KR20220146671A

KR20220146671A - 재조합 단백질을 발현시키기 위한 tis 서열 및 신호 펩티드 서열의 신규한 조합

Info

Publication number: KR20220146671A
Application number: KR1020227035849A
Authority: KR
Inventors: 키아바시 미르자데; 베로니카 램베르그; 나탈리 챗지사비도우; 패트릭 사무엘슨; 시아바시 바시리; 페르 에데브링크; 조앤 스티븐슨; 데이비드 빅스트룀
Original assignee: 엑스브레인 바이오파마 에이비
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2021-03-17
Publication date: 2022-11-01
Also published as: EP4121543A1; CA3171532A1; KR102520468B1; AU2023201976A1; KR20230051618A; JP2023517982A; CN115298313A; JP7441389B2; EP4121543A4; AU2021239744B2; KR102661211B1; AU2021239744A1; WO2021188034A1; US20230175008A1

Abstract

본 발명은 신규한 TIS 서열을 포함하는 DNA 구조체에 관한 것이다. TIS 서열이 mRNA 전사체에서 단백질 번역 개시 부위로서 기능하는 RNA 모티프로 전사된다. DNA 구조체는 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 추가적으로, DNA 구조체는 또한 재조합 단백질, 또는 그의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 DNA 구조체를 포함하는 발현 벡터, 발현 카세트 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 숙주 세포에 의해 발현되는 재조합 단백질 뿐만 아니라 재조합 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 단백질을 발현시키기 위한 TIS 서열 및 신호 펩티드 서열의 신규한 조합

본 발명은 신규한 TIS 서열을 포함하는 DNA 구조체(DNA constructs)에 관한 것이다. DNA 구조체는 또한 신호 펩티드를 인코딩(encoding)하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 추가적으로, DNA 구조체는 또한 재조합 단백질 또는 그의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 DNA 구조체를 포함하는 발현 벡터(expression vector), 발현 카세트(expression cassette) 및 숙주 세포(host cell)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 숙주 세포에 의해 발현되는 재조합 단백질 뿐만 아니라 재조합 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.

재조합 세포주에서 정상 상태의 단백질 농도 수준에 대한 주요 결정 요인은 (1) 발현 카세트의 게놈 통합 부위(genomic integration site), (2) 프로모터 강도, (3) 전사체(transcript)의 번역 효율 및 (4) 단백질 폴딩(protein folding) 및 분해 속도에 영향을 미치는 번역 후 변형(post translational modifications)을 포함한다. 재조합 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주의 생성을 위하여, 종종 높은 발현 수준을 촉진하는 랜덤 통합 부위가 스크리닝된다. 발현 벡터 그 자체는 또한 높은 전사를 생성하는 프로모터 서열과 적절한 번역 개시를 가능하게 하는 번역 개시 부위(translation initiation site, TIS)와 같은 조절 요소를 포함한다 [1]. 실망스럽게도, 높은 발현 수준을 촉진해야 하는 모든 조절 요소가 선택되더라도, 단백질 수율은 상황에 따라 다를 수 있다. 따라서, 재조합 세포주를 생성할 때 합리적인 디자인을 안내하는 솔루션이 크게 요구된다.

단백질 합성은 세포의 에너지 수지(energy budget)의 많은 부분을 다 사용하기 때문에 [2], 진화는 단백질 생산의 여러 단계들을 엄격하게 조절하였다. 진핵생물 번역 개시 단계는 12개의 개시 인자를 필요로 하며, 단백질 합성 중 속도-제한 단계(rate-limiting step)로 여겨진다 [3]. 이 개시 단계는 에너지 소비를 최소화하기 위해 진화하는 동안 엄격하게 조절되었을 가능성이 크다. 번역 개시의 효율성을 조절하는 주요 요소는 ATG 개시 코돈을 둘러싸고 있는 mRNA 뉴클레오티드 서열에 내장되어 있다. TIS 내의 이러한 뉴클레오티드 편향은 1980년대에 발견되었으며, 일반적으로 코작(Kozak) 서열로 알려져 있다 [4]. 그 이후로 리보솜 구조 연구는 TIS 서열이 리보솜과 상호작용하여 번역 개시가 일어나도록 구조적 변화를 부과하는 방법을 설명하였다 [5]. 생물학적 영향으로 인하여, 서로 다른 강도를 가진 TIS 서열은 정확한 개시 부위와 미세 조정 발현 수준에 대한 지표로서 자연스럽게 진화하였다 [6].

일반적으로, 강력한 자연 발생 TIS 서열은 재조합 생산을 위한 발현 벡터를 조작할 때 선택된다. 다른 TIS 변이체 중에서, ATG 개시 코돈 앞에 있는 포유동물 공통 서열 GCCACC는 [7] ad hoc 구조체 디자인 중에 정례적으로(routinely) 도입된다. 이 서열은 자연적으로 발견된 고도로 발현된 유전자에 널리 퍼져 있으며, 풍부한 전사체에 대한 번역 개시 속도(translation initiation rates)를 미세 조정함으로써 유기체의 적합성(fitness)을 향상시킬 수 있다. 자연적인 진화와 대조적으로, 유가식(fed-batch) 재조합 발현 조건은 프로테옴(proteome)을 변경하고, 결코 자연 환경을 모방하지 않는 세포에 대사 부담(metabolic burden)을 부과한다 [8]. 결과적으로, 최근 연구는 재조합 실험을 위한 최적의 번역 속도를 유도하는 공통 서열 특징을 확인하기 위해 TIS 라이브러리를 통한 실험적 스크리닝에 초점을 맞추었다 [9, 10].

그러나, 선행 기술은 안정적으로 사용될 수 있는 하나의 고유한 보편적인 서열을 제안하지 않는다. 결과적으로, GCCACCATG 서열보다 더 나은 기술적 효과를 제공할 수 있는 TIS 서열이 필요하다.

더욱이, 포유동물 세포는 일반적으로 재조합 바이오의약품의 생산을 위한 숙주로서 사용된다. 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 유래된 세포주는 정례적으로 g/L 범위의 생산 수율을 허용할 수 있다. 그러나, 이 분야의 발전에도 불구하고, 발현 수준은 예측할 수 없고 상황에 따라 달라질 수 있으므로, 세포주 개발 동안 원하는 발현 수준을 얻기 위한 합리적인 디자인을 제한한다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명에서는 궁극적으로 항체의 역가(titer) 및 생산성에 영향을 미치는 것을 목적으로 번역 개시 부위(TIS)를 변경하였다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 번역 개시 속도를 증가시키는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 단백질 품질에 영향을 미치지 않으면서 번역 개시 속도를 증가시키는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 단백질 생물학적 유사성(biosimilarity)을 유지하면서 번역 개시 속도를 증가시키는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 번역 후 변형을 유지하면서 번역 개시 속도를 증가시키는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 글리칸계 번역 후 변형을 유지하면서 번역 개시 속도를 증가시키는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 종(species)의 산성 및 염기성 분포를 유지하면서 번역 개시 속도를 증가시키는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 단백질의 역가를 증가시키는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항체 또는 그의 단편의 역가를 증가시키는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 단일클론 항체(monoclonal antibodies)의 역가를 증가시키는 것이다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 청구범위에 개시된 주제 및 본 발명의 하기 측면에 개시된 주제에 의해 달성된다.

본 발명의 제1 측면은 포유동물 세포에서 재조합 단백질을 발현시키기에 적합한 DNA 구조체에 관한 것으로서, 여기서 DNA 구조체가 서열 번호 1의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 서열 번호 1의 핵산 서열이 TIS 서열이다.

바람직한 실시 형태에서, 서열 번호 1의 핵산 서열이:

- ATG 개시 코돈의 업스트림(upstream)의 6개의 뉴클레오티드; 및/또는

- ATG 개시 코돈의 다운스트림의 2개의 뉴클레오티드;

를 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, DNA 구조체가 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 더 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, DNA 구조체가 재조합 단백질, 또는 그의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 핵산 서열을 더 포함한다.

본 발명의 제2 측면은 포유동물 세포에서 재조합 단백질을 발현시키기 위한 DNA 구조체에 관한 것으로서, 여기서 DNA 구조체가:

- 서열 번호 1의 핵산 서열로서, 여기서 서열 번호 1의 핵산 서열이 TIS 서열인, 서열 번호 1의 핵산 서열; 및

- 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열;

을 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 서열 번호 1의 핵산 서열이:

- ATG 개시 코돈의 업스트림의 6개의 뉴클레오티드; 및/또는

- ATG 개시 코돈의 다운스트림의 2개의 뉴클레오티드;

를 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이 서열 번호 2의 핵산 서열을 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 서열 번호 1의 핵산 서열이:

- 신호 펩티드의 첫번째 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산 서열에서의 ATG 개시 코돈; 및

- 신호 펩티드의 두번째 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산 서열에서의 ATG 개시 코돈의 다운스트림의 첫번째 2개의 뉴클레오티드;

를 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 서열 번호 1의 핵산 서열이:

- 서열 번호 2에서의 ATG 개시 코돈; 및

- 서열 번호 2의 핵산 서열에서의 ATG 개시 코돈의 다운스트림의 첫번째 2개의 뉴클레오티드;

를 포함한다.

본 발명의 제3 측면은 포유동물 세포에서 재조합 단백질을 발현시키기 위한 DNA 구조체에 관한 것으로서, 여기서 DNA 구조체가:

- 서열 번호 1의 핵산 서열로서, 여기서 서열 번호 1의 핵산 서열이 TIS 서열인, 서열 번호 1의 핵산 서열;

- 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열; 및

- 재조합 단백질, 바람직하게는 단일클론 항체, 보다 바람직하게는 IgG4 단일클론 항체를 인코딩하는 핵산 서열;

을 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 서열 번호 1의 핵산 서열이:

- ATG 개시 코돈의 업스트림의 6개의 뉴클레오티드; 및/또는

- ATG 개시 코돈의 다운스트림의 2개의 뉴클레오티드;

를 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 서열 번호 1의 핵산 서열이:

를 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 서열 번호 1의 핵산 서열이:

- 서열 번호 2에서의 ATG 개시 코돈; 및

를 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결(operably linked)된다.

본 발명의 제4 측면은 포유동물 세포에서 재조합 단백질을 발현시키기 위한 DNA 구조체에 관한 것으로서, 여기서 DNA 구조체가:

- 서열 번호 1의 핵산 서열을 각각 포함하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열로서, 여기서 서열 번호 1의 핵산 서열이 TIS 서열인, 서열 번호 1의 핵산 서열을 각각 포함하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열;

- 신호 펩티드를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열;

- 신호 펩티드를 인코딩하는 두번째 핵산 서열;

- 항체의 중쇄(heavy chain)를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열; 및

- 항체의 경쇄(light chain)를 인코딩하는 두번째 핵산 서열;

을 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 서열 번호 1의 핵산 서열이:

- ATG 개시 코돈의 업스트림의 6개의 뉴클레오티드; 및/또는

- ATG 개시 코돈의 다운스트림의 2개의 뉴클레오티드;

를 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 신호 펩티드를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열이 서열 번호 2의 핵산 서열을 각각 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 서열 번호 1의 핵산 서열을 각각 포함하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열이:

- 신호 펩티드의 첫번째 아미노산 잔기를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열에서의 ATG 개시 코돈; 및

- 신호 펩티드의 두번째 아미노산 잔기를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열에서의 ATG 개시 코돈의 다운스트림의 첫번째 2개의 뉴클레오티드;

를 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 서열 번호 1의 핵산 서열을 포함하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열이:

- 신호 펩티드를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열의 서열 번호 2에서의 ATG 개시 코돈; 및

- 신호 펩티드를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열의 서열 번호 2에서의 ATG 개시 코돈의 다운스트림의 첫번째 2개의 뉴클레오티드;

를 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 신호 펩티드를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열이 항체의 중쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다.

바람직한 실시 형태에서, 신호 펩티드를 인코딩하는 두번째 핵산 서열이 항체의 경쇄를 인코딩하는 두번째 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다.

바람직한 실시 형태에서, 항체의 중쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열이 서열 번호 5의 아미노산 서열을 인코딩한다.

바람직한 실시 형태에서, 항체의 경쇄를 인코딩하는 두번째 핵산 서열이 서열 번호 7의 아미노산 서열을 인코딩한다.

바람직한 실시 형태에서, 항체의 중쇄 및 경쇄를 각각 인코딩하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열이 서열 번호 5 및 서열 번호 7의 아미노산 서열을 각각 인코딩한다.

바람직한 실시 형태에서, 항체의 중쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열이 서열 번호 4의 서열을 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 항체의 경쇄를 인코딩하는 두번째 핵산 서열이 서열 번호 6의 서열을 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 항체의 중쇄 및 경쇄를 각각 인코딩하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열이 서열 번호 4 및 서열 번호 6의 서열을 각각 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, DNA 구조체가 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 핵산 서열을 포함한다. 생성된(resulting) 항체의 중쇄 및 경쇄는 절단되거나 절단되지 않은 신호 펩티드를 각각 포함할 수 있다. 신호 펩티드가 절단되지 않은 경우, 절단되지 않은 신호 펩티드를 갖는 상기 중쇄 및 경쇄 각각은 서열 번호 10 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, DNA 구조체가 서열 번호 12 및 서열 번호 13의 핵산 서열을 포함한다. 생성된 항체의 중쇄 및 경쇄는 절단되거나 절단되지 않은 신호 펩티드를 각각 포함할 수 있다. 신호 펩티드가 절단되지 않은 경우, 절단되지 않은 신호 펩티드를 갖는 상기 중쇄 및 경쇄 각각은 서열 번호 10 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 각각 포함한다.

본 발명의 제5 측면은 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 DNA 구조체에 관한 것으로서, 여기서 아미노산 서열이:

- 니볼루맙(Nivolumab)(Opdivo, CAS 번호 946414-94-4)에 대한 아미노산 서열;

- 니볼루맙의 중쇄 아미노산 서열에 융합된 서열 번호 3의 신호 펩티드; 및

- 니볼루맙의 경쇄 아미노산 서열에 융합된 서열 번호 3의 신호 펩티드;

를 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 니볼루맙의 중쇄 아미노산 서열이 서열 번호 5의 서열을 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 니볼루맙의 경쇄 아미노산 서열이 서열 번호 7의 서열을 포함한다.

본 발명의 제6 측면은 본 발명의 제1 측면 내지 제5 측면 중 어느 하나에 따른 DNA 구조체를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 발현 벡터는 하기의 핵산 요소들 중 하나 이상을 포함하고,

- 프로모터(promoter),

- 터미네이터(terminator),

- 선발 마커(selection marker),

- 복제 기점(origin of replication) 및/또는

- 항생제 내성 마커(antibiotic resistance marker),

여기서 발현 벡터는 제한 효소에 의해 절단 가능한 적어도 하나의 다중 클로닝 부위(multiple cloning site)를 더 포함하고, 바람직하게는 제한 효소는 EcoRI, NdeI, NotI, XhoI, PspXI, PaeR71, BbsI, StyI, AvrII, BanI, Acc65I, KpnI, Eco53kI, SacI, BamHI, XbaI, SalI, AccI, PstI, SbfI, SphI 또는 HindIII이다.

바람직한 실시 형태에서, 선발 마커가 디히드로엽산 환원효소(dihydrofolate reductase), DHFR, 또는 글루타민 합성효소, GS를 인코딩하는 유전자를 포함한다.

본 발명의 제7 측면은 본 발명의 제1 측면 내지 제5 측면 중 어느 하나에 따른 DNA 구조체를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.

본 발명의 제8 측면은 본 발명의 제1 측면 내지 제5 측면 중 어느 하나에 따른 DNA 구조체를 포함하는 숙주 세포에 관한 것으로서, 여기서 상기 숙주 세포가 바람직하게는 진핵 세포이고, 보다 바람직하게는 포유동물 세포이다.

바람직한 실시 형태에서, 숙주 세포가 중국 햄스터 난소, CHO, 세포이다.

바람직한 실시 형태에서, 숙주 세포가 CHO-DG44 세포 또는 CHO GS^-/-세포이다.

본 발명의 제9 측면은 본 발명의 제1 측면 내지 제5 측면 중 어느 하나에 따른 DNA 구조체에 의해 발현되는 재조합 단백질에 관한 것이다. 재조합 단백질은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다.

바람직한 실시 형태에서, 재조합 단백질이 항체, 항체 단편, 효소 및 호르몬이다.

바람직한 실시 형태에서, 재조합 단백질이 단일클론 항체, 다클론 항체(polyclonal antibody), 키메라 항체(chimeric antibody) 또는 상기 단일클론 항체, 다클론 항체, 키메라 항체의 단편이다.

바람직한 실시 형태에서, 재조합 단백질이 니볼루맙이다. 니볼루맙은 인간 IgG4 단일클론 항체이다. 옵디보(Opdivo)라는 상표명으로 판매되는 치료용 항체이며, 다수의 유형의 암을 치료하는데 사용되는 약물이다. 여기에는 흑색종(melanoma), 폐암, 신세포암종(renal cell carcinoma), 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma), 두경부암(head and neck cancer), 결장암(colon cancer) 및 간암이 포함된다. 일반적으로 이것은 정맥으로 천천히 주입하여 사용된다.

본 발명의 제10 측면은 본 발명의 제1 측면 내지 제5 측면 중 어느 하나에 따른 DNA 구조체에 의해 발현되는 RNA에 관한 것이다.

본 발명의 제11 측면은 재조합 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것으로서, 다음 단계:

a. 재조합 단백질, 또는 그의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 오픈 리딩 프레임(open reading frames)을 본 발명의 제1 측면 내지 제3 측면 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 DNA 구조체로 클로닝(cloning)하는 단계; 및

b. 생성된 핵산 서열을 숙주 세포로 형질감염(transfecting)시키는 단계로서, 여기서 숙주 세포가 바람직하게는 진핵 세포이고, 보다 바람직하게는 포유동물 세포인, 단계;

를 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 방법은 형질감염된 핵산 서열을 숙주 세포의 게놈으로 통합(integrating)시키는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 제13 측면은 재조합 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것으로서, 다음 단계:

a. 본 발명의 제4 측면 또는 제5 측면에 따른 DNA 구조체를 클로닝하는 단계; 및

b. 생성된 핵산 서열을 숙주 세포로 형질감염시키는 단계로서, 여기서 숙주 세포가 바람직하게는 진핵 세포이고, 보다 바람직하게는 포유동물 세포인, 단계;

를 포함한다.

바람직한 실시 형태에서, 상기 방법은 형질감염된 핵산 서열을 숙주 세포의 게놈으로 통합시키는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 제14 측면은 임의의 유형의 숙주 세포(원핵 세포, 진핵 세포 및/또는 효모 세포를 포함함)에서 신호 펩티드를 발현시키기 위한 DNA 구조체에 관한 것으로서, 여기서 DNA 구조체가 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이 서열 번호 2의 핵산 서열을 포함한다. 서열 번호 2의 핵산 서열은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 신호 펩티드를 인코딩한다. 추가의 측면은 상기 DNA 구조체를 포함하는 발현 벡터, 발현 카세트 및 숙주 세포에 관한 것이다.

도 1 - TIS^EVO를 포함하는 미니 풀(mini-pools)에 대한 높은 항체 생산 세포 배양을 식별할 가능성이 증가 - 차트는 TIS^CON(검정색) 또는 TIS^EVO(중공: hallow)를 포함하는 미니-풀에 대한 수확일(harvest day)에 대한 역가 값(g/L)을 나타낸다.
도 2 - TIS^EVO를 포함하는 미니 풀에 대해 높은 항체 생산 세포 배양을 식별할 가능성이 증가 - 차트는 TIS^CON(검정색) 또는 TIS^EVO(중공)를 포함하는 미니 풀에 대한 수확일에 대한 평균 생산성, 평균 Qp, (pg/c/d)를 나타낸다.
도 3 - CHO-DG44 세포주를 발현시키는 단일클론 항체 (mAb) 의 역가 및 비생산성(specific productivity) 비교 - TIS^CON(검은색 점) 또는 TIS^EVO(중공 점)를 포함하는 세포주의 최종 누적 역가 값(g/L).
도 4 - CHO-DG44 세포주를 발현시키는 mAb의 역가 및 비생산성 비교 - TIS^CON(검은색 점) 또는 TIS^EVO(중공 점)를 포함하는 세포주의 최종 누적 비생산성, Qp, (pg/c/d).
도 5 - 상업적으로 입수한 니볼루맙의 글리칸 프로파일(즉, 이 샘플들은 TIS^CON및 TIS^EVO를 사용하지 않고 생산됨).
도 6 - 미니 풀을 포함하는 TIS^CON에서 유래된 니볼루맙 변이체의 글리칸 프로파일.
도 7 - 미니 풀을 포함하는 TIS^EVO에서 유래된 니볼루맙 변이체의 글리칸 프로파일.
도 8 - TIS^CON 미니 풀에서 유래된 니볼루맙 변이체의 전하 분포(Charge distribution). 오리지네이터(originator)가 AAX2414로 라벨링된다.
도 9 - TIS^EVO 미니 풀에서 유래된 니볼루맙 변이체의 전하 분포. 오리지네이터가 AAX2414로 라벨링된다.

상세한 설명

당업계에서, TIS 서열은 때때로 mRNA 전사체에서의 단백질 번역 개시 부위(TIS)로서 기능하는 RNA 서열로 지칭된다 [9]. 그러나, 본 발명에서는, 용어 TIS 서열은 그 대신 상기 RNA 서열로 전사되는 DNA 서열을 지칭한다.

선행 기술 연구는 안정적으로 사용될 수 있는 하나의 고유한 보편적인 서열을 제안하지 않기 때문에, 본 발명자는 포유동물 세포에서의 항체를 생산하기 위한 재조합 발현 시스템에서 선행 기술의 GCCACCATGGA 서열(본원에서 TIS^CON로 라벨링됨) 보다 더 나은 기술적 효과를 제공하는 신규한 핵산 TIS 서열(본원에서 TIS^EVO로 지칭됨)을 디자인하였다.

본원에서 TIS^EVO로 지칭되는 신규한 TIS 서열은 본 발명에서 서열 번호 1로도 또한 지칭되는 TCGGTCATGGC의 핵산 서열을 포함한다.

본 발명에서, 핵산이라는 용어는 적어도 2개의 뉴클레오티드가 공유 결합으로(covalently) 함께 연결된 것을 의미한다. 더욱이, 단일 가닥(single strand)의 개시(disclosure)는 또한 상보적 가닥의 서열을 개시한다. 따라서, 핵산 서열은 또한 개시된 단일 가닥의 상보적 가닥을 포함한다.

서열 번호 1의 핵산 서열은 포유동물 세포에서 재조합 단백질을 발현시키기에 적합한 DNA 구조체에 포함된다. 서열 번호 1의 TIS^EVO 핵산 서열이:

- ATG 개시 코돈의 (바로 옆에) 업스트림의 6개의 뉴클레오티드(즉, ATG 개시 코돈의 A가 +1 위치인 -6에서 -1 위치까지의 뉴클레오티드를 포함함); 또한

- ATG 개시 코돈의 (바로 옆에) 다운스트림의 2개의 뉴클레오티드(즉, ATG 개시 코돈의 G가 +3 위치인 +4에서 +5 위치까지의 뉴클레오티드를 포함함);

를 포함한다.

본 발명에서, 용어 DNA 구조체는 숙주 세포(예를 들면, 발현 벡터 또는 발현 카세트의 사용을 통해)에 삽입될 핵산의 인공적으로 구성된 단편을 지칭한다.

TIS^EVO 핵산 서열은 mRNA 전사체에서 단백질 번역 개시 부위로서 기능하는 UCGGUCAUGGC의 RNA 서열(본원에서는 서열 번호 14로도 지칭됨)로 전사된다. 즉, TIS^EVO 핵산 서열은 코작-유사(Kozak-like) 서열이다.

상기 언급된 DNA 구조체는 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 서열 번호 1의 핵산 서열은 이러한 DNA 구조체에서 다음:

를 포함할 수 있다:

본 발명에서, 용어 신호 펩티드는 발현시키고자 하는 재조합 단백질의 N-말단에 융합된 선도 펩티드(leader peptide)를 의미한다. 신호 펩티드는 그것이 생산되는 숙주 세포로부터 재조합 단백질의 분비를 촉진한다. 신호 펩티드는 전형적으로 세포로부터의 분비 시에 나머지로부터 절단된다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이 신호 펩티드의 N-말단(N-terminus) 종말(end)에서 첫번째 아미노산으로서 메티오닌(M)을 갖는 신호 펩티드를 발현시키는 핵산 서열의 변형을 포함한다. 이러한 신호 펩티드는『Kober et al [11], Haryadi R. et al [12], US10066019, Ramezani A. et al [15] 및 Peng L. et al [16]』에 기술된 것과 같이 선택될 수 있는데, 이것은 모두 진핵 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현을 위한 신호 펩티드의 사용에 관한 것이다. 본 발명에 따른 변형은 첫번째 2개의 뉴클레오티드를 GC로 교환함으로써 ATG 개시 코돈의 다운스트림의 첫번째 코돈의 변경을 포함한다. 생성된 신호 펩티드는 신호 펩티드의 N-말단 종말에서 첫번째 2개의 아미노산으로서 MA를 포함할 것이다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이 서열 번호 2의 핵산 서열을 포함한다. 서열 번호 1의 핵산 서열은 이러한 DNA 구조체에서 다음:

- 서열 번호 2에서의 ATG 개시 코돈; 및

를 포함할 것이다.

DNA 구조체는 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 이러한 DNA 구조체에서, 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 재조합 단백질은 항체, 다량체성 단백질, 단량체성 단백질, 효소 및/또는 호르몬일 수 있다. 그러나, 다른 재조합 단백질도 구상될 수 있다.

본 발명에서의 용어 항체는 단일클론 항체, 다클론 항체, 키메라 항체 또는 그의 단편을 지칭한다. 항체의 이러한 단편(본원에서 항체 단편이라고도 함)은 항원-결합 부위 또는 가변 영역(variable region)을 포함하는 온전한 항체의 일부이다. 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, Fab'-SH 단편, F(ab')₂ 단편, Fd 단편, Fv 단편, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody) 및/또는 단일-사슬 Fv(scFv) 분자일 수 있다.

본 발명의 일 실시 형태에서, DNA 구조체가 다음:

- 서열 번호 1의 2개의 핵산 서열;

- 신호 펩티드를 인코딩하는 2개의 핵산 서열; 및

- 재조합 단백질;

을 포함하고,

여기서 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 동일하거나 상이한 서열일 수 있는데, 즉, 신호 펩티드는 동일하거나 상이한 신호 펩티드일 수 있다. 동일하거나 상이한 신호 펩티드를 발현시키는 벡터의 구성은 『Kober et al [11], Haryadi R. et al [12] 및 Li F. et al [13]』에 기재된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 재조합 단백질은 바람직하게는 항체이다. 더욱이, 신호 펩티드를 인코딩하는 각각의 핵산 서열은 재조합 단백질의 2개의 핵산 서열(예컨대, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열)에 작동 가능하게 연결되어 있다.

본 발명의 일 실시 형태에서, DNA 구조체가:

- 서열 번호 1의 핵산 서열을 각각 포함하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열;

- 신호 펩티드를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열;

- 신호 펩티드를 인코딩하는 두번째 핵산 서열;

- 항체의 중쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열; 및

- 항체의 경쇄를 인코딩하는 두번째 핵산 서열;

을 포함한다.

이러한 DNA 구조체에서, 서열 번호 1의 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열이 다음:

- 신호 펩티드를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열의 ATG 개시 코돈; 및

- 신호 펩티드를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열에서의 ATG 개시 코돈의 다운스트림의 첫번째 2개의 뉴클레오티드;

를 포함한다.

신호 펩티드를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열은 항체의 중쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 유사하게, 신호 펩티드를 인코딩하는 두번째 핵산 서열은 항체의 경쇄를 인코딩하는 두번째 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 신호 펩티드를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열의 DNA 구조체가 서열 번호 2의 핵산 서열을 각각 포함한다. 이러한 DNA 구조체에서, 서열 번호 1의 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열이 다음:

를 포함한다.

항체의 중쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다. 항체의 경쇄를 인코딩하는 두번째 핵산 서열은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다.

항체의 중쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열은 서열 번호 4의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 경쇄를 인코딩하는 두번째 핵산 서열은 서열 번호 6의 핵산 서열을 포함할 수 있다.

DNA 구조체가 서열 번호 8 또는 서열 번호 12의 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 서열이:

- 서열 번호 1의 핵산 서열을 포함하는 첫번째 핵산 서열;

- 서열 번호 2의 핵산 서열을 포함하는 신호 펩티드를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열; 및

- 서열 번호 4의 핵산 서열을 포함하는 항체의 중쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열;

을 포함하며,

여기서 서열 번호 1의 첫번째 핵산 서열이:

- 신호 펩티드를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열의 서열 번호 2에서의 ATG 개시 코돈; 및

- 상기 ATG 개시 코돈의 다운스트림의 첫번째 2개의 뉴클레오티드;

를 포함한다.

DNA 구조체가 서열 번호 9 또는 서열 번호 13의 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 서열이:

- 서열 번호 1의 핵산 서열을 포함하는 두번째 핵산 서열;

- 서열 번호 2의 핵산 서열을 포함하는 신호 펩티드를 인코딩하는 두번째 핵산 서열; 및

- 서열 번호 6의 핵산 서열을 포함하는 항체의 경쇄를 인코딩하는 두번째 핵산 서열;

을 포함하며,

여기서 서열 번호 1의 두번째 핵산 서열이:

- 신호 펩티드를 인코딩하는 두번째 핵산 서열의 서열 번호 2에서의 ATG 개시 코돈; 및

를 포함한다.

DNA 구조체는 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 핵산 서열 둘 다를 포함할 수 있다. 대안적으로, DNA 구조체는 그 대신 서열 번호 12 및 서열 번호 13의 핵산 서열 둘 다를 포함할 수 있다. 서열 번호 12 및 서열 번호 13의 핵산은 각각 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 핵산과 상이하며, 단지 서열 번호 12 및 서열 번호 13의 핵산에서만 각각 제한 부위를 더 포함한다.

상기 개시된 DNA 구조체는 포유동물 세포로의 형질감염에 적합한 발현 벡터로 통합될 수 있다. 이러한 벡터는 다음의 핵산 요소들을 포함할 수 있다:

- 프로모터,

- 터미네이터,

- 선발 마커,

- 복제 기점, 및/또는

- 항생제 내성 마커.

발현 벡터는 예컨대 EcoRI, NdeI, NotI, XhoI, PspXI, PaeR71, BbsI, StyI, AvrII, BanI, Acc65I, KpnI, Eco53kI, SacI, BamHI, XbaI, SalI, AccI, PstI, SbfI, SphI 및/또는 HindIII인 제한 효소에 의해 절단 가능한 적어도 하나의 다중 클로닝 부위를 더 포함할 수 있다.

포유동물 세포와 함께 사용하기 위한 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터에 전형적으로 포함되는 핵산 요소들은 『Li F. et al [13] 및 Noh S.H. et al [14]』에 기재되었고, 본 발명에서 이들 발현 벡터의 용도는 발현 벡터의 하기 기재된 실시 형태에서 나타내었다.

발현 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 유전자 발현을 유도하고 유전자 발현을 조절할 수 있는 임의의 프로모터일 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 CHO 세포와 같은 포유동물 세포에서 재조합 단백질의 발현에 효과적인 것으로 나타나는 프로모터일 수 있다. 추가의 바람직한 실시 형태에서, 프로모터는 CHO-DG44 세포에서 재조합 단백질의 발현에 효과적이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 프로모터의 구체적인 예시로는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus: CMV) 프로모터 및/또는 연장 인자 알파(elongation factor alpha: EF1α) 프로모터이다.

DNA 구조체를 갖는 발현 벡터에서는 다음:

- 항체의 중쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열,

- 항체의 경쇄를 인코딩하는 두번째 핵산 서열,

을 포함하며,

발현 벡터는 첫번째 전사체로서 첫번째 핵산 서열을 발현시키기 위한 첫번째 프로모터 및 두번째 전사체로서 두번째 핵산 서열을 발현시키기 위한 두번째 프로모터를 포함할 수 있다. 첫번째 전사체는 그 다음 중쇄 폴리펩티드로 번역될 것이고, 두번째 전사체는 경쇄 폴리펩티드로 번역될 것이고, 생성된 항체는 상기 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드에 의해 생성될 것이다. 이러한 발현 벡터에서, 첫번째 및 두번째 프로모터는 본 발명의 실시 형태에서 동일하거나 상이할 수 있다. 이러한 발현 벡터에서, 바람직한 실시 형태는 2개의 CMV 프로모터, 즉 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열 각각에 대해 하나씩 사용하는 것을 포함한다.

발현 벡터의 일 실시 형태에서, 5' 비번역 부위(5' untranslated region)의 인트론 서열은 프로모터(들) 뒤에 포함되어 숙주 세포의 핵으로부터 세포질로 전사된 mRNA의 방출(export)을 증가시키고; 또한, mRNA 수준을 최대화하기 위해 하나 이상의 3' 폴리아데닐화 신호 서열이 발현 벡터에 포함될 수도 있다. 발현 벡터에 포함될 수 있는 폴리아데닐화 신호 서열의 일부 예시로는 SV40 후기 또는 초기 폴리아데닐화 신호 서열 및 소(bovine) 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열이다.

본 발명에서, 디히드로엽산 환원효소(DHFR)를 인코딩하는 유전자와 같은 대사 선발 마커는 CHO-DG44 세포에 형질감염되는 발현 벡터에서 선발 마커로서 사용될 수 있다. DNA 구조체는 메토트렉세이트(Methotrexate: MTX), DHFR 억제제를 사용하여 증폭될 수 있다.

대체 마커는 CHO GS^-/- 세포로 형질감염될 발현 벡터에서 선발 마커로 사용될 수 있는 글루타민 합성효소(GS)를 인코딩하는 유전자이다. GS는 암모니아와 글루타메이트의 글루타민으로의 전환을 촉매화하고, MSX는 GS 단백질의 활성을 억제한다.

본 발명에서 사용될 수 있는 복제 기점은 pUC 기점, pBR 322 기점; pACYC 기점, pSC101 기점 및 ColE1 기점으로부터 선택될 수 있다. 그러나, 이들 복제 기점의 유도체 뿐만 아니라 당업계에서 사용되는 다른 복제 기점도 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 진핵생물 복제 기점의 예로는 SV40 복제 기점이다.

항생제 내성 마커는 산물이 클로람페니콜(chloramphenicol), 암피실린(ampicillin), 제오신(zeocin), 블레오마이신(bleomycin), 겐타마이신(gentamycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(tetracycline), 카나마이신(kanamycin) 및 네오마이신(neomycin)과 같은 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 따라서, 발현 벡터에서 사용되는 항생제 내성 마커의 일부 예시는 클로람페니콜 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 제오신 내성 유전자, 블레오마이신 내성 유전자, 겐타마이신 내성 유전자, 겐타마이신 내성 유전자, 스트렙토마이신 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자 및 네오마이신 내성 유전자이다. 발현 벡터에서 이들 항생제 내성 마커의 사용은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 『Li F. et al [13] 및 US8138324』를 참조한다.

사용될 수 있는 다른 항생제 선발 마커는 퓨로마이신 아세틸트랜스퍼라제(Puromycin acetyltransferase), 블라스티시딘 데아미나아제(Blasticidin deaminase), 히스티디놀 디하이드로게나아제(Histidinol dehydrogenase), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(Hygromycin phosphotransferase), 제오신 내성 유전자, 블레오마이신 내성 유전자 및 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제이다. 이 마커들은 각각 퓨로마이신, 블라스티시딘, 히스티디놀, 하이그로마이신, 제오신, 블레오마이신 및 네오마이신(G418)을 선발 마커로서 사용한다.

발현 벡터는 또한 하나 이상의 전사 종결 영역(transcription termination regions)을 포함할 수 있다. 전사 종결 영역은 일반적으로 효율적인 전사 종결을 제공하기 위해 코딩 서열의 다운스트림에 있다.

항체의 중쇄 및 경쇄의 발현에 사용하기 위한 본 발명의 특정 실시 형태에서, 본 발명의 발현 벡터는 『Li F. et al [13]』의 "Cell line development" 챕터에도 나타낸 다음의 핵산 요소들을 포함한다:

- 발현될 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열;

- 2개의 CMV 프로모터, 즉, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열 각각에 대하여 하나씩;

- 5' 비번역 영역에서의 인트론 서열은 각각의 CMV 프로모터 뒤에 포함됨;

- 3' 폴리아데닐화 신호 서열은 각각의 상기 5' 비번역 영역 뒤에 포함됨;

- 유전자 인코딩 선발 마커 DHFR;

- TIS 서열(즉, Kozak 서열) 및 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열 각각의 앞(즉, 업스트림)의 신호 펩티드를 포함하는 DNA 구조체; 및

- 항생제 내성 마커.

상기 개시된 DNA 구조체는 또한 포유동물 세포로 형질감염시키기에 적합한 발현 카세트에 포함될 수 있다. 이러한 발현 카세트는 다음의 핵산 요소들을 포함할 수 있다:

- 프로모터,

- 터미네이터, 및

- 선발 마커.

본 발명에서 사용되는 숙주 세포주는 『Li F. et al [13] 및 Noh S.H. et al [14]』에서 설명된 바와 같이 개발될 수 있다. 발현 벡터 및 발현 카세트의 전술한 실시 형태를 숙주로 하는 숙주 세포는 바람직하게는 인간, 햄스터 또는 쥐과(murine) 세포주로부터 유래된 포유동물 숙주 세포이다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에서, CHO-DG44 세포 또는 CHO GS^-/- 세포와 같은 CHO 세포가 사용될 수 있다.

상기에서 이미 논의된 바와 같이, DNA 구조체, 발현 벡터, 숙주 세포 및 방법의 다양한 실시 형태는 재조합 단백질 또는 그의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 발현시킬 수 있는 단백질의 예로는 항체, 항체 단편, 효소 및 호르몬이다.

본 발명에서, 단수 형태 "a," "and" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다는 점에 유의해야 한다. 본 발명은 또한 명시적으로 기술되었는지 여부에 관계 없이, 본원에 제시된 실시 형태들 또는 요소들을 "포함하는(comprising)", "구성되는(consisting of)" 그리고 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)" 다른 실시 형태들을 고려한다.

본 발명은 비-제한적인 실시예 섹션에 예시되는, 여러 측면들을 갖는다. 실시예 섹션에서, 니볼루맙(Opdivo^®)의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 DNA 구조체가 TIS^CON을 포함하는 발현 벡터 및 TIS^EVO를 포함하는 발현 벡터로 클로닝되었음을 주목해야 한다.

니볼루맙과 관련된 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 실시 형태를 나타내지만, 단지 예시의 방식으로 제공된 것임을 이해해야 한다. 본 발명의 상기 개시된 실시 형태 및 하기 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특성을 확인할 수 있고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고, 본 발명을 다양한 유형의 치료 항체(예컨대, mAb 또는 그의 단편) 및 면역글로빈(즉, IgG, IgM, IgD, IgA 및 IgE)에 적용하기 위해 본 발명의 다양한 변경 및 변형을 수행할 수 있다. 따라서, 본원에 도시되고 설명된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 청구항의 범위에 속하는 것으로 의도된다.

실시예

하기에 기재된 실시예 1 및 실시예 3은 서열 번호 1의 TIS^EVO를 발현 벡터로 도입함으로써, TIS^CON으로 형질감염된 미니 풀과 비교하여 미니 풀을 생산하는 높은 mAb(니볼루맙)를 식별할 가능성이 증가되었음을 나타낸다.

예상외로, > 4.2 g/L mAb를 생산하는 단일클론 세포주 중에서, 14개 중 10개가 TIS^EVO를 포함하고 있다. 또한, 상위 10개의 TIS^EVO 세포주는 일반적으로 사용되는 TIS^CON의 상위 10개의 세포주에 비해 평균 0.56g/L 더 많은 mAb(니볼루맙)를 생산했지만, 품질과 생물학적 유사성은 유지되었다. 본 발명은 CHO 세포주 발달 동안에 TIS 서열의 중요성 및 영향(implications)을 강조한다.

더욱이, 실시예 2는 TIS^EVO 및 TIS^CON 중 어느 하나를 포함하지 않는 발현 벡터 시스템에서 발현된 Opdivo^®(즉, 오리지네이터 니볼루맙)와 비교하는 경우, TIS^EVO에 의해 발현된 니볼루맙에 대한 유사한 번역 후 변형을 나타내었다. 이것은 TIS^EVO를 사용하는 경우, 니볼루맙의 품질과 생물학적 유사성이 유지되었음을 분명하게 보여준다.

아래의 실시예와 관련된 실험적 세부사항을 위하여, 독자는 별도의 재료 및 방법(MATERIALS AND METHODS) 섹션으로 안내된다. 이 문서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참조로서 포함된다.

본원에 개시된 실시예 및 재료 및 방법 섹션은 단지 예시일 뿐, 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다.

실시예 1 - TIS ^EVO 는 미니 풀의 유가식 배양에서 mAb 수율을 증가시킨다.

CHO-DG44에서 세포주 발달 동안 TIS 서열 변이체의 영향을 비교하기 위하여, TIS 서열 GCCACCATGGA (TIS^CON)을 TCGGTCATGGC (TIS^EVO)의 신규한 TIS 서열로 변경함으로써 발현 벡터에 뉴클레오티드 변화를 도입하였다.

병렬 실험(parallel experiments)에서, 세포는 TIS^EVO 또는 TIS^CON 벡터(즉, TIS^EVO 또는 TIS^CON 서열을 포함하는 벡터)로 전기천공법(electroporation)을 통해 형질감염되었고, 형질감염 24시간 후에 96-웰 플레이트 중에 4000-8000개의 생존 세포/웰을 시딩하여 통합체(integrates)를 선택하였다. 가장 잘 자라는 콜로니를 스크리닝한 후, 정적 배양(static culture)에서 역가를 측정하고, 상단 미니 풀을 확장하였고, 현탁액에 재적응하였다. 세포 비생산성(pg/cell/pay) 및 전체 역가(g/L)를 기반으로 하는 상위 12개의 미니 풀을 진탕 플라스크의 유가식 연구에서 추가로 평가하였다. 특히, 상위 12개의 미니 풀 중 7개가 TIS^EVO로 형질감염된 세포였다. 또한, 유가식 연구로부터 데이터를 분석할 때, 본 발명자들은 TIS^EVO가 포함된 미니-풀의 경우, 96-웰 플레이트에서 콜로니 형성이 증가하는 것 외에도, 역가 및 세포 비생산성이 더 높다는 분명한 징후를 보았다. 유가식 결과는 상위 3개의 높은 생산 미니 풀이 TIS^EVO와 통합된 벡터를 가지고 있음을 보여주었다(도 1 및 도 2). 평균 최대 생존 세포 밀도(VCD)/ml는 TIS^CON (20.1*10⁶ cells/ml)과 비교하여 TIS^EVO (15.2*10⁶ cells/ml)가 있는 미니 풀에 대해 더 낮았고(데이터는 표시되지 않음), TIS^EVO통합체에 대한 생존율이 연장되었다(도 1 및 도 2, x축). 이러한 결과는 TIS^EVO를 포함하는 mRNA가 잠재적으로 리보솜을 보다 효율적으로 리크루팅하는 것을 통해 수명을 연장하고, 이에 의해 세포 비생산성과 및 역가를 향상시키지만, VCD(급속한 성장에 사용 가능한 리보솜이 적음)를 약간 방해하는 것을 시사하였다.

실시예 2 - TIS ^EVO 및 TIS ^CON 미니 풀에 대한 비교가능한 mAb 글리칸 프로파일 및 전하 분포

TIS^EVO로 형질감염된 세포에 대한 생산성 및 역가의 증가가 단백질 품질에 영향을 미치는지 평가하기 위하여, 산성 및 염기성 종의 전하 분포(도 8 및 도 9), 글리칸 프로파일링(도 5-도 7) 및 크기 분포, 즉, 번역 후 변형(PTM)을 분석하였다. Water사의 RapiFluor-MS workflow의 결과 데이터는 도 5-도 9에 도시한 것과 같이, TIS^EVO 및 TIS^CON 중 어느 하나를 포함하지 않는 발현 벡터 시스템에서 발현된 Opdivo^®(즉, 오리지네이터 mAb)와 비교할 때, 각각 TIS^EVO 및 TIS^CON을 포함하는 발현 벡터 시스템에 의해 발현된 니볼루맙에 대해 유사한 PTM 패턴 및 전하 분포를 나타내었다. 이것은 번역 개시 속도의 변경이 단백질 품질이나 생물학적 유사성에 모두에 영향을 미치지 않았음을 분명하게 나타내었다.

도 5-도 8에 개시된 글리칸은 하기의 옥스포드 표기법 명칭을 갖는다[18]:

- A2;

- F(6)A2 (참고문헌 20에서의 FA2와 동일);

- A2[3]G1;

- A2[6]G1;

- F(6)A2[3]G1 (참고문헌 20에서의 FA2[3]G1와 동일);

- F(6)A2[6]G1 (참고문헌 20에서의 FA2[6]G1와 동일);

- F(6)A2G2 (참고문헌 20에서의 FA2G2와 동일);

- M5; 및

- F(6)A1.

TIS ^EVO 를 포함하는 단일클론 세포주에서의 증가된 mAb 생산

단일클론성 세포주를 생성하기 위하여, 형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting: FACS)를 사용하여 상위 8개의 미니 풀(역가 및 단백질 품질 기준)을 단일 세포로서 시딩하였고, 단일클론성을 추가로 확인하기 위해 단일 세포 이미지를 촬영하였다. 단일클론성, 세포 성장 및 생산성을 기반으로 하는 상위 48개 클론을 확장하였고, ambr15 마이크로생물반응기(microbioreactor) 실행에서 평가하기 전에 현탁액 배양에 적응시켰다. 생존율이 < 70%이거나 또는 늦어도 배양 14일째일 때, 배양물을 수확하였다. mAb를 생산하는 단일클론 세포주의 전체 수율 및 세포 비생산성을 분석할 때, TIS^EVO과 TIS^CON 함유 세포주 사이의 역가 및 비생산성에서 분명한 차이를 관찰하였다(도 3 및 도 4). 48개의 배양된 클론 중에서, 14개의 클론에서 누적 역가 값이 ≥ 4.2g/L으로 나타났으며, 그 중 10개의 클론에는 TIS^EVO가 포함되었다. 가장 많이 생산된 세포주는 또한 TIS^EVO를 포함하였으며, 최적화되지 않은 일반적인 유가식 공정에서 6.1 g/L mAb를 생성하였다(도 3). 더욱이, 세포의 비생산성을 분석할 때 14개의 높은 생산자 중 10개가 약 60 pg/c/d mAb를 생산하는 최고의 TIS^EVO 변이체를 가진 TIS^EVO를 포함하였다(도 4). 종합하면, 이러한 결과는 합리적으로 디자인된 TIS^EVO가 미니 풀 생성 동안 높은 생산자를 식별할 가능성 뿐만 아니라 생산성 및 역가가 향상된 단일클론성 DG44 세포주를 식별할 가능성 양자 모두의 측면에서 일반적으로 사용되는 표준 TIS^CON에 비해 우수함을 나타내었다.

재료 및 방법

벡터 엔지니어링 및 형질감염

TIS^CON 및 TIS^EVO를 비교하기 위한 발현 벡터(즉, TIS^CON 벡터 및 TIS^EVO 벡터)는 양자 모두『Li F. et al [13]』의 "Cell line development" 챕터에 개시된 다음의 핵산 요소들로 구성되었다:

- 3' 폴리아데닐화(polyA) 신호 서열은 각각의 상기 5' 비번역 영역 뒤에 포함됨;

- 유전자 인코딩 선발 마커 DHFR;

- 발현될 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열 각각의 앞(즉, 업스트림)에 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열;

- 신호 펩티드 핵산 서열의 업스트림의 TIS 서열(즉, Kozak 서열); 및

- 항생제 내성 마커.

니볼루맙(Opdivo^®)의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열을 하기 단락에 기재된 바와 같이, 2개의 TIS^CON 서열 또는 2개의 TIS^EVO서열을 포함하는 발현 벡터로 각각 클로닝하였다. 니볼루맙의 중쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열은 서열 번호 4의 서열을 포함하는 반면, 니볼루맙의 경쇄를 인코딩하는 두번째 핵산 서열은 서열 번호 6의 서열을 포함한다. 따라서, 첫번째 핵산 서열은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 인코딩하는 반면, 두번째 핵산 서열은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 인코딩한다.

2개의 TIS^CON서열을 포함하는 벡터(즉, TIS^CON 벡터)에서, 각각의 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 아미노산 서열 MDLLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS의 신호 펩티드를 발현시키기 위한 핵산 서열을 포함하였다. 이 신호 펩티드는 치료 항체의 폴리펩티드 사슬을 발현시키기 위한 『Haryadi R. et al [12] 및 US10066019호』에 이전에 개시되었다.

TIS^EVO 서열을 디자인하기 위하여, TIS^CON 서열의 GCCACC 서열을 TCGGTC 서열로 변경하였다. 또한, 신호 펩티드의 첫번째 아미노산을 코딩하는, ATG 개시 코돈의 다운스트림의 첫번째 코돈이 GAT에서 GCT로 변경되어 해당 위치에서 아미노산 치환이 발생하였다. 이러한 조합적 변화는 TCGGTCATGGC 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)을 포함하는 TIS^EVO 서열을 생성하였다.

2개의 TIS^EVO 서열(서열 번호 1)을 포함하는 발현 벡터는 서열 번호 2의 핵산 서열을 포함하는 신호 펩티드를 각각 인코딩하는 2개의 핵산 서열을 포함하도록 조작되었다. 서열 번호 1의 핵산 서열은 다음:

- 서열 번호 2의 서열에서의 ATG 개시 코돈; 및

를 각각 포함한다.

서열 번호 2의 핵산 서열은 이전에 어떠한 선행 기술 문서에도 개시되지 않은 아미노산 서열 MALLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS (서열 번호 3)의 신규한 신호 펩티드를 인코딩한다.

TIS^EVO의 활성을 테스트하기 위하여, 니볼루맙의 중쇄 및 경쇄를 각각 인코딩하는 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 핵산 서열을 포함하는 DNA 구조체를 발현 벡터로 클로닝하였다. 이러한 목적을 위하여 사용된 DNA 구조체는 (i) 항체의 중쇄 및 경쇄를 각각 인코딩하는 서열 번호 8 및 서열 번호 9의 핵산 서열, 및 (ii) 발현 벡터로의 클로닝을 가능하게 하는 제한 부위를 포함하는 서열 번호 12 및 서열 번호 13의 핵산 서열을 포함한다.

결과적으로, 서열 번호 8 및 서열 번호 12의 핵산 서열을 포함하는 DNA 구조체는, 각각 다음:

- 서열 번호 1의 핵산 서열 (TIS^EVO)을 포함하는 첫번째 핵산 서열;

을 포함하며,

여기서 서열 번호 1의 상기 첫번째 핵산 서열은:

를 포함한다.

유사하게, 서열 번호 9 및 서열 번호 13의 핵산 서열을 포함하는 DNA 구조체는, 각각 다음:

- 서열 번호 1의 핵산 서열 (TIS^EVO)을 포함하는 두번째 핵산 서열;

을 포함하며,

여기서 서열 번호 1의 상기 두번째 핵산 서열은:

를 포함한다.

TIS^CON의 활성을 테스트하기 위하여, 니볼루맙의 중쇄(서열 번호 4) 및 경쇄(서열 번호 6)를 각각 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 2개의 DNA 구조체를 발현 벡터로 클로닝하였다. TIS^EVO를 테스트하기 위한 전술한 벡터와 유사하게, 니볼루맙의 중쇄(서열 번호 4) 및 경쇄(서열 번호 6)를 인코딩하는 각각의 핵산 서열은 신호 펩티드 MDLLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS를 발현시키는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되었다. 상기 신호 펩티드를 발현시키는 각각의 핵산 서열은 GCCACC의 TIS 서열에 작동 가능하게 연결되었다.

결과적으로, TIS^CON 벡터 및 TIS^EVO 벡터는 다음과 같은 점에서만 단지 다르다(핵산 및 아미노산 서열의 차이가 밑줄로 표시됨):

- TIS^CON 벡터는 GCCACCATGGA의 2개의 TIS^CON 서열을 포함하는 반면, TIS^EVO 벡터는 TCGGTCATGGC의 2개의 TIS^EVO 서열을 포함하며; 그리고

- TIS^CON 벡터는 아미노산 서열 MDLLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS의 신호 펩티드를 각각 발현시키는 2개의 핵산 서열을 포함하는 반면, TIS^EVO 벡터는 아미노산 서열 MALLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS의 신호 펩티드를 각각 발현시키는 2개의 핵산 서열을 포함한다.

미니 풀 및 클론 평가를 위한 유가식 배양

표준 유가식 공정은 미니 풀 및 클론 평가를 위한 일반적인 공정에 따라 실행되었다. 세포는 125mL 진탕 플라스크(미니 풀) 또는 ambr15 마이크로생물반응기(클론)를 사용하여 25mL의 화학적으로 정해진 생산 배지 중에서 3×10⁵개 cells/mL의 밀도로 접종되었다. 표준 공급 요법에 따라 사료(Feed) A, 사료 B 및 글루코오스를 첨가하였다. 세포 밀도, 생존율, 생성물 농도, 포도당 및 젖산에 대해 배양물을 조절하였다. 세포를 최대 14일 동안 또는 생존율이 70% 미만으로 떨어질 때까지 배양하였다.

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> Xbrane Biopharma AB <120> NOVEL COMBINATION OF TIS SEQUENCE AND SIGNAL PEPTIDE SEQUENCE FOR EXPRESSING A RECOMBINANT PROTEIN <130> 2020Q105-2 <160> 14 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak sequence - DNA <400> 1 tcggtcatgg c 11 <210> 2 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide - DNA sequence <400> 2 atggctctgc tgcacaagaa catgaagcac ctgtggttct ttctgctgct ggtggccgct 60 cctagatggg tgctgtct 78 <210> 3 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide aa sequence <400> 3 Met Ala Leu Leu His Lys Asn Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser 20 25 <210> 4 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nivolumab - heavy chain - DNA sequence <400> 4 caggtgcagc tggttgaatc tggtggcgga gtggtgcagc ctggcagatc tctgagactg 60 gattgcaagg cctccggcat caccttctcc aactctggca tgcactgggt ccgacaggcc 120 cctggaaaag gactggaatg ggtcgccgtg atttggtacg acggctctaa gcggtactac 180 gccgactccg tgaagggcag attcaccatc tctcgggaca actccaagaa caccctgttt 240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgtgc caccaacgat 300 gattattggg gccagggcac actggtcacc gtgtcctctg cttctaccaa gggaccctct 360 gtgttccctc tggctccttg ctccagatcc acctctgagt ctaccgctgc tctgggctgc 420 ctggtcaagg attactttcc tgagcctgtg accgtgtctt ggaactctgg tgctctgacc 480 tccggcgtgc acacatttcc agctgtgctg cagtcctccg gcctgtactc tctgtcctct 540 gtcgtgaccg tgccttctag ctctctgggc accaagacct acacctgtaa cgtggaccac 600 aagccttcca acaccaaggt ggacaagcgc gtggaatcta agtacggccc tccttgtcct 660 ccatgtcctg ctccagaatt cctcggcgga ccttccgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 720 aaggacaccc tgatgatctc tcggacccct gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 780 caagaggacc ccgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 840 aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 900 gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 960 ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctcg ggaacctcag 1020 gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1080 ctcgtgaagg gattctaccc ttccgatatc gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1140 gagaacaact acaagacaac ccctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtat 1200 tcccgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1260 atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaagtccc tgtctctgtc cctgggcaaa 1320 tgatag 1326 <210> 5 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nivolumab - heavy chain - protein sequence <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser 115 120 125 Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys 180 185 190 Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 210 215 220 Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 225 230 235 240 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 245 250 255 Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 260 265 270 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 275 280 285 Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 290 295 300 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 305 310 315 320 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 325 330 335 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr 340 345 350 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 355 360 365 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 370 375 380 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 385 390 395 400 Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe 405 410 415 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 420 425 430 Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 6 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nivolumab - light chain - DNA sequence <400> 6 gagatcgtgc tgacccagtc tcctgccaca ttgtctctga gtcctggcga gagagctacc 60 ctgtcttgca gagcttccca gtccgtgtcc tcctacctgg cctggtatca gcagaaacct 120 ggacaggccc ctcggctgct gatctacgat gcctctaata gagccacagg catccccgcc 180 agattctctg gctctggatc tggcaccgac ttcaccctga ccatctctag cctggaacct 240 gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag tcctccaact ggcctagaac ctttggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa gagaaccgtg gctgcccctt ccgtgttcat cttcccacca 360 tctgacgagc agctgaagtc cggcacagct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420 cctcgggaag ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagtccgg caactcccaa 480 gagtctgtga ccgagcagga ctccaaggac tctacctaca gcctgtcctc cacactgacc 540 ctgtctaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gtgaagtgac ccaccaggga 600 ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac agaggcgagt gctgatag 648 <210> 7 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nivolumab - light chain - protein sequence <400> 7 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 8 <211> 1410 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak - SP - protein heavy chain - DNA <400> 8 tcggtcatgg ccctgctgca caagaacatg aagcacctgt ggttctttct gctgctggtg 60 gccgctccta gatgggtgtt gtctcaggtg cagctggttg aatctggtgg cggagtggtg 120 cagcctggca gatctctgag actggattgc aaggcctccg gcatcacctt ctccaactct 180 ggcatgcact gggtccgaca ggcccctgga aaaggactgg aatgggtcgc cgtgatttgg 240 tacgacggct ctaagcggta ctacgccgac tccgtgaagg gcagattcac catctctcgg 300 gacaactcca agaacaccct gtttctgcag atgaactccc tgagagccga ggacaccgcc 360 gtgtactact gtgccaccaa cgatgattat tggggccagg gcacactggt caccgtgtcc 420 tctgcttcta ccaagggacc ctctgtgttc cctctggctc cttgctccag atccacctct 480 gagtctaccg ctgctctggg ctgcctggtc aaggattact ttcctgagcc tgtgaccgtg 540 tcttggaact ctggtgctct gacctccggc gtgcacacat ttccagctgt gctgcagtcc 600 tccggcctgt actctctgtc ctctgtcgtg accgtgcctt ctagctctct gggcaccaag 660 acctacacct gtaacgtgga ccacaagcct tccaacacca aggtggacaa gcgcgtggaa 720 tctaagtacg gccctccttg tcctccatgt cctgctccag aattcctcgg cggaccttcc 780 gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac accctgatga tctctcggac ccctgaagtg 840 acctgcgtgg tggtggatgt gtctcaagag gaccccgagg tgcagttcaa ttggtacgtg 900 gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcctagag aggaacagtt caactccacc 960 tacagagtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac 1020 aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct tccagcatcg aaaagaccat ctccaaggct 1080 aagggccagc ctcgggaacc tcaggtttac accctgcctc caagccaaga ggaaatgacc 1140 aagaaccagg tgtccctgac ctgcctcgtg aagggattct acccttccga tatcgccgtg 1200 gaatgggagt ccaatggcca gcctgagaac aactacaaga caacccctcc tgtgctggac 1260 tccgacggct ccttctttct gtattcccgc ctgaccgtgg acaagtctag atggcaagag 1320 ggcaacgtgt tctcctgctc tgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1380 tccctgtctc tgtccctggg caaatgatag 1410 <210> 9 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak - SP - protein light chain - DNA <400> 9 tcggtcatgg ccctgctgca caagaacatg aagcacctgt ggttctttct gctgctggtg 60 gccgctccta gatgggtgct gtctgagatc gtgctgaccc agtctcctgc cacattgtct 120 ctgagtcctg gcgagagagc taccctgtct tgcagagctt cccagtccgt gtcctcctac 180 ctggcctggt atcagcagaa acctggacag gcccctcggc tgctgatcta cgatgcctct 240 aatagagcca caggcatccc cgccagattc tctggctctg gatctggcac cgacttcacc 300 ctgaccatct ctagcctgga acctgaggac ttcgccgtgt actactgcca gcagtcctcc 360 aactggccta gaacctttgg ccagggcacc aaggtggaaa tcaagagaac cgtggctgcc 420 ccttccgtgt tcatcttccc accatctgac gagcagctga agtccggcac agcttctgtc 480 gtgtgcctgc tgaacaactt ctaccctcgg gaagccaagg tgcagtggaa ggtggacaat 540 gccctgcagt ccggcaactc ccaagagtct gtgaccgagc aggactccaa ggactctacc 600 tacagcctgt cctccacact gaccctgtct aaggccgact acgagaagca caaggtgtac 660 gcctgtgaag tgacccacca gggactgtct agccccgtga ccaagtcttt caacagaggc 720 gagtgctgat ag 732 <210> 10 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP - protein heavy chain - protein <400> 10 Met Ala Leu Leu His Lys Asn Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Glu 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys 35 40 45 Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg 50 55 60 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp 65 70 75 80 Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu 100 105 110 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val 210 215 220 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 225 230 235 240 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 11 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP - protein light chain - protein <400> 11 Met Ala Leu Leu His Lys Asn Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln 20 25 30 Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser 35 40 45 Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg 65 70 75 80 Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 165 170 175 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 210 215 220 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 12 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction site - SP - protein heavy chain - DNA <400> 12 ggtacctcgg tcatggccct gctgcacaag aacatgaagc acctgtggtt ctttctgctg 60 ctggtggccg ctcctagatg ggtgttgtct caggtgcagc tggttgaatc tggtggcgga 120 gtggtgcagc ctggcagatc tctgagactg gattgcaagg cctccggcat caccttctcc 180 aactctggca tgcactgggt ccgacaggcc cctggaaaag gactggaatg ggtcgccgtg 240 atttggtacg acggctctaa gcggtactac gccgactccg tgaagggcag attcaccatc 300 tctcgggaca actccaagaa caccctgttt ctgcagatga actccctgag agccgaggac 360 accgccgtgt actactgtgc caccaacgat gattattggg gccagggcac actggtcacc 420 gtgtcctctg cttctaccaa gggaccctct gtgttccctc tggctccttg ctccagatcc 480 acctctgagt ctaccgctgc tctgggctgc ctggtcaagg attactttcc tgagcctgtg 540 accgtgtctt ggaactctgg tgctctgacc tccggcgtgc acacatttcc agctgtgctg 600 cagtcctccg gcctgtactc tctgtcctct gtcgtgaccg tgccttctag ctctctgggc 660 accaagacct acacctgtaa cgtggaccac aagccttcca acaccaaggt ggacaagcgc 720 gtggaatcta agtacggccc tccttgtcct ccatgtcctg ctccagaatt cctcggcgga 780 ccttccgtgt tcctgtttcc tccaaagcct aaggacaccc tgatgatctc tcggacccct 840 gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct caagaggacc ccgaggtgca gttcaattgg 900 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagttcaac 960 tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 1020 gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc 1080 aaggctaagg gccagcctcg ggaacctcag gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa 1140 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctcgtgaagg gattctaccc ttccgatatc 1200 gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct gagaacaact acaagacaac ccctcctgtg 1260 ctggactccg acggctcctt ctttctgtat tcccgcctga ccgtggacaa gtctagatgg 1320 caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1380 cagaagtccc tgtctctgtc cctgggcaaa tgatagaagc tt 1422 <210> 13 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction site - SP - light chain - DNA <400> 13 ggatcctcgg tcatggccct gctgcacaag aacatgaagc acctgtggtt ctttctgctg 60 ctggtggccg ctcctagatg ggtgctgtct gagatcgtgc tgacccagtc tcctgccaca 120 ttgtctctga gtcctggcga gagagctacc ctgtcttgca gagcttccca gtccgtgtcc 180 tcctacctgg cctggtatca gcagaaacct ggacaggccc ctcggctgct gatctacgat 240 gcctctaata gagccacagg catccccgcc agattctctg gctctggatc tggcaccgac 300 ttcaccctga ccatctctag cctggaacct gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag 360 tcctccaact ggcctagaac ctttggccag ggcaccaagg tggaaatcaa gagaaccgtg 420 gctgcccctt ccgtgttcat cttcccacca tctgacgagc agctgaagtc cggcacagct 480 tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac cctcgggaag ccaaggtgca gtggaaggtg 540 gacaatgccc tgcagtccgg caactcccaa gagtctgtga ccgagcagga ctccaaggac 600 tctacctaca gcctgtcctc cacactgacc ctgtctaagg ccgactacga gaagcacaag 660 gtgtacgcct gtgaagtgac ccaccaggga ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac 720 agaggcgagt gctgatagct cgag 744 <210> 14 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TIS RNA <400> 14 ucggucaugg c 11

Claims

포유동물 세포에서 재조합 단백질을 발현시키기 위한 DNA 구조체(DNA construct)로서, 여기서 DNA 구조체가:
- 서열 번호 1의 핵산 서열로서, 여기서 서열 번호 1의 핵산 서열이 TIS 서열인, 서열 번호 1의 핵산 서열; 및
- 신호 펩티드를 인코딩(encodes)하는 핵산 서열;
을 포함하며,
여기서 서열 번호 1의 핵산 서열이:
- 신호 펩티드의 첫번째 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산 서열에서의 ATG 개시 코돈(ATG start codon); 및
- 신호 펩티드의 두번째 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산 서열에서의 ATG 개시 코돈의 다운스트림(downstream)의 첫번째 2개의 뉴클레오티드;
를 포함하는, DNA 구조체.
청구항 1에 있어서, TIS 서열이 mRNA 전사체(mRNA transcript)에서 단백질 번역 개시 부위(protein translation initiation site)로서 기능하는 RNA 모티프(RNA motif)로 전사되는, DNA 구조체.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, TIS 서열이 mRNA 전사체에서 단백질 번역 개시 부위로서 기능하는 RNA 모티프로 전사되는 코작(Kozak) 서열인, DNA 구조체.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1의 핵산 서열이:
- ATG 개시 코돈의 업스트림(upstream)의 6개의 뉴클레오티드; 및
- ATG 개시 코돈의 다운스트림의 2개의 뉴클레오티드;
를 포함하는, DNA 구조체.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이 서열 번호 2의 핵산 서열을 포함하는, DNA 구조체.
청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1의 핵산 서열이:
- 서열 번호 2에서의 ATG 개시 코돈; 및
- 서열 번호 2의 핵산 서열에서의 ATG 개시 코돈의 다운스트림의 첫번째 2개의 뉴클레오티드;
를 포함하는, DNA 구조체.
청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, DNA 구조체가 상기 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 상기 재조합 단백질이 바람직하게는 항체이고, 여기서 상기 항체가 가장 바람직하게는 단일클론 항체(monoclonal antibody), 다클론 항체(polyclonal antibody), 키메라 항체(chimeric antibody) 또는 상기 항체의 단편(fragment)인, DNA 구조체.
청구항 7에 있어서, 상기 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 DNA 구조체가 단일클론 항체이고, 바람직하게는 IgG4 단일클론 항체인, DNA 구조체.
청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되는(operably linked), DNA 구조체.
청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이:
- 항체의 중쇄(heavy chain)를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열; 및
- 항체의 경쇄(light chain)를 인코딩하는 두번째 핵산 서열;
을 포함하는, DNA 구조체.
청구항 10에 있어서, 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이:
- 항체의 중쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열; 및/또는
- 항체의 경쇄를 인코딩하는 두번째 핵산 서열;
에 작동 가능하게 연결되는, DNA 구조체.
청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체를 포함하는 발현 벡터(expression vector).
청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체를 포함하는 발현 카세트(expression cassette).
청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체를 포함하는 숙주 세포(host cell)로서, 여기서 상기 숙주 세포가 바람직하게는 진핵 세포(eukaryotic cell)인, 숙주 세포.
청구항 14에 있어서, 상기 숙주 세포가 포유동물 세포인, 숙주 세포.
청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체에 의해 발현된 재조합 단백질로서, 상기 재조합 단백질이 바람직하게는 항체 또는 그의 항체 단편이고, 보다 바람직하게는 단일클론 항체 또는 그의 단편이고, 가장 바람직하게는 IgG4 단일클론 항체 또는 그의 단편인, 재조합 단백질.
청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 따른 DNA 구조체에 의해 발현된 RNA.
재조합 단백질을 발현시키는 방법으로서, 다음 단계:
- 재조합 단백질, 또는 그의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 오픈 리딩 프레임(open reading frames)을 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 DNA 구조체로 클로닝(cloning)하는 단계; 및
- 생성된(resulting) 핵산 서열을 숙주 세포로 형질감염(transfecting)시키는 단계로서, 여기서 숙주 세포가 바람직하게는 진핵 세포이고, 보다 바람직하게는 포유동물 세포인, 단계;
를 포함하는 방법.
청구항 18에 있어서, 형질감염된 핵산 서열을 숙주 세포의 게놈으로 통합(integrating)시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
신호 펩티드를 발현시키기 위한 DNA 구조체로서, 여기서 DNA 구조체가 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이 서열 번호 2의 핵산 서열을 포함하는, DNA 구조체.
청구항 20에 따른 DNA 구조체를 포함하는 발현 벡터.
청구항 20에 따른 DNA 구조체를 포함하는 발현 카세트.
청구항 20에 따른 DNA 구조체를 포함하는 숙주 세포.
청구항 20에 따른 DNA 구조체에 의해 발현된 RNA.