KR20220097487A - X-연관 만성 육아종 질환을 치료하기 위한 조혈 줄기 세포에서의 렌티바이러스 벡터 - Google Patents

Abstract

특정 구현예에서, X-연관 만성 육아종 질환 (X-CGD)의 치료를 위한 렌티바이러스 벡터가 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 벡터는 CYBB 프로모터 또는 이의 유효 단편; 및 상기 CYBB 프로모터 또는 프로모터 단편에 작동가능하게 연결된 gp91^phox를 암호화하는 핵산을 포함하는, 핵산 작제물을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.

Description

X-연관 만성 육아종 질환을 치료하기 위한 조혈 줄기 세포에서의 렌티바이러스 벡터

관련 출원에 대한 상호-참조

본 출원은 2019년 11월 12일자로 출원된 USSN 62/934,352의 이익 및 이에 대한 우선권을 주장하며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.

정부 지원 진술

[해당 사항 없음]

텍스트 파일로 제공된 서열 목록의 참조에 의한 통합

서열 목록은 2019년 11월 11일에 생성되고 46.4 kb의 크기를 갖는 텍스트 파일, "UCLA-P218P_ST25.txt"로 본원에 제공된다. 텍스트 파일의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

X-연관 만성 육아종 질환 (X-CGD)은 식세포 NADPH 옥시다아제 (PHOX) 복합체의 중요한 서브유닛을 암호화하는 CYBB 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 1차 면역 결핍증이다. 결함이 있는 PHOX 복합체는 감염을 적절하게 제거하도록 하는 면역계의 식세포에 대한 무능을 야기한다.

따라서, 환자는 매우 민감하고, 재발성이며 생명을 위협하는 세균 및 진균 감염으로 고통받는다. 전형적인 대상체에서, 면역계는 감염을 차단하려고 시도하지만 이를 제거할 수 없으며, 이는 해당 조직에 손상을 줄 수 있는 육아종의 특징적인 형성을 야기한다. 만성 육아종 질환의 특징은 일반적으로 소아기에 처음으로 나타나지만, 일부 개체는 말년까지 증상을 나타내지 않는다.

만성 육아종 질환을 가진 사람은 전형적으로 3 내지 4년마다 적어도 하나의 심각한 세균 또는 진균 감염을 갖는다. 폐는 가장 흔한 감염 부위이며 폐렴은 이 병태의 일반적인 특징이다. 만성 육아종 질환을 가진 개체는 뿌리 덮개 폐렴으로 칭해지는 일종의 진균성 폐렴이 발생할 수 있으며, 이는 부패하는 유기 물질, 예컨대 뿌리 덮개, 건초 또는 고엽에 노출된 후 발열 및 숨가쁨을 유발한다. 이러한 유기 물질 및 이들의 분해와 관련된 수많은 진균에 대한 노출은 만성 육아종 질환을 가진 사람의 폐에 진균 감염이 발생하도록 한다. 만성 육아종 질환을 가진 사람의 다른 일반적인 감염 부위는 피부, 간 및 림프절을 포함한다.

염증은 만성 육아종 질환을 가진 사람의 신체 여러 부위에서 발생할 수 있다. 가장 흔하게, 육아종은 위장관 및 비뇨생식기에서 발생한다. 많은 경우 장벽에 염증이 생기며, 중증도는 다양하지만 복통, 설사, 혈변, 메스꺼움 및 구토를 초래할 수 있는 일종의 염증성 장 질환을 유발한다. 만성 육아종 질환을 가진 사람의 다른 일반적인 염증 부위는 위, 결장, 및 직장, 뿐만 아니라 입, 인후 및 피부를 포함한다. 추가적으로, 위장관 내 육아종은 조직 파괴 및 고름 생성 (농양)을 초래할 수 있다. 위 내 염증은 음식물이 장을 통과하는 것을 막아 (위출구 폐쇄), 음식물 소화에 대한 무능을 야기한다. 이러한 소화 문제는 식사 후 구토 및 체중 감소를 유발한다. 비뇨생식기에서, 염증은 신장 및 방광에 생길 수 있다. 둘 다 면역 세포를 생성하는 림프절 (임파선염) 및 골수 (골수염)의 염증은 면역계의 추가 손상으로 이어질 수 있다.

드물게, 만성 육아종 질환을 가진 사람은 면역계가 오작동하여 자신의 신체 조직 및 기관을 공격할 때 발생하는 자가면역 질환이 발병한다.

감염 및 염증의 반복된 에피소드는 만성 육아종 질환이 있는 개체의 기대 수명을 단축시킨다.

PHOX 복합체는 5개의 상이한 유전자에 의해 암호화된 5개의 상이한 서브유닛으로 구성된다. 이들은 CYBB에 의해 암호화된 gp91^phox, CYBA에 의해 암호화된 p22^phox, NCF1에 의해 암호화된 p47^phox, NCF2에 의해 암호화된 p67^phox 및 NCF4에 의해 암호화된 p40^phox이다. 가장 흔한 돌연변이는 모든 CGD 사례의 ~56%-70%를 차지하는 gp91^phox를 암호화하는 CYBB 유전자에 있다. 이 병태는 X-연관이며 따라서 주로 남성에게 영향을 미친다.

상기 질환은 처음에 용어 "소아기의 치명적인 육아종성 질환"이었으며, 치료 없이 환자는 생후 10년을 거의 살지 못하였다. 현재 치유 표준은 정례적인 예방적 항균 및 항진균 요법을 사용하며 평균 생존 연령은 약 30-40세이다. 이러한 치료는 상기 질환에 대한 치유를 제공하지 않는다.

한 가지 잠재적인 치유 요법은 HLA 일치된 공여자로부터의 동종이계 조혈 줄기 세포 이식이다. 그러나, 이것은 적합한 일치된 공여자의 이용불가능성으로 인해 많은 환자를 위한 실행가능한 옵션이 아니다.

대체 치유 요법은 생체외 유전자 요법을 사용한 자가 조혈 줄기 세포(HSC) 이식이다. 이러한 접근 방식에서, 환자는 그들 자신의 공여자 역할을 하여, 면역학적 합병증의 위험을 제거한다. 환자 자신의 혈액 HSC를 수확하고 생체외에서 유전자적으로 조작하여 관심 유전자의 기능적 복제를 도입하고, 유전자 변형된 세포를 재주입한다.

이전의 바이러스-기반 치료법은 비장 병소-형성 바이러스 (SFFV) 프로모터에 의해 도입되는 γ-레트로바이러스 벡터를 활용하였다. 이것은 유망한 임상 이점을 제공하였다. 그러나, 2/2의 환자에서 삽입 종양형성으로 인해 골수이형성증이 발달하였다. 현재 더 안전한 SIN 렌티바이러스 벡터 (pChim-CYBB; MSP-Gp91phox-WPRE라고도 알려짐)는 키메라 "골수성-특이적 프로모터" (MSP)를 사용하며, 현재 임상 시험으로부터의 초기 결과는 잠재적인 임상 이점을 나타낸다. 그러나, pChim-CYBB 작제물은 Gp91^phox의 발현 및 조절의 야생형 수준을 요약하지 못한다. 따라서, 예를 들어, 유전자 요법 후 환자의 호중구는 정상적인 건강한 공여자 세포와 비교하여 Gp91^phox를 저발현한다.

요약

X-CGD의 치료를 위한 신규 렌티바이러스 벡터(들) (LV)의 개발이 본원에 기술된다. 본원에 기술된 벡터는 현재의 렌티바이러스 벡터보다 더 나은 (더 높은) 발현을 나타낸다. 추가적으로, 본원에 기술된 벡터는 천연 CYBB 유전자의 발현 패턴을 모방하는 엄격한 계통 및 단계 특이적 발현을 보유한다. 이는 표적외 발현을 갖고 천연 CYBB 유전자의 계통 특이적 발현 패턴을 요약하지 못하는 MSP 작제물(들)과 대조적이다.

따라서, 본원에서 고려되는 다양한 구현예는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한될 필요는 없다:

구현예 1: 만성 육아종 질환의 치료를 위한 재조합 렌티바이러스 벡터 (LV)로서, 상기 벡터는

CYBB 프로모터 또는 이의 유효 단편; 및

상기 CYBB 프로모터 또는 프로모터 단편에 작동가능하게 연결된 gp91^phox를 암호화하는 핵산:

을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 발현 카세트:를 포함하는 것인, 벡터.

구현예 2: 구현예 1에 있어서, 상기 CYBB 프로모터 또는 이의 유효 단편은 전장 내인성 CYBB 프로모터 (서열번호 1)를 포함하는 것인, 벡터.

구현예 3: 구현예 1에 있어서, 상기 CYBB 프로모터는 CYBB 프로모터의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편은 최소 CYBB 프로모터 (코어) (서열번호 2)를 포함하거나 이로 이루어진 것인, 벡터.

구현예 4: 구현예 3에 있어서, 상기 CYBB 프로모터는 CYBB 프로모터의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편은 최소 CYBB 프로모터 (코어) (서열번호 2)로 이루어진 것인, 벡터.

구현예 5: 구현예 1에 있어서, 상기 CYBB 프로모터는 CYBB 프로모터의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편은 최소 CYBB 프로모터 (울트라 코어) (서열번호 3)를 포함하거나 이로 이루어지는 것인, 벡터.

구현예 6: 구현예 5에 있어서, 상기 CYBB 프로모터는 서열이 최소 CYBB 프로모터 (울트라 코어) (서열번호 3)로 이루어진 CYBB 프로모터의 유효 단편으로 이루어진 것인, 벡터.

구현예 7: 구현예 1 내지 6 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 2 (서열번호 4) 또는 이의 유효 단편을 포함하는 것인, 벡터.

구현예 8: 구현예 7에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 2의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편은 인핸서 요소 2 코어 (서열번호 5)를 포함하거나 이로 이루어진 것인, 벡터.

구현예 9: 구현예 8에 있어서, 상기 인핸서 요소 2의 유효 단편의 서열은 인핸서 요소 2 코어 (서열번호 5)의 서열로 이루어진 것인, 벡터.

구현예 10: 구현예 7에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 2의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편은 인핸서 요소 2 울트라 코어 (서열번호 6)를 포함하거나 이로 이루어진 것인, 벡터.

구현예 11: 구현예 10에 있어서, 상기 인핸서 요소 2의 유효 단편의 서열은 인핸서 요소 2 울트라 코어 (서열번호 6)의 서열로 이루어진 것인, 벡터.

구현예 12: 구현예 1 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 발현 카세트는 RELA TF 결합 부위 또는 이의 유효 단편을 추가로 포함하는 것인, 벡터.

구현예 13: 구현예 12에 있어서, 상기 RELA TF 결합 부위는 서열번호 7)의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 벡터.

구현예 14: 구현예 1 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4 또는 이의 유효 단편을 포함하는 것인, 벡터.

구현예 15: 구현예 14에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4R 또는 이의 유효 단편을 포함하는 것인, 벡터.

구현예 16: 구현예 15에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4R의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편의 핵산 서열은 인핸서 요소 4R 코어 (서열번호 10)의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 벡터.

구현예 17: 구현예 15에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4R의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편의 핵산 서열은 인핸서 요소 4R 울트라 코어 (서열번호 11)의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 벡터.

구현예 18: 구현예 16에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4R의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편의 핵산 서열은 인핸서 요소 4R 울트라 코어 (서열번호 11)의 핵산 서열로 이루어진 것인, 벡터.

구현예 19: 구현예 1 내지 18 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4L 또는 이의 유효 단편을 포함하는 것인, 벡터.

구현예 20: 구현예 19에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4L의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편은 4L 코어 서열 (서열번호 13)의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 벡터.

구현예 21: 구현예 1 내지 20 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 발현 카세트는 인트론 인핸서 요소 3 (서열번호 14) 또는 이의 유효 단편을 포함하는 것인, 벡터.

구현예 22: 구현예 21에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열번호 15의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 인트론 인핸서 요소 3 중간 단편을 포함하는 것인, 벡터.

구현예 23: 구현예 21 내지 22 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열번호 16의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 인트론 인핸서 요소 3 우측 단편을 포함하는 것인, 벡터.

구현예 24: 구현예 1 내지 23 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 gp91^phox를 암호화하는 핵산을 암호화하는 핵산은 CYBB cDNA 또는 코돈-최적화된 CYBB인 것인, 벡터.

구현예 25: 구현예 24에 있어서, 상기 gp91^phox를 암호화하는 핵산은 CYBB cDNA (서열번호 17)인 것인, 벡터.

구현예 26: 구현예 24에 있어서, 상기 gp91^phox를 암호화하는 핵산은 코돈 최적화된 CYBB인 것인, 벡터.

구현예 27: 구현예 26에 있어서, 상기 gp91^phox를 암호화하는 핵산의 서열은 jCAT 코돈 최적화된 CYBB (서열번호 18), GeneArt 최적화된 CYBB (서열번호 20), IDT 최적화된 CYBB 서열번호 21), 및 이전 임상 후보 (서열번호 19)로 이루어진 군으로부터 선택되는 코돈 최적화된 CYBB인 것인, 벡터.

구현예 28: 구현예 26에 있어서, 상기 gp91^phox를 암호화하는 핵산의 서열은 jCAT 코돈 최적화된 CYBB (서열번호 18)인 것인, 벡터.

구현예 29: 구현예 1 내지 28 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 벡터는 Ψ 영역 벡터 게놈 패키징 신호를 포함하는 것인, 벡터.

구현예 30: 구현예 1 내지 29 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 벡터는 CMV 인핸서/프로모터를 포함하는 5' LTR을 포함하는 것인, 벡터.

구현예 31: 구현예 1 내지 30 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 벡터는 Rev 반응 요소 (RRE)를 포함하는 것인, 벡터.

구현예 32: 구현예 1 내지 31 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 벡터는 중심 폴리퓨린 트랙을 포함하는 것인, 벡터.

구현예 33: 구현예 1 내지 32 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 벡터는 번역후 조절 요소를 포함하는 것인, 벡터.

구현예 34: 구현예 33에 있어서, 상기 전사후 조절 요소는 변형된 우드척 전사-후 조절 요소 (WPRE)인 것인, 벡터.

구현예 35: 구현예 1 내지 34 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 벡터는 재조합을 통하여 야생형 렌티바이러스를 재구성할 수 없는 것인, 벡터.

구현예 36: 구현예 1에 있어서, 상기 벡터는 도 19에 도시된 전체-크기 2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE의 특징을 포함하고, 여기서 mCit는 Gp91^phox를 암호화하는 핵산으로 대체되는 것인, 벡터.

구현예 37: 구현예 1에 있어서, 상기 벡터는 도 20, 패널 A에 도시된 UC 2-4R-Int3-pro-coGp91^phox-WRPE의 특징을 포함하는 것인, 벡터.

구현예 38: 구현예 37에 있어서, 상기 벡터는 도 20, 패널 B에 나타낸 벡터에 도시된 특징을 포함하는 것인, 벡터.

구현예 39: 구현예 38에 있어서, 상기 벡터는 울트라 코어 (UC) 2-4R-Int3-Pro-(GP91-jcat)-WPRE (서열번호 22)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 벡터.

구현예 40: 구현예 1 내지 39 중 어느 한 구현예에서, 상기 벡터는 CD33+ (대량 골수성 세포)에서 고발현, CD19+ (B 세포에서 고발현, CD66b+ CD15+ CD11b+ CD16+ (성숙한 호중구)에서 고발현, 및 CD3+ T 세포에서 저발현 또는 무발현을 나타내는 것인, 벡터.

구현예 41: 구현예 1 내지 40 중 어느 한 구현예에 따른 벡터로 형질도입된 숙주 세포.

구현예 42: 구현예 41에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포인 것인, 숙주 세포.

구현예 43: 구현예 42에 있어서, 상기 세포는 골수, 및/또는 제대혈, 및/또는 말초 혈액으로부터 유래된 줄기세포인 것인, 숙주 세포.

구현예 44: 구현예 41에 있어서, 상기 세포는 인간 조혈 전구 세포인 것인, 숙주 세포.

구현예 45: 구현예 44에 있어서, 상기 인간 조혈 전구 세포는 CD34+ 세포인 것인, 숙주 세포.

구현예 46: 대상체에서, 만성 육아종 질환 (X-CGD)을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은

구현예 1 내지 40 중 어느 한 구현예에 따른 벡터로 상기 대상체로부터의 줄기 세포 및/또는 전구 세포를 형질도입하는 단계; 및

상기 대상체 내로 상기 형질도입된 세포 또는 이들로부터 유래된 세포를 이식하는 단계로서, 여기서 상기 세포 또는 이들로부터의 유도체는 상기 Gp91^phox를 발현하는 것인 단계:를 포함하는, 방법.

구현예 47: 구현예 46에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포인 것인, 방법.

구현예 48: 구현예 46에 있어서, 상기 세포는 골수로부터 유래된 줄기 세포인 것인, 숙주 세포.

구현예 49: 구현예 46에 있어서, 상기 세포는 인간 조혈 줄기 및 전구 세포인 것인, 방법.

구현예 50: 구현예 49에 있어서, 상기 인간 조혈 전구 세포는 CD34⁺ 세포인 것인, 방법.

구현예 51: 하기 중 하나 이상을 암호화하는 재조합 핵산:

CYBB 프로모터, 또는 이의 유효 단편; 및/또는

CYBB 내인성 인핸서 요소 2 (CYBB B-세포 인핸서), 또는 이의 유효 단편; 및/또는

CYBB 내인성 인핸서 4R (CYBB 내인성 골수성 인핸서), 또는 이의 유효 단편; 및/또는

CYBB 내인성 인핸서 4L, 또는 이의 유효 단편; 및/또는

CYBB 내인성 골수성 인트론 3 인핸서, 또는 이의 유효 단편; 및/또는

Gp91^phox를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산.

구현예 52: 구현예 51에 있어서, 상기 핵산은 전장 내인성 CYBB 프로모터 (서열번호 1)를 포함하거나 이로 이루어진 서열을 암호화하는 것인, 핵산.

구현예 53: 구현예 51에 있어서, 상기 핵산은 CYBB 프로모터의 유효 단편을 포함하는 서열을 암호화하고, 여기서 상기 단편은 최소 CYBB 프로모터 (코어) (서열번호 2)를 포함하거나 이로 이루어진 것인, 핵산.

구현예 54: 구현예 53에 있어서, 상기 핵산은 CYBB 프로모터의 유효 단편을 포함하는 서열을 암호화하고, 여기서 상기 단편은 최소 CYBB 프로모터 (코어) (서열번호 2)로 이루어진 것인, 핵산.

구현예 55: 구현예 51에 있어서, 상기 핵산은 CYBB 프로모터의 유효 단편을 포함하는 서열을 암호화하고, 여기서 상기 단편은 최소 CYBB 프로모터 (울트라 코어) (서열번호 3)를 포함하거나 이로 이루어진 것인, 핵산.

구현예 56: 구현예 55에 있어서, 상기 핵산은 CYBB 프로모터의 유효 단편을 포함하는 서열을 암호화하고, 여기서 상기 단편은 최소 CYBB 프로모터 (울트라 코어) (서열번호 3)로 이루어진 것인, 핵산.

구현예 57: 구현예 51 내지 56 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 핵산은 CYBB 내인성 인핸서 요소 2 (CYBB B-세포 인핸서)의 유효 단편을 암호화하는 것인, 핵산.

구현예 58: 구현예 57에 있어서, 상기 CYBB 내인성 인핸서 요소 2의 핵산 서열은 인핸서 요소 2 코어 (서열번호 5)의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 핵산.

구현예 59: 구현예 57에 있어서, 상기 CYBB 내인성 인핸서 요소 2의 핵산 서열은 인핸서 요소 2 울트라 코어 (서열번호 6)의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 핵산.

구현예 60: 구현예 51 내지 59 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 핵산은 CYBB 내인성 인핸서 4R (CYBB 내인성 골수성 인핸서)의 유효 단편을 포함하는 것인, 핵산.

구현예 61: 구현예 60에 있어서, 상기 CYBB 내인성 인핸서 4R의 유효 단편의 핵산 서열은 인핸서 요소 4R 울트라 코어 (서열번호 10)의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 핵산.

구현예 62: 구현예 51 내지 61 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 핵산은 인핸서 요소 4L의 유효 단편을 포함하는 것인, 핵산.

구현예 63: 구현예 62에 있어서, 상기 인핸서 요소 4L의 유효 단편은 4L 코어 서열 (서열번호 13)의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 핵산.

구현예 64: 구현예 51 내지 63 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 핵산은 CYBB 내인성 골수성 인트론 3 인핸서의 유효 단편을 포함하는 것인, 핵산.

구현예 65: 구현예 64에 있어서, 상기 CYBB 내인성 골수성 인트론 3 인핸서의 유효 단편의 핵산 서열은 요소 3 중간 단편 핵산 서열 (서열번호 15)을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 핵산.

구현예 66: 구현예 64 내지 65 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 CYBB 내인성 골수성 인트론 3 인핸서의 유효 단편의 핵산 서열은 인트론 인핸서 요소 3 우측 단편 (서열번호 16)을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 핵산.

구현예 67: 구현예 51 내지 66 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 핵산은 jCAT 코돈 최적화된 CYBB (서열번호 18)를 포함하는 것인, 핵산.

구현예 68: 구현예 51 내지 67 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 핵산은 발현 카세트를 포함하는 것인, 핵산.

구현예 69: 구현예 68에 있어서, 상기 발현 카세트는 생체내에서 Gp91^phox를 발현하는데 효과적인 것인, 핵산.

구현예 70: 구현예 51 내지 69 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 핵산은 구현예 1 내지 40 중 어느 한 구현예에 따른 렌티바이러스 벡터를 포함하는 것인, 핵산.

정의.

"프로모터"는 유전자 (예를 들어, 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자)의 전사를 개시하는데 필요한 핵산 내의 조절 서열을 지칭한다.

"인핸서"는 전사 인자로 불리는 특정 단백질에 결합될 때, 관련 유전자의 전사를 향상시키는 조절 DNA 서열을 지칭한다.

프로모터와 관련하여 사용될 때 "유효 단편" (예를 들어, CYBB 프로모터의 유효 단편)은 해당 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 개시하기에 충분한 전장 프로모터의 단편을 지칭한다.

인핸서와 관련하여 사용될 때 "유효 단편" (예를 들어, CYBB 인핸서의 유효 단편)은 전사 인자에 의해 결합될 때 작동가능하게 연결된 유전자의 조절 발현을 제공하기에 충분한 전장 인핸서의 단편을 지칭한다. 특정 구현예에서, 조절은 전장 인핸서에 의해 제공되는 발현 수준 및/또는 계통과 관련하여 유사하다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 위치하는 핵산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 해당 프로모터가 해당 유전자의 전사를 개시하도록 허용하는 위치에 위치할 때 유전자에 작동가능하게 연결된다. 인핸서는 적절한 전사 인자에 의해 결합될 때, 해당 인핸서가 해당 유전자의 발현을 조절 (예를 들어, 상향조절)할 수 있는 경우 유전자에 작동가능하게 연결된다.

"재조합"은 단일 서열의 일부로서 함께 천연적으로 발생하지 않거나 천연 발생 서열에 대해 재배열된 부분을 포함하는 핵산 서열을 지칭하기 위해 당업계에서 이의 용법과 일관되게 사용된다. 재조합 핵산은 사람의 손을 수반하는 과정에 의해 생성되고/되거나 사람의 손에 의해 (예를 들어, 복제, 증폭, 전사 등의 하나 이상의 사이클에 의해) 생성된 핵산으로부터 생성된다. 재조합 바이러스는 재조합 핵산을 포함하는 것이다. 재조합 세포는 재조합 핵산을 포함하는 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 렌티바이러스 벡터" 또는 "재조합 LV)는 인간 개입 및 조작의 결과로서 LV 및 다수의 추가 분절로부터 조립된 인공적으로 생성된 폴리뉴클레오티드 벡터를 지칭한다.

상기 "유효량"은 비치료된 환자에 비해 질환의 증상을 개선하거나 제거하기 위해 필요한 작용제 또는 작용제를 포함하는 조성물의 양을 의미한다. 질환의 치료적 처리를 위해 본원에 기술된 방법을 실행하는데 사용되는 조성물(들)의 유효량은 투여 방식, 대상체의 연령, 체중 및 일반적인 건강에 따라 달라진다. 궁극적으로, 주치의 또는 수의사가 적절한 양 및 투여 요법을 결정할 것이다. 이러한 양을 "유효" 양으로 지칭한다.

도 1은 인간 혈액 세포에서 gp91^phox의 내인성 발현 패턴을 예시한다.
도 2는 인핸서 활성을 조사하는데 사용된 작제물을 예시한다.
도 3 CB CD34+ 분화된 호중구 16일차 (CD11b+ CD66b+ CD15+ CD16+)에서 인핸서 작제물의 발현.
도 4 CB CD34+ 분화된 단핵구 16일차 (CD11b+ CD15+)에서 인핸서 작제물의 발현.
도 5는 형질도입된 RAMO (B-세포주) D14 흐름(flow)에 있어서 인핸서 작제물의 발현을 나타낸다.
도 6은 형질도입된 Jurkat (T-세포주) D16 흐름에서 인핸서 작제물의 발현을 나타낸다.
도 7은 CB CD34+ 분화된 호중구 16일차 (CD11b+ CD66b+ CD15+ CD16+)에서 인핸서 작제물의 발현을 나타낸다.
도 8은 CB CD34+ 분화된 단핵구 16일차 (CD11b+ CD15+)에서 인핸서 작제물의 발현을 나타낸다.
도 9는 형질도입된 Jurkat (T-세포주) D16 흐름에서 인핸서 작제물의 발현을 나타낸다.
도 10은 형질도입된 RAMO (B-세포주) D14 흐름에서 인핸서 작제물의 발현을 나타낸다.
도 11은 E2-E4R-Int3-pro-mCit-WPRE 벡터 (상단) 및 m시트린이 Gp91^phox를 암호화하는 핵산으로 대체된 동일한 벡터 (하단)의 구조를 나타낸다.
도 12는 CB CD34+ 분화된 호중구 16일차에서 감소된 크기 벡터의 발현을 나타낸다.
(CD11b+ CD66b+ CD15+ CD16+)
도 13은 CB CD34+ 분화된 단핵구 16일차에서 감소된 크기 벡터의 발현을 나타낸다
(CD11b+ CD15+)
도 14는 Jurkat 세포 (T-세포주)에서 감소된 크기 벡터의 발현을 나타낸다.
도 15는 RAMOS 세포 (B-세포주)에서 감소된 크기 벡터의 발현을 나타낸다.
도 16은 "코어", "울트라 코어", "엑스트라 코어" 및 "엑스트라 울트라 코어" 작제물의 원시 소규모 역가를 나타낸다.
도 17은 PLB-985 X-CGD ^-/- 세포에서 Gp91^phox의 다양한 코돈 최적화에 의해 생성된 발현 수준을 나타낸다.
도 18은 MSP-Gp91^phox-WPRE의 다양한 코돈 최적화의 원시 역가를 나타낸다.
도 19는 X-CGD의 치료를 위한 렌티바이러스 벡터의 일 구현예를 예시한다. 치료에 사용하기 위해 mCit 리포터는 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 Gp91phox를 암호화하는 핵산 서열로 대체될 것이다.
도 20 패널 A-B는 X-CGD의 치료를 위한 최적화된 렌티바이러스 벡터의 일 구현예를 예시한다. 패널 A는 UC 2-4R-Int3-pro-coGp91^phox-WRPE의 요소를 개략적으로 예시한다. 패널 B는 벡터의 "지도"를 나타낸다.
도 21은 벡터가 원래의 2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE에서 코어 변이체 및 울트라 코어 (UC) 변이체로 최적화되었을 때 역가 (상단 패널) 및 감염성 (하단 패널)의 개선을 예시한다. UC 변이체 (MyeloVec은 선도 후보 벡터임).
도 22, 패널 A-B는 MyeloVec이 각각 혈액 세포 (패널 A) 및 골수 세포 (패널 B)에서 천연 CYBB 유전자의 내인성 발현 패턴을 요약할 수 있음을 나타낸다.
도 23은 MyeloVec이 호중구 발달 전반에 걸쳐 천연 CYBB 유전자의 시간적 발현 패턴을 요약할 수 있음을 나타낸다. 발현은 호중구가 성숙함에 따라 더 높아져, 천연 CYBB 유전자의 패턴을 모방한다.
도 24는 Gp91^phox 발현의 회복을 나타낸다.
도 25는 옥시다제 활성을 야생형 수준으로의 회복을 나타낸다.
도 26은 말초혈액의 호중구 및 단핵구에서의 Gp91^phox 발현의 회복을 나타낸다.
도 27은 혈액 호중구 및 단핵구에서 야생형 수준에 가까운 옥시다아제 활성의 회복을 나타낸다.
도 28은 골수 호중구 및 단핵구에서 높은 수준의 Gp91^phox 발현의 회복을 나타낸다.
도 29는 야생형 수준의 옥시다제 활성의 회복을 나타낸다.
도 30은 인간 X-CGD 호중구에서 야생형 수준의 Gp91^phox 발현을 회복시키는 MyeloVec의 능력을 나타낸다.
도 31은 인간 X-CGD 호중구에서 야생형 수준의 세포 옥시다아제 활성을 회복시키는 MyeloVec의 능력을 나타낸다 (DHR 검정).
도 32는 1.63의 평균 VCN으로 인간 X-CGD 호중구에서 야생형 수준의 대량 옥시다아제 활성을 회복시키는 MyeloVec의 능력을 나타낸다 (사이토크롬 C 검정).

다양한 구현예에서, X-연관 만성 육아종 질환 (X-CGD)의 치료 (또는 예방)를 위한 렌티바이러스 벡터가 제공된다. 특정 구현예에서 벡터는 벡터 크기를 감소시키고 발현 수준 및 역가를 증가시키도록 최적화된다. 추가적으로, 다양한 구현예에서 벡터는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 천연 CYBB 유전자의 계통 특이적 발현 패턴을 요약한다 (예를 들어, 도 1 참조).

본원에 기재된 바와 같이 (예를 들어, 실시예 1 참조), 식세포 항-미생물 옥시다아제 시스템의 gp91^phox 구성요소를 생성하는 CYBB 유전자에 대한 생물정보학 정보의 분석은, 히스톤 표시, DNAse 과민성 부위 및 전사 인자 결합에 대한 서열 모티프를 기반으로 하여, 추정되는 여러 전사 조절 도메인을 확인하였다.

15개의 추정되는 내인성 인핸서 요소가 천연 CYBB 위상학적으로 관련된 도메인 (TAD) 내에서 확인되었다. CYBB 유전자를 조절하는 중요한 인핸서 요소를 실험적으로 확인하기 위해, 각각의 추정되는 인핸서 요소는 리포터 유전자 (m시트린)의 발현을 유도하기 위한 내인성 CYBB 프로모터의 업스트림에 클로닝되었다 (예를 들어, 도 2 참조). 각각의 추정되는 인핸서 요소의 기능을 설명하기 위해, 본 발명자들은 3개의 표적 세포 계통인 제대혈 (CB) CD34+ 분화된 성숙한 호중구 및 단핵구 뿐만 아니라 RAMOS 세포 (B-림프구 세포주)에서 벡터 각각의 활성을 검정하였다.

인핸서 요소 4는 B-세포에서 발현되지 않고, 성숙한 호중구 및 단핵구에서는 높은 수준의 발현을 유도한다는 것이 밝혀졌다. 또한, 인핸서 요소 2는 호중구에서 발현되지 않고, B-세포에서는 높은 수준의 계통 특이적 발현을 유도한다는 것이 밝혀졌다. 인핸서 요소 중 어느 것도 Jurkat (T-세포)에서 발현되지 않으며, 이는 각 인핸서 요소의 계통 특이적 발현을 시사한다.

또한, 인핸서 요소 4가 2개의 별개의 인핸서 모듈 (4L 및 4R)로 이루어지며, 이러한 요소 중 하나를 제거하여 벡터 크기를 감소시킬 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 평가되었음이 밝혀졌다.

추가적으로, 인핸서 요소 2, 인핸서 요소 4, 인트론 인핸서 3, 및 CYBB 내인성 프로모터의 환원된 변이체를 제조하고 평가하였다. Gp91^phox를 암호화하는 핵산의 코돈 최적화도 평가되었다.

이러한 발견의 관점에서, 다양한 구현예에서, 만성 육아종 질환의 치료를 위한 재조합 렌티바이러스 벡터 (LV)가 제공되며, 상기 벡터는 CYBB 프로모터 또는 이의 유효 단편; 및 상기 CYBB 프로모터 또는 프로모터 단편에 작동가능하게 연결된 gp91^phox를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 CYBB 프로모터 또는 이의 유효 단편은 전장 내인성 CYBB 프로모터 (예를 들어, 표 1, 서열번호 1 참조)를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 CYBB 프로모터는 CYBB 프로모터의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편은 최소 CYBB 프로모터 (예를 들어, 표 1, 서열번호 3 참조)를 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 상기 CYBB 프로모터는 서열이 최소 CYBB 프로모터 (예를 들어, 표 1, 서열번호 3 참조)로 이루어진 CYBB 프로모터의 유효 단편으로 이루어진다.

특정 구현예에서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 2 (예를 들어, 표 1, 서열번호 4 참조) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 인핸서 요소 2의 유효 단편의 서열은 인핸서 요소 2 "코어" (예를 들어, 표 1, 서열번호 5 참조)의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 상기 인핸서 요소 2의 유효 단편의 서열은 인핸서 요소 2 코어 (예를 들어, 표 1, 서열번호 5 참조)의 서열로 이루어진다. 특정 구현예에서, 상기 인핸서 요소 2의 유효 단편의 서열은 인핸서 요소 2 "울트라 코어" 서열 (예를 들어, 표 1, 서열번호 6 참조)을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 상기 인핸서 요소 2의 유효 단편의 서열은 인핸서 요소 2 울트라 코어 (예를 들어, 표 1, 서열번호 6 참조)의 서열로 이루어진다.

특정 구현예에서, 상기 렌티바이러스 벡터를 포함하는 발현 카세트는 RELA TF 결합 부위 또는 이의 유효 단편을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 RELA TF 결합 부위는 표 1에서 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

특정 구현예에서, 상기 렌티바이러스 벡터의 발현 카세트는 인핸서 요소 4 (예를 들어, 표 1, 서열번호 8 참조) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4R (예를 들어, 표 1, 서열번호 9 참조) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4R의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 핵산 서열은 인핸서 요소 4R 코어 (예를 들어, 표 1, 서열번호 10 참조)의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4R의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편의 핵산 서열은 인핸서 요소 4R "울트라 코어" (예를 들어, 표 1, 서열번호 11 참조)의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4R의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편의 핵산 서열은 인핸서 요소 4R 울트라 코어 (예를 들어, 표 1, 서열번호 11 참조)의 핵산 서열로 이루어진다.

특정 구현예에서, 상기 렌티바이러스 벡터의 발현 카세트는 인핸서 요소 4L ((예를 들어, 표 1, 서열번호 12 참조) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 인핸서 요소 4L의 유효 단편은 4L 코어 서열 (예를 들어, 표 1, 서열번호 13 참조)의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 상기 인핸서 요소 4L의 유효 단편은 4L 코어 서열 (예를 들어, 표 1, 서열번호 13 참조)의 서열로 이루어진다.

특정 구현예에서, 상기 렌티바이러스 벡터의 발현 카세트는 인트론 인핸서 요소 3 (예를 들어, 표 1, 서열번호 14 참조) 또는 이의 유효 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 렌티바이러스 벡터의 발현 카세트는 표 1의 서열번호 15의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 인트론 인핸서 요소 3 중간 단편을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 구현예에서, 상기 렌티바이러스 벡터의 발현 카세트는 표 1의 서열번호 15의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 인트론 인핸서 요소 3 중간 단편으로 이루어진다. 특정 구현예에서, 상기 렌티바이러스 벡터의 발현 카세트는 표 1의 서열번호 16의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 인트론 인핸서 요소 3 우측 단편을 포함하거나 이로 이루어진다.

특정 구현예에서, gp91^phox를 암호화하는 핵산은 전체 CYBB 유전자, CYBB cDNA, 또는 코돈-최적화된 CYBB이다. 특정 구현예에서, gp91^phox를 암호화하는 핵산은 CYBB cDNA이다 (예를 들어, 표 1, 서열번호 17 참조). 특정 구현예에서, gp91^phox를 암호화하는 핵산은 코돈 최적화된 CYBB (예를 들어, jCAT 코돈 최적화된 CYBB (예를 들어, 표 1, 서열번호 18 참조), GeneArt 최적화된 CYBB (예를 들어, 표 1, 서열번호 20 참조), IDT 최적화된 CYBB (예를 들어, 표 1, 서열번호 21 참조), 및 이전 임상 후보 (예를 들어, 표 1, 서열번호 19 참조))이다. 특정 구현예에서, 상기 gp91^phox를 암호화하는 핵산의 서열은 jCAT 코돈 최적화된 CYBB (예를 들어, 표 1, 서열번호 18 참조)이다.

렌티바이러스 벡터의 맥락에서 본원에 기술된 발현 카세트는 이러한 맥락으로 제한될 필요가 없다는 것이 인식될 것이다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원에 기술된 CYBB 조절 요소 중 임의의 하나 이상을 포함하는 재조합 핵산이 고려된다. 특정 구현예에서, 재조합 핵산은 발현 카세트, 예를 들어, 생체내에서 Gp91^phox를 발현하는데 효과적인 발현 카세트를 포함한다. 이러한 발현 카세트는 다른 작제물과, 예를 들어, CRISPR 작제물과 함께 사용될 수 있음을 인식할 것이다.

표 1. 본원에 기술된 바와 같은 X-CGD의 치료를 위한 렌티바이러스 벡터의 다양한 구성요소의 핵산 서열.

다양한 구현예에서, 본원에 기술된 렌티바이러스 벡터(LV)는 예를 들어, 절연체 (예를 들어, 3'LTR에서 FB 절연체)의 존재를 포함할 수 있는 다양한 "안전성" 특징을 가질 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 특정 구현예에서, HIV LTR은 패키징 동안 HIV TAT 단백질의 포함 없이 더 높은 역가 벡터를 생성하기 위해 대체 프로모터 (예를 들어, CMV)로 치환되었다. 다른 강력한 프로모터 (예를 들어, RSV 등도 사용될 수 있음).

다양한 구현예에서, 본원에 기술된 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터에서 전형적으로 발견되는 요소 중 임의의 하나 이상을 함유한다. 이러한 요소는 예를 들어, 하기에 기술된 바와 같이, Ψ 영역 벡터 게놈 패키징 신호, Rev 반응 요소 (RRE), 폴리퓨린 트랙 (예를 들어, 중심 폴리퓨린 트랙, 3' 폴리퓨린 트랙 등), 번역후 조절 요소 (예를 들어, 변형된 우드척 전사-후 조절 요소 (WPRE)), 절연체 등을 포함하나, 이에 제한될 필요는 없다.

다양한 구현예에서, 벡터는 재조합을 통하여 야생형 렌티바이러스를 실질적으로 재구성할 수 없는 SIN 벡터이다.

특정 구현예에서, 벡터는 도 20, 패널 A에 도시된 "울트라 코어" (UC) 2-4R-Int3-Pro-(GP91-jcat)-WPRE의 특징을 포함한다. 특정 구현예에서, 벡터는 도 20, 패널 B에 나타낸 벡터에 도시된 특징을 포함한다. 특정 구현예에서, 벡터는 울트라 코어 (UC) 2-4R-Int3-Pro-(GP91-jcat)-WPRE (서열번호 22)의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

다양한 구현예에서, 벡터는 CD33+ (대량 골수성 세포)에서 고발현, 및/또는 CD19+ (B 세포)에서 고발현, CD66b+ CD15+ CD11b+ CD16+ (성숙한 호중구)에서 고발현, 및/또는 CD3+ (T 세포)에서 저발현 또는 무발현을 나타낸다. 다양한 구현예에서, 벡터는 CD33+ (대량 골수성 세포)에서 고발현, CD19+ (B 세포에서 고발현, CD66b+ CD15+ CD11b+ CD16+ (성숙한 호중구)에서 고발현, 및 CD3+ T 세포에서 저발현 또는 무발현을 나타낸다.

상기 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서, 본원에 기술된 벡터는 세포를 높은 역가로 형질도입하고, Gp91^phox의 높은 수준의 발현을 제공하는 데 또한 효과적이다.

이러한 결과의 관점에서, 본원에 기술된 LV, 예를 들어, Gp91^phox를 암호화하는 핵산을 발현하는 재조합 TAT-비의존성 SIN LV는 대상체 (예를 들어, 인간 및 비-인간 포유류)에서 X-연관 만성 육아종 질환 (X-CGD)을 효과적으로 치료하는 데 사용될 수 있는 것으로 여겨진다. 이들 벡터는 예를 들어, X-CGD를 갖는 것으로 확인된 대상체의 치료를 위해 이를 필요로 하는 대상체 내로 도입될 수 있는 줄기 세포 (예를 들어, 조혈 줄기 및 전구 세포)의 변형에 사용될 수 있는 것으로 여겨진다. 더욱이, 생성된 세포는 대상체 건강의 상당한 개선을 입증하기에 충분한 형질전환 Gp91^phox 단백질을 생산할 것으로 여겨진다. 또한, 벡터는 표적 (예를 들어, 조혈 줄기 또는 전구 세포)의 생체내 형질도입을 달성하기 위해 대상체에게 직접적으로 투여될 수 있고, 이에 의해 이를 필요로 하는 대상체의 치료에도 영향을 미칠 수 있는 것으로 여겨진다.

상기 언급된 바와 같이, 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 LV는 다양한 안전성 특징을 포함할 수 있다. 예를 들어, HIV LTR은 패키징 동안 HIV TAT 단백질의 포함 없이 더 높은 역가 벡터를 생성하기 위해 CMV 프로모터로 치환되었다. 특정 구현예에서, 절연체 (예를 들어, FB 절연체)는 안전성을 위해 3'LTR에 도입될 수 있다. LV는 또한 효율적인 형질도입 및 높은 역가를 제공하도록 구성된다.

전술한 요소들은 예시적인 것이며 제한할 필요가 없다는 것이 이해될 것이다. 본원에 제공된 교시의 관점에서, 이들 요소에 대한 적합한 치환은 당업자에 의해 인식될 것이며, 본원에 제공된 교시의 범위 내에서 고려된다.

Gp91 ^phox 코돈 최적화.

상기 언급된 바와 같이, 다양한 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 CYBB 유전자 또는 cDNA를 포함할 수 있다. 그러나, 특정 구현예에서 Gp91phox를 암호화하는 핵산은 코돈 최적화된다. 수많은 코돈 최적화 방법이 당업자에게 알려져 있다. 한 가지 예시적인 방법은 JCat (자바 코돈 적응 도구)이다. jCAT 도구는 대부분의 시퀀싱된 원핵생물 및 다양한 진핵생물 유전자 발현 숙주에 유전자 코돈 사용을 적응시킨다. 많은 도구와 대조적으로, JCat은 고도로 발현된 유전자의 수동 정의를 필요로 하지 않으므로, 매우 빠르고 쉬운 방법이다. 코돈 적응을 위한 JCat의 추가 옵션에는 제한 효소 및 Rho-독립적 전사 종결자에 대한 원치 않는 절단 부위의 회피가 포함된다. JCat의 출력은 그래프로, 그리고 입력 서열 및 새로 적응된 서열에 대해 주어진 코돈 적응 지수 (CAI) 값으로 둘 다이다. JCat 최적화는 Grote 등 (2005) Nucleic Acids Res. 33(보충 2): W526-W531)에 의해 설명되고, JCat 도구는 www.jcat.de에서 온라인으로 이용가능하다.

다른 코돈 최적화 도구는 (ThermoFisher Scientific®로부터의) GeneArt에 의해 제공된다.

또 다른 코돈 최적화 도구는 IDT이다. IDT 코돈 최적화 도구는 새로운 유기체에서 각 코돈의 사용 빈도를 기반으로 하여 코돈 사용을 재할당함에 의해 다른 유기체에서의 발현을 위해 한 유기체의 DNA 또는 단백질 서열을 최적화하도록 개발되었다. 예를 들어, 발린은 4개의 상이한 코돈 (GUG, GUU, GUC 및 GUA)으로 암호화된다. 그러나, 인간 세포주에서는 GUG 코돈이 우선적으로 사용된다 (46% 사용 대 각각 18, 24 및 12%). 코돈 최적화 도구는 이 정보를 고려하여, 동일한 빈도로 발린 코돈을 할당한다. 또한, 도구 알고리즘은 빈도가 10% 미만인 코돈을 제거하고, 나머지 빈도를 100%로 재-정규화한다. 더욱이, 최적화 도구는 반복, 헤어핀 및 극단적인 GC 함량과 같이 제조 및 다운스트림 발현을 방해할 수 있는 복잡성을 감소시킨다. IDT 최적화 도구는 IDT (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa)로부터 이용가능하며, www.idtdna.com/CodonOpt에서 찾을 수 있다.

다른 코돈 최적화 도구는 codonw.sourceforge.net에서 찾을 수 있는 CodonW 오픈 소스 소프트웨어 프로그램, 및 GenScript으로부터의 OptimumGene^TM 알고리즘을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

일 구현예에서, 실시예 1에 예시된, 코돈 최적화된 Gp91^phox는 현재 임상 후보인 MSP-Gp91^phox-WPRE에서 사용되는 서열일 수 있다.

이러한 코돈 최적화는 예시적이며 비제한적이다. 본원 및 실시예 1에 제공된 교시를 사용하여, Gp91^phox 코돈 사용은 특정 적용분야에 쉽게 최적화될 수 있다.

TAT-독립 및 자가 불활성화 렌티바이러스 벡터.

안전성을 추가로 개선하기 위해, 다양한 구현예에서, 본원에 기재된, 렌티바이러스 벡터는 TAT-독립적, 자가-불활성화 (SIN) 구성을 포함한다. 따라서, 다양한 구현예에서, 야생형 LTR에 비해 감소된 프로모터 활성을 갖는 LTR 영역을 본원에 기재된 LV에서 사용하는 것이 바람직하다. 생물안전성 특성을 제공하는 효과적으로 "자가-불활성화"(SIN)하는 이와 같은 작제물이 제공될 수 있다. SIN 벡터는 형질도입된 세포에서 전장 벡터 RNA의 생성이 크게 감소되거나 완전히 없어진 것이다. 이러한 특성은 복제-가능 재조합체(RCR)가 생길 위험을 최소화한다. 또한, 이는 벡터 통합 부위에 인접하여 위치한 세포의 암호화 서열이 비정상적으로 발현될 위험을 감소시킨다.

또한, SIN 설계는 LTR과 이식유전자의 발현을 유도하는 프로모터 사이의 간섭 가능성을 감소시킨다. SIN LV는 종종 내부 프로모터의 완전한 활성을 허용할 수 있다.

SIN 설계는 LV의 생물안전성을 증가시킨다. HIV LTR의 대부분은 U3 서열로 구성된다. U3 영역은 감염된 세포에서 그리고 세포 활성화에 반응하여 HIV 게놈의 기저 및 유도된 발현을 조절하는 인핸서 및 프로모터 요소를 함유한다. 이러한 프로모터 요소 중 몇 가지는 바이러스 복제에 필수적이다. 인핸서 요소 중 일부는 바이러스 분리물 중에서 고도로 보존되어 있으며, 바이러스 발병기전에서 중요한 병독성 인자로 연루되어 있다. 인핸서 요소는 바이러스의 상이한 세포 표적에서 복제 속도에 영향을 미치도록 작용할 수 있다.

바이러스 전사는 5' LTR의 U3 영역의 3' 말단에서 시작하기 때문에, 이들 서열은 바이러스 mRNA의 일부가 아니며, 3' LTR 유래의 이의 복제물은 통합된 프로바이러스에서 LTR 둘 다의 생성을 위한 주형으로 작용한다. U3 영역의 3' 복제물이 레트로바이러스 벡터 작제물에서 변경되는 경우, 벡터 RNA는 여전히 생산자 세포에서 온전한 5' LTR로부터 생성되지만, 표적 세포에서 재생될 수 없다. 이와 같은 벡터의 형질도입은 자손 바이러스에서 LTR 둘 다의 불활성화를 초래한다. 따라서, 레트로바이러스는 자가-불활성화 (SIN)이고, 이들 벡터는 SIN 전달 벡터로 알려져 있다.

특정 구현예에서, 자가-불활성화는 벡터 DNA의 3' LTR의 U3 영역, 즉 벡터 RNA를 생성하는 데 사용되는 DNA에서 결실의 도입을 통해 달성된다. RT 동안, 이러한 결실은 프로바이러스 DNA의 5' LTR로 전달된다. 전형적으로, 충분한 U3 서열을 제거하여 LTR의 전사 활성을 크게 감소시키거나 완전히 없앰으로써, 형질도입된 세포에서 전장 벡터 RNA의 생성을 크게 감소시키거나 없애는 것이 바람직하다. 그러나, 일반적으로 바이러스 RNA의 폴리아데닐화에 관여하는 LTR의 요소를 유지하는 것이 바람직하며, 기능은 전형적으로 U3, R 및 U5에 퍼져있다. 따라서, 특정 구현예에서, 폴리아데닐화 결정인자를 아끼면서 LTR로부터 전사적으로 중요한 모티프를 가능한 한 많이 제거하는 것이 바람직하다.

SIN 설계는 Zufferey 등 (1998) J Virol. 72(12): 9873-9880, 및 미국 특허 제5,994,136호에 상세히 기술되어 있다. 그러나, 본원에 기술된 바와 같이, 3' LTR에서 결실의 정도에 제한이 있다. 먼저, U3 영역의 5' 말단은 벡터 전달에서 또 다른 필수적인 기능을 제공하며, 이는 통합에 필요하다 (말단 디뉴클레오타이드+att 서열). 따라서, 말단 디뉴클레오티드 및 att 서열은 결실될 수 있는 U3 서열의 5' 경계를 나타낼 수 있다. 또한, 일부 엄밀하지 않게 정의된 영역은 R 영역에서 다운스트림 폴리아데닐화 부위의 활성에 영향을 미칠 수 있다. 3'LTR 유래 U3 서열의 과도한 결실은 벡터 전사체의 폴리아데닐화를 감소시킬 수 있으며, 이는 생산자 세포에서 벡터의 역가 및 표적 세포에서 이식유전자 발현 둘 다에 불리한 결과를 초래한다.

추가적인 SIN 설계는 미국 특허 공개 제2003/0039636호에 기술되어 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 특정 구현예에서, LTR로부터 제거된 렌티바이러스 서열은 비-렌티바이러스 레트로바이러스 유래의 비슷한 서열로 대체되어, 하이브리드 LTR을 형성한다. 특히, LTR 내의 렌티바이러스 R 영역은 전체적으로 또는 부분적으로 비-렌티바이러스 레트로바이러스 유래의 R 영역으로 대체될 수 있다. 특정 구현예에서, TAT 단백질과 상호작용하여 바이러스 복제를 향상시키는 서열인 렌티바이러스 TAR 서열은 R 영역으로부터, 바람직하게는 전체적으로 제거된다. 그 다음, TAR 서열은 비-렌티바이러스 레트로바이러스 유래의 R 영역의 비슷한 일부분으로 대체되어, 하이브리드 R 영역을 형성한다. LTR은 추가로 변형되어 렌티바이러스 U3 및 U5 영역의 전부 또는 일부분을 제거하고/하거나 비-렌티바이러스 서열로 대체할 수 있다.

따라서, 특정 구현예에서, SIN 구성은 이의 TAR 서열의 전부 또는 일부분이 결여되어 있는 하이브리드 렌티바이러스 R 영역을 포함하는 레트로바이러스 LTR을 제공하여, TAT에 의한 임의의 가능한 활성화를 제거하며, 여기서 TAR 서열 또는 이의 일부분은 비-렌티바이러스 레트로바이러스 유래의 R 영역의 비슷한 일부분으로 대체되어 하이브리드 R 영역을 형성한다. 특정 구현예에서, 레트로바이러스 LTR은 하이브리드 R 영역을 포함하며, 여기서 하이브리드 R 영역은 TAR 서열이 결여되어 있는 HIV R 영역의 일부분 (예를 들어, US 2003/0039636호의 서열번호 10으로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 일부분), 및 HIV R 영역이 결여된 TAR 서열과 비슷한 MoMSV R 영역의 일부분 (예를 들어, 2003/0039636호의 서열번호 9로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 일부분)을 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 전체 하이브리드 R 영역은 2003/0039636호의 서열번호 11로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.

R 영역이 유래될 수 있는 적합한 렌티바이러스는, 예를 들어 HIV (HIV-1 및 HIV-2), EIV, SIV 및 FIV를 포함한다. 비-렌티바이러스 서열이 유래될 수 있는 적합한 레트로바이러스는, 예를 들어 MoMSV, MoMLV, 프렌드(Friend), MSCV, RSV 및 스푸마바이러스를 포함한다. 하나의 예시적인 구현예에서, 렌티바이러스는 HIV이고, 비-렌티바이러스 레트로바이러스는 MoMSV이다.

US 2003/0039636호에 기술된 또 다른 구현예에서, 하이브리드 R 영역을 포함하는 LTR은 좌측 (5') LTR이고, 하이브리드 R 영역으로부터 업스트림에 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 바람직한 프로모터는 기원이 비-렌티바이러스이며, 예를 들어, 비-렌티바이러스 레트로바이러스 유래의 U3 영역 (예를 들어, MoMSV U3 영역)을 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, U3 영역은 US 2003/0039636호의 서열번호 12로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 좌측 (5') LTR은 하이브리드 R 영역으로부터 다운스트림에 렌티바이러스 U5 영역을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, U5 영역은 게놈 통합에 필요한 HIV att 부위를 포함하는 HIV U5 영역이다. 또 다른 구현예에서, U5 영역은 US 2003/0039636호의 서열번호 13으로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 전체 좌측 (5') 하이브리드 LTR은 US 2003/0039636호의 서열번호 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

또 다른 예시적인 구현예에서, 하이브리드 R 영역을 포함하는 LTR은 우측 (3') LTR이고, 하이브리드 R 영역으로부터 업스트림에 변형된 (예를 들어, 절단된) 렌티바이러스 U3 영역을 추가로 포함한다. 변형된 렌티바이러스 U3 영역은 att 서열을 포함할 수 있지만, 프로모터 활성을 갖는 임의의 서열이 결여되어, 바이러스 전사가 염색체 통합 후 제1 복제 라운드를 넘을 수 없다는 점에서 벡터가 SIN이 되도록 한다. 특정 구현예에서, 하이브리드 R 영역으로부터 업스트림의 변형된 렌티바이러스 U3 영역은 최대 렌티바이러스 U3 att 부위까지 그리고 이 부위를 포함하는 렌티바이러스 (예를 들어, HIV) U3 영역의 3' 말단으로 이루어진다. 일 구현예에서, U3 영역은 US 2003/0039636호의 서열번호 15로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 우측 (3') LTR은 하이브리드 R 영역으로부터 다운스트림에 폴리아데닐화 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 폴리아데닐화 서열은 US 2003/0039636호의 서열번호 16으로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 전체 우측 (5') LTR은 US 2003/0039636호의 서열번호 2 또는 17로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

따라서, HIV 기반 LV의 경우에, 이와 같은 벡터는 벡터 역가의 상당한 감소 없이, LTR TATA 박스의 제거 (예를 들어, -418 내지 -18의 결실)를 포함하여, 상당한 U3 결실을 용인하는 것으로 밝혀졌다. 이들 결실은 LTR의 전사 능력이 약 90% 이하로 감소된다는 점에서 LTR 영역을 실질적으로 전사적 불활성이 되도록 한다.

또한, 전달 벡터 작제물에서 업스트림 LTR의 일부가 구성적으로 활성인 프로모터 서열로 대체되는 경우, Tat의 트랜스-작용 기능이 불필요하게 된다는 것이 입증되었다 (예를 들어, Dull 등 (1998) J Virol. 72(11): 8463-8471 참조). 또한, 본 발명자들은 트랜스에서 rev의 발현이 단지 gag 및 pol을 함유하는 패키징 작제물로부터 고역가의 HIV-유래 벡터 스톡의 생성을 허용한다는 것을 보여준다. 이러한 설계는 상보성을 조건으로 한 패키징 기능의 발현이 생산자 세포에서만 이용가능하게 한다. 생성된 유전자 전달 시스템은 HIV-1의 9개 유전자 중 단지 3개만 보존하며, 형질도입 입자의 생성을 위해 4개의 별개 전사 단위에 의존한다.

실시예 1에 예시된 일 구현예에서, gp91^phox를 암호화하는 핵산을 발현하는 카세트는 5' LTR에서 치환된 CMV 인핸서/프로모터를 갖는 SIN 벡터이다.

CMV 프로모터는 전형적으로 높은 수준의 비-조직 특이적 발현을 제공하는 것으로 인식될 것이다. 유사한 구성적 활성을 갖는 다른 프로모터는 RSV 프로모터, 및 SV40 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 포유동물 프로모터, 예컨대 베타-액틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 신장 인자 1α프로모터, 튜불린 프로모터 등이 또한 사용될 수 있다.

전술한 SIN 구성은 예시적이고 비제한적이다. 다수의 SIN 구성이 당업자에게 알려져 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 특정 구현예에서, LTR 전사는 약 95% 내지 약 99%까지 감소된다. 특정 구현예에서, LTR은 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 전사적으로 불활성화될 수 있다.

절연체 요소

특정 구현예에서, 생물안전성을 추가로 향상시키기 위해, 절연체는 본원에 기술된 렌티바이러스 벡터에 삽입된다. 절연체는 게놈 전체에 걸쳐 존재하는 DNA 서열 요소이다. 이들은 염색질을 변형시키고 국소적 유전자 발현을 변경시키는 단백질에 결합한다. 본원에 기술된 벡터에서 절연체의 배치는 특히 다음을 포함하는 다양한 잠재적 이점을 제공한다: 1) 측접 염색체에 의한 발현의 위치 효과 변화로부터 벡터의 차폐 (즉, 장벽 활성); 및 2) 벡터에 의한 유전자 발현의 삽입 트랜스-활성화로부터 측접 염색체의 차폐 (인핸서 차단). 따라서, 절연체는 이들의 발현이 달리 게놈 또는 유전적 내용물 내의 조절 신호에 의해 영향을 받을 수 있는 게놈 또는 유전적 내용물에 내재된 유전자 또는 전사 단위의 독립적인 기능을 보존하는 것을 도울 수 있다 (예를 들어, Burgess-Beusse 등 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 16433; 및 [Zhan 등 (2001) Hum. Genet., 109: 471 참조). 본 문맥에서, 절연체는 통합 부위 효과로부터 렌티바이러스-발현 서열을 보호하는 데 기여할 수 있으며, 이는 게놈 DNA에 존재하는 시스-작용 요소에 의해 매개되고 전달된 서열의 조절되지 않은 발현을 야기할 수 있다. 다양한 구현예에서, 절연체 서열이 하나 또는 둘의 LTR 또는 세포 게놈 내로 통합되는 벡터의 영역의 어느 곳에 삽입되는 LV가 제공된다.

최초의 가장 잘 특성화된 척추동물 염색질 절연체는 닭 β-글로빈 유전자좌 제어 영역 내에 위치한다. DNase-I 과민성 부위-4 (cHS4)를 함유하는 이 요소는 닭 β-글로빈 유전자좌의 5' 경계를 구성하는 것으로 보인다 (Prioleau 등 (1999) EMBO J. 18: 4035-4048). cHS4 요소를 함유하는 1.2 kb 단편은 세포주에서 글로빈 유전자 프로모터 및 인핸서의 상호작용을 차단하는 능력 (Chung 등 (1993) Cell, 74: 505-514), 및 초파리 (Id.), 형질전환된 세포주 (Pikaart 등 (1998) Genes Dev. 12: 2852-2862), 및 형질전환 포유동물 (Wang 등 (1997) Nat. Biotechnol., 15: 239-243; Taboit-Dameron 등 (1999) Transgenic Res., 8: 223-235)에서 발현 카세트를 위치 효과로부터 보호하는 능력을 포함하여, 고전적인 절연체 활성을 나타낸다. 다수의 이러한 활성은 250-bp 단편에 함유되어 있다. 이러한 구간 내에 인핸서-차단 검정에 개입되는 징크 핑거 DNA 결합 단백질 CTCF와 상호작용하는 49-bp cHS4 코어 (Chung 등 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94: 575-580)가 있다 (Bell 등 (1999) Cell, 98: 387-396).

하나의 예시적이고 적합한 절연체는, Ramezani 등 (2008) Stem Cell 26: 3257-3266에 기술된 인간 T-세포 수용체 알파/델타 차단 요소 알파/델타 I (BEAD-I) 절연체 유래의 닭 β-글로빈 5' HS4 절연체 및 상동성 영역의 최소의 CTCF 결합 부위 인핸서-차단 구성요소를 함유하는 77 bp 절연체 요소인 FB (FII/BEAD-A)이다. FB "합성" 절연체는 완전한 인핸서 차단 활성을 갖는다. 이러한 절연체는 예시적이고 비제한적이다. 예를 들어 전장 닭 베타-글로빈 HS4 또는 이의 절연체 서브-단편, 안키린 유전자 절연체 및 다른 합성 절연체 요소를 포함한 다른 적합한 절연체가 사용될 수 있다.

패키징 신호.

다양한 구현예에서, 본원에 기술된 벡터는 패키징 신호를 추가로 포함한다. "패키징 신호", "패키징 서열", 또는 "PSI 서열"은 서열이 레트로바이러스 입자 내로의 패키징 신호를 포함하는 핵산의 패키징을 지시하기에 충분한 임의의 핵산 서열이다. 상기 용어는 천연 발생 패키징 서열 및 또한 이의 조작된 변이체를 포함한다. 렌티바이러스를 포함하는, 다수의 상이한 레트로바이러스의 패키징 신호는 당업계에 공지되어 있다. 하나의 예시적이지만, 비제한적인 PSI는 서열번호 25로 제공된다.

Rev 반응 요소 (RRE).

특정 구현예에서, 본원에 기술된 렌티바이러스 벡터는 스플라이싱되지 않은 RNA의 핵외 수송을 향상시키기 위한 Rev 반응 요소 (RRE)를 포함한다. RRE는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예시적인 RRE는 HIV NL4-3 게놈(Genbank 등록번호 AF003887)의 7622 내지 8459번 위치에 위치한 것과 같은 RRE 뿐만 아니라, HIV의 다른 균주 또는 다른 레트로바이러스 유래의 RRE를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이와 같은 서열은 Genbank로부터 또는 URL hiv-web.lanl.gov/content/index인 데이터베이스로부터 쉽게 이용할 수 있다. 하나의 예시적이지만, 비제한적인 RRE는 서열번호 26)에 제시되어 있다.

폴리퓨린 트랙 (cPPT, 3'PPT).

다양한 구현예에서, 본원에 기술된 렌티바이러스 벡터는 폴리퓨린 트랙 (예를 들어, 중심 폴리퓨린 트랙 (cPPT), 3' 폴리퓨린 트랙 (3'PPT))을 추가로 포함한다. 렌티바이러스 (예를 들어, HIV-1) 벡터 작제물에 3'PPT (예를 들어, 서열번호 28 참조) 또는 중심 폴리퓨린 트랙 (cPPT)을 함유하는 단편의 삽입은 형질도입 효율을 향상시키는 것으로 알려져 있다.

발현-자극 전사후 조절 요소 (PRE)

특정 구현예에서, 본원에 기술된 렌티바이러스 벡터 (LV)는 전사체 내의 존재가 단백질 수준에서 이종성 핵산 (예를 들어, gp91^phox)의 발현을 증가시키는 임의의 다양한 전사후 조절 요소(PRE)를 포함할 수 있다. PRE는 특정 구현예, 특히 보통의 프로모터를 갖는 렌티바이러스 작제물을 수반하는 구현예에서 특히 유용할 수 있다.

PRE의 한 유형은 유전자 발현을 자극할 수 있는 발현 카세트 내에 위치한 인트론이다. 그러나, 인트론은 렌티바이러스의 수명 주기 이벤트 동안 스플라이싱으로 제거될 수 있다. 따라서, 인트론이 PRE로서 사용되는 경우, 이들은 전형적으로 벡터 게놈 전사체와 반대 방향으로 배치된다.

스플라이싱 이벤트에 의존하지 않는 전사후 조절 요소는 바이러스 수명 주기 동안 제거되지 않는 이점을 제공한다. 일부 예는 단순 포진 바이러스의 전사후 처리 요소, B형 간염 바이러스의 전사후 조절 요소 (HPRE) 및 우드척 간염 바이러스의 전사후 조절 요소 (WPRE)이다. 이들 중 WPRE는 HPRE에서 발견되지 않는 추가적인 시스-작용 요소를 함유하기 때문에, 전형적으로 바람직하다. 이러한 조절 요소는 전형적으로 벡터 내에 위치하여 이식유전자의 RNA 전사체에 포함되지만, 이식유전자 번역 단위의 정지 코돈 외부에 위치한다.

WPRE는 미국 특허 제6,136,597호에서 특성화되고 기술되어 있다. 본원에 기술된 바와 같이, WPRE는 핵으로부터 세포질로 RNA의 효율적인 수송을 매개하는 RNA 수송 요소이다. 이는 시스-작용 핵산 서열의 삽입에 의해 이식유전자의 발현을 향상시켜, 요소 및 이식유전자가 단일 전사체 내에 함유되도록 한다. 센스(sense) 방향으로 WPRE의 존재는 이식유전자 발현을 최대 7배 내지 10배까지 증가시키는 것으로 나타났다. 인트론으로서 완전한 인트론-함유 유전자 대신 cDNA의 형태인 레트로바이러스 벡터 전달 서열은 일반적으로 레트로바이러스 입자의 형성을 야기하는 일련의 사건 동안 스플라이싱으로 제거된다. 인트론은 스플라이싱 기작과 1차 전사체의 상호작용을 매개한다. 스플라이싱 기작에 의한 RNA의 가공은 이들의 세포질 수송을 촉진시키기 때문에, 스플라이싱과 수송 기작 사이의 커플링으로 인해, cDNA는 종종 비효율적으로 발현된다. 따라서, 벡터에서 WPRE (예를 들어, 서열번호 27 참조)의 포함은 이식유전자의 발현 향상을 초래한다.

형질도입된 숙주 세포 및 세포 형질도입의 방법.

본원에 기술된 재조합 렌티바이러스 벡터 (LV) 및 생성된 바이러스는 포유동물 세포 내로 이종성 핵산 서열 (예를 들어, gp91^phox를 암호화하는 핵산)을 전달할 수 있다. 다양한 구현예에서, 세포로의 전달을 위해, 본원에 기술된 벡터는 바람직하게는 적합한 패키징 세포주와 함께 사용되거나 필요한 레트로바이러스 유전자 (예를 들어, gag 및 pol)를 함유하는 다른 벡터 플라스미드와 함께 시험관 내에서 세포 내로 공동 형질감염되어 본 발명의 벡터를 패키징하고 세포를 감염시킬 수 있는 복제 무능 비리온을 형성한다.

특정 구현예에서, 벡터는 형질감염을 통해 패키징 세포주 내로 도입된다. 패키징 세포주는 벡터 게놈을 함유하는 바이러스 입자를 생성한다. 형질감염 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 패키징 세포주로의 패키징 벡터 및 전달 벡터의 동시 형질감염 후, 재조합 바이러스는 배양 배지로부터 회수되고 당업자에 의해 사용되는 표준 방법에 의해 적정된다. 따라서, 패키징 작제물은 일반적으로 우성 선별 마커, 예컨대 네오마이신, DHFR, 글루타민 합성효소와 함께 인산칼슘 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공에 의해 인간 세포주로 도입된 다음, 적절한 약물의 존재 하에 선택되고 클론이 분리될 수 있다. 특정 구현예에서, 선별 마커 유전자는 작제물에서 패키징 유전자에 물리적으로 연결될 수 있다.

패키징 기능이 적합한 패키징 세포에 의해 발현되도록 구성된 안정적인 세포주는 공지되어 있다 (예를 들어, 패키징 세포를 기술하는 미국 특허 제5,686,279호 참조). 일반적으로, 바이러스 입자의 생성을 위해, 렌티바이러스 Gag 및 Pol 유전자의 발현과 양립가능한 임의의 세포, 또는 이와 같은 발현을 지지하도록 조작될 수 있는 임의의 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어, 생산자 세포, 예컨대 293T 세포 및 HT1080 세포가 사용될 수 있다.

패키징 세포에 통합된 렌티바이러스 세포를 갖는 패키징 세포는 생산자 세포를 형성한다. 따라서 생산자 세포는 관심이 있는 치료 유전자 (예를 들어, Gp91^phox)를 운반하는 패키징된 감염성 바이러스 입자를 생성하거나 방출할 수 있는 세포 또는 세포주이다. 이러한 세포는 추가로 고정 의존성일 수 있으며, 이는 이들 세포가 표면, 예컨대 유리 또는 플라스틱에 부착될 경우 최적으로 성장, 생존, 또는 기능을 유지할 것임을 의미한다. 벡터가 복제 가능한 경우 렌티바이러스 벡터 패키징 세포주로서 사용되는 고정 의존성 세포주의 일부 예는 HeLa 또는 293 세포 및 PERC.6 세포이다.

따라서, 특정 구현예에서, 세포를 본원에 기술된 렌티바이러스 벡터를 함유하는 비리온과 접촉시키는 단계를 포함하는, 유전자를 세포로 전달한 후, 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법이 제공된다. 세포 (예를 들어, 조직 또는 기관의 형태)는 생체외에서 비리온과 접촉 (예를 들어, 감염)될 수 있고, 이후 유전자 (예를 들어, gp91^phox를 암호화하는 핵산)가 발현될 대상체 (예를 들어, 포유동물, 동물 또는 인간)에게 전달될 수 있다. 다양한 구현예에서, 세포는 대상체에 대해 자가 유래 (즉, 대상체 유래)일 수 있거나, 이는 대상체에 대해 비-자가 유래 (즉, 동종이계 또는 이종)일 수 있다. 더욱이, 본원에 기술된 벡터는 분열 세포 및 비분열 세포 둘 다에 전달될 수 있기 때문에, 세포는 예를 들어, 골수 세포, 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 지방 조직으로부터 수득됨), 및 인간 및 동물 공급원으로부터 유래된 다른 1차 세포를 포함하여 매우 다양할 수 있다. 대안적으로, 비리온은 생체내에서 대상체에게 또는 대상체의 국소 영역 (예를 들어, 골수)에 직접적으로 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 기술된 렌티벡터는 골수, 말초 혈액 또는 제대혈로부터 수득된 인간 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포의 형질도입 뿐만 아니라, CD4⁺ T 세포, 말초 혈액 B 또는 T 림프구 세포 등의 형질도입에 특히 유용할 것이다. 특정 구현예에서, 특히 바람직한 표적은 CD34⁺ 조혈 줄기 및 전구 세포이다.

유전자 요법.

또 다른 구현예에서, 인간 조혈 줄기 세포를 형질도입하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 조혈 줄기 세포를 포함하는 인간 세포 집단에서 벡터에 의한 인간 조혈 전구 세포의 형질도입을 수행하는 조건 하에서 상기 집단을 전술한 렌티벡터 중 하나와 접촉시키는 단계를 수반한다. 줄기 세포는 최종 적용에 따라 생체내 또는 시험관내에서 형질도입될 수 있다. 인간 유전자 요법, 예컨대 인간 줄기 세포의 유전자 요법의 맥락에서도, 줄기 세포를 생체내에서 형질도입하거나, 대안적으로 시험관내에서 형질도입한 후, 형질도입된 줄기 세포를 인간 대상체에게 주입할 수 있다. 이러한 구현예의 일 측면에서, 인간 줄기 세포는 인간, 예를 들어, X-CGD 환자로부터, 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 제거되고 상기 언급한 바와 같이 형질도입될 수 있다. 이후 형질도입된 줄기 세포는 동일 또는 상이한 인간으로 재도입된다.

줄기 세포/전구 세포 유전자 요법.

다양한 구현예에서, 본원에 기술된 렌티벡터는 골수, 말초 혈액 또는 제대혈로부터 수득된 인간 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포 (HSC)의 형질도입 뿐만 아니라, CD4⁺ T 세포, 말초 혈액 B 또는 T 림프구 세포 등의 형질도입에 특히 유용하다. 특정 구현예에서, 특히 바람직한 표적은 CD34⁺ 조혈 줄기 및 전구 세포이다.

세포, 예를 들어 CD34⁺ 세포, 수지상 세포, 말초 혈액 세포 또는 종양 세포가 생체외에서 형질도입되는 경우, 벡터 입자는 일반적으로 10⁵개의 세포 당 바이러스 벡터의 1×10⁵ 내지 50×10⁵개의 형질도입 단위에도 상응하는, 대략 1 내지 50의 감염다중도 (MOI)의 용량을 사용하여 세포와 인큐베이션된다. 이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 및 50 MOI에 상응하는 벡터의 양을 포함할 수 있다. 전형적으로, 벡터의 양은 HT-29 형질도입 단위 (TU) 면에서 표현될 수 있다.

특정 구현예에서, 세포-기반 요법은 줄기 세포 및/또는 조혈 전구체를 제공하는 것을 수반하고, 예를 들어, Gp91^phox를 암호화하는 렌티바이러스로 세포를 형질도입시킨 후, 형질전환된 세포를 이를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, CYBB 유전자에 돌연변이가 있는 대상체)에 도입한다.

특정 구현예에서, 방법은 세포 집단, 예를 들어, 대상체로부터 줄기 세포를 분리하고, 임의로 조직 배양물에서 세포를 확장하고, 세포 내 존재가 시험관내 세포에서 Gp91^phox의 생성을 초래하는 렌티바이러스 벡터를 투여하는 것을 수반한다. 이후, 세포는 대상체에게 복귀되며, 여기에서, 예를 들어, 이들은 Gp91^phox를 생성하는 식세포 집단을 제공할 수 있다.

일부 예시적이지만 비제한적인 구현예에서, 세포주 또는 대상체 이외의 개체 유래의 세포일 수 있는 세포의 집단이 사용될 수 있다. 대상체로부터 줄기세포, 면역계 세포 등을 분리하고 이들을 대상체에게 복귀시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 방법은 화학요법을 받는 환자에서, 예를 들어, 골수 이식, 말초 혈액 줄기 세포 이식 등에 사용된다.

줄기 세포가 사용되는 경우, 이와 같은 세포는 골수 (BM), 제대혈 (CB), 동원된 말초 혈액 줄기 세포 (mPBSC) 등을 포함하는 다수의 공급원으로부터 유래될 수 있음이 인식될 것이다. 특정 구현예에서, 유도 만능 줄기 세포 (IPSC)의 사용이 고려된다. 조혈 줄기 세포 (HSC)를 분리하고, 이러한 세포를 형질도입한 다음, 이를 포유동물 대상체에 도입하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

특정 구현예에서, 본원에 기술된 렌티바이러스 벡터 (예를 들어, 도 19 참조)는 Gp91^phox를 암호화하는 핵산을 X-CGD 환자의 골수 줄기 세포로 도입한 후 자가 이식함으로써, X-CGD에 대한 줄기 세포 유전자 요법에 사용된다.

벡터의 직접 도입.

특정 구현예에서, 본원에 기술된 벡터(들)의 직접 도입에 의한 대상체의 직접 치료가 고려된다. 렌티바이러스 조성물은 비경구 (예를 들어, 정맥내), 피내, 피하, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피 (국부), 경점막, 직장, 및 질을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 이용가능한 경로에 의한 전달을 위해 제형화될 수 있다. 일반적으로 사용되는 전달 경로는 흡입, 비경구, 및 경점막을 포함한다.

다양한 구현예에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 LV를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 약학 투여와 양립가능한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.

일부 구현예에서, 활성제, 즉 본원에 기술된 렌티바이러스 벡터 및/또는 벡터와 함께 투여되는 다른 작용제는 화합물이 신체로부터 빨리 제거되는 것을 방지할 담체와 함께, 예컨대 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함한 방출 제어 제형으로 제조된다. 생분해성이고 생체적합성인 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이와 같은 조성물의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 적합한 물질은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼스사(Nova Pharmaceuticals, Inc)로부터 상업적으로 입수될 수 있다. 리포좀은 또한 약학적으로 허용가능한 담체로서 사용될 수 있다. 이는 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호에 기술된 바와 같이, 당업자에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 바이러스에 의해 감염된 세포 또는 특정 세포 유형을 표적으로 한다. 예를 들어, 조성물은 세포 표면 마커, 예를 들어, 감염된 세포의 표면 상에서 발현된 내인성 마커 또는 바이러스 항원에 대한 단클론성 항체를 사용하여 표적화될 수 있다.

투여의 용이성 및 투약의 균일성을 위해 조성물을 투약 단위 형태로 제형화하는 것이 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투약 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 투약량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 약학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 LV를 포함한다.

단위 용량은 단일 주사로 투여될 필요는 없지만, 정해진 기간에 걸쳐 연속 주입을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 LV의 단위 용량은 세포주, 예컨대 HeLa 또는 293 상에서 벡터를 적정함으로써 정의된 바와 같이, 렌티벡터의 형질도입 단위 (T.U.)의 관점에서 편리하게 기술될 수 있다. 특정 구현예에서, 단위 용량은 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³ T.U. 이상의 범위일 수 있다.

약학 조성물은 필요에 따라 다양한 간격으로 그리고 상이한 기간에 걸쳐, 예를 들어, 약 1 내지 약 10주; 약 2 내지 약 8주; 약 3 내지 약 7주; 약 4주; 약 5주; 약 6주 등의 기간 동안 주당 1회 투여될 수 있다. 치료 조성물을 무기한으로 투여하는 것이 필요할 수 있다. 당업자는 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 기타 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는 특정 인자가 대상체를 효과적으로 치료하는데 요구되는 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. LV를 이용한 대상체의 치료는 단일 치료를 포함할 수 있거나, 많은 경우에 일련의 치료를 포함할 수 있다.

예시적이지만 비제한적인, 유전자 요법 벡터의 투여를 위한 용량 및 적합한 용량을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 또한, LV의 적절한 용량은 특정 수용자 및 투여 방식에 따라 달라질 수 있음이 이해된다. 임의의 특정 대상체에 대한 적절한 용량 수준은 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도, 기타 투여되는 치료제 등을 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 기술된 렌티바이러스 유전자 요법 벡터는 예를 들어, 정맥내 주사, 국소 투여에 의해, 또는 정위 주사에 의해 대상체에게 전달될 수 있다 (예를 들어, Chen 등 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3054 참조). 특정 구현예에서, 벡터는 경구로 또는 흡입으로 전달될 수 있고, 이들을 분해로부터 보호하고, 조직 또는 세포 내로 흡수 등을 향상시키기 위해 캡슐화되거나 달리 조작될 수 있다. 약학적 제제는 허용가능한 희석제 중에 LV를 포함할 수 있거나, LV가 내장된 서방형 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 기술된 바와 같은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터의 경우와 같이 벡터가 재조합 세포로부터 온전히 생성될 수 있는 경우, 약학적 제제는 벡터를 생성하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 LV를 포함하는 약학적 조성물은 임의로 투여 지침서와 함께, 용기, 팩, 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.

전술한 조성물, 방법 및 용도는 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 의도된다. 본원에 제공된 교시를 사용하여 조성물, 방법 및 용도에 대한 다른 변형이 당업자에게 쉽게 이용가능할 것이다.

실시예 1

X-CGD 치료를 위한 렌티바이러스 벡터의 개발

이 실시예는 X-연관 만성 육아종 질환 (X-CGD)의 치료를 위한 신규 렌티바이러스 벡터의 개발을 설명한다. 특히, 본 발명자들은 X-CGD에 대한 임상 시험을 진행 중인 현재 렌티바이러스 벡터보다 더 높은 발현 수준을 나타내는 벡터(들)의 개발을 기술하였다 (MSP-Gp91^phox-WPRE로도 알려진, pChim-CYBB, 예를 들어, Santilli 등(2011) Mol. Therapy., 19(1): 122-122 참조). 이 렌티바이러스 벡터는 키메라 골수성-특이적 프로모터 (MSP)를 사용하고, 성숙한 인간 호중구 집단에서 만성적으로 저-발현되며, 천연 CYBB 유전자의 계통 특이적 발현 패턴을 요약하지 못한다. 대조적으로, 이 실시예에 기술된 벡터는 천연 CYBB 유전자의 발현 패턴을 모방하는 엄격한 계통 및 단계 특이적 발현을 보유한다 (예를 들어, 도 1 참조).

본 발명자들은 인간 게놈에서 내인성 CYBB 유전자를 조절하는 요소를 설명하기 위해 생물정보학 접근 방식을 구현하였다. 천연 CYBB 위상학적으로 관련된 도메인 (TAD)은 CYBB 유전자의 업스트림 100kb에서 다운스트림 500kb에 이르는 600kb 윈도우를 포함한다. 따라서, 이러한 CYBB TAD는 상기 유전자를 적절하게 조절하기 위해 인간 게놈에 600,000개의 염기쌍 윈도우를 제공한다.

본 발명자들은 600,000개의 염기쌍 윈도우 내에서 기능적 인핸서 요소를 설명하고, 9,000개의 염기쌍 미만의 렌티바이러스 벡터에 중요한 요소를 패키징하려고 시도하였다. 생물정보학 접근 방식을 사용하여, 15개의 추정되는 내인성 요소가 천연 CYBB 위상학적으로 관련된 도메인 (TAD) 내에서 확인되었다.

CYBB 유전자를 조절하는 중요한 인핸서 요소를 실험적으로 확인하기 위해, 각각의 추정되는 인핸서 요소는 리포터 유전자 (m시트린)의 발현을 유도하기 위한 내인성 CYBB 프로모터의 업스트림에 클로닝되었다 (예를 들어, 도 2 참조). 각각의 추정되는 인핸서 요소의 기능을 설명하기 위해, 본 발명자들은 3개의 표적 세포 계통인 제대혈 (CB) CD34+ 분화된 성숙한 호중구 및 단핵구 뿐만 아니라 RAMOS 세포 (B-림프구 세포주)에서 벡터 각각의 활성을 검정하였다. 모든 벡터를 MSP-mCit-WPRE 구성과 비교했다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 인핸서 요소 4는 성숙한 호중구에서 높은 수준의 발현을 유도한다. 추가적으로, 현재 임상 시험 중인 X-CGD 벡터를 사용하여 얻은 것보다 발현 수준이 현저하게 더 높다. 유사하게, 도 4에 나타낸 바와 같이, 인핸서 요소 4는 단핵구에서도 높은 수준의 발현을 유도하며, 그리고 또 발현 수준은 현재 임상 시험 중인 X-CGD 벡터를 사용하여 얻은 것보다 현저하게 더 높다.

도 5는 인핸서 요소 2가 B-세포에서 높은 수준의 계통 특이적 발현을 유도한다는 것을 보여준다. 인핸서 요소 중 어느 것도 Jurkat (T-세포)에서 발현되지 않으며, 이는 각 인핸서 요소의 계통 특이적 발현을 시사한다 (도 6 참조). 대조적으로, MSP-mCit-WPRE 작제물은 가장 높은 수준의 표적외 발현을 나타내었다.

따라서, 인핸서 요소 4는 성숙한 호중구 및 단핵구에서 계통 특이적 발현을 증가시키고, MSP-mCit-WPRE 벡터보다 2배 더 높은 발현을 나타내는 것으로 보인다. T-세포 (Jurkat) 또는 B-세포 (RAMO)에서는 인핸서 요소 4 유도된 발현이 관찰되지 않았다. 인핸서 요소 2는 B-세포 (RAMO)에서 계통 특이적 발현을 증가시키는 것으로 보인다. 인핸서 요소 2 유도된 발현은 호중구, 단핵구 또는 T-세포에서 관찰되지 않았다.

따라서, 인핸서 요소 2 및 4를 렌티바이러스 벡터에 통합하여 호중구, 단핵구 및 B-세포에서 표적 계통 특이적 발현을 보유하는 벡터를 설계하는 것으로 결정하였다. 본 발명자들은 인핸서 요소 4가 2개의 별개의 인핸서 모듈 (4L 및 4R)로 이루어지며, 이러한 요소 중 하나를 제거하여 벡터 크기를 감소시킬 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 평가되었음에 주목한다.

따라서, 평가를 위해 5개의 신규 벡터가 생성되었다. 이들은 4L-Int3-pro-mCit-WPRE, 4R-Int3-pro-mCit-WPRE, 2+ 4L-Int3-pro-mCit-WPRE, 2+ 4R-Int3-pro-mCit-WPRE, 및 2+ 4-Int3-pro-mCit-WPRE이었다. 이러한 신규 벡터는 CB CD34+ 분화된 호중구 및 단핵구에서, 그리고 RAMO 및 Jurkat에서 평가되었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 인핸서 요소 4의 2가지 단편, 4L 및 4R은, 호중구에서 상승적으로 작용한다. 그러나, 요소 4R 단독은 여전히 MSP 벡터 (현재 임상 시험 중인 벡터)보다 더 높은 발현을 갖는다. 단핵구에서, 4R 단편은 전체 요소 4와 유사한 수준으로 발현되는 것으로 보인다 (도 8 참조). 계통 특이성은 유지되었다 (도 9 참조). MSP-mCit-WPRE (현재 임상 시험 중인 벡터)와 달리, 모든 후보 벡터는 T-세포에서 표적외 발현을 제공하지 않았다. 추가적으로, 인핸서 요소 2의 통합은 B 세포에서 발현을 증가시키는 것으로 보인다 (도 10 참조).

이러한 결과의 관점에서, 본 발명자들은 요소 4 (4R)의 우측 절반이 호중구 및 단핵구에서 계통 특이적 인핸서 활성에 핵심 기여자인 것으로 결론지었다. 그러나, 4L 및 4R은 호중구에서 함께 조합할 때 발현의 상승적인 증가를 갖고 단핵구에서 함께 조합될 때 부가적인 효과를 갖는 것으로 보인다. 요소 2는 골수성 인핸서 요소 4, 4L 또는 4R 중 하나와 조합될 때 B-세포 인핸서로 남아 있으며, 이는 골수성 계통에서 불활성이다. 벡터 2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE는 CB CD34+ 분화된 호중구 및 단핵구에서 MSP-mCit-WPRE보다 1.6배 더 높게 발현된다. 그러나, 이는 RAMO 세포 (B-세포 계통)에서 MSP-mCit-WPRE 발현의 50%를 갖지만, 이는 치료하기에 충분한 발현량일 수 있다.

2-4Full-Int3-pro-mCit-WPRE는 호중구 및 단핵구에서 MSP-mCit-WPRE보다 각각 2배 및 1.6배 더 높게 발현된다.

특히 관심 있는 X-CGD 벡터 후보 중 하나는 2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE이며, 여기서 mCit은 Gp91^phox 를 암호화하는 핵산으로 대체될 수 있으며 (예를 들어, 도 11 참조), 이는 계통 특이적 발현을 보유하고, 천연 CYBB 유전자의 발현 패턴을 요약하고, 또한 성숙한 호중구 및 단핵구에서 MSP-mCit-WPRE 보다 더 높게 발현한다는 목표를 달성한다.

또 다른 목표는 발현을 유지하면서 벡터의 크기를 감소시키기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 설계된 결실은 "코어" 및 "울트라-코어" 변이체를 제조할 수 있다. 각각 7.6kb 및 5.9kb 벡터를 제조하기 위한 변형 (ORF에서 w/ Gp91^phox). 두 번째 목표는 발현을 증가시키면서 벡터를 축소하는 것이다. 특정 구현예에서, 이는 "엑스트라 4L 코어" 및/또는 "엑스트라 2"를 코어 및 울트라 코어 변이체에 추가하는 것을 수반할 수 있다. 추가적으로, Gp91^phox의 상이한 코돈 최적화를 활용하여 오픈 리딩 프레임 (ORF)에서 m시트린을 대체할 수 있다.

전장 요소 2는 1092개의 염기쌍을 포함한다. 200 bp 결실을 만들어 892 bp "코어" 변이체를 생성하였다 (예를 들어, 표 1, 서열번호 5 참조). 745 bp 결실을 만들어 347 bp 인핸서 요소 2 "울트라 코어" 변이체를 생성하였다 (예를 들어, 표 1, 서열번호 6 참조).

유사하게, 전장 요소 4R은 995bp를 포함하고 496bp 결실은 500bp 인핸서 요소 4R "코어" 변이체를 생성하도록 만들어졌다 (예를 들어, 표 1, 서열번호 10 참조). 741 bp 결실을 만들어 254 bp 요소 4R 인핸서 "울트라 코어" 변이체를 생성하였다 (예를 들어, 표 1, 서열번호 11 참조).

유사하게, 인트론 3 인핸서 (1778 bp)에 대해 242 bp 결실을 만들어 1536 bp 인트론 3 인핸서 "코어" 변이체를 생성하고, 1058bp 결실을 만들어 중간 단편 (예를 들어, 표 1, 서열번호 15 참조) 및 우측 단편 (예를 들어, 표 1, 서열번호 16 참조)을 포함하는 720bp 인트론 3 인핸서 "울트라 코어" 단편을 생성하였다.

507 bp 전장 CYBB 내인성 프로모터 (예를 들어, 표 1, 서열번호 1 참조)에 240 bp 결실을 만들어 267 bp CYBB 프로모터 "코어" 단편 (서열번호 2)을 생성하고, 337 bp 결실을 만들어 최소 CYBB 프로모터 "CYBB 울트라 코어 프로모터" (예를 들어, 표 1, 서열번호 3 참조)를 생성하였다.

"코어" 및 "울트라-코어"를 결실시킴으로써, 벡터 크기가 표 2에 나타낸 바와 같이 각각 1182bp 및 2882bp만큼 감소한다.

표 2. "코어" 및 "울트라 코어" 벡터 변이체의 크기.

추가적으로, 특정 구현예에서, "엑스트라" 단편이 포함된다. 따라서, 예를 들어, 본 발명자들은 RELA TF 결합 부위가 B-세포 발현을 증가시킬 수 있다고 가정하였다. RELA는 염증 및 면역을 포함하는 많은 세포 과정에서 역할을 한다. 더욱이, RELA 결합 크기에서 B 세포 계통 특이적 DNAseI 과민성이 있다. 따라서, 특정 구현예에서, TF 결합 풋프린트는 요소 2 구성요소 (예를 들어, 표 1, 서열번호 7 참조)에 포함될 수 있다.

추가적으로, 특정 구현예에서 4L "코어" 변이체 또는 4L "울트라 코어" 변이체가 4R 구성요소에 포함될 수 있다. 이러한 "엑스트라" 단편 작제물의 크기가 또한 표 2에 나타내어져 있다.

표 3에 나타낸 작제물을 시험하였다:

표 3. 시험된 렌티바이러스 작제물.

울트라-코어 및 엑스트라 울트라코어 변이체 벡터는 E2-E4R-Int3-pro-mCit-WPRE 작제물 또는 현재 임상 벡터 (MSP-Gp91^phox-WPRE)보다 CB CD34+ 분화된 호중구 (CD11b+ CD66b+ CD15+ CD16+) (도 12) 및 CB CD34+ 분화된 단핵구 (CD11b+ CD15+) (도 13)에서 현저하게 더 높은 발현을 나타낸다.

모든 울트라-코어 및 엑스트라 울트라 코어 변이체 벡터는 Jurkat 세포에서 낮은 발현 (현재 임상 벡터보다 낮음)을 나타내었다 (도 14).

도 16에 나타낸 바와 같이, 울트라 코어 벡터 및 엑스트라 울트라 코어 벡터는 코어 및 엑스트라 코어 변이체보다 더 높은 역가를 나타내었다.

이러한 관점에서 본 발명자들은 본 발명자들의 리드 벡터에 2.9kb를 결실시킴으로써, 본 발명자들은 하기와 같이 발현이 증가하였음을 결론 내렸다:

·호중구에서 180% 증가함 (MSP보다 3.4X 더 높음)

·단핵구에서 150% 증가함 (MSP보다 2.2X 더 높음)

·RAMO (B-세포주)에서 129% 증가함 (MSP보다 1.16X 더 높음)

벡터는 또한 T-세포 발현 없이 특이성을 유지한다 (변화 없음). 추가적으로, 1.2kb를 결실시킴으로써, 하기와 같이 발현을 감소시켰다:

·호중구에서 15% 감소

·단핵구에서 33% 감소

·RAMOS (B-세포주)에서 6% 감소

특정 구현예에서 하나의 특히 적합한 벡터는 2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE의 울트라-코어 변이체 (UC 2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE)이다. m시트린의 ORF는 임상적으로 관련된 벡터를 제공하기 위해 치료적 이식유전자 (Gp91^phox를 암호화하는 핵산)로 대체될 수 있다.

더욱이, 발현 및 역가를 최대화하기 위해 다수의 상이한 코돈 최적화가 평가되었다. 이들에는 jCAT, GeneArt, IDT, 현재 임상 벡터 (MSP-Gp91^phox-WPRE)에서 코돈 최적화된 서열 및 Gp91^phox cDNA가 포함된다.

본 발명자들은 원래 Int3-pro-Gp91^phox-WPRE 벡터 백본에서 상이한 코돈 최적화를 스크리닝하였다. 그러나, Int3-pro 벡터는 높은 계통 특이적 발현을 가지며, 성숙한 호중구에서만 발현되고 PLB-985 CYBB ^-/- 세포주 (인간 전골수아세포주)에서는 잘 발현되지 않았다. PLB-985 X-CGD 세포주를 사용하기 위해, 본 발명자들은 MSP-Gp91^phox-WPRE 벡터 백본으로 Gp91^phox의 상이한 코돈 최적화를 스크리닝하기로 결정하였다.

리드 코돈 최적화된 서열은 본원에 기술된 다양한 X-CGD 벡터로 전달될 수 있다. 본 발명자들은 코돈 최적화가 특정 종 (아마도 심지어 세포 유형) 내에서 발현의 최적화를 위한 것이나, 이상적인 코돈 최적화는 이것이 발현되는 유래의 프로모터/벡터와 독립적이어야 한다는 것에 주목한다.

도 17에 나타낸 바와 같이, gp91^phox의 jCAT 최적화는 시험된 최적화 중 가장 높은 발현 수준을 생성하였다. 다양한 최적화의 원시 역가는 (MSP-Gp91^phox-WPRE) 최적화에 제시되어 있으며, jCAT 최적화는 현저하게 다르지 않았다 (도 18).

전술한 관점에서, 본 발명자들은 jCAT가 Gp91^phox의 최적 코돈 최적화라고 결론 내렸다. 이 코돈 최적화는 임상 MSP-Gp91^phox-WPRE 벡터에서 천연 cDNA 서열보다 2배 더 높고 현재 코돈 최적화된 서열보다 1.2배 더 높은 발현을 증가시킨다. 이 최적화는 또한 천연 cDNA 서열 (MSP-Gp91^phox-WPRE) 보다 1.2X 더 높은 역가를 증가시킨다.

생물정보학 유도 접근 방식을 구현함으로써, 본 발명자들은 천연 CYBB 유전자의 발현 패턴을 모방하는 엄격한 계통 및 단계 특이적 발현을 보유하는 신규 X-CGD 렌티바이러스 벡터를 합리적으로 설계하였다. 하나의 선도 후보 벡터는 예를 들어, 도 20, 패널 A에 예시된 바와 같은 울트라 코어: UC 2-4R-Int3-pro-Gp91phox(jCAT)-WPRE 벡터이다. 이 벡터의 지도는 도 20, 패널 B에 제시되어 있고, 서열은 표 1 (서열번호 22)에 제시되어 있다.

실시예 2

MeloVec의 계통-특이적 발현

상기 실시예 1은 최적화된 선도 후보 벡터의 생성을 기술한다: UC 2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE (MyeloVec로도 알려짐). 이러한 벡터는 개선된 역가, 개선된 감염성 및 개선된 발현을 나타내었다.

다수의 상이한 코돈 최적화가 선별되었으며, 이는 m시트린의 오픈 리딩 프레임을 jCAT 코돈 최적화 Gp91^phox로 대체하여 실제 치료적 전이유전자를 발현하도록 결정되었다.

본원에 기술된 바와 같이, (m시트린을 발현하는) MyeloVec의 시험관내 계통 특이적 발현은 형질도입된 인간의 건강한 공여자 (HD) 제대혈 (CB) CD34+ 세포를 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스에 이식시켜 입증하였다. 추가적으로, X-CGD 표현형을 기능적으로 교정하는 (코돈 최적화된 Gp91^phox을 발현하는) MyeloVec의 능력은 하기와 같이 입증하였다:

1) 뮤린 X-CGD 계통 음성 (Lin-) 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)를 형질도입하고 시험관내에서 호중구로 분화시켜 Gp91^phox 발현의 회복 및 기능적 옥시다아제 활성의 회복을 평가함;

2) 뮤린 X-CGD Lin- HSPC를 형질도입하고 세포를 유사유전자형 B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (Pepboy) 마우스에 이식하여 질환의 생체내 기능적 교정을 입증함; 및

3) 인간 X-CGD 환자 세포를 형질도입하고 시험관내에서 호중구로 분화시켜 Gp91^phox 발현 및 기능적 옥시다아제 활성의 회복을 입증함.

도 21은 본 발명자들의 벡터를 원래의 2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE에서 코어 변이체 및 울트라 코어 (UC) 변이체로 최적화하였을 때 역가 (상단 패널) 및 감염성 (하단 패널)의 개선을 입증한다. 본 발명자들은 원래의 2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE에서 코어 변이체 및 울트라 코어 (UC) 변이체로 본 발명자들의 벡터의 크기를 감소시킴으로써 역가 및 감염성을 개선하였다.

도 22에 나타낸 바와 같이, (m시트린을 발현하는) MyeloVec은 천연 CYBB 유전자의 내인성 발현 패턴을 요약할 수 있다. 본 실험에서, 본 발명자들은 건강한 공여자 (HD) 제대혈 (CB) CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)를 형질도입하고 세포를 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스에 이식하였다. 유전자 변형된 세포는 조혈 시스템의 모든 상이한 계통을 만들어낼 것이다. 어떠한 계통이 m시트린을 어느 정도 발현하는지를 평가함으로써, 본 발명자들은 벡터의 계통 특이적 발현 패턴을 결정할 수 있고, 이것이 천연 CYBB 유전자의 내인성 발현 패턴을 모방하는지를 확인할 수 있다.

MyeloVec은 천연 CYBB 유전자의 내인성 발현 패턴을 요약할 수 있다 -- 호중구에서의 매우 높은 발현, 대량 골수성 세포에서의 높은 발현, B-세포에서의 중간 수준 발현 및 T-세포 및 HSPC에서의 최소 발현. 이는 도 22, 패널 A의 혈액 및 골수 (도 22, 패널 B)에 나타내었다.

MyeloVec은 또한 호중구 발달 전반에 걸쳐 천연 CYBB 유전자의 시간적 발현 패턴을 요약할 수 있다. 발현은 호중구가 성숙함에 따라 더 높아져, 천연 CYBB 유전자의 패턴을 모방한다 (예를 들어, 도 23 참조).

따라서, NSG 마우스에 이식된 형질도입된 인간 제대혈 CD34+ 세포에서 MyeloVec의 m시트린 발현 패턴은 혈액 및 골수 세포의 여러 계통에 걸쳐 Gp91^phox의 내인성 발현 패턴을 요약하였다 (예를 들어, 표 4 참조).

표 4. MyeloVec의 발현 패턴.

이후, 본 발명자들은 m시트린 리포터 유전자를 포함하는 오픈 리딩 프레임을 jCAT 코돈 최적화된 버전의 Gp91^phox로 대체하여 기능적 연구를 위한 치료적 전이유전자를 발현시켰다.

도 24 및 도 25는 마우스 X-CGD HSPC에서 시험관내 X-CGD 표현형을 기능적으로 교정하는 MyeloVec의 능력을 입증한다. 본 실험을 위해, 본 발명자들은 뮤린 X-CGD 계통 음성 (Lin-) 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)를 형질도입하고 세포를 성숙한 호중구로 분화시켜, Gp91^phox의 발현 (도 24) 및 옥시다아제 활성 (도 25)을 회복하도록 하는 선도 후보 벡터 (UC-2-4R-Int3-pro-Gp91^phox(jCAT)-WPRE)의 능력을 입증한다. 이러한 실험에서, 옥시다아제 활성은 디하이드로로다민(DHR) 검정에 의해 평가되었다.

도 24에 나타낸 바와 같이, MyeloVec은 X-CGD 마우스 HPSC로부터 분화된 호중구에서 현재 임상 벡터 (MSP)보다 더 높은 수준의 Gp91^phox를 회복시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 추가적으로, MyeloVec은 성숙한 호중구로 분화된 형질도입된 뮤린 X-CGD 세포에서 옥시다아제 활성을 WT 수준으로 복원할 수 있다 (예를 들어, 도 25 참조). 따라서, MyeloVec은 뮤린 CYBB Lin- 시험관내 분화된 호중구에서 MSP (현재 임상 벡터) 보다 1.6배 더 높은 Gp91phox를 발현하고, MyeloVec은 뮤린 CYBB Lin- 시험관내 분화된 호중구에서 WT 수준으로 옥시다아제 활성을 회복할 수 있는 것으로 보인다.

도 26-29는 X-CGD 마우스 모델에서 생체내 X-CGD 표현형을 교정하는 MyeloVec의 능력을 입증한다. 간략하게, HPSC를 X-CGD 마우스로부터 분리하고 MyeloVec을 이용하여 형질도입하였다. 이후, 유전자 변형된 세포를 유사유전자형 B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (Pepboy) 마우스에 이식하였다. 상이한 조혈 계통에 걸쳐 Gp91^phox 발현 및 옥시다아제 활성 회복의 분석을 위해 이식 후 16주에 마우스를 수확하였다.

높은 수준의 Gp91^phox 발현은 호중구 및 말초 혈액의 단핵구에서 회복되었다 (예를 들어, 도 26 참조). 이는 혈액 호중구 및 단핵구에서 야생형 수준에 가까운 옥시다아제 활성의 회복을 이끌었다 (예를 들어, 도 27 참조). 높은 수준의 Gp91^phox 발현은 또한 골수 호중구 및 단핵구에서 회복되었고 (예를 들어, 도 28 참조), 이는 옥시다아제 활성의 야생형 수준의 회복을 이끌었다 (예를 들어, 도 26 참조). 따라서, 이는 생체내 X-CGD 마우스 모델을 교정한 것으로 보인다.

시험관내에서 인간 환자 X-CGD 세포를 기능적으로 교정하는 MyeloVec의 능력을 입증하기 위해, 본 발명자들은 인간 X-CGD HSPC를 MyeloVec을 사용하여 형질도입하고 세포를 시험관내에서 성숙한 호중구로 분화시켰다. 이후, 본 발명자들은 DHR 검정 및 사이토크롬 C 검정으로 Gp91^phox 발현의 회복 및 옥시다아제 활성의 회복을 측정하였다. 도 30은 인간 X-CGD 호중구에서 야생형 수준의 Gp91^phox 발현을 회복시키는 MyeloVec의 능력을 나타낸다. 도 31은 인간 X-CGD 호중구에서 야생형 수준의 세포 옥시다아제 활성을 회복시키는 MyeloVec의 능력을 나타낸다 (DHR 검정). 도 32는 1.63의 평균 VCN으로 인간 X-CGD 호중구에서 야생형 수준의 대량 옥시다아제 활성을 회복시키는 MyeloVec의 능력을 나타낸다 (사이토크롬 C 검정).

따라서 생물정보학-기반 설계 접근 방식을 구현하여, 본 발명자들은 본 발명자들의 선도 후보 X-CGD 벡터 UC-2-4R-Int3-pro-coGp91^phox-WPRE (MyeloVec)를 개발하였다 (예를 들어, 도 : 20, 패널 A 및 B, 및 서열번호 22 참조).

결론

상기 기술된 실험은, 뮤린 X-CGD 마우스 모델에서 생체내 X-CGD 표현형을 교정하는 능력을 입증한다. 치명적으로 조사된 PepBoy 마우스에 이식된 형질도입된 뮤린 X-CGD Lin- 세포에서:

MyeloVec은 골수 호중구 및 단핵구에서 옥시다아제 활성을 WT 수준으로 회복시킬 수 있었으며;

MyeloVec은 1.74 이상의 VCN으로 말초 혈액 호중구 및 단핵구에서 WT 수준에 가까운 옥시다아제 활성을 달성하였으며; 그리고

MyeloVec을 이용하여 형질도입된 인간 X-CGD 환자 CD34+ HSPC로부터의 시험관내 분화된 호중구는 1.63의 평균 VCN으로 Gp91^phox 발현 및 기능적 옥시다아제 활성을 건강한 공여자 수준으로 회복시켰다.

본원에 기술된 실시예 및 구현예는 단지 예시적인 목적을 위한 것이며, 이를 고려하여 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이고 본 출원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구범위의 범주에 포함되어야 함이 이해된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 본원에 전문이 참조로 포함된다.

서열목록

서열번호 1: CYBB 프로모터

서열번호 2: 최소 CYBB 프로모터 (코어)

서열번호 3: 최소 CYBB 프로모터 (울트라-코어)

서열번호 4: 인핸서 요소 2

서열번호 5: 인핸서 요소 2 코어

서열번호 6: 인핸서 요소 2 울트라 코어

서열번호 7: 요소 2 RELA TF 결합 부위

서열번호 8: 인핸서 요소 4

서열번호 9: 인핸서 요소 4R

서열번호 10: 인핸서 요소 4R 코어

서열번호 11: 인핸서 요소 4R 울트라 코어

서열번호 12: 인핸서 요소 4L

서열번호 13: 인핸서 요소 4L 코어

서열번호 14: 전체 인트론 3 인핸서

서열번호 15: 중간 단편 INT3 인핸서 울트라 코어

서열번호 16: INT3 인핸서 우측 단편 울트라 코어

서열번호 17: Gp91 ^phox cDNA

서열번호 18: jCAT 코돈 최적화된 Gp91 ^phox

서열번호 19: 임상 co-op Gp91 ^phox

서열번호 20: 유전자Art 최적화된 Gp91 ^phox

서열번호 21: IDT 최적화된 Gp91 ^phox

서열번호 22: 전체 벡터

서열번호 23: CMV:

서열번호 24: 3'R/U5:

서열번호 25: PSI:

서열번호 26: RRE:

서열번호 27: WPRE:

서열번호 28: 3' PPT:

서열번호 29: 3' 델타 U3/R/U5

서열번호 30: SV40 ori:

서열번호 31: KANr:

서열번호 32: COLE1:

SEQUENCE LISTING <110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA KOHN, DONALD B. WONG, RYAN L. HOLLIS, ROGER P. <120> LENTIVIRAL VECTORS IN HEMATOPOIETIC STEM CELLS TO TREAT X-LINKED CHRONIC GRANULOMATOUS DISEASE <130> UCLAP218PUS <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 507 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tagcacataa aattggcaca tattaagcat tttgtaaata tcaaccatta caattgttac 60 tacttttctc agcaaggcta tgaatgctgt tccagcctgt caaaatcaca cctgtttaat 120 gtgttttacc cagcacgaag tcatgtctag ttgagtggct taaaaattgt gatcaaatag 180 ctggttagtt aaaaagttat ttcactgtgt aaaatacatc ccttaaaatg cactgttatt 240 tatctcttag ttgtagaaat tggtttcatt ttccactatg tttaattgtg actggatcat 300 tatagaccct ttttttgtag ttgttgaggt ttaaagattt aagtttgtta tggatgcaag 360 cttttcagtt gaccaatgat tattagccaa tttctgataa aagaaaagga aaccgattgc 420 cccagggctg ctgttttcat ttcctcattg gaagaagaag catagtatag aagaaaggca 480 aacacaacac attcaacctc tgccacc 507 <210> 2 <211> 267 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reduced CYBB promonter <400> 2 tatctcttag ttgtagaaat tggtttcatt ttccactatg tttaattgtg actggatcat 60 tatagaccct ttttttgtag 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aaccagcaag aaaagaatga 1800 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1860 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1920 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1980 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 2040 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 2100 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 2160 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaaa ttcaaaattt 2220 tatcgatcac gagactagcc tcgagaaatc aaaatacatc ttatttgagg cattaaaact 2280 tttttaagaa aataaaattt aaaataaagt tgtattcttc taaaaataat tttttaaacc 2340 agctgaaaat gaaaaatgca gattatacta agaagcaact gttttacatt ctgctttctg 2400 aatggtattt aaaaactcag ttattttcag aaatgaggaa gtcttgatct gctagatgaa 2460 ggtcggctgc aggtggtgtt tattgcttta tgatggcaac aaaccgtaaa cccatcactc 2520 agtaaatatt aaactggctg aatgaatcca aagcatgtct aacatacagg aaaaacacag 2580 ccctgttaag cagcccttat ctgggcctgg aaatcatttt gcatttctac agtcaagtct 2640 cctttctgaa caaaagatac aacattgaaa actgtcttct gtttcctgaa atgtctactc 2700 actacctcac tttcaacaga taaccttgcc ctctctttca caaaggaaat ggaaaccaca 2760 aagaggaagt ccctcaccct gctgtcccca gccctacaaa tcctcctgca tctgcactct 2820 gctccttccc tctttttaca gagaggctta aaaaccccca acttgccatg cagaaactaa 2880 tttctgtctg gatggcagtc ctagtcttaa gatcagaaag aaacaggaag gtgagagggt 2940 gaggttttat ctgttacctt atatagtctg ggagtcagag gcactcagtg tgcctctatc 3000 tttaatcacg tggtctagca ctagtctctt gggctttctg tctcatagtt ttttttttta 3060 gttgaaaaac aggtcaacta acacaaatgt aagaaggcat atgttggtct aaaagtatat 3120 taagcttttg agtttctgta aagtgttaca ccccataaaa tatgtacttc tttttagttc 3180 cacttcccat tttcttgaaa tatttttttc ttactcagtt tcaatagagc atagaaatct 3240 gctgaagtga ctcaataatc tcccttgcat tagaatggta gtttattgaa atcgggcaag 3300 gcttccggtg acagtaacag agaaacttcc ctttagaagt caatggcaga aagtaaagta 3360 agttagtaag gaagctatgg ggcatgatgg caacgtggat aattgggaag tggctggcaa 3420 taatttagaa gtaactcaaa gcatataaat gcaatctgcc tgatgatggg gaacaaaaaa 3480 ttatgggcag tcacagacag taaagtcctt ccttcctatg ccaccaaccg gttgtctcgc 3540 ctcctttttt aaggaagtgg tgaggattta agtttgttat ggatgcaagc ttttcagttg 3600 accaatgatt attagccaat ttctgataaa agaaaaggaa accgattgcc ccagggctgc 3660 tgttttcatt tcctcattgg aagaagaagc atagtataga agaaaggcaa acacaacaca 3720 ttcaacctct gccaccatgg gcaactgggc cgtgaacgag ggcctgagca tcttcgtgat 3780 cctggtgtgg ctgggcctga acgtgttcct gttcgtgtgg tactaccgcg tgtacgacat 3840 cccccccaag ttcttctaca cccgcaagct gctgggcagc gccctggccc tggcccgcgc 3900 ccccgccgcc tgcctgaact tcaactgcat gctgatcctg ctgcccgtgt gccgcaacct 3960 gctgagcttc ctgcgcggca gcagcgcctg ctgcagcacc cgcgtgcgcc gccagctgga 4020 ccgcaacctg accttccaca agatggtggc ctggatgatc gccctgcaca gcgccatcca 4080 caccatcgcc cacctgttca acgtggagtg gtgcgtgaac gcccgcgtga acaacagcga 4140 cccctacagc gtggccctga gcgagctggg cgaccgccag aacgagagct acctgaactt 4200 cgcccgcaag cgcatcaaga accccgaggg cggcctgtac ctggccgtga ccctgctggc 4260 cggcatcacc ggcgtggtga tcaccctgtg cctgatcctg atcatcacca gcagcaccaa 4320 gaccatccgc cgcagctact tcgaggtgtt ctggtacacc caccacctgt tcgtgatctt 4380 cttcatcggc ctggccatcc acggcgccga gcgcatcgtg cgcggccaga ccgccgagag 4440 cctggccgtg cacaacatca ccgtgtgcga gcagaagatc agcgagtggg gcaagatcaa 4500 ggagtgcccc atcccccagt tcgccggcaa cccccccatg acctggaagt ggatcgtggg 4560 ccccatgttc ctgtacctgt gcgagcgcct ggtgcgcttc tggcgcagcc agcagaaggt 4620 ggtgatcacc aaggtggtga cccacccctt caagaccatc gagctgcaga tgaagaagaa 4680 gggcttcaag atggaggtgg gccagtacat cttcgtgaag tgccccaagg tgagcaagct 4740 ggagtggcac cccttcaccc tgaccagcgc ccccgaggag gacttcttca gcatccacat 4800 ccgcatcgtg ggcgactgga ccgagggcct gttcaacgcc tgcggctgcg acaagcagga 4860 gttccaggac gcctggaagc tgcccaagat cgccgtggac ggccccttcg gcaccgccag 4920 cgaggacgtg ttcagctacg aggtggtgat gctggtgggc gccggcatcg gcgtgacccc 4980 cttcgccagc atcctgaaga gcgtgtggta caagtactgc aacaacgcca ccaacctgaa 5040 gctgaagaag atctacttct actggctgtg ccgcgacacc cacgccttcg agtggttcgc 5100 cgacctgctg cagctgctgg agagccagat gcaggagcgc aacaacgccg gcttcctgag 5160 ctacaacatc tacctgaccg gctgggacga gagccaggcc aaccacttcg ccgtgcacca 5220 cgacgaggag aaggacgtga tcaccggcct gaagcagaag accctgtacg gccgccccaa 5280 ctgggacaac gagttcaaga ccatcgccag ccagcacccc aacacccgca tcggcgtgtt 5340 cctgtgcggc cccgaggccc tggccgagac cctgagcaag cagagcatca gcaacagcga 5400 gagcggcccc cgcggcgtgc acttcatctt caacaaggag aacttctaac tgcaggaatt 5460 cgagcatctt accgccattt attcccatat ttgttctgtt tttcttgatt tgggtataca 5520 tttaaatgtt aataaaacaa aatggtgggg caatcattta catttttagg gatatgtaat 5580 tactagttca ggtgtattgc cacaagacaa acatgttaag aaactttccc gttatttacg 5640 ctctgttcct gttaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctgatattct 5700 taactatgtt gctcctttta cgctgtgtgg atatgctgct ttaatgcctc tgtatcatgc 5760 tattgcttcc cgtacggctt tcgttttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct 5820 ttatgaggag ttgtggcccg ttgtccgtca acgtggcgtg gtgtgctctg tgtttgctga 5880 cgcaaccccc actggctggg gcattgccac cacctgtcaa ctcctttctg ggactttcgc 5940 tttccccctc ccgatcgcca cggcagaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac 6000 aggggctagg ttgctgggca ctgataattc cgtggtgttg tcggggaagg gcctgctgcc 6060 ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg 6120 ggccgcctcc ccgcctggaa ttcgagctcg gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggca 6180 gctgtagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac tggaagggct aattcactcc 6240 caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 6300 gcctgggagc tctctggcta actagggaac ctactgctta agcctcaata aagcttgcct 6360 tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 6420 agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtagta gttcatgtca tcttattatt 6480 cagtatttat aacttgcaaa gaaatgaata tcagagagtg agaggaactt gtttattgca 6540 gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt 6600 tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggctc 6660 tagctatccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt 6720 ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct 6780 ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg 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caggttctcc ggccgcttgg 7680 gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc 7740 gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt 7800 gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt 7860 ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc 7920 gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc 7980 atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac 8040 caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag 8100 gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag 8160 gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat 8220 atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg 8280 gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa 8340 tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc 8400 ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attattaacg cttacaattt cctgatgcgg 8460 tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tcaggtggca cttttcgggg 8520 aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 8580 catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 8640 gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 8700 aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 8760 gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta 8820 gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 8880 gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 8940 atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 9000 cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 9060 cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 9120 agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 9180 tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 9240 gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 9300 catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 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gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 300 ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 360 cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 420 atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 480 ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccg 529 <210> 24 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Component of lentiviral vector <400> 24 gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60 ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 120 tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 180 <210> 25 <211> 138 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Packaging signal in lentiviral vector <400> 25 tcgacgcagg actcggcttg ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt 60 gagtacgcca aaaattttga ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt 120 cagtattaag cgggggag 138 <210> 26 <211> 205 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RRE in lentiviral vector <400> 26 tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 60 tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 120 ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 180 gaatcctggc tgtggaaaga tacct 205 <210> 27 <211> 656 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> WPRE in lentiviral vector <400> 27 cccatatttg ttctgttttt cttgatttgg gtatacattt aaatgttaat aaaacaaaat 60 ggtggggcaa tcatttacat ttttagggat atgtaattac tagttcaggt gtattgccac 120 aagacaaaca tgttaagaaa ctttcccgtt atttacgctc tgttcctgtt aatcaacctc 180 tggattacaa aatttgtgaa agattgactg atattcttaa ctatgttgct ccttttacgc 240 tgtgtggata tgctgcttta atgcctctgt atcatgctat tgcttcccgt acggctttcg 300 ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg 360 tccgtcaacg tggcgtggtg tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact ggctggggca 420 ttgccaccac ctgtcaactc ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg atcgccacgg 480 cagaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctaggttg ctgggcactg 540 ataattccgt ggtgttgtcg gggaagggcc tgctgccggc 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tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg 120 caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa 180 gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc 240 gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat 300 ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg 360 cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc 420 gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag 480 catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc 540 gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc 600 cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata 660 gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc 720 gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac 780 gagttcttct ga 792 <210> 32 <211> 620 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Drug resistance gene <400> 32 agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 60 aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 120 cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 180 agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 240 tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 300 gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 360 gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 420 ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 480 gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 540 ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 600 ggaaaaacgc cagcaacgcg 620

Claims (70)

1. 만성 육아종 질환의 치료를 위한 재조합 렌티바이러스 벡터 (LV)로서, 상기 벡터는
   CYBB 프로모터 또는 이의 유효 단편; 및
   상기 CYBB 프로모터 또는 프로모터 단편에 작동가능하게 연결된 gp91^phox를 암호화하는 핵산을 포함하는,
   핵산 작제물을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 것인, 벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 CYBB 프로모터 또는 이의 유효 단편은 전장 내인성 CYBB 프로모터 (서열번호 1)를 포함하는 것인, 벡터.
3. 제1항에 있어서, 상기 CYBB 프로모터는 CYBB 프로모터의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편은 최소 CYBB 프로모터 (코어) (서열번호 2)를 포함하거나 이로 이루어진 것인, 벡터.
4. 제3항에 있어서, 상기 CYBB 프로모터는 CYBB 프로모터의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편은 최소 CYBB 프로모터 (코어) (서열번호 2)로 이루어진 것인, 벡터.
5. 제1항에 있어서, 상기 CYBB 프로모터는 CYBB 프로모터의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편은 최소 CYBB 프로모터 (울트라 코어) (서열번호 3)를 포함하거나 이로 이루어지는 것인, 벡터.
6. 제5항에 있어서, 상기 CYBB 프로모터는 서열이 최소 CYBB 프로모터 (울트라 코어) (서열번호 3)로 이루어진 CYBB 프로모터의 유효 단편으로 이루어진 것인, 벡터.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 2 (서열번호 4) 또는 이의 유효 단편을 포함하는 것인, 벡터.
8. 제7항에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 2의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편은 인핸서 요소 2 코어 (서열번호 5)를 포함하거나 이로 이루어진 것인, 벡터.
9. 제8항에 있어서, 상기 인핸서 요소 2의 유효 단편의 서열은 인핸서 요소 2 코어 (서열번호 5)의 서열로 이루어진 것인, 벡터.
10. 제7항에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 2의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편은 인핸서 요소 2 울트라 코어 (서열번호 6)를 포함하거나 이로 이루어진 것인, 벡터.
11. 제10항에 있어서, 상기 인핸서 요소 2의 유효 단편의 서열은 인핸서 요소 2 울트라 코어 (서열번호 6)의 서열로 이루어진 것인, 벡터.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 RELA TF 결합 부위 또는 이의 유효 단편을 추가로 포함하는 것인, 벡터.
13. 제12항에 있어서, 상기 RELA TF 결합 부위는 서열번호 7)의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 벡터.
14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4 또는 이의 유효 단편을 포함하는 것인, 벡터.
15. 제14항에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4R 또는 이의 유효 단편을 포함하는 것인, 벡터.
16. 제15항에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4R의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편의 핵산 서열은 인핸서 요소 4R 코어 (서열번호 10)의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 벡터.
17. 제15항에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4R의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편의 핵산 서열은 인핸서 요소 4R 울트라 코어 (서열번호 11)의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 벡터.
18. 제16항에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4R의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편의 핵산 서열은 인핸서 요소 4R 울트라 코어 (서열번호 11)의 핵산 서열로 이루어진 것인, 벡터.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4L 또는 이의 유효 단편을 포함하는 것인, 벡터.
20. 제19항에 있어서, 상기 발현 카세트는 인핸서 요소 4L의 유효 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편은 4L 코어 서열 (서열번호 13)의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 벡터.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 인트론 인핸서 요소 3 (서열번호 14) 또는 이의 유효 단편을 포함하는 것인, 벡터.
22. 제21항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열번호 15의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 인트론 인핸서 요소 3 중간 단편을 포함하는 것인, 벡터.
23. 제21항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열번호 16의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 인트론 인핸서 요소 3 우측 단편을 포함하는 것인, 벡터.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gp91^phox를 암호화하는 핵산을 암호화하는 핵산은 CYBB cDNA 또는 코돈-최적화된 CYBB인 것인, 벡터.
25. 제24항에 있어서, 상기 gp91^phox를 암호화하는 핵산은 CYBB cDNA (서열번호 17)인 것인, 벡터.
26. 제24항에 있어서, 상기 gp91^phox를 암호화하는 핵산은 코돈 최적화된 CYBB인 것인, 벡터.
27. 제26항에 있어서, 상기 gp91^phox를 암호화하는 핵산의 서열은 jCAT 코돈 최적화된 CYBB (서열번호 18), 유전자Art 최적화된 CYBB (서열번호 20), IDT 최적화된 CYBB 서열번호 21), 및 이전 임상 후보 (서열번호 19)로 이루어진 군으로부터 선택되는 코돈 최적화된 CYBB인 것인, 벡터.
28. 제26항에 있어서, 상기 gp91^phox를 암호화하는 핵산의 서열은 jCAT 코돈 최적화된 CYBB (서열번호 18)인 것인, 벡터.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 Ψ 영역 벡터 게놈 패키징 신호를 포함하는 것인, 벡터.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 CMV 인핸서/프로모터를 포함하는 5' LTR을 포함하는 것인, 벡터.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 Rev 반응 요소 (RRE)를 포함하는 것인, 벡터.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 중심 폴리퓨린 트랙을 포함하는 것인, 벡터.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 번역후 조절 요소를 포함하는 것인, 벡터.
34. 제33항에 있어서, 상기 전사후 조절 요소는 변형된 우드척 전사-후 조절 요소 (WPRE)인 것인, 벡터.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 재조합을 통하여 야생형 렌티바이러스를 재구성할 수 없는 것인, 벡터.
36. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 도 19에 도시된 전체-크기 2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE의 특징을 포함하고, 여기서 mCit는 Gp91^phox를 암호화하는 핵산으로 대체되는 것인, 벡터.
37. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 도 20, 패널 A에 도시된 UC 2-4R-Int3-pro-coGp91^phox-WRPE의 특징을 포함하는 것인, 벡터.
38. 제37항에 있어서, 상기 벡터는 도 20, 패널 B에 나타낸 벡터에 도시된 특징을 포함하는 것인, 벡터.
39. 제38항에 있어서, 상기 벡터는 울트라 코어 (UC) 2-4R-Int3-Pro-(GP91-jcat)-WPRE (서열번호 22)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 벡터.
40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 CD33+ (대량 골수성 세포)에서 고발현, CD19+ (B 세포)에서 고발현, CD66b+ CD15+ CD11b+ CD16+ (성숙한 호중구)에서 고발현, 및 CD3+ T 세포에서 저발현 또는 무발현을 나타내는 것인, 벡터.
41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 형질도입된 숙주 세포.
42. 제41항에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포인 것인, 숙주 세포.
43. 제42항에 있어서, 상기 세포는 골수, 및/또는 제대혈, 및/또는 말초 혈액으로부터 유래된 줄기세포인 것인, 숙주 세포.
44. 제41항에 있어서, 상기 세포는 인간 조혈 전구 세포인 것인, 숙주 세포.
45. 제44항에 있어서, 상기 인간 조혈 전구 세포는 CD34+ 세포인 것인, 숙주 세포.
46. 대상체에서, 만성 육아종 질환 (X-CGD)을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
    제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 상기 대상체로부터의 줄기 세포 및/또는 전구 세포를 형질도입하는 단계; 및
    상기 대상체 내로 상기 형질도입된 세포 또는 이들로부터 유래된 세포를 이식하는 단계로서, 여기서 상기 세포 또는 이들로부터의 유도체는 상기 Gp91^phox를 발현하는 것인 단계를 포함하는, 방법.
47. 제46항에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포인 것인, 방법.
48. 제46항에 있어서, 상기 세포는 골수로부터 유래된 줄기 세포인 것인, 숙주 세포.
49. 제46항에 있어서, 상기 세포는 인간 조혈 줄기 및 전구 세포인 것인, 방법.
50. 제49항에 있어서, 상기 인간 조혈 전구 세포는 CD34⁺ 세포인 것인, 방법.
51. 하기 중 하나 이상을 암호화하는 재조합 핵산:
    CYBB 프로모터, 또는 이의 유효 단편; 및/또는
    CYBB 내인성 인핸서 요소 2 (CYBB B-세포 인핸서), 또는 이의 유효 단편; 및/또는
    CYBB 내인성 인핸서 4R (CYBB 내인성 골수성 인핸서), 또는 이의 유효 단편; 및/또는
    CYBB 내인성 인핸서 4L, 또는 이의 유효 단편; 및/또는
    CYBB 내인성 골수성 인트론 3 인핸서, 또는 이의 유효 단편; 및/또는
    Gp91^phox를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산.
52. 제51항에 있어서, 상기 핵산은 전장 내인성 CYBB 프로모터 (서열번호 1)를 포함하거나 이로 이루어진 서열을 암호화하는 것인, 핵산.
53. 제51항에 있어서, 상기 핵산은 CYBB 프로모터의 유효 단편을 포함하는 서열을 암호화하고, 여기서 상기 단편은 최소 CYBB 프로모터 (코어) (서열번호 2)를 포함하거나 이로 이루어진 것인, 핵산.
54. 제53항에 있어서, 상기 핵산은 CYBB 프로모터의 유효 단편을 포함하는 서열을 암호화하고, 여기서 상기 단편은 최소 CYBB 프로모터 (코어) (서열번호 2)로 이루어진 것인, 핵산.
55. 제51항에 있어서, 상기 핵산은 CYBB 프로모터의 유효 단편을 포함하는 서열을 암호화하고, 여기서 상기 단편은 최소 CYBB 프로모터 (울트라 코어) (서열번호 3)를 포함하거나 이로 이루어진 것인, 핵산.
56. 제55항에 있어서, 상기 핵산은 CYBB 프로모터의 유효 단편을 포함하는 서열을 암호화하고, 여기서 상기 단편은 최소 CYBB 프로모터 (울트라 코어) (서열번호 3)로 이루어진 것인, 핵산.
57. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 CYBB 내인성 인핸서 요소 2 (CYBB B-세포 인핸서)의 유효 단편을 암호화하는 것인, 핵산.
58. 제57항에 있어서, 상기 CYBB 내인성 인핸서 요소 2의 핵산 서열은 인핸서 요소 2 코어 (서열번호 5)의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 핵산.
59. 제57항에 있어서, 상기 CYBB 내인성 인핸서 요소 2의 핵산 서열은 인핸서 요소 2 울트라 코어 (서열번호 6)의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 핵산.
60. 제51항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 CYBB 내인성 인핸서 4R (CYBB 내인성 골수성 인핸서)의 유효 단편을 포함하는 것인, 핵산.
61. 제60항에 있어서, 상기 CYBB 내인성 인핸서 4R의 유효 단편의 핵산 서열은 인핸서 요소 4R 울트라 코어 (서열번호 10)의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 핵산.
62. 제51항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 인핸서 요소 4L의 유효 단편을 포함하는 것인, 핵산.
63. 제62항에 있어서, 상기 인핸서 요소 4L의 유효 단편은 4L 코어 서열 (서열번호 13)의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 핵산.
64. 제51항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 CYBB 내인성 골수성 인트론 3 인핸서의 유효 단편을 포함하는 것인, 핵산.
65. 제64항에 있어서, 상기 CYBB 내인성 골수성 인트론 3 인핸서의 유효 단편의 핵산 서열은 요소 3 중간 단편 핵산 서열 (서열번호 15)을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 핵산.
66. 제64항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CYBB 내인성 골수성 인트론 3 인핸서의 유효 단편의 핵산 서열은 인트론 인핸서 요소 3 우측 단편 (서열번호 16)을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 핵산.
67. 제51항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 jCAT 코돈 최적화된 CYBB (서열번호 18)를 포함하는 것인, 핵산.
68. 제51항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 발현 카세트를 포함하는 것인, 핵산.
69. 제68항에 있어서, 상기 발현 카세트는 생체내에서 Gp91^phox를 발현하는데 효과적인 것인, 핵산.
70. 제51항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 렌티바이러스 벡터를 포함하는 것인, 핵산.

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