KR20230008741A - 폐 섬유증 치료를 위한 miR-21 억제제의 대식세포로의 표적 전달 - Google Patents

폐 섬유증 치료를 위한 miR-21 억제제의 대식세포로의 표적 전달 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대상체의 폐 섬유증의 치료용 조성물에 관한 것으로, 조성물은 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함한다. 또한, 조성물은 폐 투여에 의해 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 치료될 상기 대상체는 폐 섬유증을 앓고 있으며 폐 질환 또는 장애를 추가로 가지며, 폐 질환 또는 장애는 코로나 바이러스 질환일 수 있다. 또한, 본 발명은 조성물에 관한 것으로, 여기서 조성물은 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 폐 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함한다.

Description

폐 섬유증 치료를 위한 miR-21 억제제의 대식세포로의 표적 전달
본 발명은 대상체의 폐 섬유증의 치료용 조성물에 관한 것으로, 여기서 조성물은 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함한다. 또한, 조성물은 폐 투여에 의해 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 상기 투여될 대상체는 폐 섬유증을 앓고 있으며, 폐 질환 또는 장애를 추가로 가지며, 폐 질환 또는 장애는 코로나 바이러스 질환일 수 있다. 또한, 본 발명은 조성물에 관한 것으로, 조성물은 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 폐 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함한다.
기관 섬유증, 예를 들어 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)의 치료에 대한 요구가 높다. 폐 섬유증과 관련하여 COVID-19와 같은 코로나 바이러스 감염과 같은 바이러스 감염은 종종 폐의 석화 및 섬유증으로 이어진다(Xu et al., 2020). 폐 섬유증은 폐 기능을 심각하게 손상시키며 현재의 치료 및 치료 요법으로는 대부분 치료할 수 없다(Sgalla et al., 2018). 따라서, 폐 섬유증에 관여하는 대체 메커니즘 및 분자를 표적으로 하는 새로운 치료 전략이 시급히 필요하다.
또한, 섬유증은 심장 질환 또는 장애와 같은 추가 질환의 병리학에서 더 중요한 역할을 한다. 심근경색 후 급성 생존율은 지난 수십 년 동안 상당히 개선되었지만(Bahit et al., 2018), 허혈성 심부전(HF)은 매우 빈번한(약 50%) 결과로 남아 있으며 입원 및 사망의 가장 흔한 원인 중 하나를 구성한다(Bahit et al., 2018). HF의 현재 의학적 관리는 주로 혈관 확장제와 신경 체액 활성화 억제제에 의존하지만, 이러한 치료 원리의 임상적 효능은 임상적 이점에서의 추가 증가가 점점 더 달성하기 어려운 수준에 도달했다고 제안되었다(Pellicori et al., 2019). 여전히, HF 병리와 관련된 대체 메커니즘 및 분자를 표적으로 하는 새로운 치료 전략이 시급히 필요하다.
마이크로리보핵산(MiRNA 또는 miR)은 대부분의 단백질을 인코딩하는 mRNA의 3'-비번역 영역에서 안티센스 상보적 영역에 결합하는 대략 20-22개의 뉴클레오티드 길이의 RNA 분자이다(Bartel, 2018). 지금까지 조사된 거의 모든 세포성 과정에서의 중추적인 역할에 이어, 그들은 암, 면역 및 심혈관 질환을 포함하여 점점 증가하는 질병 단위 목록에서 중요한 조절자이다(Mendell & Olson, 2012).
현재까지 miR-21 억제제, 특히 올리고뉴클레오티드 기반 치료법의 임상 개발을 방해한 주요 장애물은 이러한 분자가 전신 전달 시 세포에 들어가는 범위가 상대적으로 낮다는 것이다. 일관되게, 선행 기술은 2 - 80 mg/kg 체중 범위의 비교적 고용량의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것을 제안한다. 이러한 용량은 경제적인 이유와 높은 물질 부하로 예상할 수 있는 부작용으로 인해 인간에게 적용할 수 없다(Li & Rana, 2014; Lu & Thum, 2019).
Adam (2012); Basic Research in Cardiology 107(5): 278 Altshuler (2010); Biochemistry (Moscow) 75(13): 1584-1605 Bahit (2018); JACC: Heart Failure 6(3): 179-186 Bartel (2018); Cell 173(1):, 20-51 Bashore (2012); Journal of the American College of Cardiology 59(24): 2221-2305. Bosson (2016); Mol Cell 56(3): 347-359 Brennan (1985); Science 229(4708): 81-83 Brown (2007); Nature Biotechnology 25(12): 1457-1467 Cardin (2012); Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology 5(5): 1027-1035 Carter (1992); Bio/Technology 10(2): 163-167 Cole (1985); Journal of Immunological Methods 78(2): 271-278 Harlow (1988); Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Harlow (1999); Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press Hinkel (2012); Circulation 128(10): 1066-1075 Hollinger (2005); Nature Biotechnology 23: 1126-1136 Jones (1986); Nature 321(6069): 522-525 Juliano (2016); Nucleic Acids Research, 44(14) Khvorova (2017); Nature Biotechnology 35: 238-248 Kohler (1975); Nature, 256(5517), 495-497 Kozbor (1983); Immunol Today 4(3): 72-79 Li (2014); Nature Reviews Drug Discovery, 13(8), 622-638 Lu (2019); Nature Reviews Cardiology 16: 661-674 Martinez-Pomares (2012); J. Leukoc. Biol. 92: 1177-1186 Mendell (2012); Cell 148(6): 1172-1187 Milstein 1983); Nature, 305(5934), 537-540 Morimoto (1992); J Biol Chem 267(31): 21987-21990 Patrick (2010); Journal of Clinical Investigation, 120(11), 3912-3916 Pellicori (2019); Heart Failure Review 25: 147-159 Potere (2019); Front Cardiovasc Med 2019 Apr 26;6:51 Presta (1992); Current Opinion in Biotechnology 3(4): 394-398 Ramanujam (2016); Molecular Therapy 24(11): 1939-1948 Ramilowski (2015); Nat. Commun. 6(1): 7866 Riechmann (1988); Nature, 332(6162), 323-327 Rupaimoole (2017); Nature Reviews Drug Discovery　16: 203-222 Sambrook (2001); Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. Sayed (2010); Journal of Biological Chemistry, 285(26), 20281-20290 Sgalla (2018); Respiratory Research, 19(1), 1-18 Shalaby (1992); The Journal of Experimental Medicine, 175(1), 217-225 Skelly (2018); Cell Reports, 22(3), 600-610 Sood (2006); Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(8), 2746-2751 Stenvang (2012); Silence 3(1): 1 Stephens (2017); Biostatistics 18, 275-294 Thum (2008); Nature 456: 980-984 Tutt (1991); Journal of Immunology 147(1): 60-69 Wessels (2019); Nature Communications 10(1): 1626 Xu (2020); Journal of Infection 80: 394-400 Yang (2019); ACS Nano 13: 1029-1041 Yona (2013); Immunity 38(1): 79-91
따라서, 근본적인 기술적 문제는 폐 섬유증의 개선된 치료법을 제공하는 것이다.
기술적인 문제는 아래 본 명세서에서 제공된 구체예의 제공에 의해 그리고 첨부된 청구범위에서 특징지어지는 바와 같이 해결된다.
특히, 그리고 첨부된 실시예에서 문서화된 바와 같이, 놀랍게도 miR-21 억제가 질병에 걸리거나 및/또는 손상된 폐에서 폐 리모델링 및/또는 기능장애를 감소시킨다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명은 폐 질환, 폐 손상 및/또는 폐 장애의 치료 및/또는 개선에 있어서의 miR-21 억제제의 의학적 및/또는 약학적 용도에 관한 것이다. 상기 폐 질환, 상기 폐 손상 및/또는 상기 폐 장애는 폐 섬유증의 원인일 수 있고 및/또는 폐 섬유증을 동반할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 폐 섬유증의 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "조성물"은 또한 화합물을 포함하되, 상기 "화합물"은 적어도 2개의 기능적 모이어티/부분, 즉, (a) miR-21 억제제인 기능적 모이어티/부분 및 (b) 상기 miR-21 억제제를 상기 대식세포에 전달하는 기능적 모이어티/부분을 갖는 단일 분자일 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 조성물 및 화합물은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 따라서, 그리고 한 구체예에서, 상기 miR-21 억제제를 포함하고 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 상기 모이어티를 포함하는 상기 조성물은 단일 분자일 수 있으며, 즉, 상기 "억제제" 및 대식세포(들)에 대한 상기 "표적화 모이어티"는 예를 들어 공유 결합, 컨쥬게이트 등에 의해 물리적으로 연결될 수 있다. 이러한 화합물/분자는 또한 "miR21 억제제" 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 연결하는 "링커" 구조를 포함할 수 있다. 상응하는 예시된 비제한적인 링커는 본 명세서에 제공된다. 또한, 본 발명의 조성물/화합물은 예를 들어, 추가의 모이어티들/부분들, 예컨대, 아래 본 명세서에 정의되고, 다른 표적 세포들, 특히(및 한 구체예에서) 섬유아세포에 miR-21 억제제를 표적화할 수 있는 모이어티/부분을 포함하는 것으로 구상된다.
따라서, 특정 구체예에서, 본 발명은 또한 조성물/화합물에 관한 것으로, 상기 조성물/화합물은 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 바람직하게는 폐 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함한다. 본 발명의 추가 구체예는 조성물/화합물이며, 상기 조성물/화합물은 miR-21 억제제, 상기 miR-21 억제제를 (폐) 대식세포에 전달하는 모이어티 및 상기 miR-21 억제제를 섬유아세포, 바람직하게는 폐 섬유아세포에 전달하는 추가의 모이어티를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 용어 "miR-21 억제제를 ...에 전달한다"는 "상기 miR-21 억제제가 ...을 표적으로 한다"을 의미한다. 이러한 "모이어티"의 상응하는 비-제한적 예시는 본 명세서에서 하기에 제공되고 또한 첨부된 비-제한적 실시예들에서 예시된다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 본 발명의 의학적 수단 및 방법들에 사용되는 조성물/화합물은 상기 miR-21 억제제가 상기 miR-21 억제제를 대식세포(들) 및/또는 섬유아세포(들)에 전달하는 상기 모이어티/모이어티들에 컨쥬게이트되는 조성물/화합물인 것으로 이해된다. 따라서, 용어 "화합물" 및 "조성물"은 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 화합물/조성물은 상기 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포 및/또는 섬유아세포에 전달하는 모이어티를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 miR-21 억제제 및 그 억제제를 대식세포 및/또는 섬유아세포에 전달하는 상기 모이어티는 컨쥬게이트/공유결합된다.
본 명세서에 상세히 기재된 바와 같이, miR-21 억제제는 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 그러나 제한적으로, 상기 miR-21 억제제는 대식세포 상의 (특이적) 세포 표면 수용체(들)과 바람직하게는 결합/상호작용하는 항체 또는 이의 기능적 단편에 컨쥬게이트될 수 있다. miR-21 억제제는 또한 본 발명의 맥락에서 세포 유형-특이적 표적화 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있다. 첨부된 실시예에서 본 명세서에 또한 구상되고 도시된 바와 같이, miR-21 억제제는 상기 세포 표면 마커/수용체의 "리간드"에 컨쥬게이트될 수 있다. 이러한 세포 마커/수용체의 비-제한적인 예시는 본 명세서의 표 3에 제공되어 있다. 이러한 "리간드"는 저분자 리간드 및/또는 (단백질성) 리간드 또는 상응하는 원하는 표적 세포 상의 상응하는 "수용체"와 상호작용할 수 있는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다. 이러한 "리간드-수용체" 상호작용의 예가 본 명세서에서 사용될 수 있고 "만노스"의 예시된 상호작용("저분자 리간드"와 표적 대식세포 상의 MRCI1의 예)일 수 있다. 단백질성 리간드의 예는 MRC1에 대한 상호작용 펩타이드, 즉 대식세포 상의 세포 표면 수용체인 하기 기재된 바와 같은 펩타이드 CSPGAKVRC(SEQ ID NO: 6)일 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 맥락에서 miR-21이 폐 및 심장 조직의 특정 세포 유형에서, 특히 심장 질환 또는 장애, 또는 폐 질환 또는 장애와 같은 병리학적 상태 하에서 강하게 발현되는 miRNA임을 발견하였다.
특히 그리고 선행 기술에 기초하여, 본 발명자들은 심근 또는 폐로의 전달이 어렵고 따라서 miRNA 기반 치료법의 사용을 방해한다고 생각하였다. 따라서, 본 발명자들은 이 불확실한 과학 및 의학 분야에서 대식세포 및/또는 섬유아세포, 특히 폐포 대식세포 및/또는 간질 대식세포와 같이 심장 및/또는 폐에 존재하는 대식세포 및/또는 섬유아세포에 대한 (항-) miRNA 기반 의학적 개입의 적용 가능성 및 치료적 효능을 설명하였다. 따라서, 폐포 대식세포(들) 및/또는 간질 대식세포(들)과 같이 폐 조직에 존재 및/또는 발견되는 이러한 대식세포는 본 발명의 맥락에서 "폐(lung) 대식세포(들)"이다. 용어 "폐(lung) 대식세포(들)"은 "폐(pulmonary) 대식세포"라는 용어도 포함한다. 실험 부분에서 예시된 바와 같이, 본 발명자들은 또한 폐(pulmonary) 대식세포의 표면 수용체/표면 마커를 설명하였다. "폐(lung) 대식세포"에 특이적인 이러한 수용체/마커는 예를 들어 mannose receptor C type 1(MRC1; ENSG00000260314), macrophage receptor with collagenous structure(MARCO; ENSG00000019169), CD68 antigen(CD68; ENSG00000129226), adhesion G protein-coupled receptor E1(ADGRE1; ENSG00000174837), C-C motif chemokine receptor 2(transient)(CCR2; ENSG00000121807), integrin subunit alpha M(ITGAM; ENSG00000169896) 및 Fc receptor, IgG, high affinity(FCGR1A; ENSG00000150337)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
폐포 대식세포에 특이적인 마커는 sialic acid binding Ig like lectin 1(SIGLEC1; ENSG00000088827) 및 macrophage receptor with collagenous structure(MARCO; ENSG00000019169) 수 있다. 간질 대식세포에 특이적인 마커는 CD163 분자(CD163; ENSG00000177575)일 수 있다. 섬유아세포에 특이적인 수용체/마커는 예를 들어 platelet derived growth factor receptor(PDGFRA; ENSG00000134853), transcription factor 21(TCF21; ENSG00000118526), periostin(POSTN; ENSG00000133110) 및 actin alpha 2(ACTA2; ENSG00000107796)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 맥락에서 특히 유용한 대식세포 표면의 수용체/마커는 또한 ENS 형식(Ensembl Gene ID)의 안정한 식별자에 의해 하기에 제공되고 식별된다. 표 3 또한 참조할 것. 표 3은 또한 본 발명의 맥락에서 본 명세서에서 정의된 "miR-21 억제제를 대식세포(들)(및 선택적으로 섬유아세포(들)에도)에 전달하는 모이어티"에 대한 상호작용 파트너로서 특히 유용한 대식세포 및/또는 섬유아세포에 대한 수용체/마커를 추가로 포함한다. 상기 인용된 "마커"는 각각 대식세포 및/또는 섬유아세포에서 주로 발현되는 마커에 관한 반면, 본 명세서에 정의된 "miR-21 억제제를 대식세포(및/또는 섬유아세포)에 전달하는 모이어티"에 대한 가장 바람직한 "표적"은 이들 세포 상의 세포의 표면 마커/수용체이다. 바람직한 구체예에서, 이들 표면 마커/수용체는 상기 "miR-21 억제제를 전달하는 모이어티"와 상호작용시 엔도사이토시스를 매개한다.
따라서, miR-21 억제제를 대식세포(및 선택적으로 섬유아세포)에 전달하는 상기 모이어티/부분은 특히 상기 수용체/마커와 특이적으로 상호작용할 수 있는 리간드(예를 들어, 저분자 리간드 또는 단백질성 리간드)를 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명의 맥락에서 "miR-21 억제제"는 상기 수용체/마커와 (특이적으로) 상호작용할 수 있는 (특이적) 결합 분자를 통해 상기 대식세포, 바람직하게는 폐 대식세포에 전달되는 것으로 또한 구상된다. 이러한 결합 분자는 예를 들어 특이적 항체(상기 수용체/마커에 포함된 항원에 대한 결합) 및 이의 기능적 단편을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 가장 바람직하게는, 상기 수용체/마커는 상기 대식세포(및/또는 섬유아세포) 상의 세포 표면 수용체이다. 하기 및 첨부된 실시예에 예시된 바와 같이, 본 발명의 맥락에서 유용한 "수용체/마커"는 MRC 1 유전자에 의해 인코딩되고 대식세포의 표면에서 주로 발현되는 막 수용체인 만노스 수용체 C 유형 1(Mannose receptor C type 1)일 수 있다. 그리고 그것은 대식세포에 의한 당단백질의 엔도사이토시스를 매개한다. 만노스 수용체 C 유형 1(Mannose receptor C type 1)은 바람직하게는 당 구조, 특히 (고-)만노스 구조에 결합하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 그리고 본 발명의 맥락에서, "miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티"는 만노스 수용체 C 유형 1(Mannose receptor C type 1)과 상호작용하는 리간드일 수 있다. 이러한 리간드는 당 분자 또는 이의 유도체, 예를 들어 만노스(본 명세서 아래에서는 또한 분지형 트리-만노스 구조), 디만노실만노스 또는 갈락토스의 아미노 당 유도체(GalNAc; N-아세틸갈락토사민)와 같은 저분자일 수 있다. 첨부된 실시예에서 문서화된 바와 같이, 본 발명자들은 miR-21 억제제(anti-miR-21)를 만노스 구조(여기서, 예를 들어 트리-만노스)를 통해 뿐만 아니라 "miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티"으로서 GalNAc를 통해 (폐(lung)) 대식세포에 (특히 흡입을 통해) 성공적으로 전달할 수 있었다.
본 발명자들은 놀랍게도 miR-21이 폐(lung) 대식세포에서 가장 풍부하고 풍부한 microRNA임을 발견하였다; 예시된 바와 같이 및 예를 들어, 특히 실시예 3 및 5에서. 특히, miR-21이 폐 폐포 대식세포에서 발현되는 모든 miR의 대략 20%를 포함하는 miR의 가장 풍부한 분획을 나타낸다; 예를 들어 첨부된 도 12 B 참조. 따라서 miR-21은 폐 대식세포에서 가장 풍부한 miR이다. 이러한 높은 수준은 모든 miRNA 판독의 10% 이상이 miR-21에 기인할 수 있는 폐 간질 대식세포에서도 발견되었다. 따라서, 대식세포, 특히 폐(lung) 대식세포는 본 명세서에 제공된 의학적 개입/치료의 수단 및 방법에서 표적 세포로 사용된다. 본 명세서에서 또한 아래에 예시된 바와 같이, 놀랍게도 본 발명의 맥락에서 miR-21이 폐 섬유증과 같은 구조적 손상을 나타내는 인간 폐 조직에서 극적으로 증가된다는 것이 또한 발견되었다. 이러한 맥락에서, 예를 들어 miR-21은 COVID-19 희생자의 폐에서 가장 많이 상향조절된 miRNA 중 하나인 것으로 밝혀졌다. 이론에 얽매이지 않고, 본 발명의 맥락에서 그리고 본 명세서에 제공된 과학적 증거에 기초하여, 예를 들어 그리고 특히 SARS-CoV-2/COVID-19에 의한 폐(lung) 손상과 함께 감염에 의해 유발된 폐(pulmonary) 손상과 같이 감염에서 관찰되는 폐(lung) 손상의 병태생리학에서 폐(pulmonary) 대식세포의 miR-21이 중요한 역할을 한다는 것이다. 이러한 과학적 증거에 기초하여, 본 발명은 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포, 바람직하게는 (폐) 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 바람직하지만 제한되지 않는 구체예에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 화합물, 즉, miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 조성물/화합물은 흡입을 통해 병든 폐 조직으로 전달된다. 따라서, 상기 화합물/조성물은 약학적 조성물과 같은 흡입성 조성물에 포함될 수 있다. 따라서, miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 조성물(의료용)은 예를 들어, 에어로졸 형태일 수 있다. 첨부된 실시예는 또한 생체내 연구를 포함하되, 폐 섬유증 모델에서 폐의 대식세포에 대한 miR-21 억제제의 표적 전달(흡입을 통해)은 (또한 표적이 된 대조군 및 비활성(불일치) anti-miR-21과 비교하여) 폐 기능장애 및 또한 폐 섬유증에 대해 유의하게 효과적이다.
그러므로, 본 발명의 특정 양태에서, miR-21 억제제는 폐 대식세포(들)에 전달되어야 한다. 다시 말해, 본 명세서에 기술된 조성물/화합물에 포함된 "모이어티"(또한 miR-21 억제제를 포함함)는 miR-21 억제제를 대식세포(들), 특히 폐 대식세포(들)에 전달/표적화한다. 매우 특정한 양태에서, 조성물에 포함된 모이어티는 miR-21 억제제를 폐포 대식세포(들) 및/또는 간질 대식세포(들)로 전달/표적화한다. 하기 본 명세서에 제공된 바와 같이, 조성물에 포함된 모이어티는 miR-21 억제제를 배타적으로 또는 우세하게 표적 세포 유형, 예를 들어, 배타적으로 또는 우세하게 대식세포(들), 바람직하게는 배타적으로 또는 우세하게 폐 대식세포(들), 또는 특정 양태에서 배타적으로 또는 우세하게 폐포 대식세포(들) 및/또는 간질 대식세포(들)에 전달될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 생체분자의 결합과 관련하여 본 명세서에 사용된 "배타적으로"는 모이어티가 표적 분자/세포에만 검출가능하게 결합한다는 것을 나타내지는 않는다. 오히려, 분석 시스템에 따라 모이어티가 관련 없는 분자에 약간(약한) 결합을 나타낼 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서, "배타적으로"는 모이어티가 표적 세포 유형에 우세하게 결합한다는 것, 즉 결합이 선택적(선택적 결합)임을 나타낸다. 즉, 모이어티는 비표적 세포, 예를 들어 T-세포 또는 호중구, 상피 세포에 비해 표적 세포, 즉 대식세포 및 선택적으로 섬유아세포에 선택적으로 및 우선적으로 결합한다; 본 발명의 예시된 화합물이 선택적으로 대식세포(및 예를 들어 T-세포, 상피 세포, 호중구 등은 아님)를 표적으로 하는 것으로 문서화되어 있는 첨부된 도 24(C)를 또한 참조할 것. 하기에서 또한 논의되는 바와 같이, 이러한 선택적 및 우선적 결합은 상기 표적 세포 상의 본 명세서에 정의된 세포 표면 수용체(들)와 특이적으로 상호작용 및/또는 특이적으로 결합하는 모이어티로 달성될 수 있다.
miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 것이 본 명세서에서 가장 바람직하다. 따라서, 본 명세서에 제공된 조성물/화합물은 폐 섬유증의 치료에 사용될 수 있다. 본 명세서에 제공된 조성물/화합물은 또한 폐의 대식세포 관련 섬유증의 치료 뿐만 아니라 심장 질환의 치료에 사용될 수 있으며, 여기서 본 발명은 miR-21이 압력 과부하 유발 심장 기능장애를 겪은 마우스(TAC 모델, 인간 심장 질환/장애에 대한 관련 동물 모델)의 심장 조직 대식세포에서(심장의 모든 다른 세포 유형과 비교하여) 가장 높은 발현을 가짐을 문서화한다. 첨부된 실시예에 문서화되어 있는 바와 같이, 대식세포 특이적인 miR-21의 결실이 있는 마우스는 심장 비대 및 기능장애로부터 보호되는 것으로 밝혀졌다. 예상외로, 트랜스제닉 동물은 대조군과 비교하여 압력 과부하에 대한 반응으로 심근 섬유화가 훨씬 더 적었다. 이들 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 anti-miR-21 기반 치료법(miR-21 억제제를 사용한 치료법)이 주로 대식세포에서 miR-21의 억제를 통해 관련된 중요한 치료적 효능을 발휘할 수 있다고 추측하였다. 실시예는 또한 대식세포의 miR-21이 심장 이외의 다른 기관, 즉 폐, 특히 COVID-19 희생자의 폐에서 섬유화 사건을 결정한다는 새롭고 독창적인 발견을 제공한다. miR-21은 상위 상향조절된 miRNA(또한 특히 폐 대식세포에서) 중 하나이다. 이러한 놀라운 발견에 기초하여, anti-miR-21(miR-21에 대한 억제제)의 대식세포로의 특이적인 전달은 항-섬유증 요법을 제공하며, 그러한 특이적인 전달은 치료할 환자, 예를 들어 원하지 않는 부작용이 적은 치료 및 miR-21 억제제를 대식세포로 표적화하는 본 발명의 조성물/화합물의 흡입 투여를 통해 얻을 수 있는 폐의 바람직한 치료에 이점이 있는 것으로 추측되는 당해 분야에 대한 기여를 제공한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물/화합물은 폐 섬유증의 치료에 사용되며, 여기서 조성물/화합물은 miR-21 억제제 및 miR-21 억제제를 폐 대식세포(들) 및/또는 폐 섬유아세포(들)에 전달하는 모이어티 둘 다를 포함한다. 가장 바람직한 양태에서, 조성물은 폐 섬유증의 치료에 사용되며, 여기서 조성물은 miR-21 억제제 및 miR-21 억제제를 폐 대식세포(들)에 전달하는 모이어티를 포함한다. 추가의 바람직한 양태에서, miR-21 억제제는 폐 대식세포(들) 및/또는 폐 섬유아세포(들)에 전달되고, 보다 바람직하게는 miR-21 억제제는 폐 대식세포(들)에 전달된다.
본 명세서에 제공된 바와 같은 대식세포를 표적으로 하는 miR 21 억제제는 대식세포 및/또는 섬유아세포가 질병 상태에 기여하는 다양한 종류의 폐 질환을 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다. 이러한 폐 질환에는 독성 물질(SMOG, 담배 연기 등 포함), 약물(예를 들어, 블레오마이신, 부설판, 아미오다론 등), 결합 조직 질환, 간질성 폐 질환 및 특히 감염(SARS, 코로나19와 같은 감염 포함)으로 인한 폐 질환에 의해 유발된 (섬유성) 폐 질환을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이와 관련하여, 본 발명은 COVID-19 희생자의 폐(부검 후 채취)에서 miR-21이 상위 상향조절된 miRNA 중 하나임을 처음으로 문서화한다. 따라서, 본 발명은 또한 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 본 명세서에 기재된 조성물/화합물의 코로나 바이러스, 특히 SARS-CoV-2로 인한 폐 질환 또는 장애의 치료에서의 의학적/약학적 용도에 관한 것이다. 따라서, 또한 본 명세서에 제공된 기술 정보 및 첨부된 과학적 증거/실험 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 특히 바이러스 감염 및/또는 세균 감염(예를 들어, SARS-CoV-2 또는 다른 코로나바이러스에 의해 유도된)은 이러한 질병에 걸린 대상체의 폐에서 miR-21 수준이 증가하기 때문에 여기에 제공된 수단 및 방법으로 치료할 수 있다. 위에서 논의되고 본 발명의 일 구체예와 관련하여, 본 발명자들은 놀랍게도 miR-21이 인간 COVID-19 희생자의 폐에서 상위 상향조절된 miRNA 중 하나임을 발견하였다. 이것은 본 명세서에서 특히 COVID-19 감염으로 및/또는 사망한 환자로부터 사후 채취된 인간 폐의 작은 RNAome을 분석하여 입증되었으며, 예를 들어 실시예 5 및 도 19를 참조할 것.
이러한 놀라운 결과는 폐, 특히 폐 대식세포에서 miR-21 발현이 폐 섬유증의 병태생리학에서 중요한 역할을 한다는 것을 문서화한다. 특히 본 발명의 놀라운 발견에 기초하여, miR-21(및/또는 대식세포, 즉 폐의 대식세포에서 이의 발현)이 폐 질환, 폐 손상 또는 폐 장애를 추가로 앓고 있는 환자, 특히 인간에서 폐 섬유증의 병태생리학에서 실질적인 역할을 하며, 여기서 상기 섬유증은 상기 폐 질환, 폐 손상 또는 폐 장애의 결과임이 본 명세서에 기록되어 있다. 아래에서 또한 논의되는 바와 같이, 폐 섬유증의 치료에서 miR-21 억제제의 의학적 및/또는 약학적 용도와 관련된 본 의학적 발명은 부분적으로 miR-21의 발현이 질병 및/또는 손상된 조직의 대식세포에서 특히 높다는 놀라운 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명은 특정 구체예에서 폐 섬유증의 치료를 위한 수단 및 방법의 제공에 관한 것으로, 상기 치료는 대식세포, 특히 그리고 본 발명의 맥락에서 폐 내부 또는 폐의 대식세포에서 miR-21을 억제하는 조성물의 투여를 포함한다. 그러나, 또한 본 명세서에 예시된 바와 같이, miR-21이 병에 걸리거나 손상된 폐(들)에서와 같이 병에 걸리거나 손상된 조직의 섬유아세포에서 억제되는 경우에도 유익하다. 따라서, 본 발명은 일 양태에서 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 화합물 및/또는 조성물의 의학적 및/또는 약학적 용도에 관한 것이다. 일 양태에서, 의학적 및/또는 약학적 용도를 위한 상기 화합물 및/또는 조성물은 miR-21 억제제를 섬유아세포에 전달할 수 있는/전달하는 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티와 상기 miR-21 억제제를 섬유아세포에 전달하는 모이어티는 동일한 모이어티이거나 상이한 것일 수 있다. 따라서, 그리고 본 명세서에 제공된 폐 섬유증의 치료를 위한 수단 및 방법의 또 다른 양태에서 상기 모이어티는 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 선택적으로 전달하거나, 또는 상기 모이어티는 상기 miR-21 억제제를 대식세포 및 섬유아세포에 선택적으로 전달한다. 상기에서 이미 논의된 바와 같이, 상기 "선택적 전달"/"선택적 표적화"는 모이어티가 비표적 세포, 예를 들어 T-세포 또는 호중구, 상피세포 등에 비해 표적 세포, 즉 대식세포 및 선택적으로 섬유아세포에 선택적이고 우선적으로 결합하는 것을 의미한다.
하기 본 명세서에서 예시되고 첨부된 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 수단 및 방법, 즉, miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 화합물 및/또는 조성물의 의학적 및/또는 약학적 용도는 특히 폐 섬유증을 앓고 있고, 추가로 폐 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 치료에서 구상된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 폐 질환 또는 장애는 섬유증을 야기할 수 있거나 이와 연관될 수 있고, 바람직하게는 상기 폐 질환 또는 장애는 바이러스 및/또는 세균에 의해 야기될 수 있다. 본 명세서에 예시된 바와 같이, 본 발명의 수단 및 방법은 또한 그리고 놀랍게도 폐 질환, 폐 손상 및/또는 폐 장애의 의학적 개입에 유용하며, 여기서 치료될 상기 폐 질환, 폐 손상 및/또는 폐 장애는 코로나 바이러스 질환처럼 바이러스 감염에 의해 유발된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 miR-21 억제제는 폐 섬유증의 치료 및/또는 폐 질환, 폐 손상 또는 폐 장애와 관련된 및/또는 이에 의해 야기되는 폐 섬유증의 치료에 사용되며, 여기서 질병 또는 손상 상태의 기초는 바이러스 또는 세균에 의한 감염이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, (인간) 환자의 폐 섬유증 및/또는 폐 섬유증과 또한 추가의 폐 질환, 폐 손상 또는 폐 장애를 앓고 있는 (인간) 환자의 폐 섬유증은 본 명세서에 제공된 수단과 방법에 의해 치료되어야 한다. 상기 (인간) 환자의 상기 폐 섬유증은 또한 상기 (추가의) 폐 질환, 폐 손상 또는 폐 장애에 의해 야기될 수 있다. 본 명세서에 제공된 수단 및 방법은 특히 miR-21 억제제의 의학적 및/또는 약학적 용도(들)에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 miR-21 억제제는 폐 섬유증의 치료 및/또는 폐 질환, 폐 손상 또는 폐 장애와 관련된 및/또는 이에 의해 야기되는 폐 섬유증의 치료에 사용되며, 여기서 질병 또는 손상된 상태의 기초는 바이러스 또는 세균에 의한 감염이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, (인간) 환자의 폐 섬유증 및/또는 폐 섬유증 및 또한 추가의 폐 질환, 폐 손상 또는 폐 장애를 앓고 있는 (인간) 환자의 폐 섬유증은 본 명세서에 제공된 수단과 방법으로 치료되어야 한다. 상기 (인간) 환자의 상기 폐 섬유증은 또한 상기 (추가) 폐 질환, 폐 손상 또는 폐 장애에 의해 야기될 수 있다. 본 명세서에 제공된 수단 및 방법은 특히 miR-21 억제제의 의학적 및/또는 약학적 용도(들)에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 의학적 및/또는 약학적 용도(들)는 miR-21 억제제를 이러한 의학적 개입을 필요로 하는 (인간 환자), 즉, 본 명세서에 정의된 폐 섬유증을 앓거나 앓기 쉬운 (인간) 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 추가 구체예에서, 본 발명은 화합물 및/또는 조성물이 상기 환자에게 투여되는 상기 의학적 및/또는 약학적 용도(들)에 관한 것으로, 상기 화합물 및/또는 상기 조성물은 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 상기 miR-21 억제제는 또한 상기 miR-21 억제제를 섬유아세포에 전달하는 추가 모이어티를 포함하는 것으로 구상된다. 따라서, 본 발명은 또한 본 명세서에 정의된 상기 miR-21 억제제를 배타적으로 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 miR-21 억제제(및/또는 이를 포함하는 화합물/조성물)의 의학적 및/또는 약학적 용도에 관한 것이다. 하기 본 명세서에 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명의 맥락에서 사용되는 상기 화합물/조성물은 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포 및 섬유아세포에 선택적으로 전달하는 모이어티를 포함하는 것으로 또한 구상된다.
특히 첨부된 실시예와 관련하여, miR-21 억제제는 폐 섬유증의 의학적 개입, 특히 폐 질환, 폐 손상 또는 폐 장애에 의해 야기되거나 이와 관련된 폐 섬유증의 의학적 개입에서 사용되는 것으로 구상된다. 상기 폐 질환, 폐 손상 또는 폐 장애는 폐의 감염, 특히 세균 및/또는 바이러스에 의한 감염일 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 상기 바이러스는 MERS 또는 SARS, 예를 들어, SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-1와 같은 코로나바이러스일 수 있다. 본 발명의 수단 및 방법으로 치료될 기타 폐 질환, 폐 손상 또는 폐 장애는 제한 없이, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 기타 코로나바이러스(예: CoV-229, CoV-NL63, CoV-OC43 또는 CoV-HKU1), 리노바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 또는 인간 보카바이러스에 의한 감염일 수 있다. 본 발명의 추가 맥락에서 그리고 첨부된 실시예에 비추어, 치료될 폐 질환/손상/장애, 즉 폐 섬유증은 SARS-CoV-2/COVID-19-유도 폐 손상일 수 있다. 추가로, 본 명세서에 문서화된 바와 같이, 대식세포를 표적으로 하는 anti-miR-21(즉, miR-21 억제제)은 그러한 폐 손상을 유발하는 감염원으로의 감염에 의해 유발된 폐 손상을 예방하거나 치료하기 위한 우수한 치료 원리를 추가로 구성할 수 있다. 본 명세서에 제공된 실시예는 특히 SARS-CoV-2 감염에 관한 것이다. 그러나, 본 발명의 수단 및 방법으로 치료될 상기 폐 질환/손상/장애는 또한 예를 들어 만성 폐쇄성 폐 질환 또는 특발성 폐 섬유증 등과 같은 또 다른 폐 질환일 수 있다.
본 명세서에 기록된 바와 같이, 본 발명자들은 또한 놀랍게도 miR-21이 폐 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체의 폐에서 증가된다는 것을 발견하였다; 아래 도 13A 및 B를 참조할 것. miR-21 억제제로 치료하면 폐 섬유증이 감소하였다. 아래에 설명된 바와 같이, 대식세포 또는 섬유아세포에서 miR-21의 억제는 섬유증을 감소 및/또는 예방한다. 따라서, 대식세포 및/또는 섬유아세포에 대한 miR-21 억제제의 전달이 그럴듯해진다. 따라서, 본 명세서에 제공된 조성물 및 이의 용도는 폐 질환 또는 장애, 예를 들어, 바이러스 및/또는 세균성 폐 감염에 의해 유발되고 및/또는 관련된 폐 섬유증의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명에서 치료되는 폐 섬유증은 폐 지지 또는 기계적 환기에 의해 유발되거나 이와 연관될 수 있다. 감염(세균 및/또는 바이러스), 압력 및/또는 (인공) 환기로 인해 ARDS(급성 호흡 곤란 증후군)가 발생하고 폐 섬유증이 발생할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 제공된 조성물 및 조성물의 용도는 폐 섬유증의 예방 또는 치료에 적합할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 제공된 조성물은 또한 폐 섬유증의 예방 또는 치료에 적합할 수 있다. 따라서, 조성물은 폐 섬유증을 나타내지 않은 대상체의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 정의된 miR-21 억제제, 본 명세서에 제공된 조성물/화합물은 또한 폐 질환, 폐 장애, 폐 손상 및/또는 ARDS의 치료에 사용될 수 있다. 본 명세서에 제공된 수단 및 방법들은 그들의 징후 전에 폐 질환, 폐 손상 및/또는 ARDS의 예방에 사용되는 것으로도 구상된다. 예를 들어, SARS-CoV-2 감염과 같은 "코로나바이러스 바이러스성 감염"은 또한 폐 섬유증과 연관된다. 이는 실제로 miR-21이 병에 걸린/손상된 폐의 (폐포/폐) 대식세포에서 풍부할 뿐만 아니라 더욱 놀랍게도, miR-21은 SARS-CoV-2에 감염된 개인, 즉 인간 Covid-19 환자로부터 얻은 폐 조직에서 상향조절된다. 따라서, 본 명세서에 정의된 miR-21 억제제 및 특히 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 (폐) 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 본 명세서에 정의된 화합물/조성물은 특히 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 리노바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 또는 인간 보카바이러스, MERS 또는 SARS, 예를 들어, SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-1, 기타 코로나바이러스(예를 들어, CoV-229, CoV-NL63, CoV-OC43 또는 CoV-HKU1)에 의해 유발되거나 유도된 감염의 치료에 사용될 수 있다. 본 명세서에 제공된 조성물/화합물은 또한 그러한 (바이러스) 감염과 연관된 폐 섬유증 질환의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명이 바이러스 감염과 관련된 폐 섬유증 질환의 치료에 제한되지 않는다는 점에 유의한다. 본 명세서에 토론된 바와 같이, 본 발명의 놀라운 발견에 기초하여, miR-21 억제제(들)은, 특히 상기 miR-21 억제제를 대식세포, 그리고, 일 구체예에서, 질병/손상된/감염된 조직(즉, 질병/손상된/감염된 폐)의 섬유아세포에 전달하는 모이어티에 연결될 때 세균 감염과 연관된 폐 섬유증 또는 만성 폐쇄성 폐 질환, 특발성 폐 섬유증 등과 같은 다른 폐 섬유성 장애의 치료에 의학적으로/약학적으로 유용하다는 것이 또한 그럴듯하게 문서화되어 있다. 또한 본 발명에서 제공된 그리고 miR-21 억제제를 포함하는 화합물 및 조성물은 폐 지지 또는 기계적 환기 예를 들어 그리고 특히 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS) 이후의 폐 지지/기계적 환기와 관련되고, 이에 의해 유발되거나 이에 연관된 섬유성 사건의 의학적/약학적 개입에 특히 유용하다는 것이 본 발명으로부터 명백하다.
본 명세서에 사용된 용어 "폐 섬유증(pulmonary fibrosis)" 또는 "폐 섬유증(lung fibrosis)"은 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에 첨부된 실시예 및 과학적 데이터에서 놀랍게도 입증된 바와 같이, 또한 심장 질환의 대형 동물 모델에서 miR-21 억제제의 혈관내(관상동맥내) 적용은 폐 섬유증을 감소시켰다; 예를 들어, 아래 도 13D를 참조할 것. 따라서, 특정 양태에서 miR-21 억제제를 포함하는 본 발명의 화합물/조성물은 심장 질환을 앓고 있는 대상체의 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)/폐 섬유증(lung fibrosis)의 치료에 사용하기 위한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 심장 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 폐 섬유증(lung fibrosis)의 치료에서의 본 명세서에 제공된 조성물/화합물의 의학적/약학적 용도에 관한 것이다. 일 구체예에서, 심장 질환 또는 장애는 섬유증을 유발하거나 이와 연관된다. 이러한 심장 질환 또는 장애는 심부전, 허혈, 허혈 후 심부전, 심장 비대, 고혈압 심부전, 확장기 심부전, 수축기 심부전, 심장 관련 저장 질환, 심근병증, 협착성 심낭염, 관상동맥 질환, 급성 심근경색증, 만성 심근 경색, 우심부전, 심장 부정맥, 심근염 관련 섬유증 및 심장 판막 질환으로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
위에서 논의되고 첨부된 실시예에 의해 그럴듯하게 문서화된 바와 같이, 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)은 또한 기계적 환기 관련 폐 섬유증(lung fibrosis)일 수 있다. 훨씬 더 바람직한 양태에서, 치료될 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)은 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)에서 기계적 환기-관련 폐 섬유증(lung fibrosis) 및/또는 폐 지지-관련 폐 섬유증(lung fibrosis)일 수 있다. 이것은 또한 COVID-19 환자와 같이 바이러스 감염을 앓고 있고 기계적 환기가 필요한 대상체와 특히 관련이 있다.
추가 생체내 실험에서, 본 발명자들은 또한 섬유아세포에서 miR-21의 특이적 억제를 분석하였다; 예를 들어 첨부된 비제한적인 실시예 4; 도 14 참조. 본 발명자들은 섬유아세포에서 miR-21의 억제가 심장 재형성 및 기능장애를 예방한다는 것을 입증하였다; 도 14 참조. 또한 첨부된 실시예에서 예시된 바와 같이, 폐 손상 모델에서 miR-21의 특이적 억제는 바람직하지 않은 폐 리모델링 및 기능장애를 감소시켰다; 예를 들어 첨부된 비제한적인 실시예 6 및 도 26 참조. 따라서, miR-21 억제제 및 억제제를 대식세포(들) 및/또는 섬유아세포(들)에 전달하는 모이어티를 포함하는 본 발명의 조성물/화합물은 본 명세서에 설명된 문서화된 유익한 치료 용도를 제공한다. 상기 표시된 바와 같이, 조성물에 포함된 모이어티는 표적 세포 유형, 예를 들어 배타적으로 대식세포(들) 및/또는 섬유아세포(들), 바람직하게는 배타적으로 폐 대식세포(들) 및/또는 섬유아세포(들), 또는 특정 양태에서 배타적으로 폐포 대식세포(들) 및/또는 섬유아세포 및/또는 간질 대식세포(들) 및/또는 섬유아세포(들)에 배타적으로 miR-21 억제제를 전달할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 miR-21이 폐 섬유증을 앓고 있지 않은 대상체에 비해 폐 섬유증을 앓고 있는 대상체에서 증가한다는 것을 발견하였다; 도 13A 및 B 참조. miR-21이 인간 대상체(도 13B) 그리고 또한 폐 섬유증을 앓고 있는 동물 모델에서 증가된다는 것이 본 명세서에서 아래에 기록되어 있다.
본 발명자들은 또한 miR-21 억제제, 특히 안티센스-miR-21(예를 들어, LNA-anti-miR-21, 첨부된 실시예에서도 사용 및 이용됨)을 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)을 앓고 있는 동물 모델에 투여하였다. 본 발명자들은 놀랍게도 miR-21 억제제가 폐 섬유증(또는 폐의 섬유증)을 감소, 예방 및/또는 개선한다는 것을 발견하였다. 이 유익한 치료 효과는 매우 강력하였다. 따라서, 본 명세서에 제공된 조성물 및 치료적 용도/방법은 하기에 추가로 입증되는 바와 같이 유리하고 안전하며 효과적인 치료를 제공한다.
본 명세서의 아래에서 추가로 문서화된 것 처럼, 대형 동물 모델에서 miR-21 억제제의 투여는 대식세포 침윤 감소 및 섬유아세포 증식을 초래한다. 따라서, 본 명세서는 miR-21 억제제가 섬유아세포 및 대식세포에서 이의 활성을 통해 섬유증을 감소시킴을 보여주는 생체내 데이터를 제공하였다; 실시예 1 참조. 추가의 생체내 데이터가 본 명세서의 아래에 기술된다. 예기치않게 miR-21은 모든 miRNA 중 심장의 대식세포에서 가장 강한 발현을 가짐을 보여주었다; 아래 도 8B.
이러한 실험 결과를 고려하여, 본 발명자들은 대식세포에서 miR-21을 특이적으로 억제하는 것이 섬유증에 유익한 치료인지 여부를 추가로 분석하였다. 실시예 2 참조. 대식세포 및/또는 섬유아세포에 전달되는 miR-21 억제제의 대표적인 것으로, 동물 질병 모델의 대식세포 또는 섬유아세포에서 miR-21이 결실되었다; 본 명세서의 위와 아래 참조. 대식세포에서 miR-21의 억제는 대식세포에서 염증유발 분극화를 방지하고 염증을 예방한다. 더욱이, 대식세포에서 miR-21의 억제는 섬유증, 특히 심장 섬유증 예를 들어, 압력 과부하 유발 섬유증을 감소시킨다. 추가로, 대식세포에서 miR-21의 억제가 기관의 기능장애, 예를 들어, 심장 기능장애를 개선한다는 것이 본 명세서의 아래에 제시되어 있다. 또한 대식세포에서 miR-21을 억제하면 심장 질환이나 장애에서 심장 기능이 향상된다는 것이 입증되었다. 또한, 생체내 동물 모델의 대식세포에서 miR-21의 억제가 비대 관련 유전자 및 섬유증 관련 유전자를 감소시킴을 하기에 나타내었다. 또한, 대식세포에서 miR-21의 억제에 의해 대식세포 의존성 근섬유아세포 변형이 감소됨이 본 명세서에 제시된다. 첨부된 실시예에서 볼 수 있듯이 섬유아세포는 대식세포의 세포간 신호 전달을 위한 기본 수혜자이다. 따라서 섬유아세포는 대식세포에 포함된/발현되는 miR-21에 의해 제어된다. 따라서 대식세포에서 miR-21 억제제는 섬유아세포에 대한 파라크린 및 전섬유증(pro-fibrotic) 신호전달을 조절한다. 첨부된 실시예에서 문서화한 바와 같이, 대식세포 유래의 전섬유증 분비 신호는 병리학적 섬유증을 제어하기에 충분히 강하다.
상기에서 설명하고 아래에 도시된 바와 같이, 섬유아세포에서 miR-21의 억제는 심장 재형성 및 기능장애를 예방한다. 첨부된 도 14 참조.
따라서 대식세포 또는 섬유아세포에서 miR-21의 배타적인 억제는 섬유증, 특히 폐 섬유증의 치료법에서 강력한 의학적 잠재력을 제공한다.
대식세포 및/또는 섬유아세포에 포함된 miR-21의 특이적인 표적화/억제는 miR-21의 전신적 억제에 비해 유리한 것으로 간주된다. 예를 들어, miR-21 억제제의 특이적인 전달 및 따라서 대식세포 및/또는 섬유아세포에서 miR-21의 특이적인 억제는 모든 세포 유형, 예를 들어 근세포 또는 비-근세포에서 전체 억제의 위험을 감소시킨다. 예를 들어, 근세포의 억제는 특히 급성 질환 상태에서 해롭다. 따라서, 첨부된 실시예에 문서화된 바와 같이 그리고 본 명세서에 설명된 바와 같이, 대식세포 및/또는 섬유아세포에서 miR-21의 특이적인 억제에 의한 섬유증의 예방 및 감소는 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포 및 선택적으로, 또한 그럴듯한 섬유아세포(들)에 전달하는 모이어티를 포함하는 본 발명의 조성물/화합물에 의한 섬유증의 유리한 치료법을 제공한다. 첨부된 실시예에 문서화된 바와 같이, miR-21 억제제의 대식세포로의 표적 전달은 놀랍게도 높은 항-섬유증 효과를 유도한다(비-표적화된 anti-miR-21/비-표적화된 miR-21 억제제의 이전에 기술된 효과보다 더 높음). 이것은 본 발명의 예상치못한 발견이다. 실험 부분에 문서화된 바와 같이 miR-21 억제제(anti-miR-21)의 대식세포로의 우선 전달/우선 표적화 및 섬유아세포로부터의 상대적 배제는 선행 기술에서 제공된 miR-21의 작용 부위의 섬유아세포 가설을 기반으로 하여 덜 현저한 항섬유증 효과를 초래할 것으로 예상되었다. 이 "섬유아세포 가설"은 miR-21 발현이 블레오마이신 처리된 폐의 폐 근섬유아세포와 특발성 폐 섬유증을 앓고 있는 환자의 섬유아세포 병소에서 증가한다고 생각한 Liu (2010); J Exp Med. 207:1589-97)에 의해 제안되었다. Liu(2010), loc cit.의 저자는 블레오마이신 투여 후 복강 내로 miR-21 안티센스 프로브를 투여했으며 폐에서 약화된 콜라겐 침착이 관찰되었다. 그러나 섬유증에 대한 직접적인 영향은 문서화되지 않았으며 저자는 특발성 폐 섬유증을 앓고 있는 환자의 섬유아세포 병소뿐만 아니라 블레오마이신 처리 폐의 폐(근)섬유아세포에서 증가된 miR-21 발현을 보았다. Liu(2010)의 이러한 발견과 대조적으로, 본 발명자들은 특히 병든 조직의 대식세포(폐뿐만 아니라 심장에서도)에서 miR-21의 훨씬 더 적절한 발현을 문서화할 수 있었다. 특히, 본 발명자들은 놀랍게도 miR-21이 COVID-19 희생자의 폐(예를 들어, 첨부된 도 19 참조) 뿐만 아니라 블레오마이신 투여 후 폐( 예를 들어, 첨부된 도 21 참조)에서 가장 많이 상향조절된 miRNA 중 하나임을 발견하였다. 상기 miR-21은 또한 예상외로 폐 대식세포에서 가장 풍부하고 풍부한 microRNA이다. 예를 들어, 첨부된 도 12 및 20 참조. 포유동물 폐에서 대식세포가 매우 풍부하기 때문에, 본 발명자들은 폐의 대부분의 miR-21이 폐 대식세포로부터 유래한다고 결론지었다. 따라서, 본 발명의 놀라운 발견 중 하나는 대식세포에서 특이적으로 miR-21을 표적으로 하는 것(상기 대식세포에 특이적으로 전달되는 miR-21 억제제를 통해)은 예를 들어, 또한 바이러스에 의한 감염, 예를 들어 SARS-CoV-2에 의한 감염과 같은 감염에 의해 유발된 폐 손상을 예방하거나 치료하는 우수한 치료 원리를 구성한다. 또한 첨부된 실시예에 문서화된 바와 같이, 놀랍게도 (에어로졸화된) 흡입을 통해 대식세포에 대한 miR-21 억제제의 전달이 폐 섬유증을 효율적으로 약화시키고 폐 기능의 감소는 대식세포 특이적인 miR-21의 억제에 의해 예방되었다. 예를 들어, 도 26 참조. 본 발명의 조성물/화합물의 이러한 높은 효율은 선행 기술로부터 예견되거나 예상되지 않았다. 첨부된 실시예에 제공되고 본 명세서에 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 고도로 발현되고, 이러한 세포 유형에 대해 상대적으로 선택적이며, 그 특정 수용체에 대한 (특이적) 리간드의 흡수에 적합한 폐 대식세포의 표면 수용체를 확인하였다. 이러한 리간드는 저분자 리간드일 수 있고 또한 단백질성 리간드(또는 이의 기능적 단편)를 포함할 수 있다. 상기 저분자 리간드, 상기 단백질성 리간드(또는 상기 기능적 단편)는 바람직하게는 대식세포(및 임의로 섬유아세포)의 세포 표면 상의 (표면) 분자와 특이적으로 상호작용할 수 있다. 일 구체예에서, 이러한 상호작용은 또한 예를 들어 엔도사이토시스를 통해 본 발명의 조성물/화합물의 내재화를 유도할 수 있다. 또한, 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티로서 항체(또는 scFv 등과 같은 이의 기능적 단편)의 사용이 본 명세서에서 구상된다. 이러한 항체(또는 이의 기능적 단편)는 대식세포(및 임의로, 그러나 섬유아세포에서도)의 (표면) 마커/수용체에 특이적으로 결합할 수 있다. 첨부된 실시예에서, 폐 및 심장의 프라이머리 세포의 단일 세포 시퀀싱 및 분류되고 정제된 세포 분획의 딥 RNA 시퀀싱이 수행되었다. 이러한 데이터의 생물정보학 분석은 위의 기준을 충족하는 몇 가지 표면 분자를 산출하였다(첨부된 표 3 참조). 그 중 MRC1(Macrophage receptor C type 1)은 폐 대식세포에서 고도로 특이적이고 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌다. 폐 대식세포에 대한 만노스 수용체 C 유형 1의 발현은 폐 조직의 면역형광 염색에 의해 추가로 확인되었다(첨부된 비제한적인 실시예 5 및 도 22 참조). 첨부된 도 27은 또한 심장 대식세포에서 만노스 수용체 C 유형 1의 높은 발현을 확인시켜준다.
본 발명자들은 miR-21 억제제를 (인간) 대식세포에 특이적으로 전달하기 위해 MRC1을 사용하였다. 또한, 본 발명자들은 흡입을 통한 국소 전달과 조합된 miR-21 억제제의 대식세포 특이적 표적화가 폐 섬유증을 예방 또는 치료하는 우수한 치료 원리를 구성한다는 것을 깨달았다. 하기에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 miR-21 억제제에 대한 화학적 링커를 사용하여 MRC1에 대한 리간드(여기서는 Tri-Mannose, GalNAc)를 컨쥬게이트시켰다(첨부되나 비제한적인 실시예 5 및 도 23 참조).
생체내 실험에서, 본 발명자들은 이들 화합물의 폐로의 전달을 확인하고 이들의 운명은 형광 표지화를 통해 추적한 후 형광 세포 세포계측법을 통해 검출하였다. 표지되지 않은 miR-21 억제제를 포함하는 조성물과 비교하여, 만노스-결합된 miR-21 억제제를 포함하는 조성물은 폐포 대식세포의 더 높은 분율에 전달되었고, 대식세포에서 더 높은 수준에 도달하고 내피 세포와 같은 비-대식세포 유형에서 더 낮은 수준에 도달하였다. 실시예 5 및 도 24 및 25 참조.
추가 생체내 실험에서, 본 발명자들은 대식세포를 표적으로 하는 만노스-결합된 miR-21 억제제를 포함하는 조성물의 효율을 시험하였다. 이를 위해, 폐 손상 유도 4일 후에 흡입을 통해 에어로졸화된 조성물을 마우스에 제공한 마우스 폐 섬유증 모델을 사용하였다. 하기 실시예 5 및 도 26에 나타낸 바와 같이, 상기 조성물을 투여받은 마우스는 폐 섬유증을 약화시켰다. 따라서, 이 치료 원리는 가장 관련된 기능 및 구조적 파라미터에 의해 결정된 바와 같이 폐 기능장애 및 또한 폐 섬유증에 대해 유의하게 효과적이었다.
본 명세서에 제공된 과학적 증거 및 특정 양태에 따라, 본 발명은 즉 miR-21 억제제 및 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 본 명세서에 정의된 조성물/화합물에 관한 것이다. 이러한 본 발명의 조성물/화합물은 특히 폐 섬유증의 의학적 개입에 사용되어야 한다. miR-21 억제제 및 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 조성물/화합물은 또한 폐 섬유증의 예방에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물/조성물은 폐 손상을 초래할 수 있는 장애/질병의 초기 단계, 예를 들어 감염의 초기 단계 및/또는 질병의 단계에서 사용되는 것으로 구상되며, 여기서 폐 지지 또는 기계적 환기가 보장된다. 따라서, 본 발명은 또한 예를 들어 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS)에 따른 폐 섬유증의 예방 뿐만 아니라 의학적 개입에 유용하다.
특정 양태에서, 본 발명은 폐 섬유증의 치료용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 여기서 조성물은 miR-21 억제제 및 miR-21 억제제를 대식세포 및/또는 섬유아세포에 전달하는 모이어티를 포함한다.
이하 및 상기에서 제공된 정의 및 설명은 섬유증, 특히 폐 섬유증의 치료용 조성물/화합물, 본 명세서에 제공된 조성물/화합물, 조성물/화합물의 제조 방법, 폐 섬유증의 치료용 조성물/화합물의 용도, 및 본 명세서에 제공된 치료 방법에 적용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "miR"은 용어 "마이크로-리보핵산" 또는 "miRNA"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, miR-21은 하기 첨부된 도 1B에 예시된 바와 같이 miRNA-21, 특히 miR-21a-5p 또는 miR-21-5p를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "miR-21 억제제"는 내인성 miR-21에 특이적으로 결합하여 이를 억제하는 분자를 의미한다. 따라서 miR-21 억제제의 표적은 miR-21일 수 있다. miR-21의 표적은 또한 miR-21의 다운스트림 표적을 포함하는 것으로 이해될 수 있다. miR-21 억제제는 표적 mRNA의 수준 및/또는 miR-21의 적어도 하나의 표적 mRNA의 수준을 증가시킨다. miR-21의 억제, 예를 들어, miR-21에 최소한 상보적인 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 통해 Sprouty(세포 신호 전달에 관여하는 발달 단백질) 등과 같은 miR-21의 표적의 억제 또는 과발현을 유발할 것이다. miR-21 억제제 투여 후 miR-21 억제 효과는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, miRNA 수준은 시험관내 또는 생체내 세포 또는 조직에서 정량화/결정될 수 있다. miRNA 수준의 변화는 마이크로어레이 분석으로 측정할 수 있다. miRNA 수준의 변화는 TaqMan® MicroRNA Assay(Applied Biosystems)와 같은 상업적으로 이용 가능한 여러 PCR 분석 중 하나로 측정할 수 있다. 예를 들어, miR-21 억제제 투여 시 miR-21의 억제는 miRNA의 표적의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 측정함으로써 평가된다. 첨부된 실시예에 입증된 바와 같이, miR-21의 결실에 의해 유도된 miR-21의 억제는 miR-21 수준에서 약 >90%의 급격한 감소를 제공하였다. 더욱이, miR-21 억제제는 선행 기술에 공지되어 있다; 예를 들어, Thum (2008); Nature 456: 980-984, Zhang (2015); Cancer Res 75(9): 1-9 또는 Ardite (2012); J Cell Biol 196(1): 163-175 참조. miR-21의 추가 억제제는 더 이상 고민하지 않고 식별할 수 있다. miR-21에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 가진 올리고뉴클레오티드로 구성된 miR-21 억제제의 예는 여기에서 증명된다. 예를 들어, 첨부된 도 1B(LNA-anti-miR-21 올리고뉴클레오티드를 나타냄), 첨부된 도 23B("anti-miR-21 일부"(miR-21 억제제) 뿐만 아니라 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티, 즉 여기에서는 트리-만노스 또는 N-아세틸갈락토사민을 포함하는 본 발명의 2개의 예시된 화합물/작제물을 나타냄) 또는 첨부된 도 26A(특히, "LNA-anti-miR-21 링커-만노스" 포맷이며, 첨부된 SEQ ID NO: 3에도 도시된 바와 같은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 예시된 작제물을 나타냄) 참조. 따라서, 예시된 "anti-miR-21" 올리고뉴클레오티드는 안티센스-miR-21 3'-tCgAaTaGtCtGaCT-5'(SEQ ID NO: 1), 및/또는 안티센스-miR-21 3'-TCgAaTagTCtgAcT-5'(SEQ ID NO: 2)를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 여기서 LNA-DNA 작제물(본 명세서에서 "믹스머"라고 함)이 도시된다. 대문자는 잠금 핵산 뉴클레오티드(LNA)를 나타내고 소문자는 DNA 염기를 나타내며 모든 대문자 "C"는 여기에서 5-메틸-시토신을 나타낸다. 따라서, 이들 2개의 서열 3'-tCgAaTaGtCtGaCT-5' 및 3'-TCgAaTagTCtgAcT-5'는 "믹스머", 즉 LNA를 포함하는 작제물을 구성하며, DNA 뉴클레오티드-SEQ ID NO: 3은 또한 LNA 올리고뉴클레오티드를 나타내는 유용한 "anti-MIR-21"을 나타낸다(따라서, 예시된 SEQ ID NO: 3은 SEQ ID NO: 1 및 2와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하지만 모든 뉴클레오티드가 잠겨 있는, 5'-메틸-시토신 변형 및 포스포로티오에이트 골격을 포함하는 LNA 작제물을 나타냄). 추가로 유용하지만 비제한적인 "anti-miR-21" 올리고뉴클레오티드는 SEQ ID Nos.: 7 내지 9를 포함한다. SEQ ID No: 7은 SEQ ID Nos: 1 및 2와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하지만 모든 뉴클레오티드가 잠겨 있고 5'-메틸-시토신 변형이 있지만 포스포로티오에이트 골격이 없는 LNA 작제물이다. SEQ ID No: 8은 SEQ ID Nos: 1 및 2와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하지만 모든 뉴클레오티드가 잠겨 있고 포스포로티오에이트 골격이 있지만 5'-메틸-시토신 변형은 없는 LNA 작제물이다. SEQ ID No: 9는 SEQ ID Nos: 1 및 2와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하지만 모든 뉴클레오티드가 잠겨 있고 임의의 5'-메틸-사이토신 변형이 없으며 포스포로티오에이트 골격이 없는 LNA 작제물이다. 다시, 본 명세서에 제공된 서열에서 대문자는 LNA를 나타내고 소문자는 DNA 염기를 나타낸다. 모든 대문자 C는 5-메틸-시토신을 나타낸다. miR-21에 대한 안티센스 miR은 완전한 PS(포스포로티오에이트) 골격을 가질 수 있다. 또한, 예를 들어, SEQ ID NO:1 참조. 아래에서 또한 논의된 바와 같이, 특히 유용한 안티센스-miR-21 분자가 SEQ ID NOs: 1 및 2에 제공되며, 가장 바람직하고 첨부된 실시예에 예시된 바와 같이 다음과 같은 "anti-miR-21"이 있다: 3'-tCgAaTaGtCtGaCT -5'(SEQ ID NO: 1). 그러나, 본 발명은 이러한 특이적인 올리고뉴클레오티드에 결코 제한되지 않는다. 당업자는 또한 추가의 "anti-miR-21" 작제물/올리고뉴클레오티드가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있음을 알고 있다. 이러한 "anti-miR-21" 작제물/올리고뉴클레오티드는 예를 들어 RNA 작제물, PNA(펩타이드 핵산) 등을 포함할 수 있다. 또한 anti-microRNA 올리고뉴클레오티드의 모폴리노-올리고머(포스포로디아미데이트 모폴리노 올리고머), 안타고미르/블록미르, ZEN(N,N-디에틸-4-(4-니트로나프탈렌-1-일아조)-페닐아민) 변형과 같은 상기 anti-miR-21 올리고뉴클레오티드에 대한 추가 변형이 구상된다. 추가의 유용한 변형은 특히 Khvorova(2017) Nature Biotech 35, 238-248의 리뷰에 설명되어 있다.
Sun(2019), https://doi.org/10.1155/2019/6782653에서 논의된 바와 같이 miR-21의 억제는 miRNA 스폰지, miRNA 마스크와 같은 수단에 의해, 그리고 또한 본 명세서에 구체적으로 설명된 바와 같이 anti-miRNA 올리고뉴클레오티드(anti-miR)에 의해 달성될 수 있다. anti-miR는 관심 있는 내인성 miRNA에 직접 결합하고 miRISC 복합체의 파괴를 통해 miRNA에 의한 mRNA 번역 억제를 차단하도록 설계된 단일 가닥 합성 올리고뉴클레오티드이다. miRNA 스폰지는 내인성 표적에서 miRNA를 격리시키는 미끼 역할을 하는 다중 결합 부위가 있는 전사체이다. 단일 특정 miRNA 또는 공통 시드 영역을 공유하는 관련 miRNA의 전체 패밀리를 표적으로 하도록 설계할 수 있다.
miRNA 마스크는 표적 mRNA의 3UTR에서 사전(proleptic) miRNA 결합 부위와 완전히 염기쌍을 이루는 단일 가닥 변형 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명의 맥락에서 "miRNA 스펀지" 또는 "miRNA 마스크"가 miR-21을 억제하기 위해 사용되는 것으로 구상되는 반면, 본 발명의 맥락에서 miR-21을 특이적으로 표적으로 하는 anti-miRNA 올리고뉴클레오티드(anti-miR)를 사용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티" 또는 이의 문법적 변이체는 담체 및/또는 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 지칭한다. 담체 및/또는 모이어티는 대식세포 또는 표적 세포에서 miR-21 억제제를 농축한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 표적 세포(들)은 대식세포(들) 및/또는 섬유아세포(들)이고, 바람직하게는 표적 세포(들)은 대식세포(들)이다. 바람직한 양태에서, 대식세포(들) 및/또는 섬유아세포(들)은 폐 대식세포(들) 및/또는 폐 섬유아세포(들)이다. 보다 바람직한 양태에서, 대식세포(들) 및/또는 섬유아세포(들)은 폐포 대식세포(들) 및/또는 폐포 섬유아세포(들)이고; 및/또는 간질 대식세포(들) 및/또는 간질 섬유아세포(들)이다. 특정 양태에서, 담체 및/또는 모이어티는 miR-21 억제제의 엔도사이토시스를 유도한다. 엔도사이토시스는 miR-21 억제제의 흡수를 증가시킬 수 있다. 특정 양태에서, 조성물에 포함된 모이어티 및/또는 담체는 상기 miR-21 억제제를 대식세포 또는 대식세포들에 전달한다. 조성물에 포함된 모이어티 및/또는 담체는 miR-21 억제제를 섬유아세포 또는 섬유아세포들에 추가로 전달할 수 있다. 아래에 설명된 바와 같이, 섬유아세포에서 miR-21의 결실은 유익한 효과를 제공한다. 따라서, 조성물에 포함된 모이어티 및/또는 담체는 상기 miR-21 억제제를 대식세포 또는 대식세포들 및/또는 섬유아세포 또는 섬유아세포들에 전달할 수 있다. 특정 양태에서, 조성물에 포함된 모이어티 및/또는 담체는 상기 miR-21 억제제를 대식세포 또는 대식세포들 및 섬유아세포 또는 섬유아세포들에 전달한다. 바람직한 양태에서, miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 담체 및/또는 모이어티는 miR-21 억제제, 즉 본 발명의 화합물의 두 부분, 즉 "miR-21 억제제"와 "miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티"는 하나의 분자에 포함된다. 상기 분자는 또한 "링커" 및/또는 "마커"(형광 마커와 같은)와 같은 추가 "모이어티" 및/또는 부분을 포함할 수 있다. 이러한 마커는 "링커" 구조(들)의 일부일 수도 있다. 상응하는 예가 본 명세서의 아래에 제공되고, 일 예가 첨부된 도 23B(GalNAc-컨쥬게이트-LNA-antimiR-21-FAM, 이에 의해 "링커"가 "플루오레세인 아미다이트 유도체"/FAM을 포함함)의 상부에 제시되어 있다.
특히 바람직한 양태에서, 조성물에 포함된 담체 및/또는 모이어티는 상기 miR-21 억제제를 관련 표적 세포, 여기서 특히 대식세포에만 배타적으로 전달한다. 따라서, 특정 양태에서, 조성물에 포함된 담체 및/또는 모이어티는 상기 miR-21 억제제를 배타적으로 대식세포 및/또는 섬유아세포에 전달한다. 첨부된 실시예에서 miR-21은 대식세포 또는 섬유아세포에서 결실되었다. 따라서, 첨부된 실시예는 대식세포에서 miR-21의 특정 결실/억제를 보여준다. 따라서, 본 명세서에 사용된 용어 "miR-21 억제제를 대식세포에만 전달한다"는 것은 억제제가 대식세포에만 전달된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서에 사용된 용어 "miR-21 억제제를 섬유아세포에만 전달한다"는 것은 억제제가 섬유아세포에만 전달된다는 것을 의미한다. 따라서, 모이어티 및/또는 담체는 상기 miR-21 억제제를 대식세포 및/또는 섬유아세포가 아닌 다른 세포 유형에 전달하지 않는다. 특히, 본 발명의 조성물에 포함된 모이어티 및/또는 담체는 상기 miR-21 억제제를 근세포에 전달하지 않는다. 따라서, 특정 양태에서, 조성물에 포함된 담체 및/또는 모이어티는 상기 miR-21 억제제를 대식세포에만 전달하며, 여기서 모이어티 및/또는 담체는 상기 miR-21 억제제를 근세포에 전달하지 않는다. 첨부된 실시예 및 아래에 설명된 바와 같이 대식세포의 miR-21 억제제는 섬유아세포에 대한 파라크린 및 전섬유증 신호전달을 제어함을 문서화한다. 따라서, 특정 양태에서, 모이어티 및/또는 담체는 상기 miR-21 억제제를 배타적으로 대식세포 및 섬유아세포에 전달한다. 특정 양태에서, 모이어티 및/또는 담체는 상기 miR-21 억제제를 대식세포 및 섬유아세포에 전달하며, 여기서 모이어티 및/또는 담체는 상기 miR-21 억제제를 근세포에 전달하지 않는다.
특정 양태에서, miR-21 억제제는 폐 대식세포 및/또는 폐 섬유아세포에 전달된다. 특정 양태에서, miR-21 억제제는 폐 세포에 전달된다. 가장 바람직한 양태에서, miR-21 억제제는 폐 대식세포에 전달된다. 본 명세서에 제공된 조성물의 투여는 폐 또는 폐 표적 세포로의 전달을 제공한다. 특정 양태에서, miR-21 억제제는 폐 대식세포 및 폐 섬유아세포에 전달된다. 바람직한 양태에서, 폐 세포로의 전달은 조성물의 폐로의 투여에 의해 제공된다. 따라서, 조성물은 폐 투여에 의해 투여되어야 한다. 예를 들어, 조성물은 에어로졸화된 조성물에 의해 대상체의 폐에 투여되어야 한다. 특히, 조성물은 흡입에 의해 또는 폐, 기관지 및/또는 기도에 국소 투여의 다른 수단에 의해 대상체의 폐에 에어로졸화된 조성물에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 흡입에 의한 투여를 위해 제조된다. 이러한 흡입용 조성물 중 일부는 압축 팩 또는 분무기의 에어로졸 스프레이 형태로 제조된다. 이러한 특정 조성물은 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 가스를 포함한다. 가압 에어로졸을 사용하는 특정 구체예에서, 투여 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브로 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지가 제제화될 수 있다. 이러한 특정 제형은 조성물의 분말 혼합물과 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스를 포함한다. 호흡기 및 폐의 특정 부분을 표적으로 하기 위해 분무기 장치를 사용하여 액적의 크기를 조절하기 위한 제형 및 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 추가로 적합한 장치에는 건조 분말 흡입기 또는 정량 흡입기가 포함된다.
본 명세서에 제공된 조성물은 또한 동맥내 투여, 바람직하게는 심장내 투여, 보다 바람직하게는 관상동맥내 투여에 의해 투여될 수 있다. 본 명세서에서 하기에 입증된 바와 같이, miR-21 억제제의 관상동맥내 투여는 폐 섬유증을 감소시킨다. 따라서, 특정 구체예에서, 대상체에 투여하는 것은 동맥내 투여를 포함한다. 특정 구체예에서, 대상체에 투여하는 것은 심장내 투여를 포함한다. 심장내 투여에 적합한 수단은 카테터의 사용, 또는 개심술 동안 투여를 포함한다.
또한, miR-21 억제제는 심장 대식세포(들)에 전달될 수도 있다. 첨부된 실시예에서 볼 수 있듯이, miR-21 억제제를 심장 대식세포에 전달하면 폐 섬유증이 감소하였다. 도 13D 참조. 따라서 miR-21 억제제는 특정 양태에서 심장 대식세포(들)에 전달된다. 추가의 특정 양태에서, miR-21 억제제는 폐 대식세포(들) 및/또는 심장 대식세포(들)에 전달된다. 추가의 특정 양태에서, miR-21 억제제는 폐 대식세포(들) 및/또는 폐 섬유아세포(들) 및/또는 심장 대식세포(들) 및/또는 심장 섬유아세포(들)에 전달된다. 그러나, 본 발명의 맥락에서, miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 심장 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 본 발명의 이러한 화합물/조성물은 폐 섬유증의 의학적 개입 뿐만 아니라 다른 섬유증 사건, 예를 들어 심장의 섬유증에 사용되는 것으로도 구상된다.
아래에 설명된 바와 같이, miR-21 억제제의 심장 투여는 폐 섬유증을 감소시켰다; 예를 들어 아래 첨부된 도 13D 참조. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "폐 섬유증(pulmonary fibrosis)" 또는 "폐 섬유증(lung fibrosis)"은 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 따라서, 특정 양태에서, 조성물은 대상체의 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)/폐 섬유증(lung fibrosis)의 치료에 사용하기 위한 것이다. 보다 특정한 양태에서, 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)은 기계적 환기-관련 폐 섬유증(lung fibrosis)일 수 있다. 훨씬 더 바람직한 양태에서, 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)은 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)에서 기계적 환기 관련 폐 섬유증(lung fibrosis)일 수 있다. 본 명세서에 제공되는 조성물은 ARDS(급성 호흡 곤란 증후군)에 이어 섬유증으로 이어지는 폐 손상(예를 들어, 감염, 압력 및/또는 환기에 의해 유발됨) 치료의 사용에 특히 적합할 수 있다. 본 명세서에 제공된 조성물은 또한 섬유증의 예방 또는 치료에 적합할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 제공된 조성물은 또한 폐 섬유증의 발병에 앞서 폐 손상 및/또는 ARDS의 치료 또는 예방에 적합할 수 있다.
폐 섬유증을 앓고 있는 대상체는 추가로 폐 질환 또는 장애를 갖거나/앓거나/진단받을 수 있다. 폐 질환 또는 장애는 섬유증, 바람직하게는 폐 섬유증을 유발하거나 이와 연관될 수 있다. 바람직한 양태에서, 폐 질환 또는 장애는 바이러스 및/또는 세균에 의해 유발되거나, 염증과 관련되거나, 만성 폐쇄성 폐 질환이거나, 특발성 폐 섬유증이다. 섬유증은 또한 염증을 유발할 수 있으며 본 명세서에 제공된 조성물은 이러한 염증의 치료에 사용될 수 있다. 보다 바람직한 양태에서, 폐 질환 또는 장애는 바이러스 감염 및/또는 폐 질환 또는 장애는 바이러스 감염에 기초하거나 관련되어 있다. 추가 양태에서, 폐 질환 또는 장애는 바이러스 감염 및/또는 세균 감염이다. 따라서, 본 발명에 따라 치료될 상기 대상체는 바이러스 감염 및/또는 세균 감염과 관련된 폐 질환/장애를 앓을 수 있고, 즉 대상체는 또한 두 종류의 감염을 겪을 수 있다. 보다 바람직한 양태에서, 폐 질환 또는 장애는 바이러스성 폐렴 감염이다. 보다 바람직한 양태에서, 폐 질환 또는 장애는 코로나 바이러스 질환이다. 보다 바람직한 양태에서, 폐 질환 또는 장애는 COVID 및/또는 SARS 또는 MERS와 관련되거나 유발된다. 보다 바람직한 양태에서, 폐 질환 또는 장애는 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-1에 의해 유발되거나 유도된다. 특히 바람직한 양태에서, 폐 질환 또는 장애는 COVID-19이다. 본 발명자들은 예를 들어 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-1에 의해 유발되거나 유도된 바이러스 감염 및/또는 세균 감염과 관련되거나 이에 의해 유발된 폐 섬유증이 치료될 수 있다고 생각했는데, 이는 이러한 대상체의 miR-21 수준이 증가했기 때문이다. 본 발명자들은 놀랍게도 miR-21이 폐 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체의 폐에서 증가한다는 것을 발견하였다; 아래 도 13A 및 B를 참조. miR-21 억제제로 치료하면 폐 섬유증이 감소하였다. 아래에 설명된 바와 같이, 대식세포 또는 섬유아세포에서 miR-21의 억제는 섬유증을 감소 및/또는 예방한다. 따라서, 대식세포 및/또는 섬유아세포에 대한 miR-21 억제제의 전달이 그럴듯해진다. 따라서, 본 명세서에 제공된 조성물 및 이의 용도는 폐 질환 또는 장애에 의해 야기되고/되거나 이와 관련된 폐 섬유증 치료에 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명은 대상체가 폐 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체의 폐 섬유증 치료에서의 조성물의 용도에 관한 것으로, 여기서 조성물은 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함한다. 추가의 특정 양태에서, 본 발명은 대상체의 폐 섬유증 치료에서의 조성물의 용도에 관한 것으로, 여기서 대상체는 폐 질환 또는 장애를 앓고 있고, 조성물은 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포 및/또는 섬유아세포에 전달하는 모이어티를 포함한다.
훨씬 더 바람직한 양태에서, 폐 질환 또는 장애는 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-1에 의해 야기되거나 이와 연관된다.
특정 양태에서, 본 발명에서 치료되는 폐 섬유증은 폐 지지 또는 기계적 환기에 의해 유발되거나 연관된다. 추가 양태에서, 본 발명에서 치료되는 폐 섬유증은 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS)을 따르거나 그와 연관된다.
추가 양태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 심장 섬유증, 폐 섬유증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 피부 섬유증, 연령-관련 섬유증 및/또는 비장 섬유증으로 구성된 군에서 선택되는 섬유증의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 조성물은 폐 섬유증 및/또는 심장 섬유증의 치료에 사용될 수 있다. 아래에 설명된 바와 같이, miR-21 억제제에 의한 심장 섬유증의 치료는 폐 섬유증을 추가로 감소/완화시켰다. 특정 양태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 대식세포 관련 섬유증의 치료에 사용될 수 있다.
본 명세서에 제공된 치료는 또한 섬유증, 바람직하게는 폐 섬유증을 앓고 있고, 추가로 폐 질환 또는 장애, 심장 질환 또는 장애, 및 간 질환 또는 장애로부터 선택되는 적어도 하나의 질환 또는 장애가 있는 대상체에게 투여될 수 있으며, 특히 여기서 섬유증, 바람직하게는 폐 섬유증은 폐 질환 또는 장애 및/또는 심장 질환 또는 장애와 관련된다. 특정 양태에서, 대상체는 폐 질환 또는 장애를 갖고, 추가로 심장 질환 또는 장애, 및/또는 간 질환 또는 장애를 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 치료될 대상체는 바람직하게는 인간, 즉 인간 환자이다.
특정 양태에서, 심장 질환 또는 장애는 예를 들어, 섬유증, 예를 들어, 폐 섬유증을 유발하거나 이와 관련된다. 추가 양태에서, 심장 질환 또는 장애는 심부전, 허혈, 허혈성 심부전, 심비대, 고혈압성 심부전, 확장기 심부전, 수축기 심부전, 심장 관련 저장 질환, 심근병증, 협착성 심낭염, 관상동맥 질환, 급성 심근경색증, 만성 심근경색증, 우심부전, 심부정맥, 심근염-관련 섬유증 및 심장 판막 질환으로 구성된 군에서 선택된다. 따라서, 본 명세서에 제공된 폐 섬유증의 치료는 투여되는 대상체가 폐 섬유증을 유발하거나 이와 관련된 임의의 추가 질환 또는 장애/상태를 앓을 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 맥락에서 본 명세서에 기재된 본 명세서에 제공된 조성물/화합물은 섬유증, 특히 폐 섬유증을 예방 및/또는 감소시킨다. 보다 특정 양태에서, 본 명세서에 제공된 조성물/화합물은 대식세포 전염증성 분극화를 예방하거나 감소시키고, 염증, 근섬유아세포 변형, 및/또는 폐에서의 섬유증(즉, 폐 섬유증)을 예방한다. 따라서, 치료될 폐의 섬유증은 또한 대식세포로부터 분비되는 섬유아세포 활성화 및/또는 섬유아세포 억제 인자의 조절에 의해 자극될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 맥락에서 본 명세서에 기재된 조성물/화합물은 급성 손상/질병/장애 후 적어도 약 5일 후에 대상체/환자에게 투여되어야 한다. 특정 양태에서, 조성물은 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS) 후 적어도 약 5일 후에 대상체에게 투여된다. 그러나, 의학적 개입이 필요한 환자는 가능한 가장 빠른 시점에 본 발명의 화합물/조성물을 투여받는 것으로 구상된다. 추가의 특정 양태에서, 조성물은 허혈 후 적어도 약 5일에 대상체에게 투여된다. 하기 본 명세서에 입증되는 바와 같이, 허혈(심장) 후 적어도 5일 후에 miR-21 억제제의 투여는 예기치 않게 허혈성 심근에서 증가된 흡수 및 치료 효능을 제공하였다. miR-21 억제제의 증가된 흡수가 허혈 직후에만 예상되었기 때문에 miR-21 억제제의 증가된 흡수의 발견은 허혈 후 5일에는 예상치 못한 것이었다. 급성 손상/질병/장애 상황에서 miR-21 억제제, 특히 안티센스 miR-21의 흡수는 잠재적으로 내피의 누출 및 세포외 기질의 용해로 인해 증가된다(이론에 구속되지 않음). 따라서, miR-21 억제제의 투여가 급성 손상/질병/장애(예를 들어, 허혈 또는 ARDS) 후 약 5일 후에도 miR-21 억제제의 증가된 흡수를 초래한다는 것이 놀랍게도 본 명세서에 기록되어 있다. 따라서 급성 손상/질병/장애(예: 허혈 또는 ARDS) 후 적어도 약 5일 후에 miR-21 억제제의 투여는 이러한 지연된 투여는 급성 환경에서 해로운 영향을 피하기 때문에 급성 손상/질병/장애(예: 허혈 또는 ARDS)에서의 투여에 비해 더 안전할 수 있다. 본 명세서에서 급성 손상/질병/장애는 손상/질병/장애로 인해 대상체에서 miR-21 억제제의 흡수가 증가된 상황을 의미한다. 따라서, 급성 상황에서 대상체가 손상/질병/장애를 앓지 않는 상태에 비해 miR-21 억제제의 흡수가 증가한다.
특정 양태에서, 본 발명의 조성물/화합물은 급성 손상/질병/장애 후, 특히 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS) 또는 허혈 후 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 또는 적어도 약 19일에 대상체/환자에게 투여되어야 한다. 특히, 조성물은 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS) 후 적어도 약 19일 후에 대상체에게 추가로 투여되어야 한다. 특정 양태에서, 조성물은 급성 손상/질환/장애 후, 특히 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS) 또는 허혈 후 적어도 약 19, 20, 30, 또는 40일 후에 대상체에게 투여되어야 한다. 일반적으로, 뒤늦은 투여, 즉 급성 사건 후, 예를 들어, 허혈 또는 ARDS 이후 투여가 유익한 치료 효과를 제공한다는 것이 놀랍게도 본 명세서에서 입증되었다. 따라서, 이러한 급성 사건 이후의 투여는 급성 질병 또는 장애에서의 투여에 비해 유리하다. 따라서, 특정 양태에서, 본 명세서에 제공된 조성물/화합물은 급성 질병 또는 장애, 예를 들어 급성 심장 질환 또는 장애, 및/또는 급성 폐 질환 또는 장애에 투여되지 않는다. 따라서, 상기 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포 및/또는 섬유아세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 조성물/화합물은 상기 폐 질환 또는 장애, 및/또는 상기 심장 질환 또는 장애의 만성 단계에서 투여되는 것이 바람직하다. 따라서 그리고 예로서 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 조성물/화합물을 예를 들어, 폐 섬유증의 만성 단계 동안 본 발명의 화합물/조성물을 필요로 하는 환자에게 제공하는 것으로 구상된다. 상응하는 시나리오는 예를 들어 감염(예를 들어, SARS-CoV-2)에 의해 유발된 폐 섬유증에서 감염원이 환자에서 더 이상 감지되지 않지만 (폐) 손상이 지속되거나 심지어 악화되는 경우 본 발명의 화합물/조성물의 의학적/약학적 사용이다. 예를 들어, 소위 "Long-COVID" 환자의 경우일 수 있다. 그러나, 예를 들어 감염으로 인한 폐 섬유증과 같은 폐 손상을 예방하는 경우에도 약물이 필요한 환자에게 가능한 한 가장 빠른 시점에 동일하게 제공되는 것이 구상된다는 점에 유의해야 한다.
또한 놀랍게도 약 10 mg의 miR-21 억제제를 포함하는 단일 용량으로 조성물의 투여는 치료 효과 및 감소된 섬유증을 제공하며, 예를 들어 miR-21 억제제의 단일 용량은 miR-21과 miR-21로 인한 부담을 줄인다는 것이 하기에 입증된다. 따라서, 특정 양태에서, 조성물은 약 10 mg의 miR-21 억제제를 포함하는 단일 용량으로 투여되어야 한다. 추가의 특정 양태에서, 조성물은 약 10 mg 이하의 miR-21 억제제를 포함하는 단일 용량으로 투여된다. 예를 들어, 조성물은 약 1 mg, 약 2 mg, 약 3 mg, 약 4 mg, 약 5 mg, 약 6 mg, 약 7 mg, 약 8 mg, 또는 약 9 mg의 miR-21 억제제을 포함하는 단일 용량으로 투여될 것이다. 본 발명자는 조성물의 폐 투여가 10 mg 미만의 miR-21 억제제를 필요로 한다고 생각한다. 추가 양태에서, 본 발명의 조성물/화합물은 약 1 mg 내지 약 1 g의 본 발명의 조성물/화합물을 포함하는 용량으로 의학적 개입을 필요로 하는 환자에게 투여된다. 투여될 상기 용량은 단일 용량일 수 있다. 투여는 예를 들어 흡입을 통해/에어로졸로서 이루어질 수 있다. 추가의 특정 양태에서, 조성물/화합물은 본 발명의 상기 조성물/화합물의 약 10 mg 내지 약 900 mg을 포함하는 단일 용량으로 투여된다. 예를 들어, 조성물/화합물은 약 100 mg 내지 약 800 mg의 조성물을 포함하는 단일 용량으로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 조성물/화합물의 폐 투여가 개별 용량당 약 1 mg 내지 약 1 g의 본 발명의 조성물/화합물을 필요로 한다고 생각한다. 상기 폐 투여는 흡입을 통해, 예를 들어 에어로졸 형태로 달성될 수 있다.
본 명세서의 위와 아래에 제공된 바와 같이, 조성물은 miR-21 억제제 및 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함한다. 전술한 바와 같이, 담체 및/또는 모이어티는 대식세포 또는 표적 세포에서 miR-21 억제제를 농축하게 한다. 따라서, 담체 및/또는 모이어티는 대식세포 또는 표적 세포에서 조성물을 농축하게 한다. 담체 및/또는 모이어티는 대식세포(들) 및 섬유아세포(들)에서 조성물을 농축하게 한다. 특정 양태에서, 조성물에 포함된 모이어티 및/또는 담체는 조성물을 섬유아세포 또는 섬유아세포들에 전달할 수 있다. 특정의 추가 양태에서, 조성물에 포함된 모이어티 및/또는 담체는 조성물을 대식세포 또는 대식세포들 및/또는 섬유아세포 또는 섬유아세포들에 전달할 수 있다. 특정의 추가 양태에서, 조성물에 포함된 모이어티 및/또는 담체는 조성물을 대식세포 또는 대식세포들 및 섬유아세포 또는 섬유아세포들에 전달한다. 따라서, 특정 양태는 miR-21 억제제가 표적 세포에 전달된다는 것이다. 예를 들어, miR-21 억제제를 표적에 전달하는 담체 및/또는 모이어티는 반드시 표적 세포에 들어갈 필요는 없으며, 바람직하게는 표적 세포는 대식세포 및/또는 섬유아세포이고, 또는 보다 바람직하게는 여기서 표적 세포는 대식세포이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 "담체", "모이어티" 또는 "부분"은 "담체", "모이어티" 또는 "부분"이 표적 세포의 세포 표면에서 miR-21 억제제의 농축을 제공하는 한 반드시 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 표적 세포는 대식세포 및/또는 섬유아세포이거나, 보다 바람직하게는 표적 세포는 대식세포이다. 대식세포 및/또는 섬유아세포의 표적화는 당업계에 공지되어 있다. 보다 바람직하게는, "담체" 또는 "모이어티"는 표적 세포의 세포 표면에서 miR-21 억제제의 농축을 제공하고 miR-21 억제제는 표적 세포에 들어가고, 바람직하게는 표적 세포는 대식세포 및/또는 섬유아세포이고, 또는 보다 바람직하게는 여기서 표적 세포는 대식세포이다. 훨씬 더 바람직하게는, "담체" "모이어티" 또는 "부분"은 표적 세포의 세포 표면에서 miR-21 억제제의 농축을 제공하고, miR-21 억제제는 표적 세포에 들어가고 miR-21 억제제는 miR-21의 표적을 억제하거나 과발현하고, 바람직하게는 표적 세포는 대식세포 및/또는 섬유아세포이며, 또는 보다 바람직하게는 여기서 표적 세포는 대식세포이다.
특정 양태에서, 모이어티 또는 담체는 나노입자, 리포좀, 지질 나노입자(LNP), 메조포러스 실리카 나노입자(MSN), 항체 또는 이의 기능적 단편, 및 저분자 리간드(당 또는 변형된 당 모이어티가 리간드로 사용되는 첨부된 실시예에서와 같이) 및 (단백질성) 리간드 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. (저분자) 리간드는 또한 대식세포의 표면(및 임의로 섬유아세포의 표면)의 마커/수용체와 상호작용할 수 있는 화학물질 및/또는 의약품을 포함할 수 있다.
대식세포의 표면(및 임의로 섬유아세포의 표면)에서 상응하는 (표면) 마커/수용체와 상호작용할 수 있는 (단백질성) 리간드 또는 이의 기능적 단편(들)에 대해 필요한 수정을 가하여 동일하게 적용된다. 예를 들어, 이러한 "단백질성 리간드"는 또한 본 명세서에 정의된 세포 표면 수용체(들)과 특이적으로 상호작용 및/또는 특이적으로 결합하는 항체(또는 이의 기능적 단편)를 포함할 수 있다. 그러나, 용어 "리간드"는 또한 더 작은 펩타이드 또는 펩타이드 구조를 포함한다. 이러한 "펩타이드 리간드"의 예는 Scodeller(2017); Sci Rep 7: 14655에 개시된 펩타이드 "C-S-P-G-A-K-V-R-C"(SEQ ID NO: 6; CSPGAKVRC)일 수 있다. 상기 펩타이드는 MRC1에 대한 상호작용 펩타이드, 즉 대식세포의 세포 표면 수용체이다. 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 "모이어티"는 또한 대식세포(및/또는 선택적으로 섬유아세포에) 상의 관련 세포 표면 수용체와 상호작용/결합할 수 있는 지질 구조 뿐만 아니라 나노바디 등을 포함할 수 있다.
억제제의 대식세포로의 전달은 당업자에게 알려져 있으며; 예를 들어 (Juliano, 2016) Juliano RL; The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 2016 Aug 19;44(14):6518-48. doi: 10.1093/nar/gkw236. Epub 2016 Apr 15). 다음의 비제한적인 예에서 miR-21 억제제의 표적 세포로의 전달이 제공된다. 추가 양태에서, 모이어티는 대식세포; 섬유아세포 및 대식세포; 폐 대식세포; 또는 폐 섬유아세포 및 폐 대식세포에서 발견되는 하나 이상의 항원에 결합한다. 추가의 특정 양태에서, 모이어티는 대식세포; 섬유아세포 및 대식세포; 폐 대식세포; 또는 폐 섬유아세포 및 폐 대식세포에서 배타적으로 발견되는 적어도 하나의 항원에 결합한다. 추가의 특정 양태에서, 모이어티는 대식세포; 섬유아세포 및 대식세포; 폐 대식세포; 또는 폐 섬유아세포 및 폐 대식세포 상에서 배타적으로 발견되는 적어도 하나의 항원에 특이적으로 결합한다. 본 명세서에 사용된 용어 "특이적으로 결합한다" 및/또는 "특이적으로 및/또는 우세하게 결합하거나 상호작용한다"는 모이어티가 임의의 다른 또는 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드보다 표적 세포(즉, 여기서 특히 대식세포)의 표면 상의 적어도 하나의 항원 및/또는 수용체/마커에 대해 더 강한 결합 친화성을 갖는다는 것을 의미한다.
예를 들어, 모이어티는 길항제(들), 작용제(들), 베타 아드레날린성 수용체(들), G-단백질-결합된 수용체(들) 및 수용체(들)에 결합하는 사이토카인(들)로 구성된 군에서 선택되는 세포 표면 수용체(들)에 (특이적으로 및/또는 우세하게) 결합하는 저분자 리간드 또는 단백질성 리간드 또는 이의 기능적 단편일 수 있다. 본 명세서에 토론된 바와 같이, "저분자 리간드"는 또한 대식세포(및/또는 섬유아세포 및 대식세포 및 섬유아세포)의 그러한 세포 표면 수용체(들)에 (특이적으로 또는 우세하게) 결합하거나 또는 (특이적으로 또는 우세하게) 상호작용하는 화학물질 또는 의약품을 포함할 수 있다. 상기 "저분자 리간드" 또는 상기 "단백질성 리간드 또는 이의 기능적 단편"은 상응하는 (세포 표면) 수용체의 천연 리간드일 수 있다. 예시가 본 명세서에 제공된다: 여기에서 하나 이상의 당 또는 변형된 당 모이어티는 "전달 모이어티"로 사용된다(현재 예시된 경우 예를 들어 트리-만노스 또는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 및 "표적화 구조는 만노스 수용체 C 유형 1, 대식세포 상의 이러한 당/변형 당 모이어티에 대한 표면 수용체임).
표 3에서, 표시된 표적 세포, 예를 들어, 대식세포, 섬유아세포, 및 대식세포 및 섬유아세포로의 전달을 제공할 수 있는 예시 표면 수용체/마커들이 제공된다. 이들 표면 수용체/마커들은 또한 본 발명의 맥락에서 "상기 miR-21 억제제를 대식세포; 섬유아세포 및 대식세포; 폐 대식세포; 및/또는 폐 섬유아세포 및 폐 대식세포에 전달하는 모이어티"로서 사용될 수 있는 항체(또는 이의 기능적 단편)의 표적일 수 있다.
정제된 프라이머리 세포 분획의 RNA 시퀀싱에 의해 확인된 바와 같은 인간 폐 및 심장 조직의 대식세포 및/또는 섬유아세포에 대한 miR-21 억제제의 표적화/전달을 위한 예시적인 수용체/마커. 선별은 양(abundance), 세포 유형-특이성 및 수용체 특성규명을 기반으로 한다.
앙상블 유전자 ID 앙상블 유전자 ID 버전 유전자명 유전자 설명 세포 유형 조직
ENSG00000260314 ENSG00000260314.3 MRC1 Mannose receptor C type 1 심장 및 폐 대식세포
ENSG00000165457 ENSG00000165457.14 FOLR2 Folate receptor beta 심장 및 폐 대식세포
ENSG00000278355 ENSG00000278355.4 LILRA5 Leukocyte immunoglobulin like receptor A5 심장 및 폐 대식세포
ENSG00000132514 ENSG00000132514.14 CLEC10A C-Type lectin domain containing 10A 심장 및 폐 대식세포
ENSG00000019169 ENSG00000019169.11 MARCO Macrophage receptor with collagenous structure 심장 및 폐 대식세포
ENSG00000171049 ENSG00000171049.9 FPR2 Formyl peptide receptor 2 폐 대식세포
ENSG00000140678 ENSG00000140678.17 ITGAX Integrin subunit alpha X 폐 대식세포
ENSG00000132170 ENSG00000132170.23 PPARG Peroxisome proliferator activated receptor gamma 폐 대식세포
ENSG00000019582 ENSG00000019582.16 CD74 CD74 antigen 심장 대식세포
ENSG00000182578 ENSG00000182578.13 CSF1R Colony stimulating factor 1 receptor 심장 대식세포
ENSG00000158869 ENSG00000158869.11 FCER1G Fc receptor 심장 대식세포
ENSG00000170458 ENSG00000170458.14 CD14 CD14 antigen 심장 대식세포
ENSG00000129226 ENSG00000129226.14 CD68 CD68 antigen 심장 대식세포
ENSG00000134853 ENSG00000134853.12 PDGFRA Platelet derived growth factor receptor 심장 및 폐 섬유아세포
ENSG00000168079 ENSG00000168079.17 SCARA5 Scavenger receptor class A member 5 심장 섬유아세포
ENSG00000167601 ENSG00000167601.12 AXL AXL Receptor Tyrosine Kinase 심장 섬유아세포
ENSG00000164530 ENSG00000164530.15 PI16 Peptidase inhibitor 16 심장 섬유아세포
ENSG00000011028 ENSG00000011028.14 MRC2 Mannose receptor 2 심장 섬유아세포
ENSG00000123384 ENSG00000123384.14 LRP1 Low density lipoprotein receptor-related protein 1 심장 및 폐 Macrophages and 섬유아세포
ENSG00000082781 ENSG00000082781.12 ITGB5 Integrin beta 5 심장 및 폐 Macrophages and 섬유아세포
ENSG00000241399 ENSG00000241399.7 CD302 CD302 폐 Macrophages and 섬유아세포
ENSG00000174837 ENSG00000174837.15 ADGRE1 Adhesion G protein-coupled receptor E1 심장 및 폐 대식세포
ENSG00000177575 ENSG00000177575.12 CD163 CD163 antigen 심장 및 폐 대식세포
ENSG00000168329 ENSG00000168329.14 CX3CR1 C-X3-C motif chemokine receptor 1 심장 및 폐 대식세포
ENSG00000105383 ENSG00000105383.15 CD33 CD33 antigen 심장 대식세포
ENSG00000143119 ENSG00000143119.14 CD53 CD53 antigen 심장 대식세포
ENSG00000011600 ENSG00000011600.12 TYROBP Transmembrane immune signaling adaptor TYROBP 심장 대식세포
ENSG00000121807 ENSG00000121807.6 CCR2 C-C motif chemokine receptor 2 심장 대식세포
ENSG00000169442 ENSG00000169442.9 CD52 CD52 molecule 심장 대식세포
ENSG00000169896 ENSG00000169896.18 ITGAM Integrin subunit alpha M 심장 대식세포
ENSG00000198223 ENSG00000198223.17 CSF2RA Colony stimulating factor 2 receptor subunit alpha 심장 대식세포
ENSG00000131981 ENSG00000131981.16 LGALS3 Galectin 3 심장 대식세포
ENSG00000141655 ENSG00000141655.17 TNFRSF11A TNF receptor superfamily member 11a 심장 대식세포
ENSG00000072135 ENSG00000072135.13 PTPN18 Protein tyrosine phosphatase non-receptor Type 18 심장 대식세포
ENSG00000117091 ENSG00000117091.10 CD48 CD48 antigen 심장 대식세포
ENSG00000240505 ENSG00000240505.9 TNFRSF13B TNF receptor superfamily member 13B 심장 대식세포
ENSG00000110876 ENSG00000110876.10 SELPLG Selectin P ligand 심장 대식세포
ENSG00000169252 ENSG00000169252.6 ADRB2 Adrenoceptor beta 2 심장 대식세포
ENSG00000133800 ENSG00000133800.9 LYVE1 Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 심장 대식세포
ENSG00000140030 ENSG00000140030.6 GPR65 G protein-coupled receptor 65 심장 대식세포
ENSG00000169403 ENSG00000169403.12 PTAFR Platelet activating factor receptor 심장 대식세포
ENSG00000171860 ENSG00000171860.5 C3AR1 Complement component 3a receptor 1 심장 대식세포
ENSG00000072694 ENSG00000072694.21 FCGR2B Fc receptor 심장 대식세포
ENSG00000203747 ENSG00000203747.11 FCGR3A Fc receptor 심장 대식세포
ENSG00000171631 ENSG00000171631.14 P2RY6 Pyrimidinergic receptor P2Y 심장 대식세포
ENSG00000150337 ENSG00000150337.13 FCGR1A Fc receptor, IgG, high affinity I 폐 대식세포
ENSG00000162723 ENSG00000162723.10 SLAMF9 SLAM family member 9 폐 대식세포
ENSG00000106799 ENSG00000106799.13 TGFBR1 Transforming growth factor, beta receptor I 폐 대식세포
ENSG00000196664 ENSG00000196664.5 TLR7 Toll-like receptor 7 폐 대식세포
ENSG00000101916 ENSG00000101916.11 TLR8 Toll-like receptor 8 폐 대식세포
ENSG00000095970 ENSG00000095970.17 TREM2 Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 폐 대식세포
ENSG00000135077 ENSG00000135077.9 HAVCR2 Hepatitis A virus cellular receptor 2 폐 대식세포
ENSG00000147650 ENSG00000147650.12 LRP12 Low density lipoprotein receptor-related protein 12 폐 대식세포
ENSG00000163606 ENSG00000163606.11 CD200R1 CD200 receptor 1 폐 대식세포
ENSG00000167772 ENSG00000167772.12 ANGPTL4 Angiopoietin Like 4 폐 대식세포
ENSG00000054219 ENSG00000054219.11 LY75 Lymphocyte antigen 75 폐 대식세포
ENSG00000181631 ENSG00000181631.7 P2RY13 Purinergic receptor P2Y13 폐 대식세포
ENSG00000109743 ENSG00000109743.11 BST1 Bone marrow stromal cell antigen 1 폐 대식세포
ENSG00000173391 ENSG00000173391.9 OLR1 Oxidized low density lipoprotein receptor 1 폐 대식세포
ENSG00000151490 ENSG00000151490.15 PTPRO Protein tyrosine phosphatase receptor type O 폐 대식세포
ENSG00000140564 ENSG00000140564.13 FURIN Furin, paired basic amino acid cleaving enzyme 폐 대식세포
ENSG00000090659 ENSG00000090659.18 CD209 CD209 molecule 폐 대식세포
ENSG00000171659 ENSG00000171659.15 GPR34 G protein-coupled receptor 34 폐 대식세포
ENSG00000069702 ENSG00000069702.11 TGFBR3 Transforming growth factor 심장 섬유아세포
ENSG00000169439 ENSG00000169439.12 SDC2 Syndecan 2 심장 섬유아세포
ENSG00000159640 ENSG00000159640.16 ACE Angiotensin I converting enzyme (peptidyl-dipeptidase A) 1 심장 섬유아세포
ENSG00000169604 ENSG00000169604.19 ANTXR1 Anthrax toxin receptor 1 심장 섬유아세포
ENSG00000162733 ENSG00000162733.19 DDR2 Discoidin domain receptor family 심장 섬유아세포
ENSG00000183098 ENSG00000183098.11 GPC6 Glypican 6 심장 섬유아세포
ENSG00000198121 ENSG00000198121.13 LPAR1 Lysophosphatidic acid receptor 1 심장 섬유아세포
ENSG00000179954 ENSG00000179954.16 SSC5D Scavenger receptor cysteine rich family member with 5 domains 심장 섬유아세포
ENSG00000106538 ENSG00000106538.10 RARRES2 Retinoic acid receptor responder 2 심장 섬유아세포
ENSG00000100196 ENSG00000100196.11 KDELR3 KDEL endoplasmic reticulum protein retention receptor 3 심장 섬유아세포
ENSG00000182175 ENSG00000182175.14 RGMA Repulsive guidance molecule BMP co-receptor A 심장 섬유아세포
ENSG00000129048 ENSG00000129048.7 ACKR4 Atypical chemokine receptor 4 심장 섬유아세포
ENSG00000160013 ENSG00000160013.9 PTGIR Prostaglandin I2 receptor 심장 섬유아세포
ENSG00000144476 ENSG00000144476.6 ACKR3 Atypical chemokine receptor 3 심장 섬유아세포
ENSG00000104213 ENSG00000104213.13 PDGFRL Platelet derived growth factor receptor like 심장 섬유아세포
ENSG00000128602 ENSG00000128602.11 SMO Smoothened, frizzled class receptor 심장 섬유아세포
ENSG00000151892 ENSG00000151892.15 GFRA1 GDNF family receptor alpha 1 심장 섬유아세포
상기 표 3에 나타낸 수용체(들) 또는 세포 표면 분자(들)는 miR-21 억제제를 전달하는 모이어티의 결합, 또는 miR-21 억제제의 표적화에 적합할 수 있다. 따라서, 조성물에 포함된 모이어티는 상기 표 3에 나타낸 바와 같이 수용체(들) 또는 세포 표면 분자(들) 중 하나 이상에 결합할 수 있다. 표 3에 기재된 수용체 또는 세포 표면 분자는 아래 본 명세서에서 인간 폐 또는 심장 조직의 대식세포 및/또는 섬유아세포에 포함되는 것으로 확인되었다. 또한, 수용체 또는 세포 표면 분자는 정제된 프라이머리 세포 분획의 RNA 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다. 첨부된 실시예에 설명된 바와 같이 만노스 수용체 C 유형 1(Mrc1)은 대식세포에서 강하게 발현된다. 이것은 MRC1을 "miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는" 모이어티를 위한 특히 원하고 바람직한 표적으로 만든다. 따라서 상응하는 모이어티는 MRC1/a 만노스 수용체 리간드에 결합하는 리간드이다. 이러한 리간드는 만노스와 같은 상응하는 당을 포함할 수 있다. MRC1에 대한 다른 리간드는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이것은 또한 첨부된 도 22에 예시되어 있다. 상기 도면은 만노스 수용체 C 유형 1(MRC1)이 폐 조직의 대식세포에 의해 발현됨을 문서화한다. 첨부된 도 23은 만노스 수용체 1 리간드의 화학 구조를 예시하며, 이에 의해 (A)는 리간드 컨쥬게이트 및 miR-21 억제제(여기서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 "anti-miR-21")의 비제한적이지만 예시적인 디자인의 도식을 나타낸다.
도 23(B)는 anti-miR-21 분자에 컨쥬게이트된 만노스-수용체 리간드(들)의 예시적이고 이에 따라 비제한적인 화학 구조를 제공한다. N-아세틸갈락토사민(GalNAc)(상단) 또는 만노스(여기서는 트리-만노스, 도면 하단 참조) 리간드는 (LNA-) anti-miR-21(miR21 억제제)의 5'-말단에 컨쥬게이트되었다. 당업계에 공지된 바와 같이, 예를 들어 Martinez-Pomares, L., (2012)는 MRC1에 대한 만노스 및 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 리간드의 결합을 보고하였다. 만노스 수용체 1(Mrc1)에 대한 추가의 예시적인 리간드는 MRC1의 세포외 부분에 대한 특이 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 그리고 첨부된 도 23(A)에 예시된 바와 같이, 본 발명의 맥락에서 사용되는 화합물의 일반적인 구조는 다음과 같은 포맷을 가질 수 있다:
miR-21 억제제- (링커) - 결합/표적화/전달 모이어티; 또는 결합/표적화/전달 모이어티 - (링커) - miR-21 억제제
대식세포에 대한 결합/표적화/전달 모이어티를 포함하는 후자의 비제한적인 예는 도 23(A)의 도식에 나타낸 상기 작제물이다,
- "대식세포에 표적화/전달하는 결합 모이어티"로서의 만노스 수용체 C 유형 1(MRC1)에 대한 리간드; 이어서
- (임의의) 링커/(링커); 이어서
- "miR-21 억제제"로서의 LNA-anti-miR-21
유용한 (생물학적) 링커 구조는 당업계에 매우 잘 알려져 있으며 클릭 화학 링커(예를 들어, DBCO, 테트라진, TCO, BCN, 카르복실 링커(5'-COOH-C5, 3'-COOH-C6), 알데히드/히드라지드, 모노메톡시트리틸 링커, 펩타이드 링커, β-글루코로나이드 링커, 스페이서 개질제(예: 스페이서 C3, 스페이서 C12), 방향족 링커, 이관능성 링커 등)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 링커 모이어티 사이에서 이를 통해 대식세포 및/또는 섬유아세포-특이적 리간드를 anti-miR-21 올리고뉴클레오티드에 부착하기 위해 다양한 "부착/링커 화학 수단 및 방법"이 이용가능하다는 것을 알고 있다. 그러한 "부착/링커 화학 수단 및 방법"은 올리고뉴클레오티드의 5' 위치에 1차 아미노기를 부가하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 수단 및 방법의 예는 올리고뉴클레오티드의 5' 위치에 1차 아민을 부가하는 데 사용되는 5'-아미노헥실 링커 및 TFA-아미노 링커 포스포르아미다이트를 변형시키는 것을 포함한다. 그것은 예를 들어 또한 "펩타이드 링커"가 하기 본 명세서에서 논의되는 본 발명의 맥락에서 사용되는 것으로 구상되며, 여기서 펩타이드는 또한 "링커 그룹"으로서 개시된다. 또한, "절단가능한 링커"가 사용될 수 있다는 것이 또한 구상되고 숙련된 기술자의 지식 내에서 이루어진다. 당업자는 miR-21 억제제 및 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 본 명세서에 정의된 본 발명의 화합물을 조립하기 위해 이러한 "절단가능한 링커"를 또한 쉽게 사용할 수 있는 위치에 있다. 이러한 "절단가능한 링커(들)"은 특히 Xue Y et al. Chem Soc Rev 2021 (DOI: 10.1039/d0cs01061h); Benizri (2019) Bioconjugate Chem. 2019, 30, 366-383 (특히 올리고뉴클레오티드를 위한) 또는 Jonathan (2019). Chem Soc Rev 48, 4361에 기술되어 있다.
본 발명의 화합물에서, 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 하나 이상의 모이어티, 예컨대(예를 들어) 본 명세서에 예시된 바와 같은 하나 이상의 당 또는 변형된 당 모이어티와 같은 (저분자) 리간드, 또는 하나 이상의 (단백질성) 리간드(또는 이의 기능적 단편) 또는 하나 이상의 항체(또는 이의 기능적 단편)은 상기 miR-21 억제제, 예컨대 anti-miR-21 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드의 말단 포스포로티오에이트 그룹에 직접적으로 또는 링커 그룹(이하 때때로 단순히 "링커"로 지칭됨)에 의해 연결될 수 있다. 다시, 본 명세서에 지적된 바와 같이, "링커" 구조를 통해 상기 miR-21 억제제가 대식세포(및/또는 임의로 섬유아세포)에 결합되도록 상기 miR-21 억제제를 전달하는 추가 모이어티가 사용될 수 있다.
이해되는 바와 같이, 링커는 특별히 제한되지 않으며 본 발명과 관련된 유익한 효과를 유지하면서 상당한 정도로 변경될 수 있다.
예를 들어, 링커 그룹은 선형 또는 분지형일 수 있음을 이해해야 한다. 특히, 링커 그룹이 분지형인 경우, 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 하나 이상의 잔기(예를 들어, 당 또는 변형된 당 잔기)가 링커 그룹에 부착될 수 있다.
링커 그룹이 각각의 당 또는 변형된 당 모이어티와 올리고뉴클레오티드의 말단 포스포로티오에이트 그룹 사이의 각 링커 사슬에서 20 이상 내지 100개 미만의 비수소 원자(바람직하게는 60개 미만의 비수소 원자)를 함유하는 것이 바람직하지만 이에 제한되지 않는다. 링커 그룹 전체의 비수소 원자의 수는 바람직하게는 20 이상 내지 200개 미만(바람직하게는 150 미만의 원자)의 원자이다. 비수소 원자는 바람직하게는 탄소, 질소 및 산소로부터 선택된다. 링커에서 비수소 원자의 15% 이하의 원자가 방향족 기의 일부인 것이 더욱 바람직하다.
보다 구체적으로, 링커는 C10-40 알킬렌, C10-40 알케닐렌 및 C10-40 알키닐렌으로부터 선택된 그룹 L일 수 있으며, 여기서 상기 알킬렌, 상기 알케닐렌 및 상기 알키닐렌은 각각 임의로 할로겐, C1-5 할로알킬, -O(C1-5 할로알킬), -CN, -OR21, -NR21R21, -NR21OR21, -COR21, -COOR21,-OCOR21, -CONR21R21, -NR21COR21, -NR21COOR21, -OCONR21R21, -SR21, -SOR21, -SO2R21, -SO2NR21R21, -NR21SO2R21, -SO3R21 및 -NO2 로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹으로 치환되고, 및 추가로 여기서 상기 상기 알킬렌, 상기 알케닐렌 또는 상기 알키닐렌에 포함된 하나 이상의 -CH2- 유닛은 각각 임의로 -O-, -NR21-, -CO-, -S-, -SO- 및 -SO2-로부터 독립적으로 선택된 그룹에 의해 대체된다; 또한, 상기 알킬렌, 상기 알케닐렌 또는 상기 알키닐렌에 포함된 하나 이상의 -CH2- 유닛은 각각 임의로 아릴렌, 헤테로아릴렌, 시클로알킬렌 및 헤테로시클로알킬렌으로부터 독립적으로 선택된 그룹으로 대체되며, 여기서 상기 아릴렌, 상기 헤테로아릴렌, 상기 시클로알킬렌 및 상기 헤테로시클로알킬렌은 각각 임의로 C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, 할로겐, C1-5 할로알킬, -CN, -OH, -O(C1-5 알킬), -SH, -S(C1-5 알킬), -NH2, -NH(C1-5 알킬) 및 -N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹으로 치환된다; 아릴렌, 헤테로아릴렌, 시클로알킬렌 및 헤테로시클로알킬렌 중에서, 아릴렌이 바람직하고 페닐렌이 보다 바람직하다.
각 R21은 독립적으로 수소, C1-5알킬, C2-5알케닐, C2-5알키닐, 카보시클릴 및 헤테로시클릴로부터 선택되며, 여기서 상기 알킬, 상기 알케닐 및 상기 알키닐은 각각 임의로 하나 이상의 그룹 RAlk로 치환되고, 및 추가로 여기서 상기 카보시클릴 및 상기 헤테로시클릴은 각각 임의로 하나 이상의 그룹 RCyc로 치환되며;
임의의 2개의 R21은 임의로 연결되어 고리를 형성하고;
각 RAlk는 독립적으로 -OH, -O(C1-5 알킬), -O(C1-5 알킬렌)-OH, -O(C1-5 알킬렌)-O(C1-5 알킬), -SH, -S(C1-5 알킬), -S(C1-5 알킬렌)-SH, -S(C1-5 알킬렌)-S(C1-5 알킬), -NH2, -NH(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-OH, -N(C1-5 알킬)-OH, -NH-O(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-O(C1-5 알킬), 할로겐, C1-5 할로알킬, -O(C1-5 할로알킬), -CN, -NO2, -CHO, -CO(C1-5 알킬), -COOH, -COO(C1-5 알킬), -O-CO(C1-5 알킬), -CO-NH2, -CO-NH(C1-5 알킬), -CO-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-CO(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-CO(C1-5 알킬), -NH-COO(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-COO(C1-5 알킬), -O-CO-NH(C1-5 알킬), -O-CO-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-5 알킬), -SO2-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-SO2-(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-SO2-(C1-5 알킬), -SO2-(C1-5 알킬), -SO-(C1-5 알킬), 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 및 헤테로시클로알킬로부터 선택되며, 여기서 상기 아릴, 상기 헤테로아릴, 상기 시클로알킬 및 상기 헤테로시클로알킬은 각각 임의로 C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, 할로겐, C1-5 할로알킬, -CN, -OH, -O(C1-5 알킬), -SH, -S(C1-5 알킬), -NH2, -NH(C1-5 알킬) 및 -N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹으로 치환되고;
각 RCyc는 독립적으로 C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, -OH, -O(C1-5 알킬), -O(C1-5 알킬렌)-OH, -O(C1-5 알킬렌)-O(C1-5 알킬), -SH, -S(C1-5 알킬), -S(C1-5 알킬렌)-SH, -S(C1-5 알킬렌)-S(C1-5 알킬), -NH2, -NH(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-OH, -N(C1-5 알킬)-OH, -NH-O(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-O(C1-5 알킬), 할로겐, C1-5 할로알킬, -O(C1-5 할로알킬), -CN, -NO2, -CHO, -CO(C1-5 알킬), -COOH, -COO(C1-5 알킬), -O-CO(C1-5 알킬), -CO-NH2, -CO-NH(C1-5 알킬), -CO-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-CO(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-CO(C1-5 알킬), -NH-COO(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-COO(C1-5 알킬), -O-CO-NH(C1-5 알킬), -O-CO-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-5 알킬), -SO2-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-SO2-(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-SO2-(C1-5 알킬), -SO2-(C1-5 알킬), -SO-(C1-5 알킬), 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 및 헤테로시클로알킬로부터 선택되며, 여기서 상기 아릴, 상기 헤테로아릴, 상기 시클로알킬 및 상기 헤테로시클로알킬은 각각 임의로 C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, 할로겐, C1-5 할로알킬, -CN, -OH, -O(C1-5 알킬), -SH, -S(C1-5 알킬), -NH2, -NH(C1-5 알킬) 및 -N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹으로 치환된다.
그룹 L에서 C10-40 알킬렌, C10-40 알케닐렌 및 C10-40 알키닐렌은 바람직하게는 각각 C20-35 알킬렌, C20-35 알케닐렌 및 C20-35 알키닐렌이며, 여기서 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌 각각은 전술한 바와 같이 변형될 수 있다. 링커는 C10-40 알킬렌 및 C10-40 알케닐렌, 보다 바람직하게는 C20-35 알킬렌 또는 C20-35 알케닐렌, 훨씬 더 바람직하게는 C20-35 알킬렌으로부터 선택되는 것이 더 바람직하며, 여기서 알킬렌 및 알케닐렌 각각은 전술한 바와 같이 변형될 수 있다.
분지형 링커의 경우, 링커의 분지 각각은 상기 정의된 바와 같은 그룹 L일 수 있고 링커의 주쇄는 상기 정의된 바와 같은 하나 또는 두 개의 그룹(들) L로 구성될 수 있는 것으로 구상된다. 링커의 주쇄가 2개의 그룹 L로 구성되는 경우, 이들은 순차적으로 -(그룹 L)-(그룹 L)- 연결되는 것이 바람직하며 서로 독립적으로 선택될 수 있다.
이해되는 바와 같이, 링커의 분지에서 C10-40 알킬렌, C10-40 알케닐렌 및 C10-40 알키닐렌(-CH2- 유닛의 임의의 치환 및 임의의 대체(들)을 포함)의 사슬 길이는 반드시 C10-40 으로 제한되지 않을 수 있지만 C4-9 알킬렌, C4-9 알케닐렌 및 C4-9 알키닐렌(-CH2- 유닛의 임의의 치환 및 임의의 대체(들)을 포함)를 포함할 수 있다.
따라서 분지형 링커의 예는 다음과 같은 구조를 가질 수 있다:
*-(그룹 L)
|
*-(그룹 L)-(그룹 L)-(그룹 L)-**
|
*-(그룹 L)
여기서 *는 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 위한 부착점을 나타내고, **는 miR-21 억제제를 위한 부착점을 나타낸다.
miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티가 저분자 예를 들어 당 또는 변형된 당 모이어티인 경우. "전달 모이어티"가 당 또는 변형된 당 모이어티인 경우, 링커는 이러한 당의 아노머 산소를 통해 당 또는 변형된 당 모이어티에 부착되는 것이 바람직하다.
"miR-2 억제제"가 올리고뉴클레오티드인 경우, 링커는 올리고뉴클레오티드의 말단 포스포로티오에이트 그룹을 통해 올리고뉴클레오티드에 부착되는 것이 바람직하다.
링커의 2개의 비제한적인 예가 하기에 제공되며, 그 중 하나는 분지형이고 다른 하나는 비분지형이다.
첫 번째 예에서, 링커는 분지형이며, 3개의 당 또는 변형된 당 모이어티가 제1 아미드 함유 모이어티를 통해 트리스(히드록시메틸)아미노메탄의 히드록시기에 (바람직하게는 아노머 산소를 통해) 부착되고, 여기서 트리스(히드록시메틸)아미노메탄의 아미노기는 제2 아미드 함유 모이어티를 통해 올리고뉴클레오티드(또는 miR-21의 임의의 다른 억제제), 바람직하게는 올리고뉴클레오티드의 말단 포스포로티오에이트 그룹에 연결된다. 링커는 임의로 마커 또는 표지를 포함한다. 바람직하게는, 제1 아미드 함유 모이어티는 각각 지방족이고 각각 사슬에 10 내지 15개의 원자를 함유한다. 더욱 바람직하게는, 이 분지형 링커 그룹은 도 23B의 제1 구조에 나타낸 바와 같으며, 여기서 N-아세틸갈락토사민 그룹은 독립적으로 다른 당 또는 변형된 당 모이어티(또는 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 다른 모이어티)에 의해 대체될 수 있고 올리고뉴클레오티드는 다양할 수 있음을 이해해야 한다(및 miR-21 억제제의 예이다). 본 발명의 맥락에서, 이들 당 또는 변형된 당 모이어티들은 단지 "miR-21 억제제"가 전달되는 "표적 세포" (본 실시예 및 본 발명의 맥락에서 대식세포 및/또는 섬유아세포 및 대식세포)의 표면 상의 세포 표면 단백질/수용체/마커와 상호작용할 수 있는 (저분자) 리간드의 예시적 예로서 의미되는 것으로 이해된다.
두 번째 예에서, 링커는 분지되지 않고 탄소, 질소 및 산소로부터 선택된 20 내지 40개의 원자를 함유한다. 바람직하게는, 링커는 -페닐렌-NHC(=O)CH2CH2-(OCH2CH2)4-OCH2CH2-C(=O)NH-(CH2)6- 그룹을 함유하거나 이로 구성되며, 여기서 페닐렌 그룹은 바람직하게는 당의 아노머 산소와 페닐렌 그룹 사이의 결합에 의해 당 또는 변형된 당 모이어티에 연결되고, (CH2)6- 그룹은 바람직하게는 말단 포스포로티오에이트 그룹을 통해 올리고뉴클레오티드에 연결된다. 바람직하게는, 이 링커 그룹은 도 23B의 두 번째 구조에 나타낸 바와 같으며, 여기서 디(만노실)만노스 그룹은 다른 당 또는 변형된 당 모이어티(또는 miR-21 억제제를 대식세포 및/또는 섬유아세포 및 대식세포에 전달하는 다른 모이어티)로 대체될 수 있으며, 올리고뉴클레오티드는 다양할 수 있음을 이해해야 한다(그리고 miR-21 억제제의 예임).
miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 조성물은 임의로 (예를 들어 형광) 마커 또는 표지를 추가로 함유한다. 이 마커는 miR-21 억제제, 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티 또는 링커에 있을 수 있다. 링커에서 이러한 마커 또는 표지의 예는 도 23B의 첫 번째 식에 나와 있다.
"링커" 구조에 대한 토론에서 상기 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "탄화수소 그룹"은 탄소 원자 및 수소 원자로 이루어진 그룹을 지칭한다.
"지환족"이라는 용어는 환형 그룹(cyclic group)과 관련하여 사용되며 해당 환형 그룹이 비방향족임을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 용어 "알칼"은 선형 또는 분지형일 수 있는 1가의 포화 비환식(즉, 비-환형) 탄화수소 그룹을 지칭한다. 따라서 "알킬" 그룹은 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하지 않다. "C1-5 알킬"은 탄소 원자가 1 내지 5개 있는 그룹을 나타낸다. 바람직한 예시적인 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필(예: n-프로필 또는 이소프로필), 또는 부틸(예: n-부틸, 이소부틸, sec-부틸 또는 tert-부틸)이다. 달리 정의되지 않는 한, 용어 "알킬"은 바람직하게는 C1-4 알킬, 더욱 바람직하게는 메틸 또는 에틸, 더욱 더 바람직하게는 메틸을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "알케닐"은 선형 또는 분지형일 수 있는 1가의 불포화 비환식 탄화수소 그룹을 지칭하며, 하나 이상(예를 들어, 하나 또는 둘)의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하나, 임의의 탄소-탄소 삼중 결합은 포함하지 않는다. 용어 "C2-5 알케닐"은 2 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 그룹을 나타낸다. 바람직한 예시적인 알케닐 그룹은 에테닐, 프로페닐(예를 들어, 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일 또는 프로프-2-엔-1-일), 부테닐, 부타디에닐(예를 들어, 부타 -1,3-디엔-1-일 또는 부타-1,3-디엔-2-일), 펜테닐 또는 펜타디에닐(예: 이소프레닐)이다. 달리 정의되지 않는 한, 용어 "알케닐"은 바람직하게는 C2-4 알케닐을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "알키닐"은 선형 또는 분지형일 수 있는 1가의 불포화 비환식 탄화수소 그룹을 지칭하며, 하나 이상(예를 들어, 하나 또는 둘)의 탄소-탄소 삼중 결합 및 임의로 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 포함한다. 용어 "C2-5 알키닐"은 2 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 알키닐 그룹을 나타낸다. 바람직한 예시적인 알키닐 그룹은 에티닐, 프로피닐(예를 들어, 프로파길), 또는 부티닐이다. 달리 정의되지 않는 한, 용어 "알키닐"은 바람직하게는 C2-4 알키닐을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "알킬렌"은 선형 또는 분지형일 수 있는 알칸디일 그룹, 즉 2가의 포화 비환식 탄화수소 그룹을 지칭한다. "C1-5 알킬렌"은 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 그룹을 나타내고, 용어 "C0-3 알킬렌"은 공유 결합(옵션 "C0 알킬렌"에 해당) 또는 C1-3 알킬렌이 존재함을 표시한다. 바람직한 예시적 알킬렌 그룹은 메틸렌(-CH2-), 에틸렌(예: -CH2-CH2- 또는 -CH(-CH3)-), 프로필렌(예: -CH2-CH2-CH2-, -CH(-CH2-) CH3)-, -CH2-CH(-CH3)-, 또는 -CH(-CH3)-CH2-), 또는 부틸렌(예: -CH2-CH2-CH2-CH2-)이다. 달리 정의되지 않는 한, "알킬렌"이라는 용어는 바람직하게는 C1-4 알킬렌(특히 선형 C1-4 알킬렌 포함)를 지칭하며, 보다 바람직하게는 메틸렌 또는 에틸렌, 더욱 바람직하게는 메틸렌을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "알콕시"는 -O- 그룹을 지칭하며, 여기서 이 그룹에 포함된 알킬 모이어티는 상기에 정의한 바와 같다.
본 명세서에 사용된 용어 "카보시클릴"은 일환식 고리뿐만 아니라 다리 걸친 고리(bridged ring), 스피로 고리 및/또는 접합 고리(fused ring) 시스템(예를 들어 2 또는 3개의 고리로 구성될 수 있음)을 포함하는 탄화수소 고리 그룹을 지칭하며, 여기서 상기 고리 그룹은 포화, 부분 불포화(즉, 불포화이지만 방향족은 아닌) 또는 방향족일 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, "카보시클릴"은 바람직하게는 아릴, 시클로알킬 또는 시클로알케닐을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "헤테로시클릴"은 일환식 고리뿐만 아니라 다리 걸친 고리, 스피로 고리 및/또는 접합 고리 시스템(예를 들어 2 또는 3개의 고리로 구성될 수 있음)을 포함하는 고리 그룹을 지칭하며, 여기서 상기 고리 그룹은 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상(예컨대, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 고리 헤테로원자를 포함하고, 나머지 고리 원자는 탄소 원자이며, 여기서 하나 이상의 S 고리 원자(존재하는 경우) 및/또는 하나 이상의 N 고리 원자(존재하는 경우)는 임의로 산화될 수 있고, 여기서 하나 이상의 탄소 고리 원자는 임의로 산화될 수 있으며(즉, 옥소 그룹을 형성하기 위해), 및 추가로 여기서 상기 고리 그룹은 포화, 부분 불포화(즉, 불포화이지만 방향족은 아닌) 또는 방향족일 수 있다. 예를 들어, 상기 고리 그룹에 포함된 각각의 헤테로원자-함유 고리는 1 또는 2개의 O 원자 및/또는 1 또는 2개의 S 원자(이는 임의로 산화될 수 있음) 및/또는 1, 2, 3 또는 4개의 N 원자(이는 임의로 산화될 수 있음)를 포함할 수 있으며, 단, 상응하는 헤테로원자-함유 고리 내의 헤테로원자의 총 수는 1 내지 4이고, 상응하는 헤테로원자-함유 고리에 적어도 하나의 탄소 고리 원자(이는 임의로 산화될 수 있음)가 존재한다. 달리 정의되지 않는 한, "헤테로시클릴"은 바람직하게는 헤테로아릴, 헤테로시클로알킬 또는 헤테로시클로알케닐을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "시클릴"은 상기 본 명세서에 정의된 카보시클릴 또는 헤테로시클릴을 지칭한다
본 명세서에 사용된 용어 "아릴"은 일환식 방향족 고리뿐만 아니라 적어도 하나의 방향족 고리를 포함하는 다리 걸친 고리 및/또는 접합 고리 시스템(예를 들어, 고리 시스템은 2 또는 3개의 접합 고리로 구성되며, 여기서 이들 접합 고리 중 적어도 하나는 방향족이고; 또는 다리 걸친 고리 시스템은 2개 또는 3개의 고리로 구성되며 여기서 이들 다리 걸친 고리 중 적어도 하나는 방향족임)을 포함하는 방향족 탄화수소 고리 그룹을 지칭한다. "아릴"은 예를 들어 페닐, 나프틸, 디알리닐(즉, 1,2-디히드로나프틸), 테트랄리닐(즉, 1,2,3,4-테트라히드로나프틸), 인다닐, 인데닐(예: 1H-인데닐), 안트라세닐, 페난트레닐, 9H-플루오레닐 또는 아줄레닐을 지칭할 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, "아릴"은 바람직하게는 6 내지 14개의 고리 원자, 보다 바람직하게는 6 내지 10개의 고리 원자를 가지며, 더욱 더 바람직하게는 페닐 또는 나프틸을 지칭하고, 가장 바람직하게는 페닐을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "헤테로아릴"은 일환식 방향족 고리뿐만 아니라 적어도 하나의 방향족 고리를 포함하는 다리 걸친 고리 및/또는 접합 고리 시스템(에를 들어, 고리 시스템은 2 또는 3개의 고리로 구성되며, 여기서 이들 접합 고리 중 적어도 하나는 방향족이고; 또는 다리 걸친 고리 시스템은 2개 또는 3개의 고리로 구성되며, 여기서 이들 다리 걸친 고리 중 적어도 하나는 방향족임)을 포함하는 방향족 고리 그룹을 지칭하며, 여기서 상기 방향족 고리 그룹은 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의) 고리 헤테로원자를 포함하고, 나머지 고리 원자는 탄소 원자이며, 여기서 하나 이상의 S 고리 원자(존재하는 경우) 및/또는 하나 이상의 N 고리 원자(존재하는 경우)는 임의로 산화될 수 있고, 및 또한 여기서 하나 이상의 탄소 고리 원자는 임의로 산화될 수 있다(즉, 옥소 그룹을 형성하기 위해). 예를 들어, 상기 방향족 고리 그룹에 포함된 각 헤테로원자-함유 고리는 1 또는 2개의 O 원자 및/또는 1 또는 2개의 S 원자(임의로 산화될 수 있음) 및/또는 1, 2, 3 또는 4개의 N 원자(임의로 산화될 수 있음)를 포함할 수 있으며, 단, 상응하는 헤테로원자-함유 고리에 있는 헤테로원자의 총 수는 1 내지 4이고 상응하는 헤테로원자-함유 고리에 적어도 하나의 탄소 고리 원자(임의로 산화될 수 있음)가 존재한다. "헤테로아릴"은 예를 들어 티에닐(즉, 티오페닐), 벤조[b]티에닐, 나프토[2,3-b]티에닐, 티안트레닐, 푸릴(즉, 푸라닐), 벤조푸라닐, 이소벤조푸라닐, 크로마닐, 크로메닐(예를 들어, 2H-1-벤조피라닐 또는 4H-1-벤조피라닐), 이소크로메닐(예를 들어, 1H-2-벤조피라닐), 크로모닐, 크산테닐, 페녹사티이닐(phenoxathiinyl), 피롤릴(예를 들어, 1H-피롤릴), 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리딜(즉, 피리디닐; 예를 들어, 2-피리딜, 3-피리딜, 또는 4-피리딜), 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 인돌릴(예를 들어, 3H-인돌릴), 이소인돌릴, 인다졸릴, 일돌리지닐, 푸리닐, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 퀴녹살리닐, 시놀리닐, 프터리디닐, 카바졸릴, β-카볼리닐, 페난트리디닐, 아크리디닐, 페리미디닐, 페난트롤리닐(예를 들어, [1,10]페난트롤리닐, [1,7]페난트롤리닐, 또는 [4,7]페난트롤리닐), 페나지닐, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 페노티아지닐, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 옥사디아졸릴(예를 들어, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,2,5-옥사디아졸릴(즉, 푸라자닐), 또는 1,3,4-옥사디아졸릴), 티아디아졸릴(예를 들어, 1,2,4-티아디아졸릴, 1,2,5-티아디아졸릴 또는 1,3,4-티아디아졸릴), 페녹사지닐, 피라졸로[1,5-a]피리미디닐(예를 들어, 피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일), 1,2-벤조이속사졸-3-일, 벤조티아졸릴, 벤조티아디아졸릴, 벤족사졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤지미다졸릴, 벤조[b]티오페닐(즉, 벤조티에닐), 트리아졸릴(예를 들어, 1H-1,2,3-트리아졸릴, 2H-1,2,3-트리아졸릴, 1H-1,2,4-트리아졸릴 또는 4H-1,2,4-트리아졸릴), 벤조트리아졸릴, 1H-테트라졸릴, 2H-테트라졸릴, 트리아지닐(예를 들어, 1,2,3-트리아지닐, 1,2,4-트리아지닐, 또는 1,3,5-트리아지닐), 푸로[2,3-c]피리디닐, 디히드로푸로피리디닐(예를 들어, 2,3-디히드로푸로[2,3-c]피리디닐 또는 1,3-디히드로푸로[3,4-c]피리디닐), 이미다조피리디닐(예를 들어, 이미다조[1,2-a]피리디닐 또는 이미다조[3,2-a]피리디닐), 퀴나졸리닐, 티에노피리디닐, 테트라히드로티에노피리디닐(예를 들어, 4,5,6,7-테트라히드로티에노[3,2-c]피리디닐), 디벤조푸라닐, 1,3-벤조디옥소릴, 벤조디옥사닐(예를 들어, 1,3-벤조디옥사닐 또는 1,4-벤조디옥사닐) 또는 쿠마리닐을 지칭할 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, 용어 "헤테로아릴"은 바람직하게는 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 고리 헤테로원자를 포함하는 5 내지 14원(보다 바람직하게는 5 내지 10원) 일환식 고리 또는 접합 고리 시스템을 지칭하며, 여기서 하나 이상의 S 고리 원자(존재하는 경우) 및/또는 하나 이상의 N 고리 원자(존재하는 경우)는 임의로 산화되고, 여기서 하나 이상의 탄소 고리 원자는 임의로 산화되며; 훨씬 더 바람직하게는, "헤테로아릴"은 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개 또는 3개)의 고리 헤테로원자를 포함하는 5 또는 6원 일환식 고리를 지칭하며, 여기서 하나 이상의 S 고리 원자(존재하는 경우) 및/또는 하나 이상의 N 고리 원자(존재하는 경우)는 임의로 산화되고, 여기서 하나 이상의 탄소 고리 원자는 임의로 산화된다. 또한, 달리 정의되지 않는 한, 용어 "헤테로아릴"은 특히 바람직하게는 피리디닐(예: 2-피리딜, 3-피리딜 또는 4-피리딜), 이미다졸릴, 티아졸릴, 1H-테트라졸릴, 2H-테트라졸릴, 티에닐(즉, 티오페닐)또는 피리미디닐을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "시클로알킬"은 일환식 고리뿐만 아니라 다리 걸친 고리, 스피로 고리 및/또는 접합 고리 시스템(예를 들어 2개 또는 3개의 고리로 구성될 수 있으며; 예컨대 2개 또는 3개의 접합 고리로 구성된 접합 고리 시스템)을 포함하는 포화 탄화수소 고리 그룹을 지칭한다. "시클로알킬"은 예를 들어 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 데칼리닐(즉, 데카히드로나프틸) 또는 아다만틸을 지칭할 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, "시클로알킬"은 바람직하게는 C3-11 시클로알킬, 더 바람직하게는 C3-7 시클로알킬을 지칭한다. 특히 바람직한 "시클로알킬"은 3 내지 7개의 고리원을 갖는 일환식 포화 탄화수소 고리이다. 더욱이, 달리 정의되지 않는 한, 용어 "시클로알킬"은 훨씬 더 바람직하게는 시클로헥실 또는 시클로프로필을 지칭하고, 훨씬 더 바람직하게는 시클로헥실을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "헤테로시클로알킬"은 일환식 고리뿐만 아니라 다리 걸친 고리, 스피로 고리 및/또는 접합 고리 시스템(예를 들어 2개 또는 3개의 고리로 구성될 수 있음; 예를 들어, 2개 또는 3개의 접합 고리로 구성된 접합 고리 시스템)을 포함하는 포화 고리 그룹을 지칭하며, 여기서 상기 고리 그룹은 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개)의 고리 헤테로원자를 함유하고, 나머지 고리 원자는 탄소 원자이며, 여기서 하나 이상의 S 고리 원자(존재하는 경우) 및/또는 하나 이상의 N 고리 원자(존재하는 경우)는 임의로 산화될 수 있고, 또한 여기서 하나 이상의 탄소 고리 원자는 임의로 산화될 수 있다(즉, 옥소 그룹을 형성하기 위해). 예를 들어, 상기 포화 고리 그룹에 포함된 각 헤테로원자-함유 고리는 1 또는 2개의 O 원자 및/또는 1 또는 2개의 S 원자(임의로 산화될 수 있음) 및/또는 1, 2, 3 또는 4개의 N 원자(임의로 산화될 수 있음)를 포함할 수 있다. 단, 상응하는 헤테로원자-함유 고리의 헤테로원자의 총 수는 1 내지 4이고 상응하는 헤테로원자-함유 고리에 적어도 하나의 탄소 고리 원자(임의로 산화될 수 있음)가 존재한다. "헤테로시클로알킬"은 예를 들어 아지리디닐, 아제티디닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 아제파닐, 디아제파닐(예를 들어, 1,4-디아제파닐), 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 몰포리닐(예를 들어, 폴포린-4-일), 티오몰포리닐(예를 들어, 티오몰포린-4-일), 옥사제파닐, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라히드로푸라닐, 1,3-디옥소라닐, 테트라히드로피라닐, 1,4-디옥사닐, 옥세파닐, 티이라닐, 티에타닐, 테트라히드로티오페닐(즉, 티올라닐), 1,3-디티오라닐, 티아닐, 티에파닐, 데카히드로퀴놀리닐, 데카히드로이소퀴놀리닐 또는 2-옥사-5-아자-비시클로[2.2.1]헵트-5-일을 지칭할 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, "헤테로시클로알킬"은 바람직하게는 일환식 고리 또는 접합 고리 시스템(예를 들어, 2개의 접합 고리로 구성된 접합 고리 시스템)인 3 내지 11원 포화 고리 그룹을 지칭하며, 여기서 상기 고리 그룹은 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 고리 헤테로원자를 함유하고, 여기서 하나 이상의 S 고리 원자(존재하는 경우) 및/또는 하나 이상의 N 고리 원자(존재하는 경우)는 임의로 산화되며, 여기서 하나 이상의 탄소 고리 원자는 임의로 산화되고; 보다 바람직하게는, "헤테로시클로알킬"은 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 1개 이상(예를 들어, 1개, 2개 또는 3개)의 고리 헤테로원자를 함유하는 5 내지 7원 포화 일환식 고리 그룹을 지칭하고, 여기서 하나 이상의 S 고리 원자(존재하는 경우) 및/또는 하나 이상의 N 고리 원자(존재하는 경우)는 임의로 산화되고, 여기서 하나 이상의 탄소 고리 원자는 임의로 산화된다. 더욱이, 달리 정의되지 않는 한, "헤테로시클로알킬"은 훨씬 더 바람직하게는 테트라히드로피라닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 피롤리디닐 또는 테트라히드로푸라닐을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "시클로알케닐"은 일환식 고리뿐만 아니라 다리 걸친 고리, 스피로 고리 및/또는 접합 고리 시스템(예를 들어 2개 또는 3개의 고리로 구성될 수 있다; 에컨대 2개 또는 3개의 접합 고리로 구성된 접합 고리 시스템)을 포함하는 불포화 비환식(비-방향족) 탄화수소 고리 그룹을 지칭하며, 상기 탄화수소 고리 그룹은 하나 이상(예를 들어, 1개 또는 2개)의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하나 임의의 탄소-탄소 삼중 결합은 포함하지 않는다. "시클로알케닐"은 예를 들어 시클로프로페닐, 시클로부테닐, 시클로펜테닐, 시클로헥세닐, 시클로헥사디에닐, 시클로헵테닐 또는 시클로헵타디에닐을 지칭할 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, "시클로알케닐"은 바람직하게는 C3-11 시클로알케닐을 지칭하고, 보다 바람직하게는 C3-7 시클로알케닐을 지칭한다. 특히 바람직한 "시클로알케닐"은 3 내지 7개의 고리원을 갖고 1개 이상(예를 들어, 1개 또는 2개, 바람직하게는 1개)의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 일환식 불포화 비환식 탄화수소 고리이다.
본 명세서에 사용된 용어 "헤테로시클로알케닐"은 일환식 고리뿐만 아니라 다리 걸친 고리, 스피로 고리 및/또는 접합 고리 시스템(예를 들어, 2개 또는 3개의 고리로 구성될 수 있다; 예를 들어, 2개 또는 3개의 접합 고리로 구성된 융합 고리 시스템)을 포함하는 불포화 비환식(비-방향족) 고리 그룹을 지칭하며, 여기서 상기 고리 그룹은 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4개의) 고리 헤테로원자를 함유하고, 나머지 고리 원자는 탄소 원자이며, 여기서 하나 이상의 S 고리 원자(존재하는 경우) 및/또는 하나 이상의 N 고리 원자(존재하는 경우)는 임의로 산화될 수 있고, 여기서 하나 이상의 탄소 고리 원자는 임의로 산화될 수 있으며(즉, 옥소 그룹을 형성하기 위해), 및 추가로 상기 고리 그룹은 인접한 고리 원자 사이에 적어도 하나의 이중 결합을 포함하며 인접한 고리 원자 사이에는 어떠한 삼중 결합도 포함하지 않는다. 예를 들어, 상기 불포화 비환식 고리 그룹에 포함된 각 헤테로원자-함유 고리는 1 또는 2개의 O 원자 및/또는 1 또는 2개의 S 원자(임의로 산화될 수 있음) 및/또는 1, 2, 3 또는 4개의 N 원자(임의로 산화될 수 있음)를 함유할 수 있으며, 단, 상응하는 헤테로원자-함유 고리에 있는 헤테로원자의 총 수는 1 내지 4개이고 상응하는 헤테로원자-함유 고리에 적어도 하나의 탄소 고리 원자(이는 임의로 산화될 수 있음)가 존재한다. "헤테로시클로알케닐"은 예를 들어 이미다졸리닐(예를 들어, 2-이미다졸리닐(즉, 4,5-디히드로-1H-이미다졸릴), 3-이미다졸리닐 또는 4-이미다졸리닐), 테트라히드로피리디닐(예를 들어, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐), 디히드로피리디닐(예를 들어, 1,2-디히드로피리디닐 또는 2,3-디히드로피리디닐), 피라닐(예를 들어, 2H-피라닐 또는 4H-피라닐), 티오피라닐(예를 들어, 2H-티오피라닐 또는 4H-티오피라닐), 디히드로피라닐, 디히드로푸라닐, 디히드로피라졸릴, 디히드로피라지닐, 디히드로이소인돌릴, 옥타히드로뷔놀리닐(예를 들어, 1,2,3,4,4a,5,6,7-옥타히드로퀴놀리닐) 또는 옥타히드로이소퀴놀리닐(예를 들어, 1,2,3,4,5,6,7.8-옥타히드로이소퀴놀리닐)을 지칭할 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, "헤테로시클로알케닐"은 바람직하게는 일환식 고리 또는 접합 고리 시스템(예를 들어, 2개의 접합 고리로 구성된 접합 고리 시스템)인 3 내지 11원 불포화 비환식 고리 그룹을 지칭하며, 여기서 상기 고리 그룹은 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 고리 헤테로원자를 함유하고, 여기서 하나 이상의 S 고리 원자(존재하는 경우) 및/또는 하나 이상의 N 고리 원자(존재하는 경우)가 임의로 산화되며, 여기서 하나 이상의 탄소 고리 원자는 임의로 산화되고, 여기서 상기 고리 그룹은 인접한 고리 원자 사이에 적어도 하나의 이중 결합을 포함하며 인접한 고리 원자 사이에는 어떠한 삼중 결합도 포함하지 않는다; 보다 바람직하게는, "헤테로시클로알케닐"은 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 1개 이상(예를 들어, 1개, 2개 또는 3개) 고리 헤테로원자를 함유하는 5 내지 7원 일환식 불포화 비-방향족 고리 그룹을 지칭하고, 여기서 하나 이상의 S 고리 원자(존재하는 경우) 및/또는 하나 이상의 N 고리 원자(존재하는 경우)는 임의로 산화되며, 여기서 하나 이상의 탄소 고리 원자는 임의로 산화되고, 여기서 상기 고리 그룹은 인접한 고리 원자 사이에 적어도 하나의 이중 결합을 포함하고 인접한 고리 원자 사이에는 어떠한 삼중 결합도 포함하지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "할로겐"은 플루오린(-F), 염소(-Cl), 브롬(-Br) 또는 요오드(-I)를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "할로알킬"은 플루오린, 염소, 브롬 및 요오드로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상(바람직하게는 1 내지 6개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개)의 할로겐 원자, 및 바람직하게는 모두 플루오린 원자로 치환된 알킬 그룹을 지칭한다. 할로겐 원자의 최대 수는 이용 가능한 부착 부위의 수에 의해 제한되고, 따라서 할로알킬 그룹의 모이어티에 포함된 탄소 원자의 수에 의존한다는 것이 이해될 것이다. "할로알킬"은 예를 들어, -CF3, -CHF2, -CH2F, -CF2-CH3, -CH2-CF3, -CH2-CHF2, -CH2-CF2-CH3, -CH2-CF2-CF3 또는 -CH(CF3)2를 지칭할 수 있다. 특히 바람직한 "할로알킬" 그룹은 -CF3이다.
본 명세서에 사용된 용어 "임의의(optional)", "임의로(optionally)" 및 "할 수 있다(may)"는 표시된 특징이 존재할 수 있지만 부재할 수도 있음을 나타낸다. "임의의", "임의로" 또는 "할 수 있다"라는 용어가 사용될 때마다, 본 발명은 구체적으로 두 가능성, 즉 상응하는 특징이 존재하거나 대안으로 상응하는 특징이 부재하는 가능성에 관한 것이다. 예를 들어, "X는 Y로 임의로 치환된다"(또는 "X는 Y로 치환될 수 있음")이라는 표현은 X가 Y로 치환되거나 비치환됨을 의미한다. 마찬가지로, 조성물의 성분이 "임의의"인 것으로 표시되는 경우, 본 발명은 구체적으로 두 가지 가능성, 즉 상응하는 성분이 존재하거나(조성물에 함유된) 상응하는 성분이 조성물에 부재하는 것과 관련된다.
다양한 그룹이 본 명세서에서 "임의로 치환된" 것으로 언급된다. 일반적으로, 이들 그룹은 예를 들어 1, 2, 3 또는 4개의 치환기와 같이 하나 이상의 치환기를 가질 수 있다. 치환기의 최대 수는 치환된 모이어티에서 이용가능한 부착 부위의 수에 의해 제한되는 것으로 이해될 것이다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 언급된 "임의로 치환된" 그룹은 바람직하게는 2개 이하의 치환기를 보유하고, 특히 단 하나의 치환기를 보유할 수 있다. 또한, 달리 정의되지 않는 한, 임의의 치환기가 없는 것, 즉 상응하는 그룹이 치환되지 않는 것이 바람직하다.
링커 그룹은 또한 펩타이드를 함유하거나 이로 구성될 수 있다. 이러한 펩타이드는 바람직하게는 1 내지 100개의 아미노산, 예컨대 1 내지 25개의 아미노산, 보다 바람직하게는 12 내지 20개의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 12 내지 16 또는 15 내지 20개의 아미노산을 포함한다. 펩타이드 링커는 하나 이상의 (G3S) 및/또는 (G4S) 모티프, 특히 1, 2, 3, 4, 5 또는 6(G3S) 및/또는 (G4S) 모티프, 바람직하게는 3 또는 4(G3S) 및/또는 (G4S) 모티프, 보다 바람직하게는 3 또는 4(G4S) 모티프를 포함할 수 있다.
다른 예에서, 링커는 12 내지 25개의 아미노산, 바람직하게는 서열 (G3S)3 또는 (G3S)4 또는 (G4S)3 또는 (G4S)4를 포함한다. 대안적인 펩타이드 링커는 GEGTSTGSGGSGGSGGAD 모티프로 구성되거나 이를 포함할 수 있다(SEQ ID NO: 10 참조). 펩타이드 링커는 이의 C-말단 또는 이의 N-말단을 통해 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 miR-21 억제제에 연결될 수 있다. 예를 들어, C-말단 산은 아미노프로판올과 같은 아미노 알코올과 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있고 아미노프로판올의 알코올 그룹은 miR-21 억제제의 말단 포스포로티오에이트 그룹의 인에 결합할 수 있다. 대안으로, 펩타이드 링커의 N-말단은 히드록시프로판산과 같은 (임의로 보호된) 히드록시기 함유 산(또는 이의 무수물 또는 락톤 또는 산 염화물)과 반응할 수 있고, (임의로 히드록시기로부터 보호기를 제거한 후) 히드록시기 함유 카르복실산의 히드록시기를 통해 miR-21 억제제의 말단 포스포로티오에이트 그룹의 인에 결합할 수 있다.
또한, 펩타이드 링커는 이의 C-말단 또는 이의 N-말단을 통해 miR-21 억제제를 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 대식세포에 전달하는 모이어티에 연결될 수 있다. 예를 들어 C-말단 산은 아미노프로판올과 같은 아미노 알코올과 반응하여 아미드 결합을 형성하고 아미노프로판올의 알코올 그룹은 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 부분의 당 그룹의 아노머 탄소에 결합할 수 있다. 대안으로, 펩타이드 링커의 N-말단은 히드록시프로판산과 같은 (임의로 보호된) 히드록시기 함유 산 (또는 이의 무수물, 또는 락톤 또는 산 염화물)과 반응할 수 있고, (임의로 히드록시프로판산으로부터 보호기를 제거한 후) 히드록시기 함유 카르복실산의 히드록시기를 통해 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 부분의 당 그룹의 아노머 탄소에 결합한다.
당업자는 펩타이드 링커가 C-말단을 통해 miR-21 억제제에 연결된 경우, 상기 miR-21 억제제는 이의 N-말단을 통해 대식세포에 전달하는 모이어티에 연결되고 그 반대도 마찬가지인 것으로 이해할 것이다.
적절하게 보호된 펩타이드는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 고체상 펩타이드 합성이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 적합한 프로토콜은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 "Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences", Coin et al., Nature Protocols 2007, Vol. 2, pages 3247-3256에 언급되어 있다. 고체상 펩타이드 합성을 사용하는 경우, 펩타이드는 펩타이드의 측쇄에 보호기를 남기면서 고체상으로부터 절단될 수 있다. 이 상태에서, miR-21 억제제 및/또는 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티에 대한 부착을 위한 위에서 논의된 조작이 가장 적합하게 이루어질 수 있다.
상기 지시된 바와 같이, 용어 "모이어티" 또는 "담체"는 상호교환가능하다. 특정 양태에서, 모이어티는 예를 들어 공유 결합에 의해 miR-21 억제제에 커플링될 수 있다. 담체는 특정 양태에서 miR-21 억제제를 포함할 수 있다. 담체는 예를 들어 miR-21 억제제를 포함하는 (표적화) 리포좀, 나노입자, 지질 나노입자(LNP), 메조포러스 실리카 나노입자(MSN) 등으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 특정 맥락에서, 용어 "모이어티"는 예를 들어 본 발명의 화합물의 맥락에서 용어 "부분"과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 여기서 상기 화합물의 한 "부분"은 miR-21을 억제할 수 있고 다른 "부분"은 상기 miR-21 억제 부분을 표적 세포, 바람직하게는 대식세포 및/또는 섬유아세포에 결합, 표적화 및/또는 전달할 수 있다.
대식세포 및/또는 섬유아세포에 결합/표적화/전달하는 모이어티는 (특정) 수용체 대식세포 및/또는 섬유아세포와 상호작용하는 특정 단백질 리간드일 수도 있다.
대식세포 및/또는 섬유아세포에 결합/표적화/전달하는 모이어티는 대식세포, 섬유아세포 및 대식세포, 폐 대식세포, 또는 폐 섬유아세포 및 폐 대식세포에서 발견되는 적어도 하나의 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 기능적 결합 단편일 수 있다. 이러한 특정 양태에서, 모이어티는 대식세포, 섬유아세포 및 대식세포, 폐 대식세포, 또는 폐 섬유아세포 및 폐 대식세포 상에서 배타적으로 발견되는 적어도 하나의 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 기능적 결합 단편일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 항체의 기능적 결합 단편은 항체의 항원 결합 단편일 수 있다.
항체 또는 기능적 결합 단편은 위의 표에 제공된 항원 중 적어도 하나에 (특이적으로 결합할) 수 있다. 적어도 하나의 항원에 (특이적으로) 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항체 단편을 확인하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 더욱이, 상기 표 3에 나타낸 항원 중 하나에 결합하는 항체 및 이의 단편은 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 조성물은 항체 또는 이의 결합 단편에 컨쥬게이트된 miR-21 억제제를 포함할 수 있으며, 여기서 항체 또는 이의 결합 단편은 예를 들어 상기 표 3에 나타낸 항원 중 적어도 하나에 결합함으로써 대식세포(들) 및/또는 섬유아세포에 mirR-21 억제제를 전달한다. 상기 표시된 항원에 결합하는 항체 또는 이의 항체 단편은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, miR-21 억제제 전달을 위한 항체는 MRC1(예를 들어, Abcam Cat. No. ab64693), ADGRE1(예를 들어, BioRAD Cat. No: MCA 2674), CD14(예를 들어, Abcam Cat. No. ab182032), FCGR3A(예를 들어, Abcam Cat. No. ab89207) 및 PDGFRA(예를 들어, Abcam Cat. No. ab96569)에 대해 지시된 항체로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 본 발명에 따른 용어 "항체"는 결합 특이성을 여전히 유지하는 다클론 및 단클론 항체 뿐만 아니라 이의 유도체 또는 단편을 포함한다. 항체의 생산 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 (Harlow & Lane, 1988) 및 Harlow and Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999 (Harlow & Lane, 1999)에 기술되어 있다. 본 발명에 따른 용어 "항체"는 또한 키메라, 단일쇄 및 인간화 항체와 같은 구체예뿐만 아니라 항체 단편, 예를 들어 특히 Fab 단편, Eph 수용체로 구성된 융합 단백질, 에프린 또는 포스파타제 세포외 도메인 및 Fc를 포함한다. 항체 단편 또는 유도체는 F(ab')2, Fv 단편, scFv, 단일 도메인 VH 또는 V-유사 도메인, 예컨대 VhH 또는 V-NAR-도메인, 뿐만 아니라 미니바디, 디아바디, 트리바디, 테트라바디 또는 화학적으로 컨쥬게이트된 Fab'-다량체와 같은 다량체 형식을 또한 포함한다: 예를 들어, Harlow and Lane (1988) and (1999)(Harlow & Lane, 1988, 1999), Altshuler (2010) Biochemistry (Moscow) 75, 1584-605 (Altshuler et al., 2010) or Holliger (2005) Nature Biotechnology 23, 1126-36 (Holliger & Hudson, 2005)를 참조. 다양한 절차가 당업계에 공지되어 있고 이러한 항체 및/또는 단편의 생산을 위해 사용될 수 있다. 따라서, (항체) 유도체는 펩티도미메틱스에 의해 생산될 수 있다. 추가로, 단일쇄 항체의 생산에 대해 기술된 기술(특히, 미국 특허 제4,946,778호 참조)은 본 발명의 폴리펩타이드(들) 및 융합 단백질에 특이적인 단일쇄 항체를 생산하도록 각색될 수 있다. 또한, 형질전환 동물을 사용하여 본 발명의 폴리펩타이드 및 융합 단백질에 특이적인 인간화 항체를 발현할 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 명세서에 사용된 항체는 단클론 항체이다. 단클론 항체의 제조를 위해 연속 세포주 배양에 의해 생산된 항체를 제공하는 모든 기술을 사용할 수 있다. 이러한 기술의 예는 본 기술 분야에 의해 추가로 개발된 오리지널 하이브리도마 기술(Kohler & Milstein, 1975), 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor & Roder, 1983) 및 인간 단클론 항체를 생산하는 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., 1985)을 포함한다. 항체라는 용어는 또한 인간화 항체에 관한 것이다. "인간화" 형태의 비인간(예: 쥐 또는 토끼) 항체는 비인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예: Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열)이다. 종종, 인간화 항체는 수혜자의 상보성 결정 영역(CDR) 유래의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 용량을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 CDR에서 유래된 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린(수혜자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수혜자 항체나 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하고 최적화하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 영역이다. 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 수 있다. 자세한 내용은 다음을 참조할 것(Jones et al., 1986); (Riechmann et al., 1988) 및 (Presta, 1992). 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이러한 단편은 온전한 항체의 단백질분해성 소화를 통해 유래되었다(Morimoto et al., 1992); 및 Brennan et al., 1985 참조). 항체 단편은 또한 위에서 논의된 재조합 숙주 세포 및 항체 파지 라이브러리에 의해 직접 생산될 수 있다. Fab'-SH 단편은 대장균(E. coli)에서 직접 회수될 수 있고 화학적으로 결합되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(Carter et al., 1992). 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 숙련된 시술자에게 명백할 것이다. 다른 구체예에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편(scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 제5,571,894호; 및 미국 특허 번호 제5,587,458호 참조. 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 번호 제5,641,870호에 기술된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이성 또는 이중특이성일 수 있다. 적어도 2개의 상이한 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 이중특이성 항체(Milstein & Cuello, 1983). 예를 들어, 이중특이성 항체 또는 이의 단편이 대식세포 및 섬유아세포에 결합하도록 이중특이성 항체 또는 이의 단편이 본 발명에서 사용될 수 있다(예를 들어, 항체 또는 이의 단편의 하나의 결합 부위는 대식세포에 결합하고 항체 또는 이의 단편의 다른 결합 부위는 섬유아세포에 결합한다). 예컨대 화학적 연결을 사용하여 항체 단편으로부터 이중특이성 항체를 생성하는 기술도 기술되어 있는데, 여기서 온전한 항체는 단백질분해적으로 절단되어 F(ab')2 단편을 생성한다(Brennan et al., 1985). Fab'-SH 단편은 대장균(E. coli)에서 회수하고 화학적으로 결합하여 이중특이성 항체를 형성할 수 있다(Shalaby et al., 1992). "디아바디" 기술은 이중특이성 항체 단편을 만들기 위한 대체 방법을 제공한다(Holliger & Hudson, 2005). "Fab 단편"은 일반적으로 하나의 경쇄와 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다. "Fc" 영역은 일반적으로 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 함유한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 이황화 결합과 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 결합된다. "Fab' 단편"은 일반적으로 VH 도메인 및 CH1 도메인 및 또한 CH1 및 CH2 도메인 사이의 영역을 함유하는 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 일부를 함유함으로써 사슬간 이황화 결합이 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있도록 한다. "F(ab')2 단편"은 일반적으로 CH1 및 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 일부를 함유하는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 함유함으로써 사슬간 이황화 결합이 두 중쇄 사이에 형성되도록 한다. 따라서 F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이의 이황화 결합에 의해 결합되는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다. "Fv 영역"은 일반적으로 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하지만 불변 영역은 결여되어 있다. 2개 이상의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 3개 이상의 항원 결합 부위 및 2개 이상의 가변 도메인을 갖는 다가 "옥토퍼스" 항체는 항체의 폴리펩타이드 사슬을 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 생산될 수 있다(US 2002/0004586; WO01/77342). 예를 들어, 삼중특이성 항체가 제조될 수 있다(Tutt et al., 1991).
miR-21 억제제는 항체 또는 이의 기능적 단편에 컨쥬게이트될 수 있다(예를 들어, 상기 예시된 항체 또는 이의 단편에). 항체 또는 이의 단편에 대한 컨쥬게이트은 하기 도 15에 예시되어 있다. 또한, miR-21 억제제는 세포 유형-특이적인 표적화 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, miR-21 억제제는 또한 "담체", 바람직하게는 대식세포 및/또는 섬유아세포에 전달하는 "담체"에 포함될 수 있다. 이러한 "담체"는 리포좀, LNP, 나노입자 등을 포함할 수 있다. 따라서, 추가 양태에서 miR-21 억제제는 예를 들어, 나노 입자로 구성되어 있다. 이러한 나노입자는 페길화가 있거나 없는 지질 나노입자, 올리고뉴클레오티드 코트가 있는 금 나노입자 또는 올리고뉴클레오티드 및 표적 리간드가 혼입된 DNA 나노구조일 수 있다. 추가 양식은 최첨단을 나타내며 Juliano RL, Nucl Acids Res 2016에 나열되어 있다(상기 참조).
본 발명은 또한 청구항의 조성물의 생산 방법에 관한 것이다. 지시된 바와 같이, miR-21 억제제 및 miR-21 억제제(들) 자체의 생산 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 안티센스 miR-21은 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 제공될 수 있다. 추가 양태에서, 조성물의 생산 방법은 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티에 miR-21 억제제를 컨쥬게이트하는 것을 포함한다. 예시적인 절차가 아래의 도 15에 도시되어 있다. 예를 들어, miR-21 억제제는 저분자, 항체 또는 이의 기능적 단편에 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 miR-21 또는 miR-21 억제제는 억제제를 표적 세포에 전달하는 모이어티에 커플링하는 링커(예: 아미노산 링커)에 커플링될 수 있다. 대안으로, 안티센스 miR-21 또는 miR-21 억제제는 억제제를 표적 세포에 전달하는 모이어티에 커플링될 수 있다. 이러한 방법에는 클릭 화학이 사용될 수 있다. 그러나, miR-21 억제제에 모이어티를 커플링하는 추가 방법은 예를 들어 공유 결합으로 알려져 있다. 특정 양태에서, 방법은 안티센스 miRNA-21을 모이어티와 컨쥬게이트하는 것을 포함한다. 추가로, 조성물의 생산 방법은 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티에 miR-21 억제제를 도입하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, miR21 억제제는 miR-21의 표적을 억제하거나 과발현하는 한 임의의 분자일 수 있다. 활성화(derepresses) 또는 과발현을 결정하는 방법은 또한 위에서 나타낸 바와 같이 당업자에게 공지되어 있다. 바람직한 양태에서, miR-21 억제제는 안티센스 miRNA-21을 포함하거나 안티센스 miRNA-21이다(예는 SEQ ID NOs: 1 내지 3 및 7 내지 9를 포함하나 이에 제한되지 않음). 안티센스 miRNA-21 분자는 당업자에게 알려져 있으며; 예를 들어 Khvorova & Watts Nature Biotechnology 2017 (Khvorova & Watts, 2017); 및 Rupaimoole &Slack MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases (Rupaimoole & Slack, 2017) 참조. Nature Reviews in Drug discovery 2017는 참고로 본 명세서에 포함된다. 또한, 안티센스 miRNA-21은 WO 2009/106367 A1 또는 EP 2260 101 B1에도 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 다른 서열, 특히 miR-21에 상보적인 서열에 상보적인 특정 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이해되어야 한다. miRm21의 표적은 또한 miR-21의 다운스트림 표적을 포함하는 것으로 이해될 수 있다. miR-21의 억제, 예를 들어 miR-21에 최소한 상보적인 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 통해 "표적" Sprouty(세포 신호 전달에 관여하는 발달 단백질) 등과 같은 miR-21 표적의 활성화 또는 과발현을 유발할 것이다. 아래에 첨부된 실시예에서 예시적인 안티센스 miRNA-21이 제공된다. 일반적으로, 본 발명의 맥락에서 사용되는 안티센스 miRNA는 miR-21에 상보적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 한 특정 구체예에서, 안티센스 miRNA-21은 잠금 핵산일 수 있거나 바람직하게는 포스포로티오에이티드 LNA/DNA 믹스머(mixmer)이다. 예를 들어, miR-21 억제제는 3'-tCgAaTaGtCtGaCT-5'(SEQ ID NO: 1) 및/또는 3'-TCgAaTagTCtgAcT-5'(SEQ ID NO: 2)인 안티센스 miR-21 일 수 있다. 추가로 유용한 안티센스-miR-21 분자가 SEQ ID NO: 3에 제공된다(SEQ ID NOs: 1 및 2와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하지만 모든 뉴클레오티드가 잠겨 있는 LNA 작제물, 5'-메틸-시토신 변형 및 포스포로티오에이트 백본), SEQ ID NO: 7(SEQ ID NOs: 1 및 2와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하지만 모든 뉴클레오티드가 잠겨 있고, 5'-메틸-시토신 변형이 있지만 포스포로티오에이트 골격이 없는 LNA 작제물), SEQ ID NO: 8(SEQ ID NOs: 1 및 2와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하지만 모든 뉴클레오티드가 잠겨 있고 포스포로티오에이트 골격은 있지만 5'-메틸-시토신 변형은 없음) 및 SEQ ID NO: 9(SEQ ID NOs: 1 및 2와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하지만 모든 뉴클레오티드가 잠겨 있고 임의의 5'-메틸-시토신 변형이 없고 포스포로티오에이트 골격이 없는 LNA 작제물)로 제공된다. 본 명세서에 제공된 서열에서 대문자는 LNA를 나타내고 소문자는 DNA 염기를 나타낸다. 모든 대문자 C는 5-메틸-시토신을 나타낸다. miR-21에 대한 안티센스 miR은 완전한 PS(포스포로티오에이트) 골격을 가질 수 있다. 또한 SEQ ID NO: 1 참조. 특히 유용한 안티센스-miR-21 분자는 SEQ ID NOs: 1 및 2에 제공되며, 가장 바람직하고 첨부된 실시예에 예시된 바와 같이 다음과 같은 "anti-miR-21"이 있다: 3'-tCgAaTaGtCtGaCT-5'(SEQ ID NO :1).
본 명세서에 논의된 바와 같이, 본 발명은 miR-21 억제제를 포함하고 상기 miR-21 억제제를 폐 대식세포와 같은 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기에서 논의된 바와 같이, 상기 조성물은 또한 상기 적어도 2개의 기능적 모이어티/부분을 갖는 단일 분자, 즉 miR-21 억제제인 기능적 모이어티/부분 및 상기 miR-21 억제제를 상기 대식세포에 전달하는 기능적 모이어티/부분을 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 상기 논의된 바와 같이, 상기 "화합물" 뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 조성물은 또한 예를 들어 추가 기능 모이어티들 또는 부분들, 예를 들어 상기 miR-21 억제제를 예를 들어 섬유아세포와 같은 다른 표적세포에 전달하거나 표적으로 하는 모이어티 또는 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 그리고 본 명세서에서 논의되고 예시된 바와 같이, 본 발명의 맥락에서 적어도 상기 기능적 특징, 즉 miR-21의 억제와 관련된 특징(a) 및 전달과 관련된 특징(b)를 갖는 화합물/조성물이 제공된다. 상기 억제 모이어티/부분("miR-21 억제제")을 원하는 표적 세포에 전달한다(이 전달은 또한 예를 들어 표적화 리포좀, 나노입자, 표적화 지질 나노입자(LNP), 표적화 메조포러스 실리카 나노입자(MSN) 등과 같은 본 명세서에 정의된 "담체"일 수 있다). 상기 표적 세포(들)는 대식세포(들) 및/또는 섬유아세포(들)이고, 바람직하게는 표적 세포(들)는 대식세포(들)이다. 바람직한 양태에서, 대식세포(들) 및/또는 섬유아세포(들)는 폐 대식세포(들) 및/또는 폐 섬유아세포(들)이다. 보다 바람직한 양태에서, 대식세포(들) 및/또는 섬유아세포(들)는 폐포 대식세포(들) 및/또는 폐포 섬유아세포(들)이고; 및/또는 간질 대식세포(들) 및/또는 간질 섬유아세포(들)이다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 (의학적 및/또는 약학적) 용도를 위한 조성물/화합물, 뿐만 아니라 본 발명의 조성물/화합물 그 자체, 상기 본 발명의 조성물/화합물의 생산 방법 뿐만 아니라 본 명세서에 기술된 치료 방법을 제공하며, 여기서 상기 조성물/화합물은 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 그리고 위에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 단일 분자, 즉, miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달할 수 있는/miR-21 억제제를 대식세포에 표적화할 수 있는 모이어티/부분을 포함하는 화합물일 수 있다. 상기 miR-21 억제제 및 상기 전달/표적화 모이어티/부분은 "링커"(구조)를 통해 연결될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 miR-21 억제제를 포함하고 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 적어도 하나의 모이어티를 포함하는 조성물을 제공하며,
여기서 상기 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티는 링커를 통해 연결되고, 여기서 링커는 C10-40 알킬렌, C10-40 알케닐렌 및 C10-40 알키닐렌으로부터 선택된 그룹 L을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 상기 알킬렌, 상기 알케닐렌 및 상기 알키닐렌은 할로겐, C1-5 할로알킬, -O(C1-5 할로알킬), -CN, -OR21, -NR21R21, -NR21OR21, -COR21, -COOR21,-OCOR21, -CONR21R21, -NR21COR21, -NR21COOR21, -OCONR21R21, -SR21, -SOR21, -SO2R21, -SO2NR21R21, -NR21SO2R21, -SO3R21 및 -NO2 로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 그룹으로 치환되며, 및 추가로 상기 알킬렌, 상기 알케닐렌 또는 상기 알키닐렌에 포함된 하나 이상의 -CH2- 유닛은 각각 임의로 -O-, -NR21-, -CO-, -S-, -SO-, -SO2-, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 시클로알킬렌 및 헤테로시클로알킬렌으로부터 독립적으로 선택된 그룹에 의해 대체되며, 여기서 상기 아릴렌, 상기 헤테로아릴렌, 상기 시클로알킬렌 및 상기 헤테로시클로알킬렌은 각각 임의로 C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, 할로겐, C1-5 할로알킬, -CN, -OH, -O(C1-5 알킬), -SH, -S(C1-5 알킬), -NH2, -NH(C1-5 알킬) 및 -N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 그룹으로 치환되고;
각 R21은 독립적으로 수소, C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, 카보시클릴 및 헤테로시클릴로부터 선택되며, 여기서 상기 알킬, 상기 알케닐 및 상기 알키닐은 각각 임의로 하나 이상의 그룹 RAlk로 치환되고, 및 추가로 여기서 상기 카보시클릴 및 상기 헤테로시클릴은 각각 임의로 하나 이상의 그룹 RCyc로 치환되며;
임의의 두 개의 R21은 임의로 연결되어 고리를 형성하고;
각 RAlk는 독립적으로 -OH, -O(C1-5 알킬), -O(C1-5 알킬렌)-OH, -O(C1-5 알킬렌)-O(C1-5 알킬), -SH, -S(C1-5 알킬), -S(C1-5 알킬렌)-SH, -S(C1-5 알킬렌)-S(C1-5 알킬), -NH2, -NH(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-OH, -N(C1-5 알킬)-OH, -NH-O(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-O(C1-5 알킬), 할로겐, C1-5 할로알킬, -O(C1-5 할로알킬), -CN, -NO2, -CHO, -CO(C1-5 알킬), -COOH, -COO(C1-5 알킬), -O-CO(C1-5 알킬), -CO-NH2, -CO-NH(C1-5 알킬), -CO-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-CO(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-CO(C1-5 알킬), -NH-COO(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-COO(C1-5 알킬), -O-CO-NH(C1-5 알킬), -O-CO-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-5 알킬), -SO2-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-SO2-(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-SO2-(C1-5 알킬), -SO2-(C1-5 알킬), -SO-(C1-5 알킬), 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 및 헤테로시클로알킬로부터 선택되며, 여기서 상기 아릴, 상기 헤테로아릴, 상기 시클로알킬 및 상기 헤테로시클로알킬은 각각 임의로 C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, 할로겐, C1-5 할로알킬, -CN, -OH, -O(C1-5 알킬), -SH, -S(C1-5 알킬), -NH2, -NH(C1-5 알킬) 및 -N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹으로 치환되고;
각 RCyc은 독립적으로 C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, -OH, -O(C1-5 알킬), -O(C1-5 알킬렌)-OH, -O(C1-5 알킬렌)-O(C1-5 알킬), -SH, -S(C1-5 알킬), -S(C1-5 알킬렌)-SH, -S(C1-5 알킬렌)-S(C1-5 알킬), -NH2, -NH(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-OH, -N(C1-5 알킬)-OH, -NH-O(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-O(C1-5 알킬), 할로겐, C1-5 할로알킬, -O(C1-5 할로알킬), -CN, -NO2, -CHO, -CO(C1-5 알킬), -COOH, -COO(C1-5 알킬), -O-CO(C1-5 알킬), -CO-NH2, -CO-NH(C1-5 알킬), -CO-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-CO(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-CO(C1-5 알킬), -NH-COO(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-COO(C1-5 알킬), -O-CO-NH(C1-5 알킬), -O-CO-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-5 알킬), -SO2-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-SO2-(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-SO2-(C1-5 알킬), -SO2-(C1-5 알킬), -SO-(C1-5 알킬), 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 및 헤테로시클로알킬로부터 선택되며, 여기서 상기 아릴, 상기 헤테로아릴, 상기 시클로알킬 및 상기 헤테로시클로알킬은 각각 임의로 C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, 할로겐, C1-5 할로알킬, -CN, -OH, -O(C1-5 알킬), -SH, -S(C1-5 알킬), -NH2, -NH(C1-5 알킬) 및 -N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹으로 치환된다.
본 발명의 조성물/화합물의 일 구체예에서, 상기 조성물/화합물은 대식세포에 상기 miR-21 억제제를 전달하는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다. 따라서, 조성물(또한 화합물)이 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 2개 이상의 모이어티들/부분들을 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 따라서, 상기 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 상기 둘 이상의 모이어티/부분은 분지형 링커를 통해 연결될 수 있고, 링커의 분지 각각은 선행 청구항에서 정의된 바와 같은 그룹 L이고, 링커의 주쇄는 선행 청구항에서 정의된 바와 같은 하나 또는 두개의 그룹(들) L을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 바람직하게는 주쇄는 miR-21 억제제에 부착되고 분지는 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티에 부착된다.
각 그룹 L은 C10-40 알킬렌으로부터 선택될 수 있고, 여기서 상기 알킬렌은 임의로 할로겐, C1-5 할로알킬, -O(C1-5 할로알킬), -CN, -OR21, -NR21R21, -NR21OR21, -COR21, -COOR21,-OCOR21, -CONR21R21, -NR21COR21, -NR21COOR21, -OCONR21R21, -SR21, -SOR21, -SO2R21, -SO2NR21R21, -NR21SO2R21, -SO3R21 및 -NO2으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹으로 치환되며, 및 추가로 여기서 상기 알킬렌에 포함된 하나 이상의 -CH2- 유닛은 각각 독립적으로 -O-, -NR21-, -CO-, -S-, -SO-, -SO2-, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 시클로아릴렌, 시클로알킬렌 및 헤테로시클로알킬렌으로부터 선택된 그룹에 의해 대체되고, 여기서 상기 아릴렌, 상기 헤테로알릴렌, 상기 시클로알킬렌 및 상기 헤테로시클로알킬렌은 각각 임의로 C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, 할로겐, C1-5 할로알킬, -CN, -OH, -O(C1-5 알킬), -SH, -S(C1-5 알킬), -NH2, -NH(C1-5 알킬) 및 -N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹으로 치환된다.
본 발명의 조성물/화합물의 일 구체예에서 상기 링커는 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure pct00001
또는
Figure pct00002
여기서 *는 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티에 대한 결합을 나타내고, **는 miR-21 억제제에 대한 결합을 나타낸다.
본 발명의 조성물/화합물에서 상기 miR-21 억제제는 바람직하게는 말단 포스포로티오에이트 그룹의 인 원자를 통해 링커에 결합될 수 있다.
상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 본 발명의 화합물/조성물의 하나 이상의 모이어티/부분은 당을 포함할 수 있고, 바람직하게는 만노스 및 N-아세틸갈락토사민으로부터 선택된 하나 이상을 포함하거나 이로 구성되며, 보다 바람직하게는 만노스, 디만노실만노스 및 N-아세틸갈락토사민으로 구성된다. 첨부된 비제한적 실시예에 예시된 바와 같이, 또한 트리-만노스는 miR-21 억제제를 대식세포에 표적화하는데 사용되었다(만노스 수용체 C 유형 1과의 상호작용을 통해).
상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 하나 이상의 모이어티는 하기로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00003
또는
Figure pct00004
여기서 링커는 각 구조의 오른손 부분 아래에 있는 아노머 탄소에 부착된다.
본 발명의 조성물은 도 23B에 정의된 바와 같은 화합물 중 하나 또는 둘 모두 및/또는 하기 화합물 중 하나 또는 둘 모두를 함유하거나 포함할 수 있다:
Figure pct00005
또는
Figure pct00006
본 명세서에 표시된 바와 같이, miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포, 바람직하게는 폐 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 본 발명의 조성물/화합물은 의료 환경, 특히 폐 섬유증의 예방 및/또는 치료에 특히 유용하다. 상기 및 하기에 제공된 본 발명의 조성물/화합물에 대한 정의 및 설명은 의약품으로서 사용될 이들 조성물/화합물에 적용하며 및/또는 본 명세서에서 섬유증 장애의 치료, 특히 폐 섬유증의 치료 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명의 화합물/조성물을 포함하는 상응하는 약학적 조성물은 에어로졸 형태이다. 약학적 조성물은 의약 및/또는 약제의 용도에 유리하게 사용될 수 있다. 제한 없이, 그러나 바람직한 구체예에서, 폐 섬유증의 치료에서 본 발명의 조성물/화합물은 의학적 개입을 필요로 하는 환자에 의해 흡입되는 것으로 구상된다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료" 또는 이의 문법적 변형은 대상체의 질병/의학적 상태/장애의 모든 치료를 포괄하며, (a) 질병/의학적 상태/장애에 걸리기 쉬운 대상체의 질병/의학적 상태/장애의 예방 및/또는 개선; (b) 질병/의학적 상태/장애의 억제, 즉 그것의 발달을 저지; 또는 (c) 질병/의학적 상태/장애의 완화, 즉 질병/의학적 상태/장애의 퇴행 유발을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 조성물은 폐 섬유증의 예방에 사용될 수 있다.
본 명세서에 제공된 조성물은 또한 약학적 조성물로 지칭될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함한다. 상기 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 상기 모이어티는 또한 본 명세서에 예시되고 설명된 바와 같이 연결/컨쥬게이트될 수 있다. 약학적 조성물은 개별 환자의 임상 상태, 약학적 조성물의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 실무자들에서 알려진 기타 요인들을 고려하여 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제형화 및 투여될 수 있다. 따라서, 본 명세서의 목적을 위한 약학적 조성물의 "유효량"은 이러한 고려에 의해 결정된다. 특히 의학적 및/또는 약학적 용도를 위한 본 명세서에 기술된 구현예는 본 명세서에 기술된 약학적 조성물에 대해 준용하여 적용한다.
본 명세서에 제공된 조성물은 추가의 약물/의약과 병용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 조성물은 바이러스 및/또는 세균 감염(들)의 치료 및 항염증 치료를 위한 약학적 조성물과 조합하여 치료에 투여될 것이다. 이러한 치료에는 항바이러스제(예: 렘데시비르), 베타 아드레날린성 수용체 작용제(예: 살부타몰) 및 글루코코르티코이드(예: 덱사메타손)이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
약학적 조성물 또는 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. "약학적으로 허용되는 담체"는 임의의 유형의 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제형 보조제이다.
본 발명은 본 명세서에서 제공되고, 특히 폐 섬유증의 치료에서 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 조성물(들)/화합물(들)의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 폐 섬유증 치료용 의약의 제조를 위한 조성물의 용도에 관한 것으로, 여기서 상기 조성물은 상기 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 상기 모이어티를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 조성물/화합물을 그러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 폐 섬유증의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명과 관련하여 또한 폐 섬유증의 치료 방법이 제공된다. 상기 치료 방법은 그러한 치료를 필요로 하는 대상체, 특히 폐 섬유증을 앓고 있거나, 폐 섬유증을 앓는 경향이 있는 인간 환자에게 본 명세서에서 기술되고, miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포, 바람직하게는 폐 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 조성물/화합물을 투여하는 것을 포함한다. 의학적 및/또는 약학적 용도를 위해 본 명세서에 기재된 구체예는 본 발명의 치료 방법을 준용하여 적용된다. 본 명세서에서 원하는 폐 섬유증의 치료 방법은 섬유증 상태의 개선 및/또는 심지어 예방을 목표로 하는 추가 약물의 (공동)투여를 또한 포함할 수 있다는 것이 주목된다. 이러한 약물에는 덱사메타손과 같은 글루코코르티코이드, 다중 티로신 키나제에 대한 수용체 차단제인 닌테다닙과 같은 티로신 키나제 억제제 또는 변형 성장 인자 베타(TGF-b) 자극 콜라겐 합성을 억제하는 항섬유증제인 피르페니돈이 포함될 수 있다. 다시, 특히 의학적 및/또는 약학적 용도를 위한 본 명세서에 기재된 구체예는 본 명세서에 기재된 폐 섬유증 및/또는 섬유증과 관련되거나 섬유증을 유발하는 폐 섬유증의 치료 방법을 준용하여 적용된다. 본 발명의 특정 치료 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자의 치료이며, 여기서 상기 환자는 특히 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS) 이후, 폐 지지 또는 기계적 환기에 의해 유발되거나 연관되는 폐 섬유증을 앓고 있다. 이러한 환자는 또한 COVD-19 환자를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "포함하는(comprising)" 및 "함유하는(including)" 또는 이의 문법적 변형은 언급된 특징, 정수, 단계 또는 구성요소를 지정하는 것으로 간주되나 하나 이상의 추가 기능, 정수, 단계, 구성 요소 또는 그 그룹의 추가를 배제하지 않는다. 이 용어는 "~로 구성되는" 및 "본질적으로 구성되는"이라는 용어를 포함한다. 따라서, 용어 "포함하는(comprising)"/"함유하는(including)"/"갖는(having)"은 임의의 추가 구성요소(또는 유사하게 특징, 정수, 단계 등)가 존재할 수/있을 수 있음을 의미한다.
"~로 구성되는"이라는 용어는 추가 구성요소(또는 유사하게 특징, 정수, 단계 등)가 존재하지 않음을 의미한다.
"약"이라는 용어는 바람직하게는 표시된 수치의 ±10%, 더욱 바람직하게는 표시된 수치의 ±5%, 특히 표시된 정확한 수치를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "약"은 표시된 수치의 ±10%, 특히 표시된 수치의 ±5%를 지칭한다. "약"이라는 용어가 사용될 때마다 표시된 정확한 숫자 값에 대한 특정 레퍼런스도 포함된다. "약"이라는 용어가 주어진 핵산의 뉴클레오티드 수와 같이 정수로 정량화되는 파라미터와 관련하여 사용되는 경우, 표시된 수치의 ±10% 또는 ±5%에 해당하는 숫자는 가장 가까운 정수로 반올림한다.
본 발명은 하기 비제한적인 도면 및 실시예를 참조하여 추가로 설명된다. 달리 명시되지 않는 한, 예를 들어 Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001) (Sambrook & Russell, 2001))에 기술된 바와 같이 재조합 유전자 기술의 확립된 방법이 사용되었으며, 전체가 참조로 여기에 포함된다.
본 발명은 하기 비제한적인 도면 및 실시예를 참조하여 추가로 설명된다. 도면은 다음을 보여준다.
도 1. 잠금 핵산 변형된 안티센스 miR-21을 사용한 miR-21 억제 효율.
(A) 허혈성 심근에서 miR-21의 발현. SHAM n=3; I/R 손상 n=3-6. (B) 실험 전략. 돼지에 60분 동안 좌전하행(LAD) 관상동맥의 풍선 폐색으로 카테터법을 시행한 후 33일 동안 재관류를 시행하였다. miR 억제제인 잠금 핵산 변형된 안티센스 miR-21(LNA-antimiR-21)은 재관류 손상 동안 5일 및 19일에 카테터로 국소 적용되었다. 10 mg의 LNA-antimiR-21을 좌전하행동맥(LAD)과 좌회굴동맥(LCx)에 3:2의 비율로 주입하였다. 상부 패널: miR-21(SEQ ID NO: 4), LNA-antimiR-21(SEQ ID NO: 1) 및 LNA-antimiR-Control(SEQ ID NO: 5)의 서열. 회색 영역은 씨드 서열을 나타내며 miR-21에 상보적인 염기는 빨간색으로 표시된다. (C) LNA-antimiR-21 또는 LNA-antimiR-Control의 국소 적용 후 miR-21 발현의 정량적 분석. HF 대조군 n=4; HF LNA-antimiR-Control n=3; HF LNA-antimiR-21 n=5. 데이터는 평균 및 개별 값을 나타내며 Sidak의 사후 검정과 함께 일원 ANOVA(B) 또는 이원 ANOVA(C)를 사용하여 분석되었다. **P<0.01.
도 2. LNA-antimiR-21을 사용하여 miR-21을 억제한 후 우심실, 좌심방, 우심방, 간, 폐, 신장 및 비장에서 miR-21 발현의 정량화.
LNA-antimiR-21은 재관류 손상 동안 5일 및 19일에 카테터로 국소 적용되었다. 심장의 다른 영역(좌심방, 우심방 및 우심실) 및 기타 기관(신장, 간, 폐 및 비장)에서 miR-21의 발현. HF 대조군 n=3; HF LNA-antimiR-Control n=3; HF LNA-antimiR-21 n=5. 데이터는 평균 및 개별 값을 나타내며 Sidak의 사후 검정과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 분석되었다. *P<0.05.
도 3. miR-21의 억제는 I/R 유발 심장 비대 및 심근 섬유증으로부터 돼지 심장을 보호한다.
(A) 체중에 대한 심장 무게의 비율(HW/BW). (B) 상단, 심장의 경계 영역에서 대표적인 심근 절편 내 밀 배아 응집소(agglutinin) 염색. 하단, 데이터의 정량화. (C) 상단, Sirius red/Fast green에 의한 심근 샘플의 대표적인 염색. 하단, 데이터 정량화. (D) 심장의 경계 영역에 대한 비멘틴(섬유아세포 마커) 염색의 정량적 분석. (E) 심장의 경계 영역에 대한 CD68(대식세포 마커) 염색의 정량적 분석. (F) 경계 영역에서 CD31에 대한 항체로 심근 절편을 염색하여 모세관 밀도를 결정하였다. 대표 이미지 및 정량화. (G) 콜라겐 유전자(Col1a1, Col1a2 및 Col3a1), 평활근 액틴(Acta2) 및 근세포 비대 관련 유전자(Nppa, Nppb 및 Myh7)의 mRNA 수준의 정량적 평가. 스케일 바: 50 ㎛(B), 500 ㎛(C) 및 (D). 심장 당 중심 핵이 있는 300 초과의 세포(B). 심장 당 10000 초과의 세포(D, E 및 F). Sham 대조군 n=3; HF 대조군 n=4; HF LNA-antimiR Control n=3; HF LNA-antimiR-21 n=5. 데이터는 평균 및 개별 값을 나타내며 Sidak의 사후 검정과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 분석되었다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 및 ****P<0.0001.
도 4. LNA-antimiR-21의 카테터 기반 국소 적용은 전체 및 국소 심근 기능을 향상시킨다.
돼지는 경피적 허혈/재관류(60분/33일) 손상을 받았고 LNA-antimiR-21 또는 LNA-antimiR-Control은 재관류 손상 동안 5일 및 19일에 카테터로 국소 적용되었다. (A) I/R 후 d33에서 얻은 대표적인 압력-용적 루프 추적. (B-E) PV 분석에 의해 측정된 전체 심근 기능 지수; (B) 좌심실 확장기말 압력, (C) 뇌졸중 용적, (D) 수축 속도, (E) 좌심실의 이완 속도. (F) 국소 심근 기능의 척도로서 소노마이크로메트리(sonomicrometry)에 의해 결정된 심내막 분절 단축. 분석은 휴식 중 또는 120 bpm 및 140 bpm으로 페이싱(pacing)한 후 허혈/재관류 손상 후 33일에 수행되었다. (G) I/R 손상 전 및 재관류 후 33일에 형광투시에 의해 결정된 심박출 계수. HF 대조군 n=4; HF LNA-antimiR Control n=3; HF LNA-antimiR-21 n=5. 데이터는 평균 및 개별 값을 나타내며 Sidak의 사후 검정과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 분석되었다. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001.
도 5. miR-21의 억제는 용량 의존적 방식으로 I/R 유발 심장 기능 손실을 예방하였다.
돼지는 허혈/재관류 손상을 받았고 수술 후 5일과 19일에 4 mg 또는 10 mg의 LNA-antimiR-21을 받았다. 이 도면은 또한 4 mg의 LNA-antimiR-21 투여량을 10 mg의 투여량과 직접 비교하기 위해 도 1C, 4에 제시된 데이터를 참조한다. (A) 경색 크기의 정량화. (B) miR-21 발현의 정량적 분석. (C) 좌심실 확장기말 압력 분석. (D) 심박출 계수의 정량화. (E) 소노마이크로메트리를 사용한 국소 심근 기능의 분석. HF 대조군 n=4; HF LNA-antimiR-Control n=3; HF LNA-antimiR-21(4 mg) n=2; HF LNA-antimiR-21(10 mg) n=5. 데이터는 평균 및 개별 값을 나타내며 짝을 이루지 않은 일원 ANOVA를 사용하여 분석되었다. **P<0.01 및 ***P<0.001.
도 6. 차등 발현 분석은 LNA-antimiR-21 적용 후 miR-21 표적의 활성화(de-repression)를 나타낸다.
(A) RNA 시퀀싱에 대한 도식. RNA 시퀀싱 라이브러리는 TruSeq Stranded mRNA 샘플 준비 키트를 사용하여 심근 허혈 조직에서 분리된 4 ㎍의 총 RNA 샘플에서 생성되었다. 시퀀싱은 HiSeq4000(Illumina)에서 수행되었으며 분석은 사내 Galaxy 플랫폼을 사용하여 수행되었다. 그룹 당 n=3. (B) 주성분 분석. 주성분 1(PC1, x축)은 데이터의 총 변이의 59.5%를 나타내고 PC2(y축)는 40.5%를 나타낸다(TPM>=3, n=8432). (C) TargetScan Human(버전 7)에 의해 예측된 8-mer, 7-mer-m8 또는 7-mer-A1 결합 부위를 포함하는 모든 유전자 및 광범위하게 보존된 miR-21 표적에 대한 차등 발현의 누적 분포 및 중간 배수 변화 플롯. 막대 그래프는 사분위수 범위에 따른 중간 mRNA 배수 변화를 보여준다. 데이터는 Kolmogorov-Smirnov 검정을 사용하여 분석되었다. ***P<0.001. (D) HF LNA-antimiR-Control과 Sham(왼쪽) 및 HF LNA-antimiR-21과 HF LNA-antimiR-Control(오른쪽) 사이의 고도로 탈조절된 유전자(로그 배수 변화가 2보다 크거나 -2보다 작음, 조정된 p-값 < 0.05)에 대한 생물학적 과정의 유전자 온톨로지 농축. 회색 점선은 GO 용어에 대해 P<0.05를 나타낸다. (E) 탈조절된 유전자 및 관련 유전자 온톨로지 용어를 보여주는 코드 다이어그램. (F) 심근 조직 용해물에서 수행된 인산화(p-ERK) 및 인산화되지 않은 ERK(t-ERK)에 대한 면역블롯. GAPDH는 로딩 대조군으로 사용되었다. (G) 돼지 심근 조직에서 phospho-ERK 양성 심장 섬유아세포의 백분율. 면역형광 염색은 phospho-ERK, 비멘틴(VIM; 중간엽 세포 마커) 및 CD31(내피 세포 마커)에 대해 심근 절편에서 수행되었다. 핵은 DAPI로 염색되었다. VIM에 대해 양성이고 CD31에 대해 음성인 세포를 심장 섬유아세포로 간주하였다. 스케일 바: 50 ㎛. sham 대조군 n=3; HF 대조군 n=4; HF LNA-antimiR-Control n=3; HF LNA-antimiR-21 n=5. 데이터는 평균 및 개별 값을 나타내며 일원 ANOVA를 사용하여 분석되었다. *P<0.05.
도 7. 유전자 디콘볼루션과 결합된 차세대 RNA 시퀀싱은 antimiR-21 처리 돼지 심근에서 대식세포와 섬유아세포의 중요한 역할을 보여준다.
(A) 유전자 디콘볼루션의 개요. (B) 세포 유형 전반에 걸친 유전자의 양, 특이성 및 농축을 기반으로 한 컨센서스 랭킹에 대한 유전자 간의 교집합. (C) 대식세포, 내피 세포 및 섬유아세포에 대한 시그니처 매트릭스에서 상위 3개 농축 유전자의 UMAP 기능 및 바이올린 플롯. (D) 근세포, 내피 세포, 섬유아세포 및 대식세포에 대한 벌크 및 단일 세포 RNA 발현으로부터 돼지 심근에 대한 상대적 세포 유형 비율 추정. sham 대조군 n=3; HF 대조군 n=3; HF LNA-antimiR-21 n=5. 데이터는 평균 및 개별 값을 나타내며 Sidak의 사후 검정과 함께 일원 ANOVA를 사용하여 분석되었다. *P<0.05 및 **P<0.01.
도 8. miR-21은 심장 대식세포에서 가장 풍부하고 농축된 microRNA이다.
(A) 세포 분리를 위한 도식. (B) 상이한 심근 세포 유형에서 miRNA 발현 프로파일. 야생형 마우스의 심장에서 분리된 심장 대식세포 및 기타 심근 세포 유형(근세포, 섬유아세포 및 내피 세포)에서 miRNA의 파이 그래프 표시. (C) 상이한 심근 세포 유형에서 miR-21a-5p의 발현. (D) 야생형 마우스는 횡단 대동맥 수축(TAC)을 받거나 음성 대조군으로 shamm 수술을 받았다. 압력 과부하 후 6일에 야생형 마우스의 심장에서 분리된 심장 대식세포에서 miRNA의 파이 그래프 표시. TAC n=5 후 6일. (E) 압력 과부하 후 6일 또는 21일에 심장에서 분리된 심장 대식세포에서 SYBR-green 기반 정량적 실시간 PCR에 의해 결정된 miR-21-5p의 상대적 발현. sham n=6; TAC n=5 후 6일, TAC n=3 후 21일. (F) sham 또는 TAC 수술 후 WT 마우스로부터 분리된 심장 대식세포에서 상위 발현된 miRNA에 대한 TPM(total reads per million)에서 miRNA(막대) 및 상응하는 3'-UTR 표적 풀(검은색 선)의 측정된 카피. miR-21은 빨간색으로 표시된다. Y축은 로그 스케일이다. 그룹당 n=3. (G) 대식세포 특이적인 miR-21-결핍(miR-21 cKO) 마우스는 상주형는 대식세포에서 특이적으로 활성적인 Cx3cr1 프로모터에 의해 구동되는 Cre 재조합효소를 발현하는 마우스 계통과 miR-21-floxed 마우스를 교배시켜 생성되었다. 심장 대식세포에서 miR-21의 발현. 데이터는 평균 및 개별 값을 나타내며 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 분석되었다. WT n=3; miR-21 cKO n=5. 데이터는 평균 및 개별 값을 나타내며 학생 t-검정을 사용하여 분석되었다. *P<0.05, **P<0.01 및 **P<0.001.
도 9. miR-21의 대식세포 특이적인 결실은 마우스에서 압력 과부하 유발 심근 리모델링을 예방한다.
8주 된 야생형 및 miR-21 cKO 마우스는 TAC 또는 sham 수술을 받고 4주 후에 심장을 채취하였다. 심장 기능은 수술 전, 수술 후 2주, 실험 종료 시(수술 후 4주) 실시한 심장초음파검사(echocardiography)로 모니터링하였다. (A) 실험 전략. (B) 대표적인 심근 절편의 Sirius red/Fast green 염색 및 세포외 매트릭스의 정량화. (C) 밀 배아 응집소(WGA)로 염색된 대표적인 심근 절편 및 심근 세포 구역의 정량화. (D) 콜라겐 유전자(Col1a1, Col1a2), Acta2, Myh7 및 Nppa의 mRNA 수준의 정량적 PCR 평가. (E) 좌심실 심박출 계수에 의해 측정된 심장 기능의 평가. (F) 수축기 및 확장기에서 Vevostrain 소프트웨어를 사용하여 측정된 심장 스트레인의 대표적인 반점 추적. (G) 피크 방사형 스트레인(%), 최대 종단 스트레인(%) 및 피크 원주형 스트레인(%)의 정량화. 스케일바는 2 mm(B)와 100 mm(C)를 나타낸다. WT Sham n=6; miR-21 cKO Sham n=7; WT TAC n=10; miR-21cKO TAC n=7. 데이터는 평균 및 개별 값을 나타내며 Sidaks의 사후 검정(B-G)과 함께 학생 t-검정(A) 또는 이원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 분석되었다. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001.
도 10. 단일 세포 시퀀싱은 심장 대식세포에서 miR-21의 특정 결실 후 심장에서 상주형 대식세포의 축적을 보여준다.
(A) TAC 수술 후 6일에 야생형 및 miR-21 cKO 마우스 심장에서 분리된 비-심장 근세포의 단일 세포 시퀀싱의 실험 작업도. 10X Chromium Single Cell 3'-Library 키트 시약을 사용하여 바코드 cDNA 라이브러리를 생성하고, HiSeq4000을 사용하여 시퀀싱을 수행하며, 셀 레인저 및 Seurat 패키지를 사용하여 분석하였다. (B) 야생형 및 miR-21 cKO 단일 세포 전사체(transcriptomes) 분포의 차원 감소 및 유전자 발현을 기반으로 한 세포 그룹화를 보여주는 UMAP 분포 플롯. (C) 대식세포, 상주형 및 염증성 대식세포에 대한 마커 유전자의 발현을 보여주는 바이올린 플롯. (D) 상이한 대식세포 클러스터를 나타내는 파이 그래프. (E) WT TAC 대 WT Sham 및 miR-21 cKO TAC 대 WT TAC의 상주형 대식세포에서 상위 200개의 탈조절된 유전자의 생물학적 과정에 대한 유전자 온톨로지(GO) 농축 분석. 과도하게 표현된 유전자 온톨로지 용어와 관련된 유전자의 연관성을 보여주는 코드 다이어그램. (F) RNA 속도는 WT 대조군에 비해 miR-21 cKO 마우스의 M1 유사 대식세포에서 M2 유사 대식세포로의 빠른 이동을 나타낸다. (G) LNA-antimiR-21 또는 LNA-antimiR control에서 5 ng/mL의 지질다당류(LPS)로 자극을 가하거나 자극하지 않고 처리한 골수 유래 대식세포에서 전염증성 유전자(Tnf, Il6, Nos2)의 발현. n=6. 데이터는 평균 및 개별 값을 나타내며 Sidaks의 사후 검정과 함께 이원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 분석되었다. **P<0.01, ***P<0.001 및 ****P<0.0001.
도 11. 단일 세포 전사체학 데이터 세트에서 리간드 수용체 페어링(pairing)의 분석은 심장 대식세포를 섬유아세포 활성화의 1차 파라크린 유도제로 식별한다.
(A) WT 및 miR-21 cKO 마우스에서 상이한 심장 세포 분획 사이에서 유의하게 상향조절된 파라크린 및 자가분비 상호작용을 요약한 코드 다이어그램. 선 색깔은 동일한 색깔의 세포 집단에 의한 리간드 살포를 나타낸다. 선 두께는 동족 수용체가 수혜자 세포 집단에 존재하는 리간드의 수에 비례하고 숫자는 각 집단 간 연결에 대한 리간드-수용체 쌍의 양을 나타낸다. 리간드 또는 수용체는 세포 집단 중 적어도 20%에서 검출될 때 발현되는 것으로 간주된다. 가장 많은 수의 상호작용은 miR-21 cKO 마우스에서 억제되는 야생형에서 활성화된 섬유아세포(Postn+)를 향한 M1 유사 대식세포에서 발생하였다. (B) 활성화된 섬유아세포(Postn+) 세포를 향한 M1 유사 대식세포의 파라크린 상호작용의 상세 보기. (C) RNA 속도는 WT 대조군과 비교하여 miR-21 cKO 마우스에서 활성화된 섬유아세포에서 근섬유아세포로의 분화 억제를 나타낸다. (D) 상이한 대식세포 클러스터를 나타내는 파이 그래프. (E) 성체 마우스 심장 섬유아세포(AMCF)와 골수 유래 대식세포(BMDM)의 공동 배양을 위한 실험 전략. 대식세포를 골수 전구세포로부터 분화시킨 다음, 100nM LNA-antimiR-21 또는 LNA-antimiR-Control로 형질감염시키고 LPS로 자극하였다. 새로 분리된 AMCF를 LNA-antimiR-21 처리된 BMDM(PBS로 세척한 후)과 48시간 동안 공동 배양하였다. AMCF의 단일 배양은 음성 대조군으로 사용되었다. 면역형광 염색은 비멘틴(VIM; 섬유아세포 마커) 및 α-평활근 액틴(ACTA2, 근섬유아세포 마커)에 대해 수행되었다. 핵은 DAPI로 염색되었다. 섬유아세포 활성화는 ACTA2 발현에 의해 측정되었다. (F) ACTA2 양성 심장 섬유아세포의 백분율. N=4-6개의 독립적인 실험이 3회 수행되었다. 데이터는 평균 및 개별 값이며 Sidak의 사후 검정과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 분석되었다. ***P<0.001.
도 12. MiR-21은 폐 대식세포에서 가장 풍부하고 농축된 microRNA다.
(A) 폐포 및 간질 대식세포의 분리를 위한 유세포 분석 전략. (B) 총 폐 세포 및 대식세포 집단의 작은 RNA 시퀀싱에 의해 결정된 microRNA 발현 프로파일. 야생형 마우스의 폐에서 분리된 전체 폐 세포, 폐포 및 간질 대식세포에서 miRNA의 파이 그래프 표현. n=그룹당 3마리의 마우스. (C) 다양한 폐 세포 유형에서 정량적 실시간 PCR에 의한 miR-21의 발현은 대식세포 집단에서 miR-21의 농축을 보여주었다. n=3. 데이터는 평균±sem이다.
도 13. MiR-21은 폐 손상 후 마우스와 인간에서 상향조절된다.
(A) MiR-21은 폐 손상 후 마우스에서 상승한다. PBS 또는 블레오마이신 투여 후 14일에 마우스에서 채취한 폐 조직에서 miR-21의 발현. PBS n = 8; 블레오마이신 n = 9. (B) MiR-21은 특발성 폐 섬유증(IPF) 환자의 폐 조직에서 증가한다. (C-D) miR-21의 억제는 I/R 유발 폐 섬유증으로부터 돼지 심장을 보호한다. (C) LNA-antimiR-21은 돼지의 허혈 재관류 손상 동안 5일 및 19일에 카테터로 국소 적용되었다(도 1 참조). 돼지 심장에 LNA-antimiR-21 또는 LNA-antimiR Control을 국소 적용한 후 폐 조직에서 miR-21 발현의 정량적 분석. HF LNA-antimiR control n=3; HF LNA-antimiR-21 n=5. (D) I/R 유발 폐 섬유증의 정량화. 데이터는 평균±sem이다. 학생 t-검정을 사용하여 분석하였다. *P<0.05 및 **P<0.01.
도 14. miR-21의 근섬유아세포 특이적인 결실은 마우스에서 압력 심근경색으로 인한 심근 리모델링을 예방한다.
근섬유아세포 특이적인 miR-21-결핍(Postn miR-21 cKO) 마우스는 miR-21-floxed 마우스를 근섬유아세포에서 특히 활성적인 페리오스틴(Postn) 프로모터에 의해 구동되는 유도성 mer-cre-mer 재조합효소(MCM)를 발현하는 마우스 계통과 교배하여 생성되었다. 8주 된 야생형 및 miR-21 cKO 마우스는 심근 경색(MI) 또는 Sham 수술을 받았다. 심장 기능장애를 평가하기 위해 수술 후 1주에 마우스에서 심장초음파검사를 수행하였고, 근섬유아세포에서 특이적으로 miR-21의 결실을 달성하기 위해 타목시펜(40 mg/kg/d)을 5일 동안 마우스에 복강내 투여하였다. 심장은 4주 후에 채취하였다. (A) 실험 전략. (B) 마지막 타목시펜 주사 후 2일에 마우스의 심장 섬유아세포에서 miR-21의 발현. (C) 경골 길이에 대한 심장 무게의 비율(HW/TL). (D) 경골 길이에 대한 폐 무게의 비율(LW/TL). (E) MI 수술 후 28일에 좌심실 심박출 계수에 의해 측정된 심장 기능의 평가. (F) MI 후 28일에 확장기말 용적 및 수축기말 용적의 정량화. (G) 피크 방사형 스트레인(%)의 정량화. WT Sham n=4; Postn miR-21cKO Sham n=5; WT MI n=7; Postn miR-21cKO MI n=8. 데이터는 평균 및 개별 값을 나타내며 Sidaks의 사후 검정과 함께 이원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 분석되었다. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001.
도 15. 항체 결합 올리고뉴클레오티드.
표적 세포 유형에서 특이적으로 농축된 수용체에 대한 리간드 또는 항체(또는 이의 항체 단편)에 5'-아민-변형된 올리고뉴클레오타이드를 컨쥬게이트하는 예시적인 방법. 항체는 펩신으로 분해되어 더 작은 항체 단편을 얻을 수 있다.
도 16. 표 1. 간 및 신장 기능의 선택된 생화학적 파라미터의 혈청학적 분석.
도 17. 표 2. 심혈관 이벤트.
도 18. 정제된 프라이머리 세포 분획의 RNA 시퀀싱으로 확인된 바와 같이 인간 폐 및 심장 조직의 대식세포 및/또는 섬유아세포에 대한 anti-miR-21의 표적화를 위한 후보 수용체를 나타내는 히트맵.
데이터는 전체 전사체의 딥 RNA 시퀀싱에서 얻은 것이며, 세포 유형 특이성을 위해 필터링된 다음 클러스터링된다. 빨간색은 상대적 농축을 나타내고 파란색은 다른 세포 유형과 비교하여 상대적 고갈을 나타낸다. 왼쪽 하단 모서리는 대식세포 표적화를 위한 후보 표적을 나타내는 상단 후보 표면 수용체를 나열한다.
본 발명은 본 발명 및 본 발명의 많은 이점에 대한 더 나은 이해를 제공하는 다음의 예시적인 비제한적인 실시예를 통해 추가로 설명된다.
도 19. miRNA-21은 Covid-19 환자로부터 채취한 폐 조직에서 상향조절된다.
(A) 도식. 인간의 폐 조직을 채취하고 Covid-19 환자와 대조군의 좌하엽의 유사한 영역을 RNA 추출에 사용하였다. NEB Next Small RNA 라이브러리 키트를 사용하여 작은 RNA 라이브러리를 생성하고 MiSeq를 사용하여 샘플을 시퀀싱하였다. (B) 폐 조직에서 miRNA 발현 프로필. Covid-19 환자 및 대조군의 폐 조직에 있는 상위 10개의 풍부한 miRNA의 파이 그래프 표시. 대조군 n = 3; Covid-19 환자 n = 3.
도 20. MiR-21은 쥐의 폐의 대식세포에서 농축된다.
MiR-21은 마우스 폐의 폐포 대식세포(AM)에 농축된다. 상이한 세포 유형에서 폐 세포 유형(각 세포 유형에 대해 n = 1-3) 전반에 걸쳐 차등적으로 발현된 miRNA(log2 배수변화 >= 1 또는 log2 배수변화 <= -1 및 p-조정 값 <=0.05)의 히트맵 표시: 섬유아세포(Fb), 내피 세포(EC), 상피 세포(EpC), 호중구(NeuT), T 세포(T) 및 간질 대식세포(IM).
도 21. MiR-21은 마우스 폐 섬유증 모델의 폐 조직에서 상향조절된다.
미세분무기를 사용하여 블레오마이신을 마우스 폐에 투여하고 7일 후 폐 조직을 채취하였다. 총 RNA를 추출하고 NEBNext 작은 RNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 miRNA 라이브러리를 준비하고 MiSeq 시퀀서에서 시퀀싱하였다. 시퀀싱 판독은 miRDeep2를 사용하여 분석되었고 차등적으로 발현된 miRNA는 DESeq로 확인되었다. 현저하게 탈조절된 microRNA(FDR < 0.05)는 빨간색으로 표시된다.
도 22. 만노스 수용체 C 유형 1(MRC1)은 폐 조직의 대식세포에 의해 발현된다.
(A) 폐 대식세포에 농축된 후보 표면 수용체를 확인하기 위한 전략. (B) 폐포 및 간질 대식세포에서 Mrc1의 상대적인 양. (C) 상이한 폐 세포 유형에서 Mrc1의 발현. (D) 블레오마이신(GSE141259; PBS n=7; 블레오마이신 n=4) 후 14일에 마우스 폐에서 생성된 단일 세포 전사체에서 Mrc1의 발현을 보여주는 특징 플롯. (E) MRC1에 대한 항체를 사용하여 5 ㎛ 마우스 블레오마이신 처리 폐 절편의 대표적인 면역형광 염색. 핵은 Sytox green으로 염색되었다. 스케일바는 200 ㎛를 나타낸다. (F) 대조군 및 IPF(특발성 폐 섬유증) 인간 폐(GSE135893; 대조군 n=10, IPF n=12)로부터 생성된 단일 세포 전사체에서 Mrc1의 발현을 보여주는 특징 플롯.
도 23. 만노스 수용체 C 유형 1 리간드의 예시적인 화학 구조.
(A) 리간드 컨쥬게이트 및 antimiR-21의 디자인을 보여주는 도식. (B) 만노스-수용체 리간드 컨쥬게이트된 antimiR-21 분자의 예시적인 화학 구조. N-아세틸갈락토사민(GalNAc)(상단) 또는 만노스(하단) 리간드를 LNA-antimiR-21(SEQ ID NO: 1)의 5'-말단에 컨쥬게이트시켰다.
도 24. 대식세포로의 표적 전달을 위한 리간드 컨쥬게이트된 anti-miR-21.
(A) 실험 전략. 야생형 마우스에 Flexivent 분무 장치를 사용하여 흡입에 의해 만노스-, GalNAc- 또는 컨쥬게이트되지 않은 LNA-antimiR-21-FAM 중 하나를 1.25 mg/kg으로 투여하였다. PBS를 받은 마우스는 음성 대조군으로 사용되었다. 2시간 후, 마우스를 희생시키고 2 mM EDTA를 함유하는 빙냉 PBS를 순차적으로 주입하고 흡인하여 기관지폐포 세척액(BALF)을 수집하였다. 그런 다음, 폐를 채취하고, 효소 분해에 적용하고, 자기 마이크로비드-컨쥬게이트된 항-CD45 항체에 의해 면역 세포를 농축시켰다. 면역 세포 농축 분획은 대식세포(MP)의 경우 CD45, F4/80 및 MRC1에 대한 항체로 염색하거나 T 세포 및 호중구(N)의 경우 CD45, CD3 및 Ly6G에 대한 항체로 염색하였다. 비면역 세포 분획이 농축된 세포 현탁액을 통한 플로우를 CD45, EPCAM, CD105 및 CD140a에 대한 항체로 염색하여 각각 상피 세포(Ep), 내피 세포(EC) 및 섬유아세포(FB)를 분석하였다. 항-CD45 항체는 백혈구를 배제하기 위해 비면역 세포 분획에 사용되었다. 그런 다음 유세포 분석을 사용하여 FAM 신호 강도에 대해 세포를 평가하였다. (B) BALF에서 분리된 FAM 양성 대식세포의 백분율. (C) 폐의 상이한 세포 유형에서 FAM 양성 세포의 백분율. 컨쥬게이트되지 않음: PBS n=3, 0.625 mg/kg n=3, 1.25 mg/kg n=3, 2.5 mg/kg n=3. 만노스 컨쥬게이트된: PBS n=3, 1.25 mg/kg n=3. GalNAc-컨쥬게이트된: PBS n=2, 0.625 mg/kg n=2, 1.25 mg/kg n=2, 2.5 mg/kg n=2. 데이터는 평균 및 개별 값이며 Tukey 사후 검정과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 분석되었다. 비교는 컨쥬게이트되지 않은- 및 만노스-컨쥬게이트된 LNA-antimiR-21-FAM 그룹 사이에서만 수행되었다. *P<0.05. GalNAc: N-아세틸갈락토사민. FAM: 플루오레세인 아미다이트.
도 25. 유세포 분석을 사용한 BALF 및 폐 조직으로부터의 대식세포에 의한 만노스-컨쥬게이트된 LNA-antimiR-21-FAM 흡수의 평가.
(A) BALF 및 폐 조직의 대식세포에서 FAM 신호의 중간 형광 강도. (B) 대식세포 서브세트의 대표적인 히스토그램. 컨쥬게이트되지 않음: PBS n=3, 1.25 mg/kg n=3. 만노스 컨쥬게이트된: PBS n=3, 1.25 mg/kg n=3. 데이터는 평균 및 개별 값이며 학생 t-검정을 사용하여 분석되었다. *P<0.05. FAM: 플루오레세인 아미다이트.
도 26. miR-21의 억제는 블레오마이신 유발 폐 리모델링 및 폐 기능장애를 감소시켰다.
(A) 실험 전략. 미세 분무기를 사용하여 마우스 폐에 PBS 또는 블레오마이신(2 U/kg)을 투여하였다. 만노스 컨쥬게이트된 마이크로리보핵산(miR) 억제제인 잠금 핵산(LNA) 변형된 안티센스 miR-21(2.5 mg/kg)을 블레오마이신 유발 폐 손상 후 4일에 Flexivent 분무기를 사용하여 흡입에 의해 적용하였다. antimiR 적용 후 10일에 Flexivent를 사용하여 폐 기능을 평가하고 형태 측정 분석을 위해 폐를 채취하였다. (하단) miR-21(SEQ ID NO: 4), LNA-antimiR-21(SEQ ID NO: 1) 및 LNA-antimiR-mismatch-21(대조군)(SEQ ID NO: 5)의 서열. (B) Sirius red/Fast green을 사용한 폐 조직의 대표적인 염색 및 정량화. 스케일 바는 100 ㎛를 나타낸다. (C) 압력-용적 루프 곡선의 평균 추적. 곡선 뒤의 회색 음영 영역은 표준 오차 평균을 나타낸다. (D-F) 준정적 엘라스턴스(quasi-static elastance) (D), 준정적 컴플라이언스(quasi-static compliance)(E) 및 흡기 용량(F)으로 표시되는 폐 기능. 만노스-컨쥬게이트된 LNA-antimiR-mismatch-21: PBS n=3, 블레오마이신 n=7. 만노스-컨쥬게이트된 LNA-antimiR-21: PBS n=3, 블레오마이신 n=6. 데이터는 평균 및 개별 값이며 Tukey의 사후 검정과 함께 이원 ANOVA를 사용하여 분석되었다. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001.
도 27. 만노스 수용체 C 유형 1(MRC1)은 마우스 심장의 대식세포에 의해 발현된다.
(A) 심장에 농축된 후보 표면 수용체를 확인하기 위한 전략. (B) 상이한 심근 세포 유형과 비교하여 대식세포에서 표면 수용체의 상대적인 농축 및 양. (C) 상이한 심근 세포 유형에서 Mrc1의 발현. (D) 압력 과부하 후 6일에 마우스 심장에서 생성된 단일 세포 전사체에서 Mrc1의 발현을 보여주는 특징 플롯. (E) 상이한 심근 세포 유형과 비교하여 섬유아세포에서 표면 수용체의 상대적인 농축 및 양.
실시예 1: LNA-antimiR-21의 국소 전달에 의한 miR-21의 억제
심부전의 대형 동물 모델의 좌심실(LV) 심근에서 miR-21의 발현은 즉 좌전하행동맥(LAD)의 일시적 폐색(60분)을 받은 돼지에서 결정되었다. 파일럿 실험에서 동물은 안락사 및 추가 분석을 위해 심장 제거 전에 1, 7 또는 28일 동안 추적되었다(도 1A). miR-21의 발현은 LV 심근의 원격 및 경계 영역 모두에서 점진적으로 상향조절되었다(도 1A). 급성 허혈의 심장 근육세포에서 miR-21에 대한 이러한 발현 역학 및 보고된 항-세포사멸 역할 때문에(Sayed et al., 2010) 다음의 실험 디자인이 사용되었다: 흉터가 형성되도록 며칠 후(I/R 후 5일 및 19일) 잠금 핵산(LNA) 변형된 antimiR-21(LNA-antimiR-21)을 관상동맥에 국소 제공하였다(도 1B). 높은 특이성과 효능으로 miR-21을 억제하기 위해 포스포로티오에이트 변형된, 15개 뉴클레오티드, LNA/DNA 믹스머 디자인을 선택하였다. LNA-antimiR-21(포스포로티오에이트-변형된, 15개 뉴클레오티드, LNA/DNA 믹스머) 또는 대조군 10 mg을 좌전하행동맥(LAD)과 좌회굴동맥(LCx)에 3:2의 비율로 그리고 혈관성형술 풍선에 의한 혈관 폐색이 수반되는 혈관 당 3분의 기간 동안 주입하였다(도 1B). I/R 손상 후 33일에 LNA-antimiR-21의 관내 전달은 LV 허혈성 심근에서 준비된 RNA에 대한 정량적 RT-PCR에 의해 검출된 바와 같이 miR-21(-66%)의 상당한 감소를 초래하였다(도 1C). 흥미롭게도 miR-21의 억제는 심근의 경계 영역 대 원격 영역에서 우선적으로 발생하는 것으로 나타났으며, 이는 허혈 조직에서 우선적으로 흡수됨을 시사한다. LNA-antimiR-21의 국소 적용은 마찬가지로 심장, 우심실, 좌심방 및 우심방의 다른 영역에서 miR-21 수준을 변경하지 않았다(도 2). 돼지에서 국소 antimiR 적용의 이전 결과와 일치하듯(Hinkel et al., 2013), 전신 올리고뉴클레오티드 치료제의 매우 높은 흡수로 알려진 기관들인 신장과 폐(도 2)에서 miR-21의 미미하지만 상당한 감소를 관찰하였다(Stenvang et al., 2012). 신장 및 간 기능에 대한 일상적인 임상 화학 파라미터의 혈청 농도는 정상 범위에 있었으며 이는 완전한 신장 및 간 기능을 나타낸다(표 1). 또한 LNA-antimiR-21을 적용하였을 때 antimiR을 적용하기 전에만 발생한 부정맥이나 사망은 관찰되지 않았다(표 2). 종합하면, LNA-antimiR-21의 카테터 기반 국소 전달은 심부전의 대형 동물 모델의 좌심실 심근에서 miR-21의 장기간 억제에 효과적이었다.
〔표 1〕
Figure pct00007
〔표 2〕
Figure pct00008
miR-21의 억제는 I/R 유발 심근 리모델링을 감소시킨다
또한 심근 리모델링에 대한 LNA-antimiR-21의 효과가 결정되었다(도 3). I/R 후 33일에, 두 개의 상이한 처리 그룹은 유사한 경색을 나타냈다. 이 시점에서 현저한 불리한 심장 리모델링이 관찰되었으며, 이는 체중에 대한 심장 무게, 심근세포 비대 및 심장 섬유증에서의 유의한 증가로 명백하며, 이들 모두는 LNA-antimiR-21 처리 돼지에서 유의하게 감소되었다(도 3A-C). 그런 다음 심근 리모델링, 즉 섬유아세포 증식, 염증 및 혈관신생과 관련된 주요 병리학적 과정을 평가하였다(도 3D-F). LV 심근의 면역형광 염색은 섬유아세포 증식 및 대식세포 침윤을 나타내었으며, 둘 다 대조군 처리 동물과 비교하여 LNA-antimiR-21에 의해 상당히 억제되었다. 대조적으로, 우리는 이 모델에서 모세관 밀도의 변경에 대한 증거를 찾지 못했고 이것이 antimiR-21에 의해 영향을 받지도 않았다(도 3F). QRT-PCR에 의한 심근의 총 RNA의 분석은 인간을 포함한 다른 종에서 심근 리모델링을 나타내는 유전자 발현 시그니처를 산출했으며 이는 LNA-antimiR-21 그룹에서도 마찬가지로 상당히 역전되었다(도 3G). 원격 LV 심근의 비교 분석은 심근 리모델링을 특징으로 하는 파라미터의 최소한의 변화만을 나타냈다.
LNA-antimiR-21의 카테터 기반 국소 전달은 전체 및 국소 심근 기능을 향상시킨다.
miR-21 억제가 심장 기능에 미치는 영향을 평가하기 위해, 허혈 전(d0) 및 5일(LNA-antimiR-21 투여 전)(d5) 및 허혈 후 33일(d33, 또한 속도-수축 관계를 얻기 위한 심장 페이싱(cardiac pacing)과 함께)에 침습적 혈역학적 측정(압력-체적 분석, PV 분석)을 수행하였다. 이것은 휴식 상태에서 심박출 계수(EF) 및 심근 관류를 결정하기 위해 허혈 전(d0) 및 후(d33) 조영제 형광투시로 보완되었다. d33에서 희생 및 조직 채취 전에 초음파 결정을 경계 구역(폐색 부위의 원위 10 mm) 및 원격 심근에 이식할 때 심장 페이싱을 이용한 소노마이크로메트리가 수행되었다(실험 전략에 대한 개요는 도 1B의 도식 참조).
대조군 처리 동물은 LVEDP가 증가하고 LV 뇌졸중이 감소하며 명백한 심부전을 나타내는 음의 속도-수축 관계로 전체 심근 기능이 현저하게 감소하였다(도 4A-E). 대조적으로, LNA-antimiR-21을 사용한 치료는 심장 기능의 감소를 유의하게 예방하였다(도 4A-E). 일관되게, LNA-antimiR-21 적용은 양의 속도-수축 관계(도 4D 및 E)에 의해 입증된 바와 같이 좌심실의 기능적 예비에 상당한 이득을 가져왔다. 마찬가지로 LV 용적 분석은 LV 수축기말 용적의 상당한 감소를 나타낸 반면(HF 58.5±3.4, HF LNA-antimiR-Control 58±0.4, HF LNA-antimiR-21 40.2±5.3), LNA-antimiR-21로 관찰된 LV 확장기말 용적의 약간의 감소는 통계적 유의성에 도달하지 못했다(HF 112.7±3.5, HF LNA-antimiR-Control 107.6±3, HF LNA-antimiR-21 103±2.7). LV 기능에 대한 독립적인 측정으로서, 심내막 분절 단축을 결정하기 위해 소노마이크로메트리를 사용하였다(도 4F). 혈역학적 분석에 따라 LNA-antimiR-21은 휴식 및 페이싱(140 bpm) 조건에서 LNA-antimiR-Control 처리 동물과 비교하여 국소 수축성을 개선하였다(도 4F). 조영제 주입 시 형광투시도 마찬가지로 33일에 EF의 현저한 감소를 나타내었으며, 이는 LNA-antimiR-21 그룹에서 예방되었다(도 4G). 우리의 연구 디자인은 MRI 또는 PET와 같은 조직 관류의 정량적 측정을 목표로 하지 않았지만, 미세순환을 포함하여 LAD의 정상적인 관류를 나타내는 3의 TIMI 값으로 관상동맥 혈류(조영제 주입에 의한)와 관련하여 그룹 간의 차이를 관찰하지 못하였다. 마지막으로, LNA-antimiR-21의 효과는 10 mg의 올리고뉴클레오티드 대신 4 mg으로 처리하여 얻은 현재 데이터가 시사하는 바와 같이 용량 의존적인 것으로 나타났다(도 5). 요약하면, 이러한 발견은 miR-21 억제제의 국소 적용이 허혈성 심부전의 이 모델에서 심장 기능을 유의하게 개선했음을 보여준다.
AntimiR-21은 돼지 심근 쇠약의 전사체 시그니처를 정상화한다
또한 결과는 miR-21로 간섭하는 것이 이 대형 동물 모델에서 질병 관련 유전자 발현 시그니처에 영향을 미치는 것으로 결정되었다. LNA-antimiR-21 처리된 좌심실 허혈성 심근(경계 영역) 그리고 Sham 처리된 동물(각 그룹에서 n=3)에서 분리한 폴리A가 풍부한 RNA의 TruSeq Illumina 시퀀싱을 사용하여 어댑터를 제거하고 필터링한 후 샘플 당 대략 1억 2660만개의 판독을 산출하였다(판독의 >99.9%). 돼지 게놈에 대한 판독을 매핑(Sus scrofa v11.1)하여, 1억 1200만개의 판독을 성공적으로 정렬할 수 있었다(도 6A). 이는 높은 신뢰도로 정렬된 모든 판독의 95±0.4%에 해당하고, 데이터 세트의 높은 데이터 품질을 보여주며, 우리가 아는 한 성체 돼지의 심근 질환에 대한 최초의 광범위한 딥 시퀀싱 데이터 세트이다.
주성분 분석은 연구된 3개의 서로 다른 실험 그룹 내에서 명확한 분리와 높은 균질성을 나타내어 후속 분석을 위한 이 데이터 세트의 유효성을 강조한다(도 6B). 허혈은 돼지 심장 전사체의 뚜렷한 탈조절로 이어지며, 이는 antimiR-21 처리에 의해 부분적으로 회복되었다.
이러한 전사체 변화가 심근에서 miR-21 활성 조절과 실제로 관련이 있는지 여부를 평가하기 위해 모든 유전자에 대한 mRNA-배수 변화의 분포를 결정하고 TargetScan Human 7에서 예측한 보존된 miR-21 표적의 분포와 비교하였다(도 6C). miR-21의 억제는 miR-21에 대한 부위가 없는 mRNA와 비교하여 miR-21 표적의 상당한 억제를 초래하였다(도 6C).
AntimiR-21은 심근 쇠약에서 전-섬유증 및 염증성 전사 시그니처를 억제한다.
이후 우리는 HF 동안 주로 활성화되고 miR-21로 간섭하여 조절되는 생물학적 과정을 확인하고자 하였다. HF에서 탈조절된 모든 mRNA의 유전자 온톨로지(GO) 농축 분석(로그 배수 변화 > 2 또는 로그 배수 변화 <-2 및 q-값 < 0.05)은 세포외 매트릭스 조직화, 세포 접착, 조골 세포 분화 및 염증 반응을 포함하는 조직 리모델링과 관련된 과정을 위한 농축을 보여주었다(도 6D 및 E의 왼쪽 패널). miR-21로 간섭하는 것은 염증 및 면역 반응에 가장 강력한 영향을 미쳤고 ERK-MAP-키나아제의 억제가 이어졌다(도 6D 및 E의 오른쪽 패널). 후자를 추가로 검증하고 이 전사 시그니처가 ERK-MAP 키나아제의 단백질 활성을 변경했는지 여부를 결정하기 위해, 심장 조직에서 활성화된 MAPK3(pERK)에 대해 웨스턴 블로팅 및 면역형광 염색을 수행하였다(도 6F 및 G). AntimiR-21은 HF 유발 ERK-MAPkinase 활성을 유의하게 억제하였다(도 6F). 리모델링 관련된 ERK 활성화 및 antimiR-21에 의한 억제는 주로 심장 섬유아세포에서 발생하는 것으로 밝혀졌다(도 6G).
돼지에 대한 유전자 디콘볼루션 접근법은 심장 대식세포와 섬유아세포를 antimiR-21 처리에 의해 영향을 받는 주요 세포 유형으로 식별한다
심근에서 관찰된 전사적 변화는 추정상 세포 상태의 변화에서 비롯되지만 세포 유형 비율의 변화에서 기인할 수도 있다. 후자를 분석하기 위해 돼지에 대한 유전자 디콘볼루션 접근법이 개발되었다. 마우스 심장에서 분류된 4가지 주요 심근 세포 유형(근세포, 섬유아세포, 대식세포 및 내피 세포)에서 유래된 딥 전사체 데이터가 포함되었으며 마우스 scRNA-Seq 데이터 세트(Skelly et al에 의해 보고된 재가공 데이터)에 추가로 사용되었다(Skelly et al., 2018))(도 7A). 그런 다음 관심 있는 각 세포 유형에서 가장 농축되고 매우 특이적이며 가장 풍부한 유전자를 확인하고 scRNA-Seq 및 deep RNA-Seq 데이터 세트에 대해 이들을 결합하였다(도 7A 및 B). 마지막으로, 우리는 4가지 모든 세포 유형(도 7B)에 대한 상위의 풍부하고 특이적이며 농축된 mRNA에 관한 중복을 계산한 다음 이러한 마커를 사용하여 디콘볼루션을 위한 시그니처 매트릭스를 구축하였다(도 7C). 그런 다음 이 새로운 유전자 디콘볼루션 접근법을 적용하여 심부전 중 심장 리모델링 및 antimiR-21의 효과에 따라 Sham 조건에서 상대적 세포 유형 비율을 결정하였다(도 7D). 심근 쇠약은 대식세포와 섬유아세포 수의 현저한 증가를 특징으로 한다. anti-miR-21 처리는 대식세포와 섬유아세포 수의 증가를 역전시켰다. 심장 조직에서 RNA-Seq 데이터를 분석하기 위한 이 비편향 접근법은 정량적 방식으로 세포 분획을 결정할 수 있다. 이는 antimiR-21 처리가 대식세포 및 섬유아세포의 증가된 세포 수의 정상화를 유도함을 나타낸다(도 7D).
특정 기관을 표적으로 삼는 대안적인 접근법은 antimiR-21의 적용을 국소화하는 것이다. 심장 카테터법은 급성 관상동맥 증후군을 보이는 모든 환자의 대다수가 이러한 개입을 받는 임상 심장학의 일상적인 절차가 되었다(Bashore et al., 2012). 심장 카테터법의 합병증은 매우 드물게 발생하여 적용에 대한 임계값이 낮다. 여기에서 우리는 관련된 관상동맥을 통해 antimiR-21을 적용하였으며, 이는 손상된 조직이 고농도의 antimiR에 우선적으로 노출된다는 이점을 제공한다. 흥미롭게도, 우리의 데이터는 허혈 후 심근에서 antimiR-21의 흡수가 촉진된 것으로 보이며 잠재적으로 내피의 누출과 세포외 기질의 용해로 인해 나타나(도 1C 및 2) 손상 부위에 antimiR-21을 추가로 집중시키는 아이디어를 뒷받침한다.
허혈 후 적어도 5일 특히 심근경색에 miR-21 억제제를 투여하면 예상외로 허혈성 심근에서 증가된 흡수 및 치료 효능이 제공되었다.
miR-21 억제제의 증가된 흡수의 발견은 허혈 또는 심근경색 직후에만 miR-21 억제제의 증가된 흡수를 예상했기 때문에 허혈 후 5일에는 예상치 못한 것이었다. 따라서, 허혈 후 5일에 antimiR-21의 투여는 허혈 후 5일에 치료적 antimiR의 흡수를 증가시킨다는 것이 놀랍게도 본 명세서에 기록된다. 따라서 허혈 후 5일에 miR-21 억제제를 투여하는 것은 급성 환경에서 해로운 영향을 피하기 때문에 antimiRs 전달에 안전하다.
이의 본 설명 이후 몇 년 동안 miR-21의 상향조절은 압력 과부하, 심근 경색 및 심방 세동과 같은 다양한 원인에서 비롯된 심근 리모델링의 특징으로 보고되었다. 그 후, 여러 연구에서 각각의 질병 모델에서 miR-21을 억제하는 치료 효능이 입증되었다(Adam et al., 2012; Cardin et al., 2012; Thum et al., 2008). 그러나 근세포에서 miR-21의 과발현은 급성 허혈 동안 세포사멸로부터 근세포를 보호하였다(Sayed et al., 2010). 심근세포에서 miR-21의 이러한 의심되는 유익한 역할과 일치하듯, miR-21의 전체 유전자 결실에 대한 보통 또는 중립적 효과가 관찰되었다(Patrick et al., 2010; Ramanujam et al., 2016)(Patrick et al. ., 2010; Ramanujam et al., 2016)(Patrick et al., 2010; Ramanujam et al., 2016)(Patrick et al., 2010; Ramanujam et al., 2016). 그러나 근세포에서 miR-21의 결실은 해로웠지만 비-근세포에서 miR-21의 결실은 심장 보호를 제공하였다(Ramanujam et al., 2016). 급성 허혈 환경에서 antimiR-21에 의한 심장 대식세포의 사멸을 촉진하는 잠재적인 해로운 결과를 피하는 것은 본 발명자들의 독창적인 아이디어였다. 따라서, 본 발명자들은 5일에 miR-21 억제제를 투여하였다. 하기에 설명된 바와 같이, 허혈 후 5일에 miR-21 억제제의 투여는 근세포의 손실을 촉진하지 않는다. 심근 경색 후 지연된 적용의 이러한 전략은 급성 유해 효과를 피하고 후기 질병 상태에서 상향조절된 miR-21의 유익한 효과를 완전히 이용한다.
이 모델에서 miR-21의 억제는 처리 시작 후 4주에 심근 전사체의 지속적인 재형성으로 이어지며, 이는 miR-21 활성의 현저하게 오래 지속되는 억제를 시사한다. 비편향 유전자 온톨로지 분석은 염증 관련 및 MAP 키나아제 신호전달이 miR-21 조작에 의해 가장 크게 영향을 받는 것으로 확인되었다. 이 분석은 antimiR-21이 대식세포 침윤과 섬유아세포 증식을 감소시키는 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 anti-miR-21이 섬유아세포에서의 효과뿐만 아니라 대식세포에서의 작용을 통해서도 항섬유증 활성을 발휘할 수 있음을 시사한다. 따라서 대식세포 및/또는 섬유아세포를 표적으로 하는 anti-miR-21 분자를 적용하여 치료 효과를 더욱 높일 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 제공된 실험 데이터는 허혈 후 5일까지 지연된 국소 전달이 허혈 후 심근에서 예상외로 증가된 흡수 및 치료 효능을 산출했음을 입증한다. 또한, 여기에 제공된 RNA 시퀀싱 분석은 이것이 예기치 않게 대식세포 축적을 예방하여 anti-miR-21의 1차 표적으로서 심장 대식세포를 가리키는 것으로 나타났다.
실시예 2: 대식세포에서 치료 표적으로서 miR-21
miR-21은 심장 대식세포에서 고도로 발현되며 심부전에서 증가한다
마우스 심장의 주요 세포 분획 중 전체 작은 RNA 전사체의 인벤토리를 얻기 위해(도 8), 분리된 심장(Langendorff 준비)의 역행 관류로 시작하는 세포 분리 전략, 이어서 자기 및 형광 활성화 세포 분류(MACS 및 FACS)를 사용한 근세포, 내피세포, 섬유아세포 및 대식세포로의 분획화를 사용하였다(도 8 및 도 8A의 도식 참조). 상이한 심근 세포 분획(각 그룹의 n = 3) 중 작은 RNA의 시퀀싱은 어댑터 서열을 제거하고 저품질(Phred Q < 30) 및 작은(12개 미만의 뉴클레오티드) 판독을 필터링한 후 대략 샘플 당 100만개 판독을 산출하였다(대략 85% 유효 판독). 그리고 나서, 적어도 하나의 세포 유형의 복제에서 0이 아닌 값을 가지며 모든 샘플에서 백만 당 평균 수가 3보다 큰 miRNA에 대해 작은 RNA 레퍼런스 라이브러리(miRBase 21의 miRNA 헤어핀)에 매핑된 고품질 판독을 필터링하였다. 이러한 기준을 사용하여 우리는 microRNA로 당당히 주석이 달린 307개의 고유한 개별 전사체를 검출하였다(도 8B). 상이한 세포 유형 및 조직에서 얻은 작은 RNA 전사체와 일치하듯(Sood et al., 2006; Wessels et al., 2019), 마찬가지로 전체 miRnome의 절반을 구성하는 miRNA가 거의 없는 개별 miRNA 분자의 절대 양의 일방적인 분포를 관찰하였다(도 8B). 흥미롭게도, 발현 스펙트럼의 상단에 있는 miRNA 중 일부는 다른 심근 세포 유형과 비교할 때 매우 뚜렷한 세포 유형 특이성을 나타냈다(도 1C). 우리는 miR-21이 이 세포 유형에서 모든 microRNA 분자의 약 1/4을 구성하는 심장 대식세포 c(MPs)에서 가장 높게 발현된 miR임을 발견하였다(도 8B). 이것은 섬유아세포를 포함한 다른 심장 세포 분획에서보다 훨씬 더 높다(도 8B, C). 이 분자가 심장 질환의 발병에도 역할을 하는지를 조사하기 위해 우리는 횡단 대동맥 수축(TAC)에 의해 유발된 좌심실 압력 과부하에 대한 질병 모델에서 이를 실험하였다. 흥미롭게도, cMP에서 miR-21의 발현은 압력 과부하가 시작된 후 6일 및 21일에 점진적인 방식으로 또한 증가하였다(도 8D,E). microRNA를 통한 효과적인 표적 mRNA 조절은 주어진 세포 유형에서 이의 농도가 이의 표적 부위(즉, 세포의 전체 표적체)의 것과 일치할 것을 요구한다(Bosson et al., 2016; Brown et al., 2007). 따라서 우리는 발현된 상위 40개의 miRNA에 대한 표준 표적 부위를 포함하는 모든 mRNA의 절대 양을 결정하고 각 miRNA의 절대 카피 수와 관련하여 그것을 설정하였다(도 8F). 소수의 miRNA만이 cMP에서 그들의 표적체와 일치하지만, miR-21은 또한 Sham 및 질병 상태 둘 다에서 모든 대식세포 miRNA 중에서 가장 높은 miRNA:표적 비율을 발휘하여 cMP에서 이 miR-21의 강력한 조절 효과를 시사한다(도 8E). 생체 내 cMP에서 miR-21의 역할을 추가로 조사하기 위해 miR-21-floxed-mice와 대식세포에서 특이적으로 활성인 Cx3cr1-프로모터에 의해 구동되는 Cre-재조합효소를 발현하는 마우스 계통과 교배시켜 대식세포(MP) 특이적인 miR-21 결핍 마우스(miR-21 cKO)를 생산하였다(Yona et al., 2013). Cx3cr1-Cretg/0; miR-21flox/flox 마우스(miR-21 cKO)는 다른 심장 세포 유형, 골수 및 림프 세포에서 보존된 miR-21 수준과 함께 cMP에서 크게 감소된 miR-21 수준을 나타냈다(도 8G). 우리는 miR-21-cKO가 정상적으로 발달하는 것을 발견하였으며 WT 리터메이트 대조군과 비교하여 심장초음파검사에 의해 결정된 바와 같이 정상적인 심장 기능을 나타냈다. 따라서 miR-21-cKO 마우스는 대식세포, 특히 심장 대식세포에서 miR-21의 기능을 연구하는 데 적합한 모델이다.
MP에서 특히 miR-21의 유전자 결실은 좌심실의 압력 과부하 후 심장 기능을 향상시킨다(횡단 대동맥 수축(transverse aortic constriction, TAC)에 의해)
병리학적 심장 리모델링 및 기능장애에 대한 대식세포 miR-21의 기여를 조사하기 위해 WT 및 miR-21 cKO 마우스에 TAC를 적용하고 섬유증 및 심장 비대 정도를 결정하였다(도 9A). 심근 단면에서 세포외 매트릭스 단백질을 염색하면 miR-21 cKO 그룹의 섬유증이 TAC 처리 WT 마우스와 비교하여 유의하게 예방되었음을 나타낸다(도 9B). MiR-21 cKO 마우스는 또한 형태 및 세포 수준에서 TAC 유발 심장 비대로부터 보호되었다(도 9C). 이러한 발견과 일치하듯, 비대 관련 유전자(Acta1, Myh7, Nppa) 및 섬유증 관련 유전자(Col1a1, Col1a2)의 발현은 WT 리터메이트에 비해 TAC 처리 miR-21 cKO 마우스에서 유의하게 감소하였다(도 9D).
수술 전과 sham 또는 TAC 수술 후 14일과 28일에 심장초음파검사를 실시하여 심장 기능을 평가하였다. sham 그룹의 WT 및 miR-21 cKO 마우스는 모두 TAC 처리된 WT에서 명백한 심장 기능의 전형적인 손상과 달리 건강하고 정상적이었다(도 9E 및 F). 흥미롭게도, TAC 처리된 miR-21 cKO 마우스는 WT 마우스에 비해 훨씬 더 나은 좌심실 심박출 계수(LVEF)을 표시하였다(도 9E). 이것은 또한 WT 리터메이트와 비교하여 TAC 처리 miR-21 cKO 마우스의 좌심실 전벽 두께와 같은 다른 심장초음파검사 파라미터에 의해 반영되었다. 또한, 우리는 2차원 심장초음파검사의 반점 추적 분석을 사용하여 LV 스트레인을 평가함으로써 좌심실(LV) 기능의 매우 민감하고 정확한 측정을 적용하였다(도 9F). 또한, 이 분석은 miR-21 cKO 마우스에서 더 높은 수준의 방사형 스트레인을 갖는 유의적으로 더 나은 LV 기능을 나타내었으며, sham 처리된 마우스에서 일반적으로 관찰되는 수준에 거의 도달하였다(도 9G).
더불어, 이러한 발견은 심장 리모델링 및 기능장애에서 대식세포 miR-21의 중요한 역할을 제안한다.
단일 세포 시퀀싱 분석은 대식세포의 miR-21 고갈이 M2 분극화를 선호함을 보여주었다
miR-21이 심장 대식세포에서 기능을 발휘하는 메커니즘과 이것이 어떻게 다른 심근 세포 분획의 반응을 결정하는지를 더 잘 이해하기 위해, 우리는 압력 과부하 후 6일에 야생형 또는 miR-21 cKO 마우스로부터 분리된 비-근세포 세포 집단을 사용하여 단일 세포 시퀀싱을 수행하였다(도 10A). 단일 세포의 전사 프로파일은 10X Chromium 플랫폼을 사용하여 얻었으며 품질 관리를 통과한 8,343개의 야생형 및 6,421개의 넉아웃 세포를 분석하였으며, 이 세포에 대해 세포 당 평균 ~2000개의 중간 유전자가 검출되었다(총 21,436개의 유전자가 세포 유형 전반에 걸쳐 검출됨)(도 10B).
Seurat 패키지에 의해 함께 모으고 분석된 야생형 및 miR-21 cKO 마우스의 세포를 모두 포함하는 scRNA-seq 데이터 세트 분석은 대식세포의 2개 클러스터(2 및 4), 섬유아세포의 3개 클러스터(1, 3 및 6), 내피 세포의 3개 클러스터(0, 5 및 12) 및 기타 심근 세포를 포함하여 보여주었다. 알려진 유전자 마커를 사용하여, 대식세포의 서브세트 분석은 이 세포 유형을 M2 유사 대식세포와 M1 유사 전염증성 대식세포의 두 개의 상이한 세포 집단으로 추가로 분류하였다(도 10C). 비교 시퀀싱 분석은 WT 배경에서 분리된 것과 비교하여 대식세포에서 miR-21 결실 시 M1 유사 대식세포 수의 감소를 보여주었다(도 10D).
대식세포 클러스터의 유전자 온톨로지 분석은 전염증성 신호전달과 연관되고 압력 과부하 후 상향조절되는 유전자가 miR-21 결실 시 크게 억제된다는 것을 보여주었다(도 10E). 이러한 발견은 개별 대식세포 하위 클러스터에 대해 별도로 수행된 상응하는 분석으로 확증되었으며, 이는 miR-21 결실 시 M1 유사 대식세포에서 질병 관련 전염증성 경로의 억제를 크게 확인하였다. 마찬가지로, M2 유사 대식세포(클러스터 2)는 miR-21 결실 시 압력 과부하 관련 변화의 뚜렷한 역전을 보여주었다.
접합된 판독 대 접합되지 않은 판독의 RNA 속도 분석은 cMP에서 miR-21 결핍이 매우 낮은 수준의 Il1b와 수반되는 Mrc1 발현에 의해 표시되는 바와 같이 전염증성 Il1b-발현(M1-유사)에서 M2-유사 상태로 세포의 분극화를 초래함을 확인하였다(도 10F). 시험관내에서 보다 정의된 설정에서 이러한 발견을 확증하기 위해, 우리는 LNA-antimiR-control 또는 LNA-antimiR-21로 처리하고 강력한 전염증성 자극인 지질다당류(LPS)로 자극한 후 배양된 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 전염증성 신호전달의 정도를 평가하였다. miR-21 cKO 마우스에서 얻은 단일 세포 데이터와 일치하듯, 전염증성 관련 유전자(Tnf, Il6, Nos2)의 발현은 LNA-antimiR-대조군 처리된 BMDM에 비해 LNA-antimiR-21 처리군에서 유의하게 감소하였다(도 10G).
종합하면, 우리의 데이터는 miR-21이 포유류 심장에서 대식세포의 전염증성 활성화에 필요한 핵심 분자임을 시사한다.
단일 세포 전사체 데이터 세트에서 리간드 수용체 페어링의 분석은 심장 대식세포를 섬유아세포 활성화의 1차 파라크린 유도제로 식별한다
우리의 miR-21 cKO 마우스의 표현형 특성규명(도 9)은 심근 섬유증의 상당한 예방을 포함하여 압력 과부하 동안 심근 리모델링에 대한 대식세포 miR-21의 현저한 효과를 나타냈다(도 9B). 따라서 우리는 질병 유도 시 심장 대식세포가 심장 섬유아세포에 직접 신호를 보내는지 여부를 구하였다. 복잡한 다세포 조직의 단일 세포 전사체 데이터 세트에 대한 생물정보학 분석의 최근 발전으로 리간드-수용체 페어링을 기반으로 하여 파라크린 세포간 전달을 체계적으로 매핑할 수 있다(Ramilowski et al., 2015).
따라서 우리는 세포 유형 내 및 세포 유형 사이에 약 2500개의 검증된 리간드-수용체 상호작용 쌍을 분석하고 항상성 조건에 대한 세포 상호작용 맵을 먼저 만들었다. 다음으로 우리는 모든 잠재적 리간드-수용체 상호작용 쌍을 통합하여 심장의 압력 과부하에 대한 반응으로 발생하는 세포 상호작용의 변화를 다시 비편향 방식으로 확인하고자 하였다(도 11A). 흥미롭게도, 압력 과부하 유도 시 M1 유사 대식세포와 Postn+ 서브타입의 활성화된 섬유아세포 사이에서 상호작용의 대부분의 변화가 관찰되었다(도 11A). 흥미롭게도, 우리는 TAC를 받은 miR-21 결핍 마우스를 WT 마우스와 비교할 때 M1 유사 MP에서 Postn+ 섬유아세포로의 파라크린 상호작용이 M1 유사 MP에서 발생하는 모든 세포간 상호작용 중 가장 크게 억제됨을 발견하였다(도 11A의 오른쪽 패널). 이러한 변화의 놀라운 정도는 활성화된 MP가 실제로 심장 섬유아세포의 전-섬유증 활성화를 매개할 수 있다는 가설을 세웠다. 그런 다음 우리는 이 모델에서 섬유증 반응과 miR-21의 결실에 의한 억제의 기초가 되는 후보 신호전달 메커니즘으로서 이러한 리간드-수용체 쌍을 더 자세히 조사하였다(도 11B). 흥미롭게도, 우리는 모든 문서화된 전-섬유증 활성을 나타내기 위해 활성화된 섬유아세포에 대해 예측된 수용체 신호전달을 가진 상위 상향조절된 후보 리간드를 확인하였다. 이러한 모든 섬유아세포 활성화 신호전달 경로는 압력 과부하 상태에서 miR-21 결핍 대식세포에서 나오는 신호를 분석할 때 하향조절된 것으로 나타났다(8개 중 4개가 도 11B에 적용된 조절 임계값을 통과함). 또한, 우리는 압력 과부하 miR-21 cKO 마우스에서 활성화되는 단일 신호전달 경로, 즉 Lrp1 의존적 신호전달을 발견하였다(도 11B). 단백질의 저밀도 지단백질 수용체 패밀리의 구성원인 Lrp1은 ApoE 및 C1qb와 같은 다양한 항섬유증 신호의 강력한 통합자로 보고되었다(Potere et al., 2019). 더불어, 이러한 데이터는 심장의 압력 과부하 시 심장 섬유아세포에 강력한 전-섬유증 매개체를 보내는 심장 대식세포를 시사한다. 심장 대식세포의 기본 M1 유사 및 분비 표현형의 유도는 miR-21의 기능에 달려 있다.
우리는 다음으로 이러한 신호가 심장 섬유아세포에 미치는 영향을 연구하고자 하였다. 이를 위해 우리는 압력 과부하 시 심장 섬유아세포 집단의 동적 전사 반응과 miR-21의 관련성을 평가하였다. 단일 세포 시퀀싱 데이터의 RNA 속도 분석은 활성화된 섬유아세포(Postn으로 표시)의 분획이 압력 과부하 시 근섬유아세포(Acta2 및 Postn 양으로 표시)로 밀려난 것으로 나타났다(도 11C). 미래의 근섬유아세포 표현형에 대한 이 전사 반응은 miR-21 cKO 마우스에서 크게 사라졌다(도 11C). 이러한 동적 변화와 잘 일치하듯, 우리는 또한 압력 과부하 시 근섬유아세포의 세포 수가 증가한다는 것을 발견하였다. 다시 말해, 대식세포에서 miR-2의 결실은 이러한 효과를 역전시켰다(도 11D).
마지막으로, 우리는 실제로 대식세포 세크레톰이 일반적으로 근섬유아세포 분화와 miR-21에 대한 의존성을 제공하기에 충분하다는 증거를 얻고자 하였다. 이를 위해 우리는 활성화된 대식세포와 심장 섬유아세포의 정의된 공동 배양 설정을 고안하였다(도 11E). BMDM 전구 세포를 성숙한 대식세포로 분화시키고, LNA-antimiR-21 또는 LNA-antimiR-Control로 24시간 동안 형질감염시키고 LPS로 자극하였다. 그런 다음 이러한 대식세포를 9-웰 공동 배양 슬라이드의 주변 8개 웰에 추가하여 섬유아세포:대식세포의 비율이 3:1이 되도록 하여 생체내 심근의 세포 비율과 가깝게 모방하였다. 그런 다음 Acta2(Metamorph)에 대한 면역염색의 자동화된 고함량 이미지 분석을 근섬유모세포 형성에 대한 파라미터로 사용하였다(도 11F). 자극되지 않은 휴면기 대식세포는 이 분석에서 근섬유아세포 형질전환을 유도하지 않았으며 miR-21의 억제는 이러한 조건에서 검출가능한 효과가 없었다(도 11F). LPS를 사용하여 배양된 대식세포의 전염증성 분극화는 강한 근섬유아세포 형질전환을 촉진하도록 세크레톰을 조절한다. miR-21 cKO 마우스에서 얻은 데이터와 일치하게, 대식세포 의존적인 근섬유아세포 형질전환은 LNA-antimiR-21로 대식세포를 전처리한 후 유의하게 감소되었다(도 11F).
섬유아세포에서 miR-21의 조절 역할은 조직 섬유증 및 질병에서 miR-21의 병리학적 역할 및 그에 따른 anti-miR-21(각각 RG-012)의 처리 효과의 기초가 되는 주요 메커니즘으로 간주되었다. 정제된 심근 세포 분획의 정량적 작은 RNA 시퀀싱에 대한 본 명세서에 제공된 실험 결과는 miR-21이 모든 심근 세포 유형에서 가장 높은 발현을 나타내고 모든 microRNA 중에서 1위를 차지하는 심장 대식세포에서 엄청난 농도의 miR-21을 나타낸다. 이 주요 발견은 현재 연구의 시작점이었으며 조직 섬유증 및 심장 기능에 대한 cMP miR-21의 기여도를 설명하도록 하였다. 대식세포 miR-21에 의해 매개되는 것으로 보고된 효과는 심오하며 1차 면역 기능을 훨씬 뛰어넘는다.
따라서 실험 데이터는 첫째로 miR-21이 대식세포에서 극도로 높은 농도를 가지며 질병이나 장애의 심장 대식세포(MP)에서 추가로 상향조절된다는 것을 보여준다. 이것은 이 세포 유형에서 중요하다는 것을 암시한다. 질병이 있는 심근에서 세포 당 극도로 많은 수의 miR-21 분자는 또한 내인성 miR-21을 억제하기 위해 전신 투여를 사용하는 기존 방법이 효과가 없을 수 있는 한 가지 이유일 수 있다.
둘째, 실험 데이터는 miR-21이 전염증성(M1 유사) 대식세포 분극화의 핵심 조절자임을 보여준다.
셋째, 여기에 제공된 실험 데이터는 심장 대식세포의 miR-21이 섬유아세포로의 파라크린, 전-섬유증 신호전달을 조절함을 보여준다. 이 대식세포 유래 전-섬유증 분비 신호는 병리학적 조직 섬유증을 조절하기에 충분히 강력하다. 따라서 대식세포의 표적화는 섬유증 치료의 개선되고 새로운 개념을 제공한다.
실시예 3:
작은 RNA와 특히 microRNA의 발현을 결정하기 위해 우리는 온전한 마우스 폐에서 프라이머리 세포 분획을 정제하기 위한 유세포 분석 기반 전략을 고안하였다. 도 12에 도시된 잘 확립된 세포 표면 마커를 사용하여 세포 분류 후, RNA는 표준 절차에 따라 제조되었으며, 작은 RNA 시퀀싱은 Illumina 플랫폼을 사용하여 수행되었다. 자세한 방법론은 다음과 같다:
폐 조직에 대한 유세포 분석/세포 분류: 야생형 C57BL/6N 마우스에서 추출한 폐에서 프라이머리 세포를 분리하였다. 20G 캐뉼러를 기관에 삽입하고 나일론 실을 사용하여 결찰하였다. 그런 다음 폐에 빙냉 2mM EDTA/PBS 용액 1 mL를 주입하고, 폐를 일정하게 누르면서 5초 동안 인큐베이션하고, 기관지 폐포액(BALF)을 15 mL 팔콘 튜브에 수집하였다. 이 과정을 5회 반복하였다. BALF 세포를 수집한 후, 폐가 완전히 흰색이 될 때까지 5 mL의 빙냉 2mM EDTA/PBS 용액을 좌심실에 관류하여 혈액을 제거하였다. 그런 다음 마우스에서 폐를 추출하고 콜라게나아제 II형(1 mg/mL), DNaseI(0.3 mg/mL), dispase(50 U/mL) 및 CaCl2(0.03% v/v)를 포함하는 3 mL의 DMEM 기반 분해 완충액에서 가위를 사용하여 매우 작은 조각으로 절단하였다. 폐를 37℃ 진탕기에서 25분 동안 분해한 후 세포를 400g에서 7분 동안 원심분리하였다. 그런 다음 세포를 실온에서 5분 동안 1 mL의 적혈구 용해 완충액(155mM NH4Cl 9 중량부 및 0.1mM Tris HCL pH 7.65 1 중량부)으로 처리한 후 2 mL의 PBS로 중화하였다. 그런 다음 세포를 FACS 완충액(2mM EDTA, PBS 중 0.5% BSA)으로 세척하였다. 그런 다음 프라이머리 세포를 4℃에서 10분 동안 랫트 항-마우스 CD16/CD32(클론 2.4G2)로 처리한 후 4℃에서 60분 동안 형광 컨쥬게이트된 항체와 인큐베이션하였다. 그런 다음 MACS 컬럼을 사용하여 백혈구 분획을 다른 세포 분획으로부터 분리하였다. 세포를 먼저 4℃에서 30분 동안 비오틴-컨쥬게이트된 CD45 항체와 함께 인큐베이션한 다음 4℃에서 15분 동안 스트렙타비딘 마이크로비드와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 유세포 분석 기반 세포 분류를 위해 플로우 스루 및 백혈구 농축 세포를 1차 형광 항체로 염색하였다. 하기 항체를 사용하였다. 백혈구 농축 분획: 항-CD45-FITC, 항-CD11b-PE, 항-CD24-PE/Dazzle594, 항-CD11c-PECy5, Ly6G-PerCP/Cy5.5 및 F4/80-PECy7. 플로우 스루: 항-CD45-FITC, 항-CD105-PE, 항-Epcam-PE/Dazzle594 및 항-PDGFRA-PECy7. 두 세포 현탁액을 40 ㎛ 나일론 세포 스트레이너(Falcon)를 통해 분쇄한 다음 Sony SH800S 세포 분류기를 사용하여 FACS 분석을 수행하였다.
심장 조직에 대한 유세포 분석/세포 분류: 프라이머리 세포는 이전에 설명한 대로 분리되었다(Ramanujam et al., 2016). FACS 분류를 위해, 심장 세포 현탁액을 원심분리(1분 동안 900xg)에 의해 심근세포(펠렛) 및 비-근세포 농축 분획(상등액)으로 분리하였다. 심근세포는 형태에 따라 분류되지만, 비-근세포 분획은 항체 기반 유세포 분석 절차를 더 거쳤다. 비-근세포 농축 상등액을 400xg에서 5분 동안 원심분리하고 FACS 완충액(2mM EDTA, PBS 중 0.5% BSA)으로 세척하였다. 그런 다음 프라이머리 세포를 4℃에서 10분 동안 랫트 항-마우스 CD16/CD32(클론 2.4G2)로 처리한 후 4℃에서 60분 동안 형광 컨쥬게이트된 항체와 인큐베이션하였다. 다음 항체가 사용되었다: 항-PDGFRα-PECy7(클론 APA5), 항-CD105-PE(클론 MJ7/18) 및 항-CD45-FITC(클론 30-F11). 염료 DRAQ7을 사용하여 생존력을 조절하였다. 세포 현탁액을 40 ㎛ 나일론 세포 스트레이너(Falcon, Tewksbury, USA)를 통해 분쇄한 다음 Biorad S3 세포 분류기를 사용하여 FACS 분석을 수행하였다.
RNA 시퀀싱: 총 RNA는 peqGOLD RNA pure(Peqlab)을 사용하여 조직에서 추출되었다. 라이브러리는 TruSeq Stranded mRNA 샘플 준비 키트(Illumina, San Diego, California)를 사용하여 4 ㎍의 DNase 처리된 RNA로부터 가닥 특이적인 방식으로 구축되었다. 이 키트에는 mRNA를 농축하기 위한 폴리아데닐화 선별이 포함되어 있다. 그런 다음 RNA를 단편화하고 두 라운드의 cDNA 합성을 수행한 다음 어댑터를 ds cDNA에 연결하였다. 모든 라이브러리는 Illumina HiSeq 2000에서 시퀀싱되어 100bp 페어드 엔드(paired-end) 판독을 생성하였다. 가공되지 않은 판독에서 어댑터 서열, 유효하지 않고 낮은 품질 판독을 트리밍하여 고품질 판독을 얻었다. 그런 다음 기본 파라미터를 사용하여 HISAT2 소프트웨어(v 2.1.0)에 의해 깨끗한 판독값을 Sus scrofa 11.1 레퍼런스 게놈에 매핑하였다. 그런 다음, StringTie 소프트웨어(v 1.3.6)를 사용하여 전사체 어셈블리를 구성하였다. StringTie 병합 소프트웨어(v 1.3.6)를 사용하여 전사체를 병합하고 DESeq2 소프트웨어(v 2.11.40.2)를 사용하여 차등 발현을 계산하였다. 그런 다음 ADAPTS R 패키지를 사용하여 양(abundance), 세포 유형 특이성 및 수용체 특성을 기반으로 유전자를 선별하였다.
놀랍게도 본 명세서에서 발견된 바와 같이, miR-21은 폐 대식세포에서 가장 풍부하고 농축된 microRNA이다. 우리의 데이터는 microRNA-21이 폐의 폐포 대식세포에서 발현되는 모든 microRNA 분자 중 약 20%를 나타내므로 이 세포 유형에서 상위 1위로 발현된 microRNA 종이라는 것을 보여준다. 유사한 높은 발현 수준이 폐 간질 대식세포 집단에서 발견되었으며, 여기서 모든 miRNA 판독의 12%는 miR-21에 기인할 수 있다. miR-21의 상대적 발현은 다양한 폐 세포 유형에서 정량적 실시간 PCR에 의해 추가로 검증되었으며 다시 대식세포 집단에서 miR-21의 상대적 농축을 보여주었다(도 12). 포유류의 폐에서 대식세포가 매우 풍부하다는 점을 감안할 때, 이 데이터는 폐의 miR-21의 대다수가 폐 대식세포에서 유래함을 시사한다.
그런 다음 우리는 miR-21이 폐 손상 후 마우스와 인간에서 상향조절되는지 여부를 구하였다. 따라서, 우리는 miR-21의 발현이 폐 섬유증에서 변경되고, 폐 섬유증의 잘-확립된 모델, 즉 화학요법제인 블레오마이신의 적용에 의해 유발된 폐 섬유증을 사용하였는지를 검정하였다. miR-21의 발현은 대조군 용액(PBS) 또는 블레오마이신을 투여한 후 14일에 마우스에서 채취한 폐 조직에서 결정되었다. 우리는 질병에 걸린 폐에서 miR-21의 발현이 강하게 증가함을 발견하였다(도 13A).
그런 다음 특발성 폐 섬유증 환자의 생검에서 miR-21의 발현을 연구하였다. 다시, 우리는 폐 조직에서 miR-21의 상당한 증가를 발견하였다(도 13B).
마지막으로, 우리는 miR-21에 대한 합성 올리고뉴클레오티드 억제제(LNA-anti-miR-21)를 사용한 miR-21의 억제가 폐에서 miR-21을 억제하기에 충분한지, 그리고 이것이 폐 섬유증을 예방하는지 여부를 검정하였다. 여기에서, 우리는 관상동맥 내 LNA-anti-miR-21(본 출원의 도 1 참조)을 받았고 중등도의 폐 강화 및 섬유증이 발생하는 돼지를 연구하였다. 폐 질환은 심근 경색 후 심장 기능장애로 인한 폐 울혈의 잘 알려진 결과이다. LNA-anti-miR-21의 관상동맥내 적용은 울혈된 폐에서 miR-21을 효과적으로 억제하였다(도 13C). 중요하게도, LNA-anti-miR-21은 이 심부전 관련 폐 울혈 및 섬유증 모델에서 폐 섬유증을 유의하게 예방하였다.
종합적으로, 이러한 데이터는 아마도 심장 대식세포를 포함한 대식세포에서 miR-21에 영향을 미침으로써 miR-21의 억제가 폐에서 강력한 항섬유증 효과를 가짐을 시사한다. 아래에 설명된 바와 같이, 특히 폐 대식세포에서 miR-21을 억제하면 실제로 유사하게 강력한 항섬유증 효과가 있다.
실시예 4:
활성화된 심장 섬유아세포에서 miR-21의 유전자 결실은 심장 리모델링 및 기능장애를 예방한다.
miR-21은 섬유아세포 증식, 생존 및 근섬유아세포 형질전환을 촉진하는 것으로 나타났지만, 심장 섬유아세포에서 miR-21의 활성이 실제로 심부전에서 관찰되는 것과 같은 조직 리모델링 및 기능장애의 결정 요인이라는 것은 현재까지 입증되지 않았다. 우리는 활성화된 섬유아세포에서 Cre 재조합효소의 특이적 발현을 허용하는 잘 확립된 Postn-MCM 형질전환 마우스 계통을 사용하여 loxP 부위 측면 유전적 유전자좌의 재조합을 허용하였다. 참고로, 형질전환 Postn-MCM 계통은 유도성 형질전환 계통이다. 즉, Cre 재조합효소는 타목시펜의 적용에 대한 응답으로 발현된다. 그런 다음 우리는 이 마우스 계통을 floxed miR-21 유전자좌를 가진 마우스와 교배시켜 활성화된 심장 섬유아세포에서 miR-21의 손실을 목표로 하였다. 이 마우스는 진행성 심장 리모델링 및 기능장애를 유도하는 심근 경색증(MI)에 노출되었다(도 14A).
MI 후 4주에, 마우스는 심장초음파검사로 심장의 크기와 기능을 분석하고 추가 분석을 위해 심장과 폐를 채취하였다. 활성화된 섬유아세포 집단에서 miR-21의 유전자 결실은 심근 쇠약에서 miR-21의 상당한 감소로 이어지며(도 14B), 이는 심장 쇠약에서 전체 miR-21 함량에 대한 섬유아세포 miR-21의 현저한 기여를 시사한다. miR-21의 섬유아세포 결실은 심근 질량의 심부전 관련 증가(비대(도 14C)라고 함)를 유의하게 예방하고 마찬가지로 폐 무게 대 체중의 증가를 예방하였다(도 14D). 활성화된 심장 섬유아세포 집단에서 miR-21을 결실시키는 이러한 유익한 효과는 좌심실 심박출 계수에 의해 결정된 바와 같이 심장 기능의 상당한 개선에도 반영되었다(도 14E). 더욱이, 심장초음파검사는 심장 구조적 리모델링, 즉 심부전과 관련된 확장기 및 수축기 용적 증가의 감소에 유리한 효과를 나타냈다(도 14F). 심장 기능의 개선은 야생형 그룹에 비해 방사형 스트레인 피크의 상당한 증가에 의해 추가로 확인되었다(도 14G).
종합적으로, 이러한 데이터는 miR-21의 섬유아세포 특이적인 억제가 조직 섬유증을 표적으로 하는 유효한 치료 전략임을 시사한다.
실시예 5:
MiR-21은 COVID-19 환자로부터 채취한 폐 조직과 폐 섬유증 동물 모델에서 상향조절된다
우리는 처음에 COVID-19 환자와 비섬유증 대조군 대상체로부터 채취한 폐의 작은 RNA 전사체 프로파일을 얻고자 하였다(도 19A). 인간의 폐에서 COVID-19에 의해 유발된 리모델링에 대한 선호 부위인 좌하엽의 영역에서 사후 폐 조직을 채취하였다. 우리는 miR-21이 인간 폐에서 모든 microRNA 분자의 약 5%를 구성하면서 대조군 대상체의 폐에서 고도로 발현되는 microRNA임을 발견하였다(도 19B). 흥미롭게도, miR-21의 발현은 COVID-19 환자의 폐에서 더욱 증가하였으며 또한 상위 10개의 발현된 miRNA 중에서 가장 상향조절된 단일 miRNA(약 2배의 변화)인 것으로 밝혀졌다(도 19B).
우리는 다음으로 세포 유형 전반에 걸쳐 miR-21 발현을 평가하기 위해 다양한 폐 세포 유형에 대한 작은 RNA 발현 프로파일을 얻었다. 갓 분리된 세포의 공급원으로, 우리는 생후 10주된 마우스의 폐를 사용하고 자기 활성화(MACS) 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함하는 전략을 사용하여 쥐의 폐의 다양한 폐 세포 유형에서 miR-21 발현을 조사하였다. 흥미롭게도, miR-21은 폐포 대식세포에서 가장 높게 발현된 microRNA였으며, 다른 세포 유형과 비교하여 이 세포 유형에서도 매우 농축되어 있었다(도 20). 더불어, 이 독특한 발현 패턴은 폐 대식세포에서 miR-21에 대한 강력한 조절 역할을 시사한다.
폐 섬유증 및 기능장애의 발병에 대한 miR-21의 기여를 조사하기 위해, 우리는 미세분무기를 사용하여 블레오마이신의 단일 용량 기관내 적용에 의해 야생형 마우스를 폐 손상에 노출시켰다. Flexivent 기기를 사용하여 블레오마이신 적용 후 7일에 폐 기능장애를 확인하였다(데이터는 표시되지 않음). 식염수 또는 블레오마이신 처리된 폐에서 얻은 microRNA 발현 프로필은 miR-21이 블레오마이신 투여 후 7일에 상당히 상향조절되는 것으로 나타났다(도 21). 가장 많이 발현된 miRNA 중 miR-21이 가장 강한 상향조절을 보였다.
대식세포로의 표적 전달을 위한 리간드 컨쥬게이트된 antimiR-21
우리는 다른 세포 유형에 비해 농축된 대식세포에서 강하게 발현되는 것으로서 만노스 수용체 C 유형 1(Mrc1)을 확인하는 스크리닝 전략을 사용하였다(위의 표 3 참조). 폐 및 심장 대식세포 및/또는 섬유아세포 각각에서 세포 표면 수용체를 확인하기 위한 시도에서, 우리는 마우스에서 폐 및 심장 세포 유형의 비편향 전사체 시퀀싱을 수행한 다음 이러한 분석을 인간 전사체 데이터로 확장하였다(도 22). 폐 서브타입의 RNA 시퀀싱은 모든 세포 유형 전반에 걸쳐 18,000개 이상의 유전자를 확인하였다. 그 중 우리는 1000개 이상의 표면 수용체를 검출하였으며 그 중 106개에는 대식세포에서 농축되어 있다. 후자 중에서 우리는 13개가 매우 풍부하고 대식세포에 특이적인 것을 발견하였다. anti-miR-21/miR-21 억제제 전달을 위한 이러한 대식세포 특이적인 후보 표면 수용체는 특히 다음을 포함한다:
Figure pct00009
다음으로 우리는 폐포 및 간질 대식세포와 백혈구, 상피 및 내피 세포에서 상위 후보 표면 수용체 MRC1의 상대적인 양을 비교하여 대식세포에서 MRC1의 훨씬 더 강력한 발현을 보여주었다. 대식세포를 포함한 심장 세포 유형에 대해 상응하는 데이터를 얻었다. 폐와 심장의 섬유아세포에 대해 상응하는 데이터도 얻었다.
폐 대식세포에서 MRC의 발현은 MRC1에 대한 항체를 사용한 면역형광에 의한 단백질 수준의 검출에 의해 검증되었다. 여기에서 MRC1은 형태학적으로 폐 대식세포와 유사한 세포에서 명확하게 검출되었다. 블레오마이신 처리된 마우스에서 유래한 폐 조직에서 대식세포로 확인된 MRC1 양성 세포의 강력한 증가가 있었다.
우리는 다음으로 블레오마이신으로 치료받거나 특발성 폐 섬유증을 겪는 환자의 폐 조직에서 유래한 공개적으로 이용가능한 인간 단일 세포 데이터 세트의 생물정보학 분석과 각각의 대조군을 통해 이러한 데이터를 검증하고자 하였다. 이 데이터 세트에서 인간 MRC1의 발현을 플로팅했을 때 인간 폐 대식세포에서 MRC1의 강력하고 거의 독점적인 발현을 발견하였다. MRC1 양성 세포의 수는 블레오마이신으로 치료받은 인간의 폐와 IPF를 겪는 환자의 조직에서 증가하였다.
심장 대식세포와 섬유아세포에 대한 후보 표면 수용체를 확인하기 위해 우리는 폐에 대해 위에서 설명한 것과 유사한 접근 방식을 계속하였다. 우리는 주요 심장 세포 유형의 시퀀싱을 수행하고 모든 세포 유형에서 14,000개 이상의 유전자를 확인하였다(백만 당 총 판독, > 1). 그 중 우리는 800개 이상의 표면 수용체를 확인하였으며, 89개의 표면 수용체는 대식세포에서 농축되며, 86개의 표면 수용체는 섬유아세포에서 발현되고 농축된다. 우리는 대식세포에서만 풍부하고 특이적으로 발현되는 16개의 표면 수용체와 섬유아세포에서만 풍부하고 특이적으로 발현되는 10개의 표면 수용체를 추가로 계층화하였다. 심장 대식세포에 대해 선별된 16개의 표면 수용체 중에서 Mrc1이 가장 풍부하게 존재하는 단일 후보 표면 수용체로 다시 한 번 두드러졌다. 좌심실 또는 대조군/sham 마우스의 압력 과부하를 받은 마우스의 심장에서 분리된 프라이머리 세포의 단일 세포 시퀀싱은 심장 대식세포에서 MRC1의 고도로 특이적인 발현을 확증하였다.
섬유아세포 표면 수용체에 대한 유사한 상응하는 분석은 Scara5를 최고의 후보 분자로 산출하였다. 심장 대식세포에 대한 추가의 후보 표면 수용체 분자는 다음을 포함한다.
Figure pct00010
심장 섬유아세포에 대한 추가의 후보 표면 수용체 분자는 다음을 포함한다.
Figure pct00011
만노스 수용체 C 유형 1(MRC1)에 대한 항체를 사용한 폐 조직의 면역형광 염색을 사용하면 대식세포의 형태학적 특징을 나타내는 세포에서 만노스 수용체 C 유형 1(MRC1)의 강력하고 선택적인 발현이 모두 나타난다(도 22).
여러 연구(예: Martinez-Pomares, L., 2012)는 만노스 수용체 C 유형 1(MRC1)에 대한 만노스 및 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 리간드의 결합을 보고하였다. 다음으로 우리는 miR-21(LNA-antimiR-21)에 대한 올리고뉴클레오티드를 이러한 리간드와 합성 링커 분자로 구성된 모이어티와 컨쥬게이트하였다(도 23).
특히, 탄수화물 리간드 컨쥬게이트된 LNA 올리고뉴클레오티드의 제조는 다음과 같이 수행하였다:
시판되는 탄수화물 4-아미노페닐 3,6-디-O-(α-D-만노피라노실)-α-D-만노피라노시드(Synthose, Toronto, Canada, #AM853, 24.8 mg)를 4.4 ㎕의 디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 함유하는 248 ㎕의 DMF에서 18.1 mg의 산-PEG5-NHS 에스테르(Broadpharm, San Diego, California, #BP-22220)와 반응시켰다. TLC가 출발 탄수화물의 소비를 나타내면 형성된 생성물을 에테르의 첨가에 의해 침전시켰다. 고체를 여과에 의해 수집하고 피리딘(500 ㎕)에 재용해시켰다. 아세트산 무수물(500 ㎕)을 첨가하여 삼당류의 모든 유리 히드록실기를 차단하였다. 용액을 증발 건조시키고 메탄올 및 디클로로메탄의 1:1 혼합물을 사용하는 Sephadex LH20 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
Figure pct00012
30 mg의 수득된 탄수화물 카르복실산은 3.7 ㎕의 디이소프로필카보디이미드 및 303 ㎕의 DMF의 존재 하에 2.9 mg의 N-히드록시-숙신이미드(NHS)에 의해 활성화되었다. 용액을 주위의 온도에서 밤새 교반하고 올리고뉴클레오티드와의 컨쥬게이트 반응을 위해 추가 정제 없이 사용하였다.
완전히 포스포로티오에이티드 LNA 올리고뉴클레오티드는 고체상에서 통상적인 포스포아미다이트 올리고머화 화학을 사용하여 합성되었다. 올리고뉴클레오티드에는 5'-말단에 리간드 컨쥬게이트를 위한 반응성 핸들로 제공된 아미노헥실 링커가 장착되었다. 올리고뉴클레오티드는 다음과 같이 제조되었다:
올리고뉴클레오티드는 Mermade 12 합성기(LGC Biosearch, Alexandria, MN, USA)에서 조립되었다. 합성은 87 μmol/g의 로딩으로 2'-디옥시-티미딘으로 유도체화된 제어된 포어 글래스(CPG, 600)로 만들어진 고체 지지체에서 수행되었다(LGC Biosearch에서 구입). 필요한 서열을 조립하기 위해 포스포아미다이트와 보조 시약을 SAFC(독일 함부르크)에서 구입하였다. 구체적으로, 다음과 같은 잠금 핵산(LNA) 및 DNA 포스포아미다이트가 사용되었다:
(5'-O-디메톡시트리틸-N 6-(벤조일)-(2'-O, 4'-C 메틸렌)-아데노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포아미다이트, 5'-O-디메톡시트리틸-N 4-(벤조일)-(2'-O, 4'-C 메틸렌)-5-메틸시티딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포아미다이트, (5'-O-디메톡시트리틸-N 2-(디메틸포름아미딘)-(2'-O, 4'-C 메틸렌)-구아노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포아미다이트, 및 5'-O-디메톡시트리틸-(2'-O, 4'-C 메틸렌)-5-메틸우리딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포아미다이트.
5-메틸시티딘을 포함한 DNA 포스포아미다이트는 LNA 포스포아미다이트와 동일한 보호기를 가지고 있다. 모든 아미다이트를 무수 아세토니트릴(100mM)에 용해하고 분자체(3Å)를 첨가하였다. 올리고머의 5'-말단에 C6-아미노링커를 도입하기 위해 Chemgenes(Wilmington, MA, USA)로부터 입수가능한 상응하는 아미노헥실 N-(트리플루오로아세틸아미도)-포스포아미다이트를 사용하였다. TFA 보호된 아미노링커는 생략된 캡핑 단계를 제외하고 합성 주기의 어떠한 변형도 없이 도입되었다. 5-에틸 티오테트라졸(ETT, 아세토니트릴 중 500mM)을 활성화제 용액으로 사용하였다. DNA 아미다이트에 대한 커플링 시간은 4분이었고 다른 아미다이트는 6-8분 동안 커플링되었다. 무수 아세토니트릴/피리딘(1:1 v/v) 중 3-((디메틸아미노-메틸리덴)아미노)-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온(DDTT, 미국 캘리포니아주 오션사이드의 AM Chemicals에서 수득)의 50mM 용액을 사용하여 포스포로티오에이트 결합을 생성하였다.
고체상 합성의 완료 후, 지지체로부터 올리고뉴클레오티드를 절단하지 않고 아세토니트릴 중 20% 디에틸 아민으로 30분 처리하여 시아노에틸 보호기를 제거하였다. 이어서, 건조된 고체 지지체를 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 55℃에서 적어도 18시간 동안 진한 암모니아수(Aldrich)로 처리하였다. 원심분리 후 상등액을 새 튜브로 옮기고 CPG를 암모니아수로 세척하였다. 통합한 용액을 증발시키고 잔류물을 완충제 A에서 재구성하였다(하기 참조).
미정제 올리고뉴클레오티드를 Waters(Eschborn, Germany)의 C18 XBridge Prep 컬럼(5 ㎛, 19x50 mm)과 분획 수집기 및 샘플 펌프가 장착된 AKTA Pure HPLC 시스템을 사용하여 역상(RP) HPLC(GE Helthcare)로 정제하였다. 완충액 A는 100mM 트리에틸암모늄 아세테이트(TEAAc, Biosolve, Valkenswaard, 네덜란드)였고 완충액 B는 완충액 A에 95% 아세토니트릴을 함유하였다. 15 mL/min의 유속이 사용되었고 120 컬럼 부피 내에서 0-100% B의 구배가 사용되었다. 완충액을 60℃로 가열하고 컬럼을 동일한 온도의 컬럼 오븐에서 유지하였다. 생성물 용출은 280 nm에서 모니터링하고 2 mL의 분획을 수집하였다.
생성물을 포함하는 분획을을 모아서 Sephadex G25(GE Healthcare)로 패킹된 컬럼을 사용하여 크기 배제를 사용하여 탈염하였다.
Figure pct00013
정제된 올리고뉴클레오티드를 50mM 탄산나트륨 완충액(pH 9.5) 및 DMSO에 1:1.5의 비율로 700 OD/mL의 올리고뉴클레오티드 농도로 용해시켰다. NHS 활성화 탄수화물 리간드를 90분 간격으로 두 부분으로 나누어 첨가하였다.
Figure pct00014
반응 혼합물을 올리고뉴클레오티드의 정제에 대해 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 RP HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 포함하는 분획을 서로 모아서 에탄올을 첨가하여 침전시켰다. 펠렛을 원심분리에 의해 수집하였다. 상등액을 버리고 펠렛을 500mM NaCl에 재구성하였다. 이 용액을 고정상으로 Sephadex G25를 사용하고 용리제로 물을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 탈염하였다. 생성물을 포함하는 수용액은 260 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 마지막으로, 용액을 동결 건조시켰다.
Figure pct00015
Figure pct00016
우리는 다음으로 이들 리간드 결합 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 에어로졸 형태로 흡입될 때 쥐의 폐 세포에 전달되는지를 검정하는 것을 목표로 삼았다. 이를 위해 antimiR-21(LNA-antimiR-21)의 잠금 핵산(LNA)/디옥시리보핵산 믹스머(LNA-antimiR-21)를 3' 말단에서 플루오레세인 아미다이트 유도체(FAM)에 연결하고 5' 말단에 리간드를 컨쥬게이트시켰다. 본 연구에 사용된 만노스 리간드-컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드의 예시적인 구조는 도 23에 제시되어 있다.
그런 다음 우리는 전용 마우스 흡입 장치(flexiVent system, SCIREQ, Canada; Yang et al., 2019)를 사용하여 에어로졸화된 조성물을 흡입시켜 만노스- 또는 GalNAc-컨쥬게이트된 LNA-antimiR-21-FAM의 표시된 용량을 야생형 마우스 폐에 투여하였다(도 24A). 컨쥬게이트되지 않은 LNA-antimiR-21은 대조군으로 사용되었으며 PBS 처리된 마우스 폐는 음성 대조군으로 사용되었다. miR-21 억제제를 포함하는 조성물의 적용 후 2시간에, 방법 섹션에 기재된 바와 같이 기관지폐포 세척액(BAL) 및 폐 조직을 각 동물로부터 채취하였다. 폐 세포 유형에서 LNA-antimiR-21의 흡수는 유세포 분석을 사용하여 FAM 신호 강도를 측정하여 평가하였다(도 24A). FAM 신호는 BALF 및 폐 조직 둘 다로부터 분리된 세포에서 검출되었고 LNA-antimiR-21의 농도가 증가함에 따라 증가하였다(모든 그룹은 도 24B 및 C에 기재됨).
다음으로, 폐 조직에서 분리된 백혈구 및 비백혈구 분획 모두에서 양성 세포의 비율을 결정하였다. 유세포 분석은 만노스-컨쥬게이트된 LNA-antimiR-21을 포함하는 조성물이 컨쥬게이트되지 않은 LNA-antimiR-21과 비교하여 투여되었을 때 FAM 양성 대식세포의 상대적 분율이 증가되었음을 나타내었다(도 24C). 그런 다음 우리는 대식세포 집단의 중간 형광 강도를 결정하여 이 세포 유형에 전달된 LNA-antimiR-21 분자의 상대적인 양을 추정하고 이것을 PBS 투여 폐에서 분리된 세포의 데이터로 정규화하였다. 대조군(컨쥬게이트되지 않은 올리고 처리 그룹)과 비교하여, 본 발명자들은 만노스 결합된 LNA-antimiR-21 처리 BALF 또는 폐로부터 분리된 대식세포에서 유의하게 더 높은 중간 FAM 형광 강도를 관찰하였다(도 25A 및 B).
요약하면, 만노스-컨쥬게이트된 LNA-antimiR-21을 포함하는 조성물의 에어로졸 흡입은 폐 대식세포로의 더 높은 전달을 초래하였다.
실시예 6:
miR-21의 억제는 블레오마이신 유발 폐 리모델링 및 기능장애를 감소시켰다
폐 리모델링에 대한 흡입된 만노스-컨쥬게이트된 LNA-antimiR-21 조성물의 효과를 결정하기 위해, 우리는 야생형 마우스를 블레오마이신 유발 폐 손상에 노출시켰고 그런 다음 폐 손상 후 4일에 흡입에 의해 만노스-컨쥬게이트된 LNA-antimiR-21 조성물을 폐에 국소 투여하였다(도 26A). 폐 절편에서 세포외 기질 단백질을 염색한 결과 블레오마이신을 투여한 마우스에서 섬유증이 증가했음을 나타냈다. 그러나, 만노스-컨쥬게이트된 LNA-antimiR-21 조성물의 흡입은 폐 섬유증의 상당한 감소를 유도하였다(도 26B).
그런 다음 flexiVent 인공호흡기를 사용하여 마우스 폐에 다양한 호흡 섭동을 가함으로써 폐 기능에 대한 miR-21 억제의 영향을 평가하였다. 호흡기의 고유한 엘라스턴스 특성(또는 준정적 기계적 특성)을 결정하기 위해, 폐 손상 후 14일에 PBS 및 블레오마이신 처리된 마우스로부터 압력-용적(PV) 루프를 얻었다. 블레오마이신에 노출된 폐 섬유증이 있는 마우스로부터의 PV 루프로부터의 데이터는 폐활량 및 컨플라이언스의 감소를 나타내는 하향 이동을 나타내었다(도 26C의 회색 및 검은색 곡선 참조). 측정 결과, PV 루프로부터 유도된 준정적 엘라스턴스, 준정적 컨플라이언스 및 흡기 용량 파라미터가 블레오마이신-노출된 만노스-컨쥬게이트된 LNA-antimiR-mismatch-21 마우스에서 상당히 감소된 것으로 나타났다(도 26D-F). 만노스-컨쥬게이트된 LNA-antimiR-mismatch-21 처리된 마우스의 에어로졸 흡입은 이러한 폐 기능의 감소를 예방하였다(도 26C의 빨간색 곡선 참조).
종합하면, 이들 데이터는 쥐의 폐 섬유증 모델에서 흡입에 의한 대식세포 표적, 만노스 컨쥬게이트된 antimiR-21 조성물의 국소 전달의 치료 효능을 입증한다. 특히 상기 실시예 5 및 실시예 6에 대한 방법론적 세부사항은 다음과 같다:
실험 동물 및 연구 디자인: 모든 동물 연구는 해당 기관의 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었으며 Regierung von Oberbayern의 IRB로부터 승인을 받았다(ROB-55.2-2532.Vet_02-19-82).
블레오마이신의 기관내 투여: 10주령 C57BL/6N 야생형 마우스에 미세분무기(중국 BioJane Limited에서 배포한 Penn Century 장치)를 사용하여 2 U/kg 마우스 체중에서 50 ㎕의 멸균 PBS에 희석된 블레오마이신 염산염(Sigma Aldrich Taufkirchen, 독일)을 투여하였다.
올리고뉴클레오티드 억제제의 에어로졸 적용: AntimiRs는 완전히 인산화된 잠금 핵산(LNA)/디옥시리보핵산 믹스머로 합성되었다(FAM 표지된 antimiRs: BaseClick, 독일 뮌헨, Axolabs GmbH, 독일 쿨름바흐). AntimiRs는 이전에 설명한 대로 네뷸라이저 유닛(Aeroneb Lab - 작은 액적 직경 2.5-4 ㎛, 아일랜드)에 부착된 flexiVent 설치류 인공호흡기 FX2(SciReq Inc., 캐나다)를 사용하여 적용되었다. 각 마우스에 대해 네뷸라이저는 20 ㎕의 2.5, 5 또는 10 mg/mL antimiR로 채웠고, 네뷸라이저는 분당 150회의 호흡, 15 mL/Kg 체중 1회 호흡량 및 2:1의 들숨-날숨 시간 비율로 마우스를 환기하는 동안 호흡당 40 ms 동안 활성 상태였다(25%의 작동 주기에서).
폐 기능 분석: 마우스용 flexiVent 설치류 인공호흡기 FX2를 사용하여 폐 기능을 평가하였다. 마우스를 깊은 마취하에서 기관절제하고 기관에 삽입된 20G 기관 캐뉼러를 4-0 실크 봉합사를 사용하여 단단히 고정하여 누출이 없고 신뢰할 수 있는 측정을 보장하였다. 그런 다음 캐뉼러를 기계적 환기(분당 150회 호흡, 15 mL/Kg 체중 1회 호흡량 및 0.67:1의 들숨-날숨 시간 비율)를 위해 flexiVent 장치에 연결하였고, 폐 기능은 깊은 팽창, Prime-8 및 압력 구동 램프 스타일 압력 체적 섭동과 같은 다양한 호흡 조작으로 평가되었다. 흡기 용량, 준정적 컨플라이언스 및 준정적 엘라스턴스 파라미터는 PV 루프에서 파생되었다.
성체 마우스 폐에서 프라이머리 세포의 분리: 폐를 채취하기 전에, 기관에 캐뉼러를 삽입하여 2mM EDTA를 함유하는 PBS를 순차적으로(약 5회) 점적 및 흡인하여 기관지폐포 세척액을 수집하였다. 폐를 채취하고 2mM EDTA를 함유하는 빙냉 PBS로 세척하였다. Collagenase II(Worthington, Lakewood, NJ), dispase I(Gibco) 및 DNaseI(Corning, Bedford, USA)를 포함하는 3 mL의 효소 분해 용액에서 폐의 우엽을 매우 작은 조각으로 자른 다음 37℃에서 25분 동안 인큐베이션하였다. 폐의 효소 분해는 500 ㎕의 우태아 혈청을 첨가하여 중단되었고 세포 현탁액은 1 mL 주사기를 사용하여 위아래로 피펫팅하여 혼합되었다. 그런 다음 세포를 100 ㎛ 세포 스트레이너를 통해 여과하고 400g에서 4℃에서 7분 동안 원심분리하였다. 그런 다음 세포를 1 mL의 적혈구 용해 완충액(155 mmol/l NH4Cl 9 중량부 및 0.1 mol/l Tris-HCl pH 7.65 1 중량부)으로 실온에서 약 5분 동안 처리한 후 4 mL의 PBS로 중화하였다. 그런 다음 세포를 FACS 완충액(2mM EDTA 및 0.5% 비오틴이 없는 소 혈청 알부민을 포함하는 PBS)에서 세척하고 70 ㎛ 세포 스트레이너를 통해 여과하였다.
유세포 분석/세포 분류: 그런 다음 세포 펠렛을 4℃에서 15분 동안 항-마우스 CD16/CD32로 처리한 후 진탕기에서 4℃에서 20분 동안 자기 마이크로비드-컨쥬게이트된 항-CD45 1차 항체와 인큐베이션하였다. AutoMACS(Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Germany)를 사용하여 백혈구 분획을 다른 세포 분획으로부터 분리하였다.
폐의 면역 세포 농축 분획을 CD45, F4/80, SIGLECF 및 MRC1에 대한 항체로 염색하여 대식세포를 분리하거나 CD45, Ly6G 및 CD3에 대한 항체로 염색하여 호중구 및 T 세포를 분리하였다. 비면역 세포 분획이 농축된 폐 세포 현탁액을 통한 플로우는 각각 섬유아세포, 내피 및 상피 세포를 분석하기 위해 CD45, CD140a, CD105 및 EPCAM에 대한 항체로 염색되었다. 항-CD45 항체는 백혈구를 배제하기 위해 비면역 세포 분획에 사용되었다. 세포는 Sony SH800 분류기를 사용하여 분석되었다.
PBS로 처리된 마우스는 배경 형광을 정규화하고 다른 날에 수행된 반복 및 처리 그룹 간의 비교를 용이하게 하기 위해 각 실험일에 포함되었다. 그런 다음 FAM 양성 세포의 수와 중간 형광 강도를 계산하기 위해 FlowJo 소프트웨어(v 10.7.1)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
MicroRNA 라이브러리 준비: 그런 다음 Trizol 시약을 사용하여 총 RNA를 추출하고 제조업체의 프로토콜에 따라 Illumina(NEB)용 NEBNext 작은 RNA 라이브러리 준비 세트를 사용하여 작은 RNA 라이브러리를 준비하였다. 증폭된 PCR 산물을 Monarch 키트를 사용하여 정제하고 증폭 길이를 기반으로 한 선별을 위해 6% urea-PAGE에서 실행하였다. miRNA(약 150bp)에 해당하는 밴드를 잘라내어 lexogen Gel 추출 모듈 키트를 사용하여 밤새 용출하였다. 라이브러리는 다중화되고, 모으고, 75bp 판독 길이에서 페어드 판독 칩을 사용하여 MiSeq 시퀀서(50주기 단일 실행)에서 딥 시퀀싱 실행이 수행되었다.
생물정보학: 그런 다음 시퀀서의 로우 BCL 출력에서 FASTQ 파일이 생성되었다. 작은 RNA의 시퀀싱은 어댑터 서열을 제거하고 저품질(Phred Q < 20) 및 작은(12개 뉴클레오티드 미만) 판독을 필터링한 후 샘플당 약 150만개의 판독(약 % 유효한 판독)을 산출하였다. 나머지 고품질 판독은 고유한 서열에 대해 추가로 필터링되고, 각 샘플에 대해 계수되며, 작은 RNA 레퍼런스 라이브러리(miRBase v22의 miRNA 헤어핀)에 정렬되고, miRDeep2 도구를 사용하여 백만개 당 계수로 정규화된 양을 판독하였다. 그런 다음 백만개 당 5개 이상의 모든 샘플에서 평균 검출 범위를 나타내는 microRNA를 필터링하였다. DESeq2는 샘플 사이의 작은 RNA의 차등 발현을 검정하는데 사용되었고 "ashr" 적응 수축 추정기(Stephens (2017); Biostatistics 18(2): 275-294)는 로그 배수 변화에 사용되었다. R 패키지 도구 pHeatmap을 사용하여 샘플 간의 작은 RNA의 차등 발현을 검정하였다.
도 6A의 이미지는 BioRender 온라인 도구를 사용하여 생성되었으며 화학 구조는 ChemDraw(v20.0)를 사용하여 생성되었다.
조직학: 파라핀 포매를 위해 24시간 동안 4% PFA에 조직을 저장하기 전에 기관 및 캐뉼러에 여전히 연결된 폐 좌엽에 PBS 및 4% 파라포름알데히드(PFA)를 관류하였다. 콜라겐 침착 분석을 위해 좌심실 심근의 파라핀 절편(8 ㎛)을 Sirius red와 Fast green으로 염색하였다. AxioObserver.Z1(Zeiss, Jena, Germany) 전동 주사 단계 현미경(130 x 85; Marzhauser, Wetzlar, Germany)을 사용하여 10x 대물렌즈로 전체 심장 이미지를 촬영하고 Metamorph 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 분석하였다. 섬유증은 각 절편에서 Sirius red에서 Fast green까지의 신호 비율로 정량화되었다.
크리오블락(Kryoblocks)의 경우, 폐 조직 조각(좌엽)을 4% PFA에서 인큐베이션한 후 2시간 동안 4℃에서 30% 자당/PBS 용액에 보관하였다. 폐 냉동 절편(5 ㎛)을 메탄올(-20℃에서 10분 동안)로 고정하고 수돗물로 완전히 세척하고 아세톤으로 처리하였다(-20℃에서 1분). 그런 다음 절편을 PBS에 희석된 5% 염소 혈청으로 차단하고 4℃에서 밤새 MRC1(#AB64693, RRID: AB_1523910, Abcam)에 대한 1차 항체로 염색하였다. 그런 다음 절편을 각각의 2차 항체로 염색하였다. 핵은 Sytox green(Life Technologies)으로 염색되었다. 63X 글리세롤 대물렌즈(Leica SP5)를 사용하여 공초점 현미경으로 이미지를 획득하였다.
통계 분석: 데이터는 평균 및 개별 값을 나타낸다. 통계 분석은 Graphpad Prism 소프트웨어 패키지(버전 8)를 사용하여 수행되었다. 데이터 분포는 정규성에 대해 Shapiro-Wilk 검정에 의해 평가되었다. 분산의 동질성을 검정하기 위해 Bartlett의 검정을 수행하고 이분산성을 검정하기 위해 Spearman의 순위 상관 검정을 수행하였다. 두 평균 간의 차이는 학생 t-검정에 의해 평가되었다. 다중 평균 간의 차이는 이원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Tukey의 사후 검정에 의해 평가되었다. 0.05 미만의 P 값은 유의한 것으로 간주되었다.
여기에 인용된 모든 참고 문헌은 완전히 참조로 포함된다. 이제 본 발명을 충분히 설명하였지만, 당업자는 본 발명의 사상이나 범위 또는 그 실시예에 영향을 미치지 않고서 본 발명이 조건, 파라미터 등의 넓고 동등한 범위 내에서 실시될 수 있음을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Technische Universi채t M체nchen <120> Targeted delivery of an inhibitor of miR-21 to macrophages for the treatment of pulmonary fibrosis <130> AD1813 PCT S3 <150> EP20 16 9160.7 <151> 2020-04-09 <160> 10 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> /note="Is a locked nucleotide" <220> <221> misc_feature <222> 1..15 <223> /note="Phosphorothioate backbone" <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> /note="Is a locked nucleotide" /note="Is a 5-methyl-cytosine" <220> <221> misc_feature <222> 4 <223> /note="Is a locked nucleotide" <220> <221> misc_feature <222> 6 <223> /note="Is a locked nucleotide" /note="Is a 5-methyl-cytosine" <220> <221> misc_feature <222> 8 <223> /note="Is a locked nucleotide" <220> <221> misc_feature <222> 10 <223> /note="Is a locked nucleotide" <220> <221> misc_feature <222> 12 <223> /note="Is a locked nucleotide" <220> <221> misc_feature <222> 14 <223> /note="Is a locked nucleotide" /note="Is a 5-methyl-cytosine" <400> 1 tcagtctgat aagct 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> 1 <223> /note="Is a locked nucleotide" <220> <221> misc_feature <222> 1..15 <223> /note="Phosphorothioate backbone" <220> <221> misc_feature <222> 3 <223> /note="Is a locked nucleotide" <220> <221> misc_feature <222> 6 <223> /note="Is a locked nucleotide" /note="Is a 5-methyl-cytosine" <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> /note="Is a locked nucleotide" <220> <221> misc_feature <222> 10 <223> /note="Is a locked nucleotide" <220> <221> misc_feature <222> 12 <223> /note="Is a locked nucleotide" <220> <221> misc_feature <222> 14 <223> /note="Is a locked nucleotide" /note="Is a 5-methyl-cytosine" <220> <221> misc_feature <222> 15 <223> /note="Is a locked nucleotide" <400> 2 tcagtctgat aagct 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..15 <223> /note="Is a locked nucleotide" /note="Phosphorothioate backbone" <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> /note="Is a 5-methyl-cytosine" <220> <221> misc_feature <222> 6 <223> /note="Is a 5-methyl-cytosine" <220> <221> misc_feature <222> 14 <223> /note="Is a 5-methyl-cytosine" <400> 3 tcagtctgat aagct 15 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..15 <223> /note="Is a locked nucleotide" /note="Phosphorothioate backbone" <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> /note="Is a 5-methyl-cytosine" <220> <221> misc_feature <222> 11 <223> /note="Is a 5-methyl-cytosine" <220> <221> misc_feature <222> 14 <223> /note="Is a 5-methyl-cytosine" <400> 5 tcagtattag cagct 15 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 6 Cys Ser Pro Gly Ala Lys Val Arg Cys 1 5 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..15 <223> /note="Is a locked nucleotide" <220> <221> misc_feature <222> 2 <223> /note="Is a 5-methyl-cytosine" <220> <221> misc_feature <222> 6 <223> /note="Is a 5-methyl-cytosine" <220> <221> misc_feature <222> 14 <223> /note="Is a 5-methyl-cytosine" <400> 7 tcagtctgat aagct 15 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..15 <223> /note="Is a locked nucleotide" /note="Phosphorothioate backbone" <400> 8 tcagtctgat aagct 15 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> 1..15 <223> /note="Is a locked nucleotide" <400> 9 tcagtctgat aagct 15 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 10 Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ala Asp

Claims (41)

  1. miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)의 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    모이어티는 추가로 상기 miR-21 억제제를 섬유아세포에 전달하는 치료용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    모이어티는 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 선택적으로 전달하거나, 모이어티는 상기 miR-21 억제제를 대식세포 및 섬유아세포에 선택적으로 전달하는 치료용 조성물.
  4. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    miR-21 억제제는 폐 대식세포에 전달되거나, 폐 대식세포 및 폐 섬유아세포에 전달되는 치료용 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물은 폐 투여에 의해 투여되고; 특히 조성물은 흡입에 의해, 또는 폐, 기관지 및/또는 기도에 국소 투여하는 다른 수단에 의해 대상체의 폐에 에어로졸화된 조성물로 투여되는 치료용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폐 섬유증을 앓고 있는 대상체는 폐 질환 또는 장애를 더 가지는 치료용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    폐 질환 또는 장애는 섬유증을 유발하거나 이와 연관되며, 바람직하게는 폐 질환 또는 장애는 바이러스 및/또는 세균에 의해 유발되고, 만성 폐쇄성 폐 질환이거나, 특발성 폐 섬유증이며, 보다 바람직하게는 폐 질환 또는 장애는 코로나 바이러스 질환이고, 더욱 더 바람직하게는 폐 질환 또는 장애는 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-1에 의해 유발되는 치료용 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    폐 섬유증은 특히 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS) 이후 폐 지지 또는 기계적 환기에 의해 유발되거나 연관되는 치료용 조성물.
  9. 제6항에 있어서,
    대상체는 심장 질환 또는 장애를 더 앓고 있되, 특히 심장 질환 또는 장애는 섬유증을 유발하거나 이와 연관되며, 특히, 심장 질환 또는 장애는 심부전, 허혈, 허혈후 심부전, 심장 비대, 고혈압성 심부전, 확장기 심부전, 수축기 심부전, 심장 관련 저장 질환, 심근병증, 협착성 심낭염, 관상동맥 질환, 급성 심근경색증, 만성 심근경색증, 우심부전, 심장 부정맥, 심근염 관련 섬유증 및 심장 판막 질환으로 구성된 군에서 선택되는 치료용 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물은 대식세포 전염증성(pro-inflammatory) 분극화를 예방하고, 염증, 근섬유아세포 형질전환 및/또는 섬유증을 예방하는 치료용 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물은 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS) 이후 적어도 약 5일에 대상체에게 투여되며, 특히, 조성물은 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS) 이후 적어도 약 19일에 대상체에게 더 투여되는 치료용 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물은 동맥내 투여, 바람직하게는 심장내 투여, 바람직하게는 폐로의 투여, 보다 바람직하게는 관상동맥내 투여 및/또는 흡입을 통한 투여에 의해 투여되는 치료용 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물은 약 10 mg의 miR-21 억제제를 포함하거나 약 10 mg 미만의 miR-21 억제제를 포함하는 단일 용량으로 투여되는 치료용 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 상기 모이어티는 대식세포의 세포 표면에 농축(enrichment)을 제공하는 치료용 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 상기 모이어티는 나노입자, 리포좀, 지질 나노입자(LNP), 메조포러스 실리카 나노입자(MSN), 항체 또는 이의 기능적 단편, 세포 유형-특이적인 표적화 모이어티, 저분자 리간드 및 (단백질성) 리간드 또는 이의 기능적 단편으로 구성된 군에서 선택되는 치료용 조성물.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 상기 모이어티는
    a) 대식세포;
    b) 섬유아세포 및 대식세포;
    c) 폐 대식세포; 또는
    d) 폐 섬유아세포 및 폐 대식세포에서 배타적으로 또는 우세하게 발견되는 적어도 하나의 항원에 특이적으로 결합하는 치료용 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 상기 모이어티는 길항제(들), 작용제(들), 베타 아드레날린성 수용체(들), G-단백질-결합된 수용체(들) 및 수용체(들)에 결합하는 사이토카인(들)로 구성된 군에서 선택된 세포 표면 수용체(들)과 결합 및/또는 상호작용하는 저분자 리간드, 세포 유형-특이적인 표적화 모이어티 및/또는 리간드, 바람직하게는 단백질성 리간드 또는 이의 기능적 단편인 치료용 조성물.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 기능적 단편은 다음 표에서 선택된 세포 표면 수용체(들)에 포함된 적어도 하나의 항원에 특이적으로 결합하고, 및/또는 상기 저분자 리간드 및/또는 상기 단백질성 리간드는 다음 표에서 선택된 적어도 하나의 세포 표면 수용체(들)과 결합 및/또는 상호작용하는 치료용 조성물:
    Figure pct00017

    Figure pct00018

    Figure pct00019
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 miR-21 억제제는 항체 또는 이의 기능적 단편에 컨쥬게이트되고, 상기 세포 유형-특이적인 표적화 모이어티에 컨쥬게이트되며, 상기 저분자 리간드에 컨쥬게이트되며, 및/또는 상기 리간드 또는 이의 기능적 단편에 컨쥬게이트되는 치료용 조성물.
  20. 제15항에 있어서,
    상기 miR-21 억제제는 상기 나노입자, 상기 리포좀, 상기 지질 나노입자(LNP) 및/또는 상기 메조포러스 실리카 나노입자(MSN)에 포함되는 치료용 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    miR-21 억제제는 miR-21의 표적을 활성화(derepresses) 또는 과발현하는 치료용 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    miR-21 억제제는 안티센스 miRNA-21이거나 이를 포함하는 치료용 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 miRNA는 miR-21에 상보적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드인 치료용 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 miRNA-21은 잠금 핵산(locked nucleic acid)이거나, 바람직하게는 포스포로티오에이티드 LNA/DNA 믹스머인 치료용 조성물.
  25. miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 폐 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    조성물은 에어로졸 형태인 조성물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    의약에 사용하기 위한 조성물.
  28. 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)의 치료에서의 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  29. miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 폐 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 조성물의 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)의 치료용 의약의 제조를 위한 용도.
  30. 제25항 내지 제26항 중 어느 한 항의 조성물의 생산 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    방법은 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티에 상기 miR-21 억제제를 컨쥬게이트하는 것을 포함하거나, 방법은 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티에 상기 miR-21 억제제를 도입하는 것을 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    방법은 miR-21 억제제와 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 컨쥬게이트하는 것을 포함하는 방법.
  33. miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티를 포함하는 조성물을 그러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 폐 섬유증(pulmonary fibrosis)의 치료 방법.
  34. 제1항 내지 제24항, 제28항 및 제30항 중 어느 한 항, 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항, 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항 또는 제33항에 있어서,
    miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티는 링커를 통해 연결되고, 여기서 링커는 C10-40 알킬렌, C10-40 알케닐렌 및 C10-40 알키닐렌으로부터 선택된 그룹 L을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 상기 알킬렌, 상기 알케닐렌 및 상기 알키닐렌은 각각 임의로 할로겐, C1-5 할로알킬, -O(C1-5 할로알킬), -CN, -OR21, -NR21R21, -NR21OR21, -COR21, -COOR21,-OCOR21, -CONR21R21, -NR21COR21, -NR21COOR21, -OCONR21R21, -SR21, -SOR21, -SO2R21, -SO2NR21R21, -NR21SO2R21, -SO3R21 및 -NO2로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹으로 치환되고, 및 추가로 여기서 상기 알킬렌, 상기 알케닐렌 또는 상기 알키닐렌에 포함된 하나 이상의 -CH2- 유닛은 각각 임의로 -O-, -NR21-, -CO-, -S-, -SO-, -SO2-, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 시클로알킬렌 및 헤테로시클로알킬렌으로부터 독립적으로 선택된 그룹에 의해 대체되며, 여기서 상기 아릴렌, 상기 헤테로아릴렌, 상기 시클로알킬렌 및 상기 헤테로시클로알킬렌은 각각 임의로 C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, 할로겐, C1-5 할로알킬, -CN, -OH, -O(C1-5 알킬), -SH, -S(C1-5 알킬), -NH2, -NH(C1-5 알킬) 및 -N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹으로 치환되고;
    각 R21은 독립적으로 수소, C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, 카보시클릴 및 헤테로시클릴로부터 선택되며, 여기서 상기 알킬, 상기 알케닐 및 상기 알키닐은 각각 임의로 하나 이상의 그룹 RAlk로 치환되고, 및 추가로 여기서 상기 카보시클릴 및 상기 헤테로시클릴은 각각 임의로 하나 이상의 그룹 RCyc로 치환되며;
    임의의 두 개의 R21는 임의로 연결되어 고리를 형성하고;
    각 RAlk는 독립적으로 -OH, -O(C1-5 알킬), -O(C1-5 알킬렌)-OH, -O(C1-5 알킬렌)-O(C1-5 알킬), -SH, -S(C1-5 알킬), -S(C1-5 알킬렌)-SH, -S(C1-5 알킬렌)-S(C1-5 알킬), -NH2, -NH(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-OH, -N(C1-5 알킬)-OH, -NH-O(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-O(C1-5 알킬), 할로겐, C1-5 할로알킬, -O(C1-5 할로알킬), -CN, -NO2, -CHO, -CO(C1-5 알킬), -COOH, -COO(C1-5 알킬), -O-CO(C1-5 알킬), -CO-NH2, -CO-NH(C1-5 알킬), -CO-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-CO(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-CO(C1-5 알킬), -NH-COO(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-COO(C1-5 알킬), -O-CO-NH(C1-5 알킬), -O-CO-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-5 알킬), -SO2-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-SO2-(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-SO2-(C1-5 알킬), -SO2-(C1-5 알킬), -SO-(C1-5 알킬), 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 및 헤테로시클로알킬로부터 선택되며, 여기서 상기 아릴, 상기 헤테로아릴, 상기 시클로알킬 및 상기 헤테로시클로알킬은 각각 임의로 C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, 할로겐, C1-5 할로알킬, -CN, -OH, -O(C1-5 알킬), -SH, -S(C1-5 알킬), -NH2, -NH(C1-5 알킬) 및 -N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹으로 치환되고;
    각 RCyc은 독립적으로 C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, -OH, -O(C1-5 알킬), -O(C1-5 알킬렌)-OH, -O(C1-5 알킬렌)-O(C1-5 알킬), -SH, -S(C1-5 알킬), -S(C1-5 알킬렌)-SH, -S(C1-5 알킬렌)-S(C1-5 알킬), -NH2, -NH(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-OH, -N(C1-5 알킬)-OH, -NH-O(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-O(C1-5 알킬), 할로겐, C1-5 할로알킬, -O(C1-5 할로알킬), -CN, -NO2, -CHO, -CO(C1-5 알킬), -COOH, -COO(C1-5 알킬), -O-CO(C1-5 알킬), -CO-NH2, -CO-NH(C1-5 알킬), -CO-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-CO(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-CO(C1-5 알킬), -NH-COO(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-COO(C1-5 알킬), -O-CO-NH(C1-5 알킬), -O-CO-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -SO2-NH2, -SO2-NH(C1-5 알킬), -SO2-N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬), -NH-SO2-(C1-5 알킬), -N(C1-5 알킬)-SO2-(C1-5 알킬), -SO2-(C1-5 알킬), -SO-(C1-5 알킬), 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 및 헤테로시클로알킬로부터 선택되며, 여기서 상기 아릴, 상기 헤테로아릴, 상기 시클로알킬 및 상기 헤테로시클로알킬은 각각 임의로 C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, 할로겐, C1-5 할로알킬, -CN, -OH, -O(C1-5 알킬), -SH, -S(C1-5 알킬), -NH2, -NH(C1-5 알킬) 및 -N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹으로 치환되는 치료용 조성물, 조성물, 생산 방법 또는 치료 방법.
  35. 제1항 내지 제24항, 제28항, 제30항 및 제34항 중 어느 한 항, 제25항 내지 제27항 및 제34항 중 어느 한 항, 제30항 내지 제32항 및 제34항 중 어느 한 항 또는 제33항 및 제34항에 있어서,
    miR-21 억제제 및 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 둘 이상의 모이어티는 분지형 링커를 통해 연결되고, 여기서 링커의 분지 각각은 선행하는 청구항에서 정의된 그룹 L이며 링커의 주쇄는 선행하는 청구항에 정의된 하나 또는 두개의 그룹(들) L을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 바람직하게는 주쇄는 miR-21 억제제에 부착되고, 분지는 상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티에 부착되는 치료용 조성물, 조성물, 생산 방법 또는 치료 방법.
  36. 제34항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    각 그룹 L은 C10-40 알킬렌으로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬렌은 임의로 할로겐, C1-5 할로알킬, -O(C1-5 할로알킬), -CN, -OR21, -NR21R21, -NR21OR21, -COR21, -COOR21,-OCOR21, -CONR21R21, -NR21COR21, -NR21COOR21, -OCONR21R21, -SR21, -SOR21, -SO2R21, -SO2NR21R21, -NR21SO2R21, -SO3R21 및 -NO2으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹으로 치환되며, 및 추가로 여기서 상기 알킬렌에 포함된 하나 이상의 -CH2- 유닛은 각각 독립적으로 -O-, -NR21-, -CO-, -S-, -SO-, -SO2-, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 시클로아릴렌, 시클로알킬렌 및 헤테로시클로알킬렌으로부터 선택된 그룹에 의해 대체되고, 여기서 상기 아릴렌, 상기 헤테로알릴렌, 상기 시클로알킬렌 및 상기 헤테로시클로알킬렌은 각각 임의로 C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, 할로겐, C1-5 할로알킬, -CN, -OH, -O(C1-5 알킬), -SH, -S(C1-5 알킬), -NH2, -NH(C1-5 알킬) 및 -N(C1-5 알킬)(C1-5 알킬)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 그룹으로 치환되는 치료용 조성물, 조성물, 생산 방법 또는 치료 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    링커는 다음으로 표시되는 치료용 조성물, 조성물, 생산 방법 또는 치료 방법:
    Figure pct00020

    또는
    Figure pct00021

    여기서 *는 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 모이어티에 대한 결합을 나타내고 **는 miR-21 억제제에 대한 결합을 나타낸다.
  38. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서,
    miR-21 억제제는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 및 SEQ ID NO: 9로부터 선택되고, 및
    miR-21 억제제는 바람직하게는 말단 포스포로티오에이트 그룹이 인 원자를 통해 링커에 결합되는 치료용 조성물, 조성물, 생산 방법 또는 치료 방법.
  39. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 하나 이상의 모이어티는 당을 포함하고, 바람직하게는 만노스 및 N-아세틸갈락토사민으로부터 선택된 하나 이상을 포함하거나 이로 구성되며, 보다 바람직하게는 만노스, 디만노실만노스 및 N-아세틸갈락토사민으로 구성되는 치료용 조성물, 조성물, 생산 방법 또는 치료 방법.
  40. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 miR-21 억제제를 대식세포에 전달하는 하나 이상의 모이어티는 다음으로부터 선택되는 치료용 조성물, 조성물, 생산 방법 또는 치료 방법:
    Figure pct00022
    또는
    Figure pct00023

    여기서 링커는 각 구조의 오른손 부분 아래에 있는 아노머 탄소에 부착된다.
  41. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물은 도 23B에 정의된 화합물 중 하나 또는 둘 및/또는 다음 화합물 중 하나 또는 둘을 포함하는 치료용 조성물, 조성물, 생산 방법 또는 치료 방법:
    Figure pct00024

    Figure pct00025

    또는
    Figure pct00026

    Figure pct00027
KR1020227039237A 2020-04-09 2021-04-09 폐 섬유증 치료를 위한 miR-21 억제제의 대식세포로의 표적 전달 KR20230008741A (ko)

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Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
JP2003514773A (ja) 1999-09-28 2003-04-22 ウニヴェルジテート チューリッヒ 血清及び血漿中のプリオン結合活性を有する因子並びに伝染性海綿状脳障害を検出するための薬剤
IL151853A0 (en) 2000-04-11 2003-04-10 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
EP2096171A1 (en) 2008-02-27 2009-09-02 Julius-Maximilians-Universität Würzburg MicroRNA (miRNA) and down-stream targets for diagnostic and therapeutic purposes
AU2014256406A1 (en) * 2008-02-27 2014-11-20 Julius Maximilians-Universitat Wurzburg MicroRNA (miRNA) and downstream targets for diagnostic and therapeutic purposes
SG11201406931XA (en) * 2012-04-25 2014-11-27 Regulus Therapeutics Inc Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity
WO2015061536A1 (en) * 2013-10-25 2015-04-30 Regulus Therapeutics Inc. Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity
WO2015154002A1 (en) * 2014-04-04 2015-10-08 Ohio State Innovation Foundation Oligonucleotide lipid nanoparticle compositions, methods of making and methods of using the same
US11085071B2 (en) * 2017-02-01 2021-08-10 Spot Biosystems Ltd. Highly stable and specific molecular beacons encapsulated in cationic lipoplex nanoparticles and application thereof

Non-Patent Citations (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Adam (2012); Basic Research in Cardiology 107(5): 278
Altshuler (2010); Biochemistry (Moscow) 75(13): 1584-1605
Bahit (2018); JACC: Heart Failure 6(3): 179-186
Bartel (2018); Cell 173(1):, 20-51
Bashore (2012); Journal of the American College of Cardiology 59(24): 2221-2305.
Bosson (2016); Mol Cell 56(3): 347-359
Brennan (1985); Science 229(4708): 81-83
Brown (2007); Nature Biotechnology 25(12): 1457-1467
Cardin (2012); Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology 5(5): 1027-1035
Carter (1992); Bio/Technology 10(2): 163-167
Cole (1985); Journal of Immunological Methods 78(2): 271-278
Harlow (1988); Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory
Harlow (1999); Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press
Hinkel (2012); Circulation 128(10): 1066-1075
Hollinger (2005); Nature Biotechnology 23: 1126-1136
Jones (1986); Nature 321(6069): 522-525
Juliano (2016); Nucleic Acids Research, 44(14)
Khvorova (2017); Nature Biotechnology 35: 238-248
Kohler (1975); Nature, 256(5517), 495-497
Kozbor (1983); Immunol Today 4(3): 72-79
Li (2014); Nature Reviews Drug Discovery, 13(8), 622-638
Lu (2019); Nature Reviews Cardiology 16: 661-674
Martinez-Pomares (2012); J. Leukoc. Biol. 92: 1177-1186
Mendell (2012); Cell 148(6): 1172-1187
Milstein 1983); Nature, 305(5934), 537-540
Morimoto (1992); J Biol Chem 267(31): 21987-21990
Patrick (2010); Journal of Clinical Investigation, 120(11), 3912-3916
Pellicori (2019); Heart Failure Review 25: 147-159
Potere (2019); Front Cardiovasc Med 2019 Apr 26;6:51
Presta (1992); Current Opinion in Biotechnology 3(4): 394-398
Ramanujam (2016); Molecular Therapy 24(11): 1939-1948
Ramilowski (2015); Nat. Commun. 6(1): 7866
Riechmann (1988); Nature, 332(6162), 323-327
Rupaimoole (2017); Nature Reviews Drug Discovery 16: 203-222
Sambrook (2001); Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sayed (2010); Journal of Biological Chemistry, 285(26), 20281-20290
Sgalla (2018); Respiratory Research, 19(1), 1-18
Shalaby (1992); The Journal of Experimental Medicine, 175(1), 217-225
Skelly (2018); Cell Reports, 22(3), 600-610
Sood (2006); Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(8), 2746-2751
Stenvang (2012); Silence 3(1): 1
Stephens (2017); Biostatistics 18, 275-294
Thum (2008); Nature 456: 980-984
Tutt (1991); Journal of Immunology 147(1): 60-69
Wessels (2019); Nature Communications 10(1): 1626
Xu (2020); Journal of Infection 80: 394-400
Yang (2019); ACS Nano 13: 1029-1041
Yona (2013); Immunity 38(1): 79-91

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