KR20220121850A

KR20220121850A - 항-cd73 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220121850A
Application number: KR1020227025615A
Authority: KR
Inventors: 호라시오 지. 나스트리; 숀 엠. 스튜어트; 후안 카를로스 알마그로; 징 저우; 레베카 에이. 부온판
Original assignee: 인사이트 코포레이션
Priority date: 2020-01-03
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2022-09-01
Also published as: CR20220317A; PE20221409A1; BR112022013236A2; CA3166533A1; ECSP22051701A; CO2022009248A2; AU2020417804A1; AR120936A1; JP2023509448A; WO2021138467A1; MX2022007575A; CN115135341A; EP4084825A1; CL2022001769A1; IL294436A; US20210230293A1; TW202128768A

Abstract

항-CD73 항체가 개시된다. 또한 관련된 핵산, 벡터, 세포, 및 약제학적 조성물이 개시된다. 또한 항-CD73 항체로 암을 치료하는 방법이 개시된다.

Description

항-CD73 항체 및 이의 용도

관련 출원

본 출원은 2020년 1월 3일자로 출원된 미국 가출원번호 제62/956,847호의 이익을 주장하며, 이 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 형식으로 제출되어, 그 전체가 참조로 본원에 편입된 서열 목록을 포함한다.　2020년 12월 23일자로 생성된 상기 ASCII 복사본은 20443-0644WO1_SL.txt로 명명되고 크기가 89,020 바이트이다.

분화 클러스터 73(CD73)은 세포외 아데노신 모노포스페이트(extracellular adenosine monophosphate, AMP)의 아데노신으로의 전환을 촉매하는 글리코실 포스파티딜 이노시톨-(glycosyl phosphatidyl inositol-, GPI-) 결합 막 단백질이다. 분화 클러스터 73(CD73)은 동종이량체로 기능하며, 순환계에서 가용성 단백질로서 배출될 수 있으며 활성이 있다. 효소 기능 외에도 CD73은 세포 부착 분자이며 백혈구 수송(trafficking)을 조절하는 역할을 한다. CD73 수준은 조직 손상 또는 저산소 상태로 인해 상향 조절되는 것으로 알려져 있으며 많은 고형 종양에서 CD73 수준이 상승된다. 종양 내에서 CD73의 상향 조절은 아데노신이 풍부한 종양 미세 환경에 기여하며, 이는 수많은 종양촉진효과 및 면역 억제 효과를 나타낸다. 따라서, CD73을 표적으로 하는 암 치료제가 필요하다.

한 양태에서, 본 개시는 인간 CD73에 결합하는 항체를 제공하며, 항체는 가변 중쇄(variable heavy, VH) 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 도메인을 포함하되:

VH CDR1은 아미노산 서열 GYTFTSYG(서열 번호 1)를 포함하고;

VH CDR2는 아미노산 서열 IYPGSGNT(서열번호 2)를 포함하고;

VH CDR3은 아미노산 서열 ARYDYLGSSYGFDY(서열 번호 3)를 포함하고;

항체는 가변 경쇄(variable light, VL) CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL 도메인을 포함하되:

VL CDR1은 아미노산 서열 QDVSTA(서열번호 4)를 포함하고;

VL CDR2는 아미노산 서열 SAS(서열번호 5)를 포함하며;

VL CDR3은 아미노산 서열 QQHYNTPYT(서열번호 6)를 포함한다.

제1 양태의 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.

제1 양태의 일부 구현예에서, 항체는 중쇄를 포함하며, 중쇄는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.

제1 양태의 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.

제1 양태의 일부 구현예에서, 항체는 경쇄를 포함하며, 경쇄는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.

제1 양태의 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하고, VL 도메인은 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하다.

제1 양태의 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하고 VL 도메인은 서열번호 23에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.

제1 양태의 일부 구현예에서, 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 중쇄는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.

제2 양태에서, 본 개시는 인간 CD73에 결합하는 항체를 제공하며, 항체는 서열번호 70의 40-53 번 아미노산 내의 에피토프에서 인간 CD73에 결합한다.

제3 양태에서, 본 개시는 인간 CD73에 결합하고, 인간 CD73에 결합하기 위해 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 가진 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다.

제1 양태, 제2 양태 및 제3 양태의 일부 구현예에서, 항체는 인간화 항체이다.

제1 양태, 제2 양태 및 제3 양태의 일부 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체, 단일쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fsc 단편, Fv 단편, scFv, sc(Fv)2 또는 이중체이다.

제4 양태에서, 본 개시는 제1 양태 내지 제3 양태 중 어느 한 양태의 항체를 암호화하는 하나의 핵산 또는 핵산들을 제공한다.

제5 양태에서, 본 개시는 제4 양태의 전술한 핵산 또는 핵산들을 포함하는 발현 벡터 또는 발현 벡터들을 제공한다.

제6 양태에서, 본 개시는 제4 양태의 핵산 또는 핵산들 또는 제5 양태의 발현 벡터 또는 발현 벡터들을 포함하는 단리된 세포를 제공한다.

제7 양태에서, 본 개시는 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1 양태 내지 제3 양태 중 어느 한 양태의 항체의 VH 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1 양태 내지 제3 양태 중 어느 한 양태의 항체의 VL 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포를 제공한다.

제8 양태에서, 본 개시는 제1 양태 내지 제3 양태 중 어느 한 양태의 항체를 생산하는 단리된 세포를 제공한다.

제9 양태에서, 본 개시는 제6 양태 또는 제7 양태의 세포를 배양하는 단계와 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 제1 양태 내지 제3 양태 중 어느 한 양태의 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

제10 양태에서, 본 개시는 제1 양태 내지 제3 양태 중 어느 한 양태의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

제11 양태에서, 본 개시는 치료를 필요로 하는 인간 대상의 암 치료 방법을 제공하며, 이는 인간 대상에게 제1 양태 내지 제3 양태 중 어느 한 양태의 항체의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

제11 양태의 일부 구현예에서, 암은 높은 아데노신을 특징으로 한다.

제11 양태의 일부 구현예에서, 암은 두경부암, 결장직장암, 폐암, 흑색종, 난소암, 방광암, 간암, 또는 신세포암종이다.

제12 양태에서, 본 개시는 인간 CD73에 결합하는 항체를 제공하며, 항체는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 도메인을 포함하되:

VH CDR1은 아미노산 서열 GFTFSSYD(서열 번호 34)를 포함하고;

VH CDR2는 아미노산 서열 MSYDGSNK(서열번호 35) 또는 MSYEGSNK(서열번호 40)를 포함하고;

VH CDR3은 아미노산 서열 ATEIAAKGDY(서열번호 36)를 포함하며;

항체는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL 도메인을 포함하되:

VL CDR1은 아미노산 서열 QGISNY(서열번호 37)를 포함하고;

VL CDR2는 아미노산 서열 AAS(서열번호 38)를 포함하고;

VL CDR3은 아미노산 서열 QQSYSTPH(서열번호 39)를 포함한다.

제12 양태의 일부 구현예에서,

VH CDR1은 아미노산 서열 GFTFSSYD(서열 번호 34)를 포함하고;

VH CDR2는 아미노산 서열 MSYDGSNK(서열번호 35)를 포함하고;

VH CDR3은 아미노산 서열 ATEIAAKGDY(서열번호 36)를 포함하고;

VL CDR1은 아미노산 서열 QGISNY(서열번호 37)를 포함하고;

VL CDR2는 아미노산 서열 AAS(서열번호 38)를 포함하고;

VL CDR3은 아미노산 서열 QQSYSTPH(서열번호 39)를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 중쇄를 포함하며, 중쇄는 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 경쇄를 포함하며, 경쇄는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하고, VL 도메인은 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 중쇄는 서열 번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하고 경쇄는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.

제12 양태의 일부 구현예에서,

VH CDR1은 아미노산 서열 GFTFSSYD(서열 번호 34)를 포함하고;

VH CDR2는 아미노산 서열 MSYEGSNK(서열번호 40)를 포함하고;

VH CDR3은 아미노산 서열 ATEIAAKGDY(서열번호 36)를 포함하고;

VL CDR1은 아미노산 서열 QGISNY(서열번호 37)를 포함하고;

VL CDR2는 아미노산 서열 AAS(서열번호 38)를 포함하고;

VL CDR3은 아미노산 서열 QQSYSTPH(서열번호 39)를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 중쇄를 포함하며, 중쇄는 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 경쇄를 포함하며, 경쇄는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하고, VL 도메인은 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은서열번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 중쇄는 서열 번호 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하고 경쇄는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.

제13 양태에서, 본 개시는 인간 CD73에 결합하는 항체를 제공하며, 항체는 서열번호 70의 386-399 번 및 470-489번 아미노산 내의 에피토프에서 인간 CD73에 결합한다.

제14 양태에서, 본 개시는 인간 CD73에 결합하고, 인간 CD73에 결합하기 위해 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 가진 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다.

제15 양태에서, 본 개시는 인간 CD73에 결합하고, 인간 CD73에 결합하기 위해 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 가진 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다.

제12 양태 내지 제15 양태의 일부 구현예에서, 항체는 인간화 항체이다.

제12 양태 내지 제15 양태의 일부 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체, 단일쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fsc 단편, Fv 단편, scFv, sc(Fv)2 또는 이중체이다.

제16 양태에서, 본 개시는 제12 양태 내지 제15 양태 중 어느 한 양태의 항체를 암호화하는 핵산 또는 핵산들을 제공한다.

제17 양태에서, 본 개시는 프로모터에 작동가능하게 연결된 제16 양태의 핵산 또는 핵산들을 포함하는 발현 벡터 또는 발현 벡터들을 제공한다.

제18 양태에서, 본 개시는 제16 양태의 핵산 또는 핵산들 또는 제17 양태의 발현 벡터 또는 발현 벡터들을 포함하는 단리된 세포를 제공한다.

제19 양태에서, 본 개시는 프로모터에 작동가능하게 연결된 제12 양태 내지 제15 양태 중 어느 한 양태의 항체의 VH 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 제12 양태 내지 제15 양태 중 어느 한 양태의 항체의 VL 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포를 제공한다.

제20 양태에서, 본 개시는 제12 내지 제15 양태 중 어느 한 양태의 항체를 생산하는 단리된 세포를 제공한다.

제21 양태에서, 본 개시는 제18 양태 또는 제19 양태의 세포를 배양하는 단계와 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 제12 양태 내지 제15 양태 중 어느 한 양태의 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

제22 양태에서, 본 개시는 제12 양태 내지 제15 양태 중 어느 한 양태의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

제23 양태에서, 본 개시는 치료를 필요로 하는 인간 대상의 암 치료 방법을 제공하며, 이는 인간 대상에게 제12 양태 내지 제15 양태 중 어느 한 양태의 항체의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

제23 양태의 일부 구현예에서, 암은 높은 아데노신을 특징으로 한다. 제23 양태의 일부 구현예에서, 암은 두경부암, 결장직장암, 폐암, 흑색종, 난소암, 방광암, 간암, 또는 신세포암종이다.

도1a는 인간화 CL25 항체 CL_hu10-4, HzCL25, CL25_hu_10-6, 및 CL25_hu_11-4에 대한 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL) 아미노산 서열을 나타낸다.
도1b는 인간화 CL25 항체 CL25_hu_11-5, CL25_hu_11-6, CL25_hu_8-4, 및 CL25_hu_8-5에 대한 VH 및 VL 아미노산 서열을 나타낸다.
도1c는 인간화 CL25 항체 CL25_hu_8-6, CL25_hu_9-4, CL25_hu_9-5, 및 CL25_hu_9-6에 대한 VH 및 VL 아미노산 서열을 나타낸다.
도1d는 CL25 및 인간화 CL25 항체에 대한 VH의 정렬을 나타낸다. IMGT 정의에 따라, CDR에 밑줄이 그어져 있다.
도1e는 CL25 및 인간화 CL25 항체에 대한 VL의 정렬을 나타낸다. IMGT 정의에 따라, CDR에 밑줄이 그어져 있다.
도2a는 표시된 농도에서 표시된 항체에 대한 (기하 평균 형광 강도(geometric mean fluorescence intensity, GMFI)에 의해 측정된) MDA-MB-231 세포의 세포 결합을 도시하는 그래프이다.
도2b는 표시된 농도에서 CL25, 또는 이소형 대조군(iso ctrl)에 대한 GMFI로 측정된 A375 세포의 세포 결합을 도시하는 그래프이다.
도3a는 표시된 농도에서 표시된 항체 또는 이소형 대조군(iso ctrl)으로 처리된 A375 세포에서의 세포 CD73 억제를 도시하는 그래프이다.
도3b는 표시된 농도에서 표시된 항체 또는 이소형 대조군(iso ctrl)으로 처리된 MDA-MB-231 세포에서의 세포 CD73 억제를 도시하는 그래프이다.
도3c는 표시된 농도에서 표시된 항체 또는 이소형 대조군(iso ctrl)으로 처리된 MDA-MB-231 세포에서의 세포 CD73 억제를 도시하는 그래프이다.
도4는 표시된 농도에서 표시된 항체 또는 이소형 대조군(iso ctrl)으로 처리된 재조합 CD73의 억제를 도시하는 그래프이다.
도5a-5n은 다양한 농도에서 표시된 항체 또는 이소형 대조군(iso ctrl)으로 처리된 공여 세포에서의 CD4+ T 세포 증식 퍼센트를 각기 도시하는 그래프이다.
도6은 화살표가 가리키는 영역을 포함하여 어두운 회색으로 표시된 CL25 항체 에피토프를 가진 인간 CD73(4H2F.pdb)의 결정 구조의 맵이다.
도7은 직접 접합된 비경쟁적 항체로 측정된, 표시된 항체 또는 이소형 대조군(iso ctrl)으로 처리 또는 처리하지 않은(NT) 상태에서 24시간 인큐베이션한 후의 표면 CD73 수준을 도시하는 그래프이다.
도8은 이소형 대조군(IgG 대조군) 또는 1 mg/kg 또는 10 mg/kg의 HzCL25가 투여된 마우스에 대한 종양 접종 후 표시된 날짜에서의 평균 종양 부피를 도시하는 그래프이다.
도9는 이소형 대조군(IgG 대조군) 또는 1 mg/kg 또는 10 mg/kg의 HzCL25가 투여되고 처리된 마우스로부터 수확한 종양의 CD73의 억제 퍼센트를 도시하는 그래프이다.
도10a는 비경쟁적 항체의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 결정된, 표시된 용량에서 표시된 항체로 처리된 마우스에서만 추출한 종양 세포의 단일 세포 현탁액에 대한 총 표면 CD73 수준을 도시하는 그래프이다.
도10b는 경쟁적 항체의 MFI에 의해 결정된, 표시된 용량에서 표시된 항체로 처리된 마우스에서만 추출한 종양 세포의 단일 세포 현탁액에 대한 수용체 점유율을 도시하는 그래프이다.
도11a는 10 mg/kg의 이소형 대조군(cx00376-001) 또는 HzCL25로 접종한 후 표시된 날짜에서 평균 종양 부피를 도시하는 그래프이다. x축상의 삼각형은 약물 투여 일수를 나타낸다.
도11b는 이소형 대조군(왼쪽) 또는 HzCL25(오른쪽)로 처리된 도11a의 마우스에 대한 33일까지의 개별 종양 부피를 도시하는 그래프이다.
도12 는 표시된 항체 또는 IgG 이소형 대조군으로 처리된 마우스의 혈청 내 전체 및 유리 가용성 hCD73의 농도를 도시하는 그래프이다. 전체 가용성 hCD73은 비경쟁적 항체(항체 X, 하단)로 검출되었고 유리 가용성 hCD73은 경쟁적 항체(HzCL25, 상단)로 검출되었다.
도13a는 표시된 농도에서 항체 3-F03에 대한 MDA-MB-231 세포의 세포 결합(GMFI)을 도시하는 그래프이다.
도13b는 표시된 농도에서 3-F03 또는 이소형 대조군(iso ctrl)에 대한 (GMFI로 측정된) A375 세포의 세포 결합을 도시하는 그래프이다.
도14a는 표시된 농도에서 3-F03 또는 이소형 대조군(iso ctrl)으로 처리된 A375 세포에서의 세포 CD73 억제를 도시하는 그래프이다.
도14b는 표시된 농도에서 3-F03 또는 이소형 대조군(iso ctrl)으로 처리된 MDA-MB-231 세포에서의 세포 CD73 억제를 도시하는 그래프이다.
도15는 표시된 농도에서 3-F03 또는 이소형 대조군(Iso ctrl)으로 처리된 재조합 CD73의 억제를 도시하는 그래프이다.
도16a-16d은 다양한 농도에서 3-F03 항체 또는 이소형 대조군(iso ctrl)으로 처리된 공여 세포에서의 CD4+ T 세포 증식 퍼센트를 각기 도시하는 그래프이다.
도17은 화살표가 가리키는 영역을 포함하여 어두운 회색으로 표시된 3-F03 항체 에피토프를 가진 인간 CD73(4H2F.pdb)의 결정 구조의 맵이다.
도18은 직접 접합된 비경쟁적 항체 CL43-Dy650으로 측정된, 3-F03, 이소형 대조군(iso ctrl)으로 처리, 또는 처리되지 않은(NT) 상태에서 24시간의 인큐베이션 후 CD73 표면 수준을 도시하는 그래프이다.
도19a는 10 mg/kg의 이소형 대조군(cx00376-001) 또는 3-F03으로 접종한 후 표시된 날짜에서 평균 종양 부피를 도시하는 그래프이다. x상축의 삼각형은 약물 투여 일수를 나타낸다.
도19b는 이소형 대조군(왼쪽) 또는 3-F03(오른쪽)으로 처리된 도19a의 마우스에 대한 33일까지의 개별 종양 부피를 도시하는 그래프이다.
도20 은 3-F03 항체 또는 IgG 이소형 대조군으로 처리된 마우스의 혈청 내 전체 및 유리 가용성 hCD73의 농도를 도시하는 그래프이다. 전체 가용성 hCD73은 비경쟁적 항체(항체 X, 상단)로 검출되었고 유리 가용성 hCD73은 경쟁적 항체(3-F03, 하단)로 검출되었다.
도21a-도21j는 3-F03 및 예시적인 3-F03 변이체의 VH 및 VL 아미노산 서열을 나타낸다.
도22는 표시된 농도에서 표시된 항체에 대한 MDA-MB-231 세포의 세포 결합(GMFI)을 도시하는 그래프이다.
도23은 표시된 농도에서 표시된 항체 또는 이소형 대조군(iso ctrl)으로 처리된 MDA-MB-231 세포에서의 세포 CD73 억제를 도시하는 그래프이다.
도24는 N297A 돌연변이가 있는 인간 IgG1 중쇄 CH1-힌지-CH2-CH3(서열번호 73), C-말단 라이신을 보유한 N297A 돌연변이가 있는 인간 IgG1 중쇄 CH1-힌지-CH2-CH3(서열번호 75), 및 인간 카파 경쇄 불변 영역(서열번호 74)의 예시적인 아미노산 서열을 나타낸다.
도25a는 HzCL25 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다.
도25b는 3-F03_411 중쇄를 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다.
도25c는 3-F03_411 및 3-F03_413 경쇄 및 3-F03_413 중쇄를 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다.
도26은 이소형 대조군(iso ctrl) 항체, HzCL25, 또는 3-F03으로 처리된 종양에서 아데노신의 농도를 도시하는 그래프이다.
도27은 HzCL25 항체(Ab) 및 AMP의 표시된 농도에서 아데노신의 억제를 도시하는 그래프이다.
도28은 3-F03 항체(Ab) 및 AMP의 표시된 농도에서 아데노신의 억제를 도시하는 그래프이다.
도29는 HzCL25 항체(Ab) 및 AMP의 표시된 농도에서 아데노신의 억제를 도시하는 그래프이다.

항-CD73 항체 및 관련 핵산, 발현 벡터, 세포, 및 약제학적 조성물이 본원에서 제공된다. 본원에 기술된 항-CD73 항체는 암(예를 들어, 두경부암, 결장직장암, 폐암, 흑색종, 난소암, 방광암, 간암, 또는 신세포암종)과 같은 장애의 치료 또는 예방에 유용하다.

CD73

CD73("5'-뉴클레오티다제" 및 "엑토-5'-뉴클레오티다제"로도 알려짐)은 원형질막의 외부면으로 GPI 연결하여 결합된 동종이량체로서 기능하는 이량체 효소(EC:3.1.3.5)이다. CD73은 순환계에서 가용성 단백질로서 배출될 수 있으며 활성이다. CD73은 세포외 AMP의 아데노신으로의 전환을 촉매한다. CD73 효소 활성은 개방형 CD73 입체형태에서 기질 결합이 필요하다. 기질 결합 후, CD73은 AMP를 아데노신으로 전환하기 위해 개방형 입체형태에서 폐쇄형 입체형태로의 큰 입체형태적 변화를 거친다(Knapp et al., 2012, Structure, 20(12):2161-73 참조). 또한, CD73은 세포 접착 분자로 기능하고 백혈구 수송을 조절하는 역할을 한다.

CD73 효소 활성은 암의 촉진 및 전이에 일조한다(예를 들어, Stagg and Smyth, 2010, Oncogene, 29:5346-5358; Salmi and Jalkanen, 2012, OncoImmunology, 1:247-248, 2012; Stagg, 2012, OncoImmunology, 1:217-218; Zhang, 2012, OncoImmunology, 167-70 참조). 암세포에서 CD73의 과발현은 적응성 항종양 면역 반응을 손상시켜, 종양 성장 및 전이를 강화시킨다(예를 들어,

, 2004, J. Immunol., 172:1646-1653; Sadej et al., 2006, Nucleosides Nucleotides Nucleic). Acids, 25:1119-1123, Braganhol et al., 2007, Biochim. Biophys. Acta., 1770:1352-1359; Zhang, 2010, Cancer Res., 70:6407-6411; Zhang, 2012, OncoImmunology, 1:67-70 참조).

성인 CD73 단백질의 예시적인 아미노산 서열(유전자은행(GenBank) 등록번호 NP_002517의 27-549 번 아미노산)은 다음과 같다:

WELTILHTNDVHSRLEQTSEDSSKCVNASRCMGGVARLFTKVQQIRRAEPNVLLLDAGDQYQGTIWFTVYKGAEVAHFMNALRYDAMALGNHEFDNGVEGLIEPLLKEAKFPILSANIKAKGPLASQISGLYLPYKVLPVGDEVVGIVGYTSKETPFLSNPGTNLVFEDEITALQPEVDKLKTLNVNKIIALGHSGFEMDKLIAQKVRGVDVVVGGHSNTFLYTGNPPSKEVPAGKYPFIVTSDDGRKVPVVQAYAFGKYLGYLKIEFDERGNVISSHGNPILLNSSIPEDPSIKADINKWRIKLDNYSTQELGKTIVYLDGSSQSCRFRECNMGNLICDAMINNNLRHTDEMFWNHVSMCILNGGGIRSPIDERNNGTITWENLAAVLPFGGTFDLVQLKGSTLKKAFEHSVHRYGQSTGEFLQVGGIHVVYDLSRKPGDRVVKLDVLCTKCRVPSYDPLKMDEVYKVILPNFLANGGDGFQMIKDELLRHDSGDQDINVVSTYISKMKVIYPAVEGRIKFS(서열번호 70).

성체 뮤린(murine) CD73 단백질의 예시적인 아미노산 서열(유전자은행 등록번호 NP_035981의 29-551 번 아미노산)은 다음과 같다:

WELTILHTNDVHSRLEQTSDDSTKCLNASLCVGGVARLFTKVQQIRKEEPNVLFLDAGDQYQGTIWFTVYKGLEVAHFMNILGYDAMALGNHEFDNGVEGLIDPLLRNVKFPILSANIKARGPLAHQISGLFLPSKVLSVGGEVVGIVGYTSKETPFLSNPGTNLVFEDEISALQPEVDKLKTLNVNKIIALGHSGFEMDKLIAQKVRGVDIVVGGHSNTFLYTGNPPSKEVPAGKYPFIVTADDGRQVPVVQAYAFGKYLGYLKVEFDDKGNVITSYGNPILLNSSIPEDATIKADINQWRIKLDNYSTQELGRTIVYLDGSTQTCRFRECNMGNLICDAMINNNLRHPDEMFWNHVSMCIVNGGGIRSPIDEKNNGTITWENLAAVLPFGGTFDLVQLKGSTLKKAFEHSVHRYGQSTGEFLQVGGIHVVYDINRKPWNRVVQLEVLCTKCRVPIYEPLEMDKVYKVTLPSYLANGGDGFQMIKDELLKHDSGDQDISVVSEYISKMKVVYPAVEGRIKFS(서열번호 71).

성체 시노몰구스(cynomolgus) CD73 단백질의 예시적인 아미노산 서열은 다음과 같다:

WELTILHTNDVHSRLEQTSEDSSKCVNASRCMGGVARLFTKVQQIRRAEPNVLLLDAGDQYQGTIWFTVYKGAEVAHFMNALRYDAMALGNHEFDNGVEGLIEPLLKEAKFPILSANIKAKGPLASQISGLYLPYKVLPVGDEVVGIVGYTSKETPFLSNPGTNLVFEDEITALQPEVDKLKTLNVNKIIALGHSGFETDKLIAQKVRGVDVVVGGHSNTFLYTGNPPSKEVPAGKYPFIVTSDDGRKVPVVQAYAFGKYLGYLKIEFDERGNVISSHGNPILLNSSIPEDPSIKADINKWRIKLDNYSTQELGKTIVYLDGSSQSCRFRECNMGNLICDAMINNNLRHADEMFWNHVSMCILNGGGIRSPIDERNNGTITWENLAAVLPFGGTFDLVQLKGSTLKKAFEHSVHRYGQSTGEFLQVGGIHVVYDLSRKPGDRVVKLDVLCTKCRVPSYDPLKMDEIYKVILPNFLANGGDGFQMIKDELLRHDSGDQDINVVSTYISKMKVIYPAVEGRIKFS(서열번호 72).

항-CD73 항체

본 개시는 암 치료에 유용한 항-CD73 항체를 제공한다. 이러한 항체는 인간 CD73에 결합할 수 있다.

일부 경우에, 이러한 항체는 인간 CD73 및 시노몰구스 CD73에 결합한다. 일부 경우에, 이러한 항체는 인간 CD73 및 시노몰구스 CD73에 결합하고 뮤린 CD73에는 결합하지 않는다. 이러한 항-CD73 항체는 항-CD73 단클론항체인 CL25 및 이의 인간화 버전인 HzCL25의 서열을 포함하며, 이의 인간화 버전은 인간 및 시노몰구스 CD73 둘 다에 고친화성으로 결합한다(예들 들어, 인간 및 시노몰구스 CD73 둘 다의 경우 개방형 입체 형태에서 약 0.5 nM 미만) 및 마우스 CD73과 감지될 수 없는 결합을 한다.

일부 경우에, 이러한 항체는 인간 CD73, 시노몰구스 CD73, 및 뮤린 CD73에 결합한다. 이러한 항-CD73 항체는 각각의 인간, 시노몰구스, 및 뮤린 CD73의 개방형 입체형태에 고친화성으로 결합하는 인간 항-CD73 단클론항체인 3-F03의 서열을 포함한다(예를 들어, 인간 CD73의 경우 약 0.37 nM, 시노몰구스 CD73의 경우 약 0.734nM, 뮤린 CD73의 경우 약 1.66nM). 이러한 항-CD73 항체는 과량의 절단 불가능한 CD73 리간드인 APCP의 존재하에 인간, 시노몰구스 및 뮤린 CD73 각각의 폐쇄형 입체형태에 대해 검출 불가능한 결합을 가진다.

항체 HzCL25

항체 HzCL25는 효과기 기능을 줄이기 위해 중쇄 불변 영역의 아스파라긴 297 번 위치(EU 넘버링에 따르면, N297)에 알라닌을 가지는 인간화 IgG1/카파 단클론항체이다. 항체 HzCL25는 고친화성(K_D≤0.5 nM)으로 인간 및 시노몰구스 CD73에 특이적으로 결합하고, 낮은효과기 기능을 가진다.

HzCL25는 CL25 항체의 키메라 버전으로 구성되었다. CL25 뮤린 중쇄 가변 도메인(heavy chain variable domain, VH) 및 경쇄 가변 도메인(light chain variable domain, VL)은 HIS-태그를 포함하는 재조합 인간 CD73(서열번호 70)으로 면역화된 마우스에서 획득했다. B 세포의 항체 서열이 결정됐고, 뮤린 중쇄 가변 도메인(VH)(서열번호 26) 및 경쇄 가변 도메인(VL)(서열번호 27)은 인간 IgG1 Fc를 보유한 키메라로 발현됐다.(서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 및 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 카파 경쇄 불변 영역). 하기 표 1은 IMGT, 코티아(Chothia), AbM, 카바트(Kabat) 및 콘택트(Contact) 넘버링에 따른 CL25 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열을 나타낸다. 하기 표 1은 또한 CL25 성숙 VH 및 VL의 아미노산 서열을 나타낸다.

CL25 CDR, VH 및 VL

	IMGT	코티아	AbM	카바트	콘택트
VH CDR1	GYTFTSYG (서열번호 1)	GYTFTSY (서열번호 7)	GYTFTSYGLS (서열번호 12)	SYGLS (서열번호 14)	TSYGLS (서열번호 16)
VH CDR2	IYPGSGNT (서열번호 2)	YPGSGN (서열번호 8)	EIYPGSGNTY (서열번호 13)	EIYPGSGNTYYNEKFKG (서열번호 15)	WIGEIYPGSGNTY (서열번호 28)
VH CDR3	ARYDYLGSSYGFDY (서열번호 3)	YDYLGSSYGFDY (서열번호 9)	YDYLGSSYGFDY (서열번호 9)	YDYLGSSYGFDY (서열번호 9)	ARYDYLGSSYGFD (서열번호 18)
VL CDR1	QDVSTA (서열번호 4)	KASQDVSTAVA (서열번호 10)	KASQDVSTAVA (서열번호 10)	KASQDVSTAVA (서열번호 10)	STAVAWY (서열번호 19)
VL CDR2	SAS (서열번호 5)	SASYRYN (서열번호 29)	SASYRYN (서열번호 29)	SASYRYN (서열번호 29)	LLIYSASYRY (서열번호 20)
VL CDR3	QQHYNTPYT (서열번호 6)	QQHYNTPYT (서열번호 6)	QQHYNTPYT (서열번호 6)	QQHYNTPYT (서열번호 6)	QQHYNTPY (서열번호 21)
VH	QVQLQQSGAELARPGASVKLSCRASGYTFTSYGLSWVKQRTGQGLEWIGEIYPGSGNTYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCARYDYLGSSYGFDYWGQGTTLTVSS(서열번호 26)
VL	DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYNGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYNTPYTFGGGTKLEIK(서열번호 27)

HzCL25를 구성하기 위해, CL25 VH 및 VL 서열은 인간 VH 및 VK 유전자 데이터베이스와 정렬됐다. 뮤린 CL25 항체로부터의 CDR(표 1)은 인간 VH 및 VK 유전자에 이식됐다. 하기 표 2는 IMGT, 코티아, AbM, 카바트 및 콘택트 넘버링에 따른 HzCL25 CDR의 아미노산 서열을 나타낸다. 하기 표 2는 또한 HzCL25 성숙 VH, VL, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.

HzCL25 CDR, VH, VL, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열

	IMGT	코티아	AbM	카바트	콘택트
VH CDR1	GYTFTSYG (서열번호 1)	GYTFTSY (서열번호 7)	GYTFTSYGLS (서열번호 12)	SYGLS (서열번호 14)	TSYGLS (서열번호 16)
VH CDR2	IYPGSGNT (서열번호 2)	YPGSGN (서열번호 8)	EIYPGSGNTY (서열번호 13)	EIYPGSGNTYYNEKFKG (서열번호 15)	WMGEIYPGSGNTY (서열번호 17)
VH CDR3	ARYDYLGSSYGFDY (서열번호 3)	YDYLGSSYGFDY (서열번호 9)	YDYLGSSYGFDY (서열번호 9)	YDYLGSSYGFDY (서열번호 9)	ARYDYLGSSYGFD (서열번호 18)
VL CDR1	QDVSTA (서열번호 4)	KASQDVSTAVA (서열번호 10)	KASQDVSTAVA (서열번호 10)	KASQDVSTAVA (서열번호 10)	STAVAWY (서열번호 19)
VL CDR2	SAS (서열번호 5)	SASYRYS (서열번호 11)	SASYRYS (서열번호 11)	SASYRYS (서열번호 11)	LLIYSASYRY (서열번호 20)
VL CDR3	QQHYNTPYT (서열번호 6)	QQHYNTPYT (서열번호 6)	QQHYNTPYT (서열번호 6)	QQHYNTPYT (서열번호 6)	QQHYNTPY (서열번호 21)
VH	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTSYGLSWVRQMPGKGLEWMGEIYPGSGNTYYNEKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARYDYLGSSYGFDYWGAGTTVTVSS (서열번호 22)
VL	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQDVSTAVAWYQQKPGQPPKLLIYSASYRYSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYNTPYTFGGGTKLEIK (서열번호 23)
중쇄	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTSYGLSWVRQMPGKGLEWMGEIYPGSGNTYYNEKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARYDYLGSSYGFDYWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 24)
경쇄	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQDVSTAVAWYQQKPGQPPKLLIYSASYRYSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYNTPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 25)

항-CD73 항체는 HzCL25 또는 CL25의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3 및 VL CDR 1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 HzCL25의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다(표 2 참조). 일부 경우에, 항-CD73 항체는 HzCL25의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다(표 2 참조). 일부 경우에, 항-CD73 항체는 HzCL25의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH(표 2 참조) 및 HzCL25의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL(표 2 참조)을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 CL25의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다(표 1 참조). 일부 경우에, 항-CD73 항체는 CL25의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다(표 1 참조). 일부 경우에, 항-CD73 항체는 CL25의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH(표 1 참조) 및 CL25의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL(표 1 참조)을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 HzCL25 또는 CL25의 6개 CDR 중 하나 이상(즉, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개) 내에서, 예를 들어, 1, 2 또는 3개의 치환을 가질 수 있다. 일부 경우에, 항체는 (i) 세포 CD73을 억제한다(예를 들어, 실시예 3에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 세포 CD73 활성에서 예를 들어 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 감소); 그리고/또는 (ii) 가용성 CD73을 억제한다(예를 들어, 실시예 4에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 가용성 CD73 활성에서 예를 들어 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 감소); 그리고/또는 (iii) 고친화성으로 개방형 입체형태의 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD73에 결합하지만(예를 들어, K_D≤0.5 nM), 그러나 마우스로부터의 개방형 입체형태의 CD73에는 유의하게 결합하지 않는다(예를 들어, 실시예 6에서 기술된 결합 검정에 의해 결정된다); 그리고/또는 (iv) 고친화성으로(예를 들어, K_D≤0.5 nM) 폐쇄형 입체형태의 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD73에 결합하지만, 마우스로부터의 폐쇄형 입체형태의 CD73에는 유의하게 결합하지 않는다; 그리고/또는 (v) 서열번호 70의 40-53 번 아미노산 내의 에피토프에 결합하고[즉, TKVQQIRRAEPNVL (서열번호 76) 내] (예를 들어, 실시예 6에 기술된 결합 검정에 의해 결정된다); 그리고/또는 (vi) T 세포 증식의 AMP 매개 억제를 감소시킨다(예를 들어, 실시예 5에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 T 세포 증식에서 예를 들어 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 감소); 그리고/또는 (vii) 세포 표면 CD73의 수준을 감소시킨다(예를 들어, 실시예 8에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 암세포, 예를 들어 흑색종 암세포에서 예를 들어 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 감소); 그리고/또는 (viii) 종양 성장을 감소시킨다(예를 들어 실시예 9에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 예를 들어 흑색종 종양을 예를 들어, 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 만큼 감소); 그리고/또는 (ix) 세포의 유리 표면 CD73을 감소시킨다(예를 들어 실시예 11에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 예를 들어, 암세포, 예를 들어 흑색종 암세포를 예를 들어, 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 만큼 감소).

항-CD73 항체는 IMGT 정의, 또는 대체 CDR 정의(예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 카바트 정의, 코티아 정의, AbM CDR 정의, 또는 콘택트 정의)에 따른 HzCL25 또는 CL25의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함할 수 있다. 항-CD73 항체는 HzCL25 또는 CL25의 VH CDR1 및/또는 VH CDR2 및/또는 VH CDR3에서 0, 1, 2 또는 3개의 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 IMGT 정의, 또는 대체 CDR 정의(예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 카바트 정의, 코티아 정의, AbM CDR 정의, 또는 콘택트 정의)에 따른 HzCL25 또는 CL25의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 더 포함한다. 이러한 항-CD73 항체는 HzCL25 또는 CL25의 VL CDR1 및/또는 VL CDR2 및/또는 VL CDR3에서 0, 1, 2 또는 3개의 치환을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 1, 2, 및 3에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 및 각각 서열번호 4, 5, 및 6에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 7, 8, 및 9에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 및 각각 서열번호 10, 11, 및 6에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 12, 13, 및 9에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 및 각각 서열번호 10, 11, 및 6에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 14, 15, 및 9에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 및 각각 서열번호 10, 11, 및 6에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 16, 17, 및 18에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 및 각각 서열번호 19, 20, 및 21에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 7, 8, 및 9에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 및 각각 서열번호 10, 29, 및 6에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 12, 13, 및 9에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 및 각각 서열번호 10, 29, 및 6에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 14, 15, 및 9에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 및 각각 서열번호 10, 29, 및 6에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 16, 28, 및 18에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 및 각각 서열번호 19, 20, 및 21에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항체는 (i) 세포 CD73을 억제한다(예를 들어, 실시예 3에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 세포 CD73 활성에서 예를 들어 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 감소); 그리고/또는 (ii) 가용성 CD73을 억제한다(예를 들어, 실시예 4에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 가용성 CD73 활성에서 예를 들어 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 감소); 그리고/또는 (iii) 고친화성으로 개방형 입체형태의 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD73에 결합하지만(예를 들어, K_D≤0.5 nM), 그러나 마우스로부터의 개방형 입체형태의 CD73에는 유의하게 결합하지 않는다(예를 들어, 실시예 6에서 기술된 결합 검정에 의해 결정된다); 그리고/또는 (iv) 고친화성으로(예를 들어, K_D≤0.5 nM) 폐쇄형 입체형태의 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD73에 결합하지만, 마우스로부터의 폐쇄형 입체형태의 CD73에는 유의하게 결합하지 않는다; 그리고/또는 (v) 서열번호 70의 40-53 번 아미노산 내의 에피토프에 결합하고[즉, TKVQQIRRAEPNVL (서열번호 76) 내] (예를 들어, 실시예 6에 기술된 결합 검정에 의해 결정된다); 그리고/또는 (vi) T 세포 증식의 AMP 매개 억제를 감소시킨다(예를 들어, 실시예 5에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 T 세포 증식에서 예를 들어 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 감소); 그리고/또는 (vii) 세포 표면 CD73의 수준을 감소시킨다(예를 들어, 실시예 8에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 암세포, 예를 들어 흑색종 암 세포에서 예를 들어 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 감소); 그리고/또는 (viii) 종양 성장을 감소시킨다(예를 들어 실시예 9에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 예를 들어 흑색종 종양을 예를 들어, 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 만큼 감소); 그리고/또는 (ix) 세포의 유리 표면 CD73을 감소시킨다(예를 들어 실시예 11에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 예를 들어, 암세포, 예를 들어 흑색종 암세포를 예를 들어, 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 만큼 감소).

특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 22, 26, 및 82-84 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 HzCL25의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 1-3에 기재된 아미노산 서열 참조), VH는 서열번호 22, 26, 및 82-84 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 HzCL25의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄를 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 1-3에 기재된 아미노산 서열 참조), 중쇄는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 23, 27, 80 및 81 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 HzCL25의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 4-6에 기재된 아미노산 서열 참조), VL은 서열번호 23, 27, 80 및 81 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 HzCL25의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3를 포함한 경쇄를 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 4-6에 기재된 아미노산 서열 참조), 경쇄는 서열번호 25에기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) 서열번호 22, 26, 및 82-84 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열; 및 (ii) 서열번호 23, 27, 80 및 81 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) HzCL25의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH을 포함하고(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 1-3에 기재된 아미노산 서열 참조), VH는 서열번호 22, 26, 및 82-84 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함하고, (ii) HzCL25의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 4-6에 기재된 아미노산 서열 참조), VL은 서열번호 23, 27, 80 및 81 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열; 및 (ii) 서열번호 25에 기재된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) HzCL25의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄를 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 1-3에 기재된 아미노산 서열 참조), 중쇄는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 경쇄는 HzCL25의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 4-6에 기재된 아미노산 서열 참조), 경쇄는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 22, 26, 및 82-84 중 어느 하나에 기재된 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 HzCL25의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 1-3에 기재된 아미노산 서열 참조), VH는 서열번호 22, 26, 및 82-84 중 어느 하나에 기재된 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 23, 27, 80, 및 81중 어느 하나에 기재된 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 HzCL25의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 4-6에 기재된 아미노산 서열 참조), VL은 서열번호 23, 27, 80, 및 81에 기재된 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 22, 26, 및 82-84 중 어느 하나에 기재된 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열과 서열번호 23, 27, 80, 및 81에 기재된 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) HzCL25의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 1-3에 기재된 아미노산 서열 참조), VH는 서열번호 22, 26, 및 82-84 중 어느 하나에 기재된 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고, (ii) HzCL25의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 4-6에 기재된 아미노산 서열 참조), VL은 서열번호 23, 27, 80, 및 81에 기재된 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.

특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 HzCL25의 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열). 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 HzCL25의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 1-3에 기재된 아미노산 서열 참조), VH는 HzCL25의 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열). 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 HzCL25의 중쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열). 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 HzCL25의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 1-3에 기재된 아미노산 서열 참조), VH는 HzCL25의 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고(즉, 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열), 중쇄는 HzCL25의 중쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열). 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 HzCL25의 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열). 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 HzCL25의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 4-6에 기재된 아미노산 서열 참조), VL은 HzCL25의 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열). 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 HzCL25의 경쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열). 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 HzCL25의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한 경쇄를 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 4-6에 기재된 아미노산 서열 참조), VL은 HzCL25의 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고(즉, 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열), 경쇄는 HzCL25의 경쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열). 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) HzCL25의 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열(즉, 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열); 및 (ii) HzCL25의 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열). 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) HzCL25의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 1-3에 기재된 아미노산 서열 참조), VH는 HzCL25의 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고(즉, 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열), (ii) HzCL25의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 4-6에 기재된 아미노산 서열 참조), VL은 HzCL25의 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열). 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) HzCL25의 중쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고(즉, 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열); (ii) HzCL25의 경쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열). 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) HzCL25의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 1-3에 기재된 아미노산 서열 참조), 중쇄는 HzCL25의 중쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고(즉, 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열), (ii) HzCL25의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하며(표 1, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 4-6에 기재된 아미노산 서열 참조), 경쇄는 HzCL25의 경쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열). 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

HzCL25의 CD73-결합 에피토프는 아미노산 서열 TKVQQIRRAEPNVL(서열번호 76) 내에 있다(즉, 서열번호 70에 기재된 아미노산 서열의 40-53 번 아미노산). 본 개시는 서열 TKVQQIRRAEPNVL(서열번호 76) 내의 CD73에 결합하는 항체를 특징으로 한다. 본 개시는 HzCL25와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 특징으로 한다. 또한 본 개시는 인간 CD73과 HzCL25의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체를 특징으로 한다.

일부 구현예에서, HzCL25의 VH는 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 중쇄 불변 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, HzCL25의 VH는 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, CH3 도메인에는 C-말단 라이신(K) 아미노산 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, CH3 도메인에는 C-말단 라이신(K) 아미노산 잔기가 포함되어 있다. 특정 구현예에서, HzCL25의 VH는 인간 IgG1의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 인간 IgG1의 CH3 도메인에는 C-말단 라이신(K) 아미노산 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 인간 IgG1의 CH3 도메인에는 C-말단 라이신(K) 아미노산 잔기가 포함되어 있다. 특정 구현예에서, 이러한 항체는 항체의 안정성을 증가시키는 중쇄 불변 영역에 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 항체의 특성(예를 들어, Fc 수용체 결합 감소, 항체 글리코실화 증가 또는 감소, C1q에 대한 결합 감소)을 변형시키는 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 효과기 기능을 줄이기 위해 중쇄 불변 영역의 아스파라긴 297 번 위치(EU 넘버링에 따르면, N297)에서 알라닌을 포함한다.

특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 IgG 항체이다. 하나의 구현예에서, 항체는 IgG1 항체이다. 하나의 구현예에서, 항체는 IgG4 항체이다. 또 다른 구현예에서, 항체는 IgG2 항체이다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 야생형 중쇄 불변 영역에 대해 하나 이상의 라이신(K) 아미노산 잔기가 결여된 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 예를 들어, 항체는 중쇄 불변 영역의 CH3 도메인의 C-말단 라이신(K) 아미노산 잔기가 결여된 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 73에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 75에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 74에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 73에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 불변 영역 및 서열번호 74에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 75에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 불변 영역 및 서열번호 74에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 불변 영역을 포함한다.

항체 3-F03

항체 3-F03은 효과기 기능을 줄이기 위해 중쇄 불변 영역의 아스파라긴 297 번 위치(EU 넘버링에 따르면, N297)에서 알라닌을 가지는 인간 IgG1/카파 단클론항체이다. 3-F03은 고친화성으로 인간, 시노몰구스 및 뮤린 CD73에 유의미하게 결합하고(K_D≤2 nM) 낮은 효과기 기능을 가진다.

3-F03은 단일 공여자 라이브러리의 다중 선택 라운드에 의해 얻은 서열로부터 유전자 조작되었다. 그후 해당 풀의 scFv 카세트는 뮤린 CD73(서열번호 71)을 가지고 FACs 선별을 진행한 효모 발현 벡터 라이브러리로 재조합되었다. 효모 3-F03 scFv 카세트의 아미노산 서열은 각각 서열번호 77 및 65에 기재된다.

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATEIAAKGDYWGQGTLVTVSS(서열번호 77); 및

AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPHFGQGTRLEIK(서열번호 65).

3-F03 항체를 구성하기 위해, 효모 3-F03 VH 및 VL은 하기와 같이 변형되고 인간 IgG1/카파 스캐폴드로 복제되었다. VH의 경우, 효모 3-F03 VH(서열 번호 77)의 N-말단 글루타메이트(E)가 제거되었고, 서열번호 77의 카바트 위치 H77(즉, 서열번호 77의 78 번 위치)에서 트레오닌(T)은 알라닌(A)으로 치환되었다. VL의 경우, 서열번호 65의 N-말단 알라닌(A)이 제거되었다. 생성된 전장 인간 3-F03 항체는 각각 서열번호 60 및 61의 아미노산 서열에 기재된 VH 및 VL을 포함한다. 생성된 전장 인간 3-F03 항체는 본원에서 "3-F03"으로 지칭된다. 하기 표 3은 IMGT, 코티아, AbM, 카바트 및 콘택트 넘버링에 따른 3-F03 CDR의 아미노산 서열을 나타낸다. 하기 표 3은 또한 3-F03 성숙 VH, VL, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.

3-F03 CDR, VH 및 VL의 아미노산 서열

	IMGT	코티아	AbM	카바트	콘택트
VH CDR1	GFTFSSYD(서열번호 34)	GFTFSSY(서열번호 41)	GFTFSSYDMH(서열번호 46)	SYDMH(서열번호 49)	SSYDMH(서열번호 53)
VH CDR2	MSYDGSNK(서열번호 35)	SYDGSN(서열번호 42)	VMSYDGSNKY(서열번호 47)	VMSYDGSNKYYADSVKG(서열번호 50)	WVAVMSYDGSNKY(서열번호 54)
VH CDR3	ATEIAAKGDY(서열번호 36)	EIAAKGDY(서열번호 52)	EIAAKGDY(서열번호 52)	EIAAKGDY(서열번호 52)	ATEIAAKGD(서열번호 56)
VL CDR1	QGISNY(서열번호 37)	RASQGISNYLA(서열번호 44)	RASQGISNYLA(서열번호 44)	RASQGISNYLA(서열번호 44)	SNYLAWY(서열번호 57)
VL CDR2	AAS(서열번호 38)	AASTLQS(서열번호 45)	AASTLQS(서열번호 45)	AASTLQS(서열번호 45)	LLIYAASTLQ(서열번호 58)
VL CDR3	QQSYSTPH(서열번호 39)	QQSYSTPH(서열번호 39)	QQSYSTPH(서열번호 39)	QQSYSTPH(서열번호 39)	QQSYSTP(서열번호 59)
VH	VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNALYLQMNSLRAEDTAVYYCATEIAAKGDYWGQGTLVTVSS(서열번호 60)
VL	IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPHFGQGTRLEIK(서열번호 61)
HC	VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNALYLQMNSLRAEDTAVYYCATEIAAKGDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 66)
LC	IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPHFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 31)

또한 3-F03의 변이체가 본원에서 기술된다. 3-F03_411 중쇄가 (i) 3-F03에 결여된 N-말단 글루타메이트(E)를 포함하고, (ii) 3-F03에 존재하는 C-말단 라이신을 포함하지 않는다는 점을 제외하고, 3-F03_411는 3-F03과 동일하다. 하기 표 4는, 3-F03_411 성숙 VH, VL, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다. 3-F03_413은 아스파르트산(D) 대신 VH 카바트 위치 H53(서열번호 60의 54 번 위치)에서 글루타메이트(E)를 포함한다는 점을 제외하고, 3-F03_411과 동일하다. 하기 표 5는 IMGT, 코티아, AbM, 카바트 및 콘택트 넘버링에 따른 3-F03_413 CDR의 아미노산 서열을 나타낸다. 또한 하기 표 5는 3-F03_413 성숙 VH, VL, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다. 추가적인 변이는 하기 실시예에서 기술된다(도 21a-도 21j참조).

3-F03_411 HC 및 LC의 아미노산 서열

	서열
VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNALYLQMNSLRAEDTAVYYCATEIAAKGDYWGQGTLVTVSS(서열번호 62)
VL	IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPHFGQGTRLEIK(서열번호 61)
중쇄	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNALYLQMNSLRAEDTAVYYCATEIAAKGDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 30)
경쇄	IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPHFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 31)

3-F03_413 CDR, VH, VL, HC, LC의 아미노산 서열

	IMGT	코티아	AbM	카바트	콘택트
VH CDR1	GFTFSSYD(서열번호 34)	GFTFSSY(서열번호 41)	GFTFSSYDMH(서열번호 46)	SYDMH(서열번호 49)	SSYDMH(서열번호 53)
VH CDR2	MSYEGSNK(서열번호 40)	SYEGSN(서열번호 43)	VMSYEGSNKY(서열번호 48)	VMSYEGSNKYYADSVKG(서열번호 51)	WVAVMSYEGSNKY(서열번호 55)
VH CDR3	ATEIAAKGDY(서열번호 36)	EIAAKGDY(서열번호 52)	EIAAKGDY(서열번호 52)	EIAAKGDY(서열번호 52)	ATEIAAKGD(서열번호 56)
VL CDR1	QGISNY(서열번호 37)	RASQGISNYLA(서열번호 44)	RASQGISNYLA(서열번호 44)	RASQGISNYLA(서열번호 44)	SNYLAWY(서열번호 57)
VL CDR2	AAS(서열번호 38)	AASTLQS(서열번호 45)	AASTLQS(서열번호 45)	AASTLQS(서열번호 45)	LLIYAASTLQ(서열번호 58)
VL CDR3	QQSYSTPH(서열번호 39)	QQSYSTPH(서열번호 39)	QQSYSTPH(서열번호 39)	QQSYSTPH(서열번호 39)	QQSYSTP(서열번호 59)
VH	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYEGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNALYLQMNSLRAEDTAVYYCATEIAAKGDYWGQGTLVTVSS(서열번호 63)
VL	IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPHFGQGTRLEIK(서열번호 61)
HC	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYEGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNALYLQMNSLRAEDTAVYYCATEIAAKGDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 33)
LC	IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPHFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 31)

항-CD73 항체는 3-F03 또는 3-F03_413의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3 및 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 3-F03의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다(표 3 참조). 일부 경우에, 항-CD73 항체는 3-F03의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다(표 3 참조). 일부 경우에, 항-CD73 항체는 3-F03의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH(표 3 참조) 및 3-F03의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL(표 3 참조)을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 3-F03_413의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함한다(표 5 참조). 일부 경우에, 항-CD73 항체는 3-F03_413의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다(표 5 참조). 일부 경우에, 항-CD73 항체는 3-F03_413의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH(표 5 참조) 및 3-F03_413의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL(표 5 참조)을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 3-F03 또는 3-F03_413의 6개 CDR 중 하나 이상(즉, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개) 내에서, 예를 들어, 1, 2 또는 3개의 치환을 가질 수 있다. 일부 경우에, 항체는 (i) 세포 CD73을 억제한다(예를 들어, 실시예 15에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 세포 CD73 활성에서 예를 들어 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 감소); 그리고/또는 (ii) 가용성 CD73을 억제한다(예를 들어, 실시예 16에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 가용성 CD73 활성에서 예를 들어 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 감소); 그리고/또는 (iii) 고친화성으로 개방형 입체형태의 인간, 시노몰구스 원숭이 또는 뮤린 CD73에 결합한다(예를 들어, K_D≤2 nM), (예를 들어, 실시예 18에 기술된 결합 검정에 의해 결정된다); 그리고/또는 (iv) 폐쇄형 입체형태의 인간, 시노몰구스 원숭이 또는 뮤린 CD73에는 결합하지 않는다; 그리고/또는 (v) 서열번호 70의 386-399 번 아미노산[즉, AAVLPFGGTFDLVQ (서열번호 78) 내] 서열번호 70의 470-489 번 아미노산[즉, ILPNFLANGGDGFQMIKDEL (서열번호 79) 내] 내의 에피토프에 결합한다(예를 들어, 실시예 6에 기술된 결합 검정에 의해 결정된다); 그리고/또는 (vi) T 세포 증식의 AMP 매개 억제를 감소시킨다(예를 들어, 실시예 17에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 T 세포 증식에서 예를 들어 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 감소); 그리고/또는 (vii) 세포 표면 CD73의 수준을 감소시킨다(예를 들어, 실시예 20에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 암세포, 예를 들어 흑색종 암 세포에서 예를 들어 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 만큼 감소); 그리고/또는 (viii) 종양 성장을 감소시킨다(예를 들어 실시예 21에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 예를 들어 흑색종 종양을 예를 들어, 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 만큼 감소).

항-CD73 항체는 IMGT 정의, 또는 대체 CDR 정의(예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 카바트 정의, 코티아 정의, AbM CDR 정의, 또는 콘택트 정의)에 따른 3-F03 또는 3-F03_413의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함할 수 있다. 항-CD73 항체는 3-F03 또는 3-F03_413의 VH CDR1 및/또는 VH CDR2 및/또는 VH CDR3에서 0, 1, 2 또는 3개의 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 IMGT 정의, 또는 대체 CDR 정의(예를 들어, 이에 국한되지 않지만, 카바트 정의, 코티아 정의, AbM CDR 정의, 또는 콘택트 정의)에 따른 3-F03 또는 3-F03_413의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 더 포함한다. 이러한 항-CD73 항체는 3-F03 또는 3-F03_413의 VL CDR1 및/또는 VL CDR2 및/또는 VL CDR3에서 0, 1, 2 또는 3개의 치환을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 34, 35, 및 36에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 각각 서열번호 37, 38, 및 39에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 41, 42, 및 52에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 각각 서열번호 44, 45, 및 39에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 46, 47, 및 52에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 각각 서열번호44, 45, 및 39에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 49, 50, 및 52에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 각각 서열번호 44, 45, 및 39에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 53, 54, 및 56에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 각각 서열번호 57, 58, 및 59에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 34, 40, 및 36에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 각각 서열번호 37, 38, 및 39에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 41, 43, 및 52에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 각각 서열번호 44, 45, 및 39에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 46, 48, 및 52에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 각각 서열번호 44, 45, 및 39에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 49, 51, 및 52에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 각각 서열번호 44, 45, 및 39에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항-CD73 항체는 각각 서열번호 53, 55, 및 56에 기재된 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH, 및 각각 서열번호 57, 58, 및 59에 기재된 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 경우에, 항체는 (i) 세포 CD73을 억제한다(예를 들어, 실시예 15에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 세포 CD73 활성에서 예를 들어 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 감소); 그리고/또는 (ii) 가용성 CD73을 억제한다(예를 들어, 실시예 16에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 가용성 CD73 활성에서 예를 들어 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 감소); 그리고/또는 (iii) 고친화성으로 개방형 입체형태의 인간, 시노몰구스 원숭이 또는 뮤린 CD73에 결합한다[예를 들어, K_D≤2 nM], (예를 들어, 실시예 18에 기술된 결합 검정에 의해 결정된다); 그리고/또는 (iv) 폐쇄형 입체형태의 인간, 시노몰구스 원숭이 또는 뮤린 CD73에는 결합하지 않는다; 그리고/또는 (v) 서열번호 70의 386-399 번 아미노산[즉, AAVLPFGGTFDLVQ (서열번호 78) 내] 서열번호 70의 470-489 번 아미노산[즉, ILPNFLANGGDGFQMIKDEL (서열번호 79) 내] 내의 에피토프에 결합한다(예를 들어, 실시예 6에 기술된 결합 검정에 의해 결정된다); 그리고/또는 (vi) T 세포 증식의 AMP 매개 억제를 감소시킨다(예를 들어, 실시예 17에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 T 세포 증식에서 예를 들어 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 감소); 그리고/또는 (vii) 세포 표면 CD73의 수준을 줄인다(예를 들어, 실시예 20에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 암세포, 예를 들어 흑색종 암 세포에서 예를 들어 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 만큼 감소); 그리고/또는 (viii) 종양 성장을 감소시킨다(예를 들어 실시예 21에서 기술된 검정에 의해 결정된 이소형 대조군과 비교하여 예를 들어 흑색종을 예를 들어, 적어도 10%; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 100% 만큼 감소).

특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 32, 60, 62, 63, 67-69, 77, 및 85-88 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03 또는 이의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하며(예를 들어, IMGT 정의, 예를 들어 각각 서열번호 34-36, 또는 각각 서열번호 34, 40 및 36에 기재된 아미노산 서열에 따른 표 3 및 표 5 참조), VH는 서열번호 32, 60, 62, 63, 67-69, 77, 및 85-88 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 30, 33, 및 66에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03 또는 이의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄를 포함하며(표 3 및 표 5, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 34-36, 또는 서열번호 34, 40, 및 36에 기재된 아미노산 서열 참조), 중쇄는 서열번호 30, 33, 및 66에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 61, 64, 및 65 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03 또는 이의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하며(표 3 및 표 5, IMGT 정의에 따라, 예를 들어 각각 서열번호 37-39에 제시된 아미노산 서열 참조), VL은 서열번호 61, 64, 및 65 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03 또는 이의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하며(표 3 및 표 5, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 예를 들어 각각 서열번호 37-39에 제시된 아미노산 서열 참조), 경쇄는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) 서열번호 32, 60, 62, 63, 67-69, 77, 및 85-88 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열; 및 (ii) 서열번호 61, 64, 및 65 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) 3-F03 또는 이의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하며(표 3 및 표 5, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 예를 들어 각각 서열번호 34-36 또는 각각 서열번호 34, 40, 및 36에 제시된 아미노산 서열 참조), VH는 서열번호 32, 60, 62, 63, 67-69, 77, 및 85-88 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 3-F03 또는 이의 변이체(예들 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하며(표 3 및 표 5, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 예를 들어 각각 서열번호 37-39에 제시된 아미노산 서열 참조), VL은 서열번호 61, 64 및 65 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) 서열번호 30, 33, 및 66에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열; 및 (ii) 서열번호 31에 기재된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) 3-F03 또는 이의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄를 포함하며(표 3 및 표 5, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 34-36 또는 각각 서열번호 34, 40, 및 36에 기재된 아미노산 서열 참조), 중쇄는 서열번호 30, 33, 및 66에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가, 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함하고; (ii) 경쇄는3-F03 또는 이의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하며(표 3 및 표 5,예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열 참조), 경쇄는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함한다.

특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 32, 60, 62, 63, 67-69, 77, 및 85-88 중 어느 하나에 기재된 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03 또는 그의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하며(표 3 및 표 5, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 34-36 또는 각각 서열번호 34, 40, 및 36에 기재된 아미노산 서열 참조), VH는 서열번호 32, 60, 62, 63, 67-69, 77, 및 85-88 중 어느 하나에 기재된 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 61, 64, 및 65 중 어느 하나에 기재된 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03 또는 그의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하며(표 3 및 표 5, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열 참조), VL은 서열번호 61, 64, 및 65 중 어느 하나에 기재된 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 32, 60, 62, 63, 67-69, 77, 및 85-88 중 어느 하나에 기재된 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열과 서열번호 61, 64, 및 65에 기재된 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) 3-F03 또는 그의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하며(표 3 및 표 5, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 34-36 또는 각각 서열번호 34, 40, 및 36에 기재된 아미노산 서열 참조), VH는 서열번호 32, 60, 62, 63, 67-69, 77, 및 85-88 중 어느 하나에 기재된 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 3-F03 또는 그의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하며(표 3 및 표 5, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열 참조), VL은 서열번호 61, 64, 및 65 중 어느 하나에 기재된 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03_411 또는 3-F03_413의 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 각각 서열번호 62 또는 63에 기재된 아미노산 서열). 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03_411의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하며(표 3, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 34-36에 기재된 아미노산 서열 참조), VH는 3-F03_411의 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열). 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03_413의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하며(표 5, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 34, 40, 및 36에 기재된 아미노산 서열 참조), VH는 3-F03_411의 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열). 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03_411 또는 3-F03_F13의 중쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 각각 서열번호 30 또는 33에 기재된 아미노산 서열). 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03_411의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하며(표 3, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 34-36에 기재된 아미노산 서열 참조), 중쇄는 3-F03_411의 중쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열). 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03_413의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하며(표 5,예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 34, 40, 및 36에 기재된 아미노산 서열 참조), 중쇄는 3-F03_413의 중쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열). 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03_411 또는 3-F03_413의 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열). 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03_411 또는 3-F03_413의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하며(예를 들어, IMGT 정의, 즉, 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열에 따른 표 3 참조), VL은 3-F03_411 또는 3-F03_413의 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열). 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03_411 또는 3-F03_413의 경쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열). 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03_411 또는 3-F03_413의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함하며(표 5, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열 참조), 경쇄는 3-F03_411 또는 3-F03_413의 경쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열). 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03_411 또는 3-F03_413의 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열과(즉, 각각 서열번호 62 또는 63에 기재된 아미노산 서열), 3-F03_411 또는 3-F03_413의 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열). 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) 3-F03_411의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하며(표 3, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 34-36에 기재된 아미노산 서열 참조), VH는 3-F03의 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고(즉, 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열), (ii) 3-F03_411의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하며(표 3, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열 참조), VL은 3-F03의 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열). 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) 3-F03_413의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하며(표 5, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 34, 40, 및 36에 기재된 아미노산 서열 참조), VH는 3-F03_413의 VH와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고(즉, 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열), (ii) 3-F03_413의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하며(예를 들어, IMGT 정의, 즉, 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열에 따른 표 5 참조), VL은 3-F03_413의 VL과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열). 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 (ii) 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 3-F03_411 또는 3-F03_413의 중쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열과(즉, 서열번호 30 또는 33에 기재된 아미노산 서열), 3-F03_411 또는 3-F03_413의 경쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열). 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) 3-F03_411의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하며(표 3, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 34-36에 기재된 아미노산 서열 참조), 중쇄는 3-F03_411의 중쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고(즉, 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열), (ii) 3-F03_411의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하며(표 3, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열 참조), 경쇄는 3-F03의 경쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열). 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) 3-F03_413의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함하며(표 5, 예를 들어, IMGT 정의에 따라, 즉, 각각 서열번호 34, 40, 및 36에 기재된 아미노산 서열 참조), 중쇄는 3-F03의 중쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하고(즉, 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열), (ii) 3-F03_413의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL를 포함하는 경쇄를 포함하며(표 5, 예를 들어, IMGT 정의, 즉, 각각 서열번호 37-39에 기재된 아미노산 서열 참조), 경쇄는 3-F03_413의 경쇄와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다(즉, 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열). 일부 구현예에서, 항-CD73 항체는 (i) 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD20 항체는 (i) 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

3-F03(및 이의 변이체, 예를 들어, 3-F03_411 및 3-F03_413)의 CD73-결합 에피토프는 AAVLPFGGTFDLVQ (서열번호 78)[즉, 서열번호 70에 기재된 아미노산 서열의 386-399 번 아미노산] 및 ILPNFLANGGDGFQMIKDEL (서열번호 79)[즉, 서열번호 70에 기재된 아미노산 서열의 470-489 번 아미노산]를 포함한다. 본 개시는 AAVLPFGGTFDLVQ (서열번호 78) 및 ILPNFLANGGDGFQMIKDEL (서열번호 79) 내의 에피토프인 CD73에 결합하는 항체를 특징으로 한다. 본 개시는 3-F03(또는 이의 변이체, 예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)과 같은 에피토프에 결합하는 항체를 특징으로 한다. 본 개시는 또한 인간 CD73에 3-F03 (또는 이의 변이체, 예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체를 특징으로 한다.

일부 구현예에서, 3-F03(또는 이의 변이체, 예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)의 VH는 CH1 도메인 및 힌지 영역을 포함하는 중쇄 불변 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 3-F03(또는 이의 변이체, 예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)의 VH는 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, CH3 도메인에는 C-말단 라이신(K) 아미노산 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, CH3 도메인에는 C-말단 라이신(K) 아미노산 잔기가 포함되어 있다. 일부 구현예에서, 3-F03(또는 이의 변이체, 예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)의 VH는 인간 IgG1의 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 인간 IgG1의 CH3 도메인에는 C-말단 라이신(K) 아미노산 잔기가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 인간 IgG1의 CH3 도메인에는 C-말단 라이신(K) 아미노산 잔기가 포함되어 있다. 특정 구현예에서, 이러한 항체는 항체의 안정성을 증가시키는 중쇄 불변 영역에 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 항체의 특성(예를 들어, Fc 수용체 결합 감소, 항체 글리코실화 증가 또는 감소, C1q에 대한 결합 감소)을 변형시키는 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 효과기 기능을 감소시키기 위해 중쇄 불변 영역의 아스파라긴 297 번 위치(EU 넘버링에 따르면, N297)에서 알라닌(A)을 포함한다.

특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 IgG 항체이다. 하나의 구현예에서, 항체는 IgG1 항체이다. 하나의 구현예에서, 항체는 IgG4 항체이다. 또 다른 구현예에서, 항체는 IgG2 항체이다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 야생형 중쇄 불변 영역에 대한 하나 이상의 라이신(K) 아미노산 잔기가 결여된 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 예를 들어, 항체는 중쇄 불변 영역의 CH3 도메인의 C-말단 라이신(K) 아미노산 잔기가 결여된 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 73에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 75에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 74에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 73에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 불변 영역 및 서열번호 74에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 서열번호 75에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 불변 영역 및 서열번호 74에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 불변 영역을 포함한다.

항체 단편

일부 경우에, 항-CD73 항체는 항체 단편이다. 본원에 기술된 항체의 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')₂, Facb, 및 Fv)은 온전한 항체의 단백질 가수분해 소화에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 전체 항체를 파파인, 펩신 또는 플라스민과 같은 효소로 처리하여 얻을 수 있다. 전체 항체의 파파인 소화는 F(ab)₂ 또는 Fab 단편을 생산하고; 전체 항체의 펩신 소화는 F(ab')₂ 또는 Fab'를 생산하고; 전체 항체의 플라스민 소화는 Facb 단편을 생산한다.

또는, 항체 단편은 재조합적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 목적 항체 단편을 암호화하는 핵산을 구성하고, 발현 벡터로 주입하여, 적합한 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[Co, M.S. et al., J. Immunol., 152:2968-2976 (1994); Better, M. and Horwitz, A.H., Methods in Enzymology, 178:476-496 (1989); Plueckthun, A. and Skerra, A., Methods in Enzymology, 178:476-496 (1989); Lamoyi, E., Methods in Enzymology, 121:652-663 (1989); Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology, (1989) 121:663-669 (1989); and Bird, R.E. et al., TIBTECH, 9:132-137 (1991)] 참조. 항체 단편은 E. coli에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있어, 이러한 단편을 다량으로 쉽게 생산할 수 있다. 항체 단편은 항체 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 또는, Fab'-SH 단편은 E. coli로부터 직접 회수되고, 화학적으로 결합되어 F(ab)₂단편을 형성할 수 있다(Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). 다른 접근법에 따르면, F(ab')₂단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 구제 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 증가된 생채내 반감기를 가진 Fab 및 F(ab') ₂단편이 미국 특허 제 5,869,046 호에 기술된다.

미니바디

일부 경우에, 항-CD73 항체는 미니바디이다. 항-CD73 항체의 미니바디에는 이중체, 단일쇄(scFv) 및 단일쇄 (Fv)₂ (sc(Fv)₂)가 포함된다.

"이중체"는 유전자 융합에 의해 구성된 이가(bivalent) 미니바디이다(예를 들어, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993); EP 404,097; WO 93/11161 참조). 이중체는 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 이량체이다. 이중체의 각각의 폴리펩티드 사슬의 VL 및 VH 도메인은 링커에 의해 결합된다. 링커를 구성하는 아미노산 잔기의 수량은 2 내지 12개 잔기(예를 들어, 3-10개 잔기 또는 5개 또는 대략 5개 잔기)일 수 있다. 이중체의 폴리펩티드의 링커는 특징적으로 너무 짧아서 VL과 VH가 서로 결합할 수 없다. 따라서, 동일한 폴리펩티드 사슬에 암호화된 VL 및 VH는 단일쇄 가변 영역 단편을 형성할 수 없고, 대신에 상이한 단일쇄 가변 영역 단편을 이용하여 이량체를 형성할 수 있다. 결과적으로 이중체에는 두 개의 항원 결합 부위가 있다.

scFv는 링커로 VH와 VL을 연결하여 획득된 단일쇄 폴리펩티드 항체이다(예를 들어, Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 85:5879-5883 (1988); and Plickthun, "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol.113, Ed Resenburg and Moore, Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994) 참조). 연결되는 VH 및 VL의 순서는 특별히 제한되지 않으며, 임의의 순서로 배열될 수 있다. 배열의 예는 [VH] 링커 [VL]; 또는 [VL] 링커 [VH]을 포함한다. scFv의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 본원에 기술된 임의의 항-CD73 항체로부터 유도될 수 있다.

sc(Fv)₂는 2개의 VH와 2개의 VL이 링커에 의해 연결되어 단일쇄을 형성하는 미니바디이다(Hudson, et al., J. Immunol. Methods, (1999) 231: 177-189 (1999)). sc(Fv)₂는, 예를 들어 scFv를 링커와 연결함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 sc(Fv)₂는 단일쇄 폴리펩티드의 N 말단에서 시작하여2개의 VH 및 2개의 VL이 VH, VL, VH, VL ([VH] 링커 [VL] 링커 [VH] 링커 [VL])의 순서로 배열된 항체를 포함하는 것이 바람직하다; 그러나 2개의 VH 및 2개의 VL의 순서는 상기 배열에 국한되지 않고 임의의 순서로 배열될 수 있다.

이중특이적 항체

일부 경우에, 항-CD73 항체는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 CD73 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 이중특이적 항체는 CD73 결합 부위를 또 다른 단백질의 결합 부위에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 이의 저분자량 형태(예를 들어, F(ab')₂이중특이적 항체, sc(Fv)₂ 이중특이적 항체, 이중체 이중특이적 항체)로 제조될 수 있다.

전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기반하며, 2개의 쇄는 상이한 특이성을 가진다(Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 상이한 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성을 가진 항체 가변 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 면역글로불린 중쇄 융합과, 만약 원한다면, 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA는 별개의 발현 벡터로 삽입되고, 적합한 숙주 세포로 공동 형질감염된다. 이는 3개의 폴리펩티드 단편의 비율을 조정할 때 더 융통성있게 해준다. 그러나, 동일한 비율인 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄의 발현이 고수율로 되는 경우, 2개의 폴리펩티드 쇄 또는 모두 3개의 폴리펩티드 쇄 모두에 대한 코딩 서열을 단일 발현 벡터로 삽입하는 것이 가능하다.

미국 특허 제 5,731,168호에 기재된 또 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 쌍 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수된 이형이량체 백분율을 최대화하도록 유전자 조작될 수 있다. 바람직한 계면은 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 더 큰 측쇄(예를 들어, 타이로신 또는 트립토판)로 치환된다. 큰 측쇄(들)와 동일하거나 또는 유사한 크기의 보상 "캐비티(cavity)"는 큰 아미노산 측쇄를 작은 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환함으로써 제2 항체의 계면상에서 생성된다. 이는 다른 원치 않는 최종 산물, 예컨대 동종이량체보다 이형이량체 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다.

이중특이적 항체는 가교 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체에서 항체 중 하나는 아비딘에 결합되고, 다른 것은 비오틴에 결합될 수 있다. 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 이종접합체 항체가 생성될 수 있다.

"이중체" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대체 기전을 제공한다. 단편은 동일한 쇄에 있는 2개의 도메인 사이에서 짝짓기가 되기에는 너무 짧은 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보성 VL 및 VH 도메인과 짝지어짐으로써 2개의 항원-결합 부위를 형성한다.

다가 항체

일부 경우에, 항-CD73 항체는 다가 항체이다. 다가 항체는 항체가 결합되는 항원을 발현하는 세포에 의해 이가(bivalent) 항체보다 더 빠르게 내재화(및/또는 이화)될 수 있다. 본원에서 기술된 항체는 항체의 폴리펩티드 쇄를 암호화하는 핵산의 재조합 발현에 의해 용이하게 생산될 수 있는 3개 이상의 항원 결합 부위를 가진 다가 항체[예를 들어, 사가(tetravalent) 항체]일 수 있다. 다가 항체는 하나의 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 예시적인 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다(또는 이들로 구성된다). 다가 항체는 3개 내지 약 8개(예를 들어, 4개)의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다(또는 이들로 구성될 수 있다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄(예를 들어, 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄들)를 임의로 포함하며, 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드쇄(들)는 VD1-(X1)_n-VD2-(X2)_n-Fc를 포함할 수 있으며, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이며, Fc는 Fc 영역의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 펩티드 스페이서를 나타내며, n은 0 또는 1이다.

접합된 항체

일부 경우에, 항-CD73 항체는 접합된 항체이다. 본원에 개시된 항체는 중합체[예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), PEG로 변형된 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)(PEI-PEG), 폴리글루탐산(polyglutamic acid, PGA), (N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드 (HPMA) 공중합체], 히알루론산, 방사성 물질(예를 들어, ⁹⁰Y, ¹³¹I), 형광 물질, 발광 물질, 합텐, 효소, 금속 킬레이트, 약물 및 독소[예를 들어, 칼케아미신, 슈도모나스 외독소 A, 리신(예를 들어, 탈당화된 리신 A 쇄)]와 같은 거대분자 물질을 포함하는 다양한 분자에 결합되는 접합된 항체일 수 있다.

하나의 구현예에서, 항-CD73 항체의 세포독성 작용 및 이에 따른 치료 효과를 개선하기 위해, 항체는 방사성 동위원소 및 세포독성제를 포함한 고독성 물질과 접합된다. 이들 접합체는 표적 부위(즉, 항체에 의해 인식되는 항원을 발현하는 세포)에 독성 부하를 선택적으로 전달할 수 있는 반면, 항체에 의해 인식되지 않는 세포에는 독성 부하가 전달되지 않는다. 독성을 최소화하기 위해, 접합체는 일반적으로 혈청 반감기가 짧은 분자를 기반으로 유전자 조작된다(따라서, 뮤린 서열, 및 IgG3 또는 IgG4 이소형 사용).

특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 순환계(예를 들어, 혈액, 혈청, 또는 다른 조직)에서 이의 안정화 및/또는 잔류를, 예를 들어, 적어도 1.5, 2, 5, 10, 또는 50배 개선시키는 모이어티로 변형시킨다. 예를 들어, 항-CD73 항체는 중합체, 예를 들어, 폴리알킬렌 옥사이드(polyalkylene oxide) 또는 폴리에틸렌 옥사이드(polyethylene oxide)와 같은 실질적인 비-항원적 중합체와 결합(예를 들어, 접합)될 수 있다. 적합한 중합체는 중량에 의해 유의미하게 달라질 것이다. 약 200 내지 약 35,000 달톤(또는 약 1,000 내지 약 15,000, 및 2,000 내지 약 12,500) 범위의 수 평균 분자량을 가진 중합체가 사용될 수 있다. 예를 들어,항-CD73 항체는 수용성 중합체, 예를 들어, 친수성 폴리비닐 중합체, 예를 들어, 폴리비닐알콜 또는 폴리비닐피롤리돈에 접합될 수 있다. 이러한 중합체의 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화 폴리올, 이의 공중합체 및 이의 블록 공중합체와 같은 폴리알킬렌 옥사이드 단독중합체를 포함하되, 단, 블록 공중합체의 수용성은 유지된다. 추가적으로 유용한 중합체는 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 및 폴리옥시에틸렌과 폴리옥시프로필렌의 블록 공중합체와 같은 폴리옥시알킬렌; 폴리메타크릴레이트; 카보머; 및 분지형 또는 비분지형 다당류를 포함한다.

전술한 접합 항체는 각각 항체, 또는 본원에 기술된 이의 저분자량 형태에서 화학적 변형을 수행함으로써 제조될 수 있다. 항체를 변형시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, US 제 5,057,313호 및 US 제 5,156,840호).

항체 생산 방법

항체는 박테리아 또는 진핵 세포에서 생산될 수 있다. 일부 항체, 예를 들어 Fab는 박테리아 세포, 예를 들어 E. coli 세포에서 생산될 수 있다. 항체는 또한 유전자 이식된 세포주(예를 들어, CHO, 293E, COS)와 같은 진핵 세포에서 생산될 수 있다. 추가로, 항체(예를 들어, scFv)는 피치아(Pichia) [예를 들어, Powers et al., J Immunol Methods. 251:123-35 (2001) 참조], 한세울라(Hanseula), 또는 사카로미세스(Saccharomyces)와 같은 효모 세포에서 발현될 수 있다. 목적 항체를 생산하기 위해, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 구성하고 발현 벡터에 도입한 후 적합한 숙주 세포에서 발현시킨다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질 감염시키고, 형질 전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 항체를 회수한다.

항체가 박테리아 세포(예를 들어, E. coli)에서 발현되는 경우, 발현 벡터는 박테리아 세포에서 벡터가 증폭되게 하는 특성을 가져야 한다. 또한, JM109, DH5α , HB101, 또는 XL1-Blue 와 같은 E. coli가 숙주로 사용하는 경우, 벡터에는, 예를 들어, E. coli에서 효율적인 발현이 되게 할 수 있는 lacZ 프로모터[Ward et al., 341:544-546 (1989)], araB 프로모터[Better et al., Science, 240:1041-1043 (1988)], 또는 T7 프로모터와 같은 프로모터가 있어야 한다. 이러한 벡터의 예시는, 예를 들어, M13 시리즈 벡터, pUC 시리즈 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script, pGEX-5X-1(파머시아), "QIAexpress system"(QIAGEN), pEGFP 및 pET를 포함한다(이 발현 벡터가 사용되는 경우, 숙주는 바람직하게는 T7 RNA 중합효소를 발현하는 BL21이다). 발현 벡터는 항체 분비를 위한 신호 서열을 포함할 수 있다. E. coli의 주변 세포질로의 생산을 위해, pelB 신호 서열[Lei et al., J. Bacteriol., 169:4379 (1987)]은 항체 분비를 위한 신호 서열로 사용될 수 있다. 박테리아 발현을 위해, 염화칼슘 방법 또는 전기천공 방법을 사용하여 발현 벡터를 박테리아 세포에 도입할 수 있다.

항체가 CHO, COS 및 NIH3T3 세포와 같은 동물 세포에서 발현되는 경우, 발현 벡터는 이러한 세포에서 발현에 필요한 프로모터, 예를 들어 SV40 프로모터[Mulligan et al., Nature, 277:108 (1979)], MMLV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터[Mizushima et al., Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)], 또는 CMV 프로모터를 포함한다. 면역글로불린 또는 이의 도메인을 암호화하는 핵산 서열 이외에, 재조합 발현 벡터는 추가 서열, 예를들어, 숙주 세포(예를 들어, 복제 기점) 및 선택가능한 마커 유전자에서 벡터의 복제를 조절하는 서열을 수반할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입되는 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다(예를 들어, 미국 특허 제 4,399,216호, 제 4,634,665호 및 제 5,179,017호 참조). 예를 들어, 일반적으로 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에서 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 선택가능한 마커가 있는 벡터의 예시는 pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV 및 pOP13을 포함한다.

하나의 구현예에서, 항체는 포유동물 세포에서 생산된다. 항체를 발현하기 위한 예시적인 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO 세포)[예를 들어, 문헌[Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601 621]에 기술된 바와 같이 DHFR 선택가능한 마커와 함께 사용된 문헌[Urlaub 및 Chasin(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기술된 dhfr-CHO 세포를 포함], 인간 배아 신장 293 세포(예를 들어, 293, 293E, 293T), COS 세포, NIH3T3 세포, 림프구성 세포주(예를 들어, NS0 골수종 세포 및 SP2 세포), 및 유전자 이식 동물(예를 들어, 유전자 이식 포유동물)을 포함한다. 예를 들어, 세포는 유선 상피 세포이다.

항체 발현을 위한 예시적인 시스템에서, 항-CD73 항체(예를 들어, CL25, HzCL25, 3-F03, 3-F03_411, 또는 3-F03_413)의 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘 다를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 인산칼슘-매개 형질감염에 의해 dhfr-CHO 세포로 도입된다. 재조합 발현 벡터 내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 각각 인핸서/프로모터 조절 요소(예를 들어, SV40, CMV, CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소 또는 SV40 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소와 같은 아데노바이러스 등에서 유도된 것)에 작동되게 결합하여 높은 수준의 유전자의 전사를 유도한다. 재조합 발현 벡터는 또한 DHFR 유전자를 수반하고, 이는 메토트렉세이트 선택/증폭을 사용하여 벡터로 형질감염된 CHO 세포의 선택을 가능하게 한다. 선택된 유전자 이식체 숙주 세포는 항체 중쇄 및 경쇄의 발현을 가능하게 하기 위해 배양되고, 항체는 배양 배지로부터 회수된다.

항체는 또한 유전자 이식 동물에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,849,992호는 유전자 이식 포유동물의 유선에서 항체를 발현시키는 방법을 기술하고 있다. 우유 특이적 프로모터 및 목적 항체를 암호화하는 핵산 및 분비를 위한 신호 서열을 포함하는 이식유전자가 구성된다. 이러한 유전자 이식 포유동물의 암컷에 의해 생산된 우유는 내부에 분비된 목적 항체를 포함한다. 항체는 우유로부터 정제될 수 있거나, 일부 적용의 경우, 직접 사용될 수 있다. 본원에 기술된 핵산 중 하나 이상을 포함하는 동물이 또한 제공된다.

본 개시의 항체는 숙주 세포의 내부 또는 외부(예를 들어, 배지)로부터 단리되고 실질적으로 순수하고 균질한 항체로서 정제될 수 있다. 항체 정제에 일반적으로 사용되는 단리 및 정제 방법이 항체의 단리 및 정제를 위해 사용될 수 있으며, 어떠한 특정 방법에 국한되지 않는다. 항체는, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 여과, 한외여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역침전, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 전기영동, 투석, 및 재결정을 적절히 선택하고 조합함으로써 단리하고 정제할 수 있다. 크로마토그래피에는, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피 및 흡착 크로마토그래피가 포함된다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 크로마토그래피는 HPLC 및 FPLC와 같은 액상 크로마토그래피를 사용하여 수행될 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용되는 컬럼에는 단백질 A 컬럼과 단백질 G 컬럼이 포함된다. 단백질 A 컬럼을 사용하는 컬럼의 예시는 Hyper D, POROS 및 Sepharose FF(GE Healthcare Biosciences)를 포함한다. 본 개시는 또한 이러한 정제 방법을 사용하여 고도로 정제된 항체를 포함한다.

폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 및 세포

본 개시는 또한 본원에 기술된 항-CD73 항체 또는 이의 일부(예를 들어, VH, VL, HC, 또는 LC)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 벡터를 제공한다. 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 상보성 DNA(cDNA)이다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.

일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 임의의 항체의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 암호화한다(예를 들어, 표 1, 2, 3 및 5 참조). 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 임의의 항체의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 암호화한다(예를 들어, 표 1, 2, 3 및 5 참조). 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 임의의 항체의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 암호화한다(예를 들어, 표 1, 2, 3 및 5 참조). 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 임의의 항체의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 암호화한다(예를 들어, 표 1, 2, 3 및 5 참조). 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산 서열[제1 폴리펩티드는 본원에 기술된 임의의 항체의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함(예를 들어, 표 1, 2, 3 및 5 참조)]; 및 (ii) 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산 서열[제2 폴리펩티드는 본원에 기술된 임의의 항체의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함(예를 들어, 표 1, 2, 3, 및 5 참조)]을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산 서열[제1 폴리펩티드는 본원에 기술된 임의의 항체의 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH를 포함하는 중쇄를 포함(예를 들어, 표 1, 2, 3 및 5 참조)]; 및 (ii) 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산 서열[제2 폴리펩티드는 본원에 기재된 임의의 항체의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함(예를 들어, 표 1, 2, 3, 및 5 참조)]을 포함한다. 일부 경우에, 제1 핵산은 제1 프로모터에 작동가능하게 연결되고 제2 핵산은 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 CL25의 VH 또는 이의 변이체(예를 들어, 이의 인간화 버전, 예를 들어, HzCL25)를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 22, 26, 및 82-84 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 22, 26, 및 82-84 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 22, 26, 및 82-84 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 CL25의 VL 또는 이의 변이체(예를 들어, 이의 인간화 버전, 예를 들어, HzCL25)를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23, 27, 80, 및 81 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호23, 27, 80, 및 81 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23, 27, 80, 및 81 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산[제1 폴리펩티드는 CL25의 VH 또는 이의 변이체(예를 들어, 이의 인간화 버전, 예를 들어, HzCL25)를 포함]; 및 (ii) 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산[제2 폴리펩티드는 CL25의 VL 또는 이의 변이체(예를 들어, 이의 인간화 버전, 예를 들어 HzCL25)를 포함]을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산 서열[제1 폴리펩티드는 서열번호 22, 26, 및 82-84 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함]; 및 (ii) 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산 서열[제2 폴리펩티드는 서열번호 23, 27, 80 및 81 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함]을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산 서열[제1 폴리펩티드는 서열번호 22, 26, 및 82-84 중 하나 이상에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함]; 및 (ii) 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산 서열[제2 폴리펩티드는 서열번호 23, 27, 80 및 81 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함]을 포함한다. 일부 경우에, 제1 핵산은 서열번호 22, 26, 및 82-84 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 암호화하고, 제2 핵산은 서열번호 23, 27, 80, 및 81 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 경우에, 제1 핵산은 서열 22에 기재된 아미노산 서열을 암호화하고 제2 핵산은 서열 23에 기재된 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 경우에, 제1 핵산은 제1 프로모터에 작동가능하게 연결되고 제2 핵산은 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 CL25의 중쇄 또는 이의 변이체(예를 들어, 이의 인간화 버전, 예를 들어, HzCL25)를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 89에 기재된 서열을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 CL25의 경쇄 또는 이의 변이체(예를 들어, 이의 인간화 버전, 예를 들어, HzCL25)를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 90에 기재된 서열을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 CL25의 중쇄 또는 이의 변이체(예를 들어, 이의 인간화 버전, 예를 들어, HzCL25) 및 CL25의 경쇄 또는 이의 변이체(예를 들어, 이의 인간화 버전, 예를 들어, HzCL25)를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산[제1 폴리펩티드는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함]; 및 (ii) 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산[제2 폴리펩티드는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함]을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산[제1 폴리펩티드는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함]; 및 (ii) 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산 서열[제2 폴리펩티드는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함]을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산[제1 폴리펩티드는 서열번호 24에 제시된 아미노산 서열을 포함]; 및 (ii) 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산[제2 폴리펩티드는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함]을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 서열번호 89에 기재된 서열을 포함하는 제1 핵산; 및 (ii) 서열번호 90에 기재된 서열을 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 제1 핵산은 제1 프로모터에 작동가능하게 연결되고 제2 핵산은 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 3-F03의 VH 또는 이의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 32, 60, 62, 63, 67-69, 77, 및 85-88 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 32, 60, 62, 63, 67-69, 77, 및 85-88 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 32, 60, 62, 63, 67-69, 77, 및 85-88 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 3-F03의 VL 또는 이의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 61, 64, 및 65 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 61, 64, 및 65 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 61, 64, 및 65 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산[제1 폴리펩티드는 3-F03의 VH 또는 이의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)를 포함]; 및 (ii) 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산[제2 폴리펩티드는 3-F03의 VL 또는 이의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)를 포함]을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산 서열[제1 폴리펩티드는 서열번호 32, 60, 62, 63, 67-69, 77, 및 85-88 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함]; 및 (ii) 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산 서열[제2 폴리펩티드는 서열번호 61, 64, 및 65 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함]을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산 서열[제1 폴리펩티드는 서열번호 32, 60, 62, 63, 67-69, 77, 및 85-88 중 하나 이상에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함]; 및 (ii) 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산 서열[제2 폴리펩티드는 서열번호 61, 64, 및 65 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함]을 포함한다. 일부 경우에, 제1 핵산은 서열번호 32, 60, 62, 63, 67-69, 77, 및 85-88 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 암호화하고, 제2 핵산은 서열번호 61, 64, 및 65 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 경우에, 제1 핵산은 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열을 암호화하고 제2 핵산은 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 경우에, 제1 핵산은 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열을 암호화하고 제2 핵산은 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 경우에, 제1 핵산은 제1 프로모터에 작동가능하게 연결되고 제2 핵산은 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 3-F03의 중쇄 또는 이의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 30, 33, 및 66 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 30, 33, 및 66 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 30, 33, 및 66 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 91에 기재된 서열을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 93에 기재된 서열을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 3-F03의 경쇄 또는 이의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413)를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 서열번호 92에 기재된 서열을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 3-F03의 중쇄 또는 이의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_413) 및 3-F03의 경쇄 또는 이의 변이체(예를 들어, 3-F03_411 또는 3-F03_411)를 암호화한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산[제1 폴리펩티드는 서열번호 30, 33, 및 66에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함]; 및 (ii) 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산[제2 폴리펩티드는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 100% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함]을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산[제1 폴리펩티드는 서열번호 30, 33, 및 66에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함]; 및 (ii) 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산[제2 폴리펩티드는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열에 대한 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 가진 아미노산 서열을 포함]을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산[제1 폴리펩티드는 서열번호 30, 33, 및 66에 기재된 아미노산 서열을 포함]; 및 (ii) 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산[제2 폴리펩티드는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함]을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산[제1 폴리펩티드는 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함]; 및 (ii) 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산[제2 폴리펩티드는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함]을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산[제1 폴리펩티드는 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 포함]; 및 (ii) 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산[제2 폴리펩티드는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함]을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 서열번호 91에 기재된 서열을 포함하는 제1 핵산; 및 (ii) 서열번호 92에 기재된 서열을 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 (i) 서열번호 93에 기재된 서열을 포함하는 제1 핵산; 및 (ii) 서열번호 92에 기재된 서열을 포함하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 제1 핵산은 제1 프로모터에 작동가능하게 연결되고 제2 핵산은 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드는 단리된다.

또한 본원에 기술된 항-CD73 항체 또는 이의 부분(예를 들어, VH, VL, HC, 및/또는 LC)을 암호화하는 발현 벡터가 제공된다. 또한 본원에 기술된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 다양한 유형의 발현 벡터가 당업계에 알려져 있고 본원에 기술되어 있다(예를 들어, 상기 "항체를 생산하는 방법" 섹션 참조).

또한 본원에 기술된 항-CD73 항체를 포함하는 세포가 본원에서 제공된다. 또한 본원에 기술된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포가 본원에서 제공된다. 또한 본원에 기술된 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 세포가 본원에서 제공된다. 다양한 유형의 발현 벡터가 당업계에 알려져 있고 본원에 기술되어 있다(예를 들어, 상기 "항체를 생산하는 방법" 섹션 참조).

변경된 글리코실화를 가진 항-CD73 항체

상이한 당형태는 약동학, 약력학, 수용체-상호작용 및 조직-특이적 표적화를 포함하는 치료제의 특성에 중대한 영향을 미칠 수 있다(Graddis et al., 2002, Curr Pharm Biotechnol. 3: 285-297). 특히, 항체의 경우, 올리고당 구조는 항체의 효과기 기능 이외에 프로테아제 내성, FcRn 수용체에 의해 매개된 항체의 혈청 반감기, 식균 작용 및 항체 피드백과 관련된 특성에 영향을 끼칠 수 있다(예를 들어, CDC를 유도하는 보체 복합체 C1에 결합하고, ADCC 경로 조절을 담당하는 FcγR 수용체에 대한 결합)(Nose and Wigzell, 1983; Leatherbarrow and Dwek, 1983; Leatherbarrow et al.,1985; Walker et al., 1989; Carter et al., 1992, PNAS, 89: 4285-4289).

따라서, 항체의 효과기 기능을 조절하는 또 다른 수단은 항체 불변 영역의 글리코실화를 변경하는 것을 포함한다. 변경된 글리코실화는, 예를 들어, 글리코실화된 잔기의 수의 감소 또는 증가, 글리코실화된 잔기의 패턴 또는 위치의 변화, 뿐만 아니라 당 구조(들)의 변화를 포함한다. 인간 IgG에서 발견된 올리고당은 효과기 기능의 정도에 영향을 끼친다(Raju, T.S. BioProcess International April 2003. 44-53); 인간 IgG 올리고당의 미세 이질성은 CDC 및 ADCC와 같은 생물학적 기능, 다양한 Fc 수용체에 대한 결합 및 Clq 단백질에 대한 결합에 영향을 끼친다(Wright A. & Morrison SL. TIBTECH 1997, 15 26-32; Shields et al. J Biol Chem. 2001 276(9):6591-604; Shields et al. J Biol Chem. 2002; 277(30):26733-40; Shinkawa et al. J Biol Chem. 2003 278(5):3466-73; Umana et al. Nat Biotechnol. 1999 Feb; 17(2): 176-80). 예를 들어, C1q에 결합하고 보체 연쇄반응(cascade)을 활성화하는 IgG의 능력은(일반적으로 Asn297에 고정되는) 두 개의 CH2 도메인 사이에 위치한 탄수화물 모이어티의 존재, 부재 또는 변형에 따라 달라질 수 있다(Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2 :77-94(1995). 따라서, 일부 경우에, 항-CD73 항체는 야생형 불변 영역에 대한 Asn297Ala 치환을 포함한다.

Fc-함유 폴리펩티드, 예를 들어 IgG 항체와 같은 항체의 글리코실화 부위는 표준 기술에 의해 확인될 수 있다. 글리코실화 부위의 식별은 실험 또는 서열 분석 또는 모델링 데이터를 기반으로 할 수 있다. 컨센서스 모티프, 즉 다양한 글리코실 전이효소에 의해 인식되는 아미노산 서열이 기술되어 있다. 예를 들어, N-결합 글리코실화 모티프에 대한 컨센서스 모티프는 종종 NXT 또는 NXS이며, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. 잠재적인 글리코실화 모티프를 찾기 위한 여러 알고리즘 또한 기술되어 있다. 따라서, 항체 또는 Fc 함유 단편 내의 잠재적인 글리코실화 부위를 식별하기 위해, 예를 들어 생물학적 서열 분석 센터(Center for Biological Sequence Analysis)에서 제공하는 웹사이트와 같은 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 사용하여 항체의 서열을 검사한다(N-결합 글리코실화 부위 예측을 위한 NetNGlyc 서비스 및 O-결합 글리코실화 부위 예측을 위한 NetOGlyc 서비스 참조).

생체 내 연구는 아글리코실 항체의 효과기 기능의 감소를 확인했다. 예를 들어, 아글리코실(aglycosyl) 항-CD8 항체는 마우스에서 CD8-보유 세포를 고갈시킬 수 없고(Isaacs, 1992 J. Immunol. 148: 3062), 아글리코실 항-CD3 항체는 마우스 또는 인간에서 사이토카인 방출 증후군을 유도하지 않는다(Boyd, 1995 supra; Friend, 1999 Transplantation 68:1632). 항-CD73 항체의 아글리코실화 형태는 또한 감소된 효과기 기능을 가진다.

중요하게도, CH2 도메인에서 글리칸의 제거는 효과기 기능에 상당한 영향을 미치는 것으로 보이지만, 항체의 다른 기능성 및 물성은 변경되지 않은 상태로 남아 있다. 구체적으로, 글리칸의 제거는 혈청 반감기와 항원 결합에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(Nose, 1983 supra; Tao, 1989 supra; Dorai, 1991 supra; Hand, 1992 supra; Hobbs, 1992 Mol. Immunol. 29:949).

본 발명의 항-CD73 항체는 (제2 CD73-특이적 항체와 비교하여) 효과기 기능(들)의 증가 또는 감소를 유도하도록 변형 또는 변경될 수 있다. 항체의 글리코실화 부위를 변경하는 방법은, 예를 들어, US 제6,350,861호 및 US 제5,714,350호, WO 제05/18572호 및 제05/03175호에 기술되어 있으며, 이러한 방법은 글리코실화가 변경되거나 감소되거나 또는 전혀 없는 본 발명의 항-CD73 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다.

적응증

본 개시의 항-CD73 항체는 CD73의 활성을 조절할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 화합물, 염 또는 입체이성질체는 본원에 기술된 항체 또는 조성물 중 임의의 1종 이상과 CD73을 접촉시킴으로써 CD73을 억제하는 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 본원에 기술된 항체의 유효량을 투여함으로써 억제를 필요로 하는 개체/환자에서 CD73의 활성을 억제하는 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 조절은 억제이다. 일부 구현예에서, 접촉은 생체내에서 행해진다. 일부 구현예에서, 접촉은 생체외 또는 시험관내에서 행해진다.

본 개시의 또 다른 양태는, 이러한 치료를 필요로 하는 개체에게 본 개시의 하나 이상의 항체 화합물 또는 이의 약제학적 조성물의 치료 유효량 또는 치료 용량을 투여함으로써, 개체(예를 들어, 환자)의 CD73-연관 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. CD73-연관 질환 또는 장애는, CD73의 발현 또는 활성(과발현 및/또는 비정상 활성 수준을 포함)과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되는 임의의 질환, 장애 또는 병태를 포함할 수 있다.

본 개시의 또 다른 양태는, 이러한 치료를 필요로 하는 개체에게 본 개시의 하나 이상의 항체 화합물 또는 이의 약제학적 조성물의 치료 유효량 또는 치료 용량을 투여함으로써, 개체(예를 들어, 환자)의 질환 또는 장애(예를 들어, 암)를 치료하는 방법에 관한 것이며, 질환 또는 장애는 높은 아데노신을 특징으로 한다. 질환 또는 장애가 높은 아데노신 특징을 갖는지를 측정하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 종양 조직의 유전자 발현 분석은 아데노신 반응성 유전자의 정의된 패널을 사용하여 수행할 수 있다.

본 개시의 화합물은 예를 들어 암, 염증성 질환, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 면역조절 장애, 중추 신경계 질환 및 당뇨병을 포함한 CD73의 활성과 관련된 질환의 치료에 유용하다.

다중 면역억제 기전에서 CD73의 강력한 역할을 기반으로, 억제제를 개발하면 면역 체계를 강화하여 종양 진행을 억제할 수 있다. 항-CD73 항체는 단독으로 또는 다른 요법과 병용하여 방광암, 폐암(예를 들어, 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC), 폐 전이), 흑색종(예를 들어, 전이성 흑색종), 유방암, 자궁경부암, 난소암, 결장직장암, 췌장암, 식도암, 전립선암, 신장암, 피부암, 갑상선암, 간암(예를 들어, 간세포암종), 자궁암, 두경부암(예를 들어, 두경부 편평 상피 세포 암종) 및 신세포 암종을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 전립선암은 전이성 거세 저항성 전립선 암종(metastatic castrate-resistant prostate carcinoma,, mCRPC)이다. 일부 구현예에서, 결장직장암은 결장직장암종(colorectal carcinoma, CRC)이다.

일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암), 흑색종, 췌장암, 유방암, 두경부 편평 상피 세포 암종, 전립선암, 간암, 대장암, 자궁내막암, 방광암, 피부암, 자궁암, 신장암, 위암 또는 육종이다. 일부 구현예에서, 육종은 아스킨 종양(Askin's tumor), 포도상 육종, 연골육종, 유잉 육종, 악성 혈관내피종, 악성 신경초종, 골육종, 포상연부 육종, 혈관육종, 엽상낭육종, 융기성 피부섬유육종, 데스모이드 종양(desmoid tumor), 결합조직성 소원형세포종양, 상피 육종, 골외성 연골육종, 골외성 골육종, 섬유육종, 위장관 기질종양(gastrointestinal stromal tumor: GIST), 혈관주위세포종, 혈관육종, 카포시 육종, 평활근육종, 지방육종, 림프관육종, 림프육종, 악성 말초신경초종양(malignant peripheral nerve sheath tumor: MPNST), 신경섬유육종, 횡문근육종, 활막 육종, 또는 미분화 다형성 육종이다.

일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 두경부암(예를 들어, 두경부 편평 상피 세포 암종), 결장직장암, 폐암[예를 들어, 비소세포 폐암(NSCLC)], 흑색종, 난소암, 방광암, 간암(예를 들어, 간세포 암종), 또는 신세포 암종이다.

일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 중피종 또는 선암종이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 중피종이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 선암종이다.

MDSC[골수-유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cell)]는 골수 계통(골수 줄기세포로부터 기원되는 세포의 계열)으로부터의 면역세포의 이종 그룹이다. MDSC는, 변형된 혈액생성의 결과로서 만성 감염 및 암과 같은 병리적 상태에서 강력하게 확장된다. MDSC는 면역자극 특성이 아닌 강력한 면역억제 활성을 가진 다른 골수성 세포 유형과 구별된다. 기타 골수성 세포와 유사하게, MDSC는 T 세포, 수지상 세포, 대식세포 및 자연살해 세포를 포함한 기타 면역세포 유형과 상호작용하여 이들의 기능을 조절한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 화합물 등은 높은 기저 수준의 대식세포 및/또는 MDSC 침윤을 가진 고형 종양을 포함한, MDSC의 높은 침윤을 가진 암 조직(예를 들어, 종양)에 관련된 방법에서 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 블레오마이신-유도 폐 섬유증 및 아데노신 데아미나제 결핍과 관련된 손상을 포함한 폐 염증을 치료하는데 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 알레르기 반응(예를 들어, CD73-의존성 알레르기 반응) 및 기타 CD73-면역 반응과 같은 염증성 질환을 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 본 개시의 항체에 의해 치료될 수 있는 추가 염증성 질환은 호흡기 장애, 패혈증, 재관류 손상 및 혈전증을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 관상 동맥 질환과 같은 심혈관 질환(심근경색, 협심증, 심부전), 뇌혈관 질환(뇌졸중, 일과성 허혈 발작), 말초동맥질환 및 죽상동맥경화증 및 동맥류의 치료제로서 사용될 수 있다. 죽상동맥경화증은 많은 유형의 심혈관 질환의 근본적인 병인 요소이다. 죽상동맥경화증은 청소년기에 지방 선조가 시작되어 성인기에 플라크로 진행되고 마침내 혈전성 현상을 일으켜 임상적으로 심각한 이환율과 사망률을 초래하는 혈관 폐색을 유발한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 항체는 운동 활성 장애; 선조체흑질 도파민 시스템의 퇴화로 인한 결핍; 및 파킨슨병; 우울증의 동기적 증상 중 일부의 치료제로서 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 화합물은 당뇨병 및 인슐린 저항성과 같은 관련 장애의 치료제로서 사용될 수 있다. 당뇨병은 아데노신 생산과 IL-6 및 CRP 생산, 인슐린 저항성, A2BR 유전자 단일염기다형성(ADORA2B SNP)과 염증성 마커 간의 연관성을 자극하는 A2B 아데노신 수용체(A2BR)의 발현에 영향을 끼친다. 당뇨병에서 증가된 A2BR 신호전달은 염증촉진 매개체를 상승시켜 인슐린 저항성을 부분적으로 증가시킬 수 있다. 선택적 항-CD73 항체는 인슐린 저항성을 치료하는 데 유용할 수 있다.

상호 교환 가능하게 사용되는 용어 "개체" 또는 "환자" 또는 "대상"은 포유동물, 바람직하게는, 마우스, 래트, 다른 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 말, 또는 영장류, 및 가장 바람직하게는 인간(즉, 인간 대상)을 포함한 임의의 동물을 지칭한다.

표현 "치료 유효량"은 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 구하는 조직, 계, 동물, 개체 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유발하는 활성 항체 또는 약제학적 작용제의 양을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 (1) 질환을 억제하는 것, 예를 들어, 질환, 병태, 또는 장애의 병리 또는 동반 증상을 경험하거나 나타내는 개체에서 질환, 병태 또는 장애를 억제하는 것(즉, 병리 및/또는 동반 증상의 추가 발달을 저지하는 것); 및 (2) 질환을 개선시키는 것, 예를 들어, 질환, 병태 또는 장애의 병리 또는 동반 증상을 경험하거나 나타내는 개체에서 질환, 병태, 또는 장애를 개선시키는 것(즉, 병리 및/또는 동반 증상을 역전시키는 것), 예컨대 질환의 중증도를 감소시키는 것 중 하나 이상을 지칭한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 본원에서 지칭되는 질환 중 어느 하나가 발병할 위험을 예방 또는 저감시키고, 예를 들어, 질환, 병태 또는 장애의 성향이 있을 수 있지만 아직 질환의 병리 또는 동반 증상을 경험 또는 나타내지 않는 개체에서 질환, 병태 또는 장애를 발병시킬 위험을 예방 또는 저감시키는데 유용하다.

약제학적 조성물

본원에 기술된 항-CD73 항체는 예를 들어 본원에 기술된 장애를 치료하기 위해 대상에 투여하기 위한 약제학적 조성물로서 제제할 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는, "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅물, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 조성물은 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들어 산 부가 염 또는 염기 부가 염을 포함할 수 있다(예를 들어, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19 참조).

약제학적 제제는 충분히 확립된 기술이고, 예를 들어, 문헌[Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); and Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3rd ed. (2000) (ISBN: 091733096X)]에서 더 기술된다.

약제학적 조성물은 또한 다양한 형태로 존재할 수 있다. 이들은, 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 제형, 예를 들어, 액체 용액(예를 들어, 주사 및 주입가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 알약, 산제, 리포좀 및 좌제를 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료적 적용에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 본원에 기술된 작용제용 조성물은 주사 가능하거나 주입 가능한 용액의 형태로 존재한다.

조성물은 높은 농도에서 안정적으로 보관하기에 적합한 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 기타 질서정연한 구조로서 제제할 수 있다. 멸균 주사가능 용액은 본원에 기술된 작용제를 필요한 양으로 적합한 용매에 필요에 따라 상기 열거된 하나의 성분 중 하나 또는 그 조합과 함께 혼합한 후 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 본원에 기재된 작용제를 염기성 분산매 및 상기 열거된 성분들 중 필요한 다른 성분을 포함하는 멸균성 비히클에 삽입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 앞서 멸균 여과된 용액으로부터 본원에 기술된 작용제 및 임의의 추가로 원하는 성분을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사 가능한 조성물의 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함함으로써 연장될 수 있다.

특정 구현예에서, 항-CD73 항체는 신속한 방출에 대해 화합물을 보호할 담체, 예를 들어, 이식체 및 미세캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출형 제제를 사용하여 제조될 수 있다. 생분해성, 생체 적합성 중합체, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제를 제조하기 위한 다수의 방법이 특허받거나 일반적으로 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York (1978)] 참조.

투여

항-CD73 항체는 다양한 방법에 의해 대상, 예를 들어 이를 필요로 하는 대상, 예를 들어 인간 대상에게 투여될 수 있다. 여러 가지 적용을 위해, 투여 경로는 정맥내 주사 또는 주입(IV), 피하 주사(SC), 복강내(IP) 또는 근육내 주사 중 하나이다. 관절 내 전달을 사용하는 것 또한 가능하다. 다른 비경구 투여 방법을 사용하는 것 또한 가능하다. 이러한 방법의 예시는 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 기관내, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 경막외 및 흉골내 주사를 포함한다. 일부 경우에, 경구 투여가 가능하다.

항체의 투여 경로 및/또는 방법은 또한 대상으로 모니터링하여, 예를 들어, 단층 촬영 영상화를 사용하여 예를 들어 종양을 시각화함으로써 개별 사례에 맞출 수 있다.

항체는 고정 용량 또는 mg/kg 환자 체중 용량으로 투여될 수 있다. 용량은 또한 항-CD73 항체에 대한 항체 생성을 감소시키거나 회피하도록 선택될 수 있다. 용법 용량은 치료 반응 또는 복합적 치료 효과와 같은 원하는 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 일반적으로, 항-CD73 항체(및 임의로 제2 작용제)의 용량은 대상에게 생체이용 가능한 양의 작용제를 제공하기 위해 사용될 수 있다.

본원에 사용된 투여량 단위형 또는 "고정된 용량" 또는 "고정 용량"은 치료받을 대상을 위한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하고, 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께, 그리고 임의로 기타 작용제와 함께 원하는 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 단일 또는 다중 투여량이 주어질 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 항체는 연속 주입을 통해 투여될 수 있다.

하기는 본 발명의 실시예이다. 이들은 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예

하기 실시예는 청구된 발명을 더 잘 설명하기 위해 제공되고 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 구체적 물질이 언급되지 않는 정도로, 이는 단지 설명을 목적으로 하고, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 기술분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서, 창작 능력을 사용하지 않고도 동등한 수단 또는 반응물을 개발할 수 있다.

실시예 1: 항-인간 CD73 단일클론 항체의 생성

항-인간 CD73 단일클론 항체를 생성하기 위해, C-말단 HIS-태그를 포함하는 재조합 인간 CD73(서열번호 70) 단백질로 마우스를 면역화하고 B 세포를 마우스 비장 및 림프절로부터 단리하였다. 10x Genomics VH/VL 쌍을 이루는 B 세포 서열분석을 사용하여 B 세포의 항체 서열을 결정하였다. 뮤린 VH/VL 쌍을 huIgG1 Fc(서열번호 73 및 74)를 가진 키메라로서 발현시키고 결합 및 기능성에 대해 테스트하였다. 항체 지정 CL25를 이 과정에 의해 생산하였다. 상기 표 1은 IMGT, 코티아, AbM, 카바트 및 콘택트 넘버링에 따른 CL25 CDR의 아미노산 서열과 성숙 VH, VL, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.

키메라 항체 CL25(서열번호 26의 뮤린 VH 및 서열번호 27의 뮤린 VL 포함)를 인간화하여 특이적 활성을 유지하면서 항체 프레임워크의 면역원성을 최소화하였다. 인간화는 VH 및 VL 서열을 인간 VH 및 VK 유전자의 데이터베이스에 정렬하여 수행하였다. 뮤린 CL25 항체로부터의 CDR(표 1)을 여러 상층 인간 VH 및 VK 유전자에 이식하였다. 예시적인 인간화 CL25 항체의 VH 및 VL 서열은 도 1a-도 1c에 도시되어 있다. CL25 및 예시적인 인간화 CL25 항체의 VH 및 VL의 정렬이 도 1d 및 도 1e에 각각 도시되어 있다. 뮤린 CL25에 존재하는 여러 프레임워크 돌연변이 또한 뮤린 CDR과 함께 시험되었다(도 1a-도 1e). 본원에서 "HzCL25"로 지칭되는, 서열번호 22의 VH 및 서열번호 23의 VL을 가진 CL25의 인간화 버전을 추가 연구를 위해 선택하였다. 상기 표 2는 IMGT, 코티아, AbM, 카바트 및 콘택트 넘버링에 따른 HzCL25 CDR의 아미노산 서열과 성숙 VH, VL, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.

실시예 2: 세포 표면 CD73에 대한 항-인간 CD73 단일클론 항체의 결합

인간화 및 비인간화 CL25 클론의 세포 표면 CD73에 대한 결합을 테스트하기 위해, MDA-MB-231 또는 A375 세포를 세척하고 5x10⁴개 세포/웰로 96웰 플레이트에 첨가했다. 얼음 위에서 30분 동안 세포를 표시된 농도의 항체로 염색하였다(도 2a 및 도 2b). 다음으로, 세포를 세척하고 얼음 위에서 30분 동안 피코에리트린(phycoerythrin, PE)에 2차 접합된 염소 항-마우스를 사용하여 염색하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고 유동 세포계측으로 분석하였다. CD73 염색의 기하 평균 형광 강도(Geometric mean fluorescence intensity, GMFI)를 그래프로 나타내었다(도2a 및 도 2b). CL25 및 HzCL25 모두 높은 수준의 표면 CD73(MDA-MB-231 세포) 및 중간 수준의 표면 CD73(A375 세포에서 테스트됨)을 가진 세포에 대한 고효력 결합을 나타냈다.

실시예 3: 항-인간 CD73 단일클론 항체-매개 세포 CD73 억제

세포에 대한 CD73 활성을 억제하는 항-CD73 항체의 능력을 측정하기 위해, A375 및 MDA-MB-231 세포를 무혈청 RPMI 배지(ThermoFisher)로 세척하고, A375 는 8x10⁴개 세포/웰의 농도로, MDA-MB-231은 1x10⁴개 세포/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 평판배양하였다. 표시된 농도의 항체 또는 APCP와 함께 세포를 37℃ 5% CO₂에서 30분 동안 배양하였다(도 3a, 도 3b및 도 3c). 다음으로, 아데노신 모노포스페이트(AMP)를 100μM의 최종 농도로 첨가하고, 세포를 37°C 5% CO₂에서 추가로 3시간 동안 배양하였다. 플레이트를 300g에서 1-2분 동안 원심분리하고, 25μL의 상청액을 새로운 96웰 플레이트로 옮겼다. AMP-Glo 검정을 제조사(Promega)의 지침에 따라 사용하였다. 상대 발광 단위(RLU)는 해당 검정에서 AMP 농도와 직접적인 상관 관계가 있다. 결과는 도 3a, 도 3b, 및 도 3c에 도시되어 있다.

CL25 및 HzCL25 둘 다는 테스트된 세포 유형 둘 다에서 세포 CD73을 억제하는데 우수한 효력을 가졌다(도 3a, 도 3b, 및 도 3c). HzCL25는 세포 CD73을 억제하는 CL25와 유사한 능력을 가졌다(도 3a, 도 3b, 및 도 3c).

실시예 4: 항-인간 CD73 단일클론 항체-매개 가용성 CD73 억제

재조합 단백질의 CD73 활성을 억제하는 CD73 항체의 능력을 측정하기 위해, 재조합 인간 CD73(rhuCD73)(서열번호 70)을 항체의 표시된 농도(도 4) 또는 아데노신 5'-[α,β-메틸렌]디포스페이트(APCP)의 표시된 농도와 함께 최종 농도 0.008㎍/mL에서 96-웰 플레이트에 첨가하고 37℃ 5% CO₂에서 30분 동안 배양하였다. 30분 배양 후, AMP를 100μM의 최종 농도로 첨가하고 반응물을 37°C 5% CO₂에서 추가로 3시간 동안 배양하였다. 25μL의 상청액을 새로운 96웰 플레이트로 옮겼다. AMP-Glo 검정을 제조사의 지침에 따라 사용하였다. RLU는 해당 검정에서 AMP 농도와 직접적인 상관관계가 있다. 결과는 도 4에 도시되어 있다. CL25 및 HzCL25 모두 고효력을 나타내었고 후크 효과가 없었다(도 4). HzCL25는 세포 CD73을 억제하는 CL25와 유사한 능력을 가졌다(도 4).

실시예 5: T 세포 증식의 AMP 매개 억제에 대한 항-인간 CD73 단일클론 항체 매개 역전

T 세포 증식의 AMP 매개 억제를 역전시키는 CD73 항체의 능력을 측정하기 위해, 1차 인간 CD4⁺ T 세포를 인간 CD4⁺ T-세포 단리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)로부터 정제하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 1μM의 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE)(BD Biosciences)로 단리된 CD4⁺ T 세포를 표지하였다. CFSE 표지된 세포를 10% 소 태아 혈청 및 60 IU/ml 재조합 인간 IL-2를 포함하는 RPMI에 재현탁했다. 약 50,000개 세포/웰을 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 첨가하였다. Dynabeads 인간 T 활성화제 CD3/CD28 비드를 비드:세포 비율 1:1로 세포 현탁액에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 항체의 연속 희석액을 지정된 웰에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 배양했다. 마지막으로, AMP를 1000μM의 최종 농도로 첨가하고 전체 배양물을 인큐베이터에서 37℃에서 5일 동안 배양했다. 5일 후, LSRFORTESSA X-20 분석기(BD Biosciences)를 사용한 CFSE 기반 유동 세포 계측 분석에 의해 CD4⁺T 세포 증식을 측정하였다.

항-CD73 항체는 다수의 상이한 인간 공여자에서 농도 의존적 방식으로 CD4+ T 세포 증식의 AMP 매개 억제를 역전시켰다(도 5a-5n).

실시예 6: 결합 친화성

CD73 효소 활성은 개방형 입체형태에서의 기질 결합이 필요하다. 기질 결합 후, CD73은 AMP를 아데노신으로 전환하기 위해 개방형에서 폐쇄형 입체형태로의 큰 입체형태적 변화를 거쳐야 한다. 이러한 입체형태적 변화를 억제하거나 조절하는 항체 결합은 잠재적으로 AMP에서 아데노신으로의 전환율을 감소시킬 것이다.

HzCL25의 결합 친화성을 평가하기 위해, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)을 25°C에서 Biacore 8K 기기(GE Healthcare)를 사용하여 수행했다. SPR 실행 완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.05% v/v 계면활성제 P20, pH 7.4)을 10X HBS-EP 완충액(GE Healthcare)에서 제조하였다. 항-인간 Fc 항체(GE Healthcare)를 S 시리즈 센서 칩 CM5(GE Healthcare)의 16개 유동 세포 모두에 아민 커플링을 통해 고정하였다. 고정화 수준은 모든 유동 세포에 대해 약 9000 RU였다. 각 채널의 활성 유동 세포를 통해 항-CD73 항체의 적절한 농도를 유동시킴으로써 항-CD73 항체의 원하는 포획 수준을 달성하였다. Zn²⁺가 존재하는 절단 불가능한 ADP 유사체 APCP(아데노신-5'-(α,β-메틸렌)디포스페이트)를 CD73 입체형태 평형을 개방형에서 폐쇄형으로 변경하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 재조합 CD73을 100μM APCP 및 10μM ZnCl₂의 존재 하에 SPR 실행 완충액(폐쇄형 SPR 실행 완충액)과 함께 배양하여 폐쇄형 입체형태의 CD73에 대한 항-CD73 항체의 결합을 연구했다. 이를 달성하기 위해, Biacore 8K의 ABA 주입 기능을 사용하였다. 개방형 입체형태의 경우, ABA 주입 서열은 실행 완충액의 60초 주입으로 시작되었다. 그런 다음, CD73 스톡(BPS Bioscience) 및 실행 완충액으로부터 제조된 CD73 3배 연속 희석 농도 시리즈를 180초 동안 주입한 직후 240초 동안 실행 완충액을 주입했다. 폐쇄형 입체형태의 경우, 일반 SPR 실행 완충액을 폐쇄형 SPR 실행 완충액으로 대체했다. 3M MgCl₂를 30초 동안 주입하여 표면을 재생했다. 결합 동역학 및 친화성 매개변수는 1:1 결합 모델에 대한 데이터의 전체 적합도(global fit)에서 얻었다. 개방형 또는 폐쇄형 입체형태 중 어느 하나의 인간, 시노몰구스 및 마우스 CD73에 대한 결합 친화성 및 동역학적 결합률 상수 및 해리율 상수는 하기 표 6에 나타내었다. 표 6의 결과는 시노몰구스 약동학 데이터가 인간 약동학 데이터를 반영할 것을 보장한다.

표시된 항체(Ab)에 대한 개방형 또는 폐쇄형 입체형태 중 어느 하나의 인간(서열번호 70), 시노몰구스(서열번호 72), 및 마우스(서열번호 71) CD73에 대한 결합 친화성 및 동역학적 결합률 상수 및 해리율 상수.

Ab	CD73	개방형					폐쇄형
		k _a (1/Ms)	k _d (1/s)		K _D (M)		k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K _D (M)
CL25	인간	> 1E+06	3.94E-04		< 3.94E-10		9.03E+05	3.44E-04	3.81E-10
	시노몰구스	> 1E+06	6.58E-04		< 6.58E-10		9.36E+05	4.95E-04	5.29E-10
	뮤린	결합 없음					결합 없음
HzCL25	인간	> 1E+06		4.49E-04		<4.49E-10	수행되지 않음
	시노몰구스	> 1E+06		4.68E-04		<4.68E-10	수행되지 않음
	뮤린	결합 없음					수행되지 않음
CL25_ hu_8-4	인간	7.70E+05		1.76E-03		2.29E-09	수행되지 않음
CL25_hu_8-5	인간	> 1E+06		9.49E-04		7.18E-10	수행되지 않음
CL25_hu_8-6	인간	7.15E+05		1.11E-03		1.55E-09	수행되지 않음
CL25_hu_9-4	인간	3.82E+05		2.64E-03		6.90E-09	수행되지 않음
CL25_hu_9-5	인간	5.65E+05		1.14E-03		2.02E-09	수행되지 않음
CL25_hu_9-6	인간	4.24E+05		9.53E-04		2.25E-09	수행되지 않음
CL25_hu_10-4	인간	8.87E+05		1.07E-03		1.20E-09	수행되지 않음
CL25_hu_10-6	인간	5.24E+05		9.20E-04		1.75E-09	수행되지 않음
CL25_hu_11-4	인간	6.24E+05		1.55E-03		2.48E-09	수행되지 않음
CL25_hu_11-5	인간	7.99E+05		1.17E-03		1.46E-09	수행되지 않음
CL25_hu_11-6	인간	5.50E+05		1.01E-03		1.84E-09	수행되지 않음

실시예 7: 에피토프 매핑

CL25의 에피토프를 매핑하기 위해, 수소-중수소 교환 질량 분석(HDX)을 수행했다. CD73은 단독으로 또는 CL25 Fab와 함께 중수소 산화물에서 배양하였다. 중수소 교환을 20℃에서 0초, 60초, 600초 또는 3600초 동안 수행하였다. 교환 반응을 낮은 pH로 급랭하고 단백질을 펩신/프로테아제 VIII로 소화시켰다. 식별된 펩티드에서의 중수소 수준을 LC-MS의 질량 이동으로부터 모니터링하였다. 모든 펩티드에 대한 교환 시간에 따른 중수소 축적 곡선을 시간에 따른 그래프로 나타내었다. Fab에 결합 시 중수소 흡수가 현저히 감소한 펩티드를 각 항체의 에피토프로 지정하였다. CL25에 대한 HDX-MS에 의해 결정된 에피토프는 인간 CD73(4H2F.pdb)의 결정 구조상에 매핑되고(도 6), TKVQQIRRAEPNVL(서열번호 76)(즉, 서열번호 70의 40-53번 아미노산)이다.

실시예 8: CD73 세포 표면 수준

항체 처리 후 세포 표면상의 CD73의 양을 측정하기 위해, MDA-MB-231 세포를 배지(10% FBS RPMI-1640)에 재현탁하고 1x10⁵개 세포/웰로 96-웰 플레이트에 평판배양하였다. 표시된 항체를 10㎍/mL의 최종 농도로 첨가하고 플레이트를 37°C 5% CO₂에서 24시간 동안 배양했다. Versene을 사용하여 세포를 회수하고 새로운 96웰 플레이트로 옮겼다. 세포를 세척하고 Dy650에 직접 접합된 10μg/mL의 비경쟁 항체로 얼음 위에서 30분 동안 염색했다. 세포를 세척하고, 유동 세포 계측으로 분석하였다. CD73 세포 표면 수용체 밀도는 Quantum Simply Cellular 비드를 사용하여 항체 결합 능력(Antibody Binding Capacity, ABC)에 의해 결정하였다. 24시간 동안 CL25로 세포를 처리하면 세포 표면 CD73의 수준이 감소하였다(도 7).

실시예 9: 종양 성장에 대한 항-CD73 항체의 효과

CL25 항체의 생체내 효능을 테스트하였다. HzCL25를 hu-CD34 NSG 마우스(Jackson Laboratories)의 복강내 투여를 위해 1x 인산염 완충 식염수(PBS)(Life Technologies)에 현탁했다. 1xPBS에 현탁된 1xPBS 및 Fc 비활성화 인간 IgG1을 본 연구에 대조군으로 포함하였다. 인간화된 면역 시스템을 가진 마우스는 Jackson Labs(Bar Harbor, ME)에서 구입했다. 즉, 3주령 암컷 NSG/NOD SCID 마우스는 면역 세포 전구체에 독성이 있는 단일 선량의 방사선 조사를 받은 다음, 인간 제대혈, CD34⁺ 선택된 세포를 주입하여 "구조"되었다. 12주 후(인간 면역 세포의 회수 및 이식을 하기 위해), 마우스를 Incyte 연구소의 AALAS 인증 동물 사육장에 수용하였다. 마우스는 면역 반응의 개별적 변이를 더 잘 나타내기 위해 3명의 별개의 인간 면역 공여자의 수혜자를 포함하였다.

마트리겔(Corning Life Sciences, Tewksbury, Mass)에 현탁된 인간 흑색종 라인 A375(ATCC, Manassas Virginia)의 5x10⁶개 세포를 접종하기 전날 마우스의 왼쪽 옆구리를 면도했다. 11일째에, 종양 치수를 버니어 캘리퍼스로 측정하고 부피 = [L(긴 치수) x W2(짧은 치수)]/2 공식으로 부피를 추정했다. 대략적인 평균 부피(약 200mm³)와 공여자 대표성을 가진 5 또는 6마리의 마우스로 구성된 3개의 그룹으로 마우스를 무작위 배정하였다. 연구 기간 동안 2-4일마다 종양을 측정하였다.

HzCL25를 PBS에서 1 및 0.1 mg/ml의 농도로 희석하고, 일치하는 이소형 대조군(cx00376-001)을 투여 당일 아침에 새로운 1 mg/ml로 희석하였다. 11일째부터 6일마다 항체를 마우스에 10 ml/kg으로 복강내 주사하여 1 및 10 mg/kg 체중의 유효 용량을 달성했다. 총 3회 투여했다.

세 번째 및 마지막 투여 후 48시간에, 마우스를 CO₂질식으로 안락사시켰다. 종양을 절제하고, 프로테아제 함유 배지에 넣고, 얼음 위에 놓은 다음, GentleMacs Tissue Disruptor(Miltenyi, Auburn CA)를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 파괴했다. 세포는 유동 세포 계측 및 효소 검증을 위해 처리되는 동안 얼음 위에 남아 있었다.

HzCL25가 투여된 마우스는 두 용량 모두에서 종양 성장 억제를 나타냈고, 저용량은 유의하게(p=.026, 양측 t 검정) 성장을 56% 늦췄다(도 8).

실시예 10: 생체외 효소 활성 검정

HzCL25가 투여된 종양 보유 마우스에서 CD73의 효소 활성을 평가하기 위해, 도 8의 실험으로부터 얻은 종양 균질 현탁액의 단일 세포 현탁액을 Dead Cell Removal MicroBeads(Miltenyi Biotec)를 사용하여 살아있는 세포에 대해 분류하였다. 세포 선택 후, 웰당 10,000개의 살아있는 세포를 100μM의 AMP와 함께 평판배양하였다. 양성 대조군으로, 250μM APCP 처리된 세포를 사용하였다. 처리 후 AMP-Glo 키트(Promega; Cat. # V5011)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 CD73의 효소 활성을 감지하였다. AMP 수준 검출을 위한 척도로 발광을 사용하였고 각 동물의 판독값은 APCP 처리된 배양물 판독값으로 정규화하였으며, APCP 처리된 배양물은 CD73 활성의 최대 억제를 나타내는 것으로 간주하였다(도 9). 도 9에 나타낸 바와 같이, HzCL25는 종양 세포에 대한 CD73 효소 활성의 용량 의존적 억제를 입증하였다.

실시예 11: 항-CD73-처리된 종양의 유리 표면 CD73

치료 후 수용체 커버리지를 평가하기 위해, 도 8의 실험으로부터 얻은 종양 균질현탁액의 단일 세포 현탁액을 생존성 염료(Biolegend, Cat. # 423110), 인간 CD45(Biolegend, Cat. # 304036), 마우스 CD45(BD Biosciences, Cat. # 563410), 마우스 CD90.2(BD Biosciences, Cat. # 565257), 및 경쟁 항체(AF488-접합 CL25 항체) 또는 비경쟁 항체(PE-접합 항체 X)를 이용하여 염색하였다. 세포를 각각 BD FACSymphony 유동 세포 계측 분석기 및 FlowJo 소프트웨어 패키지를 사용하여 실행 및 분석하였다. 종양 세포 집단에 초점을 맞추며 살아있는 세포 군집에 대해 게이팅(gating)한 후 마우스 세포 및 인간 면역 세포 배제에 대해 게이팅하여 분석을 수행하였다. 종양 세포에 대한 총 CD73 수준을 형광단 태그 비경쟁 CD73 항체를 사용하여 검출하였다. 용량 의존적 방식으로, HzCL25는 종양 세포에서 총 CD73 수준을 감소시켰다(도 10a). 도 10a에서 측정된 바와 같이 CD73을 발현하는 세포 중에서, 유리 표면 CD73을 형광단 태그 경쟁(CL25) 항체를 사용하여 측정하였다(도 10b). HzCL25 처리는 유리 표면 CD73의 용량 의존적 감소를 보여주었다(도10b). 게다가, 두 용량에 대한 유리 표면 CD73 수준의 이러한 감소는 IgG 처리된 종양과 비교하여 유의미하게 더 낮았다(도 10b).

실시예 12: 항-CD73 항체의 생체내 약동학 및 약력학 연구

생체내 HzCL25의 효능을 평가하기 위해, 인간 CD34⁺재구성된 암컷 마우스(21주령; The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에 5 x 10⁶개의A375 인간 흑색종 세포(ATCC# CRL-1619)를 피하 접종했다. 종양이 있는 마우스의 처리는 종양 부피가 약 330 mm³에 도달한 접종 후 7일째에 시작하였다. A375 이식된 인간화 NSG 마우스에 5일마다 10 mg/kg의 HzCL25를 복강내 투여했다. 본 연구의 동물은 32일째에 최종 용량을 포함하여 총 6회의 항체를 투여받았다. 종양은 26일과 29일째에 체중의 10%보다 큰 종양이 있는 마우스에서 수집하고 33일째에 나머지 모든 동물에서 수집했다. 혈청은 26일째에 모든 동물에서, 29일째에 체중의 10%를 초과하는 종양이 있는 마우스에서 다시 수집하고, 33일째에 나머지 모든 동물에서 수집했다. 26일 동안(IgG 대조군이 평균 효능 평가변수에 도달한 시점), HzCL25는 14%의 완만하지만 미미한 종양 성장 억제를 제공했다(도 11a). 그러나, 32일까지 연장된 투여는 HzCL25 처리된 동물과 IgG 대조군을 받은 나머지 마우스 사이에 종양 성장률과 생존에서 현저한 차이를 나타내었다(도 11b).

총 2회 용량의 항체에 대해 3일마다 10mg/kg의 HzCL25를 사용하여 22일째에 별도의 약력학(pharmacodynamic, PD) 연구를 시작했다. PD 동물로부터 얻은 종양을 2차 항체 투여 후 48시간째인 27일째에 수집하였다. 항체 처리 후 마우스 혈청에서 가용성 인간 CD73(hCD73)을 측정하기 위해, MSD 플레이트를 1μg/mL의 비경쟁 포획 IgG 항체로 코팅하고 4°C에서 밤새 배양했다. 플레이트를 세척하고 1:5로 희석된 마우스 혈청 샘플을 첨가했다. 재조합 인간 CD73(rhuCD73)을 사용하여 표준 곡선을 생성했다. 플레이트를 600rpm에서 진탕하면서 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세척하고 설포-태그에 직접 접합된 경쟁 항체(HzCL25) 또는 비경쟁(항체 X) 항체를 플레이트에 1㎍/mL로 첨가하고 600rpm에서 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세척하고 150μL의 판독 완충액을 첨가하고 MSD 플레이트 판독기를 사용하여 분석했다. 마우스 혈청의 가용성 hCD73 수준을 표준 곡선에서 계산하였다. HzCL25 처리가 마우스의 가용성 인간 CD73을 약간 안정화시켰지만, 가용성 인간 CD73의 수준은 여전히 마우스의 항체 수준보다 훨씬 낮았다(도 12).

실시예 13: 항-인간 CD73 단일클론 항체 3-F03의 생성

추가적인 항-인간 CD73 단일클론 항체를 생성하기 위해, 단일 공여자 라이브러리의 다중 선택 라운드를 수행했다. 200 nM 비오틴화된 인간 CD73(서열번호 70)을 사용하여 3 라운드 패닝에 걸쳐 약 1.5E12 파지 입자의 라이브러리를 농축하였다. 그런 다음, 해당 풀(pool)에서 얻은 scFv 카세트를 효모 디스플레이 벡터로 재조합하고 약 5.4E7의 라이브러리를 생성했다. 해당 라이브러리는 100 nM 비오틴화 뮤린 CD73(서열번호 71)을 사용하여 3 라운드 동안 FACS에 의해 선택되었다. 효모 콜로니의 Sanger 서열분석에 의한 최종 분류 출력에서 고유한 서열을 얻었다. 효모 3-F03 scFv 서열은 해당 풀로부터 식별되었고, 서열번호 77에 기재된 아미노산 서열의 VH 및 서열번호 65에 기재된 아미노산 서열의 VL을 포함했다.

전장 인간 3-F03 항체를 구성하기 위해, 서열번호 73에 기재된 인간 IgG1 불변 영역 및 서열번호 74에 기재된 인간 카파 경쇄 불변영역을 포함하는 인간 IgG1 스캐폴드 내로 클로닝하기 전에 효모 3-F03 scFv 서열을 변형하였다. VH의 경우, 서열번호 77의 N-말단 글루타메이트(E)를 제거하였고, 서열번호 77의 카바트 위치 H77(즉, 서열번호 77의 78 번 위치)에서 트레오닌(T)을 알라닌(A)으로 치환하였다. VL의 경우, 서열번호 65의 N-말단 알라닌(A)을 제거하였다. 생성된 전장 인간 3-F03 항체는 각각 서열번호 60 및 61의 아미노산 서열에 기재된 VH 및 VL을 포함한다. 생성된 전장 인간 3-F03 항체는 각각 서열번호 66 및 31의 아미노산 서열에 기재된 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 해당 항체는 본원에서 "3-F03"으로 지칭된다. 상기 표 3은 IMGT, 코티아, AbM, 카바트 및 콘택트 넘버링에 따른 3-F03 CDR의 아미노산 서열과 성숙 VH, VL, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.

실시예 14: 세포 표면 CD73에 대한 3-F03의 결합

세포 표면 CD73에 대한 3-F03의 결합을 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하였다. 3-F03은 높은 수준의 표면 CD73(MDA-MB-231) 및 중간 수준의 CD73(A375 세포)을 가진 세포에 대한 고효력 결합을 나타낸다(도 13a 및 도 13b).

실시예 15: 3-F03 매개 세포 CD73 억제

세포에 대한 CD73 활성을 억제하는 3-F03의 능력을 상기 실시예 3에 기술된 바와 같이 평가하였다. 결과는 도 14a 및 도 14b에 도시되어 있다.

클론 3-F03은 CD73의 소분자 억제제인 APCP와 비교하여 테스트된 세포 유형 둘 다에서 세포 CD73의 최대 억제를 나타내었다(도 14a 및 도 14b).

실시예 16: 3-F03 매개 가용성 CD73 억제

재조합 단백질의 CD73 활성을 억제하는 3-F03의 능력은 0.025 ug/mL의 rhuCD73을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 4에 기술된 바와 같이 평가하였다. 결과는 도 15에 도시되어 있다. 항체 3-F03은 우수한 효력을 나타냈다(도 15). 항체 3-F03은 후크 효과를 나타내지 않았다.

실시예 17: T 세포 증식의 AMP 매개 억제에 대한 항-인간 CD73 단일클론 항체 매개 역전

T 세포 증식의 AMP 매개 억제를 역전시키는 3-F03의 능력을 상기 실시예 5에 기술된 바와 같이 평가하였다. 3-F03은 다수의 상이한 인간 공여자에서 농도 의존적 방식으로 CD4+ T 세포 증식의 AMP 매개 억제를 역전시켰다(도 16a-16d).

실시예 18: 항-CD73 항체의 결합 친화성

3-F03의 결합 친화성을 상기 실시예 6에 기술된 바와 같이 평가하였다. 개방형 또는 폐쇄형 입체형태 중 어느 하나의 인간, 시노몰구스 및 마우스 CD73에 대한 결합 친화성 및 동역학적 결합률 상수 및 해리율 상수를 하기 표 7에 나타내었다.

개방형 또는 폐쇄형 입체형태 중 어느 하나의 인간, 시노몰구스 및 마우스 CD73에 대한 결합 친화성 및 동역학적 결합률 상수 및 해리율 상수.

시료 명칭	CD73	개방형			폐쇄형
		k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K _D (M)	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K _D (M)
3-F03	인간	2.15E+05	7.96E-05	3.70E-10	결합 없음
	시노몰구스	3.01E+05	2.21E-04	7.34E-10	결합 없음
	뮤린	2.17E+05	3.60E-04	1.66E-09	결합 없음

실시예 19: 3-F03의 에피토프 매핑

3-F03의 에피토프를 상기 실시예 7에 기술된 바와 같이 매핑하였다. 3-F03에 대해 HDX-MS에 의해 결정된 에피토프는 인간 CD73(4H2F.pdb)의 결정 구조상에 매핑되고(도 17), AAVLPFGGTFDLVQ(서열번호 78)(즉, 서열번호 70의 386-399번 아미노산) 및 ILPNFLANGGDGFQMIKDEL(서열번호 79)(즉, 서열번호 70의 470-489번 아미노산)이다.

실시예 20: CD73 세포 표면 수준에 대한 3-F03의 효과

3-F03으로 처리한 후 세포 표면의 CD73의 양을 상기 실시예 8에 기술된 바와 같이 평가하였다. 3-F03은 이소형 대조군 항체 또는 미처리 세포와 비교하여 세포 표면에서 검출가능한 CD73의 수준을 극적으로 감소시켰다(도 18).

실시예 21: 생체내 연구

3-F03의 생체내 효능을 상기 실시예 12에 기술된 바와 같이 평가하였다. 26일 동안(IgG 대조군이 평균 효능 평가변수에 도달한 시점), 3-F03은 8%의 완만하지만 통계적으로 무의미한 종양 성장 억제를 제공했다(도 19a). 그러나, 32일까지 연장된 투여는 3-F03 처리된 동물과 IgG 대조군을 받은 나머지 마우스 사이에 종양 성장률 및 생존에서 현저한 차이를 나타내었다(도 19b).

3-F03의 PD 특성 또한 상기 실시예 12에 기술된 바와 같이 평가하였다. 3-F03 처리 시 전체 또는 유리 가용성 인간 CD73의 검출가능한 증가가 없었기 때문에, 3-F03으로 처리한 경우 마우스에서 가용성 인간 CD73을 안정화시키지 않았다(도 20).

실시예 22: 3-F03 변이체

3-F03 경쇄(LC, 서열번호 66) 및 중쇄(HC, 서열번호 31)의 서열을 사용하여 상동성 모델을 구성하였다. 도 21a-도 21j는 예시적인 3-F03 변이체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 제공한다. 이러한 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체는 서열번호 73에 기재된 중쇄 불변 영역 및 서열번호 74에 기재된 경쇄 불변 영역을 포함했다. 표 8은 예시적인 3-F03 변이체의 결합 친화성 및 동역학을 제공한다. 테스트된 돌연변이 중 어느 것도 Biacore에 의한 CD73 결합에 극적인 영향을 미치지 않았다. 테스트된 모든 돌연변이는 3-F03 항체의 10배 이내의 친화성을 가졌고, 대다수는 3-F03의 2배 이내였다.

3-F03 변이체의 Biacore 결합 친화성 및 동역학. - = 부재.

시료 명칭	생성된 돌연변이(카바트 넘버링)				k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K _D (M)
시료 명칭	VH1 (E 또는 -)	VH53 (D, E 또는 S)	VH77 (A 또는 T)	VL1 (A, D 또는 -)	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K _D (M)
3-F03_396	E	D	T	A	1.39E+05	1.78E-04	1.28E-09
3-F03_408	E	D	T	-	1.40E+05	1.86E-04	1.33E-09
3-F03_402	-	D	T	A	1.32E+05	1.84E-04	1.39E-09
3-F03_384	E	D	T	D	1.40E+05	1.98E-04	1.41E-09
3-F03_399	E	D	A	A	1.38E+05	1.97E-04	1.43E-09
3-F03_411	E	D	A	-	1.39E+05	2.04E-04	1.47E-09
3-F03_414	-	D	T	-	1.31E+05	1.98E-04	1.51E-09
3-F03_390	-	D	T	D	1.29E+05	2.12E-04	1.64E-09
3-F03_398	E	E	T	A	9.26E+04	1.59E-04	1.71E-09
3-F03_387	E	D	A	D	1.37E+05	2.38E-04	1.74E-09
3-F03_386	E	E	T	D	9.23E+04	1.64E-04	1.78E-09
3-F03_401	E	E	A	A	9.15E+04	1.67E-04	1.82E-09
3-F03_413	E	E	A	-	9.13E+04	1.71E-04	1.88E-09
3-F03_405	-	D	A	A	1.26E+05	2.39E-04	1.90E-09
3-F03_410	E	E	T	-	9.01E+04	1.76E-04	1.95E-09
3-F03_389	E	E	A	D	9.17E+04	1.89E-04	2.06E-09
3-F03_393	-	D	A	D	1.14E+05	2.39E-04	2.09E-09
3-F03_417	-	D	A	-	1.34E+05	2.84E-04	2.12E-09
3-F03_392	-	E	T	D	8.08E+04	1.80E-04	2.23E-09
3-F03_404	-	E	T	A	8.35E+04	1.89E-04	2.26E-09
3-F03_419	-	E	A	-	8.28E+04	2.00E-04	2.41E-09
3-F03_416	-	E	T	-	9.01E+04	2.21E-04	2.45E-09
3-F03_407	-	E	A	A	8.74E+04	2.35E-04	2.69E-09
3-F03_395	-	E	A	D	7.12E+04	2.10E-04	2.94E-09
3-F03_388	E	S	A	D	1.15E+05	8.68E-04	7.56E-09
3-F03_397	E	S	T	A	6.07E+04	4.89E-04	8.04E-09
3-F03_385	E	S	T	D	6.33E+04	5.38E-04	8.50E-09
3-F03_400	E	S	A	A	6.15E+04	5.29E-04	8.60E-09
3-F03_409	E	S	T	-	6.02E+04	5.46E-04	9.06E-09
3-F03_403	-	S	T	A	5.79E+04	5.41E-04	9.34E-09
3-F03_415	-	S	T	-	5.99E+04	6.06E-04	1.01E-08
3-F03_391	-	S	T	D	5.69E+04	5.84E-04	1.03E-08
3-F03_406	-	S	A	A	7.41E+04	7.65E-04	1.03E-08
3-F03_412	E	S	A	-	5.27E+04	6.38E-04	1.21E-08
3-F03_394	-	S	A	D	4.84E+04	6.30E-04	1.30E-08
3-F03_418	-	S	A	-	5.55E+04	7.99E-04	1.44E-08

세포 표면 CD73에 대한 유전자 조작된 3-F03 변이체의 결합을 테스트하기 위해, MDA-MB-231 세포를 세척하고 5x10⁴개 세포/웰로 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 얼음 위에서 1시간 동안 표시된 농도의 항체로 세포를 염색하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고 얼음 위에서 30분 동안 PE에 2차 접합된 염소 항-마우스 염색을 하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 유동 세포 계측에 의해 분석하였다. CD73 염색의 GMFI를 그래프로 나타내었다(도 22). 각각의 3-F03 변이체는 3-F03_417을 제외하고 약간 더 높은 Ymax를 나타내는 유사한 결합 프로파일을 가졌다(도 22). 이러한 데이터는 Biacore 연구를 확인한다(표 8) 즉 이러한 돌연변이는 이러한 변이체 클론에 대한 인간 CD73 결합을 극적으로 변경하지 않았다.

세포에 대한 CD73 활성을 억제하는 3-F03 변이체의 능력을 테스트하기 위해, MDA-MB-231 세포를 무혈청 RPMI 배지로 세척하고 96-웰 플레이트에 1x10⁴개 세포/웰로 평판배양하였다. 표시된 농도의 항체 또는 APCP를 이용해 37℃ 5% CO₂에서 30분 동안 세포를 배양하였다. 다음으로, AMP를 최종 농도 100μM로 첨가하고, 세포를 37°C 5% CO₂에서 추가로 3시간 동안 배양하였다. 플레이트를 300g에서 1-2분 동안 원심분리하였고, 25μL의 상청액은 새로운 96웰 플레이트로 옮겼다. AMP-Glo 검정을 제조사의 지침에 따라 사용하였다. RLU는 이 검정에서 AMP 농도와 직접적인 상관관계가 있다. 3-F03은 3-F03 변이체 중에서 최대 억제를 나타냈다(도 23). 변이체 3-F03_417, 3-F03_411 및 3-F03_413은 3-F03과 비교하여 약간 더 낮은 효력을 나타냈다(도 23). 변이체 3-F03_412는 MDA-MB-231세포에서 막 결합 CD73을 억제하지 않았다(도 23).

실시예 23: 항-CD73 항체-처리 종양의 종양 아데노신 수준

종양내 아데노신을 조절하는 HzCL25 및 3-F03의 능력을 생체내에서 평가하여였다. 처리군 당 3마리의 마우스를 이용하여, 인간 CD34+ 재구성 암컷 마우스(29주령; The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)의 왼쪽 옆구리에 마트리겔(Corning Life Sciences)로 현탁된 3 x 10⁶개의MDA-MB-231 세포(ATCC# HTB-26)를 피하 접종했다. 종양이 있는 마우스의 처리는 종양 부피가 약 240 mm³에 도달한 접종 후 10일째에 시작하였다. HzCL25, 3-F03 또는 IgG 이소형 대조군을 인산염완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)에 1mg/ml로 희석하고, 12일째에 10mg/kg의 용량으로 마우스에 복강내 주사하여 투여하고 5일 후 17일째에 다시 투여하였다. 18일째에 마우스를 안락사시키고 종양을 절제하고 극저온관에 넣고 액체 질소에서 급속 동결시켰다.

종양의 아데노신 농도를 결정하기 위해, 동결 조직 시료를 절개하여 박편으로 만들고 80μm 공간 분해능에서 3중으로 정량적 MALDI 질량 분석 이미징(mass spectrometry imaging, MSI)을 수행했다. 조직 박편에서 얻은 MSI 데이터 세트와 대조군 박편에서 발견된 희석 표준 시리즈를 기반으로, 다중 이미징 소프트웨어를 사용하여 선택된 조직 박편에서 아데노신을 정량화했다. 검량 곡선과 획득된 신호 사이의 상관관계를 만들어 각 목적 영역에서 분석물의 농도를 결정하였다. 목적 영역을 포함하는 종양을 연속 박편의 H&E 염색으로 식별하였다.

도 26에 나타낸 바와 같이, HzCL25 또는 3-F03을 이용한 처리로 인해 종양내 아데노신 농도가 각각 35% 및 42% 감소하였다.

실시예 24: 항-CD73 항체에 의한 CD73 효소 억제

재조합 전장 CD73이 사용되고 아데노신 생산이 LCMS에 의해 측정되는 효소 검정을 사용하여 3-F03 및 HzCL25 억제의 분자 기전을 연구하였다. 데이터는 혼합 억제 모델을 사용하여 분석하였고, 3-F03 및 HzCL25 모두에 대한 결과가 표 9에 요약되어 있다.

즉, 작용제의 억제 효력은 기질로서 아데노신 ¹³C₁₀, ¹⁵N₅ 5'-모노포스페이트 나트륨 염 용액(650676, Sigma)과 LC-MS에 의한 검출 생성물인 아데노신을 사용하는 효소 검정에서 측정하였다. 항체 작용제를 완충액에서 연속적으로 희석하고 5 μL의 부피를 96-웰 플레이트로 옮겼다. 검정 완충액(25mM Tris, 5mM MgCl₂, 0.005% Brij35 pH 7.5)에서 0.5pM 재조합 CD73 20 μL를 플레이트에 첨가하고 25℃에서 2시간 동안 사전 배양하였다. 검정은 다양한 농도의 AMP를 포함하는 25μL 용액을 첨가함으로써 개시하였다. 반응은 25°C에서 0.5시간 동안 실행한 후 50 μL의 메탄올로 급랭하였다.

결과는 HzCL25가 0.3±0.2nM의 Ki 값 및 1에 가까운 α 값을 가진 비경쟁적 억제제임을 나타내었다(도 27). 3-F03은 1.5 ± 0.7 nM의 Ki 및 19 ± 12의 α를 가진 혼합 억제제이며, 이러한 수치는 3-F03이 효소 기질보다 유리 효소에 대해 더 높은 친화성을 가지며 경쟁력이 강한 특성을 나타냄을 시사한다(도 28).

또한, HzCL25는 높은 작용제 농도에서 억제 손실이 관찰되는 "후크" 효과를 나타내었다(도 29). 이것은 HzCL25 및 CD73 분자 상호작용의 화학량론이 농도 비율이 변경됨에 따라 변경되어 분자 집단을 억제된 종에서 비억제된 종으로 이동시킨다는 것을 시사한다.

HzCL25 및 3-F03에 대한 동역학 매개변수 요약

작용제	작용 기전	K_i(nM)	α	K_m (uM)
3-F03 IgG	혼합 억제	1.5 ± 0.7	19 ± 12	1.4 ± 0.5
HzCL25 IgG	비경쟁적 억제	0.3 ± 0.2	2.1 ± 1.7	0.9 ± 0.3

기타 구현예

본 발명은 이의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용과 함께 기술된 반면, 전술한 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는, 본 발명의 범주를 예시하려는 것으로 제한하고자 하지 않는다. 다른 양태, 이점, 및 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> INCYTE CORPORATION <120> ANTI-CD73 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 20443-0644WO1 <140> <141> <150> 62/956,847 <151> 2020-01-03 <160> 93 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr 1 5 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Ala Arg Tyr Asp Tyr Leu Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Gln Asp Val Ser Thr Ala 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 81 Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Phe Ser Ala Ser Thr Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 82 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 82 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys 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cgtcatacgg cttcgattac tggggggcgg gaactaccgt gactgtgtcc 360 tccgcctcca ctaagggacc ctcagtgttc ccccttgccc cgagctccaa gagcacttcg 420 ggcggaaccg ctgccctggg ttgcctcgtg aaggattact tccccgagcc tgtgaccgtg 480 tcctggaact ccggggcctt gaccagcgga gtccacacct tcccggccgt gctgcaatca 540 tccggtctgt acagtctgtc ctccgtggtc acggtgccct cgtcctcact ggggactcag 600 acttacatct gtaacgtgaa ccataagcca tcgaacacca aagtcgacaa acgggtggaa 660 cctaagtcat gcgacaagac ccacacgtgc ccaccttgcc ccgcccccga gctcctgggg 720 gggccgagcg tgttcctctt cccgccgaaa ccgaaggaca ccctgatgat ctcgaggact 780 cctgaagtca cttgcgtggt cgtggacgtg tcgcacgagg accccgaagt caagttcaat 840 tggtacgtgg acggagtcga agtgcacaac gctaagacca aaccccgcga ggagcagtac 900 gcaagcacct accgcgttgt cagcgtgctc accgtgctgc atcaggattg gctgaatgga 960 aaggagtaca agtgcaaagt gtccaacaag gccctgcctg caccaattga aaagaccatc 1020 tccaaggcca agggccagcc ccgggagccc caagtctaca ctctgccgcc gtcgagagaa 1080 gaaatgacca agaaccaagt gtccctgact tgtctggtca agggcttcta tccttcggac 1140 atcgcggtgg aatgggagag caacggccag ccggagaaca attacaagac tacgccaccc 1200 gtgctggact ctgacggctc ctttttcctg tattccaagc tcaccgtgga caagagccgc 1260 tggcaacagg gaaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aagccctgca caaccactac 1320 acccagaagt ccctgagctt gtcccctggt 1350 <210> 90 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 90 gacatcgtga tgacccagtc cccggattca ctcgcggtgt ctttggggga gagggcaacc 60 attaactgca aggcctcaca ggatgtgtcc actgctgtcg cctggtacca gcagaagcct 120 gggcagccgc ccaagctgct gatctactcg gcctcctacc gctattccgg agtccccgac 180 cggttctccg gctcgggttc cggaactgat ttcaccctga caatttcgtc gctgcaagcc 240 gaggacgtgg ccgtgtacta ctgccaacag cattacaaca ctccttacac ttttggtggc 300 ggaactaagc tcgagatcaa gcggacggtg gcagctccgt cagtgttcat cttccctcca 360 tcggacgaac agctgaagtc cggcaccgcg tccgtcgtgt gtctgttgaa caacttctac 420 ccgcgggaag ccaaggtcca gtggaaagtc gacaacgcgc tgcagtccgg aaatagccag 480 gaaagcgtga ccgaacagga ctccaaggac agcacctact ccctgagctc aaccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactatga gaagcacaaa gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccaaggc 600 ctgagcagcc cagtgaccaa gtccttcaac cgcggggagt gt 642 <210> 91 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 91 gaagtgcagt tggtggagag cgggggcgga ctggtgcagc cggggggctc gctgcggctg 60 tcctgcgccg cgtccggttt cactttttcg agctacgaca tgcactgggt ccgccaagca 120 ccggggaagg gtctggaatg ggtggccgtg atgtcgtacg acggctccaa caagtactac 180 gccgactccg tgaagggacg gttcaccatc tcccgcgaca acagcaagaa cgccctttac 240 ctccaaatga acagcctgag ggccgaggac acagccgtat actactgcgc gaccgagatc 300 gccgccaagg gggactactg gggtcaaggc actctggtca ccgtgtcctc cgcctccact 360 aagggaccct cagtgttccc ccttgccccg agctccaaga gcacttcggg cggaaccgct 420 gccctgggtt gcctcgtgaa ggattacttc cccgagcctg tgaccgtgtc ctggaactcc 480 ggggccttga ccagcggagt ccacaccttc ccggccgtgc tgcaatcatc cggtctgtac 540 agtctgtcct ccgtggtcac ggtgccctcg tcctcactgg ggactcagac ttacatctgt 600 aacgtgaacc ataagccatc gaacaccaaa gtcgacaaac gggtggaacc taagtcatgc 660 gacaagaccc acacgtgccc accttgcccc gcccccgagc tcctgggggg gccgagcgtg 720 ttcctcttcc cgccgaaacc gaaggacacc ctgatgatct cgaggactcc tgaagtcact 780 tgcgtggtcg tggacgtgtc gcacgaggac cccgaagtca agttcaattg gtacgtggac 840 ggagtcgaag tgcacaacgc taagaccaaa ccccgcgagg agcagtacgc aagcacctac 900 cgcgttgtca gcgtgctcac cgtgctgcat caggattggc tgaatggaaa ggagtacaag 960 tgcaaagtgt ccaacaaggc cctgcctgca ccaattgaaa agaccatctc caaggccaag 1020 ggccagcccc gggagcccca agtctacact ctgccgccgt cgagagaaga aatgaccaag 1080 aaccaagtgt ccctgacttg tctggtcaag ggcttctatc cttcggacat cgcggtggaa 1140 tgggagagca acggccagcc ggagaacaat tacaagacta cgccacccgt gctggactct 1200 gacggctcct ttttcctgta ttccaagctc accgtggaca agagccgctg gcaacaggga 1260 aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgaa gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320 ctgagcttgt cccctggt 1338 <210> 92 <211> 636 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 92 atccagatga ctcagtcccc ttcctcgttg tccgcttccg tgggtgatcg ggtcacaatc 60 acttgccggg ccagccaggg aatttccaac tacctcgcct ggtaccagca gaagcccgga 120 aaggcaccga agctgctgat ctacgccgcg tccactctgc aatccggagt gccttctcgg 180 ttctcgggct cgggaagcgg caccgacttt accctgacca ttagcagcct gcagcccgag 240 gacttcgcaa cctactactg tcagcagtcc tactcaaccc ctcacttcgg acagggtact 300 agactcgaga tcaagaggac tgtggccgcg ccgtcggtgt tcatcttccc accctcggac 360 gagcagctga agtccggcac cgccagcgtg gtctgcctgc tgaacaactt ctatccgcgc 420 gaagccaagg tccagtggaa agtggataat gcgctgcaga gcgggaactc ccaagagtcc 480 gtgacggaac aggactccaa agactccacc tactcactgt catccaccct gaccctgtca 540 aaggccgact acgagaagca taaggtctac gcctgcgaag tgacccacca agggctgagc 600 tcgcccgtga ccaagtcctt caaccggggc gaatgc 636 <210> 93 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 93 gaagtgcagt tggtggagag cgggggcgga ctggtgcagc cggggggctc 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cgcgttgtca gcgtgctcac cgtgctgcat caggattggc tgaatggaaa ggagtacaag 960 tgcaaagtgt ccaacaaggc cctgcctgca ccaattgaaa agaccatctc caaggccaag 1020 ggccagcccc gggagcccca agtctacact ctgccgccgt cgagagaaga aatgaccaag 1080 aaccaagtgt ccctgacttg tctggtcaag ggcttctatc cttcggacat cgcggtggaa 1140 tgggagagca acggccagcc ggagaacaat tacaagacta cgccacccgt gctggactct 1200 gacggctcct ttttcctgta ttccaagctc accgtggaca agagccgctg gcaacaggga 1260 aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgaa gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320 ctgagcttgt cccctggt 1338

Claims

인간 CD73에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 가변 중쇄(variable heavy, VH) 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 도메인을 포함하되:
상기 VH CDR1은 아미노산 서열 GYTFTSYG(서열 번호 1)를 포함하고;
상기 VH CDR2는 아미노산 서열 IYPGSGNT(서열번호 2)를 포함하고;
상기 VH CDR3은 아미노산 서열 ARYDYLGSSYGFDY(서열 번호 3)를 포함하며;
상기 항체는 가변 경쇄(variable light, VL) CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL 도메인을 포함하되:
상기 VL CDR1은 아미노산 서열 QDVSTA(서열번호 4)를 포함하고;
상기 VL CDR2는 아미노산 서열 SAS(서열번호 5)를 포함하며;
상기 VL CDR3은 아미노산 서열 QQHYNTPYT(서열번호 6)를 포함하는, 항체.
제1항에 있어서, 상기 VH 도메인은 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 중쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
제1항에 있어서, 상기 VL 도메인은 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 경쇄를 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
제1항에 있어서, 상기 VH 도메인은 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하고, 상기 VL 도메인은 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한, 항체.
제1항에 있어서, 상기 VH 도메인은 서열번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL 도메인은 서열번호 23에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
인간 CD73에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호 70의 40-53 번 아미노산 내의 에피토프에서 인간 CD73에 결합하는, 항체.
인간 CD73에 결합하며, 인간 CD73에 결합하기 위해 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 가진 항체와 경쟁하는 항체.
제1항, 제9항 또는 제10항에 있어서, 인간화 항체인 항체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이중특이적 항체, 단일쇄 항체, Fab 단편, F(ab')₂ 단편, Fab' 단편, Fsc 단편, Fv 단편, scFv, sc(Fv)₂, 또는 이중체인, 항체.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 상기 항체를 암호화하는 하나의 핵산 또는 핵산들.
프로모터에 작동가능하게 연결된 제13항의 상기 핵산 또는 핵산들을 포함하는 하나의 발현 벡터 또는 발현 벡터들.
제13항의 상기 핵산 또는 핵산들 또는 제14항의 상기 발현 벡터 또는 발현 벡터들을 포함하는 단리된 세포.
프로모터에 작동가능하게 연결된 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 상기 항체의 상기 VH 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 상기 항체의 상기 VL 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 상기 항체를 생산하는 단리된 세포.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 상기 항체를 제조하는 방법으로서, 제15항 또는 제16항의 상기 세포를 배양하는 단계와 상기 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 상기 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
치료를 필요로 하는 인간 대상의 암 치료방법으로서, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 상기 항체의 유효량을 상기 인간 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 암은 높은 아데노신을 특징으로 하는, 방법.
제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 암은 두경부암, 결장직장암, 폐암, 흑색종, 난소암, 방광암, 간암 또는 신세포암종인, 방법.
인간 CD73에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 가변 중쇄(variable heavy, VH) 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 도메인을 포함하되:
상기 VH CDR1은 아미노산 서열 GFTFSSYD(서열 번호 34)를 포함하고;
상기 VH CDR2는 아미노산 서열 MSYDGSNK(서열번호 35) 또는 MSYEGSNK(서열번호 40)를 포함하고;
상기 VH CDR3은 아미노산 서열 ATEIAAKGDY(서열번호 36)를 포함하며;
상기 항체는 가변 경쇄(variable light, VL) CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL 도메인을 포함하되:
상기 VL CDR1은 아미노산 서열 QGISNY(서열번호 37)를 포함하고;
상기 VL CDR2는 아미노산 서열 AAS(서열번호 38)를 포함하며;
상기 VL CDR3은 아미노산 서열 QQSYSTPH(서열번호 39)를 포함하는, 항체.
제23항에 있어서,
상기 VH CDR1은 상기 아미노산 서열 GFTFSSYD(서열 번호 34)를 포함하고;
상기 VH CDR2는 상기 아미노산 서열 MSYDGSNK(서열번호 35)를 포함하고;
상기 VH CDR3은 상기 아미노산 서열 ATEIAAKGDY(서열번호 36)를 포함하고;
상기 VL CDR1은 상기 아미노산 서열 QGISNY(서열번호 37)를 포함하고;
상기 VL CDR2는 상기 아미노산 서열 AAS(서열번호 38)를 포함하고;
상기 VL CDR3은 상기 아미노산 서열 QQSYSTPH(서열번호 39)를 포함하는, 항체.
제24항에 있어서, 상기 VH 도메인은 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
제24항에 있어서, 상기 항체는 중쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
제24항에 있어서, 상기 VL 도메인은 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
제24항에 있어서, 상기 항체는 경쇄를 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
제24항에 있어서, 상기 VH 도메인은 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하고, 상기 VL 도메인은 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한, 항체.
제24항에 있어서, 상기 VH 도메인은 서열번호 62에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
제24항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
제23항에 있어서,
상기 VH CDR1은 상기 아미노산 서열 GFTFSSYD(서열 번호 34)를 포함하고;
상기 VH CDR2는 상기 아미노산 서열 MSYEGSNK(서열번호 40)를 포함하고;
상기 VH CDR3은 상기 아미노산 서열 ATEIAAKGDY(서열번호 36)를 포함하고;
상기 VL CDR1은 상기 아미노산 서열 QGISNY(서열번호 37)를 포함하고;
상기 VL CDR2는 상기 아미노산 서열 AAS(서열번호 38)를 포함하고;
상기 VL CDR3은 상기 아미노산 서열 QQSYSTPH(서열번호 39)를 포함하는, 항체.
제32항에 있어서, 상기 VH 도메인은 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
제32항에 있어서, 상기 항체는 중쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
제32항에 있어서, 상기 VL 도메인은 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
제32항에 있어서, 상기 항체는 경쇄를 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
제32항에 있어서, 상기 VH 도메인은 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하고, 상기 VL 도메인은 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한, 항체.
제32항에 있어서, 상기 VH 도메인은 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL 도메인은 서열번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
제32항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
인간 CD73에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 서열번호 70의 386-399 번 및 470-489번 아미노산 내의 에피토프에서 인간 CD73에 결합하는, 항체.
인간 CD73에 결합하는 항체이며, 인간 CD73에 결합하기 위해 서열번호 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 가진 항체와 경쟁하는 항체.
인간 CD73에 결합하며, 인간 CD73에 결합하기 위해 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 가진 항체와 경쟁하는 항체.
제23항, 제32항, 제40항, 제41항 또는 제42항에 있어서, 인간화 항체인 항체.
제 23항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이중특이적 항체, 단일쇄 항체, Fab 단편, F(ab')₂ 단편, Fab' 단편, Fsc 단편, Fv 단편, scFv, sc(Fv)₂, 또는 이중체인, 항체.
제23항 내지 제44항 중 어느 한 항의 상기 항체를 암호화하는 하나의 핵산 또는 핵산들.
프로모터에 작동가능하게 연결된 제45항의 상기 핵산 또는 핵산들을 포함하는 하나의 발현 벡터 또는 발현 벡터들.
제45항의 상기 핵산 또는 핵산들 또는 제46항의 상기 발현 벡터 또는 발현 벡터들을 포함하는 단리된 세포.
프로모터에 작동가능하게 연결된 제23항 내지 제44항 중 어느 한 항의 상기 항체의 상기 VH 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 제23항 내지 제44항 중 어느 한 항의 상기 항체의 상기 VL 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포.
제23항 내지 제44항 중 어느 한 항의 상기 항체를 생산하는 단리된 세포.
제47항 또는 제48항의 상기 세포를 배양하는 단계와 상기 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 제23항 내지 제44항 중 어느 한 항의 상기 항체를 제조하는 방법.
제23항 내지 제44항 중 어느 한 항의 상기 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
치료를 필요로 하는 인간 대상의 암 치료방법으로서, 제23항 내지 제44항 중 어느 한 항의 상기 항체의 유효량을 상기 인간 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제52항에 있어서, 상기 암은 높은 아데노신을 특징으로 하는, 방법.
제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 암은 두경부암, 결장직장암, 폐암, 흑색종, 난소암, 방광암, 간암 또는 신세포암종인, 방법.