CN114107231B - 实现全脑突触后神经元胞体标记的重组腺相关病毒及其应用 - Google Patents

实现全脑突触后神经元胞体标记的重组腺相关病毒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过将特定类型启动子介导的、耦连核定位序列H2B的荧光蛋白元件构建成双链载体，然后包装成高滴度的血清型1型重组腺相关病毒，可高效实现全脑范围内多种细胞类型突触后神经元胞体的标记。相比使用染料和其他重组腺相关病毒只能标记轴突投射的神经纤维，本发明可以直接标记神经元胞体且标记亮度和效率更高。相比于嗜神经病毒，本发明的标记毒性更小、安全性更高且能介导目的基因长时间稳定表达。本发明不仅适用于机械手工切片，而且适用于自动或半自动的全脑成像***，用于展示突触后神经元胞体的标记。进一步的，结合全脑成像***，能更直观在三维水平展示特定脑区和脑区内细胞突触后神经元胞体在全脑水平的整体分布以及在全脑范围内众多脑区和亚脑区的分布，还在同一个样本中并行展示和比较不同实验个体、不同脑区、同一脑区不同细胞类型对输出环路中不同脑区或不同类型突触后神经元调控强弱的差异。

Description

实现全脑突触后神经元胞体标记的重组腺相关病毒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组腺相关病毒及其应用和突触后神经元胞体的标记制剂，具体涉及重组腺相关病毒标记制剂用于实现对全脑范围内多种类型细胞突触后神经元胞体的高效标记。
背景技术
神经环路是大脑神经***结构和功能的基础，由神经输入环路和输出环路两部分组成，神经环路内特定类型的神经元或神经元群体通过树突上数目众多的树突棘接收上游其他脑区多种类型神经元的信息输入(输入环路)，在胞体进行信息整合后通过长程投射的轴突将信息进一步传递给皮层及皮层下的众多脑区(输出环路)。因此深入***的解析神经输入和输出环路将有助于理解脑的结构组成和信息处理的机制，并为脑疾病的诊断治疗提供科学依据。更确切的，对于神经输出环路高度可视化的探究将有助于我们理解靶定脑区与下游众多投射脑区之间、各脑区内不同细胞类型之间、特定类型的神经元之间的连接关系，进而理解脑在介观水平(脑区-脑区)和微观水平(神经元突触前-突触后)等不同尺度内如何行使功能的机制。
当前常用于实现特定脑区输出环路标记的工具主要有传统的神经示踪剂(Classical neural tracers)和病毒示踪物(Viral tracers)两大类。其中，前者以物理扩散的方式(主动或被动运输)实现标记，是应用于神经环路顺向标记最早且最为经典的方法，常用的顺向神经示踪剂主要有生物素化葡聚糖胺(Biotinylated dextran amine,BDA)和菜豆白细胞凝集素(Phaseolus vulgaris-leucoagglutinin,PHA-L)等；后者以侵染的方式实现标记，应用更广、效率更高，而且形式灵活多变可根据需要设计各种各样的载体，根据侵染特点可进一步分为重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)和嗜神经病毒(Neurotropic virus)介导的标记***这两类。具体的实现策略有以下几种：
1.将与荧光染料(如Alexa Fluor家族)耦连的BDA或PHA-L注射到特定脑区；
2.将包含正常表达的荧光蛋白片段(如AAV-EGFP)、或者两端被重组酶识别序列包裹的荧光蛋白片段(如AAV-FLEX-EGFP或AAV-DIO-EGFP)分别注射到野生型鼠和表达Cre或者CreER(需要他莫昔芬药物诱导)的转基因鼠的特定脑区；
3.将嗜神经病毒，如将经过改造的单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus 1)的H129株(H129-ΔTK-tdT)，或水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)注射到特定脑区。
然而，上述策略依然存在一些不足，例如使用策略1和2均只能在下游投射的脑区观察到所标记神经元的轴突纤维，无法标记突触后的神经元胞体。而轴突纤维的亮度要远远低于神经元胞体，并且较之于轴突纤维，神经元胞体将更容易定量。此外，策略1中使用染料标记的神经元群体没有细胞类型特异性，而且和重组腺相关病毒相比标记效率比较低。使用策略3虽然可以标记特定类型细胞投射到下游脑区的突触后神经元的胞体结构，但较之于染料和重组腺相关病毒，所使用的嗜神经病毒毒性比较大，因而对实验操作环境要求较高。此外，嗜神经病毒并不能像重组腺相关病毒那样介导基因长时间表达。因此，当前输出环路研究领域依然缺少能够高效、长时间表达的，实现全脑范围内多种细胞类型突触后神经元胞体标记的工具。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组腺相关病毒，应用于介导的标记***，使用重组腺相关病毒就可以实现对全脑范围内多种细胞类型突触后神经元胞体的标记。多种细胞类型包括非特定细胞类型和特定的细胞/亚细胞类型。通过将启动子介导的耦连核定位序列H2B的荧光蛋白元件改造成双链载体的形式，然后包装成高滴度的血清型1型双链重组腺相关病毒实现标记。耦连核定位序列H2B的荧光蛋白元件可以单独使用，进而在无遗传背景的野生型动物(如C57BL/6J鼠)中实现各脑区非特定细胞类型的标记(如说明书附图6中(1)所示)；也可以分别由重组酶识别序列(如说明书附图6中(2)所示)或四环素应答序列介导表达(如说明书附图6中(3)所示)，前者适用于表达各种类型重组酶(如Cre、药物诱导的CreER、Dre、vCre、sCre和Flp等)的转基因动物品系，后者适用于表达四环素转录激活因子(Tetracycline transactivator,tTA)的转基因动物品系。也可以分由重组酶识别序列和四环素应答序列组合介导表达(如说明书附图6中(4)所示)。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.一种重组腺相关病毒，该重组腺相关病毒的制备方法为：通过启动子介导的耦连核定位序列H2B的荧光蛋白元件构建成双链载体，再用包装细胞包装成重组腺相关病毒。
所述重组腺相关病毒为高滴度的血清型1型双链重组腺相关病毒。
进一步，所述的重组腺相关病毒中，所述启动子选取广谱表达(如hSyn、EF1α、CMV、CAG等)及细胞类型特异性表达(如介导兴奋性神经元表达的CaMKII和介导GABA能中间神经元表达的Dlx以及介导多巴胺能神经元表达的TH等)的启动子中的一种。
进一步，所述的重组腺相关病毒中，荧光蛋白选自蓝色荧光蛋白及其衍生物(如BFP、EBFP、EBFP2、Azurite、mTagBFP等)、青色荧光蛋白及其衍生物(如CFP、ECFP、(m)Cerulean、mTurquoise等)、绿色荧光蛋白及其衍生物(如GFP、EGFP、mClover、Emerald)、黄色荧光蛋白及其衍生物(YFP、EYFP、(m)Citrine、(m)Venus等)、橙色荧光蛋白及其衍生物(mHoneydew、mKO、mOrange、mOrange2、pHOran1(2/3/4)、mBanana等)、红色荧光蛋白及其衍生物(mCherry、(t)dTomato、DsRed、DsRed2、Kaede、mRFP1、PHTomato、mRuby、TagRFP、mBanana、mApple、mTangerine、mStrawberry等)、远红光荧光蛋白及其衍生物(如mKate、mKate 2、mMaroon1)等。
进一步，所述的重组腺相关病毒中，耦连核定位序列H2B的荧光蛋白元件的表达为单独表达，或由重组酶识别序列、四环素应答序列介导表达。
进一步，所述的重组腺相关病毒中，重组酶识别序列选自Cre识别的lox序列之间、变体序列(如lox N、lox2722)之间、以及lox与变体序列的组合，如loxP和loxP(LSL)、loxP和lox2722(FLEX或DIO)；Flp识别的FRT序列之间、变体序列(如F3、F5)之间、以及FRT与变体序列的组合，如FRT和F5(fDIO)。Dre识别的rox序列之间、变体序列(如rox1、rox2、rox3)之间、以及rox与变体序列的组合，如rox1和rox2(dDIO)。还包括任意两种或两种以上重组酶识别序列之间的组合，如loxP-lox2722和FRT-F5，loxP-lox2722和rox1-rox2，FRT-F5和rox1-rox2等。
进一步，所述的重组腺相关病毒中，所述包装细胞为HEK293T细胞。
进一步，所述包装为常规的三质粒包装***，即辅助质粒(包含Rep和Cap基因的质粒)、腺病毒helper质粒与双链质粒混合共转染HEK293T细胞包装细胞系。
进一步地，所述的四环素应答序列介导的转录激活标记***可以与上述启动子、荧光蛋白和重组酶识别序列各元件进行任意组合。
2、上述任一项所述重组腺相关病毒在神经元胞体标记中的应用。
进一步，重组腺相关病毒在神经元胞体标记中的应用中，所述神经元胞体为全脑范围内多种细胞类型突触后神经元胞体。
进一步，重组腺相关病毒在神经元胞体标记中的应用中，所述应用的对象为啮齿类、哺乳动物类等野生型、表达重组酶或四环素转录激活因子的转基因动物品系和/或非人灵长类动物。
进一步，所述啮齿类为小鼠、大鼠、豚鼠等。
进一步，所述哺乳动物类为雪貂、树鼩、猫、狗、猪等。
3、突触后神经元胞体的标记制剂，包含上述任一项所述重组腺相关病毒。
所述标记制剂由所述重组腺相关病毒介导的高效实现对全脑范围内多种细胞类型突触后神经元胞体的标记。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：
1.使用本发明的重组腺相关病毒就可以实现对全脑范围内多种细胞类型突触后神经元胞体的标记，完成了过去使用染料和除本发明之外的其他重组腺相关病毒无法实现的目标，且直接对胞体进行标记具有如下的优点：(1)神经元的胞体亮度要远远高于神经元纤维(大于10倍以上的亮度)，观察或成像过程中不仅很容易捕捉到信号而且大大降低了对成像参数的要求(如汞灯或激光器的功率等)，减少了对样本的损伤。此外，样本的信号能实现长时间的保存，更有助于后续的研究。(2)较之于神经纤维，神经元的胞体更容易实现定量研究，极大提高了所得实验结论的可靠性和准确性，而且通过胞体分布的定性和定量分析可以更为直观的比较靶定脑区对下游投射脑区调控的强度，更有助于理解脑输出环路信息处理及行使功能的机制。(3)借助免疫染色等手段可以对投射脑区神经元胞体所属细胞类型进行进一步鉴定，较之于神经纤维，神经元胞体的形状及直径大小等形态特征将为选用何种抗体进行染色提供直观证据，避免实验的盲目性能，极大缩短实验周期。(4)该方法具有高效率的特点，有助于研究使用以往方法或策略标记效率低的脑区与靶定脑区结构与功能的联系，或发现以往方法或策略无法标记的新的投射脑区、新的投射类型，进一步提高研究人员对脑输出环路复杂性的认识。如图5中b所示，使用本方法在胼胝体标记到一定数目的突触后神经元胞体，而以往的方法及研究报道认为该脑区只有投射到对侧脑区的神经纤维存在，如图5中c图使用AAV1-EF1a-EGFP标记所示。
2.使用重组腺相关病毒进行标记免疫原性较低，避免了使用嗜神经病毒毒性较高的缺陷，对注射环境也没有太高的要求，提高实验成功率。此外，使用本发明的重组腺相关病毒能介导目的基因长时间稳定的表达。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1是本发明用于非特定细胞类型标记的载体(pscAAV-hSyn-H2B-mClover3)的构建示意图。
图2是包装得到的重组腺相关病毒感染HEK293T细胞后分别在明场和荧光下使用低倍镜和高倍镜观察的效果。
图3为重组腺相关病毒介导的非特定细胞类型标记***用于解析小鼠听觉皮层全脑范围内的突触后神经元胞体的切片成像应用举例。
图4是重组腺相关病毒介导的非特定细胞类型标记***用于解析小鼠听觉皮层全脑范围内的突触后神经元胞体的全脑成像应用举例。
图5是选取了图4中代表性的脑片用于重点展示众多亚脑区内标记的效果。
图6是用于实现对全脑范围内多种类型细胞突触后神经元胞体高效标记的重组腺相关病毒载体示意图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
图6是用于实现对全脑范围内多种类型细胞突触后神经元胞体高效标记的重组腺相关病毒载体示意图，包括非特定细胞类型的标记***(1)、由单独由重组酶识别序列(2)或四环素应答序列介导(3)，以及两个序列组合(4)介导的能够实现对特定细胞/亚细胞类型进行标记的***。其中***(1)的载体主体部分为启动子介导与核定位序列H2B耦连的荧光蛋白元件；***(2)的载体主体部分为启动子介导的、两端被重组酶识别序列包裹的耦连核定位序列H2B的荧光蛋白元件；***(3)的载体主体部分为启动子介导的、前置有四环素应答序列的耦连核定位序列H2B的荧光蛋白元件；***(4)的载体主体部分为启动子介导的、同时包含四环素应答序列和重组酶识别序列的耦连核定位序列H2B的荧光蛋白元件。
一种重组腺相关病毒介导的高效实现非特定细胞类型突触后神经元胞体的标记***，包含双链载体构建和重组腺相关病毒的制备等过程，其步骤如下：
1.包含表达基因双链载体的构建：为了展示该标记***的效果，选取商业化双链载体pscAAV-GFP(Addgene#32396；http://www.addgene.org/32396/)用于构建包含表达元件的目的载体。为了对标记的突触后神经元胞体进行观察和成像，启动子选取在神经元中广泛表达的hSyn(Human synapsin 1)，荧光蛋白选取绿色荧光蛋白的变体mClover3。该载体的构建步骤如图1所示：首先根据需求合成hSyn-H2B-mClover3片段(核苷酸序列如SEQID NO：1所示)；其次从模板载体pscAAV-GFP上选取SnaBI和StuI两个酶切位点，使用两种重组酶分别处理模板载体pscAAV-GFP和hSyn-H2B-mClover3，酶切后从模板载体pscAAV-GFP切下启动子CMV和荧光蛋白GFP之间的片段以利于合成的片段hSyn-H2B-mClover3的***；使用连接酶对经两种酶处理后的模板载体和合成片段进行连接，得到包含表达基因的双链载体pscAAV-hSyn-H2B-mClover3(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)。应当指出的是，hSyn启动子可以换成其他诸如EF1α、CMV和CAG等，荧光蛋白mClover3也可以更换成EGFP或其他颜色的种类，如mCherry等。此外，H2B-mClover3片段的两端还可以由重组酶的识别序列介导，如两对loxP和lox2722之间、FRT和F5之间以及rox1和rox2之间的组合，以及任意两种或两种以上重组酶识别序列之间的组合，如loxP-lox2722和FRT-F5，loxP-lox2722和rox1-rox2，FRT-F5和rox1-rox2等；也可以连接四环素应答序列(TRE)。上述启动子与重组酶应答元件或四环素应答序列任意组合后序列的合成、载体的构建和病毒的制备采用类似的步骤。
2.重组腺相关病毒的制备：病毒的制备依照常规的三质粒包装***进行，即包含Rep和Cap基因的辅助质粒(pAAV-RC)、腺病毒helper质粒(pAAV-helper)与上述1中构建的双链质粒pscAAV-hSyn-H2B-mClover3混合共转染HEK293T细胞，具体的包装制备过程如下：
(1)质粒抽提：包装所用的质粒均使用Qiagen无毒素抽提试剂盒抽提，要求浓度大于1μg/μL并测定抽提后的质粒纯度(A260/280≈1.8，A260/230>2.0)。
(2)细胞培养：使用0.25％胰蛋白酶消化HEK293T细胞，控制细胞密度为1×107个/15cm培养皿，37℃、5％CO2细胞培养箱中过夜培养。
(3)转染：待细胞密度达到90％左右即可进行转染，于2小时前更换新鲜的DMEM+10％FBS培养基，配制质粒和PEI转染复合物，其规格为(以10×15cm培养皿为例)：8mL无血清的DMEM+约0.4mL DNA(170μg双链载体质粒+170μg RC pAAV-RC+170μgpAAV-Helper质粒)+1.6mL PEI，混匀静置15分钟后每皿加入1mL转染复合物，37℃、5％CO2细胞培养箱过夜培养48-72小时。转染后完毕后将细胞连同培养基一起收集至离心管中，离心，分别收获培养基上清与细胞沉淀：PEG8000沉淀培养基上清中的病毒；裂解细胞沉淀收毒；合并从细胞沉淀和上清中得到的腺相关病毒粒子。
(4)病毒纯化、滴度测定：使用碘克沙醇超速离心对病毒进行纯化，采用荧光定量PCR对病毒滴度进行测定，最终得到的重组腺相关病毒滴度大于1×1013viral genome/mL。
(5)血清型：本实施例中重组腺相关病毒被包装成2/1血清型。
使用包装得到的双链重组腺相关病毒(scAAV2/1-hSyn-H2B-mclover3)感染HEK293T细胞，明场图显示细胞生长状态良好，并且在低倍镜和高倍镜下均可以观察到强信号的荧光蛋白表达，结果如图2所示，这些结果表明该病毒可以正常表达。
实施例2
非特定细胞类型标记***用于解析小鼠AUD全脑范围内的突触后神经元胞体分布。
活体标记：将包装得到的实现非特定细胞类型突触后神经元胞体标记的双链重组腺相关病毒(scAAV2/1-hSyn-H2B-mclover3)以100nL体积注射到野生型鼠小鼠听觉皮层(Auditory cortex,AUD)脑区(AP:-3.0mm，ML:-3.8mm，DV:-1.9mm)，待病毒表达四周后。将标记样本灌流取样分别用于手工切片成像和全脑连续切削成像。
手工切片成像：将灌流后固定的标记鼠脑样本使用0.01M PBS漂洗后在30％蔗糖中脱水48-72小时(时间根据脱水情况而定，判断依据为鼠脑完全沉入底部)，使用OCT冰冻切片包埋剂对脱水样本进行包埋，使用冰冻切片机以50μm厚度对样本进行连续手工切片(切片范围介于Bregma+3.0mm到Bregma-7.0mm之间)，将脑片从前到后依次贴片后使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)复染10-15分钟，漂洗干净后使用抗荧光淬灭封片剂封片并在脑片四周涂上指甲油便于长期保存。在荧光显微镜下对含有胞体信号的脑片进行筛选并对代表性的脑片进行成像。
全脑连续切削成像：将灌流后的标记鼠脑样本使用Lowicryl HM20树脂包埋，包埋所用的流程为：漂洗(鼠脑放在0.01M PBS里分别漂洗3次，前两次6小时，第三次过夜)→脱水(依次经过50％、75％、95％、100％和100％乙醇处理，每个梯度2小时)→渗透(依次经过50％、75％、100％和100％树脂处理，前三个梯度处理2小时，最后一个48小时)→聚合(48℃烘箱放置8小时)。全脑成像由商业化的双色荧光显微光学切片断层成像***(Fluorescence micro-optical sectioning tomography,fMOST)(型号：Biomapping5000)以0.3×0.3×2μm3的体素分辨率实现，历时约4天的连续成像后获取了一个包含4,300张冠状面图片的双色全脑数据。
数据分析：将获得的全脑双色通道原始数据进行预处理，绿色通道每50张冠状面脑片进行最大值投影(100μm厚度)。然后分别与相应的红色通道单张冠状面脑片(2μm厚度)进行合并，得到双色最大值投影的数据集进行信号展示。为了更好的展示本发明的优势，选取Allen脑研究所网上公开的AUD全脑投射数据集(https://connectivity.brain- map.org/；编号：146858006)并进行加工后处理，然后与本发明标记***获得的AUD双色全脑数据进行比较。具体做法是：分别从两组全脑数据集选取几张不同位置的双色冠状面脑片配准到Allen标准脑图谱中，然后选取相同的脑区展示两组数据集的信号分布。
图3是重组腺相关病毒介导的非特定细胞类型标记***用于解析小鼠AUD全脑范围内的突触后神经元胞体的切片成像应用举例。选取了6张50μm厚度的代表性脑片(从Bregma-0.9mm到Bregma-4.0mm)用于展示AUD在皮层和皮层下众多投射脑区突触后神经元胞体的分布。这些皮层的脑区包括：轨道皮层(Orbital area,ORB)、前扣带皮层(Anteriorcingulate area,ACA)、运动皮层(Motor area,MO)、嗅外皮层(Ectorhinal area,ECT)、颞叶联合皮质(Temporal association cortex,TEa)、压后皮层(Retrosplenial area,RSP)、视觉皮层(Visual area,VIS)和嗅内皮层(Entorhinal area,ENT)等。皮层下的脑区包括：尾状核(Caudoputamen,CP)、基底外侧杏仁核(Basolateral amygdala,BLA)、丘脑后外侧核(Lateral posterior nucleus of the thalamus,LP)、束旁核(Parafascicular nucleus,PF)、内侧膝状体(Medial geniculate complex,MG)和下丘(Inferior colliculus,IC)等。
图4是重组腺相关病毒介导的非特定细胞类型标记***用于解析小鼠AUD全脑范围内的突触后神经元胞体的全脑成像应用举例。全脑数据是使用fMOST双色通道成像获得。在绿色通道内将每50张脑片进行最大值投影(100μm厚度)，然后分别与相应的红色通道单张冠状面脑片(2μm厚度)进行合并，得到双色最大值投影的数据集。将该数据集中的图片从前到后依次排列对所标记的全脑突触后神经元胞体的分布进行展示。
图5是选取了图4中代表性的脑片用于重点展示众多亚脑区内标记的效果。为了更好的展示本发明的优势，将使用本发明的标记***和现有技术的方法(如使用AAV-EF1a-EGFP标记)在全脑范围内众多相同脑区的标记效果进行比较。其中图a是选取的6张代表性的脑片的位置，图b是使用fMOST获得的、本发明标记***获得的AUD双色全脑数据，图c是修改自Allen脑研究所公开的、使用AAV1-EF1a-EGFP标记的AUD轴突投射的全脑数据(https://connectivity.brain-map.org/；编号：146858006)。如该图所示，较之于轴突标记，本发明实现的突触后胞体标记具有如下优势：(1)标记的效率更高：在众多的脑区本发明标记的胞体信号分布更为广泛，如皮层的初级运动皮层(Primary motor area,MOp)、次级运动皮层(Secondary motor area,MOs)、视觉皮层前区(Anterior area,VISa)和前内侧区(Anteromedial visual area,VISam)、颞叶联合皮质Tea等；皮层下的众多脑区，如尾状核CP、位于背侧丘脑外侧群的丘脑后外侧核LP和丘脑后复合体(Posterior complex ofthe thalamus,PO)、位于背侧丘脑膝状体组的外侧膝状体复合体背侧部(Dorsal part ofthe lateral geniculate complex,LGd)，以及视上丘的几个亚脑区：与运动相关的中间灰色层(Superior colliculus,motor related,intermediate gray layer；SCig)、与运动相关的中间白色层(Superior colliculus,motor related,intermediate white layer；SCiw)和与运动相关的深灰色层(SCdg,Superior colliculus,motor related,deep graylayer；SCdg)；中脑网状核(Midbrain reticular nucleus；MRN)等。(2)能够准确的判断AUD的突触后神经元信号在皮层内各层调控强度的差异：如在初级感觉皮层(Primarysomatosensory area,SSp)和视觉皮层VIS等皮层，第5层的神经元胞体均多于其它层，这表明AUD对这些皮层第5层神经元的调控强度最大；相比之下，使用AAV1-EF1a-EGFP标记的轴突分布较为弥散并且不易定量分析，因而无法准确判断来自于AUD的轴突纤维在其他皮层各层的信号强弱分布。(3)发现新的投射脑区、新的投射类型：如使用本发明可以在胼胝体清晰的观察到一定数目的突触后神经元胞体，这表明AUD与该脑区特定类型的神经元存在着环路连接，根据胞体数目的多少判断对该脑区调控强弱程度，并且后续还可以借助免疫染色等手段对神经元的化学成分进行鉴定；而使用AAV1-EF1a-EGFP只标记了经由该脑区投射到对侧半脑的神经纤维，无法实现上述目标。
总的来说，本发明不仅适用于机械手工切片，而且适用于自动或半自动的全脑成像***，用于展示突触后神经元胞体的标记。进一步的，本发明结合全脑成像***，不仅可以更直观的在三维水平展示特定脑区和脑区内特定类型细胞突触后神经元胞体在全脑水平的整体分布以及在全脑范围内众多脑区和亚脑区的分布，而且还能在同一个样本中并行展示和比较不同实验个体、不同脑区、同一脑区不同细胞类型对输出环路中不同脑区或不同类型突触后神经元调控强弱的差异。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 重庆大学
<120> 实现全脑突触后神经元胞体标记的重组腺相关病毒及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1567
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgcagaggg ccctgcgtat gagtgcaagt gggttttagg accaggatga ggcggggtgg 60
gggtgcctac ctgacgaccg accccgaccc actggacaag cacccaaccc ccattcccca 120
aattgcgcat cccctatcag agagggggag gggaaacagg atgcggcgag gcgcgtgcgc 180
actgccagct tcagcaccgc ggacagtgcc ttcgcccccg cctggcggcg cgcgccaccg 240
ccgcctcagc actgaaggcg cgctgacgtc actcgccggt cccccgcaaa ctccccttcc 300
cggccacctt ggtcgcgtcc gcgccgccgc cggcccagcc ggaccgcacc acgcgaggcg 360
cgagataggg gggcacgggc gcgaccatct gcgctgcggc gccggcgact cagcgctgcc 420
tcagtctgcg gtgggcagcg gaggagtcgt gtcgtgcctg agagcgcaga tgccagagcc 480
agcgaagtct gctcccgccc cgaaaaaggg ctccaagaag gcggtgacta aggcgcagaa 540
gaaaggcggc aagaagcgca agcgcagccg caaggagagc tattccatct atgtgtacaa 600
ggttctgaag caggtccacc ctgacaccgg catttcgtcc aaggccatgg gcatcatgaa 660
ttcgtttgtg aacgacattt tcgagcgcat cgcaggtgag gcttcccgcc tggcgcatta 720
caacaagcgc tcgaccatca cctccaggga gatccagacg gccgtgcgcc tgctgctgcc 780
tggggagttg gccaagcacg ccgtgtccga gggtactaag gccatcacca agtacaccag 840
cgctaagatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga 900
gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtccgc ggcgagggcg agggcgatgc 960
caccaacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg 1020
gcccaccctc gtgaccacct tcggctacgg cgtggcctgc ttcagccgct accccgacca 1080
catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac 1140
catctctttc aaggacgacg gtacctacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga 1200
caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct 1260
ggggcacaag ctggagtaca acttcaacag ccactacgtc tatatcacgg ccgacaagca 1320
gaagaactgc atcaaggcta acttcaagat ccgccacaac gttgaggacg gcagcgtgca 1380
gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga 1440
caaccactac ctgagccatc agtccaagct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca 1500
catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggattaca catggcatgg acgagctgta 1560
caagtaa 1567
<210> 2
<211> 4911
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60
acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120
tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180
ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctct 240
cgagatctag aaagcttccc ggggggatct gggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc 300
tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag 360
tgagcgagcg agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tcctggaggg 420
gtggagtcgt gacctaggca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 480
tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac 540
atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg ctgcagaggg ccctgcgtat gagtgcaagt 600
gggttttagg accaggatga ggcggggtgg gggtgcctac ctgacgaccg accccgaccc 660
actggacaag cacccaaccc ccattcccca aattgcgcat cccctatcag agagggggag 720
gggaaacagg atgcggcgag gcgcgtgcgc actgccagct tcagcaccgc ggacagtgcc 780
ttcgcccccg cctggcggcg cgcgccaccg ccgcctcagc actgaaggcg cgctgacgtc 840
actcgccggt cccccgcaaa ctccccttcc cggccacctt ggtcgcgtcc gcgccgccgc 900
cggcccagcc ggaccgcacc acgcgaggcg cgagataggg gggcacgggc gcgaccatct 960
gcgctgcggc gccggcgact cagcgctgcc tcagtctgcg gtgggcagcg gaggagtcgt 1020
gtcgtgcctg agagcgcagt cgagaagtac taggccgcgc cggctagcgc gccacgccac 1080
catgccagag ccagcgaagt ctgctcccgc cccgaaaaag ggctccaaga aggcggtgac 1140
taaggcgcag aagaaaggcg gcaagaagcg caagcgcagc cgcaaggaga gctattccat 1200
ctatgtgtac aaggttctga agcaggtcca ccctgacacc ggcatttcgt ccaaggccat 1260
gggcatcatg aattcgtttg tgaacgacat tttcgagcgc atcgcaggtg aggcttcccg 1320
cctggcgcat tacaacaagc gctcgaccat cacctccagg gagatccaga cggccgtgcg 1380
cctgctgctg cctggggagt tggccaagca cgccgtgtcc gagggtacta aggccatcac 1440
caagtacacc agcgctaagg atccaccggt cgccaccagt gacatggtga gcaagggcga 1500
ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca 1560
caagttcagc gtccgcggcg agggcgaggg cgatgccacc aacggcaagc tgaccctgaa 1620
gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccttcgg 1680
ctacggcgtg gcctgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa 1740
gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc tctttcaagg acgacggtac 1800
ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct 1860
gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaactt 1920
caacagccac tacgtctata tcacggccga caagcagaag aactgcatca aggctaactt 1980
caagatccgc cacaacgttg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa 2040
cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gccatcagtc 2100
caagctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac 2160
cgccgccggg attacacatg gcatggacga gctgtacaag taaagcggcc gctaggcctc 2220
acctgcgatc tcgatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca 2280
ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc 2340
agggggaggt gtgggaggtt ttttaaacta gtccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct 2400
cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt 2460
gagcgagcga gcgcgcagag agggacagat ccgggcccgc atgcgtcgac aattcactgg 2520
ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg 2580
cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt 2640
cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc 2700
atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg 2760
catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc 2820
tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga 2880
ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt 2940
tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa 3000
atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 3060
tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 3120
aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 3180
acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 3240
acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 3300
ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg 3360
ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 3420
caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 3480
ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 3540
aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 3600
aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 3660
tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 3720
aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 3780
cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca 3840
ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 3900
gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta 3960
agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 4020
atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 4080
cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 4140
cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 4200
cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 4260
tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 4320
tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 4380
ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 4440
aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 4500
cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 4560
ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 4620
agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 4680
ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 4740
acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg 4800
cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 4860
gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa g 4911

Claims (8)

1.重组腺相关病毒在神经元胞体标记中的应用，其特征在于，所述神经元胞体为全脑范围内多种细胞类型的突触后神经元胞体；所述重组腺相关病毒的制备方法为：通过启动子介导的耦连核定位序列H2B的荧光蛋白元件构建成双链载体，再用包装细胞包装成重组腺相关病毒。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述启动子选取hSyn、EF1α、CMV、CAG、CaMKII、Dlx、TH中的一种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，荧光蛋白选自蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、红色荧光蛋白、远红光荧光蛋白或上述荧光蛋白的衍生物。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，耦连核定位序列H2B的荧光蛋白元件的表达为单独表达，或由重组酶识别序列、四环素应答序列介导表达。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，重组酶识别序列选自loxP-STOP-loxP、FLEX、DIO、fDIO、dDIO、vcDIO和scDIO中两种及其以上元件的组合。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述包装细胞为HEK293T细胞。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用的对象为哺乳动物。
8.突触后神经元胞体的标记制剂，其特征在于，包含重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒的制备方法为：通过启动子介导的耦连核定位序列H2B的荧光蛋白元件构建成双链载体，再用包装细胞包装成重组腺相关病毒。
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