도를 결정할 수 있다. 각 SAP를 바코딩함으로써 다수-대-일 스크린은 단일 판독 차세대 시퀀싱을 사용하여 특정 SAP 및 SAP 라이브러리 간의 상대적 메이팅 빈도를 평가할 수 있다. CRE 레콤비나제 기반 전좌 방식을 사용하여 각 메이팅 타입의 바코드를 동일한 염색체에 병치할 수 있다. 이 염색체 전좌 절차를 추가함에 따라 페어드 엔드 차세대 시퀀싱을 사용하여 두 SAP 라이브러리 간의 상대적 메이팅 빈도를 평가할 수 있다. 이 접근법을 통해 임의의 단백질 상호작용 토폴로지를 분석할 수 있다.
더 많은 SAP 쌍으로 추가의 메이팅 검정법을 수행하고, SAP 쌍의 모든 측정된 친화도를 사용하면 각 SAP의 표면 발현 강도 및 메이팅 효율을 제공할 수 있다. 결합 친화도, 각 SAP의 표면 발현 강도 및 메이팅 효율 사이의 관계를 결정하기 위해 통계 분석을 수행할 수 있다. 결과는 결합 친화도의 추정치를 제공하고, 검출 가능한 메이팅 효율의 회복을 위한 임계값을 결정하기 위해 메이팅 효율 및 표면 발현 강도를 측정하는 데 사용될 수 있도록 상기 4가지 변수 사이의 예측 관계를 결정하는 데 사용될 수 있다.
실시예 2는 단일 검정법에서 단백질 상호작용의 라이브러리-온-라이브러리 특징화를 가능하게 하는 쌍별 효모 표면 디스플레이 검정을 입증한다. 천연 S. 세레비시아에 유성 응집소 단백질을 합성 접착 단백질로 대체함으로써 메이팅 효율 및 단백질 결합 강도를 커플링할 수 있다. 이어서, 상기 접근법을 사용하여 두 특정 단백질 간의 결합을 평가하거나, 단백질 라이브러리 간의 상대적인 상호작용 강도를 결정할 수 있다.
특정 실시양태가 설명되었지만, 이들 실시양태는 단지 예로서 제공된 것이며, 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 실제로, 본원에 기술된 신규 방법, 장치 및 시스템은 다양한 다른 형태로 구현될 수 있고; 추가로, 본 개시내용의 정신으로부터 벗어남 없이, 본원에 기술된 방법, 장치 및 시스템의 형태에서 다양하게 생략, 치환 및 변경될 수 있다. 첨부된 청구범위 및 그 등가물은 본 개시내용의 범주 및 정신 내에 포함되는 상기와 같은 형태 또는 변형을 포함하도록 의도된다.

Claims (21)

  1. 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리를 제공하는 단계로서, 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 제1 야생형 폴리펩티드 및 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계;
    제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리를 제공하는 단계로서, 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리는 제2 야생형 폴리펩티드 및 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계;
    제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너와 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너 사이의 관찰된 친화도 값을 측정하는 단계; 및
    제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너와 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너 사이의 각 관찰된 친화도 값에 기초하여,
    (i) 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드, 및
    (ii) 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드를 포함하는 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍을 확인하는 단계로서,
    여기서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍의 각 쌍의 관찰된 친화도 값은 단백질 결합 파트너의 각 쌍 사이의 각 예측된 친화도 값과 실질적으로 상이하고,
    여기서, 주어진 단백질 결합 파트너 쌍에 대한 예측된 친화도 값은
    a) 주어진 쌍의 제1 야생형 폴리펩티드와 주어진 쌍의 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값, 및
    b) 주어진 쌍의 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 주어진 쌍의 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값에 기초하여 계산되는 것인 단계를 포함하는,
    두 단백질 결합 파트너 사이의 보상적 돌연변이를 확인하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너가 제1 복수의 효모 세포 중 하나의 표면 상에서 발현되고, 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너가 제2 복수의 효모 세포 중 하나의 표면 상에서 발현되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 제1 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너와 제2 단백질 결합 파트너의 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너 사이의 관찰된 친화도 값이 제1 복수의 효모 세포와 제2 복수의 효모 세포 사이의 합성 응집에 의해 측정되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너가 항체, scFv, Fab, 또는 VHH 종인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너가 항원 종인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너가 수용체 종인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너가 리간드 종인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 각각 및 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 각각이 사용자 지정 돌연변이유발에 의해 생성되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍의 각 쌍에 대한 관찰된 친화도 값이 단백질 결합 파트너 쌍의 예측된 친화도 값보다 실질적으로 더 높은 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍의 각 쌍에 대한 관찰된 친화도 값이 단백질 결합 파트너 쌍의 예측된 친화도 값보다 2배 초과만큼 더 높은 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍의 각 쌍에 대한 관찰된 친화도 값이 단백질 결합 파트너 쌍의 예측된 친화도 값보다 실질적으로 더 낮은 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍의 각 쌍에 대한 관찰된 친화도 값이 단백질 결합 파트너 쌍의 예측된 친화도 값보다 2배 초과만큼 더 낮은 것인 방법.
  13. 단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리를 제공하는 단계로서, 단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리는 제1 야생형 폴리펩티드 및 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계;
    단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리를 제공하는 단계로서, 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리는 제2 야생형 폴리펩티드 및 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계;
    단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너와 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너 사이의 관찰된 친화도 값을 측정하는 단계;
    단백질 결합 파트너의 제1 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너와 단백질 결합 파트너의 제2 라이브러리의 각 단백질 결합 파트너 사이의 관찰된 친화도 값에 기초하여, 그의 각 관찰된 친화도 값이 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값과 실질적으로 상이한 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍을 확인하는 단계를 포함하는,
    두 단백질 결합 파트너 사이의 보상적 돌연변이를 확인하기 위한 방법.
  14. 제13항에 있어서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍이 하기 조건을 충족시키는 것인 방법:
    a. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값보다 실질적으로 더 낮음;
    b. 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값보다 실질적으로 더 낮음; 및
    c. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값과 실질적으로 동일하거나, 또는 그보다 실질적으로 더 높음.
  15. 제13항에 있어서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍이 하기 조건을 충족시키는 것인 방법:
    a. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값과 실질적으로 동일하거나, 또는 그보다 실질적으로 더 높음;
    b. 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값보다 실질적으로 더 낮음; 및
    c. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값과 실질적으로 동일함.
  16. 제13항에 있어서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍이 하기 조건을 충족시키는 것인 방법:
    a. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값보다 실질적으로 더 낮음;
    b. 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값과 실질적으로 동일하거나, 또는 그보다 실질적으로 더 높음; 및
    c. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값과 실질적으로 동일하거나, 또는 그보다 실질적으로 더 높음.
  17. 제13항에 있어서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍이 하기 조건을 충족시키는 것인 방법:
    a. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값과 실질적으로 동일하거나, 또는 그보다 실질적으로 더 높음;
    b. 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값과 실질적으로 동일하거나, 또는 그보다 실질적으로 더 높음; 및
    c. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 복수의 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값보다 실질적으로 더 낮음.
  18. 제13항에 있어서, 하나 이상의 단백질 결합 파트너 쌍이 하기 조건을 충족시키는 것인 방법:
    a. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값, 또는 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값보다 실질적으로 더 낮음;
    b. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값은 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 야생형 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값, 또는 제1 야생형 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 관찰된 친화도 값보다 실질적으로 더 높음.
  19. 제5항에 있어서, 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드의 돌연변이가 항체, scFv, Fab, 또는 VHH 종의 파라토프를 정의하고/거나, 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드의 돌연변이가 항원 종의 에피토프를 정의하는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드의 돌연변이 및 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드의 돌연변이가 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 오르토고날 결합 관계를 발생시키며, 이에 따라
    a. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드는 제2 야생형 폴리펩티드 및 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드에 결합하고,
    b. 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드는 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드에는 결합하지만, 제2 야생형 폴리펩티드에는 결합하지 않는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드의 돌연변이 및 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드의 돌연변이가 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드와 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드 사이의 오르토고날 결합 관계를 발생시키며, 이에 따라
    a. 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드는 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드에는 결합하지만, 제2 야생형 폴리펩티드에는 결합하지 않고,
    b. 제2 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드는 제1 복수의 돌연변이체 폴리펩티드 중 하나의 폴리펩티드에는 결합하지만, 제1 야생형 폴리펩티드에는 결합하지 않는 것인 방법.
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