CN114829614A - 治疗x连锁慢性肉芽肿病的造血干细胞中的慢病毒载体 - Google Patents

治疗x连锁慢性肉芽肿病的造血干细胞中的慢病毒载体 Download PDF

Info

Publication number
CN114829614A
CN114829614A CN202080086551.8A CN202080086551A CN114829614A CN 114829614 A CN114829614 A CN 114829614A CN 202080086551 A CN202080086551 A CN 202080086551A CN 114829614 A CN114829614 A CN 114829614A
Authority
CN
China
Prior art keywords
vector
cybb
nucleic acid
seq
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080086551.8A
Other languages
English (en)
Inventor
D·B·科恩
R·L·王
R·P·霍利斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of CN114829614A publication Critical patent/CN114829614A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/03—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with oxygen as acceptor (1.6.3)
    • C12Y106/03001—NAD(P)H oxidase (1.6.3.1), i.e. NOX1

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

在某些实施方案中，提供了用于治疗X连锁慢性肉芽肿病(X‑CGD)的慢病毒载体。在某些实施方案中，所述载体包含表达盒，所述表达盒包含核酸构建体，所述核酸构建体包含CYBB启动子或其有效片段；和与所述CYBB启动子或启动子片段可操作连接的编码gp91phox的核酸。

Description

治疗X连锁慢性肉芽肿病的造血干细胞中的慢病毒载体
相关申请的交叉引用
本申请要求2019/11/12提交的USSN 62/934,352的优先权，出于所有目的将其通过引用完整并入本文。
政府支持声明
[不适用]
通过引用并入作为文本文件形式提供的序列表
以创建于2019年11月11日且大小为46.4kb的文本文件“UCLA-P218P_ST25.txt”随同提供序列表。将所述文本文件的内容通过引用完整并入本文。
背景技术
X连锁慢性肉芽肿病(X-CGD)是由编码吞噬细胞NADPH氧化酶(PHOX)复合物的重要亚基的CYBB基因中的突变引起的原发性免疫缺陷。有缺陷的PHOX复合物导致免疫***的吞噬细胞不能正确消除感染。
患者因此高度易感和罹患复发性危及生命的细菌和真菌感染。在典型的受试者中，免疫***试图隔离感染但无法消除它，导致肉芽肿的特征性形成，可导致那些组织受损。慢性肉芽肿病的特征通常首先出现在童年期，不过一些个体直到晚年才出现症状。
患有慢性肉芽肿病的人通常每3至4年至少有一次严重的细菌或真菌感染。肺部是最常见的感染区域，并且肺炎是这种疾患的共同特征。患有慢性肉芽肿病的个体可能发生一种类型的真菌性肺炎，称为覆盖物肺炎，在暴露于腐烂的有机材料(比如覆盖物、干草或枯叶)之后引起发热和呼吸急促。暴露于这些有机材料和参与其分解的众多真菌引起患有慢性肉芽肿病的人在其肺部中发生真菌感染。患有慢性肉芽肿病的人的其他常见感染区域包括皮肤、肝脏和***。
炎症可发生在患有慢性肉芽肿病的人的身体的许多不同区域。最常见的肉芽肿发生在胃肠道和泌尿生殖道。在许多情况下，肠壁发炎，引起一种形式的炎性肠病，其严重程度各不相同，但会导致胃痛、腹泻、血便、恶心和呕吐。患有慢性肉芽肿病的人的其他常见炎症区域包括胃、结肠和直肠，以及口腔、咽喉和皮肤。另外，胃肠道内的肉芽肿可导致组织分解和脓液产生(脓肿)。胃中的炎症可能阻止食物穿行进入肠道(胃出口阻塞)，导致不能消化食物。这些消化问题引起进食后呕吐和体重减轻。在泌尿生殖道中，在肾脏和膀胱中会发生炎症。产生免疫细胞的***的炎症(***炎)和骨髓中的炎症(骨髓炎)可导致免疫***进一步受损。
患有慢性肉芽肿病的人很少发生自身免疫病症，所述病症在免疫***发生故障并攻击身体的自身组织和器官时出现。
感染和炎症的反复发作降低了患有慢性肉芽肿病的个体的预期寿命。
PHOX复合物由五个不同基因编码的五个不同亚基组成。这些是由CYBB编码的gp91phox、由CYBA编码的p22phox、由NCF1编码的p47phox、由NCF2编码的p67phox和由NCF4编码的p40phox。最常见的突变位于编码gp91phox的CYBB基因中，占所有CGD病例的约56％-70％。这种疾患是X连锁的，并因此主要影响男性。
所述疾病最初被称为“儿童致命性肉芽肿病”，并且未经治疗的患者很少活过他们生命的第一个十年。目前的护理标准利用常规预防性抗细菌和抗真菌疗法，并且产生的平均存活年龄约为30-40岁。这些治疗不提供该疾病的治愈。
一种潜在的治愈性疗法是来自HLA匹配供体的同种异体造血干细胞移植。然而，由于没有适合的匹配供体，这对许多患者来说不是可行的选项。
替代的治愈性疗法是具有离体基因疗法的自体造血干细胞(HSC)移植。在这种方法中，患者充当其自己的供体，从而消除了免疫并发症的风险。采集患者自己的血液HSC，并进行离体遗传工程化以引入感兴趣的基因的功能拷贝，并将基因修饰的细胞重新注入。
先前的基于病毒的疗法利用由脾病灶形成病毒(SFFV)启动子驱动的γ-逆转录病毒载体。这提供了有希望的临床益处。然而，2/2的患者由于***性肿瘤发生而发生脊髓发育不良。目前更安全的SIN慢病毒载体(pChim-CYBB；又名MSP-Gp91phox-WPRE)采用嵌合“骨髓特异性启动子”(MSP)，并且目前临床试验的初步结果指示了临床益处。然而，pChim-CYBB构建体不能概括Gp91phox的表达和调控的野生型水平。因而，例如，与正常健康供体细胞相比，基因疗法后患者的嗜中性粒细胞使Gp91phox表达不足。
发明内容
本文描述了用于治疗X-CGD的新型慢病毒载体(LV)的开发。本文所述的载体显示出比当前慢病毒载体更好(更高)的表达。另外，本文所述的载体具有严格的谱系和阶段特异性表达，其模拟天然CYBB基因的表达模式。这与具有脱靶表达且不能概括天然CYBB基因的谱系特异性表达模式的MSP构建体形成对比。
因此，本文考虑的各种实施方案可以包括但不必限于以下一项或多项：
实施方案1：一种用于治疗慢性肉芽肿病的重组慢病毒载体(LV)，所述载体包含：
包含核酸构建体的表达盒，所述核酸构建体包含：
CYBB启动子或其有效片段；以及
编码与所述CYBB启动子或启动子片段可操作地连接的gp91phox的核酸。
实施方案2：根据实施方案1所述的载体，其中所述CYBB启动子或其有效片段包含全长内源CYBB启动子(SEQ ID NO:1)。
实施方案3：根据实施方案1所述的载体，其中所述CYBB启动子包含CYBB启动子的有效片段，其中所述片段包含最小CYBB启动子(核心)(SEQ ID NO:2)或由其组成。
实施方案4：根据实施方案3所述的载体，其中所述CYBB启动子包含CYBB启动子的有效片段，其中所述片段由最小CYBB启动子(核心)(SEQ ID NO:2)组成。
实施方案5：根据实施方案1所述的载体，其中所述CYBB启动子包含CYBB启动子的有效片段，其中所述片段包含最小CYBB启动子(超核心)(SEQ ID NO:3)或由其组成。
实施方案6：根据实施方案5所述的载体，其中所述CYBB启动子包含CYBB启动子的有效片段，所述有效片段的序列由最小CYBB启动子(超核心)(SEQ ID NO:3)组成。
实施方案7：根据实施方案1-6中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2(SEQ ID NO:4)或其有效片段。
实施方案8：根据实施方案7所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2核心(SEQ ID NO:5)或由其组成。
实施方案9：根据实施方案8所述的载体，其中增强子元件2的所述有效片段的序列由增强子元件2核心的序列(SEQ ID NO:5)组成。
实施方案10：根据实施方案7所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2超核心(SEQ ID NO:6)或由其组成。
实施方案11：根据实施方案10所述的载体，其中增强子元件2的所述有效片段的序列由增强子元件2超核心的序列(SEQ ID NO:6)组成。
实施方案12：根据实施方案1-11中任一项所述的载体，其中所述表达盒进一步包含RELA TF结合位点或其有效片段。
实施方案13：根据实施方案12所述的载体，其中所述RELA TF结合位点包含SEQ IDNO:7的核酸序列或由其组成。
实施方案14：根据实施方案1-11中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4或其有效片段。
实施方案15：根据实施方案14所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4R或其有效片段。
实施方案16：根据实施方案15所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4R的有效片段，其中所述片段的核酸序列包含增强子元件4R核心的核酸序列(SEQ ID NO:10)或由其组成。
实施方案17：根据实施方案15所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4R的有效片段，其中所述片段的核酸序列包含增强子元件4R超核心的核酸序列(SEQ ID NO:11)或由其组成。
实施方案18：根据实施方案16所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4R的有效片段，其中所述片段的核酸序列由增强子元件4R超核心的核酸序列(SEQ ID NO:11)组成。
实施方案19：根据实施方案1-18中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4L或其有效片段。
实施方案20：根据实施方案19所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4L的有效片段，其中所述片段包含4L核心序列(SEQ ID NO:13)或由其组成。
实施方案21：根据实施方案1-20中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含内含子增强子元件3(SEQ ID NO:14)或其有效片段。
实施方案22：根据实施方案21所述的载体，其中所述表达盒包含内含子增强子元件3中间片段，所述中间片段包含SEQ ID NO:15的核酸序列或由其组成。
实施方案23：根据实施方案21-22中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含内含子增强子元件3右片段，所述右片段包含SEQ ID NO:16的核酸序列或由其组成。
实施方案24：根据实施方案1-23中任一项所述的载体，其中编码编码gp91phox的核酸的所述核酸是CYBB cDNA或密码子优化的CYBB。
实施方案25：根据实施方案24所述的载体，其中所述gp91phox编码核酸是CYBBcDNA(SEQ ID NO:17)。
实施方案26：根据实施方案24所述的载体，其中所述gp91phox编码核酸是密码子优化的CYBB。
实施方案27：根据实施方案26所述的载体，其中所述gp91phox编码核酸的序列是密码子优化的CYBB，其选自jCAT密码子优化的CYBB(SEQ ID NO:18)、GeneArt优化的CYBB(SEQID NO:20)、IDT优化的CYBB(SEQ ID NO:21)和先前的临床候选物(SEQ ID NO:19)。
实施方案28：根据实施方案26所述的载体，其中所述gp91phox编码核酸的序列是jCAT密码子优化的CYBB(SEQ ID NO:18)。
实施方案29：根据实施方案1-28中任一项所述的载体，其中所述载体包含ψ区载体基因组包装信号。
实施方案30：根据实施方案1-29中任一项所述的载体，其中所述载体包含包括CMV增强子/启动子的5'LTR。
实施方案31：根据实施方案1-30中任一项所述的载体，其中所述载体包含Rev响应元件(RRE)。
实施方案32：根据实施方案1-31中任一项所述的载体，其中所述载体包含中央多嘌呤束。
实施方案33：根据实施方案1-32中任一项所述的载体，其中所述载体包含翻译后调控元件。
实施方案34：根据实施方案33所述的载体，其中所述转录后调控元件是修饰的土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。
实施方案35：根据实施方案1-34中任一项所述的载体，其中所述载体不能通过重组使野生型慢病毒重构。
实施方案36：根据实施方案1所述的载体，其中所述载体包含图19中所示的全尺寸2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE的特征，其中mCit被替换为Gp91phox编码核酸。
实施方案37：根据实施方案1所述的载体，其中所述载体包含图20的图A中所示的UC 2-4R-Int3-pro-coGp91phox_WRPE的特征。
实施方案38：根据实施方案37所述的载体，其中所述载体包含在图20的图B中表示的载体中所示的特征。
实施方案39：根据实施方案38所述的载体，其中所述载体包含超核心(UC)2-4R-Int3-Pro-(GP91-jcat)-WPRE(SEQ ID NO:22)的核苷酸序列。
实施方案40：根据实施方案1-39中任一项所述的载体，其中所述载体显示在CD33+(大量髓系细胞)中高表达、在CD19+(B细胞)中高表达、在CD66b+CD15+CD11b+CD16+(成熟嗜中性粒细胞)中高表达以及在CD3+T细胞中低表达或无表达。
实施方案41：一种用根据实施方案1-40中任一项所述的载体转导的宿主细胞。
实施方案42：根据实施方案41所述的宿主细胞，其中所述细胞是干细胞。
实施方案43：根据实施方案42所述的宿主细胞，其中所述细胞是来源于骨髓、和/或来自脐带血、和/或来自外周血的干细胞。
实施方案44：根据实施方案41所述的宿主细胞，其中所述细胞是人类造血祖细胞。
实施方案45：根据实施方案44所述的宿主细胞，其中所述人类造血祖细胞是CD34+细胞。
实施方案46：一种治疗受试者中的慢性肉芽肿病(X-CGD)的方法，所述方法包括：
用根据实施方案1-40中任一项所述的载体转导来自所述受试者的干细胞和/或祖细胞；和
将所述转导的细胞或从其来源的细胞移植到所述受试者中，其中所述细胞或从其来源的衍生物表达所述Gp91phox。
实施方案47：根据实施方案46所述的方法，其中所述细胞是干细胞。
实施方案48：根据实施方案46所述的宿主细胞，其中所述细胞来源于骨髓的干细胞。
实施方案49：根据实施方案46所述的方法，其中所述细胞是人类造血干细胞和祖细胞。
实施方案50：根据实施方案49所述的方法，其中所述人类造血祖细胞是CD34+细胞。
实施方案51：一种编码以下一者或多者的重组核酸：
CYBB启动子或其有效片段；和/或
CYBB内源性增强子元件2(CYBB B细胞增强子)或其有效片段；和/或
CYBB内源性增强子4R(CYBB内源性髓样增强子)或其有效片段；和/或
CYBB内源性增强子4L或其有效片段；和/或
CYBB内源性髓样内含子3增强子或其有效片段；和/或
密码子优化的Gp91phox编码核酸。
实施方案52：根据实施方案51所述的核酸，其中所述核酸编码包含全长内源性CYBB启动子(SEQ ID NO:1)或由其组成的序列。
实施方案53：根据实施方案51所述的核酸，其中所述核酸编码包含CYBB启动子的有效片段的序列，其中所述片段包含最小CYBB启动子(核心)(SEQ ID NO:2)或由其组成。
实施方案54：根据实施方案53所述的核酸，其中所述核酸编码包含CYBB启动子的有效片段的序列，其中所述片段由最小CYBB启动子(核心)(SEQ ID NO:2)组成。
实施方案55：根据实施方案51所述的核酸，其中所述核酸编码包含CYBB启动子的有效片段的序列，其中所述片段包含最小CYBB启动子(超核心)(SEQ ID NO:3)或由其组成。
实施方案56：根据实施方案55所述的核酸，其中所述核酸编码包含CYBB启动子的有效片段的序列，其中所述片段由最小CYBB启动子(超核心)(SEQ ID NO:3)组成。
实施方案57：根据实施方案51-56中任一项所述的核酸，其中所述核酸编码CYBB内源性增强子元件2(CYBB B细胞增强子)的有效片段。
实施方案58：根据实施方案57所述的核酸，其中所述CYBB内源性增强子2的核酸序列包含增强子元件2核心的序列(SEQ ID NO:5)或由其组成。
实施方案59：根据实施方案57所述的核酸，其中所述CYBB内源性增强子元件2的核酸序列包含增强子元件2超核心的序列(SEQ ID NO:6)或由其组成。
实施方案60：根据实施方案51-59中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含CYBB内源性增强子4R(CYBB内源性髓样增强子)的有效片段。
实施方案61：根据实施方案60所述的核酸，其中CYBB内源性增强子4R的所述有效片段的核酸序列包含增强子元件4R超核心的序列(SEQ ID NO:10)或由其组成。
实施方案62：根据实施方案51-61中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含增强子元件4L的有效片段。
实施方案63：根据实施方案62所述的核酸，其中增强子元件4L的所述有效片段包含4L核心序列(SEQ ID NO:13)的序列或由其组成。
实施方案64：根据实施方案51-63中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含CYBB内源性髓样内含子3增强子的有效片段。
实施方案65：根据实施方案64所述的核酸，其中CYBB内源性髓样内含子3增强子的所述有效片段的核酸序列包含元件3中间片段核酸序列(SEQ ID NO:15)或由其组成。
实施方案66：根据实施方案64-65中任一项所述的核酸，其中CYBB内源性髓样内含子3增强子的所述有效片段的核酸序列包含内含子增强子元件3右片段(SEQ IDNO:16)或由其组成。
实施方案67：根据实施方案51-66中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含jCAT密码子优化的CYBB(SEQ ID NO:18)。
实施方案68：根据实施方案51-67中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含表达盒。
实施方案69：根据实施方案68所述的核酸，其中所述表达盒有效地在体内表达Gp91phox。
实施方案70：根据实施方案51-69中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含根据实施方案1-40中任一项所述的慢病毒载体。
定义
“启动子”是指核酸中的启动基因(例如，与启动子可操作地联接的基因)的转录所需的调控序列。
“增强子”是指调控性DNA序列，当其被称为转录因子的特定蛋白质结合时，增强相关基因的转录。
当用于启动子时，“有效片段”(例如，CYBB启动子的有效片段)是指全长启动子的片段，其足以启动与该启动子可操作连接的基因的转录。
当用于增强子时，“有效片段”(例如，CYBB增强子的有效片段)是指全长增强子的片段，当被转录因子结合时其足以提供可操作连接的基因的表达调节。在某些实施方案中，所述调节在由全长增强子提供的表达水平和/或谱系方面是可比较的。
术语“可操作连接”是指被置于与另一个核酸序列的功能关系中的核酸序列。例如，当该启动子被置于允许该启动子启动该基因的转录的位置时，所述启动子与所述基因可操作连接。当该增强子在被适当的转录因子结合时能够调节(例如，上调)该基因的表达时，所述增强子与所述基因可操作连接。
“重组”与其在本领域中的用法一致地用于指这样的核酸序列，所述核酸序列包含不作为单个序列的一部分天然一起存在的部分或相对于天然存在的序列已经重排的部分。通过涉及人工的过程产生和/或由通过人工产生的核酸(例如，通过复制、扩增、转录等的一个或多个循环)生成重组核酸。重组病毒是包含重组核酸的病毒。重组细胞是包含重组核酸的细胞。
如本文所用，术语“重组慢病毒载体”或“重组LV”是指人工产生的多核苷酸载体，其由LV和由于人工干预和操作而产生的多个附加区段组装而成。
关于“有效量”，意指相对于未治疗患者改善或消除疾病症状所需的药剂或包含所述药剂的组合物的量。用于实施本文所述的疾病治疗方法的组合物的有效量取决于施用方式、受试者的年龄、体重和一般健康状况而变化。最终，主治医师或兽医将决定适当的量和剂量方案。这样的量被称为“有效”量。
附图说明
图1展示了gp91phox在人血细胞中的内源性表达模式。
图2展示了用于探测增强子活性的构建体。
图3第16天增强子构建体在CB CD34+分化的嗜嗜中性粒细胞中的表达(CD11b+CD66b+CD15+CD16+)。
图4第16天增强子构建体在CB CD34+分化的单核细胞中的表达(CD11b+CD15+)。
图5显示了增强子构建体在转导的RAMO(B细胞系)D14流中的表达。
图6显示了增强子构建体在转导的Jurkat(T细胞系)D16流中的表达。
图7显示了第16天增强子构建体在CB CD34+分化的嗜中性粒细胞中的表达(CD11b+CD66b+CD15+CD16+)。
图8显示了第16天增强子构建体在CB CD34+分化的单核细胞中的表达(CD11b+CD15+)。
图9显示了增强子构建体在转导的Jurkat(T细胞系)D16流中的表达。
图10显示了增强子构建体在转导的RAMO(B细胞系)D14流中的表达。
图11显示了E2-E4R-Int3-pro-mCit-WPRE载体(顶部)和其中mCitrine被Gp91phox编码核酸替换的相同载体(底部)的结构。
图12显示了第16天尺寸减小的载体在CB CD34+分化的嗜中性粒细胞中的表达。
(CD11b+CD66b+CD15+CD16+)
图13显示了第16天尺寸减小的载体在CB CD34+分化的单核细胞中的表达。
(CD11b+CD15+)
图14显示了尺寸减小的载体在Jurkat细胞(T细胞系)中的表达。
图15显示了尺寸减小的载体在RAMOS细胞(B细胞系)中的表达。
图16显示了“核心”、“超核心”、“额外核心”和“额外超核心”构建体的原始小规模滴度。
图17显示了通过在PLB-985 X-CGD-/-细胞中的Gp91phox的各种密码子优化产生的表达水平。
图18显示了MSP-Gp91phox-WPRE的各种密码子优化的原始滴度。
图19展示了用于治疗X-CGD的慢病毒载体的一个实施方案。为了用于治疗，mCit报道分子将被替换为编码Gp91phox的核酸序列，例如，如本文所述。
图20的图A-B展示了用于治疗X-CGD的优化的慢病毒载体的一个实施方案。图A示意性地展示了UC 2-4R-Int3-pro-coGp91phox-WRPE的元件。图B显示了载体的“图谱”。
图21展示了随着载体从原始2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE优化为核心变体和超核心(UC)变体在滴度(上图)和感染性(下图)方面的提高。UC变体(MyeloVec是主要候选载体)。
图22的图A-B显示，MyeloVec能够概括天然CYBB基因分别在血细胞(图A)和骨髓细胞(图B)中的内源性表达模式。
图23显示，MyeloVec能够概括天然CYBB基因在整个嗜中性粒细胞发育过程中的时间表达模式。随着嗜中性粒细胞的成熟，表达变得更高，模仿天然CYBB基因的模式。
图24显示了Gp91phox表达的恢复。
图25显示了氧化酶活性到野生型水平的恢复。
图26显示了在外周血中的嗜中性粒细胞和单核细胞中Gp91phox表达的恢复。
图27显示了在血液嗜中性粒细胞和单核细胞中氧化酶活性接近野生型水平的恢复。
图28显示了高水平的Gp91phox表达在骨髓嗜中性粒细胞和单核细胞中的恢复。
图29显示了氧化酶活性的野生型水平的恢复。
图30显示了MyeloVec恢复人X-CGD嗜中性粒细胞中Gp91phox表达的野生型水平的能力。
图31显示了MyeloVec恢复人X-CGD嗜中性粒细胞中的细胞氧化酶活性的野生型水平的能力(DHR测定法)。
图32显示了MyeloVec在平均VCN为1.63时恢复人X-CGD嗜中性粒细胞中的大量氧化酶活性的野生型水平的能力(细胞色素C测定法)。
具体实施方式
在各种实施方案中，提供了用于治疗(或预防)X连锁慢性肉芽肿病(X-CGD)的慢病毒载体。在某些实施方案中，优化载体以减小载体大小、提高表达水平和滴度。另外，在各种实施方案中，所述载体概括了天然CYBB基因的谱系特异性表达模式，例如，如本文所述(参见，例如，图1)。
如本文所述(参见，例如，实施例1)，基于组蛋白标记、DNA酶超敏反应位点和结合转录因子的序列基序，关于产生吞噬细胞抗微生物氧化酶***的gp91phox组分的CYBB基因的生物信息学信息分析鉴定了几个推定的转录调控结构域。
在天然CYBB拓扑相关结构域(TAD)中鉴定了十五个推定的内源性增强子元件。为了通过实验鉴定调节CYBB基因的关键增强子元件，将每个推定的增强子元件克隆到内源性CYBB启动子的上游以驱动报告基因(mCitrine)的表达(参见，例如，图2)。为了阐明每个假定的增强子元件的功能，我们测定了每种载体在脐带血(CB)CD34+分化的成熟嗜中性粒细胞和单核细胞以及RAMOS细胞(B淋巴细胞细胞系)中的活性，这些细胞是3个中靶的细胞谱系。
发现增强子元件4在成熟嗜中性粒细胞和单核细胞中驱动高水平表达，而在B细胞中无表达。还发现增强子元件2在B细胞中驱动高水平的谱系特异性表达，而在嗜中性粒细胞中无表达。在Jurkat(T细胞)中没有任何增强子元件表达，表明每个增强子元件的谱系特异性表达。
还发现增强子元件4由两个不同的增强子模块(4L和4R)组成，并且对它们进行评价以确定是否可以消除这些元件之一以减小载体的大小。
另外，制备并评价了增强子元件2、增强子元件4、内含子增强子3和CYBB内源启动子的减小的变体。还评价了Gp91phox编码核酸的密码子优化。
鉴于这些发现，在各种实施方案中，提供了用于治疗慢性肉芽肿病的重组慢病毒载体(LV)，其中所述载体包含包括核酸构建体的表达盒，所述核酸构建体包含CYBB内源性启动子或其有效片段；和与所述CYBB启动子或启动子片段可操作连接的gp91phox编码核酸。在某些实施方案中，CYBB启动子或其有效片段包含全长内源性CYBB启动子(参见，例如，表1，SEQ ID NO:1)。在某些实施方案中，CYBB启动子包含CYBB启动子的有效片段，其中所述片段包含最小CYBB启动子或由其组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:3)。在某些实施方案中，CYBB启动子由CYBB启动子的有效片段组成，其序列由最小CYBB启动子组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:3)。
在某些实施方案中，慢病毒载体中的表达盒包含增强子元件2(参见，例如，表1，SEQ ID NO:4)或其有效片段。在某些实施方案中，增强子元件2的有效片段的序列包含增强子元件2“核心”的序列或由其组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:5)。在某些实施方案中，增强子元件2的有效片段的序列由增强子元件2核心的序列组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:5)。在某些实施方案中，增强子元件2的有效片段的序列包含增强子元件2“超核心”或由其组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:6)。在某些实施方案中，增强子元件2的所述有效片段的序列由增强子元件2超核心的序列组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:6)。
在某些实施方案中，包含慢病毒载体的表达盒进一步包含RELA TF结合位点或其有效片段。在某些实施方案中，RELA TF结合位点包含表1中的SEQ ID NO:7的核酸序列或由其组成。
在某些实施方案中，慢病毒载体中的表达盒包含增强子元件4(参见，例如，表1，SEQ ID NO:8)或其有效片段。在某些实施方案中，所述表达盒包含增强子元件4R(参见，例如，表1，SEQ ID NO:9)或其有效片段。在某些实施方案中，所述表达盒包含增强子元件4R的有效片段，其中所述核酸序列包含增强子元件4R核心的核酸序列或由其组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:10)。在某些实施方案中，所述表达盒包含增强子元件4R的有效片段，其中所述片段的核酸序列包含增强子元件4R“超核心”的核酸序列或由其组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:11)。在某些实施方案中，所述表达盒包含增强子元件4R的有效片段，其中所述片段的核酸序列由增强子元件4R超核心的核酸序列组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:11)。
在某些实施方案中，慢病毒载体中的表达盒包含增强子元件4L(参见，例如，表1，SEQ ID NO:12)或其有效片段。在某些实施方案中，增强子元件4L的有效片段包含4L核心序列的序列或由其组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:13)。在某些实施方案中，增强子元件4L的有效片段由4L核心序列的序列组成(参见，例如，表1，SEQ ID NO:13)。
在某些实施方案中，慢病毒载体中的表达盒包含内含子增强子元件3(参见，例如，表1，SEQ ID NO:14)或其有效片段。在某些实施方案中，慢病毒载体中的表达盒包含内含子增强子元件3中间片段或由其组成，所述中间片段包含表1中的SEQ ID NO:15的核酸序列或由其组成。在某些实施方案中，慢病毒载体中的表达盒由内含子增强子元件3中间片段组成，所述中间片段包含表1中的SEQ ID NO:15的核酸序列或由其组成。在某些实施方案中，慢病毒载体中的表达盒包含内含子增强子元件3右片段或由其组成，所述右片段包含表1中的SEQ ID NO:16的核酸序列或由其组成。
在某些实施方案中，gp91phox编码核酸是全CYBB基因、CYBB cDNA或密码子优化的CYBB。在某些实施方案中，gp91phox编码核酸是CYBB cDNA(参见，例如，表1，SEQ ID NO:17)。在某些实施方案中，gp91phox编码核酸是密码子优化的CYBB(例如，jCAT密码子优化的CYBB(参见，例如，表1，SEQ ID NO:18)、GeneArt优化的CYBB(参见，例如，表1，SEQ ID NO:20)、IDT优化的CYBB(参见，例如，表1、SEQ ID NO:21)和先前的临床候选物(参见，例如，表1，SEQID NO:19))。在某些实施方案中，所述gp91phox编码核酸的序列是jCAT密码子优化的CYBB(参见，例如，表1，SEQ ID NO:18)。
将认识到的是，在慢病毒载体的上下文中，本文所述的表达盒不必限于此上下文。因此，在某些实施方案中，考虑了包含本文所述的任何一种或多种CYBB调控元件的重组核酸。在某些实施方案中，重组核酸包含表达盒，例如在体内有效表达Gp91phox的表达盒。将认识到的是，这样的表达盒可以与其他构建体一起使用，例如，与CRISPR构建体结合使用。
表1.如本文所述用于治疗X-CGD的慢病毒载体的各种组分的核酸序列.
Figure BDA0003692844870000141
Figure BDA0003692844870000151
Figure BDA0003692844870000161
Figure BDA0003692844870000171
Figure BDA0003692844870000181
Figure BDA0003692844870000191
Figure BDA0003692844870000201
Figure BDA0003692844870000211
Figure BDA0003692844870000221
Figure BDA0003692844870000231
Figure BDA0003692844870000241
在各种实施方案中，本文所述的慢病毒载体(LV)可以具有各种“安全”特征，例如可以包括隔离子(例如，3'LTR中的FB隔离子)的存在。另外地或可替代地，在某些实施方案中，HIV LTR已被选择性启动子(例如CMV)取代，以产生更高滴度的载体，其在包装过程中不包含HIV TAT蛋白。其他强启动子(例如，RSV等也可以使用)。
在各种实施方案中，本文所述的慢病毒载体含有任何一种或多种通常发现于慢病毒载体中的元件。这样的元件包括但不必限于Ψ区载体基因组包装信号、Rev响应元件(RRE)、多嘌呤束(例如，中央多嘌呤束、3'多嘌呤束等)、翻译后调控元件(例如，修饰的土拨鼠转录后调控元件(WPRE))、隔离子等，例如，如下所述。
在各种实施方案中，所述载体是基本上不能通过重组使野生型慢病毒重构的SIN载体。
在某些实施方案中，所述载体包含在图20的图A中所示的“超核心”(UC)2-4R-Int3-Pro-(GP91-jcat)-WPRE的特征。在某些实施方案中，所述载体包含在图20的图B中表示的载体中所示的特征。在某些实施方案中，所述载体包含超核心(UC)2-4R-Int3-Pro-(GP91-jcat)-WPRE(SEQ ID NO:22)。
在各种实施方案中，所述载体显示在CD33+(大量髓系细胞)中高表达、和/或在CD19+(B细胞)中高表达、在CD66b+CD15+CD11b+CD16+(成熟嗜中性粒细胞)中高表达和/或在CD3+(T细胞)中低表达或无表达。在各种实施方案中，所述载体显示在CD33+(大量髓系细胞)中高表达、在CD19+(B细胞)中高表达、在CD66b+CD15+CD11b+CD16+(成熟嗜中性粒细胞)中高表达以及在CD3+T细胞中低表达或无表达。
如上所示，在实施例1中，本文所述的载体有效地以高滴度转导细胞并且还提供Gp91phox的高水平表达。
鉴于这些结果，人们认为本文所述的LV，例如，表达Gp91phox编码核酸的重组TAT非依赖性SIN LV可用于有效治疗在受试者(例如，人类和非人类哺乳动物)中的X连锁慢性肉芽肿病(X-CGD)。人们认为这些载体可用于修饰干细胞(例如，造血干细胞和祖细胞)，可以将所述干细胞引入到有需要的受试者中以治疗例如被鉴定为患有X-CGD的受试者。而且，人们认为，生成的细胞将产生足够的转基因Gp91phox蛋白，以证明受试者健康的显著改善。人们还认为可以将所述载体直接施用于受试者，以实现靶标(例如，造血干细胞或祖细胞)的体内转导，从而也实现对有需要的受试者的治疗。
如上所述，在各种实施方案中，本文所述的LV可以包含各种安全特征。例如，HIVLTR已被CMV启动子取代，以产生更高滴度的载体，其在包装过程中不包含HIV TAT蛋白。在某些实施方案中，为了安全起见，可以将隔离子(例如，FB隔离子)引入到3'LTR中。还将LV构建为提供有效的转导和高滴度。
应当理解的是，前述元件是说明性的并且不必是限制性的。鉴于本文提供的教导，这些元件的适当取代将被本领域技术人员认识到并且被视为在本文提供的教导的范围内。
Gp91phox密码子优化
如上所述，在各种实施方案中，慢病毒载体可以包含CYBB基因或cDNA。然而，在某些实施方案中，Gp91phox编码核酸是密码子优化的。许多密码子优化方法是本领域技术人员已知的。一种说明性方法是JCat(Java Codon Adaptation Tool)。jCAT工具使基因密码子使用适应大多数已测序的原核生物和各种真核基因表达宿主。与许多工具相比，JCat不需要手动定义高表达基因，因此是一种非常快速和容易的方法。JCat用于密码子适应的其他选项包括避免限制酶和Rho非依赖性转录终止子的不需要的切割位点。JCat的输出为针对输入序列和新适应的序列给出的图形方式并且是密码子适应指数(CAI)值。JCat优化由Grote等人描述于(2005)Nucleic Acids Res.33(增刊2):W526–W531)，并且JCat工具可在www.jcat.de在线获得。
另一种密码子优化工具由GeneArt(来自ThermoFisher
Figure BDA0003692844870000261
)提供。
又另一个密码子优化工具是IDT。开发IDT密码子优化工具来优化来自一种生物的DNA或蛋白质序列，以便在另一种生物中表达，这是通过基于每个密码子在所述新的生物中的使用频率重新分配密码子使用来实现的。例如，缬氨酸由4种不同的密码子(GUG、GUU、GUC和GUA)编码。然而，在人类细胞系中，优先使用GUG密码子(分别为46％使用与18％、24％和12％)。所述密码子优化工具将此信息考虑进去，并分配具有相同频率的缬氨酸密码子。另外，所述工具算法消除了频率低于10％的密码子，并将剩余频率重新归一化为100％。而且，所述优化工具降低了可能干扰制造和下游表达的复杂性，比如重复、发夹和极高GC含量。IDT优化工具可从IDT(整合DNA技术公司，Integrated DNA Technologies)(爱荷华州克拉威尔)获得，并可在ww.idtdna.com/CodonOpt找到。
其他密码子优化工具包括但不限于可在codonw.sourceforge.net找到的开源软件程序CodonW和来自GenScript的OptimumGeneTM算法。
在实施例1中说明的一个实施方案中，密码子优化的Gp91phox可以是在当前临床候选物MSP-Gp91phox-WPRE中使用的序列。
这些密码子优化是说明性的而非限制性的。使用此处和实施例1中提供的教导，可以容易地针对特定应用优化Gp91phox密码子使用。
TAT非依赖性和自灭活慢病毒载体
为了进一步提高安全性，在各种实施方案中，本文所述的慢病毒载体包含TAT非依赖性自失活(SIN)构型。因而，在各种实施方案中，希望在本文所述的LV中采用相对于野生型LTR具有降低的启动子活性的LTR区域。可以提供这样的构建体，其为有效“自灭活”(SIN)的，以提供生物安全特征。SIN载体是其中在转导细胞中全长载体RNA的产生大大减少或完全消除的载体。这个特征使出现具有复制能力的重组体(RCR)的风险最大限度地降低。此外，它使位于载体整合位点附近的细胞编码序列异常表达的风险降低。
此外，SIN设计使在LTR和驱动所述转基因表达的启动子之间的干扰的可能性降低。SIN LV通常可允许内部启动子的全活性。
SIN设计使LV的生物安全性提高。大多数HIV LTR由U3序列组成。U3区含有增强子和启动子元件，它们调节HIV基因组在感染细胞中的基础和诱导表达并且对细胞活化作出响应。这些启动子元件中有几个对于病毒复制是至关重要的。一些增强子元件在病毒分离物中高度保守，并被认为是病毒发病机制中的关键毒力因子。所述增强子元件可起作用而影响病毒在不同细胞靶标中的复制率
由于病毒转录开始于5'LTR的U3区的3'端，因此这些序列不是病毒mRNA的一部分，并且其来自3'LTR的拷贝用作用于生成在整合的原病毒中的两种LTR的模板。如果在逆转录病毒载体构建体中改变了U3区的3'拷贝，则所述载体RNA仍由生产细胞中的完整5'LTR产生，但不能在靶细胞中再生。转导这种载体导致子代病毒中两个LTR的失活。因此，逆转录病毒是自灭活(SIN)的，这些载体被称为SIN转移载体。
在某些实施方案中，通过在载体DNA(即，用于产生载体RNA的DNA)的3'LTR的U3区中引入缺失来实现自灭活。在RT期间，这种缺失被转移至原病毒DNA的5'LTR。通常，希望消除足够多的U3序列以大大减少或完全消除LTR的转录活性，从而大大减少或消除转导细胞中全长载体RNA的产生。然而，通常希望保留那些涉及病毒RNA多腺苷酸化的LTR元件，其为通常分布在U3、R和U5上的功能。因此，在某些实施方案中，希望从LTR消除尽可能多的转录重要基序，同时保留多腺苷酸化决定簇。
SIN设计详细描述于Zufferey等人(1998)J Virol.72(12):9873-9880，以及美国专利号5,994,136。然而，如其中所述，在3'LTR处的缺失程度有限制。首先，U3区的5'端在载体转移中发挥着另一个重要功能，对于整合是必需的(末端二核苷酸+att序列)。因而，末端二核苷酸和att序列可代表可以缺失的U3序列的5'边界。另外，一些松散定义的区域可以影响R区域中的下游多腺苷酸化位点的活性。从3'LTR过度删除U3序列可以降低载体转录物的多腺苷酸化，对生产细胞中载体的滴度和靶细胞中的转基因表达两者都具有不利影响。
在美国专利公开号2003/0039636中描述了另外的SIN设计。如其中所述，在某些实施方案中，从LTR去除的慢病毒序列被替换为来自非慢病毒逆转录病毒的可比较序列，从而形成杂合LTR。具体而言，LTR内的慢病毒R区可以全部或部分被来自非慢病毒逆转录病毒的R区替代。在某些实施方案中，优选地将慢病毒TAR序列(一种与TAT蛋白相互作用以增强病毒复制的序列)从R区全部去除。然后用来自非慢病毒逆转录病毒的R区的可比较部分替换TAR序列，从而形成杂合R区。可以进一步修饰LTR以去除慢病毒U3和U5区的全部或部分和/或用非慢病毒序列进行替换。
因此，在某些实施方案中，SIN构型提供包含缺乏其TAR序列的全部或部分的杂合慢病毒R区的逆转录病毒LTR，从而消除TAT的任何可能激活，其中所述TAR序列或其部分被替换为来自非慢病毒逆转录病毒的R区的可比较部分，从而形成杂合R区。在具体实施方案中，逆转录病毒LTR包含杂合R区，其中所述杂合R区包含缺乏TAR序列的HIV R区的一部分(例如，包含US 2003/0039636中的SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列或由其组成的部分)，以及与HIV R区中缺乏的与TAR序列可比较的MoMSV R区的一部分(例如，包含2003/0039636中的SEQ ID NO:9中所示的核苷酸序列或由其组成的部分)。在另一个具体实施方案中，整个杂合R区包含2003/0039636中的SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列或由其组成。
R区从其可衍生的适合的慢病毒包括例如HIV(HIV-1和HIV-2)、EIV、SIV和FIV。非慢病毒序列可以从其衍生的适合的逆转录病毒包括例如MoMSV、MoMLV、Friend、MSCV、RSV和泡沫病毒(Spumavirus)。在一个说明性实施方案中，所述慢病毒是HIV，并且所述非慢病毒逆转录病毒是MoMSV。
在US 2003/0039636中描述的另一个实施方案中，包含杂合R区的LTR是左(5')LTR并且进一步包含杂合R区上游的启动子序列。优选启动子是非慢病毒来源的并且包括例如来自非慢病毒逆转录病毒的U3区(例如MoMSV U3区)。在一个具体实施方案中，所述U3区包含US 2003/0039636中的SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，左(5')LTR进一步包含杂合R区下游的慢病毒U5区。在一个实施方案中，U5区是包括基因组整合必需的HIV att位点的HIV U5区。在另一个实施方案中，所述U5区包含US 2003/0039636中的SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。在又另一个实施方案中，所述整个左(5')杂合LTR包含US2003/0039636中的SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
在另一个说明性实施方案中，包含杂合R区的LTR是右(3')LTR并且进一步包含杂合R区上游的修饰的(例如，截短的)慢病毒U3区。修饰的慢病毒U3区可以包括att序列，但缺乏任何具有启动子活性的序列，从而引起载体为SIN，因为病毒转录不能超过染色体整合后的第一轮复制。在具体实施方案中，杂合R区上游的修饰的慢病毒U3区由慢病毒(例如，HIV)U3区的3'端组成，直到并包括慢病毒U3 att位点。在一个实施方案中，所述U3区包含US2003/0039636中的SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，右(3')LTR进一步包含杂合R区下游的多腺苷酸化序列。在另一个实施方案中，所述多腺苷酸化序列包含US2003/0039636中的SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。在又另一个实施方案中，所述整个右(5')LTR包含US 2003/0039636中的SEQ ID NO:2或17所示的核苷酸序列。
因而，在基于HIV的LV的情况下，已发现这样的载体耐受显著的U3缺失，包括去除LTR TATA框(例如，从-418到-18的缺失)，而没有显著降低载体滴度。这些缺失使LTR区基本上没有转录活性，因为LTR的转录能力降低到约90％或更低。
还已经证明，如果转移载体构建体中的上游LTR的一部分被组成型活性启动子序列替换，则Tat的反式作用功能变得可有可无(参见，例如，Dull等人(1998)J Virol.72(11):8463–8471。此外，我们表明，rev以反式表达允许从仅含gag和pol的包装构建体生产高滴度的HIV衍生的载体原种。这种设计使包装功能的表达以仅在生产细胞中可用的互补为条件。生成的基因递送***仅保留了HIV-1的九个基因中的三个，并依赖于四个独立的转录单位来生产转导颗粒。
在实施例1中展示的一个实施方案中，表达gp91phox编码核酸的盒为SIN载体，其中CMV增强子/启动子在5'LTR中被取代。
将认识到的是，CMV启动子通常提供高水平的非组织特异性表达。其他具有相似组成活性的启动子包括但不限于RSV启动子和SV40启动子。也可以使用哺乳动物启动子，比如β-肌动蛋白启动子、泛素C启动子、延伸因子1α启动子、微管蛋白启动子等。
前述SIN构型是说明性的而非限制性的。许多SIN构型对于本领域技术人员是已知的。如上所述，在某些实施方案中，LTR转录降低了约95％至约99％。在某些实施方案中，可以使LTR失去至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的转录活性。
隔离子元件
在某些实施方案中，为了进一步增强生物安全性，将隔离子***到本文所述的慢病毒载体中。隔离子是存在于整个基因组的DNA序列元件。它们结合修饰染色质并改变区域基因表达的蛋白质。在本文所述的载体中放置隔离子提供了各种潜在的好处，包括，除其他外：1)保护载体免于侧翼染色体表达的位置效应变异(即，屏障活性)；和2)保护侧翼染色体免于通过载体对基因表达的***反式激活(增强子阻断)。因而，隔离子可以帮助保持嵌入基因组或遗传背景中的基因或转录单位的独立功能，其中它们的表达可能另外受到基因组或遗传背景中的调节信号的影响(参见，例如，Burgess-Beusse等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:16433；和Zhan等人(2001)Hum.Genet.,109:471)。在本上下文中，隔离子可以有助于保护慢病毒表达的序列免受整合位点影响，这可由基因组DNA中存在的顺式作用元件介导，并导致转移序列的表达失调。在各种实施方案中，提供了LV，其中将隔离子序列***到一个或两个LTR中或整合到细胞基因组中的载体区域中的别处。
第一个和最佳表征的脊椎动物染色质隔离子位于鸡β-珠蛋白基因座控制区内。这个元件含有DNA酶I超敏感位点4(cHS4)，似乎构成了鸡β-珠蛋白基因座的5'边界(Prioleau等人(1999)EMBO J.18:4035-4048)。含有cHS4元件的1.2-kb片段显示出经典的隔离子活性，包括阻断细胞系中的珠蛋白基因启动子和增强子相互作用的能力(Chung等人(1993)Cell,74:505-514)，以及保护在果蝇(Id.)、转化细胞系(Pikaart等人(1998)GenesDev.12:2852-2862)和转基因哺乳动物(Wang等人(1997)Nat.Biotechnol.,15:239-243；Taboit-Dameron等人(1999)Transgenic Res.,8:223-235)中的表达盒免受位置效应影响的能力。这种活性的大部分包含在一个250-bp片段中。在这一段中是一个49-bp的cHS4核心(Chung等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,94:575-580)，它与增强子阻断测定法中涉及的锌指DNA结合蛋白CTCF相互作用(Bell等人(1999)Cell,98:387-396)。
一种说明性的和适合的隔离子是FB(FII/BEAD-A)，为一种77bp的隔离子元件，其含有鸡β-珠蛋白5’HS4隔离子的最小CTCF结合位点增强子阻断组分和来自人T细胞受体α/δ阻断元件α/δI(BEAD-I)隔离子的同源区，如由Ramezani等人在(2008)Stem Cell 26:3257-3266中描述。FB“合成”隔离子具有完全的增强子阻断活性。此隔离子是说明性的而非限制性的。可以使用其他适合的隔离子，包括例如全长鸡β-珠蛋白HS4或其隔离子亚片段、锚蛋白基因隔离子和其他合成隔离子元件。
包装信号
在各种实施方案中，本文所述的载体进一步包含包装信号。“包装信号”、“包装序列”或“PSI序列”是足以指导其序列包含包装信号的核酸包装到逆转录病毒颗粒中的任何核酸序列。所述术语包括天然存在的包装序列，还有其工程化变体。包括慢病毒在内的许多不同的逆转录病毒的包装信号是本领域已知的。SEQ ID NO:25提供了一种说明性的而非限制性的PSI。
Rev响应元件(RRE)
在某些实施方案中，本文所述的慢病毒载体包含Rev响应元件(RRE)以增强未剪接RNA的核输出。RRE是本领域技术人员熟知的。说明性RRE包括但不限于位于HIV NL4-3基因组(Genbank登录号AF003887)中第7622-8459位的RRE，比如，以及来自其他HIV毒株或其他逆转录病毒的RRE。这样的序列可容易地从Genbank或URLhiv-web.lanl.gov/content/index的数据库获得。一个说明性而非限制性的RRE显示在SEQ ID NO:26中。
多嘌呤束(cPPT,3'PPT)
在各种实施方案中，本文所述的慢病毒载体进一步包括多嘌呤束(例如，中央多嘌呤束(cPPT)、3'多嘌呤束(3'PPT))。已知在慢病毒(例如，HIV-1)载体构建体中***含有3'PPT(参见，例如，SEQ ID NO:28)或中央多嘌呤束(cPPT)的片段提高了转导效率。
刺激表达的转录后调控元件(PRE)
在某些实施方案中，本文所述的慢病毒载体(LV)可包含多种转录后调控元件(PRE)中的任一种，其在转录物中的存在增加了异源核酸(例如，gp91phox)在蛋白质水平上的表达。PRE在某些实施方案中可能特别有用，尤其是那些涉及具有适度启动子的慢病毒构建体的实施方案。
一种类型的PRE是位于表达盒内的内含子，其可以刺激基因表达。然而，内含子可以在慢病毒的生命周期事件期间被剪接。因此，如果将内含子用作PRE，通常将它们以与载体基因组转录物相反的方向放置。
不依赖剪接事件的转录后调控元件提供了在病毒生命周期中不被去除的优势。一些实例是单纯疱疹病毒的转录后加工元件、乙型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE)和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。在这些元件中，WPRE通常是优选的，因为它含有在HPRE中未见的另外的顺式作用元件。这个调控元件通常位于载体内以便被包含在转基因的RNA转录物中，但在转基因翻译单元的终止密码子之外。
WPRE在美国专利第6,136,597号中被表征和描述。如其中所述，WPRE是介导RNA从细胞核到细胞质的有效转运的RNA输出元件。它通过***顺式作用核酸序列来增强转基因的表达，从而使元件和转基因包含在单个转录物中。显示有义方向的WPRE的存在使转基因表达增加多达7到10倍。逆转录病毒载体以cDNA的形式转移序列，而不是完整的含有内含子的基因，因为内含子通常在导致逆转录病毒颗粒形成的一些列事件的过程中被剪接。内含子介导初级转录物与剪接机制的相互作用。因为通过剪接机制加工RNA促进了它们的细胞质输出，由于剪接和转运机制之间的耦合，cDNA通常以低效率表达。因而，将WPRE(参见，例如，SEQ ID NO:27)包含在载体中导致转基因表达增强。
转导的宿主细胞和细胞转导方法
本文所述的重组慢病毒载体(LV)和生成的病毒能够将异源核酸序列(例如，gp91phox编码核酸)转移到哺乳动物细胞中。在各种实施方案中，为了递送至细胞，本文所述的载体优选地与适合的包装细胞系结合使用或在体外与含有必需的逆转录病毒基因(例如，gag和pol)的其他载体质粒一起共转染到细胞中以形成能够包装本发明的载体并感染细胞的无复制能力的病毒粒子。
在某些实施方案中，经由转染将载体引入到包装细胞系中。所述包装细胞系产生含有载体基因组的病毒颗粒。转染方法是本领域技术人员熟知的。在将包装载体和转移载体共转染到包装细胞系后，从培养基中回收重组病毒并通过本领域技术人员使用的标准方法进行滴定。因而，可以通过磷酸钙转染、脂转染或电穿孔将所述包装构建体引入人细胞系中，通常与诸如新霉素、DHFR、谷氨酰胺合成酶之类的显性选择标记一起使用或不用所述显性选择标记，随后在存在适当药物的情况下进行选择，然后分离克隆。在某些实施方案中，所述选择标记基因可以与构建体中的包装基因物理连接。
其中包装功能被配置为由适合的包装细胞表达的稳定细胞系是已知的(参见，例如，描述包装细胞的美国专利第5,686,279号)。一般而言，对于病毒颗粒的生产，人们可以使用与慢病毒Gag和Pol基因的表达相容的任何细胞，或者可以工程改造任何细胞来支持这样的表达。例如，可以使用诸如293T细胞和HT1080细胞等生产细胞。
具有掺入其中的慢病毒载体的包装细胞形成生产细胞。因而，生产细胞是可以产生或释放携带感兴趣的治疗基因(例如，Gp91phox)的包装的感染性病毒颗粒的细胞或细胞系。这些细胞可以进一步依赖于锚定，这意味着当附着于诸如玻璃或塑料的表面时，这些细胞将最佳地生长、存活或维持功能。当载体具有复制能力时，用作慢病毒载体包装细胞系的锚定依赖性细胞系的一些实例是HeLa或293细胞和PERC.6细胞。
因此，在某些实施方案中，提供了将基因递送至细胞的方法，然后将其整合到细胞的基因组中，所述方法包括使所述细胞与含有本文所述的慢病毒载体的病毒粒子接触。可以使细胞(例如，呈组织或器官的形式)与病毒粒子离体接触(例如，感染)，然后将其递送至其中将表达所述基因(例如，gp91phox编码核酸)的受试者(例如，哺乳动物、动物或人)。在各种实施方案中，所述细胞可以是受试者自体的(即，来自受试者)或它可以是受试者非自体的(即，同种异体的或异种的)。而且，因为本文所述的载体能够被递送至***细胞和非***细胞两者，所述细胞可以来自多种细胞，包括例如骨髓细胞、间充质干细胞(例如，从脂肪组织获得)，以及其他来源于人和动物来源的原代细胞。可替代地，可以直接地将病毒粒子体内施用于受试者或受试者的局部区域(例如，骨髓)。
在某些实施方案中，本文所述的慢病毒载体在从骨髓、外周血或脐带血中获得的人造血祖细胞或造血干细胞的转导中以及在CD4+T细胞、外周血B或T淋巴细胞等的转导中将特别有用。在某些实施方案中，特别优选的靶标是CD34+造血干细胞和祖细胞。
基因疗法
仍然在其他实施方案中，提供了用于转导人类造血干细胞的方法。在某些实施方案中，所述方法涉及使包括造血干细胞的人细胞群与前述慢载体之一在通过所述载体实现所述群中的人造血祖细胞转导的条件下接触。可以体内或体外转导所述干细胞，具体取决于最终应用。即使在人基因疗法的背景下，比如人干细胞的基因疗法，人们也可以体内转导干细胞，或者体外转导，然后将转导的干细胞输注到人类受试者中。在这个实施方案的一个方面，可以使用本领域技术人员熟知的方法从人例如X-CGD患者移出人干细胞，并如上所述进行转导。然后将转导的干细胞重新引入到相同或不同的人的体内。
干细胞/祖细胞基因疗法
在各种实施方案中，本文所述的慢病毒载体对于从骨髓、外周血或脐带血中获得的人造血祖细胞或造血干细胞(HSC)的转导以及在CD4+T细胞、外周血B或T淋巴细胞等的转导是特别有用的。在某些实施方案中，特别优选的靶标是CD34+造血干细胞和祖细胞。
当离体转导细胞，例如CD34+细胞、树突细胞、外周血细胞或肿瘤细胞时，使用通常在1至50个感染复数(MOI)之间级别的剂量将载体颗粒与所述细胞一起孵育，所述感染复数也对应于每105个细胞1×105至50×105个转导单位的病毒载体。这可以包括对应于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45和50个MOI的载体量。通常，载体量可以用HT-29转导单位(TU)表示。
在某些实施方案中，基于细胞的疗法涉及提供干细胞和/或造血前体，用编码例如Gp91phox的慢病毒转导所述细胞，然后将转化的细胞引入有需要的受试者(例如，具有CYBB基因突变的受试者)中。
在某些实施方案中，所述方法涉及从受试者分离细胞群，例如干细胞，任选地在组织培养物中扩增细胞，并施用慢病毒载体，所述慢病毒载体在细胞内的存在导致在所述细胞中体外产生Gp91phox。然后将细胞返回给所述受试者，例如，它们可以提供产生Gp91phox的吞噬细胞群。
在一些说明性而非限制性的实施方案中，可以使用细胞群，其可以是来自细胞系或来自除受试者之外的个体的细胞。从受试者分离干细胞、免疫***细胞等并将它们返回给受试者的方法是本领域熟知的。这样的方法用于，例如，在经历化学疗法的患者中的骨髓移植、外周血干细胞移植等。
在使用干细胞的情况下，将认识到的是，这样的细胞可以衍生自多种来源，包括骨髓(BM)、脐带血(CB)、动员的外周血干细胞(mPBSC)等。在某些实施方案中，考虑使用诱导的多能干细胞(IPSC)。分离造血干细胞(HSC)、转导这样的细胞并将它们引入到哺乳动物受试者中的方法是本领域技术人员熟知的。
在某些实施方案中，通过将Gp91phox编码核酸引入到患有X-CGD的患者的骨髓干细胞中，随后进行自体移植，从而将本文所述的慢病毒载体(参见，例如，图19)用于X-CDG的干细胞基因疗法中。
直接引入载体
在某些实施方案中，考虑通过直接引入本文描述的载体直接治疗受试者。可将慢病毒组合物配制成通过任何可用途径递送，包括但不限于，肠胃外(例如，静脉内)、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、透皮(局部)、经粘膜、经直肠和经***。常用的递送途径包括吸入、肠胃外和经粘膜。
在各种实施方案中，药物组合物可包括LV与药学上可接受的载体的组合。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。组合物中还可掺入补充的活性化合物。
在一些实施方案中，将活性剂，即本文所述的慢病毒和/或与所述载体(vector)一起施用的其他药剂，与将保护化合物免于从体内快速消除的载体(carrier)比如控释制剂一起制备，所述控释制剂包括植入物和微囊化递送***。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，比如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的组合物的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。适合的材料也可以从阿尔扎公司(Alza Corporation)和诺瓦药物公司(Nova Pharmaceuticals,Inc.)商购获得。还可以使用脂质体作为药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如美国专利第4,522,811号中所述。在一些实施方案中，所述组合物靶向特定的细胞类型或被病毒感染的细胞。例如，可以使用针对细胞表面标志物例如内源性标志物或在感染细胞表面上表达的病毒抗原的单克隆抗体来靶向组合物。
配制剂量单位形式的组合物是有利的，以便易于施用并且剂量一致。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗受试者的物理上离散的单位；每个单位包含经计算与药物载体联合产生期望的治疗作用的预定量的LV。
单位剂量不需要以单次注射的形式施用，而是可以包括在设定的时间段内的连续输注。本文所述的LV的单位剂量可以方便地用慢病毒载体的转导单位(T.U.)加以描述，如通过在诸如HeLa或293的细胞系上滴定所述载体所定义的。在某些实施方案中，单位剂量可以在103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013个T.U.和更高的范围内。
可以根据需要以不同的间隔和不同的时间段施用药物组合物，例如每周一次，持续约1周至约10周；约2周至约8周；约3周至约7周；约4周；约5周；约6周等。可能需要在不确定的基础上施用治疗组合物。本领域技术人员将理解，某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排，这些因素包括但不局限于疾病或疾患的严重性、先前的治疗、所述受试者的一般健康状况和/或年龄、以及存在的其他疾病。患有LV的受试者的治疗可以包括单一治疗，或者在许多情况下，可以包括一系列治疗。
说明性而非限制性的基因疗法载体的施用剂量和确定适合剂量的方法是本领域已知的。进一步理解的是，LV的适当剂量可能取决于特定的接受者和施用方式。对任何特定的受试者的适当剂量水平可能取决于多种因素，包括受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、***率、施用的其他治疗剂等。
在某些实施方案中，本文所述的慢病毒基因疗法载体可以通过例如静脉内注射、局部施用或通过立体定向注射递送至受试者(参见，例如，Chen等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3054)。在某些实施方案中，载体可以口服或吸入方式递送，并且可以被封装或以其他方式操作以保护它们免于降解、增强组织或细胞的摄取等。药物制剂可以包括在可接受的稀释剂中的LV，或者可以包括其中嵌入LV的缓释基质。可替代地或另外地，当载体可以由重组细胞完整产生时，正如本文所述的逆转录病毒或慢病毒载体的情况，药物制剂可以包括一种或多种产生载体的细胞。包含本文所述的LV的药物组合物可以任选地与施用说明书一起容纳在容器、包装或分配器中。
前述组合物、方法和用途旨在是说明性而非限制性的。使用本文提供的教导，在组合物、方法和用途方面的其他变化对于本领域的技术人员来说将是容易获得的。
实施例1
开发用于治疗X-CGD的慢病毒载体
本实施例描述了用于治疗X连锁慢性肉芽肿病(X-CGD)的新型慢病毒载体的开发。具体而言，我们描述了一种或多种载体的开发，其显示出的表达水平高于正在经历X-CGD临床试验的当前慢病毒载体(pChim-CYBB，又名MSP-Gp91phox-WPRE，参见例如，Santilli等人(2011)Mol.Therapy.,19(1):122-122)。这种慢病毒载体利用嵌合骨髓特异性启动子(MSP)，并且在成熟的人类嗜中性粒细胞群中长期表达不足，并且无法概括天然CYBB基因的谱系特异性表达模式。相比之下，在本实施例中描述的载体具有严格的谱系和阶段特异性表达，其模拟天然CYBB基因的表达模式(参见，例如图1)。
我们已经实施了生物信息学方法来阐明调控人类基因组中的内源性CYBB基因的元件。天然CYBB拓扑相关结构域(TAD)包含600kb的窗口，其跨越CYBB基因上游100kb到下游500kb的范围。因而，这个CYBB TAD在人类基因组中提供了一个600,000个碱基对的窗口，用于正确调控所述基因。
我们试图阐明在600,000个碱基对的窗口内的功能增强子元件，并将重要元件包装在少于9,000个碱基对的慢病毒载体中。使用生物信息学方法，鉴定了在天然CYBB拓扑相关结构域(TAD)中的十五个推定的内源性元件。
为了通过实验鉴定调控CYBB基因的关键增强子元件，将每个推定的增强子元件克隆到内源性CYBB启动子的上游以驱动报告基因(mCitrine)的表达(参见，例如，图2)。为了阐明每个假定的增强子元件的功能，我们测定了每种载体在脐带血(CB)CD34+分化的成熟嗜中性粒细胞和单核细胞以及RAMOS细胞(B淋巴细胞细胞系)中的活性，这些细胞是3个中靶的细胞谱系。将所有载体与MSP-mCit-WPRE构建体比较。
如图3中所示，增强子元件4驱动成熟嗜中性粒细胞中的高水平表达。另外，表达水平显著高于使用正在经历临床试验的当前X-CGD载体获得的表达水平。类似地，如图4中所示，增强子元件4也驱动单核细胞中的高水平表达，并且再次表达水平显著高于使用正在经历临床试验的当前X-CGD载体获得的表达水平。
图5显示增强子元件2驱动B细胞中的高水平的谱系特异性表达。在Jurkat(T细胞)中没有任何增强子元件表达，表明每个增强子元件的谱系特异性表达(参见，图6)。相比之下，MSP-mCit-WPRE构建体显示出最高水平的脱靶表达。
因而，似乎增强子元件4赋予成熟嗜中性粒细胞和单核细胞中增加的谱系特异性表达并且显示出比MSP-mCit-WPRE载体高2倍的表达。在T细胞(Jurkat)或B细胞(RAMO)中未观察到增强子元件4驱动的表达。增强子元件2似乎赋予B细胞(RAMO)中增加的谱系特异性表达。在嗜中性粒细胞、单核细胞或T细胞中未观察到增强子元件2驱动的表达。
因而确定将增强子元件2和4掺入慢病毒载体中，以设计在嗜中性粒细胞、单核细胞和B细胞中具有中靶谱系特异性表达的载体。我们注意到增强子元件4由两个不同的增强子模块(4L和4R)组成，并且对它们进行评价以确定是否可以消除这些元件之一以减小载体的大小。
因此，产生了五个用于评价的新载体。这些是4L-Int3-pro-mCit-WPRE、4R-Int3-pro-mCit-WPRE、2+4L-Int3-pro-mCit-WPRE、2+4R-Int3-pro-mCit-WPRE和2+4-Int3-pro-mCit-WPRE。在CB CD34+分化的嗜中性粒细胞和单核细胞中以及在RAMO和Jurkat中评价了这些新载体。
如图7所示，增强子元件4的两个片段4L和4R在嗜中性粒细胞中协同作用。然而，单独的元件4R仍然比MSP载体(正在经历临床试验的当前载体)具有更高的表达。在单核细胞中，所述4R片段似乎与整个元件4以相似的水平表达(参见，图8)。谱系特异性得以维持(参见，图9)。与MSP-mCit-WPRE(正在经历临床试验的当前载体)不同，所有候选载体在T细胞中均未提供脱靶表达。另外，增强子元件2的掺入似乎增加了B细胞中的表达(参见图10)。
鉴于这些结果，我们得出结论，元件4的右半部分(4R)似乎是嗜中性粒细胞和单核细胞中的谱系特异性增强子活性的关键贡献者。然而，4L和4R在嗜中性粒细胞中组合在一起时似乎具有协同的表达增加，并且在单核细胞中组合在一起时似乎具有相加作用。当与髓样增强子元件4，即4L或4R中的任一者结合时，元件2仍然是B细胞增强子，并且在骨髓谱系中是惰性的。载体2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE在CB CD34+分化的嗜中性粒细胞和单核细胞中的表达是MSP-mCit-WPRE的1.6倍。然而，它在RAMO细胞(B细胞谱系)中具有50％的MSP-mCit-WPRE表达，但这可能是对于治疗剂足够的表达量。
2-4Full-Int3-pro-mCit-WPRE在嗜中性粒细胞和单核细胞中的表达分别是MSP-mCit-WPRE的2倍和1.6倍。
一种特别感兴趣的X-CGD载体候选物是2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE，其中mCit可以替换为编码Gp91phox的核酸(参见，例如，图11)并且其实现了具有谱系特异性表达的目标，概括了天然CYBB基因的表达模式，并且在成熟嗜中性粒细胞和单核细胞中的表达也高于MSP-mCit-WPRE。
另一个目标是在保持表达的同时减小载体的大小。在某些实施方案中，设计的缺失可以产生“核心”和“超核心”变体。修饰分别产生7.6kb和5.9kb的载体(在ORF中具有Gp91phox)。第二个目标是在增加表达的同时缩小载体。在某些实施方案中，这可以涉及将“额外4L核心”和/或“额外2”添加至核心和超核心变体。另外，Gp91phox的不同密码子优化可用于替换开放阅读框(ORF)中的mCitrine。
全长元件2包含1092个碱基对。产生200个bp的缺失，以生成892个bp的“核心”变体(参见，例如，表1，SEQ ID NO:5)。产生745个bp的缺失，以生成347个bp的增强子元件2“超核心”变体(参见，例如，表1，SEQ ID NO:6)。
类似地，全长元件4R包含995bp，并且产生496bp的缺失，以生成500bp的增强子元件4R“核心”变体(参见，例如，表1，SEQ ID NO:10)。产生741个bp的缺失，以生成254个bp的元件4R增强子“超核心”变体(参见，例如，表1，SEQ ID NO:11)。
类似地，使内含子3增强子(1778bp)产生242个bp的缺失以生成1536个bp的内含子3增强子“核心”变体，并产生1058bp缺失以生成720bp内含子3增强子“超核心”片段，其包含中间片段(参见，例如，表1，SEQ ID NO:15)和右片段(参见，例如，表1，SEQ ID NO:16)。
使507个bp的全长CYBB内源性启动子(参见，例如，表1，SEQ ID NO:1)产生240bp缺失以生成267个bp的CYBB启动子“核心”片段(SEQ ID NO:2)，并且产生337个bp的缺失以生成最小CYBB启动子“CYBB超核心启动子”(参见，例如，表1，SEQ ID NO:3)。
通过产生“核心”和“超核心”缺失，载体大小分别减小了1182bp和2882bp，如表2中所示。
表2.“核心”和“超核心”载体变体的大小
原始： 7.8kb具有mCit和8.8kb具有Gp91<sup>phox</sup>；
核心： 6.6kb具有mCit和7.6kb具有Gp91<sup>phox</sup>；
超核心： 4.9kb具有mCit和5.9kb具有Gp91<sup>phox</sup>.
额外(E2核心和4L核心)核心 7.4kb具有mCit和8.4kb具有Gp91<sup>phox</sup>
额外(E2核心和4L核心)超核心 5.7kb具有mCit和6.7kb具有Gp91<sup>phox</sup>
另外，在某些实施方案中，包括“额外”片段。因而，例如，我们假设RELA TF结合位点可以增加B细胞表达。RELA在包括炎症和免疫在内的许多细胞过程中发挥作用。而且，在RELA结合位点存在B细胞谱系特异性DNAseI超敏反应。因此，在某些实施方案中，TF结合足迹可以被包括在元件2组分中(参见，例如，表1，SEQ ID NO:7)。
另外，在某些实施方案中，4L“核心”变体或4L“超核心”变体可以被包括在4R组分中。这些“额外”片段构建体的大小也显示在表2中。
测试了表3中所示的构建体：
表3.测试了慢病毒构建体。
Figure BDA0003692844870000401
Figure BDA0003692844870000411
与E2-E4R-Int3-pro-mCit-WPRE构建体或当前临床载体(MSP-Gp91phox-WPRE)相比，超核心和额外超核心变体载体在CB CD34+分化的嗜中性粒细胞(CD11b+CD66b+CD15+CD16+)(图12)和CB CD34+分化的单核细胞(CD11b+CD15+)(图13)中显示出显著更高的表达。
所有超核心和额外超核心变体载体在Jurkat细胞中均显示低表达(低于当前临床载体)(图14)。
如图16所示，超核心载体和额外超核心载体显示出比核心和额外核心变体更高的滴度。
鉴于此，我们得出结论，通过对我们的先导载体产生2.9kb的缺失，我们增加了表达如下：
·嗜中性粒细胞中增加180％(是MSP的3.4倍)
·单核细胞中增加150％(是MSP的2.2倍)
·RAMO(B细胞系)中增加129％(是MSP的1.16倍)
所述载体还保留了特异性，没有T细胞表达(无变化)。另外，通过产生1.2kb的缺失，我们降低了表达如下：
·嗜中性粒细胞中降低15％
·单核细胞中降低33％
·RAMOS(B细胞系)中降低6％
在某些实施方案中，一种特别适合的载体是2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE的超核心变体(UC 2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE)。mCitrine的ORF可以替换为治疗性转基因(Gp91phox编码核酸)，以提供临床相关载体。
而且，为了使表达和滴度最大化，评价了许多不同的密码子优化。这些包括jCAT、GeneArt、IDT、当前临床载体中的密码子优化序列(MSP-Gp91phox-WPRE)和Gp91phoxcDNA。
我们最初筛选了Int3-pro-Gp91phox-WPRE载体骨架中的不同密码子优化。然而，Int3-pro载体具有高谱系特异性表达，并且仅在成熟嗜中性粒细胞中表达，并在PLB-985CYBB-/-细胞系(人早幼粒细胞的细胞系)中表达不佳。为了使用PLB-985X-CGD细胞系，我们决定用MSP-Gp91phox-WPRE载体骨架筛选Gp91phox的不同密码子优化。
可以将前导密码子优化序列转移至本文所述的各种X-CGD载体。我们注意到，密码子优化是为了优化特定物种(甚至可能是细胞类型)内的表达，然而理想的密码子优化应该与从其表达的哪种启动子/载体无关。
如图17中所示，gp91phox的jCAT优化产生了经测试的优化的最高表达水平。各种优化的原始滴度显示在(MSP-Gp91phox-WPRE)优化中，并且jCAT优化没有显著差异(图18)。
鉴于上述情况，我们得出结论，jCAT是Gp91phox的最佳密码子优化。这种密码子优化使表达增加，是天然cDNA序列的2倍以上，并且是临床MSP-Gp91phox-WPRE载体中的当前密码子优化序列的1.2倍。这种优化还增加了是天然cDNA序列(MSP-Gp91phox-WPRE)1.2倍的滴度。
通过实施生物信息学指导的方法，我们合理地设计了一种具有严格的谱系和阶段特异性表达的新型X-CGD慢病毒载体，其模拟天然CYBB基因的表达模式。一种先导候选载体是超核心：UC 2-4R-Int3-pro-Gp91phox(jCAT)-WPRE载体，例如，如图20的图A所示。这种载体的图谱如图20的图B所示，并将所述序列显示在表1中(SEQ ID NO:22)。
实施例2
MeloVec的谱系特异性表达
上面的实施例1描述了优化的先导候选载体：UC 2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE(又名MyeloVec)的生成。这种载体显示出改进的滴度、改进的感染性和改进的表达。
筛选了许多不同的密码子优化，并决定用jCAT密码子优化Gp91phox替换mCtrine的开放阅读框，以表达实际的治疗性转基因。
如本文所述，通过将转导的人类健康供体(HD)脐带血(CB)CD34+细胞移植到NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠中证明了MyeloVec(表达mCitrine)的体外谱系特异性表达。另外，MyeloVec(表达密码子优化的Gp91phox)在功能上纠正X-CGD表型的能力通过以下所述来证明：
1)转导鼠X-CGD谱系阴性(Lin-)造血干细胞和祖细胞细胞(HSPC)并且在体外分化为嗜中性粒细胞来评价Gp91phox表达的恢复和功能氧化酶活性的恢复；
2)将鼠X-CGD Lin-HSPC转导并将细胞移植到同源B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ(Pepboy)小鼠中，以证明所述疾病的体内功能正确；以及
3)转导人类X-CGD患者的细胞并且在体外分化为嗜中性粒细胞，以证明Gp91phox表达和功能氧化酶活性的恢复。
图21证明了随着我们将我们的载体从原始2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE优化为核心变体和超核心(UC)变体在滴度(上图)和感染性(下图)方面的提高。随着我们将我们的载体的大小从原始2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE减小到核心变体和超核心(UC)变体，我们提高了滴度和传染性。
如图22所示，MyeloVec(表达mCitrine)能够概括天然CYBB基因的内源性表达模式。在本实验中，我们转导了健康供体(HD)脐带血(CB)CD34+造血干细胞和祖细胞(HSPC)，并将所述细胞移植到NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠中。所述基因修饰的细胞将产生造血***的所有不同谱系。通过评价哪些谱系表达mCitrine以及表达程度，我们可以确定我们的载体的谱系特异性表达模式，并判断它是否模拟了天然CYBB基因的内源性表达模式。
MyeloVec能够概括天然CYBB基因的内源性表达模式--在嗜中性粒细胞中非常高的表达、高的大量骨髓表达、中等水平的B细胞表达以及在T细胞和HSPC中的最小表达。这显示在血液(图22，图A)和骨髓(图22，图B)中。
MyeloVec也能够概括天然CYBB基因在整个嗜中性粒细胞发育过程中的时间表达模式。随着嗜中性粒细胞的成熟，表达变得更高，从而模仿天然CYBB基因的模式(参见，例如，图23)。
因而，在移植到NSG小鼠中的转导的人脐带血CD34+细胞中，来自MyeloVec的mCitrine表达模式概括了Gp91phox跨血液和骨髓细胞中的多个谱系的内源性表达模式(参见，例如，表4)。
表4.MyeloVec的表达模式
Figure BDA0003692844870000441
然后，我们用Gp91phox的jCAT密码子优化版本替换含有mCitrine报告基因的开放阅读框，以表达用于我们的功能研究的治疗性转基因。
图24和25展示了MyeloVec在体外对小鼠X-CGD HSPC中的X-CGD表型进行功能校正的能力。对于本实验，我们转导了鼠X-CGD谱系阴性(Lin-)造血干细胞和祖细胞(HSPC)，并使细胞分化为成熟嗜中性粒细胞，以证明我们的先导候选载体(UC-2-4R-Int3-pro-Gp91phox(jCAT)-WPRE)使Gp91phox的表达(图24)和氧化酶活性(图25)恢复的能力。在这些实验中，氧化酶活性通过二氢罗丹明(DHR)测定法进行评估。
如图24所示，MyeloVec被认为比当前临床载体(MSP)可以恢复从X-CGD小鼠HPSC分化的嗜中性粒细胞中的更高水平的Gp91phox。另外，MyeloVec能够使分化为成熟嗜中性粒细胞的转导的鼠X-CGD细胞中的氧化酶活性恢复到WT水平(参见，例如，图25)。因而，似乎MyeloVec是MSP(当前临床载体)在鼠CYBB Lin-体外分化的嗜中性粒细胞中表达的Gp91phox的1.6倍，并且MyeloVec能够使鼠CYBB Lin-体外分化的嗜中性粒细胞中的氧化酶活性恢复至WT水平。
图26-29展示了MyeloVec在X-CGD小鼠模型中体内校正X-CGD表型的能力。简言之，从X-CGD小鼠分离HPSC，并用MyeloVec转导。然后将基因修饰的细胞移植到同源B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ(Pepboy)小鼠中。移植后16周收获小鼠，用于分析跨不同造血谱系的Gp91phox表达和氧化酶活性的恢复。
在外周血中的嗜中性粒细胞和单核细胞中恢复了高水平的Gp91phox表达(参见，例如，图26)。这导致血液嗜中性粒细胞和单核细胞中接近野生型水平的氧化酶活性的恢复(参见，例如，图27)。在骨髓嗜中性粒细胞和单核细胞中也恢复了高水平的Gp91phox表达(参见，例如，图28)，这导致了氧化酶活性的野生型水平的恢复(参见，例如，图26)。因而，似乎我们已经体内校正了X-CGD小鼠模型。
为了证明MyeloVec在体外在功能上校正人类患者X-CGD细胞的能力，我们用MyeloVec转导人类X-CGD HSPC，并在体外使所述细胞分化为成熟嗜中性粒细胞。然后，我们通过DHR测定法和细胞色素C测定法测量了Gp91phox表达的恢复和氧化酶活性的恢复。图30显示了MyeloVec恢复人X-CGD嗜中性粒细胞中Gp91phox表达的野生型水平的能力。图31显示了MyeloVec恢复人X-CGD嗜中性粒细胞中的细胞氧化酶活性的野生型水平的能力(DHR测定法)。图32显示了MyeloVec在平均VCN为1.63时恢复人X-CGD嗜中性粒细胞中的大量氧化酶活性的野生型水平的能力(细胞色素C测定法)。
因而，通过实施基于生物信息学的设计方法，我们开发了我们的先导候选X-CGD载体UC-2-4R-Int3-pro-coGp91phox-WPRE(MyeloVec)(参见，例如，图20，图A和B，以及SEQ IDNO:22)。
结论
上述实验证明了在鼠X-CGD小鼠模型中体内校正X-CGD表型的能力。在移植到受到致命照射的PepBoy小鼠中的转导的鼠X-CGD Lin-细胞中：
MyeloVec能够使骨髓嗜中性粒细胞和单核细胞中的氧化酶活性恢复至WT水平；
MyeloVec在VCN为1.74或更高时在外周血嗜中性粒细胞和单核细胞中实现了接近WT水平的氧化酶活性；和
在平均VCN为1.63时来自用MyeloVec转导的人X-CGD患者CD34+HSPC的体外分化的嗜中性粒细胞使Gp91phox表达和功能氧化酶活性恢复至健康供体水平。
应该理解的是，在本文中描述的实施例和实施方案仅用于说明的目的，并依照它们的各种修改或改变将对本领域技术人员作出暗示并且将被包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求书的范围内。出于所有目的，将本文中引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容通过引用并入本文。
序列表
SEQ ID NO:1CYBB启动子
tagcacataaaattggcacatattaagcattttgtaaatatcaaccattacaattgttactacttttctcagcaaggctatgaatgctgttccagcctgtcaaaatcacacctgtttaatgtgttttacccagcacgaagtcatgtctagttgagtggcttaaaaattgtgatcaaatagctggttagttaaaaagttatttcactgtgtaaaatacatcccttaaaatgcactgttatttatctcttagttgtagaaattggtttcattttccactatgtttaattgtgactggatcattatagaccctttttttgtagttgttgaggtttaaagatttaagtttgttatggatgcaagcttttcagttgaccaatgattattagccaatttctgataaaagaaaaggaaaccgattgccccagggctgctgttttcatttcctcattggaagaagaagcatagtatagaagaaaggcaaacacaacacattcaacctctgccacc
SEQ ID NO:2最小CYBB启动子(核心)
tatctcttagttgtagaaattggtttcattttccactatgtttaattgtgactggatcattatagaccctttttttgtagttgttgaggtttaaagatttaagtttgttatggatgcaagcttttcagttgaccaatgattattagccaatttctgataaaagaaaaggaaaccgattgccccagggctgctgttttcatttcctcattggaagaagaagcatagtatagaagaaaggcaaacacaacacattcaacctctgccacc
SEQ ID NO:3最小CYBB启动子(超核心)
tttaagtttgttatggatgcaagcttttcagttgaccaatgattattagccaatttctgataaaagaaaaggaaaccgattgccccagggctgctgttttcatttcctcattggaagaagaagcatagtatagaagaaaggcaaacacaacacattcaacctctgccacc
SEQ ID NO:4增强子元件2
gcttagtcatgttggtcccaaagtcatagttgatgagaagtagcaagttaagagagaaagacttctagagataggtacatacacaatgataacaagtgacatcagagaacctaaggaagggcaaagaaagaaacactgcaaagcagactcaaacacttaaaagcatagcagcttggggccagttagtgtaagagaaaaggagctccatatgcctcaatagaacctaagagcatcattgtactgcatttattcattcattcacttcacatgtttattcaacaaatgctatgtatactgagatttttctctggtcattgtactggctagaacctaaaggagtgagactattaattagagtttacaatctggcaatgatattaacagtctattcacaaaagggttaactcaagttaagccggcctaaatgtttatgcaaaataggatttttgcctaagtctaaagggtatcagaaaagtgtagccattgagaatgactcatttcatggtgttctcggatggcttaagtattattaatatgtctccatttctagtgcaggaacctccacgttttagaggaaaggaggaaagaatttgtgaagactgtgcctaaaaaaggtagaaatttgtttacaatttatttaaagataaaagtaaagaactaggttgctttaaaaaagggagggaaagaaaatcaaaatacatcttatttgaggcattaaaacttttttaagaaaataaaatttaaaataaagttgtattcttctaaaaataattttttaaaccagctgaaaatgaaaaatgcagattatactaagaagcaactgttttacattctgctttctgaatggtatttaaaaactcagttattttcagaaatgaggaagtcttgatctgctagatgaaggtcggctgcaggtggtgtttattgctttatgatggcaacaaaccgtaaacccatcactcagtaaatattaaactggctgaatgaatccaaagcatgtctaacatacaggaaaaacacagccctgttaagcagtcttgaaacccacaagctacatggaaaacacagattcaactacatcataaaaattca
SEQ ID NO:5增强子元件2核心
gagctccatatgcctcaatagaacctaagagcatcattgtactgcatttattcattcattcacttcacatgtttattcaacaaatgctatgtatactgagatttttctctggtcattgtactggctagaacctaaaggagtgagactattaattagagtttacaatctggcaatgatattaacagtctattcacaaaagggttaactcaagttaagccggcctaaatgtttatgcaaaataggatttttgcctaagtctaaagggtatcagaaaagtgtagccattgagaatgactcatttcatggtgttctcggatggcttaagtattattaatatgtctccatttctagtgcaggaacctccacgttttagaggaaaggaggaaagaatttgtgaagactgtgcctaaaaaaggtagaaatttgtttacaatttatttaaagataaaagtaaagaactaggttgctttaaaaaagggagggaaagaaaatcaaaatacatcttatttgaggcattaaaacttttttaagaaaataaaatttaaaataaagttgtattcttctaaaaataattttttaaaccagctgaaaatgaaaaatgcagattatactaagaagcaactgttttacattctgctttctgaatggtatttaaaaactcagttattttcagaaatgaggaagtcttgatctgctagatgaaggtcggctgcaggtggtgtttattgctttatgatggcaacaaaccgtaaacccatcactcagtaaatattaaactggctgaatgaatccaaagcatgtctaacatacaggaaaaacacagccctgttaagcagtcttgaaacccacaagctacatggaaaacacagattcaactacatcataaaaattc
SEQ ID NO:6增强子元件2超核心
Aaatcaaaatacatcttatttgaggcattaaaacttttttaagaaaataaaatttaaaataaagttgtattcttctaaaaataattttttaaaccagctgaaaatgaaaaatgcagattatactaagaagcaactgttttacattctgctttctgaatggtatttaaaaactcagttattttcagaaatgaggaagtcttgatctgctagatgaaggtcggctgcaggtggtgtttattgctttatgatggcaacaaaccgtaaacccatcactcagtaaatattaaactggctgaatgaatccaaagcatgtctaacatacaggaaaaacacagccctgttaagca
SEQ ID NO:7元件2 RELA TF结合位点
aactgcccaggccatccacagatgactgtagatacatgtgtaagttcagttcacatcctcagaaccacccagatgtcctgtagatgcatgagaaatgttaaatgcttgttgttttaagccactaacttcagagtagtttgttatataacaaaaccgctgatgcaaatggcatcaaaaattgttgaaagagagatgggggttcagggtgagagctgtaggtgattgtatctgtgctaataccacatagcccttttttggggattgccatgaataatatattagctttgctatgagtaaaatactatatcctctgaattgtcatgaattacgtggagtcatacgtgttttggaagtgtgaaagtccctgggctcagataaaaggtgttgccatctggaaagtacaggtagtttatttcaattctgctccaataactagcacgtcattccattcatgtagaaataagctactggctatctcactatctgaaatagaagtatgaactgtgggtaagtgggtgaggacaatgtctgagcaaccaaaaaggagctcaaatcc
SEQ ID NO:8增强子元件4
aaactaatatgaccttataagaggaggaagttggggcacaggcatgtacacacagaggaaagaccatacagaggaaagaccatattaagataaaggaagaggatgaccatctacaagccaagcaaaggggccccagaaggaaaccaaacatgctgaaaccttgatcttgaatttgtagcttctaaaactgtgagaaaataaatttctgttgtttaaaacatccaggctgaggtactttgttatggaagccctgtcaaactaatgcaacaacatttcctcccattagatttcttaattcgtgtatagctggcctgataatgtcttatcagctaccccaactcaattgctgcaaatacatttttaaaagttctggtggttgtagttgattgcacacttctgtatgagccaataatgtgaggcaagtctttaaaagggtagcacaatcagtctgaggttacaccatagatatggttaaccatagtgtggtctccataacataggaagtcaagatcccccttcactcttgaccagtcagattgcacctagaacatttttctcaattctgcataccacatttaaagaggaagacaaaacccatgcgttgtgcagctaccacatgtcgagcatcagactatgtgcactgtgtacacttagtcctcccaccaacccaatgaagatggtattaatacccacctcccattgtacagatgaggagactggggctaaatgaggtcaaataggttgctcaacagagatcttcacctccatggactcccatagccacactctgaaccctgtcatctctcagaagtgcactgcttctgaaatctgcatctcatacacccatcctctgactaccacctcctgttccctggcttcctaattcactcacacccaagatgactgtccttcaacctcatcaaactttgagttctttttgactctttgactttgctcccatcttgtgttcacttcttggcattctactcatcttagactcagttcacttctgccattttcttgcacaaatcctgaattctctcatgcagtgcccttctgtaccacctgcaggcaaaaaccaaccctgatcaactcaattgtcctctatacttgctcgtgggtgggtaagaaaagctagaaaagctacccacagactcctaccattactgatttatgagctccaggctcaactgggcccttatctgggcctggaaatcattttgcatttctacagtcaagtctcctttctgaacaaaagatacaacattgaaaactgtcttctgtttcctgaaatgtctactcactacctcactttcaacagataaccttgccctctctttcacaaaggaaatggaaaccacaaagaggaagtccctcaccctgctgtccccagccctacaaatcctcctgcatctgcactctgctccttccctctttttacagagaggaggcccctcctgtctaaagcaaattccatttccttcctgccttgggctcagaaatctcaccccatccaaaatcttccatggttagcctgtccctttgttgcgactctttctcaatatttacaagctcctatattttttaaaataataaaactaggtcctcctggtgttcacatgttttcccaattgtagccaagtcctctcattcttatcacagcctcagacattttgaggtgtctcactacctcacctcaacccacaacatctggcttccctcattgttttccagtaggcccctt
SEQ ID NO:9增强子元件4R
cagagatcttcacctccatggactcccatagccacactctgaaccctgtcatctctcagaagtgcactgcttctgaaatctgcatctcatacacccatcctctgactaccacctcctgttccctggcttcctaattcactcacacccaagatgactgtccttcaacctcatcaaactttgagttctttttgactctttgactttgctcccatcttgtgttcacttcttggcattctactcatcttagactcagttcacttctgccattttcttgcacaaatcctgaattctctcatgcagtgcccttctgtaccacctgcaggcaaaaaccaaccctgatcaactcaattgtcctctatacttgctcgtgggtgggtaagaaaagctagaaaagctacccacagactcctaccattactgatttatgagctccaggctcaactgggcccttatctgggcctggaaatcattttgcatttctacagtcaagtctcctttctgaacaaaagatacaacattgaaaactgtcttctgtttcctgaaatgtctactcactacctcactttcaacagataaccttgccctctctttcacaaaggaaatggaaaccacaaagaggaagtccctcaccctgctgtccccagccctacaaatcctcctgcatctgcactctgctccttccctctttttacagagaggaggcccctcctgtctaaagcaaattccatttccttcctgccttgggctcagaaatctcaccccatccaaaatcttccatggttagcctgtccctttgttgcgactctttctcaatatttacaagctcctatattttttaaaataataaaactaggtcctcctggtgttcacatgttttcccaattgtagccaagtcctctcattcttatcacagcctcagacattttgaggtgtctcactacctcacctcaacccacaacatctggcttccctcattgttttccagtaggcccctt
SEQ ID NO:10增强子元件4R核心
catgcagtgcccttctgtaccacctgcaggcaaaaaccaaccctgatcaactcaattgtcctctatacttgctcgtgggtgggtaagaaaagctagaaaagctacccacagactcctaccattactgatttatgagctccaggctcaactgggcccttatctgggcctggaaatcattttgcatttctacagtcaagtctcctttctgaacaaaagatacaacattgaaaactgtcttctgtttcctgaaatgtctactcactacctcactttcaacagataaccttgccctctctttcacaaaggaaatggaaaccacaaagaggaagtccctcaccctgctgtccccagccctacaaatcctcctgcatctgcactctgctccttccctctttttacagagaggaggcccctcctgtctaaagcaaattccatttccttcctgccttgggctcagaaatctcaccccatccaaaatcttccatggttagcctgtccct
SEQ ID NO:11增强子元件4R超核心
gcccttatctgggcctggaaatcattttgcatttctacagtcaagtctcctttctgaacaaaagatacaacattgaaaactgtcttctgtttcctgaaatgtctactcactacctcactttcaacagataaccttgccctctctttcacaaaggaaatggaaaccacaaagaggaagtccctcaccctgctgtccccagccctacaaatcctcctgcatctgcactctgctccttccctctttttacagagagg
SEQ ID NO:12增强子元件4L
aaactaatatgaccttataagaggaggaagttggggcacaggcatgtacacacagaggaaagaccatacagaggaaagaccatattaagataaaggaagaggatgaccatctacaagccaagcaaaggggccccagaaggaaaccaaacatgctgaaaccttgatcttgaatttgtagcttctaaaactgtgagaaaataaatttctgttgtttaaaacatccaggctgaggtactttgttatggaagccctgtcaaactaatgcaacaacatttcctcccattagatttcttaattcgtgtatagctggcctgataatgtcttatcagctaccccaactcaattgctgcaaatacatttttaaaagttctggtggttgtagttgattgcacacttctgtatgagccaataatgtgaggcaagtctttaaaagggtagcacaatcagtctgaggttacaccatagatatggttaaccatagtgtggtctccataacataggaagtcaagatcccccttcactcttgaccagtcagattgcacctagaacatttttctcaattctgcataccacatttaaagaggaagacaaaacccatgcgttgtgcagctaccacatgtcgagcatcagactatgtgcactgtgtacacttagtcctcccaccaacccaatgaagatggtattaatacccacctcccattgtacagatgaggagactggggctaaatgaggtcaaataggttgctcaa
SEQ ID NO:13增强子元件4L核心
agccaataatgtgaggcaagtctttaaaagggtagcacaatcagtctgaggttacaccatagatatggttaaccatagtgtggtctccataacataggaagtcaagatcccccttcactcttgaccagtcagattgcacctagaacatttttctcaattctgcataccacatttaaagaggaagacaaaacccatgcgttgtgcagct
SEQ ID NO:14全内含子3增强子
gatcatccctccttgacttccatacatgtggggattacaggcatgagtcacctgcctggcgagttccttgtttctaaggagacacaattcatttttattctccctacccccattagaatagtttctatttagaggaagtaaagcctgagaaacaggcaatgttttcaccaagatggcctgttaagaaatcttggttagtctacaagtccaaatttcactgccggtgagcaccatgtcccatgagcagcacatgttgtaatgccagctagaggtctcaatcattgaaactttgctttgtaatccttctggttacctagagaaagaaagccccagggttgcccaccccaccactccaggaaaggtaggggtaaaggctctcagactgctttgttgagaaaaatggagaatgggtgaagctcagcacacaaaaatctctgaggaagccttaaaaacccccaacttgccatgcagaaactaatttctgtctggatggcagtcctagtcttaagatcagaaagaaacaggaaggtgagagggtgaggttttatctgttaccttatatagtctgggagtcagaggcactcagtgtgcctctatctttaatcacgtggtctagcactagtctcttgggctttctgtctcatagtttttttttttagttgaaaaacaggtcaactaacacaaatgtaagaaggcatatgttggtctaaaagtatattaattgtttaagtctgtcaattagtgagttgtcagtcaataaatatttgttgagtgccatttatgtgctaagcactggggacatgtggtaagtaaagattaagttatagataggccatgagcttaaggagcttagagtgttaacaggagagacagagaataaatatggaacttccaaattataaacagtgctatgcaaataaggtagtgttattcatatttatcagatattctactgccagcaggtgtggatattactgtcaacttacttgcctgagttctgtagattcaaagttggattttgtaatttctcccagttgcgtataaatatctaaatcagatacattgatggtgcgtgtggtgagatcaagtgtacaaaaagtagagcttttgagtttctgtaaagtgttacaccccataaaatatgtacttctttttagttccacttcccattttcttgaaatatttttttcttactcagtttcaatagagcatagaaatctgctgaagtgactcaataatctcccttgcattagaatggtagtttattgaaatcgggcaaggcttccggtgacagtaacagagaaacttccctttagaagtcaatggcagaaagtaaagtaagttagtaaggaagctatggggcatgatggcaacgtggataattgggaagtggctggcaataatttagaagtaactcaaagcatataaatgcaatctgcctgatgatggggaacaaaaaattatgggcagtcacagacagtaaagtccttccttcctatgccaccaaccggttgtctcgcctccttttttaaggaagtggtgaggagatggtattcttaaaagcccagtatcagcatgacttgtggcttctttttggatttgtttgccattcctgtccacaccaaagagggtaggtgggaaaaattagggatttgtgccctgatggttggacccactccactgatccattagttactagtaatctcactttttcctttcaatataatatatgtgttttacattaactagctttttaaaaattacctattaagatgaaa
SEQ ID NO:15中间片段INT3增强子超核心
cttaaaaacccccaacttgccatgcagaaactaatttctgtctggatggcagtcctagtcttaagatcagaaagaaacaggaaggtgagagggtgaggttttatctgttaccttatatagtctgggagtcagaggcactcagtgtgcctctatctttaatcacgtggtctagcactagtctcttgggctttctgtctcatagtttttttttttagttgaaaaacaggtcaactaacacaaatgtaagaaggcatatgttggtctaaaagtatatta
SEQ ID NO:16INT3增强子右片段超核心
Agcttttgagtttctgtaaagtgttacaccccataaaatatgtacttctttttagttccacttcccattttcttgaaatatttttttcttactcagtttcaatagagcatagaaatctgctgaagtgactcaataatctcccttgcattagaatggtagtttattgaaatcgggcaaggcttccggtgacagtaacagagaaacttccctttagaagtcaatggcagaaagtaaagtaagttagtaaggaagctatggggcatgatggcaacgtggataattgggaagtggctggcaataatttagaagtaactcaaagcatataaatgcaatctgcctgatgatggggaacaaaaaattatgggcagtcacagacagtaaagtccttccttcctatgccaccaaccggttgtctcgcctccttttttaaggaagtggtgagga
SEQ ID NO:17Gp91phoxcDNA
atggggaactgggctgtgaatgaggggctctccatttttgtcattctggtttggctggggttgaacgtcttcctctttgtctggtattaccgggtttatgatattccacctaagttcttttacacaagaaaacttcttgggtcagcactggcactggccagggcccctgcagcctgcctgaatttcaactgcatgctgattctcttgccagtctgtcgaaatctgctgtccttcctcaggggttccagtgcgtgctgctcaacaagagttcgaagacaactggacaggaatctcacctttcataaaatggtggcatggatgattgcacttcactctgcgattcacaccattgcacatctatttaatgtggaatggtgtgtgaatgcccgagtcaataattctgatccttattcagtagcactctctgaacttggagacaggcaaaatgaaagttatctcaattttgctcgaaagagaataaagaaccctgaaggaggcctgtacctggctgtgaccctgttggcaggcatcactggagttgtcatcacgctgtgcctcatattaattatcacttcctccaccaaaaccatccggaggtcttactttgaagtcttttggtacacacatcatctctttgtgatcttcttcattggccttgccatccatggagctgaacgaattgtacgtgggcagaccgcagagagtttggctgtgcataatataacagtttgtgaacaaaaaatctcagaatggggaaaaataaaggaatgcccaatccctcagtttgctggaaaccctcctatgacttggaaatggatagtgggtcccatgtttctgtatctctgtgagaggttggtgcggttttggcgatctcaacagaaggtggtcatcaccaaggtggtcactcaccctttcaaaaccatcgagctacagatgaagaagaaggggttcaaaatggaagtgggacaatacatttttgtcaagtgcccaaaggtgtccaagctggagtggcacccttttacactgacatccgcccctgaggaagacttctttagtatccatatccgcatcgttggggactggacagaggggctgttcaatgcttgtggctgtgataagcaggagtttcaagatgcgtggaaactacctaagatagcggttgatgggccctttggcactgccagtgaagatgtgttcagctatgaggtggtgatgttagtgggagcagggattggggtcacacccttcgcatccattctcaagtcagtctggtacaaatattgcaataacgccaccaatctgaagctcaaaaagatctacttctactggctgtgccgggacacacatgcctttgagtggtttgcagatctgctgcaactgctggagagccagatgcaggaaaggaacaatgccggcttcctcagctacaacatctacctcactggctgggatgagtctcaggccaatcactttgctgtgcaccatgatgaggagaaagatgtgatcacaggcctgaaacaaaagactttgtatggacggcccaactgggataatgaattcaagacaattgcaagtcaacaccctaataccagaataggagttttcctctgtggacctgaagccttggctgaaaccctgagtaaacaaagcatctccaactctgagtctggccctcggggagtgcatttcattttcaacaaggaaaacttctaa
SEQ ID NO:18jCAT密码子优化的Gp91phox
Atgggcaactgggccgtgaacgagggcctgagcatcttcgtgatcctggtgtggctgggcctgaacgtgttcctgttcgtgtggtactaccgcgtgtacgacatcccccccaagttcttctacacccgcaagctgctgggcagcgccctggccctggcccgcgcccccgccgcctgcctgaacttcaactgcatgctgatcctgctgcccgtgtgccgcaacctgctgagcttcctgcgcggcagcagcgcctgctgcagcacccgcgtgcgccgccagctggaccgcaacctgaccttccacaagatggtggcctggatgatcgccctgcacagcgccatccacaccatcgcccacctgttcaacgtggagtggtgcgtgaacgcccgcgtgaacaacagcgacccctacagcgtggccctgagcgagctgggcgaccgccagaacgagagctacctgaacttcgcccgcaagcgcatcaagaaccccgagggcggcctgtacctggccgtgaccctgctggccggcatcaccggcgtggtgatcaccctgtgcctgatcctgatcatcaccagcagcaccaa
gaccatccgccgcagctacttcgaggtgttctggtacacccaccacctgttcgtgatcttcttcatcggcctggccatccacggcgccgagcgcatcgtgcgcggccagaccgccgagagcctggccgtgcacaacatcaccgtgtgcgagcagaagatcagcgagtggggcaagatcaaggagtgccccatcccccagttcgccggcaacccccccatgacctggaagtggatcgtgggccccatgttcctgtacctgtgcgagcgcctggtgcgcttctggcgcagccagcagaaggtggtgatcaccaaggtggtgacccaccccttcaagaccatcgagctgcagatgaagaagaagggcttcaagatggaggtgggccagtacatcttcgtgaagtgccccaaggtgagcaagctggagtggcaccccttcaccctgaccagcgcccccgaggaggacttcttcagcatccacatccgcatcgtgggcgactggaccgagggcctgttcaacgcctgcggctgcgacaagcaggagttccaggacgcctggaagctgcccaagatcgccgtggacggccccttcggcaccgccagcgaggacgtgttcagctacgaggtggtgatgctggtgggcgccggcatcggcgtgacccccttcgccagcatcctgaagagcgtgtggtacaagtactgcaacaacgccaccaacctgaagctgaagaagatctacttctactggctgtgccgcgacacccacgccttcgagtggttcgccgacctgctgcagctgctggagagccagatgcaggagcgcaacaacgccggcttcctgagctacaacatctacctgaccggctgggacgagagccaggccaaccacttcgccgtgcaccacgacgaggagaaggacgtgatcaccggcctgaagcagaagaccctgtacggccgccccaactgggacaacgagttcaagaccatcgccagccagcaccccaacacccgcatcggcgtgttcctgtgcggccccgaggccctggccgagaccctgagcaagcagagcatcagcaacagcgagagcggcccccgcggcgtgcacttcatcttcaacaaggagaacttctaa
SEQ ID NO:19临床co-op Gp91phox
atgggcaactgggccgtgaacgagggcctgagcatcttcgtgatcctggtgtggctgggcctgaacgtgttcctgttcgtgtggtactaccgggtgtacgacatcccccccaagttcttctacacccggaagctgctgggcagcgccctggccctggccagagcccctgccgcctgcctgaacttcaactgcatgctgatcctgctgcccgtgtgccggaacctgctgtccttcctgcggggcagcagcgcctgctgcagcaccagagtgcggcggcagctggaccggaacctgaccttccacaagatggtggcctggatgatcgccctgcacagcgccatccacaccatcgcccacctgttcaacgtggagtggtgcgtgaacgcccgggtgaacaacagcgacccctacagcgtggccctgagcgagctgggcgaccggcagaacgagagctacctgaacttcgcccggaagcggatcaagaaccccgagggcggcctgtacctggccgtgaccctgctggccggcatcaccggcgtggtgatcaccctgtgcctgatcctgatcatcaccagcagcaccaagaccatccggcggagctacttcgaggtgttctggtacacccaccacctgttcgtgatctttttcatcggcctggccatccacggcgccgagcggatcgtgaggggccagaccgccgagagcctggccgtgcacaacatcaccgtgtgcgagcagaaaatcagcgagtggggcaagatcaaagagtgccccatcccccagttcgccggcaacccccccatgacctggaagtggatcgtgggccccatgttcctgtacctgtgcgagcggctggtgcggttctggcggagccagcagaaagtggtgattaccaaggtggtgacccaccccttcaagaccatcgagctgcagatgaagaaaaagggcttcaagatggaagtgggccagtacatctttgtgaagtgccccaaggtgtccaagctggaatggcaccccttcaccctgaccagcgcccctgaagaggacttcttcagcatccacatcagaatcgtgggcgactggaccgagggcctgttcaatgcctgcggctgcgacaagcaggaattccaggacgcctggaagctgcccaagatcgccgtggacggcccctttggcaccgccagcgaggacgtgttcagctacgaggtggtgatgctggtcggagccggcatcggcgtgacccccttcgccagcatcctgaagagcgtgtggtacaagtactgcaacaacgccaccaacctgaagctgaagaagatctacttctactggctgtgccgggacacccacgccttcgagtggttcgccgatctgctgcagctgctggaaagccagatgcaggaacggaacaacgccggcttcctgagctacaacatctacctgaccggctgggacgagagccaggccaaccacttcgccgtgcaccacgacgaggaaaaggacgtgatcaccggcctgaagcagaaaaccctgtacggcaggcccaactgggacaacgagtttaagaccatcgccagccagcaccccaacacccggatcggcgtgtttctgtgcggccctgaggccctggccgagacactgagcaagcagagcatcagcaacagcgagagcggccccaggggcgtgcacttcatcttcaacaaagaaaacttctga
SEQ ID NO:20GeneArt优化的Gp91phox
atgggaaactgggccgtgaatgagggcctgagcatcttcgtgatcctcgtgtggctgggcctgaacgtgttcctgttcgtgtggtactaccgggtgtacgacatccctcctaagttcttctacacccggaagctgctgggctctgctctggctcttgctagagcaccagccgcctgcctgaacttcaactgcatgctgatcctgctgcctgtgtgccggaacctgctgagctttctgagaggcagcagcgcctgctgtagcaccagagttagacggcagctggacagaaacctgaccttccacaagatggtggcctggatgatcgccctgcacagcgccattcacacaatcgcccacctgttcaacgtcgagtggtgcgtgaacgccagagtgaacaacagcgacccttacagcgtggccctgagcgagctgggcgatagacagaatgagagctacctgaatttcgcccggaagcggatcaagaaccctgaaggcggactgtacctggccgtgacactgctggctggaatcacaggcgtggtcatcaccctgtgcctgatcctgatcatcaccagcagcaccaagaccatccggcggagctacttcgaggtgttctggtacacccaccacctgtttgtgatctttttcatcggcctggccatccacggcgccgagagaatcgttagaggacagacagccgagtctctggccgtgcacaatatcaccgtgtgcgagcagaaaatcagcgagtggggcaagatcaaagagtgccccattcctcagttcgccggcaatcctcctatgacctggaagtggatcgtgggccccatgttcctgtacctgtgcgaaagactcgtgcggttctggcggagccagcagaaggtggtcattaccaaggtcgtgacacacccctttaagaccatcgagctgcagatgaagaaaaagggcttcaagatggaagtgggccagtacatctttgtgaagtgccccaaggtgtccaagctggaatggcaccccttcacactgacaagcgcccctgaagaggacttcttcagcatccacatccggatcgtcggcgattggaccgagggcctgtttaatgcctgcggctgcgacaagcaagagttccaggatgcttggaagctgcccaagatcgccgtggacggaccttttggaacagccagcgaggacgtgttcagctacgaggtcgtgatgctcgttggagccggcatcggcgtgacaccttttgccagcatcctgaagtctgtgtggtacaagtactgcaacaacgccaccaacctgaagctcaagaagatctacttctactggctgtgccgggacacccacgcctttgagtggttcgctgatctcctgcagctgctggaaagccagatgcaagagagaaacaacgccggcttcctgagctacaacatctacctgaccggctgggatgagagccaggccaatcactttgccgtgcaccacgacgaagagaaggacgtgatcaccggcctgaagcagaaaaccctgtacggcagacccaactgggacaacgagttcaagacaatcgcctctcagcaccccaataccagaatcggagtgtttctgtgcggccctgaggctctggccgaaacactgagcaagcagagcatcagcaacagcgagtctggccctagaggcgtgcacttcatcttcaacaaagagaacttctga
SEQ ID NO:21IDT优化的Gp91phox
atgggtaactgggcagtgaacgaggggctttctatctttgtcatactcgtgtggcttggcctcaacgtgttcttgttcgtctggtactaccgagtgtacgacattcctcctaaattcttttacacacgcaaactccttgggtctgctttggcgctcgctcgggcacctgcagcgtgcctgaattttaactgtatgctgatcctccttcctgtgtgccgaaaccttctttcattcctgcgaggtagttccgcttgctgctcaactcgggtgcgcaggcagcttgaccgcaacctgacgttccataagatggtagcatggatgattgcgttgcattccgcgatccacactatcgcgcacctctttaacgtggaatggtgtgtaaacgcgagagtaaataacagcgacccatactctgtagcactttccgaacttggagaccggcagaacgaatcttaccttaacttcgctaggaagagaattaaaaacccagaaggtggcctttatctcgcggttacgctgcttgctggcattaccggcgttgtcataactctctgtttgatacttataattacaagctccaccaagactataagacgatcctactttgaagtcttctggtacacgcaccacctgttcgtaattttctttataggactggctattcacggtgcggaaaggattgtacgaggtcagacagctgaatccctcgcggtgcacaacattacggtatgcgagcagaagataagtgagtggggaaaaattaaagagtgccccataccacagttcgccggcaatccaccaatgacatggaagtggatcgtgggcccaatgttcctctacctgtgtgagcgccttgtaaggttttggcgaagccaacagaaagtagtgataacgaaagtagttacacacccgttcaagacaatagagctccagatgaaaaaaaaaggcttcaagatggaagtcggtcaatacatattcgtgaagtgcccgaaagtctcaaagttggaatggcacccattcactctcacatcagcgcctgaagaagactttttctccattcatattcgcattgtgggcgattggacggaagggctctttaacgcttgcgggtgtgataaacaagagtttcaagacgcatggaaattgcctaagatagcagttgatggcccgttcggaaccgccagcgaagatgttttcagttacgaggtcgtcatgctcgttggtgctggaatcggagttactccgtttgcttccatacttaagagcgtctggtacaaatattgtaataatgccaccaatttgaaactcaagaagatttacttttattggttgtgtagggatactcacgctttcgaatggttcgcagaccttctccagctccttgaaagccaaatgcaggaacgaaataacgcaggatttttgagctacaatatataccttacgggttgggacgaatctcaggctaatcatttcgcggtacaccatgatgaagaaaaggatgttataacgggtttgaaacaaaaaacactctatggacgacctaactgggataatgaatttaaaacaatcgccagccaacatcctaacacccggattggagttttcctgtgcgggccagaggcactcgcggagacgctgagtaaacaatcaattagcaactctgagtccgggccacgcggggtgcattttatttttaacaaagagaacttctag
SEQ ID NO:22全载体
AGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatcacgagactagcctcgagAAATCAAAATACATCTTATTTGAGGCATTAAAACTTTTTTAAGAAAATAAAATTTAAAATAAAGTTGTATTCTTCTAAAAATAATTTTTTAAACCAGCTGAAAATGAAAAATGCAGATTATACTAAGAAGCAACTGTTTTACATTCTGCTTTCTGAATGGTATTTAAAAACTCAGTTATTTTCAGAAATGAGGAAGTCTTGATCTGCTAGATGAAGGTCGGCTGCAGGTGGTGTTTATTGCTTTATGATGGCAACAAACCGTAAACCCATCACTCAGTAAATATTAAACTGGCTGAATGAATCCAAAGCATGTCTAACATACAGGAAAAACACAGCCCTGTTAAGCAGCCCTTATCTGGGCCTGGAAATCATTTTGCATTTCTACAGTCAAGTCTCCTTTCTGAACAAAAGATACAACATTGAAAACTGTCTTCTGTTTCCTGAAATGTCTACTCACTACCTCACTTTCAACAGATAACCTTGCCCTCTCTTTCACAAAGGAAATGGAAACCACAAAGAGGAAGTCCCTCACCCTGCTGTCCCCAGCCCTACAAATCCTCCTGCATCTGCACTCTGCTCCTTCCCTCTTTTTACAGAGAGGCTTAAAAACCCCCAACTTGCCATGCAGAAACTAATTTCTGTCTGGATGGCAGTCCTAGTCTTAAGATCAGAAAGAAACAGGAAGGTGAGAGGGTGAGGTTTTATCTGTTACCTTATATAGTCTGGGAGTCAGAGGCACTCAGTGTGCCTCTATCTTTAATCACGTGGTCTAGCACTAGTCTCTTGGGCTTTCTGTCTCATAGTTTTTTTTTTTAGTTGAAAAACAGGTCAACTAACACAAATGTAAGAAGGCATATGTTGGTCTAAAAGTATATTAAGCTTTTGAGTTTCTGTAAAGTGTTACACCCCATAAAATATGTACTTCTTTTTAGTTCCACTTCCCATTTTCTTGAAATATTTTTTTCTTACTCAGTTTCAATAGAGCATAGAAATCTGCTGAAGTGACTCAATAATCTCCCTTGCATTAGAATGGTAGTTTATTGAAATCGGGCAAGGCTTCCGGTGACAGTAACAGAGAAACTTCCCTTTAGAAGTCAATGGCAGAAAGTAAAGTAAGTTAGTAAGGAAGCTATGGGGCATGATGGCAACGTGGATAATTGGGAAGTGGCTGGCAATAATTTAGAAGTAACTCAAAGCATATAAATGCAATCTGCCTGATGATGGGGAACAAAAAATTATGGGCAGTCACAGACAGTAAAGTCCTTCCTTCCTATGCCACCAACCGGTTGTCTCGCCTCCTTTTTTAAGGAAGTGGTGAGGATTTAAGTTTGTTATGgatgcaagcttttcagttgaccaatgattattagccaatttctgataaaagaaaaggaaaccgattgccccagggctgctgttttcatttcctcattggaAGAAGAAGCATAGTATAGAAGAAAGGCAAACACAACACATTCAACCTCTGCCACCATGGGCAACTGGGCCGTGAACGAGGGCCTGAGCATCTTCGTGATCCTGGTGTGGCTG GGCCTGAACGTGTTCCTGTTCGTGTGGTACTACCGCGTGTACGACATCCCCCCCAAGTTCTTCTACACCCGCAAGCT GCTGGGCAGCGCCCTGGCCCTGGCCCGCGCCCCCGCCGCCTGCCTGAACTTCAACTGCATGCTGATCCTGCTGCCCG TGTGCCGCAACCTGCTGAGCTTCCTGCGCGGCAGCAGCGCCTGCTGCAGCACCCGCGTGCGCCGCCAGCTGGACCGC AACCTGACCTTCCACAAGATGGTGGCCTGGATGATCGCCCTGCACAGCGCCATCCACACCATCGCCCACCTGTTCAA CGTGGAGTGGTGCGTGAACGCCCGCGTGAACAACAGCGACCCCTACAGCGTGGCCCTGAGCGAGCTGGGCGACCGCC AGAACGAGAGCTACCTGAACTTCGCCCGCAAGCGCATCAAGAACCCCGAGGGCGGCCTGTACCTGGCCGTGACCCTG CTGGCCGGCATCACCGGCGTGGTGATCACCCTGTGCCTGATCCTGATCATCACCAGCAGCACCAAGACCATCCGCCG CAGCTACTTCGAGGTGTTCTGGTACACCCACCACCTGTTCGTGATCTTCTTCATCGGCCTGGCCATCCACGGCGCC
GAGCGCATCGTGCGCGGCCAGACCGCCGAGAGCCTGGCCGTGCACAACATCACCGTGTGCGAGCAGAA GATCAGCGAGTGGGGCAAGATCAAGGAGTGCCCCATCCCCCAGTTCGCCGGCAACCCCCCCATGACCTGGAAGTGG ATCGTGGGCCCCATGTTCCTGTACCTGTGCGAGCGCCTGGTGCGCTTCTGGCGCAGCCAGCAGAAGGTGGTGATCA CCAAGGTGGTGACCCACCCCTTCAAGACCATCGAGCTGCAGATGAAGAAGAAGGGCTTCAAGATGGAGGTGGGCCA GTACATCTTCGTGAAGTGCCCCAAGGTGAGCAAGCTGGAGTGGCACCCCTTCACCCTGACCAGCGCCCCCGAGGAG GACTTCTTCAGCATCCACATCCGCATCGTGGGCGACTGGACCGAGGGCCTGTTCAACGCCTGCGGCTGCGACAAGC AGGAGTTCCAGGACGCCTGGAAGCTGCCCAAGATCGCCGTGGACGGCCCCTTCGGCACCGCCAGCGAGGACGTGTT CAGCTACGAGGTGGTGATGCTGGTGGGCGCCGGCATCGGCGTGACCCCCTTCGCCAGCATCCTGAAGAGCGTGTGG TACAAGTACTGCAACAACGCCACCAACCTGAAGCTGAAGAAGATCTACTTCTACTGGCTGTGCCGCGACACCCACG CCTTCGAGTGGTTCGCCGACCTGCTGCAGCTGCTGGAGAGCCAGATGCAGGAGCGCAACAACGCCGGCTTCCTGAG CTACAACATCTACCTGACCGGCTGGGACGAGAGCCAGGCCAACCACTTCGCCGTGCACCACGACGAGGAGAAGGAC GTGATCACCGGCCTGAAGCAGAAGACCCTGTACGGCCGCCCCAACTGGGACAACGAGTTCAAGACCATCGCCAGCC AGCACCCCAACACCCGCATCGGCGTGTTCCTGTGCGGCCCCGAGGCCCTGGCCGAGACCCTGAGCAAGCAGAGCAT CAGCAACAGCGAGAGCGGCCCCCGCGGCGTGCACTTCATCTTCAACAAGGAGAACTTCTAActgcaggaattcgagcatcttaccgccatttattcccatatttgttctgtttttcttgatttgggtatacatttaaatgttaataaaacaaaatggtggggcaatcatttacatttttagggatatgtaattactagttcaggtgtattgccacaagacaaacatgttaagaaactttcccgttatttacgctctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctcccgatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggaattcgagctcggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacctactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctagggacgtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatagcacctagatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaattattaacgcttacaatttcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcgcgcaattaaccctcactaaagggaacaaaagctggagctgcaagcttggccattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatgg
SEQ ID NO:23CMV:
AGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCG
SEQ ID NO:243’R/U5:
GGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGC
SEQ ID NO:25PSI:
Tcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggag
SEQ ID NO:26RRE:
Tccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacct
SEQ ID NO:27WPRE:
Cccatatttgttctgtttttcttgatttgggtatacatttaaatgttaataaaacaaaatggtggggcaatcatttacatttttagggatatgtaattactagttcaggtgtattgccacaagacaaacatgttaagaaactttcccgttatttacgctctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctcccgatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctgga
SEQ ID NO:28 3’PPT:
tttttaaaagaaaaggggggac
SEQ ID NO:29 3’δU3/R/U5
tggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacctactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGC
SEQ ID NO:30SV40起点:
Atcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctagg
SEQ ID NO:31KANr:
Attgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctga
SEQ ID NO:32COLE1:
agatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcg
序列表
<110> 加州大学董事会(THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA)
唐纳德·B·科恩(KOHN, DONALD B.)
王瑞安·L(WONG, RYAN L.)
罗格·P·霍利斯(HOLLIS, ROGER P.)
<120> 治疗X连锁慢性肉芽肿病的造血干细胞中的慢病毒载体
<130> UCLAP218PUS
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 507
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
tagcacataa aattggcaca tattaagcat tttgtaaata tcaaccatta caattgttac 60
tacttttctc agcaaggcta tgaatgctgt tccagcctgt caaaatcaca cctgtttaat 120
gtgttttacc cagcacgaag tcatgtctag ttgagtggct taaaaattgt gatcaaatag 180
ctggttagtt aaaaagttat ttcactgtgt aaaatacatc ccttaaaatg cactgttatt 240
tatctcttag ttgtagaaat tggtttcatt ttccactatg tttaattgtg actggatcat 300
tatagaccct ttttttgtag ttgttgaggt ttaaagattt aagtttgtta tggatgcaag 360
cttttcagtt gaccaatgat tattagccaa tttctgataa aagaaaagga aaccgattgc 420
cccagggctg ctgttttcat ttcctcattg gaagaagaag catagtatag aagaaaggca 480
aacacaacac attcaacctc tgccacc 507
<210> 2
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 减小的CYBB启动子
<400> 2
tatctcttag ttgtagaaat tggtttcatt ttccactatg tttaattgtg actggatcat 60
tatagaccct ttttttgtag ttgttgaggt ttaaagattt aagtttgtta tggatgcaag 120
cttttcagtt gaccaatgat tattagccaa tttctgataa aagaaaagga aaccgattgc 180
cccagggctg ctgttttcat ttcctcattg gaagaagaag catagtatag aagaaaggca 240
aacacaacac attcaacctc tgccacc 267
<210> 3
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> CYBB减小的增强子元件
<400> 3
tttaagtttg ttatggatgc aagcttttca gttgaccaat gattattagc caatttctga 60
taaaagaaaa ggaaaccgat tgccccaggg ctgctgtttt catttcctca ttggaagaag 120
aagcatagta tagaagaaag gcaaacacaa cacattcaac ctctgccacc 170
<210> 4
<211> 1092
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
gcttagtcat gttggtccca aagtcatagt tgatgagaag tagcaagtta agagagaaag 60
acttctagag ataggtacat acacaatgat aacaagtgac atcagagaac ctaaggaagg 120
gcaaagaaag aaacactgca aagcagactc aaacacttaa aagcatagca gcttggggcc 180
agttagtgta agagaaaagg agctccatat gcctcaatag aacctaagag catcattgta 240
ctgcatttat tcattcattc acttcacatg tttattcaac aaatgctatg tatactgaga 300
tttttctctg gtcattgtac tggctagaac ctaaaggagt gagactatta attagagttt 360
acaatctggc aatgatatta acagtctatt cacaaaaggg ttaactcaag ttaagccggc 420
ctaaatgttt atgcaaaata ggatttttgc ctaagtctaa agggtatcag aaaagtgtag 480
ccattgagaa tgactcattt catggtgttc tcggatggct taagtattat taatatgtct 540
ccatttctag tgcaggaacc tccacgtttt agaggaaagg aggaaagaat ttgtgaagac 600
tgtgcctaaa aaaggtagaa atttgtttac aatttattta aagataaaag taaagaacta 660
ggttgcttta aaaaagggag ggaaagaaaa tcaaaataca tcttatttga ggcattaaaa 720
cttttttaag aaaataaaat ttaaaataaa gttgtattct tctaaaaata attttttaaa 780
ccagctgaaa atgaaaaatg cagattatac taagaagcaa ctgttttaca ttctgctttc 840
tgaatggtat ttaaaaactc agttattttc agaaatgagg aagtcttgat ctgctagatg 900
aaggtcggct gcaggtggtg tttattgctt tatgatggca acaaaccgta aacccatcac 960
tcagtaaata ttaaactggc tgaatgaatc caaagcatgt ctaacataca ggaaaaacac 1020
agccctgtta agcagtcttg aaacccacaa gctacatgga aaacacagat tcaactacat 1080
cataaaaatt ca 1092
<210> 5
<211> 892
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> CYBB减小的增强子元件
<400> 5
gagctccata tgcctcaata gaacctaaga gcatcattgt actgcattta ttcattcatt 60
cacttcacat gtttattcaa caaatgctat gtatactgag atttttctct ggtcattgta 120
ctggctagaa cctaaaggag tgagactatt aattagagtt tacaatctgg caatgatatt 180
aacagtctat tcacaaaagg gttaactcaa gttaagccgg cctaaatgtt tatgcaaaat 240
aggatttttg cctaagtcta aagggtatca gaaaagtgta gccattgaga atgactcatt 300
tcatggtgtt ctcggatggc ttaagtatta ttaatatgtc tccatttcta gtgcaggaac 360
ctccacgttt tagaggaaag gaggaaagaa tttgtgaaga ctgtgcctaa aaaaggtaga 420
aatttgttta caatttattt aaagataaaa gtaaagaact aggttgcttt aaaaaaggga 480
gggaaagaaa atcaaaatac atcttatttg aggcattaaa acttttttaa gaaaataaaa 540
tttaaaataa agttgtattc ttctaaaaat aattttttaa accagctgaa aatgaaaaat 600
gcagattata ctaagaagca actgttttac attctgcttt ctgaatggta tttaaaaact 660
cagttatttt cagaaatgag gaagtcttga tctgctagat gaaggtcggc tgcaggtggt 720
gtttattgct ttatgatggc aacaaaccgt aaacccatca ctcagtaaat attaaactgg 780
ctgaatgaat ccaaagcatg tctaacatac aggaaaaaca cagccctgtt aagcagtctt 840
gaaacccaca agctacatgg aaaacacaga ttcaactaca tcataaaaat tc 892
<210> 6
<211> 347
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> CYBB减小的增强子元件
<400> 6
aaatcaaaat acatcttatt tgaggcatta aaactttttt aagaaaataa aatttaaaat 60
aaagttgtat tcttctaaaa ataatttttt aaaccagctg aaaatgaaaa atgcagatta 120
tactaagaag caactgtttt acattctgct ttctgaatgg tatttaaaaa ctcagttatt 180
ttcagaaatg aggaagtctt gatctgctag atgaaggtcg gctgcaggtg gtgtttattg 240
ctttatgatg gcaacaaacc gtaaacccat cactcagtaa atattaaact ggctgaatga 300
atccaaagca tgtctaacat acaggaaaaa cacagccctg ttaagca 347
<210> 7
<211> 556
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 修饰的CYBB增强子元件
<400> 7
aactgcccag gccatccaca gatgactgta gatacatgtg taagttcagt tcacatcctc 60
agaaccaccc agatgtcctg tagatgcatg agaaatgtta aatgcttgtt gttttaagcc 120
actaacttca gagtagtttg ttatataaca aaaccgctga tgcaaatggc atcaaaaatt 180
gttgaaagag agatgggggt tcagggtgag agctgtaggt gattgtatct gtgctaatac 240
cacatagccc ttttttgggg attgccatga ataatatatt agctttgcta tgagtaaaat 300
actatatcct ctgaattgtc atgaattacg tggagtcata cgtgttttgg aagtgtgaaa 360
gtccctgggc tcagataaaa ggtgttgcca tctggaaagt acaggtagtt tatttcaatt 420
ctgctccaat aactagcacg tcattccatt catgtagaaa taagctactg gctatctcac 480
tatctgaaat agaagtatga actgtgggta agtgggtgag gacaatgtct gagcaaccaa 540
aaaggagctc aaatcc 556
<210> 8
<211> 1744
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> CYBB减小的增强子元件
<400> 8
aaactaatat gaccttataa gaggaggaag ttggggcaca ggcatgtaca cacagaggaa 60
agaccataca gaggaaagac catattaaga taaaggaaga ggatgaccat ctacaagcca 120
agcaaagggg ccccagaagg aaaccaaaca tgctgaaacc ttgatcttga atttgtagct 180
tctaaaactg tgagaaaata aatttctgtt gtttaaaaca tccaggctga ggtactttgt 240
tatggaagcc ctgtcaaact aatgcaacaa catttcctcc cattagattt cttaattcgt 300
gtatagctgg cctgataatg tcttatcagc taccccaact caattgctgc aaatacattt 360
ttaaaagttc tggtggttgt agttgattgc acacttctgt atgagccaat aatgtgaggc 420
aagtctttaa aagggtagca caatcagtct gaggttacac catagatatg gttaaccata 480
gtgtggtctc cataacatag gaagtcaaga tcccccttca ctcttgacca gtcagattgc 540
acctagaaca tttttctcaa ttctgcatac cacatttaaa gaggaagaca aaacccatgc 600
gttgtgcagc taccacatgt cgagcatcag actatgtgca ctgtgtacac ttagtcctcc 660
caccaaccca atgaagatgg tattaatacc cacctcccat tgtacagatg aggagactgg 720
ggctaaatga ggtcaaatag gttgctcaac agagatcttc acctccatgg actcccatag 780
ccacactctg aaccctgtca tctctcagaa gtgcactgct tctgaaatct gcatctcata 840
cacccatcct ctgactacca cctcctgttc cctggcttcc taattcactc acacccaaga 900
tgactgtcct tcaacctcat caaactttga gttctttttg actctttgac tttgctccca 960
tcttgtgttc acttcttggc attctactca tcttagactc agttcacttc tgccattttc 1020
ttgcacaaat cctgaattct ctcatgcagt gcccttctgt accacctgca ggcaaaaacc 1080
aaccctgatc aactcaattg tcctctatac ttgctcgtgg gtgggtaaga aaagctagaa 1140
aagctaccca cagactccta ccattactga tttatgagct ccaggctcaa ctgggccctt 1200
atctgggcct ggaaatcatt ttgcatttct acagtcaagt ctcctttctg aacaaaagat 1260
acaacattga aaactgtctt ctgtttcctg aaatgtctac tcactacctc actttcaaca 1320
gataaccttg ccctctcttt cacaaaggaa atggaaacca caaagaggaa gtccctcacc 1380
ctgctgtccc cagccctaca aatcctcctg catctgcact ctgctccttc cctcttttta 1440
cagagaggag gcccctcctg tctaaagcaa attccatttc cttcctgcct tgggctcaga 1500
aatctcaccc catccaaaat cttccatggt tagcctgtcc ctttgttgcg actctttctc 1560
aatatttaca agctcctata ttttttaaaa taataaaact aggtcctcct ggtgttcaca 1620
tgttttccca attgtagcca agtcctctca ttcttatcac agcctcagac attttgaggt 1680
gtctcactac ctcacctcaa cccacaacat ctggcttccc tcattgtttt ccagtaggcc 1740
cctt 1744
<210> 9
<211> 995
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> CYBB减小的增强子元件
<400> 9
cagagatctt cacctccatg gactcccata gccacactct gaaccctgtc atctctcaga 60
agtgcactgc ttctgaaatc tgcatctcat acacccatcc tctgactacc acctcctgtt 120
ccctggcttc ctaattcact cacacccaag atgactgtcc ttcaacctca tcaaactttg 180
agttcttttt gactctttga ctttgctccc atcttgtgtt cacttcttgg cattctactc 240
atcttagact cagttcactt ctgccatttt cttgcacaaa tcctgaattc tctcatgcag 300
tgcccttctg taccacctgc aggcaaaaac caaccctgat caactcaatt gtcctctata 360
cttgctcgtg ggtgggtaag aaaagctaga aaagctaccc acagactcct accattactg 420
atttatgagc tccaggctca actgggccct tatctgggcc tggaaatcat tttgcatttc 480
tacagtcaag tctcctttct gaacaaaaga tacaacattg aaaactgtct tctgtttcct 540
gaaatgtcta ctcactacct cactttcaac agataacctt gccctctctt tcacaaagga 600
aatggaaacc acaaagagga agtccctcac cctgctgtcc ccagccctac aaatcctcct 660
gcatctgcac tctgctcctt ccctcttttt acagagagga ggcccctcct gtctaaagca 720
aattccattt ccttcctgcc ttgggctcag aaatctcacc ccatccaaaa tcttccatgg 780
ttagcctgtc cctttgttgc gactctttct caatatttac aagctcctat attttttaaa 840
ataataaaac taggtcctcc tggtgttcac atgttttccc aattgtagcc aagtcctctc 900
attcttatca cagcctcaga cattttgagg tgtctcacta cctcacctca acccacaaca 960
tctggcttcc ctcattgttt tccagtaggc ccctt 995
<210> 10
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> CYBB减小的增强子元件
<400> 10
catgcagtgc ccttctgtac cacctgcagg caaaaaccaa ccctgatcaa ctcaattgtc 60
ctctatactt gctcgtgggt gggtaagaaa agctagaaaa gctacccaca gactcctacc 120
attactgatt tatgagctcc aggctcaact gggcccttat ctgggcctgg aaatcatttt 180
gcatttctac agtcaagtct cctttctgaa caaaagatac aacattgaaa actgtcttct 240
gtttcctgaa atgtctactc actacctcac tttcaacaga taaccttgcc ctctctttca 300
caaaggaaat ggaaaccaca aagaggaagt ccctcaccct gctgtcccca gccctacaaa 360
tcctcctgca tctgcactct gctccttccc tctttttaca gagaggaggc ccctcctgtc 420
taaagcaaat tccatttcct tcctgccttg ggctcagaaa tctcacccca tccaaaatct 480
tccatggtta gcctgtccct 500
<210> 11
<211> 254
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> CYBB减小的增强子元件
<400> 11
gcccttatct gggcctggaa atcattttgc atttctacag tcaagtctcc tttctgaaca 60
aaagatacaa cattgaaaac tgtcttctgt ttcctgaaat gtctactcac tacctcactt 120
tcaacagata accttgccct ctctttcaca aaggaaatgg aaaccacaaa gaggaagtcc 180
ctcaccctgc tgtccccagc cctacaaatc ctcctgcatc tgcactctgc tccttccctc 240
tttttacaga gagg 254
<210> 12
<211> 749
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> CYBB减小的增强子元件
<400> 12
aaactaatat gaccttataa gaggaggaag ttggggcaca ggcatgtaca cacagaggaa 60
agaccataca gaggaaagac catattaaga taaaggaaga ggatgaccat ctacaagcca 120
agcaaagggg ccccagaagg aaaccaaaca tgctgaaacc ttgatcttga atttgtagct 180
tctaaaactg tgagaaaata aatttctgtt gtttaaaaca tccaggctga ggtactttgt 240
tatggaagcc ctgtcaaact aatgcaacaa catttcctcc cattagattt cttaattcgt 300
gtatagctgg cctgataatg tcttatcagc taccccaact caattgctgc aaatacattt 360
ttaaaagttc tggtggttgt agttgattgc acacttctgt atgagccaat aatgtgaggc 420
aagtctttaa aagggtagca caatcagtct gaggttacac catagatatg gttaaccata 480
gtgtggtctc cataacatag gaagtcaaga tcccccttca ctcttgacca gtcagattgc 540
acctagaaca tttttctcaa ttctgcatac cacatttaaa gaggaagaca aaacccatgc 600
gttgtgcagc taccacatgt cgagcatcag actatgtgca ctgtgtacac ttagtcctcc 660
caccaaccca atgaagatgg tattaatacc cacctcccat tgtacagatg aggagactgg 720
ggctaaatga ggtcaaatag gttgctcaa 749
<210> 13
<211> 208
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> CYBB减小的增强子元件
<400> 13
agccaataat gtgaggcaag tctttaaaag ggtagcacaa tcagtctgag gttacaccat 60
agatatggtt aaccatagtg tggtctccat aacataggaa gtcaagatcc cccttcactc 120
ttgaccagtc agattgcacc tagaacattt ttctcaattc tgcataccac atttaaagag 180
gaagacaaaa cccatgcgtt gtgcagct 208
<210> 14
<211> 1778
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
gatcatccct ccttgacttc catacatgtg gggattacag gcatgagtca cctgcctggc 60
gagttccttg tttctaagga gacacaattc atttttattc tccctacccc cattagaata 120
gtttctattt agaggaagta aagcctgaga aacaggcaat gttttcacca agatggcctg 180
ttaagaaatc ttggttagtc tacaagtcca aatttcactg ccggtgagca ccatgtccca 240
tgagcagcac atgttgtaat gccagctaga ggtctcaatc attgaaactt tgctttgtaa 300
tccttctggt tacctagaga aagaaagccc cagggttgcc caccccacca ctccaggaaa 360
ggtaggggta aaggctctca gactgctttg ttgagaaaaa tggagaatgg gtgaagctca 420
gcacacaaaa atctctgagg aagccttaaa aacccccaac ttgccatgca gaaactaatt 480
tctgtctgga tggcagtcct agtcttaaga tcagaaagaa acaggaaggt gagagggtga 540
ggttttatct gttaccttat atagtctggg agtcagaggc actcagtgtg cctctatctt 600
taatcacgtg gtctagcact agtctcttgg gctttctgtc tcatagtttt tttttttagt 660
tgaaaaacag gtcaactaac acaaatgtaa gaaggcatat gttggtctaa aagtatatta 720
attgtttaag tctgtcaatt agtgagttgt cagtcaataa atatttgttg agtgccattt 780
atgtgctaag cactggggac atgtggtaag taaagattaa gttatagata ggccatgagc 840
ttaaggagct tagagtgtta acaggagaga cagagaataa atatggaact tccaaattat 900
aaacagtgct atgcaaataa ggtagtgtta ttcatattta tcagatattc tactgccagc 960
aggtgtggat attactgtca acttacttgc ctgagttctg tagattcaaa gttggatttt 1020
gtaatttctc ccagttgcgt ataaatatct aaatcagata cattgatggt gcgtgtggtg 1080
agatcaagtg tacaaaaagt agagcttttg agtttctgta aagtgttaca ccccataaaa 1140
tatgtacttc tttttagttc cacttcccat tttcttgaaa tatttttttc ttactcagtt 1200
tcaatagagc atagaaatct gctgaagtga ctcaataatc tcccttgcat tagaatggta 1260
gtttattgaa atcgggcaag gcttccggtg acagtaacag agaaacttcc ctttagaagt 1320
caatggcaga aagtaaagta agttagtaag gaagctatgg ggcatgatgg caacgtggat 1380
aattgggaag tggctggcaa taatttagaa gtaactcaaa gcatataaat gcaatctgcc 1440
tgatgatggg gaacaaaaaa ttatgggcag tcacagacag taaagtcctt ccttcctatg 1500
ccaccaaccg gttgtctcgc ctcctttttt aaggaagtgg tgaggagatg gtattcttaa 1560
aagcccagta tcagcatgac ttgtggcttc tttttggatt tgtttgccat tcctgtccac 1620
accaaagagg gtaggtggga aaaattaggg atttgtgccc tgatggttgg acccactcca 1680
ctgatccatt agttactagt aatctcactt tttcctttca atataatata tgtgttttac 1740
attaactagc tttttaaaaa ttacctatta agatgaaa 1778
<210> 15
<211> 276
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> CYBB减小的增强子元件
<400> 15
cttaaaaacc cccaacttgc catgcagaaa ctaatttctg tctggatggc agtcctagtc 60
ttaagatcag aaagaaacag gaaggtgaga gggtgaggtt ttatctgtta ccttatatag 120
tctgggagtc agaggcactc agtgtgcctc tatctttaat cacgtggtct agcactagtc 180
tcttgggctt tctgtctcat agtttttttt tttagttgaa aaacaggtca actaacacaa 240
atgtaagaag gcatatgttg gtctaaaagt atatta 276
<210> 16
<211> 444
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> CYBB减小的增强子元件
<400> 16
agcttttgag tttctgtaaa gtgttacacc ccataaaata tgtacttctt tttagttcca 60
cttcccattt tcttgaaata tttttttctt actcagtttc aatagagcat agaaatctgc 120
tgaagtgact caataatctc ccttgcatta gaatggtagt ttattgaaat cgggcaaggc 180
ttccggtgac agtaacagag aaacttccct ttagaagtca atggcagaaa gtaaagtaag 240
ttagtaagga agctatgggg catgatggca acgtggataa ttgggaagtg gctggcaata 300
atttagaagt aactcaaagc atataaatgc aatctgcctg atgatgggga acaaaaaatt 360
atgggcagtc acagacagta aagtccttcc ttcctatgcc accaaccggt tgtctcgcct 420
ccttttttaa ggaagtggtg agga 444
<210> 17
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> Gp91phox (CYBB) cDNA
<400> 17
atggggaact gggctgtgaa tgaggggctc tccatttttg tcattctggt ttggctgggg 60
ttgaacgtct tcctctttgt ctggtattac cgggtttatg atattccacc taagttcttt 120
tacacaagaa aacttcttgg gtcagcactg gcactggcca gggcccctgc agcctgcctg 180
aatttcaact gcatgctgat tctcttgcca gtctgtcgaa atctgctgtc cttcctcagg 240
ggttccagtg cgtgctgctc aacaagagtt cgaagacaac tggacaggaa tctcaccttt 300
cataaaatgg tggcatggat gattgcactt cactctgcga ttcacaccat tgcacatcta 360
tttaatgtgg aatggtgtgt gaatgcccga gtcaataatt ctgatcctta ttcagtagca 420
ctctctgaac ttggagacag gcaaaatgaa agttatctca attttgctcg aaagagaata 480
aagaaccctg aaggaggcct gtacctggct gtgaccctgt tggcaggcat cactggagtt 540
gtcatcacgc tgtgcctcat attaattatc acttcctcca ccaaaaccat ccggaggtct 600
tactttgaag tcttttggta cacacatcat ctctttgtga tcttcttcat tggccttgcc 660
atccatggag ctgaacgaat tgtacgtggg cagaccgcag agagtttggc tgtgcataat 720
ataacagttt gtgaacaaaa aatctcagaa tggggaaaaa taaaggaatg cccaatccct 780
cagtttgctg gaaaccctcc tatgacttgg aaatggatag tgggtcccat gtttctgtat 840
ctctgtgaga ggttggtgcg gttttggcga tctcaacaga aggtggtcat caccaaggtg 900
gtcactcacc ctttcaaaac catcgagcta cagatgaaga agaaggggtt caaaatggaa 960
gtgggacaat acatttttgt caagtgccca aaggtgtcca agctggagtg gcaccctttt 1020
acactgacat ccgcccctga ggaagacttc tttagtatcc atatccgcat cgttggggac 1080
tggacagagg ggctgttcaa tgcttgtggc tgtgataagc aggagtttca agatgcgtgg 1140
aaactaccta agatagcggt tgatgggccc tttggcactg ccagtgaaga tgtgttcagc 1200
tatgaggtgg tgatgttagt gggagcaggg attggggtca cacccttcgc atccattctc 1260
aagtcagtct ggtacaaata ttgcaataac gccaccaatc tgaagctcaa aaagatctac 1320
ttctactggc tgtgccggga cacacatgcc tttgagtggt ttgcagatct gctgcaactg 1380
ctggagagcc agatgcagga aaggaacaat gccggcttcc tcagctacaa catctacctc 1440
actggctggg atgagtctca ggccaatcac tttgctgtgc accatgatga ggagaaagat 1500
gtgatcacag gcctgaaaca aaagactttg tatggacggc ccaactggga taatgaattc 1560
aagacaattg caagtcaaca ccctaatacc agaataggag ttttcctctg tggacctgaa 1620
gccttggctg aaaccctgag taaacaaagc atctccaact ctgagtctgg ccctcgggga 1680
gtgcatttca ttttcaacaa ggaaaacttc taa 1713
<210> 18
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 密码子优化的Gp91phox
<400> 18
atgggcaact gggccgtgaa cgagggcctg agcatcttcg tgatcctggt gtggctgggc 60
ctgaacgtgt tcctgttcgt gtggtactac cgcgtgtacg acatcccccc caagttcttc 120
tacacccgca agctgctggg cagcgccctg gccctggccc gcgcccccgc cgcctgcctg 180
aacttcaact gcatgctgat cctgctgccc gtgtgccgca acctgctgag cttcctgcgc 240
ggcagcagcg cctgctgcag cacccgcgtg cgccgccagc tggaccgcaa cctgaccttc 300
cacaagatgg tggcctggat gatcgccctg cacagcgcca tccacaccat cgcccacctg 360
ttcaacgtgg agtggtgcgt gaacgcccgc gtgaacaaca gcgaccccta cagcgtggcc 420
ctgagcgagc tgggcgaccg ccagaacgag agctacctga acttcgcccg caagcgcatc 480
aagaaccccg agggcggcct gtacctggcc gtgaccctgc tggccggcat caccggcgtg 540
gtgatcaccc tgtgcctgat cctgatcatc accagcagca ccaagaccat ccgccgcagc 600
tacttcgagg tgttctggta cacccaccac ctgttcgtga tcttcttcat cggcctggcc 660
atccacggcg ccgagcgcat cgtgcgcggc cagaccgccg agagcctggc cgtgcacaac 720
atcaccgtgt gcgagcagaa gatcagcgag tggggcaaga tcaaggagtg ccccatcccc 780
cagttcgccg gcaacccccc catgacctgg aagtggatcg tgggccccat gttcctgtac 840
ctgtgcgagc gcctggtgcg cttctggcgc agccagcaga aggtggtgat caccaaggtg 900
gtgacccacc ccttcaagac catcgagctg cagatgaaga agaagggctt caagatggag 960
gtgggccagt acatcttcgt gaagtgcccc aaggtgagca agctggagtg gcaccccttc 1020
accctgacca gcgcccccga ggaggacttc ttcagcatcc acatccgcat cgtgggcgac 1080
tggaccgagg gcctgttcaa cgcctgcggc tgcgacaagc aggagttcca ggacgcctgg 1140
aagctgccca agatcgccgt ggacggcccc ttcggcaccg ccagcgagga cgtgttcagc 1200
tacgaggtgg tgatgctggt gggcgccggc atcggcgtga cccccttcgc cagcatcctg 1260
aagagcgtgt ggtacaagta ctgcaacaac gccaccaacc tgaagctgaa gaagatctac 1320
ttctactggc tgtgccgcga cacccacgcc ttcgagtggt tcgccgacct gctgcagctg 1380
ctggagagcc agatgcagga gcgcaacaac gccggcttcc tgagctacaa catctacctg 1440
accggctggg acgagagcca ggccaaccac ttcgccgtgc accacgacga ggagaaggac 1500
gtgatcaccg gcctgaagca gaagaccctg tacggccgcc ccaactggga caacgagttc 1560
aagaccatcg ccagccagca ccccaacacc cgcatcggcg tgttcctgtg cggccccgag 1620
gccctggccg agaccctgag caagcagagc atcagcaaca gcgagagcgg cccccgcggc 1680
gtgcacttca tcttcaacaa ggagaacttc taa 1713
<210> 19
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 密码子优化的Gp91phox
<400> 19
atgggcaact gggccgtgaa cgagggcctg agcatcttcg tgatcctggt gtggctgggc 60
ctgaacgtgt tcctgttcgt gtggtactac cgggtgtacg acatcccccc caagttcttc 120
tacacccgga agctgctggg cagcgccctg gccctggcca gagcccctgc cgcctgcctg 180
aacttcaact gcatgctgat cctgctgccc gtgtgccgga acctgctgtc cttcctgcgg 240
ggcagcagcg cctgctgcag caccagagtg cggcggcagc tggaccggaa cctgaccttc 300
cacaagatgg tggcctggat gatcgccctg cacagcgcca tccacaccat cgcccacctg 360
ttcaacgtgg agtggtgcgt gaacgcccgg gtgaacaaca gcgaccccta cagcgtggcc 420
ctgagcgagc tgggcgaccg gcagaacgag agctacctga acttcgcccg gaagcggatc 480
aagaaccccg agggcggcct gtacctggcc gtgaccctgc tggccggcat caccggcgtg 540
gtgatcaccc tgtgcctgat cctgatcatc accagcagca ccaagaccat ccggcggagc 600
tacttcgagg tgttctggta cacccaccac ctgttcgtga tctttttcat cggcctggcc 660
atccacggcg ccgagcggat cgtgaggggc cagaccgccg agagcctggc cgtgcacaac 720
atcaccgtgt gcgagcagaa aatcagcgag tggggcaaga tcaaagagtg ccccatcccc 780
cagttcgccg gcaacccccc catgacctgg aagtggatcg tgggccccat gttcctgtac 840
ctgtgcgagc ggctggtgcg gttctggcgg agccagcaga aagtggtgat taccaaggtg 900
gtgacccacc ccttcaagac catcgagctg cagatgaaga aaaagggctt caagatggaa 960
gtgggccagt acatctttgt gaagtgcccc aaggtgtcca agctggaatg gcaccccttc 1020
accctgacca gcgcccctga agaggacttc ttcagcatcc acatcagaat cgtgggcgac 1080
tggaccgagg gcctgttcaa tgcctgcggc tgcgacaagc aggaattcca ggacgcctgg 1140
aagctgccca agatcgccgt ggacggcccc tttggcaccg ccagcgagga cgtgttcagc 1200
tacgaggtgg tgatgctggt cggagccggc atcggcgtga cccccttcgc cagcatcctg 1260
aagagcgtgt ggtacaagta ctgcaacaac gccaccaacc tgaagctgaa gaagatctac 1320
ttctactggc tgtgccggga cacccacgcc ttcgagtggt tcgccgatct gctgcagctg 1380
ctggaaagcc agatgcagga acggaacaac gccggcttcc tgagctacaa catctacctg 1440
accggctggg acgagagcca ggccaaccac ttcgccgtgc accacgacga ggaaaaggac 1500
gtgatcaccg gcctgaagca gaaaaccctg tacggcaggc ccaactggga caacgagttt 1560
aagaccatcg ccagccagca ccccaacacc cggatcggcg tgtttctgtg cggccctgag 1620
gccctggccg agacactgag caagcagagc atcagcaaca gcgagagcgg ccccaggggc 1680
gtgcacttca tcttcaacaa agaaaacttc tga 1713
<210> 20
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 密码子优化的Gp91phox
<400> 20
atgggaaact gggccgtgaa tgagggcctg agcatcttcg tgatcctcgt gtggctgggc 60
ctgaacgtgt tcctgttcgt gtggtactac cgggtgtacg acatccctcc taagttcttc 120
tacacccgga agctgctggg ctctgctctg gctcttgcta gagcaccagc cgcctgcctg 180
aacttcaact gcatgctgat cctgctgcct gtgtgccgga acctgctgag ctttctgaga 240
ggcagcagcg cctgctgtag caccagagtt agacggcagc tggacagaaa cctgaccttc 300
cacaagatgg tggcctggat gatcgccctg cacagcgcca ttcacacaat cgcccacctg 360
ttcaacgtcg agtggtgcgt gaacgccaga gtgaacaaca gcgaccctta cagcgtggcc 420
ctgagcgagc tgggcgatag acagaatgag agctacctga atttcgcccg gaagcggatc 480
aagaaccctg aaggcggact gtacctggcc gtgacactgc tggctggaat cacaggcgtg 540
gtcatcaccc tgtgcctgat cctgatcatc accagcagca ccaagaccat ccggcggagc 600
tacttcgagg tgttctggta cacccaccac ctgtttgtga tctttttcat cggcctggcc 660
atccacggcg ccgagagaat cgttagagga cagacagccg agtctctggc cgtgcacaat 720
atcaccgtgt gcgagcagaa aatcagcgag tggggcaaga tcaaagagtg ccccattcct 780
cagttcgccg gcaatcctcc tatgacctgg aagtggatcg tgggccccat gttcctgtac 840
ctgtgcgaaa gactcgtgcg gttctggcgg agccagcaga aggtggtcat taccaaggtc 900
gtgacacacc cctttaagac catcgagctg cagatgaaga aaaagggctt caagatggaa 960
gtgggccagt acatctttgt gaagtgcccc aaggtgtcca agctggaatg gcaccccttc 1020
acactgacaa gcgcccctga agaggacttc ttcagcatcc acatccggat cgtcggcgat 1080
tggaccgagg gcctgtttaa tgcctgcggc tgcgacaagc aagagttcca ggatgcttgg 1140
aagctgccca agatcgccgt ggacggacct tttggaacag ccagcgagga cgtgttcagc 1200
tacgaggtcg tgatgctcgt tggagccggc atcggcgtga caccttttgc cagcatcctg 1260
aagtctgtgt ggtacaagta ctgcaacaac gccaccaacc tgaagctcaa gaagatctac 1320
ttctactggc tgtgccggga cacccacgcc tttgagtggt tcgctgatct cctgcagctg 1380
ctggaaagcc agatgcaaga gagaaacaac gccggcttcc tgagctacaa catctacctg 1440
accggctggg atgagagcca ggccaatcac tttgccgtgc accacgacga agagaaggac 1500
gtgatcaccg gcctgaagca gaaaaccctg tacggcagac ccaactggga caacgagttc 1560
aagacaatcg cctctcagca ccccaatacc agaatcggag tgtttctgtg cggccctgag 1620
gctctggccg aaacactgag caagcagagc atcagcaaca gcgagtctgg ccctagaggc 1680
gtgcacttca tcttcaacaa agagaacttc tga 1713
<210> 21
<211> 1713
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 密码子优化的Gp91phox
<400> 21
atgggtaact gggcagtgaa cgaggggctt tctatctttg tcatactcgt gtggcttggc 60
ctcaacgtgt tcttgttcgt ctggtactac cgagtgtacg acattcctcc taaattcttt 120
tacacacgca aactccttgg gtctgctttg gcgctcgctc gggcacctgc agcgtgcctg 180
aattttaact gtatgctgat cctccttcct gtgtgccgaa accttctttc attcctgcga 240
ggtagttccg cttgctgctc aactcgggtg cgcaggcagc ttgaccgcaa cctgacgttc 300
cataagatgg tagcatggat gattgcgttg cattccgcga tccacactat cgcgcacctc 360
tttaacgtgg aatggtgtgt aaacgcgaga gtaaataaca gcgacccata ctctgtagca 420
ctttccgaac ttggagaccg gcagaacgaa tcttacctta acttcgctag gaagagaatt 480
aaaaacccag aaggtggcct ttatctcgcg gttacgctgc ttgctggcat taccggcgtt 540
gtcataactc tctgtttgat acttataatt acaagctcca ccaagactat aagacgatcc 600
tactttgaag tcttctggta cacgcaccac ctgttcgtaa ttttctttat aggactggct 660
attcacggtg cggaaaggat tgtacgaggt cagacagctg aatccctcgc ggtgcacaac 720
attacggtat gcgagcagaa gataagtgag tggggaaaaa ttaaagagtg ccccatacca 780
cagttcgccg gcaatccacc aatgacatgg aagtggatcg tgggcccaat gttcctctac 840
ctgtgtgagc gccttgtaag gttttggcga agccaacaga aagtagtgat aacgaaagta 900
gttacacacc cgttcaagac aatagagctc cagatgaaaa aaaaaggctt caagatggaa 960
gtcggtcaat acatattcgt gaagtgcccg aaagtctcaa agttggaatg gcacccattc 1020
actctcacat cagcgcctga agaagacttt ttctccattc atattcgcat tgtgggcgat 1080
tggacggaag ggctctttaa cgcttgcggg tgtgataaac aagagtttca agacgcatgg 1140
aaattgccta agatagcagt tgatggcccg ttcggaaccg ccagcgaaga tgttttcagt 1200
tacgaggtcg tcatgctcgt tggtgctgga atcggagtta ctccgtttgc ttccatactt 1260
aagagcgtct ggtacaaata ttgtaataat gccaccaatt tgaaactcaa gaagatttac 1320
ttttattggt tgtgtaggga tactcacgct ttcgaatggt tcgcagacct tctccagctc 1380
cttgaaagcc aaatgcagga acgaaataac gcaggatttt tgagctacaa tatatacctt 1440
acgggttggg acgaatctca ggctaatcat ttcgcggtac accatgatga agaaaaggat 1500
gttataacgg gtttgaaaca aaaaacactc tatggacgac ctaactggga taatgaattt 1560
aaaacaatcg ccagccaaca tcctaacacc cggattggag ttttcctgtg cgggccagag 1620
gcactcgcgg agacgctgag taaacaatca attagcaact ctgagtccgg gccacgcggg 1680
gtgcatttta tttttaacaa agagaacttc tag 1713
<210> 22
<211> 9854
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 慢病毒载体
<400> 22
agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 60
gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 120
gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 180
atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 240
cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 300
ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 360
cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 420
atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 480
ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgg ggtctctctg 540
gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 600
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 660
taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 720
aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 780
gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 840
actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 900
attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 960
aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 1020
gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 1080
tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 1140
atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 1200
aagaccaccg cacagcaagc ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga 1260
caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc 1320
acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc 1380
tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct 1440
gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag 1500
ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca 1560
ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg 1620
ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa 1680
atctctggaa cagatttgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1740
ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1800
acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1860
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1920
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1980
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 2040
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 2100
aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 2160
aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaaa ttcaaaattt 2220
tatcgatcac gagactagcc tcgagaaatc aaaatacatc ttatttgagg cattaaaact 2280
tttttaagaa aataaaattt aaaataaagt tgtattcttc taaaaataat tttttaaacc 2340
agctgaaaat gaaaaatgca gattatacta agaagcaact gttttacatt ctgctttctg 2400
aatggtattt aaaaactcag ttattttcag aaatgaggaa gtcttgatct gctagatgaa 2460
ggtcggctgc aggtggtgtt tattgcttta tgatggcaac aaaccgtaaa cccatcactc 2520
agtaaatatt aaactggctg aatgaatcca aagcatgtct aacatacagg aaaaacacag 2580
ccctgttaag cagcccttat ctgggcctgg aaatcatttt gcatttctac agtcaagtct 2640
cctttctgaa caaaagatac aacattgaaa actgtcttct gtttcctgaa atgtctactc 2700
actacctcac tttcaacaga taaccttgcc ctctctttca caaaggaaat ggaaaccaca 2760
aagaggaagt ccctcaccct gctgtcccca gccctacaaa tcctcctgca tctgcactct 2820
gctccttccc tctttttaca gagaggctta aaaaccccca acttgccatg cagaaactaa 2880
tttctgtctg gatggcagtc ctagtcttaa gatcagaaag aaacaggaag gtgagagggt 2940
gaggttttat ctgttacctt atatagtctg ggagtcagag gcactcagtg tgcctctatc 3000
tttaatcacg tggtctagca ctagtctctt gggctttctg tctcatagtt ttttttttta 3060
gttgaaaaac aggtcaacta acacaaatgt aagaaggcat atgttggtct aaaagtatat 3120
taagcttttg agtttctgta aagtgttaca ccccataaaa tatgtacttc tttttagttc 3180
cacttcccat tttcttgaaa tatttttttc ttactcagtt tcaatagagc atagaaatct 3240
gctgaagtga ctcaataatc tcccttgcat tagaatggta gtttattgaa atcgggcaag 3300
gcttccggtg acagtaacag agaaacttcc ctttagaagt caatggcaga aagtaaagta 3360
agttagtaag gaagctatgg ggcatgatgg caacgtggat aattgggaag tggctggcaa 3420
taatttagaa gtaactcaaa gcatataaat gcaatctgcc tgatgatggg gaacaaaaaa 3480
ttatgggcag tcacagacag taaagtcctt ccttcctatg ccaccaaccg gttgtctcgc 3540
ctcctttttt aaggaagtgg tgaggattta agtttgttat ggatgcaagc ttttcagttg 3600
accaatgatt attagccaat ttctgataaa agaaaaggaa accgattgcc ccagggctgc 3660
tgttttcatt tcctcattgg aagaagaagc atagtataga agaaaggcaa acacaacaca 3720
ttcaacctct gccaccatgg gcaactgggc cgtgaacgag ggcctgagca tcttcgtgat 3780
cctggtgtgg ctgggcctga acgtgttcct gttcgtgtgg tactaccgcg tgtacgacat 3840
cccccccaag ttcttctaca cccgcaagct gctgggcagc gccctggccc tggcccgcgc 3900
ccccgccgcc tgcctgaact tcaactgcat gctgatcctg ctgcccgtgt gccgcaacct 3960
gctgagcttc ctgcgcggca gcagcgcctg ctgcagcacc cgcgtgcgcc gccagctgga 4020
ccgcaacctg accttccaca agatggtggc ctggatgatc gccctgcaca gcgccatcca 4080
caccatcgcc cacctgttca acgtggagtg gtgcgtgaac gcccgcgtga acaacagcga 4140
cccctacagc gtggccctga gcgagctggg cgaccgccag aacgagagct acctgaactt 4200
cgcccgcaag cgcatcaaga accccgaggg cggcctgtac ctggccgtga ccctgctggc 4260
cggcatcacc ggcgtggtga tcaccctgtg cctgatcctg atcatcacca gcagcaccaa 4320
gaccatccgc cgcagctact tcgaggtgtt ctggtacacc caccacctgt tcgtgatctt 4380
cttcatcggc ctggccatcc acggcgccga gcgcatcgtg cgcggccaga ccgccgagag 4440
cctggccgtg cacaacatca ccgtgtgcga gcagaagatc agcgagtggg gcaagatcaa 4500
ggagtgcccc atcccccagt tcgccggcaa cccccccatg acctggaagt ggatcgtggg 4560
ccccatgttc ctgtacctgt gcgagcgcct ggtgcgcttc tggcgcagcc agcagaaggt 4620
ggtgatcacc aaggtggtga cccacccctt caagaccatc gagctgcaga tgaagaagaa 4680
gggcttcaag atggaggtgg gccagtacat cttcgtgaag tgccccaagg tgagcaagct 4740
ggagtggcac cccttcaccc tgaccagcgc ccccgaggag gacttcttca gcatccacat 4800
ccgcatcgtg ggcgactgga ccgagggcct gttcaacgcc tgcggctgcg acaagcagga 4860
gttccaggac gcctggaagc tgcccaagat cgccgtggac ggccccttcg gcaccgccag 4920
cgaggacgtg ttcagctacg aggtggtgat gctggtgggc gccggcatcg gcgtgacccc 4980
cttcgccagc atcctgaaga gcgtgtggta caagtactgc aacaacgcca ccaacctgaa 5040
gctgaagaag atctacttct actggctgtg ccgcgacacc cacgccttcg agtggttcgc 5100
cgacctgctg cagctgctgg agagccagat gcaggagcgc aacaacgccg gcttcctgag 5160
ctacaacatc tacctgaccg gctgggacga gagccaggcc aaccacttcg ccgtgcacca 5220
cgacgaggag aaggacgtga tcaccggcct gaagcagaag accctgtacg gccgccccaa 5280
ctgggacaac gagttcaaga ccatcgccag ccagcacccc aacacccgca tcggcgtgtt 5340
cctgtgcggc cccgaggccc tggccgagac cctgagcaag cagagcatca gcaacagcga 5400
gagcggcccc cgcggcgtgc acttcatctt caacaaggag aacttctaac tgcaggaatt 5460
cgagcatctt accgccattt attcccatat ttgttctgtt tttcttgatt tgggtataca 5520
tttaaatgtt aataaaacaa aatggtgggg caatcattta catttttagg gatatgtaat 5580
tactagttca ggtgtattgc cacaagacaa acatgttaag aaactttccc gttatttacg 5640
ctctgttcct gttaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctgatattct 5700
taactatgtt gctcctttta cgctgtgtgg atatgctgct ttaatgcctc tgtatcatgc 5760
tattgcttcc cgtacggctt tcgttttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct 5820
ttatgaggag ttgtggcccg ttgtccgtca acgtggcgtg gtgtgctctg tgtttgctga 5880
cgcaaccccc actggctggg gcattgccac cacctgtcaa ctcctttctg ggactttcgc 5940
tttccccctc ccgatcgcca cggcagaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac 6000
aggggctagg ttgctgggca ctgataattc cgtggtgttg tcggggaagg gcctgctgcc 6060
ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg 6120
ggccgcctcc ccgcctggaa ttcgagctcg gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggca 6180
gctgtagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac tggaagggct aattcactcc 6240
caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 6300
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ctactgctta agcctcaata aagcttgcct 6360
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 6420
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtagta gttcatgtca tcttattatt 6480
cagtatttat aacttgcaaa gaaatgaata tcagagagtg agaggaactt gtttattgca 6540
gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt 6600
tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggctc 6660
tagctatccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt 6720
ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct 6780
ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctagggacg tacccaattc 6840
gccctatagt gagtcgtatt acgcgcgctc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 6900
ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 6960
gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg 7020
cgaatgggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 7080
cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 7140
tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 7200
ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 7260
tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 7320
taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 7380
tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 7440
aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttaggtgg cacttttcgg 7500
ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 7560
ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatagc acctagatca agagacagga 7620
tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg 7680
gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc 7740
gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt 7800
gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt 7860
ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc 7920
gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc 7980
atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac 8040
caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag 8100
gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag 8160
gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat 8220
atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg 8280
gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa 8340
tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc 8400
ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attattaacg cttacaattt cctgatgcgg 8460
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tcaggtggca cttttcgggg 8520
aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 8580
catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 8640
gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 8700
aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 8760
gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta 8820
gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 8880
gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 8940
atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 9000
cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 9060
cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 9120
agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 9180
tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 9240
gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 9300
catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 9360
agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 9420
ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 9480
ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 9540
ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 9600
tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa 9660
gcgcgcaatt aaccctcact aaagggaaca aaagctggag ctgcaagctt ggccattgca 9720
tacgttgtat ccatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc 9780
atgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca 9840
tagcccatat atgg 9854
<210> 23
<211> 529
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> CMV启动子
<400> 23
agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 60
gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 120
gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 180
atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 240
cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 300
ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 360
cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 420
atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 480
ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccg 529
<210> 24
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 慢病毒载体组分
<400> 24
gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60
ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 120
tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 180
<210> 25
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 慢病毒载体中的包装信号
<400> 25
tcgacgcagg actcggcttg ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt 60
gagtacgcca aaaattttga ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt 120
cagtattaag cgggggag 138
<210> 26
<211> 205
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 慢病毒载体中的RRE
<400> 26
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 60
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 120
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 180
gaatcctggc tgtggaaaga tacct 205
<210> 27
<211> 656
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 慢病毒载体中的WPRE
<400> 27
cccatatttg ttctgttttt cttgatttgg gtatacattt aaatgttaat aaaacaaaat 60
ggtggggcaa tcatttacat ttttagggat atgtaattac tagttcaggt gtattgccac 120
aagacaaaca tgttaagaaa ctttcccgtt atttacgctc tgttcctgtt aatcaacctc 180
tggattacaa aatttgtgaa agattgactg atattcttaa ctatgttgct ccttttacgc 240
tgtgtggata tgctgcttta atgcctctgt atcatgctat tgcttcccgt acggctttcg 300
ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg 360
tccgtcaacg tggcgtggtg tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact ggctggggca 420
ttgccaccac ctgtcaactc ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg atcgccacgg 480
cagaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctaggttg ctgggcactg 540
ataattccgt ggtgttgtcg gggaagggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc 600
ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg cctgga 656
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 慢病毒载体中的PPT
<400> 28
tttttaaaag aaaagggggg ac 22
<210> 29
<211> 233
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 慢病毒载体组分
<400> 29
tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ctactgctta 120
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agc 233
<210> 30
<211> 140
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> SV40复制起点
<400> 30
atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt 60
tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga 120
ggcttttttg gaggcctagg 140
<210> 31
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 耐药基因
<400> 31
attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc 60
tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg 120
caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa 180
gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc 240
gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat 300
ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg 360
cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc 420
gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag 480
catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc 540
gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc 600
cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata 660
gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc 720
gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac 780
gagttcttct ga 792
<210> 32
<211> 620
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 耐药基因
<400> 32
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 60
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 120
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 180
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 240
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 300
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 360
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 420
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 480
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 540
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 600
ggaaaaacgc cagcaacgcg 620

Claims (70)

1.一种用于治疗慢性肉芽肿病的重组慢病毒载体(LV)，所述载体包含：
包含核酸构建体的表达盒，所述核酸构建体包含：
CYBB启动子或其有效片段；和
与所述CYBB启动子或启动子片段可操作连接的编码gp91phox的核酸。
2.如权利要求1所述的载体，其中所述CYBB启动子或其有效片段包含全长内源性CYBB启动子(SEQ ID NO:1)。
3.如权利要求1所述的载体，其中所述CYBB启动子包含CYBB启动子的有效片段，其中所述片段包含最小CYBB启动子(核心)(SEQ ID NO:2)或由其组成。
4.如权利要求3所述的载体，其中所述CYBB启动子包含CYBB启动子的有效片段，其中所述片段由最小CYBB启动子(核心)(SEQ ID NO:2)组成。
5.如权利要求1所述的载体，其中所述CYBB启动子包含CYBB启动子的有效片段，其中所述片段包含最小CYBB启动子(超核心)(SEQ ID NO:3)或由其组成。
6.如权利要求5所述的载体，其中所述CYBB启动子包含CYBB启动子的有效片段，所述有效片段的序列由最小CYBB启动子(超核心)(SEQ ID NO:3)组成。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含子增强子元件2(SEQID NO:4)或其有效片段。
8.如权利要求7所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2核心(SEQ ID NO:5)或由其组成。
9.如权利要求8所述的载体，其中所述增强子元件2的有效片段的序列由增强子元件2核心的序列(SEQ ID NO:5)组成。
10.如权利要求7所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件2的有效片段，其中所述片段包含增强子元件2超核心(SEQ ID NO:6)或由其组成。
11.如权利要求10所述的载体，其中所述增强子元件2的有效片段的序列由增强子元件2超核心的序列(SEQ ID NO:6)组成。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的载体，其中所述表达盒进一步包含RELA TF结合位点或其有效片段。
13.如权利要求12所述的载体，其中所述RELA TF结合位点包含SEQ ID NO:7的核酸序列或由其组成。
14.根据权利要求1-11中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4或其有效片段。
15.如权利要求14所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4R或其有效片段。
16.如权利要求15所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4R的有效片段，其中所述片段的核酸序列包含增强子元件4R核心的核酸序列(SEQ ID NO:10)或由其组成。
17.如权利要求15所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4R的有效片段，其中所述片段的核酸序列包含增强子元件4R超核心的核酸序列(SEQ ID NO:11)或由其组成。
18.如权利要求16所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4R的有效片段，其中所述片段的核酸序列由增强子元件4R超核心的核酸序列(SEQ ID NO:11)组成。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4L或其有效片段。
20.如权利要求19所述的载体，其中所述表达盒包含增强子元件4L的有效片段，其中所述片段包含4L核心序列(SEQ ID NO:13)的序列或由其组成。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含内含子增强子元件3(SEQ ID NO:14)或其有效片段。
22.如权利要求21所述的载体，其中所述表达盒包含内含子增强子元件3中间片段，所述中间片段包含SEQ ID NO:15的核酸序列或由其组成。
23.根据权利要求21-22中任一项所述的载体，其中所述表达盒包含内含子增强子元件3右片段，所述右片段包含SEQ ID NO:16的核酸序列或由其组成。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的载体，其中编码编码gp91phox的核酸的所述核酸是CYBB cDNA或密码子优化的CYBB。
25.如权利要求24所述的载体，其中所述编码gp91phox的核酸是CYBB cDNA(SEQ ID NO:17)。
26.如权利要求24所述的载体，其中所述编码gp91phox的核酸是密码子优化的CYBB。
27.如权利要求26所述的载体，其中所述编码gp91phox的核酸的序列是选自由以下组成的组的密码子优化的CYBB：jCAT密码子优化的CYBB(SEQ ID NO:18)、GeneArt优化的CYBB(SEQ ID NO:20)、IDT优化的CYBB(SEQ ID NO:21)和先前的临床候选物(SEQ ID NO:19)。
28.如权利要求26所述的载体，其中所述编码gp91phox的核酸的序列是jCAT密码子优化的CYBB(SEQ ID NO:18)。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的载体，其中所述载体包含ψ区载体基因组包装信号。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的载体，其中所述载体包含含CMV增强子/启动子的5'LTR。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的载体，其中所述载体包含Rev响应元件(RRE)。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的载体，其中所述载体包含中央多嘌呤束。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的载体，其中所述载体包含翻译后调控元件。
34.如权利要求33所述的载体，其中所述转录后调控元件是修饰的土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的载体，其中所述载体不能通过重组使野生型慢病毒重构。
36.如权利要求1所述的载体，其中所述载体包含图19中所示的全尺寸2-4R-Int3-pro-mCit-WPRE的特征，其中所述mCit被替换为编码Gp91phox的核酸。
37.如权利要求1所述的载体，其中所述载体包含图20的图A中所示的UC2-4R-Int3-pro-coGp91phox-WRPE的特征。
38.如权利要求37所述的载体，其中所述载体包含在图20的图B中表示的载体中所示的特征。
39.如权利要求38所述的载体，其中所述载体包含超核心(UC)2-4R-Int3-Pro-(GP91-jcat)-WPRE(SEQ ID NO:22)的核苷酸序列。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的载体，其中所述载体显示在CD33+(大量髓系细胞)中高表达、在CD19+(B细胞)中高表达、在CD66b+CD15+CD11b+CD16+(成熟嗜中性粒细胞)中高表达以及在CD3+T细胞中低表达或无表达。
41.一种用根据权利要求1-40中任一项所述的载体转导的宿主细胞。
42.如权利要求41所述的宿主细胞，其中所述细胞是干细胞。
43.如权利要求42所述的宿主细胞，其中所述细胞是来源于骨髓、和/或来源于脐带血、和/或来源于外周血的干细胞。
44.如权利要求41所述的宿主细胞，其中所述细胞是人类造血祖细胞。
45.如权利要求44所述的宿主细胞，其中所述人类造血祖细胞是CD34+细胞。
46.一种治疗受试者中的慢性肉芽肿病(X-CGD)的方法，所述方法包括：
用根据权利要求1-40中任一项所述的载体转导来自所述受试者的干细胞和/或祖细胞；和
将从其来源的所述一个或多个转导的细胞移植到所述受试者中，其中所述细胞或其衍生物表达所述Gp91phox。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述细胞是干细胞。
48.如权利要求46所述的宿主细胞，其中所述细胞来源于骨髓的干细胞。
49.如权利要求46所述的方法，其中所述细胞是人类造血干细胞和祖细胞。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述人类造血祖细胞是CD34+细胞。
51.一种编码以下的一者或多者的重组核酸：
CYBB启动子或其有效片段；和/或
CYBB内源性增强子元件2(CYBB B细胞增强子)或其有效片段；和/或
CYBB内源性增强子4R(CYBB内源性髓样增强子)或其有效片段；和/或
CYBB内源性增强子4L或其有效片段；和/或
CYBB内源性髓样内含子3增强子或其有效片段；和/或
编码Gp91phox的经密码子优化的核酸。
52.如权利要求51所述的核酸，其中所述核酸编码包含全长内源性CYBB启动子(SEQ IDNO:1)或由其组成的序列。
53.如权利要求51所述的核酸，其中所述核酸编码包含CYBB启动子的有效片段的序列，其中所述片段包含最小CYBB启动子(核心)(SEQ ID NO:2)或由其组成。
54.如权利要求53所述的核酸，其中所述核酸编码包含CYBB启动子的有效片段的序列，其中所述片段由最小CYBB启动子(核心)(SEQ ID NO:2)组成。
55.如权利要求51所述的核酸，其中所述核酸编码包含CYBB启动子的有效片段的序列，其中所述片段包含最小CYBB启动子(超核心)(SEQ ID NO:3)或由其组成。
56.如权利要求55所述的核酸，其中所述核酸编码包含CYBB启动子的有效片段的序列，其中所述片段由最小CYBB启动子(超核心)(SEQ ID NO:3)组成。
57.根据权利要求51-56中任一项所述的核酸，其中所述核酸编码CYBB内源性增强子元件2(CYBB B细胞增强子)的有效片段。
58.如权利要求57所述的核酸，其中所述CYBB内源性增强子2的核酸序列包含增强子元件2核心的序列(SEQ ID NO:5)或由其组成。
59.如权利要求57所述的核酸，其中所述CYBB内源性增强子元件2的核酸序列包含增强子元件2超核心的序列(SEQ ID NO:6)或由其组成。
60.根据权利要求51-59中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含CYBB内源性增强子4R(CYBB内源性髓样增强子)的有效片段。
61.如权利要求60所述的核酸，其中所述CYBB内源性增强子4R的有效片段的核酸序列包含增强子元件4R超核心的序列(SEQ ID NO:10)或由其组成。
62.根据权利要求51-61中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含增强子元件4L的有效片段。
63.如权利要求62所述的核酸，其中所述增强子元件4L的有效片段包含4L核心序列(SEQ ID NO:13)的序列或由其组成。
64.根据权利要求51-63中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含CYBB内源性髓样内含子3增强子的有效片段。
65.如权利要求64所述的核酸，其中所述CYBB内源性髓样内含子3增强子的有效片段的核酸序列包含元件3中间片段核酸序列(SEQ ID NO:15)或由其组成。
66.根据权利要求64-65中任一项所述的核酸，其中所述CYBB内源性髓样内含子3增强子的有效片段的核酸序列包含内含子增强子元件3右片段(SEQ ID NO:16)或由其组成。
67.根据权利要求51-66中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含jCAT密码子优化的CYBB(SEQ ID NO:18)。
68.根据权利要求51-67中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含表达盒。
69.如权利要求68所述的核酸，其中所述表达盒有效地在体内表达Gp91phox。
70.根据权利要求51-69中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含根据权利要求1-40中任一项所述的慢病毒载体。
CN202080086551.8A 2019-11-12 2020-11-12 治疗x连锁慢性肉芽肿病的造血干细胞中的慢病毒载体 Pending CN114829614A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962934352P 2019-11-12 2019-11-12
US62/934,352 2019-11-12
PCT/US2020/060263 WO2021097109A1 (en) 2019-11-12 2020-11-12 Lentiviral vectors in hematopoietic stem cells to treat x-linked chronic granulomatous disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114829614A true CN114829614A (zh) 2022-07-29

Family

ID=75912844

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080086551.8A Pending CN114829614A (zh) 2019-11-12 2020-11-12 治疗x连锁慢性肉芽肿病的造血干细胞中的慢病毒载体

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220378937A1 (zh)
EP (1) EP4058068A4 (zh)
JP (1) JP2023502593A (zh)
KR (1) KR20220097487A (zh)
CN (1) CN114829614A (zh)
AU (1) AU2020384286A1 (zh)
CA (1) CA3161175A1 (zh)
WO (1) WO2021097109A1 (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030138954A1 (en) * 2001-10-02 2003-07-24 Didier Trono Methods and compositions relating to restricted expression lentiviral vectors and their applications
US20070161031A1 (en) * 2005-12-16 2007-07-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Functional arrays for high throughput characterization of gene expression regulatory elements
CN109971787A (zh) * 2019-04-17 2019-07-05 北京美康基免生物科技有限公司 一种cybb慢病毒载体、慢病毒载体转染的干细胞及其制备方法和应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070054278A1 (en) * 2003-11-18 2007-03-08 Applera Corporation Polymorphisms in nucleic acid molecules encoding human enzyme proteins, methods of detection and uses thereof
US8088976B2 (en) * 2005-02-24 2012-01-03 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of plant pest infestation and compositions thereof
EP2019134A1 (en) * 2007-07-26 2009-01-28 Vision 7 GmbH Gene therapy of chronic granulomatous disease
BRPI1010873B1 (pt) * 2009-04-30 2020-04-14 Fond Centro San Raffaele Del Monte Tabor usos de um vetor de genes, de uma composição farmacêutica e de uma célula
EP3452101A2 (en) * 2016-05-04 2019-03-13 CureVac AG Rna encoding a therapeutic protein
WO2018045266A1 (en) * 2016-09-02 2018-03-08 Senlin Li Methods and compositions for treating chronic granulomatous disease

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030138954A1 (en) * 2001-10-02 2003-07-24 Didier Trono Methods and compositions relating to restricted expression lentiviral vectors and their applications
CN1606456A (zh) * 2001-10-02 2005-04-13 克雷顿研究院 限制性表达慢病毒载体
US20070161031A1 (en) * 2005-12-16 2007-07-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Functional arrays for high throughput characterization of gene expression regulatory elements
CN109971787A (zh) * 2019-04-17 2019-07-05 北京美康基免生物科技有限公司 一种cybb慢病毒载体、慢病毒载体转染的干细胞及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孟凡荣 等: "慢病毒载体及其研究进展", 中国肺癌杂志, vol. 17, no. 12, pages 870 - 876 *
黄丽莲 等: "慢性肉芽肿病的诊治研究进展", 内科, no. 2, pages 68 - 72 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220378937A1 (en) 2022-12-01
JP2023502593A (ja) 2023-01-25
CA3161175A1 (en) 2021-05-20
EP4058068A4 (en) 2024-03-13
AU2020384286A1 (en) 2022-06-09
EP4058068A1 (en) 2022-09-21
KR20220097487A (ko) 2022-07-07
WO2021097109A1 (en) 2021-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11672874B2 (en) Methods and compositions for genomic integration
US20220220188A1 (en) Compositions and methods of chimeric alloantigen receptor t cells
KR102628872B1 (ko) 세포의 증식을 제어하기 위해 세포 분열 좌위를 사용하기 위한 도구 및 방법
KR20160102024A (ko) 아데노바이러스 및 상응하는 플라스미드의 제조 방법
JP2022160505A (ja) ファンコニ貧血患者に対する遺伝子療法
KR20230041028A (ko) SARS-CoV-2 면역원성 조성물, 백신 및 방법
KR20220130093A (ko) 오토펄린 듀얼 벡터 시스템을 사용한 감각신경성 난청을 치료하기 위한 조성물 및 방법
CN112522321B (zh) 一种基因治疗载体及其用途
KR20240004253A (ko) 오토펄린 듀얼 벡터 시스템을 사용한 감각신경성 난청을 치료하기 위한 방법
CN115362000A (zh) 使用多核苷酸沉默和替换的神经退行性病症的基因疗法
CN114829614A (zh) 治疗x连锁慢性肉芽肿病的造血干细胞中的慢病毒载体
KR20240037192A (ko) 게놈 통합을 위한 방법 및 조성물
US20230220417A1 (en) Lentiviral System
KR20220115943A (ko) 재조합 활성화 유전자 1 (rag1) 중증 복합 면역결핍증 (scid) 을 치료하기 위한 조혈 줄기 세포에서의 렌티바이러스 벡터
CN116323942A (zh) 用于基因组编辑的组合物及其使用方法
CN117120085A (zh) Sars-cov-2免疫原性组合物、疫苗和方法
KR20220113944A (ko) Wiskott-aldrich 증후군 (was) 치료를 위한 조혈 줄기 세포에서 렌티바이러스 벡터
KR20240004433A (ko) Ert2 돌연변이체 및 이의 용도
KR20200086649A (ko) Runx3 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 함유하는 K-Ras 돌연변이 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물
JP2016067356A (ja) レンチウイルスベクター製造用核酸

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40082768

Country of ref document: HK