KR20220131522A

KR20220131522A - 완전-인간 글리코실화된 인간 알파-l-이두로니다아제 (idua)를 사용한 점액다당류증 i의 치료

Info

Publication number: KR20220131522A
Application number: KR1020227025630A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 조셉 파콜라; 파울로 팔라벨라; 마리-로르 뉴보렛
Original assignee: 리젠엑스바이오 인크.
Priority date: 2020-01-22
Filing date: 2021-01-20
Publication date: 2022-09-28
Also published as: CA3167685A1; JP2023511382A; EP4093428A1; US20230059395A1; IL294625A; WO2021150570A1; AU2021211416A1; BR112022014563A2

Abstract

점액다당류증 I (MPS I)로 진단된 인간 대상체의 중추 신경계 (CNS)의 뇌척수액에 완전히 인간-글리코실화된 (HuGly) α-L-이두로니다아제 (IDUA)를 전달하기 위한 조성물 및 방법이 설명되어 있다.

Description

완전-인간 글리코실화된 인간 알파-L-이두로니다아제 (IDUA)를 사용한 점액다당류증 I의 치료

관련된 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 2020년 10월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 63/086,145 및 2020년 1월 22일에 출원된 미국 가출원 번호 62/964,351의 이익을 주장하며, 이의 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

전자적으로 제출된 서열 목록 참조

본 출원은 2021년 1월 11일에 생성되고, 크기가 86,234 바이트인 "Sequence_Listing_12656-128-228.txt"라는 제목의 텍스트 파일로서 본 출원과 함께 제출된 서열 목록을 참조로 포함한다.

1. 도입

2. 발명의 배경

I형 점액다당류증 (MPS I)은 희귀 열성 유전 질환으로, 발생률은 100,000명의 정상 출산아 중 1명으로 추정된다 (Moore D 등, 2008, Orphanet Journal of Rare Diseases 3). MPS I은 편재하는 복합 다당류 헤파란 설페이트와 더마탄 설페이트의 리소좀 이화작용에 필요한 효소인, α-l-이두로니다아제 (IDUA)의 결핍으로 인해 발생한다. 글리코사미노글리칸 (GAG)이라고 하는 이 다당류는 MPS I 환자의 조직에 축적되어 특징적인 저장 병변과 다양한 질환 후유증을 유발한다. 환자는 작은 키, 뼈 및 관절 기형, 거친 얼굴 특징, 간비장비대, 심장 판막 질환, 폐쇄 수면 무호흡, 재발성 상기도 감염, 청력 장애, 손목 터널 증후군 및 각막 혼탁으로 인한 시력 장애를 나타낼 수 있다 (Beck M, 등, 2014, The natural history of MPS I: global perspectives from the MPS I Registry. Genetics in medicine: official journal of the American College of Medical Genetics 16(10):759-765). 또한, 많은 환자에서 중추 신경계의 GAG 저장과 관련된 증상이 발생하는데, 여기에는 수두증, 척수 압박 및 일부 환자의 경우에 인지 장애가 포함될 수 있다.

MPS I 환자는 광범위한 질환 중증도 및 CNS 연루 정도를 포괄한다. 중증도의 이러한 가변성은 잔여 IDUA 발현과 관련이 있으며; 넌센스 돌연변이, 결실 및 일부 미스센스 돌연변이를 포함하여, 활성 효소 발현을 초래하지 않는 2개의 돌연변이가 있는 환자는 전형적으로 2세 이전에 증상을 보이며, 일반적으로 초기 정상 발달 기간 후에 심각한 인지 저하를 나타낸다 (Terlato NJ & Cox GF, 2003, Genetics in Medicine: official journal of the American College of Medical Genetics 5(4):286-294). 이 심각한 형태의 MPS I는 헐러 (H) 증후군으로도 지칭된다. 소량의 활성 IDUA를 생성하는 적어도 하나의 돌연변이가 있는 환자는 헐러-샤이 (Hurler-Scheie; HS) 증후군 또는 샤이 증후군으로 지칭되는, 약화된 표현형을 나타낸다. 이들 환자들은 어린 시절 조기에 증상이 나타날 수 있거나 생후 10년이 지날 때까지도 식별되지 않을 수 있다. 발병이 일반적으로 늦어지고 중증도가 감소될 수 있지만, 약화된 형태의 MPS I 환자는 헐러 증후군 환자와 동일한 임의의 신체적 특징을 경험할 수 있다 (Vijay S & Wraith JE, 2005, Acta Paediatrica 94(7):872-877). 약화된 MPS I 환자는 또한 척수 압박 및 수두증을 포함한 신경계 합병증의 비율이 높다. 인지 장애는 약화된 MPS I를 갖는 것으로 분류된 환자의 대략 30%에서 보고된다 (Beck M, 등, 2014, Genetics in medicine: official journal of the American College of Medical Genetics 16(10):759-765).

효소 대체 요법 (ERT) [Aldurazyme® (라로니다아제(laronidase))]은 MPS I의 전신 증상에 대한 표준 치료로 인정되었지만, CNS 증상은 치료하지 않는다 (de Ru MH, 등, 2011, Orphanet Journal of Rare Diseases 6:9; Wraith JE, 등, 2007, Pediatrics 120(1): E37-E46). 조혈모세포 이식 (HSCT)은 MPS I의 신경인지 증상에 영향을 주지만, 시술에는 중요한 한계가 있다. MPS I에 대한 HSCT는 실질적인 이환율 및 최대 20%의 사망률과 관련이 있으며, IDUA 발현이 안정화되는 동안 HSCT 후 최대 1년까지 환자가 여전히 신경인지 저하를 겪기 때문에 치료가 불완전하다 (de Ru MH, 등, 2011, Orphanet Journal of Rare Diseases 6:9; Fleming DR, 등, 1998, Pediatric transplantation 2(4):299-304; Boelens JJ, 등, 2007, Bone Marrow Transplantation 40(3):225-233; Souillet G, 등, 2003, Bone Marrow Transplantation 31(12):1105-1117; Whitley CB, 등, 1993, American Journal of Medical Genetics 46(2):209-218). 성공적으로 이식된 환자 중 지능은 전형적으로 정상보다 유의하게 낮다.

3. 발명의 요약

본 발명은 헐러, 헐러-샤이, 또는 샤이 증후군으로 진단된 환자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 점액다당류증 I (MPS I)로 진단된 인간 대상체의 중추 신경계의 뇌척수액 (CSF)에 완전히 인간-글리코실화된 (HuGly) α-L-이두로니다아제 (HuGlyIDUA)를 전달하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 치료는 유전자 요법을 통해, 예를 들어, MPS I로 진단된 환자 (인간 대상체)의 CSF에, 인간 IDUA (hIDUA) 또는 hIDUA의 유도체를 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 기타 DNA 발현 작제물을 투여하여 완전히 인간-글리코실화된 이식유전자 산물을 CNS에 지속적으로 공급하는 형질도입된 세포의 영구적인 데포(depot)가 생성됨으로써 달성된다. 상기 데포로부터 CSF로 분비된 HuGlyIDUA는 CNS의 세포에 의해 세포내 이입되어 수용 세포에서 효소 결함에 대한 "교차-보정(cross-correction)"을 초래할 것이다. 대안적인 구현예에서, HuGlyIDUA는 세포 배양으로 생성될 수 있고, 효소 대체 요법 ("ERT")으로, 예를 들어, 효소를 주입함으로써 투여될 수 있다. 그러나 유전자 치료 접근법은 ERT에 비해 몇 가지 이점을 제공하며, 즉 효소가 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 없기 때문에 효소의 전신 전달은 CNS 치료로 이어지지 않을 것이며; 본 발명의 유전자 치료 접근법과는 달리, 효소를 CNS로 직접 전달하는 것은 부담이 될뿐만 아니라 감염 위험이 있는 반복 주사를 필요로 할 것이다.

이식유전자에 의해 인코딩된 HuGlyIDUA는 서열 번호 1 (도 1에 도시됨)의 아미노산 서열을 갖는 인간 IDUA (hIDUA), 및 예를 들어, 도 2에 도시된 IDUA의 오르토로그(ortholog)에서 상응하는 비-보존 잔기로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가가 있는 hIDUA의 유도체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않고, 단 이러한 돌연변이는 도 3에 도시된 (그 전문이 본원에 참조로 포함된, Saito 등, 2014, Mol Genet Metab 111:107-112, 표 3 목록 57 MPS I 돌연변이로부터) 중증, 중증-중간, 중간 또는 약화된 MPS I 표현형으로 식별되거나; 또는 문헌(Venturi 등, 2002, 인간 Mutation #522 Online ("Venturi 2002"), 또는 Bertola 등, 2011 인간 Mutation 32:E2189-E2210 ("Bertola 2011"), 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 보고된 어떤 것도 포함하지 않는다.

예를 들어, hIDUA의 특정 위치에서 아미노산 치환은 도 2 (그 전문이 본원에 참조로 포함된, 보고된 Maita 등, 2013, PNAS 110:14628, 도 S8과 같은 오르토로그의 정렬을 보여줌)에 도시된 IDUA 오르토로그의 해당 위치에서 발견되는 상응하는 비-보존 아미노산 잔기 중에서 선택될 수 있고, 단 이러한 치환은 도 3에 도시되거나 상기 Venturi 2002 또는 Bertola 2011에 보고된 임의의 유해한 돌연변이를 포함하지 않는다. 생성된 이식유전자 산물은 돌연변이가 IDUA 기능을 방해하지 않는지 확인하기 위해 시험관내, 세포 배양 또는 시험 동물에서 종래의 분석을 사용하여 시험될 수 있다. 선택된 바람직한 아미노산 치환, 결실 또는 첨가는 MPS I에 대한 종래의 시험관내 분석, 세포 배양 또는 동물 모델에서 시험될 때 IDUA의 효소 활성, 안정성 또는 반감기를 유지하거나 증가시키는 것들이어야 한다. 예를 들어, 이식유전자 산물의 효소 활성은 4-메틸움벨리페릴 α-L-이두로나이드를 기질로 하는 종래의 효소 분석을 사용하여 평가될 수 있다 (사용될 수 있는 예시적인 IDUA 효소 분석에 대해서는 예를 들어, Hopwood 등, 1979, Clin Chim Acta 92: 257-265; Clements 등, 1985, Eur J Biochem 152: 21-28; 및 Kakkis 등, 1994, Prot Exp Purif 5: 225-232 참조, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). MPS I 표현형을 교정하는 이식유전자 산물의 능력은 세포 배양으로; 예를 들어, 배양 중 MPS I 세포를 hIDUA 또는 유도체를 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 기타 DNA 발현 작제물로 형질도입시키거나; rHuGlyIDUA 또는 유도체를 배양 중 MPS I 세포에 첨가하거나; 또는 MPS I 세포를, rHuGlyIDUA 또는 유도체를 발현시키고 분비하도록 조작된 인간 숙주 세포와 공동 배양하고, 예를 들어, IDUA 효소 활성 및/또는 배양 중 MPS I 세포의 GAG 저장 감소를 검출하여 MPS I 배양된 세포에서 결함 보정을 결정함으로써 평가될 수 있다 (예를 들어, Myerowitz & Neufeld, 1981, J Biol Chem 256: 3044-3048; 및 Anson 등 1992, Hum Gene Ther 3: 371-379 참조, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).

MPS I에 대한 동물 모델은 마우스 (예를 들어, Clarke 등, 1997, Hum Mol Genet 6(4):503-511 참조), 애완용 쇼트헤어 고양이 (예를 들어, Haskins 등, 1979, Pediatr Res 13(11):1294-97 참조), 및 몇몇 품종의 개 (예를 들어, Menon 등, 1992, Genomics 14(3):763-768; Shull 등, 1982, Am J Pathol 109(2):244-248 참조)에 대해 설명되었다. 개의 MPS I 모델은 IDUA 돌연변이로 인해 단백질이 검출되지 않기 때문에 MPS I의 가장 중증 형태인 헐러 증후군과 유사하다. IDUA 단백질 간의 높은 유전자 상동성 (도 2의 정렬 참조)은 hIDUA가 동물에서 기능적이며, hIDUA를 포함하는 치료가 이러한 동물 모델에서 시험될 수 있음을 의미한다.

바람직하게는, rHuGlyIDUA 이식유전자는 뉴런 및/또는 신경아교 세포에서 기능하는 발현 조절 요소, 예를 들어, CB7 프로모터 (닭 β-액틴 프로모터 및 CMV 인핸서)에 의해 조절되어야 하고, 벡터에 의해 구동되는 이식유전자의 발현을 향상시키는 다른 발현 조절 요소 (예를 들어, 닭 β-액틴 인트론 및 토끼 β-글로빈 폴리 A 신호)를 포함할 수 있다. hIDUA 이식유전자에 대한 cDNA 작제물은 형질도입된 CNS 세포에 의한 적절한 동시 번역 처리 및 번역 후 처리 (글리코실화 및 단백질 황산화)를 보장하는 신호 펩티드에 대한 코딩 서열을 포함해야 한다. CNS 세포에 의해 사용되는 이러한 신호 펩티드는 다음을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다:

ㆍ 희소돌기아교세포-미엘린 당단백질 (hOMG) 신호 펩티드:

MEYQILKMSLCLFILLFLTPGILC (서열 번호:2)

ㆍ E1A-자극 유전자 2의 세포 억제인자 (hCREG2) 신호 펩티드:

MSVRRGRRPARPGTRLSWLLCCSALLSPAAG (서열 번호:3)

ㆍ V-세트 및 막횡단 도메인 함유 2B (hVSTM2B) 신호 펩티드:

MEQRNRLGALGYLPPLLLHALLLFVADA (서열 번호:4)

ㆍ 프로토카데린(Protocadherin) 알파-1 (hPCADHA1) 신호 펩티드:

MVFSRRGGLGARDLLLWLLLLAAWEVGSG (서열 번호:5)

ㆍ FAM19A1 (TAFA1) 신호 펩티드:

MAMVSAMSWVLYLWISACA (서열 번호:6)

ㆍ 인터류킨-2 신호 펩티드:

MYRMQLLSCIALILALVTNS (서열 번호:14)

신호 펩티드는 또한 본원에서 리더 서열 또는 리더 펩티드로 지칭될 수 있다.

이식유전자를 전달하는 데 사용되는 재조합 벡터는 뉴런 및/또는 신경아교 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 CNS의 세포에 대한 향성(tropism)을 가져야 한다. 이러한 벡터는 비-복제 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터 ("rAAV")를 포함할 수 있으며, 특히 AAV9 또는 AAVrh10 캡시드를 갖는 것이 바람직하다. 그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 7,906,111의 윌슨(Wilson)에 의해 설명된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 AAV 변이체 캡시드; 뿐만 아니라 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 번호 8,628,966, 미국 특허 번호 8,927,514의 채터지(Chatterjee) 및 문헌(Smith 등, 2014, Mol Ther 22: 1625-1634)에 설명된 AAV 변이체 캡시드가 사용될 수 있으며, AAV/hu.31 및 AAV/hu.32가 특히 바람직하다. 그러나, 렌티바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 또는 "네이키드(naked) DNA" 작제물로 지칭되는 비-바이러스 발현 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 바이러스 벡터가 사용될 수 있다 (섹션 5.2 참조).

일 구현예에서, AAV-작제물　1은 이식유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. AAV-작제물　1은 인간 α-L-이두로니다아제 (IDUA) 발현 카세트를 함유하는 재조합 아데노-관련 바이러스 혈청형 9 캡시드이고, 여기서 카세트로부터 발현은 CB7 프로모터, 거대세포바이러스 (CMV) 최초 인핸서와 닭 베타 액틴 프로모터 사이 하이브리드에 의해 구동되고, 여기서 IDUA 발현 카세트는 역방위 말단 반복 (ITR)이 측면에 있고 발현 카세트는 닭 베타 액틴 인트론 및 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 (polyA) 신호를 포함한다. 바람직한 구현예에서, ITR은 AAV2 ITR이다. AAV-작제물　1의 벡터 게놈의 개략도는 도 6에 도시된다. 일 구현예에서, AAV-작제물 1은 서열번호:27의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.

CSF에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물은 생리적으로 적합한 수성 완충액, 계면활성제 및 선택적 부형제를 포함하는 제형 완충액 중의 rHuGlyIDUA 벡터의 현탁액을 포함한다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 경막내 투여에 적합하다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 수조내 투여 (대조(cisterna magna)로 주사)에 적합하다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 C1-2 천자를 통해 지주막하 공간으로 주사하기에 적합하다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 뇌실내(intracerebroventricular) 투여에 적합하다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 요추 천자를 통한 투여에 적합하다.

치료학적 유효 용량의 재조합 벡터는 경막내 투여 (즉, 재조합 벡터가 CSF를 통해 분포하고 CNS에서 세포를 형질도입시키도록 지주막하 공간으로의 주사)를 통해 CSF에 투여되어야 한다. 이는 여러 가지 방법으로, 예를 들어, 두개내 (수조 또는 뇌실) 주사 또는 요추 수조(lumbar cistern)로의 주사에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어 수조내 (IC) 주사 (대조로)는 CT-유도 후두하 천자에 의해 수행될 수 있거나; 지주막하 공간으로의 주사는 환자에게 가능할 때 C1-2 천자를 통해 수행될 수 있거나; 또는 CSF에 접근하기 위해 요추 천자 (전형적으로 CSF 샘플을 수집하기 위해 수행되는 진단 절차)가 사용될 수 있다. 대안적으로, 재조합 벡터를 뇌의 뇌실에 직접 주입하기 위해 뇌실내 (ICV) 투여 (혈액-뇌 장벽을 통과하지 않는 항감염 또는 항암 약물의 도입에 사용되는 보다 침습적인 기술)를 사용할 수 있다. 대안적으로, 재조합 벡터를 CNS에 전달하기 위해 비강내 투여를 사용할 수 있다. 적어도 9.25 μg/mL의 C_min에서 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 유지하거나 9.25 내지 277 μg/mL 범위의 농도를 유지하는 용량을 사용해야 한다.

CSF 농도는 후두 또는 요추 천자로부터 얻은 CSF 유체 중의 rHuGlyIDUA 농도를 직접 측정하여 모니터링되거나 환자의 혈청에서 검출된 rHuGlyIDUA의 농도로부터 외삽법에 의해 추정될 수 있다. 특정 구현예에서, 혈청 내 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 rHuGlyIDUA는 CSF에서 1 내지 30 mg의 rHuGlyIDUA를 나타낸다. 특정 구현예에서, 재조합 벡터는 혈청 내 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다.

특정 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량으로 투여되고, 여기서 뇌 질량은 대상체의 뇌의 뇌 자기 공명 영상 (MRI)에 의해 결정된다. 특정 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 MRI에 의해 결정된 경우에 약 2 × 10⁹ GC/g 뇌 질량의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 MRI에 의해 결정된 경우에 약 1 × 10¹⁰ GC/g 뇌 질량의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 MRI에 의해 결정된 경우에 약 5 × 10¹⁰ GC/g 뇌 질량의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 인간 대상체의 뇌 질량은 cm³의 인간 대상체의 뇌 용적과 1.046 g/cm³의 인수를 곱셈함으로써 인간 대상체의 뇌 용적으로부터 전환되고, 여기서 인간 대상체의 뇌 용적은 인간 대상체의 뇌 MRI로부터 수득된다.

배경으로, 인간 IDUA는 653개의 아미노산 폴리펩티드로 번역되고, 도 1에 도시된 6개의 잠재적인 부위 (N110, N190, N336, N372, N415 및 N451)에서 N-글리코실화된다. 신호 서열이 제거되고, 폴리펩티드는 리소좀에서 성숙한 형태로 처리되는데: 75 kDa 세포내 전구체는 수 시간 내에 72 kDa으로 트리밍되고, 결국 4 내지 5일에 걸쳐 66 kDa 세포내 형태로 처리된다. 분비된 형태의 IDUA (사용된 분석에 따라 76 kDa 또는 82 kDa)는 만노스-6-포스페이트 수용체를 통해 세포에 의해 쉽게 세포내 이입되고, 유사하게 더 작은 세포내 형태로 처리된다. (Myerowitz & Neufeld, 1981, J Biol Chem 256: 3044-3048; Clements 등, 1989, Biochem J. 259: 199-208; Taylor 등, 1991, Biochem J. 274: 263-268; 및 Zhao 등, 1997 J Biol Chem 272:22758-22765 참조, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).

hIDUA의 전체 구조는 3개의 도메인으로 구성되며: 잔기 42-396은 고전적인 (β/α) 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TIM) 배럴 도메인을 형성하고; 잔기 27-42 및 397-545는 짧은 나선-루프-나선 (482-508)을 갖는 β-샌드위치 도메인을 형성하고; 잔기 546-642는 Ig-유사 도메인을 형성한다. 후자의 두 도메인은 C⁵⁴¹과 C⁵⁷⁷ 사이의 이황화 다리를 통해 연결된다. β-샌드위치 및 Ig-유사 도메인은 TIM 배럴의 첫 번째, 일곱 번째 및 여덟 번째 α-나선에 부착된다. β-헤어핀 (β12-β13)은 기질 결합 및 효소 활성에 필요한 N-글리코실화된 N³⁷²를 포함하는 TIM 배럴의 여덟 번째 β-가닥과 여덟 번째 α-나선 사이에 삽입된다. (도 1 및 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된 Maita 등, 2013, PNAS 110: 14628-14633, 및 Saito 등, 2014, Mol Genet Metab 111: 107-112에 기재된 결정 구조 참조).

본 발명은 부분적으로 다음의 원리에 기초한다:

(i) CNS의 뉴런 및 신경아교 세포는 CNS의 강력한 프로세스인, 글리코실화 및 티로신-O-황산화를 포함하는, 분비된 단백질의 번역 후 처리를 위한 세포 기구를 보유한 분비 세포이다. 예를 들어, 인간의 뇌 만노스-6-포스페이트 (M6P) 글리코프로테옴(glycoproteome)을 설명하고, 뇌에는 다른 조직에서 발견되는 것보다 훨씬 더 많은 수의 개별 이소형 및 만노스-6-인산화 단백질을 갖는 더 많은 단백질을 함유하고 있음에 주목하는 Sleat 등, 2005, Proteomics 5: 1520-1532, 및 Sleat 1996, J Biol Chem 271: 19191-98; 및 뉴런 세포에서 분비되는 티로신-황산화 당단백질의 생성을 보고하는 Kanan 등, 2009, Exp. Eye Res. 89: 559-567 및 Kanan & Al-Ubaidi, 2015, Exp. Eye Res. 133: 126-131을 참조하며, 이들 각각은 인간 CNS 세포에 의해 이루어진 번역 후 변형에 대해 그 전문이 참조로 포함된다.

(ii) hIDUA는 도 1에서 식별된 6개의 아스파라진 ("N") 글리코실화 부위 (N¹¹⁰FT; N¹⁹⁰VS; N³³⁶TT; N³⁷²NT; N⁴¹⁵HT; N⁴⁵¹RS)를 갖는다. N³⁷²의 N-글리코실화는 기질과의 결합 및 효소 활성에 필요하며, 만노스-6-인산화는 분비된 효소의 세포 흡수 및 MPS I 세포의 교차-보정에 필요하다. N-연결된 글리코실화 부위는 복합, 고 만노스 및 인산화된 만노스 탄수화물 모이어티를 함유하지만 (도 4), 분비된 형태만이 세포에 흡수된다. (상기 Myerowitz & Neufeld, 1981). 본원에 기재된 유전자 치료 접근법은 2,6-시알릴화 및 만노스-6-인산화된 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (사용된 분석에 따라 다름)에 의해 측정될 때 76 - 82 kDa의 IDUA 당단백질의 지속적인 분비를 초래해야 한다. 분비된 글리코실화된/인산화된 IDUA는 CNS에서 형질도입되지 않은 신경 및 신경아교 세포에 의해 흡수되고 올바르게 처리되어야 한다.

(iii) 리소좀 단백질의 세포 및 세포하 수송/흡수는 M6P를 통해 이루어진다. 이두로네이트-2-설파타아제 효소에 대해 다니엘(Daniele) 2002 (Biochimica et Biophysica Acta 1588(3):203-9)에서 수행된 바와 같이, 분비된 단백질의 M6P 함량을 측정하는 것이 가능하다. 억제성 M6P (예를 들어, 5 mM)의 존재 하에, 다니엘 2002의 유전적으로 조작된 신장 세포와 같은 비-뉴런 또는 비-신경아교 세포에 의해 생성된 효소 전구체의 흡수는 다니엘 2002에서 보여준 바와 같이 대조 세포의 수준에 가까운 수준으로 감소할 것으로 예상된다. 억제성 M6P가 존재하는 동안, 뉴런 및 신경아교 세포와 같은 뇌 세포에 의해 생성된 효소 전구체의 흡수는 다니엘 2002에서 보여준 바와 같이 높은 수준으로 유지될 것으로 예상되며, 여기서 흡수는 대조 세포보다 4배 더 높았고, 억제성 M6P의 존재 없이 유전적으로 조작된 신장 세포에 의해 생성된 효소 전구체의 효소 활성 (또는 흡수) 수준과 비슷하였다. 이 분석을 통해 뇌 세포에 의해 생성된 효소 전구체의 M6P 함량을 예측하고, 특히 상이한 유형의 세포에 의해 생성된 효소 전구체의 M6P 함량을 비교할 수 있다. 본원에 기재된 유전자 치료 접근법은 이러한 분석에서 억제성 M6P의 존재 하에 높은 수준으로 뉴런 및 신경아교 세포로 흡수될 수 있는 hIDUA의 지속적인 분비를 초래해야 한다.

(iv) N-연결된 글리코실화 부위 이외에, hIDUA는 결합 및 활성에 필요한 N³⁷²를 함유하는 도메인 근처에 티로신 ("Y") 황산화 부위 (ADTPIY²⁹⁶NDEADPLVGWS)를 함유한다. (예를 들어, 단백질 티로신 황산화를 겪는 티로신 잔기를 둘러싼 아미노산의 분석을 위해 그 전문이 참조로 포함된 Yang 등, 2015, Molecules 20:2138-2164, esp. at p. 2154를 참조한다. "규칙"은 다음과 같이 요약될 수 있다: Y의 +5 내지 -5 위치 내에 E 또는 D가 있고, Y의 위치 -1이 중성 또는 산성 하전된 아미노산이지만, 황산화를 무효화하는 염기성 아미노산, 예를 들어, R, K, 또는 H가 아닌 Y 잔기). 어떤 이론에도 구속되는 것은 아니지만, 티로신-황산화 영역 (예를 들어, W306L) 내의 돌연변이가 효소 활성 및 질환 감소와 관련이 있는 것으로 알려져 있기 때문에 hIDUA에서 이 부위의 황산화가 활성에 결정적일 수 있다. (Maita 등, 2013, PNAS 110:14628 at pp. 14632-14633 참조).

(v) CNS의 인간 세포에 의한 hIDUA의 글리코실화는 안정성, 반감기를 개선하고, 이식유전자 산물의 원치 않는 응집을 감소시킬 수 있는 글리칸의 첨가를 초래할 것이다. 유의하게도, 본 발명의 HuGlyIDUA에 첨가되는 글리칸은 2,6-시알산을 포함하는 고도로 처리된 복합형 바이안테너리(biantennary) N-글리칸으로, Neu5Ac ("NANA")를 포함하지만 이의 하이드록실화 유도체인 NeuGc (N-글리콜릴뉴라민산, 즉, "NGNA" 또는 "Neu5Gc")는 포함하지 않는다. 이러한 글리칸은 이 번역 후 변형을 만드는 데 필요한 2,6-시알릴트랜스퍼라아제를 갖지 않고, 이등분(bisecting) GlcNAc를 생성하지도 않는 CHO 세포에서 만들어진 라로니다아제에 존재하지 않지만, 이는 Neu5Ac (NANA) 대신 인간에게 전형적이지 않은 (그리고 잠재적으로 면역원성인) 시알산으로 Neu5Gc (NGNA)를 추가한다. 예를 들어, Dumont 등, 2016, Critical Rev, Biotech 36(6):1110-1122 (Early Online pp. 1-13 at p. 5); 및 Hague 등, 1998 Electrophor 19:2612-2630 ("CHO 세포주는 α2,6-시알릴-트랜스퍼라아제가 없기 때문에 글리코실화 측면에서 '표현형적으로 제한되는' 것으로 간주됨")을 참조한다. 더욱이, CHO 세포는 또한 α-Gal 항원인, 면역원성 글리칸을 생성할 수 있으며, 이는 대부분의 개체에 존재하는 항-α-Gal 항체와 반응하며, 고농도에서는 아나필락시스를 유발할 수 있다. 예를 들어, Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156을 참조한다. 본 발명의 HuGlyIDUA의 인간 글리코실화 패턴은 이식유전자 산물의 면역원성을 감소시키고 효능을 개선해야 한다.

(vi) 인간 CNS 세포에서 강력한 번역 후 과정인 hIDUA의 티로신-황산화는 이식유전자 산물의 처리 및 활성을 개선시켜야 한다. 리소좀 단백질의 티로신-황산화의 중요성은 밝혀지지 않았지만; 다른 단백질에서는 단백질-단백질 상호작용 (항체 및 수용체)의 결합력을 높이고, 단백질분해 처리 (펩티드 호르몬)를 촉진하는 것으로 나타났다. (Moore, 2003, J Biol. Chem. 278:24243-46; 및 Bundegaard 등, 1995, The EMBO J 14: 3073-79 참조). 티로신-황산화 (IDUA 처리의 마지막 단계로 발생할 수 있음)를 담당하는 티로실단백질 설포트랜스퍼라아제 (TPST1)는 명백하게 뇌에서 더 높은 수준 (mRNA 기반)으로 발현된다 (예를 들어, http://www.ebi.ac.uk/gxa/home에서 액세스할 수 있는 EMBL-EBI Expression Atlas에서 TPST1에 대한 유전자 발현 데이터를 확인할 수 있음). 이러한 번역 후 변형은 CHO 세포 산물인 라로니다아제에서 기껏해야 과소 표현된다. 인간 CNS 세포와 달리, CHO 세포는 분비 세포가 아니며, 번역 후 티로신-황산화에 대한 능력이 제한된다. (하기 참조: 예를 들어, Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537, esp. p. 1537에서 토론).

(vii) 이식유전자 산물의 면역원성은 환자의 면역 상태, 주입된 단백질 약물의 구조 및 특성, 투여 경로, 치료 기간을 포함하는 다양한 요인에 의해 유도될 수 있다. 공정-관련 불순물, 예컨대 숙주 세포 단백질 (HCP), 숙주 세포 DNA 및 화학적 잔류물, 및 생성물-관련 불순물, 예컨대 단백질 분해물 및 구조적 특성, 예컨대 글리코실화, 산화 및 응집 (미가시(sub-visible) 입자)은 면역 반응을 향상시키는 보조제 역할을 하여 면역원성을 높일 수도 있다. 공정-관련 및 생성물-관련 불순물의 양은 제조 공정, 즉 세포 배양, 정제, 제형화, 저장 및 취급에 의해 영향을 받을 수 있으며, 이는 상업적으로 제조된 IDUA 산물에 영향을 미칠 수 있다. 유전자 요법에서 단백질은 생체내에서 생성되므로 공정-관련 불순물이 존재하지 않으며, 단백질 산물은 단백질 응집 및 단백질 산화와 같은 재조합 기술에 의해 생성된 단백질과 관련된 생성물-관련 불순물/분해물을 함유하지 않을 가능성이 높다. 예를 들어, 응집은 높은 단백질 농도, 제조 장비 및 용기와의 표면 상호작용, 및 특정 완충 시스템을 사용한 정제 공정으로 인해 단백질 생산 및 저장과 관련이 있다. 그러나 응집을 촉진하는 이러한 조건은 이식유전자가 생체내에서 발현될 때 존재하지 않는다. 메티오닌, 트립토판 및 히스티딘 산화와 같은 산화는 또한, 예를 들어, 스트레스 세포 배양 조건, 금속 및 공기 접촉, 완충액 및 부형제 중의 불순물로 인해 발생하는 단백질 생산 및 저장과 관련이 있다. 생체내에서 발현되는 단백질은 스트레스 조건에서도 산화될 수 있지만, 많은 유기체와 마찬가지로 인간은 산화 스트레스를 감소시킬뿐만 아니라 산화를 복구 및/또는 역전시킬 수 있는 항산화 방어 시스템을 갖추고 있다. 따라서, 생체내에서 생성된 단백질은 산화된 형태일 가능성이 없다. 응집과 산화 모두 효능, PK (제거율)에 영향을 미칠 수 있으며 면역원성 우려를 증가시킬 수 있다. 본원에 기재된 유전자 치료 접근법은 상업적으로 제조된 제품에 비해 면역원성을 감소시키면서 hIDUA의 지속적인 분비를 초래해야 한다.

전술한 이유로, HuGlyIDUA의 생산은 유전자 요법을 통해, 예를 들어, MPS I 질환 (헐러, 헐러-샤이 또는 샤이를 포함하지만 이에 제한되지 않음)으로 진단된 환자 (인간 대상체)의 CSF에, HuGlyIDUA를 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 기타 DNA 발현 작제물을 투여하여 형질도입된 CNS 세포에 의해 분비된 완전히 인간-글리코실화된, 만노스-6-인산화된, 황산화된 이식유전자 산물을 지속적으로 공급하는 CNS의 영구적인 데포가 생성됨으로써 달성되는 MPS I의 치료를 위한 "바이오베터(biobetter)" 분자를 생성해야 한다. 상기 데포로부터 CSF로 분비된 HuGlyIDUA 이식유전자 산물은 CNS의 세포에 의해 세포내 이입되어 MPS I 수용 세포에서 효소 결함에 대한 "교차-보정"을 초래할 것이다.

유전자 요법 또는 단백질 치료 접근법에서 생성된 모든 hIDUA 분자가 완전히 글리코실화되고 황산화되는 것이 필수적인 것은 아니다. 오히려 생성된 당단백질 집단은 효능을 입증하기에 충분한 글리코실화 (2,6-시알릴화 및 만노스-6-인산화 포함) 및 황산화를 가져야 한다. 본 발명의 유전자 요법 치료의 목적은 질환의 진행을 늦추거나 저지하는 것이다. 효능은 인지 기능 (예를 들어, 신경인지 저하의 예방 또는 감소); CSF 및/또는 혈청에서 질환의 바이오마커 (예컨대 GAG) 감소; 및/또는 CSF 및/또는 혈청에서 IDUA 효소 활성의 증가를 측정하여 모니터링될 수 있다. 염증 징후 및 기타 안전 사건도 모니터링될 수 있다.

유전자 요법에 대한 대안 또는 추가 치료로서, rHuGlyIDUA 당단백질이 재조합 DNA 기술에 의해 인간 세포주에서 생산될 수 있으며, 상기 당단백질은 MPS I로 진단된 환자에게 전신적으로 및/또는 ERT를 위해 CSF로 투여될 수 있다. 이러한 재조합 당단백질 생산에 사용될 수 있는 인간 세포주는 HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, ReNcell VM, 인간 배아 신장 293 세포 (HEK293), 섬유육종 HT-1080, HKB-11, CAP, HuH-7, 및 망막 세포주, PER.C6 또는 RPE 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, rHuGlyIDUA 당단백질의 재조합 생산에 사용될 수 있는 인간 세포주에 대한 검토를 위해 그 전문이 참조로 포함된 Dumont 등, 2016, Biotech 36(6):1110-1122의 Critical Rev "Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives" 참조). 완전한 글리코실화, 특히 시알릴화 및 티로신-황산화를 보장하기 위해, 생산에 사용되는 세포주는 α-2,6-시알릴트랜스퍼라아제 (또는 α-2,3- 및 α-2,6-시알릴트랜스퍼라아제 둘 모두) 및/또는 티로신-O-황산화를 담당하는 TPST-1 및 TPST-2 효소를 공동 발현하도록 숙주 세포를 조작함으로써 강화될 수 있다.

rHuGlyIDUA의 전달은 면역 반응을 최소화해야 하지만, CNS 유도 유전자 요법과 관련된 가장 명확한 잠재적 독성의 출처는 IDUA에 대해 유전적으로 결핍되어 잠재적으로 이식유전자 전달에 사용되는 단백질 및/또는 벡터에 대해 내성이 없는 인간 대상체에서 발현된 hIDUA 단백질에 대한 면역을 생성하는 것이다.

따라서, 바람직한 구현예에서, 특히 IDUA 수준이 0에 가까운 중증 질환 (예를 들어, 헐러) 환자를 치료할 때 면역 억제 요법으로 환자를 공동 치료하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 마이코페놀산과 함께 또는 프레드니솔론 및/또는 메틸프레드니솔론과 같은 코르티코스테로이드, 또는 조직 이식 절차에 사용되는 다른 면역 억제 요법과 함께 타크로리무스 또는 라파마이신 (시롤리무스) 요법을 포함하는 면역 억제 요법이 사용될 수 있다. 이러한 면역 억제 치료는 유전자 치료 과정 동안 투여될 수 있고, 특정 구현예에서 면역 억제 요법을 통한 사전 치료가 바람직할 수 있다. 면역 억제 요법은 치료 의사의 판단에 따라 유전자 요법 치료 후 계속될 수 있으며, 이후 면역 관용이 유도되면; 예를 들어, 180일 후 중단될 수 있다.

다른 이용 가능한 치료의 전달과 함께 CSF로의 HuGlyIDUA 전달의 조합은 본 발명의 방법에 포함된다. 추가 치료는 유전자 요법 치료 전, 동시에 또는 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 유전자 요법과 조합될 수 있는 MPS I에 대해 이용 가능한 치료는 전신적으로 또는 CSF로 투여되는 라로니다아제를 사용하는 효소 대체 요법; 및/또는 HSCT 요법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

일 측면에서, 점액다당류증 I (MPS I)로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 인간 뉴런 세포에 의해 생성된 재조합 인간 α-L-이두로니다아제 (IDUA)의 치료적 유효량을 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 인간 IDUA는 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 투여에 의해 전달되고, 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량으로 투여되고, 상기 뇌 질량은 대상체의 뇌의 뇌 자기 공명 영상 (MRI)에 의해 결정되는, 방법이 본원에 제공된다.

또 다른 측면에서, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 인간 신경아교 세포에 의해 생성된 재조합 인간 IDUA의 치료적 유효량을 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 인간 IDUA는 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 투여에 의해 전달되고, 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량으로 투여되고, 상기 뇌 질량은 대상체의 뇌의 뇌 MRI에 의해 결정되는, 방법이 본원에 제공된다.

본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 인간 대상체의 뇌 질량은 cm³의 인간 대상체의 뇌 용적과 1.046 g/cm³의 인수를 곱셈함으로써 인간 대상체의 뇌 용적으로부터 전환되고, 상기 인간 대상체의 뇌 용적은 대상체의 뇌의 뇌 MRI에 의해 결정된다.

본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 MRI에 의해 결정된 경우에 약 2 × 10⁹ GC/g 뇌 질량, MRI에 의해 결정된 경우에 약 1 × 10¹⁰ GC/g 뇌 질량, 또는 MRI에 의해 결정된 경우에 약 5 ×　10¹⁰ GC/g 뇌 질량의 용량으로 투여된다.

본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 수조내 (IC) 투여를 통해 투여된다. 본원에 기재된 치료하는 방법의 다른 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 뇌실내 (ICV) 투여를 통해 투여된다.

본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 인간 대상체의 총 뇌척수액 용적의 10%를 초과하지 않는 용적으로 투여된다.

본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 본 방법은 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 인간 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 억제 요법은 (a) 타크로리무스 및 마이코페놀산, (b) 라파마이신 및 마이코페놀산, 또는 (c) 타크로리무스, 라파마이신, 및 코르티코스테로이드 예컨대 프레드니솔론 및/또는 메틸프레드니솔론의 조합을 인간 대상체에게 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 투여하고, 그 후에 계속하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 억제 요법은 180 일후 중단된다.

본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 인간 IDUA는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.

3.1 예시적인 구현예

1. 점액다당류증 I (MPS I)로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 인간 뉴런 세포에 의해 생성된 재조합 인간 α-L-이두로니다아제 (IDUA)의 치료적 유효량을 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 인간 IDUA는 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 투여에 의해 전달되고, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량으로 투여되고, 뇌 질량은 대상체의 뇌의 뇌 자기 공명 영상 (MRI)에 의해 결정되는, 방법.

2. MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 인간 신경아교 세포에 의해 생성된 재조합 인간 IDUA의 치료적 유효량을 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 인간 IDUA는 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 투여에 의해 전달되고, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량으로 투여되고, 뇌 질량은 대상체의 뇌의 뇌 MRI에 의해 결정되는, 방법.

3. 단락 1 또는 2에 있어서, 상기 인간 대상체의 뇌 질량은 cm³의 인간 대상체의 뇌 용적과 1.046 g/cm³의 인수를 곱셈함으로써 인간 대상체의 뇌 용적으로부터 전환되고, 인간 대상체의 뇌 용적은 대상체의 뇌 MRI로부터 수득되는, 방법.

4. 단락 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 약 2 × 10⁹ GC/g 뇌 질량, 약 1 × 10¹⁰ GC/g 뇌 질량, 또는 약 5 ×　10¹⁰ GC/g 뇌 질량의 용량으로 투여되는, 방법.

5. 단락 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 수조내 (IC) 투여를 통해 투여되는, 방법.

6. 단락 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 뇌실내 (ICV) 투여를 통해 투여되는, 방법.

7. 단락 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 인간 대상체의 총 뇌척수액 용적의 10%를 초과하지 않는 용적으로 투여되는, 방법.

8. 단락 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 인간 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

9. 단락 8에 있어서, 상기 면역 억제 요법은 (a) 타크로리무스 및 마이코페놀산, (b) 라파마이신 및 마이코페놀산, 또는 (c) 타크로리무스, 라파마이신, 및 코르티코스테로이드 예컨대 프레드니솔론 및/또는 메틸프레드니솔론의 조합을 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 인간 대상체에게 투여하고, 그 후에 계속하는 단계를 포함하는, 방법.

10. 단락 8 또는 9에 있어서, 상기 면역 억제 요법은 180일 후 중단되는, 방법.

11. 단락 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 인간 IDUA는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

12. 단락 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터가 하기 표에 따른 용량으로 투여되는, 방법.

도 1. 인간 IDUA의 아미노산 서열. 6개의 N-연결된 글리코실화 부위 (N)는 굵게 표시되고 밑줄이 그어져 있고; 하나의 티로신-O-황산화 부위 (Y)는 굵게 표시되고 밑줄이 그어져 있고, 전체 황산화 부위 서열 (ADTPIYNDEADPLVGWS)은 음영 처리되어 있고; 이황화 결합 (2개의 시스테인 잔기; C)은 굵게 표시되고 밑줄이 그어져 있다. CHO 세포에서 만들어진 분비된 재조합 산물의 N-말단은 A²⁶인 반면, 인간 간의 천연 세포내 효소의 N-말단은 E²⁷이다 (Kakkis 등, 1994, Prot Exp Purif 5: 225-232, p. 230 참조).
도 2. hIDUA와 공지된 오르토로그의 다중 서열 정렬. 서열은 Clustal X 버전 2를 사용하여 정렬되었다 (Larkin MA, 등, 2007, Clustal W 및 Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23(21):2947-2948). 종의 이름과 단백질 ID는 다음과 같다: 인간 (호모 사피엔스(Homo sapiens); NP_000194.2), 개 (캐니스 파밀리아리스(Canis familiaris); M81893.1), 소 (보스 타우루스(Bos taurus); XP_002688492.1), 마우스 (머스 머스쿨러스(Mus musculus); NP_032351.2), 래트 (래투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus); NP_001165555.1), 오리너구리 (오르니토린쿠스 아나티누스(Ornithorhynchus anatinus); XP_001514102.2), 닭 (갤러스 갤러스(Gallus gallus); NP_001026604.1), 제노푸스 (제노푸스 라에비스(Xenopus laevis); NP_001087031.1), 제브라피시 (다니오 레리오(Danio rerio); XP_001923689.3), 성게 (스트롱길로센트로투스 퍼푸라투스(Strongylocentrotus purpuratus); XP_796813.3) 유령멍게 (시오나 인테스티날리스(Ciona intestinalis); XP_002120937.1), 및 초파리 (드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster); NP_609489.1). 인간 단백질에서 N-글리코실화 부위 (N110, N190, N336, N372, T374, N415, N451); 기질 결합에 관련된 잔기 (R89, H91, N181, E182, H262, K264, E299, D349, 및 R363) 및 N372에서 N-글리칸과의 상호작용 (P54, H58, W306, S307, Y355, R368, 및 Q370)은 음영으로 표시된다. (다음에서 변경됨: Maita 등, 2013, PNAS 110: 14628-14633; Supplementary Material, Fig. S8).
도 3. MPS I 돌연변이, IDUA 및 표현형의 구조적 변화 (Saito 등, Mol Genet Metab 111:107-112, 표 3으로부터).
도 4. CHO 세포에 의해 분비되는 재조합 인간 α-L-이두로니다아제의 6개의 글리코실화 부위에 있는 올리고당. C, 복합; M, 고 만노스; P, 인산화된 고 만노스. 대문자는 잘 식별된 주요 올리고당을 나타내는 반면, 소문자는 소수이거나 불완전하게 특성화된 성분을 나타낸다 (Zhao 등, 1997, J Biol Chem 272: 22758-22765로부터).
도 5. AAV 캡시드 1 - 9 (서열 번호: 16-26)의 Clustal 다중 서열 정렬. 다른 정렬된 AAV 캡시드의 상응하는 위치에서 아미노산 잔기를 "동원"하여 AAV9 및 AAV8 캡시드에서 아미노산 치환 (하단 열에 굵게 표시됨)이 만들어질 수 있다. "HVR"로 지정된 서열 영역 = 초가변 영역.
도 6. AAV-작제물 1의 벡터 게놈의 개략도.

본 발명은 헐러, 헐러-샤이, 또는 샤이 증후군으로 진단된 환자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 점액다당류증 I (MPS I)로 진단된 인간 대상체의 중추 신경계의 뇌척수액 (CSF)에 완전히 인간-글리코실화된 (HuGly) α-L-이두로니다아제 (HuGlyIDUA)를 전달하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 치료는 유전자 요법을 통해, 예를 들어, MPS I로 진단된 환자 (인간 대상체)의 CSF에, 인간 IDUA (hIDUA) 또는 hIDUA의 유도체를 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 기타 DNA 발현 작제물을 투여하여 완전히 인간-글리코실화된 이식유전자 산물을 CNS에 지속적으로 공급하는 형질도입된 세포의 영구적인 데포가 생성됨으로써 달성된다. 상기 데포로부터 CSF로 분비된 HuGlyIDUA는 CNS의 세포에 의해 세포내 이입되어 수용 세포에서 효소 결함에 대한 "교차-보정"을 초래할 것이다. 대안적인 구현예에서, HuGlyIDUA는 세포 배양으로 생성될 수 있고, 효소 대체 요법 ("ERT")으로, 예를 들어, 효소를 주입함으로써 투여될 수 있다. 그러나 유전자 치료 접근법은 ERT에 비해 몇 가지 이점을 제공하며, 즉 효소가 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 없기 때문에 효소의 전신 전달은 CNS 치료로 이어지지 않을 것이며; 본 발명의 유전자 치료 접근법과는 달리, 효소를 CNS로 직접 전달하는 것은 부담이 될뿐만 아니라 감염 위험이 있는 반복 주사를 필요로 할 것이다.

이식유전자에 의해 인코딩된 HuGlyIDUA는 서열 번호 1 (도 1에 도시됨)의 아미노산 서열을 갖는 인간 IDUA (hIDUA), 및 예를 들어, 도 2에 도시된 IDUA의 오르토로그에서 상응하는 비-보존 잔기로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가가 있는 hIDUA의 유도체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않고, 단 이러한 돌연변이는 도 3에 도시된 (그 전문이 본원에 참조로 포함된, Saito 등, 2014, Mol Genet Metab 111:107-112, 표 3 목록 57 MPS I 돌연변이로부터) 중증, 중증-중간, 중간 또는 약화된 MPS I 표현형으로 식별되거나; 또는 문헌(Venturi 등, 2002, 인간 Mutation #522 Online ("Venturi 2002"), 또는 Bertola 등, 2011 인간 Mutation 32:E2189-E2210 ("Bertola 2011"), 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 보고된 어떤 것도 포함하지 않는다.

바람직하게는, rHuGlyIDUA 이식유전자는 뉴런 및/또는 신경아교 세포에서 기능하는 발현 조절 요소, 예를 들어, CB7 프로모터 (닭 β-액틴 프로모터 및 CMV 인핸서)에 의해 조절되어야 하고, 벡터에 의해 구동되는 이식유전자의 발현을 향상시키는 다른 발현 조절 요소 (예를 들어, 닭 β-액틴 인트론 및 토끼 β-글로빈 폴리 A 신호)를 포함할 수 있다. huIDUA 이식유전자에 대한 cDNA 작제물은 형질도입된 CNS 세포에 의한 적절한 동시 번역 처리 및 번역 후 처리 (글리코실화 및 단백질 황산화)를 보장하는 신호 펩티드에 대한 코딩 서열을 포함해야 한다. CNS 세포에 의해 사용되는 이러한 신호 펩티드는 다음을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다:

ㆍ 희소돌기아교세포-미엘린 당단백질 (hOMG) 신호 펩티드:

MEYQILKMSLCLFILLFLTPGILC (서열 번호:2)

ㆍ E1A-자극 유전자 2의 세포 억제인자 (hCREG2) 신호 펩티드:

MSVRRGRRPARPGTRLSWLLCCSALLSPAAG (서열 번호:3)

ㆍ V-세트 및 막횡단 도메인 함유 2B (hVSTM2B) 신호 펩티드:

MEQRNRLGALGYLPPLLLHALLLFVADA (서열 번호:4)

ㆍ 프로토카데린(Protocadherin) 알파-1 (hPCADHA1) 신호 펩티드:

MVFSRRGGLGARDLLLWLLLLAAWEVGSG (서열 번호:5)

ㆍ FAM19A1 (TAFA1) 신호 펩티드:

MAMVSAMSWVLYLWISACA (서열 번호:6)

ㆍ 인터류킨-2 신호 펩티드:

MYRMQLLSCIALILALVTNS (서열 번호:14)

이식유전자를 전달하는 데 사용되는 재조합 벡터는 뉴런 및/또는 신경아교 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 CNS의 세포에 대한 향성을 가져야 한다. 이러한 벡터는 비-복제 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터 ("rAAV")를 포함할 수 있으며, 특히 AAV9 또는 AAVrh10 캡시드를 갖는 것이 바람직하다. 그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 7,906,111의 윌슨(Wilson)에 의해 설명된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는 AAV 변이체 캡시드; 뿐만 아니라 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 번호 8,628,966, 미국 특허 번호 8,927,514의 채터지 및 문헌(Smith 등, 2014, Mol Ther 22: 1625-1634)에 설명된 AAV 변이체 캡시드가 사용될 수 있으며, AAV/hu.31 및 AAV/hu.32가 특히 바람직하다. 그러나, 렌티바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 또는 "네이키드 DNA" 작제물로 지칭되는 비-바이러스 발현 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 바이러스 벡터가 사용될 수 있다 (섹션 5.2 참조).

CSF에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물은 생리적으로 적합한 수성 완충액, 계면활성제 및 선택적 부형제를 포함하는 제형 완충액 중의 rHuGlyIDUA 벡터의 현탁액을 포함한다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 경막내 투여에 적합하다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 수조내 투여 (대조로 주사)에 적합하다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 C1-2 천자를 통해 지주막하 공간으로 주사하기에 적합하다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 경막내 투여에 적합하다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 뇌실내 투여에 적합하다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 요추 천자를 통한 투여에 적합하다.

치료학적 유효 용량의 재조합 벡터는 경막내 투여 (즉, 재조합 벡터가 CSF를 통해 분포하고 CNS에서 세포를 형질도입시키도록 지주막하 공간으로의 주사)를 통해 CSF에 투여되어야 한다. 이는 여러 가지 방법으로, 예를 들어, 두개내 (수조 또는 뇌실) 주사 또는 요추 수조로의 주사에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어 수조내 (IC) 주사 (대조로)는 CT-유도 후두하 천자에 의해 수행될 수 있거나; 지주막하 공간으로의 주사는 환자에게 가능할 때 C1-2 천자를 통해 수행될 수 있거나; 또는 CSF에 접근하기 위해 요추 천자 (전형적으로 CSF 샘플을 수집하기 위해 수행되는 진단 절차)가 사용될 수 있다. 대안적으로, 재조합 벡터를 뇌의 뇌실에 직접 주입하기 위해 뇌실내 (ICV) 투여 (혈액-뇌 장벽을 통과하지 않는 항감염 또는 항암 약물의 도입에 사용되는 보다 침습적인 기술)를 사용할 수 있다. 대안적으로, 재조합 벡터를 CNS에 투여하기 위해 비강내 투여를 사용할 수 있다. 적어도 9.25 μg/mL의 C_min에서 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 유지하거나 9.25 내지 277 μg/mL 범위의 농도를 유지하는 용량을 사용해야 한다.

본 발명은 부분적으로 다음의 원리에 기초한다:

(i) CNS의 뉴런 및 신경아교 세포는 CNS의 강력한 프로세스인, 글리코실화 및 티로신-O-황산화를 포함하는, 분비된 단백질의 번역 후 처리를 위한 세포 기구를 보유한 분비 세포이다. 예를 들어, 인간의 뇌 만노스-6-포스페이트 (M6P) 글리코프로테옴을 설명하고, 뇌에는 다른 조직에서 발견되는 것보다 훨씬 더 많은 수의 개별 이소형 및 만노스-6-인산화 단백질을 갖는 더 많은 단백질을 함유하고 있음에 주목하는 Sleat 등, 2005, Proteomics 5: 1520-1532, 및 Sleat 1996, J Biol Chem 271: 19191-98; 및 뉴런 세포에서 분비되는 티로신-황산화 당단백질의 생성을 보고하는 Kanan 등, 2009, Exp. Eye Res. 89: 559-567 및 Kanan & Al-Ubaidi, 2015, Exp. Eye Res. 133: 126-131을 참조하며, 이들 각각은 인간 CNS 세포에 의해 이루어진 번역 후 변형에 대해 그 전문이 참조로 포함된다.

(iii) 리소좀 단백질의 세포 및 세포하 수송/흡수는 M6P를 통해 이루어진다. 이두로네이트-2-설파타아제 효소에 대해 다니엘 2002에서 수행된 바와 같이, 분비된 단백질의 M6P 함량을 측정하는 것이 가능하다. 억제성 M6P (예를 들어, 5 mM)의 존재 하에, 다니엘 2002의 유전적으로 조작된 신장 세포와 같은 비-뉴런 또는 비-신경아교 세포에 의해 생성된 효소 전구체의 흡수는 다니엘 2002에서 보여준 바와 같이 대조 세포의 수준에 가까운 수준으로 감소할 것으로 예상된다. 억제성 M6P가 존재하는 동안, 뉴런 및 신경아교 세포와 같은 뇌 세포에 의해 생성된 효소 전구체의 흡수는 다니엘 2002에서 보여준 바와 같이 높은 수준으로 유지될 것으로 예상되며, 여기서 흡수는 대조 세포보다 4배 더 높았고, 억제성 M6P의 존재 없이 유전적으로 조작된 신장 세포에 의해 생성된 효소 전구체의 효소 활성 (또는 흡수) 수준과 비슷하였다. 이 분석을 통해 뇌 세포에 의해 생성된 효소 전구체의 M6P 함량을 예측하고, 특히 상이한 유형의 세포에 의해 생성된 효소 전구체의 M6P 함량을 비교할 수 있다. 본원에 기재된 유전자 치료 접근법은 이러한 분석에서 억제성 M6P의 존재 하에 높은 수준으로 뉴런 및 신경아교 세포로 흡수될 수 있는 hIDUA의 지속적인 분비를 초래해야 한다.

(iv) N-연결된 글리코실화 부위 이외에, hIDUA는 결합 및 활성에 필요한 N³⁷²를 함유하는 도메인 근처에 티로신 ("Y") 황산화 부위 (ADTPIY²⁹⁶NDEADPLVGWS)를 함유한다. (예를 들어, 단백질 티로신 황산화를 겪는 티로신 잔기를 둘러싼 아미노산의 분석을 위해 그 전문이 참조로 포함된 Yang 등, 2015, Molecules 20:2138-2164, esp. at p. 2154를 참조한다. "규칙"은 다음과 같이 요약될 수 있다: Y의 +5 내지 -5 위치 내에 E 또는 D가 있고, Y의 위치 -1이 중성 또는 산성 하전된 아미노산이지만, 황산화를 무효화하는 염기성 아미노산, 예를 들어, R, K, 또는 H가 아닌 Y 잔기). 어떤 이론에도 구속되는 것은 아니지만, 티로신-황산화 영역 (예를 들어, W306L) 내의 돌연변이가 효소 활성 및 질환 감소와 관련이 있는 것으로 알려져 있기 때문에 hIDUA에서 이 부위의 황산화가 활성에 결정적일 수 있다. (Maita 등, 2013, PNAS 110:14628, pp. 14632-14633 참조).

(v) CNS의 인간 세포에 의한 hIDUA의 글리코실화는 안정성, 반감기를 개선하고, 이식유전자 산물의 원치 않는 응집을 감소시킬 수 있는 글리칸의 첨가를 초래할 것이다. 유의하게도, 본 발명의 HuGlyIDUA에 첨가되는 글리칸은 2,6-시알산을 포함하는 고도로 처리된 복합형 바이안테너리 N-글리칸으로, Neu5Ac ("NANA")를 포함하지만 이의 하이드록실화 유도체인 NeuGc (N-글리콜릴뉴라민산, 즉, "NGNA" 또는 "Neu5Gc")는 포함하지 않는다. 이러한 글리칸은 이 번역 후 변형을 만드는 데 필요한 2,6-시알릴트랜스퍼라아제를 갖지 않고, 이등분 GlcNAc를 생성하지도 않는 CHO 세포에서 만들어진 라로니다아제에 존재하지 않지만, 이는 Neu5Ac (NANA) 대신 인간에게 전형적이지 않은 (그리고 잠재적으로 면역원성인) 시알산으로 Neu5Gc (NGNA)를 추가한다. 예를 들어, Dumont 등, 2016, Critical Rev, Biotech 36(6):1110-1122 (Early Online pp. 1-13, p. 5); 및 Hague 등, 1998 Electrophor 19:2612-2630 ("CHO 세포주는 α2,6-시알릴-트랜스퍼라아제가 없기 때문에 글리코실화 측면에서 '표현형적으로 제한되는' 것으로 간주됨")을 참조한다. 더욱이, CHO 세포는 또한 α-Gal 항원인, 면역원성 글리칸을 생성할 수 있으며, 이는 대부분의 개체에 존재하는 항-α-Gal 항체와 반응하며, 고농도에서는 아나필락시스를 유발할 수 있다. 예를 들어, Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156을 참조한다. 본 발명의 HuGlyIDUA의 인간 글리코실화 패턴은 이식유전자 산물의 면역원성을 감소시키고 효능을 개선해야 한다.

(vi) 인간 CNS 세포에서 강력한 번역 후 과정인 hIDUA의 티로신-황산화는 이식유전자 산물의 처리 및 활성을 개선시켜야 한다. 리소좀 단백질의 티로신-황산화의 중요성은 밝혀지지 않았지만; 다른 단백질에서는 단백질-단백질 상호작용 (항체 및 수용체)의 결합력을 높이고, 단백질분해 처리 (펩티드 호르몬)를 촉진하는 것으로 나타났다. (Moore, 2003, J Biol. Chem. 278:24243-46; 및 Bundegaard 등, 1995, The EMBO J 14: 3073-79 참조). 티로신-황산화 (IDUA 처리의 마지막 단계로 발생할 수 있음)를 담당하는 티로실단백질 설포트랜스퍼라아제 (TPST1)는 명백하게 뇌에서 더 높은 수준 (mRNA 기반)으로 발현된다 (예를 들어, http://www.ebi.ac.uk/gxa/home에서 액세스할 수 있는 EMBL-EBI Expression Atlas에서 TPST1에 대한 유전자 발현 데이터를 확인할 수 있음). 이러한 번역 후 변형은 CHO 세포 산물인 라로니다아제에서 기껏해야 과소 표현된다. 인간 CNS 세포와 달리, CHO 세포는 분비 세포가 아니며, 번역 후 티로신-황산화에 대한 능력이 제한된다. (예를 들어, Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537, esp. p. 1537에 토론, 참조).

(vii) 이식유전자 산물의 면역원성은 환자의 면역 상태, 주입된 단백질 약물의 구조 및 특성, 투여 경로, 치료 기간을 포함하는 다양한 요인에 의해 유도될 수 있다. 공정-관련 불순물, 예컨대 숙주 세포 단백질 (HCP), 숙주 세포 DNA 및 화학적 잔류물, 및 생성물-관련 불순물, 예컨대 단백질 분해물 및 구조적 특성, 예컨대 글리코실화, 산화 및 응집 (미가시 입자)은 면역 반응을 향상시키는 보조제 역할을 하여 면역원성을 높일 수도 있다. 공정-관련 및 생성물-관련 불순물의 양은 제조 공정, 즉 세포 배양, 정제, 제형화, 저장 및 취급에 의해 영향을 받을 수 있으며, 이는 상업적으로 제조된 IDUA 산물에 영향을 미칠 수 있다. 유전자 요법에서 단백질은 생체내에서 생성되므로 공정-관련 불순물이 존재하지 않으며, 단백질 산물은 단백질 응집 및 단백질 산화와 같은 재조합 기술에 의해 생성된 단백질과 관련된 생성물-관련 불순물/분해물을 함유하지 않을 가능성이 높다. 예를 들어, 응집은 높은 단백질 농도, 제조 장비 및 용기와의 표면 상호작용, 및 특정 완충 시스템을 사용한 정제 공정으로 인해 단백질 생산 및 저장과 관련이 있다. 그러나 응집을 촉진하는 이러한 조건은 이식유전자가 생체내에서 발현될 때 존재하지 않는다. 메티오닌, 트립토판 및 히스티딘 산화와 같은 산화는 또한, 예를 들어, 스트레스 세포 배양 조건, 금속 및 공기 접촉, 완충액 및 부형제 중의 불순물로 인해 발생하는 단백질 생산 및 저장과 관련이 있다. 생체내에서 발현되는 단백질은 스트레스 조건에서도 산화될 수 있지만, 많은 유기체와 마찬가지로 인간은 산화 스트레스를 감소시킬뿐만 아니라 산화를 복구 및/또는 역전시킬 수 있는 항산화 방어 시스템을 갖추고 있다. 따라서, 생체내에서 생성된 단백질은 산화된 형태일 가능성이 없다. 응집과 산화 모두 효능, PK (제거율)에 영향을 미칠 수 있으며 면역원성 우려를 증가시킬 수 있다. 본원에 기재된 유전자 치료 접근법은 상업적으로 제조된 제품에 비해 면역원성을 감소시키면서 hIDUA의 지속적인 분비를 초래해야 한다.

전술한 이유로, HuGlyIDUA의 생산은 유전자 요법을 통해, 예를 들어, MPS I 질환 (헐러, 헐러-샤이 또는 샤이를 포함하지만 이에 제한되지 않음)으로 진단된 환자 (인간 대상체)의 CSF에, HuGlyIDUA를 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 기타 DNA 발현 작제물을 투여하여 형질도입된 CNS 세포에 의해 분비된 완전히 인간-글리코실화된, 만노스-6-인산화된, 황산화된 이식유전자 산물을 지속적으로 공급하는 CNS의 영구적인 데포가 생성됨으로써 달성되는 MPS I의 치료를 위한 "바이오베터" 분자를 생성해야 한다. 상기 데포로부터 CSF로 분비된 HuGlyIDUA 이식유전자 산물은 CNS의 세포에 의해 세포내 이입되어 MPS I 수용 세포에서 효소 결함에 대한 "교차-보정"을 초래할 것이다.

유전자 요법에 대한 대안 또는 추가 치료로서, rHuGlyIDUA 당단백질이 재조합 DNA 기술에 의해 인간 세포주에서 생산될 수 있으며, 상기 당단백질은 MPS I로 진단된 환자에게 전신적으로 및/또는 ERT를 위해 CSF로 투여될 수 있다. 이러한 재조합 당단백질 생산에 사용될 수 있는 인간 세포주는 HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, ReNcell VM, 인간 배아 신장 293 세포 (HEK293), 섬유육종 HT-1080, HKB-11, CAP, HuH-7, 및 망막 세포주, PER.C6 또는 RPE 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, rHuGlyIDUA 당단백질의 재조합 생산에 사용될 수 있는 인간 세포주에 대한 검토를 위해 그 전문이 참조로 포함된 Dumont 등, 2016, Biotech의 Critical Rev 36(6):1110-1122 "Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives" 참조). 완전한 글리코실화, 특히 시알릴화 및 티로신-황산화를 보장하기 위해, 생산에 사용되는 세포주는 α-2,6-시알릴트랜스퍼라아제 (또는 α-2,3- 및 α-2,6-시알릴트랜스퍼라아제 둘 모두) 및/또는 티로신-O-황산화를 담당하는 TPST-1 및 TPST-2 효소를 공동 발현하도록 숙주 세포를 조작함으로써 강화될 수 있다.

따라서, 바람직한 구현예에서, 특히 IDUA 수준이 0에 가까운 중증 질환 (예를 들어, 헐러) 환자를 치료할 때 면역 억제 요법으로 환자를 공동 치료하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 마이코페놀산과 함께 및/또는 프레드니솔론 및/또는 메틸프레드니솔론과 같은 코르티코스테로이드, 또는 조직 이식 절차에 사용되는 다른 면역 억제 요법과 함께 타크로리무스 또는 라파마이신 (시롤리무스) 요법을 포함하는 면역 억제 요법이 사용될 수 있다. 이러한 면역 억제 치료는 유전자 치료 과정 동안 투여될 수 있고, 특정 구현예에서 면역 억제 요법을 통한 사전 치료가 바람직할 수 있다. 면역 억제 요법은 치료 의사의 판단에 따라 유전자 요법 치료 후 계속될 수 있으며, 이후 면역 관용이 유도되면; 예를 들어, 180일 후 중단될 수 있다.

일 구현예에서, 면역 억제는 선택적으로 MMF와 함께 투여되는, 프레드니솔론 및/또는 메틸프레드니솔론과 같은 코르티코스테로이드 및 일군의 타크로리무스 및/또는 시롤리무스의 투여를 포함한다. 예를 들어, 메틸프레드니솔론과 같은 코르티코스테로이드를 1회 주사한 후 경구 코르티코스테로이드를 투여하고, 12주에 걸쳐 점점 줄인 후 중단한다. 동시에, 타크로리무스 및 시롤리무스가 24 내지 48주에 걸쳐 저용량 (예를 들어, 4 내지 8 ng/mL의 혈청 농도를 유지함)으로 조합하여 경구 투여되거나 표지 용량으로 단독으로 투여될 수 있다. 타크로리무스 또는 시롤리무스는 MMF와 함께 표지 용량으로 투여될 수도 있다. 따라서, 환자에게 즉시 이용 가능한 초기 스테로이드 주사를 투여한 후 경구 투여를 통해 이 스테로이드를 유지하고, 12주까지 점점 줄인다. 48주 동안 추가 면역 억제는 선택적으로 MMF와 함께 타크로리무스 및/또는 시롤리무스에 의해 유지된다.

일 측면에서, 점액다당류증 I (MPS I)로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 인간 뉴런 세포에 의해 생성된 재조합 인간 α-L-이두로니다아제 (IDUA)의 치료적 유효량을 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계를 포함하고, 인간 IDUA는 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 투여에 의해 전달되고, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량으로 투여되고, 뇌 질량은 대상체의 뇌의 뇌 자기 공명 영상 (MRI)에 의해 결정되는, 방법이 본원에 제공된다.

또 다른 측면에서, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 인간 뉴런 세포에 의해 생성된 재조합 인간 α-L-이두로니다아제 (IDUA)의 치료적 유효량을 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계를 포함하고, 인간 IDUA를 전달하는 단계는 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량으로 투여하는 단계를 포함하고, 뇌 질량은 대상체의 뇌의 뇌 MRI에 의해 결정되는, 방법이 본원에 제공된다.

또 다른 측면에서, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 인간 신경아교 세포에 의해 생성된 재조합 인간 IDUA의 치료적 유효량을 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계를 포함하고, 인간 IDUA는 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 투여에 의해 전달되고, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량으로 투여되고, 뇌 질량은 대상체의 뇌의 뇌 MRI에 의해 결정되는, 방법이 본원에 제공된다.

또 다른 측면에서, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 인간 신경아교 세포에 의해 생성된 재조합 인간 IDUA의 치료적 유효량을 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계를 포함하고, 인간 IDUA를 전달하는 단계는 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량으로 투여하는 것을 포함하고, 뇌 질량은 대상체의 뇌의 뇌 MRI에 의해 결정되는, 방법이 본원에 제공된다.

일 측면에서, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 뇌 MRI로부터 대상체의 뇌 질량을 결정하는 단계, 및 후속적으로 인간 뉴런 세포에 의해 생성된 재조합 인간 IDUA의 치료적 유효량을 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계를 포함하고, 인간 IDUA는 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 투여에 의해 전달되고, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량으로 투여되는, 방법이 본원에 제공된다.

일 측면에서, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 뇌 MRI로부터 대상체의 뇌 질량을 결정하는 단계, 및 후속적으로 인간 신경아교 세포에 의해 생성된 재조합 인간 IDUA의 치료적 유효량을 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계를 포함하고, 인간 IDUA는 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 투여에 의해 전달되고, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량으로 투여되는, 방법이 본원에 제공된다.

일 측면에서, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, (a) 대상체의 뇌 MRI로부터 대상체의 뇌 질량을 결정하는 단계, (b) 인간 대상체의 뇌 질량을 기반으로 한 용량을 계산하는 단계, 및 (c) 후속적으로 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 상기 용량을 대상체의 뇌의 뇌척수액에 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다.

바람직한 구현예에서, 인간 IDUA 이식유전자 산물은 CNS에서 세포에 의한 세포내 이입일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 인간 IDUA 이식유전자 산물은 CNS의 세포의 리소좀에 전달된다.

본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 인간 대상체의 뇌 질량은 cm³의 인간 대상체의 뇌 용적과 1.046 g/cm³의 인수를 곱셈함으로써 인간 대상체의 뇌 용적으로부터 전환되고, 여기서 인간 대상체의 뇌 용적은 인간 대상체의 뇌 MRI로부터 수득된다. 본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 본 방법은 인간 대상체의 뇌 MRI로부터 인간 대상체의 뇌 용적을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 본 방법은 cm³의 인간 대상체의 뇌 용적과 1.046 g/cm³의 인수를 곱셈함으로써 인간 대상체의 뇌 용적으로부터 인간 대상체의 뇌 질량을 전환시키는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 본 방법은 인간 대상체의 뇌 MRI로부터 인간 대상체의 뇌 용적을 수득하는 단계, 및 cm³의 인간 대상체의 뇌 용적과 1.046 g/cm³의 인수를 곱셈함으로써 인간 대상체의 뇌 용적으로부터 인간 대상체의 뇌 질량을 전환시키는 단계를 추가로 포함한다.

본원에 기재된 치료하는 방법의 일부 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 수조내 (IC) 투여를 통해 투여된다. 본원에 기재된 치료하는 방법의 다른 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 뇌실내 (ICV) 투여를 통해 투여된다.

본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 본 방법은 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 인간 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 추가로 포함한다.

본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 액체 조성물이다. 본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 냉동된 조성물이다. 본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 동결건조된 조성물 또는 재구성된 동결건조된 조성물이다.

본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 본원에 제공된 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 IC 또는 ICV 투여를 위한 다양한 투여 형태로 제형화될 수 있다. 본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 본원에 제공된 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 단위-투여 형태 또는 다중-투여 형태로 제공될 수 있다. 단위-투여 형태는, 본원에 사용된 경우에, 인간 및 동물 대상체에 투여에 적합한, 그리고 당업계에서 알려진 대로 개별적으로 패키징된 물리적으로 별개 단위를 지칭한다. 각 단위-용량은, 요구된 약제학적 담체 또는 부형제와 공동으로, 원하는 치효적 효과를 생성하기에 충분한 소정량의 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터 및/또는 다른 구성성분(들)을 함유한다. 단위-투여 형태의 예는 앰풀, 바이알, 사전충전형 주사기, 또는 카트리지를 포함한다. 본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 단위-투여 형태는 이의 분수 또는 배수로 투여될 수 있다. 본원에 기재된 치료하는 방법의 특정 구현예에서, 다중-투여 형태는 격리된 단위-투여 형태로 투여될 단일 용기에 패키징된 복수의 동일한 단위-투여 형태이다. 다중-투여 형태의 예는 바이알, 사전충전형 주사기, 또는 카트리지를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 6.5×　10¹²GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 7.5×　10¹²GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 8.5×　10¹²GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 9.75×　10¹²GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 9.8×　10¹²GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 1.12×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 1.1×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 1.3×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 3.25×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 3.3×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 3.75×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 3.8×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 4.25×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 4.3×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 4.88×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 4.9×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 5.0×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 6.5×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 6.5×　10¹²GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 7.5×　10¹²GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 8.5×　10¹²GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 9.75×　10¹²GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 9.8×　10¹²GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 1.12×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 1.1×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 1.3×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 3.25×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 3.3×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 3.75×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 3.8×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 4.25×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 4.3×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 4.88×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 4.9×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 5×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 사전충전형 주사기는 약 6.5×　10¹³GC의 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터를 포함한다.

특정 구현예에서, 인간 뉴런 세포에 의해 생성된 재조합 인간 IDUA의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계를 포함하는, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 인간 신경아교 세포에 의해 생성된 재조합 인간 IDUA의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계를 포함하는, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

특정 구현예에서, 치료적 유효량의 α2,6-시알릴화된 인간 α-L-이두로니다아제 (IDUA)를 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계; 및 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 포함하는, 점액다당류증 I (MPS I)로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

특정 구현예에서, 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 글리코실화된 인간 IDUA의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계; 및 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 포함하는, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

특정 구현예에서, 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 글리코실화된 인간 IDUA의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계; 및 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 포함하는, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

특정 구현예에서, 티로신-황산화를 함유하는 인간 IDUA의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계; 및 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 상기 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 포함하는, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

특정 구현예에서, 인간 IDUA를 인코딩하는 발현 벡터를 상기 인간 대상체의 뇌에 투여하는 단계로서, 상기 IDUA는 인간 불멸화된 뉴런 세포에서 상기 발현 벡터로부터 발현시 α2,6-시알릴화되는 단계; 및

발현 벡터의 투여 전 또는 동시에 상기 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 포함하는, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

특정 구현예에서, 인간 IDUA를 인코딩하는 발현 벡터를 상기 인간 대상체의 뇌에 투여하는 단계로서, 상기 IDUA는 글리코실화되지만 인간 불멸화된 뉴런 세포에서 상기 발현 벡터로부터 발현시 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 단계; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 동시에 상기 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 포함하는, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

특정 구현예에서, 단계 a) 인간 IDUA를 인코딩하는 발현 벡터를 상기 인간 대상체의 뇌에 투여하는 단계로서, 상기 인간 IDUA는 글리코실화되지만 인간 또는 불멸화된 뉴런 세포에서 상기 발현 벡터로부터 발현시 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 단계; 및 단계 b) 발현 벡터의 투여 전 및/또는 동시에 및/또는 후에 상기 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 포함하는, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

특정 구현예에서, 인간 IDUA를 인코딩하는 발현 벡터를 상기 인간 대상체의 뇌에 투여하는 단계로서, 상기 IDUA는 인간 불멸화된 뉴런 세포에서 상기 발현 벡터로부터 발현시 티로신-황산화되는 단계; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 동시에 상기 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 포함하는, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

특정 구현예에서, 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 투여하여 α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유하는 상기 IDUA를 방출하는 데포가 형성되도록 하는 단계; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 동시에 상기 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 포함하는, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

특정 구현예에서, 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 투여하여 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 글리코실화된 인간 IDUA를 방출하는 데포가 형성되도록 하는 단계; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 동시에 상기 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 포함하는, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

특정 구현예에서, 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 투여하여 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 글리코실화된 인간 IDUA를 방출하는 데포가 형성되도록 하는 단계; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 동시에 상기 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 포함하는, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

특정 구현예에서, 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 투여하여 티로신-황산화를 함유하는 상기 IDUA를 방출하는 데포가 형성되도록 하는 단계; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 동시에 상기 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 포함하는, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

특정 구현예에서, α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유하는 상기 IDUA의 생산은 세포 배양에서 인간 뉴런 세포주를 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터로 형질도입시킴으로써 확인된다. 특정 구현예에서, 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 상기 글리코실화된 IDUA의 생산은 세포 배양에서 인간 뉴런 세포주를 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터로 형질도입시킴으로써 확인된다. 특정 구현예에서, 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 상기 글리코실화된 IDUA의 생산은 세포 배양에서 인간 뉴런 세포주를 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터로 형질도입시킴으로써 확인된다. 특정 구현예에서, 티로신-황산화를 함유하는 상기 IDUA의 생산은 세포 배양에서 인간 뉴런 세포주를 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터로 형질도입시킴으로써 확인된다. 특정 구현예에서, IDUA 이식유전자는 신호 펩티드를 인코딩한다. 특정 구현예에서, 인간 뉴런 세포주는 HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, 또는 ReNcell VM이다.

특정 구현예에서, 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 투여하여 α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유하는 상기 IDUA를 방출하는 데포가 형성되도록 하는 단계; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 동시에 상기 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 포함하는, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되며; 여기서 상기 재조합 벡터는, 배양에서 인간 뉴런 세포를 형질도입시키는 데 사용되는 경우, 상기 세포 배양에서 α2,6-시알릴화된 글리칸을 함유하는 상기 IDUA의 생산을 초래한다. 특정 구현예에서, 인간 뉴런 세포는 HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, 또는 ReNcell VM 세포이다.

특정 구현예에서, 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 투여하여 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 글리코실화된 IDUA를 방출하는 데포가 형성되도록 하는 단계; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 동시에 상기 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 포함하는, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되며; 여기서 상기 재조합 벡터는, 배양에서 인간 뉴런 세포를 형질도입시키는 데 사용되는 경우, 글리코실화되지만 상기 세포 배양에서 검출 가능한 NeuGc를 함유하지 않는 상기 IDUA의 생산을 초래한다. 특정 구현예에서, 인간 뉴런 세포는 HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, 또는 ReNcell VM 세포이다.

특정 구현예에서, 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 투여하여 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 글리코실화된 IDUA를 방출하는 데포가 형성되도록 하는 단계; 및 발현 벡터의 투여 전 또는 동시에 상기 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 포함하는, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되며; 여기서 상기 재조합 벡터는, 배양에서 인간 뉴런 세포를 형질도입시키는 데 사용되는 경우, 글리코실화되지만 상기 세포 배양에서 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 항원을 함유하지 않는 상기 IDUA의 생산을 초래한다. 특정 구현예에서, 인간 뉴런 세포는 HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, 또는 ReNcell VM 세포이다.

특정 구현예에서, 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 치료적 유효량을 상기 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 투여하여 티로신-황산화를 함유하는 상기 IDUA를 방출하는 데포가 형성되도록 하는 단계;　및 발현 벡터의 투여 전 또는 동시에 상기 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 포함하는, MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되며; 여기서 상기 재조합 벡터는, 배양에서 인간 뉴런 세포를 형질도입시키는 데 사용되는 경우, 상기 세포 배양에서 티로신-황산화되는 상기 IDUA의 생산을 초래한다. 특정 구현예에서, 인간 뉴런 세포는 HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, 또는 ReNcell VM 세포이다.

특정 구현예에서, 인간 IDUA는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 억제 요법은 (a) 타크로리무스 및 마이코페놀산, 또는 (b) 라파마이신 및 마이코페놀산의 조합을 인간 IDUA 치료 전 또는 동시에 상기 대상체에게 투여하고, 그 후에 계속하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 억제 요법은 180일 후 중단된다.

바람직한 구현예에서, 글리코실화된 IDUA는 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal을 함유하지 않는다. 본원에 사용된 "검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal"이라는 문구는 당 업계에 공지된 표준 분석 방법에 의해 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal 모이어티를 의미한다. 예를 들어, NeuGc는, NeuGc를 검출하는 방법에 대한 참조로 본원에 포함된, 문헌(Hara 등, 1989, "Highly Sensitive Determination of N-Acetyl-and N-Glycolylneuraminic Acids in 인간 Serum and Urine and Rat Serum by Reversed-Phase Liquid Chromatography with Fluorescence Detection." J. Chromatogr., B: Biomed. 377: 111-119,)에 따라 HPLC에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, NeuGc는 질량 분석법에 의해 검출될 수 있다. α-Gal은 ELISA (예를 들어, Galili 등, 1998, "A sensitive assay for measuring alpha-Gal epitope expression on cells by a monoclonal anti-Gal antibody." Transplantation. 65(8):1129-32 참조) 또는 질량 분석법 (예를 들어, Ayoub 등, 2013, "Correct primary structure assessment and extensive glyco-profiling of cetuximab by a combination of intact, middle-up, middle-down and bottom-up ESI and MALDI mass spectrometry techniques." Landes Bioscience. 5(5): 699-710 참조)을 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 문헌(Platts-Mills 등, 2015, "Anaphylaxis to the Carbohydrate Side-Chain Alpha-gal" Immunol Allergy Clin North Am. 35(2): 247-260)에 인용된 참고문헌을 참조한다.

본원에 사용된 경우에, 용어 "약"은 주어진 값 또는 범위의 더하기 또는 빼기 10% 이내를 의미한다. 특정 구현예에서, 용어 "약"은 주어진 값 또는 범위의 더하기 또는 빼기 1% 이내를 의미하고, 여기서 값은 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량이고, 여기서 뇌 질량은 대상체의 뇌의 뇌 MRI에 의해 결정된다. 특정 구현예에서, 용어 "약"은 주어진 값 또는 범위의 더하기 또는 빼기 2% 이내를 의미하고, 여기서 값은 대상체의 뇌의 뇌 MRI에 의해 결정되는 용량이고, 여기서 뇌 질량은 대상체의 뇌의 뇌 MRI에 의해 결정된다. 특정 구현예에서, 용어 "약"은 주어진 값 또는 범위의 더하기 또는 빼기 5% 이내를 의미하고, 여기서 값은 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량이고, 여기서 뇌 질량은 대상체의 뇌의 뇌 MRI에 의해 결정된다. 특정 구현예에서, 용어 "약"은 주어진 값 또는 범위의 더하기 또는 빼기 7% 이내를 의미하고, 여기서 값은 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량이고, 여기서 뇌 질량은 대상체의 뇌의 뇌 MRI에 의해 결정된다. 특정 구현예에서, 용어 "약"은 주어진 값 또는 범위의 더하기 또는 빼기 10% 이내를 의미하고, 여기서 값은 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량이고, 여기서 뇌 질량은 대상체의 뇌의 뇌 MRI에 의해 결정된다. 하지만, 본 명세서에서, 용어 "약"이 또한 상기 용어가 연결되는 정확한 값의 인용에 대한 지원을 제공하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어 "약 10"은 정확히 숫자 "10"에 대한 지원을 제공한다.

5.1 N- 글리코실화 및 티로신 황산화

5.1.1. N-글리코실화

CNS의 뉴런 및 신경아교 세포는 글리코실화 및 티로신-O-황산화를 포함하는, 분비된 단백질의 번역 후 처리를 위한 세포 기구를 보유한 분비 세포이다. hIDUA는 도 1에서 식별된 6개의 아스파라진 ("N") 글리코실화 부위 (N¹¹⁰FT; N¹⁹⁰VS; N³³⁶TT; N³⁷²NT; N⁴¹⁵HT; N⁴⁵¹RS)를 갖는다. N³⁷²의 N-글리코실화는 기질과의 결합 및 효소 활성에 필요하며, 만노스-6-인산화는 분비된 효소의 세포 흡수 및 MPS I 세포의 교차-보정에 필요하다. N-연결된 글리코실화 부위는 복합, 고 만노스 및 인산화된 만노스 탄수화물 모이어티를 함유하지만 (도 4), 분비된 형태만이 세포에 흡수된다. 본원에 기재된 유전자 치료 접근법은 2,6-시알릴화 및 만노스-6-인산화된 IDUA 당단백질의 지속적인 분비를 초래해야 한다. 분비된 글리코실화된/인산화된 IDUA는 CNS에서 형질도입되지 않은 신경 및 신경아교 세포에 의해 흡수되고 올바르게 처리되어야 한다.

CNS의 인간 세포에 의한 hIDUA의 글리코실화는 안정성, 반감기를 개선하고, 이식유전자 산물의 원치 않는 응집을 감소시킬 수 있는 글리칸의 첨가를 초래할 것이다. 유의하게도, 본 발명의 HuGlyIDUA에 첨가되는 글리칸은 2,6-시알산을 포함하는 고도로 처리된 복합형 바이안테너리 N-글리칸으로, Neu5Ac ("NANA")를 포함하지만 이의 하이드록실화 유도체인 NeuGc (N-글리콜릴뉴라민산, 즉, "NGNA" 또는 "Neu5Gc")는 포함하지 않는다. 이러한 글리칸은 이 번역 후 변형을 만드는 데 필요한 2,6-시알릴트랜스퍼라아제를 갖지 않고, 이등분 GlcNAc를 생성하지도 않는 CHO 세포에서 만들어진 라로니다아제에 존재하지 않지만, 이는 Neu5Ac (NANA) 대신 인간에게 전형적이지 않은 (그리고 잠재적으로 면역원성인) 시알산으로 Neu5Gc (NGNA)를 추가한다. 더욱이, CHO 세포는 또한 α-Gal 항원인, 면역원성 글리칸을 생성할 수 있으며, 이는 대부분의 개체에 존재하는 항-α-Gal 항체와 반응하며, 고농도에서는 아나필락시스를 유발할 수 있다. 예를 들어, Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156을 참조한다. 본 발명의 HuGlyIDUA의 인간 글리코실화 패턴은 이식유전자 산물의 면역원성을 감소시키고 효능을 개선해야 한다.

유전자 요법 또는 단백질 치료 접근법에서 생성된 모든 분자가 완전히 글리코실화되고 황산화되는 것이 필수적인 것은 아니다. 오히려 생성된 당단백질 집단은 효능을 입증하기에 충분한 글리코실화 및 황산화를 가져야 한다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용된 HuGlyIDUA는, 생체내 또는 시험관내에서 뉴런 또는 신경아교 세포에서 발현될 때, 이의 N-글리코실화 부위의 100%에서 글리코실화될 수 있다. 그러나, 당업자는 글리코실화의 이점을 얻기 위해 HuGlyIDUA의 모든 N-글리코실화 부위가 N-글리코실화될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 오히려 글리코실화의 이점은 N-글리코실화 부위의 일부만이 글리코실화될 때 및/또는 발현된 IDUA 분자의 일부만이 글리코실화될 때 실현될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용된 HuGlyIDUA는, 생체내 또는 시험관내에서 뉴런 또는 신경아교 세포에서 발현될 때, 이의 가용 N-글리코실화 부위의 10% - 20%, 20% - 30%, 30% - 40%, 40% - 50%, 50% - 60%, 60% - 70%, 70% - 80%, 80% - 90%, 또는 90% - 100%에서 글리코실화된다. 특정 구현예에서, 생체내 또는 시험관내에서 뉴런 또는 신경아교 세포에서 발현될 때, 본원에 기재된 방법에 따라 사용된 HuGlyIDUA 분자의 10% - 20%, 20% - 30%, 30% - 40%, 40% - 50%, 50% - 60%, 60% - 70%, 70% - 80%, 80% - 90%, 또는 90% - 100%는 이의 가용 N-글리코실화 부위 중 적어도 하나에서 글리코실화된다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용된 HuGlyIDUA에 존재하는 N-글리코실화 부위의 적어도 10%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는, HuGlyIDUA가 생체내 또는 시험관내에서 뉴런 또는 신경아교 세포에서 발현될 때, N-글리코실화 부위에 존재하는 Asn 잔기 (또는 다른 관련 잔기)에서 글리코실화된다. 즉, 생성된 HuGlyIDUA의 N-글리코실화 부위의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 글리코실화된다.

또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 사용된 HuGlyIDUA 분자에 존재하는 N-글리코실화 부위의 적어도 10%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는, HuGlyIDUA가 생체내 또는 시험관내에서 뉴런 또는 신경아교 세포에서 발현될 때, N-글리코실화 부위에 존재하는 Asn 잔기 (또는 다른 관련 잔기)에 연결된 동일한 부착된 글리칸과 글리코실화된다. 즉, 생성된 HuGlyIDUA의 N-글리코실화 부위의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 동일한 부착된 글리칸을 갖는다.

중요하게는, 본원에 기재된 방법에 따라 사용된 IDUA 단백질이 뉴런 또는 신경아교 세포에서 발현될 때, 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)) 또는 진핵 숙주 세포 (예를 들어, CHO)에서의 시험관내 생산에 대한 필요성이 회피된다. 대신, 본원에 기재된 방법 (예를 들어, IDUA를 발현시키기 위한 뉴런 또는 신경아교 세포의 사용)의 결과로서, IDUA 단백질의 N-글리코실화 부위는 유리하게는 인간 치료에 관련되고 유익한 글리칸으로 장식된다. 이러한 이점은 CHO 세포 또는 이. 콜라이가 단백질 생산에 이용될 경우 얻을 수 없는데, 그 이유는 예를 들어, CHO 세포가 (1) 2,6 시알릴트랜스퍼라아제를 발현시키지 않고 따라서 N-글리코실화 동안 2,6 시알산을 추가할 수 없고, (2) Neu5Ac 대신 시알산으로 Neu5Gc를 추가할 수 있으며; 이. 콜라이가 N-글리코실화에 필요한 성분을 자연적으로 포함하지 않기 때문이다. 따라서, 일 구현예에서, 본원에 기재된 치료 방법에 사용되는 HuGlyIDUA를 생성하기 위해 뉴런 또는 신경아교 세포에서 발현되는 IDUA 단백질은, 단백질이 인간 뉴런 또는 신경아교 세포에서 N-글리코실화되는 방식으로 글리코실화되지만, 단백질이 CHO 세포에서 글리코실화되는 방식으로는 글리코실화되지 않는다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 치료 방법에 사용되는 HuGlyIDUA를 생성하기 위해 뉴런 또는 신경아교 세포에서 발현되는 IDUA 단백질은 단백질이 뉴런 또는 신경아교 세포에서 N-글리코실화되는 방식으로 글리코실화되며, 여기서 이러한 글리코실화는, 예를 들어, 이. 콜라이를 사용하는 원핵 숙주 세포를 사용하여 자연적으로 가능하지 않다.

단백질의 글리코실화 패턴을 결정하기 위한 분석은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 하이드라진분해를 사용하여 글리칸을 분석할 수 있다. 첫째, 다당류는 하이드라진과 함께 인큐베이션하여 이의 관련 단백질로부터 방출된다 (영국 옥스퍼드셔 소재의 Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit를 사용할 수 있음). 친핵체 하이드라진은 다당류와 담체 단백질 사이의 글리코시드 결합을 공격하고, 부착된 글리칸의 방출을 허용한다. 이 치료 중에 N-아세틸 기가 손실되며, 재-N-아세틸화에 의해 재구성되어야 한다. 유리 글리칸을 탄소 컬럼에서 정제한 다음 환원 말단에서 형광단 2-아미노 벤즈아미드로 표지할 수 있다. 표지된 다당류는 문헌(Royle et al, Anal Biochem 2002, 304(1):70-90)의 HPLC 프로토콜에 따라 GlycoSep-N 컬럼 (GL Sciences)에서 분리될 수 있다. 생성된 형광 크로마토그램은 다당류 길이와 반복 단위 수를 나타낸다. 구조 정보는 개별 피크를 수집한 후 MS/MS 분석을 수행하여 수집될 수 있다. 이에 의해 반복 단위의 단당류 조성 및 서열을 확인할 수 있으며, 추가로 다당류 조성의 균질성도 식별될 수 있다. 저 분자량의 특정 피크는 MALDI-MS/MS로 분석될 수 있으며, 그 결과는 글리칸 서열을 확인하는 데 사용될 수 있다. 각 피크는 특정 수의 반복 단위 및 이의 단편으로 구성된 폴리머에 해당한다. 따라서 크로마토그램을 통해 폴리머 길이 분포를 측정할 수 있다. 용리 시간은 폴리머 길이에 대한 표시인 한편, 형광 강도는 각 폴리머의 몰 존재량과 상관관계가 있다.

단백질과 연합된 글리칸 패턴의 균질성은, 글리칸 길이 및 글리코실화 부위에 걸쳐 존재하는 글리칸 수 모두와 관련이 있기 때문에, 당 업계에 공지된 방법, 예를 들어, 글리칸 길이 및 유체역학적 반경을 측정하는 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 크기 배제-HPLC를 통해 유체역학적 반경을 측정할 수 있다. 단백질에서 더 많은 수의 글리코실화 부위는 글리코실화 부위가 더 적은 담체에 비해 유체역학적 반경에서 더 큰 변화를 초래한다. 그러나, 단일 글리칸 사슬을 분석하는 경우, 보다 제어된 길이로 인해 보다 균질할 수 있다. 글리칸 길이는 하이드라진분해, SDS PAGE 및 모세관 겔 전기영동으로 측정될 수 있다. 또한, 균질성은 특정 글리코실화 부위 사용 패턴이 더 넓은/더 좁은 범위로 변경됨을 의미할 수도 있다. 이러한 인자는 글리코펩티드 LC-MS/MS로 측정될 수 있다.

N-글리코실화는 본원에 기재된 방법에 사용되는 HuGlyIDUA에 수많은 이점을 제공한다. 이러한 이점은 이. 콜라이에서의 단백질 생산에 의해 얻을 수 없는데, 그 이유는 이. 콜라이가 N-글리코실화에 필요한 성분을 자연적으로 보유하지 않기 때문이다. 또한, 예를 들어, CHO 세포에서의 단백질 생산을 통해 일부 이점을 얻을 수 없는데, 그 이유는 CHO 세포가 특정 글리칸 (예를 들어, 2,6 시알산)의 첨가에 필요한 성분이 결핍되어 있고, CHO 세포가 글리칸, 예를 들어, 인간에게 전형적이지 않은 Neu5Gc, 및 대부분의 개체에서 면역원성이고 고농도에서 아나필락시스를 유발할 수 있는 α-Gal 항원을 추가할 수 있기 때문이다. 따라서, 인간 뉴런 또는 신경아교 세포에서 IDUA의 발현은 달리 CHO 세포 또는 이. 콜라이에서 생산되는 경우 단백질과 연합되지 않을 유익한 글리칸을 포함하는 HuGlyIDUA의 생산을 초래한다.

5.1.2. 티로신 황산화

N-연결된 글리코실화 부위 이외에, hIDUA는 결합 및 활성에 필요한 N³⁷²를 함유하는 도메인 근처에 티로신 ("Y") 황산화 부위 (ADTPIY²⁹⁶NDEADPLVGWS)를 함유한다. (예를 들어, 단백질 티로신 황산화를 겪는 티로신 잔기를 둘러싼 아미노산의 분석을 위해 그 전문이 참조로 포함된 Yang 등, 2015, Molecules 20:2138-2164, esp., p. 2154를 참조한다. "규칙"은 다음과 같이 요약될 수 있다: Y의 +5 내지 -5 위치 내에 E 또는 D가 있고, Y의 위치 -1이 중성 또는 산성 하전된 아미노산이지만, 황산화를 무효화하는 염기성 아미노산, 예를 들어, R, K, 또는 H가 아닌 Y 잔기). 어떤 이론에도 구속되는 것은 아니지만, 티로신-황산화 영역 (예를 들어, W306L) 내의 돌연변이가 효소 활성 및 질환 감소와 관련이 있는 것으로 알려져 있기 때문에 hIDUA에서 이 부위의 황산화가 활성에 결정적일 수 있다. (Maita 등, 2013, PNAS 110:14628, pp. 14632-14633 참조).

중요한 것은, 티로신-황산화 단백질은 자연적으로 티로신-황산화에 필요한 효소를 보유하지 않는 이. 콜라이에서 생산될 수 없다는 것이다. 또한, CHO 세포는 티로신 황산화가 결핍되어 있으며, 이는 분비 세포가 아니고, 번역 후 티로신-황산화에 대한 능력이 제한된다. 예를 들어, Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537을 참조한다. 유리하게는, 본원에 제공된 방법은 분비성이고 티로신 황산화에 대한 능력을 갖는 뉴런 또는 신경아교 세포에서 IDUA, 예를 들어 HuGlyIDUA의 발현을 필요로 한다. 티로신 황산화를 검출하기 위한 분석은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Yang 등, 2015, Molecules 20:2138-2164를 참조한다.

인간 CNS 세포에서 강력한 번역 후 과정인 hIDUA의 티로신-황산화는 이식유전자 산물의 처리 및 활성을 개선시켜야 한다. 리소좀 단백질의 티로신-황산화의 중요성은 밝혀지지 않았지만; 다른 단백질에서는 단백질-단백질 상호작용 (항체 및 수용체)의 결합력을 높이고, 단백질분해 처리 (펩티드 호르몬)를 촉진하는 것으로 나타났다. (Moore, 2003, J Biol. Chem. 278:24243-46; 및 Bundegaard 등, 1995, The EMBO J 14: 3073-79 참조). 티로신-황산화 (IDUA 처리의 마지막 단계로 발생할 수 있음)를 담당하는 티로실단백질 설포트랜스퍼라아제 (TPST1)는 명백하게 뇌에서 더 높은 수준 (mRNA 기반)으로 발현된다 (예를 들어, http://www.ebi.ac.uk/gxa/home에서 액세스할 수 있는 EMBL-EBI Expression Atlas에서 TPST1에 대한 유전자 발현 데이터를 확인할 수 있음). 이러한 번역 후 변형은 CHO 세포 산물인 라로니다아제에서 기껏해야 과소 표현된다.

5.2 작제물 및 제형

본원에 제공되는 방법에 사용하기 위한 것은 α-L-이두로니다아제 (IDUA), 예를 들어, 인간 IDUA (hIDUA)를 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 작제물이다. 본원에 제공된 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 작제물은 이식유전자를 뇌척수액 (CSF)으로 전달하기 위한 임의의 적합한 방법을 포함한다. 이식유전자의 전달 수단에는 바이러스 벡터, 리포좀, 기타 지질-함유 복합체, 기타 거대분자 복합체, 합성 변형된 mRNA, 비변형 mRNA, 소분자, 비-생물학적 활성 분자 (예를 들어, 금 입자), 중합 분자 (예를 들어, 덴드리머), 네이키드 DNA, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드 또는 에피솜이 포함된다. 일부 구현예에서, 벡터는 표적화된 벡터, 예를 들어, 뉴런 세포를 표적으로 하는 벡터이다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 사용하기 위한 핵산을 제공하며, 여기서 핵산은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터에 작동 가능하게 연결된 IDUA, 예를 들어, hIDUA를 인코딩한다: 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 닭 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 및 옵신 프로모터.

특정 구현예에서, 하나 이상의 핵산 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드)을 포함하는 재조합 벡터가 본원에 제공된다. 핵산은 DNA, RNA, 또는 DNA와 RNA의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, DNA는 프로모터 서열, 관심 유전자 서열 (이식유전자, 예를 들어, IDUA), 미번역 영역, 및 종료 서열로 구성된 군으로부터 선택된 서열 중 하나 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 관심 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에 개시된 핵산 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드) 및 핵산 서열은, 예를 들어, 당업자에게 공지된 임의의 코돈-최적화 기술을 통해 코돈-최적화될 수 있다 (예를 들어, Quax 등, 2015, Mol Cell 59:149-161의 검토 참조).

5.2.1. mRNA

특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 관심 유전자 (예를 들어, 이식유전자, 예를 들어, IDUA)를 인코딩하는 변형된 mRNA이다. 이식유전자를 CSF로 전달하기 위한 변형된 및 비변형된 mRNA의 합성은, 예를 들어, 문헌(Hocquemiller 등, 2016, 인간 Gene Therapy 27(7):478-496, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 교시된다. 특정 구현예에서, IDUA, 예를 들어, hIDUA를 인코딩하는 변형된 mRNA가 본원에 제공된다.

5.2.2. 바이러스 벡터

바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV, 예를 들어, AAV9), 렌티바이러스, 헬퍼 의존성 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 폭스바이러스, 일본의 헤마글루티닌 바이러스 (HVJ), 알파바이러스, 백시니아 바이러스 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV)- 및 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)-기반 벡터를 포함한다. 알파바이러스 벡터는 셈리키 삼림열 바이러스 (SFV) 및 신드비스 바이러스 (SIN)를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 재조합 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 인간에서 복제가 결핍되도록 변경된다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 하이브리드 벡터, 예를 들어, "무력한(helpless)" 아데노바이러스 벡터에 배치된 AAV 벡터이다. 특정 구현예에서, 제1 바이러스로부터의 바이러스 캡시드 및 제2 바이러스로부터의 바이러스 외피 단백질을 포함하는 바이러스 벡터가 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 제2 바이러스는 수포성 구내염 바이러스 (vesicular stomatitus virus; VSV)이다. 보다 특정한 구현예에서, 외피 단백질은 VSV-G 단백질이다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 HIV 기반 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 HIV-기반 벡터는 적어도 2개의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 gag 및 pol 유전자는 HIV 게놈에서 유래하고, env 유전자는 또 다른 바이러스에서 유래한다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 단순 포진 바이러스-기반 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 단순 포진 바이러스-기반 벡터는 하나 이상의 조기 발현 (IE) 유전자를 포함하지 않도록 변형되어 비-세포독성으로 만든다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 MLV 기반 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 MLV-기반 벡터는 바이러스 유전자 대신 최대 8kb의 이종 DNA를 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 렌티바이러스-기반 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 렌티바이러스 벡터는 인간 렌티바이러스에서 유래한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 렌티바이러스 벡터는 비-인간 렌티바이러스에서 유래한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 캡시드로 패키징된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 렌티바이러스 벡터는 다음 요소 중 하나 이상을 포함한다: 긴 말단 반복, 프라이머 결합 부위, 폴리퓨린관(polypurine tract), att 부위, 및 캡시드 형성(encapsidation) 부위.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 알파바이러스-기반 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 알파바이러스 벡터는 재조합 복제-결함 알파바이러스이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 알파바이러스 벡터의 알파바이러스 레플리콘은 이의 비리온 표면에 기능성 이종 리간드를 표시함으로써 특정 세포 유형을 표적으로 한다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 AAV 기반 바이러스 벡터이다. 바람직한 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 AAV9 또는 AAVrh10 기반 바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 AAV9 또는 AAVrh10 기반 바이러스 벡터는 CNS 세포에 대한 향성을 유지한다. 여러 AAV 혈청형이 식별되었다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 AAV-기반 벡터는 AAV의 하나 이상의 혈청형으로부터의 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 AAV 기반 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, 또는 AAV11 중 하나 이상으로부터의 성분을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본원에 제공된 AAV 기반 벡터는 AAV8, AAV9, AAV10, 또는 AAV11 혈청형 중 하나 이상으로부터의 성분을 포함한다. AAV9-기반 바이러스 벡터는 본원에 기재된 방법에 사용된다. AAV 기반 바이러스 벡터의 핵산 서열 및 재조합 AAV 및 AAV 캡시드의 제조 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,282,199 B2, 미국 특허 번호 7,790,449 B2, 미국 특허 번호 8,318,480 B2, 미국 특허 번호 8,962,332 B2 및 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2014/076466에 교시되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일 측면에서, 이식유전자 (예를 들어, IDUA)를 인코딩하는 AAV (예를 들어, AAV9 또는 AAVrh10)-기반 바이러스 벡터가 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, IDUA를 인코딩하는 AAV9-기반 바이러스 벡터가 본원에 제공된다. 보다 특정한 구현예에서, hIDUA를 인코딩하는 AAV9-기반 바이러스 벡터가 본원에 제공된다.

일 구현예에서, hIDUA 발현 카세트를 함유하는 혈청형 9 캡시드의 비-복제 재조합 AAV (rAAV9.hIDUA)는 치료에 사용된다. AAV9 혈청형은 투여 (예를 들면, 수조내 투여 및 뇌실내 투여를 포함하는 경막내 투여) 이후 CNS에서 hIDUA 단백질의 효율적 발현을 허용한다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 AAV2-역방위 말단 반복 (ITR)이 측면에 있는 hIDUA 발현 카세트를 함유한다. 카세트로부터 발현은 바람직하게는 강력한 구성적 프로모터에 의해 구동된다.

특정 구현예에서 제공되는 것은 (i) 조절 요소의 제어 하에 있고 ITR이 측면에 있는 이식유전자를 함유하는 발현 카세트; 및 (ii) AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열을 갖거나 AAV9 캡시드의 생물학적 기능을 유지하면서 AAV9 캡시드 단백질의 아미노산 서열 (서열 번호: 26)과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일한 바이러스 캡시드를 포함하는 인공 게놈을 포함하는 AAV9 벡터이다. 특정 구현예에서, 인코딩된 AAV9 캡시드는 AAV9 캡시드의 생물학적 기능을 유지하면서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 치환이 있는 서열 번호: 26의 서열을 갖는다. 도 5는 SUBS로 표지된 행에서의 비교에 기초하여 정렬된 서열의 특정 위치에서 치환될 수 있는 잠재적인 아미노산과 상이한 AAV 혈청형의 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 비교 정렬을 제공한다. 따라서, 특정 구현예에서, AAV9 벡터는 천연 AAV9 서열의 그 위치에 존재하지 않는 도 5의 SUBS 행에서 식별된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 치환을 갖는 AAV9 캡시드 변이체를 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 AAV는 문헌(Zinn 등, 2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068, 이는 그 전문이 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, Anc80 또는 Anc80L65이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 AAV는 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 번호 9,193,956; 9458517; 및 9,587,282 및 미국 특허 출원 공개 번호 2016/0376323에 기재된 바와 같이 다음 아미노산 삽입 중 하나를 포함한다: LGETTRP 또는 LALGETTRP. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 AAV는 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 번호 9,193,956; 9,458,517; 및 9,587,282 및 미국 특허 출원 공개 번호 2016/0376323에 기재된 바와 같이 AAV.7m8이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 AAV는 AAV-PHP.B와 같이 미국 특허 번호 9,585,971에 개시된 임의의 AAV이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 AAV는 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된 다음의 특허 및 특허 출원 중 어느 것에 개시된 AAV이다: 미국 특허 번호 7,906,111; 8,524,446; 8,999,678; 8,628,966; 8,927,514; 8,734,809; US 9,284,357; 9,409,953; 9,169,299; 9,193,956; 9458517; 및 9,587,282 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0374803; 2015/0126588; 2017/0067908; 2013/0224836; 2016/0215024; 2017/0051257; 및 국제 특허 출원 번호 PCT/US2015/034799; PCT/EP2015/053335.

특정 구현예에서, 단일-가닥 AAV (ssAAV)가 상기에서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 자가-상보적 벡터, 예를 들어, scAAV가 사용될 수 있다 (예를 들어, Wu, 2007, 인간 Gene Therapy, 18(2):171-82, McCarty 등, 2001, Gene Therapy, Vol 8, Number 16, 페이지 1248-1254; 및 미국 특허 번호 6,596,535; 7,125,717; 및 7,456,683 참조, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 바이러스 벡터는 아데노바이러스 기반 바이러스 벡터이다. 재조합 아데노바이러스 벡터가 IDUA를 전달하는 데 사용될 수 있다. 재조합 아데노바이러스는 E1 결실이 있고, E3 결실이 있거나 없고, 발현 카세트가 어느 결실된 영역에 삽입된 1세대 벡터일 수 있다. 재조합 아데노바이러스는 E2 및 E4 영역의 전체 또는 부분 결실을 함유하는 2세대 벡터일 수 있다. 헬퍼-의존성 아데노바이러스는 아데노바이러스 역방위 말단 반복 및 패키징 신호 (phi)만을 보유한다. 이식유전자는 인공 게놈을 대략 36 kb의 야생형 크기에 가깝게 유지하기 위한 스터퍼 서열의 존재 또는 부재 하에 패키징 신호와 3'ITR 사이에 삽입된다. 아데노바이러스 벡터의 생산을 위한 예시적인 프로토콜은 문헌(Alba 등, 2005, "Gutless adenovirus: last generation adenovirus for gene therapy," Gene Therapy 12:S18-S27, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 확인할 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 바이러스 벡터는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터이다. 재조합 렌티바이러스 벡터가 IDUA를 전달하는 데 사용될 수 있다. 상기 작제물을 제조하기 위해 4개의 플라스미드가 사용된다: Gag/pol 서열 함유 플라스미드, Rev 서열 함유 플라스미드, 외피 단백질 함유 플라스미드 (즉 VSV-G), 및 패키징 요소 및 IDUA 유전자를 포함하는 Cis 플라스미드.

렌티바이러스 벡터 생산을 위해, 4개의 플라스미드가 세포 (즉, HEK293 기반 세포)로 공동-형질감염되고, 따라서 폴리에틸렌이민 또는 인산칼슘이 특히 형질감염제로서 사용될 수 있다. 이어서 렌티바이러스가 상청액에서 수확된다 (렌티바이러스는 활성화되기 위해 세포로부터 출아(bud)해야 하므로 세포 수확이 필요하지 않음/세포 수확을 수행하지 않아야 함). 상청액을 여과 (0.45 μm)한 다음 염화마그네슘 및 벤조나아제(benzonase)를 첨가한다. 추가 다운스트림 공정은 매우 다양할 수 있으며, TFF 및 컬럼 크로마토그래피를 사용하는 것이 가장 GMP에 적합한 공정이다. 다른 경우에는 컬럼 크로마토그래피와 함께/없이 초원심분리를 사용한다. 렌티바이러스 벡터의 생산을 위한 예시적인 프로토콜은 문헌(Lesch 등, 2011, "Production and purification of lentiviral vector generated in 293T suspension cells with baculoviral vectors," Gene Therapy 18:531-538, 및 Ausubel 등, 2012, "Production of CGMP-Grade Lentiviral Vectors," Bioprocess Int. 10(2):32-43, 둘 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 확인할 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 벡터는, CNS의 세포 또는 관련 세포 (예를 들어, 생체내 또는 시험관내 뉴런 세포)의 형질도입시, IDUA의 글리코실화된 변이체가 형질도입된 세포에 의해 발현되도록 IDUA (예를 들어, hIDUA)를 인코딩하는 벡터이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 벡터는, CNS의 세포 또는 관련 세포 (예를 들어, 생체내 또는 시험관내 뉴런 세포)의 형질도입시, IDUA의 황산화된 변이체가 상기 세포에 의해 발현되도록 IDUA (예를 들어, hIDUA)를 인코딩하는 벡터이다.

5.2.3. 유전자 발현의 프로모터 및 조절인자

특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 유전자 전달 또는 유전자 발현을 조절하는 성분 (예를 들어, "발현 조절 요소")을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 유전자 발현을 조절하는 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 세포에 대한 결합 또는 표적화에 영향을 미치는 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 흡수 후 세포 내에서 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 이식유전자)의 국재화에 영향을 미치는 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드를 흡수한 세포를 검출하거나 선택하기 위해 검출 가능하거나 선택 가능한 마커로서 사용될 수 있는 성분을 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 대안적인 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 대부분의 하우스키핑 유전자와 마찬가지로 기본 IDUA 유전자는 주로 GC가 풍부한 프로모터를 사용한다. 바람직한 구현예에서, hIDUA의 지속적인 발현을 제공하는 강력한 구성적 프로모터가 사용된다. 이러한 프로모터는 다음을 함유하는 "CAG" 합성 프로모터를 포함한다: "C" - 거대세포바이러스 (CMV) 조기 인핸서 요소; "A" - 닭 베타-액틴 유전자의 프로모터뿐만 아니라 첫 번째 엑손 및 인트론; 및 "G" - 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체 (Miyazaki 등, 1989, Gene 79: 269-277; 및 Niwa 등, Gene 108: 193-199 참조).

특정 구현예에서, 프로모터는 CB7 프로모터이다 (Dinculescu 등, 2005, Hum Gene Ther 16: 649-663 참조, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 일부 구현예에서, CB7 프로모터는 벡터에 의해 구동되는 이식유전자의 발현을 향상시키는 다른 발현 조절 요소를 포함한다. 특정 구현예에서, 다른 발현 조절 요소는 닭 b-액틴 인트론 및/또는 토끼 β-글로빈 polA 신호를 포함한다. 특정 구현예에서, 프로모터는 TATA 박스를 포함한다. 특정 구현예에서, 프로모터는 하나 이상의 요소를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 프로모터 요소는 역전되거나 서로에 대해 이동될 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터의 요소는 협력적으로 기능하도록 위치된다. 특정 구현예에서, 프로모터의 요소는 독립적으로 기능하도록 위치된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 인간 CMV 조기 발현 유전자 프로모터, SV40 조기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RS) 긴 말단 반복, 및 래트 인슐린 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 AAV, MLV, MMTV, SV40, RSV, HIV-1, 및 HIV-2 LTR로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 하나 이상의 조직 특이적 프로모터 (예를 들어, 뉴런 세포-특이적 프로모터)를 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 프로모터 이외의 하나 이상의 조절 요소를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 인핸서를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 억제인자를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 인트론 또는 키메라 인트론을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 폴리아데닐화 서열을 포함한다.

5.2.4. 신호 펩티드

특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 단백질 전달을 조절하는 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하나 이상의 신호 펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 신호 펩티드는 이식유전자 산물 (예를 들어, IDUA)이 세포에서 적절한 패키징 (예를 들어, 글리코실화)을 달성할 수 있도록 한다. 특정 구현예에서, 신호 펩티드는 이식유전자 산물 (예를 들어, IDUA)이 세포에서 적절한 국재화를 달성할 수 있도록 한다. 특정 구현예에서, 신호 펩티드는 이식유전자 산물 (예를 들어, IDUA)이 세포로부터 분비되도록 한다. 본원에 제공된 벡터 및 이식유전자와 관련하여 사용되는 신호 펩티드의 예는 표 1에서 확인할 수 있다. 신호 펩티드는 또한 본원에서 리더 서열 또는 리더 펩티드로 지칭될 수 있다.

표 1. 본원에 제공된 벡터와 함께 사용하기 위한 신호 펩티드.

5.2.5. 미번역 영역

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하나 이상의 미번역 영역 (UTR), 예를 들어, 3' 및/또는 5' UTR을 포함한다. 특정 구현예에서, UTR은 원하는 수준의 단백질 발현에 최적화되어 있다. 특정 구현예에서, UTR은 이식유전자의 mRNA 반감기에 최적화되어 있다. 특정 구현예에서, UTR은 이식유전자의 mRNA의 안정성에 최적화되어 있다. 특정 구현예에서, UTR은 이식유전자의 mRNA의 2차 구조에 최적화되어 있다.

5.2.6. 역방위 말단 반복

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 하나 이상의 역방위 말단 반복 (ITR) 서열을 포함한다. ITR 서열은 재조합 유전자 발현 카세트를 바이러스 벡터의 비리온으로 패키징하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, ITR은 AAV, 예를 들어, AAV9에서 유래된다 (예를 들어, Yan 등, 2005, J. Virol., 79(1):364-379; 미국 특허 번호 7,282,199 B2, 미국 특허 번호 7,790,449 B2, 미국 특허 번호 8,318,480 B2, 미국 특허 번호 8,962,332 B2 및 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2014/076466 참조, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).

5.2.7. 이식유전자

특정 구현예에서, 본원에 제공된 벡터는 IDUA 이식유전자를 인코딩한다. 특정 구현예에서, IDUA는 뉴런 세포에서의 발현을 위한 적절한 발현 조절 요소에 의해 조절된다: 특정 구현예에서, IDUA (예를 들어, hIDUA) 이식유전자는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, IDUA (예를 들어, hIDUA) 이식유전자는 서열 번호: 1에 제시된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

예를 들어, hIDUA의 특정 위치에서 아미노산 치환은 도 2 (그 전문이 본원에 참조로 포함된, 보고된 Maita 등, 2013, PNAS 110:14628, 도 S8과 같은 오르토로그의 정열을 보여줌)에 도시된 IDUA 오르토로그의 해당 위치에서 발견되는 상응하는 비-보존 아미노산 잔기 중에서 선택될 수 있고, 단 이러한 치환은 도 3에 도시되거나 상기 Venturi 2002 또는 Bertola 2011에 보고된 임의의 유해한 돌연변이를 포함하지 않는다. 생성된 이식유전자 산물은 돌연변이가 IDUA 기능을 방해하지 않는지 확인하기 위해 시험관내, 세포 배양 또는 시험 동물에서 종래의 분석을 사용하여 시험될 수 있다. 선택된 바람직한 아미노산 치환, 결실 또는 첨가는 MPS I에 대한 종래의 시험관내 분석, 세포 배양 또는 동물 모델에서 시험될 때 IDUA의 효소 활성, 안정성 또는 반감기를 유지하거나 증가시키는 것들이어야 한다. 예를 들어, 이식유전자 산물의 효소 활성은 4-메틸움벨리페릴 α-L-이두로나이드를 기질로 하는 종래의 효소 분석을 사용하여 평가될 수 있다 (사용될 수 있는 예시적인 IDUA 효소 분석에 대해서는 예를 들어, Hopwood 등, 1979, Clin Chim Acta 92: 257-265; Clements 등, 1985, Eur J Biochem 152: 21-28; 및 Kakkis 등, 1994, Prot Exp Purif 5: 225-232 참조, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). MPS I 표현형을 교정하는 이식유전자 산물의 능력은 세포 배양으로; 예를 들어, 배양 중 MPS I 세포를 hIDUA 또는 유도체를 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 기타 DNA 발현 작제물로 형질도입시키거나; rHuGlyIDUA 또는 유도체를 배양 중 MPS I 세포에 첨가하거나; 또는 MPS I 세포를, rHuGlyIDUA 또는 유도체를 발현시키고 분비하도록 조작된 인간 숙주 세포와 공동 배양하고, 예를 들어, IDUA 효소 활성 및/또는 배양 중 MPS I 세포의 GAG 저장 감소를 검출하여 MPS I 배양된 세포에서 결함 보정을 결정함으로써 평가될 수 있다 (예를 들어, Myerowitz & Neufeld, 1981, J Biol Chem 256: 3044-3048; 및 Anson 등 1992, Hum Gene Ther 3: 371-379 참조, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).

5.2.8. 작제물

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 다음의 순서로 다음 요소를 포함한다: a) 제1 ITR 서열, b) 제1 링커 서열, c) 프로모터 서열, d) 제2 링커 서열, e) 인트론 서열, f) 제3 링커 서열, g) 이식유전자 (예를 들어, IDUA)를 인코딩하는 서열, h) 제4 링커 서열, i) 폴리 A 서열, j) 제5 링커 서열, 및 k) 제2 ITR 서열.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 다음의 순서로 다음 요소를 포함한다: a) 프로모터 서열, 및 b) 이식유전자 (예를 들어, IDUA)를 인코딩하는 서열. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 다음의 순서로 다음 요소를 포함하고: a) a 프로모터 서열, 및 b) 이식유전자 (예를 들어, IDUA)를 인코딩하는 서열, 여기서 이식유전자는 신호 펩티드를 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 다음의 순서로 다음 요소를 포함한다: a) 제1 ITR 서열, b) 제1 링커 서열, c) 프로모터 서열, d) 제2 링커 서열, e) 인트론 서열, f) 제3 링커 서열, g) 제1 UTR 서열, h) 이식유전자 (예를 들어, IDUA)를 인코딩하는 서열, i) 제2 UTR 서열, j) 제4 링커 서열, k) 폴리 A 서열, l) 제5 링커 서열, 및 m) 제2 ITR 서열.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터는 다음의 순서로 다음 요소를 포함하고: a) 제1 ITR 서열, b) 제1 링커 서열, c) 프로모터 서열, d) 제2 링커 서열, e) 인트론 서열, f) 제3 링커 서열, g) 제1 UTR 서열, h) 이식유전자 (예를 들어, IDUA)를 인코딩하는 서열, i) 제2 UTR 서열, j) 제4 링커 서열, k) 폴리 A 서열, l) 제5 링커 서열, 및 m) 제2 ITR 서열, 여기서 이식유전자는 신호 펩티드를 포함하고, 이식유전자는 hIDUA를 인코딩한다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 도 6에서 예시된 바와 같은 순서로 요소들을 포함한다.

5.2.9. 벡터의 제조 및 시험

본원에 제공된 바이러스 벡터는 숙주 세포를 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 제공된 바이러스 벡터는 포유동물 숙주 세포, 예를 들어, A549, WEHI, 10T1/2, BHK, MDCK, COS1, COS7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, HeLa, 293, Saos, C2C12, L, HT1080, HepG2, 원발성 섬유아세포, 간세포, 및 근원세포를 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 제공된 바이러스 벡터는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼 또는 햄스터 유래 숙주 세포를 사용하여 제조될 수 있다.

숙주 세포는 이식유전자 및 관련 요소 (즉, 벡터 게놈)를 인코딩하는 서열 및 숙주 세포에서 바이러스를 생산하는 수단, 예를 들어, 복제 및 캡시드 유전자 (예를 들어, AAV의 rep 및 cap 유전자)로 안정적으로 형질전환된다. AAV8 캡시드를 사용하여 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법은 그 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 7,282,199 B2의 상세한 설명의 섹션 IV를 참조한다. 상기 벡터의 게놈 복제 역가는, 예를 들어, TAQMAN® 분석에 의해 결정될 수 있다. 비리온은, 예를 들어, CsCl₂ 침강에 의해 회수될 수 있다.

시험관내 분석, 예를 들어, 세포 배양 분석을 사용하여 본원에 기재된 벡터로부터 이식유전자 발현을 측정할 수 있으며, 따라서, 예를 들어, 벡터의 효능을 나타낼 수 있다. 예를 들어, HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, 또는 ReNcell VM 세포주, 또는 뉴런 또는 신경아교 세포 또는 뉴런 또는 신경아교 세포의 전구 세포로부터 유래된 기타 세포주가 이식유전자 발현을 평가하는 데 사용될 수 있다. 일단 발현되면, HuGlyIDUA와 관련된 글리코실화 및 티로신 황산화 패턴의 결정을 포함하여, 발현된 산물 (즉, HuGlyIDUA)의 특성을 결정할 수 있다.

5.2.10. 조성물

본원에 기재된 이식유전자를 인코딩하는 벡터 및 적합한 담체를 포함하는 조성물이 기재되어 있다. 적합한 담체 (예를 들어, CSF, 및, 예를 들어, 뉴런 세포로의 투여를 위한)는 당업자에 의해 용이하게 선택될 것이다.

5.3 유전자 요법

MPS I을 갖는 인간 대상체에게 치료적 유효량의 이식유전자 작제물을 투여하는 방법이 기재되어 있다. 보다 상세하게는, 특히 CSF로의 투여를 위해 MPS I을 갖는 환자에게 치료적 유효량의 이식유전자 작제물을 투여하는 방법이 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 치료적 유효량의 이식유전자 작제물의 CSF로의 투여를 위한 이러한 방법은 헐러 증후군 또는 헐러-샤이 증후군을 갖는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.

5.3.1. 표적 환자 집단

특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 MPS I로 진단된 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서 환자는 헐러-샤이 증후군으로 진단되었다. 특정 구현예에서, 환자는 샤이 증후군으로 진단되었다. 특정 구현예에서, 환자는 헐러 증후군으로 진단되었다.

특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 중증 MPS I로 진단된 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 약화된 MPS I로 진단된 환자에게 투여된다.

특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 IDUA, 예를 들어, hIDUA로의 치료에 반응하는 것으로 식별된 MPS I로 진단된 환자에게 투여된다.

특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 소아 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 3세 미만의 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 2세 내지 4세 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 3세 내지 8세 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 8세 내지 16세 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 6세 내지 18세 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 6세 이상의 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 3세 미만의 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 4개월 이상 9개월 미만의 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 9개월 이상 18개월 미만의 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 18개월 이상 3세 미만의 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 10세 이상의 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 4 개월 이상의 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 6세 미만의 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 청소년 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 성인 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 소아 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 유아에게 투여된다.

특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 유전자 요법으로의 치료 전에 CSF로 주사되는, IDUA, 예를 들어, hIDUA로의 치료에 반응하는 것으로 식별된 MPS I로 진단된 환자에게 투여된다.

5.3.2. 투여량 및 투여 방식

특정 구현예에서, 치료학적 유효 용량의 재조합 벡터는 경막내 투여 (즉, 재조합 벡터가 CSF를 통해 분포하고 CNS에서 세포를 형질도입시키도록 지주막하 공간으로의 주사)를 통해 CSF에 투여된다. 이는 여러 가지 방법으로, 예를 들어, 두개내 (수조 또는 뇌실) 주사 또는 요추 수조로의 주사에 의해 달성될 수 있다. 특정 구현예에서, 경막내 투여는 수조내 (IC) 주사 (예를 들어, 대조로)를 통해 수행된다. 특정 구현예에서, 수조내 주사는 CT-유도 후두하 천자에 의해 수행된다. 특정 구현예에서, 경막내 주사는 요추 천자에 의해 수행된다. 특정 구현예에서, 지주막하 공간으로의 주사는 환자에게 가능할 때 C1-2 천자를 통해 수행된다. 대안적으로, 뇌실내 (ICV) 투여 (혈액-뇌 장벽을 관통하지 않는 항감염 또는 항암 약물의 도입에 사용된 더욱 침습적인 기법), 예를 들어 영상-보조 ICV 주사는 뇌실에 직접적으로 재조합 벡터를 주입하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 재조합 벡터는 단일 영상-보조 ICV 주사를 통해 투여된다. 추가 특정 구현예에서, 재조합 벡터는 투여 카테터의 즉각 제거와 단일 영상-보조 ICV 주사를 통해 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 비강내 투여를 통해 CNS로 투여된다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 뇌실질내 주사를 통해 CNS로 투여된다. 특정 구현예에서, 뇌실질내 투여는 선조체를 표적으로 한다. 특정 구현예에서, 뇌실질내 주사는 백색질을 표적으로 한다. 특정 구현예에서, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는 당 업계에 공지된 임의의 수단, 예를 들어, 문헌(Hocquemiller 등, 2016, 인간 Gene Therapy 27(7):478-496, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 임의의 수단에 의해 CSF로 투여된다.

재조합 벡터는 적어도 9.25 내지 277 μg/mL의 C_min에서 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 유지하는 용량으로 CSF에 투여되어야 한다. 특정 구현예에서, 재조합 벡터는 적어도 9.25, 16, 46, 92, 185, 또는 277 μg/mL의 C_min에서 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 재조합 벡터는 적어도 9.25, 16, 46, 92, 185, 또는 277 μg/mL의 C_min에서 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 재조합 벡터는 적어도 9.25 μg/mL의 C_min에서 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 재조합 벡터는 적어도 16 μg/mL의 C_min에서 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 재조합 벡터는 적어도 46 μg/mL의 C_min에서 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 재조합 벡터는 적어도 92 μg/mL의 C_min에서 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 재조합 벡터는 적어도 185 μg/mL의 C_min에서 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 재조합 벡터는 적어도 277 μg/mL의 C_min에서 rHuGlyIDUA의 CSF 농도를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다.

특정 구현예에서, 소아 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 1.00 내지 30.00 mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 소아 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 1.00, 1.74, 5.00, 10.00, 20.00, 또는 30.00 mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 소아 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 1.00 mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 소아 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 1.74 mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 소아 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 5.00 mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 소아 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 10.00 mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 소아 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 20.00 mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 소아 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 30.00 mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다.

특정 구현예에서, 성인 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 1.29 내지 38.88 mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 성인 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 1.29, 2.25, 8.40, 12.96, 25.93, 또는 38.88 mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 성인 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 1.29 mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 성인 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 2.25 mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 성인 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 8.40 mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 성인 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 12.96 mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 성인 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 25.93 mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다. 특정 구현예에서, 성인 환자의 경우, 재조합 벡터는 CSF에서 38.88 mg의 총 rHuGlyIDUA를 유지하는 용량으로 CSF에 투여된다.

바람직한 구현예에서, (IC 및 ICV 투여를 포함하는) 경막내 투여 경우에, 치료적 유효 용량의 재조합 벡터는, 총 CSF 용적이 유아에서 약 50 mL이고 성인에서 약 150 mL인, 총 CSF 용적의 10%를 초과하지 않는 주사 용적으로 CSF에 투여되어야 한다. 엘리어트 B 용액(Elliotts B Solution)과 같은 경막내 주사에 적합한 담체를 재조합 벡터의 비히클로 사용해야 한다. 엘리어트 B 용액 (일반명: 염화나트륨, 중탄산나트륨, 무수 덱스트로스, 황산마그네슘, 염화칼륨, 염화칼슘 및 인산나트륨)은 정균 보존제를 함유하지 않는 멸균, 비발열성, 등장성 용액이며, 화학요법제의 경막내 투여를 위한 희석제로 사용된다.

특정 구현예에서, 투여량은 환자의 CSF에 투여된 (예를 들어, 후두하 천자 또는 요추 천자를 통해 주사된) 게놈 사본의 수로 측정된다. 특정 구현예에서, 약 1 x 10¹² 내지 약 2 x 10¹⁴개의 게놈 사본이 투여된다. 특정 구현예에서, 약 5 x 10¹² 내지 약 2 x 10¹⁴개의 게놈 사본이 투여된다. 특정 구현예에서, 약 1 x 10¹³ 내지 약 1 x 10¹⁴개의 게놈 사본이 투여된다. 특정 구현예에서, 약 1 x 10¹³ 내지 약 2 x 10¹³개의 게놈 사본이 투여된다. 특정 구현예에서, 약 6 x 10¹³ 내지 약 8 x 10¹³개의 게놈 사본이 투여된다. 특정 구현예에서, 약 1.2 x 10¹²개의 게놈 사본이 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 약 2.0 x 10¹²개의 게놈 사본이 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 약 2.2 x 10¹²개의 게놈 사본이 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 약 6.0 x 10¹²개의 게놈 사본이 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 약 1.0 x 10¹³개의 게놈 사본이 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 약 1.1 x 10¹³개의 게놈 사본이 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 약 3.0 x 10¹³개의 게놈 사본이 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 약 5.0 x 10¹³개의 게놈 사본이 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 약 5.5 x 10¹³개의 게놈 사본이 투여된다. 특정 구현예에서, 약 1.2 x 10¹² 내지 약 6.0 x 10¹²개의 게놈 사본이 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 약 2.0 x 10¹² 내지 약 1.0 x 10¹³개의 게놈 사본이 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 약 2.2 x 10¹² 내지 약 1.1 x 10¹³개의 게놈 사본이 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 약 6.0 x 10¹² 내지 약 3.0 x 10¹³개의 게놈 사본이 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 약 1.0 x 10¹³ 내지 약 5.0 x 10¹³개의 게놈 사본이 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 약 1.1 x 10¹³ 내지 약 5.5 x 10¹³개의 게놈 사본이 투여된다.

특정 구현예에서, 균일 용량의 약 1 x 10¹³개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 5.6 x 10¹³개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 1 x 10¹² 내지 약 5.6 x 10¹³개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 1 x 10¹³ 내지 약 5.6 x 10¹³개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 1.2 x 10¹²개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 2.0 x 10¹²개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 2.2 x 10¹²개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 6.0 x 10¹²개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 1.0 x 10¹³개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 1.1 x 10¹³개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 3.0 x 10¹³개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 5.0 x 10¹³개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 5.5 x 10¹³개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 1.2 x 10¹² 내지 약 6.0 x 10¹²개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 2.0 x 10¹² 내지 약 1.0 x 10¹³개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 2.2 x 10¹² 내지 약 1.1 x 10¹³개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 6.0 x 10¹² 내지 약 3.0 x 10¹³개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 1.0 x 10¹³ 내지 약 5.0 x 10¹³개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 또 다른 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 1.1 x 10¹³ 내지 약 5.5 x 10¹³개의 게놈 사본이 소아 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 2.6 Х 10¹²개의 게놈 사본이 성인 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 1.3 x 10¹³개의 게놈 사본이 성인 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 1.4 x 10¹³개의 게놈 사본이 성인 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 7.0 x 10¹³개의 게놈 사본이 성인 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 1.4 x 10¹³ 내지 약 7.0 x 10¹³개의 게놈 사본이 성인 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 1 x 10¹² 내지 약 5.6 x 10¹³개의 게놈 사본이 성인 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 1 x 10¹² 내지 약 6.5 x 10¹³개의 게놈 사본이 성인 환자에게 투여된다. 특정 구현예에서, 균일 용량의 약 6.5 x 10¹² 내지 약 6.5 x 10¹³개의 게놈 사본이 성인 환자에게 투여된다.

특정 구현예에서, 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량으로 투여된다. 바람직한 구현예에서, 뇌 질량은 대상체의 뇌의 뇌 자기 공명 영상 (MRI)에 의해 결정된다. 특정 구현예에서, 인간 대상체의 뇌 질량은 cm³의 인간 대상체의 뇌 용적과 1.046 g/cm³의 인수를 곱셈함으로써 인간 대상체의 뇌 용적으로부터 전환되고, 여기서 인간 대상체의 뇌 용적은 인간 대상체의 뇌 MRI로부터 수득된다.

특정 구현예에서, 투여량은 1 그램의 뇌 질량당 환자의 CSF에 투여된 (예를 들어, 후두하 천자 또는 요추 천자를 통해 주사된) 게놈 사본의 수로 측정된다. 특정 구현예에서, 1 그램의 뇌 질량당 약 2 × 10⁹개의 게놈 사본이 투여된다. 특정 구현예에서, 1 그램의 뇌 질량당 약 1 × 10¹⁰개의 게놈 사본이 투여된다. 특정 구현예에서, 1 그램의 뇌 질량당 약 5 × 10¹⁰개의 게놈 사본이 투여된다. 특정 구현예에서, 1 그램의 뇌 질량당 약 1 x 10⁹ 내지 약 2 x 10¹⁰개의 게놈 사본이 투여된다. 특정 구현예에서, 1 그램의 뇌 질량당 약 2 x 10⁹ 내지 약 1 x 10¹⁰개의 게놈 사본이 투여된다. 특정 구현예에서, 1 그램의 뇌 질량당 약 5 x 10⁹ 내지 약 2 x 10¹⁰개의 게놈 사본이 투여된다. 특정 구현예에서, 1 그램의 뇌 질량당 약 9 x 10⁹ 내지 약 1 x 10¹⁰개의 게놈 사본이 투여된다. 특정 구현예에서, 1 그램의 뇌 질량당 약 1 x 10¹⁰ 내지 약 1.5 x 10¹⁰개의 게놈 사본이 투여된다. 특정 구현예에서 1 그램의 뇌 질량당 약 1 x 10¹⁰ 내지 약 5 x 10¹⁰개의 게놈 사본이 투여된다. 특정 구현예에서 1 그램의 뇌 질량당 약 5 x 10¹⁰ 내지 약 6 x 10¹⁰개의 게놈 사본이 투여된다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 약 2 × 10⁹ GC/g 뇌 질량 내지 약 5　×　10¹⁰ GC/g 뇌 질량 범위의 단일 균일 용량으로 경막내로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 약 2 × 10⁹ GC/g 뇌 질량에서 단일 균일 용량으로 경막내로 투여될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 약 1 × 10¹⁰ GC/g 뇌 질량에서 단일 균일 용량으로 경막내로 투여될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 약 5 × 10¹⁰ GC/g 뇌 질량에서 단일 균일 용량으로 경막내로 투여될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 하기 표 2에 열거되고 표 2에 따른 용량 1 또는 용량 2에서 단일 균일 용량으로 경막내로 투여될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 하기 표 3에 열거되고 표3에 따른 용량 1 또는 용량 2에서 단일 균일 용량으로 경막내로 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 약 2 × 10⁹ GC/g 뇌 질량 내지 약 5　×　10¹⁰ GC/g 뇌 질량 범위의 단일 균일 용량으로 IC 투여로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 약 2 × 10⁹ GC/g 뇌 질량에서 단일 균일 용량으로 IC 투여로 투여될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 약 1 × 10¹⁰ GC/g 뇌 질량에서 단일 균일 용량으로 IC 투여로 투여될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 약 5 × 10¹⁰ GC/g 뇌 질량에서 단일 균일 용량으로 IC 투여로 투여될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 하기 표 2에 열거되고 표 2에 따른 용량 1 또는 용량 2에서 단일 균일 용량으로 IC 투여로 투여될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 하기 표 3에 열거되고 표3에 따른 용량 1 또는 용량 2에서 단일 균일 용량으로 IC 투여로 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 약 2 × 10⁹ GC/g 뇌 질량 내지 약 5　×　10¹⁰ GC/g 뇌 질량 범위의 단일 균일 용량으로 ICV 투여로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 약 2 × 10⁹ GC/g 뇌 질량에서 단일 균일 용량으로 ICV 투여로 투여될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 약 1 × 10¹⁰ GC/g 뇌 질량에서 단일 균일 용량으로 ICV 투여로 투여될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 약 5 × 10¹⁰ GC/g 뇌 질량에서 단일 균일 용량으로 ICV 투여로 투여될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 하기 표 2에 열거되고 표 2에 따른 용량 1 또는 용량 2에서 단일 균일 용량으로 ICV 투여로 투여될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA 벡터)는 하기 표 3에 열거되고 표3에 따른 용량 1 또는 용량 2에서 단일 균일 용량으로 ICV투여로 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA)는 약 1.4 × 10¹³ GC (1.1 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량) 내지 약 7.0 × 10¹³　GC (5.6　×　10¹⁰ GC/g 뇌 질량) 범위의 단일 균일 용량으로 (바람직하게는 약 5 내지 20 ml의 용적, 또는 약 5 ml 이하의 용적으로) IC (후두하 주사에 의해) 투여될 수 있다. 환자에게 AAV에 대한 중화 항체가 있는 경우 높은 범위의 용량을 사용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA)는 약 2.6 × 10¹² GC (2 × 10⁹ GC/g 뇌 질량) 내지 약 1.3 × 10¹³　GC (1　×　10¹⁰ GC/g 뇌 질량) 범위의 단일 균일 용량으로 (바람직하게는 약 5 내지 20 ml의 용적, 또는 약 5 ml 이하의 용적으로) IC (후두하 주사에 의해) 투여될 수 있다. 환자가 4개월 이상 9개월 미만인 경우, 일 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA)는 약 6.0 Х 10¹² GC (1.0 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량) 내지 약 3.0 Х 10¹³　GC (5　Х　10¹⁰ GC/g 뇌 질량) 범위의 단일 균일 용량으로 (바람직하게는, 약 5 내지 20 ml의 용적, 또는 약 5 ml 이하의 용적으로) IC (후두하 주사에 의해) 투여될 수 있으며, 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA)는 약 1.2 Х 10¹² GC (2 Х 10⁹ GC/g 뇌 질량) 내지 약 6.0 Х 10¹²　GC (1　Х　10¹⁰ GC/g 뇌 질량) 범위의 단일 균일 용량으로 (바람직하게는, 약 5 내지 20 ml의 용적, 또는 약 5 ml 이하의 용적으로) IC (후두하 주사에 의해) 투여될 수 있다. 환자가 9개월 이상 18개월 미만인 경우, 일 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA)는 약 1.0 Х 10¹³ GC (1.0 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량) 내지 약 5.0 Х 10¹³　GC (5　Х　10¹⁰ GC/g 뇌 질량) 범위의 단일 균일 용량으로 (바람직하게는, 약 5 내지 20 ml 용적, 또는 약 5 ml 이하의 용적으로) IC (후두하 주사에 의해) 투여될 수 있으며, 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA)는 약 2.0 Х 10¹² GC (2 Х 10⁹ GC/g 뇌 질량) 내지 약 1.0 Х 10¹³　GC (1　Х　10¹⁰ GC/g 뇌 질량) 범위의 단일 균일 용량으로 (바람직하게는, 약 5 내지 20 ml 용적, 또는 약 5 ml 이하의 용적으로) IC (후두하 주사에 의해) 투여될 수 있다. 환자가 18개월 이상 3세 미만인 경우, 일 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA)는 약 1.1 Х 10¹³ GC (1.0 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량) 내지 약 5.5 Х 10¹³　GC (5　Х　10¹⁰ GC/g 뇌 질량) 범위의 단일 균일 용량으로 (바람직하게는, 약 5 내지 20 ml 용적, 또는 약 5 ml 이하의 용적으로) IC (후두하 주사에 의해) 투여될 수 있으며, 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA)는 약 2.2 Х 10¹² GC (2 Х 10⁹ GC/g 뇌 질량) 내지 약 1.1 Х 10¹³　GC (1　Х　10¹⁰ GC/g 뇌 질량) 범위의 단일 균일 용량으로 (바람직하게는, 약 5 내지 20 ml 용적, 또는 약 5 ml 이하의 용적으로) IC (후두하 주사에 의해) 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA)는 하기 표 4에 열거되고 표 4에 따른 용량 1 또는 용량 2에서 단일 균일 용량으로 IC (후두하 주사에 의해) 투여될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 벡터 (예를 들어, rAAV9.hIDUA)는 하기 표 5에 열거되고 표 5에 따른 용량 1 또는 용량 2에서 단일 균일 용량으로 IC (후두하 주사에 의해) 투여될 수 있다.

표 4. 투여시 환자의 연령을 기반으로 한 환자에게 투여될 용량.

표 5. 투여시 환자의 연령을 기반으로 한 환자에게 투여될 용량.

5.4 병용 요법

5.4.1. 면역 억제와의 공동-요법

rHuGlyIDUA의 전달은 면역 반응을 최소화해야 하지만, CNS 유도 유전자 요법과 관련된 가장 명확한 잠재적 독성의 출처는 IDUA에 대해 유전적으로 결핍되어 잠재적으로 이식유전자 전달에 사용되는 단백질 및/또는 벡터에 대해 내성이 없는 인간 대상체에서 발현된 hIDUA 단백질에 대한 면역을 생성하는 것이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 특히 IDUA 수준이 0에 가까운 중증 질환 환자 (예를 들어, 헐러 증후군 환자)를 치료할 때 면역 억제 요법으로 환자를 공동 치료하는 것이 바람직하다. 마이코페놀산과 함께 또는 조직 이식 절차에 사용되는 다른 면역 억제 요법과 함께 타크로리무스 또는 라파마이신 (시롤리무스) 요법을 포함하는 면역 억제 요법이 사용될 수 있다. 이러한 면역 억제 치료는 유전자 치료 과정 동안 투여될 수 있고, 특정 구현예에서 면역 억제 요법을 통한 사전 치료가 바람직할 수 있다. 면역 억제 요법은 치료 의사의 판단에 따라 유전자 요법 치료 후 계속될 수 있으며, 이후 면역 관용이 유도되면; 예를 들어, 180일 후 중단될 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 제공된 치료 방법은 프레드니솔론, 마이코페놀산, 및 타크로리무스를 포함하는 면역 억제 요법으로 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 치료 방법은 프레드니솔론, 마이코페놀산, 및 라파마이신 (시롤리무스)을 포함하는 면역 억제 요법으로 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 치료 방법은 타크로리무스를 포함하지 않는 면역 억제 요법으로 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 치료 방법은 하나 이상의 코르티코스테로이드 예컨대 메틸프레드니솔론 및/또는 프레드니솔론, 뿐만 아니라 타크로리무스 및/또는 시롤리무스를 포함하는 면역 억제 요법으로 투여된다. 특정 구현예에서, 면역 억제 요법은 (a) 타크로리무스 및 마이코페놀산, 또는 (b) 라파마이신 및 마이코페놀산의 조합을 인간 IDUA 치료 전 또는 동시에 상기 대상체에게 투여하고, 그 후에 계속하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 억제 요법은 180일 후 중단된다. 특정 구현예에서, 면역 억제 요법은 30, 60, 90, 120, 150, 또는 180일 후 중단된다.

특정 구현예에서, 타크로리무스는 5 내지 10 ng/mL의 혈청 농도가 되는 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 타크로리무스는 4 내지 8 ng/mL의 혈청 농도가 되는 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 특히 환자가 3세 미만인 경우, 타크로리무스는 2 내지 4 ng/mL의 혈청 농도가 되는 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, MMF는 2 내지 3.5 μg/mL의 혈청 농도가 되는 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 타크로리무스는 5 내지 10 ng/mL의 혈청 농도가 되는 용량으로 투여되고, MMF는 2 내지 3.5 μg/mL의 혈청 농도가 되는 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 혈청 농도는 타크로리무스 및/또는 MMF의 최저 수준을 측정한 후 타크로리무스 및/또는 MMF의 적정에 의해 달성된다.

특정 구현예에서, 메틸프레드니솔론은 10 mg/kg의 용량으로 1회 정맥내 투여된다. 특정 구현예에서, 프레드니솔론은 0.5 mg/kg의 용량으로 1일 1회 경구로 투여된다. 특정 구현예에서, 프레드니솔론은 점점 줄어들다가 중단된다. 특정 구현예에서, 타크로리무스는 4-8 ng/ml의 목표 혈중 수준을 유지하기 위해 1일 2회 1 mg을 입으로 투여한다. 특정 구현예에서, 특히 환자가 3세 미만인 경우, 타크로리무스는 2-4 ng/ml의 목표 혈중 수준을 유지하기 위해 1일 2회 0.05 mg/kg을 입으로 투여한다. 특정 구현예에서 시롤리무스도 투여된다. 환자는 시롤리무스로 사전 투여될 수 있으며, 이어서 시롤리무스는 요법 동안 4-8 ng/ml의 목표 혈중 수준으로 유지된다. 그러나, 특정 구현예에서, 환자가 3세 미만인 경우, 환자는 바람직하게는 시롤리무스로 사전 투여된 다음 요법 동안 1-3 ng/ml의 목표 혈중 수준으로 유지된다. 특정 구현예에서, 메틸프레드니솔론은 10 mg/kg의 용량으로 1회 정맥내 투여되고, 프레드니솔론은 0.5 mg/kg의 용량으로 1일 1회 경구로 투여되고, 타크로리무스는 1일 1회 0.2 mg/kg을 입으로 투여하고, 시롤리무스가 투여된다.

특정 구현예에서, 라파마이신은 2 또는 4 mg/kg의 용량으로 1일 1회 경구로 투여된다. 특정 구현예에서, MMF는 25 mg/kg의 용량으로 1일 2회 경구로 투여된다. 특정 구현예에서, 라파마이신은 2 또는 4 mg/kg의 용량으로 1일 1회 경구로 투여되고, MMF는 25 mg/kg의 용량으로 1일 2회 경구로 투여된다. 특정 구현예에서, 라파마이신은 5 내지 15 ng/mL의 혈청 농도가 되는 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, MMF는 2 내지 3.5 μg/mL의 혈청 농도가 되는 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 라파마이신은 5 내지 15 ng/mL의 혈청 농도가 되는 용량으로 투여되고, MMF는 2 내지 3.5 μg/mL의 혈청 농도가 되는 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 혈청 농도는 라파마이신 및/또는 MMF의 최저 수준을 측정한 후 라파마이신 및/또는 MMF의 적정에 의해 달성된다.

5.4.2. 표준 치료를 포함한, 다른 치료와의 공동-요법

다른 이용 가능한 치료의 투여를 수반하는 CSF로의 HuGlyIDUA 투여의 조합은 본 발명의 방법에 포함된다. 추가 치료는 유전자 요법 치료 전, 동시에 또는 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 유전자 요법과 조합될 수 있는 MPS I에 대해 이용 가능한 치료는 전신적으로 또는 CSF로 투여되는 라로니다아제를 사용하는 효소 대체 요법; 및/또는 HSCT 요법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또 다른 구현예에서, ERT는 재조합 DNA 기술에 의해 인간 세포주에서 생산된 rHuGlyIDUA 당단백질을 사용하여 투여될 수 있다. 이러한 재조합 당단백질 생산에 사용될 수 있는 인간 세포주는 HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, ReNcell VM, 인간 배아 신장 293 세포 (HEK293), 섬유육종 HT-1080, HKB-11, CAP, HuH-7, 및 망막 세포주, PER.C6 또는 RPE 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, rHuGlyIDUA 당단백질의 재조합 생산에 사용될 수 있는 인간 세포주에 대한 검토를 위해 그 전문이 참조로 포함된 Dumont 등, 2016, Critical Rev, Biotech 36(6):1110-1122 "Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives" 참조). 완전한 글리코실화, 특히 시알릴화 및 티로신-황산화를 보장하기 위해, 생산에 사용되는 세포주는 α-2,6-시알릴트랜스퍼라아제 (또는 α-2,3- 및 α-2,6-시알릴트랜스퍼라아제 둘 모두) 및/또는 티로신-O-황산화를 담당하는 TPST-1 및 TPST-2 효소를 공동 발현하도록 숙주 세포를 조작함으로써 강화될 수 있다.

5.5 바이오마커 /샘플링/ 모니터링 효능

효능은 인지 기능 (예를 들어, 신경인지 저하의 예방 또는 감소); CSF 및 또는 혈청에서 질환의 바이오마커 (예컨대 GAG) 감소; 및/또는 CSF 및/또는 혈청에서 IDUA 효소 활성의 증가를 측정하여 모니터링될 수 있다. 염증 징후 및 기타 안전 사건도 모니터링될 수 있다.

5.5.1. 질환 마커

특정 구현예에서, 재조합 벡터를 사용한 치료의 효능은 환자의 질환 바이오 마커 수준을 측정하여 모니터링된다. 특정 구현예에서, 질환 바이오 마커 수준은 환자의 CSF에서 측정된다. 특정 구현예에서, 질환 바이오 마커 수준은 환자의 혈청에서 측정된다. 특정 구현예에서, 질환 바이오 마커 수준은 환자의 소변에서 측정된다. 특정 구현예에서, 질환 바이오마커는 GAG이다. 특정 구현예에서, 질환 바이오마커는 IDUA 효소 활성이다. 특정 구현예에서, 질환 바이오마커는 염증이다. 특정 구현예에서, 질환 바이오마커는 안전 사건이다.

5.5.2. 신경인지 기능 검사

특정 구현예에서, 재조합 벡터를 사용한 치료의 효능은 환자의 인지 기능 수준을 측정하여 모니터링된다. 인지 기능은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 인지 기능은 지능 지수 (IQ)를 측정하기 위한 검증된 도구를 통해 측정된다. 특정 구현예에서, IQ는 웩슬러 지능 검사 단축형(Wechsler Abbreviated Scale of Intelligence), 제2판 (WASI-II)으로 측정된다. 특정 구현예에서, 인지 기능은 기억력 측정을 위한 검증된 도구를 통해 측정된다. 특정 구현예에서, 기억력은 홉킨스 언어 학습 검사 (Hopkins Verbal Learning Test; HVLT)로 측정된다. 특정 구현예에서, 인지 기능은 주의력 측정을 위한 검증된 도구를 통해 측정된다. 특정 구현예에서, 주의력은 주의력 변수 검사 (Test Of Variables of Attention; TOVA)로 측정된다. 특정 구현예에서, 인지 기능은 IQ, 기억력 및 주의력 중 하나 이상을 측정하기 위해 검증된 도구를 통해 측정된다.

5.5.3. 신체 변화

특정 구현예에서, 재조합 벡터를 사용한 치료의 효능은 환자의 리소좀 저장 결핍과 관련된 신체적 특성을 측정하여 모니터링된다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 저장 병변이다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 작은 키이다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 거친 얼굴 특징이다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 폐쇄 수면 무호흡이다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 청력 장애이다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 시력 장애이다. 특정 구현예에서, 시력 장애는 각막 혼탁으로 인한 것이다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 수두증이다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 척수 압박이다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 간비장비대이다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 뼈 및 관절 기형이다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 심장 판막 질환이다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 재발성 상기도 감염이다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 손목 터널 증후군이다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 대설증 (비대한 혀)이다. 특정 구현예에서, 신체적 특성은 비대한 성대 및/또는 음성 변화이다. 이러한 신체적 특성은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다.

서열 표

6. 실시예

6.1 실시예 1: hIDUA cDNA

hIDUA (서열 번호:1)를 포함하는 이식유전자를 포함하는 hIDUA cDNA-기반 벡터가 구축된다. 이식유전자는 또한 표 1에 열거된 군으로부터 선택된 신호 펩티드를 포함하는 핵산을 포함한다. 선택적으로, 벡터는 프로모터를 추가로 포함한다.

6.2 실시예 2: 치환된 hIDUA cDNA

예를 들어, 도 2에 도시된 IDUA의 오르토로그에서 상응하는 비-보존 잔기로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 서열 번호:1의 hIDUA 서열과 비교하여 아미노산 치환, 결실 또는 첨가가 있는 hIDUA를 포함하는 이식유전자를 포함하는 hIDUA cDNA-기반 벡터가 구축되며, 단 이러한 돌연변이는 도 3에 도시된 (그 전문이 본원에 참조로 포함된, Saito 등, 2014, Mol Genet Metab 111:107-112, 표 3 목록 57 MPS I 돌연변이로부터) 중증, 중증-중간, 중간 또는 약화된 MPS I 표현형으로 식별되거나; 또는 문헌(Venturi 등, 2002, 인간 Mutation #522 Online ("Venturi 2002"), 또는 Bertola 등, 2011 인간 Mutation 32:E2189-E2210 ("Bertola 2011"), 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 보고된 어떤 것도 포함하지 않는다. 이식유전자는 또한 표 1에 열거된 군으로부터 선택된 신호 펩티드를 포함하는 핵산을 포함한다. 선택적으로, 벡터는 프로모터를 추가로 포함한다.

6.3 실시예 3: hIDUA 또는 치환된 hIDUA를 사용한 동물 모델에서 MPS I의 치료

hIDUA cDNA-기반 벡터는 이식유전자로서 발현될 때 MPS I의 치료에 유용한 것으로 간주된다. MPS I에 대한 동물 모델, 예를 들어 문헌(Clarke 등, 1997, Hum Mol Genet 6(4):503-511 (마우스), Haskins 등, 1979, Pediatr Res 13(11):1294-97 (애완용 쇼트헤어 고양이), Menon 등, 1992, Genomics 14(3):763-768 (개), 또는 Shull 등, 1982, Am J Pathol 109(2):244-248 (개))에 기재된 동물 모델에는 동물의 CSF 내 적어도 9.25 μg/mL의 C_min에서 이식유전자 산물의 농도를 전달하고 유지하기에 충분한 용량으로 hIDUA를 인코딩하는 재조합 벡터가 경막내로 투여된다. 치료 후, 동물은 특정 동물 모델에서 질환과 일치하는 증상의 개선에 대해 평가된다.

6.4 실시예 4: hIDUA 또는 치환된 hIDUA를 사용한 MPS I의 치료

hIDUA cDNA-기반 벡터는 이식유전자로서 발현될 때 MPS I의 치료에 유용한 것으로 간주된다. CSF 내 적어도 9.25 μg/mL의 C_min에서 이식유전자 산물의 농도를 전달하고 유지하기에 충분한 용량으로 hIDUA를 인코딩하는 cDNA 기반 벡터를 MPS I이 발현된 대상체에게 경막내로 투여한다. 치료 후, 대상체는 MPS I 증상 개선에 대해 평가된다. hIDUA를 인코딩하는 cDNA-기반 벡터의 투여 전, 동시에 또는 후에, 환자에게 라파마이신, MMF, 및 프레드니솔론을 포함하는 면역억제 요법이 투여된다.

6.5 실시예 5: MPS I의 임상 프로토콜 치료

다음 예는 MPSI를 치료하기 위해 rAAV9.hIDUA 벡터로 인간 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있는 프로토콜을 설정한다.

환자 집단. 치료될 환자에는 다음과 같은 남성 또는 여성이 포함될 수 있다:

ㆍ 혈장, 섬유아세포 또는 백혈구에서 측정된 효소 활성으로 확인된 MPS I 진단.

ㆍ 임의의 다른 신경학적 또는 정신과 요인으로 설명할 수 없는 경우, 다음 중 어느 하나로 정의되는, MPS I로 인한 초기-단계 신경인지 결손:

o IQ 테스트 또는 신경심리학적 기능의 1 영역 (언어 이해, 기억력, 주의력, 또는 지각 추론)에서 평균 미만의 ≥1 표준 편차 점수.

o 순차적 시험에서 >1　표준 편차 감소에 대한 문서화된 과거 증거 (의료 기록).

환자는 안정적인 ERT 요법 (예를 들어, ALDURAZYME [라로니다아제] IV)을 받은 환자를 포함할 수 있다. 가임기 여성은 치료 당일 혈청 임신 검사에서 음성이어야 한다. 성적으로 활동적인 대상체 (여성 및 남성 모두)는 벡터 투여 후 24주까지 의학적으로 허용되는 배리어 피임 방법 (예를 들어, 콘돔, 격막 또는 금욕)을 사용해야 한다. 수조내 (IC) 치료에서 제외될 수 있는 환자에는 IC 주사 또는 요추 천자에 대한 금기 사항이 있는 대상체가 포함될 수 있다. IC 주사에 대한 금기 사항에는 다음 중 어느 것이 포함될 수 있다:

ㆍ IC 주사에 대한 금기를 야기하는 이전의 두/경부 수술 이력.

ㆍ CT (또는 조영제) 또는 전신 마취에 대한 임의의 금기 사항이 있음.

ㆍ MRI (또는 가돌리늄)에 대한 임의의 금기 사항이 있음.

ㆍ 추정 사구체 여과율 (eGFR)이 <30 mL/분/1.73 m²임.

임의의 시간에 IT 치료를 받고 IT 투여와 관련된 것으로 간주되는 유의한 부작용을 경험한 환자는 IC 치료를 받지 않아야 한다.

치료 의사가 면역억제 요법에 적합하지 않다고 생각하는 임의의 상태를 갖는 환자는 치료를 받지 않아야 한다 (예를 들어, 절대 호중구 수 <1.3 Х 10³/μL, 혈소판 수 <100 Х 10³/μL, 및 헤모글로빈 <12 g/dL [남성] 또는 <10 g/dL [여성]). 대체 면역 억제 요법은 시롤리무스, MMF 또는 프레드니솔론에 대한 임의의 과민 반응 병력이 있는 임의의 환자에게 사용되어야 한다.

피부의 편평 세포 또는 기저 세포 암종 이외의 림프종 또는 또 다른 암의 병력이 있는 환자는 치료 전 적어도 3개월 동안 완전한 완화 상태가 아닌 한 치료받아서는 안된다.

정상치 상한 (ULN)의 3배 초과의 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 (ALT) 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 (AST) 또는 ULN의 1.5배 초과의 총 빌리루빈을 갖는 환자는, 대상체가 이전에 질베르 증후군(Gilbert's syndrome)의 병력이 알려져 있고, 결합형 빌리루빈이 총 빌리루빈의 35% 미만을 나타내는 분별된 빌리루빈을 가지고 있지 않는 한, 치료받아서는 안된다.

감염성 질환 또는 약물 남용 이력이 있는 환자는 치료 후보가 될 수 없다. 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)-양성 검사 이력, 활성 또는 재발성 B형 간염 또는 C형 간염 이력, 또는 B형 간염, C형 간염 또는 HIV에 대한 양성 선별 검사 이력; 치료 전 1년 이내 알코올 또는 약물 남용 이력.

일 구현예에서, 환자는 성인 환자이다. 또 다른 구현예에서, 환자는 소아 환자이다.

투여되는 치료―면역억제 요법을 통한 사전 치료. 유전자 요법 전에, 환자는 이식유전자 및/또는 AAV 캡시드에 대한 면역 반응을 예방하기 위해 면역억제 요법으로 치료를 받아야 한다. 이러한 면역억제 요법은 프레드니솔론 (60 mg PO QD -2일 내지 8일), MMF (1 g PO BID -2일 내지 60일), 및 시롤리무스 (6 mg PO -2일 이어서 2 mg QD -1일부터 48주까지)를 포함한다. 시롤리무스 용량 조정은 전혈 최저 농도를 16-24 ng/mL 이내로 유지하기 위해 이루어진다. 대부분의 대상체에서 용량 조정은 다음 방정식을 기반으로 할 수 있다: 새로운 용량 = 현재 용량 × (목표 농도/현재 농도). 대상체는 농도 모니터링으로 추가 투여량을 조정하기 전에 적어도 7 내지 14일 동안 새로운 유지 용량을 계속해야 한다. 호중구감소증이 발생하면 (절대 호중구 수 <1.3 Х 10³/μL), MMF 투여를 중단하거나 용량을 줄여야 한다.

유전자 요법. hIDUA 발현 카세트 (rAAV9.hIDUA)를 함유하는 혈청형 9 캡시드의 비-복제 재조합 AAV가 치료에 사용된다. AAV9 혈청형은 IC 투여 후 CNS에서 hIDUA 단백질의 효율적인 발현을 허용한다. 벡터 게놈은 AAV2-역방위 말단 반복 (ITR)이 측면에 있는 hIDUA 발현 카세트를 함유한다. 카세트로부터의 발현은 강력한 구성적 CAG 프로모터에 의해 구동된다. rAAV9.hIDUA 벡터는 경막내 주사를 위해 엘리어트 B 용액에 현탁된다.

rAAV9.hIDUA는 IC 투여에 의해 단일 균일 용량으로 투여되고: 1.4 Х 10¹³ GC (1.1 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량)의 저용량 또는 7.0 Х 10¹³ GC (5.6 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량)의 고용량이 약 5 내지 20 ml의 용적으로 사용될 수 있다. 환자가 AAV에 대한 중화 항체가 있는 경우 고용량을 사용할 수 있다.

rAAV9.IDUA의 투여를 위해, 대상체는 전신 마취된다. 요추 천자를 수행하여 우선 5 cc의 CSF를 제거한 후 조영제 IT를 주입하여 대조의 시각화를 돕는다. CT (조영제 포함)는 바늘 삽입 및 선택된 용량의 rAAV9.IDUA를 후두하 공간으로 투여하는 것을 유도하는 데 사용된다.

6.6 실시예 6: MPS I의 임상 프로토콜 치료

환자 집단. 치료될 환자에는 다음과 같은 6세 이상의 남성 또는 여성이 포함될 수 있다:

ㆍ 혈장, 섬유아세포 또는 백혈구에서 측정된 효소 활성으로 확인된 MPS I 진단 (여기에는 이전에 HSCT를 받았거나 이전에 라로니다아제 치료를 받았거나 현재 받고 있는 환자가 포함됨).

o IQ 테스트 또는 신경심리학적 기능의 1 영역 (언어 이해, 주의력, 또는 지각 추론)에서 평균 미만의 ≥1 표준 편차 점수.

o 순차적 시험에서 >1　표준 편차의 감소.

환자는 보조 기구를 사용하거나 사용하지 않고 필요한 프로토콜 시험을 완료하기에 충분한 청각 및 시각 능력을 가져야 하며, 해당되는 경우, 시험일에 보조 기구를 착용하는 데 기꺼이 따라야 한다.

가임기 여성은 치료 당일 혈청 임신 검사에서 음성이어야 한다. 성적으로 활동적인 모든 대상체는 스크리닝 방문부터 벡터 투여 후 24주까지 의학적으로 허용되는 배리어 피임 방법을 기꺼이 사용해야 한다. 성적으로 활동적인 여성은 스크리닝 방문부터 마지막 시롤리무스 투여 후 12주까지 (어느 쪽이든 더 늦은 시점까지) 효과적인 산아 제한 방법을 기꺼이 사용해야 한다. 수조내 (IC) 치료에서 제외될 수 있는 환자에는 IC 주사 또는 요추 천자에 대한 금기 사항이 있는 대상체가 포함될 수 있다. IC 주사에 대한 금기 사항에는 다음 중 어느 것이 포함될 수 있다:

ㆍ MRI (또는 가돌리늄)에 대한 임의의 금기 사항이 있음.

ㆍ 추정 사구체 여과율 (eGFR)이 <30 mL/분/1.73 m²임.

임의의 시간에 IT 치료를 받고 IT 투여와 관련된 것으로 간주되는 유의한 부작용을 경험한 환자는 IC 치료를 받지 않아야 한다. 치료 의사가 면역억제 요법에 적합하지 않다고 생각하는 임의의 상태를 갖는 환자는 치료를 받지 않아야 한다 (예를 들어, 절대 호중구 수 <1.3 Х 10³/μL, 혈소판 수 <100 Х 10³/μL, 및 헤모글로빈 <12 g/dL [남성] 또는 <10 g/dL [여성]). 대체 면역 억제 요법은 시롤리무스, MMF 또는 프레드니솔론에 대한 임의의 과민 반응 병력이 있는 임의의 환자에게 사용되어야 한다.

최대한의 의학적 치료에도 불구하고 조절되지 않는 고혈압 (수축기 혈압 >180 mmHg, 이완기 혈압 >100 mmHg) 환자는 치료받아서는 안된다.

정상치 상한 (ULN)의 3배 초과의 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 (ALT) 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 (AST) 또는 ULN의 1.5배 초과의 총 빌리루빈을 갖는 환자는, 대상체가 이전에 질베르 증후군의 병력이 알려져 있고, 결합형 빌리루빈이 총 빌리루빈의 35% 미만을 나타내는 분별된 빌리루빈을 가지고 있지 않는 한, 치료받아서는 안된다.

감염성 질환 또는 약물 남용 이력이 있는 환자는 치료 후보가 될 수 없다. 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 또는 B형 간염 또는 C형 간염 바이러스 감염, 또는 B형 간염 표면 항원 또는 B형 간염 코어 항체, 또는 C형 간염 또는 HIV 항체에 대한 양성 선별 검사 이력; 스크리닝 전 1년 이내 알코올 또는 약물 남용 이력.

30일 이내에 또는 5 반감기 이전 중 더 긴 기간 내에 임의의 조사 제품을 받은 환자는 이전에 임의의 시간에 투여될 수 있는 IT 라로니다아제가 투여된 환자를 제외하고는 치료받아서는 안된다.

임신중이거나, 산후 6주 미만이거나, 스크리닝시 모유수유 중이거나, 52주까지 언제든지 임신할 계획인 환자는 치료받아서는 안된다.

대상체의 안전을 위태롭게 할 수 있는 임상적으로 유의한 ECG 이상이 있는 환자는 치료받아서는 안된다. 대상체의 안전을 위태롭게 할 수 있는 심각하거나 불안정한 의학적 또는 심리적 상태에 있는 환자는 치료받아서는 안된다.

투여되는 치료―면역억제 요법을 통한 사전 치료. 유전자 요법 전에, 환자는 이식유전자 및/또는 AAV 캡시드에 대한 면역 반응을 예방하기 위해 면역억제 요법으로 치료를 받아야 한다. 이러한 면역억제 요법은 프레드니솔론 (60 mg PO QD -2일 내지 8일), MMF (1 g PO BID -2일 내지 60일), 및 시롤리무스 (6 mg Po -2일 이어서 2 mg QD -1일부터 48주까지)를 포함한다. 시롤리무스 용량 조정은 전혈 최저 농도를 16-24 ng/mL 이내로 유지하기 위해 이루어진다. 대부분의 대상체에서 용량 조정은 다음 방정식을 기반으로 할 수 있다: 새로운 용량 = 현재 용량 × (목표 농도/현재 농도). 대상체는 농도 모니터링으로 추가 투여량을 조정하기 전에 적어도 7 내지 14일 동안 새로운 유지 용량을 계속해야 한다.

면역억제 요법의 기본 원리는 면역을 완전히 억제하기 위해 코르티코스테로이드를 투여하는 것이며, 용량을 로드(load)하기 위해 IV 메틸프레드니솔론으로 시작하여 환자가 12주까지 스테로이드를 사용하지 않도록 점점 줄어드는 경구 프레드니솔론을 사용한다. 코르티코스테로이드 치료는 타크로리무스 (24주 동안) 및/또는 시롤리무스 (12주 동안)로 보충되고, MMF로 추가로 보충될 수 있다. 타크로리무스와 시롤리무스를 모두 사용하는 경우, 각각의 용량은 4 내지 8 ng/ml의 혈중 최저 수준을 유지하도록 조정된 저용량이어야 한다. 상기 제제 중 하나만 사용하는 경우, 표지 용량 (더 높은 용량)을 사용해야 하고; 예를 들어, 0.15-0.20 mg/kg/일의 타크로리무스는 12시간마다 2회 분할 용량으로 투여되고; 1 mg/m²/일의 시롤리무스; 로딩 용량은 3 mg/m²여야 한다. MMF가 상기 요법에 추가되는 경우, 작용 기전이 다르기 때문에 타크로리무스 및/또는 시롤리무스의 용량은 유지될 수 있다.

rAAV9.hIDUA는 IC 투여에 의해 단일 균일 용량으로 투여된다: 2 Х 10⁹ GC/g 뇌 질량 (2.6 Х 10¹² GC)의 용량 또는 1 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량 (1.3 Х 10¹³ GC)의 용량. 상기 용량은 약 5 내지 20 ml의 용적이 될 수 있다.

rAAV9.IDUA의 투여를 위해, 대상체는 전신 마취된다.

6.7 실시예 7: MPS I의 임상 프로토콜 치료

ㆍ 혈장, 섬유아세포 또는 백혈구에서 측정된 효소 활성으로 확인된 MPS I 진단 (여기에는 이전에 HSCT 또는 라로니다아제 치료를 받았거나 현재 받고 있는 환자가 포함됨).

o 순차적 시험에서 >1　표준 편차의 감소.

ㆍ MRI (또는 가돌리늄)에 대한 임의의 금기 사항이 있음.

ㆍ 추정 사구체 여과율 (eGFR)이 <30 mL/분/1.73 m²임.

임의의 시간에 IT 치료를 받고 IT 투여와 관련된 것으로 간주되는 유의한 부작용을 경험한 환자는 IC 치료를 받지 않아야 한다. 치료 의사가 면역억제 요법에 적합하지 않다고 생각하는 임의의 상태를 갖는 환자는 치료를 받지 않아야 한다 (예를 들어, 절대 호중구 수 <1.3 Х 10³/μL, 혈소판 수 <100 Х 10³/μL, 및 헤모글로빈 <12 g/dL [남성] 또는 <10 g/dL [여성]).

대체 면역 억제 요법은 타크로리무스, 시롤리무스 또는 프레드니솔론에 대한 임의의 과민 반응 병력이 있는 임의의 환자에게 사용되어야 한다. 원발성 면역결핍, 비장절제술 또는 대상체가 감염되기 쉬운 임의의 기저 질환의 병력이 있는 환자는 면역억제 요법으로 치료해서는 안된다. 스크리닝 전 적어도 12주 동안 완전히 해소되지 않은 대상포진, 거대세포바이러스 또는 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr Virus; EBV) 감염 환자는 면역억제 요법으로 치료해서는 안된다. (1) 두 번째 방문 전 적어도 8주 전에 해소되지 않은 부모(parental) 항-감염제로의 치료 또는 입원이 필요한 임의의 감염이 있거나 (2) 두 번째 방문 전 10일 이내에 경구 항-감염제 (항바이러스제 포함)가 필요한 임의의 활성 감염 또는 활동성 결핵 병력이 있거나 (3) 스크리닝 동안 Quantiferon_TB Gold 검사에 양성이거나 (4) 사전 동의 양식에 서명하기 전 8주 이내에 임의의 생백신을 받거나 (5) 사전 동의서에 서명하기 전 8주 이내에 대수술을 받거나 (6) 연구 기간 동안 대수술이 계획된 환자는 면역억제 요법으로 치료해서는 안된다. 절대 호중구 수가 1.3 x 10³/μL 미만인 환자는 면역억제 요법으로 치료해서는 안된다.

투여되는 치료―면역억제 요법을 통한 사전 치료. 유전자 요법 전에, 환자는 이식유전자 및/또는 AAV 캡시드에 대한 면역 반응을 예방하기 위해 면역억제 요법으로 치료를 받아야 한다. 이러한 면역억제 요법에는 코르티코스테로이드 (투여 전 1일에 한 번 정맥내 [IV] 메틸프레드니솔론 10 mg/kg, 및 2일에 0.5 mg/kg/일로 시작하여 12주까지 점점 줄어들다 중단되는 경구 프레드니손), 타크로리무스 (2일 내지 24주에 4-8 ng/mL의 목표 혈중 수준으로 입으로 [PO] 1일 2회 [BID] 1 mg, 및 24주 내지 32주 사이의 8주에 걸쳐 점점 줄어듬, 및 시롤리무스 (-2일에 4시간마다 1 mg/m²의 로딩 용량 x 3회 용량, 그리고 나서 -1일부터 48주까지 4-8 ng/ml의 목표 혈중 수준으로 BID 용량으로 분할된 시롤리무스 0.5 mg/m²/일이 포함된다. 신경학적 평가 및 타크로리무스/시롤리무스 혈중 수준 모니터링이 수행될 것이다. 시롤리무스와 타크로리무스의 용량은 혈중 수준을 목표 범위 내로 유지하기 위해 조정될 것이다. 48주 이후에는 면역억제 요법이 계획되어 있지 않다. 대부분의 대상체에서 용량 조정은 다음 방정식을 기반으로 할 수 있다: 새로운 용량 = 현재 용량 × (목표 농도/현재 농도). 대상체는 농도 모니터링으로 추가 투여량을 조정하기 전에 적어도 7 내지 14일 동안 새로운 유지 용량을 계속해야 한다.

rAAV9.IDUA의 투여를 위해, 대상체는 전신 마취된다.

6.8 실시예 8: MPS I의 임상 프로토콜 치료

o 순차적 시험에서 >1　표준 편차의 감소.

ㆍ MRI (또는 가돌리늄)에 대한 임의의 금기 사항이 있음.

ㆍ 추정 사구체 여과율 (eGFR)이 <30 mL/분/1.73 m²임.

대체 면역 억제 요법은 타크로리무스, 시롤리무스 또는 프레드니솔론에 대한 임의의 과민 반응 병력이 있는 임의의 환자에게 사용되어야 한다. 원발성 면역결핍, 비장절제술 또는 대상체가 감염되기 쉬운 임의의 기저 질환의 병력이 있는 환자는 면역억제 요법으로 치료해서는 안된다. 스크리닝 전 적어도 12주 동안 완전히 해소되지 않은 대상포진, 거대세포바이러스 또는 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 감염 환자는 면역억제 요법으로 치료해서는 안된다. (1) 두 번째 방문 전 적어도 8주 전에 해소되지 않은 부모 항-감염제로의 치료 또는 입원이 필요한 임의의 감염이 있거나 (2) 두 번째 방문 전 10일 이내에 경구 항-감염제 (항바이러스제 포함)가 필요한 임의의 활성 감염 또는 활동성 결핵 병력이 있거나 (3) 스크리닝 동안 Quantiferon_TB Gold 검사에 양성이거나 (4) 사전 동의 양식에 서명하기 전 8주 이내에 임의의 생백신을 받거나 (5) 사전 동의서에 서명하기 전 8주 이내에 대수술을 받거나 (6) 연구 기간 동안 대수술이 계획된 환자는 면역억제 요법으로 치료해서는 안된다. 절대 호중구 수가 1.3 x 10³/μL 미만인 환자는 면역억제 요법으로 치료해서는 안된다.

rAAV9.IDUA의 투여를 위해, 대상체는 전신 마취된다.

6.9 실시예 9: MPS I의 임상 프로토콜 치료

환자 집단. 치료될 환자에는 다음과 같은 6세 이상의 남성 또는 여성, 및 3세 미만의 남성 또는 여성이 포함될 수 있다:

o 순차적 시험에서 >1　표준 편차의 감소.

ㆍ 3세 미만의 환자는 신경인지 저하와 함께 헐러 증후군을 초래하는 것으로 알려진 돌연변이(들)에 의해 확인된 중증 형태의 MPS I (헐러 증후군)이 있다.

ㆍ MRI (또는 가돌리늄)에 대한 임의의 금기 사항이 있음.

ㆍ 추정 사구체 여과율 (eGFR)이 <30 mL/분/1.73 m²임.

타크로리무스, 시롤리무스 또는 프레드니솔론에 대한 임의의 과민 반응 병력이 있는 임의의 환자에게는 대체 면역 억제 요법이 사용되거나 그 환자는 배제되어야 한다. 원발성 면역결핍, 비장절제술 또는 대상체가 감염되기 쉬운 임의의 기저 질환의 병력이 있는 환자는 면역억제 요법으로 치료해서는 안된다. 스크리닝 전 적어도 12주 동안 완전히 해소되지 않은 대상포진, 거대세포바이러스 또는 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 감염 환자는 면역억제 요법으로 치료해서는 안된다. (1) 두 번째 방문 전 적어도 8주 전에 해소되지 않은 부모 항-감염제로의 치료 또는 입원이 필요한 임의의 감염이 있거나 (2) 두 번째 방문 전 10일 이내에 경구 항-감염제 (항바이러스제 포함)가 필요한 임의의 활성 감염 또는 활동성 결핵 병력이 있거나 (3) 스크리닝 동안 Quantiferon_TB Gold 검사에 양성이거나 (4) 사전 동의 양식에 서명하기 전 8주 이내에 임의의 생백신을 받거나 (5) 사전 동의서에 서명하기 전 8주 이내에 대수술을 받거나 (6) 연구 기간 동안 대수술이 계획된 환자는 면역억제 요법으로 치료해서는 안된다. 절대 호중구 수가 1.3 x 10³/μL 미만인 환자는 면역억제 요법으로 치료해서는 안된다.

투여되는 치료―면역억제 요법을 통한 사전 치료. 유전자 요법 전에, 환자는 이식유전자 및/또는 AAV 캡시드에 대한 면역 반응을 예방하기 위해 면역억제 요법으로 치료를 받아야 한다. 6세 이상의 환자를 위한 이러한 면역억제 요법에는 코르티코스테로이드 (투여 전 1일에 한 번 정맥내 [IV] 메틸프레드니솔론 10 mg/kg, 및 2일에 0.5 mg/kg/일로 시작하여 12주까지 점점 줄어들다 중단되는 경구 프레드니손), 타크로리무스 (2일 내지 24주에 4-8 ng/mL의 목표 혈중 수준으로 입으로 [PO] 1일 2회 [BID] 1 mg, 및 24주 내지 32주 사이의 8주에 걸쳐 점점 줄어듬, 및 시롤리무스 (-2일에 4시간마다 1 mg/m²의 로딩 용량 x 3회 용량, 그리고 나서 -1일부터 48주까지 4-8 ng/ml의 목표 혈중 수준으로 BID 용량으로 분할된 시롤리무스 0.5 mg/m²/일이 포함된다. 3세 미만의 환자를 위한 이러한 면역억제 요법에는 코르티코스테로이드 (투여 전 1일에 한 번 정맥내 [IV] 메틸프레드니솔론 10 mg/kg, 및 2일에 0.5 mg/kg/일로 시작하여 12주까지 점점 줄어들다 중단되는 경구 프레드니손), 타크로리무스 (2일 내지 24주에 2-4 ng/mL의 목표 혈중 수준으로 입으로 [PO] 1일 2회 [BID] 0.05 mg/kg, 및 24주 내지 32주 사이의 8주에 걸쳐 점점 줄어듬, 및 시롤리무스 (-2일에 4시간마다 1 mg/m²의 로딩 용량 x 3회 용량, 그리고 나서 -1일부터 48주까지 1-3 ng/ml의 목표 혈중 수준으로 BID 용량으로 분할된 시롤리무스 0.5 mg/m²/일이 포함된다. 신경학적 평가 및 타크로리무스/시롤리무스 혈중 수준 모니터링이 수행될 것이다. 시롤리무스와 타크로리무스의 용량은 혈중 수준을 목표 범위 내로 유지하기 위해 조정될 것이다. 48주 이후에는 면역억제 요법이 계획되어 있지 않다. 대부분의 대상체에서 용량 조정은 다음 방정식을 기반으로 할 수 있다: 새로운 용량 = 현재 용량 × (목표 농도/현재 농도). 대상체는 농도 모니터링으로 추가 투여량을 조정하기 전에 적어도 7 내지 14일 동안 새로운 유지 용량을 계속해야 한다.

6세 이상의 환자의 경우, rAAV9.hIDUA는 IC 투여에 의해 단일 균일 용량으로 투여된다: 2 Х 10⁹ GC/g 뇌 질량 (2.6 Х 10¹² GC)의 용량 또는 1 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량 (1.3 Х 10¹³ GC)의 용량. 상기 용량은 약 5 ml 이하의 용적이 될 수 있다.

3세 미만의 환자의 경우, rAAV9.hIDUA는 IC 투여에 의해 단일 균일 용량으로 투여된다: 1 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량의 용량 (4개월 이상 9개월 미만의 환자의 경우 6.0 Х　10¹²GC; 9개월 이상 18개월 미만의 환자의 경우 1.0 Х 10¹³ GC; 18개월 이상 3세 미만의 환자의 경우 1.1 Х 10¹³ GC) 또는 5 Х　10¹⁰ GC/g 뇌 질량의 용량 (4개월 이상 9개월 미만의 환자의 경우 3.0 Х　10¹³GC; 9개월 이상 18개월 미만의 환자의 경우 5.0 Х 10¹³ GC; 18개월 이상 3세 미만의 환자의 경우 5.5 Х 10¹³ GC). 상기 용량은 약 5 ml 이하의 용적이 될 수 있다.

rAAV9.IDUA의 투여를 위해, 대상체는 전신 마취된다.

6.10 실시예 10: MPS I의 임상 프로토콜 치료

환자 집단. 치료될 환자에는 다음과 같은 3세 미만의 남성 또는 여성이 포함될 수 있다:

ㆍ MPS I-H와 일치하는 임상 징후 및 증상의 존재 및/또는 중증 표현형과 배타적으로 관련된 돌연변이에 대한 동형접합성 또는 복합 이형접합성으로 확인된 중증 MPS I-헐러의 진단.

ㆍ 55 이상의 지능 지수 (IQ) 점수

수조내 (IC) 치료에서 제외될 수 있는 환자에는 IC 주사 또는 요추 천자에 대한 금기 사항이 있는 대상체가 포함될 수 있다. IC 주사에 대한 금기 사항에는 다음 중 어느 것이 포함될 수 있다:

ㆍ MRI (또는 가돌리늄)에 대한 임의의 금기 사항이 있음.

ㆍ 추정 사구체 여과율 (eGFR)이 <30 mL/분/1.73 m²임.

임의의 시간에 IT 치료를 받고 IT 투여와 관련된 것으로 간주되는 유의한 부작용을 경험한 환자는 IC 치료를 받지 않아야 한다. 치료 의사가 면역억제 요법에 적합하지 않다고 생각하는 임의의 상태를 갖는 환자는 치료를 받지 않아야 하며 (예를 들어, 절대 호중구 수 <1.3 Х 10³/μL, 혈소판 수 <100 Х 10³/μL), 헤모글로빈이 평가될 것이다.

정상치 상한 (ULN)의 3배 초과의 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 (ALT) 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 (AST) 또는 ULN의 1.5배 초과의 총 빌리루빈을 갖는 환자는, 대상체가 이전에 질베르 증후군의 병력이 알려져 있지 않는 한, 치료받아서는 안된다.

투여되는 치료―면역억제 요법을 통한 사전 치료. 유전자 요법 전에, 환자는 이식유전자 및/또는 AAV 캡시드에 대한 면역 반응을 예방하기 위해 면역억제 요법으로 치료를 받아야 한다. 프레드니손 투여는 0.5 mg/kg/일에 시작하여 12주차 방문시까지 점점 줄어들 것이다. 타크로리무스 용량은 처음 24주 동안 전혈 최저 농도를 2 내지 4 ng/mL 이내로 유지하기 위해 조정될 것이다. 24주에는 용량이 대략 50%까지 감소될 것이다. 28주에는 용량이 대략 50%까지 더 감소될 것이다. 타크로리무스는 32주에 중단될 것이다. 시롤리무스 용량은 전혈 최저 농도를 1 내지 3 ng/mL 이내로 유지하기 위해 조정될 것이다. 대부분의 대상체에서 용량 조정은 다음 방정식을 기반으로 할 수 있다: 새로운 용량 = 현재 용량 × (목표 농도/현재 농도). 대상체는 농도 모니터링으로 추가 투여량을 조정하기 전에 적어도 7 내지 14일 동안 새로운 유지 용량을 계속해야 한다. 보다 자세한 내용은 하기를 참조한다.

코르티코스테로이드

벡터를 투여하는 날 아침 (투여 전 1일)에 환자에게 적어도 30분에 걸쳐 메틸프레드니솔론 10 mg/kg IV (최대 500 mg)가 투여될 것이다. 메틸프레드니솔론은 IP의 요추 천자 및 IC 주사 전에 투여되어야 한다. 아세트아미노펜 및 항히스타민제를 사용한 사전 투약은 연구자의 재량에 따라 선택 사항이다.

2일에, 경구 프레드니손은 12주까지 프레드니손 중단을 목표로 시작될 것이다. 프레드니손의 용량은 다음과 같다:

2일 내지 2주 말: 0.5 mg/kg/일

3주 및 4주: 0.35 mg/kg/일

5주 내지 8주: 0.2 mg/kg/일

9주 내지 12주: 0.1 mg/kg

프레드니손은 12주 후에 중단될 것이다. 프레드니손의 정확한 용량은 다음으로 더 높은 임상적으로 실현 가능한 용량으로 조정될 수 있다.

시롤리무스

벡터 투여 2일 전 (-2일): 4시간마다 시롤리무스 1 mg/m2의 로딩 용량 x 3회 용량이 투여될 것이다

-1일부터: 1-3 ng/ml의 목표 혈중 수준으로 1일 2회 용량으로 분할된 시롤리무스 0.5 mg/m²/일

시롤리무스는 48주 방문 후에 중단될 것이다.

타크로리무스

타크로리무스는 2일 (IP 투여 다음 날)에 1일 2회 0.05 mg/kg의 용량으로 시작하고, 24주 동안 2-4 ng/mL의 혈중 수준을 달성하도록 조정될 것이다.

24주 방문에서 시작하여, 타크로리무스는 8주에 걸쳐 점점 줄어들 것이다. 24주에는 용량이 대략 50%까지 감소될 것이다. 28주에는 용량이 대략 50%까지 더 감소될 것이다. 타크로리무스는 32주에 중단될 것이다.

rAAV9.hIDUA는 IC 투여에 의해 단일 균일 용량으로 투여된다: 1 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량의 용량 (4개월 이상 9개월 미만의 환자의 경우 6.0 Х　10¹²GC; 9개월 이상 18개월 미만의 환자의 경우 1 Х 10¹³ GC; 18개월 이상 3세 미만의 환자의 경우 1.1 Х 10¹³ GC), 또는 5 Х　10¹⁰ GC/g 뇌 질량의 용량 (4개월 이상 9개월 미만의 환자의 경우 3 Х　10¹³GC; 9개월 이상 18개월 미만의 환자의 경우 5 Х 10¹³ GC; 18개월 이상 3세 미만의 환자의 경우 5.5 Х 10¹³ GC). 상기 용량은 약 5 내지 20 ml의 용적이 될 수 있다.

rAAV9.IDUA의 투여를 위해, 대상체는 전신 마취된다.

6.11 실시예 11: MPS I의 임상 프로토콜 치료

o 순차적 시험에서 >1　표준 편차의 감소.

ㆍ MRI (또는 가돌리늄)에 대한 임의의 금기 사항이 있음.

ㆍ 추정 사구체 여과율 (eGFR)이 <30 mL/분/1.73 m²임.

3세 미만의 환자의 경우, rAAV9.hIDUA는 IC 투여에 의해 단일 균일 용량으로 투여된다: 2 Х 10⁹ GC/g 뇌 질량의 용량 (4개월 이상 9개월 미만의 환자의 경우 1.2 Х　10¹²GC; 9개월 이상 18개월 미만의 환자의 경우 2.0 Х 10¹² GC; 18개월 이상 3세 미만의 환자의 경우 2.2 Х 10¹² GC) 또는 1 Х　10¹⁰ GC/g 뇌 질량의 용량 (4개월 이상 9개월 미만의 환자의 경우 6.0 Х　10¹²GC; 9개월 이상 18개월 미만의 환자의 경우 1.0 Х 10¹³ GC; 18개월 이상 3세 미만의 환자의 경우 1.1 Х 10¹³ GC). 상기 용량은 약 5 ml 이하의 용적이 될 수 있다.

rAAV9.IDUA의 투여를 위해, 대상체는 전신 마취된다.

6.12 실시예 12: MPS I의 임상 프로토콜 치료

ㆍ 55 이상의 지능 지수 (IQ) 점수

환자는 보조 기구를 사용하거나 사용하지 않고 필요한 프로토콜시험을 완료하기에 충분한 청각 및 시각 능력을 가져야 하며, 해당되는 경우, 시험일에 보조 기구를 착용하는 데 기꺼이 따라야 한다.

ㆍ MRI (또는 가돌리늄)에 대한 임의의 금기 사항이 있음.

ㆍ 추정 사구체 여과율 (eGFR)이 <30 mL/분/1.73 m²임.

코르티코스테로이드

2일 내지 2주 말: 0.5 mg/kg/일

3주 및 4주: 0.35 mg/kg/일

5주 내지 8주: 0.2 mg/kg/일

9주 내지 12주: 0.1 mg/kg

시롤리무스

시롤리무스는 48주 방문 후에 중단될 것이다.

타크로리무스

rAAV9.hIDUA는 IC 투여에 의해 단일 균일 용량으로 투여된다: 2 Х 10⁹ GC/g 뇌 질량의 용량 (4개월 이상 9개월 미만의 환자의 경우 1.2 Х　10¹²GC; 9개월 이상 18개월 미만의 환자의 경우 2.0 Х 10¹² GC; 18개월 이상 3세 미만의 환자의 경우 2.2 Х 10¹² GC) 또는 1 Х　10¹⁰ GC/g 뇌 질량의 용량 (4개월 이상 9개월 미만의 환자의 경우 6.0 Х　10¹²GC; 9개월 이상 18개월 미만의 환자의 경우 1.0 Х 10¹³ GC; 18개월 이상 3세 미만의 환자의 경우 1.1 Х 10¹³ GC). 상기 용량은 약 5 내지 20 ml의 용적이 될 수 있다.

rAAV9.IDUA의 투여를 위해, 대상체는 전신 마취된다.

6.13 실시예 13: MPS I의 임상 프로토콜 치료

다음 예는 MPS I를 치료하기 위해 AAV-작제물 1로 인간 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있는 프로토콜을 설정한다. AAV-작제물　1은 hIDUA 발현 카세트를 함유하는 혈청형 9 캡시드의 비-복제 재조합 AAV이고, 이는 CB7 프로모터, 닭 베타 액틴 인트론, 및 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호를 함유한다. AAV-작제물　1의 벡터 게놈의 개략도는 도 6에서 도시된다.

AAV9 혈청형은 IC 투여 이후 CNS에서 hIDUA 단백질의 효율적 발현을 허용한다. 벡터 게놈은 AAV2-역방위 말단 반복 (ITR)이 측면에 있는 hIDUA 발현 카세트를 함유한다. 카세트로부터 발현은 CB7 프로모터, CMV 최초 인핸서 (C4)와 닭 베타 액틴 프로모터 사이 하이브리드에 의해 구동된다. 이 프로모터로부터 전사는 닭 베타 액틴 인트론의 존재에 의해 향상된다. 발현 카세트를 위한 폴리아데닐화 신호는 토끼 베타-글로빈 유전자에서 나온다.

마지막 조사 제품은 0.001% Pluronic® F68이 있는 변형된 Elliotts B® 용액내 AAV 벡터 활성 구성성분(AAV9.CB7.hIDUA)의 냉동된 용액으로서 공급되고, CRYSTAL ZENITH® (CZ) 바이알내 2-mL로 충전되고, 라텍스가 없는 고무 스토퍼 및 알루미늄 플립-오프 실(flip-off seal)로 밀봉된다. 바이알은 ≤-60℃에서 보관되어야 한다. 각 조사 제품 로트의 (GC/mL로) 농도는 보고될 것이다. 양쪽 더 낮은 용량 및 더 높은 용량에 대하여 전달된 제품의 총 용적은 적절한 희석이 투여에 앞서 실시된 후 (유아에서 ~50 mL 및 성인 뇌에서 150 mL인 것으로 추정된) 총 CSF 용적의 10%를 초과하지 않을 것이다.

MPS I 질환의 치료를 위한 성공적인 유전자 요법은, 하기를 포함하여, 현재 이용가능한 요법보다 몇몇 이점을 제공할 것이다: 치료적 이식유전자 산물의 장기간 발현, 이에 의한 만성, 평생 치료에 대한 필요성 제거 (또는 유의하게 감소); MPS I의 CNS 표시를 보다 신속하게 중단하거나 유의하게 지연시키는 능력; 허용가능한 안전성 및 내약성 프로파일 제공.

6.13.1. 연구 목적 (일차 평가변수)

24 주 동안 안전성 및 내약성: 유해 사례 (AE) 및 심각한 유해 사례 (SAE).

6.13.2. 연구 목적 (이차 평가변수)

104 주 동안 안전성: AE 보고, 실험실 평가, 활력 징후, 심전도 (ECG), 신체 검사, 및 신경학적 평가.

신경인지 테스트 (웩슬러 약식 지능 검사 [WASI-II]), 베일리 영유아 발달 검사, 제3판 (Bayley-III) 및/또는 웩슬러 유치원생 및 초등학생 지능 검사, 제4판 (WPPSI-IV)], 적응 행동 (Vineland-3)에 대한 임상적으로 검증된 도구.

6세 이하 대상체에 대하여 주의력에 대한 임상적으로 검증된 도구 (주의력 변수 검사 [TOVA]).

바이러스 배출: CSF, 혈청, 및 소변에서 벡터 농도 (AAV-작제물 1 DNA에 대한 qPCR).

6.13.3. 연구 목적 (외삽 평가변수)

면역원성 측정.

· AAV9에 대한 중화 항체 및 CSF 및 혈청내 IDUA에 대한 결합 항체.

· ELISPOT 검정: AAV9 및 IDUA에 대한 T-세포 반응.

· 유세포 분석: AAV- 및 IDUA-특이적 조절 T 세포.

뇌의 MRI에 의해 평가된 CNS 구조적 이상.

청각 뇌간 반응 테스트 또는 행동 청력 측정 및 이음향 방출 테스트에 의해 측정된 청각 능력 변화.

Peds QL에 의해 측정된 삶의 질.

수면 평가.

판막 질환 및 좌심실 질량 지수에 대한 심초음파에 의한 심장 평가.

혈장 (GAG 및 IDUA), 백혈구 (IDUA), CSF (GAG, IDUA, 및 정자 수준), 및 소변 (GAG)에서 PD 바이오마커.

IV ERT를 중단하는 대상체에서 혈장 (GAG 및 IDUA), CSF (GAG 및 IDUA), 및 소변 (GAG)에서 PD 바이오마커.

신체 증상 점수.

복부의 초음파에 의해 평가된 간 및 비장 크기.

질환의 임상 평가.

질환의 환자 보고 결과 평가.

일상 생활의 활동.

6.13.4. 연구 설계

이것은 MPS I 및 CNS 관여의 문서화된 증거를 갖는 대상체 (4개월 이하)로 AAV-작제물 1의 I/II 상, 인간 최초, 다기관, 공개 라벨, 단일-아암 용량 증량 연구이다. IV 라로니다아제 치료를 이전에 받았거나 현재 받고 있는 대상체는 참가하기에 적격이다. AAV-작제물 1을 이용한 치료는 이 집단에서 신경인지 이익을 잠재적으로 초래할 수 있다. MPS I이 있는 대략 5명의 대상체는 2개 용량 코호트, 1 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량 또는 5 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량으로 치료될 것이고, 수조내 (IC) 또는 뇌실내 (ICV) 주사에 의해 투여된 AAV-작제물 1의 단일 용량을 받을 것이다. 안전성은 치료후 초기 24 주 (일차 연구 기간) 동안 일차 초점일 것이다. 일차 연구 기간의 완료 이후, 대상체는 AAV-작제물 1로 치료 이후 최대 총 104 주 동안 계속 (안전성 및 효능) 평가될 것이다. 연구의 끝에, 모든 대상체는 장기 관찰 추적 연구에 참가하도록 초대될 것이다.

첫 번째 코호트는 1 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량을 받도록 2명의 적격 대상체를 포함할 것이고 두 번째 코호트는 5 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량을 받도록 3명의 적격 대상체를 포함할 것이다. AAV-작제물 1이 각 코호트의 첫 번째 대상체 (센티넬)에 투여된 후 안전성 평가를 위하여 8 주 관찰 기간이 있을 것이다. 후원사 내부 안전 위원회 (ISC)는 코호트 1의 첫 번째 대상체에 대하여 처음 8주 동안 수득된 안전성 데이터 (8 주 방문 동안 수득된 데이터 포함)를 검토할 것이고, ISC에 의해 확인된 안전성 문제가 없다면, 두 번째 대상체는 AAV-작제물 1을 받을 수 있다.

잠재적 대상체는 용량화 이전 -60 일 내지 -2 일 스크리닝되어 연구를 위한 적격성을 결정할 것이다. 적격성 기준을 충족시키는 그들 대상체는 (기관 관행에 따라) -2 일과 1 일의 아침 사이에 병원에 입원될 것이고, 기초 평가는 용량화전 수행될 것이다. 스크리닝이 완료된 부위 이외 용량화 부위로 이동해야 하는 대상체에 대하여, 관련한 의료 정보를 공유하기 위한 통신 계획은 대상체가 이동하기 전에 2개 부위 사이 이행될 것이다. 적격성은 용량화 전에 용량화 부위에서 확인될 것이다. 대상체는 1 일에 AAV-작제물 1의 단일 IC 또는 ICV 용량을 받을 것이고 관찰을 위하여 용량화 후에 대략 30 내지 36 시간 동안 병원에 남아 있을 것이다. 일차 연구 기간에서 (즉, 24 주까지) 후속 평가는 4 주 동안 매주 그리고 8, 12, 16, 20, 및 24 주에 수행될 것이다. 일차 평가 기간 후에, 방문은 28, 32, 40, 48, 52, 56, 64, 78, 및 104 주에 있을 것이다. 20 및 28 주 평가는 전화 연락에 의한 AE 및 병용 요법의 평가로 제한될 것이다.

모든 대상체는 (효능을 감소시킬 수 있는) IDUA에 대한 항체의 형성 또는 증가 그리고 이식유전자를 발현시키는 조직 또는 캡시드에 대해 임의의 면역 매개된 반응과 연관된 위험을 최소화하기 위해 연구에서 면역억제 (IS)를 초기에 받을 것이다. IS 요법은 코르티코스테로이드 (투여 전 1 일에 한 번 IV 메틸프레드니솔론 10 mg/kg, 및 2 일에 0.5 mg/kg/일로 시작하여 12 주까지 점점 줄어들다 중단되는 경구 프레드니손), 타크로리무스 (2 일 내지 24 주에 2-4 ng/mL의 목표 혈중 수준으로 입으로 1일 2회 0.05 mg/kg, 및 24 주 내지 32 주 사이의 8 주에 걸쳐 점점 줄어듬), 및 시롤리무스 (-2 일에 4 시간마다 1 mg/m²의 로딩 용량 x 3회 용량, 그리고 나서 -1 일부터 48 주까지 1-3 ng/ml의 목표 혈중 수준으로 1일 2회 용량으로 분할된 시롤리무스 0.5 mg/m²/일)를 포함할 것이다. 신경학적 평가 및 타크로리무스/시롤리무스 혈중 수준 모니터링은 수행될 것이다. 시롤리무스 및 타크로리무스의 용량은 목표 범위에서 혈중 수준을 유지하도록 조정될 것이다.

IS 요법이 48 주 후에 계획되지 않는다. IS가 임상적으로 관련한 면역 반응을 제어하기 위해 48 주 후에 요구되면, 적절한 면역억제 요법은, 임상적으로 지시된 대로, 의료 모니터와 논의에서, PI에 의해 결정될 것이다.

6.13.5. 연구 집단의 선택

MPS I로 인한 신경인지 결손을 문서화한 4 개월 이하인 대략 5명의 대상체는 조사 제품으로 치료될 것이다.

6.13.5.1 포함 기준

이 연구에서 참가에 적격이기 위해, 대상체는 하기 기준의 모두를 충족시켜야 한다:

1) 4 개월 이하인 남성 또는 여성.

2) 연구의 성격이 설명된 후 및 연구-관련 절차 이전에 서면으로, 서명된 사전 동의서를 제공할 의사가 있고 제공할 수 있음. 대상체가 사전 동의서를 제공할 수 없다면, 사전 동의서는 수득될 것이고, 사전 동의서는 대상체의 법적 보호자에 의해 제공되어야 함.

3) 백혈구 및 섬유아세포에서 IDUA 결핍에 의해 확인된 MPS I의 이전에 문서화된 진단이 있음.

4) 임의의 다른 신경학적 또는 정신과적 요인에 의해 설명할 수 없다면, 하기 기준 중 1개를 기반으로 MPS I로 인한 CNS 관여의 증거를 문서화함:

a) 신경인지 테스트 또는 신경심리학 기능의 1개 도메인에서 평균 미만의 ≥ 1 표준편차의 점수.

b) 3 내지 36 개월 사이 떨어져 투여된 순차적 신경인지 테스트 또는 신경심리학 기능의 1개 도메인에서 > 1 표준 편차의 감소.

c) 중증 표현형을 예측하는 이대립유전자성 돌연변이에 의해 확인된 중증 MPS I의 문서화된 진단이 있음 또는 MPS I 및 동일한 IDUA 돌연변이로 임상적으로 진단된 동류가 있음. 이 대상체는 신경인지 결손의 문서화된 증거를 가질 필요가 없음.

5) 조혈모세포 이식 (HSCT)을 받은 대상체는 연구 책임자 (PI), 의료 모니터, 및 후원자가 연구에 안전하고 성공적으로 참가할 수 있음을 동의하면 연구에 등록할 수 있음.

6) 필요한 프로토콜 테스트를 완료하기 위해, 보조기의 유무에 관계없이, 충분한 청각 및 시각 능력이 있고, 해당되는 경우, 테스트 일에 보조기를 착용할 의향이 있음.

7) 가임기 여성은 스크리닝 방문시 혈청 임신 검사가 음성이어야 하고, 1 일에 음성 소변 결과가 음성이어야 하고, 연구 동안 추가의 임신 테스트를 할 의사가 있어야 함.

8) 성적으로 활발한 남성 대상체는 스크리닝 방문부터 벡터 투여 후 24 주까지 의료적으로 허용된 배리어 피임법 (예를 들면, 콘돔 또는 여성 다이아프램)을 기꺼이 사용해야 함. 이 시점 후에 피임의 중단은 대상체의 의사와 상의해야 함.

9) 성적으로 활발한 여성은 스크리닝 방문부터 시롤리무스 또는 타크로리무스의 마지막 용량 후 12 주 중 더 늦은 날짜까지 효과적인 피임 방법을 기꺼이 사용해야 함. 이 시점 후에 피임의 중단은 대상체의 의사와 상의해야 함. 효과적인 피임 방법은 이중 차단 방법 (예를 들면, 남성 콘돔에 더하여 다이아프램), 자궁내 장치, 또는 호르몬 피임법을 포함함. 지속적인 금욕은 허용가능한 관행이지만; 주기적인 금욕, 리듬법, 및 금단법은 허용가능한 피임법이 아님.

6.13.5.2 제외 기준

하기 제외 기준 중 임의의 것을 충족시키는 대상체는 연구에 참가할 자격이 없을 것이다:

1) MRI, 조영제 또는 전신 마취에 금기 사항이 있음.

a) 가돌리늄에 임의의 금기 사항이 있음.

b) 크레아티닌을 기반으로 한 추정된 사구체 여과율 (eGFR) < 30 mL/분/1.73 m²에 의해 결정된 신부전증이 있음. 크레아티닌 수준이 검정 검증 또는 검출의 하한 미만임을 실험실이 결정하면, 하한선 컷오프 값은 eGFR을 추정하는데 사용될 것임.

2) 하기 중 임의의 것을 포함하는, IC 또는 ICV 주사를 위한 금기 사항이 있음:

a) 연구에 참가하는 신경방사선과의사/신경외과의사의 팀에 의한 기초 MRI 테스트 검토 (부위당 1개)는 IC 또는 ICV 주사에 대한 금기 사항을 보여줌.

b) 연구에 참가하는 신경방사선과의사/신경외과의사의 팀에 의해 이용가능한 정보의 검토에 근거한, IC 및 ICV 주사에 대한 금기 사항을 초래한, 이전 두경부 수술의 이력.

c) 조사자 및 신경방사선과의사/신경외과의사의 팀의 의견으로, IC 및 ICV 주사에 대한 금기 사항인 임상적으로 유의한 두개내 출혈을 이전에 경험한 적이 있음.

3) MPS I로 인한 것이 아닌 임의의 신경인지 결손이 있거나, PI의 의견으로, 연구 결과의 해석을 혼란스럽게 할 수 있는 신경정신병적 병태의 진단을 받음.

4) 요추 천자에 대한 금기 사항이 있음.

5) 언제든지 IT 라로니다아제를 받았고, PI의 의견으로, 대상체를 과도한 위험에 빠뜨릴 IT 투여에 관련하여 고려된 유의한 AE를 경험함.

6) 언제든지 IV 라로니다제를 받았고, PI의 의견으로, 대상체를 과도한 위험에 빠뜨릴 IV 투여와 관련하여 고려된 유의한 AE를 경험함.

7) 스크리닝 전에 적어도 3 개월 동안 완전 관해되지 않은 피부의 편평 세포 또는 기저 세포 암종 이외의 또 다른 암의 병력 또는 림프종의 임의의 병력이 있음.

8) 최대 의료에도 불구하고 조절되지 않는 고혈압 (수축기 BP > 180 mmHg, 이완기 BP > 100 mmHg)이 있음.

9) 대상체가 이전에 알려진 길버트 증후군의 병력이 있고 총 빌리루빈의 35% 미만 결합형 빌리루빈을 보여주는 분별된 빌리루빈이 있음을 제외하면, 스크리닝시 ALT 또는 AST > 3 × ULN 또는 총 빌리루빈 > 1.5 × ULN을 가짐.

10) 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 또는 B형 간염 또는 C형 간염 바이러스 감염의 병력이 있거나, B형 간염 표면 항원 또는 B형 간염 코어 항체, 혹은 C형 간염 또는 HIV 항체에 대한 양성 스크리닝 테스트를 가짐.

11) 사전 동의 형식 (ICF)의 서명 전 30 일 또는 5 반감기 중 더 긴 기간 이내에 임의의 조사 제품을 받았음.

12) 임상 현장 직원 또는 연구의 수행에 관여된 임의의 기타 개인의 1차 가족 구성원이거나, 임상 현장 직원 또는 연구의 수행에 관여된 임의의 기타 개인임.

13) 임신 중, 산후 <　6주, 스크리닝시 모유수유 중, 또는 사전 동의서의 서명부터 52 주까지 언제든지 임신 계획이 있음 (자신 또는 파트너). 52 주 후에 임신할 계획은 대상체의 의사와 상의되어야 함.

14) 스크리닝 전 1 년 이내에 알코올 또는 약물 남용의 병력이 있음.

15) PI의 의견으로, 대상체의 안전성을 손상시킬 임상적으로 유의한 ECG 이상이 있음.

16) PI의 의견으로, 대상체의 안전성이나 연구에 성공적인 참가 또는 연구 결과의 해석을 손상시킬 심각하거나 불안정한 의학적 또는 심리학적 병태가 있음.

면역억제 요법에 관련된 제외 기준:

17) 타크로리무스, 시롤리무스, 또는 프레드니손에 대한 과민 반응의 병력.

18) 중증 면역결핍증 (예를 들면, 공통 가변성 면역결핍증 증후군), 비장절제술, 또는 대상체가 감염되기 쉬운 임의의 기저 병태의 병력.

19) 스크리닝의 적어도 12 주 전에 완전히 해결되지 않은 수두-대상포진 바이러스, 대상포진 (대상포진(shingles)), CMV, 또는 EBV 감염.

20) 2차 방문의 적어도 8 주 전에 해결되지 않은 비경구 항감염제로 입원 또는 치료가 필요한 임의의 감염.

21) 2차 방문 전 10 일 이내에 경구 항감염제 (항바이러스제 포함)가 필요한 임의의 활성 감염.

22) 활동성 결핵 (TB)의 병력 또는 스크리닝 동안 양성 QuantiFERON-TB Gold 테스트.

23) -2 일 전 4주 이내에 임의의 생 백신.

24) ICF 서명하기 전 8 주 이내에 대수술 또는 연구 기간 동안 계획된 대수술.

25) 절대 호중구 수 < 1.3 × 10³/μL.

26) PI가 면역억제 요법에 적절하지 않을 것임을 믿는 임의의 병태 또는 실험실 이상.

6.13.6. 투여된 치료

AAV-작제물 1은 단일 IC 주사로서 우선적으로 투여될 것이거나, IC 투여가 어렵거나 잠재적으로 불안전한 것으로 입증한다면 단일 ICV 주사로서 투여되어, 국한된 CSF 구획 내에서 표적 조직에 벡터의 직접 전달을 허용할 것이다. 경추 천자 (C1-C2)가 척수조영술을 위한 조영제 투여에 사용되는 일상적인 임상 절차이어도, 영상-보조 후두하 천자는 주요 임상 투여의 루트로서 제안된다. 이것은 비임상 연구에서 사용된 투여의 루트를 복제하고 MPS I을 가진 환자가 C1-C2 경막내 (IT) 공간의 비정상적 협착의 발생률이 높기 때문에 의도된 환자 집단에서 C1-C2 천자보다 유리한 것으로 간주되고, 이는 C1-C2 천자와 연관된 위험을 실질적으로 증가시킨다. 절차에 앞서, 각 대상체는 연구에 참가하는 신경방사선과의사/신경외과의사의 팀에 의해 검토된 영역의 자기 공명 영상 (MRI)을 가질 것이다. IC 주사로 진행하는 것이 안전하지 않은 것으로 간주되면, 대상체는 ICV 주사에 대해 고려될 것이다. ICV 주사는 소아 및 성인 개인의 뇌실복강간 단락술 배치에 그리고, 보다 최근에는, CNS 약물 투여에 일반적으로 사용된 루트이다 (Drake 등, 2000, Childs Nerv Syst 16(10-11):800-804; Cohen-Pfeffer 등, 2017, Pediatric Neurology 67:23-25; 및 Slavc 등, 2018, Mol Genetics and Metabolism 124(2018):184-188). 영상-보조 단일 ICV 주사는, 이 프로토콜에서 제안된 대로, 정위 뇌 생검에 필적하고, 이는 정밀 MRI 및 컴퓨터 단층촬영 (CT) 기술의 출현으로 일상적인 신경외과 개입이 또한 되었다. AAV-작제물　1로 MPS II 마우스에서 실행된 약리학 연구로부터, AAV9 벡터-기반 제품의 생체분포 및 이식유전자 발현 프로파일이 ICV 및 IC 루트에 필적하는 것으로 나타나, IC 투여가 어렵거나 잠재적으로 불안전한 것으로 입증한다면 대체 투여의 루트로서 ICV의 사용을 지원하였다.

2개 용량 수준은 연구될 것이다: 1 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량 및 5 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량. 대상체는 IP의 1개 초과 용량을 받지 않을 것이다.

발달 중인 아동에서 초기에 발생하는 비교적 신속한 뇌 성장 때문에, AAV-작제물　1 투여된 IC의 총 용량은 연구 대상체의 스크리닝 뇌 MRI에서 유래된 추정된 뇌 질량에 의존한다. 그들의 MRI로부터 연구 대상체의 추정된 뇌 용적은, 표 2에서 제시된 대로, 뇌 질량으로 전환되고 투여될 정확한 용량을 계산하는데 사용될 것이다. 적절한 용량을 결정하는 단계는 (1) 스크리닝 뇌 MRI로부터 cm³의 대상체 뇌 용적을 수득하고; (2) 대상체의 MRI 뇌 용적을 뇌 질량으로 다음과 같이 전환하고: 뇌 질량 = (cm3로 뇌 용적) x 1.046 g/cm³ (itis.swiss/virtual-population/tissue-properties/database/density에서 취득된 뇌 밀도); 그리고 (3) 표 2에서 나타난 대로 적절한 용량을 확인하는 것이다.

6.13.7. 면역억제 요법 투여

코르티코스테로이드

· 벡터를 투여하는 날 아침 (투여 전 1일)에 환자에게 적어도 30분에 걸쳐 메틸프레드니솔론 10 mg/kg 정맥내 (IV) (최대 500 mg)가 투여될 것이다. 메틸프레드니솔론은 요추 천자 및 조사 제품의 IC 주사 전에 투여되어야 한다. 아세트아미노펜 및 항히스타민제를 사용한 예비 투약은 연구자의 재량에 따라 선택 사항이다.

· 2일에, 경구 프레드니손은 12 주까지 프레드니손 중단을 목표로 시작될 것이다. 프레드니손의 용량은 다음과 같을 것이다:

o 2일 내지 2주 말: 0.5 mg/kg/일

o 3주 및 4주: 0.35 mg/kg/일

o 5-8주: 0.2 mg/kg/일

o 9-12주: 0.1 mg/kg

o 프레드니손은 12 주 후에 중단될 것이다. 프레드니손의 정확한 용량은 다음으로 더 높은 임상적으로 실용적 용량으로 조정될 수 있다.

시롤리무스

· 벡터 투여 2일 전 (-2일): 4시간마다 시롤리무스 1 mg/m²의 로딩 용량 x 3회 용량이 투여될 것이다

· -1일부터: 1-3 ng/ml의 목표 혈중 수준으로 1일 2회 용량으로 분할된 시롤리무스 0.5 mg/m²/일

· 시롤리무스는 48주 방문 후에 중단될 것이다.

타크로리무스

· 타크로리무스는 2일 (조사 제품 투여 다음 날)에 1일 2회 0.05 mg/kg의 용량으로 시작하고, 24주 동안 2-4 ng/mL의 혈중 수준을 달성하도록 조정될 것이다.

· 24주 방문에서 시작하여, 타크로리무스는 8주에 걸쳐 점점 줄어들 것이다. 24주에는 용량이 대략 50%까지 감소될 것이다. 28주에는 용량이 대략 50%까지 더 감소될 것이다. 타크로리무스는 32주에 중단될 것이다.

· 타크로리무스 및 시롤리무스 혈중 수준 모니터링은 실행될 것이다.

6.13.1. 효능 평가

신경인지 테스트를 위한 검증된 도구: WASI-II, Bayley-III 및/또는 WPPSI-IV, 적응 행동 (Vineland-3), 및 주의력 (TOVA)

혈장 (GAG 및 IDUA), 백혈구 (IDUA), CSF (GAG, IDUA, 및 정자 수준), 및 소변 (GAG)에서 바이오마커.

요추 천자는 조사 부위의 표준 관행에 따라 수행될 것이다.

신체 증상 점수.

뇌의 MRI는 방문시에 수행될 것이다. 추정된 사구체 여과율은 가돌리늄으로 스크리닝 MRI 전에 문서화되어야 한다. 조사자는 eGFR이 < 30mL/분/1.73m²이면 스크리닝 MRI로 진행하기 전에 의료 모니터와 상의해야 한다.

복부 초음파는 장형 타원체 공식 (0.52 Х 길이 Х 전후 치수 Х 너비)을 사용하여 계산된 비장 용적 및 쇄골 중앙선에서 상하 간 직경 (Kratzer 등, J Ultrasound Med 22:1155-1161, 2003)을 문서화하기 위해 방문시에 수행될 것이다.

6.14 실시예 14: 점액다당류증 I형을 가진 환자에서 수조내 AAV-작제물 1 유전자 요법의 안전성, 내약성, 및 약력학을 평가하기 위한 I/II 상 다기관, 공개 라벨 연구

하기 예는 MPS I 및 CNS 관여의 문서화된 증거를 갖는 대상체 (4개월 이상)로 AAV-작제물 1의 I/II 상, 인간 최초, 다기관, 공개 라벨, 단일-아암 용량 증량 연구이다. IV 라로니다아제 치료를 이전에 받았거나 현재 받고 있는 대상체는 참가하기에 적격이다. AAV-작제물 1을 이용한 치료는 이 집단에서 신경인지 이익을 잠재적으로 초래할 수 있다. MPS I이 있는 대략 5명의 대상체는 2개 용량 코호트, 1 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량 또는 5 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량으로 치료될 것이고, IC 또는 ICV 주사에 의해 투여된 AAV-작제물 1의 단일 용량을 받을 것이다. 안전성은 치료후 초기 24 주 (일차 연구 기간) 동안 일차 초점일 것이다. 일차 연구 기간의 완료 이후, 대상체는 AAV-작제물 1로 치료 이후 최대 총 104 주 동안 계속 (안전성 및 효능) 평가될 것이다. 연구의 끝에, 모든 대상체는 장기 관찰 추적 연구에 참가하도록 초대될 것이다.

첫 번째 코호트는 1 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량을 받도록 2명의 적격 대상체를 포함할 것이고 두 번째 코호트는 5 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량을 받도록 3명의 적격 대상체를 포함할 것이다. AAV-작제물 1이 각 코호트의 첫 번째 대상체 (센티넬)에 투여된 후 안전성 평가를 위하여 8주 관찰 기간이 있을 것이다. 후원사 내부 안전 위원회 (ISC)는 코호트 1의 첫 번째 대상체에 대하여 처음 8주 동안 수득된 안전성 데이터 (8주 방문 동안 수득된 데이터 포함)를 검토할 것이고, ISC에 의해 확인된 안전성 문제가 없다면, 두 번째 대상체는 AAV-작제물 1을 받을 수 있다. 코호트 1의 두 번째 대상체와 코호트 2의 첫 번째 대상체 사이 안전성에 대하여 4주 관찰 기간이 있을 것이다. 각 용량화된 대상체의 안전성 및 내약성은 검토될 것이다. SRT 사례가 관찰되지 않으면, 두 번째 대상체에 대하여 4주 관찰을 포함하여, 첫 번째 코호트에 대하여 모든 이용가능한 안전성 데이터는 독립 데이터 모니터링 위원회 (IDMC)에 의해 평가될 것이다. 결정이 두 번째 코호트 (5 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량)로 진행하는 것이면, 후속 3명의 대상체는 초기 코호트 (코호트 2에서 첫 번째 대상체 후에 8주 관찰 기간 그리고 코호트 2에서 대상체 2 및 3 후에 4주 관찰 기간)로서, 또는 달리 임상 데이터 및/또는 IDMC의 검토에 의해 표시된 대로 유사한 용량화 기획을 따를 것이다.

잠재적 대상체는 용량화 이전 -60일 내지 -2일 스크리닝되어 연구를 위한 적격성을 결정할 것이다. 적격성 기준을 충족시키는 그들 대상체는 (기관 관행에 따라) -2일과 1일의 아침 사이에 병원에 입원될 것이고, 기초 평가는 용량화전 수행될 것이다. 대상체는 1 일에 AAV-작제물 1의 단일 IC 또는 ICV 용량을 받을 것이고 관찰을 위하여 용량화 후에 대략 30 내지 36 시간 동안 병원에 남아 있을 것이다. 일차 연구 기간에서 (즉, 24 주까지) 후속 평가는 4 주 동안 매주 그리고 8, 12, 16, 20, 및 24 주에 수행될 것이다. 일차 평가 기간 후에, 방문은 28, 32, 40, 48, 52, 56, 64, 78, 및 104 주에 있을 것이다. 20 및 28 주 평가는 전화 연락에 의한 AE 및 병용 요법의 평가로 제한될 것이다.

모든 대상체는 효능을 감소시킬 수 있는 IDUA에 대한 항체의 형성 또는 증가와 연관된 임의의 위험을 최소화하기 위해 뿐만 아니라 이식유전자를 발현시키는 조직 또는 캡시드에 대해 임의의 면역-매개된 반응의 위험을 최소화하기 위해 연구에서 IS를 초기에 받을 것이다. 본 연구에서 이행된 면역억제 요법은 코르티코스테로이드 (투여 전 1 일에 한 번 정맥내 (IV) 메틸프레드니솔론 10 mg/kg, 및 2 일에 0.5 mg/kg/일로 시작하여 12 주까지 점점 줄어들다 중단되는 경구 프레드니손), 타크로리무스 (2 일 내지 24 주에 2-4 ng/mL의 목표 혈중 수준으로 입으로 [PO] 1일 2회 [BID] 0.05 mg/kg, 및 24 주 내지 32 주 사이의 8 주에 걸쳐 점점 줄어듬), 및 시롤리무스 (-2 일에 4 시간마다 1 mg/m²의 로딩 용량 x 3회 용량, 그리고 -1 일에 시작하여, 48 주까지 1-3 ng/ml의 목표 혈중 수준으로 BID 분할된 0.5 mg/m²/일)를 포함할 것이다. 신경학적 평가 및 타크로리무스/시롤리무스 혈중 수준 모니터링은 수행될 것이다. 시롤리무스 및 타크로리무스의 용량은 목표 범위에서 혈중 수준을 유지하도록 조정될 것이다.

NHP 안전성 연구 성과 및 IC 절차에 관한 잠재적 안전성 위험을 감안하면, 집중된 신경학적 평가 및 체성감각 유발된 전위 테스트를 포함하는 긴밀한 신경학적 모니터링은 사용될 것이다.

AAV-작제물　1의 안전성 및 내약성은 AE 및 심각한 유해 사례 (SAE), 화학, 혈액학, 소변검사, CSF 염증의 마커, 면역원성, 벡터 배출 (벡터 농도), 활력 징후, 심전도 (ECG), 및 신경학적 평가를 포함하는 신체 검사의 평가를 통해서 모니터링될 것이다. 순환하는 바이러스 게놈 (엡스타인-바 바이러스 [EBV] 및 거대세포바이러스 [CMV])의 검출을 위한 직렬 중합효소 연쇄 반응 (PCR)은 또한 대상체가 IS를 받고 있는 동안 수행될 것이다.

이차 효능 평가는 CSF, 혈장, 및 소변에서 바이오마커의 수준 및 신경인지 감소의 측정을 포함할 것이다.

조사 제품, 용량, 및 투여의 루트

· AAV-작제물　1: AAV9.CB7.hIDUA (재조합 아데노-관련 바이러스 혈청형 9 캡시드 함유 인간 α-L-이두로니다아제 발현 카세트)

· 2개 용량 수준: 1 Х 10¹⁰ 게놈 사본 (GC)/g 뇌 질량 또는 5 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량

· 수조내 (IC)를 통해 투여된 단일-용량 또는, 이 투여의 루트가 옵션이 아니라면, 뇌실내 (ICV) 투여

일차 목적:

· MPS I로 인해 CNS 침범을 문서화한 대상체에게 투여된 단일 IC 또는 ICV 용량 이후, 1 내지 24 주 AAV-작제물의 안전성 및 내약성을 평가하는 것

이차 목적:

· 104 주 동안 AAV-작제물　1의 장기간 안전성 및 내약성을 평가하는 것

· 104 주 동안 인지 및 적응 기능의 신경발달적 파라미터에 관한 AAV-작제물　1의 효과를 평가하는 것

· CSF, 혈장, 및 소변에서 벡터 배출을 평가하는 것

탐구 목적:

· AAV-작제물　1의 면역원성을 평가하는 것

· CNS 영상화에 관한 AAV-작제물　1의 효과를 탐구하는 것

· 청각 능력에 관한 AAV-작제물　1의 효과를 탐구하는 것

· 삶의 질 (QOL)에 관한 AAV-작제물　1의 효과를 탐구하는 것

· 뇌척수액 (CSF), 혈장 및 소변에서 바이오마커에 관한 AAV-작제물　1의 약력학 (PD) 효과를 탐구하는 것

· 질환의 전신 표시에 관한 AAV-작제물　1의 효과를 탐구하는 것

· 수면 측정에 관한 AAV-작제물　1의 효과를 탐구하는 것

· 임상의 보고된 성과에 관한 AAV-작제물　1의 효과를 탐구하는 것

· 환자-보고된 성과 평가에 관한 AAV-작제물　1의 효과를 탐구하는 것

6.14.1. 포함 및 제외에 대한 진단 및 기준

이 연구에 참가하는데 적격이기 위해, 대상체는 하기 기준의 모두를 충족시켜야 한다:

1) 4 개월 이상인 남성 또는 여성.

4) 임의의 다른 신경학적 또는 정신과적 요인에 의해 설명할 수 없다면, 하기 기준 중 1개에 근거하여 MPS I로 인한 CNS 관여의 증거를 문서화함:

a) 신경인지 테스트 또는 신경심리학 기능의 1개 도메인에서 평균 미만 ≥ 1 표준편차의 점수.

5) HSCT를 받은 대상체는 PI, 의료 모니터, 및 후원자가 연구에 안전하고 성공적으로 참가할 수 있음을 동의하면 연구에 등록할 수 있음.

7) 가임기 여성은 스크리닝 방문시 혈청 임신 검사가 음성이어야 하고, 1일에 음성 소변 결과가 음성이어야 하고, 연구 동안 추가의 임신 테스트를 할 의사가 있어야 함.

8) 성적으로 활발한 남성 대상체는 스크리닝 방문부터 벡터 투여 후 24 주까지 의료적으로 허용된 배리어 피임법 (예를 들면, 콘돔 또는 여성 다이아프램)을 기꺼이 사용해야 한다. 이 시점 후에 피임의 중단은 대상체의 의사와 상의해야 함.

9) 성적으로 활발한 여성은 스크리닝 방문부터 시롤리무스 또는 타크로리무스의 마지막 용량 후 12 주 중 더 늦은 날짜까지 효과적인 피임 방법을 기꺼이 사용해야 한다. 이 시점 후에 피임의 중단은 대상체의 의사와 상의해야 한다. 효과적인 피임 방법은 이중 배리어 방법 (예를 들면, 남성 콘돔에 더하여 다이아프램), 자궁내 장치, 또는 호르몬 피임법을 포함한다. 지속적인 금욕은 허용가능한 관행이지만; 주기적인 금욕, 리듬법, 및 금단법은 허용가능한 피임법이 아님.

1) MRI, 조영제 또는 전신 마취에 금기 사항이 있음.

a) 가돌리늄에 임의의 금기 사항이 있음.

a) 현장 신경방사선과의사/신경외과의사 및 적어도 2명의 추가 후원자-지정 자격을 갖춘 신경방사선과의사/신경외과의사에 의한 기초 MRI 테스트의 검토는 IC 및 ICV 주사에 대한 금기 사항을 보여줌.

4) 요추 천자에 대한 금기 사항이 있음.

5) 언제든지 경막내 (IT) 라로니다아제를 받았고, PI의 의견으로, 대상체를 과도한 위험에 빠뜨릴 IT 투여에 관련하여 고려된 유의한 AE를 경험함.

7) 스크리닝 전에 적어도 1 년 동안 완전 관해되지 않은 피부의 편평 세포 또는 기저 세포 암종 이외의 또 다른 암의 병력 또는 림프종의 임의의 병력이 있음.

8) 최대 의료에도 불구하고 조절되지 않는 고혈압 (수축기 혈압 [BP] > 180 mmHg, 이완기 [BP] > 100 mmHg)이 있음.

11) 사전 동의 형식 (ICF)의 서명 전 1일째 또는 5 반감기 중 더 긴 날짜로부터 30일 이내에 임의의 조사 제품을 받았음.

14) 스크리닝 전 1 년 이내에 알코올 또는 약물 남용의 이력이 있음.

면역억제 요법에 관련된 제외 기준:

19) 스크리닝 적어도 12 주 전에 완전히 해결되지 않은 수두-대상포진 바이러스, 대상포진 (대상포진(shingles)), CMV, 또는 EBV 감염.

20) 2차 방문 적어도 8 주 전에 해결되지 않은 비경구 항감염제로 입원 또는 치료가 필요한 임의의 감염.

23) -2 일 전 4주 이내에 임의의 생 백신.

24) ICF 서명하기 전 8주 이내에 대수술 또는 연구 기간 동안 계획된 대수술.

25) 절대 호중구 수 < 1.3 × 10³/μL.

6.14.2. 약어의 목록

6.14.3. 뇌 중량에 의해 투여된 총 용량

MPS I이 있는 대략 5명의 대상체는 2개 용량 코호트, 1 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량 또는 5 Х 10¹⁰ GC/g 뇌 질량으로 치료될 것이고, 하기 표 7에 따라 IC 또는 ICV 주사에 의해 투여된 AAV-작제물　1의 단일 용량을 받을 것이다.

1. 뇌 MRI 스크리닝으로부터 cm³의 대상체 뇌 용적을 수득함

2. 대상체의 MRI 뇌 용적을 뇌 질량으로 전환함:

뇌 질량 = (cm³의 뇌 용적) x 1.046 g/cm³ (오류! 참조 소스 미발견., IT'IS Database for Thermal and Electromagnetic Parameters of Biological Tissues, Version 4.0으로부터 취득된 뇌 밀도)

3. 상기 표 7에서 적절한 용량을 확인함.

6.14.4. 면역억제 요법 투여

코르티코스테로이드

벡터를 투여하는 날 아침 (투여 전 1일)에 환자에게 적어도 30분에 걸쳐 메틸프레드니솔론 10 mg/kg IV (최대 500 mg)가 투여될 것이다. 메틸프레드니솔론은 요추 천자 및 조사 제품의 IC 주사 전에 투여되어야 한다. 아세트아미노펜 및 항히스타민제를 사용한 예비 투약은 연구자의 재량에 따라 선택 사항이다.

2일에, 경구 프레드니손은 12 주까지 프레드니손 중단을 목표로 시작될 것이다. 프레드니손의 용량은 다음과 같을 것이다:

· 2일 내지 2주 말: 0.5 mg/kg/일

· 3주 및 4주: 0.35 mg/kg/일

· 5주-8주: 0.2 mg/kg/일

· 9주-12주: 0.1 mg/kg

· 프레드니손은 12주 후에 중단될 것이다. 프레드니손의 정확한 용량은 다음으로 더 높은 임상적으로 실용적 용량으로 조정될 수 있다.

시롤리무스

· 시롤리무스는 48주 방문 후에 중단될 것이다.

타크로리무스

프레드니손 용량화는 0.5 mg/kg/일에 시작할 것이고 12 주 방문까지 점차적으로 줄어들 것이다.

타크로리무스 용량 조정은 처음 24 주 동안 2 내지 4 ng/mL 이내로 전혈 최저 농도를 유지하기 위해 실시될 것이다. 24 주에 용량은 대략 50%만큼 감소될 것이다. 28 주에 용량은 대략 50%만큼 추가 감소될 것이다. 타크로리무스는 32 주에 중단될 것이다. 시롤리무스 용량 조정은 1 내지 3 ng/mL 이내로 전혈 최저 농도를 유지하기 위해 실시될 것이다. 용량 조정은 임상 약사에 의해 수행되어야 한다. 대상체는 농도 모니터링으로 추가 투여 조정 전에 적어도 7 내지 14 일 동안 새로운 유지 용량으로 계속해야 한다.

트리메토프림/설파메톡사졸을 사용한 폐포자충 폐렴 예방은 -2 일에 시작하여 48 주까지 계속하는 5 mg/kg의 용량으로 주 3회 (예시 용량화 일정; 월요일, 수요일, 금요일) 제공될 것이다. 설파 알레르기가 있는 환자 경우에, 대체 약물은 펜타미딘, 답손, 및 아토바쿠온을 포함할 수 있다.

항진균 예방은 절대 호중구 수가 < 500 mm³이면 시행되어야 한다. 치료 요법은 적절한 하위 전문의와 협의하여 현지 현장 치료 기준을 통해서 결정될 것이다.

상승하는 CMV 또는 EBV 바이러스 게놈이 연속 테스트 동안 검출되면, IS 감소 또는 항바이러스 요법 시작에 대한 결정은 적절한 전문가와 상의하여 현지 치료 기준을 통해서 결정될 것이다.

칼시뉴린 억제제와 라파뮨(Rapamune)의 동반 사용은 칼시뉴린 억제제-유도 혈전성 미세혈관병증의 위험을 증가시킬 수 있다. 혈전성 미세혈관병증은 혈소판 감소증, 미세혈관병증성 용혈성 빈혈, 및 다양한 기관계 침범을 특징으로 하는 장애들의 한 그룹이다. 이들 중 눈에 띄는 것은 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP)이다.

TTP는 일반적으로 심각한 혈소판감소증 (< 30 Х 10⁹/L), 혈액 도말 상의 분열적혈구를 특징으로 하는 미세혈관병증성 용혈성 빈혈, 높은 망상적혈구 수 (> 120 Х 10⁹/L), 상승된 락테이트 탈수소효소 수준, 그리고 피부 및 점막 출혈, 쇠약, 및 호흡곤란의 징후를 나타낸다. TTP는 신속한 진단 및 긴급한 관리가 필요하다. 치료는 타크로리무스의 중단 그리고 혈장 교환의 개시를 포함한다. 치료에 대한 완전 반응은 2 연속 일 동안 혈소판 수가 150 Х 10⁹/L 초과로 정의된다.

등가물

본 발명이 이의 특정 구현예를 참조하여 상세하게 설명되지만, 기능적으로 동등한 변형이 본 발명의 범위 내에 있음을 이해할 것이다. 실제로, 본원에 도시되고 설명된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 수정은 전술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 수정은 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하도록 의도된다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음의 청구범위에 포함되도록 의도된다.

본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> REGENXBIO INC. <120> TREATMENT OF MUCOPOLYSACCHARIDOSIS I WITH FULLY-HUMAN GLYCOSYLATED HUMAN ALPHA-L-IDURONIDASE (IDUA) <130> 12656-128-228 <140> TBA <141> On even date wherewith <150> 63/086,145 <151> 2020-10-01 <150> 62/964,351 <151> 2020-01-22 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 653 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human IDS <400> 1 Met Arg Pro Leu Arg Pro Arg Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala Ser 1 5 10 15 Leu Leu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Glu Ala Pro His Leu Val 20 25 30 His Val Asp Ala Ala Arg Ala Leu Trp Pro Leu Arg Arg Phe Trp Arg 35 40 45 Ser Thr Gly Phe Cys Pro Pro Leu Pro His Ser Gln Ala Asp Gln Tyr 50 55 60 Val Leu Ser Trp Asp Gln Gln Leu Asn Leu Ala Tyr Val Gly Ala Val 65 70 75 80 Pro His Arg Gly Ile Lys Gln Val Arg Thr His Trp Leu Leu Glu Leu 85 90 95 Val Thr Thr Arg Gly Ser Thr Gly Arg Gly Leu Ser Tyr Asn Phe Thr 100 105 110 His Leu Asp Gly Tyr Leu Asp Leu Leu Arg Glu Asn Gln Leu Leu Pro 115 120 125 Gly Phe Glu Leu Met 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645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 26 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV9 <400> 26 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 27 <211> 4344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nt sequence of CB7.CI.hIDUAco.RBG <400> 27 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag ggtaatgggg 180 atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240 tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300 tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360 tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 420 aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480 caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 540 tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac 600 gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat 660 tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 720 ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 780 gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 840 aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc 900 cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag 960 cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt 1020 ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg 1080 gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc 1140 gctgcccggc ggctgtgagc gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt 1200 gcgcgagggg agcgcggccg ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa 1260 caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt 1320 cgggctgcaa ccccccctgc acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg 1380 tgcggggctc cgtacggggc gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca 1440 ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg 1500 cggcggcccc cggagcgccg gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt 1560 atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa 1620 atctgggagg cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg 1680 caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc 1740 tctccagcct cggggctgtc cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc 1800 ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc 1860 cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt 1920 tggcaaagaa ttcacgcgtg gtacctctag agtcgacccg ggcggcctcg agaattcacg 1980 cgtgccacca tgcggcccct gaggcctaga gctgctctgc tggcactgct ggccagtctg 2040 ctggctgccc ctcctgtggc ccctgccgaa gcccctcacc tggtgcatgt ggatgccgcc 2100 agagccctgt ggcctctgcg gagattctgg cggagcaccg gcttttgccc cccactgcct 2160 cacagccagg ccgaccagta cgtgctgagc tgggaccagc agctgaacct ggcctacgtg 2220 ggcgccgtgc cccacagagg catcaaacag gtgagaaccc actggctgct ggaactggtg 2280 acaacccggg gctccaccgg cagaggcctg agctacaact tcacccacct ggacggctac 2340 ctggacctgc tgagagagaa ccagctgctg cccggcttcg agctgatggg cagcgccagc 2400 ggccacttca ccgacttcga ggacaagcag caagtctttg agtggaagga cctggtgtcc 2460 agcctggcca gacggtacat cggcagatac ggactggccc acgtgtccaa gtggaacttc 2520 gagacatgga acgagcccga ccaccacgac ttcgacaacg tgtcaatgac catgcagggc 2580 tttctgaact actacgacgc ctgctccgag ggcctgagag ccgccagtcc tgccctgaga 2640 ctgggcggac ccggcgatag cttccacacc ccccccagaa gccccctgag ctggggcctg 2700 ctgagacact gccacgacgg caccaatttc ttcaccggcg aggccggcgt gcggctggac 2760 tacatcagcc tgcaccggaa gggcgccaga agcagcatca gcatcctgga acaggaaaag 2820 gtcgtcgccc agcagatccg gcagctgttc cccaagttcg ccgacacccc catctacaac 2880 gacgaggccg accccctggt gggatggtca ctgcctcagc cttggagagc cgacgtgacc 2940 tacgccgcta tggtggtgaa agtgatcgcc cagcatcaga acctgctgct ggccaacacc 3000 accagcgcct tcccttacgc cctgctgagc aacgacaacg ccttcctgag ctaccacccc 3060 caccccttcg cccagagaac cctgaccgcc cggttccagg tgaacaacac cagacccccc 3120 cacgtgcagc tgctgagaaa gcccgtgctg accgctatgg gactgctggc tctgctggac 3180 gaggaacagc tgtgggccga agtgtcccag gccggcaccg tgctggacag caatcataca 3240 gtgggcgtgc tggcctccgc ccacagacct cagggacccg ccgatgcttg gcgggctgcc 3300 gtgctgatct acgccagcga cgataccaga gcccacccca acagatccgt ggccgtgacc 3360 ctgcggctga gaggcgtgcc accaggccct ggactggtgt acgtgaccag atacctggac 3420 aacggcctgt gcagccccga cggcgaatgg cgcagactgg gcagacctgt gttccccacc 3480 gccgagcagt tccggcggat gagagccgct gaggatcctg tggctgctgc ccctagacct 3540 ctgcctgctg gcggcagact gaccctgagg cccgctctga gactgcctag tctgctgctg 3600 gtgcacgtgt gcgccaggcc cgagaagcct cccggccagg tgacaagact gagagccctg 3660 cccctgaccc agggccagct ggtgctggtg tggtccgatg agcacgtggg cagcaagtgc 3720 ctgtggacct acgagatcca gttcagccag gacggcaagg cctacacccc cgtgtcccgg 3780 aagcccagca ccttcaacct gttcgtgttc agccccgata caggcgccgt gtccggctct 3840 tatagagtgc gggccctgga ctactgggcc agacccggcc ctttcagcga ccccgtgccc 3900 tacctggaag tgcccgtgcc tagaggcccc cctagccccg gcaacccttg agtcgacccg 3960 ggcggcctcg aggacggggt gaactacgcc tgaggatccg atctttttcc ctctgccaaa 4020 aattatgggg acatcatgaa gccccttgag catctgactt ctggctaata aaggaaattt 4080 attttcattg caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct cactcggaag caattcgttg 4140 atctgaattt cgaccaccca taatacccat taccctggta gataagtagc atggcgggtt 4200 aatcattaac tacaaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg 4260 ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc 4320 ctcagtgagc gagcgagcgc gcag 4344

Claims

점액다당류증 I (MPS I)로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 인간 뉴런 세포에 의해 생성된 재조합 인간 α-L-이두로니다아제 (IDUA)의 치료적 유효량을 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 인간 IDUA는 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 투여에 의해 전달되고, 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량으로 투여되고, 상기 뇌 질량은 대상체의 뇌의 뇌 자기 공명 영상 (MRI)에 의해 결정되는, 방법.
MPS I로 진단된 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 인간 신경아교 세포에 의해 생성된 재조합 인간 IDUA의 치료적 유효량을 인간 대상체의 뇌의 뇌척수액에 전달하는 단계를 포함하고, 상기 인간 IDUA는 인간 IDUA를 인코딩하는 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터의 투여에 의해 전달되고, 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 인간 대상체의 뇌 질량에 의존하는 용량으로 투여되고, 상기 뇌 질량은 대상체의 뇌의 뇌 MRI에 의해 결정되는, 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 인간 대상체의 뇌 질량은 cm³의 인간 대상체의 뇌 용적과 1.046 g/cm³의 인수를 곱셈함으로써 인간 대상체의 뇌 용적으로부터 전환되고, 상기 인간 대상체의 뇌 용적은 인간 대상체의 뇌 MRI로부터 수득되는, 방법.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 약 2 × 10⁹ GC/g 뇌 질량, 약 1 × 10¹⁰ GC/g 뇌 질량, 또는 약 5 × 10¹⁰ GC/g 뇌 질량의 용량으로 투여되는, 방법.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 수조내 (IC) 투여를 통해 투여되는, 방법.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 뇌실내 (ICV) 투여를 통해 투여되는, 방법.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터는 인간 대상체의 총 뇌척수액 용적의 10%를 초과하지 않는 용적으로 투여되는, 방법.
청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 인간 대상체에게 면역 억제 요법을 투여하고, 그 후에 면역 억제 요법을 계속하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 면역 억제 요법은 (a) 타크로리무스 및 마이코페놀산, (b) 라파마이신 및 마이코페놀산, 또는 (c) 타크로리무스, 라파마이신, 및 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론 및/또는 메틸프레드니솔론의 조합을 인간 IDUA 치료 전 또는 그와 동시에 인간 대상체에게 투여하고, 그 후에 계속하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 8 또는 9에 있어서, 상기 면역 억제 요법은 180 일 후에 중단되는, 방법.
청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IDUA는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 뉴클레오티드 발현 벡터가 하기 표에 따른 용량으로 투여되는, 방법:

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