KR20220129794A - D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents
D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물; 식품 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명의 D-리모넨은 PTZ(pentylenetetrazole)에 의해 유발되는 단발성 경련이나 만성 경련 동물모델에 투여하는 경우 경련을 효과적으로 완화시킬 수 있는바, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 뇌전증 또는 발작 관련된 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 특히, D-리모넨은 감귤류(Citrus unshiu Marcov) 과피에서 유래되는 천연 소재에 해당하는바, 인체에 안전한 이점을 갖는다.
Description
본 발명은 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물; 식품 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
뇌전증은 예측불가하게 나타나는 재발성 발작을 특징으로 하는 만성적 뇌기능 장애이다. 뇌전증 환자들에서 일어나는 발작은 뇌에서 나타나는 비정상적이며 동시성인 전기방전으로 인해 행동, 감각 또는 의식에 일시적인 변동이 생기는 것이다. 심각할 경우, 뇌전증은 뇌 외상, 뇌졸중 또는 뇌손상의 결과이며 그 외로는 뇌종양, 뇌피질 도는 혈관에 기형이 생기는 등 발달에 이상이 생겨 뇌전증의 원인이 되기도 한다. 유전적 인자들이 근본원인일 수도 있는 유전성 뇌전증은 종종 특발성으로 불리며 대부분 유전은 복합적이다. 드물게 전압작동 이온통로들과 가바(GABA) 수용체들과 같은 시냅스 수용체를 코딩하는 유전자들이나 신탁신(syntaxin) 결합 단백질을 포함한 신경전달물질 유리에 관여하는 요소들, 또 PCDH19와 같은 신경 접착 분자들과 LGI1(Leucine-rich glioma inactivated-1)과 같은 신경절 발달에 관려하는 단백질들로 인해 유전성 뇌전증에 영향을 줄 수 있다.
뇌전증성 발작들은 국소 피질영역에서 시작되는 국소발현 발작들과 처음부터 양쪽 대뇌반구에서 시작되는 전신발현 발작, 2가지로 주로 분류된다. 국소발작은 양측뇌 강직성-간대성 발작들로 이행될 수 있다. 국소 각성 발작들은 의식이 유지된다; 국소 각정 장애 발작들에선 강직성-간대성 경련들은 대부분의 사람들이 전형적인 발작으로 여기던 것으로써 의식 소실, 쓰러짐, 뻣뻣해짐(강직성 경련기)과 격렬한 떨림(간대성 경련기) 등 의식 장애를 동반한다. 강직성-간대성 경련들은 대개 3분 이내로 지속되나, 이후 착란과 피로가 뒤따르는 기간은 환자마다 다양하다. 전신 강직성-간대성 발작들은 개시시점부터 양쪽 대뇌반구에서 발생한다. 전신 소발작들은 전조증상 없이 잠깐동안 의식을 잃었다가 즉각적으로 의식이 되돌아온다. 전신 소발작은 어린이 소발작을 가진 아이들에게서 가장 흔하게 발생한다. 어린이 소발작은 4~10세 사이에 시작되는 특발성 발작으로 12세가 되면 대부분 사라진다. 다른 중요한 뇌전등 증후군들로 영아연축, 레녹스-가스타우트증우군, 청소년 근간대성 뇌전증과 드라벳 증우군이 있다. 영아연축의 가장 주요한 발작형태는 주로 근위부와 몸통 근육의 갑작스런 굴곡, 신전, 혹은 혼합 굴곡-신전으로 나타나는 뇌전증성 연축이다. 찡그림, 머리 끄덕임 및 미묘한 안구운동 같은 국소적인 형태로도 나타날 수 있다. 근간대성 발작은 해부학적으로 다양한 부위의 근육들 혹은 근육군에서 나타나는 급작스럽고, 짧으며, 불수의적인 단일 혹은 다중수축을 의미한다. 근간대성 수축은 간대성에 비해 규칙적 반복성과 지속성이 덜하다.
뇌전증 치료제로는 레베티라세탐(levetiracetam), 카바마제핀(carbamazepine), 에토숙시미드(ethosuximide), 카바펜틴(cabapentin) 및 옥스카르바제핀(oxcarbazepine) 등이 있으나, 발진, 혈액질환, 골다공증, 저나트륨증, 두통, 행동변화 및 면역반응 등의 부작용이 알려져 있다. 이들 약물들 대부분은 원인적인 치료가 아니라 증상을 조절하는 역할을 하는 것이므로 지속적인 약물의 복용을 필요로 하며, 이와 같은 장기적인 약물의 복용은 막대한 경제적 부담 및 자살충동, 졸음 및 피로 등과 같은 심각한 약물 부작용을 야기할 수 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자는 안전하면서도 효과적으로 경련 증상을 치료할 수 있는 약물을 개발하고자 하였으며, 그 결과 안전성이 입증된 천연물인 감귤류(Citrus unshiu Marcov) 과피에서 유래된 리모넨이 PTZ(pentylenetetrazole)에 의한 경련을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 인체에 안전하면서도 효과적으로 뇌전증 또는 발작 관련 질환을 치료할 수 있는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 인체에 안전하면서도 효과적으로 뇌전증 또는 발작 관련 질환을 개선할 수 있는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 인체에 안전하면서도 효과적으로 뇌전증 또는 발작 관련 질환을 개선할 수 있는 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 D-리모넨은 아데노신 A2A 수용체 활성화 및 가바성 신경전달물질 조절을 통해 항경련 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발작 관련 질환은 뇌졸중, 해마경화, 뇌선마비, 선천성기형, 중추신경계 감염, 저산소증, 뇌종양, 외상성 뇌손상, 신경퇴행성질환, 대사성 질환, 자가면역질환 및 원인 미상으로 인한 발작으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 과자류, 면류, 떡류, 빵류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류 및 주류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 D-리모넨은 PTZ(pentylenetetrazole)에 의해 유발되는 단발성 경련이나 만성 경련 동물모델에 투여하는 경우 경련을 효과적으로 완화시킬 수 있는바, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 뇌전증 또는 발작 관련된 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 특히, D-리모넨은 감귤류(Citrus unshiu Marcov) 과피에서 유래되는 천연 소재에 해당하는바, 인체에 안전한 이점을 갖는다.
도 1은 PTZ-유도된 단발성 경련 마우스 모델에서 D-리모넨 전처리에 따른 경련 억제 정도를 평가한 결과이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다(각 그룹 당 n=6-7). ** p<0.01 vs. 비히클(0.25% tween80 in saline)+식염수, # p<0.05 및 ## p<0.01 vs. 비히클(0.25% tween80 in saline)+PTZ 60mg/kg(Kruskal-Wallis one-way ANOVA on ranks with Dunn’s post hoc analysis).
도 2는 PTZ-유도된 신경발화(kindling) 마우스 모델에서 D-리모넨 전처리에 따른 경련 억제 정도를 평가한 결과이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다(각 그룹 당 n=6-8). **p<0.01 vs. 비히클(0.25% tween80 in saline)+식염수, # p<0.05 및 ## p<0.01 vs. 비히클(0.25% tween80 in saline)+PTZ, $$ p<0.01, && p<0.01(Two-way RM ANOVA followed by Holm-Sidak test).
도 3은 PTZ-유도된 신경발화(kindling) 마우스 모델에서 D-리모넨 전처리에 따른 해마에서 이끼섬유발아(mossy fiber sprouting) 억제 정도를 면역조직화학염색을 통해 확인한 결과이다. synaptoporin(빨간색), NeuN (녹색), DAPI(파란색)로 삼중 면역형광염색한 대표적인 섹션을 나타낸다(A: 비히클(0.25% tween80 in saline)+식염수 처리군; B는 비히클(0.25% tween80 in saline)+PTZ 처리군; C는 D-리모넨+식염수 처리군; D는 D-리모넨+PTZ 처리군). 넓은 스케일 바는 100 μm를 나타내며, 작은 스케일 바는 10 μm를 나타낸다.
도 4는 PTZ-유도된 신경발화(kindling) 마우스 모델에서 D-리모넨 전처리에 따른 해마에서 GABA 합성 효소(GAD-67)의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 측정한 것이다. GAD-67/GAPDH의 상대적인 단백질 발현 수준을 그래프로 나타내었다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다(각 그룹 당 n=4).
도 5A 및 5B는 각각 PTZ-유도된 단발성 경련 마우스 모델 및 PTZ-유도된 신경발화(kindling) 마우스 모델에서 D-리모넨 전처리에 따른 해마에서 Npas4 mRNA 발현 수준을 RT-PCR을 통해 측정한 결과이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다(각 그룹 당 n=4-6).
도 6A는 PTZ-유도된 신경발화(kindling) 마우스 모델에서 D-리모넨 전처리에 따른 해마에서 GABA 수준을 HPLC로 측정한 결과이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다(각 그룹 당 n=7). *p<0.05 vs. 비히클(0.25% tween80 in saline)(Student’s t-test). 도 6B는 PC12 세포 배양에 있어서 D-리모넨 처리에 따른 GABA 방출 수준을 측정한 것이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다(각 그룹 당 n=4-8). ## p<0.01 vs. 비히클(0.25% tween80 in saline)+비히클(DMSO:tween80:saline = 1:1:18), $$ p<0.01 vs. D-리모넨+비히클(DMSO:tween80:saline = 1:1:18)(Two-way ANOVA followed by Holm-Sidak test).
도 7은 PTZ-유도된 경련 마우스 모델에서 D-리모넨과 함께 아데노신 수용체 A2A에 대한 길항제인 SCH58261(1mg/kg) 또는 ZM241385(15mg/kg)를 투여한 후 경련 행동 테스트를 수행한 결과이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다(각 그룹 당 n=6-8). ** p<0.01 vs. 비히클(0.25% tween80 in saline)+비히클(DMSO:tween80:saline = 1:1:18), ## p<0.01 vs. D-리모넨+비히클(DMSO:tween80:saline = 1:1:18)(Two-way ANOVA followed by Holm-Sidak test).
도 8은 마우스에 D-리모넨(10mg/kg) 투여에 따른 해마 조직에서 인산화된 CREB(p-CREB) 수준을 측정한 결과이다. p-CREB/CREB의 상대적인 단백질 발현 수준을 그래프로 나타내었다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다(각 그룹 당 n=4). * p<0.05 vs. 비히클(0.25% tween80 in saline)+비히클(DMSO:tween80:saline = 1:1:18), ## p<0.01 vs. D-리모넨+비히클(DMSO:tween80:saline = 1:1:18)(Two-way ANOVA followed by Holm-Sidak test).
도 2는 PTZ-유도된 신경발화(kindling) 마우스 모델에서 D-리모넨 전처리에 따른 경련 억제 정도를 평가한 결과이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다(각 그룹 당 n=6-8). **p<0.01 vs. 비히클(0.25% tween80 in saline)+식염수, # p<0.05 및 ## p<0.01 vs. 비히클(0.25% tween80 in saline)+PTZ, $$ p<0.01, && p<0.01(Two-way RM ANOVA followed by Holm-Sidak test).
도 3은 PTZ-유도된 신경발화(kindling) 마우스 모델에서 D-리모넨 전처리에 따른 해마에서 이끼섬유발아(mossy fiber sprouting) 억제 정도를 면역조직화학염색을 통해 확인한 결과이다. synaptoporin(빨간색), NeuN (녹색), DAPI(파란색)로 삼중 면역형광염색한 대표적인 섹션을 나타낸다(A: 비히클(0.25% tween80 in saline)+식염수 처리군; B는 비히클(0.25% tween80 in saline)+PTZ 처리군; C는 D-리모넨+식염수 처리군; D는 D-리모넨+PTZ 처리군). 넓은 스케일 바는 100 μm를 나타내며, 작은 스케일 바는 10 μm를 나타낸다.
도 4는 PTZ-유도된 신경발화(kindling) 마우스 모델에서 D-리모넨 전처리에 따른 해마에서 GABA 합성 효소(GAD-67)의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 측정한 것이다. GAD-67/GAPDH의 상대적인 단백질 발현 수준을 그래프로 나타내었다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다(각 그룹 당 n=4).
도 5A 및 5B는 각각 PTZ-유도된 단발성 경련 마우스 모델 및 PTZ-유도된 신경발화(kindling) 마우스 모델에서 D-리모넨 전처리에 따른 해마에서 Npas4 mRNA 발현 수준을 RT-PCR을 통해 측정한 결과이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다(각 그룹 당 n=4-6).
도 6A는 PTZ-유도된 신경발화(kindling) 마우스 모델에서 D-리모넨 전처리에 따른 해마에서 GABA 수준을 HPLC로 측정한 결과이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다(각 그룹 당 n=7). *p<0.05 vs. 비히클(0.25% tween80 in saline)(Student’s t-test). 도 6B는 PC12 세포 배양에 있어서 D-리모넨 처리에 따른 GABA 방출 수준을 측정한 것이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다(각 그룹 당 n=4-8). ## p<0.01 vs. 비히클(0.25% tween80 in saline)+비히클(DMSO:tween80:saline = 1:1:18), $$ p<0.01 vs. D-리모넨+비히클(DMSO:tween80:saline = 1:1:18)(Two-way ANOVA followed by Holm-Sidak test).
도 7은 PTZ-유도된 경련 마우스 모델에서 D-리모넨과 함께 아데노신 수용체 A2A에 대한 길항제인 SCH58261(1mg/kg) 또는 ZM241385(15mg/kg)를 투여한 후 경련 행동 테스트를 수행한 결과이다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다(각 그룹 당 n=6-8). ** p<0.01 vs. 비히클(0.25% tween80 in saline)+비히클(DMSO:tween80:saline = 1:1:18), ## p<0.01 vs. D-리모넨+비히클(DMSO:tween80:saline = 1:1:18)(Two-way ANOVA followed by Holm-Sidak test).
도 8은 마우스에 D-리모넨(10mg/kg) 투여에 따른 해마 조직에서 인산화된 CREB(p-CREB) 수준을 측정한 결과이다. p-CREB/CREB의 상대적인 단백질 발현 수준을 그래프로 나타내었다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다(각 그룹 당 n=4). * p<0.05 vs. 비히클(0.25% tween80 in saline)+비히클(DMSO:tween80:saline = 1:1:18), ## p<0.01 vs. D-리모넨+비히클(DMSO:tween80:saline = 1:1:18)(Two-way ANOVA followed by Holm-Sidak test).
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 D-리모넨(D-limonene) 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
<화학식 1>
본 발명의 상기 'D-리모넨(D-limonene)'은 오렌지와 같은 Citrus 계열 식물의 껍질에서 추출되는 C10 터페노이드(terpenoid)에 속하는 물질로써, 분자식은 C10H16이며, 분자량은 136.23 g/mol인 화합물이며, (R)-(+)-Limonene 또는 (+)-(4R)-Limonene 으로도 불린다. 리모넨과 관련된 연구로는 항균 효과, 항바이러스 효과, 항산화 효과 및 항염 효과 등이 알려져 있다.
그러나 아직까지 상기 화합물이 뇌전증 발작(경련)을 효과적으로 억제한다는 사실은 보고된 바 없다.
이에 본 발명자는 D-리모넨의 뇌전증 또는 발작 관련 질환 치료제로서의 가능성을 알아보기 위하여, PTZ(pentylenetetrazole)에 의해 유발되는 단발성 경련 또는 만성 경련 동물모델에 투여에 따른 경련 완화 효과를 실험한 결과, D-리모넨이 아데노신 A2A 수용체 활성화 및 가바성 신경전달물질(GABAergic neurotransmission) 조절을 통해 항경련 효과를 갖는다는 사실을 최초로 규명하였다.
본 명세서에서 용어 '뇌전증'이란 뇌전증 발작(epileptic seizure)이 반복적으로 발생하는 만성화된 질환을 의미한다. 뇌전증은 그 원인이 매우 다양하며, 정확한 원인은 밝혀져 있지 않은 실정이다. 다만, 최근 신경영상검사 기술의 발달에 따라 과거에는 관찰할 수 없었던 뇌의 미세한 병리적 변화들을 관찰할 수 있게 되면서 뇌전증의 원인에 대한 규명이 점차 확대되고 있다. 일부 역학 연구에서는 환자의 1/3 이상이 뇌에 생긴 병리적 변화나 뇌손상의 과거 병력이 있는 것으로 보고된 바 있고, 주요한 원인으로는 뇌졸중, 선천기형, 두부외상, 뇌염, 뇌종양, 퇴행성 뇌병증, 유전, 미숙아, 분만 전후의 손상 등으로 알려져 있다.
본 명세서에서 용어 '발작 관련 질환'이란 발작이 수반되는 뇌 관련 질환을 포함하며, 발작(seizure) 일으키는, 예를 들면 뇌졸중; 뇌염; 해마경화; 뇌성마비 및 선천성 기형; CNS 감염관련 발작; 저산소증; 뇌종양; 외상성 뇌손상; 혈관기형; 신경퇴행성질환; 저혈당증, 당원축적병 및 파이루베이트탈수소효소 결핍증과 같은 대사성 질환; 다발성경화증; 전신홍반루프스와 같은 자가면역질환을 들 수 있고, 원인을 알지 못하고 발작이 일어나는 질환을 포함한다.
먼저, 본 발명자는 하기 실시예에서 D-리모넨의 항경련 활성을 평가하기 위해 PTZ(pentylenetetrazole)에 의해 유발되는 단발성 경련 테스트를 통해 경련의 억제정도를 확인하였다. 자세하게는, 마우스에 D-리모넨(5 또는 10 mg/kg)을 처리하고 이후 PTZ(60 mg/kg)를 투여하여 단발성 경련을 유도하였다. 그 결과 D-리모넨 투여 용량에 의존적으로 PTZ-유도된 경련이 완화되는 것을 확인하였다(도 1 참고).
또한, 본 발명자는 하기 실시예에서 D-리모넨의 만성 경련 동물모델에서 항경련 효과가 있는지 확인하기 위해, 총 27일 동안 2일에 한번 PTZ 30mg/kg를 투여하여 신경발화 모델(kindling model)을 만들었고 그에 대한 D-리모넨의 경련 억제정도를 확인하였다. 그 결과 마우스에 D-리모넨(10mg/kg) 약물을 전처리하는 경우 PTZ로 인한 발작 점수가 유의하게 감소되는 것을 확인하였으며, 이러한 결과를 통해 D-리모넨이 PTZ로 인한 신경발화(kindling)를 방지하는 것을 보여주었다(도 2 참조).
또한, 본 발명자는 하기 실시예에서 D-리모넨 처리로 인한 마우스 해마에서 PTZ로 유도된 축삭발아(Axonal Sprouting)의 변화를 조사하였으며, 그 결과 PTZ에 의해 유도된 축삭발아의 증가는 D-리모넨에 의해 감소되는 것을 확인하였다(도 3 참조). 참고로, 축삭발아라 함은 정상적인 축삭의 돌기가 비정상적으로 가지를 내고(발아, axonal sprouting) 심한 경우 자기 세포체(cell body)에까지 내는 등 비정상적으로 과다한 회로를 만들고, 흥분상태를 주위로 쉽게 전달하는 역할을 하게 된다. 이러한 축삭발아는 뇌전증 발생 기전과 밀접한 연관이 있다.
또한, 본 발명자는 하기 실시예에서 D-리모넨의 발작에 미치는 영향의 기전을 밝히기 위해 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 분석을 통해 GABA 합성 효소(GAD-67)의 발현 수준을 조사하였으며, 또한, D-리모넨이 뉴런 활동에 의해 유도되는 Npas4와 같은 전사인자를 조절하는지 여부를 추가로 조사하였다. 그 결과 D-리모넨의 처리가 GAD-67 단백질의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(도 4 참조). 또한, PTZ의 급성 및 만성 투여에 따른 해마에서 Npas4 발현을 증가를 D-리모넨이 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 5 참조).
또한, 본 발명자는 하기 실시예에서 D-리모넨 처리가 해마의 GABA 수준에 미치는 영향을 조사한 결과, D-리모넨으로 처리된 마우스 그룹의 경우 음성 대조군에 비해 해마에서 GABA 수준이 감소한 것을 확인하였다(도 6A 참조), 또한, 가바성 신경전달물질(GABAergic neurotransmission)과 PC12 세포의 기본 메커니즘에 대한 D-리모넨의 효과를 추가로 조사한 결과, PC12 세포의 배양 배지에서 GABA 수준은 D-리모넨 전처리에 의해 향상되고 SCH58261에 의해 감소되는 것을 확인하였다(도 6B 참조).
또한, 본 발명자는 하기 실시예에서 D-리모넨이 아데노신 A2A 수용체를 통해 PTZ에 의해 유도된 발작 점수를 감소시켰는지 알아보기 위해, D-리모넨 주사 전에 SCH58261 또는 ZM241385를 처리하고 경련 행동 테스트를 수행하였다. 참고로, SCH58261 및 ZM241385는 아데노신 수용체 A2A에 대한 길항제이다. 그 결과, D-리모넨에 의해 억제된 발작 점수가 SCH58261 또는 ZM241385로 전처리를 통해 회복되는 것을 확인하였다(도 7 참조). 이러한 결과는, D-리모넨이 아데노신 A2A 수용체 활성화의 조절을 통해 PTZ로 유발된 경련을 억제하는 것을 보여주는 것이다.
또한, 본 발명자는 하기 실시예에서 D-리모넨이 아데노신 A2A 수용체 다운 스트림 신호 경로에서 인산화된 CREB(p-CREB) 수준에 영향을 미치는지 조사하였다. 그 결과, D-리모넨(10mg/kg)의 급성 주사는 해마에서 인산화된 CREB(p-CREB) 수준을 증가시키는 것을 확인하였다(도 8 참조).
그러므로 본 발명에서는 D-리모넨이 농도 의존적으로 경련(발작)을 억제할 수 있음을 실험에 의해 객관적으로 입증하였는바, 이러한 효과를 갖는 리모넨을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 D-리모넨 화합물은 염, 바람직하게는 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약제학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
본 발명에 따른 D-리모넨은 시중에서 판매되는 것을 사용할 수도 있으며, 또는 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물로서 이러한 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 D-리모넨은 조성물에 0.1 내지 10000mg/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 또한 본 발명의 리모넨 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 95중량%로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 및 치료용 의약의 제조를 위한 D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 및 치료용 의약의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 D-리모넨을 투여하는 것을 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 및 치료방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 '포유동물‘은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
본 명세서에서 용어 '치료상 유효량‘은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약제학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 리모넨을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01㎎/kg~250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 D-리모넨과 종래 알려진 뇌전증 치료제를 함께 제제화하거나 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 유효성분인 D-리모넨을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분(D-리모넨) 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 본 발명의 유효성분(D-리모넨)은 식용 가능한 식물로부터 추출된 소재로서 화학약품과 같은 부작용은 거의 없으므로 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 개선을 위한 기능성 부여를 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
즉, 본 발명의 식품 조성물은 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 개선을 위한 기능성 식품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분(D-리모넨)을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분(D-리모넨)을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분(D-리모넨)을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분(D-리모넨)과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분(D-리모넨)과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 하기 실시예에서도 확인한 바와 같이 경련(발작) 억제 효과를 갖는바, 뇌전증과 더불어 다양한 발작 관련 질환(뇌졸중, 해마경화, 뇌선마비, 선천성기형, 중추신경계 감염, 저산소증, 뇌종양, 외상성 뇌손상, 신경퇴행성질환, 대사성 질환, 자가면역질환 및 원인 미상으로 인한 발작)의 예방 또는 개선에 효과적이다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예>
1. 재료 및 방법
약물
순도 97%의 R-(+)-리모넨(C10H16)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 매일 식염수에 0.25% 트윈-80에 용해시켜 신선한 용액으로 제조하였다. SCH58261은 Tocris(Bristol, UK)에서 구입하였다. PTZ, ZM241385 및 기타 시약은 달리 명시되지 않는 한 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
동물
C57BL/6J 마우스는 대한바이오링크(한국, 충북)에서 구입하였다. 7-11 주령의 동물은 표준 조건(23±2℃, 50±5% 습도)에서 12 시간 명암주기를 조절하여 케이지 당 4-5 마리로 유지하였다. 식수와 사료는 자유롭게 제공되었다. 실험 시작 시점에 모든 마우스의 무게는 20~25g이었다. 모든 실험은 동물 보호 및 사용 지침(충북 대학교)에 따라 수행되었다.
세포 배양
랫트(rat) 부신 수질의 갈색 세포종에서 유래된 세포주인 PC12 세포는 Korean Collection for Type Cultures로부터 제공받았다. 세포는 소태아 혈청(FBS, 5%), 말 혈청(10%, Gibco, Grand Island, USA) 및 항생제(1%, Gibco)가 보충된 RPMI 세포 배양 배지에서 표준 조건 및 37℃ 높은 대기습도에서 배양되었다. 실험을 위해 Poly-L-Lysine 코팅된 35mm 플레이트에서 4-6번 계대 배양된 세포를 사용하였으며, 세포는 1×106 cells/plate 의 밀도로 분주하였다.
펜틸렌테트라졸(PTZ)-유도된 경련 및 신경발화 모델(kindling model)
PTZ를 30 또는 60mg/kg의 용량으로 마우스의 복강 내(i.p.)로 주입하고, 이전 연구에 따라 PTZ에 의해 유발된 경련의 강도를 점수화하였다. 경련 행동을 30분 동안 관찰하였다. 발작 상태는 다음과 같이 분류하였다. 0: 정상 행동 또는 이상이 없음; 1: 부동 또는 엎드림(immobilization or lying on belly); 2: 머리를 끄덕이고 안면, 앞다리 또는 뒷다리 근간대성 경련(head nodding and facial, forelimb, or hindlimb myoclonus); 3: 지속적인 전신의 근간대성 경련, 근간 대성 경련 또는 꼬리가 뻣뻣하게 들림(continuous whole-body myoclonus, myoclonic jerks or tail held up stiffly); 4: 뒤로 몸을 제끼는 경련, 긴장성 발작 또는 옆으로 쓰러짐(rearing, tonic seizure or falling down on its side); 5: 강직-간대성 발작, 뒷쪽으로 쓰러짐, 거친 돌진 또는 점프(tonic-clonic seizure, falling down on its back, wild rushing or jumping); 6: 사망(death).
PTZ-유도된 신경발화 마우스 모델을 확립하기 위해 30mg/kg PTZ를 48 시간마다 1 회(총 14 회) 복강 내 투여하였다. 연속적인 4 단계 발작 수준이 3개 이상인 마우스를 신경발화 마우스로 정의하였다. 면역 블롯팅, IHC, HPLC 및 RT-PCR을 위한 뇌 샘플은 최종 행동 테스트 직후에 수득하였다.
D-리모넨이 PTZ-유도된 경련 및 신경발화(kindling)에 미치는 영향
PTZ-유발 경련에 대한 D-리모넨의 효과를 연구하기 위해 PTZ 주입(60 mg/kg) 40 분 전에 D-리모넨(5 또는 10 mg/kg, i.p.)을 복강 내 투여하였다. 30분 동안 발작 점수를 측정하였다. D-리모넨의 PTZ-유발 신경발화(kindling)에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 마우스에 PTZ (30mg/kg) 주입 40 분 전에 D-리모넨(10mg/kg)을 복강 내 투여하였다. 경련 행동을 30 분 동안 관찰하였다. D-리모넨에 의해 유도된 항경련 활성에서 아데노신 A2A 수용체의 역할을 조사하기 위해, 마우스를 D-리모넨 주사 10분 전에 SCH58261(1mg/kg, i.p.) 또는 ZM241385(15mg/kg, i.p.)로 처리하였다. D-리모넨 주입 후 40 분에 PTZ 유발 경련 행동 테스트를 수행하였다.
면역블롯팅(Immunoblotting)
해마 균질물은 제조업체의 프로토콜에 따라 Bio-Rad DC 단백질 분석 키트(BIO-RAD, Hercules, USA)를 사용하여 결정되었다. 면역블롯팅 분석을 위해, 해마 단백질 30μg을 12% 트리스-글리신 폴리아크릴아미드 겔에서 분리한 다음 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(Merck Millipore, Burlington, USA)으로 옮겼다. 5% 무지방 분유를 사용하여 블롯을 차단하고, 이러한 면역 블롯을 1차 항체 Tyrosine hydroxylase(EMD Millipore, Darmstadt, Germany), GAD-67(Abcam, Cambridge, UK), CREB(Cell signaling, Danvers, USA), phospho-CREB(EMD Millipore) 및 GAPDH(Cell signaling)와 밤새 배양한 후, 호스라디쉬 퍼옥시다아제 결합된 2차 항체(Amersham Life Science Inc., IL, USA)와 함께 배양하였다. 단백질은 ECL 키트 (Amersham Life Science)를 사용하여 화학 발광에 의해 검출되었다. 단백질 밴드의 상대 밀도는 ImageJ (Wayne Rasband, National Institutes of Health, Bethesda, MD)에 의해 스캔되고 정량화되었다.
RAN 추출 및 실시간 RT-PCR
QIAGEN RNA 키트(QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 동결된 해마에서 RNA를 추출하고, 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, Foster city, USA)를 사용하여 1μg total RNA에서 cDNA를 합성하였다. 증폭 반응은 StepOne Plus 실시간 RCR 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 12.5μL 2×SYBR Green PCR 마스터 믹스 (Applied Biosystems), 1μg cDNA, 및 순방향 및 역방향 프라이머(각각 100 μM)로 수행되었다. PCR 반응 조건은 다음과 같다: 50℃에서 2분 및 95℃에서 10분간; 95℃에서 15초간 1 사이클 및 60℃에서 2분간 40 사이클; 이후 95℃에서 30초간 처음 스텝 및 55℃에서 30초간 마지막. 프라이머 서열을 하기 표 1에서 자세히 나타내었다.
| 유전자 | 프라이머 서열 (5‘->3’) | |
| Npas4 | 순방향 | AGCATTCCAGGCTCATCTGAA |
| 역방향 | GGCGAAGTAAGTCTTGGTAGGATT | |
| GAPDH | 순방향 | TGTCAAGCTCATTTCCTGGTATGA |
| 역방향 | TCTTACTCCTTGGAGGCCATGTAG | |
면역조직화학염색(Immunohistochemistry)
마우스를 마취시키고 차가운 포스페이트 완충 식염수(PBS, 0.1 % 헤파린 포함)로 경심 관류시켰다. 뇌는 4% PFA(paraformaldehyde)가 포함된 PBS로 관류 고정하였다. 관류 고정된 뇌를 4% PFA가 포함된 PBS로 4℃에서 하룻밤동안 관류후고정(post-fixation)시킨 다음 Leica CM1850 마이크로톰(10 μm 두께 섹션)으로 관상 절개하였다. 그런 다음 절편(sections)을 0.3% Triton X-100 및 0.3 % 과산화수소를 사용하여 PBS에서 투과시키고 실온(RT)에서 1시간 동안 5% 소혈청 알부민(BSA, 1% 염소 혈청 포함)에서 차단하였다. 이후, 상기 절편은 래빗 Synaptoporin(SynapticSystems, 1/300) 및 마우스-NeuN (EMD Millipore, 1/500)을 사용하여 4℃에서 5% BSA로 희석된 1차 항체와 함께 밤새 반응시켰다. 절편을 PBS로 3회 세척한 후, 5% BSA로 희석된 Alexa Fluor-접합 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 마지막으로 DAPI(300 nM in 5% BSA, Sigma-Aldrich)로 20 분 동안 염색하였다. 그런 다음 절편을 마운팅 배지(Vector Laboratories, Inc., California, USA)로 유리 슬라이드(Matsunami, Osaka, Japan) 위에 마운팅하였다. 각 절편에 대해 공 초점 현미경 (LSM-880, ZEISS, Oberkochen, Germany) 설정을 사용하여 2.5X 또는 40X 대물렌즈를 사용하여 이미지를 촬영하였다.
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석
최종 행동 분석 후 마우스를 즉시 희생시켰다. 그런 다음 뇌를 제거하고 해마를 얼음으로 식힌 유리판에서 분리하였다. 이러한 조직은 드라이아이스에서 신속하게 냉동시킨 후 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다. 냉동 조직의 무게를 재고 1.5 mL Eppendorf 튜브에 넣고 1 mL 얼음처럼 차가운 PBS에서 균질화하였다. PC12 세포의 경우 대조군은 완전 배지로 배양하고, 리모넨 그룹은 리모넨(30μM) 1시간, SCH58261 그룹은 SCH58261(1μM) 30분, SCH58261+리모넨 그룹은 SCH58261(1μM)을 30분 동안 처리 후 리모넨(30μM)으로 1 시간 처리하였으며, 상층액을 얻었다. 4℃에서 15 분 동안 20,000 G에서 원심분리한 후 투명한 상층액을 0.22 μm CHROMDISC 주사기 필터를 통해 여과시켰다. GABA 검출을 위해 250μL 에탄올과 50mM 아황산나트륨이 함유된 0.1μM 붕산염 완충액 (pH 10.4)에서 o-phthaldialdehyde (37mM)로 제조된 10μL의 반응성 용액에 180μL의 샘플을 첨가하였다. UK-C18 컬럼(50 x 2mm, 3μm; Imtakt)은 0.85V로 설정된 유리질 탄소전극이 있는 전기화학 검출기(Eicom)와 결합되었다. 이동상은 50mM 인산, 50mM 시트르산, 0.1mM EDTA (pH 3.5) 및 5% 아세토니트릴로 구성되었으며 0.3 mL/min의 유속으로 0.45μm 필터(EMD Millipore)를 통해 여과되었다. 샘플(20μL)을 HPLC 시스템(Waters Corporation, Milford, USA)에 주입하였다.
데이터 분석
데이터는 평균±표준편차로 나타내었다. 데이터는 Student 's t-test, 단방향, 양방향 또는 양방향 반복 측정 분산분석(ANOVA)을 사용하여 분석한 다음, SigmaPlot 13 소프트웨어(SigmaPlot, Chicago, IL, USA)를 사용하여 Holm-Sidak post-hoc tests를 진행하였다. Non-parametric 데이터는 순위에 대한 Kruskal Wallis ANOVA를 사용하여 분석한 다음 SigmaPlot 13 소프트웨어를 사용하여 Dunn’s post hoc analysis을 수행하였다.
2. 결과
D-리모넨은 PTZ-유도된 경련을 용량 의존적으로 감소시킴
D-리모넨의 항경련 활성을 평가하기 위해 D-리모넨이 PTZ로 유도한 경련 테스트를 통해 경련의 억제정도를 확인하였다. 마우스에 비히클(0.25% tween-80 in saline, 10 mL/kg) 또는 D-리모넨(5 또는 10 mg/kg)을 PTZ(60 mg/kg) 투여 40분 전에 주사하였다.
그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, 마우스에 PTZ(60 mg/kg)를 주사하는 경우 대조군에 비해 상당한 발작을 유발하였다. 반면에, D-리모넨을 전처리한 실험군에서 용량 의존적으로 PTZ-유도된 발작이 억제되는 것을 확인하였다. 자세하게는, PTZ 단독 처리군(60mg/kg, n = 7)에서는 2 마리의 마우스가 5점, 5 마리의 마우스가 4점을 보였다. 반면에, PTZ와 함께 D-리모넨을 처리한 그룹(10mg/kg of D-limonene, 60 mg/kg of PTZ, n = 7)에서는 1 마리의 마우스만이 4의 발작 점수를 보인 반면, 4 마리의 마우스와 2 마리의 다른 마우스는 각각 2 및 3의 발작 점수를 나타냈다. 이러한 결과는 D-리모넨의 처리가 PTZ-유도된 경련을 감소시키는 것을 보여주는 것이다.
D-리모넨은 PTZ로 인한 신경발화(kindling)의 발생을 억제함
리모넨이 만성 경련모델에서 항경련 효과가 있는지 확인하기 위해 총 27일 동안 2일에 한번씩 PTZ 30mg/kg를 투여하여 신경발화 모델(kindling model)을 만들었고 그에 대한 경련의 억제정도를 확인하였다. PTZ 단회 투여로 경련점수 평균 1.2가 나오는 용량(30 mg/kg)을 2일에 한번 반복 투여하여 이후 자극이 있을 때마다 변연계 발작이 나타나도록 신경발화 모델(kindling model)을 개발하였다.
그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 마우스에 D-리모넨(10mg/kg)을 전처리하는 경우 PTZ로 인한 발작 점수를 유의하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 D-리모넨이 PTZ로 인한 신경발화(kindling)를 방지하는 것을 보여주는 것이다.
참고로, 신경발화 모델(kindling model)은 설치류에게 정해진 일정에 따라 편도체와 해마에 약한 전기 자극을 반복해서 부과하거나 동일한 용량을 반복 투여하여 이후 영구적으로 자극이 있을 때마다 변연계 발작이 나타나도록 개발된 모델이다. 신경발화모델은 화학물질이 국소발작으로부터 보호할 수 있는 활성을 가지고 있는지 여부를 평가하는데 사용된다.
D-리모넨은 해마에서 축삭발아(Axonal Sprouting)를 억제함
D-리모넨 처리로 인한 해마에서 PTZ로 유도된 축삭발아의 변화를 조사하였다. 이를 위해, 신경발화(kindling) 마지막 날 발작 점수를 매긴 후 마우스를 즉시 희생시키고, 이후 면역조직화학염색을 수행하였다.
그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, PTZ에 의해 유도된 축삭발아의 증가는 D-리모넨에 의해 감소되는 것을 확인할 수 있었다(B 및 D 참조). 이러한 결과는 D-리모넨이 PTZ-유도된 축삭발아를 예방할 수 있음을 보여주는 것이다.
참고로, 축삭발아라 함은 정상적인 축삭의 돌기가 비정상적으로 가지를 내고 (발아, axonal sprouting) 심한 경우 자기 세포체(cell body)에까지 내는 등 비정상적으로 과다한 회로를 만들고, 흥분상태를 주위로 쉽게 전달하는 역할을 하게 된다. 이러한 축삭발아는 뇌전증 발생 기전과 밀접한 연관이 있다.
D-리모넨은 GAD-67 및 Npas4 발현 수준을 조절함
D-리모넨이 발작에 미치는 영향의 기전을 밝히기 위해 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 분석을 통해 GABA 합성 효소(GAD-67)의 발현 수준을 조사하였으며, 또한, D-리모넨이 뉴런 활동에 의해 유도되는 Npas4와 같은 전사인자를 조절하는지 여부를 추가로 조사하였다.
그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, D-리모넨의 처리가 GABA 합성 효소인 GAD-67 단백질의 발현을 증가시키는 것을 보여주었다. 또한, 도 5에서 나타낸 바와 같이, PTZ의 급성 및 만성 투여는 모두 해마에서 Npas4 발현을 증가시킨 반면, 이렇게 증가된 Npas4 발현은 D-리모넨에 의해 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다.
D-리모넨은 GABA 수준을 조절함
억제성 신경전달물질인 GABA는 D-리모넨의 항경련 효과에 역할을 할 수 있는바, 본 실험에서는 D-리모넨 처리가 해마의 GABA 수준에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다. 그 결과 급성 D-리모넨으로 처리된 마우스 그룹은 비히클(0.25% tween-80 in saline, 10 mL/kg) 처리된 그룹에 비해 해마에서 GABA 수준이 감소한 것으로 나타났다(도 6A 참조). 또한, 가바성 신경전달물질(GABAergic neurotransmission)과 PC12 세포의 기본 메커니즘에 대한 D-리모넨의 효과를 추가로 조사하였다. 그 결과, PC12 세포의 배양 배지에서 GABA 수준은 D-리모넨 전처리에 의해 향상되고 SCH58261에 의해 감소되는 것으로 나타났다(도 6B 참조).
이러한 결과는 D-리모넨이 가바성 신경전달물질(GABAergic neurotransmission)을 조절하는 것을 시사한다.
D-리모넨은 아데노신 A2A 수용체를 통해 PTZ-유도된 발작 점수를 억제함
D-리모넨이 아데노신 A2A 수용체를 통해 PTZ에 의해 유도된 발작 점수를 감소 시켰는지 알아보기 위해 D-리모넨 주사 전에 SCH58261 또는 ZM241385를 처리하고 경련 행동 테스트를 수행하였다. 참고로, SCH58261 및 ZM241385는 아데노신 수용체 A2A에 대한 길항제이다.
그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, D-리모넨에 의해 억제된 발작 점수가 SCH58261 또는 ZM241385로 전처리를 통해 회복되었음을 확인하였다. 그러나 비히클(0.25% tween 80 in saline) 또는 D-리모넨과 함께 SCH58261 또는 ZM241385를 처리한 경우 경련을 유발하지 않았다(데이터는 표시되지 않음). 이러한 결과는, D-리모넨이 아데노신 A2A 수용체 활성화의 조절을 통해 PTZ로 유발된 경련을 억제하는 것을 보여주는 것이다.
D-리모넨은 해마에서 인산화된 CREB를 증강시킴
D-리모넨은 아데노신 A2A 수용체 작용제이므로, 본 실험에서는 D-리모넨이 아데노신 A2A 수용체 다운 스트림 신호 경로에서 인산화된 CREB(p-CREB) 수준에 영향을 미치는지 조사하였다.
그 결과 도 8에서 나타낸 바와 같이, D-리모넨(10mg/kg)의 급성 주사는 해마에서 인산화된 CREB(p-CREB) 수준을 증가시키는 것을 확인하였다. 그러나 전체 CREB 발현양은 변하지 않는 것으로 나타났다. 더욱이, 아데노신 A2A 수용체 길항제인 SCH58261을 전처리하는 경우 D-리모넨에 의해 유도된 인산화된 CREB(p-CREB) 상향 조절이 감소되는 것으로 나타났다.
상기와 같은 결과를 종합하면, D-리모넨은 아데노신 A2A 수용체 활성화 및 GABA성 신경전달물질 조절을 통해 항경련 효과를 발휘하는 것으로 사료된다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
CREB: cAMP response element-binding protein
GABA: Gamma-aminobutyric acid
GAD-67: Glutamate decarboxylase-67
HPLC: High-performance liquid chromatography
Npas4: Neuronal PAS Domain Protein 4
PC12 cell: Pheochromocytoma cells derived from the adrenal gland of Rattus norvegicus
PTZ: Pentylenetetrazole
GABA: Gamma-aminobutyric acid
GAD-67: Glutamate decarboxylase-67
HPLC: High-performance liquid chromatography
Npas4: Neuronal PAS Domain Protein 4
PC12 cell: Pheochromocytoma cells derived from the adrenal gland of Rattus norvegicus
PTZ: Pentylenetetrazole
Claims (6)
- D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 D-리모넨은 아데노신 A2A 수용체 활성화 및 가바성 신경전달물질 조절을 통해 항경련 효과를 나타낸 것을 특징으로 하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 발작 관련 질환은 뇌졸중, 해마경화, 뇌선마비, 선천성기형, 중추신경계 감염, 저산소증, 뇌종양, 외상성 뇌손상, 신경퇴행성질환, 대사성 질환, 자가면역질환 및 원인 미상으로 인한 발작으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물. - D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제5항에 있어서,
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 과자류, 면류, 떡류, 빵류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류 및 주류로 이루어진 군으로부터 선택되는 건강기능식품.
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| KR1020210034540A KR102588274B1 (ko) | 2021-03-17 | 2021-03-17 | D-리모넨을 유효성분으로 포함하는 뇌전증 또는 발작 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 |
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| KR20110120153A (ko) * | 2010-04-28 | 2011-11-03 | 고려대학교 산학협력단 | 리모넨을 함유하는 아데노신 Ａ2ａ 수용체 작용제 |
| KR20170034662A (ko) | 2015-09-21 | 2017-03-29 | 경북대학교 산학협력단 | 실리비닌을 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR20180040374A (ko) | 2016-10-12 | 2018-04-20 | 경북대학교 산학협력단 | Age-1을 유효성분으로 포함하는 뇌전증의 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR102138348B1 (ko) | 2020-04-24 | 2020-07-28 | 권혁분 | 뇌전증의 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법 |
-
2021
- 2021-03-17 KR KR1020210034540A patent/KR102588274B1/ko active IP Right Grant
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Biol.Pharm.Bull 23(11), 1314-1317 (2000) 1부.* * |
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