CN116732003A - 工程化核酸酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了用于编辑活细胞的工程化核酸酶及其应用。

Description

工程化核酸酶及其应用
技术领域
本发明涉及用于编辑活细胞的工程化核酸酶及其应用。
背景技术
在以下讨论中，将出于背景和介绍的目的描述某些文章和方法。本文包含的任何内容不被解释为对现有技术的“承认”。本申请人明确地保留根据情况证明根据可适用的法定条文由本文引用的方法不构成现有技术的权利。
对活细胞基因组进行精确、靶向的改变的能力一直是生物医学研究和开发的长期目标。最近，已经鉴定了各种允许操作基因序列并因此操作基因功能的核酸酶。这些核酸酶包括核酸指导的核酸酶。然而，核酸指导的核酸酶可以识别的靶序列的范围受特定前间区邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)需要定位于期望的靶序列附近的限制。PAM是由gRNA/核酸酶复合体识别的短核苷酸序列，其中该复合体指导活细胞中靶序列的编辑。用于不同的核酸指导的核酸酶的精确的PAM序列和长度要求不同；然而，PAM通常是与靶序列邻近或接近的2-7个碱基对序列，并且取决于核酸酶，可以在靶序列的5’或3’。核酸指导的核酸酶的工程化可以允许改变PAM的偏好，允许在不同生物体中的编辑优化和/或改变酶的保真度；可能增加特定核酸指导的核酸酶对某些编辑任务的多功能性(versatility)的所有改变。
因此，在核酸指导的核酸酶基因编辑领域中存在对改进的核酸酶的需求，如专利CN111511906A、CN113227368A等。本文描述的工程化核酸酶同样满足了这一需求。
发明简述
提供该概述是为了以简化的形式介绍概念的选择，所述概念在下文的详述中进一步描述。该概述既不意图确定所要求保护的主题的关键或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优势将是从下面撰写的详述，包括附图中阐明的和所附的权利要求中限定的那些方面明显的。
本发明提供一种工程化核酸酶，其包含与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比具有下述突变的氨基酸序列：在第169位氨基酸由赖氨酸突变为精氨酸。
在一个具体实施方式中，所述氨基酸序列还具有选自下组的一个或多个突变：在第589位氨基酸由天冬酰胺突变为其他任何氨基酸，优选组氨酸；在第535位氨基酸由赖氨酸突变为其他任何氨基酸，优选精氨酸；在第563位氨基酸由赖氨酸突变为其他任何氨基酸，优选精氨酸；在第601位氨基酸由苏氨酸突变为其他任何氨基酸，优选精氨酸；在第624位氨基酸由丝氨酸突变为其他任何氨基酸，优选精氨酸。
在另一个具体实施方式中，所述氨基酸序列进一步与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性。
本发明还提供一种工程化核酸酶，其包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQID NO:14。
在另一个具体实施方式中，所述工程化核酸酶与具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核酸酶相比，在酵母中的编辑活性提高。
本发明还提供一种酶混合物，所述酶混合物包含所述的工程化核酸酶中的一个或两个以上组合。
本发明还提供一种修饰细胞基因组中的靶区域的方法，所述方法包括：
(a)使细胞与以下接触：
所述的工程化核酸酶；
工程化引导核酸，所述工程化引导核酸能够与所述核酸酶复合；和
编辑序列，所述编辑序列编码与所述靶区域互补的、相对于所述靶区域具有序列改变的核酸；以及
(b)允许所述核酸酶、引导核酸和编辑序列在所述细胞基因组的靶区域中创建基因组编辑。
在一个具体实施方式中，其中所述工程化引导核酸和所述编辑序列作为单一核酸提供。
在另一个具体实施方式中，其中所述单一核酸还在前间区序列邻近基序(PAM)位点中包含突变。
本发明还提供一种核酸引导性核酸酶***，所述核酸引导性核酸酶***包括：
(a)所述的工程化核酸酶；
(b)工程化引导核酸，所述工程化引导核酸能够与所述核酸酶复合；和
(c)编辑序列，所述编辑序列相对于细胞基因组中的靶区域的序列具有序列改变；
其中所述***通过所述核酸酶、所述工程化引导核酸和所述编辑序列促成在所述细胞基因组的靶区域中产生基因组编辑。
在一个具体实施方式中，其中所述工程化引导核酸和所述编辑序列作为单一核酸提供。
在另一个具体实施方式中，其中所述单一核酸还在前间区序列邻近基序(PAM)位点中包含突变。
本发明还提供一种组合物，所述组合物包含：
(a)所述的工程化核酸酶；和
(b)工程化引导核酸，所述工程化引导核酸能够与所述核酸酶复合，其中所述工程化引导核酸包含环序列，所述环序列包含以下序列：UAUU、UUUU、UGUU、UCUU、UCUUU或UAGU。
在一个具体实施方式中，所述工程化引导核酸是异源工程化引导核酸。
在另一个具体实施方式中，所述核酸酶由为了在来自特定生物体的细胞中使用而被密码子优化的核酸序列编码。
本发明还提供一种核酸引导性核酸酶***，所述核酸引导性核酸酶***包括：
(a)所述的工程化核酸酶；和
(b)异源工程化引导核酸，所述异源性的工程化引导核酸能够与所述核酸酶复合。
在一个具体实施方式中，所述***还包括(c)编辑序列，所述编辑序列相对于靶区域的序列具有序列改变。
在另一个具体实施方式中，所述靶向***通过所述核酸酶、所述异源工程化引导核酸和所述编辑序列促成在靶区域中产生编辑。
在另一个具体实施方式中，所述工程化引导核酸包含环序列，所述环序列包含以下序列：UAUU、UUUU、UGUU、UCUU、UCUUU或UAGU。
在另一个具体实施方式中，所述核酸酶由为了在来自特定生物体的细胞中使用而被密码子优化的核酸序列编码。
本发明还提供一种用于基因编辑的试剂盒，所述试剂盒包括所述的工程化核酸酶。
本发明还提供所述的工程化核酸酶在制备制剂或试剂盒中的用途，所述制剂或试剂盒用于：(i)基因组编辑；(ii)靶核酸诊断；(iii)疾病的治疗。
下面更详细地描述本发明的这些方面和其他特征和优势。
附图说明
图1代表突变体K169R及野生型dMad7(WT)在TDO/-Trp/-Leu/-Ura平板上对AbA的激活强度。
图2代表dMad7各突变体对3-AT抗性。
图3代表Mad7双突变体体外酶活测定。
图4代表Mad7突变体在水稻原生质体中对OsPPO1基因的编辑测序结果。
图5代表Mad7突变体在水稻原生质体中对OsYSA基因的编辑测序结果。
图6中上图代表Mad7-K169R/N589H突变体对水稻基因OsGDI1的编辑结果；下图代表Mad7-K169R/N589H突变体对水稻基因S-OsGDI1的编辑结果。
图7代表Mad7-K169R/N589H在大豆毛根***中的编辑效率测试结果。
图8代表Mad7-K169R/N589H在斑马鱼酪氨酸酶基因(tyr)中的编辑测序结果。
图9代表Mad7-K169R/N589H在猪SOCS2基因中的编辑测序结果。
序列号 名称
SEQ ID NO:1 Mad7
SEQ ID NO:2 Mad7-K169R
SEQ ID NO:3 Mad7-K169R/N589H
SEQ ID NO:4 dMad7
SEQ ID NO:5 dMad7-K169R
SEQ ID NO:6 dMad7-K169R/K535R
SEQ ID NO:7 dMad7-K169R/K563R
SEQ ID NO:8 dMad7-K169R/N589H
SEQ ID NO:9 dMad7-K169R/T601R
SEQ ID NO:10 dMad7-K169R/S624R
SEQ ID NO:11 Mad7-K169R/K535R
SEQ ID NO:12 Mad7-K169R/K563R
SEQ ID NO:13 Mad7-K169R/T601R
SEQ ID NO:14 Mad7-K169R/S624R
发明详述
下文结合所附的附图阐述的描述意图描述所公开主题的多种说明性实施方案。结合每种说明性实施方案描述了特定特征和功能；然而，对本领域技术人员将明显的是，所公开的实施方案可以在没有这些特定特征和功能的每一种的情况下实践。此外，除非明确声明或者特征或功能与另外的实施方案不兼容，否则结合一种实施方案描述的所有功能意图适用于本文描述的另外的实施方案。例如，除非特征或功能与替代实施方案不兼容，否则在结合一种实施方案明确描述给定特征或功能但没有结合替代实施方案明确提及的情况下，应当理解，该特征或功能可以结合替代实施方案来部署、利用或实现。
除非另外指出，否则本文描述的技术的实践可以采用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学、生物乳液产生和测序技术的常规技术和描述，这些都在本领域从业的人员的技术内。这样的常规的技术包括聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接以及使用标记物的杂交检测。合适的技术的具体的说明可以通过参考本文的实例获得。然而，当然，也可以使用其他等同的常规程序。这样的常规技术和描述可以见于标准实验室手册，诸如Green等人编著(1999),Genome Analysis:A Laboratory ManualSeries(卷I-IV)；Weiner,Gabriel,Stephens,编著(2007),Genetic Variation:ALaboratory Manual；Dieffenbach,Dveksler,编著(2003),PCR Primer:A LaboratoryManual；Bowtell和Sambrook(2003),DNA Microarrays:A Molecular Cloning Manual；Mount(2004),Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis；Sambrook和Russell(2006),Condensed Protocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual；以及Sambrook和Russell(2002),Molecular Cloning:A Laboratory Manual(全部来自ColdSpring Harbor Laboratory Press)；Stryer,L.(1995)Biochemistry(第4版)W.H.Freeman,New York N.Y.；Gait,“Oligonucleotide Synthesis:A PracticalApproach”1984,IRL Press,London；Nelson和Cox(2000),Lehninger,Principles ofBiochemistry第3版,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.；Berg等人(2002)Biochemistry,第5版,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.；Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths,编著,John Wiley&Sons 1998)；Mammalian Chromosome Engineering–Methods and Protocols(G.Hadlaczky,编著,Humana Press 2011)；Essential Stem Cell Methods,(Lanza和Klimanskaya,编著,Academic Press 2011)，所有文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。核酸酶特异性技术可以见于，例如，Genome Editing and Engineering From TALENs and CRISPRs toMolecular Surgery,Appasani和Church,2018；以及CRISPR:Methods and Protocols,Lindgren和Charpentier,2015；这两篇文献出于所有目的通过引用以其整体并入本文。酶工程化的基本方法可以见于，Enzyme Engineering Methods and Protocols,Samuelson,编著,2013；Protein Engineering,Kaumaya,编著,(2012)；以及Kaur和Sharma,“DirectedEvolution:An Approach to Engineer Enzymes”,Crit.Rev.Biotechnology,26:165-69(2006)。
注意，除非上下文另外清楚指出，否则如本文和所附的权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“寡核苷酸”是指一种或更多种寡核苷酸，并且提及“自动化***”包括提及用于与本领域技术人员已知的***一起使用的等同步骤和方法，等等。另外地，应当理解，本文可以使用的术语诸如“左”、“右”、“顶”、“底”、“前”、“后”、“侧”、“高度”、“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“内部(interior)”、“外部(exterior)”、“内(inner)”、“外(outer)”等仅描述参考点，并且不必然将本公开内容的实施方案限制为任何特定的方向或配置。此外，术语诸如“第一”、“第二”、“第三”等，仅标识如本文公开的许多部分、组件、步骤、操作、功能和/或参考点中的一个，并且同样不必然将本公开内容的实施方案限制为任何特定的配置或方向。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同含义。本文提及的所有的出版物为了描述和公开可以与本文描述的发明结合使用的设备、方法和细胞群体的目的，以引用方式并入。
在提供值的范围情况下，应理解，在该范围的上限值和下限值之间的每一个中间值和该规定的范围内的任何其他规定的值或中间值被涵盖在本发明内。这些较小的范围的上限值和下限值可以独立地被包括在较小的范围内，并且也被涵盖在本发明内，受限于规定的范围内的任何特定地排除的限值。在规定的范围包括限值中的一个或两个的情况下，将那些所包括的限值中的任一个或两个排除的范围也被包括在本发明中。
在以下的描述中，阐述了许多具体细节，以提供对本发明的更充分理解。然而，对本领域普通技术人员将明显的是，可以在没有一个或更多个这些具体细节的情况下，实践本发明。在其他情况下，为了避免使本发明含混不清，尚未描述本领域技术人员熟知的特征和熟知的程序。
如本文使用的术语“互补”是指核苷酸之间的Watson-Crick碱基配对，并且特别地是指彼此氢键合的核苷酸，其中胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键与腺嘌呤残基连接，并且胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接。通常，核酸包含被描述为与指定的第二核苷酸序列具有“互补性百分比”或“同源性百分比”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以与指定的第二核苷酸序列具有80％、90％或100％的互补性，指示序列的10个核苷酸中的8个、10个核苷酸中的9个或10个核苷酸中的10个与指定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3’-TCGA-5’与核苷酸序列5’-AGCT-3’是100％互补的；并且核苷酸序列3’-TCGA-5’与核苷酸序列5’-TTAGCTGG-3’的区域是100％互补的。
术语DNA“控制序列”统指启动子序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点、核定位序列、增强子等，它们共同地提供编码序列在接受者细胞中的复制、转录和翻译。只要选择的编码序列能够在适当的宿主细胞中被复制、转录和(对于一些组分)翻译，则并非所有这些类型的控制序列都需要存在。
如本文使用的，术语“供体DNA”或“供体核酸”是指被设计成通过使用核酸指导的核酸酶的同源重组将DNA序列修饰(***、缺失、取代)引入基因座的核酸。对于同源指导的修复，供体DNA必须与基因组靶序列中的“切割位点”或待编辑位点侧翼的区具有足够的同源性。一条或更多条同源臂的长度将取决于，例如，所做修饰的类型和大小。在许多情况下，并且优选地，供体DNA将与基因组靶基因座具有两个序列同源性区(例如，两个同源臂)。优选地，“***物(insert)”区或“DNA序列修饰”区(期望引入细胞中的基因组靶基因座的核酸修饰)将位于两个同源区之间。DNA序列修饰可以改变一个特定位点或多于一个特定位点处的靶基因组DNA序列的一个或更多个碱基。改变可以包括改变靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400个或500个或更多个碱基对。缺失或***可以是靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400个或500个或更多个碱基对的缺失或***。
术语“指导核酸(guide nucleic acid)”或“指导RNA(guide RNA)”或“gRNA”是指包含以下的多核苷酸：1)能够与基因组靶基因座杂交的指导序列和2)能够与核酸指导的核酸酶相互作用或复合的支架序列。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间的序列相似性，或者在本公开内容的上下文中，更常见地是指两个核酸分子之间的序列相似性。术语“同源区”或“同源臂”是指供体DNA上与靶基因组DNA序列具有一定程度同源性的区域。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，所述每个序列可以出于比较的目的而被对齐。当比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置处是同源的。序列之间的同源性程度随着序列共有的匹配或同源位置数而变化。
“可操作地连接”指其中如此描述的组分被配置以执行它们的通常功能的元件布置。因此，可操作地连接至编码序列的控制序列能够影响编码序列的转录，并且在一些情况下，能够影响编码序列的翻译。只要控制序列起作用以指导编码序列的表达，控制序列不必与编码序列邻接。因此，例如，不翻译但转录的间插序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，且启动子序列仍可以被认为是“可操作地连接”至编码序列。事实上，这样的序列不必驻留于同一连续DNA分子(即染色体)上，并且仍可以具有引起调控改变的相互作用。
“启动子”或“启动子序列”是能够与RNA聚合酶结合并启动多核苷酸或多肽编码序列(诸如信使RNA、核糖体RNA、小核RNA(small nuclear RNA)或核仁小RNA(smallnucleolar RNA)、指导RNA或由任何类别的任何RNA聚合酶I、II或III转录的任何种类的RNA)的转录的DNA调控区。启动子可以是组成型或诱导型，并且，在一些实施方案中，特别地在许多采用选择的实施方案中，核酸指导的核酸酶编辑***的至少一种组分的转录处于诱导型启动子的控制下。
如本文使用的术语“选择标记(selectable marker)”是指引入细胞中的、赋予适于人工选择的性状的基因。一般使用的选择标记是本领域普通技术人员熟知的。可以采用药物选择标记，诸如氨苄青霉素/羧苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、庆大霉素、博莱霉素、链霉素、利福平、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素和G418。在其他实施方案中，选择标记包括，但不限于，人类神经生长因子受体(用MAb检测，诸如美国专利第6,365,373号中描述的)；截短的人类生长因子受体(用MAb检测)；突变体人类二氢叶酸还原酶(DHFR；可得荧光MTX底物)；分泌型碱性磷酸酶(SEAP；可得荧光底物)；人类胸苷酸合酶(TS；赋予对抗癌剂氟脱氧尿苷的抗性)；人类谷胱甘肽S-转移酶α(GSTA1；将谷胱甘肽与干细胞选择性烷化剂白消安缀合；CD34+细胞中的化学保护性选择标记)；造血干细胞中的CD24细胞表面抗原；赋予对N-膦酰乙酰基-L-天冬氨酸(PALA)的抗性的人类CAD基因；人类多耐药性-1(MDR-1；通过增加的耐药性可选择或通过FACS富集的P-糖蛋白表面蛋白)；人类CD25(IL-2α；可通过Mab-FITC检测)；甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT；可通过卡莫司汀(carmustine)选择)；和胞苷脱氨酶(CD；可通过Ara-C选择)。如本文使用的“选择性培养基”是指向其中添加了选择选择标记或针对选择标记进行选择的化学化合物或生物部分的细胞生长培养基。
术语“靶基因组DNA序列”、“靶序列”或“基因组靶基因座”是指体外或体内，或者细胞或细胞群体的核酸(例如基因组)中的期望使用核酸指导的核酸酶编辑***对至少一个核苷酸进行改变的任何基因座。靶序列可以是基因组基因座或染色体外基因座。
“载体”是包含待递送至细胞和/或在细胞中表达的期望的一种序列或更多种序列的多种核酸中的任一种。载体通常由DNA构成，但是RNA载体也是可用的。载体包括但不限于质粒、F粘粒(fosmid)、噬菌粒、病毒基因组、合成染色体等。如本文使用的，短语“工程载体”包含用于本公开内容的核酸指导的核酸酶***和方法中的核酸酶的编码序列。在细菌***中，工程载体还可以包含λRed重组工程***或其等同物。工程载体通常还包含选择标记。如本文使用的，短语“编辑载体”包含供体核酸和gRNA编码序列，所述供体核酸任选地包括对靶序列的改变，所述改变在编辑发生后阻止核酸酶在靶序列中的PAM或间隔物(spacer)处结合。编辑载体还可以包括选择标记和/或条形码。在一些实施方案中，可以将工程载体和编辑载体组合；即，工程载体的内容物可以在编辑载体上找到。此外，工程载体和编辑载体包含可操作地连接至例如核酸酶编码序列、重组工程***编码序列(如果存在)、供体核酸、指导核酸和一种或更多种选择标记的控制序列。
核酸指导的核酸酶在基因组***中的一般编辑
本公开内容提供了工程化基因编辑核酸酶，所述工程化基因编辑核酸酶具有各异的PAM偏好、不同生物体中优化的编辑效率和/或改变的RNA指导的酶保真度。尽管某些工程化核酸酶在例如酵母或哺乳动物细胞中表现出增强的效率，其可以用于编辑所有细胞类型，包括古细菌、原核细胞和真核(例如，酵母、真菌、植物和动物)细胞。
本文描述的工程化核酸酶变体改进了RNA指导的酶编辑***，其中使用核酸指导的核酸酶(例如，RNA指导的核酸酶)来编辑生物体基因组中的特定靶区域。与适当的合成的指导核酸在细胞中复合的核酸指导的核酸酶可以在期望的位置处切割细胞的基因组。指导核酸有助于核酸指导的核酸酶识别和切割特定靶序列处的DNA。通过操纵指导核酸的核苷酸序列，核酸指导的核酸酶可以被编程为靶向任何用于裂解的DNA序列，只要适当的前间区邻近基序(PAM)在附近。
工程化核酸酶可以作为多肽被递送至待编辑的细胞中；可选地，将编码工程化核酸酶的多核苷酸序列转化或转染到待编辑的细胞中。编码工程化核酸酶的多核苷酸序列可以被密码子优化以在特定细胞，诸如古细菌、原核细胞或真核细胞中表达。真核细胞可以是酵母、真菌、藻类、植物、动物或人类的细胞。真核细胞可以是特定生物体的细胞或来源于特定生物体的细胞，所述特定生物体诸如哺乳动物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔、犬或非人类哺乳动物，包括非人类灵长类动物。待采用的工程化核酸酶的选择取决于许多因素，诸如在靶序列中待进行何种类型的编辑，以及适当的PAM是否位于期望的靶序列附近。工程化核酸酶可以由载体(例如，工程载体)上的DNA序列编码，并且处于组成型或诱导型启动子的控制下。在一些实施方案中，编码核酸酶的序列处于诱导型启动子的控制下，并且诱导型启动子可以与控制指导核酸转录的诱导型启动子分开但相同；即，分开的诱导型启动子可以驱动核酸酶和指导核酸序列的转录，但是这两个诱导型启动子可以是相同类型的诱导型启动子。可选地，控制核酸酶表达的诱导型启动子可以与控制指导核酸转录的诱导型启动子不同。
通常，指导核酸(例如，gRNA)与相容的核酸指导的核酸酶复合，并且然后可以与靶序列杂交，从而将核酸酶引导至靶序列。在某些方面，RNA指导的酶编辑***可以使用组合起来发挥指导核酸的作用的两个分开的指导核酸分子，例如CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。在其他方面——并与本文描述的工程化核酸酶一起使用——指导核酸可以是包括crRNA序列和tracrRNA序列二者的单个指导核酸。指导核酸可以是DNA或RNA；可选地，指导核酸可以包含DNA和RNA二者。在一些实施方案中，指导核酸可以包含修饰的或非天然存在的核苷酸。在指导核酸包含RNA的情况下，gRNA可以由多核苷酸分子诸如质粒、线性构建体上的DNA序列编码，或者编码序列可以驻留于编辑盒内，并且处于组成型启动子的控制下，或者在一些实施方案中，在如下文描述的诱导型启动子的控制下。
指导核酸包含指导序列，其中指导序列是与靶序列具有足够互补性以与靶序列杂交并且指导复合的核酸指导的核酸酶与靶序列的序列特异性结合的多核苷酸序列。指导序列和对应的靶序列之间的互补性程度在使用合适的比对算法进行最佳比对时是约以下或多于约以下：50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。最佳比对可以通过使用用于序列比对的任何合适的算法来确定。在一些实施方案中，指导序列的长度是约以下或多于约以下：10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、75个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列的长度是少于约75个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个核苷酸。优选地，指导序列是10-30个或15-20个核苷酸长，或者长度是15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸。
在本发明的方法和组合物中，指导核酸通常作为待由质粒或载体表达的序列提供，并且包含指导序列和支架序列二者作为启动子控制下的，并且在一些实施方案中，诱导型启动子控制下的单一转录物。通过改变指导序列可以将指导核酸工程化成靶向期望的靶序列，使得指导序列与期望的靶序列互补，从而允许指导序列和靶序列之间的杂交。通常，为了在靶序列中产生编辑，gRNA/核酸酶复合体与如由指导RNA确定的靶序列结合，并且核酸酶识别与靶序列邻近的前间区邻近基序(PAM)序列。靶序列可以是对原核细胞或真核细胞而言为内源或外源的任何多核苷酸，或体外的任何多核苷酸。例如，靶序列可以是驻留于真核细胞的细胞核中的多核苷酸。靶序列可以是编码基因产物(例如，蛋白质)的序列或非编码序列(例如，调控多核苷酸、内含子、PAM或“垃圾”DNA(“junk”DNA))。
指导核酸可以是编码供体核酸的编辑盒的一部分，诸如，以下中描述的：2019年3月26日发布的USPN 10,240,167；2019年4月23日发布的USPN 10,266,849；2018年6月22日发布的USPN 9,982,278；2019年7月15日发布的USPN 10,351,877；和2019年7月30日发布的USPN 10,362,422；和2019年2月14日提交的USSN 16/275,439；2019年2月14日提交的USSN16/275,465；2019年8月23日提交的USSN 16/550,092；和2019年8月26日提交的USSN16/552,517。可选地，指导核酸可以不是编辑盒的一部分，而是可以被编码在工程或编辑载体骨架上。例如，可以首先将编码指导核酸的序列组装或***载体骨架中，随后将供体核酸***例如编辑盒中。在其他情况下，可以首先将例如编辑盒中的供体核酸***或组装到载体骨架中，随后***编码指导核酸的序列。在又其他情况下，编码指导核酸和供体核酸(例如，***编辑盒中)的序列同时但分开***或组装到载体中。在又其他实施方案中，编码指导核酸的序列和编码供体核酸的序列二者均包含在编辑盒中。
靶序列与PAM相关，PAM是由gRNA/核酸酶复合体识别的短核苷酸序列。用于不同的核酸指导的核酸酶的精确的PAM序列和长度要求不同；然而，PAM通常是与靶序列邻近或接近的2-7个碱基对序列，并且取决于核酸酶，可以在靶序列的5’或3’。核酸指导的核酸酶的PAM相互作用结构域的工程化可以允许改变PAM特异性、改进保真度或降低保真度。在某些实施方案中，靶序列的基因组编辑既将期望的DNA改变引入靶序列，例如细胞的基因组DNA，又去除靶序列中的前间区突变(PAM)区，使靶序列中的前间区突变(PAM)区突变或失活。使靶序列处的PAM失活排除了对该靶序列处细胞基因组的另外的编辑，例如，在后续的编辑轮中随后暴露于与合成的指导核酸复合的核酸指导的核酸酶时。因此，具有期望的靶序列编辑和改变的PAM的细胞可以使用与合成的指导核酸复合的核酸指导的核酸酶来选择，所述合成的指导核酸与靶序列互补。没有经历第一编辑事件的细胞会被切割，引起双链DNA断裂，并且因此会无法继续存活。包含期望的靶序列编辑和PAM改变的细胞不会被切割，因为这些编辑的细胞不再包含必需的PAM位点，并且会继续生长和繁殖。
核酸指导的核酸酶可以识别的靶序列的范围受特定PAM需要定位于期望的靶序列附近的限制。因此，以基因组编辑必需的精度靶向编辑通常可能是困难的。已经发现，核酸酶可以非常好地识别一些PAM(例如，典型PAM(canonical PAM))，而不太好或较差地识别其他PAM(例如，非典型PAM)。因为本文公开的某些工程化核酸酶识别不同的PAM，工程化核酸酶增加了可以被靶向用于编辑的靶序列的数目；即，工程化核酸酶减少了基因组中的“PAM沙漠(PAM deserts)”区域。因此，工程化核酸酶通过增加被识别的PAM序列的数目(多样化(variety))扩大了可以被编辑的靶序列的范围。此外，可以将工程化核酸酶的混合物递送至细胞，使得可以在单次编辑运行中编辑与若干不同PAM邻近的靶序列。
核酸指导的核酸酶***的另一组分是供体核酸。在一些实施方案中，供体核酸与指导核酸在同一多核苷酸(例如，编辑载体或编辑盒)上，并且可以(但不必然)处于与指导核酸相同的启动子的控制下(例如，单一启动子驱动指导核酸和供体核酸二者转录)。供体核酸被设计成用作用于与靶序列同源重组的模板，该靶序列被作为gRNA/核酸酶复合体的一部分的核酸指导的核酸酶切口或裂解。供体核酸多核苷酸可以具有任何合适的长度，诸如约或多于约20个、25个、50个、75个、100个、150个、200个、500个或1000个核苷酸的长度。在某些优选的方面，供体核酸可以以20-300个核苷酸之间，更优选地50-250个核苷酸之间的寡核苷酸提供。供体核酸包含与靶序列的一部分互补的区域(例如同源臂)。当最佳比对时，供体核酸与靶序列重叠(互补)例如，约20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、70个、80个、90或更多个核苷酸。在许多实施方案中，供体核酸包含位于供体核酸和靶模板之间的突变或差异的侧翼的两个同源臂(与靶序列互补的区域)。供体核酸包含与靶序列相比的至少一个突变或改变，诸如与靶序列相比的***、缺失、修饰或其任何组合。
如先前提及的，通常，供体核酸以编辑盒提供，其被***到载体骨架中，其中载体骨架可以包含驱动gRNA转录的启动子和gRNA编码序列，或者载体骨架可以包含驱动gRNA转录的启动子，但不包含gRNA本身。此外，可以存在多于一个，例如两个、三个、四个或更多个指导核酸/供体核酸盒***到工程载体中，其中每个指导核酸处于分开的不同启动子、分开的相似启动子的控制下，或者其中所有指导核酸/供体核酸对处于单个启动子的控制下。在一些实施方案——诸如采用细胞选择的实施方案中——驱动gRNA和供体核酸(或驱动多于一个gRNA/供体核酸对)转录的启动子是诱导型启动子。诱导型编辑的优点在于，在启动编辑前，单个化的细胞可以生长几倍至许多倍的细胞倍增，这增加具有编辑的细胞将存活的可能性，因为由有效编辑(active editing)引起的双链切割对细胞有很大毒性。这种毒性既导致编辑的集落中的细胞死亡，也导致确实存活但必须在编辑后修复和恢复(recover)的编辑的细胞生长延滞。然而，在编辑的细胞具有恢复的机会后，编辑的细胞集落的尺寸最终会赶上未编辑的细胞集落的尺寸。参见，例如，2019年4月30日提交的USSN 16/399,988；2019年6月26日提交的USSN 16/454,865；和2019年8月14日提交的USSN 16/540,606。此外，指导核酸可以有效指导编辑盒中多于一个供体核酸的编辑；例如，如果期望的编辑在靶序列中彼此接近。
除了供体核酸之外，编辑盒可以包含一个或更多个引物位点。引物位点可以用于通过使用寡核苷酸引物扩增编辑盒；例如，如果引物位点位于编辑盒的一个或更多个其他组分的侧翼。
此外，如以上描述的，供体核酸可以包含除了相对于靶序列的至少一个突变之外的一个或更多个PAM序列改变，所述改变使靶序列中的PAM位点突变、缺失或失活。靶序列中的PAM序列改变使PAM位点对核酸指导的核酸酶“免疫”，并且如果使用相同的核酸酶，保护靶序列在随后的编辑轮中不被进一步编辑。
此外，编辑盒可以包含条形码。条形码是对应于供体DNA序列的独特DNA序列，使得条形码可以鉴定对对应靶序列进行的编辑。条形码通常包含四个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，编辑盒包含代表例如供体核酸的全基因或全基因组文库的供体核酸的集合。编辑盒的文库被克隆到载体骨架中，其中，例如，每个不同的供体核酸与不同的条形码缔合。
此外，在一些实施方案中，编码核酸指导的核酸酶***的组分的表达载体或盒还编码包含一个或更多个核定位序列(NLS)诸如约或多于约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个NLS的工程化核酸酶。在一些实施方案中，工程化核酸酶包含氨基末端处或其附近的NLS、羧基末端处或其附近的NLS，或组合。
工程和编辑载体包含可操作地连接至待转录的组分序列的控制序列。如以上陈述的，驱动工程化核酸酶编辑***的一种或更多种组分转录的启动子可以是诱导型的，并且如果要进行选择，可能采用诱导型***。已经开发了用于在植物、微生物和动物细胞(包括哺乳动物细胞)中控制基因表达的许多基因调控控制***，包括pL启动子(通过CI857阻遏物的热失活诱导)、pBAD启动子(通过将***糖添加至细胞生长培养基中诱导)和鼠李糖诱导型启动子(通过将鼠李糖添加至细胞生长培养基中诱导)。其他***包括四环素控制的转录激活***(Tet-On/Tet-Off，Clontech,Inc.(Palo Alto,CA)；Bujard和Gossen,PNAS,89(12):5547-5551(1992))、Lac开关诱导型***(Wyborski等人，Environ Mol Mutagen,28(4):447-58(1996)；Du Coeur等人，Strategies 5(3):70-72(1992)；美国专利第4,833,080号)、蜕皮素诱导型基因表达***(No等人，PNAS,93(8):3346-3351(1996))、cumate基因开关***(Mullick等人，BMC Biotechnology,6:43(2006))、以及他莫昔芬诱导型基因表达(Zhang等人，Nucleic Acids Research,24:543-548(1996))以及其他。
通常，在活细胞中进行基因组编辑要求用进行核酸指导的核酸酶编辑所必需的组分转化细胞。例如，细胞可以用分开的工程载体和编辑载体同时转化；细胞可以已经表达工程化核酸酶(例如，细胞可能已经用工程载体转化，或者工程化核酸酶的编码序列可以稳定地整合到细胞基因组中)，使得仅需要将编辑载体转化到细胞中；或者细胞可以用包含进行核酸指导的核酸酶基因组编辑所需的所有组分的单个载体转化。
可以使用多种递送***将核酸指导的核酸酶编辑***组分引入(例如，转化或转染)宿主细胞。这些递送***包括酵母***、脂质体转染***、显微注射***、基因枪***、病毒微体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子、脂质:核酸缀合物、病毒粒子、人工病毒粒子、病毒载体、电穿孔、细胞可渗透肽、纳米粒子、纳米线、外泌体的使用。可选地，可以使用分子特洛伊木马(trojan horse)脂质体跨越血脑屏障递送核酸指导的核酸酶成分。特别感兴趣的是电穿孔的使用，特别地流通式电穿孔(作为独立的仪器或作为自动化多模块***中的模块)的使用，如以下中描述的：例如，2019年10月08日发布的USPN 10,435,717；和2019年10月15日发布的USPN10,443,074；2019年8月26日提交的USSN 16/550,790；2019年6月18日发布的USSN 10/323,258；和2019年9月17日发布的USSN 10/415,058。
在将细胞用进行核酸指导的核酸酶编辑所必需的组分转化后，使细胞在促进编辑的条件下培养。例如，使用如果组成型启动子驱动工程化核酸酶和/或gRNA的转录，转化的细胞仅需要在典型条件下(例如，温度、CO2气氛等)在典型培养基中培养。可选地，如果编辑是诱导型的——例如通过激活诱导型启动子，该诱导型启动子控制核酸指导的核酸酶编辑所需的一种或更多种组分的转录，诸如，例如gRNA、供体DNA、核酸酶的转录，或者，在细菌的情况下，编辑是重组工程***的——则细胞经历诱导条件。本文描述的工程化核酸酶可以用于自动化***，诸如以下描述的那些：2019年4月09日发布的USPN 10,253,316；2019年6月25日发布的USPN 10,329,559；2019年6月18日发布的USPN 10,323,242；和2019年9月24日发布的USPN 10,421,959；和2019年5月14日提交的USPN 16/412,195；2019年5月28日提交的USPN 16/423,289；和2019年9月14日提交的USPN 16/571,091。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入一样。
具体实施方式
提出以下实施例，以便为本领域技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，且以下实施例并不意图限制发明人视作其发明的范围，它们也不意图代表或暗示下文的实验是进行的所有实验或仅有的实验。本领域的技术人员应该明白，可以在对具体方面中所示的发明作出许多变化和/或修饰而不脱离本发明所广泛描述的精神或范畴。因此，本文的方面在各个方面中被认为是说明性的而非限制性的。
实例1：Mad7及其突变体K169R在酵母中的激活测试
为了测试Mad7在酵母中的激活活性，参考酵母单杂实验构建了缺失切割活性的核酸酶蛋白(dMad7)与GAL4激活结构域(AD)的融合蛋白(该质粒能同时恢复亮氨酸营养缺陷型)，在Y1H酵母中引入7个四环素操纵子驱动的金但子素A(AbA)抗性基因以及修复Ura营养缺陷，并利用pGBKT7改造的CrRNA表达质粒(该质粒能同时恢复色氨酸营养缺陷型)表达CrRNA以引导融合蛋白结合，从而激活金但子素A抗性基因的表达(图1)。核酸酶蛋白用寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应扩增，以在N末端引入SV40核定位序列，该序列由对应于“MAPKKKRKV”的蛋白质序列的DNA序列“ATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTC”组成。然后将所得扩增的DNA片段与线性化筛选质粒经同源重组转化大肠杆菌，确保质粒正确后将质粒提取并转化突变型酵母Y1H-7xTet。选择包含质粒的2mm菌落溶于生理盐水中并稀释10-1涂布在在包含0、200、400、800、1200(ng/ml)的TDO/-Trp/-Leu/-Ura平板上在恒温培养箱中在30℃持续3天。由于CrRNA引导核酸酶的融合蛋白能激活Y1H-7xTet酵母中AbA的表达从而能在含有一定浓度AbA的TDO/-Trp/-Leu/-Ura平板上生长，培养物的生长密度与dMad7-CrRNA激活作用与7xTet位点的结合活性成比例。该分析的结果示于图1中，突变体K169R(SEQ ID NO:5)相对于野生型dMad7(SEQ ID NO:4)显示出较高的与靶点的结合活性。
实例2：利用组氨酸与3-氨基-1,2,4-三氮唑(3-AT)拮抗作用在酵母中测试激活Mad7突变体的激活能力
参考酵母单杂实验构建了缺失切割活性的核酸酶蛋白(dMad7)与GAL4激活结构域(AD)的融合蛋白(该质粒能同时表达亮氨酸)，在Y1H酵母中引入3个四环素操纵子的启动子、组氨酸基因表达框(His)以及修复Ura营养缺陷，并利用pGBKT7改造的CrRNA表达质粒(该质粒能同时表达色氨酸)表达CrRNA引导融合蛋白结合，从而激活组氨酸的表达。核酸酶蛋白用寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应扩增，以在N末端引入SV40核定位序列，该序列由对应于“MAPKKKRKV”的蛋白质序列的DNA序列“ATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTC”组成。然后将所得扩增的DNA片段与线性化筛选质粒经同源重组转化大肠杆菌，确保质粒正确后将质粒提取并转化突变型酵母Y1H-3xTet。选择包含质粒的菌落复点板至TDO/Trp-/Leu-/His-+3-AT平板上在恒温培养箱中在30℃持续3天。由于CrRNA引导核酸酶的融合蛋白能激活Y1H-3xTet酵母中His的表达从而能在含有一定浓度3-AT的TDO/Trp-/Leu-/His-平板上生长，酵母的3-AT抗性与dMad7突变体与CrRNA的结合活性成正相关。该分析的结果示于图2中，突变体K169R(SEQ ID NO:5)、K169R/K535R(SEQ ID NO:6)、K169R/K563R(SEQ ID NO:7)、K169R/N589H(SEQ ID NO:8)、K169R/T601R(SEQ ID NO:9)、K169R/S624R(SEQ ID NO:10)相对于野生型dMad7(SEQ IDNO:4)显示出较高的CrRNA结合活性。
实例3：Mad7突变体蛋白体外酶活测定
通过细菌表达Mad7双突变体蛋白K169R/K535R、K169R/K563R、K169R/N589H、K169R/T601R、K169R/S624R，体外合成获得CrRNA以及带靶点的底物DNA，首先将纯化的蛋白与合成的CrRNA一起孵育形成RNA-蛋白酶复合物(RNP)，再用带靶点的双链DNA作为底物，激活RNP的切割活性，进而切割游离的带有荧光和猝灭基团的短链单链DNA，如果该单链被切割，那么被猝灭的荧光基团就会释放出来，荧光强度增加，通过测定单位时间内的荧光增量(ΔRn)来反映MAD7及其突变体的活性。因无法对纯化的蛋白精确定量，通过使野生型蛋白量≥待比较突变体蛋白的量，若测得的任一突变体的荧光增量≥野生型，则该突变体在体外的切割活性优于野生型。从图3中可以看出，Mad7双突变体蛋白K169R/K535R、K169R/K563R、K169R/N589H、K169R/T601R、K169R/S624R活性均优于野生型。
实例4：Mad7突变体蛋白细菌体内编辑测试
在细菌中存在半乳糖代谢途径：半乳糖经半乳糖激酶(galK,Gene ID:66670972)磷酸化后最终形成6磷酸葡萄糖，该产物是糖酵解底物，经代谢生成丙酮酸，氧气充足情况下还会进入三羧酸循环产生大量酸性物质，在中性红存在的条件下，能使其变为红色，这样可以通过颜色判别是否存在敲除现象。引入λ噬菌体蛋白使细菌获得同源重组能力，将galK同源敲除片段连入带有λ蛋白的载体，提取质粒转化大肠杆菌W3110进行扩繁，使其拥有大量的重组片段，后将其制备为感受态，再转化Mad7/Mad7突变体-CrRNA质粒，通过诱导，同时产生Mad7蛋白和λ蛋白，在大量同源重组片段的存在下，敲除现象就很容易发生。因此，将平板上的克隆挑取到含有中性红的液体培养基中培养，培养后呈浑浊黄色的为敲除株，呈浑浊红色的为非敲除株，培养液呈澄清黄色的为死亡株。代表性数据如表1所示，通过培养后按以下公式计算各蛋白的敲除效率：
由表1可以看出，Mad7双突变体Mad7-K169R/N589H和Mad7-K169R/S624R在细菌中对galk的敲除效率高于野生型。
表1Mad7及其突变体的细菌敲除效率Mad7细菌编辑效率
实例5：不同Mad7突变体在水稻原生质体中的编辑效率测试
分别在水稻OsPPO1(LOC4327918)和OsYSA(LOC4333379)基因上设计合适的Mad7靶点，分别构建Mad7和Mad7突变体(Mad7-K169R和Mad7-K169R/N589H)单靶点编辑测试载体。靶点序列分别为：OsPPO1-CrRNA3：tttc aactccagctgctgttagactgt和OsYSA-CrRNA1:tttcacctggtgcccctcccgccgca。
使用Promega质粒提取试剂盒(Midipreps DNA Purification System,Promega,A7640)进行质粒DNA提取。制备水稻原生质体对测试载体进行PEG介导的转化，转化方法参照“Lin etal.,2018Application of protoplast technology to CRISPR/Cas9mutagenesis:from single-cell mutation detection to mutant plantregeneration.Plant Biotechnology Journal https://doi.org/10.1111/pbi.12870”。
使用CTAB法提取原生质体DNA，用hitom测序的方法检测靶点的编辑效率。针对靶点设计hitom检测引物，目的片段长度分别为127bp和129bp。
PPO1-sgRNA3-Hi-TOM-F：ggagtgagtacggtgtgcccaaggtatcgctgtcaagttg
PPO1-sgRNA3-Hi-TOM-R：GAGTTGGATGCTGGATGgcagtcaaatagtgtgcaaacatg
YSA-Hi-TOM-F：GGAGTGAGTACGGTGTGCcagaatcaggtcgacggcatc
YSA-Hi-TOM-R：GAGTTGGATGCTGGATGGgacctcatgaaggtgctcgtc
扩增目的片段进行Hi-TOM测序分析，代表性测序结果见图4和图5，分别对编辑结果进行统计，结果表明：对于水稻OsPPO1靶点，Mad7-K169R/N589H的编辑效率为4.58％、Mad7-K169R编辑效率为2.62％、野生型Mad7编辑效率为2.16％；对于水稻OsYSA靶点，Mad7-K169R/N589H的编辑效率为4.32％、Mad7-K169R编辑效率为2.80％、野生型Mad7编辑效率为2.10％。Mad7-K169R和Mad7-K169R/N589H的编辑效率均高于Mad7。
实例6：Mad7-K169R/N589H在水稻基因编辑测试
为了获得抗水稻黑条矮缩病(RBSDV)的水稻材料，选择两个负调控水稻黑条矮缩病的基因OsGDI1(Os05g0418000)和S-OsGDI1(Os07g0271000)进行敲除，使用Mad7-K169R/N589H作为敲除的核酸酶，选择“TTTN”作为PAM，在两个基因的第三个外显子设计敲除靶点OsGDI1-ats1和S-OsGDI1-ats1。构建相应的敲除载体，并使用本领域内通用的农杆菌转化法对水稻组织进行遗传转化。
所得到的水稻T0代植株使用CTAB法提取水稻的总DNA，PCR分别扩增OsGDI1和S-OsGDI1的靶点附近片段，将每个单株扩增得到的片段送北京擎科生物科技有限公司进行测试，根据测序结果确定目的基因发生敲除(如图6所示)。
对T0代转化苗的敲除效率进行了统计，OsGDI1-ats1靶点编辑水稻在检测的39株水稻中发现27株发生了敲除，敲除效率为69.2％，S-OsGDI1-ats1在检测的40株水稻中发现22株发生了敲除，敲除效率为55.0％。
实例7：Mad7-K169R/N589H在大豆毛状根***中的编辑效率测试
根据本领域常规技术方法，分别在大豆FAD(GLYMA_10G286400)和MRP5a(GLYMA_03G056000)基因上设计合适的靶点，构建了Mad7-K169R/N589H单靶点编辑测试载体，并通过发根农杆菌侵染大豆的方式获得大豆的毛状根。截取带有荧光标记的毛状根提取DNA后进行高通量测序分析。
实验结果如图7所示，Mad7-K169R/N589H对FAD和MRP5a基因靶点区域产生了明显的突变。
实例8：Mad7-K169R/N589H突变体在斑马鱼胚胎中的效率测定
设计斑马鱼黑色素合成通路必须基因酪氨酸酶基因(tyr,Gene ID:30207)靶点gactggaggacttctggggaggt，其PAM序列为tttg。通过化学合成相应的CrRNA与突变体Mad7-K169R/N589H一起孵育形成RNA-蛋白酶复合物(RNP)。调节浓度为1uM注射斑马鱼单细胞胚胎。48小时后观察斑马鱼胚胎黑色素形成情况。观察不同批次注射后成活的胚胎约500枚，发现4枚胚胎有黑色素缺失表型。取黑色素缺失的胚胎提取DNA。用Dr-TYR-F:GCGTCTCACTCTCCTCGACTCTTC和Dr-TYR-R:GTAGTTTCCGGCGCACTGGCAG扩增靶标序列并进行测序。
测序结果如图8所示，与未注射的野生型斑马鱼胚胎相比，注射样本在设计的靶点处均产生了明确的碱基缺失型突变。
实施例9：Mad7-K169R/N589H突变体在猪原代成纤维细胞内敲除验证
猪SOCS2(Gene ID:100037966)基因靶点设计：通过基因组序列对比设计在猪SOCS2基因编码区5’端UTR设计了gggttctcactgacttctaagga和在SOCS2基因的终止密码子后设计了ctaaacacgcctcctgtagcgtc靶点，以达到SOCS2基因删除的目的。通过化学合成相应的crRNA分别命名为CR85和CR86。
利用转染试剂Lipofectamine Stem Transfection Reagent对猪成纤维细胞PEF进行RNP转染。
表2细胞转染溶液中各组分用量
细胞转染24h后进行消化，并对细胞进行细胞计数，按每个10cm皿不超过200个细胞的密度均匀接种到单个10cm皿中，每48h更换一次新鲜培养基。在细胞分盘后的第10天，细胞即可长成大小合适的单细胞克隆，使用克隆环对形成单克隆的细胞消化后转移到24孔细胞培养板中。继续培养3-5天后取部分单克隆细胞系提取DNA扩增靶点进行测序验证。
结果如图9所示，多个单克隆细胞系测序结果表明在设计的双靶点直接发生了明确片段删除。
虽然本发明通过许多不同形式的实施方案来满足，但是如结合本发明的优选的实施方案详细描述的，应理解本公开内容应被认为是对本发明的原理的示例而不意在将本发明局限于本文说明和描述的具体实施方案。本领域的技术人员可以作出许多变化而不脱离本发明的精神。本发明的范围将通过附加的权利要求和它们的等同物判断。摘要和标题不应被解释为限制本发明的范围，因为它们的目的是使适当的机构以及一般公众能够迅速确定本发明的一般性质。

Claims (22)

1.一种工程化核酸酶，其包含与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比具有下述突变的氨基酸序列：在第169位氨基酸由赖氨酸突变为精氨酸。
2.根据权利要求1所述的工程化核酸酶，所述氨基酸序列还具有选自下组的一个或多个突变：在第589位氨基酸由天冬酰胺突变为其他任何氨基酸，优选组氨酸；在第535位氨基酸由赖氨酸突变为其他任何氨基酸，优选精氨酸；在第563位氨基酸由赖氨酸突变为其他任何氨基酸，优选精氨酸；在第601位氨基酸由苏氨酸突变为其他任何氨基酸，优选精氨酸；在第624位氨基酸由丝氨酸突变为其他任何氨基酸，优选精氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的工程化核酸酶，所述氨基酸序列进一步与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的工程化核酸酶，其包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的工程化核酸酶，其与具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核酸酶相比，在酵母中的编辑活性提高。
6.一种酶混合物，所述酶混合物包含权利要求1-5任意一项所述的工程化核酸酶中的一种或两个以上组合。
7.一种修饰细胞基因组中的靶区域的方法，所述方法包括：
(a)使细胞与以下接触：
如权利要求1-5任意一项所述的工程化核酸酶；
工程化引导核酸，所述工程化引导核酸能够与所述核酸酶复合；和
编辑序列，所述编辑序列编码与所述靶区域互补的、相对于所述靶区域具有序列改变的核酸；以及
(b)允许所述核酸酶、引导核酸和编辑序列在所述细胞基因组的靶区域中创建基因组编辑。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述工程化引导核酸和所述编辑序列作为单一核酸提供。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述单一核酸还在前间区序列邻近基序(PAM)位点中包含突变。
10.一种核酸引导性核酸酶***，所述核酸引导性核酸酶***包括：
(a)如权利要求1-5任意一项所述的工程化核酸酶；
(b)工程化引导核酸，所述工程化引导核酸能够与所述核酸酶复合；和
(c)编辑序列，所述编辑序列相对于细胞基因组中的靶区域的序列具有序列改变；
其中所述***通过所述核酸酶、所述工程化引导核酸和所述编辑序列促成在所述细胞基因组的靶区域中产生基因组编辑。
11.如权利要求10所述的***，其中所述工程化引导核酸和所述编辑序列作为单一核酸提供。
12.如权利要求11所述的***，其中所述单一核酸还在前间区序列邻近基序(PAM)位点中包含突变。
13.一种组合物，所述组合物包含：
(a)如权利要求1-5任意一项所述的工程化核酸酶；和
(b)工程化引导核酸，所述工程化引导核酸能够与所述核酸酶复合，其中所述工程化引导核酸包含环序列，所述环序列包含以下序列：UAUU、UUUU、UGUU、UCUU、UCUUU或UAGU。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述工程化引导核酸是异源工程化引导核酸。
15.如权利要求13所述的组合物，其中所述核酸酶由为了在来自特定生物体的细胞中使用而被密码子优化的核酸序列编码。
16.一种核酸引导性核酸酶***，所述核酸引导性核酸酶***包括：
(a)如权利要求1-5任意一项所述的工程化核酸酶；和
(b)异源工程化引导核酸，所述异源性的工程化引导核酸能够与所述核酸酶复合。
17.如权利要求16所述的***，所述***还包括(c)编辑序列，所述编辑序列相对于靶区域的序列具有序列改变。
18.如权利要求17所述的***，其中，所述靶向***通过所述核酸酶、所述异源工程化引导核酸和所述编辑序列促成在靶区域中产生编辑。
19.如权利要求16所述的***，其中所述工程化引导核酸包含环序列，所述环序列包含以下序列：UAUU、UUUU、UGUU、UCUU、UCUUU或UAGU。
20.如权利要求16所述的***，其中所述核酸酶由为了在来自特定生物体的细胞中使用而被密码子优化的核酸序列编码。
21.一种用于基因编辑的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-5任意一项所述的工程化核酸酶。
22.权利要求1-5任意一项所述的工程化核酸酶在制备制剂或试剂盒中的用途，所述制剂或试剂盒用于：(i)基因组编辑；(ii)靶核酸诊断；(iii)疾病的治疗。
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