KR20220133257A - 전기천공 모듈 및 기구 - Google Patents

Abstract

본 개시는 독립형 유닛으로서 또는 자동화된 다중-모듈 세포 처리 환경에서 사용하도록 구성되고 세포 처리 시간 및 세포 생존을 감소시키도록 구성된 구체-패킹 격자 전기천공 장치를 제공한다.

Description

전기천공 모듈 및 기구

관련 사례

[0001] 본 국제 PCT 출원은 2020년 1월 27일에 출원된 USSN 62/966,088에 대한 우선권을 주장한다.

발명의 분야

[0002] 본 개시는 세포를 외인성 물질로 형질전환시키기 위한 다양한 전기천공 장치에 사용되는 구체-패킹 격자에 관한 것이다. 구체-패킹 격자를 이용하는 전기천공 장치는 독립형 전기천공 모듈로서 또는 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에서 하나의 모듈로서 구성될 수 있다.

발명의 배경

[0003] 다음 논의에서 특정 물품 및 방법이 배경 및 소개 목적으로 설명될 것이다. 본원에 포함된 어떠한 것도 선행 기술의 "승인"으로 해석되어서는 안 된다. 출원인은 적절한 경우 본원에 언급된 물품 및 방법이 적용 가능한 법적 조항에 따라 선행 기술을 구성하지 않음을 입증할 권리를 명시적으로 보유한다.

[0004] 세포막은 세포의 내부와 외부 사이에서 분자와 이온의 수송을 위한 일차 장벽을 구성한다. 전기투과성으로도 알려진 전기천공은 펄스 전기장의 존재 하에 세포막 투과성을 실질적으로 증가시킨다. 전통적인 전기천공 시스템이 널리 사용되어 왔다; 그러나, 전통적인 시스템은 높은 전류 입력을 필요로 하고, 전기장 왜곡, 국소 pH 변화, 금속 이온 용해 및 과도한 열 생성과 같은 불리한 환경 조건을 겪으며, 이들 모두는 낮은 전기천공 효율 및/또는 세포 생존력의 원인이 될 수 있다. 세포 형질감염을 위한 전통적인 전기천공 방법은 전달 과정의 상대적인 비효율성을 극복하기 위해 외인성 분자를 과량(즉, "높은 카피 수")으로 공급해야 한다. 따라서, 각각의 전기천공 반응은 전형적으로 단일 종의 페이로드 분자(즉, "단일-플렉스 전달")로 제한된다. 또한, 전통적인 전기천공 시스템은 쉽게 자동화되지 않거나 전기천공이 수행되는 많은 프로세스 중 하나의 프로세스인 자동화된 세포 처리 시스템에 통합된다.

[0005] 따라서, 효율적이고 자동화된 방식으로 다수의 세포를 형질전환할 수 있는 개선된 전기천공 조성물, 방법 및 자동화된 다중-모듈 세포 처리 시스템에 대한 요구가 있다. 본 발명은 이러한 요구를 해결한다.

발명의 개요

[0006] 본 요약은 아래의 상세한 설명에서 추가로 설명되는 개념의 선택을 단순화된 형태로 소개하기 위해 제공된다. 본 요약은 청구된 주제의 핵심 또는 필수 특징을 식별하기 위한 것이 아니며 청구된 주제의 범위를 제한하기 위해 사용된 것도 아니다. 청구된 주제의 다른 특징, 세부 사항, 유용성 및 이점은 첨부된 도면에 예시되고 첨부된 청구 범위에 정의된 양태를 포함하는 다음의 문서화된 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.

[0007] 본 개시는 격자-형성 비드, 시약 번들 및 세포를 포함하는 구체-패킹 격자를 제공하며, 여기서 구체-패킹 격자는 세포를 형질전환하기 위한 다양한 전기천공 장치에 사용될 수 있다. 전기천공 장치는 독립형 전기천공 장치로서 사용하거나 자동화된 다중-모듈 세포 처리 환경에서 사용하도록 구성될 수 있다. 구체-패킹 격자는 크기가 균일하고 결정질-유사 격자로 자가-조립되는 격자-형성 비드를 사용한다. 시약 번들은 결정질-유사 격자의 틈새 영역에 맞도록 충분히 작은 비드 또는 다른 기질(예를 들어, 시약 전달 기질)에 고정되고 여기서 시약 번들은 세포로 전달되는 외인성 물질(예를 들어, DNA, RNA, 단백질, 리보단백질 복합체)의 다수의 클론 카피를 포함한다.

[0008] 세포를 전기천공할 때 구체-패킹 격자를 사용하는 데는 두 가지 주요 이점이 있다. 첫째, 세포 및 외인성 물질을 격자 틈새 공간으로 밀집시킴으로써, 세포에 근접한 외인성 물질의 "유효" 농도가 배지 내의 외인성 물질의 총량에 영향을 미치지 않으면서 증가된다. 외인성 물질이 전기 전도도를 증가시킬 수 있기 때문에(예를 들어, DNA의 경우에서와 같이), 전기천공 장치에 첨가될 수 있는 총 외인성 물질의 상한 임계값은 세포가 견딜 수 있는 전류/줄(Joule) 가열의 양에 의해 결정된다. 구체-패킹 격자를 사용하는 전기천공은 배지의 벌크 전도도에 영향을 주지 않으면서 세포에 전달되는 외인성 물질의 양을 증가시켜 배지의 가열을 감소시키고 세포 생존력을 증가시킴으로써 형질전환 또는 형질감염 효율을 개선시킨다. 둘째, 구체 패킹은 개별 시약 번들을 격자-형성 비드에 의해 물리적으로 분리된 틈새 격자 영역으로 분할하여, 국소 환경을 생성함으로써, 다수의 고유한 시약 유형이 세포에 동시에 전달될 수 있게 한다(즉, "다중화" 시약 전달).

[0009] 따라서, 일부 구현예에서, 세포, 격자-형성 비드 및 시약 전달 기질의 구체-패킹 조성물을 배지에 제공하는 단계로서, 상기 시약 전달 기질이 격자-형성 비드에 의해 형성된 격자의 틈새 영역에 맞도록 크기가 조정되는, 단계; 시약 전달 기질로부터 시약의 방출을 촉발시키는 단계; 및 세포, 격자-형성 비드 및 시약의 구체-패킹 조성물에 전기 펄스를 제공하는 단계를 포함하는 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 방법이 제공된다.

[0010] 일부 양태에서, 상기 방법은 제2 제공 단계 이후에, 격자를 해체하는 단계; 및 해체된 격자로부터 세포를 수집하는 단계를 추가로 포함한다.

[0011] 일부 양태에서, 시약 번들은 외인성 물질의 다수의 클론 카피를 포함하고, 일부 양태에서, 외인성 물질은 DNA, RNA, 단백질 또는 리보단백질 복합체이다. 일부 양태에서, 시약 번들은 상이한 외인성 물질을 포함한다; 즉, 일부 시약 번들은 시약 A를 포함할 수 있고, 일부 시약 번들은 시약 B를 포함할 수 있으며, 일부 시약 번들은 시약 C를 포함할 수 있으며(기타 등등), 최대 100만 개 이상의 상이한 시약(예를 들어, 핵산 또는 단백질 라이브러리의 상이한 구성원)을 포함한다.

[0012] 상기 방법의 일부 양태에서, 시약 전달 기질은 중합성 마이크로입자, 세라믹 마이크로입자 또는 하이드로겔 마이크로입자로부터 선택되고, 일부 양태에서, 중합성 입자는 폴리스티렌 비드이고, 하이드로겔 입자는 가교된 중합체를 포함하고, 가교된 중합체는 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜 또는 알기네이트로부터 선택된다.

[0013] 일부 양태에서, 격자-형성 비드는 중합성 하이드로겔이고, 일부 양태에서, 중합성 하이드로겔은 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 알기네이트 또는 젤라틴으로부터 선택된다.

[0014] 전형적으로, 격자-형성 비드의 직경은 75 내지 250 μm이거나, 직경은 125 내지 150 μm이다.

[0015] 일부 구현예에서, 시약 번들로부터의 시약 방출은 화학적 트리거, 광자 트리거, 전기적 트리거 또는 온도 트리거에 의해 촉발된다. 일부 양태에서, 화학적 트리거는 효소적, pH 또는 경쟁적 결합 반응 트리거이고, 광자 트리거는 UV 또는 가시 광선이고, 전기적 트리거는 소포의 전기장 유도 불안정화이다.

[0016] 일부 양태에서, 세포, 격자-형성 비드 및 시약 전달 기질의 조성물의 부피는 10 내지 500 μL이다.

[0017] 일부 양태에서, 시약 전달 기질의 직경은 20 내지 90 μm이고, 일부 양태에서, 시약 전달 기질의 직경은 30 내지 50 μm이다.

[0018] 놀랍게도, 세포에 전달되는 시약(예를 들어, 외인성 물질)이 시약 번들에 의해 전달되지 않고 대신 세포 및 격자-형성 비드가 현탁된 배지에 존재하는 시약 번들이 없는 시스템이 발견되었다. 따라서, 대안적인 구현예에서, 세포, 격자-형성 비드 및 외인성 물질의 구체-패킹 조성물을 배지에 제공하는 단계; 및 세포, 격자-형성 비드 및 시약의 구체-패킹 조성물에 전기 펄스를 제공하는 단계를 포함하는 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 방법이 제공된다. 추가 단계는, 제2 제공 단계 후에, 격자를 해체하는 단계; 및 해체된 격자로부터 세포를 수집하는 단계를 포함한다.

[0019] 본 발명의 이러한 양태 및 다른 특징 및 이점은 아래에서 보다 상세히 설명된다.

도면의 간단한 설명

[0020] 본 발명의 상기 및 다른 특징 및 이점은 첨부된 도면과 함께 취해진 예시적인 구현예의 하기 상세한 설명으로부터 더욱 완전히 이해될 것이다:

[0021] 도 1a는 구체-패킹 격자에서 세포를 전기천공하는 방법의 단순화된 블록도이다. 도 1b는 페이로드(예를 들어, 시약) 방출 전후에 격자-형성 비드, 세포 및 시약 번들을 갖는 구체-패킹 격자를 단순화된 도면으로 도시한다.

[0022] 도 2a-2d는 편집된 세포를 생성하기 위한 자동화된 다중-모듈 기기 및 이의 모듈 및 구성요소를 도시한다.

[0023] 도 3a-3k는 구체-패킹 격자가 세포를 형질전환하기 위해 관통할 수 있는 예시적인 관통형(flow-through) 전기천공 장치(FTEP)의 구조 및 구성요소를 도시한다.

[0024] 도 4a 및 4b는 시약 카트리지의 예시적인 구현예의 구조 및 구성요소를 도시한다.

[0025] 도 5a는 세포 성장 모듈과 함께 사용하기 위한 회전 성장 바이알의 일 구현예를 도시한다. 도 5b는 세포 성장 모듈에서 회전 성장 바이알의 일 구현예의 사시도를 예시한다. 도 5c는 도 5b로부터의 세포 성장 모듈의 컷어웨이 도면을 도시한다. 도 5d는 LED, 검출기 및 온도 조절 구성요소에 연결된 도 5b의 세포 성장 모듈을 예시한다.

[0026] 도 6a는 접선 유동 여과 모듈(예를 들어, 세포 성장 및/또는 농축 모듈)에 사용하기 위한 보유물(상단) 및 투과물(하단) 부재뿐만 아니라 접선 유동 조립체로 조립된 보유물 및 투과물 부재(하단)를 도시한다. 도 6b는 접선 유동 여과 모듈의 저장소 조립체의 2개의 측면 사시도를 도시한다. 도 6c-6e는 도 6b에 도시된 저장소 조립체에 적합한 유체 및 공압 포트 및 개스킷을 갖는 예시적인 상부를 도시한다.

[0027] 도 7a는 세포를 단일화, 편집 및 정규화(normalizing)하기 위한 워크플로우의 단순화된 그래픽을 도시한다. 도 7b-7d는 고체 벽 분리 인큐베이션 및 정규화(SWIIN) 모듈의 구현예를 도시한다. 도 7e는 히터 및 가열된 커버를 추가로 포함하는 도 7b-7d의 SWIIN 모듈의 구현예를 도시한다.

[0028] 도 8은 구체-패킹 격자에서 세포를 형질전환하기 위해 FTEP를 사용하는 자동화된 다중-모듈 세포 편집을 위한 예시적인 방법의 흐름도이다.

[0029] 도 9는 예시적인 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 구현예의 단순화된 블록도이다.

[0030] 도 10은 반복적 편집에 사용되는 경우에 사용되는 예시적인 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 대안적인 구현예의 단순화된 블록도이다.

[0031] 도 11은 예시적인 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 또 다른 구현예의 단순화된 프로세스 도면이다.

[0032] 도 12는 비드의 벌크 혼합 슬러리에 의해 형성된 125 μm 폴리아크릴아미드 비드(예를 들어, 격자-형성 비드) 및 40 μm 폴리스티렌 비드(예를 들어, 시약 번들)를 사용하는 자가-조립된 구체-패킹 격자를 보여준다.

[0033] 도 13a 및 13b는 형광 표지된 DNA가 비드 사이의 틈새 영역 내에 보유된 폴리아크릴아미드 하이드로겔 비드를 보여주는 현미경 사진이다. 도 13c는 DNA를 함유하는 배지의 전도도가 폴리아크릴아미드 하이드로겔 비드의 유무에 관계 없이 동일함을 보여주는 막대 그래프이다.

[0034] 도 14는 구체-패킹 격자가 있는 배지에서 형광 표지된 DNA를 갖는 HEK293 세포의 형질전환 효율이 구체-패킹 격자가 없는 배지에서의 형질전환 효율과 유사함을 보여주는 막대 그래프이다.

[0035] 도면은 반드시 일정한 비율일 필요는 없으며, 유사한 참조 번호는 유사한 특징을 지칭한다는 것을 이해하여야 한다.

상세한 설명

[0036] 본원에 기술된 방법, 장치 또는 기기의 일 구현예와 관련하여 설명된 모든 기능은 명시적으로 언급된 경우 또는 특징 또는 기능이 추가 구현예들과 호환되지 않는 경우를 제외하고는 본원에 기술된 방법, 장치 및 기기의 추가 구현예들에 적용 가능하도록 의도된다. 예를 들어, 주어진 특징 또는 기능이 일 구현예와 관련하여 명시적으로 설명되지만 대안적인 구현예와 관련하여 명시적으로 언급되지 않은 경우, 특징 또는 기능이 대안적인 구현예와 호환되지 않는 것이 아닌 한 그 특징 또는 기능은 대안적인 구현예와 관련하여 전개, 활용 또는 구현될 수 있음이 이해되어야 한다.

[0037] 본원에 기재된 기술의 실행은 달리 지시되지 않는 한, 분자 생물학(재조합 기술 포함), 세포 생물학, 생화학 및 유전 공학 기술의 통상적인 기술 및 설명을 사용할 수 있으며, 이는 당 분야에 종사하는 사람들의 기술 내에 있다. 이러한 통상적인 기술 및 설명은 문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2014); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al. eds., (2017); Neumann, et al., Electroporation and Electrofusion in Cell Biology, Plenum Press, New York, 1989; and Chang, et al., Guide to Electroporation and Electrofusion, Academic Press, California (1992)]과 같은 표준 실험실 매뉴얼에서 찾을 수 있으며, 이들 모두는 모든 목적을 위해 그 전체내용이 본원에 참조로 포함된다. 핵산-가이드된 뉴클레아제 기술은, 예를 들어, 문헌[Genome Editing and Engineering from TALENs and CRISPRs to Molecular Surgery, Appasani and Church (2018); and CRISPR: Methods and Protocols, Lindgren and Charpentier (2015)]에서 찾을 수 있으며; 둘 모두는 모든 목적을 위해 그 전체내용이 본원에 참조로 포함된다.

[0038] 본원 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 단수 형태는 문맥상 명확하게 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함하는 것에 유의한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 하나 이상의 세포를 지칭하고, "시스템"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 동등한 단계, 방법 및 장치에 대한 언급을 포함하며, 그 외에도 마찬가지이다. 또한, 본원에서 사용될 수 있는 "좌측", "우측", "상단", "하단", "전방", "후방", "측면", "높이", "길이", "폭", "상부", "하부", "내부", "외부", "내면", "외측"과 같은 용어는 단지 참조 포인트를 설명하는 것이며, 본 개시의 구현예를 임의의 특정 배향 또는 구성으로 반드시 제한하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 더욱이, "제1", "제2", "제3" 등과 같은 용어는 단지 본원에 개시된 바와 같은 다수의 부분, 구성요소, 단계, 동작, 기능 및/또는 참조 포인트 중 하나를 식별하는 것이며, 마찬가지로 본 개시의 구현예를 임의의 특정 구성 또는 배향으로 반드시 제한하는 것이 아니다.

[0039] 추가로, 용어 "대략", "근접한", "작은" 및 유사한 용어는 일반적으로 특정 구현예에서 20%, 10% 또는 바람직하게는 5%의 차이 내에서 식별된 값, 및 그 사이의 임의의 값을 포함하는 범위를 지칭한다.

[0040] 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 간행물은 본원에 기재된 발명과 관련하여 사용될 수 있는 장치, 제형 및 방법을 설명하고 개시할 목적으로 참조로 포함된다.

[0041] 값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 중간 값 및 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 값 또는 중간 값이 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 언급된 범위 내에서 임의의 특별히 배제되는 한계를 조건으로 하여, 더 작은 범위의 상한 및 하한이 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 본 발명에 또한 포함된다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 상기 포함된 한계 중 어느 하나 또는 둘 모두를 배제한 범위가 또한 본 발명에 포함된다.

[0042] 다음의 설명에서, 본 발명의 보다 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부 사항이 제시된다. 그러나, 본 발명이 이들 특정 세부 사항 중 하나 이상 없이 실시될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 예에서, 본 발명을 불명료하게 하는 것을 피하기 위해 당업자에게 널리 공지된 특징 및 절차는 설명되지 않았다. 본원에서 사용되는 용어는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 평범하고 일반적인 의미를 갖는 것으로 의도된다.

[0043] 본원에서 사용되는 용어 "상보적"은 뉴클레오티드 사이의 왓슨-크릭 염기쌍을 지칭하며, 구체적으로 2개의 수소 결합에 의해 아데닌 잔기에 연결된 티민 또는 우라실 잔기 및 3개의 수소 결합에 의해 연결된 시토신 및 구아닌 잔기를 포함하는 서로 수소 결합된 뉴클레오티드를 지칭한다. 일반적으로, 핵산은 특정 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 "상보성 퍼센트" 또는 "상동성 퍼센트"를 갖는 것으로 설명된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 특정 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 80%, 90% 또는 100% 상보성을 가질 수 있으며, 이는 서열의 10개의 뉴클레오티드 중 8개, 10개 중 9개 또는 10개 중 10개가 특정 제2 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적임을 나타낸다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 3'-TCGA-5'는 뉴클레오티드 서열 5'-AGCT-3'에 대해 100% 상보적이며; 뉴클레오티드 서열 3'-TCGA-5'는 뉴클레오티드 서열 5'-TAGCTG-3'의 영역에 100% 상보적이다.

[0044] 용어 DNA "조절 서열"은 수용자 세포에서 코딩 서열의 복제, 전사 및 번역을 집합적으로 제공하는 프로모터 서열, 아데닐중합체형성 신호, 전사 종결 서열, 업스트림 조절 도메인, 복제 기점, 내부 리보솜 진입 부위, 핵 국소화 서열, 인핸서 등을 집합적으로 나타낸다. 선택된 코딩 서열이 적절한 숙주 세포에서 복제되고, 전사되고, (일부 구성요소의 경우) 번역될 수 있는 한 이들 유형의 조절 서열 모두가 존재할 필요는 없다.

[0045] 본원에서 사용되는 용어 "공여자 DNA" 또는 "공여자 핵산"은 핵산-가이드된 뉴클레아제를 사용한 상동성 재조합에 의해 DNA 서열 변형(삽입, 결실, 치환)을 유전자좌에 도입하도록 설계된 핵산을 지칭한다. 상동성 지시된 복구를 위해, 공여자 DNA는 "절단 부위" 또는 게놈 표적 서열에서 편집될 부위에 측접한 영역에 대해 충분한 상동성을 가져야 한다. 상동성 아암(들)의 길이는, 예를 들어, 이루어질 변형의 유형 및 크기에 좌우될 것이다. 많은 경우에 바람직하게는, 공여자 DNA는 게놈 표적 유전자좌에 대해 서열 상동성의 2개의 영역(예를 들어, 2개의 상동성 아암)을 가질 것이다. 바람직하게는, "삽입" 영역 또는 "DNA 서열 변형" 영역(세포에서 게놈 표적 유전자좌로 도입되기를 원하는 핵산 변형)은 상동성의 두 영역 사이에 위치될 것이다. DNA 서열 변형은 하나의 특정 부위 또는 다수의 특정 부위에서 표적 게놈 DNA 서열의 하나 이상의 염기를 변경할 수 있다. 변경은 표적 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개 이상의 염기쌍을 변경하는 것을 포함할 수 있다. 결실 또는 삽입은 표적 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개 이상의 염기쌍의 결실 또는 삽입일 수 있다.

[0046] 본원에서 사용된 바와 같이, "풍부화(enrichment)"는 단일화, 선택적으로 편집 유도, 및 단일화 또는 실질적으로 단일화된 세포의 최종-크기 콜로니로의 성장(예를 들어, 콜로니 성장의 포화 또는 정규화)에 의해 편집된 세포를 풍부화시키는 것을 지칭한다. 대안적으로, "풍부화"는 세포가 대수 성장기의 끝에 있을 때 또는 세포가 성장 노화에 진입한 직후에 편집을 유도함으로써 벌크 액체 배양에서 수행될 수 있다. 편집을 유도하는 것은 뉴클레아제, gRNA 또는 둘 모두의 전사를 유도하는 것을 수반한다.

[0047] 용어 "가이드 핵산" 또는 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 1) 게놈 표적 유전자좌에 하이브리드화될 수 있는 가이드 서열, 및 2) 핵산-가이드된 뉴클레아제와 상호작용하거나 복합체화될 수 있는 스캐폴드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.

[0048] "상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2개의 펩티드 사이, 또는 본 발명의 개시의 맥락에서 더욱 흔히 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 나타낸다. 용어 "상동성 영역" 또는 "상동성 아암"은 표적 게놈 DNA 서열과 어느 정도의 상동성을 갖는 공여자 DNA 상의 영역을 나타낸다. 상동성은 비교의 목적을 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열 내의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열 내의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유될 때, 상기 분자는 그 위치에서 상동성이다. 서열 사이의 상동성 정도는 서열에 의해 공유되는 일치 또는 상동성 위치의 수의 함수이다.

[0049] "작동 가능하게 연결된"은 설명된 구성요소가 이들의 일반적인 기능을 수행하도록 구성되는 요소의 배열을 나타낸다. 따라서, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열은 코딩 서열의 전사, 및 일부 경우에, 번역에 영향을 미칠 수 있다. 조절 서열은 코딩 서열의 발현을 지시하는 기능을 하는 한 코딩 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 사이에 존재하는 번역되지 않았지만 전사된 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다. 사실상, 이러한 서열은 동일한 인접한 DNA 분자(즉, 염색체)에 존재할 필요가 없으며, 여전히 상호작용을 가질 수 있어 변경된 조절을 발생시킬 수 있다.

[0050] "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 RNA 중합효소에 결합하고, 메신저 RNA, 리보솜 RNA, 작은 핵 또는 핵소체 RNA, 가이드 RNA, 또는 임의의 부류의 임의의 RNA 중합효소 I, II 또는 III에 의해 전사되는 임의의 종류의 RNA와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터는 항시적이거나 유도성일 수 있으며, 일부 구현예(특히 풍부화가 사용된 많은 구현예)에서 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템의 적어도 하나의 구성요소의 전사는 유도성 프로모터의 제어 하에 있다.

[0051] 본원에서 사용되는 용어 "선택 가능한 마커"는 인공 선택에 적합한 형질을 부여하는 세포 내로 도입된 유전자를 지칭한다. 일반적으로 사용되는 선택 가능한 마커는 당업자에게 잘 알려져 있다. 암피실린/카르베니실린, 카나마이신, 클로르암페니콜, 에리트로마이신, 테트라사이클린, 겐타마이신, 블레오마이신, 스트렙토마이신, 리팜피신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, 블라스티시딘 및 G418과 같은 약물 선택 가능한 마커가 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 선택 가능한 마커는 람노스와 같은 당, 인간 신경 성장 인자 수용체(미국 특허 번호 6,365,373에 기재된 바와 같이, MAb로 검출됨); 트렁케이션된 인간 성장 인자 수용체(MAb로 검출됨); 돌연변이체 인간 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR; 형광 MTX 기질 이용 가능); 분비된 알칼리성 포스파타제(SEAP; 형광 기질 이용 가능); 인간 티미딜레이트 신타제(TS; 항암제 플루오로데옥시우리딘에 대한 내성 부여); 인간 글루타티온 S-트랜스퍼라제 알파(GSTA1; 글루타티온을 줄기 세포 선택적 알킬화기 부술판에 컨쥬게이션함; CD34+세포에서 화학보호 선택 가능한 마커); 조혈 줄기 세포에서 CD24 세포 표면 항원; N-포스폰아세틸-L-아스파르테이트(PALA)에 대한 내성을 부여하는 인간 CAD 유전자; 인간 다중-약물 내성-1(MDR-1; 증가된 약물 내성에 의해 선택 가능하거나 FACS에 의해 풍부화된 P-당단백질 표면 단백질); 인간 CD25(IL-2α; Mab-FITC에 의해 검출 가능); 메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT; 카르무스틴에 의해 선택 가능); 및 시티딘 데아미나제(CD; Ara-C에 의해 선택 가능)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 "선택적 배지"는 선택 가능한 마커에 대해 또는 이에 반해 선택되는 화학적 화합물 또는 생물학적 모이어티가 첨가된 세포 성장 배지를 지칭한다.

[0052] 본원에서 사용되는 "구체-패킹 격자"라는 어구는 격자-형성 비드, 시약 번들 및 세포를 포함하는 슬러리를 지칭한다. "격자-형성 비드"는 격자 형성을 담당하는 구체-패킹 격자의 1차 비드 기질을 나타낸다. "시약 번들"은 시약이 초기에 번들로 제공되고 이로부터 시약이 방출되는 비드, 소포 또는 다른 기질을 지칭한다.

[0053] 용어 "표적 게놈 DNA 서열", "표적 서열" 또는 "게놈 표적 유전자좌"는 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템을 사용하여 적어도 하나의 뉴클레오티드의 변화가 요구되는 시험관 내 또는 생체 내, 세포 또는 세포 집단의 핵산(예를 들어, 게놈) 내의 임의의 유전자좌를 지칭한다. 표적 서열은 게놈 유전자좌 또는 염색체 외 유전자좌일 수 있다.

[0054] "벡터"는 세포로 전달되고/되거나 세포에서 발현될 원하는 서열 또는 서열들을 포함하는 임의의 다양한 핵산이다. 벡터는 전형적으로 DNA로 구성되지만, RNA 벡터도 또한 이용 가능하다. 벡터는 플라스미드, 포스미드, 파지미드, 바이러스 게놈, YAC, BAC, 합성 염색체 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 어구 "엔진 벡터"는 본 개시의 핵산-가이드된 뉴클레아제 시스템 및 방법에 사용되는 뉴클레아제에 대한 코딩 서열을 포함한다. 엔진 벡터는 또한 박테리아 시스템에서 λ Red 리컴비니어링(recombineering) 시스템 또는 이와 동등한 것을 포함할 수 있다. 엔진 벡터는 또한 전형적으로 선택 가능한 마커를 포함한다. 본원에서 사용되는 어구 "편집 벡터"는 선택적으로 편집이 일어난 후 표적 서열에서 PAM 또는 스페이서에서의 뉴클레아제 결합을 방지하는 표적 서열에 대한 변경을 포함하는 공여자 핵산, 및 gRNA에 대한 코딩 서열을 포함한다. 편집 벡터는 또한 선택 가능한 마커 및/또는 바코드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 엔진 벡터 및 편집 벡터는 조합될 수 있다; 즉, 모든 편집 및 선택 구성요소는 단일 벡터에서 찾을 수 있다. 추가로, 엔진 및 편집 벡터는, 예를 들어, 뉴클레아제 코딩 서열, 리컴비니어링 시스템 코딩 서열(존재하는 경우), 공여자 핵산, 가이드 핵산 및 선택 가능한 마커(들)에 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함한다.

일반적인 본 발명

[0055] 전기천공은 세포막의 투과성을 위해 전기 자극으로 세포막에 일시적으로 기공을 생성하여 작업하는 널리 사용되는 방법이다. 전기천공의 적용은 DNA, RNA 또는 펩티드와 같은 외인성 물질을 포유동물 세포(인간 세포 포함), 식물 세포, 고세균, 효모, 기타 진핵 세포, 박테리아 및 다른 세포 유형과 같은 다양한 세포로 전달하는 것을 포함한다. 또한, 세포 유형의 혼합물도 단일 실행으로 전기천공될 수 있다; 예를 들어, E. 콜리(E. coli) 균주의 혼합물, 다른 박테리아 균주의 혼합물, 효모 균주의 혼합물, 포유동물 세포의 혼합물. 전기 자극은 또한 하이브리도마 또는 다른 융합된 세포의 생산에서 세포 융합에 사용될 수 있다. 전형적인 전기천공 절차 동안, 세포는 세포 생존에 유리한 완충액 또는 배지에 현탁된다. 박테리아 세포 전기천공의 경우, 물, 글리세롤 용액 등과 같은 낮은 전도도 배지가 일시적 고전류에 의한 열 생성을 줄이기 위해 종종 사용된다. 세포 및 세포로 전기천공될 물질(총칭하여 "세포 샘플")은 이후 방전을 위한 2개의 평평한 전극이 내장된 큐벳에 배치된다. 예를 들어, Bio-Rad(Hercules, CA)는 큐벳의 세포를 전기천공하기 위한 GENE PULSER XCELL™ 제품 라인을 만든다. 전통적으로, 전기천공은 높은 전계 강도를 필요로 한다.

[0056] 본 개시는 전기천공 장치가 격자-형성 구형 하이드로겔 비드, 시약 "번들" 또는 전달 기질, 및 세포를 포함하는 구체-패킹 격자 조성물을 사용하는, 낮은 독성으로 고효율 세포 전기천공을 달성하는 전기천공 조성물, 방법, 모듈 및 자동화된 다중-모듈 기기를 제공한다. 구체-패킹 격자 조성물은 전기천공 장치에 무관하며, 그 이유는 표준 큐벳이 사용될 수 있거나, 이하의 상세한 바와 같이, 관통형 전기천공 장치가 사용될 수 있기 때문이다. 또한, 어떤 전기천공 장치를 사용하든, 구체-패킹 격자는 로봇식 액체 핸들링 기구와 함께 사용될 수 있다. 이러한 자동화된 기구는 Tecan(Mannedorf, Switzerland), Hamilton(Reno, NV), BeckmanCoulter(Fort Collins, CO) 등으로부터의 기성품인 자동화된 액체 핸들링 시스템을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

[0057] 전기천공 프로세스 동안, 물질을 세포로 전기천공하는데 충분한 전압을 사용하는 것이 중요하지만, 너무 많은 전력은 세포 생존력을 감소시키므로 너무 많은 전압은 사용하지 않는다. 예를 들어, 인간 세포주의 현탁액을 전기천공하려면, 약 1000 μF의 커패시터로부터 지수 방전을 갖는 4mm-갭 큐벳에서 0.2 ml 샘플에 대해 200 볼트가 필요하다. 그러나, 동일한 0.2 ml 세포 현탁액을 2 cm 전극 거리(큐벳 갭 거리의 5배)를 갖는 더 긴 용기에 넣는 경우, 필요한 전압은 1000 볼트지만 40 μF(1000 μF의 1/25)의 커패시터만이 필요한데, 그 이유는 커패시터의 전기 에너지가 다음 방정식을 따르기 때문이다:

E=0.5 U² C

여기서 E는 전기 에너지이고, U는 전압이고, C는 커패시턴스이다.

[0058] 본 개시의 구체-패킹 격자 조성물은 비교적 짧은 시간에 높은 속도의 세포 형질전환을 가능하게 한다. 구체-패킹 격자는 격자-형성 비드(예를 들어, 균일한 크기의 구형 하이드로겔 비드), 시약 번들(예를 들어, 시약을 포함하는 시약 전달 기질) 및 세포를 포함하며, 여기서 구체-패킹 격자 조성물은 세포를 형질전환하기 위한 다양한 전기천공 장치에 사용될 수 있다. 구체-패킹 격자를 사용하는 것에 대한 주요 이점 중 하나는 세포 및 외인성 물질(예를 들어, 시약 번들)을 격자 내의 틈새 영역으로 밀집시킴으로써, 세포에 근접한 외인성 물질의 "유효" 농도가 배지에서 외인성 물질의 총량에 영향을 미치지 않으면서 증가된다는 것이다. 외인성 물질(예를 들어, DNA)이 배지의 전기 전도도를 증가시킬 수 있기 때문에, 전기천공 장치에 첨가될 수 있는 총 외인성 물질의 상한 임계값은 세포가 견딜 수 있는 전류/줄 가열의 양에 의해 결정된다. 구체-패킹 격자 조성물을 사용하는 전기천공은 배지의 벌크 전도도에 영향을 주지 않으면서 세포에 전달되는 외인성 물질의 양을 증가시켜 배지의 가열을 감소시키고 세포 생존력을 증가시킴으로써 형질전환 또는 형질감염 효율을 개선시킨다.

[0059] 세포 형질전환 속도는 세포 유형 및 형질전환되는 세포의 수에 좌우된다. 예를 들어, E. 콜리의 경우, 전기천공 장치는 분당 10³ 내지 10¹²개, 분당 10⁴ 내지 10¹⁰개, 분당 10⁵ 내지 10⁹개, 또는 분당 10⁶ 내지 10⁸개 세포의 세포 형질전환 속도를 제공할 수 있다. 전형적으로, 형질전환 라운드당 10⁷ 내지 10⁸개의 효모 세포가 형질전환되고 10⁴ 내지 10⁵개가 형질전환되며, 형질전환 라운드당 10⁹ 내지 10¹⁰개의 박테리아가 형질전환되고 10⁶ 내지 10⁷개가 형질전환된다. 전기천공 장치는 또한 병렬 장치를 사용한 단일 형질전환 절차에서 1개 세포 내지 10¹¹개 세포 범위의 세포 배치의 형질전환을 허용한다.

예시적인 구체-패킹 격자 조성물 및 방법

[0060] 본 개시는 하이드로겔 격자-형성 비드, 시약 번들(예를 들어, 시약 전달 기질) 및 세포를 포함하는 구체-패킹 격자 조성물에 관한 것이며, 여기서 구체-패킹 격자 조성물은 세포를 형질전환하기 위한 다양한 전기천공 장치에 사용될 수 있다. 전기천공 장치는 하기에 상세히 기재된 바와 같이 독립형 전기천공 장치로서 사용하거나 자동화된 다중-모듈 세포 처리 환경에서 사용하도록 구성될 수 있다. 구체-패킹 격자 조성물은 크기가 균일하고 결정질-유사 격자로 자가-조립되는 격자-형성 비드를 사용한다. 시약 번들은 결정질-유사 격자의 틈새 영역에 맞도록 충분히 작은 비드 또는 다른 기질을 포함하며, 여기서 시약 번들은 세포에 전달되는 외인성 물질(예를 들어, DNA, RNA, 단백질, 리보단백질 복합체)의 클론 카피를 가역적으로 포함한다.

[0061] 도 1a는 구체-패킹 격자에서 세포를 전기천공하는 방법(100)의 단순화된 블록도이다. 제1 단계에서, 페이로드를 제조한다(102). "페이로드"는 세포로 전달(예를 들어, 형질전환 또는 형질감염)되는 외인성 물질이다. 외인성 물질은 DNA, RNA, siRNA, 펩티드, 단백질, 항체, 약물, 리보핵단백질, 호르몬과 같은 소분자, 사이토카인, 케모카인, 약물, 약물 전구체 또는 기타 물질을 포함한다. 제조는 시약 번들을 형성하기 위해 시약 전달 기질 상에 가역적 로딩에 적합한 상태로 외인성 물질을 제조하거나 기능화하는 것을 포함한다(104). 이러한 방법에서, 가역적 로딩은 외인성 물질 또는 페이로드를 시약 전달 기질에 결합하여 시약 번들을 형성할 수 있는 한편, 전기천공 프로세스 전에 시약 전달 기질로부터 외인성 물질 또는 페이로드를 능동적으로 또는 수동적으로 방출할 수 있음을 의미한다. 본원의 방법에서, 능동적 방출이 바람직하며, 예를 들어, 화학적, 광자 또는 전기적 방출을 포함한다. 예를 들어, 시약 번들은 비드와 같은 고체 기질에 물리적으로 테더링되거나 에멀젼 또는 리포솜과 같은 소포에 한정된 높은 카피 수의 클론 DNA 서열을 포함할 수 있다. 시약 번들 기질의 크기는 격자-형성 비드의 크기에 대해 조정될 수 있으며, 그에 따라 하나의 시약 번들만이 각각의 틈새 구획에 맞춰져 이원 구체-패킹 격자를 형성한다. 이러한 구조로 인해 외인성 물질을 구획으로 수퍼-푸아송 로딩할 수 있다. 격자에 패킹되면, 시약 번들은 전기천공 직전에 페이로드를 방출하도록 촉발된다. 적합한 시약 전달 기질은 폴리스티렌 비드(공급업체는, 예를 들어, Thermo Fisher, Sigma-Aldrich Spherotech, Polysciences를 포함함)와 같은 중합성 또는 세라믹 마이크로입자 또는 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜 또는 알기네이트 등과 같은 가교된 중합체를 포함하는 하이드로겔 마이크로입자를 포함하고, 여기서 비드는 직경이 20 내지 100 μm, 직경이 30 내지 80 μm, 또는 직경이 40 내지 75 μm이다. 예를 들어, DNA와 같은 페이로드 물질은 기질 표면 물질에 반응성인 화학적 모이어티로 변형될 수 있으며, 이를 테면, 여기서 변형은, 예를 들어, Integrated DNA Technologies, Inc.(IDT, Coralville IA)를 통해 상업적으로 이용 가능하다. 대안적으로, 페이로드 분자는, 예를 들어, 고체-상 PCR을 통해 기질 표면에서 직접 합성되거나 증폭될 수 있으며, 특정 경우에 비드 표면에 대한 증폭은 전체 비드 표면에 걸쳐 클론성을 보장하기 위해 단일 주형 분자로부터 개시될 수 있다. 대안적으로, DNA 또는 다른 페이로드 분자는 입자 합성 동안 기질 입자의 전체 부피로 가교될 수 있다. 시약 기질에 물리적으로 테더링된 시약 분자의 경우, 불안정한 모이어티(예를 들어, 광- 또는 화학적으로-불안정한)가 기질 물질 또는 기질-페이로드 결합 화학에 도입되어 분자의 방출이 외부에서 촉발될 수 있다. 시약 페이로드는 또한 액적 또는 지질 소포의 구획화에 의해 고체-상 고정화 없이 번들링될 수 있다.

[0062] 시약 번들이 형성되면(104), 세포를 시약 번들 및 고농도의 격자-형성 구형 하이드로겔 비드와 혼합함으로써(106) 형질전환 또는 형질감염을 위한 세포 현탁액(예를 들어, 배지 내 세포)을 제조한다. 구체-형성 격자 조성물의 조도는 다양할 수 있지만, 구체-형성 격자 조성물은 과립 흐름(granular flow)을 허용하기에 충분히 액체이다. "세포"는 포유동물 세포(인간 세포 포함), 식물 세포, 고세균, 효모, 다른 진핵 세포, 박테리아 및 다른 세포 유형과 같은 다양한 부착 또는 현탁 세포를 포함한다. 격자-형성 구형 하이드로겔 비드는 균일한 크기를 가지며, 바람직하게는 낮은 전도도를 갖고, 밀착 패킹된 과립 흐름을 촉진하기 위해 엘라스토머이며, 생체적합성이고, DNA, 단백질 및 리보핵단백질과 같은 외인성 물질에 대해 불투과성인 물질로 제조된다. 적합한 격자-형성 비드는 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 알기네이트, 젤라틴 등과 같은 중합성 하이드로겔을 포함하며, 여기서 비드는 직경이 75 내지 250 μm, 또는 직경이 100 내지 200 μm, 또는 직경이 125 내지 150 μm이다. 전기천공 배지에서 격자-형성 하이드로겔 비드가 세포 및 시약 번들과 함께 구체-패킹 격자를 형성함에 따라(예를 들어, 침전 또는 원심분리에 의해), 격자-형성 비드는 세포 및 세포에 전달되는 외인성 물질이 비드 사이의 틈새 부피로 격리되는 결정질-유사 격자로 패킹된다. 틈새 영역의 부피 및 수는 격자-형성 비드의 유형 및 크기에 따라 달라진다. 또한, 결정질-유사 격자의 조립 속도를 제어하면 균일한 격자를 형성할 가능성이 높아진다.

[0063] 단계(108)에서, 시약 번들로부터 페이로드(예를 들어, 외인성 물질)를 방출하는 조건이 제공된다. 다시, 형질전환 또는 형질감염 전에 시약 페이로드를 안정적으로 방출할 수 있도록 하기 위해 능동 트리거가 바람직하다. 적합한 트리거는 효소적, pH 또는 경쟁적 결합 반응과 같은 화학적 트리거; UV 또는 가시 광선에 대한 방출과 같은 광자 트리거; 또는 소포의 전기장 유도 불안정화와 같은 전기적 트리거, 또는 온도 트리거를 포함한다. 시약 페이로드가 시약 번들로부터 방출되면, 세포를 전기천공하기 위한 조건이 제공된다(110). 전기천공 후, 세포를 선택적으로 회수할 수 있고 구체-패킹 격자를 해체하고 세포를 수집한다(112). 격자-형성 비드 및 시약 번들 기질은 여과, 원심분리 또는 자성 분리를 통해 세포로부터 분리될 수 있다.

[0064] 도 1b는 페이로드(예를 들어, 시약) 방출 전(좌측) 및 후(우측)에 세포 및 시약 번들을 갖는 예시적인 구체-패킹 격자를 도시한다. 도 1b의 좌측에서 격자-형성 비드(150); 시약 번들(152a, 152b, 152c, 152d, 152e 및 152f)(여기서 각 유형의 시약 번들은 하나 이상의 및 다양한 양일 수 있음); 및 세포(154)를 볼 수 있다. 페이로드 방출(예를 들어, 시약 번들(152)로부터 시약 방출) 후, 도 1b의 우측에서 격자-형성 비드(150); 시약 번들(153a, 153b, 153c, 153d, 153e 및 153f)(이제 시약의 확산 원으로 도시됨); 및 세포(154)가 관찰된다. 이러한 예시적인 구현예에서, 모든 격자-형성 비드 또는 구체는 동일한 크기이지만, 구체-형성 격자는 상이한 크기의 격자-형성 비드에 의해 형성될 수 있음에 유의한다. 핵심은 격자-형성 구체의 크기(및 하나 초과의 크기의 비드가 사용되는 경우 비드 크기의 상대적 비율)가 시약 번들을 수용하기 위해 적절한 크기의 틈새 영역을 갖는 격자를 형성하도록 조정된다는 것이다. 일부 구현예에서, 동일한 수의 상이한 시약 번들이 구체-패킹 격자에 첨가된다; 즉, 동일한 수 또는 농도의 시약 번들 1, 시약 번들 2, 시약 번들 3, 시약 번들 4 등부터 시약 번들 X까지 구체-패킹 격자에 첨가된다. 그러나, 다른 구현예에서, 상이한 양의 상이한 시약 번들이 첨가되어 구체-패킹 격자를 형성한다.

[0065] 구체-패킹 격자의 부피는 10 μL 내지 1 mL, 또는 50 μL 내지 750 μL, 또는 100 μL 내지 500 μL일 수 있다. 세포를 현탁시키기 위해 사용되고 구체-패킹 격자에 사용되는 배지 또는 완충액은 SOC, MEM, DMEM, IMDM, RPMI, 행크액(Hanks'), PBS 및 링거액과 같이 형질전환되거나 형질감염되는 세포 유형에 적합한 임의의 배지 또는 완충액일 수 있다. 또한, 세포는 형질전환 또는 형질감염 전에 전기적격성이 되어야 하기 때문에, 완충액은 또한 글리세롤 또는 소르비톨을 포함할 수 있고, 계면활성제도 포함할 수 있다. 대부분의 진핵 세포의 전기천공을 위해, 배지 또는 완충액은 적절한 삼투압을 유지하기 위해 일반적으로 염을 함유한다. 배지 또는 완충액의 염은 또한 배지를 전도성으로 만든다. 박테리아와 같은 매우 작은 원핵 세포의 전기천공을 위해, 때때로 물 또는 10% 글리세롤이 매우 높은 전계 강도를 허용하기 위해 낮은 전도도 배지로 사용된다. 이 경우, 전달될 하전된 분자는 여전히 수성 배지가 지질 기반 세포막보다 더 전도성이 되도록 하고, 배지는 특히 세포막과 비교하여 여전히 대략 전도성으로 간주될 수 있다.

[0066] 다시, 구체-패킹 격자를 사용하는 데는 두 가지 주요 이점이 있다. 첫째, 세포 및 외인성 물질을 격자 틈새로 밀집시킴으로써, 세포에 근접한 외인성 물질의 "유효" 농도가 배지 내의 외인성 물질의 총량에 영향을 미치지 않으면서 증가된다. 외인성 물질이 전기 전도도를 증가시킬 수 있기 때문에(예를 들어, DNA), 전기천공 장치에 첨가될 수 있는 총 외인성 물질의 상한 임계값은 세포가 견딜 수 있는 전류/줄 가열의 양에 의해 결정된다. 구체-패킹 격자를 사용하는 전기천공은 배지의 벌크 전도도에 영향을 주지 않으면서 세포에 전달되는 외인성 물질의 양을 증가시켜 배지의 가열을 감소시키고 세포 생존력을 증가시킴으로써 형질전환 또는 형질감염을 개선시킨다. 둘째, 구체 패킹은 또한 각 틈새 영역이 격자-형성 비드에 의해 이웃으로부터 분리되기 때문에 분할된 형식으로 다중화된 시약 전달이 가능하다.

[0067] 놀랍게도, 세포에 전달되는 시약이 시약 번들에 의해 전달되지 않고 대신 세포 및 격자-형성 비드가 현탁된 배지에 존재하는 시약 번들이 없는 시스템이 또한 발견되었다; 즉, "페이로드"인 DNA, RNA, siRNA, 펩티드, 단백질, 항체, 약물, 리보핵단백질, 호르몬과 같은 소분자, 사이토카인, 케모카인, 약물 및 약물 전구체는 시약 번들로 전달되지 않는다. 다시, 세포 및 외인성 물질을 격자 틈새로 밀집시킴으로써, 세포에 근접한 외인성 물질 또는 페이로드의 "유효" 농도가 배지 내의 외인성 물질의 총량에 영향을 미치지 않으면서 증가된다. 따라서, 대안적인 구현예에서, 세포, 격자-형성 비드 및 시약의 구체-패킹 조성물을 배지에 제공하는 단계; 및 세포, 격자-형성 비드 및 시약의 구체-패킹 조성물에 전기 펄스를 제공하는 단계를 포함하는 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 방법이 제공된다.

일반적인 핵산-지시된 뉴클레아제 게놈 편집

[0068] 본원에 기재된 방법에 의해 형질전환된 세포는 살아있는 세포에서 게놈 편집을 생성하는 핵산-지시된 뉴클레아제(예를 들어, RNA-가이드된 뉴클레아제) 게놈 편집에 사용될 수 있다. 세포에서 적절한 합성 가이드 핵산과 복합체화된 핵산-가이드된 뉴클레아제는 원하는 위치에서 세포의 게놈을 절단할 수 있다. 가이드 핵산은 핵산-가이드된 뉴클레아제가 특정 표적 서열에서 DNA를 인식하고 절단하는 것을 돕는다. 가이드 핵산의 뉴클레오티드 서열을 조작함으로써, 핵산-가이드된 뉴클레아제는 적절한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)가 근처에 있는 한 절단을 위해 임의의 DNA 서열을 표적화하도록 프로그래밍될 수 있다. 특정 양태에서, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템은 가이드 핵산으로서 기능하도록 조합되는 2개의 개별 가이드 핵산 분자, 예를 들어, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)를 사용할 수 있다. 다른 양태에서, 가이드 핵산은 crRNA 및 tracrRNA 서열 둘 모두를 포함하는 단일 가이드 핵산일 수 있다.

[0069] 일반적으로, 가이드 핵산(예를 들어, gRNA)은 양립되는 핵산-가이드된 뉴클레아제와 복합체화될 수 있고, 이후 표적 서열과 하이브리드화될 수 있으며, 이에 의해 뉴클레아제를 표적 서열로 유도할 수 있다. 가이드 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으며; 대안적으로, 가이드 핵산은 DNA 및 RNA 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 핵산은 변형된 또는 비-천연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 가이드 핵산이 RNA를 포함하는 경우, gRNA는 플라스미드, 선형 작제물과 같은 폴리뉴클레오티드 분자 상의 DNA 서열에 의해 인코딩될 수 있거나, 코딩 서열은 편집 카세트 내에 존재할 수 있다. gRNA에 대한 서열은 항시적 프로모터, 또는 일부 구현예에서 바람직하게는, 하기 기재된 바와 같은 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.

[0070] 가이드 핵산은 가이드 서열을 포함하며, 여기서 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리화되고 표적 서열에 대한 복합체화된 핵산-가이드된 뉴클레아제의 서열-특이적 결합을 지시하기에 충분한 표적 서열과의 상보성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때, 가이드 서열과 상응하는 표적 서열 사이의 상보성의 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이거나 이를 초과한다. 최적 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 이상의 뉴클레오티드 길이이거나 이를 초과한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게는 가이드 서열은 10-30개 또는 15-20개의 뉴클레오티드 길이, 또는 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오티드 길이이다.

[0071] 본 발명의 방법 및 조성물에서, 가이드 핵산은 플라스미드 또는 벡터로부터 발현되는 서열로서 제공되며, 프로모터, 및 일부 구현예에서, 유도성 프로모터의 제어 하에 단일 전사체로서 가이드 서열 및 스캐폴드 서열 둘 모두를 포함한다. 가이드 핵산은 가이드 서열이 원하는 표적 서열에 상보적이도록 가이드 서열을 변경함으로써 원하는 표적 서열을 표적화하도록 공학처리될 수 있으며, 이에 의해 가이드 서열과 표적 서열 사이의 하이브리드화가 가능하다. 일반적으로, 표적 서열에서 편집을 생성하기 위해, gRNA/뉴클레아제 복합체는 가이드 RNA에 의해 결정된 바와 같은 표적 서열에 결합하고, 뉴클레아제는 표적 서열에 인접한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 인식한다. 표적 서열은 원핵 또는 진핵 세포에 대해 내인성 또는 외인성이거나, 시험관 내 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 진핵 세포의 핵에 존재하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 표적 서열은 유전자 생성물(예를 들어, 단백질)을 인코딩하는 서열 또는 비-코딩 서열(예를 들어, 조절 폴리뉴클레오티드, 인트론, PAM, 또는 "정크" DNA)일 수 있다.

[0072] 가이드 핵산은 공여자 핵산을 인코딩하는 편집 카세트의 일부일 수 있다. 대안적으로, 가이드 핵산은 편집 카세트의 일부가 아닐 수 있고, 대신 엔진 또는 편집 벡터 백본 상에서 인코딩될 수 있다. 예를 들어, 가이드 핵산을 코딩하는 서열은 먼저 벡터 백본에 어셈블링되거나 삽입된 다음, 예를 들어, 편집 카세트에 공여자 핵산이 삽입될 수 있다. 다른 경우에, 예를 들어, 편집 카세트 내의 공여자 핵산은 먼저 벡터 백본에 삽입되거나 어셈블링될 수 있으며, 이어서 가이드 핵산을 코딩하는 서열이 삽입될 수 있다. 또 다른 경우에, 가이드 핵산 및 공여자 핵산을 인코딩하는 서열(예를 들어, 편집 카세트에 삽입됨)은 동시에 그러나 별도로 벡터에 삽입되거나 어셈블링된다. 또 다른 구현예에서, 가이드 핵산을 인코딩하는 서열 및 공여자 핵산을 인코딩하는 서열 둘 모두는 편집 카세트에 포함된다.

[0073] 표적 서열은 gRNA/뉴클레아제 복합체에 의해 인식되는 짧은 뉴클레오티드 서열인 프로토-스페이서 돌연변이(PAM)와 관련된다. 상이한 핵산-가이드된 뉴클레아제에 대한 정확한 바람직한 PAM 서열 및 길이 요건은 다양하다; 그러나, PAM은 전형적으로 표적 서열에 인접하거나 근접한 2-7개의 염기쌍 서열이고, 뉴클레아제에 따라, 표적 서열에 대해 5' 또는 3'측에 존재할 수 있다. 핵산-가이드된 뉴클레아제의 PAM-상호작용 도메인의 공학처리는 PAM 특이성의 변경을 가능하게 하거나, 표적 부위 인식 충실도를 개선시키거나, 표적 부위 인식 충실도를 감소시키거나, 핵산-가이드된 뉴클레아제의 다능성을 증가시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 서열의 게놈 편집 둘 모두는 표적 서열, 예를 들어, 세포의 게놈 DNA에 원하는 DNA 변화를 도입하고, 표적 서열에서 프로토-스페이서 돌연변이(PAM) 영역을 제거, 돌연변이 또는 불활성화시키는 것을 포함한다. 표적 서열에서 PAM을 불활성화시키는 것은, 예를 들어, 후속 편집 라운드에서 합성 가이드 핵산과 복합체화된 핵산-가이드된 뉴클레아제에 대한 후속 노출시, 그 표적 서열에서 세포 게놈의 추가 편집을 배제한다. 따라서, 원하는 표적 서열 편집 및 변경된 PAM을 갖는 세포는 표적 서열에 상보적인 합성 가이드 핵산과 복합체화된 핵산-가이드된 뉴클레아제를 사용하여 선택될 수 있다. 첫 번째 편집 이벤트를 겪지 않은 세포의 게놈은 절단되어 이중 가닥 DNA 파손을 일으키므로, 세포는 계속해서 생존할 수 없을 것이다. 원하는 표적 서열 편집 및 PAM 변경을 함유하는 세포의 게놈은 이러한 편집된 세포가 더 이상 필요한 PAM 부위를 함유하지 않기 때문에 절단되지 않을 것이며, 계속 성장하고 증식할 것이다.

[0074] 핵산-가이드된 뉴클레아제가 인식할 수 있는 표적 서열의 범위는 특정 PAM이 원하는 표적 서열 근처에 위치할 필요성에 의해 제한된다. 결과적으로, 게놈 편집에 필요한 정확도로 편집 대상을 지정하는 것이 종종 어려울 수 있다. 뉴클레아제는 일부 PAM을 매우 잘 인식하고(예를 들어, 전형 PAM) 다른 PAM을 덜 잘 인식하거나 불량하게 인식할 수 있는 것으로(예를 들어, 비전형 PAM) 밝혀졌다. 본원에 개시된 특정 방법은 편집되지 않은 세포의 배경에서 편집된 세포의 식별을 허용하기 때문에(예를 들어, 도 7a-7e 및 이의 설명 참조), 상기 방법은 PAM이 최적에 못 미치는 편집된 세포의 식별을 허용한다; 즉, 본원에서 편집된 세포를 식별하는 방법은 편집 효율이 매우 낮더라도 편집된 세포의 식별을 허용한다. 추가로, 본 방법은 게놈 편집이 덜 기능적인 PAM과 연관된 세포를 포함하여, 편집이 보다 쉽게 식별되기 때문에 편집될 수 있는 표적 서열의 범위를 확장한다.

[0075] 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템의 뉴클레아제 구성요소에 대해, 핵산-가이드된 뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 고세균, 원핵 또는 진핵 세포와 같은 특정 세포 유형에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 진핵 세포는 효모, 진균, 조류, 식물, 동물 또는 인간 세포일 수 있다. 진핵 세포는 인간, 마우스, 래트, 토끼, 개, 또는 비인간 영장류를 포함하는 비인간 포유동물을 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물과 같은 특정 유기체의 세포 또는 그로부터 유래된 세포일 수 있다. 사용되는 핵산-가이드된 뉴클레아제의 선택은 표적 서열에서 어떠한 유형의 편집이 이루어져야 하고 적절한 PAM이 원하는 표적 서열에 가깝게 위치하는지와 같은 많은 요인에 좌우된다. 본원에 기재된 방법에 사용되는 뉴클레아제는 Cas 9, Cas 12/CpfI, MAD2 또는 MAD7, 또는 다른 MADzyme을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 가이드 핵산에 대해, 뉴클레아제는 벡터(예를 들어, 엔진 벡터) 상의 DNA 서열에 의해 인코딩될 수 있고 항시적 또는 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제를 인코딩하는 서열은 유도성 프로모터의 제어 하에 있고, 유도성 프로모터는 가이드 핵산의 전사를 제어하는 유도성 프로모터와는 별개이지만 동일할 수 있다; 즉, 별개의 유도성 프로모터가 뉴클레아제의 전사를 구동하고 핵산 서열을 가이드할 수 있지만 2개의 유도성 프로모터는 동일한 유형의 유도성 프로모터일 수 있다(예를 들어, 둘 모두가 pL 프로모터임). 대안적으로, 뉴클레아제의 발현을 제어하는 유도성 프로모터는 가이드 핵산의 전사를 제어하는 유도성 프로모터와 상이할 수 있다; 즉, 예를 들어, 뉴클레아제는 pBAD 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있고, 가이드 핵산은 pL 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.

[0076] 핵산-가이드된 뉴클레아제 시스템의 또 다른 구성요소는 공여자 핵산이다. 일부 구현예에서, 공여자 핵산은 가이드 핵산과 동일한 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 편집 벡터 또는 편집 카세트) 상에 있고 가이드 핵산과 동일한 프로모터(예를 들어, 가이드 핵산 및 공여자 핵산 둘 모두의 전사를 구동시키는 단일 프로모터)의 제어 하에 있을 수 있다. 공여자 핵산은 gRNA/뉴클레아제 복합체의 일부로서 핵산-가이드된 뉴클레아제에 의해 닉킹(nicking)되거나 절단된 표적 서열과의 상동성 재조합을 위한 주형으로서 작용하도록 설계된다. 공여자 핵산 폴리뉴클레오티드는 약 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 또는 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이와 같은 임의의 적합한 길이일 수 있다. 특정 바람직한 양태에서, 공여자 핵산은 20-300개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 50-250개의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드로서 제공될 수 있다. 공여자 핵산은 표적 서열의 일부에 상보적인 영역(예를 들어, 상동성 아암)을 포함한다. 최적으로 정렬될 때, 공여자 핵산은, 예를 들어, 약 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90개 이상의 뉴클레오티드만큼 표적 서열과 중첩된다(상보적이다). 많은 구현예에서, 공여자 핵산은 공여자 핵산과 표적 주형 사이의 돌연변이 또는 차이에 측접한 2개의 상동성 아암(표적 서열에 상보적인 영역)을 포함한다. 공여자 핵산은 표적 서열과 비교하여 적어도 하나의 돌연변이 또는 변경, 예를 들어, 표적 서열과 비교하여 삽입, 결실, 변형 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

[0077] 종종 공여자 핵산은 벡터 백본에 삽입되는 편집 카세트로서 제공되며, 여기서 벡터 백본은 gRNA의 전사를 구동하는 프로모터 및 gRNA의 코딩 서열을 포함할 수 있거나, 벡터 백본은 gRNA 자체가 아닌 gRNA의 전사를 구동하는 프로모터를 포함할 수 있다. 더욱이, 편집 벡터에 삽입된 하나 초과, 예를 들어, 2개, 3개, 4개 이상의 가이드 핵산/공여자 핵산 카세트가 있을 수 있으며, 여기서 각 가이드 핵산은 별개의 상이한 프로모터, 별개의 유사한 프로모터의 제어 하에 있거나, 모든 가이드 핵산/공여자 핵산 쌍은 단일 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 구현예에서, gRNA 및 공여자 핵산의 전사를 구동하는(또는 하나 초과의 gRNA/공여자 핵산 쌍을 유도하는) 프로모터는 유도성 프로모터이고, 뉴클레아제의 전사를 구동하는 프로모터도 유도성 프로모터이다. 카세트 편집에 관한 추가 정보는 USPN 9,982,278; 10,240,167; 10,266,849; 10,351,877; 10,364,442; 및 10,435,715; 및 USSN 16/275,465 및 16/551,517을 참조한다.

[0078] 공여자 핵산에 추가하여, 편집 카세트는 하나 이상의 프라이머 부위를 포함할 수 있다. 프라이머 부위는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 편집 카세트를 증폭시키는데 사용될 수 있다; 예를 들어, 프라이머 부위가 편집 카세트의 다른 구성요소 중 하나 이상에 측접하는 경우.

[0079] 또한, 상기 기재된 바와 같이, 공여자 핵산은 선택적으로 (표적 서열에 대한 적어도 하나의 돌연변이에 추가하여) 표적 서열에서 PAM 부위를 돌연변이, 결실 또는 불활성화시키는 하나 이상의 PAM 서열 변경을 포함할 수 있다. 표적 서열에서 PAM 서열 변경은 PAM 부위를 핵산-가이드된 뉴클레아제에 "면역"시키고, 동일한 뉴클레아제가 사용되는 경우 후속 편집 라운드에서 표적 서열을 추가 편집으로부터 보호한다.

[0080] 또한, 편집 카세트는 바코드를 포함할 수 있다. 바코드는 이러한 바코드가 상응하는 표적 서열에 대해 이루어진 편집을 확인할 수 있도록 하는 공여자 DNA 서열에 상응하는 고유한 DNA 서열이다. 바코드는 전형적으로 4개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 편집 카세트는, 예를 들어, 공여자 핵산의 유전자-전체 또는 게놈-전체 라이브러리를 나타내는 공여자 핵산의 집합체를 포함한다. 편집 카세트의 라이브러리는, 예를 들어, 각각의 상이한 공여자 핵산이 상이한 바코드와 연관된 벡터 백본으로 클로닝된다.

[0081] 추가로, 일부 구현예에서, 핵산-가이드된 뉴클레아제 시스템의 구성요소를 인코딩하는 발현 벡터 또는 카세트는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상 또는 그 초과의 핵 국소화 서열(NLS)과 같은 하나 이상의 NLS를 포함하는 핵산-가이드된 뉴클레아제를 추가로 인코딩한다. 일부 구현예에서, 공학처리된 뉴클레아제는 아미노-말단 또는 그 근처의 NLS, 카르복시-말단 또는 그 근처의 NLS, 또는 이들의 조합을 포함한다.

[0082] 엔진 및 편집 벡터는 전사되는 구성요소 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, gRNA 및 뉴클레아제 중 하나 또는 둘 모두와 같은 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소의 전사를 구동하는 프로모터는 유도성일 수 있다. 포유동물 세포를 포함하는 식물, 미생물 및 동물 세포에서 유전자의 제어된 발현을 위한 pL 프로모터(CI857 리프레서의 열 불활성화에 의해 유도됨), pBAD 프로모터(세포 성장 배지에 대한 아라비노스의 첨가에 의해 유도됨) 및 람노스 유도성 프로모터(세포 성장 배지에 대한 람노스의 첨가에 의해 유도됨)를 포함하는 다수의 유전자 조절 제어 시스템이 개발되었다. 다른 시스템은 테트라사이클린-제어 전사 활성화 시스템(Tet-On/Tet-Off, Clontech, Inc. (Palo Alto, CA); Bujard and Gossen, PNAS, 89(12):5547-5551 (1992)), Lac 스위치 유도성 시스템(Wyborski et al., Environ Mol Mutagen, 28(4):447-58 (1996); DuCoeur et al., Strategies 5(3):70-72 (1992); U.S. Patent No. 4,833,080), 엑디손-유도성 유전자 발현 시스템(No et al., PNAS, 93(8):3346-3351 (1996)), 쿠메이트 유전자-스위치 시스템(Mullick et al., BMC Biotechnology, 6:43 (2006)), 및 타목시펜-유도성 유전자 발현(Zhang et al., Nucleic Acids Research, 24:543-548 (1996))뿐만 아니라 다른 것들을 포함한다. 본원에 기재된 모듈 및 기기에 사용되는 본 방법에서, 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 구성요소(예를 들어, 뉴클레아제 및/또는 gRNA) 중 적어도 하나는 온도 상승에 의해 활성화되는 프로모터의 제어 하에 있는 것이 바람직한데, 그 이유는 이러한 프로모터가 온도 증가에 의해 프로모터가 활성화되고, 온도 감소에 의해 비활성화되어, 편집 과정을 "턴 오프"시키는 것을 허용하기 때문이다. 따라서, 온도 감소에 의해 비활성화되는 프로모터의 시나리오에서, 세포에서 편집은 배지를 변경하지 않고도 턴 오프될 수 있다; 예를 들어, 편집을 유도하는데 사용되는 배지에서 유도성 생화학 물질을 제거하기 위함.

자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기 및 모듈

[0083] 본 개시는 독립형 전기천공 장치에서 사용될 수 있는 세포를 형질전환시키는 방법에 관한 것이고, 또는 상기 방법은 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 하나인 모듈인 전기천공 장치 또는 모듈에서 수행될 수 있다. 전기천공부를 갖는 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기를 사용하여 박테리아 세포, 포유동물 세포, 비포유동물 진핵 세포, 효모 세포, 진균, 고세균 등을 포함하는 다양한 유형의 세포를 제어되고, 억제되며, 재현 가능한 방식으로 처리할 수 있다.

자동화된 세포 편집 기기

[0084] 도 2a는, 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 세포의 형질전환을 수행하고 핵산-가이드된 뉴클레아제 유전자 편집을 수행하기 위한 예시적인 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기(200)를 도시한다. 예를 들어, 기기(200)는 실험실 환경 내에서 사용하기 위한 독립형 데스크톱 기기로서 설계될 수 있으며, 바람직하게는 설계된다. 기기(200)는 인간 개입 없이 세포에서 자동화된 게놈 절단 및/또는 편집을 수행하는데 있어서 다양한 통합 프로세스를 수행하기 위한 재사용 가능 및 일회용 구성요소의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 공기 변위 피펫터(232)를 포함하는, 예를 들어, 자동화된(즉, 로봇식) 액체 핸들링 시스템(258)에 XYZ 축 모션 제어를 공급하는 자동화된 기계적 모션 시스템(작동기)(도시되지 않음)을 제공하는 갠트리(202)가 예시되며, 이는 인간 개입 없이 다수의 모듈 사이의 세포 처리를 허용한다. 일부 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에서, 공기 변위 피펫터(232)는 갠트리(202)에 의해 이동되고, 다양한 모듈 및 시약 카트리지는 정지 상태로 남아 있으나; 다른 구현예에서, 액체 핸들링 시스템(258)은 다양한 모듈 및 시약 카트리지가 이동되는 동안 정지 상태를 유지할 수 있다. 또한, 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기(200)에는 저장소(212) 및 형질전환 모듈(230)(예를 들어, 도 3a-3n과 관련하여 상세히 설명된 바와 같은 관통형 전기천공 장치)뿐만 아니라 세척 저장소(206), 세포 투입 저장소(251) 및 세포 산출 저장소(253)를 포함하는 시약 카트리지(210)가 포함된다. 세척 저장소(206)는 큰 튜브, 예를 들어, 세척 용액, 또는 반복적인 프로세스 전체에 걸쳐 자주 사용되는 용액을 수용하도록 구성될 수 있다. 2개의 시약 카트리지(210)가 도 2a에서 세척 저장소(206)를 포함하지만, 대신에 세척 저장소는 시약 및 세척 카트리지가 별개의 카트리지인 세척 카트리지에 포함될 수 있다. 이러한 경우에, 시약 카트리지(210) 및 세척 카트리지(204)는 그 안에 삽입된 소모품(시약 또는 다양한 삽입물 내에 함유된 다른 구성요소)을 제외하고는 동일할 수 있다. (예를 들어, 도 4a 및 4b를 참조한다.)

[0085] 일부 구현에서, 시약 카트리지(210)는 자동화된 다중-모듈 세포 처리/편집 기기(200)에서 사용하기 위한 시약 및 세포를 포함하는 일회용 키트이다. 예를 들어, 사용자는 세포 처리를 활성화하기 전에 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기(200)의 섀시 내에 다양한 원하는 삽입물 및 시약을 포함하는 시약 카트리지(210)의 각각을 개방하고 위치시킬 수 있다. 또한, 각각의 시약 카트리지(210)는 그 안에 함유된 시약에 적절한 상이한 온도 구역을 갖는 섀시의 리셉터클에 삽입될 수 있다.

[0086] 또한, 갠트리(202) 및 공기 변위 피펫터(232)를 포함하는 로봇식 액체 핸들링 시스템(258)이 도 2a에 예시된다. 일부 예에서, 로봇식 핸들링 시스템(258)은 Mannedorf, Switzerland의 Tecan Group Ltd., Reno, NV의 Hamilton Company(예를 들어, WO2018015544A1 참조) 또는 Fort Collins, CO.의 Beckman Coulter, Inc.(예를 들어, US20160018427A1 참조)에 의해 제조된 것들과 같은 자동화된 액체 핸들링 시스템을 포함할 수 있다. (예를 들어, US20160018427A1을 참조한다). 피펫 팁은 공기 변위 피펫터(232)와 함께 사용하기 위해 피펫 이송 팁 공급부(도시되지 않음)에 제공될 수 있다.

[0087] 일부 구현에서, 시약 카트리지(210)의 삽입물 또는 구성요소는 로봇식 핸들링 시스템(258)에 의한 인식을 위해 바코드와 같은 기계 판독 가능한 표시(도시되지 않음)로 표시된다. 예를 들어, 로봇식 액체 핸들링 시스템(258)은 내용물을 확인하기 위해 각각의 시약 카트리지(210) 내의 하나 이상의 삽입물을 스캔할 수 있다. 다른 구현에서, 기계 판독 가능한 표시는 각각의 시약 카트리지(210)에 표시될 수 있고, 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기(200)의 처리 시스템(도시되지 않았지만, 도 2b의 요소(237)를 참조한다)은 기계 판독 가능한 표시를 기반으로 저장된 물질 맵을 확인할 수 있다. 도 2a에 예시된 구현예에서, 세포 성장 모듈은 세포 성장 바이알(218)을 포함한다(도 5a-5d와 관련하여 하기에 더 상세히 설명됨). TFF 모듈(222)(도 6a-6e와 관련하여 상세히 설명됨) 및 선택 모듈(220)이 추가로 제시된다. 또한, 도 2a의 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 일부로서, 예를 들어, 로봇식 액체 핸들링 시스템(258) 및 공기 변위 피펫터(232)에 의해 제공되는, 도 7a-7e와 관련하여 본원에 설명된 단일화 모듈(240)(예를 들어, 고체 벽 분리, 인큐베이션 및 정규화 장치(SWIIN 장치)가 여기에 도시됨)이 예시된다. 추가적으로 선택 모듈(220)이 제시된다. 또한, 3개의 히트싱크(heatsink)(255)의 배치에 주목한다.

[0088] 도 2b는 도 2a에 도시된 예시적인 다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 내용물의 단순화된 표현이다. 예를 들어, 카트리지-기반 소스 물질(예를 들어, 시약 카트리지(210)에서)은 공기 변위 피펫터(232)에 의한 접근을 위해 기기(200)의 데크 상의 지정된 영역에 위치될 수 있다. 다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 데크는 기기(200)의 임의의 모듈로부터 흘러 내리거나, 떨어지거나, 넘치는 오염물이 보호 싱크의 립 내에 포함되도록 하는 보호 싱크를 포함할 수 있다. 또한, 상이한 영역에 적절한 온도 구역을 생성할 수 있는 열 조립체(211)와 함께 배치된 것으로 도시된 시약 카트리지(210)가 제시된다. 시약 카트리지 중 하나는 또한 전기천공 인터페이스(예를 들어, 매니폴드 아암) 및 작동기(231)에 의해 제공되는 관통형 전기천공 장치(230)(전기천공부)를 포함하는 것에 주목한다. 또한, 인접한 열 조립체(225)를 갖는 TFF 모듈(222)이 제시되며, 여기서 TFF 모듈은 TFF 인터페이스(예를 들어, 매니폴드 아암) 및 작동기(233)에 의해 제공된다. 열 조립체(225, 235 및 245)는 펠티에 장치뿐만 아니라 히트싱크, 팬 및 냉각기와 같은 열 전기 장치를 포함한다. 회전 성장 바이알(218)은 성장 모듈(234) 내에 있으며, 여기서 성장 모듈은 2개의 열 조립체(235)에 의해 제공된다. 선택 모듈은 (220)에서 제시된다. 또한, SWIIN 카트리지(241)를 포함하는 SWIIN 모듈(240)이 제시되며, 여기서 SWIIN 모듈은 또한 열 조립체(245), 조명(243)(본 구현예에서, 백라이팅), 증발 및 응축 제어장치(249)를 포함하고, 여기서 SWIIN 모듈은 SWIIN 인터페이스(예를 들어, 매니폴드 아암) 및 작동기(247)에 의해 제공된다. 또한, 터치 스크린 디스플레이(201), 디스플레이 작동기(203), 조명(205)(다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 양측에 하나) 및 카메라(239)(다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 양측에 하나의 조명 장치)가 본 도면에서 제시된다. 마지막으로, 요소(237)는 회로 제어 보드, 고-전압 증폭기, 전원 공급장치 및 전원 입력과 같은 전자 장치뿐만 아니라 펌프, 밸브 및 센서와 같은 공압장치를 포함한다.

[0089] 도 2c는 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기(200)의 데스크탑 버전으로 사용하기 위한 다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 전방 사시도를 예시한다. 예를 들어, 섀시(290)는 약 24-48 인치의 폭, 약 24-48 인치의 높이 및 약 24-48 인치의 깊이를 가질 수 있다. 섀시(290)는 자동화된 세포 처리에 사용되는 모든 모듈 및 일회용 소모품을 보유하고, 인간 개입 없이 필요한 모든 프로세스를 수행하도록 설계될 수 있으며, 바람직하게는 설계되고; 즉, 섀시(290)는 통합된 독립형 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기를 제공하도록 구성된다. 도 2c에 예시된 바와 같이, 섀시(290)는 내부 팬(도시되지 않음)을 통한 공기 흐름을 허용하는 터치 스크린 디스플레이(201), 냉각 화격자(264)를 포함한다. 터치 스크린 디스플레이는 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기(400)의 처리 상태에 관한 정보를 사용자에게 제공하고, 세포 처리를 수행하기 위해 사용자로부터의 입력을 수용한다. 이러한 구현예에서, 섀시(290)는 조정 가능한 발(270a, 270b, 270c 및 270d)에 의해 들어 올려진다(발(270a-270c)은 이러한 도 2c에 도시되어 있다). 예를 들어, 조정 가능한 발(270a-270d)은 섀시(290) 아래에 추가 공기 흐름을 허용한다.

[0090] 일부 구현에서, 섀시(290) 내부에 도 2a 및 2b와 관련하여 설명된 구성요소의 대부분 또는 전부가 존재할 것이며, 이는 갠트리를 따라 배치된 로봇식 액체 핸들링 시스템, 관통형 전기천공 장치를 포함하는 시약 카트리지(210), 세포 성장 모듈(234) 내의 회전 성장 바이알(218), 접선 유동 여과 모듈(222), SWIIN 모듈(240)뿐만 아니라 다양한 모듈을 위한 인터페이스 및 작동기를 포함한다. 또한, 섀시(290)는 제어 회로, 액체 핸들링 튜브, 공기 펌프 제어장치, 밸브, 센서, 열 조립체(예를 들어, 가열 및 냉각 유닛) 및 다른 제어 메커니즘을 수용한다. 다중-모듈 세포 편집 기기의 예에 대해서는 2019년 4월 9일에 발행된 USPN 10,253,316; 2019년 6월 25에 발행된 10,329,559; 2019년 6월 18일에 발행된 10,323,242; 2019년 9월 24일에 발행된 10,421,959; 2019년 11월 5일에 발행된 10,465,185; 및 2019년 12월 31일에 발행된 10,519,437; 및 2019년 10월 29일에 출원된 USSN 16/666,964; 및 2019년 11월 12일에 출원된 16/680,643을 참조하며, 이들 모두는 그 전체내용이 본원에 참조로 포함된다.

형질전환 장치

[0091] 본원에 개시된 구체-패킹 격자 조성물은 관통형 전기천공 장치(FTEP 장치) 및 전기천공 큐벳에서 사용될 수 있다. FTEP 조립체는 도 3a-3c에 예시되어 있다. 도 3a 내지 3c는 각각 6개의 공동 결합된 FTEP 장치(350)를 포함하는 FTEP 조립체(3500)의 상부 사시도, 하부 사시도 및 저면도이다. 도 3a는 단일의 일체로 형성된 사출 성형된 기판(356) 상에 배열된 6개의 FTEP 유닛(350)을 도시한다. 6개의 FTEP 유닛(350) 각각은 입구를 정의하는 웰(352) 및 출구를 정의하는 웰(354)을 갖는다. 또한, 각각의 FTEP 유닛에서 2개의 전극 채널(378) 중 하나를 볼 수 있다. 도 3b는 단일 기판(356) 상에 배열된 도 3a의 6개의 공동 결합된 FTEP 장치(350)를 갖는 FTEP 조립체(3500)의 하부 사시도이다. 각각의 관통형 전기천공 유닛(350)에 대해 하나씩, 6개의 입구 웰(352)이 관찰될 수 있고, 하나의 출구 웰(354)이 가장 좌측 FTEP 유닛에서 관찰될 수 있다. 또한, 도 3b에서 각 FTEP 유닛(350)에 대해 입구(302), 출구(304), 5개의 영역, 즉, 입구-필터 영역(306a), 입구-근위 영역(306b), 중앙 영역(306c), 출구-근위 영역(306d) 및 출구-필터 영역(306e)을 포함하는 유동 채널(306)이 제시된다(도 3b에는 중앙 영역(306c)만이 표시되지만, 도 3c 및 3d를 참조한다). 각각의 FTEP 유닛은 유동 채널(306)의 중앙 영역(306c)의 측면에 있는 2개의 전극(308)을 추가로 포함한다.

[0092] 도 3c는 도 3a 및 3b의 6개의 공동 결합된 FTEP 장치(350)의 FTEP 조립체(3500)의 저면도이다. 단일 기판(356) 상에 배열된 6개의 FTEP 유닛(350)이 도 3c에 도시되며, 여기서 각각의 FTEP 유닛(350)은 입구(302), 출구(304), 5개의 영역, 즉, 입구-필터 영역(306a), 입구-근위 영역(306b), 중앙 영역(106c), 출구-근위 영역(306d) 및 출구-필터 영역(306e)을 포함하는 유동 채널(306)을 포함한다. 각각의 FTEP 유닛은 유동 채널(306)의 중앙 영역(306c)의 측면에 있는 2개의 전극(308)을 추가로 포함한다. 6개의 FTEP 유닛(350)이 제작되면, 이들은 도시된 스코어 라인에서 서로 분리되어(예를 들어, "스냅 분리됨(snapped apart)") 한 번에 하나씩 사용될 수 있다; 대안적으로, FTEP 유닛은 2개 이상의 FTEP 유닛(350)이 병렬로 사용된 구현예에서 사용될 수 있다.

[0093] FTEP 장치의 기판, 입구 웰, 출구 웰, 필터 및 차단 어레이는 FTEP 장치가 재사용되는지, 오토클레이브되는지 또는 일회용인지에 따라 스테인리스 강, 실리콘, 유리, 수지, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 아크릴로니트릴 부타디엔, 폴리카르보네이트, 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 폴리설폰 및 폴리우레탄, 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함하는 많은 물질로 제조될 수 있다. 유사하게, 장치 내의 채널 벽은 실리콘, 수지, 유리, 유리 섬유, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 아크릴로니트릴 부타디엔, 폴리카르보네이트, 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 폴리설폰 및 폴리우레탄, 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함하는 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있다. 바람직한 물질은 결정 스티렌, 사이클로-올레핀 중합체(COP) 및 사이클릭 올레핀 공중합체(COC)를 포함하며, 이는 FTEP 장치가 전극 및, 예를 들어, 존재시 바닥 및/또는 상부 밀봉 필름을 제외하고 일체의 사출 성형에 의해 전적으로 형성될 수 있도록 한다.

[0094] 본원에 개시된 FTEP 장치(또는 FTEP 장치의 일부)는, 예를 들어, 전체 장치로서 또는 융합되거나 달리 결합되는 구조적 층의 생성에 의해 다양한 기술을 통해 생성되거나 제작될 수 있다. 예를 들어, 금속 FTEP 장치의 경우, 제작은 정밀 기계 가공 또는 레이저 가공을 포함할 수 있으며; 실리콘 FTEP 장치의 경우, 제작은 건식 또는 습식 에칭을 포함할 수 있고; 유리 FTEP 장치의 경우, 제작은 건식 또는 습식 에칭, 파우더블라스팅(powderblasting), 샌드블라스팅(sandblasting) 또는 광구조화를 포함할 수 있고; 플라스틱 FTEP 장치의 경우, 제작은 열성형, 사출 성형, 고온 엠보싱 또는 레이저 가공을 포함할 수 있다. FTEP 장치의 구성요소는 별도로 제조된 후 조립될 수 있거나, FTEP 장치의 특정 구성요소(또는 심지어 전극을 제외한 전체 FTEP 장치)는 단일한 존재물로서 제조(예를 들어, 3D 프린팅 사용) 또는 성형(예를 들어, 사출 성형 사용)될 수 있고, 다른 구성요소는 성형 후에 추가된다. 예를 들어, 하우징 및 채널은 단일 존재물로서 제조되거나 성형될 수 있고, 전극은 FTEP 유닛을 형성시키기 위해 나중에 추가된다. 일부 구현예에서, 필름 또는 편평한 기판은 장치의 바닥을 밀봉하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 필름은 FTEP 장치와 동일한 물질, 이 경우에, 예를 들어, 결정 스티렌, 사이클로-올레핀 중합체(COP) 및 사이클릭 올레핀 공중합체(COC)로 제조된다. FTEP 장치는 또한 개별적으로 제조되고/되거나 성형되고 제조 후에 조립되는 2개 이상의 평행한 층, 예를 들어, 수평 채널 및 필터를 갖는 층, 수직 채널을 갖는 층, 및 입구 및 출구 포트를 갖는 층으로 형성될 수 있다.

[0095] 특정 양태에서, FTEP 장치는 회로 기판 상에 원하는 구성으로 형성된 전극, 필터 및/또는 유동 채널을 갖는 베이스로서의 회로 기판, 및, 예를 들어, 이후에 회로 기판 상에 밀봉되는 별도 층으로서 형성되는 하나 이상의 입구 및 출구 채널 및/또는 유동 채널을 포함하는 장치의 나머지 하우징을 사용하여 제작될 수 있다. 회로 기판 상에 하우징 상부 밀봉은 본 개시의 FTEP 장치의 상이한 요소의 원하는 구성을 제공한다. 또한, 2개 내지 다수의 FTEP 장치(최대 48개 이상)가 단일 기판 상에 병렬로 제조된 다음, 이후에 서로 분리되거나 병렬로 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, FTEP 장치는 재사용 가능하고, 일부 구현예에서, FTEP 장치는 일회용이다. 추가 구현예에서, FTEP 장치는 오토클레이브될 수 있다.

[0096] 전극(308)은 구리, 스테인리스 강, 티타늄, 알루미늄, 황동, 은, 로듐, 금 또는 백금, 또는 흑연과 같은 임의의 적합한 금속으로 형성될 수 있다. 하나의 바람직한 전극 물질은 합금 303(UNS330300) 오스테나이트계 스테인리스 강이다. 적용된 전기장은 알루미늄과 같은 금속으로 제조된 전극을 파괴할 수 있다. 일회용, 1회-사용 FTEP 장치와 반대로 다중-사용(즉, 비-일회용) FTEP 장치가 요구되는 경우, 전극 판은 전기화학적 부식에 내성이 있는 금속으로 코팅될 수 있다. 예를 들어, 귀금속, 예를 들어, 금과 같은 전도성 코팅이 전극 판을 보호하기 위해 사용될 수 있다.

[0097] FTEP 장치의 전체 크기는 3 cm 내지 15 cm 길이, 또는 4 cm 내지 12 cm 길이, 또는 5 cm 내지 10 cm 길이일 수 있다. FTEP 장치의 전체 폭은 1 cm 내지 7.5 cm, 또는 1.5 cm 내지 5 cm, 또는 2 cm 내지 4 cm일 수 있다.

[0098] 저장소가 세포 및 외인성 물질을 FTEP 장치에 도입하기 위해 사용되는 FTEP 장치의 구현예에서, 저장소의 부피 범위는 100 μL 내지 15 mL, 또는 500 μL 내지 10 mL, 또는 1 mL 내지 10 mL이다. FTEP의 유량은 분당 0.01 mL 내지 5.0 mL, 또는 분당 0.05 mL 내지 3.0 mL, 또는 분당 0.1 mL 내지 2.5 mL, 또는 분당 0.2 내지 2.0 mL의 범위이다. FTEP 장치의 압력은 1-30 psi, 또는 2-10 psi, 또는 3-5 psi의 범위이다.

[0099] 전극 사이의 상이한 전계 강도를 피하기 위해, 전극은 병렬로 배열되어야 한다. 또한, 전극의 표면은 핀 홀 또는 피크 없이 가능한 한 평탄해야 한다. 1 내지 10 μm의 거칠기 Rz를 갖는 전극이 바람직하다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 관통형 전기천공 장치는 FTEP 장치에 접지 전위를 적용하는 적어도 하나의 추가 전극을 포함한다.

[00100] 전극은 1-50 kV/cm, 또는 5-40 kV/cm, 또는 10-25 kV/cm를 전달하도록 구성된다. 전극이 멀어질수록 더 많은 전압을 공급해야 한다; 또한, 물론 전달되는 전압은 천공되는 세포의 유형, 세포가 현탁된 배지(예를 들어, 구체-형성 격자 조성물), 전기천공 채널의 크기, 및 전극의 길이 및 직경에 따라 달라진다. FTEP 장치와 함께 사용될 수 있는 많은 상이한 펄스 형태가 있으며, 이는 지수 감쇠파, 구형파 또는 직사각파, 임의의 파형, 또는 파형의 선택된 조합을 포함한다. 일반적인 펄스 형태의 한 가지 유형은 전형적으로 로딩된 커패시터를 세포 샘플로 방전시켜 만들어지는 지수 감쇠파이다. 초기 피크 전류가 감쇠될 수 있도록 인덕터를 세포 샘플에 연결함으로써 지수 감쇠파를 덜 가파르게 만들 수 있다. 지정된 시퀀스의 여러 파형이 사용되는 경우, 이들은 동일한 방향(직류) 또는 다른 방향(교류)일 수 있다. 교류를 사용하는 것은 단지 1개를 사용할 수 있는 것 대신에 세포의 2개의 국소 표면이 분자 수송에 사용될 수 있고, 교류가 전기분해를 방지할 수 있다는 점에서 유리할 수 있다. 펄스 발생기는 디지털 또는 아날로그 패널로 제어될 수 있다. 일부 구현예에서, 구형파 형태가 바람직하고, 다른 구현예에서, 구형파 이전의 초기 파동 스파이크가 바람직하다.

[00101] FTEP 장치는 10 μL 내지 1 mL, 또는 50 μL 내지 750 μL, 또는 100 μL 내지 500 μL, 및 바람직하게는 10 μL 내지 100 μL의 세포 샘플 부피를 전기천공하도록 구성될 수 있다. 전기천공 프로세스를 위해 세포 내로 전기천공될 구체-형성 격자 조성물을 형성하는데 사용되는 배지 또는 완충액은 SOC, MEM, DMEM, IMDM, RPMI, 행크액, PBS 및 링거액과 같은 형질전환되거나 형질감염되는 세포의 유형에 대한 임의의 적합한 배지 또는 완충액일 수 있다. 또한, 세포는 형질전환 또는 형질감염 전에 전기적격성이 되어야 하기 때문에, 완충액은 또한 글리세롤 또는 소르비톨을 포함할 수 있고, 계면활성제도 포함할 수 있다. 대부분의 진핵 세포의 전기천공을 위해, 배지 또는 완충액은 적절한 삼투압을 유지하기 위해 일반적으로 염을 함유한다. 배지 또는 완충액의 염은 또한 배지를 전도성으로 만든다. 박테리아와 같은 매우 작은 원핵 세포의 전기천공을 위해, 때때로 물 또는 10% 글리세롤이 매우 높은 전계 강도를 허용하기 위해 낮은 전도도 배지로 사용된다. 이 경우, 전달될 하전된 분자는 여전히 수성 배지가 지질 기반 세포막보다 더 전도성이 되도록 하고, 배지는 특히 세포막과 비교하여 여전히 대략 전도성으로 간주될 수 있다.

[00102] 또한, FTEP 장치는 다중-통과 전기천공 절차를 허용하는 푸쉬-풀(push-pull) 공압 수단을 포함할 수 있다; 즉, 전기천공될 구체-패킹 격자 조성물의 세포는 전기천공의 1회 통과를 위해 입구로부터 출구를 향해 "당겨질" 수 있고, 이후 관통형 FTEP 장치의 출구 단부로부터 입구 단부로 "밀어"져서 전기천공의 또 다른 통과를 위해 다시 전극 사이를 통과할 수 있다. 이러한 프로세스는 1회 내지 여러 번 반복될 수 있다. 대안적으로, FTEP는 세포의 순차적 분취량을 천공하는데 사용될 수 있다; 예를 들어, 제1 부피의 세포를 제1 부피를 갖는 제1 통과로 천공한 다음 회수부에 전달하고, 이후 제2 부피의 세포를 제2 부피를 갖는 제2 통과로 천공한 다음 회수부에 전달하는 식으로, 제3, 제4 및 제5 이상의 부피도 마찬가지이다.

[00103] 도 3d는 유동 채널의 영역이 표시된 FTEP 장치(350)의 확대된 저면도이다. FTEP 장치(350)는 입구(302), 출구(304), 5개의 영역, 즉, 입구-필터 영역(306a), 입구-근위 영역(306b), 중앙 영역(306c), 출구-근위 영역(306d) 및 출구-필터 영역(306e)을 포함하는 유동 채널(306)을 포함한다. 2개의 전극(308)은 유동 채널(306)의 중앙 영역(306c)의 측면에 있다. 램프(374a 및 374b)도 제시된다. 입구(302)에 근접한 램프(374a)는 유동 채널(306)의 중앙 영역(306c)에 근접한 램프(374a)의 영역을 향해 이동하면서 전극(308)에 근접한 램프(374a)의 영역으로부터 유동 채널(306)의 단면적을 감소시킨다. 출구(304)에 근접한 램프(374b)는 전극(308)을 향해 이동하면서 유동 채널(306)의 중앙 영역(306c)에 근접한 램프(374b)의 영역으로부터 유동 채널(306)의 단면적을 증가시킨다. 채널 높이는 전계 강도를 조정하는데 사용될 수 있는 파라미터이다. 일정한 인가 전압에서, 전계 강도는 세포가 통과하는 유동 채널의 단면적을 감소시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 유동 채널의 높이가 감소함에 따라 전계 강도가 증가한다. 유사하게, 상기 기재된 바와 같이, 차단 어레이에서 차단물 사이의 간격이 작아질 때, 전계 강도가 증가한다. 따라서, 선택적 램프는 향상된 전기천공 효율을 달성하기 위해 전계 강도를 증가시킬 목적으로 사용된다. 램프(374a 및 374b)는 (비록 거울상이지만) 유사하게 구성될 수 있거나 상이한 구성을 가질 수 있다. 램프의 길이는 0.3 mm 내지 2.0 mm, 또는 0.5 mm 내지 1.5 mm, 또는 0.8 mm 내지 1.0 mm의 범위일 수 있다. 램프(374)의 폭(W)은 바람직하게는 약 1.0 cm 내지 7.5 cm, 또는 1.5 cm 내지 5 cm, 또는 2 cm 내지 4 cm와 같이, 채널의 폭과 동일하다. 램프(374a)는 유동 채널(306)의 중앙 영역(306c)의 단면 높이를 1000 μm에서 400 μm로, 또는 750 μm에서 300 μm로 감소시키고 램프(374b)는 유동 채널(306)의 중앙 영역(306c)에서 전극(308)까지의 단면 높이를 400 μm에서 1000 μm로, 또는 300 μm에서 750 μm로 증가시킨다. 추가로, 램프(374a 및 374b)의 구성은 더 큰 단면 높이에서 더 작은 단면 높이로의 유동 채널 높이의 매끄러운 변천일 수 있거나, 램프(374a 및 374b)의 구성은 계단식일 수 있다. 예를 들어, 램프(374a)의 경우, 제1 계단은 중앙 영역(306c)의 단면 높이를 중앙 영역(306c)의 길이(X)에 대해 25 μm만큼 감소시킬 수 있고, 이어서 다음 계단은 중앙 영역(306c)의 단면 높이를 중앙 영역(306c)의 길이(Y)에 대해 추가로 25 μm만큼 감소시킬 수 있다. 램프(374b)의 구성은 램프(374a)의 구성과 일치할 수 있거나(거울상), (374a)의 구성과 상이할 수 있다.

[00104] 전기천공될 세포의 유형(예를 들어, 박테리아, 효모, 포유동물) 및 전극의 구성에 따라, 유동 채널 내의 전극 사이의 거리는 광범위하게 변할 수 있다. 각 전극(108)의 중간 점으로부터의 길이(L1)는 대략 1 내지 15 mm, 또는 2 내지 12 mm, 3 내지 10 mm, 또는 4 mm 내지 8 mm이다.

[00105] 도 3e-3g는, 예를 들어, 시약 카트리지에 삽입되도록 구성된 관통형 전기천공 장치 삽입물(308)의 3개의 측면 사시도를 도시한다. 도 4a에 도시된 시약 카트리지(400)의 구현예에서, 관통형 전기천공 장치(406)는 시약 카트리지(400)에 위치한다(또한 도 2a의 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기(200)의 한 구성요소로서 관통형 전기천공 장치(230)를 갖는 시약 카트리지(210)를 참조한다); 그러나 대안적인 구현예에서, 전기천공 모듈은 시약 카트리지와 분리될 수 있다. 전기천공은 입구 웰(352)(도 3e 및 3f에 포함됨) 및 출구 웰(354)(또한 도 3e 및 3f에 포함됨), 및 전극 채널(378)의 외부를 포함한다. 전기천공 장치 삽입물(308)은 탭(317) 및 외부 플랜지(307) 둘 모두를 포함한다. 도 3g는, 예를 들어, 운송 및 사용하기 전까지 전기천공 장치(306)를 멸균 상태로 유지하기 위한 커버(305)를 갖는 전기천공 장치 삽입물(308)을 도시한다. 전기천공 삽입물은 임의의 적절한 물질로 제조될 수 있다; 그러나, 삽입물은 대부분의 구현예에서 일회용이므로, 전형적으로 폴리비닐 클로라이드, 사이클릭 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 아크릴로니트릴 부타디엔, 폴리카르보네이트, 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 폴리(메틸 메틸아크릴레이트)(PMMA), 폴리설폰 및 폴리우레탄, 및 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함하는 생체적합성 플라스틱으로 제작된다.

[00106] 도 3h-3k는 전기천공 삽입물(308)의 추가 도면을 제공한다. 도 3h는 입구 웰(352), 출구 웰(354) 및 전극 채널(378)을 수용하는 전기천공 삽입물(308)의 단면도이다. 전기천공 삽입물(308)은 외부 플랜지(307), 전기천공 커버(305), 및 예를 들어, 시약 카트리지에 삽입될 때 시약 카트리지의 탭 결합 부재(도시되지 않음)와 결합하도록 구성된 탭(317)을 포함한다. 또한, 이 구현예에서 사용 준비가 될 때까지 전기천공의 멸균 상태를 유지하기 위해 사용되는 박리 호일, 필름 또는 다른 유형의 밀봉인 전기천공 커버(305)가 도시된다. 도 3i는 도 3h에 도시된 전기천공 삽입물(308)의 평면도이다. 사용 전에 전기천공 장치를 보호하고 멸균 상태로 유지하며, 사용자, 데이터(373) 및 기계 판독 가능한 표시(375)에 의해 제거 가능한 전기천공 삽입물 커버 또는 밀봉(305)이 제시된다. 데이터(373)는 로트 번호, 일련 번호, 제품 번호, 만료일, 또는 전기천공 삽입물(308)과 관련된 다른 데이터와 같은 정보를 포함할 수 있다. 기계 판독 가능한 표시(375)는 바코드, QR 코드, 데이터 매트릭스 코드(오류 정정형 바코드), RFID 또는 다른 유형의 기계 판독 가능한 표시일 수 있으며, 이는, 예를 들어, 전기천공 삽입물(308)의 내용물을 확인하고 선택적으로 작동을 제어하기 위해 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에 위치한 하나 이상의 이미징 센서(예를 들어, 바코드 스캐너, 카메라 등)(도시되지 않음)에 의해 감지된다. 도 3k는 전기천공 삽입물 커버(305)(도 3i에 제시됨)가 제거된 전기천공 삽입물(308)의 평면도이다. 다시, 데이터(373), 기계 판독 가능한 표시(375) 및 전기천공부(306)를 볼 수 있다. 또한, 전기천공부(306)의 전극 채널(378)이 제시된다.

[00107] 전술한 바와 같이, 구체-패킹 격자 조성물은 전기천공 장치에 무관하다. FTEP 장치에서의 사용과 관련하여 기술되었지만, 구체-패킹 격자 조성물은 또한 표준 큐벳에서 사용될 수 있다. 큐벳은 VWR(Radnor, PA), Bio-Rad, Inc.(Hercules, CA), Bulldog Bio(Portsmith, NH), Sigma Aldrich(St. Louis, MO) 및 Starna(Atascadero, CA)를 포함하는 다양한 공급업체로부터 어디에서나 입수할 수 있다.

시약 카트리지

[00108] 도 4a는 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에서 사용될 수 있는 전기천공 장치(206)를 포함하는 예시적인 조합 시약 카트리지(400)("카트리지" 또는 "시약 카트리지")를 도시한다. 카트리지(400)는 본체(402), 및 전기천공 장치(406)와 함께 시약 리셉터클 또는 저장소(404)를 포함한다. 카트리지(400)는 일회용이거나 재사용되도록 구성될 수 있다. 카트리지(400)는 스테인리스 강, 알루미늄, 종이 또는 기타 섬유, 또는 폴리비닐 클로라이드, 사이클릭 올레핀 공중합체(COC), 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 아크릴로니트릴 부타디엔, 폴리카르보네이트, 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 폴리(메틸 메틸아크릴레이트)(PMMA), 폴리설폰 및 폴리 우레탄, 및 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함하는 플라스틱을 포함하는 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있다. 카트리지가 일회용인 경우, 바람직하게는 이는 플라스틱 또는 종이로 제조된다. 바람직하게는, 카트리지(400)가 시약 리셉터클 또는 저장소(404)에서 시약을 가열하거나 냉각시키는 열 장치(도시되지 않음)와 접촉하는 특정 구현예에서와 같이, 카트리지를 제조하는데 사용되는 물질은 열 전도성이다. 일부 구현예에서, 열 장치는 펠티에 장치 또는 열전 냉각기이다. 시약 리셉터클 또는 저장소(404)는 도 4a에 도시된 바와 같이 개별 시약 튜브가 삽입된 리셉터클일 수 있으며, 리셉터클에 하나 이상의 다수의 공동 결합된 튜브가 삽입되거나(예를 들어, 공동 결합된 4개 튜브의 열이 시약 리셉터클에 삽입됨), 시약 리셉터클은 튜브를 삽입하지 않고 시약을 리셉터클 또는 저장소에 직접 분배하여 시약을 담을 수 있다. 추가로, 시약 카트리지(400)의 리셉터클(404)은 튜브, 공동 결합된 튜브 및 시약의 직접 충전의 임의의 조합을 위해 구성될 수 있다.

[00109] 일 구현예에서, 시약 카트리지(400)의 시약 리셉터클 또는 저장소(404)는, 예를 들어, 250 ml 튜브, 25 ml 튜브, 10 ml 튜브, 5 ml 튜브 및 에펜도르프(예를 들어, 미세원심분리기) 튜브를 포함하는 다양한 크기의 튜브를 담도록 구성된다. 또 다른 구현예에서, 모든 리셉터클은 동일한 크기의 튜브, 예를 들어, 5 ml 튜브를 담도록 구성될 수 있고, 저장소 삽입물은 시약 저장소에 더 작은 튜브를 수용하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 특히 시약 카트리지(400)가 일회용인 구현예에서, 시약 저장소(404)는 삽입된 튜브 없이 시약을 담는다. 이러한 일회용 구현예에서, 시약 카트리지는 키트의 일부일 수 있으며, 여기서 시약 카트리지는 시약 및, 예를 들어, 호일, 필름, 열 밀봉 아크릴산 등으로 밀봉된 리셉터클 또는 저장소로 미리 채워져 소비자에게 제공되며, 이후 시약 카트리지는 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에서 사용될 수 있다. 시약 카트리지(400)에 포함되는 시약은 워크플로우에 따라 달라질 것이다; 즉, 시약은 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에서 세포가 겪는 프로세스에 따라 달라질 것이다. 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에서 특히 사용되는 시약 카트리지의 다양한 구현예에 대해서는 2019년 8월 13일에 발행된 USPN 10,376,889; 2019년 9월 10일에 발행된 10,406,525; 및 2019년 11월 19일에 발행된 10,478,822를 참조한다.

[00110] 도 4b는 도 4a의 시약 카트리지에 함유된 시약에 대한 예시적인 매트릭스 구성(440)을 도시하며, 여기서 이 매트릭스 구현예는 4 X 4 시약 매트릭스이다. 매트릭스 구성을 통해, 사용자(또는 프로그래밍된 프로세서)는 주어진 프로세스에 적당한 시약을 위치시킬 수 있다. 즉, 세포 샘플, 효소, 완충액, 핵산 벡터, 발현 카세트, 반응 성분(예를 들어, 이를 테면, MgCl₂, dNTP, 등온 핵산 어셈블리 시약, 갭 복구 시약 등), 세척 용액, 에탄올, 및 핵산 정제 및 분리를 위한 자성 비드 등과 같은 시약은 매트릭스(240)에서 공지된 위치에 위치된다. 예를 들어, 시약은 위치 A1(210), A2(211), A3(212), A4(213), B1(214), B2(215) 등부터, 이 구현예에서, 위치 D4(225)까지 위치된다. 도 4a는 여러 저장소(404)가 매트릭스(440)에 대응하는 것을 보여주기 위해 표시된다; 리셉터클(410, 411, 412, 413, 421 및 425)을 참조한다. 도 4a의 시약 카트리지(400) 및 도 4b의 매트릭스 구성(440)은 4 X 4 매트릭스를 나타내지만, 시약 카트리지 및 전기천공 장치의 매트릭스는, 예를 들어, 2 X 2, 2 X 3, 2 X 4, 2 X 5, 2 X 6, 3 X 3, 3 X 5, 4 X 6, 6 X 7와 같은 임의의 구성, 또는 비대칭 구성을 포함하는 임의의 다른 구성, 또는 의도된 워크플로우에 필요한 시약에 따라 2개 이상의 상이한 매트릭스일 수 있다.

[00111] 도 4a에 도시된 시약 카트리지(400)의 바람직한 구현예에서, 시약 카트리지는 액체 핸들링 장치(도 2a의 (232)에 도시된 ADP 헤드)를 통해 시약을 분배하고 시약 카트리지(400) 내에 포함된 전기천공 장치를 제어하기 위한 프로세서(도시되지 않음)에 의해 판독 가능한 스크립트(도시되지 않음)를 포함한다. 또한, 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 하나의 구성요소로서 시약 카트리지(400)는 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에 의해 수행되는 2개, 3개, 4개, 5개, 10개 이상의 프로세스를 지정하는 스크립트를 포함하거나, 심지어 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에 의해 수행되는 모든 프로세스를 지정할 수 있다. 특정 구현예에서, 시약 카트리지는 일회용이고 특정 세포 처리 프로토콜, 예를 들어, 게놈 편집 또는 단백질 생산을 수행하도록 맞춤화된 시약으로 미리 패키징된다. 시약 카트리지 내용물은 다양하지만 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 구성요소는 그렇지 않을 수 있으므로, 특정 시약 카트리지와 관련된 스크립트는 사용된 시약 및 수행된 세포 프로세스와 일치한다. 따라서, 예를 들어, 시약 카트리지는 게놈 편집을 위한 시약 및 도 2a-2c와 관련하여 설명된 것과 같은 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에서 게놈 편집을 수행하기 위한 프로세스 단계를 지정하는 스크립트(또는 예를 들어, 시약 카트리지의 업데이트된 시약에 기초하여 사전 프로그래밍된 스크립트의 단계를 수정하는 스크립트)와 함께 미리 패키징될 수 있다.

[00112] 예를 들어, 도 4a의 시약 카트리지(400)는 저장소 A2(411)로부터 전기적격 세포를 피펫팅하고, 세포를 전기천공 장치(406)로 전달하고, 저장소 C3(420)로부터의 편집 벡터를 포함하는 핵산 용액을 피펫팅하고, 핵산 용액을 전기천공 장치로 전달하고, 지정된 시간 동안 전기천공 프로세스를 개시한 다음, 천공된 세포를 시약 카세트의 저장소 D4(425) 또는 도 2a의 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 회전 성장 바이알(예를 들어, 도 2a의 (218)을 참조한다)과 같은 다른 모듈로 이동시키는 스크립트를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 시약 카트리지는 저장소 C3(420)의 벡터를 포함하는 핵산 용액, 저장소 C4(421)의 편집 올리고뉴클레오티드 카세트를 포함하는 핵산 용액, 및 A1(410)의 등온 핵산 어셈블리 반응 혼합물을 등온 핵산 어셈블리/탈염 저장소로 피펫 전달하는 스크립트를 포함할 수 있다. 스크립트는 또한 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에서 다른 모듈에 의해 수행되는 프로세스 단계를 지정할 수 있다. 예를 들어, 스크립트는 어셈블링된 등온 핵산 생성물을 생성하기 위해 등온 핵산 어셈블리/탈염 모듈이 30분 동안 50℃로 가열되고; 어셈블링된 등온 핵산 생성물이 저장소 B2(415)에서 자성 비드의 일련의 피펫 전달 및 혼합, 저장소 B3(416)에서 에탄올 세척, 및 저장소 C1(418)의 물을 등온 핵산 어셈블리/탈염 저장소(도 2a에 도시되지 않음)로 보내는 것을 포함하는 자성 비드-기반 핵산 정제를 통해 탈염되도록 지정할 수 있다.

회전 세포 성장 모듈

[00113] 도 5a는 본원에 개시된 세포 성장 장치와 함께 사용하기 위한 회전 성장 바이알(500)의 일 구현예를 제시한다. 회전 성장 바이알은 액체 배지 및 세포를 수용하기 위한 개방 단부(504), 세포 성장을 위한 1차 용기를 정의하는 중앙 바이알 영역(506), 적어도 하나의 광 경로(510)를 정의하는 테이퍼-수축 영역(tapered-to-constricted region)(518), 폐쇄 단부(516), 및 구동 결합 메커니즘(512)을 갖는 광학적으로 투명한 용기이다. 회전 성장 바이알은 바이알이 회전하는 중심 종축(520)을 가지며, 광 경로(510)는 일반적으로 바이알의 종축에 수직이다. 제1 광 경로(510)는 테이퍼-수축 영역(518)의 하부 수축 부분에 위치된다. 선택적으로, 회전 성장 바이알(500)의 일부 구현예는 테이퍼-수축 영역(518)의 테이퍼 영역에 제2 광 경로(508)를 갖는다. 본 구현예에서 둘 모두의 광 경로는 세포 배양물(세포 + 성장 배지)로 지속적으로 채워지고 성장 바이알의 회전 속도에 의해 영향을 받지 않는 회전 성장 바이알의 영역에 위치된다. 제1 광 경로(510)는 제2 광 경로(508)보다 짧아서 바이알 내의 세포 배양물의 OD 값이 높은 수준인 경우(예를 들어, 세포 성장 과정에서 나중에) OD 값의 민감한 측정을 가능하게 하는 반면, 제2 광 경로(508)는 바이알 내의 세포 배양물의 OD 값이 낮은 수준인 경우(예를 들어, 세포 성장 과정에서 더 일찍) OD 값의 민감한 측정을 가능하게 한다. 또한, 회전 성장 바이알이 성장 모듈(도시되지 않음)에 안착되도록 하고 추가로 사용자에 의한 용이한 핸들링을 허용하는 립(502)이 도시된다.

[00114] 회전 성장 바이알의 일부 구성에서, 회전 성장 바이알은 회전 성장 바이알의 내벽으로부터 중앙 바이알 영역(506)의 중심을 향해 연장되는, 회전 성장 바이알 내에 배치된 2개 이상의 "패들" 또는 내부 피처를 갖는다. 일부 양태에서, 패들 또는 피처의 폭은 회전 성장 바이알의 크기 또는 부피에 따라 달라지고, 회전 성장 바이알의 직경의 1/20 내지 1/3 약간 초과, 또는 회전 성장 바이알의 직경의 1/15 내지 1/4, 또는 회전 성장 바이알의 직경의 1/10 내지 1/5의 범위일 수 있다. 일부 양태에서, 패들의 길이는 회전 성장 바이알의 크기 또는 부피에 따라 달라지고, 회전 성장 바이알(500)의 본체의 길이의 4/5 내지 1/4, 또는 회전 성장 바이알의 중앙 본체 영역(506)의 길이의 3/4 내지 1/3, 또는 회전 성장 바이알(500)의 중앙 본체 영역(506)의 길이의 1/2 내지 1/3의 범위일 수 있다. 다른 양태에서, 수평 또는 수직으로 배열된 회전 성장 바이알의 본체의 내부 표면 상에 배치된 융기된 피처의 동심원 열이 존재할 수 있으며; 다른 양태에서, 회전 성장 바이알의 본체의 내부 표면 상에 배치된 융기된 피처의 나선형 구성이 존재할 수 있다. 대안적인 양태에서, 융기된 피처 또는 나선형 구성의 동심원 열은 회전 성장 바이알의 포스트 또는 중심 구조 상에 배치될 수 있다. 2개의 패들을 갖는 것으로 위에서 설명되었지만, 회전 성장 바이알(500)은 3, 4, 5, 6개 이상의 패들 및 최대 20개의 패들을 포함할 수 있다. 패들의 수는, 예를 들어, 회전 성장 바이알(500)의 크기 또는 부피에 좌우될 것이다. 패들은 바이알의 내벽으로부터 바이알 내부로 연장되는 단일 패들로서 대칭적으로 배열될 수 있거나, 패들은 바이알의 내벽으로부터 바이알 내부로 연장되는 그룹으로, 2, 3, 4개 이상의 패들의 그룹으로 대칭적으로 배열될 수 있다(예를 들어, 한 쌍의 패들이 다른 쌍의 패들 반대편에 있음). 다른 구현예에서, 패들은 회전 성장 바이알의 중간으로부터, 예를 들어, 회전 성장 바이알의 내부에 있는 포스트 또는 다른 지지 구조로부터 회전 성장 바이알의 벽을 향해 연장될 수 있다.

[00115] 구동 결합 메커니즘(512)은 바이알을 회전시키기 위해 모터(도시되지 않음)와 결합한다. 일부 구현예에서, 모터는 회전 성장 바이알이 한 방향으로만 회전하도록 구동 결합 메커니즘(512)을 구동하고, 다른 구현예에서, 회전 성장 바이알은 제1 시간 또는 주기성 동안 제1 방향으로 회전하고, 제2 시간 또는 주기성 동안 제2 방향(즉, 반대 방향)으로 회전하며, 이러한 프로세스는 회전 성장 바이알(및 세포 배양 내용물)이 진동 운동에 적용되도록 반복될 수 있다. 또한, 배양물이 진동에 적용되는지 여부 및 이에 따른 주기성의 선택은 사용자에 의해 선택될 수 있다. 제1 시간 및 제2 시간은 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. 시간은 1초, 2초, 3초, 4초, 5초 이상이거나, 1분, 2분, 3분, 4분 이상일 수 있다. 다른 구현예에서, 세포 성장의 초기 단계에서, 회전 성장 바이알은 제1 주기성(예를 들어, 60초마다)으로 진동될 수 있고, 이후 세포 성장의 후기 단계에서, 회전 성장 바이알은 제1 주기성과 상이한 제2 주기성(예를 들어, 1초마다)으로 진동될 수 있다.

[00116] 회전 성장 바이알(500)은 재사용될 수 있거나, 바람직하게는, 회전 성장 바이알은 소모품이다. 일부 구현예에서, 회전 성장 바이알은 소모품이고, 성장 배지로 미리 채워진 채로 사용자에게 제공되며, 여기서 바이알은 호일 또는 필름 밀봉으로 개방 단부(504)에서 밀폐 밀봉된다. 이러한 방식으로 패키징된 배지-충전된 회전 성장 바이알은 독립형 세포 성장 장치 또는 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 일부인 세포 성장 모듈과 함께 사용하기 위한 키트의 일부일 수 있다. 바이알에 세포를 도입하기 위해, 사용자는 원하는 부피의 세포를 피펫팅하고, 바이알의 호일 또는 호일 밀봉을 천공하기 위해 피펫 팁을 사용하기만 하면 된다. 개방 단부(504)는 세포 성장 장치(도시되지 않음)와 중첩하고 결합하기 위해 연장된 립(502)을 선택적으로 포함할 수 있다. 자동화된 시스템에서, 회전 성장 바이알(500)은 자동화된 기기의 일부인 스캐너 또는 카메라(도시되지 않음)에 의해 판독될 수 있는 바코드 또는 다른 식별 수단으로 태깅될 수 있다.

[00117] 회전 성장 바이알(500)의 부피 및 세포 배양물의 부피(성장 배지 포함)는 크게 변할 수 있지만, 회전 성장 바이알(500)의 부피는 바이알이 회전하는 동안 적당한 통기를 얻고 적절한 수의 세포를 생성하기 위한 성장 바이알에서의 세포 배양을 위해 충분히 커야 한다. 실제로, 회전 성장 바이알(500)의 부피는 1-250 mL, 2-100 mL, 5-80 mL, 10-50 mL 또는 12-35 mL의 범위일 수 있다. 마찬가지로, 세포 배양물(세포 + 성장 배지)의 부피는 회전 성장 바이알에서 적절한 통기를 허용하기에 적절해야 한다. 따라서, 세포 배양물의 부피는 성장 바이알 부피의 대략 5-85% 또는 성장 바이알 부피의 20-60%이어야 한다. 예를 들어, 35 mL 성장 바이알의 경우, 세포 배양물의 부피는 약 1.8 mL 내지 약 27 mL, 또는 5 mL 내지 약 21 mL일 것이다.

[00118] 회전 성장 바이알(500)은 바람직하게는 생체적합성의 광학적으로 투명한 물질로 제작되거나, 광 경로(들)를 포함하는 바이알의 적어도 일부는 투명하다. 추가로, 회전 성장 바이알을 제작하는 물질은 온도 기반 세포 검정 및 저온에서의 장기간 저장 둘 모두를 수용하기 위해 약 4℃ 이하로 냉각되고 약 55℃ 이상으로 가열될 수 있어야 한다. 또한, 바이알을 제작하는데 사용되는 물질은 회전하는 동안 변형 없이 최대 55℃의 온도를 견딜 수 있어야 한다. 적합한 물질은 유리, 사이클릭 올레핀 공중합체(COC), 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트(PMMA), 폴리설폰, 폴리우레탄, 및 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함한다. 바람직한 물질은 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트 또는 폴리스티렌을 포함한다. 일부 구현예에서, 회전 성장 바이알은, 예를 들어, 사출 성형 또는 압출에 의해 저렴하게 제작된다.

[00119] 도 5b-5d는 회전 성장 바이알(500)을 포함하는 세포 성장 모듈(550)의 구현예를 보여준다. 도 5b는 세포 성장 모듈(550)의 일 구현예의 사시도이다. 도 5c는 도 5b로부터의 세포 성장 모듈(550)의 컷어웨이 도면을 도시한다. 둘 모두의 도면에서, 회전 성장 바이알(500)은 메인 하우징(526) 내부에 위치하는 것으로 제시되며, 회전 성장 바이알(500)의 연장된 립(502)은 메인 하우징(526) 위로 연장된다. 추가로, 단부 하우징(522), 하부 하우징(532) 및 플랜지(524)가 두 도면 모두에 표시되어 있다. 플랜지(524)는 세포 성장 장치/모듈을 가열/냉각 수단 또는 다른 구조(도시되지 않음)에 부착하는데 사용된다. 도 5c는 추가 세부 사항을 도시한다. 도 5c에서, 상부 베어링(542) 및 하부 베어링(530)은 메인 하우징(526) 내에 위치하는 것으로 도시되어 있다. 상부 베어링(542) 및 하부 베어링(530)은 회전 성장 바이알(500)의 수직 하중을 지지한다. 하부 하우징(532)은 구동 모터(536)를 포함한다. 도 5c의 세포 성장 장치(550)는 제1 광 경로(534) 및 제2 광 경로(530)의 2개의 광 경로를 포함한다. 광 경로(534)는 회전 성장 바이알의 테이퍼-수축 부분의 수축 부분에 위치된 광 경로(510)에 해당하고, 광 경로(530)는 회전 성장 바이알의 테이퍼-수축 부분의 테이퍼 부분 내의 광 경로(508)에 해당한다. 광 경로(510 및 508)는 도 5c에 도시되지 않았지만, 예를 들어, 도 5a에서 볼 수 있다. 광 경로(534 및 530)에 추가하여, 광 경로(들)를 조명하기 위한 방출 보드(528), 및 회전 성장 바이알(500)에서 세포 배양 액체를 통해 광이 이동한 후 광을 검출하기 위한 검출기 보드(546)가 있다.

[00120] 일부 구현예에서, 회전 성장 바이알(500)을 회전시키는데 사용되는 구동 모터(536)는 0 내지 약 3000 RPM의 일정한 분당 회전수(RPM)를 유지하도록 설정될 수 있는 내장 구동 제어장치를 갖는 브러시리스(brushless) DC 유형 구동 모터이다. 대안적으로, 스테퍼(stepper), 서보(servo), 브러시 DC 등과 같은 다른 모터 유형이 사용될 수 있다. 선택적으로, 구동 모터(506)는 또한 회전 방향의 반전을 허용하는 방향 제어장치, 및 실제 RPM을 감지하고 보고하는 타코미터를 가질 수 있다. 모터는, 예를 들어, 프로세서 및/또는 사용자 입력에 프로그래밍된 표준 프로토콜에 따라 프로세서(도시되지 않음)에 의해 제어되고, 모터는 세포 배양물의 축방향 전진을 유발하여 혼합을 향상시키고, 예를 들어, 세포 응집을 방지하고, 통기를 증가시키고, 세포 호흡을 최적화시키기 위해 RPM을 변화시키도록 구성될 수 있다.

[00121] 세포 성장 장치/모듈(550)의 메인 하우징(526), 단부 하우징(522) 및 하부 하우징(532)은 알루미늄, 스테인리스 강, 및 플라스틱을 포함하는 다른 열 전도성 물질을 포함하는 임의의 적합한 견고한 물질로 제작될 수 있다. 이들 구조 또는 이의 부분은 다양한 기술, 예를 들어, 금속 제작, 사출 성형, 융합되는 구조 층의 생성 등을 통해 생성될 수 있다. 회전 성장 바이알(500)이 일부 구현예에서 재사용 가능하지만 바람직하게는 소모품인 것으로 구상되는 반면, 세포 성장 장치(550)의 다른 구성요소는 바람직하게는 재사용 가능하고 독립형 벤치탑 장치로서 또는 여기에서와 같이 다중-모듈 세포 처리 기기의 모듈로서 기능할 수 있다.

[00122] 세포 성장 시스템의 프로세서(도시되지 않음)는 성장 세포 배양물에 대한 "블랭크" 또는 대조군으로서 사용될 정보로 프로그래밍될 수 있다. "블랭크" 또는 대조군은 세포 성장 배지만을 함유하는 용기이며, 이는 100% 투과율 및 0 OD를 생성하는 반면, 세포 샘플은 광선을 편향시키고 더 낮은 투과율 및 더 높은 OD를 가질 것이다. 세포가 배지에서 성장하고 밀도가 높아짐에 따라, 투과율이 감소하고 OD가 증가할 것이다. 세포 성장 시스템의 프로세서는 세포 배양(예를 들어, 포유동물 세포, 박테리아 세포, 동물 세포, 효모 세포 등이든 간에)에서 전형적으로 사용되는 성장 배지에 상응하는 블랭크에 대한 파장 값을 사용하도록 프로그래밍될 수 있다. 대안적으로, 제2 분광광도계 및 용기가 세포 성장 시스템에 포함될 수 있으며, 여기서 제2 분광광도계는 지정된 간격으로 블랭크를 판독하는데 사용된다.

[00123] 도 5d는 광원(590), 검출기(592) 및 열전 구성요소(594)에 결합된 도 5b의 세포 성장 장치(550)를 포함하는 조립체의 일부로서 세포 성장 장치/모듈(550)를 예시한다. 회전 성장 바이알(500)이 세포 성장 장치(550)에 삽입된다. 광원(590) 및 검출기(592)의 구성요소(예를 들어, 5-로그를 커버하는 획득 제어를 갖는 포토다이오드)는 세포 성장 장치(550)의 메인 하우징에 결합된다. 회전 성장 바이알을 회전시키는 모터를 수용하는 하부 하우징(532)이 예시되며, 이는 세포 성장 장치를 조립체에 고정시키는 플랜지(524) 중 하나이다. 또한, 펠티에 장치 또는 열전 구성요소(594)가 예시된다. 이러한 구현예에서, 열 제어는 하부 하우징(532)의 베이스 상의 플랜지(504)를 통해 열전 구성요소(594)에 대한 세포 성장 장치(500)의 부착 및 전기적 통합에 의해 달성된다. 열전 냉각기/장치(594)는 전류 흐름의 방향에 따라 표면을 냉각시키거나 표면을 가열하면서 접합부의 양측으로 열을 "펌핑"할 수 있다. 일 구현예에서, 서미스터(thermistor)를 사용하여 메인 하우징의 온도를 측정한 후, 표준 전자 비례-적분-미분(PID) 제어기 루프를 통해, 회전 성장 바이알(500)은 대략 +/- 0.5℃로 제어된다.

[00124] 특정 구현예에서, 후방-장착 전력 입력 모듈은 안전 퓨즈 및 온-오프 스위치를 포함하며, 이는 스위치 온될 때 프로세서를 활성화하는 내부 AC 및 DC 전력 공급기(도시되지 않음)에 전력을 공급한다. 프로그래밍된 시간 간격에서 광학 밀도(OD)의 측정은 관심 세포를 포함하는 회전 성장 바이알의 하부 수축 부분으로 광학계를 통해 컬럼화된 600 nm 발광 다이오드(LED)(도시되지 않음)를 사용하여 달성된다. 광은 수집 광학계를 통해 (디지털) 획득-제어 실리콘 포토다이오드로 구성된 검출 시스템으로 계속된다. 일반적으로, 광학 밀도는 보통 광학 감쇠기의 전력 전송 계수의 밑이 10인 로그의 절대값으로 제시된다: OD = -log10 (파워 아웃(Power out)/파워 인(Power in)). OD는 광 감쇠(즉, 흡수, 산란 및 반사의 합)의 척도이기 때문에, 세포 성장 장치 OD 측정은 전체 전력 전송을 기록하므로, 세포가 성장하고 집단의 밀도가 높아짐에 따라 OD(신호 손실)가 증가한다. OD 시스템은 측정 프로그램에 의해 접근할 수 있는 온-보드(on-board) 메모리에 저장된 이들 값으로 OD 표준에 대해 사전 보정된다.

[00125] 사용시, 세포는 호일 또는 필름 밀봉을 관통함으로써 회전 성장 바이알(500)의 사전 충전된 성장 배지로 접종된다(세포는, 예를 들어, 자동화된 액체 핸들링 시스템으로부터 또는 사용자에 의해 피펫팅될 수 있다). 세포 성장 장치(550)의 프로그래밍된 소프트웨어는 성장을 위한 제어 온도, 전형적으로 30℃를 설정한 후, 회전 성장 바이알의 회전을 천천히 시작한다. 세포/성장 배지 혼합물은 회전 성장 바이알이 혼합물의 넓은 표면적을 정상적인 산소 환경에 노출시키는 것을 가능하게 하는 원심력으로 인해 벽 위로 천천히 수직으로 이동한다. 성장 모니터링 시스템은 사전 설정된 또는 사전 프로그래밍된 시간 간격으로 OD 또는 OD 측정값을 연속적으로 판독한다. 이들 측정은 내부 메모리에 저장되며, 요청시 소프트웨어는 시간 대비 측정을 플롯팅하여 성장 곡선을 표시한다. 예를 들어, 성장 조건을 최적화하기 위해 향상된 혼합이 요구되는 경우, 바이알 회전 속도는 액체의 축방향 전진을 야기하도록 변경될 수 있고/있거나 완전한 방향 변화가 프로그래밍된 간격으로 수행될 수 있다. 성장 모니터링은 사전 결정된 OD에서 성장 단계를 자동으로 종결시킨 후, 혼합물을 더 낮은 온도로 신속하게 냉각시켜 추가 성장을 억제하도록 프로그래밍될 수 있다.

[00126] 세포 성장 장치(550)에 대한 한 가지 응용은 성장 세포 배양물의 광학 밀도를 지속적으로 측정하는 것이다. 설명된 세포 성장 장치의 한 가지 이점은 광학 밀도가 연속적으로(동역학적 모니터링) 또는 특정 시간 간격, 예를 들어, 5, 10, 15, 20, 30, 45 또는 60초마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10분마다 측정될 수 있다는 것이다. 세포 성장 장치가 성장 세포 배양물의 광학 밀도(OD)를 측정하는 맥락에서 설명되었지만, 본 명세서의 교시를 고려할 때 다른 세포 성장 파라미터가 세포 배양 OD에 추가하여 또는 이를 대신하여 측정될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 예를 들어, 가시 광선, UV 또는 근적외선(NIR) 광을 사용하는 분광법은 세포 배양물 내의 영양소 및/또는 폐기물의 농도를 모니터링할 수 있다. 또한, 분광 측정은 여러 화학 종을 동시에 정량화하는데 사용될 수 있다. 비대칭 화학 종은 NIR에서 특징적인 흡광도 특징을 식별함으로써 정량화될 수 있다. 반대로, 대칭 화학 종은 Raman 분광기를 사용하여 쉽게 정량화될 수 있다. 글루코스, 글루타민, 암모니아 및 락테이트와 같은 많은 중요한 대사 산물은 IR에서 뚜렷한 스펙트럼 특징을 가지므로, 쉽게 정량화될 수 있다. 샘플에 의해 흡수되는 빛의 양과 주파수는 샘플에 존재하는 화학 종의 유형 및 농도와 관련될 수 있다. 이러한 각 측정 유형은 특정 이점을 제공한다. FT-NIR은 가장 큰 빛 투과 깊이를 제공하며 더 두꺼운 샘플에 사용될 수 있다. FT-mid-IR(MIR)은 특정 분석물에 대해 특이적인 것으로 더 쉽게 식별될 수 있는 정보를 제공하는데, 이러한 파장이 기본 IR 흡수에 더 가깝기 때문이다. FT-Raman은 물로 인한 간섭을 최소화해야 할 때 유리하다. 다른 스펙트럼 특성은, 예를 들어, 유전 임피던스 분광법, 가시 형광, 형광 분극 또는 발광을 통해 측정될 수 있다. 또한, 세포 성장 장치는, 예를 들어, 용존 산소, 이산화탄소, pH, 전도도 등을 측정하기 위한 추가 센서를 포함할 수 있다.

세포 농축 모듈

[00127] 회전 성장 바이알 및 세포 성장 모듈과 관련하여 상기 설명된 바와 같이, 형질전환 또는 형질감염을 위한 적절한 수의 세포를 획득하기 위해, 세포는 전형적으로 관심 세포의 성장에 적절한 배지에서 특정 광학 밀도로 성장된다; 그러나, 효과적인 형질전환 또는 형질감염을 위해, 세포의 부피를 감소시킬 뿐만 아니라 완충액 또는 배지 교환을 통해 세포를 적격으로 만드는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 열거된 프로세스를 위한 세포 처리 시스템에서 요구되는 하나의 하위-구성요소 또는 모듈은 세포를 성장시키고/시키거나, 완충액 교환을 수행하고/하거나, 세포를 농축시킬 수 있고, 이들이 세포의 게놈을 조작하거나 편집하는데 필요한 핵산으로 형질전환되거나 형질감염될 수 있도록 이들을 적격으로 만드는 모듈 또는 구성요소이다.

[00128] 도 6a는 보유물 부재(622)(상단), 투과물 부재(620)(중간) 및 보유물 부재(622), 막(624)(도 6a에서 도시되지 않음) 및 투과물 부재(620)(또한 도시되지 않음)를 포함하는 접선 유동 조립체(610)(하단)를 도시한다. 도 6a에서, 보유물 부재(622)는 보유물 부재(622)의 하나의 하부 코너에서(특히, 보유물 포트(628)에서) 시작하고, 보유물 부재(622)를 가로질러 횡단하고 이의 위 및 이후 아래로 가로질러 제2 보유물 포트(628)에서 보유물 부재(622)의 다른 하부 코너에서 끝나는 구불구불한 구성을 갖는 접선 유동 채널(602)을 포함한다. 또한, 보유물 부재(622)에는 막 또는 필터(이러한 도 6a에 도시되지 않음)가 안착되는 영역을 둘러싸고 있을 뿐만 아니라 채널(602)의 영역 사이에 맞물리는 에너지 디렉터(691)가 제시된다. 이러한 구현예에서, 에너지 디렉터(691)는 투과물/여과물 부재(620)(우측) 상의 에너지 디렉터 구성요소(691)를 통해 투과물/여과물 부재(620)와 보유물 부재(622)의 초음파 용접 또는 결합과 짝을 이루고 이를 촉진하는 역할을 한다. 추가로, 카운터싱크(623)가 제시될 수 있는데, 2개는 보유물 부재(622)의 하부에, 1개는 상부 중간에 존재한다. 카운터싱크(623)는 접선 유동 조립체(610)를 저장소 조립체(이러한 도 6a에는 도시되지 않지만 도 6b를 참조한다)에 결합시키는데 사용된다.

[00129] 투과물/여과물 부재(620)는 도 6a의 중간에서 제시되며, 에너지 디렉터(691)에 추가하여, 각각의 하단 코너에서 보유물 포트(628)에 대한 관통-홀(이는 보유물 부재(622)의 하단 코너에서 보유물 포트(628)에 대한 관통-홀과 짝을 이룸)뿐만 아니라 접선 유동 채널(602) 및 투과물 부재(620)의 상부 및 중앙에 위치된 2개의 투과물/여과물 포트(626)를 포함한다. 본 구현예에서, 접선 유동 채널(602) 구조는 구불구불한 구성 및 물결 모양의 기하학적 구조를 갖지만, 다른 기하학적 구조가 사용될 수 있다. 투과물 부재(620)는 또한 보유물 부재(620) 상의 카운터싱크(623)와 일치하는 카운터싱크(623)를 포함한다.

[00130] 도 6a의 하단에는 투과물 부재(620)와 조립된 상부에 위치된 보유물 부재(622)를 포함하는 접선 유동 조립체(610)가 있다. 이러한 도면에서, 보유물 부재(622)는 도면의 "상단"에 있고, 막(조립체의 이러한 도면에서 도시되지 않음)은 보유물 부재(622)에 인접하고 그 아래에 있을 것이며, 투과물 부재(620)(또한 조립체의 이러한 도면에서 도시되지 않음)는 막에 인접하고 그 아래에 있다. 다시, 카운터싱크(623)가 제시되며, 여기서 보유물 부재(622) 및 투과물 부재(620)의 카운터싱크는 일치하고 저장소 조립체에 배치된 카운터싱크에 대한 스레드(thread) 또는 짝지음(mating) 요소와 짝을 이루도록 구성된다(도 6a에 도시되지 않았지만 도 6b를 참조한다).

[00131] 막 또는 필터는 보유물 및 투과물 부재 사이에 배치되며, 여기서 유체는 막을 통해 유동할 수 있지만, 세포는 유동할 수 없고, 따라서 보유물 부재에 배치된 유동 채널에 보유된다. TFF 장치/모듈에 사용하기에 적절한 필터 또는 막은 용매 내성이고, 여과 중에 오염되지 않으며, 관심 세포의 유형 및 크기를 유지할 수 있는 것들이다. 예를 들어, 박테리아 세포와 같은 작은 세포 유형을 유지하기 위해, 기공 크기는 0.2 μm만큼 작을 수 있지만, 다른 세포 유형의 경우, 기공 크기는 20 μm만큼 클 수 있다. 실제로, TFF 장치/모듈에 유용한 기공 크기는 0.20 μm, 0.21 μm, 0.22 μm, 0.23 μm, 0.24 μm, 0.25 μm, 0.26 μm, 0.27 μm, 0.28 μm, 0.29 μm, 0.30 μm, 0.31 μm, 0.32 μm, 0.33 μm, 0.34 μm, 0.35 μm, 0.36 μm, 0.37 μm, 0.38 μm, 0.39 μm, 0.40 μm, 0.41 μm, 0.42 μm, 0.43 μm, 0.44 μm, 0.45 μm, 0.46 μm, 0.47 μm, 0.48 μm, 0.49 μm, 0.50 μm 이상의 크기를 갖는 필터를 포함한다. 필터는 셀룰로스 혼합 에스테르(셀룰로스 니트레이트 및 아세테이트)(CME), 폴리카르보네이트(PC), 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 폴리에테르설폰(PES), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 나일론, 유리 섬유, 또는 레이저 또는 전기화학 에칭의 경우에서와 같이 금속 기판을 포함하는 임의의 적합한 비-반응성 물질로 제작될 수 있다.

[00132] 채널 구조(602)의 길이는 성장될 세포 배양물의 부피 및 농축될 세포 배양물의 광학 밀도에 따라 달라질 수 있다. 채널 구조의 길이는 전형적으로 60 mm 내지 300 mm, 또는 70 mm 내지 200 mm, 또는 80 mm 내지 100 mm이다. 유동 채널(402)의 단면 구성은 원형, 타원형, 난형, 정사각형, 직사각형, 사다리꼴 또는 불규칙할 수 있다. 정사각형, 직사각형 또는 일반적으로 직선인 변을 갖는 또 다른 형상인 경우, 단면은 약 10 μm 내지 1000 μm 폭, 또는 200 μm 내지 800 μm 폭, 또는 300 μm 내지 700 μm 폭, 또는 400 μm 내지 600 μm 폭; 및 약 10 μm 내지 1000 μm 높이, 또는 200 μm 내지 800 μm 높이, 또는 300 μm 내지 700 μm 높이, 또는 400 μm 내지 600 μm 높이일 수 있다. 유동 채널(102)의 단면이 일반적으로 원형, 난형 또는 타원형인 경우, 채널의 반경은 약 50 μm 내지 1000 μm 수력 반경, 또는 5 μm 내지 800 μm 수력 반경, 또는 200 μm 내지 700 μm 수력 반경, 또는 300 μm 내지 600 μm 수력 반경, 또는 약 200 내지 500 μm 수력 반경일 수 있다. 또한, 보유물(422) 및 투과물(620) 부재의 채널의 부피는 각 부재의 채널의 깊이에 따라 상이할 수 있다.

[00133] 도 6b는 도 6a에 제시된 접선 유동 조립체(610)와 함께 사용되도록 구성된 저장소 조립체(650)의 전방 사시도(상단 도면) 및 후방 사시도(하단 도면)를 도시한다. 전방 사시도(예를 들어, "전방"은 도 6a에 제시된 접선 유동 조립체(610)에 결합된 저장소 조립체(650) 측면임)에서 투과물 저장소(654)의 양 측에 보유물 저장소(652)가 제시된다. 투과물 포트(626), 보유물 포트(628), 및 카운터싱크(623)(카운터싱크(623)는 이러한 도 6b에 도시되지 않음)에 대한 3개의 스레드 또는 짝지음 요소(625)가 또한 제시된다. 카운터싱크(623)에 대한 스레드 또는 짝지음 요소(625)는 접선 유동 조립체(610)(도 6a에 도시됨)를 저장소 조립체(650)와 짝을 이루거나 결합시키도록 구성된다. 대안적으로 또는 추가로, 패스너, 음파 용접 또는 열 스테이크가 접선 유동 조립체(610)를 저장소 조립체(650)와 짝을 이루거나 결합시키는데 사용될 수 있다. 또한, 저장소 조립체(650)의 상부를 덮는 개스킷(645)이 제시된다. 개스킷(645)은 도 6e와 관련하여 상세히 설명된다. 도 6b의 좌측은 저장소 조립체(650)의 후방 사시도이고, 여기서 "후방"은 접선 유동 조립체에 결합되지 않은 저장소 조립체(650)의 측면이다. 보유물 저장소(652), 투과물 저장소(654) 및 개스킷(645)이 제시된다.

[00134] TFF 장치는 스테인리스 강, 실리콘, 유리, 알루미늄, 또는 플라스틱, 예를 들어, 사이클릭-올레핀 공중합체(COC), 사이클로-올레핀 중합체(COP), 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 아크릴로니트릴 부타디엔, 폴리카르보네이트, 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 폴리(메틸 메틸아크릴레이트)(PMMA), 폴리설폰 및 폴리우레탄, 및 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함하는 채널(및 채널 분지)이 밀링될 수 있는 임의의 견고한 물질로 제작될 수 있다. TFF 장치/모듈이 일회용인 경우, 바람직하게는 이는 플라스틱으로 제조된다. 일부 구현예에서, TFF 장치/모듈을 제작하는데 사용되는 물질은 열 전도성이어서 세포 배양물이 원하는 온도로 가열되거나 냉각될 수 있다. 특정 구현예에서, TFF 장치는 정밀 기계 가공, 레이저 가공, 전기 방전 가공(금속 장치의 경우); 습식 또는 건식 에칭(실리콘 장치의 경우); 건식 또는 습식 에칭, 분말 또는 샌드블라스팅, 광구조화(유리 장치의 경우); 또는 이러한 대량 생산 기술에 적합한 상기 언급된 물질을 사용한 열성형, 사출 성형, 고온 엠보싱 또는 레이저 가공(플라스틱 장치의 경우)에 의해 형성된다.

[00135] 도 6c는 도 6b에 도시된 저장소 조립체(650)의 상부 평면도를 도시한다. 도 6d는 도 6b에 도시된 저장소 조립체(650)에 대한 커버(644)를 도시하고, 도 6e는 작동 중에 도 6b에 도시된 저장소 조립체(650)의 커버(644) 상에 배치되는 개스킷(645)을 도시한다. 도 6c는 투과물 저장소(654)의 양측에 하나씩 있는 2개의 보유물 저장소(652)의 상부를 도시하는 저장소 조립체(650)의 상부 평면도이다. 또한, 공압 포트(도시되지 않음)와 짝을 이룰 그루브(632), 및 투과물 부재(620) 및 막(624)(또한 도시되지 않음) 내의 보유물 포트에 대한 관통-홀을 통해 보유물 저장소(652)와 보유물 포트(628)(도시되지 않음)를 유체적으로 연결하는 보유물 저장소(652)의 하부에 존재하는 유체 채널(634)이 제시된다. 도 6d는 저장소 조립체(650)의 상부에 배치되도록 구성된 커버(644)를 도시한다. 커버(644)는 보유물 저장소(652) 및 투과물/여과물 저장소(654)의 상부에 둥근 컷-아웃(cut-out)을 갖는다. 다시, 보유물 저장소(652)의 하부에서, 유체 채널(634)이 제시될 수 있으며, 여기서 유체 채널(634)은 보유물 저장소(652)를 보유물 포트(628)(도시되지 않음)와 유체적으로 연결시킨다. 또한, 각각의 보유물 저장소(652) 및 투과물/여과물 저장소(654)에 대한 3개의 공압 포트(630)가 도시되어 있다. 도 6e는 저장소 조립체(650)의 커버(644) 위에 배치되도록 구성된 개스킷(645)을 도시한다. 각각의 보유물 저장소(652) 및 투과물/여과물 저장소(654)에 대한 3개의 유체 전달 포트(642)가 제시된다. 다시, 각각의 보유물 저장소(652) 및 투과물/여과물 저장소(654)에 대한 3개의 공압 포트(630)가 도시된다.

[00136] 세포 성장을 위한 전체 작업 흐름은 성장될 세포 배양물을 제1 보유물 저장소에 로딩하고, 선택적으로 세포 배양물을 통해 공기 또는 적절한 기체를 버블링하고, 투과물 포트(606) 중 하나 또는 둘 모두를 통해 배지 또는 완충액을 수집하는 동안 세포 배양물을 제1 보유물 포트를 통해 그리고 이후 TFF 채널 구조를 통해 접선으로 통과시키거나 유동시키고, 제2 보유물 포트(604)를 통해 세포 배양물을 제2 보유물 저장소로 수집하고, 선택적으로 세포 배양물에 추가의 또는 상이한 배지를 첨가하고, 선택적으로 세포 배양물을 통해 공기 또는 기체를 버블링시키고, 이후 모두, 예를 들어, 보유물 저장소에서 연속적으로 또는 원하는 간격으로 세포 배양물의 광학 밀도를 측정하는 한편 상기 프로세스를 반복하는 것을 포함한다. 프로그래밍된 시간 간격에서 광학 밀도(OD)의 측정은 성장하는 세포를 함유하는 보유물 저장소(들)로 광학계를 통해 컬럼화된 600 nm 발광 다이오드(LED)를 사용하여 달성된다. 광은 수집 광학계를 통해 (디지털) 획득-제어 실리콘 포토다이오드로 구성된 검출 시스템으로 계속된다. 일반적으로, 광학 밀도는 광학 감쇠기의 전력 전송 계수의 밑이 10인 로그의 절대값으로 제시된다: OD = -log10 (파워 아웃(Power out)/파워 인(Power in)). OD는 광 감쇠(즉, 흡수, 산란 및 반사의 합)의 척도이기 때문에, TFF 장치 OD 측정은 전체 전력 전송을 기록하므로, 세포가 성장하고 집단의 밀도가 높아짐에 따라 OD(신호 손실)가 증가한다. OD 시스템은 측정 프로그램에 의해 접근할 수 있는 온-보드 메모리에 저장된 이들 값으로 OD 표준에 대해 사전 보정된다.

[00137] 채널 구조에서, 유동 채널을 분기시키는 막은 막의 한면(보유물 측면(622))에 세포를 보유하고, 원하지 않는 배지 또는 완충액이 막을 가로질러 장치의 여과물 또는 투과물 측면(예를 들어, 투과물 부재(620))으로 유동하도록 한다. 세포 배양을 통한 버블링 공기 또는 다른 적절한 기체는 둘 모두가 세포 성장을 향상시키기 위해 배양물을 통기시키고 혼합한다. 프로세스 동안, 채널 구조를 통한 유동 동안 제거되는 배지는 투과물/여과물 포트(606)를 통해 제거된다. 대안적으로, 세포는 한 저장소에서 다른 저장소로 TFF 채널을 통해 세포를 통과시키지 않고 버블링 또는 교반과 함께 한 저장소에서 성장될 수 있다.

[00138] TFF 장치/모듈을 사용하는 세포 농축에 대한 전체 작업 흐름은 채널 구조를 통해 접선 방향으로 세포 배양물 또는 세포 샘플을 유동시키는 것을 포함한다. 세포 성장 프로세스에서와 같이, 유동 채널을 분기시키는 막은 막의 한면에 세포를 보유하고, 원하지 않는 배지 또는 완충액이 막을 가로질러 장치의 투과물/여과물 측면(예를 들어, 투과물 부재(620))으로 유동하도록 한다. 이러한 프로세스에서, 세포 샘플이 보유물 포트(604) 중 하나에 수집될 때까지 배지 또는 완충액 내의 세포의 고정된 부피가 장치를 통해 구동되고, 막을 통과한 배지/완충액은 투과물/여과물 포트(606) 중 하나 또는 둘 모두를 통해 수집된다. 모든 유형의 원핵 및 진핵 세포(부착성 및 비-부착성 세포 둘 모두)는 TFF 장치에서 성장할 수 있다. 부착성 세포는 TFF 장치를 통해 유동하는 배지에 현탁된 비드 또는 다른 세포 스캐폴드에서 성장할 수 있다.

[00139] 세포 농축 장치/모듈에서 세포를 현탁시키는데 사용되는 배지 또는 완충액은 LB, SOC, TPD, YPG, YPAD, MEM, DMEM, IMDM, RPMI, 행크액, PBS 및 링거액과 같은 형질전환되거나 형질감염되는 세포의 유형에 대한 임의의 적합한 배지 또는 완충액일 수 있으며, 여기서 배지는 키트의 일부로서 시약 카트리지에 제공될 수 있다. 부착 세포의 배양을 위해, 세포는 비드, 마이크로캐리어 또는 배지에 현탁된 다른 유형의 스캐폴드에 배치될 수 있다. 조혈계에서 유래한 세포를 제외한 대부분의 정상적인 포유동물 조직 유래된 세포는 고정 의존적이며 정상적인 증식을 위해 표면 또는 세포 배양 지지대를 필요로 한다. 본원에 개시된 회전 성장 바이알에서, 마이크로캐리어 기술이 활용된다. 특정 용도의 마이크로캐리어는 일반적으로 직경이 100-300 μm이고, 배양 배지의 밀도보다 약간 더 큰 밀도를 가지지만(따라서 예를 들어, 배지 교환을 위해 세포와 배지의 용이한 분리를 가능하게 함) 밀도 또한 세포에 대한 유체역학적 손상을 방지하기 위해 최소 교반 속도로 담체의 완전한 현탁을 허용하도록 충분히 낮아야 한다. 많은 다양한 유형의 마이크로캐리어가 이용 가능하며, 다양한 마이크로캐리어는 다양한 유형의 세포에 최적화된다. 양으로 하전된 담체, 예를 들어, Cytodex 1(덱스트란 기반, GE Healthcare), DE-52(셀룰로스 기반, Sigma-Aldrich Labware), DE-53(셀룰로스 기반, Sigma-Aldrich Labware) 및 HLX 11-170(폴리스티렌 기반); Cytodex 3(덱스트란 기반, GE Healthcare) 또는 HyQ-스피어 Pro-F 102-4(폴리스티렌 기반, Thermo Scientific)와 같은 콜라겐- 또는 ECM-(세포외 기질) 코팅된 담체; HyQ-스피어 P 102-4(Thermo Scientific)와 같은 비하전 담체; 또는 젤라틴(Cultisphere, Percell Biolytica) 또는 셀룰로스(Cytopore, GE Healthcare)를 기반으로 하는 거대다공성 담체가 존재한다.

[00140] 세포 성장 및 농축 프로세스 둘 모두에서, 세포 샘플을 TFF 장치를 통해 통과시키고 보유물 포트(604) 중 하나에서 세포를 수집하는 한편 투과물/여과물 포트(606) 중 하나에서 배지를 수집하는 것은 세포 샘플의 "1회 통과"로 간주된다. 보유물 저장소 사이의 이동은 배양물을 "플립(flip)"시킨다. 제공된 통과에 대해 각각 세포 및 배지를 수집하는 보유물 및 투과물 포트는 보유물 및 투과물/여과물 측면에 대해 2개의 별개의 유동 층이 존재하도록 배열된 유체 연결이 있는 TFF 장치/모듈의 동일한 말단에 존재하나, 보유물 포트(604)가 장치/모듈의 보유물 부재에 존재하는 경우(즉, 세포가 막 위의 채널을 통해 구동되고, 여과물(배지)이 막 아래의 채널 부분으로 통과함), 투과물/여과물 포트(606)는 장치/모듈의 투과물 부재에 존재하거나 그 반대일 것이다(즉, 세포 샘플이 막 아래의 채널을 통해 구동되는 경우, 여과물(배지)은 막 위의 채널 부분으로 통과함). TFF 장치의 유동 채널을 통해 세포 배양물 및 유체를 전달하는데 사용되는 고압으로 인해, 중력의 영향은 무시할 수 있다.

[00141] 성장 및 농축 프로세스 중 어느 하나에서 "통과"의 종료시, 세포 샘플은 보유물 포트(604)를 통해 보유물 저장소(도시되지 않음)로 통과함으로써 수집된다. 또 다른 "통과"를 개시하기 위해, 세포 샘플은 TFF 장치를 통해 다시 통과되며, 이번에는 첫 번째 통과와 반대되는 유동 방향으로 통과된다. 세포 샘플은 보유물 포트(604)를 통해 첫 번째 통과 동안 세포를 수집하기 위해 사용된 보유물 포트(604)로부터 장치/모듈의 반대쪽 단부 상의 보유물 저장소(도시되지 않음)로 통과함으로써 수집된다. 마찬가지로, 제2 통과에서 막을 통과하는 배지/완충액은 제1 통과 동안 여과물을 수집하는데 사용된 투과물 포트(606)로부터 장치/모듈의 반대쪽 단부 상의 투과물 포트(606)를 통해, 또는 둘 모두의 포트를 통해 수집된다. 보유물(농축된 세포 샘플)을 장치/모듈을 통해 통과시키는 이러한 교대 프로세스는 세포가 원하는 광학 밀도로 성장되고/되거나 원하는 부피로 농축될 때까지 반복되며, 둘 모두의 투과물 포트(즉, 하나 초과가 존재하는 경우)는 작업 시간을 감소시키기 위해 통과 동안 개방될 수 있다. 또한, 완충액 교환은 또 다른 "통과"를 개시하기 전에 원하는 완충액(또는 신선한 배지)을 보유물 저장소의 세포 샘플에 첨가하고, 오래된 배지 또는 완충액이 희석되고 여과될 때까지 이러한 프로세스를 반복함으로써 수행될 수 있으며, 세포는 신선한 배지 또는 완충액에 존재한다. 완충액 교환 및 세포 성장은 동시에 발생할 수 있고(전형적으로 동시에 발생함), 완충액 교환 및 세포 농축은 동시에 발생할 수 있다는(전형적으로 동시에 발생함) 것에 주목한다. TFF에 대한 추가 정보 및 대안적인 구현예에 대해서는, 예를 들어, 2019년 9월 5일에 출원된 USSN 16/516,701을 참조한다.

[00142] 전술한 TFF 모듈에 대한 대안으로서, 중공 필터를 포함하는 세포 농축 모듈이 사용될 수 있다. 본 개시에 사용하기에 적합한 필터의 예는 막 필터, 세라믹 필터 및 금속 필터를 포함한다. 필터는 임의의 형상으로 사용될 수 있고; 예를 들어, 필터는 원통형이거나 본질적으로 편평할 수 있다. 바람직하게는, 사용되는 필터는 막 필터, 가장 바람직하게는 중공 섬유 필터이다. 용어 "중공 섬유"는 관형 막을 포함하는 것을 의미한다. 튜브의 내경은 적어도 0.1 mm, 보다 바람직하게 적어도 0.5 mm, 가장 바람직하게 적어도 0.75 mm이며, 바람직하게는, 튜브의 내경은 최대 10 mm, 보다 바람직하게 최대 6 mm, 가장 바람직하게 최대 1 mm이다. 중공 섬유를 포함하는 여과 모듈은 G.E. Life Sciences(Marlborough, MA) 및 InnovaPrep(Drexel, MO)를 포함하는 다양한 회사로부터 상업적으로 입수 가능하다. 본 발명의 방법 및 시스템에서 사용, 변형 또는 사용을 위해 적합화될 수 있는 중공 섬유 필터 시스템의 특정 예는 USPN 9,738,918; 9,593,359; 9,574,977; 9,534,989; 9,446,354;. 9,295,824; 8,956,880; 8,758,623; 8,726,744; 8,677,839; 8,677,840; 8,584,536; 8,584,535; 및 8,110,112를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

핵산 어셈블리 모듈

[00143] 본 개시의 전기천공을 포함하는 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기의 특정 구현예는 선택적으로 핵산 어셈블리 모듈을 포함한다. 핵산 어셈블리 모듈은 전기천공을 사용하여 원하는 세포로 천공되는데 필요한 핵산을 수용하고 어셈블링하고 원하는 게놈 편집 이벤트를 용이하게 하도록 구성된다. 일반적으로, 용어 "벡터"는 세포 내로 연결된 원하는 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 부분적으로 이중 가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단을 포함하거나, 자유 말단을 포함하지 않는(예를 들어, 원형) 핵산 분자; DNA, RNA 또는 둘 모두를 포함하는 핵산 분자; 및 당 분야에 공지된 다른 다양한 폴리뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 한 가지 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는, 예를 들어, 표준 분자 클로닝 기술에 의해 추가 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 바이러스 내로 패키징하기 위한 바이러스-유래 DNA 또는 RNA 서열이 벡터에 존재한다(예를 들어, 레트로바이러스, 복제 결함이 있는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 복제 결함이 있는 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스). 바이러스 벡터는 또한 숙주 세포로의 형질감염을 위해 바이러스에 의해 운반되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제가 가능하다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입시에 숙주 세포의 게놈에 통합되고, 이에 의해, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터" 또는 "편집 벡터"로 지칭된다. 재조합 DNA 기술에서 유용한 일반적인 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 추가 벡터는 포스미드, 파지미드, BAC, YAC 및 다른 합성 염색체를 포함한다.

[00144] 재조합 발현 벡터는 전사에 적합하고, 일부 핵산 서열에 대해, 숙주 세포에서 핵산의 번역 및 발현에 적합한 형태의 핵산을 포함할 수 있고, 이는 재조합 발현 벡터가 (발현을 위해 사용되는 숙주 세포에 기초하여 선택될 수 있는) 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동 가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오티드 서열이 전사를 허용하고, 일부 핵산 서열에 대해, 뉴클레오티드 서열의 번역 및 발현을 허용하는 방식으로(예를 들어, 시험관 내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포에서) 조절 요소(들)에 연결되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 적절한 재조합 및 클로닝 방법들은 US 공개 번호 2004/0171156에서 개시되며, 이의 내용은 모든 목적을 위해 그 전체내용이 본원에 참조로 포함된다.

[00145] 일부 구현예에서, 조절 요소는 전사를 구동하고, 일부 핵산 서열에 대해, 표적화 가능한 뉴클레아제 시스템의 하나 이상의 구성요소의 번역 및 발현을 구동하도록, 표적화 가능한 뉴클레아제 시스템의 하나 이상의 요소에 작동 가능하게 연결된다.

[00146] 또한, 핵산-가이드된 뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 특정 세포, 예를 들어, 원핵 또는 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 진핵 세포는 효모, 진균, 조류, 식물, 동물 또는 인간 세포일 수 있다. 진핵 세포는 인간, 마우스, 래트, 토끼, 개, 또는 비인간 영장류를 포함하는 비인간 포유동물을 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물과 같은 특정 유기체의 세포이거나 그로부터 유래될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 벡터는 전사될 때 가이드 RNA를 형성하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되는 조절 요소를 포함할 수 있다.

[00147] 핵산 어셈블리 모듈은 자동화된 방식으로 매우 다양한 상이한 핵산 어셈블리 기술을 수행하도록 구성될 수 있다. 개시된 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기의 핵산 어셈블리 모듈에서 수행될 수 있는 핵산 어셈블리 기술은 PCR, BioBrick 어셈블리(USPN 9,361,427), 유형 IIS 클로닝(예를 들어, GoldenGate 어셈블리, 유럽 특허 출원 공개 EP 2 395 087 A1) 및 리가제 순환 반응(de Kok, ACS Synth Biol., 3(2):97-106 (2014); Engler, et al., PLoS One, 3(11):e3647 (2008); and USPN 6,143,527)을 포함하는, 제한 엔도뉴클레아제를 사용하는 어셈블리 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 구현예에서, Gibson Assembly®, CPEC, SLIC, 리가제 순환 등과 같은 개시된 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기에 의해 수행되는 핵산 어셈블리 기술은 핵산들의 인접한 부분 사이의 중첩을 기반으로 한다. 부가적인 어셈블리 방법은 효모에서의 갭 복구(Bessa, Yeast, 29(10):419-23 (2012)), 게이트웨이 클로닝(Ohtsuka, Curr Pharm Biotechnol, 10(2):244-51 (2009)); USPNs 5,888,732; and 6,277,608) 및 토포이소머라제-매개 클로닝(Udo, PLoS One, 10(9):e0139349 (2015); and USPN 6,916,632)을 포함한다. 이들 및 다른 핵산 어셈블리 기술은, 예를 들어, 문헌[Sands and Brent, Curr Protoc Mol Biol., 113:3.26.1-3.26.20 (2016)]에 개시되어 있다.

[00148] 핵산 어셈블리 모듈은 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기에서 사용되는 핵산 어셈블리의 유형에 따라 온도 제어된다. 예를 들어, PCR이 핵산 어셈블리 모듈에서 이용될 때, 모듈은 온도가 변성, 어닐링 및 연장 단계 사이를 순환하도록 하는 열순환 능력을 포함한다. 단일 온도 어셈블리 방법(예를 들어, 등온 어셈블리 방법)이 핵산 어셈블리 모듈에서 이용될 때, 모듈은 수행되는 특정 어셈블리 프로세스를 최적화하는 온도에 도달하고 유지하는 능력을 제공한다. 이러한 온도 및 이러한 온도를 유지하기 위한 기간은 스크립트에 의해 실행되는 사전 프로그래밍된 파라미터 세트에 의해 결정되거나, 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기의 처리 시스템을 사용하여 사용자에 의해 수동으로 제어될 수 있다.

[00149] 일 구현예에서, 핵산 어셈블리 모듈은 단일의 등온 반응을 사용하여 어셈블리를 수행하기 위한 모듈이다. 특정 등온 어셈블리 방법은 서열 동일성에 기초하여 최대 15개의 핵산 단편을 동시에 조합할 수 있다. 어셈블리 방법은, 일부 구현예에서, 인접한 핵산 단편과 대략 20-40개의 염기 중첩을 포함하는 어셈블링될 핵산을 제공한다. 단편은 완충 성분과 함께 3개 효소, 즉, 엑소뉴클레아제, 중합효소 및 리가제의 칵테일과 혼합된다. 프로세스가 등온이고 단일 반응 용기를 사용하여 1-단계 또는 2-단계 방법으로 수행될 수 있기 때문에, 등온 어셈블리 반응은 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기에서 사용하기에 이상적이다. 1-단계 방법을 사용하면 단일 단계 등온 프로세스를 사용하여 최대 5개의 상이한 단편을 어셈블링할 수 있다. 단편과 효소의 마스터 믹스를 조합하고 최대 1시간 동안 50℃에서 인큐베이션한다. 최대 15개의 단편을 갖는 보다 복잡한 작제물의 생성을 위해 또는 100 bp 내지 10 kb의 단편을 통합하기 위해, 전형적으로 2-단계가 사용되며, 여기서 2-단계 반응은 마스터 믹스의 2번의 개별 첨가를 필요로 한다; 하나는 엑소뉴클레아제 및 어닐링 단계를 위한 것이고 두 번째는 중합효소 및 라이게이션 단계를 위한 것이다.

세포 풍부화 모듈

[00150] 본 개시의 하나의 선택적 양태는 게놈이 적절하게 편집된 세포에 대한 풍부화 기술을 구현하는 핵산-가이드된 뉴클레아제 게놈 편집을 위한 자동화된 모듈 및 기기를 제공한다. 풍부화 모듈은 편집된 세포와 편집되지 않은 세포 사이의 성장 경쟁을 감소시키기 위해 세포 단일화 및 정규화를 사용하는 방법을 수행하거나 세포 성장 동안 특정 시간에 편집을 유도하는 방법을 이용한다. 단일화는 편집되지 않은 세포 또는 성장 이점 또는 단점을 부여하는 편집을 포함하는 세포로부터의 성장 편향을 극복한다. 방법, 모듈 및 기기는 고세균, 원핵 및 진핵(예를 들어, 효모, 진균, 식물 및 동물) 세포를 포함하는 모든 세포 유형에 적용될 수 있다.

[00151] 단일화 또는 실질적으로 단일화, 편집의 유도 및 세포 콜로니의 정규화는 편집된 세포를 식별하는데 있어서 종래 기술의 방법에 비해 2-250x, 10-225x, 25-200x, 40-175x, 50-150x, 60-100x 또는 5-100x 이득을 가져오며, 게놈 라이브러리를 포함하는 배열되거나 풀링된 편집된 세포를 생성한다. 또한, 방법, 모듈 및 기기는 조합 라이브러리를 생성하고, 희귀한 세포 편집을 식별하고, 고 처리량 풍부화 애플리케이션이 편집 활동을 식별할 수 있도록 반복 편집 시스템을 생성하는데 활용될 수 있다.

[00152] 본원에 기재된 조성물 및 방법은 핵산-가이드된 뉴클레아제(예를 들어, RNA-가이드된 뉴클레아제)를 사용하여 유기체의 게놈에서 특정 표적 영역을 편집하는 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집 시스템을 개선한다. 도 7a는 고체 벽 장치(7050) 및 고체 벽 장치의 마이크로웰에서 세포를 단일화하기 위한 워크플로우를 도시하며, 이 워크플로우에서 gRNA 및 뉴클레아제 중 하나 또는 둘 모두는 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 도 (i)의 좌측 상단에는, 마이크로웰(7052)을 갖는 고체 벽 장치(7050)가 도시된다. 고체 벽 장치(7050)의 섹션(7054)은 (ii)에 도시되어 있으며, 또한 마이크로웰(7052)을 도시한다. (iii)에서, 고체 벽 장치(7050)의 측단면이 제시되고, 마이크로웰(7052)이 로딩되었으며, 여기서, 본 구현예에서, 푸아송(Poisson) 로딩이 발생하였고; 즉, 각각의 마이크로웰은 하나의 세포를 갖거나(예를 들어, 마이크로웰(7052, 7056)) 갖지 않으며, 어느 하나의 마이크로웰이 하나 초과의 세포를 가질 가능성은 낮다. 그러나, 대안적인 구현예에서, 실질적인 단일화(세포를 구획당 20개 미만의 세포, 보다 바람직하게는 구획당 10개 미만의 세포의 작은 "그룹"으로 분할함)는 라이브러리의 유연성에 따라 수행될 수 있다는 것에 주목한다. (iv)에서, 워크플로우(7040)가 예시되며, 여기서 마이크로웰(7052)을 갖는 기질(7050)은 마이크로웰당 하나의 세포를 갖는 마이크로웰(7056), 마이크로웰에 세포가 없는 마이크로웰(7057), 및 마이크로웰에 2개의 세포가 있는 하나의 마이크로웰(7060)을 나타낸다. 단계(7051)에서, 마이크로웰의 세포는 클론 콜로니를 형성하기 위해 약 2-50배로 배가되도록 허용되고(v), 이후 기질을 가열하거나(예를 들어, 온도-유도된 편집을 위해) 기질 아래 또는 위로 화학물질(예를 들어, 당, 화학물질-유도된 편집을 위한 항생제)을 유동시키거나 고체 벽 장치를 다른 배지로 이동시킴으로써(고체 벽 장치가 마이크로웰(7052)의 바닥을 형성하는 유체 투과성 막 상에 배치되는 경우 특히 용이함) 편집이 유도된다(7053). 편집(7053)의 유도 후, 편집된 세포의 콜로니에 있는 많은 세포가 활성 편집에 의해 유발된 이중 가닥 절단의 결과로서 사멸하고, 아마 생존하지만 편집 후 복구 및 회복되어야 하는 편집된 세포의 성장 지연이 있으며(마이크로웰(7058)), 여기서 편집을 겪지 않은 세포가 번성한다(마이크로웰(7059))(vi). 모든 세포는 계속해서 성장하여 콜로니를 확립하고 정규화될 수 있으며, 여기서 마이크로웰(7058)의 편집된 세포의 콜로니는 편집되지 않은 세포가 정지기에 도달함에 따라 세포 노화로 인해 편집을 겪지 않은 마이크로웰(7059)의 세포를 크기 및/또는 세포 수에 있어서 따라 잡는다(vii). 세포 콜로니가 정규화되면, 마이크로웰 내의 모든 세포의 풀링(pooling)이 발생할 수 있으며, 이 경우 비-편집 세포로부터의 편향 및 편집으로부터의 적합화 효과를 제거함으로써 세포는 편집된 세포에 대해 풍부화되고; 대안적으로, 마이크로웰에서의 콜로니 성장은 편집 후에 모니터링되고, 느리게 성장하는 콜로니(예를 들어, 마이크로웰(7058) 내의 세포)가 확인되고 선택되어(예를 들어, "체리 픽킹(cherry picked)") 편집된 세포가 훨씬 더 풍부해진다.

[00153] 세포 성장에서, 물론 사용되는 배지는 편집되는 세포의 유형(예를 들어, 박테리아, 효모 또는 포유동물)에 좌우될 것이다. 예를 들어, 박테리아 성장을 위한 배지는 LB, SOC, M9 최소 배지 및 매직(Magic) 배지를 포함하고; 효모 세포 성장을 위한 배지는 TPD, YPG, YPAD 및 합성 최소 배지를 포함하고; 포유동물 세포 성장을 위한 배지는 MEM, DMEM, IMDM, RPMI 및 행크액을 포함한다.

[00154] 도 7a에 도시된 방법을 수행하는데 유용한 모듈은 고체 벽 분리, 인큐베이션 및 정규화(SWIIN) 모듈이다. 도 7b는 분해된 상부 사시도로부터의 SWIIN 모듈(750)의 구현예를 도시한다. SWIIN 모듈(750)에서, 보유물 부재는 SWIIN 모듈 구성요소의 상부의 바닥에 형성되고, 투과물 부재는 SWIIN 모듈 구성요소의 바닥의 상부에 형성된다.

[00155] 도 7b의 SWIIN 모듈(750)은 위에서 아래로 저장소 개스킷 또는 커버(758), 보유물 부재(704)(여기서, 보유물 유동 채널은 이러한 도 7b에서 볼 수 없음), 필터로 스웨이징(swaged)된 천공된 부재(701)(필터는 도 7b에 제시되지 않음), 통합된 저장소(투과물 저장소(752) 및 보유물 저장소(754))를 포함하는 투과물 부재(708), 및 투과물 저장소(752) 및 보유물 저장소(754)의 하부를 밀봉하는 2개의 저장소 밀봉(762)을 포함한다. 투과물 채널(760a)은 구불구불한 채널(760a)의 융기 부분(776)에 의해 정의되는 투과물 부재(708)의 상부에 배치된 것을 볼 수 있고, 초음파 탭(764)이 또한 투과물 부재(708)의 상부에 배치된 것을 볼 수 있다. 천공된 부재(701) 상의 웰을 형성하는 천공은 이러한 도 7b에서 보이지 않지만; 초음파 탭(764)을 수용하기 위한 관통-홀(766)이 제시된다. 또한, SWIIN 모듈(750)을 지지하고, 투과물 저장소로부터 구불구불한 채널(760a)로의 유체 경로 또는 보유물 저장소로부터 구불구불한 채널(760b)로의 유체 경로(어느 유체 경로도 이러한 도 7b에 제시되지 않음)로의 기포 또는 공기 진입을 최소화하기 위해 저장소(752 및 754) 위로 투과물 부재(708) 및 보유물 부재(704)를 상승시키기 위해 SWIIN 모듈(750)의 양 단부에 지지대(770)가 배치된다.

[00156] 이러한 도 7b에서, 투과물 부재(708)의 상부에 배치된 구불구불한 채널(760a)은 투과물 저장소(752) 및 보유물 저장소(754)를 포함하는 투과물 부재(708)의 일부를 제외하고 투과물 부재(708)의 대부분의 길이 및 투과물 부재(708)의 대부분의 폭에 대해 투과물 부재(708)를 횡단하는 것이 관찰될 수 있다. 보유물 부재 또는 투과물 부재의 분배 채널과 관련하여 본원에서 사용되는 "대부분의 길이"는 보유물 부재 또는 투과물 부재의 길이의 약 95%, 또는 보유물 부재 또는 투과물 부재의 길이의 약 90%, 85%, 80%, 75% 또는 70%를 의미한다. 보유물 부재 또는 투과물 부재의 분배 채널과 관련하여 본원에서 사용되는 "대부분의 폭"은 보유물 부재 또는 투과물 부재의 폭의 약 95%, 또는 보유물 부재 또는 투과물 부재의 폭의 약 90%, 85%, 80%, 75% 또는 70%를 의미한다.

[00157] SWIIN 모듈의 이러한 구현예에서, 천공된 부재는 투과물 부재 상에 배치된 초음파 탭을 수용하기 위한 관통-홀을 포함한다. 따라서, 이러한 구현예에서, 천공된 부재는 스테인리스 강으로 제작되고(316), 천공은 마이크로웰의 벽을 형성하는 반면, 필터 또는 막은 마이크로웰의 바닥을 형성하는데 사용된다. 전형적으로, 천공(마이크로웰)은 약 150 μm-200 μm 직경이고, 천공된 부재는 약 125 μm 깊이이며, 그 결과 대략 총 200,000개 마이크로웰을 갖는 약 2.5 nl의 부피를 갖는 마이크로웰이 생성된다. 마이크로웰 사이의 거리는 중심에서 중심까지 약 279 μm이다. 여기서, 마이크로웰은 약 2.5 nl의 부피를 갖지만, 마이크로웰의 부피는 1 내지 25 nl, 또는 바람직하게는 2 내지 10 nl, 더욱 더 바람직하게는 2 내지 4 nl일 수 있다. 필터 또는 막의 경우, 이전에 설명된 필터와 마찬가지로, 사용하기에 적절한 필터는 용매 내성이고, 여과 동안 오염되지 않으며, 관심 세포의 유형 및 크기를 유지할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 세포와 같은 작은 세포 유형을 유지하기 위해, 기공 크기는 0.10 μm만큼 작을 수 있지만, 다른 세포 유형(예를 들어, 포유동물 세포의 경우와 같이)의 경우, 기공 크기는 10.0 μm-20.0 μm 이상만큼 클 수 있다. 실제로, 세포 농축 장치/모듈에 유용한 기공 크기는 0.10 μm, 0.11 μm, 0.12 μm, 0.13 μm, 0.14 μm, 0.15 μm, 0.16 μm, 0.17 μm, 0.18 μm, 0.19 μm, 0.20 μm, 0.21 μm, 0.22 μm, 0.23 μm, 0.24 μm, 0.25 μm, 0.26 μm, 0.27 μm, 0.28 μm, 0.29 μm, 0.30 μm, 0.31 μm, 0.32 μm, 0.33 μm, 0.34 μm, 0.35 μμm, 0.36 μm, 0.37 μm, 0.38 μm, 0.39 μm, 0.40 μm, 0.41 μm, 0.42 μm, 0.43 μm, 0.44 μm, 0.45 μm, 0.46 μm, 0.47 μm, 0.48 μm, 0.49 μm, 0.50 μm 이상의 크기를 갖는 필터를 포함한다. 필터는 셀룰로스 혼합 에스테르(셀룰로스 니트레이트 및 아세테이트)(CME), 폴리카르보네이트(PC), 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 폴리에테르설폰(PES), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 나일론 또는 유리 섬유를 포함하는 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있다.

[00158] 짝을 이룬 구불구불한 채널의 단면 구성은 원형, 타원형, 난형, 정사각형, 직사각형, 사다리꼴 또는 불규칙할 수 있다. 정사각형, 직사각형 또는 일반적으로 직선인 변을 갖는 또 다른 형상인 경우, 단면은 약 2 mm 내지 15 mm 폭, 또는 3 mm 내지 12 mm 폭, 또는 5 mm 내지 10 mm 폭일 수 있다. 짝을 이룬 구불구불한 채널의 단면이 일반적으로 원형, 난형 또는 타원형인 경우, 채널의 반경은 약 3 mm 내지 20 mm 수력 반경, 또는 5 mm 내지 15 mm 수력 반경, 또는 8 mm 내지 12 mm 수력 반경일 수 있다.

[00159] 구불구불한 채널(760a 및 760b)은 대략 동일한 부피를 가질 수 있거나 구불구불한 채널(760a 및 760b)은 상이한 부피를 가질 수 있다. 예를 들어, 구불구불한 채널의 각각의 "측면" 또는 부분(760a, 760b)은, 예를 들어, 2 mL의 부피를 가질 수 있거나, 투과물 부재(708)의 구불구불한 채널(760a)은 2 mL의 부피를 가질 수 있고, 보유물 부재(704)의 구불구불한 채널(760b)은, 예를 들어, 3 mL의 부피를 가질 수 있다. 구불구불한 채널의 유체 부피는 약 2 mL 내지 약 80 mL, 또는 약 4 mL 내지 60 mL, 또는 5 mL 내지 40 mL, 또는 6 mL 내지 20 mL의 범위일 수 있다(이들 부피는, 예를 들어, 50-500K 천공 부재를 포함하는 SWIIN 모듈에 적용됨을 주목). 저장소의 부피는 5 mL 내지 50 mL, 또는 7 mL 내지 40 mL, 또는 8 mL 내지 30 mL 또는 10 mL 내지 20 mL의 범위일 수 있고, 모든 저장소의 부피는 동일할 수 있거나, 저장소의 부피는 상이할 수 있다(예를 들어, 투과물 저장소의 부피는 보유물 저장소의 부피보다 크다).

[00160] 투과물 부재(708) 및 보유물 부재(704)의 구불구불한 채널 부분(760a 및 760b)은 각각 대략 200 mm 길이, 130 mm 폭 및 4 mm 두께이지만, 다른 구현예에서, 보유물 및 투과물 부재는 75 mm 내지 400 mm 길이, 또는 100 mm 내지 300 mm 길이, 또는 150 mm 내지 250 mm 길이; 50 mm 내지 250 mm 폭, 또는 75 mm 내지 200 mm 폭, 또는 100 mm 내지 150 mm 폭; 및 2 mm 내지 15 mm 두께, 또는 4 mm 내지 10 mm 두께, 또는 5 mm 내지 8 mm 두께일 수 있다. 구현예의 보유물(및 투과물) 부재는 PMMA(폴리(메틸 메타크릴레이트)로 제작될 수 있거나, 폴리카르보네이트, 사이클릭 올레핀 공중합체(COC), 유리, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리프로필렌, 폴리설폰, 폴리우레탄, 및 이들 및 다른 중합체의 공중합체를 포함하는 다른 물질이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 적어도 보유물 부재는 세포가 시각화될 수 있도록 투명한 물질로 제작된다(예를 들어, 도 7e 및 이의 설명 참조). 예를 들어, 비디오 카메라는, 예를 들어, 위상차를 갖는 빈 웰의 이미지에 기초한 밀도 변화 측정에 의해, 또는, 예를 들어, 발색성 단백질과 같은 발색성 마커가 세포에 구별 가능한 색상을 추가하기 위해 사용되는 경우에 세포 성장을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 블리첸 블루(blitzen blue), 드레이델 틸(dreidel teal), 버지니아 바이올렛(virginia violet), 빅센 퍼플(vixen purple), 프란서 퍼플(prancer purple), 틴셀 퍼플(tinsel purple), 마카비 퍼플(maccabee purple), 도너 마젠타(donner magenta), 큐피드 핑크(cupid pink), 세라피나 핑크(seraphina pink), 스쿠루지 오렌지(scrooge orange), 및 레오르 오렌지(and leor orange)(Chromogenic Protein Paintbox, 모두 ATUM(Newark, CA)로부터 이용 가능함)와 같은 발색성 마커는 형광을 사용할 필요성을 제거하지만, 형광 세포 마커, 형광 단백질 및 화학발광 세포 마커가 또한 사용될 수 있다.

[00161] 보유물 부재가 바람직하게는 투명하기 때문에, SWIIN 모듈에서의 콜로니 성장은 JoVE(ScanLag™ system, Cambridge, MA)에 의해 판매되는 것과 같은 자동화 장치에 의해 모니터링될 수 있다(또한 문헌[Levin-Reisman, et al., Nature Methods, 7:737-39 (2010)] 참조). 예를 들어, 포유동물 세포에 대한 세포 성장은, 예를 들어, IncuCyte(Ann Arbor, MI)에 의해 판매되는 성장 모니터에 의해 모니터링될 수 있다(또한, 문헌[Choudhry, PLos One, 11(2):e0148469 (2016)] 참조). 또한, 예를 들어, TECAN(Pickolo™ system, Mannedorf, Switzerland); Hudson Inc.(RapidPick™, Springfield, NJ); Molecular Devices(QPix 400™ system, San Jose, CA); 및 Singer Instruments(PIXL™ system, Somerset, UK)에 의해 판매되는 것과 같은 자동화 콜로니 픽커(picker)가 사용될 수 있다.

[00162] SWIIN 모듈의 가열 및 냉각으로 인해, 응축물이 보유물 부재에 축적되어 성장하는 세포 콜로니의 정확한 시각화를 방해할 수 있다. SWIIN 모듈(750)의 응축은, 예를 들어, SWIIN 모듈(750)의 상부(예를 들어, 보유물 부재) 위로 가열된 공기를 이동시키거나, 보유물 부재(704)의 적어도 구불구불한 채널 부분(760b) 위에 투명한 가열된 뚜껑을 적용함으로써 제어될 수 있다. 예를 들어, 도 7e 및 아래에 있는 이의 설명을 참조한다.

[00163] SWIIN 모듈(750)에서, 세포 및 배지(천공된 부재의 마이크로웰에서 세포의 푸아송 또는 실질적인 푸아송 분포에 적절한 희석에서)는 보유물 부재(704)의 포트로부터 구불구불한 채널(760b)로 유동하고, 배지가 필터를 통해 투과물 부재(708)의 구불구불한 채널(760a)로 통과하는 동안 세포는 마이크로웰에 침전된다. 세포는 필터(703)를 통해 이동할 수 없기 때문에 천공된 부재(701)의 마이크로웰에 세포가 유지된다. 적절한 배지가 투과물 포트(711)를 통해 투과물 부재(708)에 도입될 수 있다. 배지는 천공된 부재(701)의 마이크로웰(천공) 내의 세포에 영양을 공급하기 위해 필터(703)를 통해 위쪽으로 유동한다. 추가로, 완충액 교환은 보유물 및 투과물 부재를 통해 배지를 순환시킴으로써 수행될 수 있다. 작동시, 세포는 마이크로웰에 침착되고, 초기, 예를 들어, 2-100배 배가 동안 성장되고, 편집은, 예를 들어, 온도 유도성 프로모터를 유도하기 위해 SWIIN의 온도를 42℃로 상승시키거나, 투과물 부재로부터 성장 배지를 제거하고, 성장 배지를 유도성 프로모터를 유도하는 화학적 성분을 포함하는 배지로 대체함으로써 유도된다.

[00164] 편집이 발생하면, SWIIN의 온도는 감소될 수 있거나, 유도 배지가 제거되고, 화학적 성분이 없는 신선한 배지로 대체되어 유도성 프로모터를 비활성화시킬 수 있다. 이후, 마이크로웰에서 세포 콜로니의 성장이 정규화될 때까지 세포는 SWIIN 모듈(750)에서 계속 성장한다. 정규화 프로토콜의 경우, 일단 콜로니가 정규화되면, 유체 또는 공기 압력(또는 둘 모두)을 투과물 부재의 구불구불한 채널(760a) 및 이에 따라 필터(703)에 적용함으로써 콜로니는 마이클로웰로부터 플러싱되고, 풀링된다. 대안적으로, 체리 픽킹이 필요한 경우, 마이크로웰에서 세포 콜로니의 성장이 모니터링되고, 느리게 성장하는 콜로니가 직접 선택되거나; 빠르게 성장하는 콜로니가 제거된다.

[00165] 도 7c는 부분 단면에서 보유물 및 천공된 부재를 갖는 SWIIN 모듈의 상부 사시도이다. 이러한 도 7c에서, 구불구불한 채널(760a)이 투과물 부재(708)의 상부에 배치되고, 융기 부분(776)에 의해 정의되고, 투과물 및 보유물 저장소(단지 하나의 보유물 저장소(752)를 볼 수 있음에 유의)를 포함하는 투과물 부재(708)의 일부를 제외하고 투과물 부재(708)의 대부분의 길이 및 폭에 대해 투과물 부재(708)를 횡단하는 것이 관찰될 수 있다. 좌측에서 우측으로 이동하면, 저장소 개스킷(758)은 보유물 부재(704)의 통합된 저장소 커버(778)(커버는 이러한 도 7c에서 보이지 않음) 상에 배치된다. 개스킷(758)은 저장소 접근 구멍(732a, 732b, 732c 및 732d)뿐만 아니라 공압 포트(733a, 733b, 733c 및 733d)를 포함한다. 또한, 맨 좌측 끝에는 지지대(770)가 있다. 2개의 저장소 밀봉(762) 중 하나는 투과물 저장소(752) 아래에 배치된 것으로 관찰될 수 있다. 보유물 부재가 단면에 있는 것에 추가하여, 천공된 부재(701) 및 필터(703)(필터(703)는 이러한 도 7c에서 보이지 않음)가 단면에 있다. 천공된 부재(701)의 관통-홀(766)을 통해 연장되는 초음파 탭(764)을 포함하여, SWIIN 모듈(750)의 우측 단부 및 구불구불한 채널(760a)의 채널 턴을 정의하는 융기 부분(776) 상에 배치된 다수의 초음파 탭(764)이 존재하는 것에 주목한다. 투과물 부재(708)의 말단 원위 저장소(752, 754)에 지지대(770)가 또한 존재한다.

[00166] 도 7d는 우측에서 좌측으로 보유물 부재(704)의 통합된 저장소 커버(778)(제시되지 않음) 상에 배치된 저장소 개스킷(758)을 포함하는 조립된 SWIIIN 모듈(750)의 측면 사시도이다. 개스킷(758)은 고무, 실리콘, 니트릴 고무, 폴리테트라플루오로에틸렌, 플라스틱 중합체, 예를 들어, 폴리클로로트리플루오로에틸렌, 또는 다른 가요성, 압축성 물질로 제작될 수 있다. 개스킷(758)은 저장소 접근 구멍(732a, 732b, 732c 및 732d)뿐만 아니라 공압 포트(733a, 733b, 733c 및 733d)를 포함한다. 또한, 맨 좌측 단부에는 투과물 부재(708)의 지지대(770)가 있다. 또한, 투과물 저장소(752)뿐만 아니라 하나의 저장소 밀봉(762)이 관찰될 수 있다. 맨 우측 단부에는 제2 지지대(770)가 있다.

[00167] SWIIN의 웰에서 성장하는 세포 콜로니의 영상화는, 예를 들어, 세포 성장 및 장치 성능 둘 모두를 모니터링하기 위한 대부분의 구현에서 바람직하며, 체리-픽킹 구현을 위해 영상화가 필요하다. SWIIN에서 세포 성장을 실시간으로 모니터링하는 것은 백라이팅, 보유물 플레이트(상부 플레이트) 응축 관리 및 온도 제어, 기류 및 열 관리에 대한 시스템-수준 접근법을 필요로 한다. 일부 구현에서, 영상화는 개별 웰을 영상화시킬 수 있을 만큼 충분한 해상도를 갖는 카메라 또는 CCD 장치를 사용한다. 예를 들어, 일부 구성에서, 9-픽셀 피치를 갖는 카메라가 사용된다(즉, 각각의 웰에 대해 중심에서 중심으로 9 픽셀이 존재함). 일부 구현에서, 이미지를 처리하는 것은 그레이스케일로 이미지를 판독하여 각 픽셀을 낮음에서 높음으로 평가하는 것을 활용할 수 있으며, 여기서 세포가 없는 웰은 가장 밝아질 것이고(백라이트로부터 전체 또는 거의 전체 광 투과로 인함), 세포를 갖는 웰은 어두워질 것이다(백라이트로부터 광 투과를 차단하는 세포로 인함). 이미지를 처리한 후, 어느 픽셀이 "밝음" 또는 "어두움"으로 불릴지 결정하기 위해 스레시홀딩(thresholding)이 수행되고, 밝은 픽셀을 찾아서 블록으로 이들을 배열하기 위해 스폿 찾기가 수행된 후, 스폿이 스폿에 해당하는 픽셀의 육각 격자에 배열된다. 일단 배열되면, 각각의 웰의 강도 측정은, 예를 들어, 스폿의 중간에 있는 하나 이상의 픽셀을 보거나, 무작위 또는 사전 설정된 위치에서 여러 픽셀 내지 많은 픽셀을 보거나, 스폿에서 X개의 픽셀을 평균화함으로써 추출된다. 또한, 배경 강도가 공제될 수 있다. 스레시홀딩은 다시 각각의 웰을 양성(예를 들어, 세포 함유) 또는 음성(예를 들어, 웰에 세포가 없음)으로 칭하는데 사용된다. 영상화 정보는 세포 성장을 모니터링하기 위한 시점에서 이미지를 찍는 것을 포함하여 여러 방식으로 사용될 수 있다. 세포 성장 모니터링은, 예를 들어, 빠르게 성장하는 세포의 "머핀 상부(muffin top)"를 제거한 후 모든 세포를 제거하거나 상기 설명된 바와 같이 "원형" 세포를 제거하거나, 특정 웰로부터 세포(예를 들어, 느리게 성장하는 세포 콜로니)를 회수하는데 사용될 수 있고; 대안적으로, 빠르게 성장하는 세포를 함유하는 웰이 확인될 수 있고, 빠르게 성장하는 세포 콜로니를 커버하는 UV 광 영역이 SWIIN에 투사(또는 셔터로 래스터링(rastered))되어 이들 세포를 조사하거나 이의 성장을 억제할 수 있다. 영상화는 또한 구불구불한 채널(760)에서 적절한 유체 유동을 보장하기 위해 사용될 수 있다.

[00168] 도 7e는 히터 및 가열된 커버를 포함하는 열 관리 시스템을 추가로 포함하는 도 7b-7d의 SWIIN 모듈의 구현예를 도시한다. 히터 커버는 영상화에 필요한 응축 관리를 촉진한다. 조립체(798)는 단면이 길이 방향으로 제시된 SWIIN 모듈(750)을 포함하며, 여기서 하나의 투과물 저장소(752)가 보인다. SWIIN 모듈(750) 바로 위에는 커버(794)가 배치되고, SWIIN 모듈(750) 바로 아래에는 영상화를 가능하게 하는 백라이트(780)가 배치된다. 백라이트 및 SWIIN 모듈 아래에 인접하게 절연체(782)가 존재하며, 이는 히트싱크(784) 위에 배치된다. 이러한 도 7e에서, 히트싱크의 핀은 페이지의 내외부(in-out)에 존재할 것이다. 또한, 축류 팬(786) 및 히트싱크(788)뿐만 아니라 2개의 열전 냉각기(792), 및 공압, 열전 냉각기, 팬, 솔레노이드 밸브 등을 제어하기 위한 제어기(790)가 또한 존재한다. 화살표는 유닛으로 들어오는 냉각 공기 및 유닛에서 제거되는 고온의 공기를 나타낸다. 가열의 제어는 많은 상이한 유형의 세포(원핵 세포 및 진핵 세포)뿐만 아니라, 예를 들어, 온도에 민감한 세포의 균주 등의 성장을 허용하고, 온도에 민감한 프로모터의 사용을 허용한다는 점에 주목해야 한다. 온도 제어는 형질전환 효율, 세포 성장 및 생존력의 차이를 고려하여 프로토콜이 조정되는 것을 허용한다. 고체 벽 분리 인큐베이션 및 정규화 장치에 대한 보다 상세한 설명은 2019년 4월 30일에 출원된 USSN 16/399,988; 2019년 6월 26일에 출원된 16/454,865; 2019년 8월 14일에 출원된 16/540,606; 2019년 10월 9일에 출원된 16/597,826; 및 2019년 10월 9일에 출원된 16/597,831을 참조한다. 대안적인 분리, 인큐베이션 및 정규화 모듈에 있어서는 2019년 8월 08일에 출원된 USSN 16/536,049를 참조한다.

세포 성장 장치의 사용

[00169] 도 8은 도 2a-2c에 예시된 시스템과 같은 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기를 사용하기 위한 예시적인 방법(800)의 흐름도이다. 예를 들어, 처리 시스템은 방법(800)의 처리 단계를 지시한다. 예를 들어, 소프트웨어 스크립트는 각 처리 단계에 대한 설정 및 방법(800)의 작동을 수행하기 위한 로봇식 핸들링 시스템의 움직임을 위한 명령들을 식별할 수 있다. 일부 구현예에서, 소프트웨어 명령 스크립트는 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기에 공급되는 시약 카트리지에 의해 식별될 수 있다. 예를 들어, 시약 카트리지는 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기의 메모리에 저장된 스크립트의 식별을 포함하는 바코드 또는 QR 코드와 같은 기계 판독 가능한 표시를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 시약 카트리지는 무선 주파수(RF) 태그와 같은 기계 판독 가능한 표시에 내장된 다운로드 가능한 스크립트를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 사용자는, 예를 들어, 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기의 처리 시스템에 대한 유선 또는 무선 연결을 통해 스크립트를 다운로드하거나 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기의 사용자 인터페이스를 통해 저장된 스크립트를 선택함으로써 스크립트를 식별할 수 있다. 특정 예에서, 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기는 사용자 설정을 제출하고 세포 처리를 활성화하기 위한 터치 스크린 인터페이스를 포함할 수 있다. 다시, 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기는 독립형 기기이며, 스크립트, 시약 저장소 및 액체 핸들링 시스템 사이에서 사람의 개입 없이 완전히 자동화된 방식으로 살아있는 세포 편집을 용이하게 한다.

[00170] 일부 구현에서, 방법(800)은 세포를 세포 성장 모듈(802)로 전달하는 것으로 시작한다. 성장 모듈은, 예를 들어, 도 5b-5d와 관련하여 설명된 세포 성장 모듈(550)과 같이 자동화로 수정 가능한 임의의 성장 모듈일 수 있다. 특정 예에서, 처리 시스템은 로봇식 핸들링 시스템에 의해 세포를 시약 카트리지로부터 성장 모듈로 전달하는 것과 같이, 세포를 성장 모듈로 전달하도록 로봇식 핸들링 시스템에 지시할 수 있다. 일부 구현예에서, 성장 바이알은 성장 배지를 함유할 수 있고, 예를 들어, 키트의 일부로서 공급될 수 있다. 다른 구현예에서, 성장 바이알은, 예를 들어, 액체 핸들링 장치를 통해 시약 용기로부터 전달된 배지로 채워질 수 있다.

[00171] 일부 구현예에서, 세포를 (예를 들어, 시약 카트리지로부터 또는 기기에 추가된 바이알로부터) 옮기기 전에, 바이알 또는 용기가 세포를 함유하는 것으로 표시되어 있음을 확인하기 위해 세포에 대한 지정된 위치에 위치한 바이알 또는 다른 용기 상의 기계 판독 가능한 표시를 스캔할 수 있다. 또한, 기계 판독 가능한 표시는 기기에 제공된 세포의 유형을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 유형은 기기로 하여금 특정 처리 스크립트(예를 들어, 로봇식 핸들링 시스템에 대한 일련의 명령 및 다양한 모듈의 설정 및 활성화)를 선택하도록 할 수 있다.

[00172] 일부 구현에서, 세포는 성장 모듈에서 원하는 광학 밀도로 성장된다(804). 예를 들어, 처리 시스템은 성장 주기 동안 세포를 인큐베이션하기 위한 성장 모듈의 온도 설정을 관리할 수 있다. 처리 시스템은 광학 밀도를 나타내는 성장 모듈로부터 센서 신호를 추가로 수신하고 센서 신호를 분석하여 세포의 성장을 모니터링할 수 있다. 일부 구현예에서, 사용자는 세포의 성장을 관리하기 위한 성장 파라미터를 설정할 수 있다. 예를 들어, 이는 온도 및 세포의 교반 정도이다. 또한, 일부 구현예에서, 사용자는 성장 프로세스에 대해 업데이트될 수 있다. 일부 예에서, 업데이트는 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기의 사용자 인터페이스 상에 제시된 메시지, 사용자의 휴대폰 번호로의 문자 메시지, 이메일 계정으로의 이메일 메시지, 또는 휴대용 전자 장치(예를 들어, 휴대폰, 태블릿 등)에서 실행되는 앱으로 송신된 메시지를 포함할 수 있다. 메시지에 응답하여, 일부 구현예에서, 사용자는 세포 성장을 조정하기 위해 온도와 같은 파라미터를 수정할 수 있다. 예를 들어, 사용자는 사용자 인터페이스(예를 들어, 도 2c의 터치 스크린 디스플레이(201) 참조)와 같이, 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기의 사용자 인터페이스를 통해 또는 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기와 통신하는 휴대용 컴퓨팅 장치 애플리케이션을 통해 업데이트된 파라미터를 제출할 수 있다.

[00173] 광학 밀도와 관련하여 설명되었지만, 다른 구현에서, 성장 모듈 내의 세포 성장은 세포 밀도의 상이한 척도 및 생리학적 상태, 예를 들어, 일부 예에서, pH, 용존 산소, 방출된 효소, 음향 특성 및 전기적 특성을 사용하여 모니터링될 수 있다.

[00174] 일부 구현에서, 원하는 광학 밀도에 도달하면(804), 세포는 성장 모듈로부터 여과 모듈 또는 세포 세척 및 농축 모듈로 전달된다(806). 예를 들어, 로봇식 핸들링 시스템은 세포를 성장 모듈로부터 세포 농축 모듈로 옮길 수 있다. 예를 들어, 세포 농축 모듈은 세포가 전기적격성이 되도록 설계될 수 있다(및 전형적으로 설계됨). 위의 TFF 장치와 관련하여 도 6a-6d를 참조한다. 세포가 전기적격성이 되고, 여과 모듈 또는 세포 세척 및 농축 모듈에서 용리된다(808). 세포는 세척 용액을 사용하여 용리될 수 있다. 예를 들어, 세포는 시약 공급부로부터의 시약을 사용하여 용리될 수 있다.

[00175] 세포가 전기적격성이 되고 형질전환을 위해 50 μL 내지 7.5 mL, 또는 100 μL 내지 5 mL, 또는 150 μL 내지 2.5 mL의 적절한 부피의 배지에 현탁되면(808), 시약 번들 및 격자-형성 비드가 세포에 첨가되어 구체-패킹 격자를 형성한다. 구체-패킹 격자는, 예를 들어, 전기천공 모듈의 입구 웰로 전달된다(812). 예를 들어, 로봇식 핸들링 시스템은 세포를 세포 농축 장치 또는 모듈로부터 전기천공 모듈로 전달할 수 있다(812).

[00176] 일부 구현에서, 핵산은 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기 외부에서 제조된다. 예를 들어, 어셈블링된 벡터 또는 다른 핵산 어셈블리 또는 벡터 또는 다른 핵산은 시약 번들을 형성하기 위해 시약 전달 기질에 미리 로딩될 수 있고, 방법(800)에서 형질전환 프로세스 및 다른 프로세스를 실행하기 전에 사용자에 의해, 예를 들어, 시약 카트리지에 시약으로서 포함될 수 있다(810). 시약 카트리지에 제공되는 경우, 시약 번들이 전달되어 전기적격성 세포 및 격자-형성 비드와 혼합된다.

[00177] 구체-패킹 격자의 세포는 시약 전달 기질(예를 들어, 시약 번들)에 가역적으로 결합된 편집 벡터의 라이브러리를 사용하여 전기천공 모듈에서 형질전환된다. 완충액 또는 배지, 격자-형성 비드 또는 시약 번들을 세포로 옮기기 전에, 바이알, 용기 또는 저장소의 내용물을 확인하기 위해 시약에 대해 지정된 위치에 위치한 바이알 또는 다른 용기 또는 저장소 상의 기계 판독 가능한 표시를 스캔할 수 있다. 또한, 기계 판독 가능한 표시는 기기에 제공된 시약의 유형을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 사용된 시약의 유형은 기기로 하여금 특정 처리 스크립트(예를 들어, 특정 완충액 또는 배지에 적합한 형질전환 모듈의 설정 및 활성화)를 선택하도록 할 수 있다. 박테리아 세포 전기천공의 경우, 물 또는 글리세롤 용액과 같은 저 전도성 배지가 일시적 고전류에 의한 열 생성을 줄이기 위해 사용될 수 있다. 효모 세포의 경우, 소르비톨 용액이 사용될 수 있다. 포유동물 세포 전기천공의 경우, 세포는 MEM, DMEM, IMDM, RPMI, 행크액, PBS, HBSS, HeBS 및 링거액과 같은 고 전도성 배지 또는 완충액에 현탁될 수 있다. 특정 예에서, 로봇식 핸들링 시스템은 완충 용액을 시약 카트리지로부터 전기천공 모듈로 전달할 수 있다. 도 3a-3k와 관련하여 설명된 바와 같이, 전기천공 장치는 일회용 전기천공 장치일 수 있고/있거나 전기천공 장치는 시약 카트리지의 일부로서 제공될 수 있다. 대안적으로, 전기천공 장치는 별도의 모듈일 수 있다. 추가로, 구체-패킹 격자 조성물은 전기천공 장치에 무관하며, 이는 당 분야에 공지된 대부분의 전기천공 장치가 구체-패킹 격자에서 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는데 사용될 수 있음을 의미한다.

[00178] 일단 형질전환되면, 세포는 선택적으로 희석되고, 예를 들어, 도 5a-5d와 관련하여 설명된 세포 성장 모듈과 같은 제2 성장/회수/편집 모듈(816)로 전달된다. 예를 들어, 로봇식 핸들링 시스템은 형질전환된 세포를 시퍼(sipper) 또는 피펫터 인터페이스를 통해 제2 성장 모듈로 전달할 수 있다. 다른 예에서, 로봇식 핸들링 시스템은 형질전환된 세포를 함유하는 바이알을 형질전환 모듈의 챔버로부터 제2 성장 모듈의 챔버로 전달할 수 있다.

[00179] 일부 구현예에서, 제2 성장 모듈은 세포가 형질전환 프로세스로부터 회수되고 격자-형성 비드로부터 분리되도록 하는 회수 모듈로서 작용한다. 다른 구현예에서, 세포는 제2 성장 모듈로 수송되기 전에 별도의 회수 및 분리 모듈에 제공될 수 있다. 회수 동안, 제2 성장 모듈은 형질전환된 세포가 도입된 핵산을 세포의 게놈으로 흡수하고, 특정 양태에서, 통합시킬 수 있게 한다. 제2 성장 모듈은 세포 성장에 최적인 임의의 사용자 정의 온도, 바람직하게는 25℃, 30℃ 또는 37℃에서 세포를 인큐베이션하도록 구성될 수 있다.

[00180] 일부 구현예에서, 제2 성장 모듈은 항생제 또는 다른 시약에 기초하여 형질전환된 세포를 선택하는 선택 모듈로서 작용한다. 한 가지 예에서, RNA-가이드된 뉴클레아제(RGN) 단백질 시스템은 원하는 편집을 받지 않은 세포의 게놈을 절단하기 위한 선택에 사용된다. 항생제 선택제의 예에서, 항생제는 선택을 실행하기 위해 제2 성장 모듈에 첨가될 수 있다. 적합한 항생제 내성 유전자는 암피실린 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 네오 마이신 내성 유전자, 카나바닌 내성 유전자, 블라스티시딘 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자 또는 클로르암페니콜 내성 유전자와 같은 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 로봇식 핸들링 시스템은 항생제를 시퍼 또는 피펫터 인터페이스를 통해 제2 성장 모듈로 전달할 수 있다. 일부 구현예에서, 죽은 세포 배경의 제거는 용해 인핸서, 예를 들어, 세제, 저산소 세척에 의한 삼투 스트레스, 온도, 효소, 프로테아제, 박테리오파지, 환원제 또는 카오트로프를 사용함으로써 보조된다. 예를 들어, 처리 시스템은 선택을 유도하기 위해 온도와 같은 환경 변수를 변경할 수 있는 반면, 로봇식 핸들링 시스템은 선택을 돕기 위해 추가 물질(예를 들어, 세제, 효소, 환원제 등)을 전달할 수 있다. 다른 구현예에서, 여과에 의한 세포 제거 및/또는 배지 교환은 죽은 세포 배경을 감소시키기 위해 사용된다.

[00181] 추가 구현예에서, 선택을 적용하는 것에 추가로 또는 대안으로서, 제2 성장 모듈은 형질전환된 세포에서 게놈 편집을 허용하는 편집 모듈로서의 역할을 한다. 대안적으로, 다른 구현예에서, 회수 후, 분리 후 및 선택 후(수행되는 경우) 세포는 별도의 편집 모듈로 전달된다. 편집 모듈로서, 제2 성장 모듈은, 예를 들어, 도입된 핵산의 발현을 촉진함으로써 세포 게놈의 편집을 유도한다. 뉴클레아제의 발현 및/또는 편집 카세트 핵산은 화학적, 광, 바이러스 또는 온도 유도 방법 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제2 성장 모듈은 온도 유도 프로세스 동안 세포를 가열하거나 냉각하도록 구성될 수 있다. 특정 예시에서, 세포는 42℃ 내지 50℃에서 가열함으로써 유도될 수 있다. 예시에 더하여, 그 이후 세포는 유도 후 0-10℃로 냉각될 수 있다. 화학적 또는 바이러스 유도의 예에서, 유도제는 편집을 유도하기 위해 제2 성장 모듈로 전달될 수 있다. 유도성 뉴클레아제 및/또는 편집 카세트가 편집 동안 세포에 도입된 경우, 이는 유도인자 분자의 도입을 통해 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 유도제 또는 유도인자 분자는, 예를 들어, 피펫터 또는 시퍼 인터페이스를 통해 로봇식 핸들링 시스템에 의해 제2 성장 모듈로 전달된다.

[00182] 일부 구현에서, 추가적인 세포 편집이 요구되지 않는 경우(818), 세포는 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기로부터의 추후 제거를 위해 제2 세포 성장 모듈 또는 편집 모듈로부터 저장 유닛으로 전달될 수 있다(820). 예를 들어, 로봇식 핸들링 시스템은 세포를 시퍼 또는 피펫터 인터페이스를 통해 저장 유닛으로 옮길 수 있다. 다른 예에서, 로봇식 핸들링 시스템은 세포를 함유하는 바이알을 제2 성장 모듈의 챔버로부터 저장 유닛 내의 바이알 또는 튜브로 옮길 수 있다.

[00183] 일부 구현에서, 추가적인 세포 편집이 요구되는 경우(818), 세포는 성장 모듈로 전달되고(802), 원하는 OD로 성장하고(804), 세포 농축 모듈로 전달된 다음(806), 농축되고 전기적격성이 될 수 있다(808). 또한, 일부 구현예에서, 새로운 어셈블링된 핵산 샘플은 이 때 핵산 어셈블리 모듈에 의해 제조되고 시약 번들을 형성하기 위해 시약 전달 기질에 로딩될 수 있거나, 대안적으로, 제2 시약 번들이, 예를 들어, 시약 카트리지로부터 세포에 직접 도입될 수 있다. 반복적 편집 전에, 일부 구현예에서, 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기는, 예를 들어, 하나 이상의 분리된 시약 바이알 또는 카트리지의 도입을 통해, 사용자에 의해 추가 물질이 공급될 것을 요구할 수 있다.

[00184] 단계들은 제2 편집 라운드 동안 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단계(804)의 후속 실행시에, 선택적 성장 배지가 성장 모듈로 전달되어 제1 편집 라운드로부터 편집된 세포를 선택할 수 있다. 로봇식 핸들링 시스템은 선택적 성장 배지에 대해 지정된 위치에 위치한 시약 카트리지의 바이알 또는 용기로부터 선택적 성장 배지를 전달할 수 있다. 선택적 성장 배지를 전달하기 전에, 바이알, 용기 또는 저장소의 내용물을 확인하기 위해 선택적 성장 배지에 대해 지정된 위치에 위치한 바이알 또는 다른 용기 또는 저장소 상의 기계 판독 가능한 표시가 스캔될 수 있다. 또한, 기계 판독 가능한 표시는 기기에 제공된 선택적 성장 배지의 유형을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 선택적 성장 배지의 유형은 기기로 하여금 특정 처리 스크립트(예를 들어, 특정 선택적 성장 배지에 적절한 성장 모듈의 설정 및 활성화)를 선택하도록 할 수 있다. 반복적 편집 워크플로우의 특정 예는 도 10과 관련하여 설명된다.

[00185] 일부 구현에서, 방법(800)은 물질을 도입하고/하거나 사용자의 스케줄과 협력하여 편집 주기 또는 성장 주기를 완료하도록 시간을 정할 수 있다. 예를 들어, 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기는 방법(800)이 사용자가 선호하는 시간에 완료되는 것을 목표로 실행되도록 하나 이상의 세포 처리 주기(예를 들어, 하나 이상의 반복적 편집)의 완료를 스케줄링하는 능력을 사용자에게 제공할 수 있다. 예를 들어, 시간 스케줄링은 사용자 인터페이스를 통해 설정될 수 있다. 단지 예시를 위해, 사용자는 제1 사이클의 완료를 오후 4시로 설정하여, 사용자가 또 다른 라운드의 세포 편집을 밤새 처리할 수 있도록 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기에 물질의 추가 카트리지를 공급할 수 있다. 따라서, 사용자는 2개 이상의 사이클이 특정 기간, 예를 들어, 24시간 기간에 프로그래밍될 수 있도록 프로그램 시간을 정할 수 있다.

[00186] 일부 구현에서, 방법(800) 전체에 걸쳐, 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기는 사용자에게 그 현재 상태를 알려줄 수 있다. 예를 들어, 사용자 인터페이스는 현재 처리 단계의 그래픽 표시를 제공할 수 있다. 특정 예에서, 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 전면은 세포 처리의 현재 상태를 묘사하는 애니메이션 그래픽을 제시하는 사용자 인터페이스(예를 들어, 터치 스크린)로 오버레이될 수 있다. 사용자 인터페이스는 현재 처리 단계와 관련된 임의의 사용자 및/또는 기본 설정(예를 들어, 온도 설정, 시간 설정 등)을 추가로 제공할 수 있다. 특정 구현에서, 상태는 무선 통신 제어기를 통해 사용자에게 통신될 수 있다.

[00187] 특정 일련의 작동으로서 예시되었지만, 다른 구현예에서, 방법(800)에 더 많거나 더 적은 단계가 포함될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 편집의 각 라운드에 참여하기 전에, 저장소, 시약 카트리지 및/또는 바이알의 내용물을 스크리닝하여 적절한 물질이 처리를 진행하는데 이용될 수 있는지 확인할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 이미징 센서(예를 들어, 바코드 스캐너, 카메라 등)는 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기의 하우징 내의 다양한 위치에서 내용물을 확인할 수 있다. 하나의 예에서, 다수의 이미징 센서가 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기의 하우징 내에 배치될 수 있으며, 각각의 이미징 센서는 하나 이상의 물질을 검출하도록 구성된다(예를 들어, 바코드 또는 QR 코드와 같은 기계 판독 가능한 표시, 물질의 형상/크기). 다른 예에서, 적어도 하나의 이미징 센서는 하나 이상의 물질을 검출하기 위해 로봇식 핸들링 시스템에 의해 다수의 위치로 이동될 수 있다. 추가 구현예에서, 하나 이상의 중량 센서는 일회용 또는 교체 가능한 물질의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다. 예시적인 예에서, 전달 팁 공급 홀더는 팁이 영역 내에 로딩되었는지 여부를 검출하기 위해 중량 센서를 포함할 수 있다. 다른 예시적인 예에서, 광학 센서는 액체 폐기물의 수준이 임계 수준에 도달했음을 검출할 수 있으며, 세포 처리를 계속하기 전에 폐기를 요구하거나 진행을 위한 최소 수준에 도달되지 않은 경우 액체의 첨가를 요구할 수 있다. 일부 구현에서, 추가 물질, 폐기물 공급의 제거, 또는 다른 사용자 개입(예를 들어, 하나 이상의 요소의 수동 세정 등)에 대한 요청은 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기의 그래픽 사용자 인터페이스에 제시된다. 일부 구현에서, 자동화된 다중-모듈 세포 편집 기기는, 예를 들어, 소프트웨어 앱, 이메일 또는 텍스트 메시지를 통해 새로운 물질 또는 다른 수동 개입에 대한 요청에 따라 사용자와 접촉한다.

[00188] 도 9는 편집된 세포를 풍부화하기 위한 모듈(940)을 포함하는 예시적인 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기(900)의 구현예의 단순화된 블록도이다. 세포 처리 기기(900)는 하우징(944), 형질전환 또는 형질감염될 세포의 저장소(902), 및 성장 모듈(세포 성장 장치)(904)를 포함할 수 있다. 형질전환될 세포는 세포가 목표 OD에 도달할 때까지 저장소(902)로부터 배양되는 성장 모듈(904)로 전달된다. 세포가 목표 OD에 도달하면, 성장 모듈(904)은 추후 처리를 위해 세포를 냉각 또는 동결시킬 수 있거나, 세포를 세포 농축 모듈(930)로 전달할 수 있는데, 여기서 세포는 전기적격성이 되고 세포 형질전환에 최적인 부피로 농축된다. 농축되면, 세포는 격자-형성 비드 및 시약 번들에 첨가되어 구체-패킹 격자를 형성하고, 관통형 전기천공 모듈(905)(예를 들어, 형질전환/형질감염 모듈)로 전달된다.

[00189] 세포를 저장하기 위한 저장소(902)에 추가하여, 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기(900)는 편집 올리고뉴클레오티드 카세트(916)를 저장하기 위한 저장소 및 발현 벡터 백본(918)을 저장하기 위한 저장소를 포함할 수 있다. 편집 올리고뉴클레오티드 카세트 및 발현 벡터 백본 둘 모두는 시약 카트리지로부터 핵산 어셈블리 모듈(920)로 전달되고, 여기서 편집 올리고뉴클레오티드 카세트는 발현 벡터 백본에 삽입된다. 어셈블링된 핵산은 형질전환을 위해 어셈블링된 핵산을 제조하는데 필요한 탈염 및/또는 다른 정제 및/또는 농축 절차를 위한 선택적 정제 모듈(922)로 전달될 수 있다. 대안적으로, 사전 어셈블링된 핵산, 예를 들어, 편집 벡터는 저장소(916 또는 918) 내에 저장될 수 있다. 정제 모듈(922)에 의해 수행되는 프로세스가 완료되면, 어셈블링된 핵산은 시약 전달 기질에 결합되어 시약 번들을 형성한 다음, 예를 들어, 전기천공 장치(905)로 전달되는데, 이는 이미 목표 OD까지 성장하고 세포 농축 모듈(930)을 통해 전기적격성이 된 세포를 갖는 구체-패킹 격자를 포함한다. 전기천공 장치(905)에서, 시약 번들은 어셈블링된 핵산을 방출하도록 촉발되고, 어셈블링된 핵산은 세포 내로 도입된다. 전기천공 후, 세포는 조합된 회수/희석/선택 모듈(910)로 전달된다.

[00190] 회수, 격자-형성 비드 및 시약 전달 기질로부터의 분리 및 선택적으로, 선택 후, 세포는 단일화, 선택, 성장, 유도, 편집 및 정규화 모듈(940)로 전달되고, 여기서 세포는 구획당 평균 하나의 세포가 존재하도록 희석 및 구획화된다. 단일화되면, 세포는, 예를 들어, 미리 결정된 수의 배가를 위해 선택적 배지에서 성장한다. 이들 초기 콜로니가 확립되면, 편집이 유도되고 편집된 세포가 최종 크기로 성장된 콜로니를 확립하도록 허용된다(예를 들어, 콜로니가 정규화됨). 일부 구현예에서, 편집은 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 편집 성분 중 하나 이상에 의해 유도된다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 온도 상승에 의해 활성화되고 온도를 낮춤으로써 "비활성화"된다. 대안적으로, 단일화 장치가 마이크로웰의 바닥을 형성하는 필터를 포함하는 고체 벽 장치인 구현예에서, 고체 벽 장치는 유도된 편집을 활성화하는 성분을 갖는 배지를 포함하는 플레이트(예를 들어, 한천 플레이트 또는 심지어 액체 배지로)로 전달된 다음, 편집을 비활성화하는 배지로 전달될 수 있다. 콜로니가 최종 크기로 성장하면, 콜로니는 풀링된다. 다시, 단일화는 편집되지 않은 세포로부터의 성장 편향 및 상이한 편집의 적합도 효과로 인한 성장 편향을 극복한다.

[00191] 회수, 희석, 분리, 선택, 단일화, 유도, 편집 및 성장 모듈은 모두 분리될 수 있거나, 도 9에 도시된 바와 같이 배열 및 조합될 수 있거나, 다른 구성으로 배열 또는 조합될 수 있다. 특정 구현예에서, 모든 회수, 선택, 단일화, 성장, 편집 및 정규화는 고체 벽 장치에서 수행된다. 대안적으로, 필요한 경우, 분리된 용기(모듈)의 액체 배지에서 회수, 선택 및 희석이 수행된 다음, 고체 벽 단일화/성장/유도/편집/정규화 모듈로 전달된다.

[00192] 정규화된 세포 콜로니가 풀링되면, 세포는, 예를 들어, 저장 모듈(912)에 저장될 수 있으며, 여기서 세포는 추가 연구를 세포가 회수될 때까지(914), 예를 들어, 4℃에서 유지될 수 있다. 대안적으로, 세포는 또 다른 편집 라운드에 사용될 수 있다. 다중-모듈 세포 처리 기기(900)는 하나 이상의 스크립트의 지시에 따라, 또는 사용자 입력 또는 스크립트의 조합으로서, 사용자 입력을 기반으로 기기(900)를 작동하도록 구성된 프로세서(942)에 의해 제어된다. 프로세서(942)는 기기(900)의 다양한 모듈의 타이밍, 기간, 온도 및 작동, 및 시약의 분배를 제어할 수 있다. 예를 들어, 프로세서(942)는 편집이 요구될 때까지 형질전환 후 세포를 냉각시킬 수 있고, 이 때 온도는 게놈 편집 및 세포 성장에 도움이 되는 온도로 상승될 수 있다. 프로세서는 사용자가 선택할 수 있는 표준 프로토콜 파라미터로 프로그래밍될 수 있고, 사용자가 하나 이상의 파라미터를 수동으로 지정할 수 있거나 시약 카트리지와 관련된 하나 이상의 스크립트가 하나 이상의 작동 및/또는 반응 파라미터를 지정할 수 있다. 또한, 프로세서(942)는 사용자에게 (예를 들어, 스마트 폰 또는 기타 장치에 대한 애플리케이션을 통해) 세포가 목표 OD에 도달하였음을 알리고/거나 다중-모듈 세포 처리 기기(900)의 다양한 모듈에서 세포의 진행 상황을 사용자에게 업데이트할 수 있다.

[00193] 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기(900)는 뉴클레아제-지시된 게놈 편집 시스템이고 단일 편집 시스템에서 사용될 수 있다(예를 들어, 단일 편집 프로세스에서 세포 게놈에 하나 이상의 편집을 도입함). 하기 설명되는 도 10의 시스템은, 예를 들어, 세포에서 2개 이상의 게놈 편집을 제공하기 위해 순차적으로 상이한 뉴클레아제-지시된 시스템을 사용하는 순차적 편집; 및/또는 예를 들어, 세포에서 2개 이상의 게놈 편집을 순차적으로 도입하기 위해 단일 뉴클레아제-지시된 시스템을 활용하는 반복적 편집을 수행하도록 구성된다.

[00194] 도 10은 다중-모듈 세포 처리 기기(1000)의 다른 구현예를 예시한다. 이 구현예는 세포 집단에 대해 반복적 유전자 편집을 수행하는 예시적인 시스템을 도시한다. 도 9에 도시된 구현예와 같이, 세포 처리 기기(1000)는 하우징(1044), 형질전환되거나 형질감염될 세포를 저장하기 위한 저장소(1002) 및 세포 성장 모듈(예를 들어, 회전 성장 바이알을 포함함)(1004)을 포함할 수 있다. 형질전환될 세포는 세포가 목표 OD에 도달할 때까지 저장소로부터 배양되는 세포 성장 모듈(1004)로 전달된다. 세포가 목표 OD에 도달하면, 성장 모듈은 추후 처리를 위해 세포를 냉각 또는 동결시킬 수 있거나, 세포를 세포 농축 모듈(1060)로 전달할 수 있는데, 여기서 세포는 완충액 교환을 거쳐 전기적격성이 되고, 세포의 부피는 실질적으로 감소될 수 있다. 세포가 적절한 부피로 농축되면, 세포는 격자-형성 비드 및 시약 번들과 혼합되어 구체-패킹 격자를 형성하고, 구체-형성 격자는 전기천공 장치 또는 모듈(1008)로 전달된다. 세포를 저장하기 위한 저장소에 추가하여, 다중-모듈 세포 처리 기기(1000)는 편집 올리고뉴클레오티드 카세트와 사전 어셈블링된 벡터를 저장하기 위한 저장소(1052)를 포함한다. 사전 어셈블링된 핵산 벡터는 시약 전달 기질과 조합되어 시약 번들을 형성한 다음, 이미 세포 및 격자-형성 비드를 함유하는 전기천공 장치(1008)로 전달된다. 전기천공 장치(1008)에서, 핵산은 세포 내로 전기천공된다. 전기천공 후, 세포는 분리, 회수(및 선택적으로, 희석) 모듈(1056)로 전달되고, 여기서 세포는 격자-형성 비드로부터 분리되고 형질전환 후 짧게 회수될 수 있다.

[00195] 회수 후, 세포는 저장 모듈(1012)로 전달될 수 있고, 여기서 세포는, 예를 들어, 추후 처리를 위해 4℃에서 저장될 수 있거나, 세포는 희석되고 선택/성장/유도/편집 모듈/장치(1058)로 전달될 수 있다. 세포를 성장시킨 다음 편집을 유도하기 위한 조건(예를 들어, 온도, 유도 또는 억제 화학물질의 첨가)을 제공함으로써 편집이 유도된다. 선택/성장/유도 및 편집 모듈은 모든 프로세스가, 예를 들어, 고체 벽 단일화 장치에서 수행되는 동일한 모듈 또는 장치일 수 있거나, 선택 및/또는 희석은 세포가 유도/편집 모듈로 전달되기 전에 별도의 용기에서 발생할 수 있다는 것에 주목한다. 예를 들어, 고체 벽 장치에서 단일화에 대한 대안으로서, 형질전환된 세포는 벌크 액체에서 성장될 수 있고 편집이 유도될 수 있다(예를 들어, 2019년 8월 20일에 출원된 USSN 16/545,097을 참조한다). 추정상 편집된 세포가 풀링되면, 이들은 또 다른 편집 라운드를 거칠 수 있어, 성장, 세포 농축 및 전기적격성이 되기 위한 처리, 및 전기천공 장치/모듈(1008)을 통해 다른 편집 카세트에서 또 다른 공여자 핵산에 의한 형질전환을 시작한다.

[00196] 전기천공 장치(1008)에서, 제1 편집 라운드로부터 선택된 세포는 제2 세트의 편집 올리고(또는 다른 유형의 올리고)에 의해 형질전환되고, 세포가, 예를 들어, 원하는 수의 편집 카세트에 의해 형질전환되고 편집될 때까지 사이클이 반복된다. 도 10에 예시된 다중-모듈 세포 처리 기기(1000)는 사용자 입력에 기초하여 기기를 작동시키도록 구성된 프로세서(1042)에 의해 제어되거나 시약 카트리지와 관련된 적어도 하나의 스크립트를 포함하는 하나 이상의 스크립트에 의해 제어된다. 프로세서(1042)는 다양한 프로세스의 타이밍, 기간 및 온도, 시약의 분배, 및 기기(1000)의 다양한 모듈의 다른 작동을 제어할 수 있다. 예를 들어, 스크립트 또는 프로세서는 세포, 시약, 벡터 및 편집 올리고뉴클레오티드의 분배; 세포 편집에 사용되는 편집 올리고뉴클레오티드 및 그 순서; 회수 및 발현 모듈에서 사용되는 시간, 온도 및 다른 조건들, 세포 성장 모듈에서 OD가 판독되는 파장, 세포가 성장되는 목표 OD, 세포가 목표 OD에 도달할 목표 시간을 제어할 수 있다. 또한, 프로세서는 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기에서 세포의 진행 상황에 대해 사용자에게 (예를 들어, 애플리케이션을 통해) 알리도록 프로그래밍될 수 있다.

[00197] 설명된 프로세스는 반복적이고 다중화될 수 있다는 것이 본 발명의 개시를 고려하여 당업자에게 명백해야 하며; 즉, 세포는 도 10과 관련하여 개시된 워크플로우를 거칠 수 있고, 이후 생성된 편집된 배양물은 상이한 편집 벡터를 사용하여 또 다른(또는 여러 번 또는 더 많은) 라운드의 추가 편집(예를 들어, 반복적 편집)을 거칠 수 있다. 예를 들어, 1 라운드 편집으로부터의 세포는 희석될 수 있고, 편집 벡터 A에 의해 편집된, 편집된 세포의 분취량은 편집 벡터 B와 조합될 수 있고, 편집 벡터 A에 의해 편집된, 편집된 세포의 분취량은 편집 벡터 C와 조합될 수 있고, 편집 벡터 A에 의해 편집된, 편집된 세포의 분취량은 편집 벡터 D와 조합될 수 있는 식으로, 제2 라운드의 편집에 대해서도 마찬가지이다. 2 라운드 후, 각각의 이중 편집된 세포의 분취량은 제3 라운드의 편집에 적용될 수 있으며, 여기서, 예를 들어, AB-, AC-, AD-편집된 세포 각각의 분취량은 추가 편집 벡터, 예를 들어, 편집 벡터 X, Y 및 Z와 조합된다. 즉, 이중 편집된 세포 AB는 벡터 X, Y 및 Z와 조합되고 편집되어 삼중-편집된 편집된 세포 ABX, ABY 및 ABZ를 생성할 수 있고; 이중 편집된 세포 AC는 벡터 X, Y 및 Z와 조합되고 편집되어 삼중 편집된 세포 ACX, ACY 및 ACZ를 생성할 수 있고; 이중 편집된 세포 AD는 벡터 X, Y 및 Z와 조합되고 편집되어 삼중 편집된 세포 ADX, ADY 및 ADZ를 생성할 수 있고, 그 밖에도 마찬가지이다.

[00198] 이러한 과정에서, 편집의 많은 순열 및 조합이 실행될 수 있으며, 이는 매우 다양한 세포 집단 및 세포 라이브러리로 이어진다. 임의의 반복적 과정에서, 이전 엔진 및 편집 벡터(또는 단일 벡터 시스템에서 단일 엔진 + 편집 벡터)를 "치유"시키는 것이 유리하다. "치유"는 이전 라운드의 편집에서 사용된 하나 이상의 벡터가 형질전환된 세포로부터 제거되는 프로세스이다. 치유는, 예를 들어, 치유 플라스미드를 사용하여 벡터(들)를 절단하여 이에 의해 편집 및/또는 엔진 벡터(또는 단일, 조합된 벡터)가 비기능성이 되도록 하고; 세포 성장을 통해 세포 집단에서 벡터(들)을 희석시키거나(즉, 세포가 더 많은 성장 주기를 거칠수록, 더 적은 딸 세포가 편집 또는 엔진 벡터(들)를 보유할 것임), 예를 들어, 편집 또는 엔진 벡터(또는 조합된 엔진 + 편집 벡터)에서 열-민감성 복제 기점을 사용함으로써 달성될 수 있다. 치유 조건은 치유에 사용되는 메커니즘, 즉, 이러한 예에서, 치유 플라스미드가 편집 및/또는 엔진 플라스미드를 절단하는 방법에 좌우될 것이다.

[00199] 도 11은, 예를 들어, 편집된 세포에 대한 유도된 편집 및 풍부화를 위한 벌크 액체 성장 모듈을 포함하는 예시적인 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기(1100)의 구현예의 단순화된 블록도이다. (예를 들어, USSN 16/545,097 참조, 2019년 8월 20일에 출원됨.) 세포 처리 기기(1100)는 하우징(1144), 형질전환되거나 형질감염될 세포의 저장소(1102) 및 성장 모듈(세포 성장 장치)(1104)을 포함할 수 있다. 형질전환될 세포는 세포가 목표 OD에 도달할 때까지 저장소(1102)로부터 배양되는 성장 모듈(1104)로 전달된다. 세포가 목표 OD에 도달하면, 성장 모듈은 추후 처리를 위해 세포를 냉각 또는 동결시킬 수 있거나, 세포는 세포 농축 모듈(1130)로 전달될 수 있는데, 여기서 세포는 전기적격성이 되고 시약 번들 및 격자-형성 비드와 조합하기에 최적인 부피로 농축되어 구체-패킹 격자 조성물을 형성한다. 일단 형성되면, 구체-패킹 격자 조성물은 전기천공 모듈(1108)(예를 들어, 형질전환/형질감염 모듈)로 전달된다.

[00200] 세포를 저장하기 위한 저장소(1102)에 추가하여, 기기(1100)는 편집 카세트 또는 시약 번들을 저장하기 위한 저장소(1116) 및 발현 벡터 백본을 저장하기 위한 저장소(1118)를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 편집 올리고뉴클레오티드 카세트 및 발현 벡터 백본 둘 모두는 시약 카트리지로부터 핵산 어셈블리 모듈(1120)로 전달되고, 여기서 편집 올리고뉴클레오티드 카세트는 발현 벡터 백본에 삽입된다. 어셈블링된 핵산은 탈염 및/또는 다른 정제를 위해 선택적 정제 모듈(1122)로 전달될 수 있고 시약 전달 기질과 조합되어 시약 번들을 형성할 수 있다. 시약 번들이 형성되면, 이들은 전기적격성 세포 및 격자-형성 비드와 혼합되고, 예를 들어, 전기천공 장치 또는 모듈(1108)로 전달된다. 전기천공 장치(1108)에서, 어셈블링된 핵산이 세포 내로 도입된다. 전기천공 후, 세포는 조합된 분리/회수/선택 모듈(1110)로 전달된다.

[00201] 회수, 격자-형성 비드로부터의 분리 및 선택적으로, 선택 후, 세포는 성장, 유도 및 편집 모듈(벌크 액체 배양물)(1140)로 전달된다. 세포가 성장 정지기에 도달할 때까지(또는 거의 그렇게) 세포가 성장하도록 한 다음, 뉴클레아제 및 gRNA 중 하나 또는 둘 모두의 전사 유도에 의해 편집이 유도된다. 일부 구현예에서, 편집은 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 뉴클레아제 및 gRNA 중 하나 또는 둘 모두의 전사에 의해 유도된다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 프로모터가 온도 상승에 의해 활성화되고 온도를 낮춤으로써 "비활성화"되는 pL 프로모터이다.

[00202] 회수, 선택, 성장, 유도, 편집 및 저장 모듈은 모두 분리될 수 있고, 도 11에 도시된 바와 같이 배열 및 조합될 수 있거나, 다른 구성으로 배열 또는 조합될 수 있다. 특정 구현예에서, 회수 및 선택은 하나의 모듈에서 수행되고, 성장, 편집 및 재성장은 별도의 모듈에서 수행된다. 대안적으로, 회수, 선택, 성장, 편집 및 재성장은 단일 모듈에서 수행된다.

[00203] 세포가 편집되고 재성장되면(예를 들어, 편집으로부터 회수됨), 세포는, 예를 들어, 저장 모듈(1112)에 저장될 수 있으며, 여기서 세포는 세포가 추가 연구를 위해 회수될 때까지(예를 들어, 세포 회수(1114)), 예를 들어, 4℃에서 유지될 수 있다. 대안적으로, 세포는 또 다른 편집 라운드에 사용될 수 있다. 다중-모듈 세포 처리 기기(1100)는 하나 이상의 스크립트의 지시에 따라, 또는 사용자 입력 또는 스크립트의 조합으로서, 사용자 입력을 기반으로 기기를 작동하도록 구성된 프로세서(1142)에 의해 제어된다. 프로세서(1142)는 기기(1100)의 다양한 모듈의 타이밍, 기간, 온도 및 작동, 및 시약의 분배를 제어할 수 있다. 예를 들어, 프로세서(1142)는 편집이 요구될 때까지 형질전환 후 세포를 냉각시킬 수 있고, 이 때 온도는 게놈 편집 및 세포 성장에 도움이 되는 온도로 상승될 수 있다. 프로세서는 사용자가 선택할 수 있는 표준 프로토콜 파라미터로 프로그래밍될 수 있고, 사용자가 하나 이상의 파라미터를 수동으로 지정할 수 있거나 시약 카트리지와 관련된 하나 이상의 스크립트가 하나 이상의 작동 및/또는 반응 파라미터를 지정할 수 있다. 또한, 프로세서는 사용자에게 (예를 들어, 스마트 폰 또는 기타 장치에 대한 애플리케이션을 통해) 세포가 목표 OD에 도달하였음을 알리고/거나 다중-모듈 시스템의 다양한 모듈에서 세포의 진행 상황을 사용자에게 업데이트할 수 있다.

실시예

[00204] 하기 실시예는 본 발명을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시된 것이고, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하려는 의도이거나 아래의 실험이 수행된 실험의 전부 또는 유일한 실험임을 나타내거나 암시하려는 의도가 아니다. 당업자는 광범위하게 기술된 바와 같은 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으며 특정 양태에 제시된 바와 같은 본 발명에 대해 다양한 변경 및/또는 수정이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 양태는 모든 점에서 제한적이지 않고 예시적인 것으로 간주되어야 한다.

실시예 I: 구체-패킹 격자의 형성 및 특성화

[00205] 폴리아크릴아미드 비드를 사용하여 패킹된 격자에서 HEK293T 세포로 용액-상 플라스미드의 전기천공이 입증되었다. 도 12는 반경이 상이한 비드의 슬러리를 벌크 혼합하여 형성된 125 μm 폴리아크릴아미드 비드(예를 들어, 격자-형성 비드) 및 40 μm 폴리스티렌 비드(예를 들어, 시약 번들)를 사용하는 자가-조립된 구체-패킹 격자를 보여준다.

[00206] 그 뒤에, 형광 표지된 DNA가 격자-형성 비드에 첨가되었을 때 비드 사이의 틈새 영역에 집중되었고 비드는 DNA에 대해 불투과성인 것으로 나타났다. 도 13a 및 13b는 형광 표지된 DNA가 비드 사이의 틈새 구획 내에 보유된 폴리아크릴아미드 하이드로겔 비드를 보여주는 현미경 사진이다. 또한, 격자 형성 비드가 있거나 없는 배지의 전도도를 측정하였다. 도 13c는 DNA를 함유하는 배지의 전도도가 폴리아크릴아미드 하이드로겔 비드의 유(EP 배지/GB 격자)무(EP 배지)시에 대략 동일함을 보여주는 막대 그래프이다.

[00207] 그 뒤에, HEK293 세포는 폴리아크릴아미드 격자-형성 비드를 사용한 구체-패킹 격자에서 전기천공되었을 때 적어도 동등한 효율로 형질감염되고 더 높은 평균 형광 강도를 나타낸 것으로 입증되었다. 도 14는 배지에 형광 표지된 DNA를 갖는 HEK293 세포의 형질전환 효율이 구체-패킹 격자가 없는 형질전환 효율과 유사하다는 것을 보여주는 막대 그래프이다.

실시예 II: 완전 자동화 싱글플렉스 RGN-지시된 편집 실행

[00208] MAD7 뉴클레아제를 사용한 싱글플렉스 자동화 게놈 편집은 본 개시의 자동화된 다중-모듈 기기로 성공적으로 수행되었다. 2018년 6월 30일에 출원된 미국 특허 번호 9,982,279; 및 USSN 16/024,831; 2018년 6월 30일에 출원된 16/024,816; 2018년 9월 28일에 출원된 16/147,353; 2018년 9월 30일에 출원된 16/147,865; 및 2018년 6월 30일에 출원된 16/147,871을 참조한다.

[00209] ampR 플라스미드 백본 및 lacZ_F172* 편집 카세트를 Gibson Assembly®을 통해 자동화 기기에 포함된 등온 핵산 어셈블리 모듈 내의 "편집 벡터"로 어셈블링하였다. lacZ_F172는 lacZ 유전자를 기능적으로 녹아웃시킨다. "lacZ_F172*"는 편집이 lacZ 아미노산 서열의 172번째 잔기에서 발생함을 나타낸다. 어셈블리 후, 생성물을 AMPure 비드를 사용하여 등온 핵산 어셈블리 모듈에서 탈염시키고, 80% 에탄올로 세척하고, 완충액에서 용리시켰다. 어셈블링된 편집 벡터 및 리컴비니어링 준비가 된 전기적격 E. 콜리 세포를 전기천공을 위한 형질전환 모듈로 옮겼다. 세포 및 핵산을 조합하고, 1분 동안 혼합하고, 전기천공을 30초 동안 수행하였다. 천공 펄스에 대한 파라미터는 전압, 2400 V; 길이, 5 ms; 간격, 50 ms; 펄스 수, 1; 극성, +였다. 전달 펄스에 대한 파라미터는 전압, 150 V; 길이, 50 ms; 간격, 50 ms; 펄스 수, 20; 극성, +/-였다. 전기천공 후, 세포를 회수 모듈(또 다른 성장 모듈)로 옮기고, 클로르암페니콜을 함유하는 SOC 배지에서 회수하였다. 카르베니실린을 1시간 후에 배지에 첨가하고, 세포를 또 다른 2시간 동안 회수하였다. 회수 후, 사용자에 의해 회수될 때까지 세포를 4℃에서 유지하였다.

[00210] 자동화 프로세스 및 회수 후, 세포의 분취량을 락토스(당 기질로서), 클로르암페니콜 및 카르베니실린이 보충된 MacConkey 한천 베이스에 플레이팅하고, 콜로니가 나타날 때까지 성장시켰다. 백색 콜로니는 기능적으로 편집된 세포를 나타내고, 자주색 콜로니는 편집되지 않은 세포를 나타내었다. 모든 액체 전달은 자동화된 다중-모듈 세포 처리 기기의 자동화된 액체 핸들링 장치에 의해 수행되었다.

[00211] 자동화 처리의 결과로서 대략 1.0E⁰³개의 총 세포가 형질전환되었고(전통적인 벤치탑 결과와 유사함), 편집 효율은 83.5%였다. 백색 콜로니에서의 lacZ_172 편집은 세포 게놈의 편집된 영역의 시퀀싱에 의해 확인되었다. 또한, 자동화 세포 처리 단계는 웹캠에 의해 원격으로 관찰되었고, 자동화 처리 절차의 상태를 업데이트하기 위해 문자 메세지가 전송되었다.

실시예 II: 완전 자동화 반복적 편집 실행

[00212] 반복적 편집은 자동화된 다중-모듈 세포 처리 시스템을 사용하여 성공적으로 달성되었다. ampR 플라스미드 백본 및 lacZ_V10* 편집 카세트를 Gibson Assembly®을 통해 자동화 시스템에 포함된 등온 핵산 어셈블리 모듈 내의 "편집 벡터"로 어셈블링하였다. lacZ_F172 편집과 유사하게, lacZ_V10 편집은 기능적으로 lacZ 유전자를 녹아웃시킨다. "lacZ_V10"은 편집이 lacZ 아미노산 서열의 아미노산 위치 10에서 발생함을 나타낸다. 어셈블리 후, 생성물을 AMPure 비드를 사용하여 등온 핵산 어셈블리 모듈에서 탈염시키고, 80% 에탄올로 세척하고, 완충액에서 용리시켰다. 첫 번째 어셈블링된 편집 벡터 및 리컴비니어링 준비가 된 전기적격 E. 콜리 세포를 전기천공을 위한 형질전환 모듈로 옮겼다. 세포 및 핵산을 조합하고, 1분 동안 혼합하고, 전기천공을 30초 동안 수행하였다. 천공 펄스에 대한 파라미터는 전압, 2400 V; 길이, 5 ms; 간격, 50 ms; 펄스 수, 1; 극성, +였다. 전달 펄스에 대한 파라미터는 전압, 150 V; 길이, 50 ms; 간격, 50 ms; 펄스 수, 20; 극성, +/-였다. 전기천공 후, 세포를 회수 모듈(또 다른 성장 모듈)로 옮기고, 클로르암페니콜을 함유하는 SOC 배지에서 회수하였다. 카르베니실린을 1시간 후에 배지에 첨가하고, 세포를 또 다른 2시간 동안 성장시켰다. 이후, 세포를 원심분리기 모듈로 옮긴 후, 배지 교환을 수행하였다. 세포를 클로르암페니콜 및 카르베니실린을 함유하는 TB에 재현탁시키고, 여기서 세포를 2.7의 OD600으로 성장시킨 후, 농축시키고, 전기적격이 되도록 하였다.

[00213] 세포 성장 동안, 등온 핵산 어셈블리 모듈에서 제2 편집 벡터를 제조하였다. 제2 편집 벡터는 카나마이신 내성 유전자를 포함하였고, 편집 카세트는 galK Y145* 편집을 포함하였다. 성공적인 경우, galK Y145* 편집은 세포에 갈락토스를 흡수하고 대사하는 능력을 부여한다. galK Y154* 카세트에 의해 생성된 편집은 154번째 아미노산 잔기에 정지 코돈을 도입하여 티로신 아미노산을 정지 코돈으로 변경한다. 이러한 편집은 galK 유전자 생성물을 비-기능성으로 만들고, 세포가 갈락토스를 대사할 수 없게 한다. 어셈블리 후, 제2 편집 벡터 생성물을 AMPure 비드를 사용하여 등온 핵산 어셈블리 모듈에서 탈염시키고, 80% 에탄올로 세척하고, 완충액에서 용리시켰다. 어셈블링된 제2 편집 벡터 및 전기적격 E. 콜리 세포(제1 편집 벡터로 형질전환되고 선택됨)를 상기 상세히 설명된 바와 같은 동일한 파라미터를 사용하여 전기천공을 위한 형질전환 모듈로 옮겼다.

[00214] 전기천공 후, 세포를 회수 모듈(또 다른 성장 모듈)로 옮기고, 카르베니실린을 함유하는 SOC 배지에서 회수하였다. 회수 후, 세포를 회수시까지 4℃에서 유지시킨 후, 세포 분취량을 클로르암페니콜 및 카나마이신이 보충된 LB 한천에 플레이팅하였다. lacZ 및 galK 편집 둘 모두를 정량화하기 위해, 복제 패치 플레이트를 1) 락토스(당 기질로서), 클로르암페니콜 및 카나마이신이 보충된 MacConkey 한천 베이스, 및 2) 갈락토스(당 기질로서), 클로르암페니콜 및 카나마이신이 보충된 MacConkey 한천 베이스의 2개의 배지 유형에서 생성시켰다. 모든 액체 전달은 자동화된 다중-모듈 세포 처리 시스템의 자동화된 액체 핸들링 장치에 의해 수행되었다.

[00215] 이러한 반복적 편집 실험에서, 스크리닝된 콜로니의 41%는 lacZ 및 galK 편집 둘 모두를 가졌고, 그 결과는 "벤치탑" 또는 수동 접근법을 사용하여 획득된 이중 편집 효율과 유사하였다.

[00216] 본 발명은 본 발명의 바람직한 구현예와 관련하여 상세하게 기술된 바와 같이 많은 상이한 형태의 구현예에 의해 충족되지만, 본 개시는 본 발명의 원리의 예시로서 고려되어야 하고, 본 발명을 본원에 예시되고 기술된 특정 구현예로 제한하려는 의도가 아님이 이해된다. 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 당업자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위 및 그 등가물에 의해 판단될 것이다. 요약서 및 명칭은 적절한 권위자뿐만 아니라 일반 대중이 본 발명의 일반적인 특성을 신속하게 판단할 수 있도록 하는 것이기 때문에 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 다음의 청구 범위에서, "수단"이라는 용어가 사용되지 않는 한, 그 안에 언급된 특징 또는 요소는 35 U.S.C. §112, ¶6에 따른 수단-및-기능 제한으로 해석되어서는 안 된다.

Claims (30)

1. 세포, 격자-형성 비드 및 시약 전달 기질의 구체-패킹 조성물을 배지에 제공하는 단계로서, 상기 시약 전달 기질이 격자-형성 비드에 의해 형성된 격자의 틈새 영역에 맞도록 크기가 조정되는, 단계;
   시약 전달 기질로부터 시약의 방출을 촉발시키는 단계; 및
   세포, 격자-형성 비드 및 시약의 구체-패킹 조성물에 전기 펄스를 제공하는 단계를 포함하는 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 제2 제공 단계 후에,
   격자를 해체하는 단계; 및
   해체된 격자로부터 세포를 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 시약 번들이 외인성 물질의 다수의 클론 카피를 포함하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 외인성 물질이 DNA, RNA, 단백질 또는 리보단백질 복합체인 방법.
5. 제3항에 있어서, 시약 번들이 상이한 외인성 물질을 포함하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 시약 전달 기질이 중합성 마이크로입자, 세라믹 마이크로입자 또는 하이드로겔 마이크로입자로부터 선택되는 방법.
7. 제6항에 있어서, 중합성 마이크로입자가 폴리스티렌 비드인 방법.
8. 제6항에 있어서, 하이드로겔 마이크로입자가 가교된 중합체를 포함하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 가교된 중합체가 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜 또는 알기네이트로부터 선택되는 방법.
10. 제1항에 있어서, 격자-형성 비드가 중합성 하이드로겔인 방법.
11. 제10항에 있어서, 중합성 하이드로겔이 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 알기네이트 또는 젤라틴으로부터 선택되는 방법.
12. 제1항에 있어서, 격자-형성 비드의 직경이 75 내지 250 μm인 방법.
13. 제12항에 있어서, 격자-형성 비드의 직경이 125 내지 150 μm인 방법.
14. 제1항에 있어서, 시약 번들로부터의 시약 방출이 화학적 트리거, 광자 트리거, 전기적 트리거 또는 온도 트리거에 의해 촉발되는 방법.
15. 제14항에 있어서, 화학적 트리거가 효소적, pH 또는 경쟁적 결합 반응 트리거인 방법.
16. 제14항에 있어서, 광자 트리거가 UV 또는 가시 광선인 방법.
17. 제14항에 있어서, 전기적 트리거가 소포의 전기장 유도 불안정화인 방법.
18. 제1항에 있어서, 세포, 격자-형성 비드 및 시약 전달 기질의 구체-패킹 조성물의 부피가 10 내지 500 μL인 방법.
19. 제1항에 있어서, 시약 전달 기질의 직경이 20 내지 90 μm인 방법.
20. 제19항에 있어서, 시약 전달 기질의 직경이 30 내지 50 μm인 방법.
21. 세포, 격자-형성 비드 및 외인성 물질의 구체-패킹 조성물을 배지에 제공하는 단계; 및
    세포, 격자-형성 비드 및 시약의 구체-패킹 조성물에 전기 펄스를 제공하는 단계를 포함하는 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 방법.
22. 제21항에 있어서, 제2 제공 단계 후에,
    격자를 해체하는 단계; 및
    해체된 격자로부터 세포를 수집하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
23. 제21항에 있어서, 외인성 물질이 DNA, RNA, 단백질 또는 리보단백질 복합체인 방법.
24. 제23항에 있어서, 외인성 물질이 DNA, RNA, 단백질 또는 리보단백질 복합체 중 어느 하나의 혼합물인 방법.
25. 제21항에 있어서, 격자-형성 비드가 중합성 하이드로겔인 방법.
26. 제25항에 있어서, 중합성 하이드로겔이 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 알기네이트 또는 젤라틴으로부터 선택되는 방법.
27. 제21항에 있어서, 격자-형성 비드의 직경이 75 내지 250 μm인 방법.
28. 제27항에 있어서, 격자-형성 비드의 직경이 125 내지 150 μm인 방법.
29. 제21항에 있어서, 시약 번들로부터의 시약 방출이 화학적 트리거, 광자 트리거, 전기적 트리거 또는 온도 트리거에 의해 촉발되는 방법.
30. 제1항에 있어서, 세포, 격자-형성 비드 및 시약 전달 기질의 구체-패킹 조성물의 부피가 10 내지 500 μL인 방법.

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