KR20220103143A - 메르캅토 변성 히알루론산 및 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

메르캅토 변성 히알루론산 및 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메르캅토 변성 히알루론산 화합물 및 이의 제조 방법 및 응용에 관한 것으로, 본 발명의 메르캅토 변성 히알루론산의 메르캅탄 함량은 높고, 주쇄 분자의 분자량 변화가 작으며, 현저히 향상된 점도, 보수성 및 항산화 성능을 갖는다. 본 발명은 아크릴로일 화합물 변형의 히알루론산과 멀티메르캅토 화합물을 사용하여 메르캅탄과 공액 이중결합의 마이클 부가 반응을 통해 상기 화합물을 제조하는데, 상기 제조 방법은 합성 생성물의 구조, 조성, 대량의 화합물 분자 말단 작용기의 종류 및 함량 등을 유연하고 효과적으로 제어할 수 있고; 생체 적합성이 높은 시약을 사용하여 생산 비용을 효과적으로 제어하며 합성 공법 과정에서 독성을 줄일 수 있고; 안전한 시약을 사용하고 간단한 반응 단계의 조건에서, 원 재료 구조와 생물학적 활성이 잘 유지되고, 작용기의 종류와 함량이 필요에 따라 조정될 수 있는, 세포외 기질 재료의 메르캅토 변성 히알루론산으로 사용될 수 있도록 보장할 수 있으며, 다양한 임상 응용 요구를 충족시킨다.

Description

메르캅토 변성 히알루론산 및 이의 제조 방법 및 용도
본 발명은 2019년 11월 18일에 중국 국가지식재산권국에 제출한 출원 번호가 201911130065.7이고, 발명 명칭이 “메르캅토 변성 히알루론산 및 이의 제조 방법 및 용도”인 우선 출원의 우선권을 주장하는바, 상기 우선 출원의 전체 내용은 참조로서 본 발명에 인용된다.
본 발명은 생물 재료 분야에 속하는 것으로, 구체적으로 메르캅토 변성 히알루론산 및 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
생체 적합성 고분자는 중요한 생리학적 기능을 갖고 있으며, 일반적인 생체 적합성 고분자는, 다당, 단백질 및 합성 고분자를 포함하고, 히알루론산은 대표적인 생체 적합성 고분자이다.
히알루론산(Hyaluronic acid, HA)은 1934년에 Karl Mayer 교수가 최초로 소 눈의 유리체에서 천연 히알루론산을 획득하였으며, 천연 히알루론산은 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid) 및 N-아세틸-D-글루코사민의 교체 구조로 조성된 천연 헤테로 다당이다. 수십년의 연구 끝에, 이는 인간과 다른 척추 동물의 결체 조직에서 널리 존재하는 것을 발견할 수 있으며, 예를 들어 세포 간격, 운동 관절 조직, 탯줄, 피부, 연골, 혈관벽, 활액 및 닭의 볏 등 조직과 기관에는 모두 히알루론산이 함유된다. 히알루론산은 선형 고분자 다당에 속하고, 구조에 이당 반복 단위가 함유되며, 반복 단위 중의 D-글루쿠론산은 β-1,3글리코시드 결합을 통해 N-아세틸-D-글루코사민과 연결되고, 수천수만개의 이당 반복 단위는 β-1,4글리코시드 결합을 통해 연결되며, 전체 고분자 직쇄, 선형 구조를 형성한다. HA의 사슬 길이는 약 200 kDa에서 약 10 MDa까지 다양하며 가장 일반적인 크기는 2 MDa에서 5 MDa까지 다양하다. HA의 50 % 이상이 피부, 폐 및 장 조직에서 발견된다. 또한 관절 활액, 연골, 탯줄, 혈관벽 등 조직의 간질에도 존재한다. 인체 내 HA는 주로 윤활 및 완충 작용, 장벽의 충진 및 확산, 자유기 소거와 같은 생리적 기능의 역할을 한다. 현재 시판되고 있는 HA 제품은 맨드라미, 눈 유리체, 뇌연골, 관절액과 같은 동물 조직으로부터 추출할 수 있으며, 연쇄상구균, 녹농균과 같은 세균 발효로도 제조될 수 있다.
최근 몇년간, HA에 대한 심층적 연구와 함께, HA는 약물 전달 시스템의 제조, 정형외과 및 안과 질환의 치료, 수술 후 유착 예방 및 연조직 회복과 같은 의약 분야에 널리 응용되고 있으며, HA의 응용은 조직 공학과 재생 의학 분야의 연구 이슈로 되었다.
천연 HA는 생체 적합성 및 항염 효과가 뛰어나지만 천연 HA는 기계적 강도가 약하고 분해가 쉽다. 따라서 조직 공학을 위한 스캐폴드 재료로서 HA는 이러한 결함을 개선하고 생물학적 효과를 더 잘 발휘하며 세포 생존과 기능, 조직 복구 및 재생을 위한 좋은 환경을 제공하기 위해 적절하게 화학적으로 변성되거나 다른 재료와 조합하여 사용해야 한다. HA는 수소 결합, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용 및 사슬간 얽힘과 같은 분자간 물리적 상호작용을 통해 일시적으로 물리적으로 가교될 수 있으며, 이 과정은 가역적 가교이다. 변형되지 않은 HA는 시너지 효과를 가지기 어렵고 안정적인 히드로겔을 형성할 수 없다. 고농도의 고분자량의 미변형 HA는 화학적 가교 없이 겔 형상의 용액을 형성할 수 있다. 이 유형의 겔은 별도의 가교제가 필요하지 않지만 겔은 역학적 성능이 좋지 않고 체내 대사가 빨라 대부분의 조직 공학의 응용 요구를 충족시킬 수 없다.
쉽게 분해되는 천연 HA는 화학적 변성을 통해 더 나은 물리적 안정성과 기계적 강도를 획득할 수 있다. HA의 화학적 가교는 일반적으로 소분자 가교제를 통해 HA의 분자내 또는 분자간 가교를 구현할 수 있고, HA에 대한 화학적 변형을 통해 반응성 작용기를 도입한 후 가교를 구현할 수도 있다. HA 분자 구조에는 1차 및 2차 히드록실 및 카르복실과 같은 대량의 그룹이 존재하므로, 에폭시 화합물, 글루타르알데히드, 디비닐설폰, 다관능성 히드라지드 화합물과 같은 이관능성 소분자 가교제로 가교될 수 있다. 또한, HA 분자의 측쇄에 있는 그룹은 화학적 변형을 통해 알데히드화 HA, 히드라지드화 HA, 메르캅탄화 HA(즉, 메르캅토화 HA), 이중 결합 HA와 같은 기능화 HA를 획득할 수 있다. 기능화 HA는 자체 가교 또는 다른 성분과의 가교에 의해 역학적 성능 및 분해 성능이 우수한 히드로겔을 획득할 수 있다. HA는 또한 다른 성분의 생체 기능 재료와 함께 사용되어 서로의 장단점을 보완함으로써 우수한 특성을 가진 3차원 스캐폴드 재료를 획득할 수도 있다.
여기서, 메르캅토화 HA는 독특한 화학적 성질로 인해 항산화 건강 기능 식품, 생물 의약, 의료 미용 및 성형, 화장품 등 분야에 매우 적합하다.
기존의 메르캅토화 HA의 제조에는 주로 다음과 같은 방법이 포함된다.
Prestwich 및 수샤오정(舒曉正) 등은 디티오디히드라지드법에 의한 메르캅토 히알루론산 유도체(이하 HA-SH로 약칭함) 합성을 최초로 보고하였으며, 구조는 도 1(문헌 1: Biomacromolecules 2002, 3, 1304 및 공개번호가 CN101511875A인 특허 문헌)을 참조한다. 상기 방법은 다단계 반응을 통해 이황화 결합이 함유된 디히드라지드 화합물의 사전 합성을 필요로 하며 반응 과정에 사용되는 시약은 독성이 비교적 높고, 예를 들어, 히드라진 수화물은 고독성 화합물이며 래트의 경구 LD50은 129 mg/kg이다. 이후 EDCI, 즉 카르보디이미드 탈수제와 축합 반응하여 히알루론산과 디히드라지드 화합물이 가교되어 겔을 형성하도록 하며, 상기 단계는 반응 시스템의 전체 겔화로 인해 pH 4.75의 최적 반응 조건을 유지하기 위한 지속적인 교반을 유지할 수 없으므로, 균일화의 메르캅토 유도체를 획득하기 쉽지 않다. 획득된 겔을 디티오트레이톨을 환원 반응시켜 메르캅토 변형의 히알루론산 유도체를 얻는다.
Prestwich 등은 2008년에 티오시클로에탄(Thiocycloethane) 변형에 의한 HA-SH 합성 방법을 보고하였으며, 구체적으로 도 2(문헌 2: Biomaterials 2008, 29, 1388)를 참조한다. 상기 방법은 변형 시약의 사전 합성이 필요하지 않지만 히알루론산 1차 알코올의 낮은 반응 활성에 의해 제한되고 변형 비율이 상대적으로 낮다.
2007년 Shimobouji 등은 디히드라지드와 Traut’s 시약에 관한 2단계 변형법에 의한 HA-SH 합성을 보고하였으며, 구체적으로 도 3(문헌 3: J Biomed Mater Res A. 2007, 80, 916.)을 참조한다. 상기 방법의 제1 단계에서는 과량의 디히드라지드 화합물을 사용하여 히알루론산을 변형시키고, 중간 생성물을 투석 및 동결건조와 같은 정제 단계를 거쳐 히드라지드 변형의 히알루론산 유도체를 얻었다. 제2 단계에서는 Traut’s 시약을 사용하여 히드라지드 히알루론산 유도체를 변형시키고, 일련의 정제 작업을 거쳐 메르캅토 변형의 히알루론산 유도체를 얻었다. 상기 반응의 제2 단계에서 사용되는 Traut’s 시약은 고가이며 참조 가격은 374€/g이고 Sigma 회사의 것이며, 순도 98 %이다. 이는 상기 방법의 대규모 산업화 생산을 크게 방해한다.
2007년, Tae Gwan Park 등은 포토아민 변형 방법을 사용한 HA-SH 합성을 보고하였으며, 구체적으로 도 4(문헌 4: Journal of Controlled Release 2007, 119, 245)를 참조한다. 상기 방법은 디티오디히드라지드법과 유사하고, 이황화 결합을 함유한 포토아민을 변형 원료로서 사용하여 EDCI 탈수 축합을 통해 디티오트레이톨이 이황화 결합을 환원시켜 최종 HA-SH 유도체를 얻었다. 아미노 반응 활성이 히드라지드 반응 활성보다 낮으므로, 상기 방법의 치환도는 디티오디히드라지드법에 의해 합성된 HA-SH에 비해 낮다.
2012년, C. Yan 등은 β-메르캅토에틸아민을 사용하여 히알루론산을 변형시켜 HA-SH를 합성하는 방법을 보고하였으며, 구체적으로 도 5(문헌 5: Acta Biomaterialia 2012, 8, 3643)를 참조한다. 상기 방법은 메르캅탄을 함유한 소분자 화합물을 직접 사용하여 히알루론산의 카르복실을 변형시키며, 반응 과정에서 메르캅탄 그룹에 대한 보호 조치를 취하지 않는다. 메르캅탄은 또한 EDCI 촉매에 의해 카르복실과 커플링 반응을 할 수 있기 때문에 상기 방법으로 얻은 제품은 실제로 메르캅토와 아민기가 변형된 히알루론산의 혼합물이며, 메르캅탄의 치환도는 히드라지드법에 의해 합성된HA-SH에 비해 훨씬 낮다.
2015년, Andreas Bernkop-Schunrch 등은 시스테인 에틸에스테르를 사용하여 HA-SH를 합성하는 방법을 보고하였으며, 구체적으로 도 6(문헌 6: International Journal of Pharmaceutics 2015, 478, 383)을 참조한다. 상기 방법은 β-메르캅토에틸아민법과 유사하며, 반응 과정에서 메르캅탄도 카르복실 커플링 반응에 참여하여 치환 효율이 효과적으로 향상될 수 없다.
공개번호가 CN101200504A인 특허 문헌에서는 변성 디티오디히드라지드 화합물을 사용하여 히알루론산을 변형시켜 HA-SH를 합성하는 방법을 개시하였으며 구체적으로 도 7을 참조한다. 상기 방법에 사용된 변성 디티오디히드라지드 화합물은 더 긴 골격 구조를 가지므로, 얻은 HA-SH 중 메르캅토의 반응 활성은 일반 디티오디히드라지드법에 의해 얻은 메르캅탄 활성보다 높다. 그러나, 상기 변성 디티오디히드라지드는 다단계 합성법으로 제조해야 하고 산업화 비용이 상대적으로 높다.
공개번호가 CN103613686A인 특허 문헌에서는 일련의 HA-SH의 합성 방법을 개시하였으며, 여기에는 일반 일반 디티오디히드라지드법(즉 문헌 1 및 특허 CN101511875A) 중의 HA-SH 구조가 포함되고 구체적으로 도 8을 참조한다.
상기 방법에 의해 제조된 메르캅토 변성 HA는 다음의 3가지 유형으로 분류될 수 있다. 첫째, 고분자 화합물의 측쇄 카르복실에 아미드화 변형을 수행하여 메르캅토를 함유한 소분자 단편을 부가하는 것이고, 둘째, 고분자 화합물의 측쇄 카르복실을 아미드화 또는 히드라지드화 변형시킨 후 2차 관능화하여 환원 반응 또는 개환 반응을 통해 메르캅토를 함유한 측쇄 구조를 얻는 것이며; 셋째, 고분자 화합물의 측쇄 히드록실에 대해 높은 알칼리성 조건하에서 에틸렌 설피드의 개환 반응을 수행하여 메르캅토를 함유한 측쇄 구조를 얻는 것이다. 이러한 방법은 다음과 같은 결함이 존재한다. 1) EDCI, Traut’s 시약과 같은 반응 시약이 상대적으로 고가이고; 2) 디티오디히드라지드 화합물이 별도의 2단계 화학 합성으로 제조되어야 하는 것과 같이 반응 과정에 비상업적 시약을 사용하여 산업화 비용을 크게 증가시키며; 3) 카르복실 변성 방법에 대해 EDCI를 사용해야 하며 최적 반응 pH는 4.75로 특정 고분자 화합물(예를 들어, 히알루론산)의 불가역적 분해를 일으키고; 4) 히드록실에 대한 에틸렌 설피드의 변성 방법은 pH=10의 가혹한 반응 조건을 포함하며, 이는 또한 특정 고분자 화합물의 불가역적 분해를 일으킬 것이고; 5) 아미노 변형 방법은 반응성이 낮아 제한적이며 메르캅토 변형 정도가 일반적으로 높지 않다.
상기 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 보다 우수한 점도, 보다 우수한 보수성 및 보다 강한 항산화 활성을 가지며, 동시에 또한 높은 반응 활성 및 높은 메르캅토화 정도를 가지며, 추가로 구조를 제어할 수 있고 생물 활성이 우위적인 장점을 더 갖는 새로운 구조의 메르캅토 변성 히알루론산 계열 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이에 기반하여, 상기 메르캅토 변성 히알루론산은 항산화 건강 기능 식품, 생물 의약, 의료 미용 및 성형, 화장품 등 분야에 사용되는데 보다 더 유리하다.
본 발명의 두 번째 목적은, 상기 메르캅토 변성 히알루론산 계열 화합물의 제조 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 종래의 기술에 존재하는 여러 단점과 부족한 점을 극복하였으며, 응용 전망을 갖는다. 구체적으로, 상기 방법은 종래의 기술에 존재하는 다음과 같은 단점과 부족한 점을 극복하였다. 1) 변형 시약은 디티오디히드라지드법 및 변성 디티오디히드라지드법과 같은 다단계 반응을 통해 합성해야 하고; 2) 변형 시약 합성 과정에서 히드라진 수화물과 같은 고독성 유기물을 사용할 필요가 있어 녹색 화학이나 친환경 사회의 발전 요구에 부합되지 않으며; 3) EDCI 커플링제를 이용한 메르캅토 변형 방법은 활성화 단계에서 반응 시스템 pH=4.75로 유지해야 하고, 겔 단계에 진입한 후에는 교반과 같은 균질화 작업으로 반응 시스템의 안정적 및 균일성을 구현할 수 없으며, 산업화 조작이 어렵고; 4) Ethylene sulfide법에 의한 HA-SH의 합성은 pH=10의 조건하에서 수행되어야 하고 합성 과정에서 히알루론산의 분해 반응을 피할 수 없으며; 또한 티오시클로에탄은 가연성 및 독성이 있는 위험한 제품으로 물에서의 용해도가 낮아 상기 방법에서 더 높은 치환도를 얻을 가능성을 제한하고; 5) Traut’s 시약의 히드라지드 히알루론산 유도체 변형법은 높은 원료 비용으로 인해 제한적이며 대규모 산업화로 생산할 수 없고; 6) 메르캅탄과 아미노는 모두 활성이 높은 친핵 시약이므로, β-메르캅토에틸아민과 시스테인 에틸에스테르와 같은 메르캅탄의 직접 변형 과정에는 아미노와 카르복실의 축합 반응 및 메르캅탄과 카르복실의 축합 반응의 부반응이 존재하며, 상기 부반응은 반응 조건을 변경하는 것으로 완전히 피하기 어렵다.
본 발명의 제1 양태에서는 메르캅토 변성 히알루론산을 제공하며, 상기 히알루론산의 반복 단위의 측쇄에 함유된 -COOH 및/또는 -OH의 일부 또는 전부는 말단기가 하기 그룹인 측쇄를 형성하도록 변형되고,
Figure pct00001
상기 그룹에서, *는 연결점을 나타내며;
R1은 수소, 할로겐, 지방족 그룹, 방향족 그룹 등으로부터 선택되고;
R2 및 R3은 동일하거나 상이하며, 독립적으로 수소, 할로겐, 지방족 그룹, 방향족 그룹 등으로부터 선택되고;
R4는 멀티메르캅토 화합물 단편이다.
본 발명의 제2 양태에서는,
1) 히알루론산의 아크릴로일화 단계, 즉 히알루론산의 반복 단위의 측쇄에 함유된 -COOH, -OH 중 적어도 하나를 하기 그룹과 직접 또는 간접적으로 연결시키되,
Figure pct00002
R1, R2 및 R3의 정의는 상술한 바와 같고; *는 연결점을 나타내며;
2) 단계 1)에서 얻은 아크릴로일화의 히알루론산을 멀티메르캅토 화합물 HS-R4-SH와 반응시켜, 상기 메르캅토 변성 히알루론산을 제조하되, R4의 정의는 상술한 바와 같은 단계를 포함하는 상기 메르캅토 변성 히알루론산의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 제3 양태에서는 항산화 건강 기능 식품, 생물 의약, 의료 미용 및 성형, 화장품(항산화 화장품, 보수 보습 화장품 중 적어도 하나) 등 분야에 사용되는 상기 메르캅토 변성 히알루론산의 용도를 제공한다.
본 발명의 유익한 효과
본 발명은 새로운 메르캅토 변성 히알루론산을 제안하며, 예측 가능하거나 추측 가능한 메르캅탄 함량의 증가와, 주쇄 분자의 분자량 변화 감소를 제외하고, 예상치 못한 점은 상기 메르캅토 변성 히알루론산의 점도, 보수성 및 항산화 성능이 변형되기 이전의 히알루론산 및 히알루론산 유도체에 비해 현저한 차이를 가지며 현저하게 향상된 것이다.
구체적으로, 본 발명은 새로운 구조의 메르캅토 변성 히알루론산 계열의 화합물을 제공하며, 상기 계열의 화합물은 본 발명에서 언급된 메르캅탄 그룹을 가진 다양한 측쇄 변형의 히알루론산이고, 상기 계열의 화합물은 하기와 같은 특성을 갖는다.
1. 히알루론산에 의해 합성 반응을 통해 활성 부위에서 새로운 측쇄에 결합하여 생성된 새로운 화합물 구조.
2. 합성 과정에서, 변형되기 이전의 히알루론산과 비교하고, 종래의 기술에서 가장 근접한 화합물의 합성 과정과 비교하면, 그 우세는 다음을 포함한다. 1) 히알루론산의 주쇄는 변형 과정에서 기본적으로 분해되지 않고; 2) 메르캅탄 함량이 크게 증가하며; 3) 멀티메르캅토 화합물(예를 들어, 디메르캅토, 트리메르캅토, 테트라메르캅토 및 심지어 메르캅토 수가 더 많은 멀티메르캅토 화합물)을 도입하고, 상기 멀티메르캅토 화합물의 구조는 유연하고 조정 가능하며, 측쇄 단편의 길이는 실제 수요에 따라 맞춤화 변성되어, 메르캅토 측쇄의 활성 제어 및 미시적 가교 3차원 구조 공도 크기 및 공극률의 자유 조절을 구현할 수 있고; 4) 종래의 기술의 메르캅토 변형 방법의 이론적 메르캅토 치환도는 최고로 100 %(반복 단위를 갖는 고분자 화합물의 경우)에 불과하지만, 본 발명에서는 트리메르캅토 및 테트라메르캅토 화합물을 사용하여 이론적 메르캅토 치환도가 각각 200 %와 300 %에 달할 수 있도록 하며, 상기 효과는 다른 종래의 기술에 없는 독특한 장점이다.
3. 구조적 개선 이전의 히알루론산, 또는 종래의 기술에서 가장 근접한 변성 후의 히알루론산에 대해, 본 발명의 새로운 구조의 계열 화합물은 예상치 못한 유익한 기술적 효과를 가지며 종래의 기술과 현저히 상이하며, 상이하고 예상치 못한 물리화학적 성질을 적어도 가지며, 구체적으로 점도, 보수성 및 항산화 성능 등 측면에서 현저한 우세를 갖는다.
4. 상기 새로운 계열의 화합물의 성질에 의한 잠재적인 응용 분야의 우세 또는 잠재적인 새로운 용도에서 우세를 갖는다.
이에 기반하여, 상기 메르캅토 변성 히알루론산은 항산화 건강 기능 식품, 생물 의약, 의료 미용 및 성형, 화장품 등 분야에 사용되는데 보다 더 유리하다.
본 발명은 상기 메르캅토 변성 히알루론산의 새로운 제조 방법을 더 제공하며, 구체적으로, 본 발명은 아크릴로일 화합물 변형의 히알루론산과 멀티메르캅토 화합물을 사용하여 메르캅탄과 공액 이중결합의 마이클 부가 반응을 통해 메르캅토 변성 히알루론산을 제조하는데, 상기 제조 방법은 본 발명에 따른 새로운 화합물 구조의 목적을 달성하는 외, 다음과 같은 우세를 더 갖는다. 합성 생성물의 구조, 조성, 대량의 화합물 분자 말단 작용기의 종류 및 함량 등을 유연하고 효과적으로 제어할 수 있고; 생체 적합성이 높은 시약을 사용하여 생산 비용을 효과적으로 제어하며 합성 공법 과정에서 독성을 줄일 수 있고; 안전한 시약을 사용하고 간단한 반응 단계의 조건에서, 원 재료 구조와 생물학적 활성이 잘 유지되고, 작용기의 종류와 함량이 필요에 따라 조정될 수 있는, 세포외 기질 재료의 메르캅토 변성 히알루론산으로 사용될 수 있도록 보장할 수 있어, 다양한 임상 응용 요구를 충족시킨다. 구체적으로, 상기 방법은 하기와 같은 우세를 갖는다.
1) 상기 반응은 온화하고 제어 가능하며, 중성 조건에서 변형 반응을 구현할 수 있어, 가혹한 pH 환경에서 히알루론산 주쇄의 분해를 방지한다.
2) 상기 메르캅탄과 공액 이중결합의 마이클 부가 반응은 매우 효율적이고, 어떠한 부생성물이 생성되지 않으며, 원자 경제학 원리 및 녹색 화학 발전 조건에 부합된다.
3) 멀티메르캅토 화합물(e.g. 디메르캅토, 트리메르캅토, 테트라메르캅토 및 심지어 메르캅토 수가 더 많은 멀티메르캅토 화합물)은 상업적 상품에서 선택되며, 선택의 폭이 넓고 다단계 합성 반응을 통해 메르캅토 변형 시약을 미리 준비할 필요가 없으며, 산업화 비용이 낮다.
4) 상기 멀티메르캅토 화합물의 구조는 유연하고 조정 가능하며, 측쇄 단편의 길이는 실제 수요에 따라 맞춤화 변성되어, 메르캅토 측쇄의 활성 제어 및 미시적 가교 3차원 구조 공도 크기 및 공극률의 자유 조절을 구현할 수 있다.
5) 종래의 기술의 메르캅토 변형 방법의 이론적 메르캅토 치환도는 최고로 100 %(반복 단위를 갖는 고분자 화합물의 경우)에 불과하지만, 본 발명에서는 트리메르캅토 및 테트라메르캅토 화합물을 사용하여 이론적 메르캅토 치환도가 각각 200 %와 300 %에 달할 수 있도록 하며, 상기 효과는 다른 종래의 기술에 없는 독특한 장점이다.
도 1은 문헌 1에서 보고된 주요 반응 과정이다(디히드라지드법에 의한 HA-SH 합성).
도 2는 문헌 2에서 보고된 주요 반응 과정이다(Ethylene sulfide법에 의한 HA-SH 합성).
도 3은 문헌 3에서 보고된 주요 반응 과정이다(히드라지드 후 변형법에 의한 HA-SH 합성).
도 4는 문헌 4에서 보고된 주요 반응 과정이다(포토아민변형법에 의한 HA-SH 합성).
도 5는 문헌 5에서 보고된 주요 반응 과정이다(-메르캅토에틸아민법에 의한 HA-SH 합성).
도 6은 문헌 6에서 보고된 주요 반응 과정이다(시스테인 에틸에스테르 변형에 의한 HA-SH 합성).
도 7은 문헌 CN101200504A에서 보고된 주요 반응 과정이다(디히드라지드법에 의한 HA-SH 합성). 여기서, R1 및 R2 는 알킬리덴, 치환된 알킬리덴, 방향족, 폴리에테르 등(유의: 여기서의 R1 및 R2의 정의는 도 7 및 문헌 CN101200504A에 의해서만 한정됨)이며; P는 측쇄에 카르복실이 함유된 고분자 화합물 잔기를 의미한다.
도 8은 문헌 CN103613686A에서 보고된 주요 반응 과정이다(문헌 1과 유사하며, 디히드라지드법에 의한 HA-SH 합성).
도 9는 실시예1의 반응 방정식이다.
도 10은 실시예2의 반응 방정식이다.
도 11은 실시예3의 반응 방정식이다.
도 12는 실시예4의 반응 방정식이다.
도 13은 실시예5의 반응 방정식이다.
도 14는 실시예6의 반응 방정식이다.
도 15는 실시예7의 반응 방정식이다.
도 16은 실시예8의 반응 방정식이다.
도 17은 실시예9의 반응 방정식이다.
도 18은 실시예10의 반응 방정식이다.
도 19는 실시예11의 반응 방정식이다.
도 20은 실시예12의 반응 방정식이다.
도 21은 실시예13의 반응 방정식이다.
도 22는 실시예14의 반응 방정식이다.
도 23은 실시예15의 반응 방정식이다.
도 24는 실시예16의 반응 방정식이다.
도 25는 실시예17의 반응 방정식이다.
도 26은 HA-A1의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 27은 HA-A2의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 28은 HA-MA1의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 29는 HA-MA2의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 30은 HA-A1-SH1의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 31은 HA-A2-SH1의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 32는 HA-MA1-SH1의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 33은 HA-MA2-SH1의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 34는 HA-A1-SH2의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 35는 HA-A1-SH3의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 36은 HA-A2-SH2의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 37은 HA-A2-SH3의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 38은 HA-A2-SH4의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 39는 HA-A2-SH5의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 40은 HA-A2-SH6의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 41은 HA-A2-SH7의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 42는 HA-A2-SH8의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 43은 HA-MA1-SH5의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 44는 HA-MA1-SH6의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 45는 HA-MA2-SH7의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 46은 HA-MA2-SH8의 구조식 및 이의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 47은 Ellman 검출 기준 곡선이다.
도 48은 DPPH 자유기 함량 검출 기준 곡선이다.
도 49는 DPPH 자유기 포획 백분율이다.
도 50은 HA-A1-SH1, HA-A2-SH1, HA-MA1-SH1, HA-MA2-SH1의 세포 생체 적합성 실험이다.
[메르캅토 변성 히알루론산]
상술한 바와 같이, 본 발명은 새로운 구조를 갖는 메르캅토 변성 히알루론산 계열의 화합물을 제공하며, 상기 히알루론산의 반복 단위의 측쇄에 함유된 -COOH 및/또는 -OH의 일부 또는 전부는 말단기가 하기 그룹인 측쇄를 형성하도록 변형되고,
Figure pct00003
상기 그룹에서, *는 연결점을 나타내며;
R1은 수소, 할로겐, 지방족 그룹, 방향족 그룹 등으로부터 선택되고; 구체적으로, 상기 할로겐, 지방족 그룹, 방향족 그룹은 하기 추가 정의를 충족시키며; 바람직하게는, R1은 수소, 할로겐, 지방족 그룹으로부터 선택되고; 더 바람직하게는, R1은 수소, 할로겐, C1-6 알킬(예를 들어, 메틸, 에틸 등)로부터 선택되며;
R2 및 R3은 동일하거나 상이하고, 독립적으로 수소, 할로겐, 지방족 그룹, 방향족 그룹 등으로부터 선택되며; 구체적으로, 상기 할로겐, 지방족 그룹, 방향족 그룹은 하기 추가 정의를 충족시키고;
R4는 멀티메르캅토 화합물 단편이다.
구체적인 일 구현 실시형태에서, 상기 말단기는 R 그룹을 통해 -COOH 및/또는 -OH와 연결되거나 -COOH 및/또는 -OH와 직접 연결되어 하기 구조 중 적어도 하나의 측쇄를 형성하고,
Figure pct00004
(a 구조)
Figure pct00005
(b 구조)
Figure pct00006
(c 구조)
Figure pct00007
(d 구조)
상기 a 구조, b 구조, c 구조 및 d 구조에서, R은
Figure pct00008
,
Figure pct00009
, 알킬렌(alkylene), 아릴렌(arylene), 아미드(amide) 잔기, 히드라지드(hydrazide) 잔기 등으로부터 선택되며; *는 연결점을 나타내고; 1*은 R의 좌측 그룹과의 연결점을 나타내며; 2*는 R의 우측 그룹과의 연결점을 나타내고; R1, R2, R3 및 R4의 정의는 상술한 바와 같다.
여기서, 상기 메르캅토 변성 히알루론산의 분자량 범위는 5천에서 2천만 달톤이다. 상기 메르캅토 변성 히알루론산의 분자량은 변성 전후의 변화가 크지 않거나, 분자량이 기본적으로 변하지 않았다.
여기서, Ellman법으로 검출된 상기 메르캅토 변성 히알루론산의 메르캅토 함량은 0.01-30 mmol/g이고, 예를 들어 0.1-10.0 mmol/g이며, 더 예를 들어 0.3-5.0 mmol/g이고, 다시 예를 들어 0.5-3.0 mmol/g이다.
예를 들어, 본 발명의 메르캅토 변성 히알루론산은 하기 구조 중 적어도 하나를 포함하고,
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
상기 구조에서, R, R1, R2, R3 및 R4의 정의는 상술한 바와 같으며; (n2+n3)/(n1+n2+n3)은 아크릴로일화 정도를 나타내고; n3/(n1+n2+n3)은 메르캅토화 정도를 나타내며, 상기 Ellman법으로 검출된 상기 메르캅토 변성 고분자 화합물의 메르캅토 함량과 대응되고; 상기 n1은 0일 수 있으며, 0이면 아크릴로일화 정도를 한정할 필요가 없고, 단지 n3/(n2+n3)만 메르캅토화 정도를 나타내며 상기 Ellman법으로 검출된 상기 메르캅토 변성 고분자 화합물의 메르캅토 함량과 대응되고; 상기 n2는 0일 수 있으며, 0이면 n3/(n1+n3)은 아크릴로일화 정도를 나타낼 뿐만 아니라 메르캅토화 정도도 나타내고, 상기 Ellman법으로 검출된 상기 메르캅토 변성 고분자 화합물의 메르캅토 함량과 대응되며;
상기 A1은,
Figure pct00014
이고,
상기 A2는 하기 구조 중 하나이며,
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
A1 및 A2의 구조 중 *는 COOH 또는 OH와의 연결점을 나타낸다.
본 발명에서 특별한 설명이 없는 한, 여기서 나타나는 n1, n2, n3, n4, n5, n6, m1, m2는 모두 구조식에 나타나는 반복 단위의 개수를 의미한다. 그 값의 범위는 본 기술분야의 공지된 통상적인 범위에 속한다.
상술한 바와 같이, R1은 수소, 할로겐, 지방족 그룹, 방향족 그룹 등으로부터 선택되고; R2 및 R3은 동일하거나 상이하며, 독립적으로 수소, 할로겐, 지방족 그룹, 방향족 그룹 등으로부터 선택된다.
상술한 바와 같이, 상기 R은 알킬렌, 아릴렌, 아미드 잔기, 히드라지드 잔기로부터 선택될 수 있다.
상기 할로겐은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 의미한다.
상기 지방족 그룹은 예를 들어 직쇄 또는 측쇄 포화/불포화 지방족 그룹이고, 구체적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐일 수 있다.
본 발명에서 독립적으로 사용되거나 접미사 또는 접두사로 사용되는 “히드로카르빌”은 예를 들어 직쇄 또는 분지쇄 포화/불포화 지방족 그룹이고, 구체적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐일 수 있다.
본 발명에서 독립적으로 사용되거나 접미사 또는 접두사로 사용되는 “알킬”은 1 내지 20개, 바람직하게는 1-6개의 탄소 원자를 갖는 분지쇄 및 측쇄 포화 지방족 히드로카르빌을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, “C1-6알킬”은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자를 갖는 측쇄 및 분지쇄 알킬을 나타낸다. 알킬의 구현예는 메틸, 에틸, N-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸 및 헥실을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 독립적으로 사용되거나 접미사 또는 접두사로 사용되는 “알케닐”은 2 내지 20개, 바람직하게는 2-6개의 탄소 원자(또는 탄소 원자의 구체적인 수가 제공되면 상기 구체적인 수를 의미함)를 갖는 알케닐 또는 알켄을 포함한 분지쇄 및 측쇄 지방족 히드로카르빌을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, “C2-6알케닐”은 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자를 갖는 알케닐을 나타낸다. 알케닐의 구현예는 비닐, 알릴(allyl), 1-프로페닐(1-propenyl), 1-부테닐(1-butenyl), 2-부테닐, 3-부테닐, 2-메틸부트-2-에닐(2-methylbut-2-enyl), 3-메틸부트-1-알케닐, 1-펜테닐(1-pentenyl), 3-펜테닐 및 4-헥세닐(4-hexenyl)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 독립적으로 사용되거나 접미사 또는 접두사로 사용되는 “알키닐”은 2 내지 20개, 바람직하게는 2-6개의 탄소 원자(또는 탄소 원자의 구체적인 수가 제공되면 상기 구체적인 수를 의미함)를 갖는 알키닐 또는 알킨을 포함한 분지쇄 및 측쇄 지방족 히드로카르빌을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 에티닐(ethynyl), 프로피닐(propynyl)(예를 들어, 1-프로피닐, 2-프로피닐), 3-부티닐, 펜티닐, 헥시닐(hexynyl) 및 1-메틸펜트-2-이닐(1-methylpent-2-ynyl)이다.
본 발명에 따른 “알킬렌”은 상기 “히드로카르빌”에서 하나의 수소를 제거한 후의 그룹이다.
상기 방향족 그룹은 5 내지 20개의 탄소 원자로 구성된 방향족 고리 구조를 의미한다. 예를 들어, 5, 6, 7 및 8개의 탄소 원자를 포함하는 방향족 고리 구조는 페닐과 같은 단일 고리 방향족기일 수 있고; 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 탄소 원자를 포함하는 고리 구조는 나프틸과 같은 다중 고리일 수 있다. 방향족 고리는 하나 이상의 고리 위치에서 치환기로 치환될 수 있고, 상기 치환기는 톨릴과 같은 알킬, 할로겐 등이다. 용어 “아릴”은 2개 이상의 고리를 갖는 다중 고리 고리계를 더 포함하되, 여기서 2개 이상의 탄소는 2개의 인접한 고리에 의해 공유되고(상기 고리는 “축합 고리”임), 여기서 적어도 하나의 고리는 방향족이고 다른 고리는 예를 들어, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알키닐, 아릴 및/또는 헤테로시클릴일 수 있다. 다중 고리의 구현예는 2,3-디히드로-1,4-벤조디옥신(2,3-dihydro-1,4-benzodioxine) 및 2,3-디히드로-1-벤조푸란(2,3-dihydro-1-benzofuran)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 “아릴렌”은 상기 “방향족 그룹”에서 하나의 수소를 제거한 후의 기이다.
본 발명에 따른 독립적으로 사용되거나 접미사 또는 접두사로 사용되는 “아미도”는 Ra-C(=O)-NH-그룹을 의미하고, 여기서 Ra는 비치환 또는 하나 이상의 Rb에 의해 선택적으로 치환된 알킬, 시클로알킬, 알케닐, 시클로알케닐, 알키닐, 시클로알키닐, 헤테로시클릴, 아릴, 헤테로아릴 등 그룹으로부터 선택되며; Rb는 비치환 또는 하나 이상의 Rb1에 의해 선택적으로 치환된 할로겐, 히드록실, 메르캅토, 니트로, 시아노, 알킬, 알콕시, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로시클릴, 아릴, 헤테로아릴, 아미노, 카르복실, 에스테르, 히드라진, 아실, 설피닐, 설포닐, 포스포릴 등 그룹으로부터 선택되고; 각각의 Rb1은 독립적으로 할로겐, 히드록실, 알킬, 아릴로부터 선택된다.
본 발명에 따른 독립적으로 사용되거나 접미사 또는 접두사로 사용되는 “히드라지드기”는 Ra-C(=O)-NH-NH-그룹을 의미하며, 여기서 Ra의 정의는 상술한 바와 같다.
본 발명에 따른 “아미드 잔기”는 상기 “아미도”에서 하나의 수소를 제거한 후의 그룹이다.
본 발명에 따른 “히드라지드 잔기”는 상기 “히드라지드기”에서 하나의 수소를 제거한 후의 그룹이다.
본 발명에 사용되는 용어 “시클로알킬”은 지정된 수의 탄소 원자를 갖는 포화 고리 기를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 축합되거나 가교된 다중 고리 시스템을 포함할 수 있다. 시클로알킬은 이의 고리 구조에서 3 내지 40개의 탄소 원자를 갖는다. 일 실시수단에서, 시클로알킬은 이의 고리 구조에서 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자를 갖는다. 예를 들어, “C3-6시클로알킬”은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 또는 시클로헥실과 같은 그룹을 나타낸다.
본 발명에 사용되는 용어 “시클로알케닐”은 지정된 수의 탄소 원자를 갖는 적어도 하나의 알케닐을 함유한 고리 기를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 축합되거나 가교된 다중 고리 시스템을 포함할 수 있다. 시클로알케닐은 이의 고리 구조에서 3 내지 40개의 탄소 원자를 갖는다. 일 실시수단에서, 시클로알케닐은 이의 고리 구조에서 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자를 갖는다. 예를 들어, “C3-6시클로알케닐”은 시클로프로페닐, 시클로부테닐, 시클로펜테닐 또는 시클로헥세닐과 같은 그룹을 나타낸다.
본 발명에 사용되는 용어 “시클로알키닐”은 지정된 수의 탄소 원자를 갖는 적어도 하나의 알키닐을 함유한 고리 기를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 축합되거나 가교된 다중 고리 시스템을 포함할 수 있다. 시클로알키닐은 이의 고리 구조에서 6 내지 40개의 탄소 원자를 갖는다. 일 실시수단에서, 시클로알키닐은 이의 고리 구조에서 6개의 탄소 원자를 갖는다. 예를 들어, “C3-6시클로알키닐”은 시클로프로피닐, 시클로부티닐, 시클로펜티닐 또는 시클로헥시닐과 같은 그룹을 나타낸다.
본 발명에 사용되는 “헤테로아릴”은 적어도 하나의 시클로헤테로 원자(예를 들어, 유황, 산소 또는 질소)를 갖는 헤테로방향족 헤테로 고리를 의미한다. 헤테로아릴은 단일 고리 시스템 및 다중 고리 시스템(예를 들어, 2, 3 또는 4개의 축합 고리를 갖고 있음)을 포함한다. 헤테로아릴의 구현예는, 피리디닐(pyridinyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 피라지닐(pyrazinyl), 피리다지닐(pyridazinyl), 트리아지닐(triazinyl), 푸릴(furyl), 퀴놀리닐(quinolinyl), 이소퀴놀리닐(isoquinolinyl), 티에닐(thienyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 티아졸릴(thiazolyl), 인돌릴(indolyl), 피롤릴(pyrrolyl), 옥사졸릴(oxazolyl), 벤조푸라닐(benzofuranyl), 벤조티에닐(benzothienyl), 벤조티아졸릴(benzothiazolyl), 이속사졸릴(isoxazolyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 트리아졸릴(triazolyl), 테트라졸릴(tetrazolyl), 인다졸릴(indazolyl), 1,2,4-티아디아졸릴(1,2,4-thiadiazolyl), 이소티아졸릴(isothiazolyl), 벤조티에닐(benzothienyl), 퓨리닐(purinyl), 카르바졸릴(carbazolyl), 벤즈이미다졸릴(benzimidazolyl), 벤조옥사졸릴(benzoxazolyl), 아자벤조옥사졸릴(azabenzoxazolyl), 이미다조티아졸릴(imidazothiazolyl), 벤조[1,4]디옥솔릴(benzo[1,4]dioxolyl), 벤조[1,3]디옥솔릴(benzo[1,3]dioxolyl) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시수단에서, 헤테로아릴은 3 내지 40개의 탄소 원자를 갖고 다른 실시수단에서 3 내지 20개의 탄소 원자를 갖는다. 일부 실시수단에서, 헤테로아릴은 3 내지 14개, 4 내지 14개, 3 내지 7개 또는 5 내지 6개의 고리-형성 원자를 포함한다. 일부 실시수단에서, 헤테로아릴은 1 내지 4개, 1 내지 3개 또는 1 내지 2개의 헤테로 원자를 갖는다. 일부 실시수단에서, 헤테로아릴은 1개의 헤테로 원자를 갖는다.
본 발명에 사용되는 용어 “헤테로시클릴”은 3 내지 20개의 원자를 포함한 포화, 불포화 또는 부분 포화의 단일 고리, 이중 고리 또는 삼중 고리를 의미하고, 여기서 1, 2, 3, 4 또는 5개의 고리 원자는 질소, 유황, 산소 또는 인으로부터 선택되며, 달리 설명되지 않는 한, 이는 탄소 또는 질소를 통해 연결될 수 있고, 여기서 -CH2-그룹은 -C(O)-에 의해 선택적으로 대체되며; 여기서 다른 반대의 설명이 없는 한, 고리 질소 원자 또는 고리 유황 원자는 선택적으로 산화되어 N-옥시드 또는 S-옥시드를 형성하거나 고리 질소 원자는 선택적으로 4차화되고; 여기서 고리 중의 -NH는 아세틸(acetyl), 포르밀(formyl), 메틸 또는 메틸설포닐(methylsulfonyl)에 의해 치환되며; 고리는 하나 이상의 할로겐에 의해 치환된다. 이해해야 할 것은, 헤테로시클릴 중 S 원자 및 O 원자의 총수가 1을 초과하는 경우, 이러한 헤테로 원자는 서로 인접하지 않는다. 상기 헤테로시클릴이 이중 고리 또는 삼중 고리이면, 적어도 하나의 고리가 비 헤테로방향족인 조건에 한하여 적어도 하나의 고리는 선택적으로 헤테로방향족 고리 또는 방향족 고리일 수 있다. 상기 헤테로시클릴이 단일 고리이면 이는 반드시 방향족이 아니다. 헤테로시클릴의 구현예는, 피페리디닐(piperidinyl), N-아세틸피페리디닐(N-acetylpiperidinyl), N-메틸피페리디닐(N-methylpiperidinyl), N-포르밀피페라지닐(N-formylpiperazinyl), N-메탄설포닐피페라지닐(N-methanesulfonylpiperazinyl), 호모피페라지닐(homopiperazinyl), 피페라지닐(piperazinyl), 아제티딘알킬(azetidine Alkyl), 옥세타닐(oxetanyl), 모르폴리닐(morpholinyl), 테트라히드로이소퀴놀리닐(tetrahydroisoquinolinyl), 테트라히드로퀴놀리닐(tetrahydroquinolinyl), 디히드로인돌릴(dihydroindolyl), 테트라히드로피란일(tetrahydropyranyl), 디히드로-2H-피라닐(dihydro-2H-pyranyl), 테트라히드로푸라닐(tetrahydrofuranyl), 테트라히드로티오피라닐(tetrahydrothiopyranyl), 테트라히드로티오피란-1-옥시드(tetrahydrothiopyran-1-oxide), 테트라히드로티오피란-1,1-디옥시드(tetrahydrothiopyran-1,1-dioxide), 1H-피리딘-2-온(1H-pyridin-2-one) 및 2,5-디옥소이미다졸리디닐(2,5-dioxoimidazolidinyl)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 사용되는 용어 “아실”은 Ra-C(=O)-그룹을 의미하고, 여기서, Ra의 정의는 상술한 바와 같다.
본 발명에 사용되는 용어 “설피닐”은 Ra-S(=O)-그룹을 의미하고, 여기서, Ra의 정의는 상술한 바와 같다.
본 발명에 사용되는 용어 “설포닐”은 Ra-S(=O)2-그룹을 의미하고, 여기서, Ra의 정의는 상술한 바와 같다.
본 발명에 사용되는 용어 “포스포릴”은 Rc-P(=O)(Rd)-그룹을 의미하고, 여기서, Rc 및 Rd는 동일하거나 상이하며, 독립적으로 비치환된 또는 선택적으로 하나 이상의 Rb에 의해 치환된 알킬, 시클로알킬, 알콕시, 히드록실, 알케닐, 시클로알케닐, 알키닐, 시클로알키닐, 헤테로시클릴, 아릴, 헤테로아릴 등 그룹으로부터 선택되고, Rb의 정의는 상술한 바와 같다.
본 발명에 사용되는 용어 “히드라지노”는 -NHNHRa 그룹을 의미하고, Ra의 정의는 상술한 바와 같다.
본 발명에 사용되는 용어 “아민기”는 -NHRa 그룹 또는 -N(Ra)2 그룹을 의미하고, Ra의 정의는 상술한 바와 같다.
본 발명에 사용되는 용어 “아미노”는 -NH2 그룹을 의미한다.
본 발명에 사용되는 용어 “카르복실”은 -COOH 그룹을 의미한다.
본 발명에 사용되는 용어 “에스테르기”는 Ra-C(=O)-O-그룹 또는 Ra-O-C(=O)-그룹을 의미하고, 여기서, Ra의 정의는 상술한 바와 같다.
상술한 바와 같이, R4는 멀티메르캅토 화합물 단편이고, 즉 -S-R4-SH 단편은 하기 멀티메르캅토 화합물에 의해 도입될 수 있지만 이에 한정되지 않으며,
Figure pct00019
여기서, n4=2-30의 정수이고, 예를 들어 n=2, 3, 4, 5 또는 6이며; n5=1-30의 정수이고, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 등이며, n6=1-30의 정수이고, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 등이며;
4-arm-PEG-SH는 4개의 메르캅토 그룹을 함유한 PEG 폴리머를 나타내고; 6-arm-PEG-SH는 6개의 메르캅토 그룹을 함유한 PEG 폴리머를 나타내며; 8-arm-PEG-SH는 8개의 메르캅토 그룹을 함유한 PEG 폴리머를 나타내고; 상기 PEG는 폴리에틸렌글리콜의 약어이다.
구체적으로, 상기 메르캅토 변성 히알루론산은 하기 구조 중 적어도 하나를 갖지만 이하 구조에 한정되지 않으며,
Figure pct00020
Figure pct00021
HA-A1-SH1로 표기됨 HA-MA1-SH1로 표기됨
Figure pct00022
Figure pct00023
HA-A1-SH2로 표기됨 HA-MA1-SH2로 표기됨
Figure pct00024
Figure pct00025
HA-A1-SH3으로 표기됨 HA-MA1-SH3으로 표기됨
Figure pct00026
Figure pct00027
HA-A1-SH4로 표기됨 HA-MA1-SH4로 표기됨
Figure pct00028
Figure pct00029
HA-A1-SH5로 표기됨 HA-MA1-SH5로 표기됨
Figure pct00030
Figure pct00031
HA-A1-SH6으로 표기됨 HA-MA1-SH6으로 표기됨
Figure pct00032
Figure pct00033
HA-A1-SH7로 표기됨 HA-MA1-SH7로 표기됨
Figure pct00034
Figure pct00035
HA-A1-SH8로 표기됨 HA-MA1-SH8로 표기됨
Figure pct00036
Figure pct00037
HA-A2-SH1로 표기됨 HA-MA2-SH1로 표기됨
Figure pct00038
Figure pct00039
HA-A2-SH2로 표기됨 HA-MA2-SH2로 표기됨
Figure pct00040
Figure pct00041
HA-A2-SH3으로 표기됨 HA-MA2-SH3으로 표기됨
Figure pct00042
Figure pct00043
HA-A2-SH4로 표기됨 HA-MA2-SH4로 표기됨
Figure pct00044
Figure pct00045
HA-A2-SH5로 표기됨 HA-MA2-SH5로 표기됨
Figure pct00046
Figure pct00047
HA-A2-SH6으로 표기됨 HA-MA2-SH6으로 표기됨
Figure pct00048
Figure pct00049
HA-A2-SH7로 표기됨 HA-MA2-SH7로 표기됨
Figure pct00050
Figure pct00051
HA-A2-SH8로 표기됨 HA-MA2-SH8로 표기됨
Figure pct00052
Figure pct00053
HA-A3-SH1로 표기됨 HA-MA3-SH1로 표기됨
Figure pct00054
Figure pct00055
HA-A3-SH2로 표기됨 HA-MA3-SH2로 표기됨
Figure pct00056
Figure pct00057
HA-A3-SH3으로 표기됨 HA-MA3-SH3으로 표기됨
Figure pct00058
Figure pct00059
HA-A3-SH4로 표기됨 HA-MA3-SH4로 표기됨
Figure pct00060
Figure pct00061
HA-A3-SH5로 표기됨 HA-MA3-SH5로 표기됨
Figure pct00062
Figure pct00063
HA-A3-SH6으로 표기됨 HA-MA3-SH6으로 표기됨
Figure pct00064
HA-A3-SH7로 표기됨
Figure pct00065
HA-MA3-SH7로 표기됨
Figure pct00066
HA-A3-SH8로 표기됨
Figure pct00067
HA-MA3-SH8로 표기됨
Figure pct00068
Figure pct00069
HA-A4-SH1로 표기됨 HA-MA4-SH1로 표기됨
Figure pct00070
Figure pct00071
HA-A4-SH2로 표기됨 HA-MA4-SH2로 표기됨
Figure pct00072
Figure pct00073
HA-A4-SH3으로 표기됨 HA-MA4-SH3으로 표기됨
Figure pct00074
Figure pct00075
HA-A4-SH4로 표기됨 HA-MA4-SH4로 표기됨
Figure pct00076
Figure pct00077
HA-A4-SH5로 표기됨 HA-MA4-SH5로 표기됨
Figure pct00078
Figure pct00079
HA-A4-SH6으로 표기됨 HA-MA4-SH6으로 표기됨
Figure pct00080
Figure pct00081
HA-A4-SH7로 표기됨 HA-MA4-SH7로 표기됨
Figure pct00082
Figure pct00083
HA-A4-SH8로 표기됨 HA-MA4-SH8로 표기됨
상기 구조식에서, n1, n2 및 n3의 정의는 상술한 바와 같다.
본 발명의 메르캅토 변성 히알루론산의 경우, 현재 일반적으로 그 물리적 성질을 특성화하기 위해 사용되는 지표 및 측정 방법은 주로 고유 점성도 측정, 보수율 측정 및 항산화 성능 측정 등 3가지가 있다. 고유 점성도 즉 intrinsic viscosity는 고분자 화합물 분자량을 특성화하는 유효 파라미터이며, 이와 대응되는 것은 고성능 겔 투과 크로마토그래피법 및 다각도 레이저 광산란 기기와 겔 투과 크로마토그래피의 결합 방법이다. 상술한 바와 같이, 점도, 보수성, 항산화 성능은 히알루론산의 주요 물리화학적 성질이고, 이러한 물리화학적 성질은 히알루론산의 응용 범위와 밀접히 관계된다. 구체적으로, 본 발명에 따른 메르캅토 변성 히알루론산 계열 화합물의 물리 화학적 특징을 특성화할 경우, 점도는 주요 성능 지표로서, 점도 자체가 반응 분자량 크기의 외적 지표인 것을 제외하고, 인체 내에서 각 메르캅토 변성 히알루론산의 치료또는 또는 성형 등 효과에 영향을 미치는 핵심 지표이기도 하며, 점도가 클수록 조직 내 분산이 어려워 이러한 물질에 대한 조직의 흡수 속도를 감소시키고, 따라서 상기 물질이 인체 내에서 더 오랜 시간 작용하도록 하며, 즉 체내에서의 이의 대사 반감기를 증가시킨다. 이 밖에, 보수 보습 기능은 임상, 화장품 등의 적용에서 이러한 물질에 대한 중요한 기능 지표이며, 보수율은 상기 물질을 평가하는 중요한 지표이자 바람직한 비교 지표이다. 항산화 성능은 본 발명에 포함된 메르캅토 변성 히알루론산의 주요 기능 지표이기도 하며, 이러한 물질이 항산화 화장품, 항산화 건강 기능 식품, 항산화 의약품에 사용되는 주요 기능 지표이고, 항산화 성능의 측정에는 완전한 검출 방법 및 평가 시스템이 구비되어 있다.
고유 점성도법은, 고분자 물질의 유변학적 성질을 이용하여 물질의 분자량을 계산하는 방법으로, 상기 방법은 간단하고 구현이 용이하며, 지금까지 널리 응용되고 있다. 예를 들어, 《유럽 약전》 및 《영국 약전》에 등재되어 있는 히알루론산나트륨의 검사항목은 고유 점성도법으로 그 질량을 조절하여 분자량을 조절하는 것이다. 상기 방법은 대조품이 필요하지 않으나 샘플의 순도의 영향을 크게 받으며 용액 내 히알루론산의 함량을 정확히 알 필요가 있다. 고유 점성도법은 고가의 장비가 필요 없고 검출 방법이 간단하고 정확하기 때문에 히알루론산의 분자량 측정에 가장 많이 사용되는 방법이다. 현재 이 방법으로 히알루론산 용액의 분자량을 측정할 경우, 우선 용액을 에탄올 침전시키고, 침전물을 수집하여 건조시켜 고체를 얻은 후 측정하며, 상기 방법의 복잡한 결과는 정확하지 않고 시간이 많이 걸린다. 고유 점성도법에 근접한 것은 이러한 고분자 화합물의 점도를 직접 측정하는 것이며, 이러한 고분자 화합물의 점도 역시 분자량과 관계가 있는 중요한 특성화 물리화학적 지표이다.
첨부: 이러한 고분자 화합물의 분자량을 특성화하는 두 가지 다른 측정 방법은 즉 고성능 겔 투과 크로마토그래피법 및 다각도 레이저 광산란 기기와 겔 투과 크로마토그래피의 결합 방법이다.
고성능 겔 투과 크로마토그래피(HPGPC)는 분자 크기에 따라 분리하는 액체 크로마토그래피 기술로, 크로마토그래피 컬럼을 통과하는 물질의 보류 시간은 이의 분자량의 로그와 선형적 음의 상관관계를 나타낸다. 상기 방법은 재현성이 좋고 속도가 빠르며 평균 분자량 및 분포를 측정할 수 있다. 그러나 HPGPC법에 의한 분자량 측정은 대응되는 대조품으로 보정해야 하며, 히알루론산 대조품은 일반적으로 구하기 어렵기 때문에 구조가 유사한 샘플만 대조품으로서 선택할 수 있으며, 대조품 구조가 다르고 측정된 분자량이 다르기 때문에 샘플의 측정된 샘플 분자량이 실제값과 일정한 편차가 있다.
다각도 레이저 광산란 기기와 겔 투과 크로마토그래피의 결합 방법, 즉 GPC/MALLS법은 이동상의 분자 상태에 관계없이 모든 분자량 범위의 고분자 샘플에 대해, 모두 샘플의 용출 도표에서 각 분획점의 농도 및 분자량을 얻을 수 있다. 상기 방법은 대조품 없이 샘플의 분자량을 얻을 수 있으며 측정 결과는 정확하고 신뢰적이다. 그러나 상기 장비가 고가이고 초고분자량 측정의 경우, 샘플이 다공성 매질에서 전단 분해가 발생할 수 있으며 겔 컬럼을 차단할 수도 있다. 따라서 이 방법의 적용은 제한적이다.
보수율 측정 방법: 적절한 샘플 및 효과 비교 샘플을 선택한 기초상에서, 다양한 생체 적합성 고분자 재료의 보수 성능을 측정하며, 주로 순수한 물에서의 수분 흡수율, 적절한 용액에서의 액체 흡수율, 순수한 물 또는 적절한 용액에서의 물 흡수율, 보수성, 반복 흡수성 및 모의 조직액, 모의 세포액을 포함하는 인체 내 사용 환경에서의 모의 액체의 액체 흡수 성능 등 지표를 측정한다. 테스트된 시험은 모두 반복 및 검증 과정을 거친다.
상이한 보수제의 수분 흡수율(Q)의 측정은 하기 식에 따라 산출된다. (m2-m1)/m1, 여기서 m1 및 m2는 질량 기준의 건조 상태에서 수분 흡수가 포화상태에 도달한 후 생체 적합성 고분자 화합물의 보수제 질량으로, 일반적으로 그램 단위로 표시한다. 질량 기준에서 건조 상태는 완제품의 함수량이 10 %를 초과하지 않는 것을 의미한다.
상이한 생체 적합성 고분자 화합물의 흡수율은, 흡수율을 측정하기 위한 여과 방법에 따라 측정된다. 약 1 g의 생체 적합성 고분자 또는 적당량의 중량부를 칭량하고 정밀하게 칭량하여 각각 물 또는 상이한 용액에 정치시키며, 순차적으로 다른 시간에 여과하고 칭량하여 다른 시간에서 보수제의 흡수율을 얻는다.
항산화 성능 측정: 본 특허와 관련된 생체 적합성 고분자 재료의 항산화 성능 측정법은, 자유기 소거 능력으로 각 생체 적합성 고분자 화합물의 항산화 성능을 평가하며, 여기서의 자유기 소거는 주로 산소 자유기의 소거를 의미하며, 의료 분야에서 성숙되고 업계에서 인정하는 측정 방법이다.
[메르캅토 변성 히알루론산의 제조 방법]
상술한 바와 같이, 본 발명은,
1) 히알루론산의 아크릴로일화 단계, 즉 히알루론산의 반복 단위의 측쇄에 함유된 -COOH, -OH 중 적어도 하나를 하기 그룹과 직접 또는 간접적으로 연결시키되,
Figure pct00084
R1, R2 및 R3의 정의는 상술한 바와 같고; *는 연결점을 나타내며;
2) 아크릴로일화의 히알루론산을 멀티메르캅토 화합물 HS-R4-SH와 반응시켜, 상기 메르캅토 변성 히알루론산을 제조하되, R4의 정의는 상술한 바와 같은 단계를 포함하는 상기 메르캅토 변성 히알루론산의 제조 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 단계 1)은, 히알루론산의 아크릴로일화 단계로, 히알루론산의 반복 단위의 측쇄에 함유된 -COOH, -OH 중 적어도 하나를 R 그룹을 통해 상기 말단기와 연결시키거나 상기 말단기와 직접 연결시켜 하기 구조의 적어도 하나의 측쇄를 형성하되,
Figure pct00085
(a 구조)
Figure pct00086
(b 구조)
Figure pct00087
(c 구조)
Figure pct00088
(d 구조)
상기 a 구조, b 구조, c 구조 및 d 구조에서, R, R1, R2, R3 및 R4의 정의는 상술한 바와 같으며; *는 연결점을 나타낸다.
단계 1)에서, 상기 아크릴로일화 단계는, 변성될 히알루론산과 아크릴레이트 화합물의 반응을 통해 구현될 수 있고, 변성될 히알루론산과 아크릴클로라이드 화합물 또는 아크릴산 무수물 화합물의 반응을 통해 구현될 수도 있다.
상기 아크릴레이트 화합물은, 알킬아크릴레이트(alkyl acrylate) 화합물, 아릴아크릴레이트(aryl acrylate) 화합물, 다가 알코올 아크릴레이트(polyhydric alcohol acrylate) 화합물 중 하나 이상일 수 있다.
상기 다가 알코올 아크릴레이트 화합물 중의 다가 알코올은 예를 들어 3가 알코올이고, 구체적으로 글리세롤(glycerol), 부탄트리올(butanetriol), 펜타트리올(pentatriol) 등일 수 있다.
단계 1)에서, 상기 아크릴로일화 단계는 통상적인 반응 단계일 수 있고, 종래의 일반 조건을 사용하여 반응시키면 된다. 통상적으로 아크릴로일 클로라이드 및 이의 유도체 또는 아크릴산 무수물 및 이의 유도체와 변성될 히알루론산을 반응시켜 얻는다. 또한 글리시딜아크릴레이트(Glycidyl acrylate) 및 이의 유도체와 변성될 히알루론산을 반응시켜 얻을 수 있다.
단계 1)에서, 상기 아크릴로일화 단계는 비통상적인 반응 단계일 수 있고, 상기 이외의 방법으로 합성된 a 구조식 , b 구조식 , c 구조식 , d 구조식 중 적어도 하나를 함유하는 고분자 화합물이다.
단계 1)에서, 상기 아크릴로일화 단계의 생성물의 구조는 하기 구조 중 적어도 하나이고,
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
상기 구조에서, R, R1, R2 및 R3의 정의는 상술한 바와 같으며; (m2)/(m1+m2)는 아크릴로일화 정도이다.
단계 2)에서, 멀티메르캅토 화합물 HS-R4-SH와의 반응은 용매에서 수행된다. 상기 용매는 예를 들어 물 또는 유기 용매이고, 또한 탈이온수 또는 디메틸포름아미드(dimethylformamide)일 수 있다.
단계 2)에서, 멀티메르캅토 화합물 HS-R4-SH와의 반응은 저온 내지 고온 조건에서 수행된다. 예를 들어 반응 온도는 0-80 ℃이고, 또한 10-70 ℃일 수 있으며, 예를 들어 실온에서 반응할 수 있다.
단계 2)에서, 멀티메르캅토 화합물 HS-R4-SH와의 반응 시간은 0.1-100시간이다.
단계 2)에서, 멀티메르캅토 화합물 HS-R4-SH와의 반응 pH 범위는 -1 내지 15이다. 예를 들어 반응 pH는 6-8일 수 있고, 다시 예를 들어 7이다.
여기서, 단계 2)의 반응 생성물은 후처리 단계를 더 포함한다.
여기서, 상기 후처리 단계는 투석 방법을 사용한다. 구체적으로, 반응 후의 용액을 투석백(예를 들어, 분자량 컷오프 2kDa 이상인 투석백)에 넣고, 염산 용액(예를 들어, pH=4)으로 수일 동안(예를 들어 1-10일, 더 예를 들어 5일 등) 투석하며, 선택적으로 여러 차례(예를 들어, 2회 이상 등) 물을 교체(예를 들어, 매일 또는 격일로 물을 교체)하고, 마지막에 투석백 내의 용액을 수집하여, 건조(예를 들어, 동결 건조)시킨 후 고체 즉 상기 메르캅토 변성 히알루론산 유도체를 얻는다.
본 발명의 방법에서는 멀티메르캅토 화합물의 메르캅토와 아크릴로일 그룹 중의 탄소-탄소 이중결합의 마이클 부가 반응으로 상기 메르캅토 변성 히알루론산을 제조하는 것을 최초로 제안하였으며, 상기 방법은 메르캅토화 정도가 높을 뿐만 아니라, 메르캅토화 반응 조건이 온화하고(상온, 수용액에서 수행될 수 있음), 오염이 없으며, 제조된 메르캅토 변성 히알루론산의 순도가 높아, 특히 의약, 미용, 의학 등 분야에서 추가로 사용하기에 적합하다.
[메르캅토 변성 히알루론산의 응용]
상술한 바와 같이, 본 발명은 항산화 건강 기능 식품, 생물 의약, 의료 미용 및 성형, 화장품(항산화 화장품, 보수 보습 화장품 중 적어도 하나) 등 분야에 사용되는 상기 메르캅토 변성 히알루론산의 용도를 더 제공한다.
이미 알려진 바와 같이, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)은 이당류가 반복적으로 교대로 연결되어 조성된 선형의 비분지형 대분자 산성 점액 다당 폴리머(구조 단위는 각각 β-(1,4)-N-아세틸-D-글루코사민 및 β-(1,3)-D-글루쿠론산)이다. HA 사슬 길이는 약 5kDa에서 20MDa까지 다양하며 가장 일반적인 크기는 2MDa에서 5MDa이다. 히알루론산의 50 % 이상이 피부, 폐 및 장 조직에서 발견된다. 또한 관절 활액, 연골, 탯줄, 혈관벽 등 조직의 간질에도 존재한다. 인체 내 히알루론산은 주로 윤활 및 완충 작용, 장벽의 충진 및 확산, 자유기 소거와 같은 생리적 기능의 역할을 한다. 현재 시판되고 있는 히알루론산 제품은 동물 조직(예를 들어, 맨드라미, 눈 유리체, 뇌연골, 관절액)으로부터 추출할 수 있으며, 세균(예를 들어, 연쇄상구균, 녹농균) 발효로도 제조될 수 있다. 최근 몇년간, HA에 대한 심층적 연구와 함께, HA는 약물 전달 시스템의 제조, 정형외과 및 안과 질환의 치료, 수술 후 유착 예방 및 연조직 회복과 같은 의약 분야에 널리 응용되고 있으며, 상기 방향은 조직 공학과 재생 의학 분야의 연구 이슈로 되었다. 천연 HA는 생체 적합성 및 항염 효과가 뛰어나지만 단순한 천연 HA는 기계적 강도가 약하고 분해가 쉽다. 따라서 조직 공학을 위한 스캐폴드 재료로서 HA는 이러한 결함을 개선하고 생물학적 효과를 더 잘 발휘하며 세포 생존과 기능, 조직 복구 및 재생을 위한 좋은 환경을 제공하기 위해 적절하게 화학적으로 변성되거나 다른 재료와 조합하여 사용해야 한다.
본 발명은 메르캅토 변성 히알루론산, 즉 HA-SH를 제조하였으며, 상기 HA-SH는 메르캅탄 산화 가교를 통해 안정적인 가교 재료(e.g. 히드로겔)를 형성할 수 있으며, 상기 가교 재료의 역학적 성능은 우위적이고, 양호한 물리적 안정성 및 기계적 강도를 가지며; 이 밖에, 체내 대사 속도를 제어할 수 있으며, 상기 HA-SH는 또한 다른 성분의 생체 기능 재료와 함께 사용되어 서로의 장단점을 보완함으로써 우수한 특성을 가진 3차원 스캐폴드 재료를 획득할 수도 있고, 대부분의 조직 공학의 응용 요구를 충족시킬 수 있다.
아래에 구체적인 실시예를 결합하여 본 발명을 더 설명한다. 이해해야 할 것은, 이러한 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호 범위를 한정하려는 것이 아니다. 이 밖에, 이해해야 할 것은, 본 발명에 개시된 내용을 열독한 이후, 본 기술분야의 기술자는 본 발명에 대해 다양한 변경 또는 수정을 수행할 수 있고, 이러한 등가 형태는 마찬가지로 본 발명에 의해 한정된 보호 범위 이내에 포함된다.
본 발명에서, 상기 1H-NMR 스펙트럼은 Varian 400MHz 핵자기공명기기로 측정하였으며, 시험 온도는 25 섭씨도이고, 이완 시간은 1초이며, 스캔 횟수는 8회이다. 구체적으로 시험 물질 8 ~ 10 mg을 취하여 750 μL의 중수에 용해시키고 얻은 샘플 용액의 1H-NMR 스펙트럼을 시험한다.
제조예1 아크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-A1이라 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 1 g의 히알루론산(Huaxi Freda Company에서 구입, 그 중량 평균 분자량은 약 300kDa임), 50 mL의 탈이온수, 50 mL의 디메틸포름아미드, 12 mL의 트리에틸아민(Triethylamine), 14 mL의 글리시딜아크릴레이트를 첨가한다. 실온에서 균일하고 투명해질 때까지 교반한 후, 48시간 동안 계속 교반하였다. 300 mL의 아세톤(acetone)을 첨가하여 대량의 백색 침전물이 생성되었다. 원심분리하여 얻은 침전물을 100 mL의 탈이온수에 용해시켜 무색 투명한 용액을 얻었다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa)에 넣고 5 L의 탈이온수로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 921 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-A1을 얻었으며, 수율은 92.1 %이다.
HA-A1의 구조식은 도 26을 참조한다. 도 26은 단지 모식도이며, 상기 히알루론산의 부분 반복 단위 중의 COOH가 글리시딜아크릴레이트에 의해 에스테르화된 것을 나타내고, 즉 여기서 m2/(m1+m2)는 아크릴로일화 정도를 나타내며, m1+m2=n이고 n은 미변성 히알루론산의 반복 단위 수이다. 아래 제조예 및 실시예에서의 구조식의 의미는 제조예1과 동일하며 더이상 반복 설명하지 않는다.
HA-A1의 1H-NMR 스펙트럼은 도 26을 참조하며, 6-6.5ppm 사이에 위치한 아크릴산 작용기에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 상기 그룹이 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
제조예2 아크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-A2로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 1 g의 히알루론산(Huaxi Freda Company에서 구입, 그 중량 평균 분자량은 약 400kDa임), 50 mL의 탈이온수, 50 mL의 디메틸포름아미드, 6.3 g의 아크릴산 무수물을 첨가하고 교반하여 용해시킨다. 1 mol/L의 NaOH로 용액 pH=8±0.5로 유지시키고 계속하여 24시간 동안 교반하였다. 300 mL의 아세톤을 첨가하여 대량의 백색 침전물이 생성되었다. 원심분리하여 얻은 침전물을 100 mL의 탈이온수에 용해시켜 무색 투명한 용액을 얻었다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고 5 L의 탈이온수로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 789 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-A2를 얻었으며, 수율은 78.9 %이다.
HA-A2의 구조식은 도 27을 참조한다.
HA-A2의 1H-NMR 스펙트럼은 도 27을 참조하며, 5.8-6.4ppm 사이에 위치한 아크릴산 작용기에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 상기 그룹이 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
제조예3 메타크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-MA1로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 1 g의 히알루론산(Huaxi Freda Company에서 구입, 그 중량 평균 분자량은 약 400kDa), 50 mL의 탈이온수, 50 mL의 디메틸포름아미드(Sigma), 12 mL의 트리에틸아민(Sigma), 15 mL의 글리시딜 메타크릴레이트(glycidyl methacrylate)를 첨가한다. 실온에서 균일하고 투명해질 때까지 교반한 후, 48시간 동안 계속 교반하였다. 300 mL의 아세톤(Sigma)을 첨가하여 대량의 백색 침전물이 생성되었다. 원심분리하여 얻은 침전물을 100 mL의 탈이온수에 용해시켜 무색 용액을 얻었다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고 5 L의 탈이온수로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 859 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-MA1을 얻었으며, 수율은 85.9 %이다.
HA-MA1의 구조식은 도 28을 참조한다.
HA-MA1의 1H-NMR 스펙트럼은 도 28을 참조하며, 5.8-6.2ppm 사이에 위치한 메타크릴산 작용기에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 상기 그룹이 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
제조예4 메타크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-MA2로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 1 g의 히알루론산(Huaxi Freda Company에서 구입, 그 중량 평균 분자량은 약 400kDa), 100 mL의 탈이온수를 첨가하고 실온에서 교반하여 용해시킨다. 7.7 g의 메타크릴산 무수물을 더 첨가하고 교반하여 용해시킨다. 1 mol/L의 NaOH로 용액 pH=8±0.5로 유지시키고 계속하여 24시간 동안 교반하였다. 200 mL의 아세톤(Sigma)을 첨가하여 대량의 백색 침전물이 생성되었다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고 5 L의 탈이온수로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 846 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-MA2를 얻었으며, 수율은 84.6 %이다.
HA-MA2의 구조식은 도 29를 참조한다.
HA-MA2의 1H-NMR 스펙트럼은 도 29를 참조하며, 5.8-6.2ppm 사이에 위치한 메타크릴산 작용기에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 상기 그룹이 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예1 메르캅토-아크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-A1-SH1로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 제조예1의 방법에 따라 제조된 1 g의 HA-A1, 0.3 g의 디티오트레이톨(dithiothreitol)(VWR회사에서 구입), 100 mL의 탈이온수를 첨가하고 실온에서 교반하여 용해시켜, 투명 용액을 얻었다. 얻은 투명 용액을 12시간 동안 계속 교반하였다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고 5 L의 pH=4인 염산 용액으로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 842 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-A1-SH1을 얻었으며, 수율은 84.2 %이다.
HA-A1-SH1의 반응 방정식은 도 9에 도시된 바와 같고, 그 구조식은 도 9 및 도 30을 참조한다.
HA-A1-SH1의 1H-NMR 스펙트럼은 도 30, 2.3-2.8ppm 사이에 위치한 메르캅토 측쇄에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 메르캅토가 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예2 메르캅토-아크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-A2-SH1로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 제조예2의 방법에 따라 제조된 1 g의 HA-A2, 0.3 g의 디티오트레이톨(VWR), 100 mL의 탈이온수를 첨가하고 실온에서 교반하여 용해시켜, 투명 용액을 얻었다. 얻은 투명 용액을 12시간 동안 계속 교반하였다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고, 5 L의 pH=4인 염산 용액으로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 827 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-A2-SH1을 얻었으며, 수율은 82.7 %이다.
HA-A2-SH1의 반응 방정식은 도 10에 도시된 바와 같고, 그 구조식은 도 10 및 도 31을 참조한다.
HA-A2-SH1의 1H-NMR 스펙트럼은 도 31을 참조하며, 2.6-2.9ppm사이에 위치한 메르캅토 측쇄에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 메르캅토가 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예3 메르캅토-메타크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-MA1-SH1로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 제조예3의 방법에 따라 제조된 1 g의 HA-MA1, 0.3 g의 디티오트레이톨(VWR), 100 mL의 탈이온수를 첨가하고 실온에서 교반하여 용해시킨다. 얻은 투명 용액을 12시간 동안 계속 교반하였다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고, 5 L의 pH=4인 염산 용액으로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 약 854 mg의 백색 응집성 고체를 얻었다. 즉 HA-MA1-SH1을 얻었으며, 수율은 85.4 %이다.
HA-MA1-SH1의 반응 방정식은 도 11에 도시된 바와 같고, 그 구조식은 도 11 및 도 32를 참조한다.
HA-MA1-SH1의 1H-NMR 스펙트럼은 도 32를 참조하며, 2.6-3.0ppm사이에 위치한 메르캅토 측쇄에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 메르캅토가 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예4 메르캅토-메타크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-MA2-SH1로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 제조예4의 방법에 따라 제조된 1 g의 HA-MA2, 0.3 g의 디티오트레이톨(VWR), 100 mL의 탈이온수를 첨가하고 실온에서 교반하여 용해시킨다. 얻은 투명 용액을 12시간 동안 계속 교반하였다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고, 5 L의 pH=4인 염산 용액으로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 약 833 mg의 백색 응집성 고체를 얻었다. 즉 HA-MA2-SH1을 얻었으며, 수율은 83.3 %이다.
HA-MA2-SH1의 반응 방정식은 도 12에 도시된 바와 같고, 그 구조식은 도 12 및 도 33을 참조한다.
HA-MA2-SH1의 1H-NMR 스펙트럼은 도 33을 참조하며, 2.6-3.0ppm사이에 위치한 메르캅토 측쇄에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 메르캅토가 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예5 메르캅토-아크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-A1-SH2로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 제조예1의 방법에 따라 제조된 1 g의 HA-A1, 0.42 g의 1,4-부탄디메르캅탄(Sigma회사에서 구입), 100 mL의 탈이온수를 첨가하고, 실온에서 교반하여 용해시켜, 투명 용액을 얻었다. 얻은 투명 용액을 12시간 동안 계속 교반하였다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고, 5 L의 pH=4인 염산 용액으로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 852 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-A1-SH2를 얻었으며, 수율은 85.2 %이다.
HA-A1-SH2의 반응 방정식은 도 13에 도시된 바와 같고, 그 구조식은 도 13 및 도 34를 참조한다.
HA-A1-SH2의 1H-NMR 스펙트럼은 도 34를 참조하며, 1.6-1.9ppm사이에 위치한 메르캅토 측쇄에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 메르캅토가 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예6 메르캅토-아크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-A1-SH3으로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 제조예1의 방법에 따라 제조된 1 g의 HA-A1, 0.43 g의 2-아미노-1,4-부탄디메르캅탄 염산염(Sigma회사에서 구입), 100 mL의 탈이온수를 첨가하고, 실온에서 교반하여 용해시켜, 투명 용액을 얻었다. 얻은 투명 용액을 12시간 동안 계속 교반하였다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고, 5 L의 pH=4인 염산 용액으로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 843 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-A1-SH3을 얻었으며, 수율은 84.3 %이다.
HA-A1-SH3의 반응 방정식은 도 14에 도시된 바와 같고, 그 구조식은 도 14 및 도 35를 참조한다.
HA-A1-SH3의 1H-NMR 스펙트럼은 도 35를 참조하며, 3.0-3.2ppm사이에 위치한 메르캅토 측쇄에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 메르캅토가 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예7 메르캅토-아크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-A2-SH2로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 제조예2의 방법에 따라 제조된 1 g의 HA-A2, 0.42 g의 1,4-부탄디메르캅탄(Sigma회사에서 구입), 100 mL의 탈이온수를 첨가하고, 실온에서 교반하여 용해시켜, 투명 용액을 얻었다. 얻은 투명 용액을 12시간 동안 계속 교반하였다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고, 5 L의 pH=4인 염산 용액으로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 827 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-A2-SH2를 얻었으며, 수율은 82.7 %이다.
HA-A2-SH2의 반응 방정식은 도 15에 도시된 바와 같고, 그 구조식은 도 15 및 도 36을 참조한다.
HA-A2-SH2의 1H-NMR 스펙트럼은 도 36을 참조하며, 1.6-1.9ppm사이에 위치한 메르캅토 측쇄에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 메르캅토가 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예8 메르캅토-아크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-A2-SH3으로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 제조예2의 방법에 따라 제조된 1 g의 HA-A2, 0.43 g의 2-아미노-1,4-부탄디메르캅탄 염산염(Sigma), 100 mL의 탈이온수, 실온에서 교반하여 용해시켜, 투명 용액을 얻었다. 얻은 투명 용액을 12시간 동안 계속 교반하였다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고, 5 L의 pH=4인 염산 용액으로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 833 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-A2 -SH3을 얻었으며, 수율은 83.3 %이다.
HA-A2-SH3의 반응 방정식은 도 16에 도시된 바와 같고, 그 구조식은 도 16 및 도 37을 참조한다.
HA-A2-SH3의 1H-NMR 스펙트럼은 도 37을 참조하며, 3.0-3.2ppm사이에 위치한 메르캅토 측쇄에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 메르캅토가 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예9 메르캅토-아크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-A2-SH4로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 제조예2의 방법에 따라 제조된 1 g의 HA-A2, 0.38 g의 1,3-프로판디메르캅탄(1,3-propanedithiol)(Sigma회사에서 구입), 100 mL의 탈이온수, 실온에서 교반하여 용해시켜, 투명 용액을 얻었다. 얻은 투명 용액을 12시간 동안 계속 교반하였다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고, 5 L의 pH=4인 염산 용액으로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 814 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-A2 -SH4을 얻었으며, 수율은 81.4 %이다.
HA-A2-SH4의 반응 방정식은 도 17에 도시된 바와 같고, 그 구조식은 도 17 및 도 38을 참조한다.
HA-A2-SH4의 1H-NMR 스펙트럼은 도 38을 참조하며, 2.5-2.8ppm사이에 위치한 메르캅토 측쇄에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 메르캅토가 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예10 메르캅토-아크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-A2-SH5로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 제조예2의 방법에 따라 제조된 1 g의 HA-A2, 0.52 g의 1,3-벤젠디메르캅탄(1,3-Benzenedithiol)(Sigma회사에서 구입), 100 mL의 탈이온수, 실온에서 교반하여 용해시켜, 투명 용액을 얻었다. 얻은 투명 용액을 12시간 동안 계속 교반하였다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고, 5 L의 pH=4인 염산 용액으로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 836 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-A2-SH5를 얻었으며, 수율은 83.6 %이다.
HA-A2-SH5의 반응 방정식은 도 18에 도시된 바와 같고, 그 구조식은 도 18 및 도 39를 참조한다.
HA-A2-SH5의 1H-NMR 스펙트럼은 도 39를 참조하며, 6.9-7.4ppm사이에 위치한 메르캅토 측쇄에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 메르캅토가 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예11 메르캅토-아크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-A2-SH6으로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 제조예2의 방법에 따라 제조된 1 g의 HA-A2, 0.52 g의 1,4-벤젠디메르캅탄(Sigma회사에서 구입), 100 mL의 탈이온수, 실온에서 교반하여 용해시켜, 투명 용액을 얻었다. 얻은 투명 용액을 12시간 동안 계속 교반하였다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고, 5 L의 pH=4인 염산 용액으로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 831 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-A2-SH6을 얻었으며, 수율은 83.1 %이다.
HA-A2-SH6의 반응 방정식은 도 19에 도시된 바와 같고, 그 구조식은 도 19 및 도 40을 참조한다.
HA-A2-SH6의 1H-NMR 스펙트럼은 도 40을 참조하며, 6.8-7.0ppm사이에 위치한 메르캅토 측쇄에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 메르캅토가 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예12 메르캅토-아크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-A2-SH7로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 제조예2의 방법에 따라 제조된 1 g의 HA-A2, 0.96 g의 메르캅토폴리에틸렌글리콜(Sigma회사에서 구입), 100 mL의 탈이온수, 실온에서 교반하여 용해시켜, 투명 용액을 얻었다. 얻은 투명 용액을 12시간 동안 계속 교반하였다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고, 5 L의 pH=4인 염산 용액으로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 894 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-A2-SH7을 얻었으며, 수율은 89.4 %이다.
HA-A2-SH7의 반응 방정식은 도 20에 도시된 바와 같고, 그 구조식은 도 20 및 도 41을 참조한다.
HA-A2-SH7의 1H-NMR 스펙트럼은 도 41을 참조하며, 3.6ppm에 위치한 메르캅토 측쇄에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 메르캅토가 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예13 메르캅토-아크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-A2-SH8로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 제조예2의 방법에 따라 제조된 1 g의 HA-A2, 0.74 g의 트리메틸올프로판일-트리스(3-메르캅토프로피오네이트)(Trimethylolpropanyl-tris(3-mercaptopropionate))(Sigma회사에서 구입), 50 mL의 탈이온수 및 50 mL의 디메틸포름아미드를 첨가하고, 실온에서 교반하여 용해시켜, 투명 용액을 얻었다. 얻은 투명 용액을 12시간 동안 계속 교반하였다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고, 5 L의 pH=4인 염산 용액으로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 785 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-A2-SH8을 얻었으며, 수율은 78.5 %이다.
HA-A2-SH8의 반응 방정식은 도 21에 도시된 바와 같고, 그 구조식은 도 21 및 도 42를 참조한다.
HA-A2-SH8의 1H-NMR 스펙트럼은 도 42를 참조하며, 0.8-1.0ppm, 1.5ppm, 2.6-2.9ppm사이에 위치한 메르캅토 측쇄에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 메르캅토가 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예14 메르캅토-메타크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-MA1-SH5로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 제조예3의 방법에 따라 제조된 1 g의 HA-MA1, 0.50 g의 1,3-벤젠디메르캅탄(1,3-Benzenedithiol)(Sigma회사에서 구입), 100 mL의 탈이온수를 첨가하고, 실온에서 교반하여 용해시켜, 투명 용액을 얻었다. 얻은 투명 용액을 12시간 동안 계속 교반하였다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고, 5 L의 pH=4인 염산 용액으로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 828 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-MA1-SH5를 얻었으며, 수율은 82.8 %이다.
HA-MA1-SH5의 반응 방정식은 도 22에 도시된 바와 같고, 그 구조식은 도 22 및 도 43을 참조한다.
HA-MA1-SH5의 1H-NMR 스펙트럼은 도 43을 참조하며, 6.9-7.4ppm사이에 위치한 메르캅토 측쇄에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 메르캅토가 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예15 메르캅토-메타크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-MA1-SH6으로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 제조예3의 방법에 따라 제조된 1 g의 HA-MA1, 0.50 g의 1,4-벤젠디메르캅탄(Sigma회사에서 구입), 100 mL의 탈이온수를 첨가하고, 실온에서 교반하여 용해시켜, 투명 용액을 얻었다. 얻은 투명 용액을 12시간 동안 계속 교반하였다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고, 5 L의 pH=4인 염산 용액으로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 833 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-MA1-SH6을 얻었으며, 수율은 83.3 %이다.
HA-MA1-SH6의 반응 방정식은 도 23에 도시된 바와 같고, 그 구조식은 도 23 및 도 44를 참조한다.
HA-MA1-SH6의 1H-NMR 스펙트럼은 도 44를 참조하며, 6.9-7.0ppm사이에 위치한 메르캅토 측쇄에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 메르캅토가 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예16 메르캅토-메타크릴레이트 변형의 히알루론산(HA-MA2-SH7로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 제조예4의 방법에 따라 제조된 1 g의 HA-MA2, 0.92 g의 메르캅토폴리에틸렌글리콜(Sigma회사에서 구입), 100 mL의 탈이온수를 첨가하고, 실온에서 교반하여 용해시켜, 투명 용액을 얻었다. 얻은 투명 용액을 12시간 동안 계속 교반하였다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고, 5 L의 pH=4인 염산 용액으로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 876 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-MA2-SH7을 얻었으며, 수율은 87.6 %이다.
HA-MA2-SH7의 반응 방정식은 도 24에 도시된 바와 같고, 그 구조식은 도 24 및 도 45를 참조한다.
HA-MA2-SH7의 1H-NMR 스펙트럼은 도 45를 참조하며, 3.6ppm에 위치한 메르캅토 측쇄에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 메르캅토가 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예17 메르캅토-메타크릴레이트2 변형의 히알루론산(HA-MA2-SH8로 약칭함)의 합성
200 mL의 비커에 제조예4의 방법에 따라 제조된 1 g의 HA-MA2, 0.68 g의 트리메틸올프로판일-트리스(3-메르캅토프로피오네이트)(Trimethylolpropanyl-tris(3-mercaptopropionate))(Sigma회사에서 구입), 50 mL의 탈이온수 및 50 mL의 디메틸포름아미드를 첨가하고, 실온에서 교반하여 용해시켜, 투명 용액을 얻었다. 얻은 투명 용액을 12시간 동안 계속 교반하였다. 상기 용액을 투석백(분자량 컷오프 8kDa, Spectrum Laboratories Inc.)에 넣고, 5 L의 pH=4인 염산 용액으로 5일 동안 투석하고 물을 하루 2회 교체하였다. 마지막으로 투석백에 담긴 용액을 수집하여 동결건조시킨 후 825 mg의 백색 응집성 고체, 즉 HA-MA2-SH8을 얻었으며, 수율은 82.5 %이다.
HA-MA2-SH8의 반응 방정식은 도 25에 도시된 바와 같고, 그 구조식은 도 25 및 도 46을 참조한다.
HA-MA2-SH8의 1H-NMR 스펙트럼은 도 46을 참조하며, 0.8-1.0ppm, 1.5ppm, 2.6-2.9ppm사이에 위치한 메르캅토 측쇄에 속하는 핵자기 피크를 관찰할 수 있는데, 이는 메르캅토가 히알루론산의 구조에 성공적으로 접목되었음을 증명한다.
실시예18 Ellman법을 이용한 메르캅토 변성 고분자 화합물의 메르캅토 함량 검출
준비 과정:
1. 시험 완충 용액 조제: 0.1 mol/L의 Na2HPO4(1 mmol/L EDTA 함유, 농염산을 사용하여 완충액 pH = 8.0으로 조정함).
2. 기준품 작업 용액 조제: 30 mmol/L 시스테인 용액.
3. Ellman 시약 모액 조제: 0.1 mol/L의 Ellman 시약 용액.
4. 기준품 용액 조제: 표 1
메르캅토 몰 농도 0 mmol/L 0.5 mmol/L 1.0 mmol/L 1.5 mmol/L 2.0 mmol/L
기준품 작업 용액(μL) 0 4 8 12 16
완충액(μL) 240 236 232 228 224
총 부피(μL) 240 240 240 240 240
5. 제품 시험 샘플: 메르캅토 변성 고분자 화합물 샘플 적당량을 취하여 완충 용액에 용해시켜 1 mg/mL의 시험 용액을 조제한다(샘플 당 3개 군의 평행 샘플).
시험 과정:
1. 시스테인 기준품 용액을 상기 단계 4에 따라 0.5 mL 원심분리 튜브에 조제하였다.
2. 1.5 mL 원심분리 튜브를 별도로 취하고 50 μL Ellman 검출액을 1 mL의 완충 용액에 첨가하여 검출액을 얻는다.
3. 240 μL 기준품 용액/시험 샘플 용액을 각각 취하여 시험 과정 단계 2 중의 Ellman 검출액에 혼합 용해시키고 실온에서 15분 동안 반응시킨다.
4. 15분 후 오리피스미터로 412 nm에서의 흡광도를 검출하였다.
5. 제품의 메르캅탄 함량은 얻어진 기준품 용액의 흡광도/농도 기준 곡선으로부터 산출할 수 있다.
메르캅토 함량 검출 기준 곡선은 도 47을 참조하며, 메르캅토 함량의 시험 결과는 표 2를 참조한다.
실시예19 메르캅토 변형 HA의 역학적 점도 검출
500 mg의 메르캅토 변형 고분자 화합물을 취하여 50 mL의 탈이온수에 용해시켜 농도가 1 % w/v인 용액을 얻었다. 25 ℃의 온도 조건에서 회전 점도계를 사용하여 얻은 용액을 시험하여 역학적 점도를 얻었으며, 결과는 표 1을 참조한다.
표 2 메르캅토 변형 고분자 화합물의 메르캅토 함량 및 역학적 점도 검출 결과
샘플 Ellman 검출 결과 점도 검출 결과
메르캅토 함량(mmol/g) 역학적 점도(mPaㆍs)
HA-A1-SH1 1.357 420
HA-A2-SH1 1.424 416
HA-MA1-SH1 1.322 387
HA-MA2-SH1 1.362 441
HA-A1-SH2 1.428 452
HA-A1-SH3 1.347 398
HA-A2-SH2 1.471 435
HA-A2-SH3 1.413 412
HA-A2-SH4 1.458 487
HA-A2-SH5 1.347 437
HA-A2-SH6 1.298 416
HA-A2-SH7 0.974 473
HA-A2-SH8 2.471 451
HA-MA1-SH5 1.242 436
HA-MA1-SH6 1.317 429
HA-MA2-SH7 0.857 481
HA-MA2-SH8 2.146 447
실시예20 GPC를 이용한 메르캅토 변형 고분자 화합물 분자량 및 이의 분포 측정
GPC 유동상은 0.05M 황산나트륨 용액이고, 유속은 1 mL/min이며, 컬럼 온도는 30 ℃이고, 기준 폴리에틸렌글리콜 폴리머를 기준 곡선으로 사용하였다.
5 mg의 메르캅토 변형 HA를 취하여 1 mL의 0.05M 황산나트륨 용액에 용해시키고, 0.22마이크론 필터로 여과한 후 GPC시험을 수행하며, 분자량 및 분포 결과는 표 3을 참조한다.
표 3 메르캅토 변형 HA의 분자량 및 분자량 분포의 검출 결과
샘플 Mn (Da) Mw (Da) PDI
HA-A1-SH1 114599 338178 2.95
HA-A2-SH1 90222 426199 4.72
HA-MA1-SH1 74053 454233 6.13
HA-MA2-SH1 52132 427591 8.20
HA-A1-SH2 102221 454335 4.44
HA-A1-SH3 72720 429952 5.91
HA-A2-SH2 103770 373400 3.60
HA-A2-SH3 83819 411866 4.91
HA-A2-SH4 73382 417944 5.70
HA-A2-SH5 57322 416987 7.27
HA-A2-SH6 76601 337406 4.40
HA-A2-SH7 77628 419439 5.40
HA-A2-SH8 61804 375555 6.08
HA-MA1-SH5 63887 391562 6.13
HA-MA1-SH6 108308 397962 3.67
HA-MA2-SH7 69148 373393 5.40
HA-MA2-SH8 99257 337377 3.39
실시예21 메르캅토 변형 HA의 보수 성능 시험
병 무게를 미리 칭량한 20 mL의 유리 플라스크에 50 mg의 메르캅토 변형 HA를 첨가하고, 5 mL의 탈이온수를 첨가하여 용해시켜 1 % 농도의 용액을 얻고, 질량 감산법에 의해 용액 질량 m0을 얻었다. 유리 플라스크를 37 ℃의 쉐이커에 넣고 일정한 간격으로 용액 질량을 칭량하여 mt를 얻었다. 메르캅토 변형 HA의 보수 능력은 하기 식에 따라 산출될 수 있다.
보수 백분율(%)= mt/m0×100 %
보수율 결과는 표 4를 참조한다.
표 4: 보수율 지표 비교표
샘플 보수율
시점(일)
0 1 2 4 6
HA-A1-SH1 100 % 92.7 % 81.1 % 50.3 % 25.9 %
HA-A2-SH1 100 % 93.4 % 81.7 % 49.1 % 27.6 %
HA-MA1-SH1 100 % 91.6 % 79.1 % 46.9 % 25.4 %
HA-MA2-SH1 100 % 92.6 % 82.3 % 48.5 % 28.1 %
HA-A1-SH2 100 % 89.4 % 76.1 % 39.5 % 16.9 %
HA-A1-SH3 100 % 89.2 % 77.6 % 41.6 % 18.5 %
HA-A2-SH2 100 % 88.6 % 74.4 % 36.7 % 15.6 %
HA-A2-SH3 100 % 86.9 % 77.8 % 33.2 % 13.9 %
HA-A2-SH4 100 % 91.5 % 81.5 % 38.3 % 21.4 %
HA-A2-SH5 100 % 89.4 % 80.5 % 38.8 % 21.1 %
HA-A2-SH6 100 % 87.8 % 76.8 % 47.5 % 24.5 %
HA-A2-SH7 100 % 88.5 % 77.4 % 46.5 % 26.2 %
HA-A2-SH8 100 % 86.8 % 74.9 % 44.4 % 24.8 %
HA-MA1-SH5 100 % 87.7 % 78.3 % 46.5 % 26.6 %
HA-MA1-SH6 100 % 84.7 % 72.1 % 37.4 % 16.0 %
HA-MA2-SH7 100 % 84.3 % 73.5 % 39.4 % 18.4 %
HA-MA2-SH8 100 % 83.9 % 70.5 % 34.8 % 14.8 %
실시예22 DPPH 자유기 포획법에 의한 메르캅토 변형 HA의 항산화성 검출
25 μmol/L의 1,1-디페닐-2-트리니트로페닐히드라진(TNBS)의 절대 에탄올 용액을 작업 용액으로 정밀하게 조제하였다. 일정한 작업 용액을 취하여 에탄올로 희석한 후 일련의 기준품 용액(0, 5, 10, 15, 20, 25 μmol/L)을 얻었다.
메르캅토 변형 HA의 PBS 용액을 정밀하게 조제하여 일련의 농도가 0.1 mg/mL인 시험 샘플 용액을 얻었다.
90 μL의 TNBS 작업 용액을 취하여 10 μL의 시험 샘플 용액과 균일하게 혼합하고, 어두운 조건의 실온에서 30분 동안 보관한 후 TNBS 기준품 용액 및 517 nm에서의 시험 샘플 혼합액의 흡광도를 검출하였으며, 얻은 기준 곡선에 따라 시험 샘플 중 나머지 DPPH의 농도를 산출하고, 시험 샘플 자유기 포획 능력(%)은 하기 식에 따라 산출된다.
자유기 포획 능력(%)=(1-(C샘플/CDPPH))×100 %
DPPH 기준 곡선은 도 48을 참조한다.
자유기 포획 능력은 도 49를 참조한다.
실시예23 본 발명의 HA-SH의 세포 활성의 바람직한 실시예
“GBT 16886.5-2017 의료기계 생물학적 평가+제5 부분+체외 세포 독성 시험” 기준을 참조하여 본 발명의 HA-SH의 세포 활성 및 생체 적합성을 시험하였다. 구체적으로, 다음 MTT법을 사용하였는데, MTT법은 MTT 비색법으로, 세포 생존과 성장을 측정하는 방법이다. 그 검출 원리는 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 석시네이트 탈수소 효소가 외인성 MTT를 수불용성의 청자색 결정형 포르마잔(Formazan)으로 환원시키고 세포에 침착시킬 수 있지만 죽은 세포는 그러한 기능이 없다는 것이다. 디메틸설폭시드(DMSO)는 세포 중의 포르마잔을 용해시킬 수 있고, 490 nm 파장에서 마이크로플레이트 리더로 이의 광 흡수값을 측정하여 간접적으로 살아있는 세포의 수를 반영할 수 있다. 일정한 세포 수 범위 내에서 MTT 결정 형성량은 세포 수에 비례한다. 구체적인 시험 과정과 결과는 다음과 같다.
실시예1-4에서 제조된 메르캅토-아크릴레이트 변형의 히알루론산을 각각 10 mg/mL 용액으로 조제하고 용매는 PBS이며, 용액 pH를 7.35-7.45 사이로 조절한다.
DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium), 10 % 소 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액으로 제조된 세포 배양액을 사용하여 본 발명의 시험 샘플을 100, 500, 1000, 2500, 5000, 10000 μg/mL의 농도로 희석하였다. 블랭크 대조 샘플은 용매이다. 음성 대조 샘플은 세포 배양액이다. L929 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고 각 웰에 8000개의 세포를 첨가하며, 세포가 부착될 때까지 하룻밤 동안 배양한 후, 배양액을 100 μL 샘플 용액으로 교체하고, 5 % CO2, 37 ℃, >90 % 습도 조건에서 24시간 동안 세포 배양기에서 배양하였다. 상기 시험 샘플, 대조 샘플과 세포를 공동으로 배양하였고; 24시간 후 각 시험 농도 조건에서의 세포 활성을 측정하여 음성 대조 샘플의 세포 활성과 비교하였다. 음성 대조군은 100 % 활성이었다. 24시간 후 먼저 각 샘플의 세포 독성 효과로 인한 세포 형태학적 측면의 변화를 관찰하고 기록하였다. 결과는 상이한 농도의 시험 샘플이 세포 형태의 변화를 초래하지 않았음을 보여준다. 배양액을 제거하고 20 μL, 5 mg/mL MTT를 각각의 시험 웰에 첨가하고 4시간 동안 계속하여 인큐베이션하였다. 다음, MTT 용액을 폐기하고 각 웰에 100 μL DMSO 용액을 첨가하여 15분 동안 균일하게 쉐이킹한 후, 마이크로플레이트 리더로 490 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 결과는 도 50을 참조한다. MTT 실험에서 세포 생존율 결과가 70 % 미만인 재료는 잠재적인 세포 독성을 갖는 것으로 간주되었다. 결과, 본 발명에 따른 메르캅토 변형의 히알루론산 세포의 생존율은 상이한 재료 및 상이한 농도 시험 조건에서 모두 70 % 이상이며, 이는 재료가 명백한 세포 독성이 없고 생체 적합성이 우수함을 나타낸다.
이상, 본 발명의 실시형태에 대해 설명하였다. 그러나, 본 발명은 상기 실시형태에 한정되지 않는다. 본 발명의 정신 및 원칙 이내에서 이루어진 모든 수정, 등가 교체, 개선 등은 모두 본 발명의 보호 범위 이내에 포함되어야 한다.

Claims (10)

  1. 메르캅토 변성 히알루론산 화합물로서,
    상기 히알루론산의 반복 단위의 측쇄에 함유된 -COOH 및/또는 -OH의 일부 또는 전부는 말단기가 하기 그룹인 측쇄를 형성하도록 변형되고,
    Figure pct00093

    상기 그룹에서, *는 연결점을 나타내며;
    R1은 수소, 할로겐, 지방족 그룹, 방향족 그룹 등으로부터 선택되고;
    R2 및 R3은 동일하거나 상이하며, 독립적으로 수소, 할로겐, 지방족 그룹, 방향족 그룹 등으로부터 선택되고;
    R4는 멀티메르캅토 화합물 단편인 것을 특징으로 하는 메르캅토 변성 히알루론산 화합물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 말단기는 R 그룹을 통해 -COOH 및/또는 -OH와 연결되거나 -COOH 및/또는 -OH와 직접 연결되어 하기 구조 중 적어도 하나의 측쇄를 형성하고,
    Figure pct00094
    (a 구조)
    Figure pct00095
    (b 구조)
    Figure pct00096
    (c 구조)
    Figure pct00097
    (d 구조)
    상기 a 구조, b 구조, c 구조 및 d 구조에서, R은
    Figure pct00098
    ,
    Figure pct00099
    , 알킬렌(alkylene), 아릴렌(arylene), 아미드(amide) 잔기, 히드라지드(hydrazide) 잔기 등으로부터 선택되며; *는 연결점을 나타내고; 1*은 R의 좌측 그룹과의 연결점을 나타내며; 2*는 R의 우측 그룹과의 연결점을 나타내고; R1, R2, R3 및 R4의 정의는 상술한 바와 같은 것을 특징으로 하는 메르캅토 변성 히알루론산 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 메르캅토 변성 히알루론산은 하기 구조 중 적어도 하나를 포함하고,
    Figure pct00100

    Figure pct00101

    Figure pct00102

    Figure pct00103

    상기 구조에서, R, R1, R2, R3 및 R4의 정의는 상술한 바와 같으며; (n2+n3)/(n1+n2+n3)은 아크릴로일화 정도를 나타내고; n3/(n1+n2+n3)은 메르캅토화 정도를 나타내며, 상기 Ellman법으로 검출된 상기 메르캅토 변성 고분자 화합물의 메르캅토 함량과 대응되고; 상기 n1은 0일 수 있으며, 0이면 아크릴로일화 정도를 한정할 필요가 없고, 단지 n3/(n2+n3)만 메르캅토화 정도를 나타내며 상기 Ellman법으로 검출된 상기 메르캅토 변성 고분자 화합물의 메르캅토 함량과 대응되고; 상기 n2는 0일 수 있으며, 0이면 n3/(n1+n3)은 아크릴로일화 정도를 나타낼 뿐만 아니라 메르캅토화 정도도 나타내고, 상기 Ellman법으로 검출된 상기 메르캅토 변성 고분자 화합물의 메르캅토 함량과 대응되며;
    상기 A1은,
    Figure pct00104
    이고,
    상기 A2는 하기 구조 중 하나이며,
    Figure pct00105
    Figure pct00106

    Figure pct00107
    Figure pct00108

    A1 및 A2의 구조 중 *는 COOH 또는 OH와의 연결점을 나타내는 것을 특징으로 하는 메르캅토 변성 히알루론산 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    R4는 멀티메르캅토 화합물 단편이고, 즉 -S-R4-SH 단편은 하기 멀티메르캅토 화합물에 의해 도입될 수 있지만 이에 한정되지 않으며,
    Figure pct00109

    상기 식에서, n4=2-30의 정수이고, 예를 들어 n=2, 3, 4, 5 또는 6이며; n5=1-30의 정수이고, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 등이며, n6=1-30의 정수이고, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 등이며;
    4-arm-PEG-SH는 4개의 메르캅토 그룹을 함유한 PEG 폴리머를 나타내고; 6-arm-PEG-SH는 6개의 메르캅토 그룹을 함유한 PEG 폴리머를 나타내며; 8-arm-PEG-SH는 8개의 메르캅토 그룹을 함유한 PEG 폴리머를 나타내고; 상기 PEG는 폴리에틸렌글리콜의 약어인 것을 특징으로 하는 메르캅토 변성 히알루론산 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 메르캅토 변성 히알루론산은 하기 구조 중 적어도 하나를 가지고,
    Figure pct00110
    Figure pct00111

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    상기 구조식에서, n1, n2 및 n3의 정의는 상술한 바와 같은 것을 특징으로 하는 메르캅토 변성 히알루론산 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 메르캅토 변성 히알루론산의 제조 방법으로서,
    상기 방법은,
    1) 히알루론산의 아크릴로일화 단계, 즉 히알루론산의 반복 단위의 측쇄에 함유된 -COOH, -OH 중 적어도 하나를 하기 그룹과 직접 또는 간접적으로 연결시키되,
    Figure pct00174

    R1은 수소, 할로겐, 지방족 그룹, 방향족 그룹 등으로부터 선택되고; R2 및 R3은 동일하거나 상이하며, 독립적으로 수소, 할로겐, 지방족 그룹, 방향족 그룹 등으로부터 선택되고; *는 연결점을 나타내며;
    2) 아크릴로일화의 히알루론산을 멀티메르캅토 화합물 HS-R4-SH와 반응시켜, 상기 메르캅토 변성 히알루론산을 제조하되, R4의 정의는 상술한 바와 같은 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 메르캅토 변성 히알루론산의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 단계 1)은, 히알루론산의 아크릴로일화 단계로, 히알루론산의 반복 단위의 측쇄에 함유된 -COOH, -OH 중 적어도 하나를 R 그룹을 통해 상기 말단기와 연결시키거나 상기 말단기와 직접 연결시켜 하기 구조의 적어도 하나의 측쇄를 형성하되,
    Figure pct00175
    (a 구조)
    Figure pct00176
    (b 구조)
    Figure pct00177
    (c 구조)
    Figure pct00178
    (d 구조)
    상기 a 구조, b 구조, c 구조 및 d 구조에서, R, R1, R2, R3 및 R4의 정의는 상술한 바와 같으며; *는 연결점을 나타내는 것을 특징으로 하는 메르캅토 변성 히알루론산의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    단계 1)에서, 상기 아크릴로일화 단계는, 변성될 히알루론산과 아크릴레이트 화합물의 반응을 통해 구현될 수 있고, 변성될 히알루론산과 아크릴클로라이드 화합물 또는 아크릴산 무수물 화합물의 반응을 통해 구현될 수도 있는 것을 특징으로 하는 메르캅토 변성 히알루론산의 제조 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 2)에서, 멀티메르캅토 화합물 HS-R4-SH와의 반응은 용매에서 수행되고;
    바람직하게는, 단계 2)에서, 멀티메르캅토 화합물 HS-R4-SH와의 반응은 저온 내지 고온 조건에서 수행되며;
    바람직하게는, 단계 2)에서, 멀티메르캅토 화합물 HS-R4-SH와의 반응 pH 범위는 -1 내지 15인 것을 특징으로 하는 메르캅토 변성 히알루론산의 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 메르캅토 변성 히알루론산의 용도로서,
    상기 메르캅토 변성 히알루론산은 항산화 건강 기능 식품, 생물 의약, 의료 미용 및 성형, 화장품 등 분야에 사용되는 것을 특징으로 하는 메르캅토 변성 히알루론산의 용도.
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