CN115443287A - 复发性呼吸道***瘤病的改进疫苗及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
公开了抗HPV免疫原和编码它们的核酸分子在治疗和预防RRP中的用途。公开了药物组合物、包含DNA质粒的重组疫苗和减毒活疫苗,并公开了诱导免疫反应以治疗或预防RRP的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年10月24日提交的美国临时申请号62/925,283的优先权和利益,其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及改进的人***瘤病毒(HPV)疫苗,改进的诱导免疫反应的方法,以及改进的预防性和/或治疗性地使个体对复发性呼吸道***瘤病(RRP)免疫的方法。
背景技术
人***瘤病毒相关(HPV+)恶性肿瘤是一种新兴的全球流行病(Gradishar等人,《国家综合癌症网络杂志:JNCCN(Journal of the National Comprehensive CancerNetwork:JNCCN)》2014;12(4):542-90.)。HPV相关的呼吸消化癌前病变和恶性肿瘤可能发生在口咽、喉和上呼吸道。虽然HPV6在大多数呼吸消化***恶性肿瘤的病因学中的作用仍不清楚,但它的作用被广泛认为与复发性呼吸道***瘤病(RRP)有因果关系(Mounts等人,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA.)》1982;79(17):5425-9;Gissmann等人,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA.)》1983;80(2):560-3;Bonagura等人,《斯堪的纳维亚病理微生物学与免疫学学报(APMIS.)》2010;118(6-7):455-70),复发性呼吸道***瘤病(RRP)是喉上皮最常见的良性肿瘤。RRP是罕见的,在美国的发病率估计为1.8人/100,000名成年人(Winton等人,《新英格兰医学杂志(The New England journal ofmedicine.)》2005;352(25):2589-97)。尽管大多数病变是良性的,但有些会发生恶性转化,并且RRP患者发生喉肿瘤和癌的风险更高(Omland等人,《美国科学公共图书馆(PloSone.)》2014;9(6):e99114)。
RRP的临床过程在受影响的个体中可能有很大差异。包括不进行治疗的主动监测、手术、放射疗法或组合在内的治疗的选择取决于许多因素。通常,反复手术切除***状瘤以用于对症管理仍然是治疗主力军(Derkay等人,《北美耳鼻喉科诊所(Otolaryngol ClinNorth Am.)》2019;52(4):669-79)。在少数情况下,可能会发生恶性转化,这通常与预后不良有关。一些患有恶性疾病的此类患者可能是包括潜在的决定性手术在内的挽救疗法的候选者(Richey等人,《耳鼻咽喉头颈外科:美国耳鼻咽喉头颈外科科学学会官方期刊(Otolaryngology—head and neck surgery:official journal of American Academyof Otolaryngology-Head and Neck Surgery.)》2007;136(l):98-103)。尽管这种方法的患病率高,在这种情况下选定的患者可能会受益于放射。(Mendenhall等人,《美国临床肿瘤学杂志(American journal of clinical oncology.)》2008;31(4):393-8)。最近,一项派姆单抗在RRP患者中的II期研究表明反应率为43%,并支持RRP免疫治疗管理的基本原理(Pai等人,《临床肿瘤学杂志(Journal of Clinical Oncology.)》2019;37(15_suppl):2502)。
因此,本领域需要用于治疗或预防RRP的改进组合物和方法。本发明满足了这种未满足的需要。
发明内容
本发明的方面提供包含至少一种核苷酸序列的组合物,所述核苷酸序列包含HPV6E6-E7融合抗原,及其用于治疗或预防RRP的用途。
另一方面提供了包含一个或多个编码HPV6 E6-E7融合抗原的核苷酸序列的组合物,所述抗原选自由以下组成的群组:编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列;与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少95%同源的核苷酸序列;与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列片段至少95%同源的核苷酸序列。在一些实施例中,编码HPV6 E6-E7融合抗原的核苷酸序列在5'端没有前导序列,所述核苷酸序列是编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
在本发明的另一个方面,提供了包含一个或多个编码HPV6 E6-E7融合抗原的核苷酸序列的组合物,所述抗原选自由以下组成的群组:SEQ ID NO:1;与SEQ ID NO:1至少95%同源的核苷酸序列;SEQ ID NO:1的片段;与SEQ ID NO:1的片段至少95%同源的核苷酸序列。在一些实施例中,编码HPV6 E6-E7融合抗原的核苷酸序列在5'端没有前导序列,所述核苷酸序列具有核苷酸序列SEQ ID NO:3。
提供的核苷酸序列可以是质粒。
在另外的方面,提供了包含所公开的核苷酸序列的药物组合物。
在一些方面,存在通过在个体中诱导有效免疫反应来治疗或预防个体中RRP的方法,包括向所述个体施用包含一种或多种所提供的核苷酸序列的组合物。该方法优选包括通过电穿孔将所提供的核苷酸序列引入个体的步骤。
在一些方面,该方法进一步包括向个体施用包含佐剂的组合物。在一个实施例中,该方法进一步包括向个体施用包含编码IL-12的核酸分子的组合物。例如,在某些实施例中,该方法进一步包括向个体施用组合物,该组合物包含编码以下一种或多种的核酸分子:IL-12的p35和p40亚基。
在一些方面,该方法包括向个体施用核酸分子,该核酸分子包含编码以下一种或多种的核苷酸序列:IL-12的p35和p40亚基。在一个实施例中,编码p35的核苷酸序列包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列:编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列;与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列至少95%同源的核苷酸序列;编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列片段;与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列片段至少95%同源的核苷酸序列。在一个实施例中,编码p40的核苷酸序列包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列:编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列;与编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列至少95%同源的核苷酸序列;编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列片段;与编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列片段至少95%同源的核苷酸序列。
附图说明
图1:HPV6 E6和HPV6 E7 SynCon抗原的比较3D模型。E6被建模为单体,并且E7的有序C末端区域被建模为同源二聚体。无序的N末端如图所示。两者都以带有侧链和透明的溶剂可及表面的带状形式显示。两个模型上的锌指基序都有注释。
图2:干扰素γ由RRP患者的HPV6 E6和HPV6 E7特异性T细胞产生。在整个研究中纵向跟踪受试者603(上图)和604(下图)在ELISpot测定中产生干扰素γ的能力。E6特异性活性以蓝色虚线显示,E7特异性活性以蓝色实线显示,两种抗原的总和以黑色实线显示。记录了长期随访(LTFU)时间点,并相对于第4剂完成后的时间进行了描述。
图3:INO-3106在RRP患者中激活HPV6特异性细胞毒性淋巴细胞。进行流式细胞术以评估免疫疗法之前和之后取自受试者的HPV6特异性CD8+T细胞上的激活标志物表达。左栏中记录了患者604在用INO-3106治疗之前(上图)和之后(下图)的CD137和CD38表达。右栏中记录了患者604在用INO-3106治疗之前(上图)和之后(下图)Ki67和CD69的表达。
图4A和图4B:免疫基因转录物在INO-3106治疗后以HPV6特异性方式受到差异调节。热图显示疫苗接种之前和之后受刺激细胞与未受刺激细胞中差异表达基因的倍数差异。(图4A)用肽库刺激24小时的细胞与单独培养基刺激24小时的细胞中基因表达的变化倍数(≥2倍)。(图4B)T细胞扩增11天,然后用肽库再刺激细胞24小时与单独培养基再刺激细胞24小时之后,基因表达的变化倍数(≥2倍)。数据转换为log2变化倍数,红色表示上调,和绿色表示下调。
图5:用INO-3106治疗RRP患者以避免手术的形式赋予临床益处。上图-游泳者图,表示受试者604和603无手术的持续时间,以天计。红色虚线表示基于先前在INO-3106干预之前的手术频率预期手术的时间点。Φ表示受试者604需要手术的时间点。λ表示截至所指示的时间点,受试者603保持无手术。左下图-绿条跟踪左侧y轴,并指示表达CD38、Ki67、颗粒酶A、颗粒酶B和穿孔素的HPV6特异性CD8+T细胞的大小。蓝条跟踪右侧y轴,并指示相对于这些受试者的预期手术频率的无手术时间的变化倍数。右下图指示患者ID、无手术时间增加的倍数、总无手术时间以及这些受试者在INO-3106治疗后经历的无手术时间增加。
图6描绘了评估受试者601的HPV6 E6和E7细胞免疫反应的实验结果。
具体实施方式
本文使用的术语仅出于描述特定实施例的目的,并不旨在进行限制。如在说明书和所附权利要求中使用的,单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物,除非上下文另有明确规定。
为了叙述本文的数值范围,明确涵盖其间具有相同精确度的每一个***数值。举例来说,当范围为6-9时,除了6和9外,还涵盖数字7和8;且当范围为6.0-7.0时,明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6,9和7.0。
a.佐剂
如本文所用的“佐剂”可以指添加到本文所述的DNA质粒疫苗中以增强一种或多种由DNA质粒编码并编码下文所述的核酸序列的抗原的抗原性的任何分子。
b.抗体
“抗体”可以指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类的抗体,或其片段、片段或衍生物,包括Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从哺乳动物的血清样本中分离的抗体,多克隆抗体,亲合纯化的抗体或其混合物,所述抗体或其混合物对期望的表位或由其衍生的序列表现出足够的结合特异性。
c.抗原
“抗原”是指如下蛋白质:具有HPV E6或HPV E7结构域,并且优选与E6和E7融合,在其间具有内切蛋白水解切割位点。抗原包括SEQ ID NO:2(亚型6);其具有本文所述的长度的片段,变体,即具有与本文所述的SEQ ID NO:2同源的序列的蛋白质,具有本文所述的长度的变体的片段,以及它们的组合。抗原可具有SEQ ID NO:4的IgE前导序列或可替代地具有从N末端去除的此类序列。抗原可以任选地包括信号肽,例如来自其它蛋白质的那些肽。
d.编码序列
如本文所用,“编码序列”或“编码核酸”可意指包含编码如上述c部分所述抗原的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可以进一步包含与调节元件可操作地连接的起始信号和终止信号,所述调节元件包含能够在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中直接表达的启动子和聚腺苷酸化信号。编码序列可进一步包括编码信号肽的序列,例如IgE前导序列,如SEQ ID NO:3。
e.补体
如本文所使用的,“补体”或“互补”可能意味着核酸可能在核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间具有沃森-克里克(Watson-Crick)(例如,A-T/U和C-G)或胡格斯丁(Hoogsteen)碱基配对。
f.片段
“片段”可以意指抗原的多肽片段,其能够引发哺乳动物中针对该抗原的免疫反应。抗原片段可以与全长100%相同,除了在N和/或C末端缺少至少一个氨基酸,在每种情况下在位置1处有或没有信号肽和/或甲硫氨酸。片段可以包含特定全长抗原长度(不包括添加的任何异源信号肽)的60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多百分比。优选地,该片段可以包含与抗原95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多或99%或更多同源的多肽片段,并且另外包含在计算同源性百分比时不包括在内的N末端甲硫氨酸或异源信号肽。片段可进一步包含N末端甲硫氨酸和/或信号肽,例如免疫球蛋白信号肽,例如IgE或IgG信号肽。N末端甲硫氨酸和/或信号肽可以与抗原片段连接。
编码抗原的核酸序列片段可以与全长100%相同,除了在5'和/或3'端缺少至少一个核苷酸,在每种情况下在位置1处有或没有编码信号肽和/或甲硫氨酸的序列。片段可包含特定全长编码序列长度(不包括添加的任何异源信号肽)的60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多百分比。优选地,该片段可以包含编码多肽的片段,该多肽与抗原95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多或99%或更多同源,并且另外任选包含在计算同源性百分比时不包括在内的N末端甲硫氨酸或异源信号肽。片段可进一步包含N末端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。对N端甲硫氨酸和/或信号肽进行编码的编码序列可以与编码序列的片段连接。
g.相同
如本文在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中使用的“相同”或“同一性”,可以指该序列在指定区域内具有指定百分比的相同残基。可以通过以下计算百分比:优化比对两个序列、比较指定区域内的两个序列、确定两个序列中出现相同残基的位置的数量以产生匹配位置的数量、将匹配位置数除以指定区域中的总位置数以及将结果乘以100得出序列同一性的百分比。在两个序列长度不同或比对产生一个或多个交错末端并且指定的比较区域仅包含单个序列的情况下,单个序列的残基包含在分母中但不包含在计算的分子中。在比较DNA和RNA时,胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可能被认为是等同的。可以手动或通过使用计算机序列算法(如BLAST或BLAST 2.0)执行同一性。
h.免疫反应
如本文所用,“免疫反应”可以指宿主免疫***的激活,例如哺乳动物免疫***响应于通过所提供的DNA质粒疫苗引入一种或多种抗原的激活。免疫应答可以呈细胞或体液应答的形式,或两者兼有。
i.核酸
如本文所使用的,“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可以意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。对单链的描绘也定义了互补链的序列。因此,核酸还涵盖所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可以出于与给定核酸相同的目的而使用。因此,核酸还涵盖基本上相同的核酸和其补体。单链提供了可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此,核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链或双链的,或者可以含有双链序列和单链序列两者的部分。核酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA两者)、RNA或杂交体,其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合以及包含尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基组合。可以通过化学合成法或通过重组方法获得核酸。
j.可操作地连接
如本文所使用的,“可操作地连接”可以意指基因的表达是与其在空间上连接的启动子的控制下进行。启动子可以位于其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可能与所述启动子与所述启动子在其来源的基因中控制的基因之间的距离大致相同。如本领域已知的,可以在不损失启动子功能的情况下适应此距离的变化。
k.启动子
如本文所使用的,“启动子”可以意指能够赋予、激活或增强细胞中核酸的表达的合成或天然源性分子。启动子可以包括一个或多个具体转录调节序列以进一步增强表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可以包括远侧增强子或阻遏子元件,这些元件可以定位在与转录起始位点相距多达数千个碱基对处。启动子可以来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可以相对于发生表达的细胞、组织或器官或相对于表达发生的发育阶段或响应于如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂等外部刺激而组成性地或差异性地调节基因组分的表达。启动子的代表性实例包括细菌噬菌体T7启动子、细菌噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMVIE启动子。
l.严格杂交条件
如本文所用的“严格杂交条件”可以意指第一核酸序列(例如,探针)将与第二核酸序列(例如,靶标)如在核酸的复杂混合物中杂交的条件。严格条件取决于序列,并且在不同情况下会有所不同。严格条件可以选择为比特定序列在确定的离子强度pH下的热熔点(Tm)低约5 10℃。Tm可以是温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下),在该温度下,与靶标互补的探针的50%与靶标序列杂交,处于平衡状态(靶标序列过量存在时,在Tm下,50%的探针处于平衡状态)。严格条件可以是以下条件:其中盐浓度小于约1.0M钠离子,例如在pH7.0至8.3下约0.01-1.0M钠离子浓度(或其他盐),并且用于短探针(例如,约10-50个核苷酸)的温度为至少约30℃和用于长探针(例如,大于约50个核苷酸)的温度为至少约60℃。严格条件还可以通过添加如甲酰胺等去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交,阳性信号可能是背景杂交的至少2到10倍。示例性严格杂交条件包含以下:50%甲酰胺,5x SSC和1%SDS,在42℃下孵育,或者5x SSC,1%SDS,在65℃下孵育,在0.2x SSC和0.1%SDS中在65℃下洗涤。
m.基本互补
如本文所用,“基本互补”可以指第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域上与第二序列的互补序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性,或者两条序列在严格杂交条件下杂交。
n.基本相同
如本文所用,“基本相同”可以指第一和第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域上至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%相同,或就核酸而言,假设第一序列与第二序列的互补序列基本互补。
o.变异体
本文所用的关于核酸的“变体”可以意指:(i)所引用的核苷酸序列的部分或片段;(ii)所引用的核苷酸序列或其部分的补体;(iii)与所引用的核酸或其补体基本上相同的核酸;或(iv)在严格条件下与所引用的核酸、其补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。
关于肽或多肽的“变异体”通过***、缺失或保守取代氨基酸而使氨基酸序列不同,但保留至少一种生物活性。变体还可以意指与具有氨基酸序列的保留至少一种生物活性的所引用的蛋白质基本上相同的具有氨基酸序列的蛋白质。氨基酸的保守取代,即用具有类似性质(例如,亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸在本领域中被认为典型地涉及微小变化。如本领域所理解的,可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定这些微小变化。Kyte等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》157:105-132(1982).氨基酸的亲水指数是基于对其疏水性和电荷的考虑。本领域已知具有类似亲水指数的氨基酸可以被取代并且仍然保留蛋白质功能。在一方面,具有±2的亲水指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以用于揭示将产生保留生物学功能的蛋白质的取代基。在肽的上下文中对氨基酸亲水性的考虑允许计算所述肽的最大局部平均亲水性,这是已经报道与抗原性和免疫原性良好相关的有用测量。美国专利号4,554,101通过引用整体并入本文。如本领域所理解的,具有类似亲水性值的氨基酸的取代可以导致保留生物学活性(例如,免疫原性)的肽。可以用亲水性值在±2以内的氨基酸进行彼此取代。氨基酸的疏水性指数和亲水值受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致,与生物学功能相容的氨基酸取代应理解为取决于氨基酸的相对类似性,并且尤其是那些氨基酸的侧链,如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质所揭示的。
p.载体
本文使用的“载体”可以指含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体或掺入到宿主基因组中的载体。
公开了改进的疫苗,其源于增强由免疫原诱导的细胞免疫反应的多阶段策略。生成了修改的共有序列。还公开了遗传修饰,包括密码子优化、RNA优化和添加高效免疫球蛋白前导序列。与相应的密码子优化的免疫原相比,该新型构建体被设计为引发更强和更广泛的细胞免疫反应。
改进的HPV疫苗基于蛋白质和基因构建体,该蛋白质和基因构建体编码具有使它们作为免疫原特别有效的表位的蛋白质,使得它们介导针对RRP的预防或治疗策略。因此,疫苗可以诱导治疗性或预防性免疫反应。在一些实施例中,递送免疫原的手段是DNA疫苗、重组疫苗、蛋白质亚基疫苗、包含免疫原的组合物、减毒疫苗或灭活疫苗。在一些实施例中,疫苗包含选自由以下组成的群组的组合:一种或多种DNA疫苗、一种或多种重组疫苗、一种或多种蛋白质亚基疫苗、一种或多种包含免疫原的组合物、一种或多种减毒疫苗和一种或多种灭活疫苗。
根据一些实施例,将疫苗递送至个体以调节个体免疫***的活性并由此增强针对HPV的免疫反应以治疗RRP。当编码蛋白质的核酸分子被个体的细胞摄取时,核苷酸序列在细胞中表达并且蛋白质由此被递送至个体。提供了在核酸分子如质粒上递送蛋白质编码序列作为重组疫苗的一部分和作为减毒疫苗的一部分,作为分离的蛋白质或载体的蛋白质部分的方法。
提供了在个体中提供针对RRP的预防性和/或治疗性治疗的组合物和方法。
用于递送包含编码免疫原的核苷酸序列的核酸分子的组合物与调节元件可操作地连接。组合物可以包括编码免疫原的质粒、包含编码免疫原的核苷酸序列的重组疫苗、编码本发明蛋白质和/或包括本发明蛋白质的减毒活病原体;包括本发明蛋白质的灭活病原体;或包含本发明蛋白质的组合物,例如脂质体或亚基疫苗。本发明进一步涉及包含组合物的可注射药物组合物。
本发明的方面提供了包含至少一种核苷酸序列的组合物,所述核苷酸序列包含HPV6 E6-E7融合抗原。
另一方面提供了包含一个或多个编码HPV6 E6-E7融合抗原的核苷酸序列的组合物,所述抗原选自由以下组成的群组:编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列;与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少95%同源的核苷酸序列;编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列片段;与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列片段至少95%同源的核苷酸序列。
在一些实施例中,组合物包括HPV6 E6-E7融合抗原,所述抗原选自由以下组成的群组:编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列;与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少95%同源的核苷酸序列;编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列片段;与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列片段至少95%同源的核苷酸序列。
在本发明的另一方面,提供了包含一个或多个编码HPV6 E6-E7融合抗原的核苷酸序列的组合物,所述抗原选自由以下组成的群组:SEQ ID NO:1;与SEQ ID NO:1至少95%同源的核苷酸序列;SEQ ID NO:1的片段;与SEQ ID NO:1的片段至少95%同源的核苷酸序列。
在一些实施例中,本文所述的核苷酸序列不存在前导序列。在一个实施例中,包含HPV6 E6-E7融合抗原的核苷酸序列不存在前导序列。特别地,包括编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列的HPV6 E6-E7融合抗原在5'端不存在前导序列,例如编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列。特别地,包括核苷酸序列SEQ ID NO:1的HPV6 E6-E7融合抗原在5'端不存在前导序列,例如核苷酸序列SEQ ID NO:3。
在一些实施例中,本发明的核苷酸序列可以与所提供的核苷酸序列80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源;优选95%、96%、97%、98%或99%;或98%或99%。
提供的核苷酸序列可以包括在多种已知载体或递送***之一中,包括质粒、病毒载体、脂质载体、纳米颗粒;优选质粒。
在另外的方面,提供了包含所公开的核苷酸序列的药物组合物。
在一些方面,存在诱导个体中针对多于一种HPV亚型的有效免疫反应从而提供针对RRP的预防性或治疗性治疗的方法,包括向所述个体施用包含所提供的一种或多种核苷酸序列的组合物;优选地,组合物具有多于一种抗原。该方法优选包括通过电穿孔将所提供的核苷酸序列引入个体的步骤。
SEQ ID NO:1包含编码HPV6 E6和E7蛋白质的共有免疫原的核苷酸序列。SEQ IDNO:1包括与SEQ ID NO:1的5'端的核苷酸序列连接的IgE前导序列SEQ ID NO:3。SEQ IDNO:2包含HPV 6E6和E7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。SEQ ID NO:2包括在共有免疫原序列的N末端的IgE前导序列SEQ ID NO:4。IgE前导序列是SEQ ID NO:4并且可以由SEQ IDNO:3编码。关于HPV6 E6-E7融合抗原的进一步信息至少可以在美国专利号9,050,287中找到,该专利通过引用整体并入。
在一些实施例中,疫苗包括SEQ ID NO:2,或编码SEQ ID NO:2的核酸分子。
SEQ ID NO:2的片段可以与全长100%相同,除了在N和/或C末端缺少至少一个氨基酸,在每种情况下在位置1处有或没有信号肽和/或甲硫氨酸。SEQ ID NO:2的片段可以包含全长SEQ ID NO:2长度(不包括添加的任何异源信号肽)的60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多百分比。优选地,该片段可以包含与SEQ ID NO:2的95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多或99%或更多同源的SEQ ID NO:2片段,并且另外包含在计算同源性百分比时不包括在内的N末端甲硫氨酸或异源信号肽。片段可以进一步包含N末端甲硫氨酸和/或信号肽,例如免疫球蛋白信号肽,如IgE或IgG信号肽。N末端甲硫氨酸和/或信号肽可以与该片段连接。
核酸序列SEQ ID NO:1的片段可以与全长100%相同,除了在5'和/或3'端缺少至少一个核苷酸,在每种情况下在位置1处有或没有编码信号肽和/或甲硫氨酸的序列。片段可包含全长编码序列SEQ ID NO:1长度(不包括添加的任何异源信号肽)的60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多百分比。优选地,所述片段可以包含编码多肽的片段,所述多肽与抗原SEQ IDNO:2的95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多或99%或更多同源,并且另外任选地包含在计算同源性百分比时不包括在内的编码N末端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段可进一步包含N末端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。编码N末端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可以与该片段连接。
在一些实施例中,SEQ ID NO:1的片段可以包含786个或更多个核苷酸;在一些实施例中,830个或更多个核苷酸;在一些实施例中,856个或更多个核苷酸;并且在一些实施例中,865个或更多个核苷酸。在一些实施例中,SEQ ID NO:1的片段例如本文所述的那些可以进一步包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施例中,SEQ ID NO:1的片段不包含IgE前导序列的编码序列。
在一些实施例中,SEQ ID NO:2的片段可以包含252个或更多个氨基酸;在一些实施例中,266个或更多个氨基酸;在一些实施例中,275个或更多个氨基酸;并且在一些实施例中,278个或更多个氨基酸。
在一个实施例中,HPV6 E6-E7免疫原或编码HPV6 E6-E7免疫原的核酸分子与IL-12组合施用。在一个实施例中,IL-12由合成DNA质粒编码。
在一些实施例中,该方法包括施用包含编码IL-12的p35和/或p40亚基的核酸分子的组合物。
SEQ ID N0:5包含编码IL-12的p35亚基的核苷酸序列。SEQ ID NO:6包含IL-12的p35亚基的氨基酸序列。
在一些实施例中,疫苗包括SEQ ID NO:6,或编码SEQ ID NO:6的核酸分子。
SEQ ID NO:6的片段可以与全长100%相同,除了在N和/或C末端缺少至少一个氨基酸,在每种情况下在位置1处有或没有信号肽和/或甲硫氨酸。SEQ ID NO:6的片段可以包含全长SEQ ID NO:6长度(不包括添加的任何异源信号肽)的60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多百分比。优选地,该片段可以包含与SEQ ID NO:6的95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多或99%或更多同源的SEQ ID NO:6的片段,并且另外包含在计算同源性百分比时不包括在内的N末端甲硫氨酸或异源信号肽。片段可进一步包含N末端甲硫氨酸和/或信号肽,例如免疫球蛋白信号肽,例如IgE或IgG信号肽。N末端甲硫氨酸和/或信号肽可以与该片段连接。
核酸序列SEQ ID NO:5的片段可以与全长100%相同,除了在5'和/或3'端缺少至少一个核苷酸,在每种情况下在位置1处有或没有编码信号肽和/或甲硫氨酸的序列。片段可包含全长编码序列SEQ ID NO:5长度(不包括添加的任何异源信号肽)的60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多百分比。优选地,所述片段可以包含编码多肽的片段,所述多肽与抗原SEQ IDNO:6的95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多或99%或更多同源,并且另外任选地包含在计算同源性百分比时不包括在内的编码N末端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段可进一步包含N末端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。编码N末端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可以与该片段连接。
在一些实施例中,SEQ ID NO:5的片段可以包含500个或更多个核苷酸;在一些实施例中,550个或更多个核苷酸;在一些实施例中,600个或更多个核苷酸;并且在一些实施例中,630个或更多个核苷酸。在一些实施例中,SEQ ID NO:5的片段例如本文所述的那些可以进一步包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施例中,SEQ ID NO:5的片段不包含IgE前导序列的编码序列。
在一些实施例中,SEQ ID NO:6的片段可以包含150个或更多个氨基酸;在一些实施例中,175个或更多个氨基酸;在一些实施例中,200个或更多个氨基酸;并且在一些实施例中,210个或更多个氨基酸。
SEQ ID NO:7包含编码IL-12的p40亚基的核苷酸序列。SEQ ID NO:8包含IL-12的p35亚基的氨基酸序列。
在一些实施例中,疫苗包括SEQ ID NO:8,或编码SEQ ID NO:8的核酸分子。
SEQ ID NO:8的片段可以与全长100%相同,除了在N和/或C末端缺少至少一个氨基酸,在每种情况下在位置1处有或没有信号肽和/或甲硫氨酸。SEQ ID NO:8的片段可以包含全长SEQ ID NO:8长度(不包括添加的任何异源信号肽)的60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多百分比。优选地,该片段可以包含与SEQ ID NO:8的95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多或99%或更多同源的SEQ ID NO:8的片段,并且另外包含在计算同源性百分比时不包括在内的N末端甲硫氨酸或异源信号肽。片段可进一步包含N末端甲硫氨酸和/或信号肽,例如免疫球蛋白信号肽,例如IgE或IgG信号肽。N末端甲硫氨酸和/或信号肽可以与该片段连接。
核酸序列SEQ ID NO:7的片段可以与全长100%相同,除了在5'和/或3'端缺少至少一个核苷酸,在每种情况下在位置1处有或没有编码信号肽和/或甲硫氨酸的序列。片段可包含全长编码序列SEQ ID NO:7长度(不包括添加的任何异源信号肽)的60%或更多、65%或更多、70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多百分比。优选地,所述片段可以包含编码多肽的片段,所述多肽与抗原SEQ IDNO:8都95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多或99%或更多同源,并且另外任选地包含在计算同源性百分比时不包括在内的编码N末端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段可进一步包含N末端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。编码N末端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可以与该片段连接。
在一些实施例中,SEQ ID NO:7的片段可以包含850个或更多个核苷酸;在一些实施例中,900个或更多个核苷酸;在一些实施例中,930个或更多个核苷酸;并且在一些实施例中,960个或更多个核苷酸。在一些实施例中,SEQ ID NO:7的片段例如本文所述的那些可以进一步包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施例中,SEQ ID NO:7的片段不包含IgE前导序列的编码序列。
在一些实施例中,SEQ ID NO:8的片段可以包含250个或更多个氨基酸;在一些实施例中,275个或更多个氨基酸;在一些实施例中,300个或更多个氨基酸;并且在一些实施例中,315个或更多个氨基酸。
在一些实施例中,该方法包括同时施用:(a)包含编码本文公开的HPV6抗原(例如HPV6 E6-E7融合抗原)的核酸分子的组合物和(b)包含编码一个或更个本文公开的IL-12亚基(例如p35和/或p40)的核酸分子的组合物。在一些实施例中,该方法包括在先前施用包含编码本文公开的HPV6抗原(例如,HPV6 E6-E7融合抗原)的核酸分子的组合物之后施用包含编码本文公开的一个或多个IL-12亚基(例如p35和/或p40)的核酸分子的组合物。在一些实施例中,该方法包括在先前施用包含编码一个或多个本文公开的IL-12亚基(例如p35和/或p40)的核酸分子的组合物之后施用包含编码本文公开的HPV6抗原(例如HPV6 E6-E7融合抗原)的核酸分子的组合物。
通过诱导个体中针对HPV的免疫反应来治疗或预防受试者中RRP的方法,包括向所述个体施用包含本文提供的核酸序列的组合物。在一些实施例中,该方法还包括通过电穿孔将核酸序列引入个体。
在一些方面,存在通过在个体中诱导针对HPV的免疫应答来治疗或预防受试者中RRP的方法,包括向所述个体施用包含本文提供的氨基酸序列的组合物。在一些实施例中,该方法还包括通过电穿孔将氨基酸序列引入个体。
改进的疫苗包含蛋白质和基因构建体,该蛋白质和基因构建体编码具有表位的蛋白质,该表位使它们作为免疫原特别有效,可以针对该免疫原诱导抗HPV免疫反应。因此,可以提供疫苗以诱导治疗性或预防性免疫反应。在一些实施例中,递送免疫原的手段是DNA疫苗、重组疫苗、蛋白质亚基疫苗、包含免疫原的组合物、减毒疫苗或灭活疫苗。在一些实施例中,疫苗包含选自由以下组成的群组的组合:一种或多种DNA疫苗、一种或多种重组疫苗、一种或多种蛋白质亚基疫苗、一种或多种包含免疫原的组合物、一种或多种减毒疫苗和一种或多种灭活疫苗。
本发明的方面提供了在核酸分子如质粒上递送蛋白质编码序列作为重组疫苗的一部分和作为减毒疫苗的一部分,作为分离的蛋白质或载体的蛋白质部分的方法。
根据本发明的一些方面,提供了预防性和/或治疗性免疫个体的组合物和方法。
DNA疫苗描述于美国专利号5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055、5,676,594,和其中引用的优先权申请,其各自通过引用并入本文。除了在那些申请中所描述的递送方案之外,递送DNA的替代性方法描述于美国专利号4,945,050和5,036,006,其均通过引用并入本文。
本发明涉及使用重组载体递送编码抗原的外源基因的改进的减毒活疫苗、改进的灭活疫苗和改进的疫苗以及亚基和糖蛋白疫苗。减毒活疫苗、使用重组载体递送外源抗原的那些、亚基疫苗和糖蛋白疫苗的实例描述于美国专利号:4,510,245;4,797,368;4,722,848;4,790,987;4,920,209;5,017,487;5,077,044;5,110,587;5,112,749;5,174,993;5,223,424;5,225,336;5,240,703;5,242,829;5,294,441;5,294,548;5,310,668;5,387,744;5,389,368;5,424,065;5,451,499;5,453,3 64;5,462,734;5,470,734;5,474,935;5,482,713;5,591,439;5,643,579;5,650,309;5,698,202;5,955,088;6,034,298;6,042,836;6,156,319和6,589,529,其各自通过引用并入本文。
当被细胞吸收时,一个或多个基因构建体可以作为发挥作用的染色体外分子仍然存在于细胞中和/或整合到细胞的染色体DNA中。DNA可以被引入细胞,在那里它以一种或多种质粒的形式作为单独的遗传物质保留。或者,可以将可以整合到染色体中的线性DNA引入细胞中。当将DNA引入细胞时,可以添加促进DNA整合到染色体中的试剂。可用于促进整合的DNA序列也可包括在DNA分子中。或者,可以将RNA施用于细胞。还考虑提供作为包括着丝粒、端粒和复制起点的线性微型染色体的遗传构建体。基因构建体可能仍然是减毒活微生物或生活在细胞中的重组微生物载体中遗传物质的一部分。基因构建体可能是重组病毒疫苗基因组的一部分,其中遗传物质整合到细胞的染色体中或保持在染色体外。遗传构建体包括核酸分子基因表达所必需的调节元件。这些元件包括:启动子、起始密码子、终止密码子和多腺苷酸化信号。此外,编码靶蛋白或免疫调节蛋白的序列的基因表达通常需要增强子。将这些元件可操作地连接到编码所需蛋白质的序列上并且调节元件在施用它们的个体中可操作是必要的。
起始密码子和终止密码子通常被认为是编码所需蛋白质的核苷酸序列的一部分。然而,这些元件必须在施用基因构建体的个体中起作用。起始密码子和终止密码子必须与编码序列在框内。
使用的启动子和多腺苷酸化信号必须在个体细胞内发挥作用。
可用于实施本发明、尤其是用于生产人类基因疫苗的启动子的实例包括但不限于来自以下的启动子:猿猴病毒40(SV40)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(MV)如BIV长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼病毒、ALV、巨细胞病毒(CMV)如CMV立即早期启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)以及来自人类基因的启动子如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白。
可用于实施本发明、尤其是用于生产人类基因疫苗的多腺苷酸化信号的实例包括但不限于SV40多腺苷酸化信号和LTR多腺苷酸化信号。特别低,使用pCEP4质粒(Invitrogen,San Diego CA)中的SV40多腺苷酸化信号,称为SV40多腺苷酸化信号。
除了DNA表达所需的调节元件外,DNA分子中还可能包括其他元件。此类附加元件包括增强子。增强子可以选自包括但不限于以下的群组:人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和病毒增强子,例如来自CMV、RSV和EBV的那些。
可以提供具有哺乳动物复制起点的遗传构建体,以便在染色体外维持构建体并在细胞中产生构建体的多个拷贝。来自Invitrogen(SanDiego,CA)的质粒pVAX1、pCEP4和pREP4含有爱泼斯坦巴尔病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区,其产生高拷贝游离型复制而不整合。
在与免疫应用相关的一些优选实施例中,递送一种或多种核酸分子,其包括编码本发明蛋白质的核苷酸序列,并且另外包括进一步增强针对此类靶蛋白的免疫反应的蛋白质基因。此类基因的实例是编码其他细胞因子和淋巴因子的基因,例如α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFa、TNFp、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、MHC、CD80、CD86和IL-15,包括具有缺失信号序列和任选地包括来自IgE的信号肽的IL-15。其他可能有用的基因包括编码以下的那些:MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、Caspase ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、0x40、0x40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2及其功能片段
如果出于任何原因需要消除接受基因构建体的细胞,则可以添加作为细胞破坏靶标的附加元件。可表达形式的疱疹胸苷激酶(tk)基因可以包括在遗传构建体中。药物更昔韦洛(gangcyclovir)可以施用于个体,并且该药物将导致选择性杀死任何产生tk的细胞,由此提供选择性破坏具有遗传构建体的细胞的手段。
为了使蛋白质产量最大化,可以选择非常适合在施用构建体的细胞中用于基因表达的调节序列。此外,可以选择在细胞中最有效转录的密码子。本领域普通技术人员可以产生在细胞中起作用的DNA构建体。
在一些实施例中,可以提供基因构建体,其中本文所述蛋白质的编码序列与IgE信号肽连接。在一些实施例中,本文所述的蛋白质与IgE信号肽连接。
在使用蛋白质的一些实施例中,例如,本领域普通技术人员可以使用众所周知的技术生产本发明的蛋白质和使用众所周知的技术分离本发明的蛋白质。在使用蛋白质的一些实施例中,例如,本领域普通技术人员可以使用众所周知的技术,将编码本发明蛋白质的DNA分子***商业可得的表达载体中以用于众所周知的表达***。例如,商业可得的质粒pSE420(Invitrogen,San Diego,Calif.)可用于在大肠杆菌(E.coli)中生产蛋白质。例如,商业可得的质粒pYES2(Invitrogen,San Diego,Calif.)可用于在酵母的酿酒酵母株中生产。例如,商业可得的MAXBACTM完整杆状病毒表达***(Invitrogen,San Diego,Calif.)可用于在昆虫细胞中生产。例如,商业可得的质粒pcDNA I或pcDNA3(Invitrogen,San Diego,Calif.)可用于在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞中生产。本领域普通技术人员可以使用这些商业表达载体和***或其他来通过常规技术和容易获得的起始材料生产蛋白质。(参见例如Sambrook等人,《分子克隆实验室手册(Molecular Cloning a LaboratoryManual)》,第二版,Cold Spring Harbor Press(1989),其通过引用并入本文。)因此,所需的蛋白质可以在原核和真核***二者中制备,导致一系列加工形式的蛋白质。
本领域普通技术人员可以使用其他商业可得的表达载体和***或使用众所周知的方法和容易获得的起始材料生产载体。包含必要的控制序列如启动子和多腺苷酸化信号以及优选增强子的表达***对于各种宿主来说是容易获得的并且在本领域中是已知的。参见例如Sambrook等人,《分子克隆实验室手册(Molecular Cloning a LaboratoryManual)》,第二版,Cold Spring Harbor Press(1989)。遗传构建体包括可操作地连接到启动子的蛋白质编码序列,该启动子在构建体转染到的细胞系中起作用。组成型启动子的实例包括来自巨细胞病毒或SV40的启动子。诱导型启动子的实例包括小鼠乳腺白血病病毒或金属硫蛋白启动子。本领域普通技术人员可以容易地从容易获得的起始材料生产可用于用编码本发明蛋白质的DNA转染细胞的遗传构建体。包括编码蛋白质的DNA的表达载体用于转化相容的宿主,然后将其在发生外源DNA表达的条件下培养和维持。
通过裂解细胞或自培养基从培养物中回收所产生的蛋白质,这对于本领域技术人员来说是合适的和已知的。本领域普通技术人员可以使用众所周知的技术分离使用此类表达***产生的蛋白质。如上所述使用特异性结合特定蛋白质的抗体从天然来源纯化蛋白质的方法可以同样应用于纯化通过重组DNA方法产生的蛋白质。
除了通过重组技术生产蛋白质外,还可以使用自动肽合成仪来生产分离的、基本上纯的蛋白质。此类技术对于本领域普通技术人员来说是众所周知的,并且如果衍生物具有在DNA编码的蛋白质生产中未提供的取代,则该技术是可用的。
可以使用包括DNA注射(也称为DNA疫苗接种)、重组载体如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘在内的几种众所周知的技术中的任何一种来递送核酸分子。
施用途径包括但不限于肌肉内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服以及局部、透皮、通过吸入或栓剂或至粘膜组织,例如通过灌洗至***、直肠、尿道、颊和舌下组织。优选的施用途径包含肌肉内注、腹膜内、皮内和皮下注射。遗传构建体可以通过包括但不限于电穿孔方法和装置、传统注射器、无针注射装置或“微粒轰击基因枪”的方式施用。
优选用于促进DNA疫苗递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括描述于以下的那些:Draghia-Akli等人的美国专利号7,245,963,由Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630,所述专利的内容据此通过引用以其整体并入。还优选的是在2007年10月17日提交的共同未决和共同拥有的美国专利申请序列号11/874072中提供的用于促进DNA疫苗递送的电穿孔装置和电穿孔方法,该申请要求根据35USC 119(e)要求于2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149和于2007年10月10日提交的美国临时申请序列号60/978,982的权益,所有申请据此以其整体并入。
以下是使用电穿孔技术的实施例的实例,并且在上面讨论的专利参考文献中进行了更详细的讨论:电穿孔设备可以被配置为向哺乳动物的所需组织递送能量脉冲,产生类似于用户输入的预设电流的恒定电流。电穿孔装置包括电穿孔组件和电极组合件或手柄组合件。电穿孔组件可以包括并结合电穿孔装置的各种元件中的一种或多种,包括:控制器、电流波形发生器、阻抗测试仪、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储器组件、电源和电力开关。电穿孔组件可以充当电穿孔装置的一个元件,并且其它元件是与电穿孔组件连通的单独的元件(或组件)。在一些实施例中,电穿孔组件可以充当电穿孔装置的多于一个元件,其可以与电穿孔装置的与电穿孔组件分离的仍其它元件连通。使用电穿孔技术递送改进的HPV疫苗不受作为一种机电或机械装置的一部分存在的电穿孔装置的元件的限制,因为该元件可以作为一个装置或作为相互通信的单独元件起作用。电穿孔组件能够递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲并且包含反馈机制。电极组合件包含在空间布置中具有多个电极的电极阵列,其中所述电极组合件接收来自电穿孔组件的能量脉冲并且通过电极将其递送到期望组织。所述多个电极中的至少一个电极在能量脉冲的递送期间是中性的,并且测量期望组织中的阻抗并将阻抗传送到电穿孔组件。反馈机制可以接收测量到的阻抗并且可以调节由电穿孔组件递送的能量脉冲以维持恒定电流。
在一些实施例中,多个电极可以以分散模式递送能量脉冲。在一些实施例中,多个电极可以在经过编程的序列下通过电极的控制以分散模式递送能量脉冲,并且由用户将经过编程的序列输入到电穿孔组件。在一些实施例中,经过编程的序列包括依次递送的多个脉冲,其中多个脉冲中的每个脉冲由具有测量阻抗的一个中性电极的至少两个有源电极来递送,并且其中多个脉冲中的随后脉冲由具有测量阻抗的一个中性电极的至少两个有源电极中的不同的有源电极来递送。
在一些实施例中,反馈机制由硬件或软件来执行。优选地,反馈机制由模拟闭环电路来执行。优选地,该反馈每50μs、20μs、10μs或1μs发生一次,但优选地是实时反馈或瞬时的(即,基本瞬时,由用于确定响应时间的可用技术确定)。在一些实施例中,中性电极测量期望组织中的阻抗并将阻抗传送到反馈机制,并且反馈机制对阻抗作出应答并调节能量脉冲以将恒定电流维持在类似于预设电流的值处。在一些实施例中,反馈机制在能量脉冲的递送期间连续且瞬时地维持恒定电流。
在一些实施例中,核酸分子与多核苷酸功能增强子或基因疫苗促进剂的施用一起被递送至细胞。多核苷酸功能增强子描述于美国序列号5,593,972、5,962,428和1994年1月26日提交的国际申请序列号PCT/US94/00899,它们各自通过引用并入本文。基因疫苗促进剂描述于1994年4月1日提交的美国序列号021,579,其提供引用并入本文。与核酸分子联合施用的助剂可以作为与核酸分子的混合物施用,或在施用核酸分子同时、之前或之后单独施用。此外,可以发挥转染剂和/或复制剂和/或炎性剂作用并且可以与GVF共同施用的其他试剂包括生长因子、细胞因子和淋巴因子,例如α-干扰素、γ-干扰素、GM-CSF、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-15以及成纤维细胞生长因子,表面活性剂如免疫刺激复合物(ISCOMS),弗氏不完全佐剂,LPS类似物包括单磷酰脂质A(WL)、胞壁肽、醌类似物和囊泡如角鲨烯和角鲨烯,并且透明质酸也可用于与基因构建体联合施用。在一些实施例中,免疫调节蛋白可以用作GVF。在一些实施例中,提供与PLG结合的核酸分子以增强递送/摄取。
根据本发明的药物组合物包含约1纳克至约2000微克的DNA。在一些优选的实施例中,根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约1000微克的DNA。在一些优选的实施例中,药物组合物含有约10纳克至约800微克的DNA。在一些优选的实施例中,药物组合物含有约0.1至约500微克的DNA。在一些优选的实施例中,药物组合物含有约1至约350微克的DNA。在一些优选的实施例中,药物组合物含有约25至约250微克的DNA。在一些优选的实施例中,药物组合物含有约100至约200微克的DNA。
根据本发明的药物组合物是根据要使用的施用模式调配的。在医药组合物是可注射医药组合物的情况下,它们是无菌的、不含热原质的以及不含微粒的。优选使用等张性配制物。一般来说,等张性添加剂能够包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇以及乳糖。在一些情况下,优选等张溶液,例如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施例中,将血管收缩剂添加到配制物中。
根据本发明的一些实施例,提供了诱导免疫反应的方法。疫苗可以是基于蛋白质的减毒活疫苗、细胞疫苗、重组疫苗或核酸或DNA疫苗。在一些实施例中,诱导个体中针对免疫原的免疫反应的方法,包括诱导粘膜免疫反应的方法,包括向个体施用CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白及其功能片段或其可表达的编码序列中的一种或多种与编码本发明蛋白质的分离核酸分子和/或编码本发明蛋白质的重组疫苗和/或本发明蛋白质的亚基疫苗和/或减毒活疫苗和/或灭活疫苗的组合。CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白及其功能片段中的一种或多种可以在施用编码免疫原的分离核酸分子;和/或编码免疫原的重组疫苗和/或包含免疫原的亚基疫苗和/或减毒活疫苗和/或灭活疫苗之前、同时或之后施用。在一些实施例中,将编码选自由CTACK、TECK、MEC及其功能片段组成的群组的一种或多种蛋白质的分离核酸分子施用于个体。
在以下实例中进一步说明本发明。应当理解,该实例虽然指示了本发明的实施例,但仅以说明的方式给出。通过以上讨论和本实例,本领域技术人员可以确定本发明的本质特征,并且在不脱离其精神和范围的情况下,可以对本发明进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。因此,除了本文示出和描述的那些之外,根据以上描述,本发明的各种修改对于本领域的技术人员将是显而易见的。这种修改也旨在落在所附权利要求的范围内。
在整个本公开中引用的美国专利、美国申请和参考文献中的每一个都特此通过引用整体并入。
实例
在以下实例中进一步定义了本发明。应了解,这些实例虽然指出本发明的优选实施例,但是仅为了说明而提供。通过以上讨论和这些实例,本领域的技术人员可以确定本发明的必要特征,并且可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以对本发明进行各种改变和修改,以使本发明适用于各种用途和条件。因此,除了本文示出和描述的那些之外,根据以上描述,本发明的各种修改对于本领域的技术人员将是显而易见的。这种修改也旨在落在所附权利要求的范围内。
实例1
复发性呼吸道***瘤病(RRP)是一种罕见的病症,其特征是产生呼吸消化道***状瘤,通常与人***瘤病毒(HPV)亚型6、11相关。目前对HPV6相关RRP和侵袭性恶性疾病的治疗可能会因增加HPV特异性免疫疗法而得到改善。可得的预防性HPV疫苗可以产生针对HPV主要衣壳蛋白L1的中和抗体,但它们尚未显示出对HPV感染或现有病变的治疗效果,并且不太可能产生溶细胞性T细胞反应(Lin等人,《免疫学研究(Immunologic research.)》2010;47(1-3):86-112)。另一方面,HPV特异性免疫疗法可能具有通过产生针对HPV病毒本身和HPV感染细胞的免疫力来消除先前存在的病变和感染的治疗潜力。HPV E6和E7癌蛋白代表此类治疗干预的理想靶标,因为它们在HPV相关肿瘤中的组成型表达以及它们在HPV相关疾病的诱导和维持中的关键作用(Lin等人,《免疫学研究(Immunologic research.)》2010;47(l-3):86-112)。
本文提供的实验检查了INO-3106的功效,INO-3106是一种基于DNA质粒的免疫疗法,其靶向HPV6的E6和E7蛋白以便产生强劲的免疫T细胞反应从而治疗RRP。
在这项研究中,进行了实验以评价INO-3106的功效,INO-3106是一种新型HPV6特异性免疫疗法,由编码HPV6 E6和E7的合成共有DNA序列组成(图1),HPV6 E6和E7是HPV6诱导的癌症转化和肿瘤维持所必需的蛋白质。合成DNA质粒作为免疫疗法平台提供了几个潜在优势,包括在没有基因组整合证据的情况下引发有效免疫反应的能力、良好的安全性概况、稳定性和制造相对容易(Saha等人,《最近的DNA和基因序列专利(Recent Pat DNA GeneSeq.)》2011;5(2):92-6)。INO-3106的临床前研究已在动物模型中证明了对HPV6的强烈且特异性的免疫反应(Shin等人,《人类疫苗和免疫疗法(Human vaccines&immunotherapeutics)》2012;8(4):470-8)。基于相同的合成共有平台设计和评价的HPV16/18特异性疗法(VGX-3100,Inovio Pharmaceuticals,Inc.)已展示细胞免疫反应,其与发育不良病变消退和消除HPV16/18感染形式的临床益处相关,并且现在支持靶向HPV16和18种相关疾病的晚期临床试验(Bagarazzi等人,《科学转化医学(Sci TranslMed.)》2012;4(155):155ra38)。
临床前研究表明,使用细胞因子佐剂可以显著增加DNA疫苗的免疫原性(Chattergoon等人,《疫苗(Vaccine.)》2004;22(13-14):1744-50;Hanlon等人,《病毒学杂志(JVirol.)》2001;75(18):8424-33;Kim等人,《干扰素和细胞因子研究杂志(JInterferonCytokine Res.)》1998;18(7):537-47;Kim等人,《欧洲免疫学杂志(EurJImmunol.)》1998;28(3):1089-103;Operschall等人,《临床病毒学杂志(JClinViroL)》1999;13(1-2):17-27)。重要的是,工程化质粒IL-12遗传佐剂已显示在使用装置递送时增强人类免疫原性(Kalams等人,《传染病杂志(Journal of Infectious Diseases.)》2013;Tebas等人,《传染病杂志(Journal of Infectious Diseases.)》2019)。在靶向皮肤递送和局部肌肉二者的多项临床研究中已经确定,通过设备递送优化的DNA是一种以快速方式产生人类免疫力的高度可重复的方法,用于诱导预防设置以及治疗方法范围内的各种目的(Kalams等人,《传染病杂志(Journal of Infectious Diseases.)》2013;Tebas等人,《传染病杂志(Journal of Infectious Diseases.)》2019;Tebas等人,《新英格兰医学杂志(The New England journal of medicine.)》2017;Bagarazzi等人,《科学转化医学(SciTranslMed.)》2012;4(155):155ra38;Morrow等人,《分子疗法溶瘤剂(Moleculartherapy oncolytics.)》2016;3(16025;Trimble等人,《柳叶刀(Lancet.)》2015;386(10008):2078-88;Morrow等人,《临床癌症研究:美国癌症研究协会的官方期刊(Clinicalcancer research:an official journal of the American Association for CancerResearch.)》2018;24(2):276-94;Aggarwal等人,《临床癌症研究:美国癌症研究协会的官方期刊(Clinical cancer research:an official journal of the AmericanAssociation for Cancer Research.)》2019;25(1):110-24;Morrow等人,《分子治疗:美国基因治疗学会杂志(Molecular therapy:the journal of the American Society ofGene Therapy.)》2015;23(3):591-601)。
在这里,本实验证明了利用装置通过EP肌肉内(IM)递送的有或没有INO-9012(IL-12佐剂)的INO-3106在HPV6相关RRP或恶性肿瘤患者中的初步研究的安全性和免疫原性。这项研究的数据表明,利用INO-3106和IL-12佐剂的免疫疗法可能是RRP的一种非侵入性免疫介导的治疗选择。
在这项单中心开放标签1期研究中,向HPV6阳性RRP和恶性肿瘤受试者给药肌肉内(IM)和使用装置的电穿孔(EP)组合递送的有或没有INO-9012的INO-3106,INO-3106是一种靶向HPV6的E6和E7蛋白的DNA质粒免疫疗法,INO-9012是编码IL-12的DNA质粒免疫疗法。患者接受递增剂量的INO-3106,一次3mg,然后另外三剂6mg,每剂相隔三周,第三剂和第四剂与INO-9012共同施用。该研究的主要目的是评价有和没有INO-9012的INO-3106的安全性和耐受性。次要目的是确定对有和没有INO-9012的INO-3106的细胞免疫反应。探索性目标包括治疗的初步临床疗效。
四名患者同意,并且三名患者符合所有纳入和排除标准,并入组研究。研究疗法具有良好的耐受性,没有相关的严重不良事件,并且所有相关的不良事件(AE)均为低级别。注射部位疼痛是所有患者报告的最常见的相关AE。免疫原性由多种免疫测定证明,该测定显示HPV6特异性细胞反应的参与和扩展,包括细胞毒性T细胞的标志。在这些患者中以改变生长切除手术频率的形式证明了初步功效。在干预之前,两名患者大约每180天需要进行一次手术。一名患者的手术避免增加了超过3倍(584天),并且另一名患者截至915天的最后一次接触仍然保持完全无手术,手术间隔增加了超过5倍。
本文提出的实验表明,有和没有INO-9012的INO-3106具有良好的耐受性、免疫原性,并在HPV6相关RRP呼吸消化病变患者中表现出初步功效。
现在描述这些实验中使用的材料和方法。
研究群体
这是一项前瞻性、开放标签的1期研究。至少18岁的男性和女性患者考虑入组。为了符合条件,患者必须在研究治疗首次给药前至少两个月具有组织学记录的HPV6相关呼吸消化性***状瘤、癌前病变,或具有呼吸消化侵袭性恶性肿瘤,并完成最近的疗法(例如放射、化疗)。患者必须有ECOG0-1,肝脏、肾、肝和骨髓功能在正常范围内。如果有证据表明免疫抑制或预期使用免疫抑制剂、需要使用全身性类固醇、存在心脏预激综合征或怀孕或哺乳,则患者被排除在外。在进行任何评估之前,从每位患者获得了书面知情同意书。临床试验根据赫尔辛基宣言的伦理准则进行。
INO-3106是一种编码6型HPV的E6和E7蛋白的DNA质粒,在无菌注射用水中配制。INO-3106包含编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的SEQ ID NO:1的核苷酸序列。INO-9012由编码合成人IL-12(p35和p40亚基)的DNA质粒组成,也在无菌注射用水中配制。INO-9012包含编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列(IL-12的p35亚基)的SEQ ID NO:5的核苷酸序列;以及编码SEQ ID NO:8的氨基酸序列(IL-12的p40亚基)的SEQ ID NO:7的核苷酸序列。INO-3106和INO-9012均采用专利技术(Inovio Pharmaceuticals,Inc.)设计,如前所述(Yan等人,《疫苗(Vaccine.)》2008;26(40):5210-5;Yan等人,《疫苗(Vaccine.)》2009;27(3):431-40)。2000适应性恒流电穿孔装置(Inovio Pharmaceuticals,Inc.)通过无菌的一次性阵列向注射部位递送三个52ms受控电脉冲,间隔为1s。当***组织时,针阵列以免疫疗法注射部位为中心,并在细胞膜内产生瞬时孔,以增强细胞转染。有或没有INO-9012的INO-3106以1mL体积肌肉内注射,然后立即使用装置进行EP。治疗或给药定义为注射DNA质粒,然后进行EP。
研究设计
在知情同意后,每位患者都被分配了唯一的患者识别码。确定资格和收集基线特征的筛选程序在首次给药前28天内完成。患者接受递增剂量的INO-3106,其中第一剂(第0天)递送3mg INO-3106,第二剂(第3周)递送6mg INO-3106,并且第三剂(第6周)和第四剂(第9周)递送6mg INO-3106和1mg INO-9012。每次给药相隔三周递送,以允许观察任何2级或更高级别相关全身性不良事件(AE)的发展。总的来说,所有患者的参与包括9周治疗期,然后是从最后一次给药开始的6个月长期随访期。
该研究的主要目的是评价有和没有INO-9012的INO-3106的安全性和耐受性。次要目的是确定对有和没有INO-9012的INO-3106的体液和细胞免疫反应,并且探索性目的是评估治疗的初步临床功效,以及如果可能的话将功效与给药后组织的免疫细胞浸润联系起来。
该研究在ClinicalTrials.gov上注册,标识符为NCT02241369。该研究方案符合1975年赫尔辛基宣言的伦理准则,并得到了中心机构审查委员会的审查和批准。
安全性评估
从知情同意之日到最后一次随访,监测局部和全身性不良事件(AE)、生命体征、12导联心电图(ECG)和实验室异常的发展。特别是,在每次治疗当天和治疗后连续7天评估注射部位反应,包括疼痛、瘙痒、红斑、硬结和瘀伤。每次就诊时都会询问患者新的AE或疾病的发生以及伴随药物的使用。所有事件均按照不良事件通用术语标准(CTCAE)第4.03版分级,并使用MedDRA第21版编码。
如果三分之一或更多的患者经历需要加急报告的相关事件;任何患者经历严重不良事件(SAE)、意外的4级毒性、评估为与研究治疗相关的可能危及生命的AE或死亡;三名或更多患者经历相同的相关3级或4级AE;或者如果任何患者报告3级过敏反应,则立即停止进一步的入组和治疗。
有生育潜力的女性在筛查时和每次给药前3天内必须完成妊娠试验。任何阳性妊娠试验结果的女性停止治疗。在整个研究过程中监测实验室参数,包括血液学、凝血、血清化学(包括肝功能)和肌酸磷酸激酶(CPK),并在中心进行局部评估。
抗原3D建模
比较模型使用Bioluminate(Release 2019-2,Schrodinger,New York,NY)构建,并使用Discovery Studio Visualizer(Dassault Systemes BIOVIA,San Diego,CA)显示。
干扰素γELISpot
将全血收集在ACD-A管中,并在抽取24小时内分离外周血单核细胞(PBMC)。在基线、免疫疗法给药时和每次随访时收集样本,并分批冷冻保存PBMC以用于免疫分析。如前所述(Bagarazzi等人,《科学转化医学(SciTranslMed.)》2012;4(155):155ra38),T细胞和抗体对HPV6 E6和E7抗原的反应分别通过干扰素-y ELISpot和ELISA确定。
流式细胞术
在细胞培养基中冷冻保存过夜后回收PBMC,并在第二天旋转、洗涤并重新悬浮。计数后,将1X106个PBMC铺板到96孔板中的具有足够样本的患者的RIO培养基中。对于抗原特异性反应,用2μg/ml浓度的已合并的与HPV6 E6和E7对应的肽组合刺激细胞5天,而不相关的肽用作阴性对照(OVA),并且伴刀豆球蛋白A用作阳性对照(Sigma-Aldrich)。在任何时候都没有向细胞培养物中添加共刺激抗体或细胞因子。在5天孵育期结束时,对细胞进行CD3-BUV737、CD4-APC-Cy7、CD14-BUV395、CD-16-BUV395、CD137-APC、颗粒溶素-AF488、CD-19-BUV395、CD38-BV786、CD8-BV650、颗粒酶B-AF700(BD Biosciences)、颗粒酶A-PECy7(ThermoFisher)、PD-1-PEDazzle、穿孔素-BV421、Ki67-BV605和CD69-BV711(BioLegend)染色。首先对细胞外标志物(CD4、CD8、CD137、CD69、CD38、PD-1)进行染色,然后进行透化以对剩余的标志物染色。CD3在细胞内被染色以说明细胞激活后标志物的下调。使用FlowJo软件版本X.0.7或更高版本(TreeStar)分析获得的数据。
用于基因表达分析的抗原特异性PBMC刺激
对于短期刺激-将冷冻保存的PBMC解冻,静置过夜,并在37℃、5%的CO2和95%湿度下使用DMSO(阴性对照)或HPV6 E6和E7重叠肽库(OLP)刺激22小时。刺激后,收集培养物上清液并-20℃储存。然后使用缓冲液RLT(Qiagen)裂解细胞并-80℃储存。
对于长期刺激-将冷冻保存的PBMC解冻,静置过夜,并在37℃、5%的CO2和95%湿度下用HPV6 E6和E7 OLP刺激11天。在第1、4、6和8天,分别以10U/mL和10ng/mL添加含有IL-2和IL-7的新鲜培养基。在第11天,洗涤PBMC,并在37℃、5%的CO2和95%湿度下静置过夜。过夜静置后,利用DMSO(阴性对照)或HPV6 E6和E7 OLP,用HPV6 E6和E7 OLP再刺激PBMC22小时。在22小时刺激结束时,收集细胞上清液并-20℃储存。然后将细胞裂解并-80℃储存。
多重基因表达分析
根据制造商的说明,将细胞裂解物分12批解冻,并使用nCounter(NanoString)GXHuman Immunology V2组杂交以捕获探针和荧光团条形码报告探针,该组由594个基因和15个内部参考对照组成。然后将样本放置在自动化的nCounter Prep Station(Nanostring)中以用于捕获探针与半透明盒的杂交,然后通过nCounter数字分析仪(Nanostring)经由直接计数每个样本泳道中的报告探针来测量基因表达。
统计方法
接受至少一剂治疗的受试者被纳入安全性分析。AE(包括SAE和注射部位反应)的发生率与准确的95%置信区间一起估计。与二级和探索性终点相关的分析将利用接受他们的指定数量剂量的受试者。在二级分析中,将估计免疫反应参数。在探索性分析中,将估计临床反应和组织病理学评估参数。对于连续结果,将计算平均值/中值和95%置信区间,并且对于二元结果,将使用Clopper-Pearson方法计算比例和准确的95%置信区间。
现在描述实验的结果。
患者特征和处置
总计四名患者同意并进行了资格筛选。三名患者符合所有纳入和排除标准,并于2014年10月至2017年9月入组。人口统计学和基线特征总结在表1中。在这三名患者中,两名患者出现HPV6相关RRP(均患有声带疾病)和一名患者患有侵袭性恶性肿瘤(初始疾病位于气管,并在研究登记时注意到口咽部鳞状细胞癌)。所有三名患者都完成了所有四个剂量,在第0天接受3mg INO-3106,在第3周接受6mg INO-3106,并在第6周和第9周接受6mg INO-3106和1mg INO-9012,所有通过装置肌肉内递送。两名患者在他们最后一剂治疗后完成了6个月的长期随访期。一名患者没有完成长期随访,报告了与研究无关的冲突,这是退出研究的主要原因。所有三名患者都包括在安全性分析集中。
表1
*一位父母的身高和体重指数不可得(总计n=2)。
利用EP的INO-3106和INO-9012的安全性和耐受性
通过EP递送的INO-3106和INO-9012具有良好的耐受性。治疗出现的AE包括注射部位疼痛(三个相关的1级事件)、发热(一个不相关的1级事件)和***(一个不相关的2级事件)。所有患者都报告了注射部位疼痛,在大多数情况下用药物治疗会导致消退。研究报告了一例治疗出现的SAE,即需要住院治疗的3级单瘫,但评估为与研究治疗无关。没有患者因AE或因EP不耐受而退出接受继续研究治疗或继续参与研究。在研究过程中没有报告4级事件或死亡。所有患者都经历了实验室参数的变化,其中大多数包括血液学值的轻微波动,但所有异常的实验室值都被确定为临床上不显著。
INO-3106诱导治疗的RRP患者的T细胞中的IFNγ产生以及激活标志物和裂解蛋白
的表达
对试验入组的所有三名患者进行HPV6 E6和E7细胞免疫反应的评估(图2和图6)。由于受试者601不是RRP患者并且由于与非治疗事件相关的死亡而具有有限的数据,因此与该受试者相关的免疫学信息可以在图6中找到。细胞免疫反应首先通过在不添加支持性细胞因子的情况下在INO-3106给药之前和之后获得的分离的外周血单核细胞(PBMC)上进行过夜IFNγELISpot来解决。该评估的结果表明,患者603对HPV6 E6和E7抗原以抗原特异性IFNγ分泌的形式表现出非常低的基线活性(图2)。具体地,对于E6或E7抗原注意到每106个PBMC低于20个斑点,而患者604在研究登记时对这些抗原表现出相当强劲的细胞反应,每106个PBMC的E6斑点形成单位接近150个斑点,而E7超过50个斑点(图2)。
在患者603中,INO-3106治疗使HPV6 E6和E7特异性细胞反应增至高于基线,包括对HPV6抗原的总反应超过50个斑点。但是患者604并未显示出响应于治疗的IFNγ斑点的升高(图2)。在有反应的患者中,达到峰值反应的时间各不相同,并且难以准确评估。具体地,患者601在第四剂INO-3106后因与治疗无关的事件而发生死亡,因此治疗后随访不可得,并且在第三剂后注意到峰值反应。患者603在其最终剂INO-3106后6个月表现出峰值反应,这可能与在那段时间病毒激活/抗原靶标表达的变化有关,或者可能反映了患者免疫***继续建立和支持大HPV6特异性T细胞库的动力学。
先前已表明,IFNγ的产生暗示Th1免疫反应,但不与裂解活性1:1相关(Morrow等人,《分子治疗:美国基因治疗学会杂志(Molecular therapy:the journal of theAmerican Society of Gene Therapy.)》2015;23(3):591-601,Morrow等人,《临床癌症研究:美国癌症研究协会的官方期刊(Clinical cancer research:an official journal ofthe American Association for Cancer Research.)》2017;DOI:10.1158/1078-0432.CCR-17-2335;Trimble等人,《柳叶刀(Lancet.)》2015;386(10008):2078-88;Migueles等人,《PLoS病原体(PLoSpathogens.)》201l;7(2):el002002;Varadarajan等人,《临床研究杂志(The Journal of clinical investigation.)》2011;121(11):4322-31)。可以理解,CD8+T细胞的溶细胞反应是免疫反应的关键组分,其将控制和消除病毒感染的细胞。因此,对来自患者603和604的含在INO-3106给药之前和之后分离的足够样本的PBMC进行流式细胞术,以评估HPV6特异性CD8+T细胞响应于治疗加载颗粒酶和穿孔素的能力。为此,通过细胞表面标志物如CD38、CD69、CD137和Ki67的抗原特异性表达(图3)分析CD8+T细胞区室的免疫激活,以及在用同源抗原体外刺激后由颗粒溶素(Gnly)、颗粒酶A(GrzA)、颗粒酶B(GrzB)和穿孔素(Prf)的存在确定的裂解潜能。表2显示了在用INO-3106治疗之前和之后这些标志物的抗原特异性调节。与ELISpot反应一致,患者603表现出多种CD8+T细胞的强劲升高,该CD8+T细胞表达激活标志物并伴有裂解蛋白。最值得注意的是,在用INO-3106处理后,CD38和/或Ki67与裂解潜能标志物如颗粒酶A、颗粒酶B和穿孔素的组合的表达急剧增加,达到超过对HPV6 E6和E7抗原具有特异性的总CD8+T细胞的3%的值(表2A,图3)。相反,并且与表明缺乏强劲的T细胞扩增的ELISpot结果一致,与患者603相比时,从幅度的角度看,患者604(表2B,图3)显示出CD8+T细胞反应的升高较小。有趣的是,虽然与患者603相比幅度较小,但在患者604中诱导的推定CTL的表型表明可能存在更高活性的CD8+T细胞,因为治疗后最有可能增加的群体由三个(CD38、CD137、Ki67)激活标志物或伴随表达的所有四个(除了前三个之外还有CD69)组成。这种数量的激活标志物同时共表达要罕见得多(Tebas等人,《新英格兰医学杂志(The New England journal of medicine.)》2017;Bagarazzi等人,《科学转化医学(SciTranslMed.)》2012;4(155):155ra38;Morrow等人,《分子治疗溶瘤剂(Molecular therapy oncolytics.)》2016;3(16025;Trimble等人,《柳叶刀(Lancet.)》2015;386(10008):2078-88;Morrow等人,《临床癌症研究:美国癌症研究协会的官方期刊(Clinical cancer research:an official journal of the American Association forCancer Research.)》2018;24(2):276-94;Aggarwal等人,《临床癌症研究:美国癌症研究协会的官方期刊(Clinical cancer research:an official journal of the AmericanAssociation for Cancer Research.)》2019;25(l):110-24)以及之前对表达多种激活标志物的CD8+T细胞的研究表明,这些细胞表达颗粒酶并能有效诱导表达同源抗原的靶标凋亡(Duhen等人,《自然通讯(Nat Commun.)》2018 Jul 13;9(1):2724.doi:10.1038/s41467-018-05072-0)。事实上,当注意到患者604不仅增加颗粒酶和穿孔素表达,而且还增加颗粒溶素表达时,最后一个想法得到了进一步的支持。虽然需要考虑这种小样本量的局限性,但该评估的结果表明,INO-3106可能导致诱导CD8+T细胞能够在抗原暴露的情况下激活,并且这些细胞能够进行颗粒酶、穿孔素和颗粒溶素合成,从而表现出明确的HPV6特异性CTL表型。
表2A
关键词:Prf=穿孔素,GrzA=颗粒酶A,GrzB=颗粒酶B,Grdy=颗粒溶素
表2B
关键词:Prf=穿孔素,GrzA=颗粒酶A,GrzB=颗粒酶B,Grdy=颗粒溶素
INO-3106改变RRP患者T细胞的免疫转录概况
进行患者PBMC的短期刺激(24小时),然后分析免疫基因转录物,该转录物被发现响应于HPV6 E6和E7衍生肽库的刺激而受到特异性调节。来自患者601的数据可以在图6中找到。对于患者603和604,基因转录主要与免疫疗法后促炎特征的上调有关。与基线相比,患者603在第2剂时仅表现出适度的差异基因表达。然而,在2周的随访中,与未刺激的细胞相比,在用肽库刺激的细胞中观察到与先天免疫反应相关的基因(CXCL10、CXCL9、CCL7、CCL8)、与IFNγ途径相关的基因(GBP1、GBP5)、细胞-细胞相互作用(CD209、MRC1)和B细胞帮助(CXCL13)的明显上调。患者604在2周的随访中也表现出基因上调,其特征与在患者603中观察到的相似(CXCL10、CXCL9、Stat1、GBP1、GBP5、CCL8)。此外,对于患者604,观察到指示适应性细胞激活的标志物(CD274、TNFSF13B)的上调。虽然患者603的基因上调是短暂的,但患者604在后期随访(第4剂后三个月和六个月)中在很大程度上保持这种特征(图4A,表3)。此外,特别是对于患者604,IDO1(一种由抗原呈递细胞表达的分子)的表达随时间迅速增加,在基线时表现出约4倍的差异,在第2剂时增至8倍,在2周随访时增至10倍,在3个月随访时几乎增至13倍,并且在6个月随访时达到峰值65倍(图4A,表3)。
体外培养11天然后进行24小时的抗原再刺激允许观察抗原特异性T细胞。刺激条件有利于使T细胞扩增高于所有其他细胞类型,包括B细胞和其他APC。分析显示,与离体刺激后相比,差异基因表达水平降低。总体而言,两名RRP患者表现出相似的基因上调模式,在基线时极少基因(患者603-0基因和患者604-7基因)上调,但在免疫疗法后时间点差异表达增加(患者603-分别为,第4剂时4个基因,2周随访时7个基因,3个月和6个月随访时3个基因;患者604-第2剂时12个基因,2周随访时9个基因,3个月随访时10个基因和6个月随访时22个基因)(图4B)。对于两名RRP患者,免疫疗法后样本中受刺激细胞中上调的基因表达概况主要与T细胞激活和功能(CD276、TNFRSF8、TNFRSF9、GZMB)以及B细胞帮助(IL-21、CXCL13)相关。入组试验的每个受试者的差异表达基因的完整列表参见表4。在所有受试者的免疫疗法后也观察到CXCL10和CXCL9的表达增加,但是在患者604中,这些标志物在基线时已经增加。
INO-3106减少了治疗RRP的手术干预需求
在进入研究之前,受试者603和604需要大约每180天进行一次手术干预以去除呼吸道***状瘤。假设这种模式继续下去,在研究过程中,预期需要手术干预的次数对于受试者603将是四次,对于受试者604将是两次。然而,在整个研究中,受试者都不需要手术干预来去除呼吸道***状瘤,构成对本病治疗干预需要的临床改变。这些受试者的研究后跟踪显示,在本公开时,受试者603不需要手术干预来治疗疾病,总共超过915天没有手术。584天后,受试者604出现了需要手术干预来适当治疗的疾病复发,手术频率的总体减少超过3倍(图5)。如果在研究期间产生的任何免疫学数据表明对治疗的不同临床反应,这些患者结果的差异提示检查。流式细胞术的评估表明,受试者604比受试者603具有更强劲的HPV6特异性CTL形式的免疫活性(图5)。虽然不希望受任何特定理论的束缚,但因此有可能受试者CTL上的反应幅度和激活标志物表达模式的差异可能与临床影响的持久性有关。
本文报告了在三名患有HPV6相关呼吸消化癌前病变和恶性肿瘤的患者中,肌肉内施用并通过装置经由电穿孔递送的有和没有IL-12DNA佐剂的HPV6E6ZE7特异性靶向DNA免疫疗法的I期安全性和免疫学临床试验结果。免疫疗法的施用耐受性良好。没有与治疗相关的SAE,并且最常见的治疗中出现的AE是注射部位反应。正如至少一项免疫学评估所证明的,所有患者都显示出诱导对HPV6 E6和E7抗原的细胞反应。值得注意的是,两名可评价的RRP患者都从INO-3106治疗中获得了临床益处,主要是以相对于他们的研究前手术频率延迟治疗干预(例如手术)的形式。此外,在INO-3106治疗后表现出更强劲细胞活性的患者仍然无手术,而细胞活性较不强劲的患者延迟但未完全避免手术的事实表明诱导HPV6特异性细胞反应和临床益处的类型/持续时间之间可能存在因果关系。这些结果令人鼓舞,并提出了以下想法:在某些情况下,在这种治疗环境中,额外给药以继续增强细胞反应可能是优选的。
用INO-3106治疗导致在各种免疫测定中诱导HPV6特异性细胞反应。使用ELISpot确认IFNγ的产生以及通过流式细胞术确认CD8+T细胞上颗粒酶和穿孔素的合成伴随激活标志物的表达表明INO-3106促进了诱导促炎免疫反应,包括具有高度激活的细胞毒性淋巴细胞标志的T细胞。通过观察完成治疗后PBMC中促炎和调节基因转录物的动态调节进一步强调了这些结果。具体地,与IFNγ通路相关的基因如CXCL10和GBP1,在短期和长期刺激后均被上调。最近一项针对头颈部鳞状细胞癌的研究报告,基于IFNγ、CXCL9、CXCL10、IDO1HLA-DRA和STAT1的综合评分与治疗反应率显著相关,表明基于IFNγ的特征与治疗益处相关(Ahn等人,《喉镜(Laryngoscope.)》2018;128(l):E27-E32)。
此外,观察到颗粒酶B和TNFRSF9的表达增加,证实了细胞毒性淋巴细胞在转录组水平上的活性。这种性质的T细胞反应在对抗HPV驱动的疾病中的必要性已在之前的两项基于DNA的免疫疗法的临床试验中得到例证,这两项试验均使用装置递送。在HPV相关的宫颈非典型增生的背景下,对VGX-3100(HPV16/18的DNA免疫疗法)治疗的呈伴随HPV感染消除的病变消退形式的临床反应与存在强劲细胞反应在统计学上相关,该细胞反应包括表现出细胞毒性表型标志物的IFNγ和CD8+T细胞(Trimble等人,《柳叶刀(Lancet.)》2015;386(10008):2078-88)。此外,在另一项研究HPV相关口咽鳞状细胞癌治疗的试验中,一名在MEDI0457(HPV16/18的利用质粒编码的IL-12佐剂的DNA免疫疗法)治疗后对纳武利尤单抗治疗产生完全反应的转移性癌症患者被认为具有治疗驱动的PD1+细胞毒性T细胞的强劲扩增(Aggarwal等人,《临床癌症研究:美国癌症研究协会的官方期刊(Clinical cancer research:an official journal of the American Association forCancer Research.)》2019;25(1):110-24)。因此,目前的研究提供了进一步的证据,即由装置递送的HPV特异性免疫疗法诱导产生有可能在临床上影响HPV相关肿瘤发生的有效T细胞反应。
从这项研究收集的数据首次表明HPV特异性免疫疗法可能能够影响HPV6相关复发性呼吸道***瘤病患者的临床状态,并充当额外或替代的辅助疗法。这些发现与今年早些时候提供的数据相辅相成,其中帕博利珠单抗的施用与减少对常规手术干预的需求有关(Pai等人,《临床肿瘤学杂志(Journal of Clinical Oncology.)》37.2502-2502.10.1200/JC0.2019.37.15_suppl.2502)。这些发现共同提供了支持在这些患者的管理中使用免疫治疗方法的早期数据。这种疾病治疗的标准护理是重复手术干预,这会带来许多并发症,并且由于潜伏病毒可能存在于邻近组织中,因此不太可能完全根除病变复发(Chow等人,《斯堪的纳维亚病理微生物学与免疫学学报(APMIS.)》2010;l 18(6-7):422-49)。其他非手术辅助干预指示在病变快速再生或侵袭性疾病的患者中,但此类疗法也存在固有风险,并且需要进一步评价以确定最佳治疗方案(Derkay等人,《北美耳鼻喉科诊所(Otolaryngol ClinNorth Am.)》2019;52(4):669-79)。目前的治疗限制突出了确定非侵入性和免疫介导的方法来治疗HPV阳性呼吸消化道疾病患者的必要性。事实上,据报道,预防性HPV疫苗减少***状瘤的生长并延长干预之间的时间,但是,治疗效果的确定需要继续评价(Makiyama等人,《声音杂志(J Voice.)》2017;31(1):104-6)。同样,PD-1/PD-L1抑制代表了治疗RRP的合理方法,但表达和对临床结果的影响的特征较少(Ahn等人,《喉镜(Laryngoscope.)》2018;128(l):E27-E32)。
本研究产生的数据表明,使用INO-3106和IL-12佐剂作为非侵入性免疫介导方法的免疫疗法可能为解决RRP现有治疗缺陷提供一种选择。
序列表
<110> 大卫·B·韦纳(Weiner, David B.)
严健(Yan, Jian)
<120> 复发性呼吸道***瘤病的改进疫苗(IMPROVED VACCINES FOR RECURRENTRESPIRATORY PAPILLOMATOSIS)
<130> UPVG0084 WO
<140> PCT/US2020/057314
<141> 2020-10-26
<150> US 62/925,283
<151> 2020-10-24
SEQ ID NO:1-HPV6 E6E7 DNA序列
ggtaccggat ccgccaccat ggactggacc tggattctgt tcctggtggc cgctgccaca 60
cgggtgcaca gcgaaagcgc caatgccagc accagcgcta caaccatcga ccagctgtgc 120
aagaccttca acctgagcat gcacaccctg cagatcaact gcgtgttctg caagaacgcc 180
ctgaccaccg ccgagatcta cagctacgcc tacaagcagc tgaaggtgct gttcagaggc 240
ggctacccct atgccgcctg cgcctgctgc ctggaatttc acggcaagat caaccagtac 300
cggcacttcg actacgccgg ctacgccacc accgtggaag aggaaacaaa gcaggacatc 360
ctggacgtgc tgatccggtg ctacctgtgc cacaagcccc tgtgcgaggt ggaaaaagtg 420
aagcacatcc tgaccaaggc ccggttcatc aagctgaact gcacctggaa gggccggtgc 480
ctgcactgct ggaccacctg tatggaagat atgctgccca gaggccggaa gcggcggagc 540
catggcagac acgtgaccct gaaggacatc gtgctggacc tgcagccccc cgatcctgtg 600
ggcctgcact gttacgagca gctggtggac agcagcgagg acgaggtgga cgaagtggac 660
ggccaggaca gccagcccct gaagcagcac ttccagatcg tgacctgctg ctgcggctgc 720
gacagcaacg tgcggctggt ggtgcagtgc accgagacag acatcagaga ggtccagcag 780
ctcctgctgg gcaccctgaa catcgtgtgc cccatctgcg cccccaagac ctacccttac 840
gacgtgcccg actacgcctg atgactcgag ctc 873
SEQ ID NO:2-HPV6 E6E7蛋白序列
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
His Ser Glu Ser Ala Asn Ala Ser Thr Ser Ala Thr Thr Ile Asp Gln
Leu Cys Lys Thr Phe Asn Leu Ser Met His Thr Leu Gln Ile Asn Cys
Val Phe Cys Lys Asn Ala Leu Thr Thr Ala Glu Ile Tyr Ser Tyr Ala
Tyr Lys Gln Leu Lys Val Leu Phe Arg Gly Gly Tyr Pro Tyr Ala Ala
Cys Ala Cys Cys Leu Glu Phe His Gly Lys Ile Asn Gln Tyr Arg His
Phe Asp Tyr Ala Gly Tyr Ala Thr Thr Val Glu Glu Glu Thr Lys Gln
Asp Ile Leu Asp Val Leu Ile Arg Cys Tyr Leu Cys His Lys Pro Leu
Cys Glu Val Glu Lys Val Lys His Ile Leu Thr Lys Ala Arg Phe Ile
Lys Leu Asn Cys Thr Trp Lys Gly Arg Cys Leu His Cys Trp Thr Thr
Cys Met Glu Asp Met Leu Pro Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser His Gly
Arg His Val Thr Leu Lys Asp Ile Val Leu Asp Leu Gln Pro Pro Asp
Pro Val Gly Leu His Cys Tyr Glu Gln Leu Val Asp Ser Ser Glu Asp
Glu Val Asp Glu Val Asp Gly Gln Asp Ser Gln Pro Leu Lys Gln His
Phe Gln Ile Val Thr Cys Cys Cys Gly Cys Asp Ser Asn Val Arg Leu
Val Val Gln Cys Thr Glu Thr Asp Ile Arg Glu Val Gln Gln Leu Leu
Leu Gly Thr Leu Asn Ile Val Cys Pro Ile Cys Ala Pro Lys Thr Tyr
Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
SEQ ID NO:3-IgE前导DNA序列
atggactgga cctggatcct gttcctggtg gccgctgcca cacgggtgca cagc 54
SEQ ID NO:4-IgE前导蛋白
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
His Ser
SEQ ID NO:5-p35 DNA序列:
atgtgtccag cgcgcagcct cctccttgtg gctaccctgg tcctcctgga ccacctcagt 60
ttggccagaa acctccccgt ggccactcca gacccaggaa tgttcccatg ccttcaccac 120
tcccaaaacc tgctgagggc cgtcagcaac atgctccaga aggccagaca aactctagaa 180
ttttaccctt gcacttctga agagattgat catgaagata tcacaaaaga taaaaccagc 240
acagtggagg cctgtttacc attggaatta accaagaatg agagttgcct aaattccaga 300
gagacctctt tcataactaa tgggagttgc ctggcctcca gaaagacctc ttttatgatg 360
gccctgtgcc ttagtagtat ttatgaagac ttgaagatgt accaggtgga gttcaagacc 420
atgaatgcaa agcttctgat ggatcctaag aggcagatct ttctagatca aaacatgctg 480
gcagttattg atgagctgat gcaggccctg aatttcaaca gtgagactgt gccacaaaaa 540
tcctcccttg aagaaccgga tttttataaa actaaaatca agctctgcat acttcttcat 600
gctttcagaa ttcgggcagt gactattgat agagtgatga gctatctgaa tgcttcctaa 660
SEQ ID NO:6-p35氨基酸序列:
MCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQT
LEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFM
MALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETV
PQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS*
SEQ ID NO:7-p40 DNA序列:
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagttag 987
SEQ ID NO:8-p40氨基酸序列:
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGI
TWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDIL
KDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLS
AERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPD
PPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKT
SATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
Claims (17)
1.一种治疗或预防个体复发性呼吸道***瘤病(RRP)的方法,包括向所述个体施用包含编码HPV6抗原的核酸分子的组合物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述HPV6抗原是HPV6 E6-E7融合抗原。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述核酸分子包含一种或多种选自由以下组成的群组的核苷酸序列:
编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列;
与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少95%同源的核苷酸序列;
编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列片段;
与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列片段至少95%同源的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述核酸分子包含与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少98%同源的核苷酸序列。
5.根据权利要求3所述的方法,其中所述核酸分子包含与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少99%同源的核苷酸序列。
6.根据权利要求3所述的方法,其中编码所述HPV6 E6-E7融合抗原的所述核苷酸序列在5'端没有前导序列,其是编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
7.根据权利要求3所述的方法,其中所述核酸分子包含一种或多种选自由以下组成的群组的核苷酸序列:
包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列;
与SEQ ID NO:1至少95%同源的核苷酸序列;
SEQ ID NO:1的片段;
与SEQ ID NO:1的片段至少95%同源的核苷酸序列。
8.根据权利要求3所述的方法,其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO:1至少98%同源的核苷酸序列。
9.根据权利要求3所述的方法,其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO:1至少99%同源的核苷酸序列。
10.根据权利要求3所述的方法,其中所述核酸分子是质粒。
11.根据权利要求3所述的方法,其中所述组合物是药物组合物。
12.根据权利要求1所述的方法,其进一步包括向所述个体施用包含佐剂的组合物。
13.根据权利要求1所述的方法,其进一步包括向所述个体施用包含编码以下一种或多种的核苷酸序列的核酸分子:IL-12的p35和p40亚基。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述编码p35的核苷酸序列包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列:
编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列;
与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列至少95%同源的核苷酸序列;
编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列片段;
与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列片段至少95%同源的核苷酸序列。
15.根据权利要求13所述的方法,其中所述编码p40的核苷酸序列包含选自由以下组成的群组的核苷酸序列:
编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列;
与编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列至少95%同源的核苷酸序列;
编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列片段。
16.与编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列片段至少95%同源的核苷酸序列。
17.根据权利要求3所述的方法,其中向所述个体施用所述核酸分子包括电穿孔。
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