KR20230000935A - 죽여 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경변성질환 및 인지기능 장애의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
죽여 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경변성질환 및 인지기능 장애의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 죽여 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경변성질환의 예방 또는 치료용 조성물, 또는 인지기능 장애의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 죽여 추출물, 특히 죽여 에탄올 추출물에는 쿠마린산(p-coumaric acid) 및 트리신(tricin)이 높은 함량으로 포함되어 있으며, LPS로 자극된 미세아교세포에서 유발된 염증반응을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 죽여 추출물은 스코폴라민으로 기억력 손상이 유도된 마우스를 이용한 Y-미로 실험 및 수동회피 실험에서 기억력 증진효과를 나타내었을 뿐만 아니라, 아세틸콜린에스테라아제 저해 활성, 항산화 활성, 지질과산화물 축적 억제 활성 및 염증성 바이오마커의 발현 억제 활성을 보이는 것을 확인하였으므로, 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능식품에 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명의 죽여 추출물, 특히 죽여 에탄올 추출물에는 쿠마린산(p-coumaric acid) 및 트리신(tricin)이 높은 함량으로 포함되어 있으며, LPS로 자극된 미세아교세포에서 유발된 염증반응을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 죽여 추출물은 스코폴라민으로 기억력 손상이 유도된 마우스를 이용한 Y-미로 실험 및 수동회피 실험에서 기억력 증진효과를 나타내었을 뿐만 아니라, 아세틸콜린에스테라아제 저해 활성, 항산화 활성, 지질과산화물 축적 억제 활성 및 염증성 바이오마커의 발현 억제 활성을 보이는 것을 확인하였으므로, 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능식품에 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 죽여 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경변성질환의 예방 또는 치료용 조성물, 또는 인지기능 장애의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
뇌의 식세포(phagocyte)인 미세아교세포(Microglia)는 수퍼옥사이드(superoxide)와 신경독(neurotoxin)을 생성함으로써 만성 신경염증을 유발할 수 있으며, 미세아교세포에서 생산되는 활성화제 및 신경독성 물질은 파킨슨병등과 같은 신경염증에 의해 유발되는 질병의 병리학적 진행과 직접 관련이 있다.
특히, 미세아교세포 활성화는 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 알츠하이머(Alzheimer's disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS) 및 다발성 경화증(multiple sclerosis; MS)과 같은 다발성 신경 퇴행성 장애의 발병 기전과 연결되어 있다. 종양괴사인자(tumor necrosis factor-α; TNF-α), 인터루킨-1β(interleukin-1β; IL-1β), 인터루킨-12(interleukin-12; IL-12), 인터루킨-6(interleukin-6; IL-6), 프로스타글라딘(prostaglandin E2; PGE2) 및 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase-2; COX-2) 등과 같은 전염증성 사이토카인과의 관련성도 입증되었다. 다른 독소는 지질다당류(Lipopolysaccharide), 6-OHDA 및 과산화수소(H2O2)와 같은 신경독으로 정립되어 있다. 이들 독소는 미소아교세포를 자극하여 NF-κB, p38, MAPK, JNK, ERK 및 IRF3과 같은 염증 경로를 활성화시키는 것으로 보고되었다 (Kim, D.C., et al., Molecules, 22(12):2130, 2017; He, X., et al., Toxicology letters, 283: 58-68, 2018; Lim, H.-W., et al., Food and chemical toxicology, 72: 265-272, 2014; Cho, D.-Y., et al., Molecules, 21(12):1718, 2016). 그러므로, 미세아교세포 활성화 조절은 신경 염증을 약화시키는 중요한 치료 전략으로 작용할 수 있다.
죽여(竹茹, Bambusae Caulis in Taeniam)는 대나무 속껍질로, 대를 꺾어 외피를 제거하고 중간층을 말린 것이다. 죽여의 효능으로, 동의보감에는 구토 및 해열, 불면증, 거담 등의 증상에 효능이 있는 것으로 알려져 있으며, 최근에는 죽여 추출물의 만성폐쇄성 폐질환 치료 효능(대한민국 등록특허 제10-1427290호), 암전이 억제 효능(대한민국 등록특허 제10-1532307호) 및 화장료 성분으로의 연구(대한민국 등록특허 제10-2082580호)가 이루어지고 있다.
이에, 본 발명에서는 효과적인 신경염증억제제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 죽여 추출물, 특히 죽여 에탄올 추출물에는 쿠마린산(p-coumaric acid) 및 트리신(tricin)이 높은 함량으로 포함되어 있으며, LPS로 자극된 미세아교세포에서 유발된 염증반응을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
또한, 죽여 추출물은 스코폴라민으로 기억력 손상이 유도된 마우스를 이용한 Y-미로 실험(Y-maze test) 및 수동회피 실험(passive avoidance test)에서 기억력 증진효과를 나타내었으며, 아세틸콜린에스테라아제 저해 활성, 항산화 활성, 지질과산화물 축적 억제 활성 및 염증성 바이오마커의 발현 억제 활성을 보이는 것을 확인하였다.
본 발명의 목적은 죽여 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 죽여 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 죽여 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 죽여 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 죽여 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 죽여 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 죽여 추출물은 정제수(또는 물), 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 글리세린, 에틸아세테이트, 아세톤, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸에테르, 부틸렌글라이콜, 헥산 및 이들의 혼합용매로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 용매에 의해 추출될 수 있으며, 바람직하게는 물 또는 에탄올(주정)에 의해 추출될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 죽여는 왕대 속껍질 또는 조릿대 속껍질일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 죽여 추출물은 쿠마린산(p-coumaric acid) 또는 트리신(tricin) 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 죽여 추출물은
ⅰ) NO, 프로스타글라딘 E2, iNOS 및 COX-2를 포함하는 염증반응 매개인자(inflammatory mediators) 생성 억제;
ⅱ) IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 포함하는 염증성 사이토카인(cytokines) 생성 억제; 및
ⅲ) IκB-α 인산화 및 분해 억제;를 통해 신경염증을 조절할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 신경염증 질환은 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증 또는 근위축성측색경화증으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 죽여 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 죽여 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 죽여 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드 및 이들의 혼합용매로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 용매에 의해 추출될 수 있으며, 바람직하게는 물 또는 에탄올에 의해 추출될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 죽여는 왕대 속껍질 또는 조릿대 속껍질일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 죽여 추출물은 쿠마린산(p-coumaric acid) 또는 트리신(tricin) 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 죽여 추출물은
ⅰ) 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase; AChE) 저해 활성;
ⅱ) 항산화 활성;
ⅲ) 지질과산화물 축적 억제 활성; 및
ⅳ) IL-1, IL-6, 및 TNF-α를 포함하는 염증성 사이토카인(cytokines) 생성 억제 활성, 및 IL-10을 포함하는 항염증성 사이토카인 생성 촉진 활성;을 보일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 인지 기능 장애는 경도인지장애, 주의력 결핍장애(ADHD), 우울증, 알츠하이머병, 뇌혈관성 치매, 노인성 치매, 픽(pick)병 및 크루츠펠트-야곱(Creutzfeldt-jakob)병으로 이루어진 군으로 부터 선택될 수 있다.
본 발명의 죽여 추출물, 특히 죽여 에탄올 추출물에는 쿠마린산(p-coumaric acid) 및 트리신(tricin)이 높은 함량으로 포함되어 있으며, LPS로 자극된 미세아교세포에서 유발된 염증반응을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 죽여 추출물은 스코폴라민으로 기억력 손상이 유도된 마우스를 이용한 Y-미로 실험 및 수동회피 실험에서 기억력 증진효과를 나타내었을 뿐만 아니라, 아세틸콜린에스테라아제 저해 활성, 항산화 활성, 지질과산화물 축적 억제 활성 및 염증성 바이오마커의 발현 억제 활성을 보이는 것을 확인하였으므로, 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능식품에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 죽여(속껍질) 추출물 및 죽엽(잎) 추출물 속에 포함된 (A, B) 쿠마린산(p-coumaric acid), (C, D) 트리신(tricin) 및 (E, F) 카페산(Caffeic acid) 함량을 확인한 데이터이다.
도 2는 LPS-자극된 BV-2 미세아교세포에 죽여 추출물을 농도별로 처리하였을 때, (A) 아질산염(NO, Nitrite), (B) 프로스타글라딘 E2(PEG2, Prostaglandin E2)의 생성 정도를 확인한 데이터이다.
도 3은 LPS-자극된 BV-2 미세아교세포에 죽여 추출물을 농도별로 처리하였을 때, iNOS의 (A) mRNA 및 (B) 단백질 발현정도를 확인한 데이터이다.
도 4는 LPS-자극된 BV-2 미세아교세포에 죽여 추출물을 농도별로 처리하였을 때, COX-1 및 COX-2의 단백질 발현정도를 확인한 데이터이다.
도 5는 LPS-자극된 BV-2 미세아교세포에 죽여 추출물을 농도별로 처리하였을 때, (A) TNF-α, (b) IL-1β, (C) IL-6 생성정도 및 (D) 이들의 mRNA 발현정도를 확인한 데이터이다.
도 6은 LPS-자극된 BV-2 미세아교세포에 죽여 추출물을 농도별로 처리하였을 때, IκB-α 분해 억제 정도를 확인한 데이터이다.
도 7은 (A) 죽여 메탄올 추출물 및 (B) 죽여 부탄올 추출물의 아세틸콜린에스터라아제 저해능을 확인한 데이터이다.
도 8은 LPS-자극된 BV-2 미세아교세포에 죽여 추출물을 농도별로 처리하였을 때, (A) 아질산염 생성 억제활성 및 (B) 세포 독성정도를 확인한 데이터이다.
도 9는 스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에 죽여 에탄올 추출물을 처리하였을 때, 수동회피 실험(passive avoidance test) 결과를 나타낸 데이터이다.
도 10은 스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에 죽여 에탄올 추출물을 처리하였을 때, Y-미로실험 결과를 나타낸 데이터이다.
도 11은 스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에 죽여 에탄올 추출물을 처리하였을 때, 해마(Hippocampus) 및 대뇌피질(Cerebral cortex)에서 항산화 효소 활성을 확인한 데이터이다.
도 11a는 SOD(Superoxide Dismutase) 활성을, 도 11b는 CAT(Catalase) 활성을, 도 11c는 GPx(Glutathione peroxidase) 활성을 확인한 데이터이다.
도 12는 스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에 죽여 에탄올 추출물을 처리하였을 때, 해마(Hippocampus) 및 대뇌피질(Cerebral cortex)에서 지질과산화 지표물질인 MDA(Malondialdehyde) 수준을 확인한 데이터이다.
도 13은 스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에 죽여 에탄올 추출물을 처리하였을 때, 해마 및 대뇌피질에서 신경염증 정도를 확인한 데이터이다.
도 13a는 TNF-α 수준을, 도 13b는 IL-1β 수준을, 도 13c는 IL-1 수준을, 도 13d는 IL-10 수준을 확인한 데이터이다.
도 2는 LPS-자극된 BV-2 미세아교세포에 죽여 추출물을 농도별로 처리하였을 때, (A) 아질산염(NO, Nitrite), (B) 프로스타글라딘 E2(PEG2, Prostaglandin E2)의 생성 정도를 확인한 데이터이다.
도 3은 LPS-자극된 BV-2 미세아교세포에 죽여 추출물을 농도별로 처리하였을 때, iNOS의 (A) mRNA 및 (B) 단백질 발현정도를 확인한 데이터이다.
도 4는 LPS-자극된 BV-2 미세아교세포에 죽여 추출물을 농도별로 처리하였을 때, COX-1 및 COX-2의 단백질 발현정도를 확인한 데이터이다.
도 5는 LPS-자극된 BV-2 미세아교세포에 죽여 추출물을 농도별로 처리하였을 때, (A) TNF-α, (b) IL-1β, (C) IL-6 생성정도 및 (D) 이들의 mRNA 발현정도를 확인한 데이터이다.
도 6은 LPS-자극된 BV-2 미세아교세포에 죽여 추출물을 농도별로 처리하였을 때, IκB-α 분해 억제 정도를 확인한 데이터이다.
도 7은 (A) 죽여 메탄올 추출물 및 (B) 죽여 부탄올 추출물의 아세틸콜린에스터라아제 저해능을 확인한 데이터이다.
도 8은 LPS-자극된 BV-2 미세아교세포에 죽여 추출물을 농도별로 처리하였을 때, (A) 아질산염 생성 억제활성 및 (B) 세포 독성정도를 확인한 데이터이다.
도 9는 스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에 죽여 에탄올 추출물을 처리하였을 때, 수동회피 실험(passive avoidance test) 결과를 나타낸 데이터이다.
도 10은 스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에 죽여 에탄올 추출물을 처리하였을 때, Y-미로실험 결과를 나타낸 데이터이다.
도 11은 스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에 죽여 에탄올 추출물을 처리하였을 때, 해마(Hippocampus) 및 대뇌피질(Cerebral cortex)에서 항산화 효소 활성을 확인한 데이터이다.
도 11a는 SOD(Superoxide Dismutase) 활성을, 도 11b는 CAT(Catalase) 활성을, 도 11c는 GPx(Glutathione peroxidase) 활성을 확인한 데이터이다.
도 12는 스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에 죽여 에탄올 추출물을 처리하였을 때, 해마(Hippocampus) 및 대뇌피질(Cerebral cortex)에서 지질과산화 지표물질인 MDA(Malondialdehyde) 수준을 확인한 데이터이다.
도 13은 스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에 죽여 에탄올 추출물을 처리하였을 때, 해마 및 대뇌피질에서 신경염증 정도를 확인한 데이터이다.
도 13a는 TNF-α 수준을, 도 13b는 IL-1β 수준을, 도 13c는 IL-1 수준을, 도 13d는 IL-10 수준을 확인한 데이터이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
신경염증 질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 일관점에서, 죽여 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 일관점에서, 죽여 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 죽여는 왕대 속껍질 또는 조릿대 속껍질일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 죽여 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으며, 바람직하게는 정제수(또는 물), 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 글리세린, 에틸아세테이트, 아세톤, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸에테르, 부틸렌글라이콜, 헥산 및 이들의 혼합용매으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매를 사용하여 추출되며, 보다 바람직하게는 물 또는 에탄올(주정)을 사용하여 추출되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 죽여 추출물은 쿠마린산(p-coumaric acid) 또는 트리신(tricin) 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서, 왕대, 조릿대, 오죽의 속껍질(죽여) 또는 잎(죽엽)을 이용하여 열수, 30% 에탄올(주정), 70% 에탄올(주정) 및 100% 에탄올(주정)을 이용하여 추출물을 제조하였다. 각 추출물의 유효성분으로 쿠마린산(p-coumaric acid), 트리신(tricin) 및 카페산(Caffeic acid) 함량을 비교한 결과, 도 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, 죽여 추출물의 경우 죽엽 추출물에 비해 트리신 함량이 현저하게 높은 것으로 확인되었다. 또한, 쿠마린산은 죽여 100% 에탄올 추출물에서, 트리신은 죽여 70% 에탄올 추출물에서 함량이 높은 것으로 확인되었다.
본 발명에 있어서, 상기 죽여 추출물은
ⅰ) NO, 프로스타글라딘 E2, iNOS 및 COX-2를 포함하는 염증반응 매개인자(inflammatory mediators) 생성 억제;
ⅱ) IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 포함하는 염증성 사이토카인(cytokines) 생성 억제; 및
ⅲ) IκB-α 인산화 및 분해 억제;를 통해 신경염증을 조절할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에서, 죽여 추출물의 신경염증 조절 효과를 확인하기 위해, NO 생성 억제 효과, iNOS 및 COX-2 발현 저해 효과, 전염증성 매개체인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 생성 저해 효과, 및 NF-κB 활성 억제(IκB-α 분해 억제) 효과를 확인하였다.
그 결과, 본 발명의 죽여 추출물은 LPS에 의해 유도된 NO 생성 및 프로스타글라딘 E2 억제(도 2), iNOS 및 COX-2 mRNA/단백질 발현 억제(도 3 및 도 4), IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 포함하는 염증성 사이토카인 생성 억제(도 5) 효과가 있는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 죽여 추출물은 IκB-α 분해를 억제하여 NF-κB 신호전달을 차단하는 것을 확인하였다 (도 6).
본 발명에 있어서, 죽여 추출물은 전체 조성물에 10 내지 250 ㎍/㎖의 농도로, 바람직하게는 10 내지 200 ㎍/㎖, 더 바람직하게는 10 내지 150 ㎍/㎖ 농도로 포함하는 것이 바람직하다. 10 ㎍/㎖ 미만의 농도로 죽여 추출물을 포함하는 경우 신경 염증 예방 또는 치료 효과가 미미할 수 있으며, 250 ㎍/㎖농도를 초과하여 죽여 추출물을 포함하는 경우, 세포 독성이 나타날 수 있다 (도 7).
본 발명에서 "신경염증 질환"은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 여러 가지 증상을 유발하는 질환 등을 총칭하며, 본 발명에 따른 대표적인 신경염증 질환에는 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증 또는 근위축성측색경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 또 다른 일관점에서, 죽여 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 일관점에서, 죽여 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 죽여는 왕대 속껍질 또는 조릿대 속껍질일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 죽여 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으며, 바람직하게는 정제수(또는 물), 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 글리세린, 에틸아세테이트, 아세톤, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸에테르, 부틸렌글라이콜, 헥산 및 이들의 혼합용매으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매를 사용하여 추출되며, 보다 바람직하게는 물 또는 에탄올을 사용하여 추출되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 죽여 추출물은 쿠마린산(p-coumaric acid) 또는 트리신(tricin) 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 죽여 추출물은
ⅰ) 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase; AChE) 저해 활성;
ⅱ) SOD(Superoxide Dismutase), CAT(Catalase), GPxGlutathione peroxidase) 효소 활성을 통한 항산화 활성;
ⅲ) 지질과산화물 축적 억제 활성; 및
ⅳ) IL-1, IL-6, 및 TNF-α를 포함하는 염증성 사이토카인(cytokines) 생성 억제 활성, 및 IL-10을 포함하는 항염증성 사이토카인 생성 촉진 활성;을 보일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서, 죽여 추출물의 기억력 증진 또는 인지 기능 개선능을 확인하기 위해, 수동회피능력 실험 및 Y-미로 실험을 수행하였으며, 아세틸콜린에스터라아제 저해 효과, 항산화 효과, 지질과산화물 축적 억제 효과, 및 염증성 사이토카인 생성 효과를 확인하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 죽여 메탄올 또는 부탄올 분획물을 이용하여 아세틸콜린에스터라아제 저해능을 확인한 결과, 메탄올 분획물 및 부탄올 분획물 모두 아세틸콜린에스터라아제 활성을 저해하는 것을 확인하였다.
스코폴라민으로 기억력을 손상시킨 마우스에, 죽여 에탄올 추출물을 각각 처리한 후 수동회피능력 실험을 수행한 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 밝은 방에 머무르는 시간을 체류시간(PAT retention time)이 증가한 것을 확인하였다. 또한, 도 10에 나타난 바와 같이, Y-미로 실험 장치를 이용한 변경 행동력(Alternation behavior) 실험에서 죽여 에탄올 추출물에 의해 변경 행동력이 유의성 있게 감소한 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 다른 실시예에서, 스코폴라민으로 기억력을 손상시킨 마우스에 죽여 추출물을 처리하였을 때, 해마(Hippocampus) 및 대뇌피질(Cerebral cortex)에서 산화스트레스 정도를 확인한 결과, 항산화 효소인 SOD(Superoxide Dismutase), CAT(Catalase) 및 GPxGlutathione peroxidase) 활성이 증가하였으며(도 11a ~ 도 11c), 지질과산화 지표인 MDA (Malondialdehyde) 수준은 감소한 것을 확인하였다 (도 12).
또한, 해마 및 대뇌피질에서 신경염증 억제 효능을 확인하기 위해, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-10 수준을 확인한 결과, 죽여 추출물 투여에 의해 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성이 감소하고(도 13a ~ 도 13c), 항염증성 사이토카인인 IL-10 생성은 증가하는 것을 확인하였다 (도 13d).
본 발명에 있어서, 상기 인지 기능 장애는 경도인지장애, 주의력 결핍장애(ADHD), 우울증, 알츠하이머병, 뇌혈관성 치매, 노인성 치매, 픽(pick)병 및 크루츠펠트-야곱(Creutzfeldt-jakob)병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다. 상기 약학 조성물을 제제화나 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 제공하는 것을의미한다. 본 발명은 약학 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자 등에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국소 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 약학 조성물은 1 ~ 10,000㎎/㎏/일의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 건강기능식품, 식품 첨가제 또는 식이보조제로 사용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 식품 첨가제로 사용할 경우, 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 사용되는 등 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
또한 상기 건강기능식품 조성물의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 변경될 수 있다. 구체적인 예로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 추출물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하여 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 양으로 첨가될 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으나, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료로 제조될 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 추가 성분을 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐 등의 합성 감미제 등이 사용될 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01 ~ 10중량%, 바람직하 게는 0.01 ~ 0.1중량%로 포함된다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있으며, 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함 할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기의 첨가제 비율은 크게 제한되지는 않으나, 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01 ~ 0.1중량% 범위내로 포함되는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
죽여 추출물 제조 및 주요 유효 성분 함량 확인
1-1 : 죽여 및 죽엽 추출물 제조
본 발명에서는 하기 표 1과 같이, 오족, 왕대, 조릿대 속껍질(죽여) 또는 입(죽엽)을 이용하여 추출물을 제조하였다.
| 열수 | 30%에탄올 | 70% 에탄올 | 100% 에탄올 | |
| 오죽 | 152g | 152g | 77g | 76g |
| 왕대 | 106.5g | 106.5g | 53g | 53g |
| 조릿대 | 90g | 90g | 90g | 45g |
열수 추출물, 30% (v/v) 에탄올 추출물, 70% (v/v) 에탄올 추출물 및 100% (v/v) 에탄올 추출물을 아래의 추출 조건으로 환류 추출 하였으며, 10 ㎛ 여과포를 이용하여 여과한 다음, 감압 농축하여 각각의 추출물을 제조하였다.
추출 조건은 아래와 같다.
- 열수 : 정제수 4L 투입, 온도 60℃, 추출시간 16시간
- 30% 에탄올 : 30% 주정 4L 투입, 온도 60℃, 추출시간 16시간
- 70% 에탄올 : 70% 주정 4L 투입, 온도 60℃, 추출시간 16시간
- 100% 에탄올 : 100% 주정 4L 투입, 온도 60℃, 추출시간 16시간
1-2 : 유효성분 함량 확인
각 추출물의 유효성분으로 쿠마린산(p-coumaric acid), 트리신(tricin) 및 카페산(Caffeic acid) 함량을 비교하였다.
| p-coumaric acid (μg/mg) |
Tricin (μg/mg) |
Caffeic acid (μg/mg) |
||
| 왕대 속껍질 |
열수 | 0.1 | 0 | 0.457 |
| 주정 30% | 4.364 | 7.406 | 0.185 | |
| 주정 70% | 4.987 | 20.58 | 0.127 | |
| 주정 100% | 7.034 | 19.225 | 0.258 | |
| 조릿대 속껍질 |
열수 | 0 | 0 | 0.4561 |
| 주정 30% | 2.217 | 5.327 | 0 | |
| 주정 70% | 3.028 | 12.695 | 0 | |
| 주정 100% | 4.002 | 8.890 | 0 | |
| 왕대 잎 |
열수 | 1.557 | 0.325 | 0 |
| 주정 30% | 6.799 | 2.627 | 1.1477 | |
| 주정 70% | 7.345 | 3.094 | 1.2637 | |
| 주정 100% | 9.168 | 4.856 | 4.6300 | |
| 오죽 잎 |
열수 | 1.968 | 0.412 | 62.4704 |
| 주정 30% | 6.944 | 1.149 | 13.3346 | |
| 주정 70% | 10.931 | 5.233 | 22.2112 | |
| 주정 100% | 9.374 | 3.094 | 38.7871 | |
| 조릿대 잎 |
열수 | 1.371 | 0.298 | 0 |
| 주정 30% | 6.502 | 2.538 | 1.3804 | |
| 주정 70% | 6.774 | 4.458 | 1.6943 | |
| 주정 100% | 6.496 | 4.276 | 1.7734 | |
표 2 및 도 1에 나타난 바와 같이, 죽여 추출물의 경우 죽엽에 비해 트리신(tricin)의 함량이 현저하게 높은 것으로 확인되었으며, 특히 왕대 및 조릿대 모두 죽여 추출물에서 쿠마린산(p-coumaric acid) 보다 트리신(tricin)이 상대적으로 함량이 높은 것으로 나타났다. 또한, 쿠마린산(p-coumaric acid)은 100% 주정 추출물에서, 트리신(tricin)은 70% 주정 추출물에서 함량이 높은 것으로 나타났다. 죽여 추출물의 경우 카페산(Caffeic acid) 함량은 미미한 수준인 것으로 확인되었다.
LPS-자극된 미세아교세포에서 죽여 추출물에 의한 염증매개인자 억제 효능 확인
2-1 : NO 발생 억제 효과 확인
본 발명에서는 죽여 추출물의 신경염증 억제 효능을 확인하기 위해, 아질산염(NO) 방출 저해 작용효능을 측정하였으며, 아질산염 농도에 측정은 공지된 방법(Kim, J J, et al., Journal of Ethnopharmacology, 140:213-221, 2012)에 따라 BV-2 세포 생존율을 측정하였다.
BV-2 세포는 불활성화 상태의 5% FBS와 100 units/㎖ 1% penicilline/streptomycin을 첨가한 DMEM 배지에서 습도가 유지되는 5% CO₂, 95% O₂ 조건에서 배양하였다.
구체적으로, BV-2 세포를 96 웰 플레이트에 1×104 세포/웰로 도말(plating)한 다음, 상기 실시예 1에서 추출한 죽여(왕대 속껍질) 30% 주정 추출물의 농도가 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖이 되도록 첨가하였다. 1시간 후에 신경염증 유발 인자인 LPS(200ng/㎖)를 처리한 다음, 24시간 동안 BV-2 세포를 자극하였으며, 이 때 생산되는 아질산염(NO)가 농도 의존적으로 저해효능을 보이는지 분석하였다.
아질산염(NO)의 측정은 그리스(Griess) 시약을 이용한 NO 어세이 키트(NO assay kit; Abcam)를 사용하였으며, 측정 방법은 키트의 사용설명서에 따라 진행하였다. 세포배양액 100 ㎕ 및 그리스 시약을 혼합한 후 10분간 반응시키고 540 nm의 흡광도에서 관찰하였으며, 농도는 표준곡선(standard curve)을 이용하여 최종 확인하였다.
그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, LPS를 BV-2 세포에 처리할 경우, 대조군 대비 NO 생성이 현저하게 증가하였으나, 죽여 추출물 처리에 의해 LPS에 의해 자극 받은 NO 생성이 억제되는 것을 확인하였다.
2-2 : 프로스타글라딘 E
2
(PEG
2
, Prostaglandin E
2
) 생성 억제 효능
본 발명에서는 죽여 추출물의 신경염증 억제 효능을 확인하기 위해, 프로스타글라딘 생성 정도를 측정하였다. 프로스타글라딘은 COX-1 과 COX-2의 작용을 받아 생성되며, 프로스타글라딘에 의해 혈관이 확장되고, 이런 자극들이 신경세포를 자극해서 통증을 발생시키는 원인이된다.
프로스타글라딘은 Prostaglandin E2 Parameter assay kit (R&D SYSTEM)을 이용하여, 제조사의 사용설명서를 바탕으로 분석하였다. 간략하게, 세포배양액 100㎕를 Horseradish Peroxidase (HRP)-labeled PGE2와 경쟁시키기 위해 항체와 반응시키고 발색을 유도하였다. 흡광도 450nm에서 측정하였으며, 농도는 표준곡선을 이용하여 최종 확인하였다.
그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, LPS에 의해 생성이 증가한 프로스타글라딘은 죽여 추출물 농도 의존적으로 생성이 감소하는 것을 확인하였다.
LPS-자극된 미세아교세포에서 죽여 추출물에 의한 iNOS, COX-1 및 COX-2 발현 억제 효능 확인
본 발명에서는 죽여 추출물염증반응 매개인자인 iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-1(cyclooxygenase-1) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)의 mRNA 및 단백질 발현 억제 효능을 확인하였다.
3-1 : mRNA 발현 수준 확인
BV-2 세포를 각 웰당 5 × 106 세포/웰 이 되도록 6-웰 플레이트에 분주하여 하룻밤 동안 배양한 다음, 죽여 추출물의 농도가 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖이 되도록 첨가하였다. 1시간 후에 신경염증 유발 인자인 LPS(200ng/㎖)를 처리한 다음, 6시간 동안 BV-2 세포를 자극시킨 다음, TRIzol 시약((Invitrogen Life Technologies, 미국)을 사용하여 제조회사 메뉴얼에 따라 전체 RNA를 분리하였다. RT(reverse transcription) PCR은 시료를 1㎍/㎕의 농도가 되도록 하고, ReverTra Ace (TOYOBO, JAPAN)의 cDNA 합성법에 따라 cDNA를 합성 한 후, 각 PCR반응은 cDNA 2㎕ (0.5㎍/㎕)를 사용하여 수행하였다.
| 프라이머 서열(5'-3') | 서열 번호 |
|
| iNOS | F: 5'-GAG GTA CTC AGC GTG CTC CA-3' | 1 |
| R: 5'-AGG GAG GAA AGG GAG AGA GG-3' | 2 | |
| GAPDH | F: 5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3' | 3 |
| R: 5'-CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG-3' | 4 |
PCR은 AccuPower®RocketPlex RT-PCR PreMix (BIONEER)를 이용하여 수행하였으며, 변성(94 ℃, 5분), 증폭 20 ~ 28 사이클(94 ℃에서 30초, 50 ~ 57 ℃ 에서 1분 및 72 ℃에서 1분) 및 연장(72 ℃에서 5분)으로 수행하였으며, PCR 증폭물은 1% 아가로스겔을 사용하여 분석하였다. GAPDH mRNA는 샘플 로딩 및 mRNA 무결성(integrity)에 대한 내부 컨트롤의 역할을 수행한다.
3-2 : 단백질 발현 수준 확인
BV-2 세포를 각 웰당 5 × 106 세포/웰 이 되도록 6-웰 플레이트에 분주하여 하룻밤 동안 배양한 다음, 죽여 추출물의 농도가 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖이 되도록 첨가하였다. 1시간 후에 신경염증 유발 인자인 LPS(200ng/㎖)를 처리한 다음, 18시간 동안 BV-2 세포를 자극시킨 다음, 단백질을 분리하였다.
단백질의 동정은 세포를 샘플 완충액(글리세롤, 10% SDS, 0.5M Tris-Hcl)를 이용하여 동정하였다. 동일량의 단백질을 10% SDS-PAGE에 전기영동 한 후, 0.2㎛ 니트로셀룰로오스 (NC: GE Healthcare Life Sciences)를 사용하여 겔에서 멤브레인에 옮겼다.
1차 항체로 항-β-액틴 항체, 항-COX-1 항체, 항-COX-2 항체(1:2000; Santa Cruz) 및 항-iNOS 항체(1:2000; Cell Signaling)를 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응 시켰다. 그 다음, PBS로 3회 이상 세척한 후, 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase; HRP)가 부착된 2차 항체를 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 멤브레인은 ECL 검출 키트(detection kit) 또는 Femto(Thermo, 미국)로 반응시킨 후, 발광 영상 분석기(Luminescent Image Analyzer; LAS-3000, 미국)를 사용하여 영상화하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, LPS를 BV-2 세포에 처리할 경우, 대조군 대비 iNOS 발현이 현저하게 증가한 반면, 죽여 추출물을 전처리한 경우 iNOS mRNA 및 단백질 발현 수준이 억제되는 것을 확인하였다.
또한, 도 4에 나타난 바와 같이, LPS를 BV-2 세포에 처리할 경우, 대조군 대비 COX-2 발현이 현저하게 증가한 반면, 죽여 추출물을 전처리한 경우 COX-2 단백질 발현 수준도 억제되는 것을 확인하였다. 반면, 죽여 추출물에 의한 COX-1 단백질 발현 변화는 관찰되지 않았다.
LPS-자극된 미세아교세포에서 죽여 추출물에 의한 전염증성 사이토카인 발현 억제 효능 확인
염증성 사이토카인의 생성의 증가는 뇌로 백혈구가 이동하는 것을 촉진시키는 케모카인의 분비, 부착분자의 유도 및 BBB(Blood Brain Barrier)의 파괴를 통해 중추신경계에서 염증발달에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 발명에서는 LPS로 자극된 BV-2 세포에 죽여 추출물을 농도별로 처리하였을 때 IL-1β, IL-6, TNF-α를 포함하는 전염증성 사이토카인(cytokines)의 생성 및 mRNA 발현이 억제되는지 확인하였다.
상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 BV-2 세포를 배양한 다음, 세포에서 mRNA를 분리하였으며, 합성된 cDNA를 주형으로 하여 각 표적에 대한 PCR을 수행하였다. 또한, IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성정도는 각각의 ELASA 키트를 이용하여 측정하였다.
| 프라이머 서열(5'-3') | 서열 번호 |
|
| IL-6 | F: 5'-TGA TGC ACT TGC AGA AAA CA-3' | 5 |
| R: 5'-ACC AGA GGA AAT TTT CAA TAG GC-3' | 6 | |
| IL-1β | F: 5'-TGT GAA ATG CCA CCT TTT GA-3' | 7 |
| R: 5'-GGT CAA AGG TTT GGA AGC AG-3' | 8 | |
| TNF-α | F: 5'-AGG GAG AGT GGT CAG GTT GC-3' | 9 |
| R: 5'-CAG CCT GGT CAC CAA ATC AG-3' | 10 | |
| GAPDH | F: 5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3' | 3 |
| R: 5'-CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG-3' | 4 |
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, BV-2 세포를 LPS로 자극을 주면 TNF-α, IL-1β 및 IL-6와 같은 염증성 사이토카인의 레벨이 증가하는 반면, 죽여 추출물 농도 의존적으로 사이토카인의 유전자 발현이 감소하였으며, 이에 따라 생성된 사이토카인 농도 역시 감소한 것을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 죽여 추출물은 LPS에 의해 자극을 받은 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 확인하였으며, 이러한 억제는 전사단계에서 이루어지는 것을 확인하였다.
LPS-자극된 미세아교세포에서 죽여 추출물에 의한 NF-κB 활성 억제 효능 확인
LPS는 NF-κB 활성화를 통해 iNOS 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려져있다. 이에 죽여 추출물이 NF-κB 신호전달체계의 활성화를 억제하는지 알아보기 위하여, 죽여 추출물이 LPS에 의해 유도된 BV-2 세포에서 IκBα 분해 억제 효능을 보이는지 확인하였다.
BV-2 세포를 각 웰당 5 × 106 세포/웰 이 되도록 6-웰 플레이트에 분주하여 12시간 동안 배양한 다음, 죽여 추출물의 농도가 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖이 되도록 첨가하였다. 1시간 후에 신경염증 유발 인자인 LPS(200ng/㎖)를 처리한 다음, 30분 동안 BV-2 세포를 자극시킨 다음, 단백질을 분리하여 웨스턴블랏을 수행하였다.
단백질 분리 및 웨스턴블랏은 상기 실시예3-2와 동일한 방법으로 수행하였으며, 1차 항체는 항-IκB-α 항체 및 항-β-actin 항체(1:2000; Sigma-Aldrich, 미국)를 이용하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 죽여 추출물에 의해 LPS-자극된 BV-2 세포에서 IκB-α 분해가 현저하게 약화되는 것을 확인하였다. 이를 통해, LPS-자극된 BV-2 세포에서 죽여 추출물에 의해 NO 생성과 염증성 사이토카인의 생성이 억제되는 것은 NF-κB 또는 MPAK 신호전달체계 차단에 의한 것임을 유추할 수 있다.
죽여 추출물의 아세틸콜린에스터라아제 저해 효능 확인
뇌혈관 내에 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholine esterase, AChE)의 농도가 증가할수록 신경세포의 콜린성 신경전달물질이 결핍되어 기억 및 인지기능장애를 유발할 수 있다고 보고되고 있으므로 AChE 저해활성 측정은 치매 예방 및 치료 또는 인지능 향상을 위한 약물 또는 건강기능성 원료의 개발의 도구로 사용될 수 있다. 이에, 본 발명에서 죽여 추출물 또는 정제분획을 이용하여 AChE 저해활성을 측정하였다.
AChE 저해활성은 엘먼의 결합효소 분석(Ellman’s coupled enzyme assay)방법을 일부 수정하여 실시하였다. 구체적으로, 96-웰 플레이트에 100mM 인산 완충액(Phosphate buffer, pH 8) 170 ㎕, 2mM DTNB(dithiobisnitrobenzoic acid) 20 ㎕ 및 죽여 추출물 20 ㎕을 혼합한 다음, 20 ㎕의 AChE(0.25U/buffer ㎖)를 첨가하고 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 3.75mM 아세틸콜린 요오드(acetylcholine Iodide) 기질용액을 첨가하였다. 효소 반응액을 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 410nm의 UV-VIS 마이크로리더(UV-VIS microreader)에서 흡광도를 측정하였으며, 기질과 시료가 포함되지 않은 대조군의 흡광도(Ac)와 시험군의 흡광도(As)를 비교하여 AChE 저해활성을 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였다.
[수학식 1]
AChE 저해활성(%) = [1-(As/Ac)] X 100
Ac: 대조군의 흡광도, As: 시료군의 흡광도
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 죽엽 메탄올 추출물과 죽엽 부탄올(n-butanol) 분획 추출물은 아세틸콜린에스터아라제의 활성을 감소시키는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 죽여 추출물이 인지기능 개선 및 치매 질환 치료제로 사용가능한 것을 의미한다.
죽여 추출물 농도에 따른 세포독성 및 NO 발생 억제 확인
죽여 추출물 농도에 따른 세포 독성 정도를 측정하기 위해 공지된 방법(Kim, J J, et al., Journal of Ethnopharmacology, 140:213-221, 2012)에 따라 BV-2 세포 생존율을 측정하였다.
세포 배양 및 NO 발생 측정은 상기 실시예 2-1과 동일하게 수행하였으며, 죽여 추출물의 농도는 죽여 추출물 농도가 15.6 ㎍/㎖, 31.25 ㎍/㎖, 62.5 ㎍/㎖, 125 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖ 및 500 ㎍/㎖이 되도록 첨가하였다.
죽여 추출물의 세포 독성 검사는 MTT 측정법을 이용하였으며, 구체적으로 LPS 자극 24시간 후에 상등액을 제거한 다음, MTT(500 ㎍/㎖)을 포함한 DMEM 배지를 각 웰에 첨가하여 37℃에서 4시간 배양하였다. 배양 후, 상등액을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide); Compound Diluent/(1%) Vehicle control, Sigma, 미국)를 각 웰에 첨가하여 포마잔(formazan)을 용해하였다. 마이크로 플레이트 판독기(Tecan Trading AG, 스위스)를 이용하여 550 ㎚에서 광학 밀도를 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 죽여 추출물 125 ㎍/㎖ 농도까지는 농도 의존적으로 NO 발생을 억제하며, 250 ㎍/㎖ 및 500 ㎍/㎖ 농도에서는 세포 독성을 보이는 것을 확인하였다. 이를 토대로, 동물실험에 사용되는 죽여 추출물의 농도를 100 mg/kg로 결정하였다.
스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에서 죽여 추출물의 인지기능 개선 효능 확인 - 수동회피능력실험 (Passive avoidance test)
본 발명에서는 죽여 추출물의 기억력 증진 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료에 대한 효과를 확인하기 위해, 스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에 죽여 추출물을 투여하였다.
수컷 C57BL/6 마우스 (25 g, 8주령)는 대한바이오링크에서 구입하였다. 이들을 4개의 그룹으로 나누어 표준조건 하에서 1주 순화하였으며 이후 실험에 사용되었다 (온도 22±2 ℃, 습도 55±5 %, 12 h-명/암 사이클, 음식/물 자유식). 모든 실험은 실험동물관리기준(NIH publication No. 85-23, revised 1985)의 가이드라인과 건국대학교 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 수행하였다.
1) vehicle (무처리군, 음성대조군),
2) 스코폴라민(Scopolamine) 2 mg/kg 처리군
3) 스코폴라민(Scopolamine) 2 mg/kg + 죽여 에탄올 추출물 100 mg/kg 처리군
4) 스코폴라민(Scopolamine) 2 mg/kg + 타크린(tacrine, TAC) 처리군(양성대조군)
모든 처리군은 생리적 식염수에 녹여 사용하였다. 죽여 에탄올 추출물 및 타크린은 스코폴라민 처리 전 7일 동안 100 mg/kg씩 매일 마우스에 경구투여하였으며, 스코폴라민 2 mg/kg는 복강주사를 통하여 투여하였다.
기억력 평가를 위해 수동 회피 실험을 진행하였으며, 수동 회피 행동을 위한 훈련 및 시험을 위해서는 두 개의 동일한 명/암 정방형 상자를 가진 미국 GEMINI 사(San Diego Instruments, San Diego, 미국)의 수동 회피 실험 시스템(Active and passive avoidance system)을 사용하였다. 이러한 장치는 명 챔버(밝은 방)과 암 챔버(어두운 방)을 가지고 있으며, 컴퓨터로 조절되는 문에 의해 구분된다. 마우스를 밝은 방에 넣은 후 빛을 주어 어두운 방으로 가게 한 후 전류를 통하게 하여 마우스가 이를 기억하게 하였으며, 마우스가 어두운 방으로 들어갈 때까지의 시간을 학습시험(acquisition trial)이라고 정의하였다.
마우스가 어두운 방으로 들어가면 문이 자동으로 닫히고 5초간 0.5 mA의 전기적 발 쇼크(Electrical foot shock)를 준다. 이때, 밝은 방에서 어두운 방으로 회피하는데 걸리는 시간 TLT(Transfer latency time)을 컴퓨터를 통해 기록, 저장하였으며, 전기적 쇼크 및 문의 개폐는 부착된 장치 시스템에 의해 조절되었다. 마우스가 어두운 방으로 들어가는데 걸리는 시간(latency time; 머무름 시간)을 300초 까지 측정하였으며, 어두운 방으로 가는데 걸리는 시간이 길수록 쥐의 학습과 기억이 좋음을 나타낸다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 스코폴라민 처리에 의해 밝은 방(명 챔버)에서 어두운 방(암 챔버)으로 이동을 회피하는데 걸리는 시간(TLT)이 음성대조군에 비해 현저하게 감소하였으나, 죽여 에탄올 추출물 투여에 의해 타크린 처리군과 유사한 수준으로 TLT가 증가한 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 죽여 에탄올 추출물이 인지기능 개선 효능이 있음을 의미한다.
스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에서 죽여 추출물의 공간지각능력 개선 효능 확인 - Y-미로 실험(Y-maze test)
본 발명에서는 죽여 추출물에 의한 기억력 증진에 대한 효과를 확인하기 위하여 Y-미로 실험(Y-maze test)을 수행하였다. 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에 죽여 추출물을 투여한 다음, 스코폴라민 투여 30분 후에 실험을 수행하였다.
Y-미로실험의 장치는 3개의 가지(각 가지를 A, B, C로 정함)로 구성되어 있으며 각 가지(arm)의 통로 길이는 40 cm, 폭은 12 cm, 높이는 30 cm이고 세 개의 가지가 인접한 가지와 접하는 각도는 120도이고 모든 실험 장치는 폴리비닐 플라스틱(polyvinyl plastic)으로 구성되어 있다. 미로의 중앙에 마우스를 조심스럽게 놓고 7분 동안 자유롭게 움직이게 한 다음 마우스가 들어간 가지를 기록하였는데, 마우스가 꼬리까지 완전히 들어갔을 경우에 한하며, 반복하게 가지에 다시 들어간 경우에도 기록하였다. 각 가지에 들어간 횟수 및 순서를 측정하여 마우스의 총 입장횟수(Total arm entry) 및 변경 행동력 점수(alteration, %)를 평가하였다. 변경 행동력 점수는 3개의 가지를 순차적으로 들어가는 경우, 즉 ABC, BCA, CAB 등으로 정의하였으며, 하기 수학식 2로 계산하였다.
[수학식 2]
% alteration = [총 alteration 수]/[arm에 들어간 총 횟수-2] X 100
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 각 그룹의 마우스의 총 입장횟수(Total arm entry)는 유의성이 나타나지 않았다. 반면, Y-미로 실험 장치를 이용한 변경 행동력(Alternation behavior) 실험에서는 스코폴라민 처리 30분 후 변경 행동력이 유의성 있게 감소하였으며, 죽여 에탄올 추출물과 타크린을 전처리한 마우스 그룹에서는 변경 행동력 감소가 개선된 것을 확인하였다.
스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에서 죽여 추출물의 산화 스트레스 개선 효능 확인
본 발명에서는 죽여 에탄올 추출물이 기억력 손상과 관련된 산화 스트레스 개선 효능을 확인하기 위해 죽여 추출물이 투여된 마우스의 해마(Hippocampus)와 대뇌피질(Cerebral cortex)에서 항산화 효소 및 지질과산화 효소 활성을 확인하였다.
실험은 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 수행하였으며, 스코폴라민 투여 60분 후에 마우스를 희생시켜 마우스 뇌를 적출하였다.
그 후 마우스의 뇌로부터 조심스럽게 해마(Hippocampus)와 대뇌피질(Cerebral cortex) 부분을 분리하여 항산화 효소인 SOD(Superoxide Dismutase), CAT(Catalase) 및 GPx(Glutathione peroxidase) 활성과 지질과산화 지표가 되는 MDA(Malondialdehyde) 수준을 측정하였다.
SOD, CAT, GPx 및 MDA 활성을 측정하기 위해, 10 %(w/v) 0.1 M 인산완충액(Phosphate buffer)을 이용하여 뇌 조직 균질 추출물을 준비하였으며, 각각 슈퍼옥시드 디스무타아제 검출 키트(superoxide dismutase assay kit; Cell Biolabs, 미국), 카탈라아제 검출 키트(catalase assay kit; Cell Biolabs, 캐나다), GPx 색도 측정 키트(GPx colorimetric assay kit; BioVision, 미국) 및 MDA 검출 키트(Lipid Peroxidation (MDA) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit; BioVision, 미국)을 이용하여 측정하였다. SOD는 490 nm, CAT는 520 nm, GPx는 340 nm의 파장으로 측정하였으며, MDA는 410 nm의 파장으로 측정하였다.
그 결과, 도 11a ~ 도 11c에 나타난 바와 같이, 스코폴라민 투여에 의해 감소된 항산화 효소 활성이, 죽여 에탄올 추출물에 의해 SOD, CAT 및 GPx 활성이 향상되었으며, 뇌의 대뇌 피질과 해마 부분에서 동일하게 증가하는 것으로 확인되었다.
지질 과산화는 생체외적인 요인뿐 아니라 내적인 요인에 의해 생성된 산소 자유라디칼이 관여함으로써 야기된다. 뇌는 산화적 반응이 쉬운 다중 불포화지방산의 함량이 높고, 체내산소 소모량이 다른 장기에 비하여 많아 산화적 손상을 받기 쉬우며, 이로 인한 지질 과산화물의 축적은 세포기능 이상을 야기하며 중추신경계의 기능을 퇴화시키는 것으로 알려져 있다.
죽여 추출물에 의한 지질 과산화 수준을 확인한 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 스코폴라민 투여에 의해 증가된 지질 과산화 수준이 죽여 에탄올 추출물에 의해 감소하였으며, 뇌의 대뇌 피질과 해마 부분에서 동일하게 감소하는 것으로 확인되었다.
스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에서 죽여 추출물의 신경염증 개선 효능 확인
본 발명에서는 죽여 추출물에 의해 스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델의 신경 염증이 개선되는지 확인하였다.
상기 실시예 10에서 추출한 마우스 해마(Hippocampus)와 대뇌피질(Cerebral cortex) 조직을 이용하여 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6와 항염증과 관련된 사이토카인인 IL-10 수준을 확인하였다. 사이토카인 생성 정도는 각각의 ELASA 키트를 이용하여 제품 메뉴얼에 따라 측정하였다.
그 결과, 도 13a ~ 도 13c에 나타난 바와 같이, 스코폴라민 처리에 의해 증가한 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 수준 죽여 추출물 투여에 의해 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 또한, 도 13d에 나타난 바와 같이, 항염증 사이토카인인 IL-10은 스코폴라민 처리에 의해 감소하였으나, 죽여 추출물에 의해 증가한 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 죽여 추출물에 의해 신경염증이 개선되는 것을 확인하였다.
<110> GLOCAL Industry-Academic Cooperation Foundation Konkuk Universit
<120> COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OFNEURODEGENERATIVE
DISEASE OR COGNITIVE DYSFUNCTIONCOMPRISING BAMBOO INNER BARK
EXTRACT
<130> PDPC214305k01
<150> KR 10-2021-0083089
<151> 2021-06-25
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS_forward primer
<400> 1
gaggtactca gcgtgctcca 20
<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS_reverse primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH_forward primer
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accacagtcc atgccatcac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> GAPDH_reverse primer
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<220>
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<223> TNF-a_reverse primer
<400> 10
cagcctggtc accaaatcag 20
Claims (14)
- 죽여 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 죽여 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 죽여는 왕대 속껍질 또는 조릿대 속껍질인 것을 특징으로 하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 죽여 추출물에는 쿠마린산(p-coumaric acid) 또는 트리신(tricin) 성분이 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 죽여 추출물은
ⅰ) NO, 프로스타글라딘 E2, iNOS 및 COX-2를 포함하는 염증반응 매개인자(inflammatory mediators) 생성 억제;
ⅱ) IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 포함하는 염증성 사이토카인(cytokines) 생성 억제; 및
ⅲ) IκB-α 인산화 및 분해 억제;를 통해 신경염증을 조절하는 것을 특징으로 하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 신경염증 질환은 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증 또는 근위축성측색경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 죽여 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품용 조성물.
- 죽여 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 죽여 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 죽여는 왕대 속껍질 또는 조릿대 속껍질인 것을 특징으로 하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 죽여 추출물에는 쿠마린산(p-coumaric acid) 또는 트리신(tricin) 성분이 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 죽여 추출물은
ⅰ) 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase; AChE) 저해 활성;
ⅱ) 항산화 활성;
ⅲ) 지질과산화물 축적 억제 활성; 및
ⅳ) IL-1, IL-6, 및 TNF-α를 포함하는 염증성 사이토카인(cytokines) 생성 억제 활성, 및 IL-10을 포함하는 항염증성 사이토카인 생성 촉진 활성;을 통해 기억력 및 인지 기능을 개선 시키는 것을 특징으로 하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 기억력 및 인지 기능 장애는 경도인지장애, 주의력 결핍장애(ADHD), 우울증, 알츠하이머병, 뇌혈관성 치매, 노인성 치매, 픽(pick)병 및 크루츠펠트-야곱(Creutzfeldt-jakob)병으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 죽여 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 개선용 건강기능식품용 조성물.
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