KR20220095681A - 브루셀라 캐니스 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 브루셀라 캐니스 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 브루셀라 캐니스 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트는 브루셀라 캐니스의 유전자형(sequence type, ST)을 신속하고 정확하게 감별할 수 있는바, 브루셀라 캐니스의 동정 및 진단 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 브루셀라 캐니스 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다.
브루셀라병은 브루셀라균(Brucella)에 의해 소, 돼지, 산양, 면양, 개 등 대부분의 동물에 감염되어 유산, 불임 등 주로 생식기 장애를 일으키는 전염병으로 전세계적으로 발생하면서 축산업에 막대한 경제적 손실을 초래한다. 이 질병은 사람에게도 감염되는 인수공통 전염병으로 주로 축주, 수의사, 도축장 종사자 등 가축과 관련된 직업 종사자들에게 많이 발생하는 직업병으로 알려져 있으며, 주기적인 발열, 두통, 식욕부진 등 감기와 같은 증상을 보이다가 만성으로 지속될수록 심내막염, 뇌척수염, 관절염 등 중증 질병으로 진행하게 되며 1-3% 미만의 치사율을 보이고 있다. 현재 국내에서도 동물뿐만 아니라 사람에서도 브루셀라병이 발생하고 있으며 감염된 동물으로부터 사람으로 브루셀라균이 전파되는 것을 막기 위한 대책이 시급한 실정이다. 감염된 동물은 뚜렷한 증상없이 균을 장기간 보균하면서 지속적으로 브루셀라균을 외부로 배출하면서 주변환경을 오염시킨다. 브루셀라병 치료를 위해서는 짧게는 수주에서 길게는 수년간의 항생제 치료가 필요하며, 다량의 항생제 복용으로 인한 후유증 때문에 치료방법에 대한 개선이 시급한 실정이며, 완치로 판단되었어도 수년 이내에 재발되는 경우가 많아 지속적 관찰이 요구되고 있다.
브루셀라균(Brucella)은 숙주특이성, 배양성, 생물·생화학적, 혈청학적 성상 차이에 따라 B. melitensis (sheep and goats), B. abortus (cattle and other Bovidae), B. canis (dogs), B. ovis (rams), B. suis (pigs, reindeer, hare, wild rodents), B. neotomae (desert wood rats), B. pinnipedialis (common seal), B. ceti (common dolphin), B. microti (soil), B. inopinata (human) 등 10종과 함께 2014년 개코원숭이(baboon)에서 분리된 B. papionis와 2016년 빨간여우(redfox)에서 분리된 B. velpis가 새롭게 추가되어 현재까지 총 12종이 알려져 있다. 이들 중 사람에게 감염되어 병원성을 일으키는 균종은 B. melitensis, B. suis, B. abortus, B.canis이며, 국내에서는 B. abortus와 B. canis만 분리 보고되고 있다. 브루셀라균의 분류는 생물학적 및 생화학적 특성을 기초로 하여 집락의 형태, oxidase 및 urease에 대한 반응성, phages에 대한 용해능에 따라 종(species)을 구분하고 더 나아가 CO2 요구도, H2S 산생능, 색소(thionin, basic fuchsin)에서의 배양성, 특이혈청과의 응집 여부에 따라 생물형(biovar)을 구분하고 있어 최종 야외에서 분리된 브루셀라균에 대하여 생물형까지 동정하기 위해서는 많은 시간이 소요되며 각 시험결과를 판독하기 위해서는 숙련된 전문가가 필요하며 살아 있는 균을 다루기 때문에 매우 위험하다. 최근 이와 같은 한계점을 극복하기 위해 유전자를 이용한 분자생물학적 기법으로 균을 보다 쉽게 감별 및 동정하려는 시도가 계속되고 있다. 하지만 브루셀라균은 유전학적 상동성(DNA homology)이 매우 높기 때문에 이들을 감별하는 연구가 90년대 중반부터 계속되었으며, 그 결과 AMOS PCR법, Bruce-ladder PCR법, differential multiplex PCR법 등이 개발되어 많은 브루셀라균을 감별동정할 수 있었다. 특히, 2012년에 개발된 differential multiplex PCR법은 10종의 브루셀라균에 대하여 단일튜브 내 동시에 감별할 수 있는 유전자 진단법이다. 그러나 이들은 균종 감별은 가능하지만 생물·생화학적 특성분석은 할 수 없기 때문에 이러한 특성 분석도 동시에 할 수 있는 진단법이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 브루셀라균 유전체를 분석하여 유전자형(sequence type, ST)을 감별하기 위한 특이 단일염기다형성을 확인하고, 이를 검출하기 위한 프라이머 세트를 설계함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 단일염기다형성 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 키트 및 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 서열번호 1 내지 22의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 감별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는 브루셀라 캐니스 감별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단일염기다형성 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 브루셀라 캐니스 감별용 조성물을 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 브루셀라 캐니스 감별용 조성물을 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 마이크로어레이를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 22의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는, 브루셀라 캐니스 감별 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 브루셀라 캐니스 감별을 위한 단일염기다형성 마커 및 이를 검출하기 위한 프라이머 세트는 브루셀라 캐니스의 유전자형(sequence type, ST)을 신속하고 정확하게 감별할 수 있는바, 브루셀라 캐니스의 동정 및 진단 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 브루셀라 캐니스 특이 SNP를 이용한 draft WGS를 통해 브루셀라 캐니스 108주를 감별한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 브루셀라 캐니스 특이 SNP를 이용한 다좌위 염기 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 브루셀라 캐니스 특이 SNP를 이용한 다좌위 염기 분석을 통해 브루셀라 캐니스의 지역적 역학 특성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 브루셀라 캐니스 특이 SNP를 이용한 다좌위 염기 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 브루셀라 캐니스 특이 SNP를 이용한 다좌위 염기 분석을 통해 브루셀라 캐니스의 지역적 역학 특성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 조성물을 제공한다.
상기 브루셀라 캐니스 감별용 조성물의 단일염기다형성 마커는 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상이다:
브루셀라 캐니스 1번 염색체(acession No. NC_010103)의 817476번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 817479번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체(acession No. NC_010104)의 687211번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 2번 염색체의 488222번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 955008번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1169973번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1302975번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1347860번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1349518번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1460891번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 302665번째 뉴클레오티드; 및
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 505973번째 뉴클레오티드.
본 발명에 있어서, 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)은 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A, T, G, C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 의미하며, DNA 서열 다형성(polymorphism) 중에서 가장 많이 존재하는 형태이다.
본 발명에 있어서, 다형성(polymorphism)은 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.
본 발명에 있어서, 대립유전자(allele)는 상동염색체의 동일한 유전자 좌 위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP은 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명에 있어서, 마커(marker)는 유전적으로 불특정 연관된 유전자 좌(genetic locus)를 동정할 때 참고 점으로 사용되는 염기서열을 의미하며, 상기 마커의 유전자 지도 상의 위치는 유전자 좌로 표시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 감별은 유전학적·생물학적 성질의 차이를 이용하여 특정한 세균을 가려내는 것을 의미한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 감별은 유전자형(sequence type, ST)을 감별하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 브루셀라 캐니스 감별용 조성물을 이용하여 브루셀라 캐니스의 유전자형을 도 1과 같이 감별할 수 있다. 예를 들어, 감별 대상 균을 분석한 결과, 1번 염색체의 817476 및 817479번째 염기가 각각 G 및 A이고, 1번 염색체의 1169973번째 염기가 C이고, 1번 염색체의 1302975번째 염기가 T이고, 1번 염색체의 1460891번째 염기가 G이고, 1번 염색체의 302665번째 염기가 C인 경우 브루셀라 캐니스 ST8로 감별할 수 있다.
본 발명에 따른 단일염기다형성 마커는 브루셀라 캐니스의 유전자형(sequence type, ST)을 감별할 수 있는바, 브루셀라 캐니스의 동정 및 감염병 진단 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 브루셀라 캐니스 감별용 조성물을 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 브루셀라 캐니스 감별용 키트는 단일염기다형성 마커를 검출하여 브루셀라 캐니스의 유전자형을 감별할 수 있다. 상기 키트에는 단일염기다형성 마커를 검출하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머 및 프로브 등을 포함할 수 있으며, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 키트는 다좌위 염기 분석(multilocus sequence analysis, MLSA) 키트인 것이 바람직하나, 단일염기다형성 마커를 검출할 수 있는 분석법이라면 제한없이 적용 가능하다.
본 발명에 있어서, 다좌위 염기 분석은 필수 유전자들의 서열을 연결한 후 연결된 염기서열을 바탕으로 계통학적 분석을 수행하는 방법으로, 분석하고자 하는 종의 분절유전자(segmentation gene)의 염기서열 증폭으로 계통분석을 수행하므로 종에 대한 보다 광범위한 정보를 제공한다는 장점이 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 브루셀라 캐니스 감별용 조성물을 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에 있어서, 마이크로어레이는 유전자 칩(gene chip)이라고도 불리며, 유전자, DNA 단편 또는 올리고뉴클레오티드를 일정한 패턴으로 고정시킨 작은 고형물을 의미한다.
본 발명의 브루셀라 캐니스 감별용 마이크로어레이는 상기 브루셀라 캐니스 감별용 조성물, 즉, 단일염기다형성 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는바, 브루셀라 캐니스의 감별 및 감염병의 진단에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 22의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 프라이머는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명의 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 키트를 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 키트는 대립유전자 특이 PCR 키트, RT-PCR 키트, 디지털 PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 본 발명의 브루셀라 캐니스 감별용 키트는 PCR을 수행하기 위한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 필수 요소는 단일염기다형성 마커에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는, 브루셀라 캐니스 감별 방법을 제공한다.
상기 (b) 단계의 단일염기다형성 마커는 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상이다:
브루셀라 캐니스 1번 염색체(acession No. NC_010103)의 817476번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 817479번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체(acession No. NC_010104)의 687211번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 2번 염색체의 488222번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 955008번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1169973번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1302975번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1347860번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1349518번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1460891번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 302665번째 뉴클레오티드; 및
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 505973번째 뉴클레오티드.
본 발명의 구체예에서, 상기 (b) 단계는 서열번호 1 내지 22의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 프라이머 세트를 이용하여, (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 (c) 단계는 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 브루셀라 캐니스(
Brucella canis
) 감별용 특이 SNP 선발 및 프라이머 제작
브루셀라 캐니스 감별용 SNP를 선발하기 위하여, 표 1의 브루셀라 캐니스 20주를 활용하였다.
| No. | Species | Type | Strain | Year | Source | Analysis | Comments |
| 1 | B. canis | rough | 23365 | 1966 | USA | draft WGS | Reference |
| 2 | B. canis | rough | RM6/66(M-) | 1968 | USA | draft WGS | Reference |
| 3 | B. canis | rough | A51105 | 2002 | Korea | draft WGS | Isolate |
| 4 | B. canis | rough | A51230 | 2003 | Korea | draft WGS | Isolate |
| 5 | B. canis | rough | A51476 | 2008 | Korea | draft WGS | Isolate |
| 6 | B. canis | rough | HSK A52141 | 2008 | Korea | draft WGS | Isolate |
| 7 | B. canis | rough | A51445 | 2007 | Korea | draft WGS | Isolate |
| 8 | B. canis | rough | A51219 | 2003 | Korea | draft WGS | Isolate |
| 9 | B. canis | rough | A51222 | 2003 | Korea | draft WGS | Isolate |
| 10 | B. canis | rough | A51446 | 2007 | Korea | draft WGS | Isolate |
| 11 | B. canis | rough | A51459 | 2007 | Korea | draft WGS | Isolate |
| 12 | B. canis | rough | A51253 | 2003 | Korea | draft WGS | Isolate |
| 13 | B. canis | rough | A51369 | 2004 | Korea | draft WGS | Isolate |
| 14 | B. canis | rough | A51232 | 2003 | Korea | draft WGS | Isolate |
| 15 | B. canis | rough | A51371 | 2004 | Korea | draft WGS | Isolate |
| 16 | B. canis | rough | A51234 | 2003 | Korea | draft WGS | Isolate |
| 17 | B. canis | rough | A51104 | 2002 | Korea | draft WGS | Isolate |
| 18 | B. canis | rough | A52140 | 2008 | Korea | draft WGS | Isolate |
| 19 | B. canis | rough | A52317 | 2015 | Korea | draft WGS | Isolate |
| 20 | B. canis | rough | A52333 | 2015 | Korea | draft WGS | Isolate |
표 1의 브루셀라 캐니스 20주를 차세대염기서열분석법(Next generation sequencing, NGS)를 통해 draft WGS(whole genome sequence) 분석을 실시하였다. Illumina TruseqNano DNA HT Kit를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA 라이브러리를 준비하였으며, Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)를 사용하여 생성된 DNA 라이브러리를 대상으로 quality control을 추가로 수행하였다. Miseq reagent kit v2를 사용하여 Illumina Miseq system으로 pairend sequencing을 수행하여 각 균주별 3GB정도의 데이터를 생성하였다. B. melitensis bv.1 16M reference genome(GCF_000740415.1) 기준으로 Bowtie2를 사용하여 맵핑하여 sequence alignment를 수행하였다.
총 20주 draft WGS를 대상으로 특이 SNP를 분석한 결과, 브루셀라 캐니스 특이 SNP가 약 140개가 분석되었으며, 동일 유전자 내에서 약 500bp 크기 이내에서 2∼3개 이상의 SNP를 갖는 부위를 중심으로 선발하여 분자역학적 특성분석에 활용하였다. 특이 SNP가 포함된 유전자 부위를 중심으로 annealing temperature는 54℃로, 증폭산물의 크기는 180bp±60 범위로 프라이머를 합성하였으며, 특이 SNP가 포함된 감별부위에 대하여 수집된 표준균주와 분리균주들의 유전자정보와 이 부위를 직접 assemble sequencing한 염기서열정보와의 일치여부를 재차 확인하여 선발된 부위의 신뢰도를 확보하였다.
SNP 분석 결과, 브루셀라 캐니스에 대한 특이 SNP는 총 11개 유전자 부위에서 선발하였다. 보다 상세하게는, 선발된 4개 유전자(bcsp31, omp25, ABC trans)의 SNP 4개는 브루셀라균 특이 SNP를 활용하였고, 브루셀라 캐니스의 특성 분석을 위한 8개 유전자(DK63_RS07725, DK63_RS08690, DK63_RS09380, DK63_RS09600, DK63_RS09610, DK63_RS10115, DK63_RS14730, DK63_RS15675)의 특이 SNP 8개는 새롭게 선발하였다.
| Gene name | Amplified size(bp) | Position | SNP Ref*/Alt |
Comments |
| bcsp31 | 224 | 121 | G/G | Gene and SNP for differential identification of B. canis |
| 124 | A/A | |||
| omp25 | 195 | 39 | C/A | |
| ABC transporter | 202 | 62 | G/A | |
| DK63_RS07725 | 161 | 99 | C/T | Gene and SNP for molecular genetic and epidemiologic characteristics of B. canis |
| DK63_RS08690 | 213 | 47 | C/T | |
| DK63_RS09380 | 295 | 131 | T/C | |
| DK63_RS09600 | 161 | 63 | G/T | |
| DK63_RS09610 | 260 | 99 | G/A | |
| DK63_RS10115 | 226 | 114 | G/A | |
| DK63_RS14730 | 213 | 80 | C/T | |
| DK63_RS15675 | 267 | 112 | G/T | |
| * B. melitensis 16M (NZ_CP007763, NZ_CP007762) | ||||
브루셀라 캐니스 특이 SNP를 선발하기 위해 사용한 유전자 및 프라이머 정보는 표 3에 정리하였다.
| Gene | Primer sequence (5` → 3`) |
서열 번호 |
Size (bp) |
타겟 부위를 기준으로 한 SNP의 위치 | 브루셀라 캐니스의 whole genome을 기준으로 한 SNP의 위치 | Comments | |
| BCSP31 | F | TGG CTC GGT TGC CAA TAT CAA | 1 | 224 | 121 124 |
Ch. 1, 817476 Ch. 1, 817479 |
Genus Brucella |
| R | CGC GCT TGC CTT TCA GGT CTG | 2 | |||||
| omp25 | F | AAG CCT GAC GAT TGG AA | 3 | 115 | 49 | Ch. 1, 687211 | B. canis |
| R | CGT CCT TGG ACT TCT TGG | 4 | |||||
| ABC transporter | F | TCC GGA TGG TTC ATC AC | 5 | 200 | 100 | Ch. 2, 488222 | B. canis B. suis 3, 4 |
| R | CAG CTA CGG AAG AGT TT | 6 | |||||
| DK63_RS07725 | F | CAG TCA TCT TCG TAA CCA T | 7 | 227 | 108 | Ch. 1, 955008 | B. canis point variation |
| R | A ATC AAT GAA GCG GTC ACA | 8 | |||||
| DK63_RS08690 | F | GCC GAC TGA AAC GAT TAA A | 9 | 231 | 69 | Ch. 1, 1169973 | B. canis point variation |
| R | TT ATC CGT TTC TCG TCA ATG | 10 | |||||
| DK63_RS09380 | F | GAA GTG GAT GAT GTC TGC | 11 | 295 | 131 | Ch. 1, 1302975 | B. canis point variation |
| R | TGG TCT TGA GGT CGT TGA | 12 | |||||
| DK63_RS09600 | F | GCC TCT ATC GCC TTG TTA | 13 | 161 | 63 | Ch. 1, 1347860 | B. canis point variation |
| R | GAT CAT TTC GCC TTC TGG | 14 | |||||
| DK63_RS09610 | F | GAT TTC CGA TTC CTT GCG | 15 | 260 | 99 | Ch. 1, 1349518 | B. canis point variation |
| R | GCG ATA TGA TGC GTG AAG | 16 | |||||
| DK63_RS10115 | F | CAG ATA GAA GAC CGA GAA C | 17 | 226 | 114 | Ch. 1, 1460891 | B. canis point variation |
| R | CGG CTC CAA TAT CTT CAT | 18 | |||||
| DK63_RS14730 | F | CAC TAT GCA ATT GAC CGT | 19 | 213 | 80 | Ch. 1, 302665 | B. canis point variation |
| R | TAA TTG CCG ACA TAG GTG C | 20 | |||||
| DK63_RS15675 | F | TTC TGG TTC GTT TCC CTC | 21 | 267 | 112 | Ch. 1, 505973 | B. canis point variation |
| R | GGA AAG AAG ATA ACC GCC | 22 | |||||
| 11 genes | 22 pairs | 12 SNPs |
상기 표 2의 브루셀라 캐니스 염색체 1 및 2번의 accession No.는 각각 NC_010103 및 NC_010104이다.
실시예 2. 선발된 브루셀라 캐니스 특이 SNP를 이용한 브루셀라 캐니스 감별법
상기 표 2의 브루셀라 캐니스 특이 SNP를 활용하여, 브루셀라 캐니스 108주를 감별할 수 있는지 확인하였으며, 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 선발된 11종의 유전자(gene)에 위치한 브루셀라 캐니스 특이 SNP 12개를 이용할 경우 브루셀라 캐니스의 유전자형(Sequence type, ST)을 모두 감별할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 선발된 브루셀라 캐니스 특이 SNP를 이용한 다좌위 염기 분석(multilocus sequence analysis, MLSA)
국내 분리주(107주)를 대상으로, 브루셀라균을 감별할 수 있는 3개 유전자(bcsp31, omp25, ABC trans)의 SNP 4개; 및 유전자형 분석을 위해 선발된 8개 유전자(DK63_RS07725, DK63_RS08690, DK63_RS09380, DK63_RS09600, DK63_RS09610, DK63_RS10115, DK63_RS14730, DK63_RS15675)의 SNP 8개;를 이용한 다좌위 염기 분석을 수행하였다. 다좌위 염기 분석 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 선발된 브루셀라 캐니스 특이 SNP를 이용하는 경우 브루셀라 캐니스의 유전자형(sequence type, ST)을 감별할 수 있음을 확인하였고, 브루셀라 캐니스의 유전자형은 총 8개(즉, ST1 내지 8)임을 확인하였다.
실시예 4. 선발된 브루셀라 캐니스 특이 SNP를 이용한 브루셀라 캐니스의 지역적 역학 특성 분석
선발된 브루셀라 캐니스 특이 SNP를 이용하여 브루셀라 캐니스의 지역적 역학 특성을 분석하였다. 상기 지역적 역학 특성 분석은 국내 분리주(107주)를 대상으로 선발된 11개 유전자의 브루셀라 캐니스 특이 SNP를 이용한 다좌위 염기 분석을 통해 수행하였다. 지역적 역학 특성 분석 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 경기(Gyeonggi) 지역은 ST1-7형으로 가장 다양한 지역과 연관성을 나타내며 분포하는 것을 확인하였다.
그 외 경북(Gyeongbuk) 지역은 ST 1, 3, 4 및 5형;
충북(Chungbuk) 지역은 ST1, 2, 3 및 6형;
충남(Chungnam) 지역은 ST2, 4 및 9형;
강원(Kangwon) 지역은 ST2 및 3)형;
전남(Jeonnam) 지역은 ST1 및 8형;
인천(Incheon) 지역은 ST3 및 5형;
전북(Jeonbuk) 및 광주(Gwangju) 지역은 ST2형;
대전(Daejeon) 지역은 ST2형;으로 확인하였다.
특히, 지역별로 우세한 유전자형은 경북 지역은 ST1형(76%), 충남/북은 ST2형(67/50%), 전남은 ST8형(67%)이다. 또한 ST1형은 5개 지역(37.4%)으로 우세하게 분포해 있는 유전자형임을 확인하였다. 유전자형 분석 결과를 토대로 가진 지역별 역학적 연관성(예를 들어, 숙주의 이동, 인근 전파 등)을 확인할 수 있었다.
종합적으로 본 발명자들은 브루셀라 캐니스의 sequencing 및 alignment를 통해 유전자형(sequence type, ST)을 감별하기 위한 특이 SNP를 확인하였고, 이를 검출하기 위한 프라이머 세트를 설계하였다. 본 발명에 따른 브루셀라 캐니스 감별용 특이 SNP 및 프라이머 세트는 브루셀라 캐니스의 유전자형을 신속하고 정확하게 감별할 수 있는바, 브루셀라 캐니스의 동정 및 진단 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency)
<120> Single nucleotide polymorphism marker for identification of
Brucella canis and primer set for detection
<130> 115
<160> 22
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BCSP31_forward primer
<400> 1
tggctcggtt gccaatatca a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BCSP31_reverse primer
<400> 2
cgcgcttgcc tttcaggtct g 21
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> omp25_forward primer
<400> 3
aagcctgacg attggaa 17
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> omp25_reverse primer
<400> 4
cgtccttgga cttcttgg 18
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ABC transporter_forward primer
<400> 5
tccggatggt tcatcac 17
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ABC transporter_reverse primer
<400> 6
cagctacgga agagttt 17
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DK63_RS07725_forward primer
<400> 7
cagtcatctt cgtaaccat 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DK63_RS07725_reverse primer
<400> 8
aatcaatgaa gcggtcaca 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DK63_RS08690_forward primer
<400> 9
gccgactgaa acgattaaa 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DK63_RS08690_reverse primer
<400> 10
ttatccgttt ctcgtcaatg 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DK63_RS09380_forward primer
<400> 11
gaagtggatg atgtctgc 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DK63_RS09380_reverse primer
<400> 12
tggtcttgag gtcgttga 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DK63_RS09600_forward primer
<400> 13
gcctctatcg ccttgtta 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DK63_RS09600_reverse primer
<400> 14
gatcatttcg ccttctgg 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DK63_RS09610_forward primer
<400> 15
gatttccgat tccttgcg 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DK63_RS09610_reverse primer
<400> 16
gcgatatgat gcgtgaag 18
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DK63_RS10115_forward primer
<400> 17
cagatagaag accgagaac 19
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DK63_RS10115_reverse primer
<400> 18
cggctccaat atcttcat 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DK63_RS14730_forward primer
<400> 19
cactatgcaa ttgaccgt 18
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DK63_RS14730_reverse primer
<400> 20
taattgccga cataggtgc 19
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DK63_RS15675_forward primer
<400> 21
ttctggttcg tttccctc 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DK63_RS15675_reverse primer
<400> 22
ggaaagaaga taaccgcc 18
Claims (10)
- 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 브루셀라 캐니스 감별용 조성물로서,
상기 단일염기다형성 마커는 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상인 조성물 :
브루셀라 캐니스 1번 염색체(acession No. NC_010103)의 817476번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 817479번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체(acession No. NC_010104)의 687211번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 2번 염색체의 488222번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 955008번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1169973번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1302975번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1347860번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1349518번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1460891번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 302665번째 뉴클레오티드; 및
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 505973번째 뉴클레오티드. - 제1항에 있어서,
상기 감별은 유전자형(sequence type, ST)을 감별하는 것인, 브루셀라 캐니스 감별용 조성물. - 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 키트.
- 제3항에 있어서,
상기 키트는 다좌위 염기 분석(multilocus sequence analysis, MLSA) 키트인, 브루셀라 캐니스 감별용 키트. - 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 마이크로어레이.
- 서열번호 1 내지 22의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는, 브루셀라 캐니스 감별용 프라이머 세트.
- 제6항의 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 키트.
- 제7항에 있어서,
상기 키트는 대립유전자 특이 PCR 키트, RT-PCR 키트, 디지털 PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인, 브루셀라 캐니스 감별용 키트. - (a) 개체로부터 분리한 시료로부터 DNA를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 증폭된 단일염기다형성 마커의 유전자형을 확인하는 단계;를 포함하는, 브루셀라 캐니스 감별 방법으로서,
상기 (b) 단계의 단일염기다형성 마커는, 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 브루셀라 캐니스 감별 방법:
브루셀라 캐니스 1번 염색체(acession No. NC_010103)의 817476번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 817479번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체(acession No. NC_010104)의 687211번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 2번 염색체의 488222번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 955008번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1169973번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1302975번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1347860번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1349518번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 1460891번째 뉴클레오티드;
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 302665번째 뉴클레오티드; 및
브루셀라 캐니스 1번 염색체의 505973번째 뉴클레오티드. - 제9항에 있어서,
상기 (b) 단계는 서열번호 1 내지 22의 염기서열로 표시되는 프라이머로 구성된 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 브루셀라 캐니스 감별용 프라이머 세트를 이용하여, (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 단일염기다형성 마커를 증폭시키는 것인, 브루셀라 캐니스 감별 방법.
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120131830A (ko) * | 2011-05-26 | 2012-12-05 | 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 농림수산검역검사본부) | 브루셀라균 종별 감별용 프라이머 세트 |
| KR20170019925A (ko) * | 2015-08-13 | 2017-02-22 | 대한민국(국군의무사령부 사령관) | 브루셀라균 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 |
| CN106701980A (zh) * | 2017-02-04 | 2017-05-24 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心snp标记及其应用 |
-
2020
- 2020-12-30 KR KR1020200187438A patent/KR102470994B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120131830A (ko) * | 2011-05-26 | 2012-12-05 | 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 농림수산검역검사본부) | 브루셀라균 종별 감별용 프라이머 세트 |
| KR20170019925A (ko) * | 2015-08-13 | 2017-02-22 | 대한민국(국군의무사령부 사령관) | 브루셀라균 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 |
| CN106701980A (zh) * | 2017-02-04 | 2017-05-24 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 用于鉴别羊种和牛种布鲁氏菌的核心snp标记及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 차세대염기서열분석법을 이용한 브루셀라균 신속 감별동정 및 분자유전학적 특성분석, 세균질병과 브루셀라병 OIE 표준실험실, 농림축산검역본부, 연구과제 최종보고, 2016* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102470994B1 (ko) | 2022-11-29 |
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