KR20220112667A - 플로우 셀의 고정화 - Google Patents

플로우 셀의 고정화 Download PDF

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KR20220112667A
KR20220112667A KR1020217031408A KR20217031408A KR20220112667A KR 20220112667 A KR20220112667 A KR 20220112667A KR 1020217031408 A KR1020217031408 A KR 1020217031408A KR 20217031408 A KR20217031408 A KR 20217031408A KR 20220112667 A KR20220112667 A KR 20220112667A
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제프리 에스. 피셔
타룬 쿠마르 쿠라나
마티외 레사드-비거
클리포드 리 왕
이얼-쉬위엔 우
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일루미나, 인코포레이티드
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Abstract

일례에서, 표적 물질은 제1 및 제2 유체를 사용하여 플로우 셀의 2개의 대향 시퀀싱 표면 상에 고정화된다. 제1 유체는 표적 물질 밀도보다 작은 밀도를 갖고, 제2 유체는 표적 물질 밀도보다 큰 밀도를 갖거나; 제2 유체는 표적 물질 밀도보다 작은 밀도를 갖고, 제1 유체는 표적 물질 밀도보다 큰 밀도를 갖는다. 제1 유체(표적 물질을 포함함)는 플로우 셀에 도입되어, 표적 물질의 적어도 일부는 시퀀싱 표면 중 하나의 표면 상의 포획 부위에 의해 고정화된다. 제1 유체 및 비고정화 표적 물질은 제거된다. 제2 유체(표적 물질을 포함함)는 플로우 셀에 도입되어, 표적 물질의 적어도 일부는 시퀀싱 표면 중 다른 하나의 표면 상의 포획 부위에 의해 고정화된다.

Description

플로우 셀의 고정화
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2019년 12월 11일자로 출원된 미국 가출원 제62/946,717호의 이익을 주장하며, 그 내용은 전체적으로 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
플로우 셀(flow cell)은 유전자 시퀀싱, 유전자형 결정 등과 같은 다양한 방법 및 응용에 사용된다. 일부 방법 및 응용에서, 이중 가닥 DNA(dsDNA) 표적 분자로부터 단편화되고 태그된 DNA 분자의 라이브러리를 생성하는 것이 바람직하다. 종종, DNA 시퀀싱 반응에서 주형으로 사용하기 위해 보다 큰 dsDNA 분자로부터 보다 작은 DNA 분자(예를 들어, DNA 단편)를 생성하는 것을 목적으로 한다. 주형에 의해, 짧은 리드(read) 길이를 얻을 수 있다. 데이터 분석 중에, 중복된 짧은 서열 리드를 정렬하여, 더 긴 핵산 서열을 재구성할 수 있다. 어떤 경우에는, 사전 시퀀싱 단계(예컨대, 특정 핵산 분자의 바코딩)를 사용하여, 데이터 분석을 단순화할 수 있다.
본 명세서에 기재된 예시적인 키트 및 방법 중 일부는 플로우 셀의 대향 표면에 하나 이상의 표적 물질을 고정화시키기에 적합하다. 본 방법의 일부 예는 순차적 고정화를 가능하게 하며, 본 방법의 다른 예는 동시 고정화를 가능하게 한다.
본 명세서에 개시된 제1 태양은 플로우 셀의 2개의 대향 시퀀싱 표면(opposed sequencing surface) 각각에 표적 물질을 고정화하는 것을 포함하는 방법으로서, 상기 고정화는 내부에 표적 물질의 제1 부분을 포함하는 제1 유체를 플로우 셀에 도입하여, 표적 물질의 적어도 일부가 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 하나의 표면 상의 포획 부위에 의해 고정화되는 단계; 플로우 셀로부터 제1 유체 및 임의의 비고정화 표적 물질을 제거하는 단계; 및 내부에 표적 물질의 제2 부분을 포함하는 제2 유체를 플로우 셀에 도입하여, 표적 물질의 적어도 일부가 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 다른 하나의 표면 상의 포획 부위에 의해 고정화되는 단계를 포함하며; 제1 유체는 표적 물질의 밀도보다 작은 밀도를 갖고, 제2 유체는 표적 물질의 밀도보다 큰 밀도를 갖거나; 제2 유체는 표적 물질의 밀도보다 작은 밀도를 갖고, 제1 유체는 표적 물질의 밀도보다 큰 밀도를 갖는 방법이다.
본 명세서에 개시된 제2 태양은 내부에 표적 물질을 포함하는 제조 유체; 표적 물질의 밀도보다 작은 밀도를 갖는 제1 도입 유체; 및 표적 물질의 밀도보다 큰 밀도를 갖는 제2 도입 유체를 포함하는 키트이다.
본 명세서에 개시된 제3 태양은 표적 물질을 포함하는 유체를 플로우 셀에 도입하는 단계 - 여기서, 표적 물질은 자성 고상 지지체; 및 자성 고상 지지체에 부착된 시퀀싱 레디(sequencing-ready) 핵산 단편 또는 주형 가닥을 포함하며, 유체는 자성 고상 지지체의 밀도와 적어도 거의 동일한 밀도를 가짐 -; 표적 물질의 일부를 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 하나의 표면 상의 포획 부위에 의해 고정화시키는 단계; 및 자기력을 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 다른 하나의 표면에 인가하여, 표적 물질의 다른 일부를 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 다른 하나의 표면에 끌어당겨, 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 다른 하나의 표면 상의 포획 부위에 의해 고정화시키는 단계에 의해, 플로우 셀의 2개의 대향 시퀀싱 표면 각각에 표적 물질을 고정화하는 것을 포함하는 방법이다.
본 명세서에 개시된 제4 태양은 제1 표적 물질 및 제2 표적 물질을 포함하는 표적 유체를 플로우 셀에 도입하여, 플로우 셀의 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제1 표면에는 제1 표적 물질을, 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제2 표면에는 제2 표적 물질을 동시에 고정화하는 것을 포함하는 방법으로서, 여기서 표적 유체의 캐리어 유체는 유체 밀도를 갖고; 제1 표적 물질은 유체 밀도보다 작은 제1 밀도를 갖고; 제2 표적 물질은 유체 밀도보다 큰 제2 밀도를 갖는 방법이다.
본 명세서에 개시된 제5 태양은 유체 밀도를 갖는 캐리어 유체; 유체 밀도보다 작은 제1 밀도를 갖는 제1 표적 물질; 및 유체 밀도보다 큰 제2 밀도를 갖는 제2 표적 물질을 포함하는 표적 유체이다.
본 명세서에 개시된 제6 태양은 2개의 대향 시퀀싱 표면을 포함하는 플로우 셀에 제1 및 제2 표적 물질을 도입하는 단계 - 여기서, 제1 표적 물질은 제2 표적 물질과 상이한 적어도 하나의 특성을 가지며, 적어도 하나의 특성은 밀도, 전하, 자성 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택됨 -; 및 제1 및 제2 표적 물질을 적어도 하나의 조건에 노출시켜, 제1 표적 물질을 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제1 표면 상의 포획 부위에 의해 고정화시키고, 제2 표적 물질을 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제2 표면 상의 포획 부위에 의해 고정화시키는 단계를 포함하는 방법이다.
어느 하나의 태양의 임의의 특징은 임의의 바람직한 방법으로 함께 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 게다가, 제1 태양 및/또는 제2 태양 및/또는 제3 태양 및/또는 제4 태양 및/또는 제5 태양 및/또는 제6 태양의 특징들의 임의의 조합이 예를 들어, 플로우 셀의 시퀀싱 표면에 걸친 표적 물질의 보다 균일한 분포를 포함하여, 본 명세서에 기술된 바와 같은 이익을 달성하기 위해 본 명세서에 개시된 실시예 중 임의의 것과 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서에 기재된 다른 예는 플로우 셀 증폭 동안 주형 가닥의 이동을 감소시키거나 방지하는데 적합하다.
이와 같이, 본 명세서에 개시된 제7 태양은 시퀀싱 레디 핵산 단편을 플로우 셀에 도입하여, 시퀀싱 레디 핵산 단편의 적어도 일부를 플로우 셀의 시퀀싱 표면 상의 각각의 프라이머에 시딩하는 단계; 플로우 셀로부터 시딩되지 않은 시퀀싱 레디 핵산 단편을 제거하는 단계; 액체 형태의 온도 반응성 물질을 포함하는 증폭 혼합물을 플로우 셀에 도입하는 단계; 액체 형태의 온도 반응성 물질을 겔화하는 단계; 시딩된 시퀀싱 레디 핵산 단편의 증폭을 개시하여 주형 가닥을 생성하여, 겔 형태의 온도 반응성 물질이 주형 가닥의 확산을 감소시키는 단계; 겔 형태의 온도 반응성 물질을 액화시키는 단계; 및 플로우 셀로부터 액체 형태의 온도 반응성 물질을 제거하는 단계를 포함하는 방법이다.
제7 태양의 임의의 특징은 임의의 바람직한 방법으로 함께 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 제7 태양의 특징들의 임의의 조합이 예를 들어, 플로우 셀의 시퀀싱 표면에 걸친 표적 물질의 보다 균일한 분포 및 플로우 셀 증폭 동안 주형 가닥의 이동 감소를 포함하여, 본 명세서에 기술된 바와 같은 이익을 달성하기 위해 본 명세서에 개시된 임의의 다른 태양 및/또는 임의의 실시예와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명의 실시예의 특징은 동일한 도면 참조부호가 유사하지만 아마도 동일하지 않은 구성요소에 대응하는 하기의 상세한 설명 및 도면을 참조함으로써 명백해질 것이다. 간결함을 위해, 이전에 설명된 기능을 갖는 도면 참조부호 또는 특징부는 이들이 나타나는 다른 도면과 관련하여 설명되거나 설명되지 않을 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 본 명세서에 개시된 표적 물질의 다양한 예의 개략도이다.
도 2a는 플로우 셀의 일례의 평면도이다.
도 2b는 도 2a의 2B-2B 선을 따라 취해진, 플로우 채널 및 비패턴화된(non-patterned) 시퀀싱 표면의 일례의 확대 단면도이다.
도 2c는 도 2a의 2C-2C 선을 따라 취해진, 플로우 채널 및 패턴화된 시퀀싱 표면의 일례의 확대 단면도이다.
도 2d는 도 2a의 2D-2D 선을 따라 취해진, 플로우 채널 및 패턴화된 시퀀싱 표면의 다른 예의 확대 단면도이다.
도 3a 및 도 3b는 본 명세서에 개시된 방법의 일례를 함께 도시한다.
도 4a 및 도 4b는 본 명세서에 개시된 방법의 다른 예를 함께 도시한다.
도 5a 및 도 5b는 본 명세서에 개시된 방법의 또 다른 예를 함께 도시한다.
도 6a 및 도 6b는 본 명세서에 개시된 방법의 또 다른 예를 함께 도시한다.
도 7a 및 도 7b는 본 명세서에 개시된 방법의 추가의 예를 함께 도시한다.
도 8a 및 도 8b는 본 명세서에 개시된 방법의 또 다른 예를 함께 도시한다.
도 9a 내지 도 9c는 증폭 동안 주형 가닥의 확산 및 대류를 감소시키는 방법의 예를 함께 도시한다.
도 10a 및 도 10b는 패턴화된 시퀀싱 표면을 포함하는 플로우 셀의 상부 시퀀싱 표면(도 10a) 및 저부 시퀀싱 표면(도 10b)에 고정화된 복합체의 명시야상(brightfield image)이다.
도 11a는 시퀀싱이 수행된 후에 플로우 셀의 하나의 레인의 상부 및 저부 시퀀싱 표면에 대한 분자 커버리지 히스토그램이다.
도 11b는 시퀀싱이 수행된 후에 하나의 레인의 상부 및 저부 시퀀싱 표면에 대한 Q30보다 큰 Qscore의 비율(Y축) 대 시퀀싱 사이클 수(X축)를 나타내는 그래프이다.
도 12a 및 도 12b는 다양한 농도(μM, X축)의 알킨-비오틴으로 처리된 플로우 셀의 저부 표면(도 12a) 및 상부 표면(도 12b)의 복합체 로딩(비드 수/㎟, Y축) - 여기서, 복합체 로딩은 2개의 상이한 도입 액체를 사용하여 수행됨 -을 도시하는 막대 그래프이다.
도 13a 및 도 13b는 2개의 상이한 플로우 셀 채널의 길이(X축)에 따른 저부 표면 및 상부 표면의 목표 복합체 로딩 및 실제 복합체 로딩(비드 수/㎟, Y축)을 도시하는 그래프이다.
도 14는 하나의 플로우 셀 채널의 길이(X축)에 따른 저부 표면 및 상부 표면의 목표/예상 복합체 로딩, 실제 복합체 로딩(비드 수/㎟, Y축), 및 각각의 표면에 대한 선형 피트(linear fit)를 도시하는 그래프이다.
일부 시퀀싱 기술은 시퀀싱 레디 핵산 단편을 이용한다. 일부 예에서, 각각의 시퀀싱 레디 핵산 단편은 유전 물질의 일부(단편)와, 3' 및 5' 말단의 어댑터를 포함한다. 시퀀싱 레디 핵산 단편은 고상 지지체에 결합되어 복합체를 형성할 수 있다. 이들 예에서, 고상 지지체의 사용은 단편이 생성되는 더 긴 유전 물질의 연속성(contiguity) 정보를 보존할 수 있기 때문에 바람직할 수 있다. 다른 시퀀싱 기술은 고상 지지체에 부착된 주형 가닥의 클러스터를 포함하는 클러스터링된 고상 지지체를 이용한다. 이들 예에서, 고상 지지체의 사용이 바람직할 수 있는데, 이는 증폭(주형 가닥의 형성)이 플로우 셀에서 수행될 수 있고, 따라서 플로우 셀 화학이 증폭 프라이머를 포함하지 않는다는 점에서 단순화되기 때문이다. 그러나, 이러한 표적 물질(예를 들어, 복합체 또는 클러스터링된 고상 지지체)이 서로 대향하게 위치한 2개의 시퀀싱 표면(예를 들어, 위쪽/상부 표면 및 하부/저부 표면)을 갖는 플로우 셀에 사용되는 경우, 표적 물질이 플로우 셀의 저부에 위치한 시퀀싱 표면으로 가라앉는 경향이 있는 것으로 밝혀졌다. 단백질 바이오마커, 마이크로바이옴, 용해물 등과 같은 다른 표적 물질이 대향 표면을 갖는 플로우 셀에 존재하는 경우에, 유사한 문제가 발생할 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법의 일부 예는 2개의 대향 시퀀싱 표면에 걸쳐 표적 물질의 보다 균형 잡힌 고정화를 제공한다. 일부 예에서, 동일한 유형의 표적 물질이 2개의 대향 시퀀싱 표면에 걸쳐 고정된다. 다른 예에서, 2개의 상이한 표적 물질(적어도 하나의 상이한 특성을 가짐)이 각각 2개의 대향 시퀀싱 표면에 고정된다.
본 명세서에 개시된 방법의 일례는 밀도가 상이한 유체의 조합을 이용한다. 하나의 유체 밀도는 표적 물질(예를 들어, 복합체, 클러스터링된 고상 지지체)이 시퀀싱 표면 중 하나로 이동하여 고정되게 하고, 다른 유체 밀도는 표적 물질이 다른 시퀀싱 표면으로 이동하여 고정되게 할 수 있다.
상기 방법의 다른 예는 유체, 실질적으로 균일한 자기력 및 자기 반응성(magnetically responsive) 표적 물질(예컨대, 고상 지지체)의 조합을 이용한다. 이러한 예에서, 유체는 자기 반응성 표적 물질과 거의 동일한 밀도를 갖도록 선택된다. 이러한 유체에서, 표적 물질 중 일부는 가라앉고(그리고 시퀀싱 표면 중 하나에 고정됨), 한편 표적 물질의 다른 일부는 부유한다. 실질적으로 균일한 자기력이 다른 시퀀싱 표면에 가해질 때, 부유하는 표적 물질은 다른 시퀀싱 표면으로 이동하여 고정된다.
본 명세서에 개시된 방법의 또 다른 예는 밀도가 상이한 2개의 상이한 표적 물질을 이용한다. 두 표적 물질은 동일한 유체에 함유된다. 표적 물질 중 하나의 밀도(유체에 대하여)는 그 표적 물질(예를 들어, 복합체, 클러스터링된 고상 지지체)이 시퀀싱 표면 중 하나로 이동하여 고정되게 하고, 다른 표적 물질의 밀도(유체에 대하여)는 그 표적 물질이 다른 시퀀싱 표면으로 이동하여 고정되게 할 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법의 또 다른 예는 밀도, 전하, 자성 또는 이들의 조합과 같은 적어도 하나의 상이한 특성을 갖는 2개의 상이한 표적 물질을 이용한다. 적어도 하나의 조건에 노출되면, 상이한 표적 물질이 각각의 대향 시퀀싱 표면으로 이동하게 된다.
두 시퀀싱 표면에 표적 물질(들)(예를 들어, 복합체, 클러스터링된 고상 지지체)을 고정하면, 플로우 셀의 전반적인 이용이 개선된다.
2개의 시퀀싱 표면에 걸친 고정화 표적 물질(들)의 보다 균형 잡힌 분포는 플로우 셀을 사용하여 얻어진 다운스트림 매트릭스 개선으로 이어질 수 있다. 일례에서, 2개의 시퀀싱 표면에 걸친 고정화 표적 물질의 보다 균형 잡힌 분포는 시퀀싱 메트릭스 개선으로 이어질 수 있다. 일례에서, 표적 물질은 복합체를 포함할 수 있고, 복합체가 플로우 셀의 2개의 시퀀싱 표면에 걸쳐 더욱 균일하게 분포될 때, 복합체로부터 방출된 라이브러리 단편도 각각의 시퀀싱 표면에 걸쳐 더욱 균일하게 시딩된다. 이는 클러스터가 형성되는 복합체의 위치에 대하여 상대적으로 국소화된 개별 클러스터의 형성으로 이어진다. 다른 예에서, 표적 물질은 클러스터링된 고상 지지체를 포함할 수 있다. 클러스터링된 고상 지지체가 플로우 셀의 2개의 시퀀싱 표면에 걸쳐 더욱 균일하게 분포될 때, 클러스터링된 주형 가닥도 더욱 균일하게 분포된다. 시퀀싱 동안, 개별 클러스터는 뉴클레오타이드가 클러스터의 각각의 주형 가닥에 혼입됨에 따라 형광 신호의 "공간 클라우드(spatial cloud)"를 생성한다. 균일한 분포는 공간 클라우드의 가독성을 개선할 수 있다.
또한 두 시퀀싱 표면을 모두 로딩하면, 이러한 공간 클라우드를 생성하기 위한 더 많은 영역이 생성된다.
정의
본 명세서에 사용되는 용어는 달리 명시되지 않는 한, 관련 기술 분야에서 이들의 통상적인 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용되는 몇몇 용어 및 그 의미는 다음과 같다.
본 명세서에 사용되는 단수형은 문맥 상 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)", "함유하는", 또는 "특징으로 하는"과 동의어이며, 포괄적 또는 개방형(open-ended)이고 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본 명세서 전반에 걸쳐 "일례", "다른 예", "예" 등에 대한 언급은 상기 예와 관련하여 기재된 특정 요소(예를 들어, 특징부, 구조, 조성, 구성 및/또는 특성)가 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 예에 포함되며, 기타 예에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다는 것을 의미한다. 게다가, 임의의 예에 대해 설명된 요소는 그 문맥에 달리 명확히 나타나 있지 않는 한 다양한 예에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있음이 이해되어야 한다.
청구범위를 포함하여 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "실질적으로" 및 "약"은, 예를 들어 처리의 변화로 인한 작은 변동을 기재하고 설명하는 데 사용된다. 예를 들어, 이러한 용어는 명시된 값에서 ±10% 이하, 예컨대 명시된 값에서 ±5% 이하, 예컨대 명시된 값에서 ±2% 이하, 예컨대 명시된 값에서 ±1% 이하, 예컨대 명시된 값에서 ±0.5% 이하, 예컨대 명시된 값에서 ±0.2% 이하, 예컨대 명시된 값에서 ±0.1% 이하, 예컨대 명시된 값에서 ±0.05% 이하를 지칭할 수 있다.
어댑터: 예를 들어, 라이게이션 또는 태그멘테이션(tagmentation)에 의해 핵산 분자에 융합될 수 있는 선형 올리고뉴클레오타이드 서열. 적절한 어댑터 길이는 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드, 약 12개의 뉴클레오타이드 내지 약 60개의 뉴클레오타이드, 또는 약 15개의 뉴클레오타이드 내지 약 50개의 뉴클레오타이드의 범위일 수 있다. 어댑터는 뉴클레오타이드 및/또는 핵산의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 어댑터는 프라이머, 예를 들어 유니버셜(universal) 뉴클레오타이드 서열(예컨대, P5 또는 P7 서열)을 포함하는 프라이머의 적어도 일부에 상보적인 서열를 포함할 수 있다. 일례로서, 단편의 한 말단에 있는 어댑터는 제1 플로우 셀 또는 고상 지지체 프라이머의 적어도 일부에 상보적인 서열을 포함하고, 단편의 다른 말단에 있는 어댑터는 제2 플로우 셀 또는 고상 지지체 프라이머의 적어도 일부와 동일한 서열을 포함한다. 상보적 어댑터는 제1 플로우 셀 또는 고상 지지체 프라이머에 하이브리디제이션될 수 있고, 동일한 어댑터는 이의 상보적 카피용 주형이며, 이는 클러스터링 시에 제2 플로우 셀 또는 고상 지지체 프라이머에 하이브리디제이션될 수 있다. 일부 예들에서, 어댑터는 시퀀싱 프라이머 서열 또는 시퀀싱 결합 부위를 포함할 수 있다. 다양한 어댑터의 조합이 DNA 단편과 같은 핵산 분자에 혼입될 수 있다.
거의 동일한: 적어도 거의 동일한 것은 하나의 구성요소(예를 들어, 유체)의 밀도가 다른 구성요소(예를 들어, 고상 지지체)의 밀도의 0.08 g/㎤ 이내임을 의미한다. 어떤 경우에는, 두 구성요소의 밀도가 동일하다.
포획 부위 또는 화학적 포획 부위: 표적 물질(예를 들어, 복합체, 클러스터링된 고상 지지체, 단백질 바이오마커 등)의 국소화를 허용하는 화학적 특성으로 개질된 플로우 셀 표면의 일부. 일례에서, 포획 부위는 표적 분자(예를 들어, 복합체, 클러스터링된 고상 지지체, 단백질 바이오마커 등)에 부착, 보유 또는 결합할 수 있는 물질, 분자 또는 부분인 화학적 포획제를 포함할 수 있다. 하나의 예시적인 화학적 포획제는 표적 물질에 (또는 표적 물질에 부착된 결합 부분에) 결합할 수 있는 수용체-리간드 결합쌍의 구성원(예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘, 비오틴, 렉틴, 탄수화물, 핵산 결합 단백질, 에피토프, 항체 등)을 포함한다. 화학적 포획제의 또 다른 예는 표적 물질과 정전기적 상호작용, 수소 결합 또는 공유 결합(예를 들어, 티올-다이설파이드 교환, 클릭 화학, 딜스-알더(Diels-Alder) 등)을 형성할 수 있는 화학 시약이다.
복합체: 캐리어, 예컨대 고상 지지체, 및 캐리어에 부착된 시퀀싱 레디 핵산 단편. 캐리어는 또한 다른 구성원이 포획 부위의 일부인 결합쌍의 하나의 구성원을 포함할 수 있다.
클러스터링된 고상 지지체: 다수의 증폭된 주형 가닥이 부착된 캐리어, 예컨대 고상 지지체. 다수의 증폭된 주형 가닥은 "클러스터"로 지칭될 수 있다.
증착: 수동이거나 자동화될 수 있으며, 어떤 경우에는 표면 특성이 변화되는 임의의 적절한 응용 기술. 일반적으로, 증착은 증착 기술, 코팅 기술, 그래프팅 기술 등을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구체적인 예에는 화학 증착(CVD), 스프레이 코팅(예를 들어, 초음파 스프레이 코팅), 스핀 코팅, 덩크(dunk) 또는 딥 코팅, 닥터 블레이드 코팅, 퍼들 디스펜싱(puddle dispensing), 플로우 스루 코팅(flow through coating), 에어로졸 프린팅, 스크린 프린팅, 마이크로 접촉 프린팅, 잉크젯 프린팅 등이 포함된다.
함몰부(depression): 기판 또는 패턴화된 수지의 틈새 영역(interstitial region)(들)에 의해 적어도 부분적으로 둘러싸인 표면 개구를 갖는 기판 또는 패턴화된 수지의 개별 오목형 특징부. 함몰부는 예를 들어, 원형, 타원형, 정사각형, 다각형, 성상(임의의 정점 수를 가짐) 등을 포함하여 표면의 개구에서 임의의 다양한 형상을 가질 수 있다. 표면과 직교하는 함몰부의 단면은 만곡형, 정사각형, 다각형, 쌍곡선, 원추형, 각형 등일 수 있다. 예로서, 함몰부는 웰 또는 2개의 상호 연결된 웰일 수 있다. 함몰부는 또한 리지(ridge), 스텝 특징부 등과 같은 더욱 복잡한 구조를 가질 수 있다.
각각(의): 아이템들의 콜렉션과 관련하여 사용되는 경우, 각각은 콜렉션 내의 개별 아이템을 나타내지만, 반드시 콜렉션 내의 모든 아이템을 지칭하지는 않는다. 명시적 개시 또는 문맥이 명백히 달리 지시하면 예외들이 발생할 수 있다.
외부 고정화제: 플로우 셀에 도입된 복합체와 비혼화성인 기체, 액체 또는 점성 매질. 기체 외부 고정화제는 복합체 또는 샘플 주위에 액적을 생성하는 데 사용될 수 있다. 기체 외부 고정화제의 예는 플로우 셀을 통해 적절한 유량으로 이동하는 공기이다. 예를 들어, 공기는 플로우 셀로부터 유체를 흡인하는데 사용될 수 있으며, 이는 플로우 셀 내에서 고정된 복합체 주위에 액적을 형성한다. 형성된 액적은 확산 장벽으로 작용한다. 액체 또는 점성 매질은 복합체로부터 방출되는 시퀀싱 라이브러리의 확산을 최소화하는 데 사용된다. 외부 고정화제는 시퀀싱 라이브러리 또는 임의의 다른 폴리뉴클레오타이드가 외부 고정화제에서 용매화를 거의 또는 전혀 나타내지 않기 때문에 확산 장벽을 형성할 수 있다. 액체 형태의 예시적인 외부 고정화제에는 소수성 오일, 예를 들어 광유, 실리콘유, 퍼플루오르화 오일, 플루오르화 카본 오일(예를 들어, FC40) 또는 이들의 조합을 포함한다. 점성 매질 형태의 예시적인 외부 고정화제에는 폴리머(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈 등), 덱스트란, 수크로스, 글리세롤 등을 함유하는 완충액이 포함된다. 일부 예에서, 점성 매질은 온도 반응성 겔이다. 온도 반응성 겔은 비시딩 온도에서 비점성이고, 시딩 온도에서 점성 매질로 변한다. 온도 반응성 겔의 예에는 폴리(N-아이소프로필아크릴아미드) 및 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드(PEO-PPO-PEO)/라포나이트 나노입자 복합체가 포함된다.
플로우 셀: 반응이 수행될 수 있는 챔버(예를 들어, 플로우 채널), 시약(들)을 챔버에 전달하기 위한 입구 및 챔버로부터 시약(들)을 제거하기 위한 출구를 갖는 용기. 일부 예에서, 챔버는 챔버에서 일어나는 반응의 검출을 가능하게 한다. 예를 들어, 챔버는 어레이, 광학적으로 표지된 분자 등의 광학적 검출을 허용하는 하나 이상의 투명 표면을 포함할 수 있다.
플로우 채널: 액체 샘플을 선택적으로 수용할 수 있는, 2개의 접합되거나 아니면 부착된 구성요소 사이에 한정된 영역. 일부 예에서, 플로우 채널은 2개의 패턴화된 또는 비패턴화된 시퀀싱 표면 사이에 한정될 수 있고, 따라서 시퀀싱 표면의 하나 이상의 구성요소와 유체 연통할 수 있다.
단편: 유전 물질(예를 들어, DNA, RNA 등)의 일부 또는 조각. 연속성 보존 라이브러리 단편은 단편화된 더 긴 핵산 샘플의 더 작은 조각으로, 더 긴 핵산 샘플의 연속성 정보가 단편에 보존되었다.
핵산 분자 또는 샘플: 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머 형태이며, 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 이들의 유사체 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 이 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 지칭할 수 있다.
"주형" 핵산 분자(또는 가닥)는 분석하고자 하는 서열을 지칭할 수 있다. 주형 가닥의 클러스터에는 라이브러리 단편의 앰플리콘이 포함된다.
핵산 샘플의 뉴클레오타이드는 자연 발생 핵산 및 이의 기능적 유사체를 포함할 수 있다. 기능적 유사체의 예는 서열 특이적으로 핵산에 하이브리디제이션될 수 있거나, 특정 뉴클레오타이드 서열의 복제를 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 자연 발생 뉴클레오타이드는 일반적으로 포스포다이에스테르 결합을 포함하는 골격을 갖는다. 유사체 구조는 당업계에 공지된 다양한 것을 포함하는 대체 골격 결합을 가질 수 있다. 자연 발생 뉴클레오타이드는 일반적으로 데옥시리보스 당(예를 들어, DNA에서 발견됨) 또는 리보스 당(예를 들어, RNA에서 발견됨)을 갖는다. 유사체 구조는 당업계에 공지된 다양한 것을 포함하는 대체 당 부분을 가질 수 있다. 뉴클레오타이드는 천연 또는 비천연 염기를 포함할 수 있다. 천연 DNA는 아데닌, 티민, 시토신 및/또는 구아닌 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 천연 RNA는 아데닌, 우라실, 시토신 및/또는 구아닌 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 잠금 핵산(locked nucleic acid, LNA) 및 가교 핵산(BNA)과 같은 임의의 비천연 염기가 사용될 수 있다.
프라이머: 표적 서열에 하이브리디제이션될 수 있는 핵산 분자, 예컨대 라이브러리 단편에 부착된 어댑터. 일례로서, 증폭 프라이머는 주형 증폭 및 클러스터 생성을 위한 개시점으로서의 역할을 할 수 있다. 다른 예로서, 합성된 핵산(주형) 가닥은 합성된 핵산 가닥에 상보적인 새로운 가닥의 합성을 프라이밍하기 위해 프라이머(예를 들어, 시퀀싱 프라이머)가 하이브리디제이션할 수 있는 부위를 포함할 수 있다. 임의의 프라이머는 뉴클레오타이드 또는 이의 유사체의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 프라이머는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드이다. 프라이머 길이는 임의의 수의 염기 길이일 수 있으며, 다양한 비-천연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일례에서, 시퀀싱 프라이머는 10 내지 60개의 염기, 또는 20 내지 40개의 염기의 범위의 짧은 가닥이다.
시퀀싱 레디 핵산 단편: 3' 및 5' 말단에 어댑터를 갖는 유전 물질의 부분. 시퀀싱 레디 핵산 단편에서, 각각의 어댑터는 (예를 들어, 플로우 셀 상의 프라이머의 적어도 일부에 상보적이거나 이와 동일한) 공지된 유니버셜 서열 및 시퀀싱 프라이머 서열을 포함한다. 두 어댑터는 또한 인덱스(바코드 또는 태그) 서열을 포함할 수 있다. 일례에서, 한 측면(예를 들어, P5 '또는 P5 서열을 포함함)은 비드 인덱스를 포함할 수 있고, 다른 측면(P7 또는 P7' 서열을 포함함)은 샘플 인덱스를 포함할 수 있다. 시퀀싱 레디 핵산 단편은 트랜스포존의 삽입을 통해 고상 지지체에 결합될 수 있으며, 여기서 삽입된 DNA 분자는 고상 지지체(예를 들어, 비드)의 표면에 고정화되거나; 결합 쌍 또는 다른 절단가능한 링커를 통해 직접 고정화되거나; 하이브리디제이션을 통해 결합되는데, 여기서 상보적 어댑터 서열은 고상 지지체의 표면에 존재한다.
시퀀싱 표면: 시퀀싱이 일어날 수 있는 플로우 셀의 표면. 일부 예에서, 시퀀싱 표면은 하나 이상의 유형의 증폭 프라이머가 그래프팅된 폴리머 하이드로겔을 포함한다. 이러한 예에서, 시퀀싱 표면은 또한 증폭 프라이머에서 또는 그 근처에서 복합체를 고정화시키기 위한 포획 부위를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 시퀀싱 표면은 클러스터링된 고상 지지체들을 고정화시키기 위한 포획 부위를 포함한다.
고상 지지체: 예를 들어, 규칙적인 치수를 갖든지 불규칙적인 치수를 갖든지 간에 구형, 타원형, 미소구체 또는 다른 인식된 입자 형상으로 특징지어지는 형상을 갖는 강성 또는 반강성 재료로 제조된 소체. 일부 예에서, 고상 지지체에는 시퀀싱 라이브러리가 부착될 수 있다. 다른 예에서, 고상 지지체에는 주형 가닥의 클러스터가 부착될 수 있다.
표적 물질: 플로우 셀 표면에 고정화되는 임의의 물질.
트랜스포좀: 통합 효소(예를 들어, 인테그라제 또는 트랜스포사제)와, 통합 인식 부위(예를 들어, 트랜스포사제 인식 부위)를 포함하는 핵산 사이에 형성된 복합체.
본 명세서에 개시된 예에서, 표적 물질은 2개의 대향 시퀀싱 표면을 포함하는 플로우 셀에 도입된다. 이제부터 표적 물질과 플로우 셀에 대해 설명될 것이며, 이어서 2개의 대향 시퀀싱 표면 각각에 표적 물질을 고정화시키는 방법의 다양한 예가 설명될 것이다.
표적 물질
예시적인 표적 물질(11)이 도 1a 내지 도 1c에 도시되어 있다. 본 명세서에 개시된 예에서, 플로우 셀의 표면에 고정화되는 임의의 표적 물질(11)이 이용될 수 있다. 예로서, 표적 물질(11)은 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체(10A, 10B)(도 1a 및 도 1b 참조), 본 명세서에 정의된 바와 같은 클러스터링된 고상 지지체(13)(도 1c 참조), 특정 샘플로부터의 다른 DNA 라이브러리, 세포, 고상 지지체에 결합된 올리고뉴클레오타이드 복합 단백질, 단백질 바이오마커, 마이크로바이옴 등일 수 있다. 하기 설명은 복합체(10A, 10B) 및 클러스터링된 고상 지지체(13)의 일부 예를 제공한다.
복합체
일부 예시적인 복합체(10A, 10B)가 각각, 도 1a 및 도 1b에 나타나 있다. 본 명세서에 개시된 방법의 예에서, 복합체(10A, 10B)는 고상 지지체(12, 12') 및 고상 지지체(12, 12')에 부착된 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")을 포함한다.
밀도가 상이한 유체, 밀도가 상이한 표적 물질(11), 또는 비하전된 표적 물질(11)의 조합을 이용하는 방법의 예에서, 고상 지지체(12)는 제한 없이, 하이드로겔; 유리(예를 들어, 제어된 기공 유리 비드); 플라스틱, 예컨대 아크릴, 폴리스티렌, 또는 스티렌과 다른 재료의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄 또는 폴리테트라플루오로에틸렌(더 케무어스 컴퍼니(The Chemours Co) 제의 테플론(Teflon)®); 다당류 또는 가교결합 다당류, 예를 들어 아가로스, 세파로스(SEPHAROSE)® 비드(사이티바(Cytiva)로부터 입수가능한, 아가로스의 가교결합 비드 형태), 또는 세파덱스(SEPHADEX)® 비드(사이티바로부터 입수가능한, 덱스트란의 가교결합 비드 형태); 나일론; 니트로셀룰로스; 수지; 실리카 또는 실리카계 재료 - 규소 및 변성 규소를 포함함 -; 탄소 섬유; 금속; 무기 유리; 광섬유 다발; 또는 다양한 다른 폴리머일 수 있다. 고상 지지체(12)의 일부 예는 고체 비드, 다공성 비드 또는 중공 비드의 형태를 가질 수 있다.
유체와 자기력의 조합을 이용하는 방법의 예에서, 고상 지지체(12')는 자기 반응성 물질이다. "자기 반응성" 물질은 자계에 반응한다. 자기 반응성 고상 지지체의 예는 자기 반응성 물질을 포함하거나 이로 구성된다. 자기 반응성 물질의 예에는 상자성 물질, 강자성 물질, 페리자성 물질 및 메타자성 물질이 포함된다. 적절한 상자성 물질의 예에는 철, 니켈, 및 코발트뿐만 아니라, 금속 산화물, 예컨대 Fe3O4, BaFe12O19, CoO, NiO, Mn2O3, Cr2O3 및 CoMnP가 포함된다. 하나의 시판용 예에는 서모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)으로부터의 다이나비즈(DYNABEADS)™ M-280 스트렙타비딘(스트렙타비딘으로 코팅된 초상자성 비드)이 포함된다. 일부 예에서, 자기 반응성 물질은 폴리머 비드의 셸에 매립된다. 다른 예에서, 자기 반응성 물질은 비드 형태이고, 패시베이션 물질, 예컨대 산화규소 또는 아질산규소로 코팅된다. 2개의 상이한 표적 물질(11)을 이용하는 예시적인 방법에서, 표적 물질(11) 중 하나는 본 명세서에 개시된 자기 반응성 고상 지지체(12') 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
고정화를 위해 전계를 이용하는 방법의 예에서, 표적 물질(11)의 고상 지지체(12)는 양으로 하전되거나 음으로 하전될 수 있다. 이들 예에서, 고상 지지체(12)에 대해 기재된 임의의 예가 사용될 수 있으며, 원하는 전하를 부여하도록 코팅되거나 작용화될 수 있다. 소분자 또는 폴리머가 고상 지지체(12)에 전하를 부여하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 임의의 고상 지지체(12)(예를 들어, 폴리스티렌, 실리카 등)는 아민으로 작용화되어 양으로 하전될 수 있다. 임의의 일차, 이차 또는 삼차 아민이 사용될 수 있다. 적절한 아민의 예에는 아미노-실란, 폴리라이신 또는 키토산이 포함된다. 다른 예에서, 임의의 고상 지지체(12)(예를 들어, 폴리스티렌, 실리카, 세파덱스® 등)는 카르복실기 또는 설페이트기로 작용화되어 음으로 하전될 수 있다. 또 다른 예에서, 임의의 고상 지지체(12)(예를 들어, 폴리스티렌, 실리카, 세파덱스® 등)는 폴리글루탐산으로 코팅되어 음으로 하전될 수 있다.
도 1a 및 도 1b에 도시되지 않았지만, 고상 지지체(12, 12')는 결합쌍의 하나의 구성원으로 작용화될 수 있다. "결합쌍"은 서로 부착할 수 있는 2개의 작용인자(예를 들어, 물질, 분자, 부분)를 지칭한다. 이러한 예에서, 고상 지지체(12, 12')의 구성원은 플로우 셀의 시퀀싱 표면에 위치된 다른 구성원과의 결합쌍이다. 다른 예에서, 고상 지지체(12, 12')는 플로우 셀의 시퀀싱 표면에 화학적으로 결합될 수 있다.
고상 지지체(12, 12')의 작용화는 고상 지지체(12, 12')를 결합쌍 구성원으로 코팅하거나, 결합쌍 구성원과 고상 지지체(12, 12')의 표면의 작용기 사이에 결합을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 하나의 예시적인 결합쌍 구성원은 플로우 셀의 시퀀싱 표면에 위치된 다른 결합쌍 구성원에 결합할 수 있는 수용체-리간드 결합쌍의 구성원(예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘, 비오틴, 렉틴, 탄수화물, 핵산 결합 단백질, 에피토프, 항체 등)을 포함한다. 결합쌍 구성원은 또한 정전기적 상호작용, 수소 결합 또는 공유 결합(예를 들어, 티올-다이설파이드 교환, 클릭 화학, 딜스-알더 등)을 형성할 수 있는 화학 시약일 수 있다. 임의의 형태의 화학적 커플링은 또한 고상 지지체(12, 12')를 플로우 셀의 시퀀싱 표면에 부착시킬 수 있다. 많은 경우에, 고상 지지체(12, 12')가 시퀀싱 전에 제거될 수 있도록 가역적 또는 절단가능한 상호작용이 바람직하다.
복합체(10A, 10B)의 예에서, 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")은 고상 지지체(12, 12')에 부착된다. 각각의 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")은 3' 및 5' 말단에 어댑터(예를 들어, 18, 18', 18", 22, 22', 22")를 갖는 더 긴 조각의 유전 물질의 일부(예를 들어, 단편(16, 16', 16"))를 포함한다. 시퀀싱 레디 단편(14, 14', 14")은 더 긴 조각의 유전 물질을 단편화하고, 원하는 어댑터(18, 18', 18", 22, 22', 22")를 단편(16, 16', 16")의 말단에 포함시키는 임의의 라이브러리 제조 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 적절한 라이브러리 제조 기술은 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명된다. 그러나, 다른 라이브러리 제조 기술도 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
도 1a는 더 큰 핵산 샘플로부터의 단편(16, 16')을 포함하는 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14')을 포함하는 복합체(10A)의 일례를 도시한 것이며, 이의 연속성은 고상 지지체(12, 12')에 보존된다. 복합체(10A)를 제조하기 위한 예시적인 방법이 본 명세서에 기술되어 있지만, 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14')이 고상 지지체(12, 12')에 부착되는 한, 다른 방법이 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.
도 1a에 나타낸 복합체(10A)를 형성하는 하나의 예시적인 방법에서, 어댑터 서열(18, 18')이 결합쌍의 하나의 구성원(20)을 통해 고상 지지체(12, 12')에 결합된다. 일례에서, 이러한 어댑터 서열(18, 18')은 제1 시퀀싱 프라이머 서열(예를 들어, 리드 1 시퀀싱 프라이머 서열) 및 플로우 셀(도 2a, 도 2b 및 도 2c에 나타냄) 상의 증폭 프라이머(예를 들어, P5) 중 하나의 적어도 일부에 상보적인 제1 서열(P5')을 포함할 수 있다. 어댑터 서열(18, 18')은 또한 인덱스 또는 바코드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 어댑터 서열(18, 18')은 결합쌍의 하나의 구성원(20)(예를 들어, 비오틴)에 결합되어, 결합쌍의 다른 구성원(예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘 등)을 포함하는 고상 지지체(12, 12')의 표면에 결합될 수 있다. 이러한 예에서, 고상 지지체(12, 12') 상의 결합쌍의 구성원은 i) 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14')을 부착하는데 사용되는 구성원(20)에 결합하고, ii) 플로우 셀의 시퀀싱 표면에 결합할 수 있다는 점에서 다작용성일 수 있다. 다른 예에서, 고상 지지체(12, 12')는 2개의 상이한 결합쌍 구성원으로 작용화될 수 있는데, 예를 들어 i) 그 중 하나는 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14')을 부착하는데 사용되는 구성원(20)에 결합할 수 있고, ii) 그 중 다른 하나는 플로우 셀의 시퀀싱 표면에 결합할 수 있다.
이러한 예에서, 트랜스포좀 복합체(도시되지 않음)가 또한 라이브러리 제조 방법의 개시 시에 고상 지지체(12, 12')에 결합될 수 있다. 고상 지지체(12, 12') 상에 트랜스포좀 복합체를 로딩하기 전에, 부분 Y-어댑터가 트랜스포사제 효소(예를 들어, 2개의 Tn5 분자)와 혼합되어 트랜스포좀 복합체를 형성할 수 있다. 부분 Y-어댑터는 서로 하이브리디제이션되는 2개의 모자이크 말단 서열을 포함할 수 있다. 모자이크 말단 서열 중 하나는 유리 모자이크 말단 서열로 지칭되는데, 이는 2개의 유리 말단, 예를 들어 어댑터(18, 18')에 부착할 수 있는 하나의 말단과, 태그멘테이션(tagmentation) 동안 단편화된 DNA 가닥(16, 16')에 부착할 수 있는 다른 말단을 갖기 때문이다. 모자이크 말단 서열 중 다른 하나는 다른 어댑터 서열(22, 22')에 부착될 수 있으며, 이는 제2 시퀀싱 프라이머 서열(예를 들어, 리드 2 시퀀싱 프라이머 서열) 및 플로우 셀 상의 증폭 프라이머(P7) 중 다른 하나의 적어도 일부와 동일한 제2 서열(P7)을 포함한다. 증폭 시에, 동일 서열은 플로우 셀 상의 다른 증폭 프라이머(P7)의 적어도 일부에 상보적인 카피의 형성을 가능하게 한다. 어댑터 서열(22, 22')은 태그멘테이션 동안 단편화된 DNA 가닥(16, 16')에 부착되지 않는다.
고상 지지체(12, 12') 상에 트랜스포좀 복합체를 로딩하는 것은 트랜스포좀 복합체를 고상 지지체(12, 12')와 혼합하고, 혼합물을 유리 모자이크 말단의 유리 말단 중 하나를 어댑터 서열(18, 18')의 3' 말단에 라이게이션하기에 적합한 조건에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 개별 트랜스포좀 복합체는 고상 지지체(12, 12') 상의 어댑터 서열(18, 18') 각각에 부착될 수 있다.
복합체(10A)를 형성하기 위한 이러한 예시적인 방법에서, 태그멘테이션 과정이 그 다음에 수행될 수 있다. 더 긴 핵산 샘플(예를 들어, DNA)을 포함하는 유체(예를 들어, 태그멘테이션 완충액)가 어댑터 서열(18, 18') 및 이에 결합된 트랜스포좀 복합체를 갖는 고상 지지체(12, 12')에 첨가될 수 있다. 샘플이 트랜스포좀 복합체와 접촉함에 따라, 더 긴 핵산 샘플이 태그멘테이션된다. 더 긴 핵산 샘플은 단편(16, 16')으로 단편화되고, 각각은 5' 말단에서 부분 Y-어댑터에 태깅된다(예를 들어, 유리 모자이크 말단 서열의 다른 유리 말단의 라이게이션을 통해). 더 긴 핵산 샘플의 연속적 태그멘테이션은 트랜스포좀 복합체 사이에 다수의 가교 분자를 형성한다. 가교 분자는 고상 지지체(12, 12') 주위를 둘러싼다. 트랜스포좀 복합체는 가교 분자로서 더 긴 핵산 샘플의 연속성을 유지한다.
이어서, 트랜스포사제 효소는 도데실황산나트륨(SDS) 처리 또는 열 또는 프로테이나아제 K 분해를 통해 제거될 수 있다. 트랜스포사제 효소의 제거는 고상 지지체(12, 12')에 부착된 연속성 보존 단편(16, 16')을 남긴다.
시퀀싱 레디 단편(14, 14')을 완성하기 위해, 샘플 단편(16, 16')이 어댑터 서열(22, 22')에 부착되는 것을 보장하기 위해 추가의 신장 및 라이게이션이 수행된다. 얻어진 복합체(10A)가 도 1a에 도시되어 있다.
각각의 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14')은 어느 한 말단에 부착된 각각의 어댑터 서열(18, 22 또는 18', 22')을 갖는 연속성 보존 라이브러리 단편(16, 16')을 포함한다. 어댑터 서열(18, 18')은 고상 지지체(12, 12')에 초기에 결합된 것들이며, 제1 시퀀싱 프라이머 서열 및 플로우 셀 프라이머 중 하나에 상보적인 제1 서열을 포함한다. 어댑터 서열(18, 18')은 결합쌍의 하나의 구성원(20)에 부착된다. 어댑터 서열(22, 22')은 부분 Y-어댑터로부터 유래되고, 다른 플로우 셀 프라이머와 동일한 제2 서열 및 제2 시퀀싱 프라이머 서열을 포함한다. 각각의 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14')이 증폭(예를 들어, 브리지 증폭) 및 시퀀싱에 적합한 어댑터를 포함하기 때문에, PCR 증폭은 수행되지 않는다. 따라서, 이들 단편(14, 14')은 시퀀싱 레디된다. 또한, 연속성 보존 라이브러리 단편(16, 16')이 동일한 더 긴 핵산 샘플로부터 유래하기 때문에, 원래 샘플의 연속성은 보존되고, 라이브러리 단편(14, 14')은 연결된 긴 리드 응용에 적합할 수 있다.
도 1b는 고상 지지체(12, 12') 및 고상 지지체(12, 12')에 부착된 시퀀싱 레디 핵산 단편(14")을 포함하는 다른 복합체(10B)를 예시한다. 일례에서, PCR이 없는 뉴클레오타이드 라이브러리를 튜브에 생성하고, 이어서 라이브러리를 튜브 내의 고상 지지체(12, 12')에 하이브리디제이션한다. 도 1b에 도시된 예에서, 어댑터(18", 22")가 튜브의 라이브러리 단편(16")에 추가되고, 결합쌍의 하나의 구성원(20)을 갖는 프라이머가 튜브의 어댑터(18")에 하이브리디제이션된 다음에, 시퀀싱 레디 핵산 단편(14")은 결합쌍의 구성원(20)을 통해 고상 지지체(12, 12')에 결합된다. 다른 예에서, 고상 지지체(12, 12')는 결합쌍(예를 들어, 지지체(12, 12') 상의 아비딘 및 프라이머에 부착된 비오틴)을 통해 부착된 프라이머를 가질 수 있다. 이들 프라이머는 라이브러리 단편(16")에 부착된 어댑터(18")에 하이브리디제이션한다(따라서, 프라이머 및 결합쌍 구성원은 단편의 한 말단에 있고, 다른 쪽에는 없다). 또 다른 예에서, 신장은 가닥 치환 효소를 사용하여 수행될 수 있다. 이렇게 하여, 완전 이중 가닥 라이브러리가 생성될 것이다(예를 들어, 도 1b에 도시된 바와 같이, 포크 또는 Y-어댑터 없음).
언급된 바와 같이, 다른 라이브러리 제조 기술도 사용될 수 있다. 예를 들어, 상보적 어댑터 서열이 플로우 셀에 고정화된 경우에, 라이게이션 기반 라이브러리 제조 기술이 사용될 수 있다. 다른 예에서, mRNA는 폴리A 테일 하이브리디제이션을 통해 고상 지지체(12, 12')에 고정화될 수 있다.
클러스터링된 고상 지지체
예시적인 클러스터링된 고상 지지체(13)가 도 1c에 도시되어 있다. 클러스터링된 고상 지지체(13)는 고상 지지체(12, 12') 및 프라이머(42 또는 42')를 통해 고상 지지체(12, 12')에 부착된 주형 가닥(64)을 포함한다.
고상 지지체(12, 12')의 임의의 예가 클러스터링된 고상 지지체(13)의 코어로서 사용될 수 있다. 고상 지지체(12, 12')의 유형 및 이의 특성/특성들(예를 들어, 밀도, 전하, 자성 등)은 사용되는 고정화 방법에 따라 달라질 수 있다.
도 1c에 도시되지 않지만, 도 1a 및 도 1b에 도시된 복합체(10A, 10B)와 유사하게, 고상 지지체(12, 12')는 플로우 셀의 포획 부위에 부착하기 위한 결합쌍의 하나의 구성원으로 작용화될 수 있다.
도 1c에 도시된 바와 같이, 고상 지지체(12, 12')의 이러한 예는 프라이머(42, 42')로 작용화된다. 프라이머(42, 42')는 프라이머(42, 42')의 5' 말단 또는 그 부근에서 단일점 공유 결합 또는 강한 비공유 상호작용에 의해 고상 지지체(12, 12')에 고정화될 수 있는 증폭 프라이머(42, 42')일 수 있다. 결합에 의해, i) 상기 프라이머(42, 42')의 어댑터 특이적 부분이 이의 관련된 시퀀싱 레디 핵산 단편에 자유롭게 어닐링할 수 있고, ii) 프라이머 신장(primer extension)을 위해 3' 하이드록실기가 자유롭게 남아있게 된다. 5' 말단 또는 그 부근에서, 프라이머(42, 42')는 공유 결합 또는 강한 비공유 상호작용이 가능한 화학적으로 변형가능한 작용기를 포함한다. 화학적으로 변형가능한 작용기의 예에는 티올, 아지도, 알킨, 아미노, 비오틴 등이 포함된다.
적절한 프라이머(42, 42')의 구체적인 예에는 하이세크(HiSeq)™, 하이세크엑스(HiSeqX)™, 마이세크(MiSeq)™, 마이세크디엑스(MiSeqDX)™, 미니세크(MiniSeq)™, 넥스트세크(NextSeq)™, 넥스트세크디엑스(NextSeqDX)™, 노바세크(NovaSeq)™, 게놈 애널라이저(Genome Analyzer)™, 아이세크(ISEQ)™ 및 다른 인스트루먼트 플랫폼(instrument platform)에서 시퀀싱하기 위해, 일루미나 인코포레이티드(Illumina Inc.)에서 판매하는 시판용 플로우 셀의 표면에 사용되는 P5 및 P7 프라이머가 포함된다. P5 및 P7 프라이머는 모두 고상 지지체(12, 12') 각각에 그래프팅될 수 있다.
일례에서, 고상 지지체(12, 12')에 대한 프라이머(42, 42')의 그래프팅은 덩크 코팅을 포함할 수 있으며, 이는 프라이머(42, 42'), 물, 완충액 및 촉매를 포함할 수 있는 프라이머 용액 또는 혼합물에 고상 지지체(12, 12')를 침지시키는 것을 포함한다. 다른 그래프팅 기술은 스프레이 코팅, 퍼들 디스펜싱, 또는 프라이머(들)(42, 42')를 고상 지지체(12, 12')에 부착시킬 다른 적절한 방법을 포함할 수 있다. 임의의 그래프팅 방법에 의해, 프라이머(42, 42')는 고상 지지체(12, 12')의 반응성 기와 반응한다.
그래프팅 동안, 프라이머(42, 42')의 화학적으로 변형가능한 작용기는 고상 지지체(12, 12')의 반응성 기와 반응하거나 상호작용한다. 다음은 그래프팅 동안 일어날 수 있는 반응 또는 상호작용의 예이다: 아지도(예를 들어, 석신이미딜(NHS) 에스테르) 말단 프라이머와 고상 지지체(12, 12')의 표면 상의 하이드라진의 반응, 알킨 말단 프라이머와 고상 지지체(12, 12')의 표면 상의 아지드와의 반응, 아미노 말단 프라이머와 고상 지지체(12, 12')의 표면 상의 활성화 카르복실레이트기 또는 NHS 에스테르와의 반응, 티올 말단 프라이머와 고상 지지체(12, 12')의 표면 상의 알킬화 반응물(예를 들어, 요오도아세트아민 또는 말레이미드)과의 반응, 포스포르아미다이트 말단 프라이머와 고상 지지체(12, 12')의 표면 상의 티오에테르와의 반응, 또는 비오틴 변성 프라이머와 고상 지지체(12, 12')의 표면 상의 스트렙타비딘과의 상호작용. 일부 핵산 프라이머(42, 42')는 카오트로픽제(chaotropic agent; KI, NI 또는 NaSCN)의 존재 하에 실리카 비드 상에 포획될 수 있다. 하나의 구체적인 예로서, 다이벤조사이클로옥틴(DBCO, 알킨 포함) 말단 프라이머는 구리 비함유 클릭 그래프팅을 위해 사용될 수 있다.
고상 지지체(12, 12') 상에 주형 가닥(64)을 생성하기 위해, 라이브러리 주형은 먼저 임의의 핵산 샘플(예를 들어, DNA 샘플 또는 RNA 샘플)로부터 제조될 수 있다. RNA 샘플이 사용되는 경우, 이것은 먼저 상보적 데옥시리보핵산(cDNA) 샘플로 전환된다. 이는 역전사효소를 이용하는 역전사를 사용하여 행해질 수 있다. 일부 예에서, 역전사 및 제2 가닥 합성용 키트가 사용된다. 이러한 예에서, 서모피셔 사이언티픽 사제의 고용량 cDNA 역전사 키트가 사용될 수 있다. 다른 예에서, 역전사 및 주형 스위치(제2 가닥용)용 키트가 사용된다. 이러한 예에서, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 사제의 주형 스위칭 RT 효소 혼합물이 사용될 수 있다.
이어서, DNA 또는 cDNA 샘플은 단일 가닥의 크기가 균일한(예를 들어, < 1000 bp) 단편으로 단편화될 수 있다. 제조 시에, 어댑터가 이들 단편의 말단에 첨가될 수 있다. 사이클 증폭 감소를 통해, 상이한 모티프, 예컨대 시퀀싱 결합 부위, 인덱스, 및 고상 지지체(12, 12') 상의 프라이머(42, 42')에 상보적이거나 이것과 동일한 영역이 어댑터에 도입될 수 있다. 최종 라이브러리 주형은 양 말단에 DNA 또는 cDNA 단편 및 어댑터를 포함한다. 일부 예에서, 단일 핵산 샘플로부터의 단편에는 동일한 어댑터가 추가된다.
다수의 라이브러리 주형이 다수의 고상 지지체(12, 12')에 도입될 수 있다. 라이브러리 주형이 각각의 고상 지지체(12, 12') 상에 고정화된 2가지 유형의 프라이머(42, 42') 중 하나에 하이브리디제이션된다. 이어서, 클러스터 생성이 수행될 수 있다. 클러스터 생성의 일례에서, 고상 지지체(12, 12') 상의 라이브러리 주형은 고충실도 DNA 폴리머라제를 사용하여 3' 신장에 의해 하이브리디제이션된 프라이머로부터 카피된다. 원래의 라이브러리 주형은 변성되어, 예를 들어 도 1c에 도시된 바와 같이 프라이머(42)를 통해 고상 지지체(12, 12') 상에 고정화된 카피(예를 들어, 주형 가닥(64))를 남긴다. 등온 브리지 증폭 또는 다른 형태의 증폭을 사용하여, 고정화 카피를 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, 카피된 주형은 인접한 상보적 프라이머(예를 들어, 프라이머(42'))에 루프되어 하이브리디제이션하고, 폴리머라제는 카피된 주형을 카피하여 이중 가닥 브리지를 형성하고, 이는 변성되어 2개의 단일 가닥으로 된 가닥을 형성한다. 이들 2개의 가닥은 인접한 상보적 프라이머(42, 42')에 루프되어 하이브리디제이션하고, 다시 신장되어 2개의 새로운 이중 가닥 루프를 형성한다. 이 프로세스는 밀도가 높은 클론 클러스터를 생성하기 위해 등온 변성 및 증폭의 사이클에 의해 각각의 주형 카피에서 반복된다. 이중 가닥 브리지의 각각의 클러스터는 변성된다. 일례에서, 역방향 가닥은 특정 염기 절단에 의해 제거되어, 정방향 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥을 남긴다. 클러스터링에 의해, 고상 지지체(12, 12') 상에 수개의 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥(64)이 형성된다. 클러스터링의 이러한 예는 브리지 증폭이며, 수행될 수 있는 증폭의 일례이다.
플로우 셀
플로우 셀(24)의 일례의 평면도가 도 2a에 도시되어 있다. 본 명세서에 언급된 바와 같이, 플로우 셀(24)은 2개의 시퀀싱 대향 시퀀싱 표면을 포함한다. 비패턴화된 시퀀싱 표면(30, 30')의 일례가 도 2b에 도시되어 있고, 패턴화된 시퀀싱 표면(32, 32')의 일례가 도 2c에 도시되어 있으며, 패턴화된 시퀀싱 표면(31, 31')의 다른 예가 도 2d에 도시되어 있다. 비패턴화된 시퀀싱 표면(30, 30') 및 패턴화된 시퀀싱 표면(32, 32')은 프라이머(42, 42')를 포함하며, 따라서 플로우 셀(24) 상에 증폭될 라이브러리 단편을 도입하는 표적 물질(11)과 함께 이용될 수 있다. 패턴화된 시퀀싱 표면(31, 31')과 같은 다른 시퀀싱 표면은 프라이머(42, 42')를 포함하지 않으며, 따라서 클러스터링된 고상 지지체(13)와 함께 이용될 수 있다.
각각의 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31')은 기판(일반적으로 도 2a에서 26으로 나타냄)에 의해 지지되고, 플로우 채널(일반적으로 도 2a에서 28로 나타냄)은 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31') 사이에 한정된다.
기판(26)은 단일 층/물질일 수 있다. 단일 층 기판의 예가 도 2b에 도면 부호 26A 및 26A'으로 도시되어 있다. 적절한 단일 층 기판(26A, 26A')의 예에는 에폭시 실록산, 유리, 개질된 또는 작용화된 유리, 플라스틱(아크릴, 폴리스티렌 및 스티렌과 다른 재료의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 폴리테트라플루오로에틸렌(예를 들어, 케무어스 사제의 테플론®), 환형 올레핀/사이클로-올레핀 중합체(COP)(예를 들어, 제온(Zeon) 사제의 제오노르(ZEONOR)®), 폴리이미드 등), 나일론(폴리아미드), 세라믹/세라믹 산화물, 실리카, 용융 실리카 또는 실리카계 재료, 규산알루미늄, 규소 및 변성 규소(예를 들어, 붕소 도핑된 p+ 규소), 질화규소(Si3N4), 산화규소(SiO2), 오산화탄탈룸(Ta2O5) 또는 다른 산화탄탈룸(들) (TaOx), 산화하프늄(HfO2), 탄소, 금속, 무기 유리 등이 포함된다.
기판(26)은 또한 다층 구조일 수 있다. 다층 기판의 예는 도 2c 및 도 2d에서 도면 부호 26B 및 26B'으로 도시되어 있다. 다층 구조(26B, 26B')의 일부 예에는 표면에 산화탄탈룸 또는 다른 세라믹 산화물의 코팅층이 있는 유리 또는 규소가 포함된다. 도 2c 및 도 2d를 구체적으로 참조하면, 다층 구조(26B, 26B')의 다른 예는 그 위에 패턴화된 수지(36, 36')를 갖는 하부 지지체(34, 34')를 포함한다. 다층 기판(26B, 26B')의 또 다른 예는 실리콘 온 인슐레이터(SOI, silicon-on-insulator) 기판을 포함할 수 있다.
일례에서, 기판(26)(단일층이든 다층이든)은 약 2 mm 내지 약 300 mm 범위의 직경, 또는 약 10 피트(약 3 미터) 이하의 최대 치수를 갖는 직사각형 시트 또는 패널을 가질 수 있다. 일례에서, 기판(26)은 약 200 mm 내지 약 300 mm 범위의 직경을 갖는 웨이퍼이다. 다른 예에서, 기판(26)은 약 0.1 mm 내지 약 10 mm 범위의 폭을 갖는 다이이다. 예시적인 치수가 제공되었지만, 임의의 적절한 치수를 갖는 기판(26)이 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 다른 예에서, 300 mm의 둥근 웨이퍼보다 더 큰 표면적을 갖는 직사각형 지지체인 패널이 사용될 수 있다.
도 2a에 도시된 예에서, 플로우 셀(24)은 플로우 채널(28)을 포함한다. 몇몇 플로우 채널(28)이 도시되어 있지만, 임의의 수의 채널(28)이 플로우 셀(24)에 포함될 수 있다(예를 들어, 단일 채널(28), 4개의 채널(28) 등). 본 명세서에 개시된 예에서, 각각의 플로우 채널(28)은 2개의 시퀀싱 표면(예컨대, 30 및 30', 또는 32 및 32', 또는 31 및 31') 사이에, 그리고 2개의 부착된 기판(예를 들어, 26A 및 26A', 또는 26B 및 26B')에 의해 한정되는 영역이다. 본 명세서에 기재된 유체는 각각, 입구(들) 및 출구(들)를 통해 플로우 채널(들)(28)에 도입되고 이로부터 제거될 수 있다. 각각의 플로우 채널(28)은 플로우 셀(24)의 각각의 다른 플로우 채널(28)로부터 분리될 수 있어서, 임의의 특정 플로우 채널(28)에 도입된 유체가 임의의 인접한 플로우 채널(28)로 유동하지 않는다.
플로우 채널(28)의 일부는 부분적으로 기판(26)의 재료(들)에 의존하는 임의의 적절한 기술을 사용하여 기판(26)에 형성될 수 있다. 일례에서, 플로우 채널(28)의 일부는 유리 기판(26)에 에칭된다. 다른 예에서, 플로우 채널(28)의 일부는 포토리소그래피, 나노임프린트 리소그래피 등을 사용하여 다층 기판(26B, 26B')의 수지(36, 36')로 패턴화될 수 있다. 또 다른 예에서, 별도의 물질(예컨대, 도 2b, 도 2c 및 도 2d의 물질(50))이 기판(26)에 적용될 수 있어서, 별도의 물질이 플로우 채널(28)의 벽의 적어도 일부를 형성한다.
일례에서, 플로우 채널(28)은 직사각형 구조를 갖는다. 플로우 채널(28)의 길이 및 폭은 각각, 기판(26)의 길이 및 폭보다 작을 수 있어서, 플로우 채널(28)을 둘러싸는 기판 표면의 일부는 다른 기판(26)에 부착시키는데 이용될 수 있다. 일부 경우에, 각각의 플로우 채널(28)의 폭은 적어도 약 1 mm, 적어도 약 2.5 mm, 적어도 약 5 mm, 적어도 약 7 mm, 적어도 약 10 mm 또는 그 이상일 수 있다. 일부 경우에, 각각의 플로우 채널(28)의 길이는 적어도 약 10 mm, 적어도 약 25 mm, 적어도 약 50 mm, 적어도 약 100 mm 또는 그 이상일 수 있다. 각각의 플로우 채널(28)의 폭 및/또는 길이는 상기에 명시된 값보다 크거나, 그보다 작거나, 그 사이에 있을 수 있다. 다른 예에서, 플로우 채널(28)은 정사각형(예컨대, 10 mm x 10 mm)이다.
각각의 플로우 채널(28)의 깊이는 예를 들어, 마이크로접촉, 에어로졸 또는 잉크젯 프린팅이 플로우 채널 벽을 형성하는 별도의 물질(예를 들어, 물질(50))을 증착하는데 사용되는 경우에, 몇 개의 단층 두께만큼 작을 수 있다. 다른 예에서, 각각의 플로우 채널(28)의 깊이는 약 1 μm, 약 10 μm, 약 50 μm, 약 100 μm 또는 그 이상일 수 있다. 일례에서, 깊이는 약 10 μm 내지 약 100 μm의 범위일 수 있다. 다른 예에서, 깊이는 약 5 μm 이하이다. 각각의 플로우 채널(28)의 깊이가 상기에 명시된 값보다 크거나, 그보다 작거나, 그 사이에 있음을 이해해야 한다. 플로우 채널(28)의 깊이는 또한 예를 들어, 패턴화된 시퀀싱 표면(32, 32' 또는 31, 31')이 사용되는 경우, 플로우 셀(24)의 길이 및 폭을 따라 변할 수 있다.
도 2b는 비패턴화된 대향 시퀀싱 표면(30, 30')을 포함하는 플로우 셀(24)의 단면도를 예시한다. 일례에서, 이들 표면(30, 30') 각각은 기판(26A, 26A') 상에 준비될 수 있고, 이어서 기판(26A, 26A')은 플로우 셀(24)의 일례를 형성하도록 서로 부착될 수 있다. 접착제와 같은 임의의 적절한 접합 물질(50), 접합을 돕는 방사선 흡수 물질 등이 기판(26A, 26B)을 함께 접합하는 데 사용될 수 있다.
도 2b에 도시된 예에서, 플로우 채널(28)의 일부는 단일 층 기판(26A, 26A') 각각에 한정된다. 예를 들어, 각각의 기판(26A, 26A')은 그 안에 형성된 오목 영역(38, 38')을 가질 수 있으며, 여기서 시퀀싱 표면(30, 30')의 구성요소가 도입될 수 있다. 시퀀싱 표면(30, 30')의 구성요소에 의해 점유되지 않은 오목 영역(38, 38') 내의 모든 공간이 플로우 채널(28)의 일부인 것으로 간주될 수 있음을 이해하여야 한다.
시퀀싱 표면(30, 30')은 폴리머 하이드로겔(40, 40'), 폴리머 하이드로겔(40, 40')에 부착된 증폭 프라이머(42, 42') 및 화학적 포획 부위(44, 44')를 포함한다.
폴리머 하이드로겔(40, 40')의 예에는 아크릴아미드 공중합체, 예를 들어 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아미드-코-아크릴아미드, PAZAM이 포함된다. PAZAM 및 일부 다른 형태의 아크릴아미드 공중합체는 하기 구조(I)로 나타내어진다:
Figure pct00001
상기 식에서,
RA는 아지도, 임의로 치환된 아미노, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알킨, 할로겐, 임의로 치환된 하이드라존, 임의로 치환된 하이드라진, 카르복실, 하이드록시, 임의로 치환된 테트라졸, 임의로 치환된 테트라진, 니트릴 옥사이드, 니트론, 설페이트 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택되고;
RB는 H 또는 임의로 치환된 알킬이며;
RC, RD 및 RE는 각각 독립적으로 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 -(CH2)p-는 임의로 치환될 수 있으며;
p는 1 내지 50의 범위의 정수이고;
n은 1 내지 50,000의 범위의 정수이며;
m은 1 내지 100,000 범위의 정수이다.
당업자는 구조(I)에서 반복되는 "n" 및 "m" 특징부의 배열이 대표적이며, 단량체 서브유닛은 중합체 구조(예를 들어, 랜덤, 블록, 패턴화 또는 이들의 조합)에서 임의의 순서로 존재할 수 있다.
PAZAM 및 다른 형태의 아크릴아미드 공중합체의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 1500 kDa, 또는 약 10 kDa 내지 약 1000 kDa 범위일 수 있거나, 구체예에서 약 312 kDa일 수 있다.
일부 예에서, PAZAM 및 다른 형태의 아크릴아미드 공중합체는 선형 중합체이다. 일부 다른 예에서, PAZAM 및 다른 형태의 아크릴아미드 공중합체는 약하게 가교결합된 중합체이다.
다른 예에서, 폴리머 하이드로겔(40, 40')은 구조(I)의 변형일 수 있다. 일례에서, 아크릴아미드 단위는 N,N-다이메틸아크릴아미드(
Figure pct00002
)로 치환될 수 있다. 이러한 예에서, 구조(I)의 아크릴아미드 단위는
Figure pct00003
로 치환될 수 있으며, 여기서 RD, RE 및 RF는 각각 H 또는 C1-C6 알킬이고, RG 및 RH는 각각 C1-C6 알킬(아크릴아미드의 경우와 같이 H 대신에)이다. 이러한 예에서, q는 1 내지 100,000 범위의 정수일 수 있다. 다른 예에서, 아크릴아미드 단위 이외에, N,N-다이메틸아크릴아미드가 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 구조(I)는 반복되는 "n" 및 "m" 특징부 이외에
Figure pct00004
를 포함할 수 있으며, 여기서 RD, RE 및 RF는 각각 H 또는 C1-C6 알킬이고, RG 및 RH는 각각 C1-C6 알킬이다. 이러한 예에서, q는 1 내지 100,000 범위의 정수일 수 있다.
폴리머 하이드로겔(40, 40')의 다른 예로서, 구조(I)의 반복되는 "n" 특징부는 하기 구조(II)를 갖는 헤테로사이클릭 아지도기를 포함하는 단량체로 치환될 수 있다:
Figure pct00005
상기 식에서, R1은 H 또는 C1-C6 알킬이고; R2는 H 또는 C1-C6 알킬이며; L은 탄소, 산소 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 내지 20개의 원자를 갖는 선형 사슬 및 상기 사슬의 탄소 및 임의의 질소 원자 상의 10개의 임의의 치환기를 포함하는 링커이고; E는 탄소, 산소 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 4개의 원자, 및 선형 사슬의 탄소 및 임의의 질소 원자 상의 임의의 치환기를 포함하는 선형 사슬이며; A는 N에 부착된 H 또는 C1-C4 알킬을 갖는 N 치환된 아미드이고; Z는 질소 함유 헤테로사이클이다. Z의 예에는 단일 환형 구조 또는 융합 구조로서 존재하는 5 내지 10개의 고리 구성원이 포함된다. Z의 일부 구체적인 예에는 피롤리디닐, 피리디닐 또는 피리미디닐이 포함된다.
또 다른 예로서, 폴리머 하이드로겔(40, 40')은 하기 구조(III) 및 (IV) 각각의 반복 단위를 포함할 수 있다:
Figure pct00006
및
Figure pct00007
상기 식에서, R1a, R2a, R1b 및 R2b는 각각 독립적으로 수소, 임의로 치환된 알킬 또는 임의로 치환된 페닐로부터 선택되고; R3a 및 R3b는 각각 독립적으로 수소, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 페닐 또는 임의로 치환된 C7-C14 아랄킬로부터 선택되고; L1 및 L2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 알킬렌 링커 또는 임의로 치환된 헤테로알킬렌 링커로부터 선택된다.
다른 분자가 올리고뉴클레오타이드 프라이머(42, 42')를 그래프팅하도록 작용화되는 한, 폴리머 하이드로겔(40, 40')을 형성하기 위해 다른 분자가 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 적절한 폴리머층의 다른 예에는 콜로이드 구조를 갖는 것들, 예컨대 아가로스; 또는 폴리머 메시 구조, 예컨대 젤라틴; 또는 가교결합된 폴리머 구조, 예컨대 폴리아크릴아미드 중합체 및 공중합체, 실란 비함유 아크릴아미드(SFA) 또는 SFA의 아지도 분해된(azidolyzed) 버전이 포함된다. 적절한 폴리아크릴아미드 중합체의 예는 아크릴아미드 및 아크릴산 또는 비닐기를 포함하는 아크릴산으로부터, 또는 [2+2] 광고리화 첨가반응을 형성하는 단량체로부터 합성될 수 있다. 적절한 폴리머 하이드로겔(42)의 또 다른 예는 아크릴아미드와 아크릴레이트의 혼합 공중합체를 포함한다. 아크릴 단량체(예를 들어, 아크릴아미드, 아크릴레이트 등)를 포함하는 다양한 폴리머 구조, 예컨대 성상 중합체, 성형(star-shaped) 또는 성형 블록(star-block) 중합체, 덴드리머(dendrimer) 등을 포함하는 분지형 중합체가 본 명세서에 개시된 실시예에 이용될 수 있다. 예를 들어, 단량체(예를 들어, 아크릴아미드 등)는 성형 중합체의 분지(아암)에 랜덤하게 또는 블록으로 포함될 수 있다.
폴리머 하이드로겔(40, 40')을 오목 영역(38, 38')에 도입하기 위해, 폴리머 하이드로겔(40, 40')의 혼합물이 생성된 다음에, 각각의 기판(26A, 26A')(내부에 오목 영역(38, 38')이 형성됨)에 적용될 수 있다. 일례에서, 폴리머 하이드로겔(40, 40')은 혼합물(예를 들어, 물, 또는 에탄올 및 물과 함께)에 존재할 수 있다. 이어서, 혼합물은 스핀 코팅, 또는 침지 또는 딥 코팅, 또는 정압 또는 부압 하에서의 물질의 유동, 또는 다른 적절한 기술을 사용하여 각각의 기판 표면(오목 영역(38, 38')의 표면 포함)에 적용될 수 있다. 이러한 유형의 기술은 폴리머 하이드로겔(40, 40')을 각각의 기판(26A, 26A')(예를 들어, 오목 영역(38, 38') 내의 및 이에 인접한 틈새 영역(46, 46') 상의)에 전면적으로 증착한다. 다른 선택적 증착 기술(예를 들어, 마스크, 제어된 프린팅 기술 등)을 사용하여 틈새 영역(46, 46')이 아닌 오목 영역(38, 38')에 폴리머 하이드로겔을 명확하게 증착할 수 있다.
일부 예에서, 기판 표면(오목 영역(38, 38')을 포함함)이 활성화될 수 있고, 이어서 혼합물(폴리머 하이드로겔(40, 40')을 포함함)이 이에 적용될 수 있다. 일례에서, 실란 또는 실란 유도체(예를 들어, 노르보르넨 실란)가 증착, 스핀 코팅 또는 다른 증착법을 사용하여 기판 표면 상에 증착될 수 있다. 다른 예에서, 기판 표면은 플라즈마 애싱(plasma ashing)에 노출되어, 폴리머 하이드로겔(40, 40')에 부착할 수 있는 표면 활성화제(들)(예를 들어, -OH 기)를 생성할 수 있다.
폴리머 하이드로겔(40, 40')의 화학적 성질에 따라, 적용된 혼합물은 경화 과정에 노출될 수 있다. 일례에서, 경화는 실온(예를 들어, 약 25℃) 내지 약 95℃ 범위의 온도에서 약 1 밀리초 내지 약 수일간의 범위의 시간 동안 일어날 수 있다.
이어서, 오목 영역(38, 38')의 표면 상의 폴리머 하이드로겔(40, 40')을 적어도 실질적으로 손상시키지 않고 온전하게 두면서, 오목 영역(38, 38')의 주변에 있는 틈새 영역(46, 46')으로부터 폴리머 하이드로겔(40, 40')을 제거하기 위해 폴리싱이 수행될 수 있다.
시퀀싱 표면(30, 30')은 또한 폴리머 하이드로겔(40, 40')에 부착된 증폭 프라이머(42, 42')를 포함한다.
그래프팅 과정은 오목 영역(38, 38')의 폴리머 하이드로겔(40, 40')에 증폭 프라이머(42, 42')를 그래프팅하기 위해 수행될 수 있다. 일례에서, 증폭 프라이머(42, 42')는 상기 프라이머(42, 42')의 5' 말단 또는 그 부근에서 단일점 공유 결합 또는 강한 비공유 상호작용에 의해 폴리머 하이드로겔(40, 40')에 고정화될 수 있다. 결합에 의해, i) 상기 프라이머(42, 42')의 어댑터 특이적 부분이 이의 관련된 시퀀싱 레디 핵산 단편에 자유롭게 어닐링할 수 있고, ii) 프라이머 신장(primer extension)을 위해 3' 하이드록실기가 자유롭게 남아있게 된다. 임의의 적절한 공유 결합 또는 강한 비공유 상호작용이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 말단 프라이머의 예에는 알킨 말단 프라이머(예를 들어, 폴리머 하이드로겔(40, 40')의 아지드 표면 부분에 부착할 수 있음), 아지드 말단 프라이머(예를 들어, 폴리머 하이드로겔(40, 40')의 알킨 표면 부분에 부착할 수 있음), 또는 클러스터링된 고상 지지체(13)와 관련하여 기재된 임의의 다른 말단 프라이머가 포함된다.
적절한 프라이머(42, 42')의 구체적인 예에는 P5 및 P7 프라이머가 포함된다. P5 및 P7 프라이머는 모두 폴리머 하이드로겔(40, 40') 각각에 그래프팅될 수 있다.
일례에서, 그래프팅은 증착(예를 들어, 일시적으로 접합된 덮개를 사용하여), 덩크 코팅, 스프레이 코팅, 퍼들 디스펜싱을 통한 유동, 또는 프라이머(들)(42, 42')를 폴리머 하이드로겔(40, 40')에 부착시킬 다른 적절한 방법에 의한 유동을 수반할 수 있다. 이들 예시적인 기술 각각은 프라이머(들)(42, 42'), 물, 완충액 및 촉매를 포함할 수 있는 프라이머 용액 또는 혼합물을 이용할 수 있다. 임의의 그래프팅 방법에 의해, 프라이머(42, 42')는 오목 영역(38, 38')의 폴리머 하이드로겔(40, 40')의 반응성 기와 반응하고 주변 기판(26A, 26A')에 대해 친화성을 갖지 않는다. 이와 같이, 프라이머(42, 42')는 폴리머 하이드로겔(40, 40')에 선택적으로 그래프팅된다.
도 2b에 나타낸 예에서, 화학적 포획 부위(44, 44')은 폴리머 하이드로겔(40, 40')의 적어도 일부에 부착되거나 그 위에 적용되는 화학적 포획제를 포함한다. 본 명세서에 개시된 화학적 포획제의 임의의 예가 사용될 수 있다. 예를 들어, 화학적 포획제는 결합쌍의 구성원일 수 있으며, 여기서 결합쌍의 다른 구성원은 고상 지지체(12, 12')에 부착된다.
일부 예에서, 폴리머 하이드로겔(40, 40')의 유리 작용기(예를 들어, 프라이머(42, 42')에 부착되지 않은 것들)는 몇몇 화학적 포획 부위(44, 44')가 폴리머 하이드로겔(40, 40')의 표면에 걸쳐 형성되도록 화학적 포획제로 작용화될 수 있다. 일례에서, 알킨-PEG-비오틴 링커 또는 알킨-비오틴 유리 아지드기는 클릭 화학을 사용하여 폴리머 하이드로겔(40, 40') 상의 유리 아지드에 공유 결합될 수 있다. 다른 예에서, 증폭 프라이머(42, 42')에 상보적인 프라이머는 화학적 포획제가 부착될 수 있다. 이러한 상보적 프라이머는 화학적 포획 부위(44, 44')를 형성하기 위해 증폭 프라이머(42, 42') 중 일부에 하이브리디제이션될 수 있다.
다른 예에서, 화학적 포획제는 마이크로접촉 프린팅, 에어로졸 프린팅 등을 사용하여 원하는 위치에 증착되어 화학적 포획 부위(들)(44, 44')를 형성할 수 있다. 또 다른 예에서, 마스크(예를 들어, 포토레지스트)는 화학적 포획제가 증착될 공간/위치를 한정하는데 사용될 수 있며, 따라서 화학적 포획 부위(44, 44')가 형성될 것이다. 이어서, 화학적 포획제가 증착될 수 있고, 마스크는 제거될 수 있다(예컨대, 리프트 오프, 용해 또는 다른 적절한 기술을 통해). 이러한 예에서, 화학적 포획 부위(44, 44')는 화학적 포획제의 단층 또는 박층을 포함할 수 있다.
도 2c는 패턴화된 대향 시퀀싱 표면(32, 32')을 포함하는 플로우 셀(24)의 단면도를 예시한다. 일례에서, 이들 표면(32, 32') 각각은 기판(26B, 26B') 상에 준비될 수 있고, 이어서 기판(26B, 26B')은 플로우 셀(24)의 일례를 형성하도록(예를 들어, 물질(50)을 통해) 서로 부착될 수 있다.
도 2c에 도시된 예에서, 플로우 셀(24)은 다층 기판(26B, 26B')을 포함하며, 이들 각각은 지지체(34, 34') 및 지지체(34, 34') 상에 위치된 패턴화된 재료(36, 36')를 포함한다. 패턴화된 재료(36, 36')는 틈새 영역(46, 46')에 의해 분리된 함몰부(48, 48')를 형성한다.
도 2c에 도시된 예에서, 패턴화된 재료(36, 36')는 각각 지지체(34, 34') 상에 위치된다. 함몰부(48, 48') 및 틈새 영역(46, 46')을 형성하도록 선택적으로 증착되거나, 증착 및 패턴화될 수 있는 임의의 재료가 패턴화된 재료(36, 36')에 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
일례로서, 무기 산화물이 증착, 에어로졸 프린팅 또는 잉크젯 프린팅을 통해 지지체(34, 34')에 선택적으로 적용될 수 있다. 적절한 무기 산화물의 예에는 산화탄탈룸(예를 들어, Ta2O5), 산화알루미늄(예를 들어, Al2O3), 산화규소(예를 들어, SiO2), 산화하프늄(예를 들어, HfO2) 등이 포함된다.
다른 예로서, 수지가 지지체(34, 34')에 적용되고, 이어서 패턴화될 수 있다. 적절한 증착 기술은 화학 증착, 딥 코팅, 덩크 코팅, 스핀 코팅, 스프레이 코팅, 퍼들 디스펜싱, 초음파 스프레이 코팅, 닥터 블레이드 코팅, 에어로졸 프린팅, 스크린 프린팅, 마이크로접촉 프린팅 등을 포함한다. 적절한 패터닝 기술은 포토리소그래피, 나노임프린트 리소그래피(NIL), 스탬핑 기술, 엠보싱 기술, 성형 기술, 마이크로에칭 기술, 프린팅 기술 등을 포함한다. 적절한 수지의 일부 예에는 다면체 올리고머 실세스퀴옥산(POSS)계 수지, 비POSS 에폭시 수지, 폴리(에틸렌 글리콜)수지, 폴리에테르 수지(예를 들어, 개환 에폭시), 아크릴 수지, 아크릴레이트 수지, 메타크릴레이트 수지, 무정형 불소중합체 수지(예를 들어, 벨렉스(Bellex) 사제의 사이탑(CYTOP)®) 및 이들의 조합이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "다면체 올리고머 실세스퀴옥산"(하이브리드 플라스틱스(Hybrid Plastics)에서 POSS®로 시판 중임)은 실리카(SiO2)와 실리콘(R2SiO) 사이의 하이브리드 중간체(예를 들어, RSiO1.5)인 화학 조성물을 말한다. 다면체 올리고머 실세스퀴옥산의 예는 전체적으로 참고로 포함된 문헌[Kehagias et al., Microelectronic Engineering 86 (2009), pp. 776-778]에 기재된 것일 수 있다. 일례에서, 조성물은 화학식 [RSiO3/2]n을 갖는 유기규소 화합물이며, 여기서 R 기는 동일하거나 상이할 수 있다. 다면체 올리고머 실세스퀴옥산의 R 기의 예에는 에폭시, 아지드/아지도, 티올, 폴리(에틸렌 글리콜), 노르보르넨, 테트라진, 아크릴레이트 및/또는 메타크릴레이트, 또는 추가로, 예를 들어 알킬, 아릴, 알콕시 및/또는 할로알킬기가 포함된다. 본 명세서에 개시된 수지 조성물은 단량체 단위로서 하나 이상의 상이한 케이지 또는 코어 구조를 포함할 수 있다. 다면체 구조는
Figure pct00008
와 같은 T8 구조일 수 있으며,
Figure pct00009
로 나타낼 수 있다. 이러한 단량체 단위는 전형적으로 작용기 R1 내지 R8으로 된 8개의 아암을 갖는다.
단량체 단위는
Figure pct00010
와 같은 T10으로 지칭되는, 10개의 규소 원자 및 10개의 R 기를 갖는 케이지 구조를 가질 수 있거나,
Figure pct00011
와 같은 T12로 지칭되는, 12개의 규소 원자 및 12개의 R 기를 갖는 케이지 구조를 가질 수 있다. 다면체 올리고머 실세스퀴옥산계 재료는 대안적으로 T6, T14 또는 T16 케이지 구조를 포함할 수 있다. 평균 케이지 함량은 합성 동안 조정될 수 있고/있거나, 정제 방법에 의해 제어될 수 있고, 단량체 단위(들)의 케이지 크기의 분포는 본 명세서에 개시된 예에서 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 다면체 올리고머 실세스퀴옥산의 일부 예에서, R1 내지 R8 또는 R10 또는 R12 중 적어도 하나는 에폭시를 포함한다. R1 내지 R8 또는 R10 또는 R12는 동일할 수 있거나 동일하지 않을 수 있으며, 일부 예에서는 R1 내지 R8 또는 R10 또는 R12 중 적어도 하나는 에폭시를 포함하고, R1 내지 R8 또는 R10 또는 R12 중 적어도 또 다른 하나는 비에폭시 작용기이다. 비에폭시 작용기는 (a) 수지를 증폭 프라이머, 중합체 또는 중합제에 커플링하기 위한 핸들로서 역할을 하는, 에폭시기에 직교 반응성인(즉, 에폭시기와 상이한 조건 하에서 반응하는) 반응성 기일 수 있거나; (b) 수지의 기계적 또는 기능적 특성, 예를 들어 표면 에너지 조절을 조정하는 기일 수 있다. 일부 예에서, 비에폭시 작용기는 아지드/아지도, 티올, 폴리(에틸렌 글리콜), 노르보르넨, 테트라진, 아미노, 하이드록실, 알키닐, 케톤, 알데히드, 에스테르기, 알킬, 아릴, 알콕시 및 할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
도 2c에 도시된 바와 같이, 패턴화된 재료(36, 36')는 내부에 각각 형성된 함몰부(48, 48') 및 인접한 함몰부(48, 48')를 분리하는 틈새 영역(46, 46')을 포함한다. 규칙적인 패턴, 반복 패턴 및 비규칙적인 패턴을 포함하여, 함몰부(48, 48')의 많은 상이한 레이아웃이 예상될 수 있다. 일례에서, 함몰부(48, 48')는 최밀 충전(close packing) 및 밀도 개선을 위해 육각 격자에 배치된다. 다른 레이아웃은 예를 들어, 직선(직사각형) 레이아웃, 삼각형 레이아웃 등을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 행렬로 된 함몰부(48, 48')의 x-y 포맷일 수 있다. 일부 다른 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 함몰부(48, 48') 및/또는 틈새 영역(46, 46')의 반복 배열일 수 있다. 또 다른 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 함몰부(48, 48') 및/또는 틈새 영역(46, 46')의 랜덤 배열일 수 있다. 패턴은 반점, 줄무늬, 소용돌이, 선, 삼각형, 직사각형, 원, 원호, 체크, 격자 무늬, 대각선, 화살표, 정사각형 및/또는 크로스해치를 포함할 수 있다.
함몰부(48, 48')의 레이아웃 또는 패턴은 한정된 영역 내의 함몰부(48, 48')의 밀도(예를 들어, 함몰부(48, 48')의 수)에 대해 특징지어질 수 있다. 예를 들어, 함몰부(48, 48')는 약 200만개/㎟의 밀도로 존재할 수 있다. 밀도는 예를 들어, 약 100개/㎟, 약 1,000개/㎟, 약 10만개/㎟, 약 100만개/㎟, 약 200만개/㎟, 약 500만개/㎟, 약 1000만개/㎟, 약 5000만개/㎟ 또는 그 이상, 또는 그 이하를 포함하여, 다양한 밀도로 조정될 수 있다. 패턴화된 재료(36, 36')의 함몰부(48, 48')의 밀도는 상기 범위로부터 선택되는 하한값 중 하나와 상한값 중 하나 사이에 있을 수 있다는 것을 추가로 이해하여야 한다. 예로서, 고밀도 어레이는 약 100 nm 미만으로 분리된 함몰부(48, 48')를 갖는 것을 특징으로 할 수 있고, 중밀도 어레이는 약 400 nm 내지 약 1 μm로 분리된 함몰부(48, 48')를 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 저밀도 어레이는 약 1 μm보다 크게 분리된 함몰부(48, 48')를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 예시적인 밀도가 제공되었지만, 임의의 적절한 밀도가 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 함몰부(48, 48')의 밀도는 부분적으로 함몰부(48, 48')의 깊이에 좌우될 수 있다. 일부 경우에, 함몰부(48, 48')들 사이의 간격이 본 명세서에 열거된 예보다 훨씬 더 큰 것이 바람직할 수 있다.
함몰부(48, 48')의 레이아웃 또는 패턴은 또한 또는 대안적으로 평균 피치, 또는 함몰부(48, 48')의 중심으로부터 인접한 함몰부(48, 48')의 중심까지의 간격(중심간 간격), 또는 하나의 함몰부(48, 48')의 좌측 에지로부터 인접한 함몰부(48, 48')의 우측 에지까지의 간격(에지간 간격)에 관하여 특징지어질 수 있다. 패턴은 규칙적일 수 있어서, 평균 피치 주위의 변동 계수가 작거나, 패턴은 비규칙적일 수 있으며, 이 경우에 변동 계수는 비교적 클 수 있다. 어느 경우에도, 평균 피치는 예를 들어, 약 50 nm, 약 0.1 μm, 약 0.5 μm, 약 1 μm, 약 5 μm, 약 10 μm, 약 100 μm 또는 그 이상, 또는 그 이하일 수 있다. 특정 패턴의 함몰부(48, 48')의 평균 피치는 상기 범위로부터 선택되는 하한값 중 하나와 상한값 중 하나 사이에 있을 수 있다. 일례에서, 함몰부(48, 48')는 약 1.5 μm의 피치(중심간 간격)를 갖는다. 예시적인 평균 피치 값이 제공되었지만, 다른 평균 피치 값이 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
각각의 함몰부(48, 48')의 크기는 이의 체적, 개구 면적, 깊이 및/또는 직경으로 특징지어질 수 있다.
각각의 함몰부(48, 48')는 플로우 셀(24)에 도입되는 적어도 일부의 유체를 제한할 수 있는 임의의 체적을 가질 수 있다. 최소 또는 최대 체적은 예를 들어 플로우 셀(24)의 하류측 사용을 위해 예상되는 처리량(예를 들어, 다중성), 분해능, 뉴클레오타이드, 또는 분석물 반응성을 수용하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 체적은 적어도 약 1×10―3 μm3, 적어도 약 1×10―2 μm3, 적어도 약 0.1 μm3, 적어도 약 1 μm3, 적어도 약 10 μm3, 적어도 약 100 μm3 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 체적은 기껏해야 약 1×104 μm3, 기껏해야 약 1×103 μm3, 기껏해야 약 100 μm3, 기껏해야 약 10 μm3, 기껏해야 약 1 μm3, 기껏해야 약 0.1 μm3 또는 그 이하일 수 있다.
각각의 함몰부 개구가 차지하는 면적은 체적에 대해 전술된 것과 유사한 기준에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 각각의 함몰부 개구 면적은 적어도 약 1×10-3 μm2, 적어도 1×10-2 μm2, 적어도 약 0.1 μm2, 적어도 약 1 μm2, 적어도 약 10 μm2, 적어도 약 100 μm2 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 면적은 기껏해야 약 1×103 μm2, 기껏해야 약 100 μm2, 기껏해야 약 10 μm2, 기껏해야 약 1 μm2, 기껏해야 약 0.1 μm2, 기껏해야 약 1×10―2 μm2 또는 그 이하일 수 있다. 각각의 함몰부 개구가 차지하는 면적은 상기에 명시된 값보다 크거나, 그보다 작거나, 그 사이에 있을 수 있다.
각각의 함몰부(48, 48')의 깊이는 폴리머 하이드로겔(40, 40')의 일부를 수용하기에 충분히 클 수 있다. 일례에서, 깊이는 적어도 약 0.1 μm, 적어도 약 0.5 μm, 적어도 약 1 μm, 적어도 약 10 μm, 적어도 약 100 μm 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 깊이는 기껏해야 약 1 × 103 μm, 기껏해야 약 100 μm, 기껏해야 약 10 μm 또는 그 이하일 수 있다. 일부 예에서, 깊이는 약 0.4 μm이다. 각각의 함몰부(48, 48')의 깊이가 상기에 명시된 값보다 크거나, 그보다 작거나, 그 사이일 수 있다.
일부 경우에, 각각의 함몰부(48, 48')의 직경 또는 길이 및 폭은 적어도 약 50 μm, 적어도 약 0.1 μm, 적어도 약 0.5 μm, 적어도 약 1 μm, 적어도 약 10 μm, 적어도 약 100 μm 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 직경 또는 길이 및 폭은 기껏해야 약 1 × 103 μm, 기껏해야 약 100 μm, 기껏해야 약 10 μm, 기껏해야 약 1 μm, 기껏해야 약 0.5 μm, 기껏해야 약 0.1 μm 또는 그 이하(예를 들어, 약 50 nm)일 수 있다. 일부 예에서, 직경 또는 길이 및 폭은 약 0.4 μm이다. 각각의 함몰부(48, 48')의 직경 또는 길이 및 폭은 상기에 명시된 값보다 크거나, 그보다 작거나, 그 사이에 있을 수 있다.
이러한 예에서, 시퀀싱 표면(32, 32')의 구성요소들 중 적어도 일부가 함몰부(48, 48')에 도입될 수 있다. 시퀀싱 표면(32, 32')의 구성요소에 의해 점유되지 않은 함몰부(48, 48') 내의 임의의 공간이 플로우 채널(28)의 일부인 것으로 간주될 수 있음을 이해하여야 한다.
도 2c에 도시된 예에서, 폴리머 하이드로겔(40, 40')은 각각의 함몰부(48, 48') 내에 위치된다. 폴리머 하이드로겔(40, 40')은 도 2b를 참조하여 설명된 바와 같이 적용될 수 있으며, 따라서 폴리머 하이드로겔(40, 40')은 함몰부(48, 48')에 존재하고 주변 틈새 영역(46, 46')에는 존재하지 않는다.
도 2c에 도시된 예에서, 프라이머(42, 42')는 각각의 함몰부(48, 48') 내에서 폴리머 하이드로겔(40, 40')에 그래프팅될 수 있다. 프라이머(42, 42')는 도 2b를 참조하여 설명된 바와 같이 적용될 수 있으며, 따라서 폴리머 하이드로겔(40, 40')에 그래프트되고 주변 틈새 영역(46, 46')에는 그래프트되지 않을 것이다.
도 2c에 도시된 예에서, 화학적 포획 부위(44, 44')는 틈새 영역(46, 46')중 적어도 일부 상에 적용되는 화학적 포획제를 포함한다. 예를 들어, 화학적 포획제는 마이크로접촉 프린팅, 에어로졸 프린팅 등을 사용하여 틈새 영역(46, 46') 중 적어도 일부에 증착되어 화학적 포획 부위(들)(44, 44')를 형성할 수 있다. 또 다른 예에서, 마스크(예를 들어, 포토레지스트)는 화학적 포획제가 증착될 공간/위치를 한정하는데 사용될 수 있며, 따라서 화학적 포획 부위(44, 44')가 형성될 것이다. 이어서, 화학적 포획제가 증착될 수 있고, 마스크는 (예컨대, 리프트 오프, 용해 또는 다른 적절한 기술을 통해) 제거될 수 있다.
다른 예에서, 화학적 포획 부위(44, 44')는 폴리머 하이드로겔(40, 40')의 유리 작용기(예를 들어, 프라이머(42, 42')에 부착되지 않은 것)에 부착된 화학적 포획제를 포함한다. 또 다른 예에서, 화학적 포획 부위(44, 44')는 증폭 프라이머(42, 42') 중 일부에 하이브리디제이션되는 프라이머에 부착된 화학적 포획제를 포함한다. 이러한 예에서, 화학적 포획 부위(44, 44')는 틈새 영역(46, 46')이 아니라 함몰부(48, 48')에 존재할 것이다.
본 명세서에 개시된 화학적 포획제의 임의의 예가 도 2c에 도시된 예에서 사용될 수 있다.
도 2d는 패턴화된 대향 시퀀싱 표면(31, 31')을 포함하는 플로우 셀(24)의 단면도를 예시한다. 일례에서, 이들 표면(31, 31') 각각은 기판(26B, 26B') 상에 준비될 수 있고, 이어서 기판(26B, 26B')은 플로우 셀(24)의 일례를 형성하도록 (예를 들어, 물질(50)을 통해) 서로 부착될 수 있다. 각각의 다층 기판(26B, 26B')은 지지체(34, 34') 및 지지체(34, 34') 상에 위치된 패턴화된 재료(36, 36')를 포함한다. 패턴화된 재료(36, 36')는 틈새 영역(46, 46')에 의해 분리된 함몰부(48, 48')를 형성한다.
대향 시퀀싱 표면(31, 31')은 폴리머 하이드로겔(40, 40') 또는 프라이머(42, 42')를 포함하지 않는다. 오히려, 대향 시퀀싱 표면(31, 31')은 각각의 함몰부(48, 48')에 위치된 화학적 포획 부위(44, 44')를 포함한다. 각각의 화학적 포획 부위(44, 44')는 각각의 클러스터링된 고상 지지체(13)를 고정화할 수 있다. 클러스터링된 고상 지지체의 각각은 주형 가닥(64)의 각각의 클러스터를 각각의 함몰부(48, 48')에 도입한다.
도 2d의 화학적 포획 부위(44, 44')는 본 명세서에 기재된 화학적 포획제의 임의의 예를 포함한다. 이러한 예에서, 화학적 포획제는 마이크로접촉 프린팅, 에어로졸 프린팅 등을 사용하여 함몰부(48, 48')에 증착되어 화학적 포획 부위(들)(44, 44')를 형성할 수 있다. 또 다른 예에서, 마스크(예를 들어, 포토레지스트)가 틈새 영역(46, 46')을 차단하는 데 사용될 수 있으므로, 화학적 포획제가 틈새 영역(46, 46')이 아니라 함몰부(48, 48') 내에 증착된다. 이러한 예에서, 이어서 화학적 포획제가 증착될 수 있고, 마스크는 (예컨대, 리프트 오프, 용해 또는 다른 적절한 기술을 통해) 제거될 수 있다.
도시되지 않았지만, 플로우 셀(24)의 다른 예는 도 2b의 비패턴화된 표면과 도 2d의 포획 부위(44, 44')가 결합되어 있다. 이러한 예에서, 오목 영역(38, 38')(도 2b에 도시된 것과 유사함)은 폴리머 하이드로겔(40, 40') 및 프라이머(42, 42') 보다는 화학적 포획제로 코팅될 수 있다. 이와 같이, 화학적 포획 부위(44, 44')는 오목 영역(38, 38')의 전체 채널(28)을 따라 형성될 수 있다. 이러한 예에서, 각각의 화학적 포획 부위(44, 44')는 클러스터링된 고상 지지체(13)를 대향 시퀀싱 표면을 따라 랜덤 분포로 고정시킬 수 있다.
도 2b 내지 도 2d에 도시된 바와 같이, 기판(26A, 26A' 또는 26B, 26B')은 서로 부착되고, 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31')은 서로 대향하여, 이들 사이에 플로우 채널(28)이 형성된다.
기판(26A, 26A' 또는 26B, 26B')은 틈새 영역(46, 46')의 일부 또는 전부에서 서로 접합될 수 있다. 기판(26A, 26A' 또는 26B, 26B') 사이에 형성되는 접합은 화학 접합, 또는 기계적 접합(예를 들어, 패스너 등을 사용하여)일 수 있다.
레이저 접합, 확산 접합, 양극 접합, 공정 접합(eutectic bonding), 플라즈마 활성화 접합, 유리 프릿 접합 또는 당업계에 공지된 다른 방법과 같은 임의의 적절한 기술이 기판(26A, 26A' 또는 26B, 26B')을 함께 접합시키는 데 사용될 수 있다. 일례에서, 스페이서 층(예컨대, 물질(50))이 기판(26A, 26A' 또는 26B, 26B')을 접합하는 데 사용될 수 있다. 스페이서 층은 기판(26A, 26A' 또는 26B, 26B')의 적어도 일부를 함께 밀봉할 임의의 물질(50)일 수 있다. 일부 예에서, 스페이서 층은 접합을 돕는 방사선 흡수 물질일 수 있다.
복합 유체를 이용한 방법 및 키트
밀도가 상이한 유체들의 조합을 이용하는 방법의 예가 도 3a 및 도 3b에 도시되어 있다.
본 방법은 일반적으로 내부에 표적 물질(11)의 제1 부분을 포함하는 제1 유체(52)(도 3a)를 플로우 셀(24)에 도입하여, 표적 물질(11)의 적어도 일부가 2개의 대향 시퀀싱 표면(30, 32 또는 30', 32' 또는 31, 31') 중 하나의 표면(30 또는 30', 32 또는 32', 또는 31 또는 31')의 포획 부위(44, 44')에 의해 고정화되는 단계; 플로우 셀(24)로부터 제1 유체 및 임의의 비고정화 표적 물질을 제거하는 단계; 및 내부에 표적 물질(11)의 제2 부분을 포함하는 제2 유체(54)(도 3b)를 플로우 셀(24)에 도입하여, 표적 물질(11)의 적어도 일부가 2개의 대향 시퀀싱 표면(30, 32 또는 30', 32' 또는 31, 31') 중 다른 하나의 표면(30 또는 30', 32 또는 32', 또는 31 또는 31')의 포획 부위(44, 44')에 의해 고정화되는 단계를 포함하며; 제1 유체(52)는 표적 물질(11)의 밀도보다 작은 밀도를 갖고, 제2 유체(54)는 표적 물질(11)의 밀도보다 큰 밀도를 갖거나; 제2 유체(54)는 표적 물질(11)의 밀도보다 작은 밀도를 갖고, 제1 유체(52)는 표적 물질(11)의 밀도보다 큰 밀도를 갖는 플로우 셀(24)의 2개의 대향 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31') 각각에 표적 물질(11)(예컨대, 복합체(10A, 10B), 클러스터링된 고상 지지체(13))을 고정화하는 것을 포함한다.
도 3a 및 도 3b에 도시된 방법을 수행하기 전에, 표적 물질(11)이 준비되거나 얻어질 수 있다.
일례에서, 복합체(10A 또는 10B)는 핵산 샘플 및 내부에 다수의 고상 지지체(12, 12')를 포함하는 라이브러리 제조 유체를 사용하여 제조될 수 있다. 일부 예에서, 라이브러리 제조 유체 내의 각각의 고상 지지체(12, 12')는 예를 들어, 도 1a를 참조하여 기술된 바와 같이, 어댑터(예를 들어, 어댑터(18)) 및 이에 부착된 트랜스포좀 복합체를 가질 수 있다. 태그멘테이션 및 라이브러리 제조를 도 1a에 기재된 바와 같이 수행하여 복합체(10A)를 형성할 수 있다. 핵산 샘플, 고상 지지체(12, 12'), 부분 Y-어댑터 및 트랜스포사제 효소는 복합체(10A)를 형성하는 것이 바람직할 때까지 별도의 유체에 포함될 수 있다. 다른 예에서, 라이브러리 제조 유체 내의 각각의 고상 지지체(12, 12')에는 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드가 부착될 수 있다. 일부 예에서, PCR 프리 뉴클레오타이드 라이브러리 제조는 고상 지지체(12, 12')와 별도로 일어날 수 있고, 이어서 제조된 라이브러리 단편은 도 1b를 참조하여 기술된 바와 같이, 고상 지지체(12, 12')의 표면에서 올리고뉴클레오타이드에 하이브리디제이션될 수 있다. 단편이 고상 지지체(12, 12')의 올리고에 하이브리디제이션되기 전에 단일 가닥 단편으로 변성되는 한, 라이브러리 제조의 다른 예가 사용될 수 있다(예를 들어, PCR을 포함함).
다른 예에서, 클러스터링된 고상 지지체(13)는 프라이머(42, 42')로 작용화된 다수의 고상 지지체(12, 12')의 존재 하에서 라이브러리 단편을 증폭시킴으로써 제조될 수 있다.
표적 물질(11)(예를 들어, 복합체(10A 또는 10B), 또는 시퀀싱 레디 단편(14, 14')이 부착된 임의의 다른 고상 지지체(12, 12') 또는 클러스터링된 고상 지지체(13))은 제1 및 제2 부분으로 분할될 수 있다. 표적 물질(11)의 제1 부분은 제1 유체(52)에 혼입될 수 있고, 표적 물질(11)의 제2 부분은 제2 유체(54)에 도입될 수 있다.
제1 및 제2 유체(52, 54)는 상이한 밀도를 갖는다. 일례에서, 제1 유체(52)는 표적 물질(11)의 밀도보다 작은 밀도를 갖고, 제2 유체(54)는 표적 물질(11)의 밀도보다 큰 밀도를 갖는다. 하나의 구체적인 예에서, 제1 유체(52)는 복합체(10A 또는 10B) 또는 클러스터링된 고상 지지체(13)의 고상 지지체(12, 12')의 밀도보다 작은 밀도를 갖고, 제2 유체(54)는 복합체(10A 또는 10B) 또는 클러스터링된 고상 지지체(13)의 고상 지지체(12, 12')의 밀도보다 큰 밀도를 갖는다. 다른 예에서, 제2 유체(54)는 표적 물질(11)의 밀도보다 작은 밀도를 갖고, 제1 유체(52)는 표적 물질(11)의 밀도보다 큰 밀도를 갖는다. 다른 구체적인 예에서, 제2 유체(54)는 복합체(10A 또는 10B) 또는 클러스터링된 고상 지지체(13)의 고상 지지체(12, 12')의 밀도보다 작은 밀도를 갖고, 제1 유체(52)는 복합체(10A 또는 10B) 또는 클러스터링된 고상 지지체(13)의 고상 지지체(12, 12')의 밀도보다 큰 밀도를 갖는다. 이와 같이, 각각의 유체(52, 54)의 밀도는 사용되는 표적 물질(11)에 의존한다. 일부 예에서, 복합체(10A 또는 10B) 또는 클러스터링된 고상 지지체(13)의 밀도는 복합체(10A 또는 10B) 또는 클러스터링된 고상 지지체(13)에 사용되는 고상 지지체(12, 12')의 밀도와 거의 동일하며, 따라서 제공된 구체적인 예에서, 각각의 유체(52, 54)의 밀도는 표적 물질(11)에 사용되는 고상 지지체(12, 12')에 의존한다.
유체(52, 54)의 밀도는 플로우 셀(24)에 도입되는 표적 물질(11)(예를 들어, 복합체(10A, 10B) 또는 클러스터링된 고상 지지체(13))의 포획 온도에서 측정될 수 있다. 일례에서, 포획 온도는 약 18℃ 내지 약 40℃의 범위이다.
일례에서, 포획 온도에서의 유체(52 또는 54) 중 하나의 밀도는 포획 온도에서의 표적 물질(11)(예를 들어, 복합체(10A 또는 10B) 또는 클러스터링된 고상 지지체(13)의 고상 지지체(12, 12'))의 밀도보다 적어도 0.1 g/㎤ 더 낮고, 포획 온도에서의 유체(54 또는 52) 중 다른 하나의 밀도는 포획 온도에서의 표적 물질(11)(예를 들어, 복합체(10A 또는 10B) 또는 클러스터링된 고상 지지체(13)의 고상 지지체(12, 12'))의 밀도보다 적어도 0.1 g/㎤ 더 크다. 하나의 구체적인 예에서, 표적 물질(예를 들어, 고상 지지체(12, 12'))의 밀도가 X g/㎤인 경우, 포획 온도에서의 유체(52 또는 54) 중 하나의 밀도는 X g/㎤ - 0.1 g/㎤이고, 포획 온도에서의 유체(54 또는 52) 중 다른 하나의 밀도는 X g/㎤ + 0.1 g/㎤이다.
각각의 밀도를 갖는 것에 더하여, 유체(52, 54)는 또한 표적 물질(11)과 상용성이어야 한다. 복합체(10A, 10B)가 사용되는 경우, 유체(52, 54)는 단편(14, 14', 14") 및 프라이머(42, 42')가 유해한 영향을 받지 않도록, 복합체(10A, 10B) 및 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31')과 상용성이어야 한다. 클러스터링된 고상 지지체(13)가 사용되는 경우, 유체(52, 54)는 주형 가닥(64)이 유해한 영향을 받지 않도록 클러스터링된 고상 지지체(13)와 상용성이어야 한다.
저밀도 유체(52 또는 54)는 임의의 완충 수용액(예를 들어, 약산 및 이의 염 중 하나(짝염기) 또는 약염기 및 이의 염 중 하나(짝산))일 수 있다. 완충 수용액 중의 염 농도는 저밀도 유체(52 또는 54)의 밀도가 표적 물질(11)의 밀도(예를 들어, 복합체(10A, 10B) 또는 클러스터링된 고상 지지체(13)의 고상 지지체(12, 12')의 밀도)보다 작도록 조정될 수 있다. 표적 물질(11)과 저밀도 유체(52 또는 54) 사이의 밀도차가 크면 클수록, 저밀도 유체(52 또는 54) 중의 표적 물질(11)(예를 들어, 복합체(10A, 10B) 또는 클러스터링된 고상 지지체(13))의 침강 시간이 더 빨라진다. 예로서, 저밀도 유체(52 또는 54)는 트리스-HCl 완충액 또는 0.5x 시트르산나트륨 완충 식염수(SSC)일 수 있다. 일례에서, 저밀도 유체(52 또는 54)는 밀도가 약 1 g/㎤인 완충 수용액이다. 이러한 저밀도 유체(52 또는 54)는 밀도가 약 1.18 g/㎤인 표적 물질(11)과 함께 사용하기에 특히 적합할 수 있다.
고밀도 유체(54 또는 52)는 염 수용액일 수 있다. 선택된 염은 유체(52 또는 54)를 "중질"로 만들어야 하고, 또한 표적 물질에 유해한 영향을 주지 않아야 한다. 복합체(10A, 10B)가 사용되는 경우, 염은 복합체(10A, 10B) 또는 프라이머(42, 42')에 유해한 영향을 주지 않아야 한다. 클러스터링된 고상 지지체(13)가 사용되는 경우, 염은 주형 가닥(64)에 유해한 영향을 주지 않아야 한다. 완충 수용액 중의 염 농도는 고밀도 유체(54 또는 52)의 밀도가 표적 물질(11)의 밀도보다 크도록 조정될 수 있다. 고밀도 유체(54 또는 52)의 예는 폴리텅스텐산나트륨 용액 및 염화나트륨 용액을 포함한다. 일례에서, 고밀도 유체(54 또는 52)는 밀도가 약 2 g/㎤ 내지 약 3 g/㎤ 범위인 폴리텅스텐산나트륨 용액이다. 이러한 고밀도 유체(54 또는 52)는 밀도가 약 1.18 g/㎤인 표적 물질(11)과 함께 사용하기에 특히 적합할 수 있다. 이러한 예에서, 폴리텅스텐산나트륨 용액은 물 1 밀리리터당 약 1 그램의 폴리텅스텐산나트륨 내지 물 1 밀리리터당 약 2.52 그램의 폴리텅스텐산나트륨의 범위의 농도를 갖는다. 다른 예에서, 25% (w/v) 염화나트륨 용액은 밀도가 약 1.2 g/㎤이다.
일례에서, 표적 물질의 밀도보다 작은 밀도를 갖는 제1 또는 제2 유체(52 또는 54)는 완충 수용액이고, 표적 물질의 밀도보다 큰 밀도를 갖는 제2 또는 제1 유체(54 또는 52)는 폴리텅스텐산나트륨 용액 또는 염화나트륨 용액이다. 다른 예에서, 표적 물질의 밀도보다 작은 제1 또는 제2 유체(52 또는 54)의 밀도는 포획 온도에서 약 1 g/㎤이고, 표적 물질의 밀도보다 큰 제2 또는 제1 유체(54 또는 52)의 밀도는 포획 온도에서 약 2 g/㎤이다.
도 3a에 도시된 바와 같이, 본 방법의 일례는 표적 물질(11)(예컨대, 도 3a의 복합체(10A))의 일부를 포함하는 제1 유체(52)를 플로우 셀(24)에 도입하는 것을 포함한다. 이러한 예에서, 제1 유체(52)는 복합체(10A)의 고상 지지체(12, 12')의 밀도보다 낮은 밀도를 가지며, 따라서 복합체(10A)는 저부 시퀀싱 표면(30')으로 이동하거나 또는 이에 가라앉는다. 포획 부위(44')(도 3a에 도시되지 않음)는 복합체(10A)의 적어도 일부를 저부 시퀀싱 표면(30')에 고정화시킨다.
제1 유체(52) 중의 일부 복합체(10A)(또는 다른 표적 물질(11))는 침강되지 않을 수 있고, 이들 복합체(10A)(또는 다른 표적 물질)는 추가의 처리 전에 플로우 셀(24)로부터 제거될 것임을 이해해야 한다. 플로우 셀(24)로부터 제1 유체(52) 및 임의의 비고정화 표적 물질(예컨대, 복합체(10A))을 제거하기 전에 소정 시간이 경과하도록 할 수 있다. 일례에서, 소정 시간은 고정화 복합체(10A) 또는 다른 표적 물질(11)의 바람직한 수를 얻기 위해 약 5분 내지 약 30분의 범위일 수 있다. 더 긴 인큐베이션 시간이 또한 사용될 수 있다.
이러한 예시적인 방법은 이어서 플로우 셀(24)로부터 제1 유체(52) 및 비고정화 표적 물질(11)(예를 들어, 복합체(10A))을 세척하는 것을 포함한다. 세척은 세척 유체를 플로우 셀(24)에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 유동에 의해, 침강되지 않고 시퀀싱 표면(30')에 고정화되지 않은 임의의 복합체(10A)(또는 다른 표적 물질(11))를 플로우 셀(24)의 출구 포트를 통해 밀어낼 수 있다. 복합체(10A)(또는 다른 표적 물질(11))와 시퀀싱 표면(30')의 포획 부위(44') 사이의 고정화 메커니즘(예를 들어, 결합쌍, 하이브리디제이션, 공유 결합 등)은 임의의 침강되고 고정화된 복합체(10A)(또는 다른 고정화 표적 물질(11))가 출구 유동의 일부가 되는 것을 방지할 수 있다. 또한, 2개의 대향 시퀀싱 표면(예컨대, 도 3a의 시퀀싱 표면(30')) 중 하나의 표면 상에 고정화된 표적 물질(11)(예컨대, 도 3a의 복합체(10A))은 제2 유체(54)가 도입될 때 그 시퀀싱 표면 상에 고정화된 채로 남아 있다.
도 3b에 도시된 바와 같이, 본 방법의 이러한 예는 표적 물질(11)(예를 들어, 복합체(10A)) 중 일부 다른 것을 포함하는 제2 유체(54)를 플로우 셀(24)에 도입하는 것을 포함한다. 이러한 예에서, 제2 유체(54)는 복합체(10A)(또는 다른 표적 물질(11))의 고상 지지체(12, 12')의 밀도보다 더 높은 밀도를 가지며, 따라서 복합체(10A)는 상부 시퀀싱 표면(30)으로 이동한다. 포획 부위(44')(도 3b에 도시되지 않음)는 복합체(10A)의 적어도 일부를 시퀀싱 표면(30)에 고정화시킨다.
시딩, 증폭 및 시퀀싱 또는 시퀀싱(후술되는 바와 같음)을 수행하기 전에, 이러한 예시적인 방법은 플로우 셀(24)으로부터 제2 유체(54) 및 비고정화 표적 물질(11)을 제거하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이와 같이, 이러한 예시적인 방법은 이어서, 플로우 셀(24)로부터 제2 유체(54) 및 비포획된 표적 물질(11)(예를 들어, 비고정화 복합체(10A))을 세척하는 것을 포함할 수 있다. 세척은 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 유동에 의해, 상부 시퀀싱 표면(30)에 고정화되지 않은 임의의 복합체(10A)(또는 다른 표적 물질(11))를 플로우 셀(24)의 출구 포트를 통해 밀어낼 수 있다. 복합체(10A)(또는 다른 표적 물질(11))와 시퀀싱 표면(30,30')의 각각의 포획 부위(44, 44') 사이의 고정화 메커니즘(예를 들어, 결합쌍, 하이브리디제이션, 공유 결합 등)은 임의의 고정화 복합체(10A)(또는 다른 고정화 표적 물질(11))가 출구 유동의 일부가 되는 것을 방지할 수 있음을 이해해야 한다.
복합체(10A 또는 10B)가 사용되는 경우, 이러한 세척 단계에는 라이브러리 단편 방출 및 증폭이 이어질 수 있다(예를 들어, 그 예가 도 9a 내지 도 9c를 참조하여 기술됨). 클러스터링된 고상 지지체(13)가 사용되는 경우, 이러한 세척 단계에는 시퀀싱이 이어질 수 있다.
도 3a 및 도 3b에 도시된 예는 저밀도의 유체 및 이어서 고밀도의 유체의 도입을 예시하지만, 상부 시퀀싱 표면(30)에 표적 물질(11)을 고정화하기 위해 고밀도의 유체가 먼저 도입될 수 있고, 그 다음에 하부/저부 시퀀싱 표면(30')에 표적 물질(11)을 고정화하기 위해 저밀도 유체가 도입될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 이러한 방법은 패턴화된 표면(32, 32')을 갖는 것을 포함하여, 본 명세서에 개시된 플로우 셀(24)의 임의의 예로 수행될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 클러스터링된 고상 지지체(13)가 사용되는 경우, 도 2d를 참조하여 도시되고 기술된 것과 같은 증폭 프라이머(42, 42')가 없는 플로우 셀(24)이 사용될 수 있다.
도 3a 및 도 3b를 참조하여 설명된 방법을 수행하기 위한 키트는 표적 물질(11)을 내부에 포함하는 제조 유체; 표적 물질(11)의 밀도보다 작은 밀도를 갖는 제1 도입 유체(예를 들어, 유체(52 또는 54)); 및 표적 물질(11)의 밀도보다 큰 밀도를 갖는 제2 도입 유체(유체(54 또는 52))를 포함할 수 있다. 하나의 예시적인 키트에서, 제1 도입 유체는 완충 수용액이고, 제2 도입 유체는 폴리텅스텐산나트륨 용액 또는 염화나트륨 용액이다. 일례에서, 제2 도입 유체가 폴리텅스텐산나트륨 용액인 경우, 폴리텅스텐산나트륨 용액은 물 1 밀리리터당 약 1 그램의 폴리텅스텐산나트륨의 농도를 갖는다. 다른 예시적인 키트에서, 포획 온도에서의 제1 도입 유체의 밀도는 포획 온도에서의 표적 물질(11)의 밀도보다 적어도 0.1 g/㎤ 더 작고, 포획 온도에서의 제2 도입 유체의 밀도는 포획 온도에서의 표적 물질(11)의 밀도보다 적어도 0.1 g/㎤ 더 크다. 또 다른 예에서, 제1 도입 유체의 밀도는 포획 온도에서 약 1 g/㎤이고, 제2 도입 유체의 밀도는 포획 온도에서 약 2 g/㎤이다.
일부 예에서, 표적 물질(11)을 포함하는 제조 유체는 고상 지지체(12, 12')를 포함하며, 키트는 또한 다른 라이브러리 제조 구성요소, 예컨대 핵산 샘플, 부분 Y-어댑터, 트랜스포사제 효소 등을 포함할 수 있으며; 이들 각각은 복합체(10A, 10B), 클러스터링된 고상 지지체(13) 등과 같은 표적 물질(11)을 형성하는 것이 바람직할 때까지 별도의 유체에 포함될 수 있다. 키트의 일부 예는 또한 플로우 셀(24)을 포함할 수 있다. 키트의 다른 예는 본 명세서에 개시된 표적 물질(11)의 임의의 예를 포함하는 제조 유체를 포함할 수 있다.
하나의 유체를 이용한 방법 및 키트
본 명세서에 개시된 방법의 다른 예는 표적 물질(11)의 고정화 동안 하나의 유체를 이용한다. 일부 방법은 하나의 표적 물질(11) 및 상이한 양식을 이용하여, 대향 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31')에 걸쳐 고정화를 달성한다. 다른 방법은 2개의 상이한 표적 물질(11)(각각, 서로 상이한 적어도 하나의 특성을 가짐) 및 동일하거나 상이한 양식을 이용하여, 대향 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31')에 걸쳐 고정화를 달성한다. 다양한 예들이 도 4a 및 도 4b 내지 도 8a 및 도 8b를 참조하여 본 명세서에 기술된다.
도 4a 및 도 4b 내지 도 8a 및 도 8b에 나타낸 임의의 방법을 수행하기 전에, 복합체(10A 또는 10B) 또는 클러스터링된 고상 지지체(13)는 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
복합체(10A 또는 10B)는 핵산 샘플 및 내부에 다수의 자성 고상 지지체(12')를 포함하는 라이브러리 제조 유체를 사용하여 제조될 수 있다. 일부 예에서, 라이브러리 제조 유체 내의 각각의 자성 고상 지지체(12')는 예를 들어, 도 1a를 참조하여 기술된 바와 같이, 어댑터(예를 들어, 어댑터(18)) 및 이에 부착된 트랜스포좀 복합체를 가질 수 있다. 태그멘테이션 및 라이브러리 제조를 도 1a에 기재된 바와 같이 수행하여 복합체(10A)를 형성할 수 있다. 핵산 샘플, 자성 고상 지지체(12'), 부분 Y-어댑터 및 트랜스포사제 효소는 복합체(10A)를 형성하는 것이 바람직할 때까지 별도의 유체에 포함될 수 있다. 다른 예에서, 라이브러리 제조 유체 내의 각각의 자성 고상 지지체(12')에는 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드가 부착될 수 있다. 일부 예에서, PCR 프리 뉴클레오타이드 라이브러리 제조는 자성 고상 지지체(12')와 별도로 일어날 수 있고, 이어서 제조된 라이브러리 단편은 도 1b를 참조하여 기술된 바와 같이, 자성 고상 지지체(12')의 표면에서 올리고뉴클레오타이드에 하이브리디제이션될 수 있다. 단편이 자성 고상 지지체(12')의 올리고에 하이브리디제이션되기 전에 단일 가닥 단편으로 변성되는 한, 라이브러리 제조의 다른 예가 사용될 수 있다(예를 들어, PCR을 포함함).
클러스터링된 고상 지지체(13)는 프라이머(42, 42')로 작용화된 다수의 고상 지지체(12, 12')의 존재 하에서 라이브러리 단편을 증폭시킴으로써 제조될 수 있다.
유체, 실질적으로 균일한 자기력, 및 자기 반응성 표적 물질, 예컨대 고상 지지체(12')를 이용하는 방법의 예가 도 4a 및 도 4b에 도시되어 있다. 본 방법은 일반적으로, 표적 물질(11)을 포함하고, 자성 고상 지지체(12')의 밀도와 거의 동일한 밀도를 갖는 유체(56)를 플로우 셀(24)에 도입하는 단계; 표적 물질(11)의 일부를 2개의 대향 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31') 중 하나의 표면(30 또는 30', 32 또는 32', 또는 31 또는 31')의 포획 부위(44 또는 44')(도 4a에 도시되지 않음)에 의해 고정화시키는 단계; 및 자기력을 2개의 대향 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31') 중 다른 하나의 표면(30' 또는 30, 32' 또는 32, 또는 31' 또는 31)에 인가하여, 표적 물질(11)의 다른 일부를 2개의 대향 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31') 중 다른 하나의 표면(30' 또는 30, 32' 또는 32, 또는 31' 또는 31)에 끌어당겨, 이들을 2개의 대향 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31') 중 다른 하나의 표면의 포획 부위(44 또는 44')(도 4b에 도시되지 않음)에 의해 고정화시키는 단계에 의해, 플로우 셀(24)의 2개의 대향 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32') 각각에 표적 물질(11)을 고정화하는 것을 포함한다. 복합체(10A, 10B)가 사용되는 경우 그리고 (후술되는 바와 같이) 시딩 및 증폭을 수행하기 전에, 이러한 예시적인 방법은 자기력의 인가를 중단하는 단계 및 플로우 셀(24)로부터 유체 및 비고정화 표적 물질을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이들 단계에는 라이브러리 단편 방출 및 증폭이 이어질 수 있다(예를 들어, 도 9a 내지 도 9c를 참조하여 기술된 바와 같이).
이에 부착된 표적 물질(11)(예컨대, 복합체(10A, 10B), 또는 시퀀싱 레디 단편(14, 14', 14")을 갖는 임의의 다른 자성 고상 지지체(12'), 또는 클러스터링된 고상 지지체(13))이 유체(56)에 혼입될 수 있다. 일례로서, 약 25,000개의 표적 물질(11)(예를 들어, 복합체(10A, 10B) 또는 클러스터링된 고상 지지체(13)) 내지 약 500,000개의 표적 물질(11)이 1 마이크로리터의 유체에 포함될 수 있다. 다른 예로서, 약 100,000개의 표적 물질(11) 내지 약 500,000개의 표적 물질(11)이 1 마이크로리터의 유체에 포함될 수 있다. 다른 농도가 플로우 셀(24)의 크기에 따라 사용될 수 있다.
유체(56)의 밀도는 플로우 셀(24)에 도입되는 표적 물질(11)의 포획 온도에서 측정될 수 있다. 일례에서, 포획 온도는 약 18℃ 내지 약 40℃의 범위이다.
유체(56)는 표적 물질(11)의 자성 고상 지지체(12')의 밀도와 적어도 거의 동일한 밀도를 갖도록 선택된다. 이러한 예에서,"적어도 거의 동일한"은 유체(56)의 밀도가 자성 고상 지지체(12')의 밀도의 0.08 g/㎤ 이내임을 의미한다. 일부 경우에, 유체(56) 및 자성 고상 지지체(12')의 밀도는 동일하다. 자성 고상 지지체(12')와 적어도 거의 동일한 밀도를 가짐으로써, 유체(56)는 약한 부유제(mild floating agent)로서 기능한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "약한 부유제"는 표적 물질(11)(예를 들어, 복합체(10A, 10B), 클러스터링된 고상 지지체(13) 등)이 가라앉거나 침강되기 전에 적어도 일정 시간 동안 부유할 수 있는 유체를 말한다. 유체(56)에서, 표적 물질(11)의 일부는 가라앉기 시작하여 플로우 셀(24)의 하부/저부 시퀀싱 표면(30', 32', 31')에 고정화되는 반면, 다른 표적 물질(11)은 (적어도 일정 시간 동안) 떠 있는 상태로 유지된다.
유체(56)는 임의의 완충 수용액일 수 있다. 완충 수용액 중의 염 농도는 유체(56)의 밀도가 자성 고상 지지체(12')의 밀도와 적어도 거의 동일하도록 조정될 수 있다. 다시 말하면, 완충 수용액 중의 염 농도는 유체(56)의 밀도가 자성 고상 지지체(12')의 밀도의 +/-0.08 g/㎤ 이내에 있도록 조정될 수 있다. 예로서, 유체(56)는 트리스-HCl 완충액 또는 0.5x 시트르산나트륨 완충 식염수(SSC) 또는 약 750 mM NaCl을 함유하는 75 mM 시트르산나트륨 용액(pH=7)일 수 있다. 일례에서, 자성 고상 지지체(12') 및 유체(56) 각각의 밀도는 약 1.1 g/㎤이다.
유체(56) 및 표적 물질(11)이 플로우 셀(24)에 도입된 후에, 표적 물질(11)은 초기에 유체(56)에서 부유한다. 시간이 경과함에 따라, 표적 물질(11)의 일부는 하부/저부 시퀀싱 표면(30', 32', 31')에 침강하여, 포획 부위(들)(44')에 고정화될 것이다. 일례가 도 4a에 도시되어 있는데, 여기서 복합체(10A)의 일부가 하부/저부 시퀀싱 표면(30')에 침강되었다. 유체(56)는 하부/저부 시퀀싱 표면(30', 32', 31')의 모든 표적 물질(11)이 너무 빨리 침강하는 것을 방지하는데 도움이 된다.
이와 같이, 유체(56)의 도입 및 표적 물질(11)의 일부의 고정화 후에, 외부 인가 자기력이 플로우 셀(24)의 다른 시퀀싱 표면(30, 32, 31)에 인가될 시간이 있다. 자기력은 부유 표적 물질(11)을 플로우 셀(24)의 위쪽/상부 시퀀싱 표면(30, 32, 31)으로 끌어당긴다. 일례가 도 4b에 도시되어 있으며, 여기서 복합체(10A)의 일부는 위쪽/상부 시퀀싱 표면(30)으로 이동하였다.
이러한 예시적인 방법에서, 유체(56)의 도입과 자기력의 인가 사이에 소정 시간이 경과하도록 허용될 수 있다. 이는 표적 물질(11)의 일부가 하나의 시퀀싱 표면(30', 32', 31')에 침강되어 고정화되는 반면에, 나머지 표적 물질(11)이 유체(56)에 떠 있는 상태로 유지되는 것이 바람직할 수 있다. 일례에서, 이러한 소정 시간은 약 5분 내지 약 30분간의 범위이다. 일부 예에서, 소정 기간이 유체(56)의 도입과 자기력의 인가 사이에 경과되고, 소정 시간은 약 5초 내지 약 2분간의 범위이다.
도 4b에 도시된 바와 같이, 이어서, 자기력은 시퀀싱 표면(30, 32)에 인접한 플로우 셀(24)의 외부 표면(60)에 자석(58)을 배치하여 인가된다. 자석(58)은 하부/저부 시퀀싱 표면(30', 32', 31')에 이미 고정화된 표적 물질(11)을 끌어당기지 않고서 부유 표적 물질(11)(예컨대, 복합체(10A, 10B), 클러스터링된 고상 지지체(13) 등)을 끌어당기기에 충분한 자계 강도를 가져야 한다. 자계 강도는 비교적 약하지만, 플로우 채널(28)의 전체 길이 및 폭에 걸쳐 적어도 실질적으로 균일하게 인가된다. 비교적 약한 자계 강도는 약 1 mT(밀리테슬라) 내지 약 100 mT의 범위일 수 있다. 일부 예에서, 상대적으로 약한 자계 강도는 약 1 mT 내지 약 10 mT, 또는 약 10 mT 내지 약 100 mT의 범위이다. 이는 부유 표적 물질(11)이 위쪽/상부 시퀀싱 표면(30, 32, 31)에 걸쳐 포획 부위(44)에 고정화될 수 있게 한다. 경우에 따라, 네오디뮴 자석과 같은 더 강한 자석이 사용될 수 있으며, 이러한 자석은 약 1T(테슬라)의 자계 강도를 갖는다.
일례에서, 자석(58)은 플로우 채널(28) 및/또는 플로우 셀(24)과 동일한 길이 및 폭을 갖는다. 일례에서, 자석(58)은 냉장고 자석과 유사하며, 약 5 mT의 자계 강도를 갖는다. 다른 예에서, 자석(58)은 내부에 매립된 작은 자성 입자를 갖는 엘라스토머 스트립이다. 이러한 유형의 플렉서블(flexible) 자석은 예를 들어, 유라인, 아놀드 마그네틱 테크놀로지즈(Uline, Arnold Magnetic Technologies; 플렉스매그(FLEXMAG)™) 등에서 시판 중이다. 일례에서, 자기력의 인가는 자성 입자가 매립된 엘라스토머 스트립을 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 다른 하나의 표면(즉, 표적 물질(11)이 그 위에 고정화되지 않은 시퀀싱 표면(30))에 인접한 플로우 셀(24)의 외부 표면(60)에 배치하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 자석은 수동으로 인가될 수 있다. 다른 예에서, 자기력의 인가는 예를 들어, 시퀀싱 시스템에 통합될 때 자동화될 수 있다.
자석(58)(및 이에 따른 자기력)의 인가를 위한 타임 프레임은 부분적으로 자석의 강도 및 유체(56) 중의 복합체(10A, 10B)의 농도에 좌우된다. 일례로서, 자석(58)은 5초 내지 약 2분간 인가될 수 있다. 이어서, 방법의 예들은 자기력의 인가를 중단하는 단계를 포함한다. 이는 자석(58)을 제거함으로써 달성될 수 있다.
유체(56) 중의 일부 표적 물질(11)(예를 들어, 복합체(10A, 10B), 클러스터링된 고상 지지체(13))이 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31') 중 어느 하나에 고정화되지 않을 수 있고, 이러한 표적 물질(11)은 추가의 처리 전에 플로우 셀(24)로부터 제거될 수 있음을 이해해야 한다. 이와 같이, 이러한 예시적인 방법은 플로우 셀(24)로부터 유체(56) 및 비포획된 표적 물질(11)을 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 세척은 세척 유체를 플로우 셀(24)에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 유동은 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31')에 고정화되지 않은 임의의 표적 물질(11)을 플로우 셀(24)의 출구 포트를 통해 외부로 밀어낼 수 있다. 표적 물질(11)과 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31')의 포획 부위(44, 44') 사이의 고정화 메커니즘(예를 들어, 결합쌍, 하이브리디제이션, 공유 결합 등)은 임의의 고정화 표적 물질(11)이 출구 유동의 일부가 되는 것을 방지할 수 있다.
도 4a 및 도 4b에 도시된 예가 시퀀싱 표면(30, 30')을 갖는 플로우 셀(24)을 예시하지만, 이러한 방법은 패턴화된 시퀀싱 표면(32, 32')을 갖는 것을 포함하여, 본 명세서에 개시된 플로우 셀(24)의 임의의 예로 수행될 수 있음을 이해해야 한다. 자기 반응성 고상 지지체(12')를 포함하는 클러스터링된 고상 지지체(13)가 사용되는 경우, 도 2d를 참조하여 도시되고 기술된 것과 같은 증폭 프라이머(42, 42')가 없는 플로우 셀(24)이 사용될 수 있다. 더욱이, 임의의 다른 자기 반응성 표적 물질이 본 방법의 이러한 예에서 사용될 수 있다.
도 4a 및 도 4b를 참조하여 기술된 방법을 수행하기 위한 키트는 내부에 다수의 자성 고상 지지체(12')를 포함하는 제조 유체; 및 자성 고상 지지체(12')의 밀도와 거의 동일한 밀도를 갖는 도입 유체(예컨대, 유체(56))를 포함할 수 있다. 키트는 또한 다른 라이브러리 제조 구성요소, 예컨대 핵산 샘플, 부분 Y-어댑터, 트랜스포사제 효소 등을 포함할 수 있으며; 이들 각각은 복합체(10A, 10B), 클러스터링된 고상 지지체(13) 등과 같은 표적 물질(11)을 형성하는 것이 바람직할 때까지 별도의 유체에 포함될 수 있다. 키트의 일부 예는 또한 플로우 셀(24)을 포함할 수 있다. 키트의 또 다른 예는 액체 형태의 온도 반응성 물질을 포함하는 증폭 혼합물을 포함할 수 있다.
도 5a 및 도 5b, 도 6a 및 도 6b, 도 7a 및 도 7b, 및 도 8a 및 도 8b에 도시된 방법이 이제 설명될 것이다. 이들 각각의 방법은 표적 물질의 조합(예를 들어, 11A 및 11B, 또는 11C 및 11D 등)을 사용하고, 상이한 표적 물질의 조합은 각 도면 세트와 관련하여 더욱 자세히 설명된다. 도면의 각각의 세트는 비패턴화된 시퀀싱 표면(30, 30')을 갖는 플로우 셀(24)에 의해 수행되는 방법을 도시한다. 그러나, 이들 방법 중 임의의 것은 패턴화된 표면(32, 32')을 갖는 것을 포함하여, 본 명세서에 개시된 플로우 셀(24)의 임의의 예로 수행될 수 있음을 이해해야 한다. 게다가, 클러스터링된 고상 지지체(13)가 표적 물질(예를 들어, 11A 및 11B 등)로 사용되는 경우, 도 2d를 참조하여 도시되고 기술된 것과 같은 증폭 프라이머(42, 42')가 없는 플로우 셀(24)이 사용될 수 있다.
표적 물질(11A, 11B)의 조합을 이용하는 방법의 일례가 도 5a 및 도 5b에 도시되어 있다. 이러한 예에서, 표적 물질(11A, 11B)은 서로 상이하고, 캐리어 유체와 다른 밀도를 갖는다.
이러한 예시적인 방법은 제1 표적 물질(11A) 및 제2 표적 물질(11B)을 포함하는 표적 유체(56')를 플로우 셀(24)에 도입하여, 플로우 셀(24)의 2개의 대향 시퀀싱 표면(30, 30', 또는 32, 32', 또는 31, 31') 중 제1 표면(30 또는 32 또는 31)에는 제1 표적 물질(11A)을, 2개의 대향 시퀀싱 표면(30, 30', 또는 32, 32', 또는 31, 31') 중 제2 표면(30' 또는 32' 또는 31')에는 제2 표적 물질(11B)을 동시에 고정화하는 것을 포함하며, 여기서 표적 유체(56')의 캐리어 유체는 유체 밀도를 갖고; 제1 표적 물질(11A)은 유체 밀도보다 작은 제1 밀도를 갖고; 제2 표적 물질(11B)은 유체 밀도보다 큰 제2 밀도를 갖는다.
표적 유체(56')의 캐리어 유체의 밀도는 플로우 셀(24)에 도입되는 표적 물질(11A, 11B)의 포획 온도에서 측정될 수 있다. 일례에서, 포획 온도는 약 18℃ 내지 약 40℃의 범위이다.
일례에서, 하나의 표적 물질(11A)의 밀도는 포획 온도에서의 캐리어 유체의 밀도보다 적어도 0.1 g/㎤ 더 작고, 다른 하나의 표적 물질(11B)의 밀도는 포획 온도에서의 캐리어 유체의 밀도보다 적어도 0.1 g/㎤ 더 크다. 하나의 구체적인 예에서, 포획 온도에서의 캐리어 유체의 밀도가 X g/㎤인 경우, 표적 물질(11A 또는 11B) 중 하나의 밀도는 X g/㎤ - 0.1 g/㎤이고, 표적 물질(11B 또는 11A) 중 다른 하나의 밀도는 X g/㎤ + 0.1 g/㎤이다.
표적 유체(56')의 캐리어 유체는 본 명세서에 기재된 완충 수용액 또는 염 수용액 중 임의의 것일 수 있다. 완충 수용액 또는 염 수용액 중의 염 농도는 포획 온도에서의 캐리어 유체의 밀도가 표적 물질(11A, 11B)의 각각의 밀도 사이에 있도록 조정될 수 있다. 다른 예에서, 표적 유체(56')의 캐리어 유체는 이온성 액체이다.
표적 물질(11A, 11B)은 복합체(10A, 10B) 또는 클러스터링된 고상 지지체(13)일 수 있다. 표적 물질(11A, 11B)의 지지체(12)는 이러한 예시적인 방법에 기술된 바와 같이, 각각의 물질(11A, 11B)의 밀도가 캐리어 유체에 대해 상이한 한, 본 명세서에 기재된 임의의 예일 수 있다. 각각의 표적 물질(11A, 11B)의 고상 지지체(12)의 밀도는 각각의 표적 물질(11A, 11B)의 밀도와 적어도 거의 동일하다. 이와 같이, 표적 물질(11A)의 고상 지지체(12)는 포획 온도에서의 표적 유체(56')의 캐리어 유체의 밀도보다 낮은 밀도를 갖도록 선택되고, 표적 물질(11B)의 고상 지지체(12)는 포획 온도에서의 표적 유체(56')의 캐리어 유체의 밀도보다 높은 밀도를 갖도록 선택된다.
도 5a에 도시된 바와 같이, 본 방법은 표적 물질(11A, 11B)을 포함하는 표적 유체(56')를 플로우 셀(24)에 도입하는 단계를 포함한다. 표적 유체(56')는 소정 시간 동안 플로우 셀(24)에서 인큐베이션되도록 허용될 수 있다. 일례에서, 소정 시간은 시퀀싱 표면(30, 30') 상의 원하는 수의 고정화 표적 물질(11A, 11B)을 얻기 위해 약 5분 내지 약 30분간의 범위일 수 있다. 더 긴 인큐베이션 시간이 또한 사용될 수 있다.
언급된 바와 같이, 표적 물질(11A)의 고상 지지체(12)는 포획 온도에서의 캐리어 유체의 밀도보다 낮은 밀도를 가지며, 따라서 표적 물질(11A)은 도 5b에 도시된 바와 같이 상부 시퀀싱 표면(30)으로 이동하거나 부유한다. 포획 부위(44)(도 5b에 도시되지 않음)는 표적 물질(11A)의 적어도 일부를 상부 시퀀싱 표면(30)에 고정화시킨다. 또한 언급된 바와 같이, 표적 물질(11B)의 고상 지지체(12)는 포획 온도에서의 캐리어 유체의 밀도보다 높은 밀도를 가지며, 따라서 표적 물질(11B)은 도 5b에 도시된 바와 같이 저부 시퀀싱 표면(30')으로 이동하거나 침강한다. 포획 부위(44')(또한 도 5b에 도시되지 않음)는 표적 물질(11B)의 적어도 일부를 하부/저부 시퀀싱 표면(30')에 고정화시킨다.
표적 물질(11A, 11B)의 고정화는 캐리어 유체에 대한 표적 물질(11A, 11B)의 상이한 밀도로 인해 플로우 셀(24)로의 표적 유체(56')의 도입 시에 동시에 일어난다. 이와 같이, 도 5a 및 도 5b의 방법에서, 제1 표적 물질(11A) 중 적어도 일부는 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제1 표면(30) 상의 각각의 포획 부위(44)에 의해 고정화되고, 제2 표적 물질(11B) 중 적어도 일부는 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제2 표면(30') 상의 각각의 포획 부위(44')에 의해 고정화된다.
일부 표적 물질(11A, 11B)이 고정화되지 않을 수 있고, 이들 표적 물질(11A, 11B)이 추가의 처리 전에 플로우 셀(24)로부터 제거될 것임을 이해해야 한다. 이와 같이, 이러한 예시적인 방법은 이어서 플로우 셀(24)로부터 표적 유체(56')의 캐리어 유체 및 비고정화 표적 물질(11A, 11B)을 세척하는 단계를 포함한다. 세척은 세척 유체를 플로우 셀(24)에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 유동에 의해, 시퀀싱 표면(30, 30')에 고정화되지 않은 임의의 표적 물질(11A, 11B)을 플로우 셀(24)의 출구 포트를 통해 외부로 밀어낼 수 있다. 각각의 표적 물질(11A, 11B)과 시퀀싱 표면(30, 30')의 포획 부위(44, 44') 사이의 고정화 메커니즘(예를 들어, 결합쌍, 하이브리디제이션, 공유 결합 등)은 임의의 고정화 표적 물질(11A, 11B)이 출구 유동의 일부가 되는 것을 방지할 수 있다.
복합체(10A 또는 10B)가 표적 물질(11A, 11B)로 사용되는 경우, 이러한 세척 단계에는 라이브러리 단편 방출 및 증폭이 이어질 수 있다(예를 들어, 그 예가 도 9a 내지 도 9c를 참조하여 기술됨). 클러스터링된 고상 지지체(13)가 사용되는 경우, 이러한 세척 단계에는 시퀀싱이 이어질 수 있다.
도 5a 및 도 5b를 참조하여 설명된 방법을 수행하기 위한 키트는 유체 밀도를 갖는 캐리어 유체; 유체 밀도보다 작은 제1 밀도를 갖는 제1 표적 물질(11A); 및 유체 밀도보다 큰 제2 밀도를 갖는 제2 표적 물질(11B)을 포함하는 표적 유체(56')를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 제1 및 제2 표적 물질(11A, 11B)은 복합체(10A 또는 10B)이다. 이러한 예에서, 제1 표적 물질(11A)은 제1 밀도와 거의 동일한(즉, 유체 밀도보다 작은) 제1 고상 지지체 밀도를 갖는 제1 고상 지지체(12), 및 제1 고상 지지체(12)에 부착된 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")을 포함하고; 제2 표적 물질(11B)은 제2 밀도와 거의 동일한(즉, 유체 밀도보다 큰) 제2 고상 지지체 밀도를 갖는 제2 고상 지지체(12), 및 제2 고상 지지체(12)에 부착된 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")을 포함한다.
다른 예에서, 제1 및 제2 표적 물질(11A, 11B)은 클러스터링된 고상 지지체(13)이다. 이러한 예에서, 제1 표적 물질(11A)은 제1 밀도와 거의 동일한(즉, 유체 밀도보다 작은) 제1 고상 지지체 밀도를 갖는 제1 고상 지지체(12), 및 제1 고상 지지체(12)에 부착된 주형 가닥(64)의 제1 클러스터를 포함하고; 제2 표적 물질(11B)은 제2 밀도와 거의 동일한(즉, 유체 밀도보다 큰) 제2 고상 지지체 밀도를 갖는 제2 고상 지지체(12), 및 제2 고상 지지체(12)에 부착된 주형 가닥(64)의 제2 클러스터를 포함한다.
키트는 대안적으로 표적 물질(11A)을 제조하기 위한 캐리어 유체, 시약 및 물질과, 표적 물질(11B)을 제조하기 위한 시약 및 물질을 포함할 수 있다. 이러한 예에서, 각각의 표적 물질(11A, 11B)은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 각각의 시약 및 물질을 사용하여 제조될 수 있고, 그 다음에 이들은 캐리어 유체에 첨가되어 표적 유체(56')를 형성할 수 있다.
본 방법의 다른 예는 다양한 표적 물질 및 상기 표적 물질을 고정화하기 위한 다양한 방식을 이용한다. 이러한 예는 일반적으로 2개의 대향 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31')을 포함하는 플로우 셀(24)에 제1 및 제2 표적 물질을 도입하는 단계 - 여기서, 제1 표적 물질은 제2 표적 물질과 상이한 적어도 하나의 특성을 가지며, 적어도 하나의 특성은 밀도, 전하, 자성 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택됨 -; 및 제1 및 제2 표적 물질을 적어도 하나의 조건에 노출시켜, 제1 표적 물질을 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제1 표면(30, 32 또는 31)의 포획 부위(44)에 의해 고정화시키고, 제2 표적 물질을 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제2 표면(30', 32', 31')의 포획 부위(44')에 의해 고정화시키는 단계를 포함한다.
하나의 예시적인 방법이 도 6a 및 도 6b에 도시되어 있다. 이러한 예에서, 표적 물질(11C, 11D)은 반대 전하를 갖는다.
도 6a에 도시된 바와 같이, 제1 표적 물질(11C)은 음전하를 갖고, 제2 표적 물질(11D)은 양전하를 갖는다. 본 명세서에 기재된 하전된 고상 지지체(12)의 임의의 예가 본 실시예에서 사용될 수 있다. 일례에서, 음으로 하전된 제1 표적 물질(11C)은 카르복실화된 고상 지지체, 폴리글루탐산 코팅된 고상 지지체 및 설페이트 작용화된 고상 지지체로 이루어진 군으로부터 선택되고; 양으로 하전된 제2 표적 물질(11D)은 아민 작용화된 고상 지지체, 예컨대 키토산 작용화된 고상 지지체 및 폴리라이신 작용화된 고상 지지체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
표적 물질(11C, 11D)은 플로우 셀(24)에 도입되는 유체(56")의 일부일 수 있다. 이러한 예에서, 하전된 표적 물질(11C, 11D)을 플로우 셀(24)에 도입하는데 사용되는 유체(56")는 전해질일 수 있다. 일례로서, 유체(56")는 동일한 몰 농도(예를 들어, 각각 4.5 mM)에 존재하는 트리스(하이드록시메틸 아미노-메탄 및 붕산의 조합일 수 있다. 복합체(10A, 10B)가 표적 물질(11C, 11D)로 사용되는 경우, 약 4 mM의 Mg2+를 함유하는 식염수-시트르산나트륨(SSC) 완충액(예를 들어, 약 45 mM)과 같은 저염 농도 완충액이 사용될 수 있다. 이러한 유형의 유체(56")는 라이브러리 단편(14, 14', 14")이 방출될 때 하이브리디제이션도 허용하면서, 하전된 표적 물질(11C, 11D)의 전하를 최대화할 수 있다. 클러스터링된 고상 지지체(13)가 표적 물질(11C, 11D)로 사용되는 경우, 물이 유체(56")로 사용될 수 있다.
또한, 유체(56") 및 표적 물질(11C, 11D)의 밀도는 표적 물질(11C, 11D)의 밀도가 표적 물질(11C, 11D)의 정전기적으로 유도된 이동을 방해하지 않도록 거의 동일할 수 있다. 다른 예에서, 유체(56") 및 표적 물질(11C, 11D)의 밀도는 동일하지 않을 수 있다. 이러한 예에서, 인가 전계(62)로 인한 힘의 강도는 밀도 차이로 인한 어떤 힘보다 크다.
이러한 예시적인 방법에서, 하전된 표적 물질(11C, 11D)이 동시 이동 및 고정화를 개시하기 위해 노출되는 조건은 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제1 표면(30, 32, 31)에 양전하(66)와, 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제2 표면(30', 32', 31')에 음전하(68)를 생성하도록 2개의 대향 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31') 사이에 인가된 전계(62)이다.
플로우 셀(24)에 걸쳐 전계(62)를 생성하기 위해, 각각의 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31')은 각각의 표적 물질(11C, 11D)을 끌어당기는 각각의 전하(66, 68)를 생성하기 위해 전원에 전기적으로 결합될 수 있다. 도 6a 및 도 6b에 도시된 예에서, 전계(62)는 하부/저부 시퀀싱 표면(30')을 향하는 방향으로 인가되어, 상부 시퀀싱 표면(30)이 양으로 하전되고, 하부/저부 시퀀싱 표면(30')이 음으로 하전된다.
표적 물질(11C, 11D)의 고정화는 플로우 셀(24)의 유체(56")의 전계(62)에의 노출 시에 동시에 일어난다. 이는 표적 물질(11C, 11D)의 양전하 및 음전하, 및 인가 전계(62)에 대한 이들의 각각의 반응으로 인한 것이다. 음으로 하전된 표적 물질(11C)은 이제 양으로 하전된 시퀀싱 표면(30)을 향해 이동하며, 상부 시퀀싱 표면(30)의 포획 부위(44)(도 6b에 도시되지 않음)에 의해 고정화된다. 양으로 하전된 표적 물질(11D)은 이제 음으로 하전된 시퀀싱 표면(30')을 향해 이동하며, 하부/저부 시퀀싱 표면(30')의 포획 부위(44)(도 6b에 도시되지 않음)에 의해 고정화된다.
전계(62)는 소정 시간 동안 인가될 수 있다. 일례에서, 소정 시간은 각각의 시퀀싱 표면(30, 30') 상의 원하는 수의 고정화 표적 물질(11C, 11D)을 얻기 위해 약 1분 내지 약 30분간의 범위일 수 있다. 다른 예에서, 전계(62)는 약 1분 내지 약 2분, 약 1분 내지 약 5분, 또는 약 5분 내지 약 30분 등의 범위의 시간 동안 인가될 수 있다.
일부 표적 물질(11C, 11D)이 고정화되지 않을 수 있고, 이들 표적 물질(11C, 11D)이 추가의 처리 전에 플로우 셀(24)로부터 제거될 것임을 이해해야 한다. 전계(62)는 비고정화 표적 물질(11C, 11D)의 제거 전에 중단될 수 있다. 이와 같이, 이러한 예시적인 방법은 전계(62)를 제거하고, 이어서 플로우 셀(24)로부터 유체(56") 및 비고정화 표적 물질(11C, 11D)을 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 세척은 세척 유체를 플로우 셀(24)에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 유동에 의해, 시퀀싱 표면(30, 30')에 고정화되지 않은 임의의 표적 물질(11C, 11D)을 플로우 셀(24)의 출구 포트를 통해 외부로 밀어낼 수 있다. 각각의 표적 물질(11C, 11D)과 시퀀싱 표면(30, 30')의 포획 부위(44, 44') 사이의 고정화 메커니즘(예를 들어, 결합쌍, 하이브리디제이션, 공유 결합 등)은 임의의 고정화 표적 물질(11C, 11D)이 출구 유동의 일부가 되는 것을 방지할 수 있다.
복합체(10A 또는 10B)가 표적 물질(11C, 11D)로 사용되는 경우, 이러한 세척 단계에는 라이브러리 단편 방출 및 증폭이 이어질 수 있다(예를 들어, 그 예가 도 9a 내지 도 9c를 참조하여 기술됨). 클러스터링된 고상 지지체(13)가 사용되는 경우, 이러한 세척 단계에는 시퀀싱이 이어질 수 있다.
다른 예시적인 방법이 도 7a 및 도 7b에 도시되어 있다. 이러한 예에서, 표적 물질(11E, 11F)은 자성 및 밀도 면에서 상이하다.
(도 7a에 도시된 바와 같은) 이러한 예에서, 표적 물질(11E, 11F)은 제1 밀도를 갖는 유체(56"')의 플로우 셀(24)에 도입된다. 이하에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 표적 물질(11E, 11F) 각각의 밀도는 이러한 제1 밀도, 즉, 표적 물질(11E, 11F)의 포획 온도에서의 유체(56"')의 밀도에 대해 선택된다. 포획 온도는 약 18℃ 내지 약 40℃의 범위이다.
도 7a 및 도 7b에 도시된 예에서, 제1 표적 물질(11E)은 자성이며, 제2 표적 물질(11F)은 비자성이고, 제1 밀도(즉, 포획 온도에서의 유체(56"')의 밀도)보다 큰 밀도를 갖는다.
이러한 예에서, 제1 표적 물질(11E)은 본 명세서에 개시된 자기 반응성 고상 지지체(12') 중 임의의 것을 포함한다. 또한, 유체(56"') 및 표적 물질(11E)의 밀도는 표적 물질(11E)의 밀도가 표적 물질(11E)의 자기적으로 유도된 이동을 방해하지 않도록 거의 동일할 수 있다. 다른 예에서, 유체(56"') 및 표적 물질(11E)의 밀도는 동일하지 않을 수 있다. 이러한 예에서, 인가 자계(70)로 인한 힘의 강도는 밀도 차이로 인한 어떤 힘보다 크다.
또한, 이러한 예에서, 제2 표적 물질(11F)은 자기적으로 반응하지 않는 본 명세서에 개시된 고상 지지체(12) 중 임의의 것을 포함한다. 고상 지지체(12) 및 따라서 표적 물질(11F)의 밀도는 포획 온도에서의 유체(56"')의 밀도보다 크다. 이와 같이, 표적 물질(11F)은 인가 자계에 반응하지 않고, 유체(56"')보다 무겁기 때문에 저부 시퀀싱 표면(30')으로 이동하거나 그 위에 침강할 수 있다.
이러한 예시적인 방법에서, 표적 물질(11E, 11F)을 포함하는 유체(56"')가 플로우 셀(24)에 도입되고(도 7a), 표적 물질(11E, 11F)이 노출되어 동시 이동 및 고정화를 개시하는 조건은 자기력(70)의 인가이다(도 7b). 유체(56"')의 밀도는 또한 이동 및 고정화에 영향을 주는 조건으로 간주될 수 있다.
자기력(또는 도 7b에 도시된 바와 같은 자계(70))은 도 4a 및 도 4b를 참조하여 기술된 바와 같이 인가될 수 있다. 도 7b에 도시된 예에서, 자기력/자계(70)는 상부 시퀀싱 표면(30)의 방향으로 인가되어, 자기 반응성 (제1) 표적 물질(11E)은 상부 시퀀싱 표면(30)을 향해 바로 그 동일한 방향으로 이동한다. 포획 부위(44)(도 7a 또는 도 7b에 도시되지 않음)는 표적 물질(11E)의 적어도 일부를 상부 시퀀싱 표면(30)에 고정화시킨다. 동시에, 표적 물질(11F)의 고상 지지체(12)는 자기적으로 반응하지 않으며, 포획 온도에서 유체(56"')보다 무겁다. 이와 같이, 표적 물질(11F)은 도 7b에 도시된 바와 같이, 저부 시퀀싱 표면(30')으로 이동하거나 그 위에 침강한다. 포획 부위(44')(또한 도 7a 또는 도 7b에 도시되지 않음)는 표적 물질(11F)의 적어도 일부를 하부/저부 시퀀싱 표면(30')에 고정화시킨다.
자기력/자계(70)는 소정 시간 동안 인가될 수 있다. 일례에서, 소정 시간은 시퀀싱 표면(30') 상의 원하는 수의 고정화 표적 물질(11E)을 얻기 위해 약 5분 내지 약 30분간의 범위일 수 있다.
표적 물질(11E, 11F)의 고정화는 표적 물질(11E, 11F)의 특성(밀도 및 자성 모두)으로 인해, 플로우 셀(24)로의 표적 유체(56"')의 도입 시 및 자계(70)에의 노출 시에 동시에 일어난다. 도 7a 및 도 7b의 방법에서, 제1 표적 물질(11E) 중 적어도 일부는 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제1 표면(30) 상의 각각의 포획 부위(44)에 의해 고정화되고, 제2 표적 물질(11F) 중 적어도 일부는 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제2 표면(30') 상의 각각의 포획 부위(44')에 의해 고정화된다.
일부 표적 물질(11E, 11F)이 고정화되지 않을 수 있고, 이들 표적 물질(11E, 11F)이 추가의 처리 전에 플로우 셀(24)로부터 제거될 것임을 이해해야 한다. 자기력/자계(70)는 비고정화 표적 물질(11E, 11F)의 제거 전에 중단될 수 있다. 이와 같이, 이러한 예시적인 방법은 자기력/자계(70)를 제거하고, 이어서 플로우 셀(24)로부터 유체(56"') 및 비고정화 표적 물질(11E, 11F)을 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 세척은 세척 유체를 플로우 셀(24)에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 유동에 의해, 시퀀싱 표면(30, 30')에 고정화되지 않은 임의의 표적 물질(11E, 11F)을 플로우 셀(24)의 출구 포트를 통해 외부로 밀어낼 수 있다. 각각의 표적 물질(11E, 11F)과 시퀀싱 표면(30, 30')의 포획 부위(44, 44') 사이의 고정화 메커니즘(예를 들어, 결합쌍, 하이브리디제이션, 공유 결합 등)은 임의의 고정화 표적 물질(11E, 11F)이 출구 유동의 일부가 되는 것을 방지할 수 있다.
복합체(10A 또는 10B)가 표적 물질(11E, 11F)로 사용되는 경우, 이러한 세척 단계에는 라이브러리 단편 방출 및 증폭이 이어질 수 있다(예를 들어, 그 예가 도 9a 내지 도 9c를 참조하여 기술됨). 클러스터링된 고상 지지체(13)가 표적 물질(11E, 11F)로 사용되는 경우, 이러한 세척 단계에는 시퀀싱이 이어질 수 있다.
도 7a 및 도 7b에 도시된 예시적인 방법은 또한 자기적으로 반응하는 표적 물질(11E)이 하부/저부 시퀀싱 표면(30')에 고정화되고, 자기적으로 반응하지 않는 표적 물질(11F)이 상부 시퀀싱 표면(30)에 고정화되도록 수행될 수 있다. 이러한 예에서, 비자기 반응성 표적 물질(11F)은 포획 온도에서 유체(56"')의 밀도보다 작은 밀도를 갖도록 선택되는 고상 지지체(12)를 포함한다. 이러한 예에서, 표적 물질(11E)은 자기력/자계(저부 시퀀싱 표면(30')의 방향으로 인가됨)에 반응하여, 저부 시퀀싱 표면(30')으로 끌어당겨지는 반면에, 표적 물질(11F)은 인가 자계에 반응하지 않고, 유체(56"')보다 가볍기 때문에 부유하거나 상부 시퀀싱 표면(30)으로 이동할 수 있다.
다른 예시적인 방법이 도 8a 및 도 8b에 도시되어 있다. 이러한 예에서, 표적 물질(11G, 11H)은 전하 및 밀도 면에서 상이하다.
이러한 예에서, 표적 물질(11G, 11H)은 제1 밀도를 갖는 유체(56"")의 플로우 셀(24)에 도입된다. 이하에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 표적 물질(11G, 11H) 각각의 밀도는 이러한 제1 밀도, 즉, 표적 물질(11G, 11H)의 포획 온도에서의 유체(56"")의 밀도에 대해 선택된다. 포획 온도는 약 18℃ 내지 약 40℃의 범위이다.
이러한 예에서, 유체(56"")는 전해질이다.
도 8a 및 도 8b에 도시된 예에서, 제1 표적 물질(11G)은 음으로 하전되며, 제2 표적 물질(11H)은 중성(하전되지 않음)이고, 제1 밀도(즉, 포획 온도에서의 유체(56"")의 밀도)보다 큰 밀도를 갖는다. 이러한 예에서, 제1 표적 물질(11G)은 본 명세서에 개시된 음으로 하전된 고상 지지체 중 임의의 것, 예컨대 카르복실화된 고상 지지체, 폴리글루탐산 코팅된 고상 지지체 또는 설페이트 작용화된 고상 지지체를 포함한다. 또한, 유체(56"")의 밀도 및 표적 물질(11G)의 밀도는 표적 물질(11G)의 밀도가 음으로 하전된 표적 물질(11G)의 정전기적으로 유도된 이동을 방해하지 않도록 거의 동일할 수 있다. 대안적으로, 표적 물질(11G)의 밀도는 유체(56"")의 밀도보다 작을 수 있고, 밀도 및 전하는 표적 물질(11G)의 이동을 도울 수 있다.
도 8a 및 도 8b로 나타낸 방법의 다른 예에서, 제1 표적 물질(11G)은 양으로 하전되며, 제2 표적 물질(11H)은 중성(하전되지 않음)이고, 제1 밀도(즉, 포획 온도에서의 유체(56"")의 밀도)보다 큰 밀도를 갖는다. 이러한 예에서, 제1 표적 물질(11G)은 본 명세서에 개시된 양으로 하전된 고상 지지체 중 임의의 것, 예컨대 아민 작용화된 고상 지지체(예를 들어, 키토산 또는 폴리라이신 작용화된 고상 지지체)를 포함한다. 또한, 유체(56"")의 밀도 및 표적 물질(11G)의 밀도는 표적 물질(11G)의 밀도가 양으로 하전된 표적 물질(11G)의 정전기적으로 유도된 이동을 방해하지 않도록 거의 동일할 수 있다. 대안적으로, 표적 물질(11G)의 밀도는 유체(56"")의 밀도보다 작을 수 있고, 밀도 및 전하는 표적 물질(11G)의 이동을 도울 수 있다.
도 8a 및 도 8b에 나타낸 예시적인 방법에서, 제2 표적 물질(11H)은 하전되지 않은 본 명세서에 개시된 임의의 고상 지지체(12)를 포함한다. 고상 지지체(12) 및 따라서 표적 물질(11H)의 밀도는 포획 온도에서의 유체(56"")의 밀도보다 크다. 이와 같이, 표적 물질(11H)은 인가 전계(62)에 반응하지 않고, 유체(56"")보다 무겁기 때문에 저부 시퀀싱 표면(30')으로 이동하거나 그 위에 침강할 수 있다.
표적 물질(11G, 11H)을 포함하는 유체(56"")가 플로우 셀(24)에 도입되고, 표적 물질(11G, 11H)이 노출되어 동시 이동 및 고정화를 개시하는 조건은 전계(62)의 인가이다. 유체(56"")의 밀도는 또한 이동 및 고정화에 영향을 주는 조건으로 간주될 수 있다.
전계(62)는 도 6a 및 도 6b를 참조하여 기술된 바와 같이 인가될 수 있다. 도 8a에 도시된 예에서(표적 물질(11G)이 음으로 하전되는 경우), 전계(62)는 하부/저부 시퀀싱 표면(30')을 향하는 방향으로 인가된다. 이것에 의해, 상부 시퀀싱 표면(30)이 양으로 하전되고, 하부/저부 시퀀싱 표면(30')이 음으로 하전된다. 이러한 예에서, 음으로 하전된 표적 물질(11G)은 이제 양으로 하전된 시퀀싱 표면(30)을 향해 이동하며, 상부 시퀀싱 표면(30)의 포획 부위(44)(도 8a 또는 도 8b에 도시되지 않음)에 의해 고정화된다. 동시에, 표적 물질(11H)의 고상 지지체(12)는 하전되지 않으며, 포획 온도에서 유체(56"")보다 무겁다. 이와 같이, 표적 물질(11H)은 도 8b에 도시된 바와 같이, 저부 시퀀싱 표면(30')으로 이동하거나 그 위에 침강한다. 포획 부위(44')(또한 도 8a 또는 도 8b에 도시되지 않음)는 표적 물질(11H)의 적어도 일부를 하부/저부 시퀀싱 표면(30')에 고정화시킨다.
상술한 바와 같이, 도 8a 및 도 8b로 나타낸 방법의 다른 예에서, 표적 물질(11G)은 양으로 하전된다. 이러한 예에서, 전계(62)는 상부 시퀀싱 표면(30)을 향하는 방향으로(즉, 도 8a 및 도 8b에 도시된 것과 반대 방향으로) 인가된다. 이것에 의해, 하부 시퀀싱 표면(30')이 양으로 하전되고, 상부 시퀀싱 표면(30)이 음으로 하전된다. 이러한 예에서, 양으로 하전된 표적 물질(11G)은 이제 음으로 하전된 시퀀싱 표면(30)을 향해 이동하며, 상부 시퀀싱 표면(30)의 포획 부위(44)에 의해 고정화된다. 동시에, 표적 물질(11H)의 고상 지지체(12)는 하전되지 않으며, 포획 온도에서 유체(56"")보다 무겁다. 이와 같이, 표적 물질(11H)은 도 8b와 유사하게, 저부 시퀀싱 표면(30')으로 이동하거나 그 위에 침강한다. 포획 부위(44')(또한 도 8b에 도시되지 않음)는 표적 물질(11H)의 적어도 일부를 하부/저부 시퀀싱 표면(30')에 고정화시킨다.
도 8a 및 도 8b로 나타낸 임의의 예에서, 전계(62)는 소정 시간 동안 인가될 수 있다. 일례에서, 소정 시간은 반대로 하전된 시퀀싱 표면(30 또는 30') 상의 원하는 수의 고정화 하전 표적 물질(11G)을 얻기 위해 약 1분 내지 약 30분간의 범위일 수 있다.
표적 물질(11G, 11H)의 고정화는 표적 물질(11G, 11H)의 특성(밀도 및 전하 모두)으로 인해, 플로우 셀(24)로의 표적 유체(56"")의 도입 시 및 전계(62)에의 노출 시에 동시에 일어난다. 도 8a 및 도 8b의 방법에서, 제1 표적 물질(11G) 중 적어도 일부는 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제1 표면(30) 상의 각각의 포획 부위(44)에 의해 고정화되고, 제2 표적 물질(11H) 중 적어도 일부는 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제2 표면(30') 상의 각각의 포획 부위(44')에 의해 고정화된다.
일부 표적 물질(11G, 11H)이 고정화되지 않을 수 있고, 이들 표적 물질(11G, 11H)이 추가의 처리 전에 플로우 셀(24)로부터 제거될 것임을 이해해야 한다. 전계(62)는 비고정화 표적 물질(11G, 11H)의 제거 전에 중단될 수 있다. 이와 같이, 이러한 예시적인 방법은 전계(62)를 제거하고, 이어서 플로우 셀(24)로부터 유체(56"") 및 비고정화 표적 물질(11G, 11H)을 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 세척은 세척 유체를 플로우 셀(24)에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 유동에 의해, 시퀀싱 표면(30, 30')에 고정화되지 않은 임의의 표적 물질(11G, 11H)을 플로우 셀(24)의 출구 포트를 통해 외부로 밀어낼 수 있다. 각각의 표적 물질(11G, 11H)과 시퀀싱 표면(30, 30')의 포획 부위(44, 44') 사이의 고정화 메커니즘(예를 들어, 결합쌍, 하이브리디제이션, 공유 결합 등)은 임의의 고정화 표적 물질(11G, 11H)이 출구 유동의 일부가 되는 것을 방지할 수 있다.
복합체(10A 또는 10B)가 표적 물질(11G, 11H)로 사용되는 경우, 이러한 세척 단계에는 라이브러리 단편 방출 및 증폭이 이어질 수 있다(예를 들어, 그 예가 도 9a 내지 도 9c를 참조하여 기술됨). 클러스터링된 고상 지지체(13)가 표적 물질(11G, 11H)로 사용되는 경우, 이러한 세척 단계에는 시퀀싱이 이어질 수 있다.
도 8a 및 도 8b에 도시된 예시적인 방법은 또한 표적 물질(11G)이 하전되지 않고, 표적 유체(56"")의 밀도보다 작은 밀도를 갖도록 수행될 수 있다. 이러한 예에서, 표적 물질(11H)은 양으로 하전된다. 이러한 예에서, 양으로 하전된 표적 물질(11H)은 전계(62)(저부 시퀀싱 표면(30')의 방향으로 인가됨)에 반응하고, 저부 시퀀싱 표면(30')으로 끌어당겨진다. 또한 이러한 예에서, 표적 물질(11G)은 인가 자계에 반응하지 않고, 유체(56"")보다 가볍기 때문에 부유하거나 상부 시퀀싱 표면(30)으로 이동할 수 있다.
2개의 상이한 표적 물질(11)을 고정화하기 위해 다른 직교 양식이 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 각각의 표적 물질(11)은 직교 양식 중 하나에 반응할 수 있지만, 다른 양식에는 반응하지 않을 수 있으며, 이는 양식이 표적 물질(11) 중 하나에 독립적으로 영향을 미치게 한다. 예를 들어, 하전되지 않은 자기 반응성 표적 물질(11)은 하전된 비자성 표적 물질(11)과 조합될 수 있다. 이러한 예에서, 자계(70)는 하전되지 않은 자기 반응성 표적 물질(11)의 이동을 대향 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32', 또는 31, 31') 중 하나의 표면(30, 32, 31)으로 안내하도록 일방향으로 인가될 수 있으며; 전계(62)는 하전된 비자성 표적 물질의 이동을 대향 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32', 또는 31, 31') 중 다른 하나의 표면(30', 32', 31')으로 안내하도록 반대 방향으로 인가될 수 있다. 몇 가지의 예가 제공되었지만, 다른 표적 물질 조합 및 양식이 이용될 수 있는 것으로 고려된다.
복합체로부터의 라이브러리 단편 방출 및 시퀀싱
플로우 셀(24)의 대향 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31') 둘 다에 고정화된 표적 물질(11)에 의해, 플로우 셀(24)은 다운스트림 분석할 준비가 된다.
대향 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32') 둘 다에 고정화된 복합체(10A, 10B)를 이용하는 예에서, 플로우 셀(24)은 라이브러리 단편 방출, 증폭, 및 시퀀싱할 준비가 된다.
고정화, 및 비고정화 표적 물질(예를 들어, 복합체(10A, 10B))의 제거 후에, 본 방법의 예는 고정화 복합체(10A, 10B)의 고상 지지체(12 또는 12')로부터 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")의 방출을 개시하여, 적어도 일부의 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")을 2개의 대향 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32')의 각각의 프라이머(42, 42')에 시딩하는 단계; 및 고상 지지체(12 또는 12') 및 시딩되지 않은 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")을 제거하는 단계를 포함한다. 이들 단계에는 도 9a 내지 도 9c를 참조하여 기술된 것을 포함하여, 본 명세서에 기술된 임의의 증폭 기술이 이어질 수 있다.
단편(14, 14', 14")의 방출 전에, 외부 고정화제가 플로우 셀(24)에 도입될 수 있다. 일례에서, 외부 고정화제는 공기, 또는 플로우 셀(24)에 도입된 표적 물질(11)(구체적으로, 복합체(10A, 10B))과 혼화성이 아닌 액체 매질 또는 점성 매질이다. 공기는 플로우 셀(24)로부터 세척 유체를 흡인하는데 사용될 수 있으며, 이는 복합체(10A, 10B)를 둘러싸서, 각각의 복합체(10A, 10B) 주위에 확산 장벽을 형성하는 액적을 생성할 수 있다. 액체 또는 점성 외부 고정화제는 플로우 셀(24) 내에 고정화된 복합체(10A, 10B)를 적어도 부분적으로 둘러싼다. 외부 고정화제는 단편(14, 14', 14")이 고상 지지체(12 또는 12')로부터 방출될 때 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")의 확산을 최소화하는 것을 도울 수 있다. 외부 고정화제가 온도 반응성 물질인 경우, 온도를 시딩 온도로 상승시키는 것은 외부 고정화제를 더욱 점성으로 만들 수 있어, 라이브러리 확산을 더욱 최소화할 수 있다.
이어서, 고상 지지체(12 또는 12')로부터 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")의 방출이 개시될 수 있다. 일례에서, 절단제가 플로우 셀(24)에 도입될 수 있고, 절단제가 고상 지지체(12 또는 12')로부터 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14'')을 방출하도록 촉발하기 위해 자극이 적용될 수 있다. 다른 예에서, 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")의 방출은 단편(14, 14', 14")에 하이브리디제이션되는 프라이머의 용융 온도 이상으로 플로우 셀(24)을 가열하는 것을 포함할 수 있다.
방출 시에, 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")의 이동 및 시딩은 외부 고정화제에 의해 제한될 수 있다. 이와 같이, 임의의 특정 복합체(10A, 10B)의 단편(14, 14', 또는 14")은 특정 복합체(10A, 10B)에 가까운 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32')의 영역에 한정될 수 있으며, 이로부터 단편(14, 14', 14")이 방출된다.
플로우 셀(24)의 각각의 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32')의 프라이머(42, 42')는 방출된 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14' 또는 14")을 시딩할 수 있다. 시딩은 단편(14, 14' 또는 14")의 제1 또는 제2 서열과 각각의 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32')의 프라이머(42, 42') 중 상보적인 것 사이의 하이브리디제이션을 통해 달성된다. 시딩은 단편(14, 14' 또는 14") 및 프라이머(들)(42, 42')에 적합한 하이브리디제이션 온도에서 수행될 수 있다. 일례에서, 시딩은 약 80℃에서 일어나며, 이어서 실온(예를 들어, 25℃)으로 온도가 저하된다.
시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14' 또는 14")이 플로우 셀(24) 내에 시딩되는 위치는 부분적으로, 프라이머(42, 42')가 어떻게 부착되는지에 따라 달라진다. 비패턴화된 시퀀싱 표면(30, 30')을 갖는 플로우 셀(24)의 예에서, 방출된 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14' 또는 14")은 오목 영역(38, 38')의 폴리머 하이드로겔(40, 40')에 걸쳐 시딩될 것이다. 패턴화된 시퀀싱 표면(32, 32')을 갖는 플로우 셀(24)의 예에서, 방출된 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14' 또는 14")은 각각의 함몰부(48, 48') 내의 폴리머 하이드로겔(40, 40')에 걸쳐 시딩될 것이다.
플로우 셀(24)의 패턴화된 시퀀싱 표면(32, 32')을 따라 상이한 함몰부(48, 48')의 시딩된 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14' 또는 14")의 예가 도 9a에 도시되어 있다.
이어서, 고상 지지체(12, 12')는 플로우 셀(24)로부터 제거될 수 있다. 고상 지지체(12, 12')의 제거는 임의의 적절한 기술을 수반할 수 있으며, 이는 고상 지지체(12, 12')를 포획 부위(44, 44')에 부착시키는 메커니즘에 의존한다. 예로서, 변성, 접합 절단 등이 사용될 수 있다. 고상 지지체(12, 12')의 제거는 또한 시딩되지 않은 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")을 제거할 수 있다. 고상 지지체(12, 12')의 제거는 또한 외부 고정화제의 액체 또는 점성 형태를 제거할 수 있다.
이어서, 시딩된 시퀀싱 라이브러리 단편(14, 14', 14")은 클러스터 생성을 사용하여 증폭될 수 있다.
클러스터 생성의 일례에서, 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14' 또는 14")은 고충실도 DNA 폴리머라제를 사용하여 3' 신장에 의해 하이브리디제이션된 프라이머(42, 42')로부터 카피된다. 고충실도 DNA 폴리머라제는 플로우 셀(24)에 도입되는 증폭 혼합물의 일부일 수 있다. 증폭 혼합물은 또한 다른 적절한 폴리머라제 연쇄 반응 시약을 포함할 수 있다. 원래의 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")은 변성되어, 카피가 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32')에 고정화된 상태로 남는다. 등온 브리지 증폭 또는 다른 형태의 증폭을 사용하여, 고정화 카피를 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, 카피된 주형은 인접한 상보적 프라이머(42, 42')에 루프되어 하이브리디제이션하고, 폴리머라제는 카피된 주형을 카피하여 이중 가닥 브리지를 형성하고, 이는 변성되어 2개의 단일 가닥으로 된 가닥을 형성한다. 이들 2개의 가닥은 인접한 상보적 프라이머(42, 42')에 루프되어 하이브리디제이션하고, 다시 신장되어 2개의 새로운 이중 가닥 루프를 형성한다. 이 프로세스는 밀도가 높은 클론 클러스터를 생성하기 위해 등온 변성 및 증폭의 사이클에 의해 각각의 주형 카피에서 반복된다. 이중 가닥 브리지의 각각의 클러스터는 변성된다. 일례에서, 역방향 가닥은 특정 염기 절단에 의해 제거되어, 정방향 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥을 남긴다. 클러스터링에 의해, 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32')을 따라 수개의 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥이 형성된다. 클러스터링의 이러한 예는 브리지 증폭이며, 수행될 수 있는 증폭의 일례이다. 배제 증폭(Examp) 워크 플로우(일루미나 인코포레이티드)와 같은 다른 증폭 기술이 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
증폭 및 이에 따른 클러스터 생성의 다른 예는 온도 반응성 물질의 사용을 포함한다. 이러한 예는 도 9a 내지 도 9c에 개략적으로 도시되어 있다. 이러한 예시적인 방법은 액체 형태(63)의 온도 반응성 물질을 포함하는 증폭 혼합물을 플로우 셀(24)에 도입하는 단계; 액체 형태(63)의 온도 반응성 물질을 겔화시키는(겔 형태(63')의 온도 반응성 물질을 생성하는) 단계; 시딩된 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")의 증폭을 개시하여 주형 가닥(64)을 생성하여, 겔 형태(63')의 온도 반응성 물질이 주형 가닥(64)의 확산을 감소시키는 단계; 겔 형태(63')의 온도 반응성 물질을 액화시키는(액체 형태(63)의 온도 반응성 물질을 생성하는) 단계; 및 플로우 셀(24)로부터 액체 형태(63)의 온도 반응성 물질을 제거하는 단계를 포함한다.
도 9a에 도시된 바와 같이, 액체 형태(63)의 온도 반응성 물질을 포함하는 증폭 혼합물이 예를 들어, 입구를 통해 플로우 채널(28)에 도입되었다. 액체 형태(63)의 온도 반응성 물질에 더하여, 증폭 혼합물의 이러한 예는 또한 고충실도 DNA 폴리머라제 및 임의의 다른 적절한 폴리머라제 연쇄 반응 시약을 포함한다.
온도 반응성 물질은 상기 물질이 노출되는 온도 조건을 변화시켜 액체 형태(63)로부터 겔 형태(63')로 전이될 수 있다. 액체 형태(63)에서, 온도 반응성 물질의 분자들은 연결되지 않고, 따라서 유동할 수 있다. 겔 형태(63')에서, 온도 반응성 물질의 분자는 가교결합되고, 따라서 유동할 수 없다. 겔 형태(63')는 i) 증폭을 위해 시딩된 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")에 접근하도록 소분자, 단백질 및 시약의 확산 교환을 촉진할 수 있고, 또한 ii) 확산 또는 대류로 인한 시딩된 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14") 또는 주형 가닥(64)의 이동을 방해하거나 방지할 수 있는 기공, 채널 또는 기타 개구를 포함한다. 이와 같이, 임의의 온도 감수성 물질은 i) 겔내(in-gel) 증폭을 용이하게 하고, ii) 시딩된 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14") 및 주형 가닥(64)의 확산, 대류 또는 기타 이동을 제한하며, iii) 가교결합 전에 액체로 펌핑되거나 달리 유동될 수 있고, iv) 제어가능하게 가교결합되고 겔화될 수 있으며, v) 제어가능하게 연결되지 않고 액화될 수 있다.
온도 반응성 물질의 예에는 다이설파이드 가교결합된 폴리아크릴아미드, 아가로스, 알기네이트, 및 폴리(N-아이소프로필아크릴아미드)(PNIPAAm)와 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 공중합체가 포함된다. 이들 물질 각각에 대해, 겔 형태(63')를 용융시키지 않을 온도에서 증폭을 수행할 수 있다.
PNIPAAm과 PEG의 공중합체는 저온에서 액체이고, 고온에서 겔이다. PNIPAAm과 PEG의 공중합체의 일례는 29℃ 미만의 온도에서 액체이고, 32℃보다 높은 온도에서 겔이다. PNIPAAm과 PEG의 공중합체의 겔화 온도는 공중합체의 폴리(N-아이소프로필아크릴아미드) 및 폴리에틸렌 글리콜의 비를 변경하여 조정될 수 있다.
증폭 혼합물은 증폭 반응이 일어나지 않는 조건에서 플로우 셀(24)에 로딩된다. 예를 들어, 증폭은 4℃에서 일어나지 않으므로, 증폭 혼합물(액체 형태(63)의 온도 반응성 물질을 포함함)이 이 온도에서 도입될 수 있다.
액체 형태(63)의 온도 반응성 물질을 겔화하여, 겔 형태(63')를 생성하는 것은 플로우 셀(24) 및 그 안에 함유된 온도 반응성 물질의 온도를 온도 반응성 물질의 겔화 온도로 조정함으로써 수행될 수 있다. 겔 형태(63')가 도 9b에 도시되어 있다. 플로우 셀(24)이 조정되는 온도는 사용되는 온도 반응성 물질에 따라 달라질 것이다.
도 9b에 도시된 바와 같이, 시딩된 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")의 증폭을 개시하여, 주형 가닥(64)을 생성한다. 증폭은 플로우 셀(24) 및 그 안에 함유된 증폭 혼합물의 온도를 PCR 시약이 활성화되는 온도로 조정하여 개시될 수 있다. 증폭 동안, 겔 형태(63')의 온도 반응성 물질은 시딩된 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14") 및 주형 가닥(64)의 이동을 감소시킨다.
겔 형태(63')의 온도 반응성 물질을 액화하여, 액체 형태(63)를 생성하는 것은 플로우 셀(24) 및 그 안에 함유된 온도 반응성 물질의 온도를 온도 반응성 물질의 액화 온도로 다시 조정함으로써 수행될 수 있다. 다시, 플로우 셀(24)이 조정되는 온도는 사용되는 온도 반응성 물질에 따라 달라질 것이다.
이어서, 액체 형태(63)가 플로우 셀(24)로부터 펌핑되어, 플로우 셀(24)이 후속 시퀀싱할 준비가 될 수 있다. 액체 형태(63)의 온도 반응성 물질이 제거된 후의 플로우 셀(24)이 도 9c에 도시되어 있다.
하나의 구체적인 예에서, PNIPAAm과 PEG의 공중합체는 증폭 혼합물에 사용되며, 재조합효소 매개 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 함께 사용된다. 전형적인 재조합효소 매개 등온 PCR이 4℃에서 비활성이고, 37℃ 또는 기타 고온에서 활성이며, PNIPAAm과 PEG의 공중합체가 29℃ 미만의 온도에서 액체이고, 32℃보다 높은 온도에서 겔이기 때문에, 온도 프로그램을 사용하여 증폭을 제어할 수 있다. 이러한 예에서, 증폭 혼합물은 액체 혼합물로서 약 4℃에서 플로우 셀(24)에 도입될 수 있다. 이어서, 온도를 약 37℃로 상승시켜, 공중합체를 겔화하고 PCR 증폭을 개시할 수 있다. 완료 시에, 공중합체의 겔 형태(63')는 온도를 29℃ 미만, 예를 들어 약 8℃(이는 적절한 시퀀싱 온도임)로 저하시켜 액화될 수 있다. 이어서, 액체 형태(63)가 플로우 셀(24)로부터 펌핑되어, 플로우 셀(24)이 후속 시퀀싱할 준비가 될 수 있다.
온도 반응성 물질(63, 63')의 사용은 시딩된 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14' 또는 14")의 확산과, 증폭된 주형 가닥(64)이 패턴화된 시퀀싱 표면(32, 32')의 주변 함몰부(48, 48')로 이동하거나(예를 들어, 확산 또는 자유 대류의 결과로서), 비패턴화된 시퀀싱 표면(30, 30') 상의 초기 시딩 위치에서 멀어지는 것을 최소화할 수 있다. 이러한 이동을 제한하거나 방지함으로써, 클러스터는 플로우 셀(24)의 상대적으로 격리된 영역에 남아 있으며, 이는 각각의 클러스터가 중복(redundancy) 없이 개별적으로 리딩될 수 있게 한다. 이동은 또한 원래의 시퀀싱 라이브러리 단편(14, 14', 14")에 존재하지 않는 하이브리드 분자를 생성할 수 있으며, 이는 부정확한 시퀀싱 데이터를 초래한다. 이러한 이동을 제한하거나 방지함으로써, 이러한 하이브리드 분자는 생성되지 않으므로, 얻어진 시퀀싱 데이터의 정확도를 향상시킨다.
도 9a 내지 도 9c가 패턴화된 시퀀싱 표면(32, 32')을 갖는 플로우 셀(24)을 도시하지만, 본 방법이 비패턴화된 시퀀싱 표면(30, 30')을 사용하여 수행될 수도 있음을 이해해야 한다.
또한, 도 9a 내지 도 9c에 도시된 방법은 고상 지지체(12, 12')에 테더링되지 않은 것을 포함하여, 임의의 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")으로 수행될 수 있다. 이러한 예에서, 단편화된 DNA 샘플에 원하는 어댑터를 부가하는 임의의 적절한 라이브러리 제조 기술이 사용될 수 있다. 시퀀싱 레디 핵산 단편(14, 14', 14")이 도입되어, 플로우 셀의 시퀀싱 표면(들)(30, 30' 또는 32, 32')에 시딩될 수 있다. 라이브러리 단편이 시딩되면, 도 9a 내지 도 9c에 설명된 방법이 수행될 수 있다.
또한, 도 9a 내지 도 9c에 도시된 방법은 클러스터링된 고상 지지체(13)를 사용하여 수행되지 않을 수 있는데, 그 이유는 이러한 표적 물질(11)이 플로우 셀(24) 상의 증폭에 노출되지 않기 때문임을 이해해야 한다.
이어서, 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥 상의 상보적 서열에 하이브리디제이션되는 시퀀싱 프라이머가 도입될 수 있다. 이러한 시퀀싱 프라이머는 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥(64)이 시퀀싱될 준비가 되게 한다. 주형(64)의 3' 말단 및 임의의 플로우 셀 결합된 프라이머(42, 42')(카피에 부착되지 않음)는 시퀀싱 반응과의 간섭을 방지하기 위해, 특히 바람직하지 않은 프라이밍을 방지하기 위해 차단될 수 있다.
시퀀싱을 개시하기 위해, 혼입 혼합물이 플로우 셀(24)에 첨가될 수 있다. 일례에서, 혼입 혼합물은 액체 캐리어, 폴리머라제 및 형광 표지된 뉴클레오타이드를 포함한다. 형광 표지된 뉴클레오타이드는 3' OH 보호기를 포함할 수 있다. 혼입 혼합물이 플로우 셀(24)에 도입될 때, 유체는 플로우 채널(28)에 들어가고, 일부 예에서 함몰부(48, 48')(주형 폴리뉴클레오타이드 가닥이 존재함)에 들어간다.
형광 표지된 뉴클레오타이드를 주형 의존 방식으로 시퀀싱 프라이머에 첨가하여(그에 의해 시퀀싱 프라이머를 신장시켜), 시퀀싱 프라이머에 첨가된 뉴클레오타이드의 순서 및 유형의 검출을 사용하여 주형의 서열을 결정할 수 있다. 보다 구체적으로, 뉴클레오타이드들 중 하나는 각각의 폴리머라제에 의해, 시퀀싱 프라이머를 신장시키고 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥에 상보적인 초기 가닥에 혼입된다. 다시 말해서, 플로우 셀(24)에 걸쳐서 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥의 적어도 일부에서, 각각의 폴리머라제는 혼입 혼합물의 뉴클레오타이드 중 하나에 의해 하이브리디제이션된 시퀀싱 프라이머를 신장시킨다.
뉴클레오타이드의 혼입은 이미징 이벤트를 통해 검출될 수 있다. 이미징 이벤트 동안, 조명 시스템(도시되지 않음)은 각각의 시퀀싱 표면(30, 30' 또는 32, 32')에 여기광을 제공할 수 있다.
일부 예에서, 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드가 시퀀싱 프라이머에 부가되면, 추가의 프라이머 신장을 종결시키는 가역적 종결 특성(예를 들어, 3' OH 보호기)을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 가역적 종결인자 부분을 갖는 뉴클레오타이드 유사체가 시퀀싱 프라이머에 부가될 수 있어서, 상기 부분을 제거하기 위해 디블로킹제(deblocking agent)가 전달될 때까지 후속 신장이 일어날 수 없다. 따라서, 가역적 종결을 사용하는 예의 경우, 디블로킹 시약은 검출이 일어난 후에, 플로우 셀(24)에 전달될 수 있다.
세척(들)은 다양한 유체 전달 단계 사이에서 일어날 수 있다. 이어서, n개의 뉴클레오타이드에 의해 시퀀싱 프라이머를 신장시키도록 SBS 사이클을 n회 반복하여, 길이 n의 서열을 검출할 수 있다.
일부 예에서, 정방향 가닥은 시퀀싱되어 제거될 수 있으며, 이어서 역방향 가닥은 본 명세서에 기재된 바와 같이 구성되어 시퀀싱된다.
SBS가 상세히 설명되었지만, 본 명세서에 기재된 플로우 셀(24)은 다른 시퀀싱 프로토콜과 함께, 유전자형 결정을 위해, 또는 다른 화학적 및/또는 생물학적 응용에서 이용될 수 있음을 이해해야 한다. 일부 경우에, 플로우 셀(24)의 프라이머(42, 42')는 동시 페어드 엔드 시퀀싱(simultaneous paired-end sequencing)을 가능하게 하도록 선택될 수 있으며, 여기서 정방향 및 역방향 가닥은 모두 폴리머 하이드로겔(40, 40')에 존재하여, 각각의 리드의 동시 염기 해독(simultaneous base calling)을 가능하게 한다. 순차적 및 동시 페어드 엔드 시퀀싱은 게놈 재배열 및 반복적 서열 요소뿐만 아니라 유전자 융합 및 새로운 전사체의 검출을 용이하게 한다.
클러스터링된 고상 지지체 및 시퀀싱
상술한 바와 같이, 플로우 셀(24)의 대향 표면(30, 30' 또는 32, 32' 또는 31, 31') 둘 다에 고정화된 표적 물질(11)에 의해, 플로우 셀(24)은 다운스트림 분석할 준비가 된다. 클러스터링된 고상 지지체(13)가 플로우 셀(24)의 대향 표면(31, 31') 둘 다에 고정화되는 경우, 플로우 셀(24)은 시퀀싱을 위해 준비된다. 이러한 예에서, 플로우 셀(24)은 증폭 및 클러스터 생성이 플로우 셀(24)의 고상 지지체(12 또는 12')에서 일어났기 때문에 시퀀싱할 준비가 된다.
시퀀싱은 시퀀싱 프라이머 및 혼입 혼합물을 도입하고, 순차적 시퀀싱 사이클을 수행함으로써 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
본 발명을 더욱 설명하기 위해, 실시예가 본 명세서에 주어진다. 이러한 실시예는 예시적인 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다.
비제한적인 실시예
실시예 1
평균 직경이 3 μm인, 도 1a에 나타낸 것과 유사한 복합체를 제조하였다. 복합체의 고상 지지체는 서모피셔 사이언티픽으로부터의 다이나비즈™ M-280 스트렙타비딘 비드이었다. 고상 지지체는 각각 밀도가 약 1.18 g/㎤이다. 특정 비드 상의 단편은 동일한 긴 DNA 분자(PhiX 게놈 유래)로부터 유래하였다. 라이브러리 단편을 비드 표면 상의 스트렙타비딘에 대하여 비오틴보다 약한 친화성을 갖는 데스티오비오틴 올리고를 통해 고상 지지체에 부착하였다. 라이브러리 단편은 인덱스 서열, 및 리드 1 및 리드 2 서열과 함께, P5' 및 P7 서열을 포함하였다.
도 3a 및 도 3b에 기술된 것과 유사한 방법의 예를 사용하여, 대향 패턴화된 시퀀싱 표면(P5 및 P7 프라이머를 포함함)을 포함하는 플로우 셀에 복합체를 로딩하였다.
보다 구체적으로, 복합체를 먼저 2개의 유체로 분할하였는데, 그 중 제1 유체는 밀도가 약 2 g/㎤이고, 제2 유체는 밀도가 약 1 g/㎤이었다. 제1 유체는 1 g/ml의 폴리텅스텐산나트륨 용액(도데실황산나트륨을 함유하는, 시트르산나트륨 완충 식염수 500 μL 당 500 mg 폴리텅스텐산나트륨)이었고, 1 μL 당 600,000개의 복합체의 농도로 복합체를 포함하였다. 제2 유체는 도데실황산나트륨을 함유하는 시트르산나트륨 완충 식염수이고, 1 μL 당 600,000개의 복합체의 농도로 복합체를 포함하였다.
제1 유체를 플로우 셀에 도입하고, 복합체를 플로우 셀의 상부 표면에 고정화시켰다. 이어서, 플로우 셀을 세척 용액으로 세척하였다. 제2 유체를 플로우 셀에 도입하고, 복합체를 플로우 셀의 저부 표면에 고정화시켰다. 각각의 표면에의 복합체의 부착을 앵커로 수행하였다(예를 들어, 비오틴을 갖는 상보적 프라이머를 겔 물질에 부착된 P5 프라이머에 하이브리디제이션하거나, 알킨-PEG-비오틴 링커를 클릭 화학을 사용하여 겔 물질 상의 유리 아지드에 공유 결합하였다).
도 10a는 복합체 고정화 후의 상부 표면의 명시야상을 예시하고, 도 10b는 복합체 고정화 후의 저부 표면의 명시야상을 예시한다. 각각의 명시야상의 어두운 부분은 고정화 복합체를 나타낸다.
도데실황산나트륨을 함유하는 시트르산나트륨 완충 식염수 중의 유리 비오틴을 도입하고, 플로우 셀을 약 80℃로 가열하여, 각각의 복합체로부터 라이브러리를 방출하였다. 이어서, 등온 증폭을 사용하여 클러스터링을 수행하였다. 클러스터를 사이톡스 그린(Sytox green)으로 염색하고, 생성된 상(본 명세서에서 재현되지 않음)으로부터, 주형 가닥의 클러스터가 플로우 셀의 시퀀싱 표면 각각에 형성되었음을 확인하였다.
이어서, 플로우 셀에서 시퀀싱을 수행하였다. 플로우 셀의 상부 및 저부 표면에 대해 수집된 시퀀싱 데이터 중 일부가 도 11a 및 도 11b에 도시되어 있다.
도 11a는 상부 및 저부 표면 상의 플로우 셀의 하나의 레인에 대한 분자 커버리지 히스토그램을 도시한다. 이 데이터는 레인에 대한 시퀀싱 커버리지의 범위 및 균일성을 보여준다.
도 11b는 상부 및 저부 표면 상의 플로우 셀의 하나의 레인에서 다양한 시퀀싱 사이클에 대하여 Q30보다 큰 Qscore의 비율을 나타낸다. 30의 Qscore(Q30)는 1/1000의 부정확한 염기 해독의 확률에 상당한다. 이는 염기 해독 정확도(즉, 정확한 염기 해독의 확률)가 99.9%임을 의미한다. 99%의 낮은 염기 해독 정확도(Q20)는 1/100의 부정확한 염기 해독의 확률을 가질 것이며, 이는 100개의 염기쌍 시퀀싱 리드마다 하나의 오류가 포함될 가능성이 있음을 의미한다. 시퀀싱 품질이 Q30에 도달할 때, 사실상 모든 리드가 완벽하게 되어, 오류 및 불명확성이 제로가 될 것이다. 도 11b에 도시된 바와 같이, Q30보다 높은 Qscore의 비율은 일반적으로 모든 시퀀싱 사이클에 대해 60% 내지 99%의 범위이었다.
수집된 모든 데이터는 보다 밀도가 높은 유체(본 실시예에서는 제1 유체)가 플로우 셀의 시퀀싱 표면에 적합함을 확인하였다.
실시예 2
평균 직경이 3 μm인, 도 1a에 나타낸 것과 유사한 복합체를 제조하였다. 복합체의 고상 지지체는 서모피셔 사이언티픽으로부터의 다이나비즈™ M-280 스트렙타비딘 비드이었다. 고상 지지체는 각각 밀도가 약 1.18 g/㎤이다. 특정 비드 상의 단편은 동일한 긴 DNA 분자(PhiX 게놈 유래)로부터 유래하였다.
본 실시예에서는, 다양한 농도의 포획 부위(즉, 알킨-PEG-비오틴 링커)를 사용하여 플로우 셀 레인(겔 물질로 코팅된 대향 표면을 가짐)을 제조하였다. 이러한 링커를 클릭 화학을 사용하여 플로우 셀 레인의 겔 물질 상의 유리 아지드에 공유 결합시켰다. 플로우 셀 레인을 세척하고, 약 0.5 μM, 약 5 μM 또는 약 25 μM의 농도를 갖는 알킨-PEG-비오틴 용액에 각각 노출시켰다. 용액을 약 60℃에서 약 30분간 인큐베이션시켰다. 이어서, 플로우 셀 레인을 다시 세척하였다.
복합체를 먼저 2개의 유체로 분할하였는데, 그 중 제1 유체는 밀도가 약 1 g/㎤이고, 제2 유체는 밀도가 약 2 g/㎤이었다. 제1 유체는 염화나트륨을 함유하는 시트르산나트륨 완충 식염수이고, 25,000개/μL의 농도로 복합체를 포함하였다. 제2 유체는 2 g/ml의 폴리텅스텐산나트륨 용액이며, 25,000개/μL의 농도로 복합체를 포함하였다.
제1 유체를 각각의 플로우 셀 레인에 도입하고, 복합체를 플로우 셀 레인의 저부 표면에 고정화시켰다. 흡인 속도는 100 μL/min이고, 제1 유체는 180초간 플로우 셀에 남아 있었다. 이어서, 플로우 셀을 세척 용액으로 세척하였다. 제2 유체를 각각의 플로우 셀 레인에 도입하고, 복합체를 플로우 셀 레인의 상부 표면에 고정화시켰다. 흡인 속도는 100 μL/ms이고, 제2 유체는 450초간 플로우 셀 레인에 남아 있었다. 이어서, 플로우 셀 레인을 세척 용액으로 세척하였다.
각각의 플로우 셀 레인의 저부 및 상부 표면을 이미지화하고, 각각의 표면 상의 고정화 복합체(비드)를 현미경 이미지를 사용하여 계수하였다.
저부 표면에 대한 ㎟ 당 비드 수는 도 12a에 나타내며, 상부 표면에 대한 ㎟ 당 비드 수는 도 12b에 나타낸다. 도 12a 및 도 12b의 각각의 막대에 대한 농도는 복합체 고정화 전에 플로우 셀을 준비하는데 사용되는 알킨-PEG-비오틴 농도(약 0.5 μM, 약 5 μM 또는 약 25 μM)를 나타낸다. 도시된 바와 같이, 알킨-PEG-비오틴 농도는 저부 표면 상의 고정화에 영향을 주지 않았는데, 그 이유는 이들 각각이 약 2,100개의 비드/㎟ 내지 약 2,300개의 비드/㎟를 가졌기 때문이었다. 상부 표면 상에 고정화된 복합체의 수는 약 550개의 비드/㎟ 내지 약 1,150개의 비드/㎟ 범위이므로, 저부 표면만큼 많지는 않았다. 상부 표면의 경우, 고 농도의 알킨-PEG-비오틴 링커로 처리된 레인은 그 위에 고정화된 복합체/비드의 수가 더 많았다.
이러한 결과는 더 무거운 유체가 상부 표면 상에 복합체를 고정화하는데 도움이 되며, 상부 표면 상의 포획 크기 농도를 증가시키는 것도 고정화에 도움이 될 수 있음을 보여준다.
실시예 3
평균 직경이 3 μm인, 도 1a에 나타낸 것과 유사한 복합체를 제조하였다. 복합체의 고상 지지체는 서모피셔 사이언티픽으로부터의 다이나비즈™ M-280 스트렙타비딘 비드이었다. 고상 지지체는 각각 밀도가 약 1.18 g/㎤이다. 특정 비드 상의 단편은 동일한 긴 DNA 분자(PhiX 게놈 유래)로부터 유래하였다.
본 실시예에서는, 포획 부위(즉, 알킨-PEG-비오틴 링커)를 사용하여 8개의 플로우 셀 레인(겔 물질로 코팅된 대향 표면을 가짐)을 제조하였다. 이러한 링커를 클릭 화학을 사용하여 플로우 셀 레인의 겔 물질 상의 유리 아지드에 공유 결합시켰다. 플로우 셀 레인을 세척하고, 약 5 μM의 농도를 갖는 알킨-PEG-비오틴 용액에 각각 노출시켰다. 용액을 약 60℃에서 약 30분간 인큐베이션시켰다. 이어서, 플로우 셀 레인을 다시 세척하였다.
복합체를 먼저 2개의 유체로 분할하였는데, 그 중 제1 유체는 밀도가 약 1 g/㎤이고, 제2 유체는 밀도가 약 2 g/㎤이었다. 제1 유체는 시트르산나트륨 완충액이고, 40,000개/μL의 농도로 복합체를 포함하였다. 제2 유체는 2 g/ml의 폴리텅스텐산나트륨 용액이며, 40,000개/μL의 농도로 복합체를 포함하였다.
제1 유체를 7개의 플로우 셀 레인에 도입하고, 복합체를 저부 표면에 고정화시켰다. 흡인 속도는 100 μL/min이고, 제1 유체는 240초간 각각의 레인에 남아 있었다. 이어서, 플로우 셀 레인을 세척 용액으로 세척하였다. 제2 유체를 7개의 플로우 셀 레인 각각에 도입하고, 복합체를 상부 표면에 고정화시켰다. 흡인 속도는 80 μL/ms 내지 100 μL/ms의 범위이고, 제2 유체는 300초간 플로우 셀에 남아 있었다. 이어서, 플로우 셀 레인을 세척 용액으로 세척하였다.
제8 레인에서, 유체를 각각 100 μL로 희석하고, 각각의 유체의 도입을 2회 수행하였다. 따라서, 레인 8은 이중 로딩을 가졌다.
각각의 플로우 셀 레인의 저부 및 상부 표면을 이미지화하고, 각각의 표면 상의 고정화 복합체(비드)를 계수하였다. 표 1은 각각의 플로우 셀 레인에 대한 ㎟ 당 평균 비드 수를 제공한다.
[표 1]
Figure pct00012
각각의 표면에 대한 복합체(비드)의 목표 수는 4,000개의 비드/㎟이었다. 레인 1 내지 7은 목표보다 약간 낮았지만, 이들 레인의 상부 및 저부 표면에 있는 복합체의 수는 비교적 일관되었다. 레인 8(이중 로딩에 노출됨)은 두 표면 상의 복합체의 목표 수를 초과하였다.
도 13a는 목표 비드 수, 및 입구(1)로부터 출구(5)까지의 플로우 셀 레인(1)의 길이를 따라 측정된 ㎟ 당 비드 수를 예시한다. 도 13b는 목표 비드 수, 및 입구(1)로부터 출구(5)까지의 플로우 셀 레인(7)의 길이를 따라 측정된 ㎟ 당 비드 수를 예시한다. 길이를 따라 동일한 거리에서 측정값을 취하였다. 이들 결과는 고정화가 상부 및 저부 표면 둘 다에서 플로우 채널 레인의 길이를 따라 비교적 일관됨을 나타낸다.
실시예 4
평균 직경이 3 μm인, 도 1a에 나타낸 것과 유사한 복합체를 제조하였다. 복합체의 고상 지지체는 서모피셔 사이언티픽으로부터의 다이나비즈™ M-280 스트렙타비딘 비드이었다. 고상 지지체는 각각 밀도가 약 1.18 g/㎤이다. 특정 비드 상의 단편은 동일한 긴 DNA 분자(PhiX 게놈 유래)로부터 유래하였다.
본 실시예에서는, 포획 부위(즉, 알킨-PEG-비오틴 링커)를 사용하여 10개의 플로우 셀 레인(겔 물질로 코팅된 대향 표면을 가짐)을 제조하였다. 이러한 링커를 클릭 화학을 사용하여 플로우 셀 레인의 겔 물질 상의 유리 아지드에 공유 결합시켰다. 플로우 셀 레인을 세척하고, 약 5 μM의 농도를 갖는 알킨-PEG-비오틴 용액에 각각 노출시켰다. 용액을 약 60℃에서 약 30분간 인큐베이션시켰다. 이어서, 플로우 셀 레인을 다시 세척하였다.
복합체를 먼저 2개의 유체로 분할하였는데, 그 중 제1 유체는 밀도가 약 1 g/㎤이고, 제2 유체는 밀도가 약 2 g/㎤이었다. 제1 유체는 시트르산나트륨 완충액이고, 50 μL 당 10 ㎍의 농도로 복합체를 포함하였다. 제2 유체는 2 g/ml의 폴리텅스텐산나트륨 용액이며, 50 μL 당 12.5 ㎍의 농도로 복합체를 포함하였다.
제1 유체를 10개의 플로우 셀 레인에 도입하고, 복합체를 저부 표면에 고정화시켰다. 흡인 속도는 100 μL/min이고, 제1 유체는 300초간 각각의 레인에 남아 있었다. 이어서, 플로우 셀 레인을 세척 용액으로 세척하였다. 제2 유체를 10개의 플로우 셀 레인 각각에 도입하고, 복합체를 상부 표면에 고정화시켰다. 흡인 속도는 80 μL/ms이고, 제2 유체는 360초간 플로우 셀에 남아 있었다. 이어서, 플로우 셀 레인을 세척 용액으로 세척하였다.
각각의 플로우 셀 레인의 저부 및 상부 표면을 이미지화하고, 각각의 표면 상의 고정화 복합체(비드)를 계수하였다.
도 14는 목표 비드 수, 및 입구(1)로부터 출구(10)까지의 하나의 플로우 셀 레인의 길이를 따라 측정된 ㎟ 당 비드 수를 나타낸다. 도 14는 또한 상부 표면 및 저부 표면 데이터에 대한 선형 피트(linear fit)를 예시한다. 이들 결과는 본 명세서에 개시된 방법의 예에 따라 복합체가 도입될 때 고정화가 플로우 채널의 상부 및 저부 표면의 길이를 따라 비교적 일관됨을 나타낸다.
실시예 5
평균 직경이 3 μm인, 도 1a에 나타낸 것과 유사한 복합체를 제조하였다. 복합체의 고상 지지체는 서모피셔 사이언티픽으로부터의 다이나비즈™ M-280 스트렙타비딘 비드이었다. 고상 지지체는 각각 밀도가 약 1.18 g/㎤이다. 특정 비드 상의 단편은 동일한 긴 DNA 분자(PhiX 게놈 유래)로부터 유래하였다. 라이브러리 단편을 비드 표면 상의 스트렙타비딘에 대하여 비오틴보다 약한 친화성을 갖는 데스티오비오틴 올리고를 통해 고상 지지체에 부착하였다.
본 실시예에서는, 포획 부위(즉, 알킨-PEG-비오틴 링커)를 사용하여 8개의 플로우 셀 레인(겔 물질로 코팅된 대향 표면을 가짐)을 제조하였다. 이러한 링커를 클릭 화학을 사용하여 플로우 셀 레인의 겔 물질 상의 유리 아지드에 공유 결합시켰다. 플로우 셀 레인을 세척하고, 약 5 μM의 농도를 갖는 알킨-PEG-비오틴 용액에 각각 노출시켰다. 용액을 약 60℃에서 약 30분간 인큐베이션시켰다. 이어서, 플로우 셀 레인을 다시 세척하였다.
복합체를 먼저 2개의 유체로 분할하였는데, 그 중 제1 유체는 밀도가 약 1 g/㎤이고, 제2 유체는 밀도가 약 2 g/㎤이었다. 제1 유체는 시트르산나트륨 완충액이고, 50 μL 당 10 ㎍의 농도로 복합체를 포함하였다. 제2 유체는 2 g/ml의 폴리텅스텐산나트륨 용액이며, 50 μL 당 12.5 ㎍의 농도로 복합체를 포함하였다.
제1 유체를 8개의 플로우 셀 레인에 도입하고, 복합체를 저부 표면에 고정화시켰다. 흡인 속도는 100 μL/min이고, 제1 유체는 240초간 각각의 레인에 남아 있었다. 이어서, 플로우 셀 레인을 세척 용액으로 세척하였다. 제2 유체를 8개의 플로우 셀 레인 각각에 도입하고, 복합체를 상부 표면에 고정화시켰다. 흡인 속도는 80 μL/ms 내지 100 μL/ms의 범위이고, 제2 유체는 300초간 플로우 셀에 남아 있었다. 이어서, 플로우 셀 레인을 세척 용액으로 세척하였다.
각각의 플로우 셀 레인의 저부 및 상부 표면을 이미지화하고, 각각의 표면 상의 고정화 복합체(비드)를 계수하였다.
시트르산나트륨 완충액 중의 유리 비오틴을 도입하고, 플로우 셀을 약 80℃로 가열하여, 각각의 복합체로부터 라이브러리를 방출하였다. 브리지 증폭을 사용하여 클러스터링을 수행하였다. 이어서, 플로우 셀에서 시퀀싱을 수행하였다. 수집된 시퀀싱 데이터는 통과 필터(passing filter; % PF)(백분율)를 포함하였다. 통과 필터(PF)는 채스터티 임계값(chastity threshold)을 통과하고, 시퀀싱 데이터의 추가 처리 및 분석에 사용되는 클러스터를 설명하는 데 사용되는 메트릭(metric)이다. % 통과 필터 결과가 높을수록 시퀀싱 데이터에 사용되는 고유 클러스터의 수율이 증가함을 나타낸다.
표 2는 각각의 플로우 셀 레인에 대한 ㎟ 당 평균 비드 수 및 각각의 레인에 대한 PF 데이터를 제공한다.
[표 2]
Figure pct00013
레인 1 내지 7의 각각의 표면에 대한 복합체(비드)의 목표 수는 4,000개의 비드/㎟(총 8,000개의 비드/㎟)이었다. 레인 8의 각각의 표면에 대한 복합체(비드)의 목표 수는 5,500개의 비드/㎟(총 11,000개의 비드/㎟)이었다. 레인 1 내지 8은 목표보다 약간 낮았지만, 이들 레인의 상부 및 저부 표면에 있는 복합체의 총수는 비교적 일관되었다. 통과 필터 데이터는 대부분의 나노웰이 단일클론 클러스터에 의해 점유되었음을 나타내었다.
보충 주석
또한, 본 명세서에 제공된 범위는 명시적으로 언급된 것처럼, 언급된 범위 및 언급된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 약 2 mm 내지 약 300 mm로 나타낸 범위는 약 2 mm 내지 약 300 mm의 명시적으로 언급된 한계뿐만 아니라, 약 15 mm, 22.5 mm, 245 mm 등과 같은 개별 값, 및 약 20 mm 내지 약 225 mm 등과 같은 하위 범위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
하기에 더 상세히 논의되는 전술한 개념들 및 추가의 개념들의 모든 조합은 (그러한 개념들이 상호 불일치하지 않는다면) 본 명세서에 개시된 발명 요지의 일부인 것으로 고려됨이 이해되어야 한다. 특히, 본 명세서의 끝부분에 나타나는 청구된 발명 요지의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 발명 요지의 일부인 것으로 고려된다. 참고로 포함된 임의의 개시내용에서 또한 나타날 수 있는 본 명세서에서 명시적으로 사용된 용어는 본 명세서에 개시된 특정 개념과 가장 일치하는 의미가 부여되어야 함이 또한 이해되어야 한다.
몇몇 예가 상세하게 설명되었지만, 개시된 예는 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 전술한 설명은 비제한적인 것으로 여겨져야 한다.

Claims (44)

  1. 플로우 셀(flow cell)의 2개의 대향 시퀀싱 표면(opposed sequencing surface) 각각에 표적 물질을 고정화하는 것을 포함하는 방법으로서, 상기 고정화는,
    내부에 표적 물질의 제1 부분을 포함하는 제1 유체를 플로우 셀에 도입하여, 표적 물질의 적어도 일부가 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 하나의 표면 상의 포획 부위에 의해 고정화되는 단계;
    플로우 셀로부터 제1 유체 및 임의의 비고정화 표적 물질을 제거하는 단계; 및
    내부에 표적 물질의 제2 부분을 포함하는 제2 유체를 플로우 셀에 도입하여, 표적 물질의 적어도 일부가 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 다른 하나의 표면 상의 포획 부위에 의해 고정화되는 단계를 포함하며;
    제1 유체는 표적 물질의 밀도보다 작은 밀도를 갖고, 제2 유체는 표적 물질의 밀도보다 큰 밀도를 갖거나;
    제2 유체는 표적 물질의 밀도보다 작은 밀도를 갖고, 제1 유체는 표적 물질의 밀도보다 큰 밀도를 갖는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 표적 물질의 밀도보다 작은 밀도를 갖는 제1 또는 제2 유체는 완충 수용액이고, 표적 물질의 밀도보다 큰 밀도를 갖는 제2 또는 제1 유체는 폴리텅스텐산나트륨 용액 또는 염화나트륨 용액인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포획 온도에서의 제1 또는 제2 유체의 밀도는 포획 온도에서의 표적 물질의 밀도보다 적어도 0.1 g/㎤ 더 작고, 포획 온도에서의 제2 또는 제1 유체의 밀도는 포획 온도에서의 표적 물질의 밀도보다 적어도 0.1 g/㎤ 더 큰, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 물질의 밀도보다 작은 제1 또는 제2 유체의 밀도는 포획 온도에서 약 1 g/㎤이고, 표적 물질의 밀도보다 큰 제2 또는 제1 유체의 밀도는 포획 온도에서 약 2 g/㎤인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 플로우 셀로부터 제1 유체 및 임의의 비고정화 표적 물질을 제거하기 전에 소정 시간이 경과하도록 하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 하나의 표면에 고정화된 표적 물질은 제2 유체가 도입될 때 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 하나의 표면에 고정화된 상태로 남아있는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 물질은,
    고상 지지체; 및
    고상 지지체에 부착된 시퀀싱 레디(sequencing-ready) 핵산 단편을 포함하는 복합체인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    플로우 셀로부터 제2 유체 및 임의의 비고정화 복합체를 제거하는 단계;
    고정화 복합체의 고상 지지체로부터 시퀀싱 레디 핵산 단편의 방출을 개시하여, 적어도 일부의 시퀀싱 레디 핵산 단편을 2개의 대향 시퀀싱 표면의 각각의 프라이머에 시딩(seeding)하는 단계;
    고상 지지체 및 시딩되지 않은 시퀀싱 레디 핵산 단편을 제거하는 단계;
    액체 형태의 온도 반응성 물질을 포함하는 증폭 혼합물을 플로우 셀에 도입하는 단계;
    액체 형태의 온도 반응성 물질을 겔화하는 단계;
    시딩된 시퀀싱 레디 핵산 단편의 증폭을 개시하여 주형 가닥을 생성하여, 겔 형태의 온도 반응성 물질이 주형 가닥의 확산을 감소시키는 단계;
    겔 형태의 온도 반응성 물질을 액화시키는 단계; 및
    플로우 셀로부터 액체 형태의 온도 반응성 물질을 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 온도 반응성 물질은 폴리(N-아이소프로필아크릴아미드)와 폴리에틸렌 글리콜의 공중합체인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 표적 물질은,
    고상 지지체; 및
    고상 지지체에 부착된 주형 가닥의 클러스터(cluster)를 포함하는 클러스터링된 고상 지지체인, 방법.
  11. 내부에 표적 물질을 포함하는 제조 유체;
    표적 물질의 밀도보다 작은 밀도를 갖는 제1 도입 유체; 및
    표적 물질의 밀도보다 큰 밀도를 갖는 제2 도입 유체를 포함하는 키트.
  12. 제11항에 있어서, 제1 도입 유체는 완충 수용액이고, 제2 도입 유체는 폴리텅스텐산나트륨 용액 또는 염화나트륨 용액인 키트.
  13. 제12항에 있어서, 제2 도입 유체는 폴리텅스텐산나트륨 용액이고, 폴리텅스텐산나트륨 용액은 물 1 밀리리터당 약 1 그램의 폴리텅스텐산나트륨의 농도를 갖는 키트.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 포획 온도에서의 제1 도입 유체의 밀도는 포획 온도에서의 표적 물질의 밀도보다 적어도 0.1 g/㎤ 더 작고, 포획 온도에서의 제2 도입 유체의 밀도는 포획 온도에서의 표적 물질의 밀도보다 적어도 0.1 g/㎤ 더 큰 키트.
  15. 제11항 또는 제14항에 있어서, 제1 도입 유체의 밀도는 포획 온도에서 약 1 g/㎤이고, 제2 도입 유체의 밀도는 포획 온도에서 약 2 g/㎤인 키트.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 대향 시퀀싱 표면을 갖는 플로우 셀을 추가로 포함하는 키트.
  17. 제16항에 있어서, 각각의 대향 시퀀싱 표면은,
    폴리머 하이드로겔;
    폴리머 하이드로겔에 부착된 증폭 프라이머; 및
    화학적 포획 부위를 포함하는 키트.
  18. 제17항에 있어서,
    화학적 포획 부위는 결합쌍의 하나의 구성원이고;
    표적 물질은 결합쌍의 다른 구성원으로 코팅된 고상 지지체인 키트.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 물질은,
    고상 지지체; 및
    고상 지지체에 부착된 시퀀싱 레디 핵산 단편을 포함하는 복합체인 키트.
  20. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 물질은,
    고상 지지체; 및
    고상 지지체에 부착된 주형 가닥의 클러스터를 포함하는 클러스터링된 고상 지지체인 키트.
  21. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 형태의 온도 반응성 물질을 포함하는 증폭 혼합물을 추가로 포함하는 키트.
  22. 표적 물질을 포함하는 유체를 플로우 셀에 도입하는 단계
    - 여기서, 표적 물질은
    자성 고상 지지체; 및
    자성 고상 지지체에 부착된 시퀀싱 레디 핵산 단편 또는 주형 가닥을 포함하며,
    유체는 자성 고상 지지체의 밀도와 적어도 거의 동일한 밀도를 가짐 -;
    표적 물질의 일부를 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 하나의 표면 상의 포획 부위에 의해 고정화시키는 단계; 및
    자기력을 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 다른 하나의 표면에 인가하여, 표적 물질의 다른 일부를 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 다른 하나의 표면에 끌어당겨, 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 다른 하나의 표면 상의 포획 부위에 의해 고정화시키는 단계에 의해, 플로우 셀의 2개의 대향 시퀀싱 표면 각각에 표적 물질을 고정화하는 것을 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 유체의 밀도는 자성 고상 지지체의 밀도의 0.08 g/㎤ 이내인, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 유체는 완충 수용액인, 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 소정 시간이 유체의 도입과 자기력의 인가 사이에 경과되고, 소정 시간은 약 5초 내지 약 2분간의 범위인, 방법.
  26. 제20 항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 자기력의 인가는 자성 입자가 매립된 엘라스토머 스트립을 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 다른 하나의 표면에 인접한 플로우 셀의 외부 표면에 배치하는 것을 포함하는, 방법.
  27. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    자기력의 인가를 중단하는 단계;
    플로우 셀로부터 유체 및 비고정화 복합체를 제거하는 단계;
    고정화 복합체의 고상 지지체로부터 시퀀싱 레디 핵산 단편의 방출을 개시하여, 적어도 일부의 시퀀싱 레디 핵산 단편을 2개의 대향 시퀀싱 표면의 각각의 프라이머에 시딩하는 단계;
    고상 지지체 및 시딩되지 않은 시퀀싱 레디 핵산 단편을 제거하는 단계;
    액체 형태의 온도 반응성 물질을 포함하는 증폭 혼합물을 플로우 셀에 도입하는 단계;
    액체 형태의 온도 반응성 물질을 겔화하는 단계;
    시딩된 시퀀싱 레디 핵산 단편의 증폭을 개시하여 주형 가닥을 생성하여, 겔 형태의 온도 반응성 물질이 주형 가닥의 확산을 감소시키는 단계;
    겔 형태의 온도 반응성 물질을 액화시키는 단계; 및
    플로우 셀로부터 액체 형태의 온도 반응성 물질을 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 온도 반응성 물질은 폴리(N-아이소프로필아크릴아미드)와 폴리에틸렌 글리콜의 공중합체인, 방법.
  29. 시퀀싱 레디 핵산 단편을 플로우 셀에 도입하여, 시퀀싱 레디 핵산 단편의 적어도 일부를 플로우 셀의 시퀀싱 표면 상의 각각의 프라이머에 시딩하는 단계;
    플로우 셀로부터 시딩되지 않은 시퀀싱 레디 핵산 단편을 제거하는 단계;
    액체 형태의 온도 반응성 물질을 포함하는 증폭 혼합물을 플로우 셀에 도입하는 단계;
    액체 형태의 온도 반응성 물질을 겔화하는 단계;
    시딩된 시퀀싱 레디 핵산 단편의 증폭을 개시하여 주형 가닥을 생성하여, 겔 형태의 온도 반응성 물질이 주형 가닥의 확산을 감소시키는 단계;
    겔 형태의 온도 반응성 물질을 액화시키는 단계; 및
    플로우 셀로부터 액체 형태의 온도 반응성 물질을 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 온도 반응성 물질은 폴리(N-아이소프로필아크릴아미드)와 폴리에틸렌 글리콜의 공중합체인, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 시퀀싱 레디 핵산 단편은 플로우 셀에 도입될 때 고상 지지체에 부착되며, 추가로 고상 지지체로부터 시퀀싱 레디 핵산 단편을 방출시키는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제1 표적 물질 및 제2 표적 물질을 포함하는 표적 유체를 플로우 셀에 도입하여, 플로우 셀의 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제1 표면에는 제1 표적 물질을, 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제2 표면에는 제2 표적 물질을 동시에 고정화하는 것을 포함하는 방법으로서,
    여기서 표적 유체의 캐리어 유체는 유체 밀도를 갖고;
    제1 표적 물질은 유체 밀도보다 작은 제1 밀도를 갖고;
    제2 표적 물질은 유체 밀도보다 큰 제2 밀도를 갖는, 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    제1 표적 물질의 적어도 일부는 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제1 표면 상의 각각의 포획 부위에 의해 고정화되고;
    제2 표적 물질의 적어도 일부는 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제2 표면 상의 각각의 포획 부위에 의해 고정화되는, 방법.
  34. 유체 밀도를 갖는 캐리어 유체;
    유체 밀도보다 작은 제1 밀도를 갖는 제1 표적 물질; 및
    유체 밀도보다 큰 제2 밀도를 갖는 제2 표적 물질을 포함하는 표적 유체.
  35. 제34항에 있어서,
    제1 표적 물질은,
    제1 밀도와 거의 동일한 제1 고상 지지체 밀도를 갖는 제1 고상 지지체; 및
    제1 고상 지지체에 부착된 시퀀싱 레디 핵산 단편을 포함하며;
    제2 표적 물질은,
    제2 밀도와 거의 동일한 제2 고상 지지체 밀도를 갖는 제2 고상 지지체; 및
    제2 고상 지지체에 부착된 시퀀싱 레디 핵산 단편을 포함하는 표적 유체.
  36. 제34항에 있어서,
    제1 표적 물질은,
    제1 밀도와 거의 동일한 제1 고상 지지체 밀도를 갖는 제1 고상 지지체; 및
    제1 고상 지지체에 부착된 주형 가닥의 제1 클러스터를 포함하며;
    제2 표적 물질은,
    제2 밀도와 거의 동일한 제2 고상 지지체 밀도를 갖는 제2 고상 지지체; 및
    제2 고상 지지체에 부착된 주형 가닥의 제2 클러스터를 포함하는 표적 유체.
  37. 2개의 대향 시퀀싱 표면을 포함하는 플로우 셀에 제1 및 제2 표적 물질을 도입하는 단계 - 여기서, 제1 표적 물질은 제2 표적 물질과 상이한 적어도 하나의 특성을 가지며, 적어도 하나의 특성은 밀도, 전하, 자성 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택됨 -; 및
    제1 및 제2 표적 물질을 적어도 하나의 조건에 노출시켜, 제1 표적 물질을 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제1 표면 상의 포획 부위에 의해 고정화시키고, 제2 표적 물질을 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제2 표면 상의 포획 부위에 의해 고정화시키는 단계를 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    제1 표적 물질은 음전하를 갖고;
    제2 표적 물질은 양전하를 가지며;
    적어도 하나의 조건은 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제1 표면에 양전하를 생성하고 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제2 표면에 음전하를 생성하도록 2개의 대향 시퀀싱 표면 사이에 인가되는 전계인, 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    제1 표적 물질은 카르복실화된 고상 지지체, 폴리글루탐산 코팅된 고상 지지체 및 설페이트 작용화된 고상 지지체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    제2 표적 물질은 아민 작용화된 고상 지지체인, 방법.
  40. 제37항에 있어서,
    제1 및 제2 표적 물질은 제1 밀도를 갖는 유체의 플로우 셀에 도입되고;
    제1 표적 물질은 자성이며;
    제2 표적 물질은 비자성이고, 제1 밀도보다 큰 밀도를 가지며;
    적어도 하나의 조건은 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제1 표면에 제1 표적 물질을 끌어당기도록 인가되는 자계인, 방법.
  41. 제37항에 있어서,
    제1 및 제2 표적 물질은 제1 밀도를 갖는 유체의 플로우 셀에 도입되고;
    제1 표적 물질은 비자성이고, 제1 밀도보다 작은 밀도를 가지며;
    제2 표적 물질은 자성이고;
    적어도 하나의 조건은 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제2 표면에 제2 표적 물질을 끌어당기도록 인가되는 자계인, 방법.
  42. 제37항에 있어서,
    제1 및 제2 표적 물질은 제1 밀도를 갖는 유체의 플로우 셀에 도입되고;
    제1 표적 물질은 음으로 하전되며;
    제2 표적 물질은 하전되지 않고, 제1 밀도보다 큰 밀도를 가지며;
    적어도 하나의 조건은 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제1 표면에 양전하를 생성하고 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제2 표면에 음전하를 생성하도록 2개의 대향 시퀀싱 표면 사이에 인가되는 전계인, 방법.
  43. 제37항에 있어서,
    제1 및 제2 표적 물질은 제1 밀도를 갖는 유체의 플로우 셀에 도입되고;
    제1 표적 물질은 양으로 하전되며;
    제2 표적 물질은 하전되지 않고, 제1 밀도보다 큰 밀도를 가지며;
    적어도 하나의 조건은 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제1 표면에 음전하를 생성하고 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제2 표면에 양전하를 생성하도록 2개의 대향 시퀀싱 표면 사이에 인가되는 전계인, 방법.
  44. 제37항에 있어서,
    제1 및 제2 표적 물질은 제1 밀도를 갖는 유체의 플로우 셀에 도입되고;
    제1 표적 물질은 하전되지 않고, 제1 밀도보다 작은 밀도를 가지며;
    제2 표적 물질은 양으로 하전되고;
    적어도 하나의 조건은 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제1 표면에 양전하를 생성하고 2개의 대향 시퀀싱 표면 중 제2 표면에 음전하를 생성하도록 2개의 대향 시퀀싱 표면 사이에 인가되는 전계인, 방법.
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