KR20220114531A - 재발성 호흡기 유두종증을 위한 개선된 백신 및 이를 사용하는 방법 - Google Patents

Abstract

RRP의 치료 및 예방을 위해 항-HPV 면역원 및 이를 인코딩하는 핵산 분자의 사용이 개시되어 있다. 약제학적 조성물, DNA 플라스미드를 포함하는 재조합 백신 및 약독화 생백신뿐만 아니라, RRP를 치료 또는 예방하기 위해 면역 반응을 유도하는 방법이 개시되어 있다.

Description

재발성 호흡기 유두종증을 위한 개선된 백신 및 이를 사용하는 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 10월 24일자로 출원된 미국 가출원 제62/925,283호를 우선권으로 주장하고, 이의 혜택을 청구하며, 이러한 문헌은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.

본 발명의 분야

본 발명은 개선된 인간 유두종바이러스(HPV) 백신, 면역 반응을 유도하기 위한 개선된 방법, 및 재발성 호흡기 유두종증(RRP)에 대해 개체를 예방학적으로 그리고/또는 치료학적으로 면역화하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다.

인간 유두종 바이러스 관련(HPV+) 악성 종양은 최근 발생하는 세계적인 전염병이다(Gradishar et al., Journal of the National Comprehensive Cancer Network: JNCCN. 2014;12(4):542-90.). HPV 관련 호흡 소화 전암성 병변 및 악성 종양은 인두, 후두 및 상기도에서 발생할 수 있다. 대부분의 호흡 소화 악성 종양의 병인학에서 HPV6의 역할이 불분명하지만, 이의 역할은 재발성 호흡기 유두종증(RRP)에 인과관계가 있는 것으로 널리 받아들여지고 있으며(Mounts et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1982;79(17):5425-9; Gissmann et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1983;80(2):560-3; Bonagura et al., APMIS. 2010;118(6-7):455-70), 이는 후두 상피의 가장 일반적인 양성 종양이다. RRP는 드물며, 발병률은 미국 성인 100,000명 당 1.8명으로 추정된다(Winton et al., The New England journal of medicine. 2005;352(25):2589-97). 대부분의 병변이 양성이지만, 일부는 악성으로 변하며, RRP를 갖는 환자는 후두 종양 형성 및 암종 발병 위험이 더 높다(Omland et al., PloS one. 2014;9(6):e99114).

RRP의 임상 과정은 영향을 받은 개체에 따라 크게 달라질 수 있다. 치료, 수술, 방사선 요법, 또는 조합 없이 능동적인 모니터링을 포함하는, 치료 선택은 여러 인자에 따라 달라진다. 대개, 증상 관리를 위해 유두종의 반복적인 외과적 제거는 치료의 핵심으로 남아 있다(Derkay et al., Otolaryngol Clin North Am. 2019;52(4):669-79). 몇몇의 경우에, 악성 변형이 일어날 수 있으며, 이는 대개 암울한 예후와 관련이 있다. 악성 질환을 갖는 몇몇 이러한 환자는 잠재적으로 최종 수술을 포함하는, 구제 요법을 위한 후보일 수 있다(Richey et al., Otolaryngology--head and neck surgery: official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 2007;136(1):98-103). 이러한 환경에서 선택된 환자는 방사선으로부터 이점을 얻을 수 있지만, 이러한 방식의 이환율이 상당하다(Mendenhall et al., American journal of clinical oncology. 2008;31(4):393-8). 최근에, RRP를 갖는 환자에서 펨브롤리주맙의 II상 연구에서는 43%의 반응률이 입증되었고, RRP의 면역치료적 관리에 대한 근거를 지지한다(Pai et al., Journal of Clinical Oncology. 2019;37(15_suppl):2502).

이에 따라, 당해 분야에서 RRP의 치료 또는 예방을 위한 개선된 조성물 및 방법이 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 미충족 요구를 충족시킨다.

본 발명의 양태는 HPV6 E6-E7 융합 항원을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물, 및 RRP의 치료 또는 예방을 위한 이의 용도를 제공한다.

다른 양태는 서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 HPV6 E6-E7 융합 항원을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, HPV6 E6-E7 융합 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 5' 단부에 서열번호 4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 리더 서열이 없다.

본 발명의 다른 양태에서, 서열번호 1; 서열번호 1과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 1의 단편; 서열번호 1의 단편과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 HPV6 E6-E7 융합 항원을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, HPV6 E6-E7 융합 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 5' 단부에 서열번호 3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 리더 서열이 없다.

제공되는 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드일 수 있다.

추가적인 양태에서, 개시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

일부 양태에서, 개체에서 효과적인 면역 반응을 유도함으로써 개체에서 RRP를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 개체에, 제공되는 뉴클레오타이드들 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 있다. 본 방법은 바람직하게는, 제공된 뉴클레오타이드 서열을 전기천공에 의해 개체에 도입하는 단계를 포함한다.

일부 양태에서, 본 방법은 개체에, 애주번트를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 본 방법은 개체에, IL-12를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 방법은 개체에, IL-12의 p35 및 p40 서브유닛 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 추가로 포함한다.

일부 양태에서, 본 방법은 개체에, IL-12의 p35 및 p40 서브유닛 중 하나 이상을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, p35를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 및 서열번호 6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, p40을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 및 서열번호 8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

도 1: HPV6 E6 및 HPV6 E7 SynCon 항원의 비교 3D 모델. E6은 모노머로서 모델링되며, E7의 정렬된 C-말단 영역은 호모다이머로서 모델링된다. 무질서한 N-말단이 도면에 표시되어 있다. 둘 모두는 측쇄 및 투명한 용매-접근 가능한 표면을 갖는 리본 포맷으로 시각화된다. 두 모델 모두에서 징크 핑거 모티프는 주석이 달려 있다.
도 2: 인터페론 감마는 RRP 환자에서 HPV6 E6 및 HPV6 E7 특이적 T 세포에 의해 생성된다. 대상체 603(상부 패널) 및 604(하부 패널)는 본 연구에 걸쳐 종단적으로 ELISpot 검정에서 인터페론 감마를 생성하는 능력에 대해 추적되었다. E6 특이적 활성은 청색 점선으로 표시되며, E7 특이적 활성은 청색 실선으로 표시되며, 두 항원 모두의 합은 검정색 실선으로 표시된다. 장기 추적 관찰(LTFU) 시점은 투여 4의 완료 후 시간에 대해 기록되고 기술된다.
도 3: INO-3106은 RRP 환자에서 HPV6-특이적 세포독성 림프구 세포를 활성화한다. 유세포분석은 면역요법 전 및 후에 대상체로부터 채취한 HPV6-특이적 CD8+ T 세포에 대한 활성화 마커 발현을 평가하기 위해 수행되었다. 환자 604에서 INO-3106으로의 치료 전(상부 패널) 및 후(하부 패널) CD137 및 CD38의 발현은 좌측 컬럼에 기록된다. 환자 604에서 INO-3106으로의 치료 전(상부 패널) 및 후(하부 패널) Ki67 및 CD69의 발현은 우측 컬럼에 기록된다.
도 4a 및 도 4b: 면역 유전자 전사체는 INO-3106으로의 치료 후 HPV6 특이적 방식으로 차등적으로 조절된다. 백신접종 전 및 후 자극된 세포 대 비자극된 세포에서 차등적으로 발현된 유전자의 배수 차이를 나타낸 히트 맵. (도 4a) 24시간 동안 배지 단독에 대한 펩타이드 풀로 자극된 세포에서 유전자 발현의 배수 변화(≥2배). (도 4b) 11일의 T 세포 확대 후, 24시간 동안 배지 단독에 대한 펩타이드 풀로 세포의 재자극 후 유전자 발현의 배수 변화(≥2배). 데이터는 log2 배수 변화로 변환되며, 적색은 상향조절을 나타내며, 녹색은 하향조절을 나타낸다.
도 5: INO-3106으로 RRP 환자의 치료는 수술을 회피할 수 있는 형태의 임상적 이점을 부여한다. 상단 패널 - 대상체 604 및 603이 수술을 받지 않은 일 단위의 시간 길이를 나타내는 스위머 플롯(Swimmer plot). 적색 점선은 수술 시점이 INO-3106으로의 개입 이전의 종래 수술 빈도를 기반으로 예상됨을 나타낸다. Φ는 대상체 604가 수술을 필요하는 시점을 나타낸다. λ는 명시된 시점까지 대상체 603이 수술을 받지 않음을 나타낸다. 하단 좌측 패널 - 녹색 막대는 좌측 y축으로 추적되고, CD38, Ki67, 그랜자임 A, 그랜자임 B 및 퍼포린을 발현시키는 HPV6-특이적 CD8+ T 세포의 크기를 나타낸다. 청색 막대는 우측 y-축으로 추적되고, 이러한 대상체에 대한 예상된 수술 빈도에 대한 수술받지 않는 시간의 배수-변화를 나타낸다. 하단 우측 - 차트는 INO-3106으로의 치료 후 이러한 대상체에 의해 경험된, 환자 ID, 수술 부재 시간에 배수 증가, 총 수술 부재 시간 및 수술 부재 시간의 증가를 나타낸다.
도 6은 대상체 601에 대한 HPV6 E6 및 E7 세포 면역 반응을 평가하는 실험 결과를 도시한 것이다.

정의.

본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 기술하기 위한 목적이고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥이 달리 명확하게 기술하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.

본 명세서의 수치 범위의 설명을 위하여, 동일한 정밀도를 갖는 이들 사이에 있는 각 개재 숫자가 명백하게 고려된다. 예를 들어, 6 내지 9의 범위의 경우에, 6 및 9 이외에 숫자 7 및 8이 고려되며, 범위 6.0 내지 7.0의 범위의 경우에, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6,9, 및 7.0이 명백하게 고려된다.

a. 애주번트

본 명세서에서 사용되는 "애주번트"는 하기에 기술되는 핵산 서열을 인코딩하고 DNA 플라스미드에 의해 인코딩된 하나 이상의 항원의 항원성을 향상시키기 위해 본 명세서에 기술된 DNA 플라스미드 백신에 첨가된 임의의 분자를 의미할 수 있다.

b. 항체

"항체"는 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE, 또는 단편의 항체, Fab, F(ab')2, Fd 및 단쇄 항체, 이중체, 이중특이성 항체, 이작용성 항체 및 이의 유도체를 포함하는 이의 단편 또는 유도체를 의미할 수 있다. 항체는 원하는 에피토프 또는 이로부터 유도된 서열에 대한 충분한 결합 특이성을 나타내는 포유동물의 혈청 샘플로부터 단리된 항체, 다클론성 항체, 친화력 정제된 항체, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

c. 항원

"항원"은 HPV E6 또는 HPV E7 도메인 및 바람직하게는, 이들 사이에 내단백질분해 절단 부위를 갖는 E6 및 E7 융합을 갖는 단백질을 지칭한다. 항원은 서열번호 2(서브타입 6); 본 명세서에 기술된 길이의 이의 단편, 변이체, 즉, 본 명세서에 기술된 서열번호 2와 상동성인 서열을 갖는 단백질, 본 명세서에 기술된 길이를 갖는 변이체의 단편, 및 이들의 조합을 포함한다. 항원은 서열번호 4의 IgE 리더 서열을 가질 수 있거나, 대안적으로, N-말단 단부로부터 제거된 이러한 서열을 가질 수 있다. 항원은 선택적으로, 다른 단백질로부터의 것과 같은 신호 펩타이드를 포함할 수 있다.

d. 코딩 서열

본 명세서에서 사용되는 "코딩 서열" 또는 "인코딩 핵산"은 섹션 c에 기술된 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산(RNA 또는 DNA 분자)을 지칭하는 것을 의미할 수 있다. 코딩 서열은 핵산이 투여되는 개체 또는 포유동물의 세포에서 발현을 유도할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 추가로 포함할 수 있다. 코딩 서열은 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열, 예를 들어, IgE 리더 서열, 예를 들어, 서열번호 3을 추가로 포함할 수 있다.

e. 보체

본 명세서에서 사용되는 "보체" 또는 "상보적"은 핵산 분자의 뉴클레오타이드들 또는 뉴클레오타이드 유사체들 간의 왓슨-클릭(예를 들어, A-T/U 및 C-G) 또는 후그스틴 염기 쌍형성을 의미할 수 있는 핵산을 의미할 수 있다.

f. 단편

"단편"은 항원에 대한 포유동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 항원의 폴리펩타이드 단편을 의미할 수 있다. 항원의 단편은 각 경우에 위치 1에 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 갖거나 가지지 않은, N 및/또는 C 말단으로부터 적어도 하나의 아미노산을 누락함을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은 첨가된 임의의 이종 신호 펩타이드를 제외하고, 특정 전장 항원의 길이의 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상을 포함할 수 있다. 단편은 바람직하게는, 항원과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상동성인 폴리펩타이드의 단편을 포함할 수 있고, 추가적으로, 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않는 N-말단 메티오닌 또는 이종 신호 펩타이드를 추가적으로 포함할 수 있다. 단편은 N-말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드, 예를 들어, 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. N-말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드는 항원의 단편에 연결될 수 있다.

항원을 인코딩하는 핵산 서열의 단편은 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 인코딩하는 서열을 갖거나 가지지 않은, 5' 및/또는 3' 단부로부터 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 누락하는 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은 첨가된 임의의 이종 신호 펩타이드를 제외하고, 특정 전장 코딩 서열의 길이의 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상을 포함할 수 있다. 단편은 바람직하게는, 항원과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상동성인 폴리펩타이드를 인코딩하는 단편을 포함할 수 있고, 추가적으로 선택적으로 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않은 N-말단 메티오닌 또는 이종 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있으며, 단편은 N-말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드, 예를 들어, 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. N-말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열은 코딩 서열의 단편에 연결될 수 있다.

g. 동일한

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 본 명세서에서 사용되는 "동일한" 또는 "동일성"은 서열이 특정 영역에서 동일한 잔기의 특정 백분율을 가짐을 의미할 수 있다. 백분율은 2개의 서열을 최적으로 정렬하고, 특정 영역에 대해 2개의 서열을 비교하고, 매칭된 위치의 수를 산출하기 위해 동일한 잔기가 두 서열 모두에서 발생하는 위치의 번호를 결정하고, 매칭된 위치의 수를 특정 영역에서 위치의 총 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 2개의 서열이 상이한 길이를 가지고 정렬이 하나 이상의 엇갈린 단부를 생성하고 비교의 특정 영역이 단지 단일 서열을 포함하는 경우에, 단일 서열의 잔기는 분모에 포함되지만, 계산의 분자에는 포함되지 않는다. DNA 및 RNA를 비교할 때, 티민(T) 및 우라실(U)은 동일한 것으로 간주될 수 있다. 동일성은 BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 시퀀스 알고리즘을 이용함으로써 또는 수동으로 수행될 수 있다.

h. 면역 반응

본 명세서에서 사용되는 "면역 반응"은 제공된 DNA 플라스미드 백신을 통한 하나 이상의 항원의 도입에 대한 반응으로, 숙주의 면역 체계, 예를 들어, 포유동물의 면역 체계의 활성화를 의미할 수 있다. 면역 반응은 세포 또는 체액성 반응, 또는 둘 모두의 형태일 수 있다.

i. 핵산

본 명세서에서 사용되는 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 함께 공유 결합된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 의미할 수 있다. 단일 가닥의 묘사는 또한, 상보적 가닥의 서열을 규정한다. 이에 따라, 핵산은 또한, 묘사된 단일 가닥의 상보적 가닥을 포함한다. 핵산의 여러 변이체는 제공된 핵산과 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다. 이에 따라, 핵산은 또한, 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 보체를 포함한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 대해 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 이에 따라, 핵산은 또한, 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 프로브를 포함한다.

핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 이중 가닥 서열 및 단일 가닥 서열 둘 모두의 부분을 함유할 수 있다. 핵산은 게놈 및 cDNA 둘 모두인 DNA, RNA 또는 하이브리드일 수 있으며, 여기서, 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오타이드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이폭산틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 포함하는 염기들의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법에 의해 또는 재조합 방법에 의해 얻어질 수 있다.

j. 작동 가능하게 연결된

본 명세서에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된"은 유전자의 발현이 공간적으로 연결된 프로모터의 조절 하에 있음을 의미할 수 있다. 프로모터는 이의 조절 하에서 유전자의 5'(업스트림) 또는 3'(다운스트림)에 정위될 수 있다. 프로모터와 유전자 간의 거리는 프로모터와 그 프로모터가 유래한 유전자에서 그것이 조절하는 유전자 간의 거리와 대략 동일할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 이러한 거리의 변화는 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.

k. 프로모터

본 명세서에서 사용되는 "프로모터"는 세포에서 핵산의 발현을 부여, 활성화 또는 향상시킬 수 있는 합성 또는 천연-유래 분자를 의미할 수 있다. 프로모터는 발현을 더욱 향상시키고/시키거나 공간적 발현 및/또는 이의 일시 발현을 변경하기 위해 하나 이상의 특정 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한, 말단 인핸서(enhancer) 또는 억제자 요소를 포함할 수 있으며, 이는 전사의 출발 부위로부터 수천 개의 염기쌍만큼 많이 위치될 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충, 및 동물을 포함하는 소스로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 장기와 관련하여, 또는 발현이 일어나는 발달 단계와 관련하여, 또는 생리학적 스트레스, 병원체, 금속 이온 또는 유도제와 같은 외부 자극에 반응하여, 본질적으로, 또는 차등적으로, 유전자 성분의 발현을 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예는 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 작동자-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터를 포함한다.

l. 엄격한 혼성화 조건

본 명세서에서 사용되는 "엄격한 혼성화 조건"은 핵산의 복합 혼합물에서와 같이, 제1 핵산 서열(예를 들어, 프로브)이 제2 핵산 서열(예를 들어, 표적)과 혼성화하는 조건을 의미할 수 있다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 상이한 환경 하에서 상이할 것이다. 엄격한 조건은 규정된 이온 세기 pH에서 특정 서열에 대한 열적 융점(Tm)보다 약 5 내지 10℃ 더 낮은 것으로 선택될 수 있다. Tm은 표적에 대해 상보적인 프로브 중 50%가 평형 상태(표적 서열이 과량으로 존재할 때, Tm에서, 프로브의 50%는 평형상태에서 점유됨)에서 표적 서열과 혼성화하는 온도(규정된 이온 세기, pH 및 핵 농도 하)일 수 있다. 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 예를 들어, 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이며 온도가 짧은 프로브(예를 들어, 약 10 내지 50개의 뉴클레오타이드)에 대해 적어도 약 30℃ 및 긴 프로브(예를 들어, 약 50개 초과의 뉴클레오타이드)에 대해 적어도 약 60℃인 조건일 수 있다. 엄격한 조건은 또한, 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 포지티브 신호는 백그라운드 혼성화의 적어도 2 내지 10배일 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 하기를 포함한다: 50% 포름아미드, 5x SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션함, 또는 5x SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션함, 65℃에서 0.2x SSC, 및 0.1% SDS 세척함.

m. 실질적으로 상보적인

본 명세서에서 사용되는 "실질적으로 상보적인"은 제1 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 영역에 대해 제2 서열의 보체와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 2개의 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화함을 의미할 수 있다.

n. 실질적으로 동일한

본 명세서에서 사용되는 "실질적으로 동일한"은 제1 서열 및 제2 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐 또는 핵산과 관련하여 제1 서열이 제2 서열의 보체와 실질적으로 상보적인 경우 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 것임을 의미할 수 있다.

o. 변이체

핵산과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "변이체"는 (i) 언급된 뉴클레오타이드 서열의 부분 또는 단편; (ii) 언급된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 부분의 보체; (iii) 언급된 핵산 또는 이의 보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 엄격한 조건 하에서 언급된 핵산, 이의 보체, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열과 혼성화하는 핵산을 의미할 수 있다.

펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대한 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열에서 상이하지만, 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유한다. 변이체는 또한, 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 언급된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉, 아미노산을 유사한 특성(예를 들어, 하전된 영역의 친수성, 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 대체하는 것은 소폭 변화와 통상적으로 관련된 당해 분야에서 인식되어 있다. 이러한 소폭 변화는 부분적으로, 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 아미노산의 소수성 지수를 고려함으로써 식별될 수 있다(Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)). 아미노산의 소수성 지수는 이의 소수성 및 전하의 고려에 기초를 둔다. 유사한 소수성 지수의 아미노산이 치환되고 여전히 단백질 기능을 보유할 수 있다는 것이 당해 분야에 공지되어 있다. 일 양태에서, ±2의 소수성 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한, 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 초래하는 치환을 밝히기 위해 사용될 수 있다. 펩타이드의 맥락에서 아미노산의 친수성의 고려는 그러한 펩타이드의 가장 큰 지역적 평균 친수성의 계산, 항원성 및 면역원성과 잘 연관되어 있다고 보고된 유용한 측정을 허용한다. 미국 특허 제4,554,101호(이러한 문헌 전부는 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 생물학적 활성, 예를 들어, 면역원성을 보유하는 펩타이드를 야기시킬 수 있다. 치환은 서로 ±2 내의 친수성 값을 갖는 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값 둘 모두는 그러한 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 그러한 관찰과 일치하게, 생물학적 기능과 양립 가능한 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 전하, 크기, 및 다른 특성에 의해 밝혀진 바와 같이, 그러한 아미노산, 및 특히, 그러한 아미노산의 측쇄의 상대적 유사성에 의존하는 것으로 이해된다.

p. 벡터

본 명세서에서 사용되는 "벡터"는 복제 개시점을 함유한 핵산 서열을 의미할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가-복제성 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈으로 통합되는 벡터 중 어느 하나일 수 있다.

면역원에 의해 유도된 세포 면역 반응을 향상시키기 위한 다단계 전략으로부터 발생하는 개선된 백신이 개시된다. 변형된 공통 서열이 생성되었다. 코돈 최적화, RNA 최적화, 및 고효율 면역글로불린 리더 서열의 첨가를 포함하는 유전학적 변형이 또한 개시된다. 신규한 작제물은 상응하는 코돈 최적화된 면역원에 비해 더 강력하고 더 넓은 세포 면역 반응을 유도하도록 설계되었다.

개선된 HPV 백신은 RRP에 대한 예방적 또는 치료적 전략을 매개하도록, 면역원으로서 특히 효과적으로 만드는 단백질 및 에피토프와 함께 단백질을 인코딩하는 유전적 작제물을 기반으로 하고 있다. 이에 따라, 백신은 치료적 또는 예방적 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역원을 전달하는 수단은 DNA 백신, 재조합 백신, 단백질 서브유닛 백신, 면역원을 포함하는 조성물, 약독화 백신 또는 사균 백신이다. 일부 실시형태에서, 백신은 하나 이상의 DNA 백신, 하나 이상의 재조합 백신, 하나 이상의 단백질 서브유닛 백신, 면역원을 포함하는 하나 이상의 조성물, 하나 이상의 약독화 백신 및 하나 이상의 사균 백신으로 이루어진 군으로부터 선택된 조합물을 포함한다.

일부 실시형태에 따르면, 백신은 개체의 면역 체계의 활성을 조절하고 이에 의해 HPV에 대한 면역 반응을 향상시켜 RRP를 치료하기 위해 개체에 전달된다. 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 개체의 세포에 의해 흡수될 때, 뉴클레오타이드 서열은 세포에서 발현되며, 이에 의해, 단백질은 개체로 전달된다. 재조합 백신으로서 및 약독화 백신의 부분으로서, 단백질 또는 벡터의 단백질 부분으로서 플라스미드와 같은 핵산 분자 상의 단백질의 코딩 서열을 전달하는 방법이 제공된다.

개체에서 RRP에 대한 예방적 및/또는 치료적 치료를 제공하는 조성물 및 방법이 제공된다.

면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 전달하기 위한 조성물은 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 조성물은 면역원을 인코딩하는 플라스미드, 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 백신, 본 발명의 단백질을 인코딩하는 약독화 생병원체를 포함할 수 있고/있거나, 본 발명의 단백질을 포함하며; 사균 병원체는 본 발명의 단백질; 또는 본 발명의 단백질을 포함하는 리포솜 또는 서브유닛 백신과 같은 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한, 조성물을 포함하는 주사 가능한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 양태는 HPV6 E6-E7 융합 항원을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.

다른 양태는 서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 HPV6 E6-E7 융합 항원을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.

일부 실시형태에서, 조성물은 서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 HPV6 E6-E7 융합 항원을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에서, 서열번호 1; 서열번호 1과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 1의 단편; 서열번호 1의 단편과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 HPV6 E6-E7 융합 항원을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물이 제공된다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 뉴클레오타이드 서열은 리더 서열이 존재하지 않는다. 일 실시형태에서, HPV6 E6-E7 융합 항원을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 리더 서열이 존재하지 않는다. 특히, 서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HPV6 E6-E7 융합 항원은 5' 단부에 리더 서열, 예를 들어, 서열번호 4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 존재하지 않는다. 특히, 뉴클레오타이드 서열 서열번호 1을 포함하는 HPV6 E6-E7 융합 항원은 5' 단부에 리더 서열, 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 서열번호 3이 존재하지 않는다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 제공된 뉴클레오타이드 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 바람직하게는, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%; 또는 98% 또는 99% 상동성일 수 있다.

제공된 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드, 바이러스 벡터, 지질 벡터, 나노입자; 바람직하게는, 플라스미드를 포함하는, 다양한 공지된 벡터 또는 전달 시스템 중 하나에 포함될 수 있다.

추가적인 양태에서, 개시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

일부 양태에서, 하나 초과의 서브타입의 HPV에 대해 개체에서 효과적인 면역 반응을 유도하고 이에 의해 RRP에 대해 예방적 또는 치료적 치료를 제공하는 방법으로서, 상기 개체에, 제공된 뉴클레오타이드 서열들 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 바람직하게는, 조성물은 하나 초과의 항원을 갖는 방법이 존재한다. 방법은 바람직하게는, 전기천공에 의해 개체에 제공된 뉴클레오타이드 서열을 도입하는 단계를 포함한다.

서열번호 1은 HPV6 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호 1은 서열번호 1의 5' 단부에서 뉴클레오타이드 서열에 연결된 IgE 리더 서열 서열번호 3을 포함한다. 서열번호 2는 HPV6 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 2는 공통 면역원 서열의 N-말단 단부에서 IgE 리더 서열 서열번호 4를 포함한다. IgE 리더 서열은 서열번호 4이고, 서열번호 3에 의해 인코딩될 수 있다. HPV6 E6-E7 융합 항원과 관련한 추가 정보는 적어도 미국 특허 제9,050,287호에서 확인될 수 있으며, 이러한 문헌은 전문이 참고로 포함된다.

일부 실시형태에서, 백신은 서열번호 2, 또는 서열번호 2를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

서열번호 2의 단편은 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 갖거나 또는 가지지 않은, N 및/또는 C 말단으로부터 적어도 하나의 아미노산을 누락하는 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 서열번호 2의 단편은 첨가된 임의의 이종 신호 펩타이드를 배제하고, 서열번호 2의 전장 길이의 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상을 포함할 수 있다. 단편은 바람직하게는, 서열번호 2와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상동성인 서열번호 2의 단편을 포함할 수 있고, 추가적으로, 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않는 N-말단 메티오닌 또는 이종 신호 펩타이드를 추가적으로 포함할 수 있다. 단편은 N-말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드, 예를 들어, 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. N-말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드는 단편에 연결될 수 있다.

핵산 서열 서열번호 1의 단편은 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 인코딩하는 서열을 갖거나 또는 가지지 않은, 5' 및/또는 3' 단부로부터 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 누락하는 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은 첨가된 임의의 이종 신호 펩타이드를 배제하고, 전장 코딩 서열 서열번호 1의 길이의 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상을 포함할 수 있다. 단편은 바람직하게는, 항원 서열번호 2와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상동성인 폴리펩타이드를 인코딩하는 단편을 포함하고 추가적으로 선택적으로, 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않는 N-말단 메티오닌 또는 이종 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 단편은 N-말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드, 예를 들어, 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. N-말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열은 단편에 연결될 수 있다.

일부 실시형태에서, 서열번호 1의 단편은 786개 이상의 뉴클레오타이드 일부 실시형태에서, 830개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 실시형태에서, 856개 이상의 뉴클레오타이드; 및 일부 실시형태에서, 865개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열번호 1의 단편, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 것은 IgE 리더 서열을 위한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열번호 1의 단편은 IgE 리더 서열을 위한 코딩 서열을 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 서열번호 2의 단편은 252개 이상의 아미노산; 일부 실시형태에서, 266개 이상의 아미노산; 일부 실시형태에서, 275개 이상의 아미노산; 및 일부 실시형태에서, 278개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.

일 실시형태에서, HPV6 E6-E7 면역원 또는 HPV6 E6-E7 면역원을 인코딩하는 핵산 분자는 IL-12와 조합하여 투여된다. 일 실시형태에서, IL-12는 합성 DNA 플라스미드로부터 인코딩된다.

일부 실시형태에서, 방법은 IL-12의 p35 및/또는 p40 서브유닛을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

서열번호 5는 IL-12의 p35 서브유닛을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호 6은 IL-12의 p35 서브유닛을 위한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 백신은 서열번호 6, 또는 서열번호 6을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

서열번호 6의 단편은 각 경우에 위치 1에서 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 갖거나 가지지 않은, N 및/또는 C 말단으로부터 적어도 하나의 아미노산을 누락하는 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 서열번호 6의 단편은 첨가된 임의의 이종 신호 펩타이드를 배제하고, 전장 서열번호 6의 길이의 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상을 포함할 수 있다. 단편은 바람직하게는, 서열번호 6과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상동성인 서열번호 6의 단편을 포함할 수 있고, 추가적으로, 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않는 N-말단 메티오닌 또는 이종 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 단편은 N-말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드, 예를 들어, 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. N-말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드는 단편에 연결될 수 있다.

핵산 서열 서열번호 5의 단편은 각 경우에 위치 1에 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 인코딩하는 서열을 갖거나 가지지 않은, 5' 및/또는 3' 단부로부터의 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 누락하는 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은 첨가된 임의의 이종 신호 펩타이드를 배제하는, 전장 코딩 서열 서열번호 5의 길이의 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상을 포함할 수 있다. 단편은 바람직하게는, 항원 서열번호 6과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상동성인 폴리펩타이드를 인코딩하는 단편을 포함할 수 있고, 추가적으로, 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않는 N-말단 메티오닌 또는 이종 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열을 선택적으로 포함할 수 있다. 단편은 N-말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드, 예를 들어, 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 위한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. N-말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열은 단편에 연결될 수 있다.

일부 실시형태에서, 서열번호 5의 단편은 500개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 실시형태에서, 550개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 실시형태에서, 600개 이상의 뉴클레오타이드; 및 일부 실시형태에서, 630개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5의 단편, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 것은 IgE 리더 서열을 위한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5의 단편은 IgE 리더 서열을 위한 코딩 서열을 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 서열번호 6의 단편은 150개 이상의 아미노산; 일부 실시형태에서, 175개 이상의 아미노산; 일부 실시형태에서, 200개 이상의 아미노산; 및 일부 실시형태에서, 210개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.

서열번호 7은 IL-12의 p40 서브유닛을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호 8은 IL-12의 p35 서브유닛을 위한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 백신은 서열번호 8, 또는 서열번호 8을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

서열번호 8의 단편은 각 경우에 위치 1에 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 갖거나 가지지 않은 N 및/또는 C 말단으로부터의 적어도 하나의 아미노산을 누락하는 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 서열번호 8의 단편은 첨가된 임의의 이종 신호 펩타이드를 배제하고 전장 서열번호 8의 길이의 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상을 포함할 수 있다. 단편은 바람직하게는, 서열번호 8과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상동성인 서열번호 8의 단편을 포함할 수 있고, 추가적으로, 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않는 N-말단 메티오닌 또는 이종 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 단편은 N-말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드, 예를 들어, 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. N-말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드는 단편에 연결될 수 있다.

핵산 서열 서열번호 7의 단편은 각 경우에 위치 1에 신호 펩타이드 및/또는 메티오닌을 인코딩하는 서열을 갖거나 가지지 않은, 5' 및/또는 3' 단부로부터의 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 누락하는 것을 제외하고 전장과 100% 동일할 수 있다. 단편은 첨가된 임의의 이종 신호 펩타이드를 배제하고, 전장 코딩 서열 서열번호 7의 길이의 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상을 포함할 수 있다. 단편은 바람직하게는, 항원 서열번호 8과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상동성인 폴리펩타이드를 인코딩하는 단편을 포함할 수 있고, 추가적으로, 퍼센트 상동성을 계산할 때 포함되지 않은 N-말단 메티오닌 또는 이종 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열을 선택적으로 포함할 수 있다. 단편은 N-말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드, 예를 들어, 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 위한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. N-말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열은 단편에 연결될 수 있다.

일부 실시형태에서, 서열번호 7의 단편은 850개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 실시형태에서, 900개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 실시형태에서, 930개 이상의 뉴클레오타이드; 및 일부 실시형태에서, 960개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열번호 7의 단편, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 것은 IgE 리더 서열을 위한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열번호 7의 단편은 IgE 리더 서열을 위한 코딩 서열을 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 서열번호 8의 단편은 250개 이상의 아미노산; 일부 실시형태에서, 275개 이상의 아미노산; 일부 실시형태에서, 300개 이상의 아미노산; 및 일부 실시형태에서, 315개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 방법은 (a) 본 명세서에 개시된 HPV6 항원(예를 들어, HPV6 E6-E7 융합 항원)을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물 및 (b) 본 명세서에 개시된 하나 이상의 IL-12 서브유닛(예를 들어, p35 및/또는 p40)을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물의 동시 투여를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 명세서에 개시된 HPV6 항원(예를 들어, HPV6 E6-E7 융합 항원)을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물의 사전 투여 후 본 명세서에 개시된 하나 이상의 IL-12 서브유닛(예를 들어, p35 및/또는 p40)을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 IL-12 서브유닛(예를 들어, p35 및/또는 p40)을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물의 사전 투여 후 본 명세서에 개시된 HPV6 항원(예를 들어, HPV6 E6-E7 융합 항원)을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

HPV에 대한 개체에서의 면역 반응을 유도함으로써 대상체에서 RRP를 치료 또는 예방하는 방법은 상기 개체에 본 명세서에 제공된 핵산 서열을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 또한, 전기천공에 의해 개체에 핵산 서열을 도입하는 것을 포함한다.

일부 양태에서, HPV에 대한 개체에서의 면역 반응을 유도함으로써 대상체에서 RRP를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 개체에, 본 명세서에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법이 존재한다. 일부 실시형태에서, 방법은 또한, 전기천공에 의해 개체에 아미노산 서열을 도입하는 것을 포함한다.

개선된 백신은 항-HPV 면역 반응이 유도될 수 있는 면역원으로서 특히 효과적이게 만드는 단백질 및 에피토프를 갖는 단백질을 인코딩하는 유전적 작제물을 포함한다. 이에 따라, 백신은 치료적 또는 예방적 면역 반응을 유도하기 위해 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역원을 전달하는 수단은 DNA 백신, 재조합 백신, 단백질 서브유닛 백신, 면역원을 포함하는 조성물, 약독화 백신 또는 사균 백신이다. 일부 실시형태에서, 백신은 하나 이상의 DNA 백신, 하나 이상의 재조합 백신, 하나 이상의 단백질 서브유닛 백신, 면역원을 포함하는 하나 이상의 조성물, 하나 이상의 약독화 백신 및 하나 이상의 사균 백신으로 이루어진 군으로부터 선택된 조합을 포함한다.

본 발명의 양태는 재조합 백신의 일부로서 및 약독화 백신의 일부로서, 벡터의 단리된 단백질 또는 단백질 부분으로서, 플라스미드와 같은 핵산 분자 상의 단백질의 코딩 서열을 전달하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일부 양태에 따르면, 개체를 예방학적으로 및/또는 치료학적으로 면역화하는 조성물 및 방법이 제공된다.

DNA 백신은 미국 특허 제5,593,972호, 제5,739,118호, 제5,817,637호, 제5,830,876호, 제5,962,428호, 제5,981,505호, 제5,580,859호, 제5,703,055호, 제5,676,594호, 및 이러한 문헌에 인용된 우선권 출원에 기술되며, 이러한 문헌은 각각 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 그러한 출원에 기술된 전달 프로토콜 이외에, DNA를 전달하는 대안적인 방법은 미국 특허 제4,945,050호 및 제5,036,006호에 기술되어 있으며, 이러한 두 문헌 모두는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.

본 발명은 항원을 인코딩하는 외래 유전자를 전달하기 위한 재조합 벡터를 사용하는 개선된 약독화 생백신, 개선된 사균 백신 및 개선된 백신뿐만 아니라 서브유닛 및 당단백질 백신에 관한 것이다. 약독화 생백신, 외래 항원을 전달하기 위해 재조합 벡터를 사용하는 것, 서브유닛 백신 및 당단백질 백신의 예는 미국 특허 제4,510,245호; 제4,797,368호; 제4,722,848호; 제4,790,987호; 제4,920,209호; 제5,017,487호; 제5,077,044호; 제5,110,587호; 제5,112,749호; 제5,174,993호; 제5,223,424호; 제5,225,336호; 제5,240,703호; 제5,242,829호; 제5,294,441호; 제5,294,548호; 제5,310,668호; 제5,387,744호; 제5,389,368호; 제5,424,065호; 제5,451,499호; 제5,453,364호; 제5,462,734호; 제5,470,734호; 제5,474,935호; 제5,482,713호; 제5,591,439호; 제5,643,579호; 제5,650,309호; 제5,698,202호; 제5,955,088호; 제6,034,298호; 제6,042,836호; 제6,156,319호 및 제6,589,529호에 기술되어 있으며, 이러한 문헌 각각은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.

세포에 의해 흡수될 때, 유전적 작제물(들)은 세포에 기능성 염색체외 분자로서 존재할 수 있고/있거나 세포의 염색체 DNA에 통합할 수 있다. DNA는 플라스미드 또는 플라스미드들 형태의 별도의 유전 물질로 잔류하는 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로, 염색체에 통합할 수 있는 선형 DNA는 세포에 도입될 수 있다. 세포에 DNA를 도입할 때, 염색체에 DNA 통합을 촉진하는 시약이 첨가될 수 있다. 통합을 촉진하는 데 유용한 DNA 서열이 또한, DNA 분자에 포함될 수 있다. 대안적으로, RNA가 세포에 투여될 수 있다. 또한, 중심체, 텔로미어 및 복제 기점을 포함하는 선형 미니염색체로서 유전적 작제물을 제공하는 것이 고려된다. 유전자 작제물은 세포에 살아 있는 약독화 생미생물 또는 재조합 미생물 벡터에서 유전 물질의 일부로 잔류할 수 있다. 유전자 작제물은 유전 물질이 세포의 염색체에 통합하거나 염색체외에 잔류하는 재조합 바이러스 백신의 게놈의 일부일 수 있다. 유전적 작제물은 핵산 분자의 유전자 발현을 위해 필요한 조절 요소를 포함한다. 요소는 프로모터, 프로모터, 개시 코돈, 정지 코돈, 및 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 또한, 표적 단백질 또는 면역조절 단백질을 인코딩하는 서열의 유전자 발현을 위해 종종 인핸서가 필요하다. 이러한 요소가 원하는 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결되며, 조절 요소가 투여되는 개체에서 작동 가능하게 존재하는 것이 필요하다.

개시 코돈 및 정지 코돈은 일반적으로, 원하는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부인 것으로 간주된다. 그러나, 이러한 요소가 유전자 작제물이 투여되는 개체에서 기능적인 것이 필요하다. 개시 코돈 및 종료 코돈은 코딩 서열 프레임 안에 있어야 한다.

사용되는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호는 개체의 세포 내에서 기능적이어야 한다.

특히, 인간을 위한 유전적 백신의 생산에서 본 발명을 실시하는 데 유용한 프로모터의 예는 유인원 바이러스 40(SV40), 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스(MV), 예를 들어, BIV 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, ALV, 시토메갈로바이러스(CMV), 예를 들어, CMV 급초기 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV), 라우스 육종 바이러스(RSV)로부터의 프로모터뿐만 아니라 인간 유전자, 예를 들어, 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 인간 메탈로티오네인으로부터의 프로모터를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

특히, 인간을 위한 유전적 백신의 생산에서, 본 발명을 실시하는 데 유용한 폴리아데닐화 신호의 예는 SV40 폴리아데닐화 신호 및 LTR 폴리아데닐화 신호를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특히, SV40 폴리아데닐화 신호로 지칭되는, pCEP4 플라스미드(Invitrogen, 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 있는 SV40 폴리아데닐화 신호가 사용된다.

DNA 발현을 위해 필요한 조절 요소 이외에, 다른 요소들이 또한 DNA 분자에 포함될 수 있다. 이러한 추가적인 요소들은 인핸서를 포함한다. 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 바이러스 인핸서, 예를 들어, CMV, RSV 및 EBV로부터의 인핸서를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.

작제물을 염색체외에 유지시키고 세포에서 작제물의 다수의 카피(copy)를 생성하기 위해 유전적 작제물에 포유류 복제 기점이 제공될 수 있다. Invitrogen(캘리포니아 샌디에고 소재)으로부터의 플라스미드 pVAX1, pCEP4 및 pREP4는 통합 없이 고-카피 에피솜 복제를 생성하는 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역 및 엡스타인 바 바이러스 복제 기점을 함유한다.

면역화 적용과 관련한 일부 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 및 추가적으로, 이러한 표적 단백질에 대한 면역 반응을 추가로 향상시키는 단백질에 대한 유전자를 포함하는 핵산 분자(들)가 전달된다. 이러한 유전자의 예는 알파-인터페론, 감마-인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, MHC, CD80, CD86 및 신호 서열이 결실되고 IgE로부터의 신호 펩타이드를 선택적으로 포함하는 IL-15를 포함하는 IL-15와 같은 다른 사이토카인 및 림포카인을 인코딩하는 것이다. 유용할 수 있는 다른 유전자는 MCP-1, MIP-lα, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, 돌연변이체 형태의 IL-18, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 비활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이의 기능성 단편을 인코딩하는 것을 포함한다.

임의의 이유로 유전적 작제물을 수용하는 세포를 제거하는 것이 바람직한 경우 세포 파괴를 위한 표적으로서 역할을 하는 추가적인 요소가 첨가될 수 있다. 발현 가능한 형태의 헤르페스 티미딘 키나제(tk) 유전자가 유전적 작제물에 포함될 수 있다. 약물 간시클로비르는 개체에 투여될 수 있으며, 그러한 약물은 임의의 세포 생성 tk의 선택적 사멸을 유발시켜, 이에 따라, 세포의 선택적 파괴를 위한 수단에 유전적 작제물을 제공할 것이다.

단백질 생성을 최대화하기 위해, 작제물이 투여되는 세포에서 유전자 발현을 위해 매우 적합한 조절 서열이 선택될 수 있다. 또한, 세포에서 가장 효율적으로 전사되는 코돈이 선택될 수 있다. 당업자는 세포에서 기능성인 DNA 작제물을 생성할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 단백질을 위한 코딩 서열이 IgE 신호 펩타이드에 연결되는 유전자 작제물이 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 단백질은 IgE 신호 펩타이드에 연결된다.

일부 실시형태에서, 단백질을 사용하는 경우에, 예를 들어, 당업자는 본 발명의 단백질을 널리 공지된 기술을 이용하여 생성하고, 이를 널리 공지된 기술을 이용하여 단리할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질을 사용하는 경우에, 예를 들어, 당업자는 널리 공지된 발현 시스템에서 사용하기 위해 상업적으로 입수 가능한 발현 벡터에 본 발명의 단백질을 인코딩하는 DNA 분자를 널리 공지된 기술을 이용하여 삽입할 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 입수 가능한 플라스미드 pSE420(Invitrogen, 캘리포니아 샌디에고 소재)는 이.콜라이(E. coli)에서 단백질의 생성을 위해 사용될 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 플라스미드 pYES2(Invitrogen, 캘리포니아 샌디에고 소재)는 예를 들어, 효모의 S. 세레비시아(S. cerevisiae) 균주에서 생성하기 위해 사용될 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 MAXBAC™ 완전 바쿨로바이러스 발현 시스템(Invitrogen, 캘리포니아 샌디에고 소재)은 예를 들어, 곤충 세포에서 생성을 위해 사용될 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 플라스미드 pcDNA I 또는 pcDNA3(Invitrogen, 캘리포니아 샌디에고 소재)은 예를 들어, 포유류 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포에서 생성을 위해 사용될 수 있다. 당업자는 일상적인 기술 및 용이하게 이용 가능한 출발 물질에 의해 단백질을 생성하기 위해 이러한 상업적 발현 벡터 및 시스템 등을 사용할 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)] 참조, 이러한 문헌은 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 이에 따라, 원하는 단백질은 원핵 시스템 및 진핵 시스템 둘 모두에서 제조되어, 처리된 형태의 단백질의 스펙트럼을 야기시킬 수 있다.

당업자는 다른 상업적으로 입수 가능한 발현 벡터 및 시스템을 사용하거나, 널리 공지된 방법 및 용이하게 입수 가능한 출발 물질을 사용하여 벡터를 생성할 수 있다. 프로모터 및 폴리아데닐화 효소, 및 바람직하게는, 인핸서와 같은, 필수 제어 서열을 함유한 발현 시스템은 다양한 숙주에 대해 당해 분야에 용이하게 입수 가능하고, 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)] 참조). 유전적 작제물은 작제물이 형질감염된 세포주에서 기능성인 프로모터에 작동 가능하게 연결된 단백질 코딩 서열을 포함한다. 구성적 프로모터의 예는 시토메갈로바이러스 또는 SV40으로부터의 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터의 예는 마우스 유선 백혈병 바이러스 또는 메탈로티오네인 프로모터를 포함한다. 당업자는 용이하게 입수 가능한 출발 물질로부터 본 발명의 단백질을 인코딩하는 DNA로 세포를 트랙스펙션시키는 데 유용한 유전적 작제물을 용이하게 생성할 수 있다. 단백질을 인코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터는 이후에 외래 DNA의 발현이 일어나는 조건 하에서 배양 및 유지되는 양립 가능한 숙주를 변형시키기 위해 사용된다.

생성된 단백질은 세포를 용리시킴으로써 배양물로부터, 또는 당업자에게 적절하고 공지된 바와 같은 배양 배지로부터 회수된다. 당업자는 널리 공지된 기술을 이용하여, 이러한 발현 시스템을 사용하여 생성된 단백질을 단리시킬 수 있다. 상술된 특정 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 천연 소스로부터 단백질을 정제하는 방법은 재조합 DNA 방법에 의해 생성된 단백질을 정제하기 위해 동일하게 적용될 수 있다.

재조합 기술에 의해 단백질을 생성하는 것 이외에, 자동화 펩타이드 합성기는 또한, 단리된, 본질적으로 순수한 단백질을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 치환을 갖는 유도체가 DNA-인코딩된 단백질 생성에서 제공되지 않는 경우에 유용하다.

핵산 분자는 DNA 주입(DNA 백신접종으로도 지칭됨), 재조합 벡터, 예를 들어, 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 관련 바이러스 및 재조합 백시니아를 포함하는 임의의 여러 널리 공지된 기술을 이용하여 전달될 수 있다.

투여 경로는 근육내, 비강내, 복막내, 피내, 피하, 정맥내, 동맥내, 안구내 및 경구뿐만 아니라, 국소, 경피로, 흡입 또는 좌제에 의해, 또는 질, 직장, 요도, 협측 및 설하 조직으로의 세척에 의한 것과 같은 점막 조직으로의 투여를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 바람직한 투여 경로는 근육내, 복막내, 피내 및 피하 주사를 포함한다. 유전적 작제물은 전기천공 방법 및 디바이스, 전통적인 시린지, 바늘 없는 주사 디바이스, 또는 "미세사출 충격 유전자 건"을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 수단에 의해 투여될 수 있다.

DNA 백신의 전달을 촉진하기 위해 바람직한 전기천공 디바이스 및 전기천공 방법의 예는 미국 특허 제7,245,963호(Draghia-Akli, et al.), 미국 특허공개 제2005/0052630호(Smith, et al.에 의해 제출됨)에 기술된 것을 포함하며, 이러한 문헌의 내용은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 또한, 35 USC 119(e)에 따라 2006년 10월 17일에 출원된 미국가출원 제60/852,149호, 및 2007년 10월 10일에 출원된 미국가출원 제60/978,982호의 혜택을 청구하는, 공동 계류 중이고 공동 소유된 미국 특허출원 제11/874072호(2007년 10월 17일에 출원됨)에 제공된 DNA 백신의 전달을 촉진하기 위한 전기천공 디바이스 및 전기천공 방법이 바람직하며, 이러한 문헌 모두는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.

하기는 전기천공 기술을 이용한 실시형태의 일 예이고, 상기에 논의된 특허 문헌에서 더욱 상세히 논의된다. 전기천공 디바이스는 사용자에 의해 미리 정해진 전류 입력과 유사한 정전류를 생산하는 에너지 펄스를 포유동물의 원하는 조직에 전달하도록 구성될 수 있다. 전기천공 디바이스는 전기천공 부품 및 전극 어셈블리 또는 핸들 어셈블리를 포함한다. 전기천공 부품은 제어기, 전류 파형 발생기, 임피던스 시험기, 파형 자동기록기, 입력 요소, 상태 보고 요소, 통신 포트, 메모리 요소, 전력원, 및 전력 스위치를 포함하는, 전기천공 디바이스의 다양한 요소들 중 하나 이상을 포함하고 도입할 수 있다. 전기천공 부품은 전기천공 디바이스의 하나의 요소로서 기능할 수 있으며, 다른 요소들은 전기천공 부품과 통신하는 별개의 요소들(또는 부품들)이다. 일부 실시형태에서, 전기천공 부품은 전기천공 디바이스의 하나 초과의 요소로서 기능할 수 있으며, 이는 전기천공 부품과 별개의 전기천공 디바이스의 또 다른 요소와 통신할 수 있다. 개선된 HPV 백신을 전달하기 위한 전기천공 기술의 사용은 하나의 전기화학적 또는 기계적 디바이스의 일부로서, 요소가 하나의 디바이스로서 기능할 수 있는 것으로서 또는 서로 통신하는 별개의 요소들로서 존재하는 전기천공 디바이스의 요소로 제한되지 않는다. 전기천공 부품은 원하는 조직에서 정전류를 생성시키는 에너지의 펄스를 전달할 수 있고, 피드백 메커니즘을 포함한다. 전극 어셈블리는 공간 배열에서 복수의 전극을 갖는 전극 어레이를 포함하며, 여기서, 전극 어셈블리는 전기천공 부품으로부터의 에너지 펄스를 수용하고, 이를 전극을 통해 원하는 조직으로 전달한다. 복수의 전극들 중 적어도 하나는 에너지 펄스의 전달 동안 중성이고, 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고, 임피던스를 전기천공 부품으로 통신한다. 피드백 메커니즘은 측정된 임피던스를 수용할 수 있고, 정전류를 유지하기 위해 전기천공 부품에 의해 전달된 에너지 펄스를 조정할 수 있다.

일부 실시형태에서, 복수의 전극은 분산 패턴으로 에너지 펄스를 전달할 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의 전극은 프로그래밍된 시퀀스 하에서 전극의 제어를 통해 분산 패턴으로 에너지 펄스를 전달할 수 있으며, 프로그래밍된 시퀀스는 사용자에 의해 전기천공 부품에 입력된다. 일부 실시형태에서, 프로그래밍된 시퀀스는 차례차례 전달되는 복수의 펄스를 포함하며, 여기서, 복수의 펄스들의 각 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극에 의해 전달되며, 복수의 펄스들의 후속 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극 중 상이한 하나에 의해 전달된다.

일부 실시형태에서, 피드백 메커니즘은 하드웨어 또는 소프트웨어 중 어느 하나에 의해 수행된다. 바람직하게는, 피드백 메커니즘은 아날로그 폐쇄-루프 회로에 의해 수행된다. 바람직하게는, 이러한 피드백은 매 50 ㎲, 20 ㎲, 10 ㎲ 또는 1 ㎲ 마다 일어나지만, 바람직하게는, 실시간 피드백 또는 즉각적(즉, 반응 시간을 결정하기 위한 이용 가능한 기술에 의해 결정될 때 실질적으로 즉각적임)이다. 일부 실시형태에서, 중성 전극은 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고, 임피던스를 피드백 메커니즘으로 통신하며, 피드백 메커니즘은 임피던스에 반응하고, 미리 정해진 전류와 유사한 값에서 정전류를 유지시키기 위해 에너지 펄스를 조정한다. 일부 실시형태에서, 피드백 메커니즘은 에너지 펄스의 전달 동안 연속적으로 및 즉각적으로 정전류를 유지한다.

일부 실시형태에서, 핵산 분자는 폴리뉴클레오타이드 기능 인핸서 또는 유전적 백신 촉진제 작용제의 투여와 함께 세포에 전달된다. 폴리뉴클레오타이드 기능 인핸서는 미국출원 제5,593,972호, 제5,962,428호 및 국제출원 PCT/US94/00899호(1994년 1월 26일에 출원됨)에 기술되며, 이러한 문헌 각각은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 유전적 백신 촉진제 작용제는 미국출원 제021,579호(1994년 4월 1일에 출원됨)에 기술되며, 이러한 문헌은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 핵산 분자와 함께 투여되는 보조 작용제는 핵산 분자와의 혼합물로서 투여되거나, 핵산 분자의 투여와 별도로, 동시에, 전 또는 후에 투여될 수 있다. 또한, 형질감염 작용제 및/또는 복제 작용제 및/또는 염증 작용제로 기능할 수 있고 GVF와 동시-투여될 수 있는 다른 작용제는 성장 인자, 사이토카인 및 림포카인, 예를 들어, α-인터페론, 감마-인터페론, GM-CSF, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNF, 표피 성장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 및 IL-15뿐만 아니라 섬유아세포 성장 인자, 표면 활성제, 예를 들여, 면역-자극 복합체(ISCOMS), 프로인트 불완전 애주번트, 모노포스포릴 지질 A(WL)를 포함하는 LPS 유사체, 무라밀 펩타이드, 퀴논 유사체 및 스쿠알렌과 같은 소포체를 포함하며, 히알루론산은 또한, 유전적 작제물과 함께 투여되게 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역조절 단백질은 GVF로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 전달/흡수를 향상시키기 위해 PLG와 함께 제공된다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약 1 나노그램 내지 약 2000 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약 5 나노그램 내지 약 1000 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 10 나노그램 내지 약 800 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 1 내지 약 350 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 25 내지 약 250 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 100 내지 약 200 마이크로그램 DNA를 함유한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 사용되는 투여 모드에 따라 제형화된다. 약제학적 조성물이 주사 가능한 약제학적 조성물인 경우에, 이러한 것은 무균이고, 발열원이 없고, 미립자가 없다. 등장성 제형이 바람직하게는, 사용된다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제는 나트륨 클로라이드, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 등장성 용액, 예를 들어, 포스페이트 완충된 염수가 바람직하다. 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 혈관수축제가 제형에 첨가된다.

본 발명의 일부 실시형태에 따르면, 면역 반응을 유도하는 방법이 제공된다. 백신은 단백질 기반, 약독화 생백신, 세포 백신, 재조합 백신 또는 핵산 또는 DNA 백신일 수 있다. 일부 실시형태에서, 점막 면역 반응을 유도하는 방법을 포함하는, 면역원에 대해 개체에서의 면역 반응을 유도하는 방법은 개체에, 본 발명의 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산 분자 및/또는 본 발명의 단백질을 인코딩하는 재조합 백신 및/또는 본 발명의 단백질을 포함하는 서브유닛 백신 및/또는 약독화 생백신 및/또는 사균 백신과 조합하여 CTACK 단백질, TECK 단백질, MEC 단백질 및 이의 기능성 단편 또는 이의 발현 가능한 코딩 서열 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함한다. CTACK 단백질, TECK 단백질, MEC 단백질 및 이의 기능성 단편 중 하나 이상은 면역원을 인코딩하는 단리된 핵산 분자; 및/또는 면역원을 인코딩하는 재조합 백신 및/또는 면역원을 포함하는 서브유닛 백신 및/또는 약독화 생백신 및/또는 사균 백신의 투여 전, 이와 동시에, 또는 후에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, CTACK, TECK, MEC 및 이의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산 분자가 개체에 투여된다.

본 발명은 하기 실시예에 추가로 예시된다. 이러한 실시예가, 본 발명의 실시형태를 나타내지만, 단지 예시의 방식으로 제공되는 것으로 이해되어야 한다. 상기 논의 및 본 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 필수 특징을 확인할 수 있고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서, 다양한 용도 및 조건에 적응시키기 위해 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 수행할 수 있다. 이에 따라, 본 명세서에 도시되고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 상기 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한, 첨부된 청구범위 내에 속하는 것으로 의도된다.

이러한 개시내용 전반에 걸쳐 인용된 미국 특허, 미국출원, 및 참고문헌 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.

실시예

본 발명은 하기 실시예에서 추가로 규정된다. 이러한 실시예가 본 발명의 바람직한 실시예를 나타내지만, 단지 예시의 방식으로 제공되는 것으로 이해되어야 한다. 상기 논의 및 이러한 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서, 다양한 용도 및 조건에 적용하기 위해 본 발명의 다양한 변화 및 변경을 수행할 수 있다. 이에 따라, 본 명세서에 도시되고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 상기 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한, 첨부된 청구범위 내에 속하는 것으로 의도된다.

실시예 1

재발성 호흡기 유두종증(RRP)은 대개 인간 유두종 바이러스(HPV) 서브 타입 6, 11과 관련된, 호흡 소화관의 유도종의 생성에 의해 특징되는 희귀 장애이다. HPV6 관련 RRP 및 침습성 악성 질환의 현 치료는 HPV-특이적 면역요법의 부가로 잠재적으로 개선될 수 있다. 이용 가능한 예방 HPV 백신은 HPV 주요 캡시드 단백질 L1에 대한 중화 항체를 생성시킬 수 있지만, 이러한 것은 HPV 감염 또는 기존 병소에 대한 치료 효과를 입증하지 못하였고, 세포 용해성 T-세포 반응을 일으킬 가능성이 없다(Lin et al., Immunologic research. 2010;47(1-3):86-112). 한편, HPV-특이적 면역요법은 HPV 바이러스 자체 및 HPV 감염된 세포에 대한 면역성을 생성함으로써 기존에 존재하는 병소 및 감염을 제거하는 치료 가능성을 가질 수 있다. HPV E6 및 E7 종양 단백질은 HPV 관련 종양에서의 구성적 발현 및 HPV 관련 질환의 유도 및 유지에서 중요한 역할로 인해 이러한 타입의 치료 개입에 대한 이상적인 표적을 나타낸다(Lin et al., Immunologic research. 2010;47(1-3):86-112).

본 명세서에서 제시되는 실험은, RRP를 치료하기 위해 강력한 면역 T 세포 반응을 생성하기 위해, HPV6의 E6 및 E7 단백질을 표적화하는 DNA 플라스미드-기반 면역요법인 INO-3106의 효능을 시험한다.

본 연구에서, 암의 및 종양 유지의 HPV6 유도 형질전환을 위해 필요한 단백질인 HPV6 E6 및 E7(도 1)에 대해 인코딩하는 합성 공통 DNA 서열로 이루어진 신규한 HPV6-특이적 면역요법인, INO-3106의 효능을 평가하기 위해 실험을 수행하였다. 합성 DNA 플라스미드는 게놈 통합의 증거 없이 강력한 면역 반응을 유도하는 능력, 바람직한 안전성 프로파일, 안정성 및 상대적 제조 용이성을 포함하는, 면역요법 플랫폼으로서 여러 잠재적인 장점을 제공한다(Saha et al., Recent Pat DNA Gene Seq. 2011;5(2):92-6). INO-3106의 전임상 연구는 동물 모델에서 HPV6에 대한 강력하고 특이적인 면역 반응을 입증하였다(Shin et al., Human vaccines & immunotherapeutics. 2012;8(4):470-8). 동일한 합성 공통 플랫폼을 기초로 하여 설계되고 평가된 HPV16/18-특이적 치료법(VGX-3100, Inovio Pharmaceuticals, Inc.)은 이형성 병소 퇴행 및 HPV16/18 감염의 제거 형태로 임상적 이점과 상관관계가 있는 세포 면역 반응을 입증하였고, 현재 HPV16 및 18 관련 질환을 표적화하는 후기 임상 시험을 지원한다(Bagarazzi et al., Sci Transl Med. 2012;4(155):155ra38).

전임상 연구에서는, DNA 백신의 면역원성이 사이토카인 애주번트의 사용에 의해 실질적으로 증가될 수 있음을 나타낸다(Chattergoon et al., Vaccine. 2004;22(13-14):1744-50; Hanlon et al., JVirol. 2001;75(18):8424-33; Kim et al., JInterferon Cytokine Res. 1998;18(7):537-47; Kim et al., EurJImmunol. 1998;28(3):1089-103; Operschall et al., JClinVirol. 1999;13(1-2):17-27). 중요하게는, 조작된 플라스미드 IL-12 유전적 애주번트는 CELLECTRA® 디바이스를 이용하여 전달될 때 인간에서 면역원성을 향상시키는 것으로 나타났다(Kalams et al., Journal of Infectious Diseases. 2013; Tebas et al., The Journal of infectious diseases. 2019). 국소 근육뿐만 아니라 피부 전달 둘 모두를 표적화하는 여러 임상 연구에서 CELLECTRA® 디바이스를 통한 최적화된 DNA의 전달이 유도 예방적 환경뿐만 아니라 치료적 방식으로부터의 범위의 다양한 목적을 위해 빠른 방식으로 인간에서 면역성을 생성시키는 고도로 재현 가능한 방법이라는 것이 확립되었다(Kalams et al., Journal of Infectious Diseases. 2013; Tebas et al., The Journal of infectious diseases. 2019; Tebas et al., The New England journal of medicine. 2017; Bagarazzi et al., SciTranslMed. 2012;4(155):155ra38; Morrow et al., Molecular therapy oncolytics. 2016;3(16025; Trimble et al., Lancet. 2015;386(10008):2078-88; Morrow et al., Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2018;24(2):276-94; Aggarwal et al., Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2019;25(1):110-24; Morrow et al., Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2015;23(3):591-601).

여기에서, 본 실험은 HPV6 관련 RRP 또는 악성 종양을 갖는 환자에서 CELLECTRA® 디바이스로 EP를 통해 INO-9012(IL-12 애주번트)를 근육내(IM)로 전달하거나 전달하지 않은 경우, INO-3106의 파일럿 연구의 안전성 및 면역원성을 입증한다. 이러한 연구로부터의 데이터는, INO-3106 및 IL-12 애주번트로의 면역요법이 RRP에 대한 비-침습성 면역 매개 치료 옵션일 수 있음을 시사한다.

이러한 단일-부위 개방-라벨 1상 연구에서, HPV6-양성 RRP 및 악성 종양을 갖는 대상체에, CELLECTRA® 디바이스로 전기천공(EP)과 함께 근육내(IM) 전달된, IL-12를 인코딩하는 DNA 플라스미드 면역요법인 INO-9012와 함께 또는 이의 없이, HPV6의 E6 및 E7 단백질을 표적화하는 DNA 플라스미드 면역요법인 INO-3106를 투여하였다. 환자는 상승 용량의 INO-3106, 1회 3㎎ 및 이후에 3회의 추가 투여를 위해 6㎎을 수용하였으며, 각 투여는 3주 간격이며, 제3 투여 및 제4 투여는 INO-9012와 함께 공동-투여되었다. 본 연구의 제1 목적은 INO-9012와 함께 및 이의 없이, INO-3106의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이었다. 제2 목적은 INO-9012와 함께 및 이의 없이, INO-3106의 세포 면역 반응을 결정하는 것이었다. 탐색적 목적은 치료법에 대한 예비 임상 효능을 포함하였다.

4명의 환자는 동의하였으며, 3명의 환자는 모든 포함 기준 및 제외 기준을 충족하였고, 본 연구에 등록되었다. 연구 요법은 내약성이 우수하였으며, 관련된 심각한 부작용이 없었으며, 모든 관련된 부작용(AE)는 낮은-등급이었다. 주사 부위 통증은 모든 환자에서 보고된 가장 일반적인 관련 AE이었다. 면역원성은 다중 면역 검정에 의해, 세포독성 T 세포의 특징을 포함하는, HPV6-특이적 세포 반응의 관여 및 확장을 나타내는 것으로 입증되었다. 예비 효능은 성장 절제술을 위한 수술 빈도의 변화 형태로 이러한 환자에서 입증되었다. 개입 전에, 두 환자 모두는 대략 180일마다 수술이 필요하였다. 1명의 환자는 수술 회피(584일)가 3배 이상 증가함을 나타내었으며, 다른 환자는 수술 간격이 5배 이상 증가인, 915일에 마지막 접촉일에 수술을 전혀 받지 않은 상태로 존재한다.

본 명세서에 제시된 실험은 INO-9012과 함께 및 이의 없이 INO-3106이 내약성이 우수하고, 면역원성이고, HPV6-관련 RRP 호흡 소화 병소를 갖는 환자에서 예비 효능을 입증함을 나타낸다.

이러한 실험에서 사용되는 물질 및 방법은 여기에 기술된다.

연구 집단

이는 유망한, 개방-라벨 1상 연구였다. 적어도 18세의 남성 및 여성 환자는 등록 대상으로 고려되었다. 자격을 얻기 위해, 환자는 조직학적으로 문서화된 HPV6-관련 호흡 소화 유두종, 전암성 병소를 가지거나 호흡 소화 침습성 악성 종양을 가져야 하며, 가장 최근 치료법(예를 들어, 방사선, 화학요법)은 제1 용량의 연구 치료하기 적어도 2개월 전에 완료되었다. 환자는 정상 범위 내의 간, 신장, 간 및 골수 기능을 갖는, ECOG 0-1을 가져야 한다. 면역억제의 증가가 있거나 면역억제제의 사용이 예상되거나, 전신 스테로이드의 사용을 필요로 하거나, 심장 흥분전 증후군이 존재하거나, 임신 중이거나 수유 중인 경우의 환자를 제외하였다. 임의의 평가를 수행하기 전에 각 환자로부터 사전 동의를 얻었다. 임상 시험을 헬싱키 선언의 윤리적 지침에 따라 수행하였다.

CELLECTRA® 디바이스를 사용한 면역요법 및 전기천공

INO-3106은 주사용 멸균수에서 제형화된, HPV 타입 6의 E6 및 E7 단백질을 위해 인코딩하는 DNA 플라스미드이다. INO-3106은 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. INO-9012는 주사용 멸균수에서도 제형화된 합성 인간 IL-12(p35 및 p40 서브유닛)를 위해 인코딩하는 DNA 플라스미드로 이루어진다. INO-9012는 서열번호 6의 아미노산 서열(IL-12의 p35 서브유닛)을 인코딩하는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 8의 아미노산 서열(IL-12의 p40 서브유닛)을 인코딩하는 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. INO-3106 및 INO-9012 둘 모두를 이전에 기술된 바와 같은 독점 기술(Inovio Pharmaceuticals, Inc.)을 이용하여 설계하였다(Yan et al., Vaccine. 2008;26(40):5210-5; Yan et al., Vaccine. 2009;27(3):431-40). CELLECTRA® 2000 적응형 정전류 전기천공 디바이스(Inovio Pharmaceuticals, Inc.)는 멸균 1회용 어레이를 통해 주사 부위에, 1 s 간격 이격하여 3회의 52 ms 제어된 전기 펄스를 전달한다. 조직에 삽입하였을 때, 바늘 어레이는 면역요법 주사 부위 둘레를 중심으로 하고, 세포 형질감염을 향상시키기 위해 세포막 내에 일시적인 기공을 생성한다. INO-9012와 함께 또는 이의 없이 INO-3106을 1㎖ 부피로 근육내로 전달한 직후에, CELLECTRA® 디바이스로 EP에 의해 전달하였다. 치료 또는 투여는 DNA 플라스미드의 주입 후 EP로서 규정된다.

연구 설계

사전 동의 후에, 각 환자에게 고유 환자 식별 코드를 할당하였다. 적격성을 결정하고 기준선 특징을 수집하기 위한 스크리닝 절차를 제1 투여 전 28일 이내에 완료하였다. 환자는 상승 용량의 INO-3106을 수용하였으며, 이중 제1 투여(0일)는 3㎎의 INO-3106을 전달하였으며, 제2 투여(3주)는 6㎎의 INO-3106을 전달하였으며, 제3 투여(6주) 및 제4 투여(9주)는 1㎎의 INO-9012와 함께 6㎎의 INO-3106을 전달하였다. 각 투여를 3주 간격으로 전달되어 임의의 등급 2 또는 더 높은 관련된 전신 부작용(AE)의 발생을 관찰할 수 있었다. 총체적으로, 모든 환자에 대한 참여는 9주 치료 기간이 포함되었고, 이후 마지막 투여로부터 6개월의 장기 추적 기간이 포함되었다.

본 연구의 제1 목적은 INO-9012와 함께 및 이의 없이 INO-3106의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이었다. 제2 목적은 INO-9012와 함께 및 이의 없이 INO-3106에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응을 결정하는 것이었으며, 탐색적 목적은 치료에 대한 예비 임상 효능을 평가할 뿐만 아니라 가능한 경우 투여후 조직에서 면역 세포 침윤과 효능을 연관시키는 것이었다.

본 연구는 식별자 NCT02241369로 ClinicalTrials.gov에 등록되었다. 본 연구 프로토콜은 1975년 헬싱키 선언의 윤리적 지침을 준수하고, 센터의 기관 검토 위원회에 의해 검토 및 승인되었다.

안전성 평가

국소 및 전신 부작용(AE), 생체 신호, 12-리드 심전도(ECG) 및 실험실 이상 발생을 마지막 후속 방문을 통해 동의 날짜로부터 모니터링하였다. 특히, 통증, 가려움증, 홍반, 경화 및 타박상을 포함하는 주사 부위 반응을 각 치료일에 및 치료후 연속 7일 동안 평가하였다. 환자에게 각 방문 시에, 새로운 AE 또는 질환의 발생, 및 병용 약제의 사용에 관해 질의하였다. 모든 부작용을 CTCAE(Common Terminology Criteria for Adverse Events), 버전 4.03에 따라 등급이 매겨지고, MedDRA 버전 21로 코딩하였다.

환자의 1/3 이상이 긴급 보고가 필요한 관련된 부작용을 경험한 직후에 추가 등록 및 치료를 중지하였으며, 임의의 환자는 연구 치료와 관련하여 평가한 경우, 심각한 부작용(SAE), 예상치 못한 등급 4 독성, 잠재적으로 치명적인 AE 및 사망을 경험하며, 3명 이상의 환자는 동일한 관련된 등급 3 또는 4 AE를 경험하거나, 임의의 경우에, 환자는 등급 3 아나필락시스를 보고한다.

가임 여성은 스크리닝 시에 및 각 투여 전 3일 이내에 임신 시험을 완료할 것을 요구하였다. 여성에서 임의의 양성의 임신 시험 결과 시에 치료를 중단하였다. 혈액학, 응고, 혈청 화학(간 기능 포함) 및 크레아틴 포스포키나제(CPK)를 포함하는 실험실 파라미터를 본 연구 전반에 걸쳐 모니터링하고, 센터에서 국소적으로 평가하였다.

항원 3D 모델링

비교 모델을 Bioluminate(Release 2019-2, Schrodinger, 뉴욕주, 뉴욕 소재)를 이용하여 구성하고, Discovery Studio Visualizer(Dassault Systemes BIOVIA, 캘리포니아, 샌디에고 소재)로 시각화하였다.

인터페론 감마 ELISpot

전혈을 ACD-A 튜브에 수집하고, 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 채혈 24시간 이내에 단리하였다. 샘플을 기준선에서, 면역요법 투약 시에, 및 각 추적 방문 시에 수집하고, PBMC를 배치식으로 면역 분석을 위해 동결보존하였다. HPV6 E6 및 E7 항원에 대한 T 세포 및 항체 반응을 각각 사전에 기술된 바와 같이, 인터페론-γ ELISpot 및 ELISA 각각에 의해 결정하였다(Bagarazzi et al., SciTranslMed. 2012;4(155):155ra38).

유세포분석

PBMC를 세포 배양 배지에서 밤새 동결보존한 후에 회수하고, 회전시키고, 세척하고, 다음날 재현탁하였다. 카운팅 후에, 1 × 10⁶개의 PBMC를 96-웰 플레이트에 충분한 샘플과 함께 환자로부터의 R10 배지 중에 플레이팅하였다. 항원 특이적 반응을 위해, 세포를 2 ㎍/㎖의 농도로 풀링된 HPV6 E6 및 E7에 해당하는 펩타이드의 조합으로 5일 동안 자극시킨 반면, 관련되지 않은 펩타이드를 음성 대조군(OVA)으로서 사용하였으며, 콘카나발린 A를 양성 대조군(Sigma-Aldrich)으로서 사용하였다. 공동-자극 항체 또는 사이토카인을 임의의 시점에서 세포 배양물에 첨가하지 않았다. 5일 인큐베이션 기간의 종료 시에, 세포를 CD3-BUV737, CD4-APC-Cy7, CD14-BUV395, CD-16-BUV395, CD137-APC, 그라눌리신-AF488 CD-19-BUV395, CD38-BV786, CD8-BV650, 그랜자임 B-AF700(BD Biosciences), 그랜자임 A-PECy7(ThermoFisher), PD-1-PEDazzle, 퍼포린-BV421, Ki67-BV605 및 CD69-BV711(BioLegend)에 대해 염색하였다. 세포외 마커(CD4, CD8, CD137, CD69, CD38, PD-1)의 염색이 먼저 일어났으며, 이후에, 나머지 마커에 대한 염색을 위해 투과시켰다. 세포 활성화 후 마커의 하향조절을 설명하기 위해 CD3을 세포내로 염색하였다. 획득된 데이터를 FlowJo 소프트웨어 버전 X.0.7 또는 그 이상(Tree Star)을 이용하여 분석하였다.

유전자 발현 분석을 위한 항원-특이적 PBMC 자극

단기 자극을 위해, 냉동보존된 PBMC를 해동하고, 밤새 휴지시키고, 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 22시간 동안 DMSO(음성 대조군) 또는 HPV6 E6 및 E7 중첩 펩타이드 풀(OLP)로 자극하였다. 자극 후에, 배양 상청액을 수집하고 -20℃에서 저장하였다. 이후에, 세포를 완충제 RLT(Qiagen)를 이용하여 용해하고, -80℃에서 저장하였다.

장기 자극을 위해, 냉동보존된 PBMC를 해동하고, 밤새 휴지시키고, 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 11일 동안 HPV6 E6 및 E7 OLP로 자극하였다. 1, 4, 6 및 8일에, IL-2 및 IL-7을 함유한 새로운 배지를 각각 10 U/㎖ 및 10 ng/㎖로 첨가하였다. 11일에, PBMC를 세척하고, 37℃, 5% CO₂ 및 95% 습도에서 밤새 휴지시켰다. 밤새 휴지 후에, PBMC를 22시간 동안 DMSO(음성 대조군) 또는 HPV6 E6 및 E7 OLP와 함께 HPV6 E6 및 E7 OLP로 재자극하였다. 22시간 자극의 종료 시에, 세포 상청액을 수집하고, -20℃에서 저장하였다. 이후에, 세포를 용해하고, -80℃에서 저장하였다.

멀티플렉스 유전자 발현 분석

세포 용해물을 제조업체 설명서에 따라 12개의 배치로 해동하고, 594개의 유전자 플러스 15개의 내부 참조 대조군으로 이루어진, nCounter(NanoString) GX Human Immunology V2 패널을 이용하여 프롭 및 형광체-바코딩된 리포터를 캡처하기 위해 혼성화하였다. 이후에, 샘플을 반투명 카트리지에 대한 캡처 프로브의 혼성화를 위해 자동화된 nCounter Prep Station(Nanostring)에 배치하였으며, 그 후에, 유전자 발현을 각 샘플 레인에서 리포터 프로브의 직접 카운트를 통해 nCounter Digital Analyzer(Nanostring)에 의해 측정하였다.

통계학적 방법

적어도 하나의 용량의 치료를 수용한 대상체를 안전성 분석에 포함하였다. SAE 및 주사 부위 반응을 포함하는, AE의 발생률은 정확한 95% 신뢰 구간과 함께 추정되었다. 제2 및 탐색적 종점과 관련된 분석은 이의 할당된 수의 투여를 수용한 대상체를 사용할 것이다. 제2 분석에서, 면역 반응 파라미터를 추정할 것이다. 탐색적 분석에서, 임상 반응 및 조직병리학적 평가 파라미터를 추정할 것이다. 연속 결과를 위해, 평균/중간값 및 95% 신뢰 구간을 계산할 것이며, 이원 결과를 위해, 비율 및 정확한 95% 신뢰 구간을 Clopper-Pearson 방법을 이용하여 계산할 것이다.

실험 결과는 여기에 기술된다.

환자 특징 및 성향

총체적으로, 4명의 환자가 동의하였고, 적격성에 대해 스크리닝되었다. 3명의 환자는 모두 포함 기준 및 제외 기준을 충족하였고, 2014년 10월에서 2017년 9월까지 등록되었다. 인구 통계 및 기준선 특징은 표 1에 요약되어 있다. 이러한 3명의 환자 중에서, 2명의 환자는 HPV6-관련 RRP(둘 모두는 성대에 질환을 가짐)를 나타내었으며, 1명의 환자는 침습성 악성종양(본 연구 항목에서 구인두에서의 편평 세포 암종과 함께 기관에 위치된 초기 질환을 나타냄)을 갖는다. 모두 3명의 환자는 모두 4개의 투여를 완료하였으며, 이는 0일에 3㎎의 INO-3106, 3주에 6㎎의 INO-3106, 및 6 및 9주에 1㎎의 INO-9012와 함께 6㎎의 INO-3106을 수용하였으며, 모두는 CELLECTRA® 디바이스를 통해 근육내로 전달하였다. 2명의 환자는 이의 치료의 마지막 투여 후 6개월 장기 추적 기간에 완료하였다. 1명의 환자는 장기 추적을 완료하지 않았으며, 이는 본 연구로부터의 철수를 위해 주요 이유로서 비-연구 관련 갈등을 보고하였다. 모두 3명의 환자는 안전성 분석 설정에 포함되었다.

EP로의 INO-3106 및 INO-9012의 안전성 및 내약성

EP를 통해 전달된 INO-3106 및 INO-9012는 내약성이 우수하였다. 치료-유발 AE는 주사 부위 통증(3개의 관련 등급 1 부작용), 발열(1개의 비관련 등급 1 부작용) 및 요로 감염(1개의 비관련 등급 2 부작용)을 포함하였다. 모든 환자는 대부분의 경우에, 약제로 치료하여 해결되는 주사 부위 통증을 보고하였다. 입원이 필요한 등급 3 단일마비의 하나의 치료-유발 SAE가 본 연구에서 보고되었지만, 연구 치료와 관련되지 않는 것으로 평가되었다. 환자는 연속 연구 치료를 수용하거나 AE 또는 EP의 불내약성으로 인해 본 연구에서 계속된 참여로부터 철회하지 않았다. 연구의 과정 동안 등급 4 부작용 또는 사망이 보고되지 않았다. 모든 환자는 실험실 파라미터의 변화를 경험하였으며, 이들 대부분은 혈액학 값에서 약간의 변동을 포함하였지만, 모든 비정상 실험실 값은 임상적으로 유의미하지 않은 것으로 결정되었다.

INO-3106은 치료된 RRP 환자로부터 T 세포에서 활성화 마커 및 용해 단백질의 발현뿐만 아니라 IFNγ 생성을 유도함

시험에 등록된 모두 3명의 환자에 대해 HPV6 E6 및 E7 세포 면역 반응의 평가를 수행하였다(도 2 및 도 6). 대상체 601이 RRP 환자가 아니고 비치료 부작용과 관련된 사망으로 인해 제한된 데이터를 갖기 때문에, 이러한 대상체와 관련된 면역학 정보는 도 6에서 확인될 수 있다. 세포 면역 반응은 INO-3106 투여 전 및 후에 얻어진 단리된 말초혈 단핵 세포(PBMC)에 지지 사이토카인을 첨가하지 않고 밤새 IFNγ ELISpot을 수행함으로써 먼저 해결되었다. 이러한 평가의 결과는, 환자 603이 항원 특이적 IFNγ 분비 형태로 HPV6 E6 및 E7 항원에 대한 매우 낮은 기준선 활성을 나타냄을 시사한다(도 2). 상세하게는, E6 또는 E7 항원에 대해 10⁶개의 PBMC당 20개 미만의 스폿(spot)이 기록된 반면, 환자 604는 연구 진입 시에 이러한 항원에 대한 상당히 강력한 세포 반응을 나타내었으며, 10⁶개의 PBMC당 E6 스폿 형성 단위는 150개의 스폿에 접근하며, E7은 50개의 스폿을 초과한다(도 2).

INO-3106으로의 치료는 50개의 스폿을 초과하는 HPV6 항원에 대한 전체 반응을 포함하는, 환자 603에서 HPV6 E6 및 E7 특이적 세포 반응을 기준선 이상으로 증가시켰다. 환자 604는 치료에 반응하여 IFNγ 스폿의 상승을 나타내지 않았다(도 2). 반응하는 환자들 중에서, 시간 대 피크 반응은 다양하였고, 정확하게 평가하기가 어려웠다. 상세하게는, INO-3106의 4차 투여 후 비치료 관련 부작용으로 인해 환자 601에서 사망이 발생하였으며, 이에 따라, 치료후 추적 관찰이 없었으며, 피크 반응은 3차 투여 후 기록되었다. 환자 603은 INO-3106의 최종 투여 후 6개월에 피크 반응을 나타내었으며, 이는 그러한 시간 동안 바이러스 활성화/항원 표적 발현의 변화와 관련될 수 있거나, HPV6 특이적 T 세포의 대규모 풀을 계속 구축하고 지지하기 위해 환자의 면역 체계의 동력학을 반영할 수 있다.

IFNγ의 생산이 Th1 면역 반응을 암시하지만, 용해 활성화 1:1 상관관계가 없다는 것이 이전에 밝혀졌다(Morrow et al., Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2015;23(3):591-601, Morrow et al., Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2017;DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-17-2335; Trimble et al., Lancet. 2015;386(10008):2078-88; Migueles et al., PLoS pathogens. 2011;7(2):e1002002; Varadarajan et al., The Journal of clinical investigation. 2011;121(11):4322-31). CD8+ T 세포에 의한 세포용행 반응이 바이러스 감염된 세포를 조절 및 제거하는 면역 반응의 중요한 성분인 것으로 이해된다. 이에 따라, 환자 603 및 604로부터의 PBMC에 대해 유세포분석을 수행하였으며, 충분한 샘플은 치료 반응으로 그랜자임 및 퍼포린을 로딩하는 HPV6 특이적 CD8+ T 세포의 능력을 평가하기 위해 INO-3106의 투여 전 및 후에 단리되었다. 이를 위해, CD8+ T 세포 구획을, CD38, CD69, CD137 및 Ki67과 같은 세포 표면 마커의 항원-특이적 발현을 통한 면역 활성화(도 3)뿐만 아니라 동족 항원으로의 시험관내 자극 후 그라눌리신(Gnly), 그랜자임 A(GrzA), 그랜자임 B(GrzB) 및 퍼포린(Prf)의 존재에 의해 결정한 바와 같은 용해 가능성에 대해 분석하였다. 표 2는 INO-3106으로 치료 전 및 후에 이러한 마커의 항원 특이적 조절을 나타낸다. ELISpot 반응과 일치하게, 환자 603은 용해 단백질에 부수적으로 따르는 활성화 마커를 발현시키는 다양한 CD8+ T 세포의 강력한 상승을 나타내었다. 가장 주목할 만한 것은, 그랜자임 A, 그랜자임 B 및 퍼포린과 같은 용해 가능성의 마커와 조합한 CD38 및/또는 Ki67의 발현은 INO-3106으로의 치료 후 크게 증가하는데, 이는 HPV6 E6 및 E7 항원에 특이적인 전체 CD8+ T 세포의 3%를 초과하는 값에 도달한다(표 2A, 도 3). 반대로, 그리고 강력한 T 세포 확대의 결여를 시사하는 ELISpot 결과와 일치하여, 환자 604(표 2B, 도 3)는 환자 603과 비교할 때 크기 관점에서 CD8+ T 세포 반응에서 더 작은 상승을 나타내었다. 흥미롭게도, 환자 603보다 크기가 더 작지만, 치료 후 증가될 가능성이 가장 큰 집단이 3개(CD38, CD137, Ki67) 활성화 마커 또는 모두 4개(이전 3개 이외에 CD69)의 동시 발현으로 이루어졌기 때문에, 환자 604에서 유도된 추정 CTL의 표현형은 더욱 고도의 활성 CD8+ T 세포의 가능성을 시사한다. 이러한 수의 활성화 마커의 공동-발현은 훨씬 더 드물며(Tebas et al., The New England journal of medicine. 2017; Bagarazzi et al., SciTranslMed. 2012;4(155):155ra38; Morrow et al., Molecular therapy oncolytics. 2016;3(16025; Trimble et al., Lancet. 2015;386(10008):2078-88; vMorrow et al., Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2018;24(2):276-94; Aggarwal et al., Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2019;25(1):110-24), 다수의 활성화 마커를 발현하는 CD8+ T 세포의 이전 조사는 이러한 세포가 그랜자임을 발현하고 동족 항원을 발현하는 표적에서 아폽토시스를 효과적으로 유도할 수 있음을 시사하였다(Duhen et al., Nat Commun. 2018 Jul 13;9(1):2724. doi: 10.1038/s41467-018-05072-0). 실제로, 이러한 마지막 사상은 환자 604가 크랜자임 및 퍼포린뿐만 아니라 그라눌리신에서도 발현의 증가를 나타내었다는 점에 주목하면 추가로 지지된다. 이러한 작은 샘플 크기의 한계가 문맥에 맞게 고려되어야 하지만, 이러한 평가의 결과는 INO-3106이 항원 반응의 맥락에서 활성화할 수 있는 CD8+ T 세포의 유도에 잠재적으로 이르게 하였으며 이러한 세포가 그랜자임, 퍼포린 및 그라눌리신 합성을 가능하게 하고 이에 따라 명확한 HPV6 특이적 CTL 표현형을 나타냄을 시사한다.

INO-3106은 RRP 환자에서 T 세포의 면역 전사 프로파일을 변경함

환자 PBMC의 단기 자극(24시간)을 수행하고, 이후에, 면역 유전자 전사체의 분석을 수행하였으며, 이는 HPV6 E6 및 E7-유래 펩타이드 풀로의 자극에 반응하여 특이적으로 조절되는 것으로 확인되었다. 환자 601로부터의 데이터는 도 6에서 확인될 수 있다. 환자 603 및 604에 대하여, 유전자 전사는 면역요법 후 전염증 특징의 상향조절과 가장 관련이 있었다. 환자 603은 기준선과 비교하여 투여 2에서 단지 대단하지 않은 차등의 유전자 발현을 나타내었다. 그러나, 2주 추적 방문에서, 선천적 면역 반응과 관련된 유전자(CXCL10, CXCL9, CCL7, CCL8), IFNγ 경로(GBP1, GBP5), 세포-세포 상호작용(CD209, MRC1) 및 B 세포 헬프(CXCL13)와 관련된 유전자의 현저한 상향조절이 자극되지 않은 세포와 비교하여 펩타이드 풀로 자극된 세포에서 관찰되었다. 환자 604는 또한, 환자 603에서 관찰된 바와 같이, 유사한 특징을 갖는, 2주 추적 방문에서 유전자 상향조절을 나타내었다(CXCL10, CXCL9, Stat1, GBP1, GBP5, CCL8). 또한, 환자 604에 대하여, 적응 세포 활성화를 나타내는 마커(CD274, TNFSF13B)의 상향조절이 관찰되었다. 환자 603에서 유전자 상향조절이 일시적인 반면, 환자 604는 투여 4 후 후기 추적 방문, 3개월 및 6개월에 이러한 특징을 거이 유지시켰다(도 4a, 표 3). 또한, 특히, 환자 604에 대하여, 항원 제시 세포에 의해 발현되는 분자인 IDO1의 발현은 시간에 따라 빠르게 증가하였으며, 이는 투여 2에서 8배, 2주 추적에서 10배, 3개월 추적에서 거의 13배까지 증가한 기준선에서 약 4배 차이를 나타내었고, 6개월 추적에서 65배 증가에서 최대화하였다(도 4a, 표 3).

11일 동안 시험관내 배양 이후 24시간 항원-재자극은 항원-특이적 T 세포를 관찰할 수 있었다. 자극 조건은 B 세포 및 다른 APC를 포함하는 다른 모든 세포 타입보다 T 세포 확대를 선호한다. 분석은 생체외 자극 후와 비교하여 감소된 수준의 차등 유전자 발현을 나타내었다. 전반적으로, RRP 환자 둘 모두는 기준선에서 상향조절되는 유전자가 거의 없는 유전자 상향조절의 유사한 패턴을 나타내었지만(환자 603- 0 유전자 및 환자 604- 7개의 유전자), 면역요법 후 시점에 차등 발현을 증가시켰다(환자 603- 각각 투여 4에서 4개의 유전자, 2주 추적에서 7개 유전자, 3 및 6개월 추적에서 3개의 유전자; 환자 604- 투여 2에서 12개의 유전자, 2주 후속에서 9개의 유전자, 3개월에 10개의 유전자 및 6개월의 추적에서 22개의 유전자)(도 4b). 두 RRP 환자 모두에 대해, 면역요법 후 샘플로부터 자극받은 세포에서 상향조절된 유전자 발현 프로파일은 주로 T 세포 활성화 및 기능성(CD276, TNFRSF8, TNFRSF9, GZMB)뿐만 아니라 B 세포 헬프(IL-21, CXCL13)와 관련되었다. 시험에 등록된 각 대상체에 대한 차등적으로 발현된 유전자의 전체 목록은 표 4 참조. CXCL10 및 CXCL9의 발현 증가는 또한, 모든 대상체에 대해 면역요법 후에도 관찰되었지만, 환자 604에서, 이러한 마커는 기준선에서 이미 증가되었다.

INO-3106은 RRP의 치료를 위한 외과적 개입에 대한 필요성을 감소시킴

연구에 참여하기 전에 대상체 603 및 604는 대략 180일마다 호흡기 유두종을 제거하기 위해 외과적 개입이 필요하였다. 이러한 패턴이 계속된다고 가정하면, 연구 과정에 걸쳐 필요한 외과 개입의 예상 횟수는 대상체 603에 대해 4회, 및 대상체 604에 대해 2회일 것이다. 그러나, 연구 전체에 걸쳐, 어느 대상체도 기도 유두종의 제거를 위한 외과적 개입을 필요로 하지 않았으며, 이는 이러한 질환의 치료에서 개입에 대한 필요성의 임상적 변화를 구성한다. 이러한 대상체의 연구후 추적은, 대상체 603이 이러한 공개 시점에 질환의 치료에 외과적 개입을 필요로 하지 않았으며, 총 915일 이상 수술을 받지 않은 것으로 나타났다. 584일 후에, 대상체 604는 적절한 치료를 위해 외과적 개입이 필요한 질환이 재발되었으며, 수술 빈도는 전체적으로 3배 이상 감소하였다(도 5). 이러한 환자의 결과의 차이는 연구 중에 생성된 임의의 면역학 데이터가 치료에 대한 차등적인 임상 반응을 시사하는 지 검사를 촉구하였다. 유세포분석의 평가는 대상체 604가 대상체 603보다 HPV6-특이적 CTL 형태의 더욱 강력한 면역 활성을 가짐을 나타내었다(도 5). 임의의 특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 이에 따라, 대상체 CTL에 대한 활성화 마커 발현의 반응 크기 및 패턴 둘 모두의 차이가 임상 영향의 지속성과 관련이 있을 수 있다는 것이 가능하다.

본 명세서에는 IL-12 DNA 애주번트가 근육내 투여되고 HPV6 관련 호흡 소화 전암성 병변 및 악성 종양을 갖는 3명의 환자에서 CELLECTRA® 디바이스에 의해 전기천공을 통해 전달되고 전달되지 않은 HPV6 E6/E7 특이적 표적화된 DNA 면역요법의 I상 안전성 및 면역학 임상 시험의 결과가 보고된다. 면역요법의 투여는 내약성이 우수하였다. 치료-관련 SAE가 존재하지 않았으며, 가장 빈번한 치료-유발 AE는 주사 부위 반응이었다. 모든 환자는 적어도 하나의 면역학적 평가에 의해 입증된 바와 같이 HPV6 E6 및 E7 항원에 대한 세포 반응의 유도를 나타내었다. 특히, 두 평가 가능한 RRP 환자 모두는 이의 연구전 수술 빈도에 비해 주로 지연된 치료 개입(예를 들어, 수술) 형태로, INO-3106으로의 치료로부터 임상적 이점을 도출하였다. 또한, INO-3106 치료 후 더욱 강력한 세포 활성을 나타낸 환자가 수술을 받지 않은 상태로 유지되는 반면 덜 강력한 세포 활성을 갖는 환자가 지연되었지만 수술을 완전히 회피하지 않았다는 사실은 HPV6-특이적 세포 반응의 유도와 임상적 이점의 타입/지속 기간 사이에 가능한 인과 관계를 시사한다. 이러한 결과는 고무적이고, 특정 경우에, 이러한 치료 환경에서 세포 반응을 계속 촉진하는 데 추가적인 투여가 바람직할 수 있다는 아이디어를 제시한다. INO-3106으로의 치료는 다양한 면역검정에 걸쳐 HPV6-특이적 세포 반응의 유도를 야기시켰다. ELISpot를 이용한 IFNγ의 생성 확인뿐만 아니라 유세포분석을 통한 CD8+ T 세포에 대한 그랜자임 및 퍼포린의 합성에 수반되는 활성화 마커의 발현의 확인은 INO-3106이 고도로 활성화된 세포독성 림프구의 특징을 갖는 T 세포를 포함한 전염증성 면역 반응의 유도를 유도하였다. 이러한 결과는 치료 완료 후 PBMC에서 전염증성뿐만 아니라 조절 유전자 전사체의 동적 조절의 관찰에 의해 더욱 강조된다. 상세하게는, CXCL10 및 GBP1과 같은 IFNγ 경로와 관련된 유전자는 단기 및 장기 자극 둘 모두 후에 상향조절되었다. 두경부의 편평 세포 암종에서의 최근 연구에서는 IFNγ, CXCL9, CXCL10, IDO1 HLA-DRA 및 STAT1을 기반으로 한 종합 스코어가 치료 반응률과 유의미하게 상관 관계가 있는데, 이는 IFNγ-기반 특징이 치료 이점과 관련이 있음을 나타낸다(Ahn et al., Laryngoscope. 2018;128(1):E27-E32). 또한, 그랜자임 B 및 TNFRSF9의 발현 증가가 관찰되었는데, 이는 전사체 수준에서 세포독성 림프구의 활성을 확인하였다. HPV-유발 질환 퇴치에서 이러한 특성의 T 세포 반응의 필요성은 DNA-기반 면역요법에 대한 2건의 이전 임상 시험에서 예시되었으며, 둘 모두는 CELLECTRA® 디바이스를 이용하여 전달되었다. HPV-관련 자궁경부 이형성증의 맥락에서, HPV 감염의 제거와 수반되는 병소의 퇴행 형태로 VGX-3100(HPV16/18에 대해 DNA 면역요법)으로의 치료에 대한 임상 반응은 세포독성의 표현형 마커를 나타내는 IFNγ 및 CD8+ T 세포를 포함한 강력한 세포 반응의 존재와 통계적으로 관련되었다(Trimble et al., Lancet. 2015;386(10008):2078-88). 추가적으로, 구강인두의 HPV-관련 편평 세포암의 치료를 조사하는 다른 시험에서, MEDI0457(플라스미드 인코딩된 IL-12 애주번트를 갖는 HPV16/18에 대한 DNA 면역요법)로의 치료 후 니볼루맙으로ㅢ 칠에 대한 완전한 반응을 달성한 전이성 암을 갖는 환자는 PD1+ 세포독성 T 세포의 치료-유도 강력한 확장을 갖는 것으로서 기록되었다(Aggarwal et al., Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2019;25(1):110-24). 이에 따라, 현 연구는 CELLECTRA® 디바이스에 의해 전달된 HPV-특이적 면역요법이 HPV-관련 종양형성에 임상적으로 영향을 미칠 가능성이 있는 강력한 T 세포 반응의 생성을 유도한다는 추가 증거를 제공한다.

이러한 연구로부터 수집된 데이터는 HPV 특이적 면역요법이 HPV6 관련 재발성 호흡기 유두종증을 갖는 환자의 임상 상태에 영향을 미칠 수 있고, 추가적인 또는 대안적인 애주번트 요법으로서 작용할 수 있음을 시사하는 첫 번째 데이터이다. 이러한 발견은 올해 초 발표된 데이터를 보완하며, 여기서, 펨브롤리주맙의 투여는 일상적인 외과적 개입의 필요성 감소와 관련이 있었다(Pai et al., Journal of Clinical Oncology. 37. 2502-2502. 10.1200/JCO.2019.37.15_suppl.2502). 함께, 이러한 발견은 이러한 환자의 관리에서 면역치료적 접근의 사용을 뒷받침하는 초기 데이터를 제공한다. 이러한 질환에 대한 치료의 표준은 반복적인 외과적 개입이며, 이는 여러 합병증을 나타내고, 잠족성 바이러스가 인접한 조직에 존재할 수 있기 때문에 병소 재발을 완전히 근절할 가능성이 없다(Chow et al., APMIS. 2010;118(6-7):422-49). 다른 비-외과적 애주번트 개입은 병소의 빠른 재성장 또는 공격적인 질환을 갖는 환자에서 나타내지만, 이러한 요법은 또한, 고유한 위험을 수반하고, 최적의 치료 요법을 결정하기 위해 추가 평가를 필요로 한다(Derkay et al., Otolaryngol Clin North Am. 2019;52(4):669-79). 현 치료 한계는 HPV 양성 호흡 소화관 질환을 갖는 환자를 치료하기 위해 비-침습적 및 면역 매개 방식을 식별할 필요를 강조한다. 실제로, 예방 HPV 백신은 유두종 성장을 감소시키고 개입들 사이에 시험을 연장하는 것으로 보고되었지만, 치료 효능의 결정은 지속적인 평가를 필요로 한다(Makiyama et al., J Voice. 2017;31(1):104-6). 유사하게는, PD-1/PD-L1 억제는 RRP를 치료하는 합리적인 방식을 나타내지만, 임상 결과에 대한 발현 및 영향은 덜 특징적이다(Ahn et al., Laryngoscope. 2018;128(1):E27-E32).

본 연구로부터 생성된 데이터는, 비-침습성 면역 매개 방식으로서 INO-3106 및 IL-12 애주번트로의 면역요법이 RRP에 대한 기존 치료 결핍을 해결하기 위한 옵션을 제공할 수 있음을 시사한다.

SEQUENCE LISTING <110> INOVIO PHARMACEUTICALS, INC. THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA <120> IMPROVED VACCINES FOR RECURRENT RESPIRATORY PAPILLOMATOSIS AND METHODS FOR USING THE SAME <130> WO/2021/081480 <140> PCT/US2020/057314 <141> 2020-10-26 <150> US 62/925,283 <151> 2019-10-24 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 873 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV6 E6E7 DNA sequence <400> 1 ggtaccggat ccgccaccat ggactggacc tggattctgt tcctggtggc cgctgccaca 60 cgggtgcaca gcgaaagcgc caatgccagc accagcgcta caaccatcga ccagctgtgc 120 aagaccttca acctgagcat gcacaccctg cagatcaact gcgtgttctg caagaacgcc 180 ctgaccaccg ccgagatcta cagctacgcc tacaagcagc tgaaggtgct gttcagaggc 240 ggctacccct atgccgcctg cgcctgctgc ctggaatttc acggcaagat caaccagtac 300 cggcacttcg actacgccgg ctacgccacc accgtggaag aggaaacaaa gcaggacatc 360 ctggacgtgc tgatccggtg ctacctgtgc cacaagcccc tgtgcgaggt ggaaaaagtg 420 aagcacatcc tgaccaaggc ccggttcatc aagctgaact gcacctggaa gggccggtgc 480 ctgcactgct ggaccacctg tatggaagat atgctgccca gaggccggaa gcggcggagc 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Gln 100 105 110 Asp Ile Leu Asp Val Leu Ile Arg Cys Tyr Leu Cys His Lys Pro Leu 115 120 125 Cys Glu Val Glu Lys Val Lys His Ile Leu Thr Lys Ala Arg Phe Ile 130 135 140 Lys Leu Asn Cys Thr Trp Lys Gly Arg Cys Leu His Cys Trp Thr Thr 145 150 155 160 Cys Met Glu Asp Met Leu Pro Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser His Gly 165 170 175 Arg His Val Thr Leu Lys Asp Ile Val Leu Asp Leu Gln Pro Pro Asp 180 185 190 Pro Val Gly Leu His Cys Tyr Glu Gln Leu Val Asp Ser Ser Glu Asp 195 200 205 Glu Val Asp Glu Val Asp Gly Gln Asp Ser Gln Pro Leu Lys Gln His 210 215 220 Phe Gln Ile Val Thr Cys Cys Cys Gly Cys Asp Ser Asn Val Arg Leu 225 230 235 240 Val Val Gln Cys Thr Glu Thr Asp Ile Arg Glu Val Gln Gln Leu Leu 245 250 255 Leu Gly Thr Leu Asn Ile Val Cys Pro Ile Cys Ala Pro Lys Thr Tyr 260 265 270 Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 275 280 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE Leader DNA sequence <400> 3 atggactgga cctggatcct gttcctggtg gccgctgcca cacgggtgca cagc 54 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE leader protein <400> 4 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser <210> 5 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p35 DNA sequence <400> 5 atgtgtccag cgcgcagcct cctccttgtg gctaccctgg tcctcctgga ccacctcagt 60 ttggccagaa acctccccgt ggccactcca gacccaggaa tgttcccatg ccttcaccac 120 tcccaaaacc tgctgagggc cgtcagcaac atgctccaga aggccagaca aactctagaa 180 ttttaccctt gcacttctga agagattgat catgaagata tcacaaaaga taaaaccagc 240 acagtggagg cctgtttacc attggaatta accaagaatg agagttgcct aaattccaga 300 gagacctctt tcataactaa tgggagttgc ctggcctcca gaaagacctc ttttatgatg 360 gccctgtgcc ttagtagtat ttatgaagac ttgaagatgt accaggtgga gttcaagacc 420 atgaatgcaa agcttctgat ggatcctaag aggcagatct ttctagatca aaacatgctg 480 gcagttattg atgagctgat gcaggccctg aatttcaaca gtgagactgt gccacaaaaa 540 tcctcccttg aagaaccgga tttttataaa actaaaatca agctctgcat acttcttcat 600 gctttcagaa ttcgggcagt gactattgat agagtgatga gctatctgaa tgcttcctaa 660 <210> 6 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p35 amino acid sequence <400> 6 Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro 20 25 30 Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val 35 40 45 Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys 50 55 60 Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser 65 70 75 80 Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys 85 90 95 Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala 100 105 110 Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr 115 120 125 Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys 130 135 140 Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu 145 150 155 160 Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr 165 170 175 Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys 180 185 190 Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr 195 200 205 Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser 210 215 <210> 7 <211> 987 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p40 DNA sequence <400> 7 atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60 gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120 gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180 accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240 gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300 ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360 aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420 acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480 ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540 agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600 gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660 gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720 ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780 acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840 agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900 cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960 gaatgggcat ctgtgccctg cagttag 987 <210> 8 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p40 amino acid sequence <400> 8 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln 50 55 60 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val 85 90 95 Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe 115 120 125 Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp 130 135 140 Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser 165 170 175 Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu 180 185 190 Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile 195 200 205 Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr 210 215 220 Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn 225 230 235 240 Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp 245 250 255 Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr 260 265 270 Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg 275 280 285 Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala 290 295 300 Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser 305 310 315 320 Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser 325

Claims (17)

1. 개체에서 재발성 호흡기 유두종증(recurrent respiratory papillomatosis; RRP)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 개체에, HPV6 항원을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 HPV6 항원은 HPV6 E6-E7 융합 항원인, 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 핵산 분자는,
   서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
   서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열;
   서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편;
   서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열
   로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 98% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
5. 제3항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 2를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 99% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
6. 제3항에 있어서, 상기 HPV6 E6-E7 융합 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 5' 단부에 서열번호 4를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 리더 서열이 없는, 방법.
7. 제3항에 있어서, 상기 핵산 분자는,
   서열번호 1을 포함하는 뉴클레오타이드 서열;
   서열번호 1과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열;
   서열번호 1의 단편;
   서열번호 1의 단편과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열
   로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
8. 제3항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1과 적어도 98% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
9. 제3항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1과 적어도 99% 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
10. 제3항에 있어서, 상기 핵산 분자는 플라스미드인, 방법.
11. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인, 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 개체에 애주번트를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 개체에 IL-12의 p35 및 p40 서브유닛 중 하나 이상을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 p35를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은,
    서열번호 6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
    서열번호 6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열;
    서열번호 6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편;
    서열번호 6을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
15. 제13항에 있어서, 상기 p40을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은,
    서열번호 8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
    서열번호 8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열;
    서열번호 8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
16. 서열번호 8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편과 적어도 95% 상동성인 뉴클레오타이드 서열.
17. 제3항에 있어서, 상기 개체에 상기 핵산 분자를 투여하는 단계는 전기천공을 포함하는, 방법.

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