KR20220164733A - 마이코플라즈마 뉴모니에의 면역 측정 방법 및 면역 측정 기구 - Google Patents

마이코플라즈마 뉴모니에의 면역 측정 방법 및 면역 측정 기구 Download PDF

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Abstract

마이코플라즈마 뉴모니에의 P1 단백질 및 P30 단백질의 양방에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체로서, 공지의 모노클로날 항체보다 마이코플라즈마 뉴모니에의 P1 단백질 및 P30 단백질에 대한 치환성이 높은 모노클로날 항체를 이용한 면역 측정 방법이 개시되어 있다. 면역 측정 방법은 마이코플라즈마 뉴모니에 유래의 P1 단백질과 P30 단백질에 대하여 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체로서, PPQPG로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 마이코플라즈마 뉴모니에 유래의 P1 단백질 및 P30 단백질의 항원 항체 반응을 이용한다.

Description

마이코플라즈마 뉴모니에의 면역 측정 방법 및 면역 측정 기구
본 발명은 마이코플라즈마 뉴모니에의 면역 측정 방법 및 그를 위한 면역 측정 기구, 및 그것에 사용되는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
모노클로날 항체는 특정한 항원만을 인식하기 때문에, 그 특정한 항원의 검출에 널리 사용되고 있다. 예를 들면, 마이코플라즈마 뉴모니에를 면역 측정하는 방법으로서, 마이코플라즈마 뉴모니에의 P30 단백질을 인식하는 모노클로날 항체를 고상에 고정화한 샌드위치법에 의한 면역 측정 방법이 특허문헌 1에 기재되어 있다.
폴리클로날 항체는 다양한 항원이나 항원 결정역을 인식하는 다양한 항체가 혼재한 것이고, 모노클로날 항체는 어떤 특정한 항원의 어떤 특정 영역만을 인식한다고 하는 성질로부터, 폴리클로날 항체와 비교하여 일반적으로 특이성이 높다. 그 한편, 항체와 결합 가능한 항원의 종류와 그 총수에 있어서, 폴리클로날 항체에 대하여, 모노클로날 항체에서 뒤떨어지는 것은 용이하게 상정된다. 이것은 모노클로날 항체 및 그것을 사용한 면역 측정 방법 및 면역 측정 기구에 있어서, 감도가 낮음을 초래한다.
본 출원인은 이 과제를 해결하기 위해서, 먼저, 마이코플라즈마 뉴모니에의 P1 단백질 및 P30 단백질의 양방에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 발명하고, 특허 출원했다(특허문헌 2).
WO 2015/025968 WO 2016/194797
특허문헌 2에 기재되어 있는 모노클로날 항체는 단일의 모노클로날 항체에서 마이코플라즈마 뉴모니에의 P1 단백질 및 P30 단백질의 양방에 특이적으로 결합하는 유용한 것이지만, P1 단백질 및 P30 단백질에 대한 친화성이 보다 높은 모노클로날 항체가 있으면, 면역 측정의 감도를 더욱 향상시킬 수 있으므로 유리한 것은 말할 필요도 없다.
본 발명의 목적은 마이코플라즈마 뉴모니에의 P1 단백질 및 P30 단백질의 양방에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체로서, 특허문헌 2에 기재되어 있는 모노클로날 항체보다 마이코플라즈마 뉴모니에의 P1 단백질 및 P30 단백질에 대한 친화성이 높은 신규한 모노클로날 항체, 및 상기 모노클로날 항체를 사용한 마이코플라즈마 뉴모니에의 면역 측정 방법 및 그를 위한 면역 측정 기구를 제공하는 것이다.
본원 발명자들은 예의 연구의 결과, 마이코플라즈마 뉴모니에 유래의 P1 단백질과 P30 단백질에 대하여 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체로서, PPQPG로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체를 사용함으로써, 특허문헌 2에 기재된 모노클로날 항체를 사용하는 면역 측정 방법보다 고감도로 마이코플라즈마 뉴모니에를 측정 가능한 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하의 것을 제공한다.
(1) 마이코플라즈마 뉴모니에 유래의 P1 단백질과 P30 단백질에 대하여 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체로서, PPQPG로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 마이코플라즈마 뉴모니에 유래의 P1 단백질 및 P30 단백질의 항원 항체 반응을 이용한 마이코플라즈마 뉴모니에의 면역 측정 방법.
(2) 상기 펩티드의 아미노산 서열이 PPQPGFPPKR 또는 GMPPQPGFPPKR인 (1) 기재의 면역 측정 방법.
(3) 상기 모노클로날 항체 또는 그 항원 결합성 단편이 표식 또는 고상의 적어도 어느 일방에 사용되는 상기 면역 측정 방법이 샌드위치법인 (1) 기재의 방법.
(4) 상기 면역 측정 방법이 면역 크로마토그래피법인 (2) 기재의 방법.
(5) 상기 모노클로날 항체에 의해 인식되는 상기 2종류 이상의 항원이 복합체를 형성하고 있는 (1)∼(4) 중 어느 1항에 기재된 방법.
(6) (1) 기재의 방법을 행하기 위한 면역 측정 기구로서, 상기 모노클로날 항체 또는 그 항원 결합성 단편이 표식 또는 고상 중 적어도 어느 일방에 사용되는, 면역 측정 기구.
(7) 면역 크로마토 시험편인 (6) 기재의 면역 측정 기구.
(8) 상기 피검 대상이 마이코플라즈마 뉴모니에인 (6) 또는 (7) 기재의 면역 측정 기구.
(9) 마이코플라즈마 뉴모니에 유래의 P1 단백질과 P30 단백질에 대하여 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체로서, PPQPG로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체.
본 발명의 방법은 특허문헌 2에 기재되어 있는 방법보다 검출 감도가 개선되어 있다. 또한, 본 발명에 의해, 본 발명의 신규한 검출 방법에 사용하는 면역 측정 기구 및 모노클로날 항체가 제공되었다.
본 발명의 방법에 의해 검출되는 피검 대상은 마이코플라즈마 뉴모니에이고, 항원이 P1 단백질과 P30 단백질이다. 또한, 피검 대상을 정량 또는 반정량인 경우라도, 정량이나 반정량은 필연적으로 「검출」을 수반하므로, 본 발명에서 말하는 「검출」에 포함된다.
본 발명의 방법에서는 상기 2종류의 항원과 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 사용해서 면역 측정을 행한다. 여기서, 「특이적으로 반응한다」란 항원 항체 반응한다,라고 하는 의미이며, 단백질과 상기 항체가 서로 섞이는 액계에 있어서, 상기 항체가 항원의 단백질 성분과 검출 가능한 레벨에서 항원 항체 반응을 일으키지 않거나, 또는 어떠한 결합 반응이나 회합 반응을 일으켰다고 하여도, 상기 항체의 항원과의 항원 항체 반응보다 명백히 약한 반응밖에 일으키지 않는 것을 의미한다.
본 발명의 모노클로날 항체를 기초로, 항원 결합 부위만을 분리시킨 항원 결합성 단편도 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 즉, 공지의 방법에 의해 제작된 Fab, Fab', F(ab'2, 1본쇄 항체(scFv) 등의 특이적인 항원 결합성을 갖는 단편(항원 결합성 단편)을 사용하는 경우도 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 모노클로날 항체의 클래스는 IgG에 한정되지 않고, IgM이나 IgY이어도 좋다.
본 발명의 방법에 사용하는 모노클로날 항체는 공지의 면역학적 방법을 사용하고, 상기 2종류의 항원을 포함하는 복합체나 추출물, 또는 2종류의 항원 중 1개의 항원 또는 그 부분 펩티드를 피면역 동물에게 면역하고, 피면역 동물의 세포를 사용해서 하이브리도마를 제작함으로써 얻을 수 있다. 면역에 사용하는 펩티드의 길이는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 5개 아미노산 이상, 보다 바람직하게는 10개 아미노산 이상의 펩티드를 사용해서 면역원으로 할 수 있다. 면역원은 배양액으로부터 얻을 수도 있지만, 임의의 항원을 코드하는 DNA를 플러스미드 벡터에 조립하고, 이것을 숙주 세포에 도입해서 발현시킴으로써 얻을 수도 있다. 면역원으로 하는 임의의 항원 또는 그 부분 펩티드는 이하에 예시하는 것 같은 단백질과 융합 단백질로서 발현시키고, 정제 후 또는 미정제인채로 면역원으로서 사용할 수도 있다. 융합 단백질의 제작에는 당업자가 「단백질 발현·정제택」으로서 일반적으로 사용하는, 글루타티온 S-트랜스페라아제(GST), 말토오스 결합 단백질(MBP), 티오레독신(TRX), Nus택, S택, HSV택, FRAG택, 폴리히스티딘택 등을 이용할 수 있다. 이들과의 융합 단백질은 소화 효소를 사용해서 임의의 항원 또는 그 부분 펩티드 부분과 그 이외의 택 부분을 절단하고, 분리 정제한 후에 면역원으로서 사용하는 것이 바람직하다.
면역한 동물로부터의 모노클로날 항체의 조제는 주지의 콜러 들의 방법(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))에 의해 용이하게 행할 수 있다. 즉, 면역한 동물로부터, 비세포나 림프구 등의 항체 산생 세포를 회수하고, 이것을 통상의 방법에 의해 마우스 골수종 세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제작하고, 얻어진 하이브리도마를 한계희석법 등에 의해 클로닝하고, 클로닝된 각 하이브리도마가 산생하는 모노클로날 항체 중 동물의 면역에 사용한 항원과 항원 항체 반응하는 모노클로날 항체를 선택한다.
본 발명의 방법에 사용하는 모노클로날 항체는 2종류의 항원을 인식하는 것이기 때문에, 이렇게 하여 선택된 2종류의 항원 중 하나를 인식하는 모노클로날 항체에 대해서, 또한, 다른 하나의 항원을 인식하는 모노클로날 항체를 스크리닝한다. 본 발명의 방법에 사용하는 모노클로날 항체는 이렇게 하여 얻어지는 2종류의 항원의 양방을 인식하는 모노클로날 항체로서, PPQPG(서열번호 1)로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 스크리닝에 사용하는 펩티드로서는 PPQPG로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이고, 예를 들면, 아미노산 서열이 PPQPGFPPKR(서열번호 2)로 이루어지는 펩티드 및 GMPPQPGFPPKR(서열번호 3)로 이루어지는 펩티드를 사용할 수 있다.
복수나 배양 상청으로부터의 모노클로날 항체의 정제는 공지의 면역 글로블린 정제법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 황산 암모늄이나 황산 나트륨을 사용한 염석에 의한 분획법, PEG 분획법, 에탄올 분획법, DEAE 이온 교환 크로마토그래피법, 겔 여과법 등이 열거된다. 또한, 면역동물종과 모노클로날 항체의 클래스에 따라서, 프로틴 A, 프로틴 G, 프로틴 L 중 어느 하나를 결합시킨 담체를 사용한 어피니티 크로마토그래피법에 의해서도 정제하는 것이 가능하다.
본 발명의 면역 측정 방법에서는 상기한 바와 같이 해서 제작한 2종류의 항원과 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체 또는 그 항원 결합성 단편(이하, 실시예 전까지의 기술에 있어서, 문맥으로부터 그렇지 않은 것이 명확할 경우를 제외하고, 「항체」는 「항체 또는 그 항원 결합성 단편」을 의미한다)과 검체 중의 마이코플라즈마 뉴모니에와의 항원 항체 반응을 이용한 면역 측정에 의해 측정한다. 이를 위한 면역 측정법으로서는 경합법, 응집법, 웨스턴 블롯법, 면역 염색법, 샌드위치법 등, 당업자에게 있어서 주지의 모든 방법을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 「측정」에는 정량, 반정량, 검출의 모두가 포함된다.
면역 측정으로서는 샌드위치법이 바람직하다. 샌드위치법 자체는 면역 측정의 분야에 있어서 주지이고, 예를 들면 면역 크로마토그래피법이나 ELISA법에 의해 행할 수 있다. 이들의 샌드위치법 자체는 모두 주지이고, 본 발명의 방법은 상기한 본 발명의 2종류 이상의 항원을 인식하는 모노클로날 항체를 사용하는 것 이외는 주지의 샌드위치법에 의해 행할 수 있다.
샌드위치법에는 항원을 인식하는 2종류의 항체(고상에 고정화되는 항체와, 표식 항체)가 사용되지만, 본 발명의 방법에서는 이들의 2종류의 항체 중 적어도 어느 일방이 상기한 2종류의 항원을 인식하는 모노클로날 항체이다. 후술하는 바와 같이, 고상에 고정화되는 항체는 단위 면적당에 고정화 가능한 항체량이 한정되어 있으므로, 감도 향상이라고 하는 본 발명의 목적을 보다 양호하게 달성하기 위해서는 적어도 고정화 항체에 상기한 2종류의 항원을 인식하는 모노클로날 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 단일의 분자 또는 단일의 복합체 중에, 상기 모노클로날 항체에 의해 인식되는 항원이 적어도 2종류 존재하는 경우에는 단일 종류의 상기 모노클로날 항체를 고상화 항체 및 표식 항체로서 사용해서 샌드위치법을 행하는 것도 가능하다.
샌드위치법을 검출 원리로 하는 면역 측정에 있어서, 항체가 고정화되는 고상으로서는 항체를 공지 기술에 의해 고정 가능한 것은 모두 사용할 수 있고, 예를 들면, 모세관 작용을 갖는 다공성 박막(멤브레인), 입자상 물질, 시험관, 수지 평판 등 공지의 것을 임의로 선택할 수 있다. 또한, 항체를 표식하는 물질로서는 효소, 방사성 동위체, 형광 물질, 발광 물질, 유색 입자, 콜로이드 입자 등을 사용할 수 있다. 상술의 다양한 재료에 의한 면역 측정법 중에서도, 특히 임상 검사의 간편성과 신속성의 관점에서, 멤브레인을 사용한 래터럴 플로우식의 면역 측정법이 바람직하다.
본 발명에서는 2종류 이상의 항원을 인식하는 모노클로날 항체를 사용해서 래터럴 플로우식으로 면역 측정을 행할 수 있는 면역 측정 기구도 제공한다. 본 발명이 제공하는 면역 측정 기구는 측정 대상물(항원)을 포착하는 항체(항체 1)가 고정화된 검출 영역을 갖는 지지체, 이동 가능한 표식 항체(항체 2)를 갖는 표식체 영역, 검체를 적하 첨가하는 샘플 패드, 전개된 검체액을 흡수하는 흡수대, 이들 부재를 1개에 부착하기 위한 배킹 시트로 이루어지고, 항체 1 및 항체 2 중 적어도 일방이 본 발명의 2종류 이상의 항원을 인식하는 모노클로날 항체인 면역 측정 기구이다.
또한, 검출 영역의 수 및 표식체 영역에 포함되는 표식 항체의 종류는 1에 한정되는 것이 아니고, 복수의 측정 대상물에 대응하는 항체를 사용함으로써, 2 이상의 항원을 동일한 면역 측정 기구로 검출할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해, 면역 측정의 감도가 향상하는 원리는 이하와 같다라고 생각된다. 샌드위치법에 있어서는 고상에 고정화된 항체가 사용되지만, 고상의 단위 면적당에 고정화 가능한 항체의 양은 한정되어 있다. 또한, 항원 항체 반응의 시간도 한정되어 있다. 특히, 면역 크로마토그래피법에서는 검체 또는 검체를 사용해서 조제된 시료(검체의 희석물 등)가 상류로부터 흘러 나와서 검출 영역을 통과하는 동안에만 항원 항체 반응이 행해지므로, 이 시간 내에 항체에 결합할 수 없었던 항원은 그대로 검출 영역보다 하류로 흘러가서, 검출되는 경우는 없다. 검체 중의 항원량이 적은 경우에는 고상화 항체로서, 1종류의 항원을 인식하는 1종류의 모노클로날 항체를 사용하기(통상의 샌드위치법)보다, 2종류 이상의 항원을 인식하는 모노클로날 항체를 사용한 경우쪽이, 항체에 결합하는 항원의 양이 증가하므로, 감도가 향상된다. 또한, 고상화 항체로서, 각각 1종류의 항원을 인식하는 모노클로날 항체를 2종류 조합시켜서 사용한 경우, 고상화되는 각 모노클로날 항체의 양은 각각, 전 고상화 항체량의 절반이기 때문에, 항원 항체 반응의 시간이 짧을 경우에는 어떤 항원이, 이 항원과 결합 가능한 모노클로날 항체와 소정의 방향에서 충돌해서 결합할 확률은, 고상화 항체의 전부가 그 항원을 인식하는 모노클로날 항체인 경우와 비교하면 1/2이 된다. 한편, 2종류 이상의 항원을 인식하는 모노클로날 항체를 사용하는 경우에는 2종류 이상의 항원의 어느 것이라도, 고상화 항체와 소정의 방향으로 충돌하면 항체와 결합하므로, 고상화 항체에 포착되는 항원량은 각각 1종류의 항원을 인식하는 모노클로날 항체를 2종류 조합시켜서 사용하는 경우보다 많아지고, 따라서 면역 측정의 감도가 향상한다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 항마이코플라즈마 뉴모니에 모노클로날 항체의 제작
1. 마이코플라즈마 뉴모니에 항원의 조제
마이코플라즈마 뉴모니에를 배양하고, 그 배양액을 60℃, 30분 간의 열처리로 불활화한 것의 항원으로서 사용했다.
2. 항마이코플라즈마 뉴모니에 모노클로날 항체의 제작
상기 1.의 마이코플라즈마 불활화 항원을 BALB/c 마우스에 면역하고, 일정 기간 사육한 마우스로부터 비장을 적출하고, 콜러들의 방법(Kohler et al., Nature, vol,256, p495-497(1975))에 의해 마우스 골수종 세포(P3×63)와 융합했다. 얻어진 융합 세포(하이브리도마)를 37℃ 인큐베이터 중에서 유지하고, 마이코플라즈마 뉴모니에 P1 항원을 고상한 플레이트와 마이코플라즈마 뉴모니에 P30 항원을 고상한 플레이트를 사용한 ELISA에 의해 상청의 항체 활성을 확인하면서 세포의 순화(단클론화)를 행했다.
그 결과, 표 1에 나타내는 바와 같이 항마이코플라즈마 뉴모니에 P1 항체, 항마이코플라즈마 뉴모니에 P30 항체 및 항마이코플라즈마 뉴모니에 P1·P30 항체를 산생하는 하이브리도마 세포주가 복수 얻어졌다.
Figure pct00001
또한, 이 ELISA에 사용한 P1, P30은 겔 여과 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 조제했다. 취득한 세포주를 프리스탄 처리한 BALB/c 마우스에 복강 투여하고, 약 2주일 후, 항체 함유 복수를 채취했다. 얻어진 복수로부터, 프로틴 A 컬럼을 사용한 어피니티 크로마토그래피법에 의해 IgG를 정제하고, 정제 항마이코플라즈마 뉴모니에 모노클로날 항체를 복수얻었다.
<실시예 2>
[합성 펩티드를 사용한 ELISA법에 의한 에피토프의 해석]
P30의 아미노산 리피트 배열 부위로부터 이하에 나타내는 펩티드를 제작했다.
(합성 펩티드)
펩티드 1-1: GFPPQPGMAP(서열번호 4)
펩티드 1-2: QPGMAPRPGM(서열번호 5)
펩티드 1-3: APRPGMPPHP(서열번호 6)
펩티드 1-4: GMPPHPGMAP(서열번호 7)
펩티드 1-5: HPGMAPRPGF(서열번호 8)
펩티드 1-6: APRPGFPPQP(서열번호 9)
펩티드 1-7: APRPGMQPPR(서열번호 10)
펩티드 1-8: GMQPPRPGMP(서열번호 11)
펩티드 1-9: PGMPPQPGFP(서열번호 12)
펩티드 1-10: PPQPGFPPKR(서열번호 2)
펩티드 1-11: PGMAPRPGMPPH(서열번호 13)
펩티드 1-12: PGMAPRPGFPPQ(서열번호 14)
펩티드 1-13: GMPPQPGFPPKR(서열번호 3)
실시예 1에서 얻어진 모노클로날 항체 P1-30Aab 및 P1-30Bab에 대해서, 상기의 합성 펩티드에 대한 반응을 이하에 나타내는 ELISA법에 의해 평가했다. ELISA법에 의한 측정에는 합성 펩티드를 고상한 96웰 플레이트(NUNC사)를 사용했다. 합성 펩티드(2.0μg/ml)를 상기의 플레이트에 100μl/웰에 첨가하고, 하룻밤 반응시켰다. 그 후, 1×TBS Buffer로 세정하고, Blocking Buffer(1% BSA/TBS)를 200μL/웰에 첨가했다. Blocking Buffer를 버리고, 실시예 1 2.를 희석한 항체를 100μL/웰에 가하고, 30분 간 반응시켰다. 그 후, 1×세정 Bf 200μL로 세정하고, 표식 항체액 HRP 표식 Polyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins(P0260;Dako사)을 100μL/웰에 첨가하고, 2w/v% BSA를 포함하는 TBS(pH 7.0))를 50μl/웰에 첨가하고, 30분 간 반응시켰다. 그 후, Buffer II로 세정하고, HRP의 기질인 OPD를 포함하는 기질액을 100μl/웰에 첨가하고 10분간 정치하고, 2N 황산을 100μl/웰에 첨가해서 반응을 정지시켰다. 각 웰 중의 반응액의 450-630nm의 흡광도를, 마이크로플레이트 리더를 사용해서 측정했다.
그 결과, 모든 항체가 P30의 아미노산 리피트 배열 부위에 대한 반응이 보였다.
모노클로날 항체 P1-30Aab(본 발명의 모노클로날 항체)는 펩티드 1-10 및 1-13에 강하게 반응했다. 또한, 펩티드 1-1 및 1-9에도 반응했다. 이상의 결과로부터, 모노클로날 항체 P1-30Aab는 「PPQPG(Pro-Pro-Gln-Pro-Gly)」를 포함하는 펩티드 배열에 반응성을 갖는 것이 확인되었다. 한편으로 모노클로날 항체 P1-30Bab은 P1에 반응을 나타내지만, P1의 아미노산 서열에는 PPQPG는 존재하지 않고, 대신에 유사한 배열로서 PPHP가 존재한다.
<실시예 3> 마이코플라즈마 뉴모니에를 측정하는 면역 측정 기구
1. 항마이코플라즈마 뉴모니에 항체의 니트로셀룰로오스 멤브레인에의 고정화
실시예 1에서 제작한 항체를 1.0mg/mL가 되도록 정제수로 희석한 액 및 항마우스 IgG 항체를 준비하고, PET 필름으로 뒷댄 니트로셀룰로오스 멤브레인의 샘플 패드측에 항체, 흡수체측에 항마우스 IgG 항체를 각각 선형상으로 도포했다. 그 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인을 45℃, 30분간 건조시켜, 항마이코플라즈마 뉴모니에 항체 고정화 멤브레인을 얻었다. 본 실시예에 있어서 항체 고정화 멤브레인이라고 부른다.
2. 항마이코플라즈마 뉴모니에 항체의 착색 폴리스티렌 입자에의 고정화
실시예 1에서 제작한 항체를 1.0mg/mL가 되도록 정제수로 희석하고, 이것에 착색 폴리스티렌 입자를 0.1%가 되도록 가하고, 교반 후, 카르보디이미드를 1%가 되도록 가하고 더 교반한다. 원심 조작에 의해 상청을 제거하고, 50mM Tris(pH9.0), 3% BSA에 재부유하고, 항마이코플라즈마 뉴모니에 항체 결합 착색 폴리스티렌 입자를 얻었다. 본 실시예에 있어서, 항체 고정화 입자라고 한다.
3. 마이코플라즈마 뉴모니에를 측정하는 시험편의 제작
1에서 제작한 항체 고정화 멤브레인과 타부재(배킹 시트, 흡수체, 샘플 패드)를 부착해서 5mm 폭으로 절단하고, 마이코플라즈마 뉴모니에 시험편으로 했다. 이들을 본 실시예에 있어서, 시험편이라고 한다.
면역 크로마토 감도
<실시예 4> 마이코플라즈마 뉴모니에를 측정하는 면역 측정 기구의 감도 비교
실시예 1에서 얻어진 항 P1-P30 모노클로날 항체(P1-30Aab, P1-30Bab) 및 항P1 모노클로날 항체(P1ab), 항P30 모노클로날 항체(P30ab)를 표 2의 조합으로 실시예 3의 순서에 의해 P1P30, P30 시험편 및 P1×P1P30의 3종류 제작했다.
Figure pct00002
각 시험편에, 임의로 희석한 마이코플라즈마 뉴모니에 항원과 2에서 제작한 항체 고정화 입자를 포함하는 검체 부유액을 50μL 적하 첨가하고, 15분간 정치했다. 항 마우스 IgG 항체 및 항마이코플라즈마 뉴모니에 항체의 양방의 도포 위치에서 발색을 육안으로 확인할 수 있었을 경우에 +라고 판정했다. 항 마우스 IgG 항체의 도포 위치에서만 발색을 육안으로 확인할 수 있고, 항 마이코플라즈마 뉴모니에 항체의 도포 위치에서 발색을 육안으로 확인할 수 없을 경우는 -라고 판정했다. 또한, 항마우스 IgG 항체의 도포 위치에서 발색을 육안으로 확인할 수 없을 경우는 무효라고 판정했다.
각 시험편의 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
표 3에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 모노클로날 항체인 P1-30Bab을 사용한 면역 측정 기구는 다른 항체를 사용한 면역 측정 기구와 비교해서 뛰어난 감도를 나타냈다.
SEQUENCE LISTING <110> DENKA CO., LTD. <120> Immunoassay of Mycoplasma pneumoniae and immunoassay tool <130> PF000700-PCT <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mycoplasma pneumoniae <400> 1 Pro Pro Gln Pro Gly 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial fragment of Mycoplasma pneumoniae antigen <400> 2 Pro Pro Gln Pro Gly Phe Pro Pro Lys Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial fragment of Mycoplasma pneumoniae antigen <400> 3 Gly Met Pro Pro Gln Pro Gly Phe Pro Pro Lys Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial fragment of Mycoplasma pneumoniae antigen <400> 4 Gly Phe Pro Pro Gln Pro Gly Met Ala Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial fragment of Mycoplasma pneumoniae antigen <400> 5 Gln Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Met 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial fragment of Mycoplasma pneumoniae antigen <400> 6 Ala Pro Arg Pro Gly Met Pro Pro His Pro 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial fragment of Mycoplasma pneumoniae antigen <400> 7 Gly Met Pro Pro His Pro Gly Met Ala Pro 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial fragment of Mycoplasma pneumoniae antigen <400> 8 His Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Phe 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial fragment of Mycoplasma pneumoniae antigen <400> 9 Ala Pro Arg Pro Gly Phe Pro Pro Gln Pro 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial fragment of Mycoplasma pneumoniae antigen <400> 10 Ala Pro Arg Pro Gly Met Gln Pro Pro Arg 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial fragment of Mycoplasma pneumoniae antigen <400> 11 Gly Met Gln Pro Pro Arg Pro Gly Met Pro 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial fragment of Mycoplasma pneumoniae antigen <400> 12 Pro Gly Met Pro Pro Gln Pro Gly Phe Pro 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial fragment of Mycoplasma pneumoniae antigen <400> 13 Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Met Pro Pro His 1 5 10 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PGMAPRPGFPPQ <400> 14 Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Phe Pro Pro Gln 1 5 10

Claims (9)

  1. 마이코플라즈마 뉴모니에 유래의 P1 단백질과 P30 단백질에 대하여 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체로서, PPQPG로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 마이코플라즈마 뉴모니에 유래의 P1 단백질 및 P30 단백질의 항원 항체 반응을 이용한 마이코플라즈마 뉴모니에의 면역 측정 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩티드의 아미노산 서열이 PPQPGFPPKR 또는 GMPPQPGFPPKR인 면역 측정 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체 또는 그 항원 결합성 단편이 표식 또는 고상 중 적어도 어느 일방에 사용되는 상기 면역 측정 방법이 샌드위치법인 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 면역 측정 방법이 면역 크로마토그래피법인 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체에 의해 인식되는 상기 2종류 이상의 항원이 복합체를 형성하고 있는 방법.
  6. 제 1 항에 기재된 방법을 행하기 위한 면역 측정 기구로서, 상기 모노클로날 항체 또는 그 항원 결합성 단편이 표식 또는 고상 중 적어도 어느 일방에 사용되는 면역 측정 기구.
  7. 제 6 항에 있어서,
    면역 크로마토 시험편인 면역 측정 기구.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    상기 피검 대상이 마이코플라즈마 뉴모니에인 면역 측정 기구.
  9. 마이코플라즈마 뉴모니에 유래의 P1 단백질과 P30 단백질에 대하여 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체로서, PPQPG로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체.
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