KR20220090446A - 과수 화상병 및 가지검은마름병 원인균에 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 및 이의 용도 - Google Patents

과수 화상병 및 가지검은마름병 원인균에 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 과수 화상병 및 가지검은마름병 원인균에 사멸능을 갖는 신규 박 테리오파지 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

과수 화상병 및 가지검은마름병 원인균에 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 및 이의 용도 {Novel bacteriophage effective for fire blight bacteria and black shoot blight disease bacteria, and use thereof}
본 발명은 과수 화상병 및 가지검은마름병 원인균에 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 및 이의 용도에 관한 것이다.
Erwinia amylovora (에르위니아 아밀로보라)는 배나무 또는 사과나무 등의 과수에서 화상병을 야기하는 그람 음성 (Gram-negative) 식물병원균이다. 에르위니아 아밀로보라의 대표적인 증상으로 잎은 시들고 흑색으로 변하여 마르며, 줄기나 열매도 처음에는 수침상의 병반이 생기고 움푹 들어가며 열매가 시들어가며 화상을 입은 것처럼 검게 변한다. 에르위니아 아밀로보라는 미국에서 1780년에 처 음 발견되었고, 유럽, 북미, 중동, 중앙아시아, 뉴질랜드 등 전 세계적으로 보고된 바 있다 (van der Zwet et al 2012). 이 병원균은 한국에서는 2015년 사과와 배의 화상병을 통해 처음으로 보고되었다 (Myung et al, 2016; Park et al, 2016).
또한, Erwinia pyrifoliae(에르위니아 피리폴리애)는 에르위니아 아밀로보라와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 화상병과 유사한 증상을 보이는 가지검은마름병의 원인균으로 보고되고 있다.
한편, 이들 균은 곤충이나 비바람에 의해 전염되어 꽃, 꿀샘, 기공, 피목, 상처 등을 통해 기주체로 침입하기 때문에 전염성이 높고 배나무, 사과나무, 살구나무 등 70여종의 식물을 침해할 수 있다는 특징이 있어 세계적으로 화상병 및 가지검은마름병에 대한 피해가 발생하고 있다.
화상병(또는 가지검은마름병)은 당해의 수확을 망칠 뿐만 아니라, 장기간의 타격도 줄 수 있다. 꽃의 감염은 과일을 말려 죽여, 당해의 수확을 감소시키고 어린 가지의 화상은 다음해의 과수가 열릴 가능성을 감소시킨다. 많은 과수 품종의 뿌리와 줄기에 있어서 화상은 큰 가지나 나무 전체마저도 파괴할 수 있다. 과수 수확에 대한　화상병의 잠재적인 영향을 감안해 봤을 때, 이 질병에 대한 해결책이 절실한 상황이다.
화상병에 대응하기 위한 방법 중 하나는 원예적인 실시에 의해 질병 발생을 최소한으로 하는 것이다. 예를 들어, 토양 수분을 감소시키고 비료 영양소의 균형을 유지함으로써　화상병의 감염 및 확산을 제어할 수 있는 방법이 있다. 그러나, 이 방법은 본질적인 질병 발생을 제거할 수 없다.
다른 방법으로, 감염된 과수나 검게 변한 가지를 병원균이 휴지 기간을 갖는 겨울에 제거함으로써 화상병을 치료하는 것도 가능하다. 그러나 이러한 방법은 장비의 멸균에 주의하여 질병의 확산을 방지해야 한다. 또한, 이 방법은 작 은 병변 또는 내부 감염을 다 검출할 수 없기 때문에 질병을 완전하게 근절할 수 없다.
또한, 화상병에 감염된 과수는 구리 화합물 또는 항생 물질을 정기적으로 살포하는 방법으로 화상병을 제어할 수 있다. 그러나, 구리 화합물의 사용은 종종 효과적이지 않거나 과일의 녹(russeting)을 일으키므로 보편적으로 사용하기에는 어려운 점이 있다. 항생 물질의 사용, 특히, 스트렙토마이신은 구리 화합물보다 효과적이고 과일에 대한 해가 적다. 그러나, 에르위니아 아밀로보라는 캘리포니아, 오리건, 워싱턴, 미주리 및 미시간을 포함한 스트렙토마이신이 사용되고 있는 미국의 많은 주에서 스트렙토마이신에 대한 내성을 일으키고 있어 다른 방법이 필 요한 상황이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 화상병과 가지검은마름병의 원인균인 에르위니아 아밀로보라와 에르위니아 피리폴리애의 동시 방제 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 화상병 및 가지검은마름병이 발병한 농가 주위의 하천, 유출수, 농수로 등에서 채취한 샘플로부터 분리된 박테리오파지와 이들을 혼합한 칵테일이 이들 균에 대한 사멸능력이 현저히 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 pEp_SNUABM_03(NCBI accession number: MT822284), pEp_SNUABM_04(NCBI accession number: MT822285), pEp_SNUABM_08(NCBI accession number: NB184886), pEp_SNUABM_11(NCBI accession number: MT822287) 및 pEp_SNUABM_12(NCBI accession number: MT822288)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고, Erwinia amylovora (에르위니아 아밀로보라) 및 Erwinia pyrifoliae (에르위니아 피리폴리애)에 사멸능을 갖는, 박테리오파지를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 농약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항균제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 세척제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 박테리오파지를 처리하는 단계를 포함하는 Erwinia amylovora (에르위니아 아밀로보라) 및 Erwinia pyrifoliae (에르위니아 피리폴리애)를 용균하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 박테리오파지를 처리하는 단계를 포함하는 과수 화상병 및 가지검은마름병을 방제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서는 pEp_SNUABM_03(NCBI accession number: MT822284), pEp_SNUABM_04(NCBI accession number: MT822285), pEp_SNUABM_08(NCBI accession number: NB184886), pEp_SNUABM_11(NCBI accession number: MT822287) 및 pEp_SNUABM_12(NCBI accession number: MT822288)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고, Erwinia amylovora (에르위니아 아밀로보라) 및 Erwinia pyrifoliae (에르위니아 피리폴리애)에 사멸능을 갖는, 박테리오파지를 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 박테리오파지는 수탁번호 KACC87002BP로 기탁된 에르위니아 파지 칵테일 에르위가드(Erwinia phage cocktail Erwiguard)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 농약 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 박테리오파지는 과수 화상병 (fire blight) 및/또는 가지검은마름병의 예방 또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 농약 조성물은 수간주사 조성물, 생물제제 조성물, 비료 조성물, 영양 조성물, 식물 강화 조성물, 식물 보호 조성물, 토양 개량 조성물 (soil conditioner composition) 및 생산량 증가 조성물 (yield enhancer composition)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항균제를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 세척제를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 박테리오파지를 박테리아에 처리하는 단계를 포함하는 Erwinia amylovora (에르위니아 아밀로보라) 및 Erwinia pyrifoliae (에 르위니아 피리폴리애)를 동시에 용균하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 박테리오파지를 식물에 처리하는 단계를 포함하는 과수 화상병 또는 가지검은마름병을 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 하기 실시예를 통해 분리된 5종의 신규 박테리오파지 및 이들의 혼합 용액이 과수화상병 및 검은가지마름병 세균을 효과적으로 생장을 억제하고 감염을 억제하는 효과를 보임을 확인하였는바, 본 발명에 따른 박테리오파지는 과수 화상병 또는 가지검은마름병의 예방 또는 치료에 활용할 수 있을 뿐만 아니라, 항균제, 소독제, 또는 세척제 등에도 광범위하게 이용될 것으로 기대된다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, pEp_SNUABM_03(NCBI accession number: MT822284), pEp_SNUABM_04(NCBI accession number: MT822285), pEp_SNUABM_08(NCBI accession number: NB184886), pEp_SNUABM_11(NCBI accession number: MT822287) 및 pEp_SNUABM_12(NCBI accession number: MT822288)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고, Erwinia amylovora (에르위니아 아밀로보라) 및 Erwinia pyrifoliae (에르위니아 피리폴리애)에 동시 사멸능을 갖는, 박테리오파지를 제공한다.
본 발명에서의 용어, "박테리오파지(bacteriophage)"란 특정한 타겟 박테리 아를 감염시키는 바이러스이다. 단백질 캡시드(capsid)로 싸여 있는 박테리오파지의 머리는 핵산 게놈으로 이루어져 있으며, 몇몇 박테리오파지는 지질 또는 단백질로 구성된 꼬리를 갖는다. 대부분의 박테리오파지는 유전 물질로서 이중나선 DNA를 포함한다.
알려진 박테리오파지의 95% 이상이 카우도비랄레스(Caudovirales) 목(order)에 속한다(Maniloff J and Ackermann H-W. 1998. Arch. Virology. 143: 2051- 2063.). 박테리오파지의 주요 세 가지 과(family)는 형태적인 특징으로 구분되며, 특히 꼬리 모양으로 구분된다. 마이오비리대(Myoviridae) 과에 속하는 파지는 이중 층의 수축성 꼬리를 가지며, 시포비리대(Siphoviridae) 과에 속하는 파지는 긴 탄 성의 꼬리를 가지며, 포도비리대(Podoviridae) 과에 속하는 파지는 짧고 뭉툭한 꼬리를 갖는다(Deveau H, 2006, Appl. Environ. Microbiol. 72: 4338-4346.).
박테리오파지는 물, 흙, 및 식물의 안 또는 밖의 모든 환경에서 찾아볼 수 있다. 박테리오파지는 타겟 박테리아에 부착하여 숙주 안으로 자신의 DNA를 주입하며, 숙주 내에서 자가복제하여 박테리아의 죽음을 야기한다. 박테리오파지는 동물 또는 식물 세포에 대해서는 상대적으로 안전하며(Kutter E and Sulakvelidze A. 2004. CRC Press.), 다른 유익한 미생물에 대해서도 영향을 미치지 않는다. 또한, 박테리오파지는 숙주 박테리아성 환경에서 비교적 쉽게 분리된다.
최근, 박테리오파지는 식물병원성 박테리아, 예를 들어 Dickeya solani(Czajkowski R,2014, Plant Pathol. 63: 758-772.), Pectobacterium carotovorum(Lim JA, J. Microbiol. Biotechnol. 19 23: 1147-1153.), 또는 Ralstonia solanacearum(Young BJ, J. Microbiol. Biotechnol. 22:16 1613-1620.)에 의하여 야기되는 식물 질병을 방제하기 위한 파지 테라피(phage therapy)의 물질로서 많이 연구되고 있다. 그러나, 박테리오파지의 유전적 다양성으로 인해, 식물 질병 방제를 위해서는 특정 박테리아 특이적으로 사멸능을 갖는 특정 박테리오파지를 규명하는 것이 필요하다.
한편, 본 발명의 박테리오파지는 기존의 알려진 파지와 상이한 유전체 서열을 가지고 있는 신규한 파지로서, 본 발명자들에 의해 에르위니아 아밀로보라 및 에르위니아 피리폴리애에 동시 특이적 사멸능을 갖는 것으로 최초로 규명되었다.
본 발명자들은 가지검은마름병이 발병한 농가 주위의 하천, 유출수, 농수로 등에서 샘플을 채취하였고, 상기 샘플에서 에르위니아 아밀로보라 및 에르위니아 피리폴리애에 특이적인 동시 사멸능을 가지는 박테리오파지를 분리하였다.
이러한 에르위니아 아밀로보라 및 에르위니아 피리폴리애에 특이적인 사멸능을 갖고, 안정성을 가지는 박테리오파지는 에르위니아 아밀로보라 및 에르위니아 피리폴리애에 효과적인 항균 활성을 나타내고, 따라서 과수 화상병과 가지검은마름병의 방제에도 유용한 효과를 가질 수 있다.
이에 본 발명자는 에르위니아 아밀로보라 및 에르위니아 피리폴리애에 특이적인 동시 사멸능을 갖고 상기와 같은 특징을 갖는 상기 박테리오파지 5종을 혼합한 칵테일을 2020년 11월 9일 농업생명공학연구원에 수탁번호 KACC87002BP로 기탁하였다.
본 명세서에서 상기 수탁번호 KACC87002BP로 기탁된 박테리오파지는 Erwinia phage cocktail Erwiguard인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 분리된 5종의 신규 박테리오파지 및 이들의 혼합 칵테일 용액이 과수화상병 및 검은가지마름병 세균을 효과적으로 생장을 억제하고 감염을 억제하는 효과를 보임을 확인하였다(표 2 및 표 3 참조).
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 농약 조성물을 제공한다.
이때, 상기 박테리오파지의 정의는 전술한 바와 같다.
본 발명에서의 용어, "농약"이란, 농작물의 보호와 생장에 사용되는 약제를 의미하며, 농작물의 재배 또는 저장 중 발생하는 병충, 해충, 잡초 등을 방제하는 데 사용하는 화학농약 및 생물농약, 농작물의 생리기능을 증진 또는 억제하는데 사 용되는 생장조정제, 약효를 증진시키는 보조제 등을 총칭한다.
본 발명의 농약 조성물은 에르위니아 아밀로보라 및 에르위니아 피리폴리애에 특이적인 사멸능을 갖는 박테리오파지를 유효성분으로 포함하므로, 상기 농약 조성물은 과수 화상병(fire blight) 및 가지검은마름병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 농약 조성물은 수간주사 조성물, 생물제제 조성물, 비료 조성물, 영양 조성물, 식물 강화 조성물, 식물 보호 조성물, 토양 개량 조성 물(soil conditioner composition) 또는 생산량 증가 조성물(yield enhancer composition)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 농약 조성물의 제형으로는 수화제(wettable powder), 입상 수화 제(water dispersible granule), 분제(dusting powder), 액상 수화제(suspension concentrate), 유제(emulsifiable concentrate), 정제(tablet), 액제(liquid) 또는 오일 현탁제(oil suspension)로 제제화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 농약 조성물은 유효량의 물과 함께, 하나 이상의 분산제를 포함할 수 있으며, 상기 분산제는 약 2 내지 약 60%(w/w)의 범위로 포함될 수 있다. Rhone Poulenc, Witco, Westvaco, International Speciality products, Crodachemicals, Borregaard, BASF, Rhodia, 등에서 판매되는 다양한 분산제가 농약 조성물에 사용하기 위해 상업적으로 입수가능하다.
상기 농약 조성물에 사용될 수 있는 분산제의 구체적인 예로, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 리그노술포네이트, 페닐 나프탈렌 술포네이트, 에톡시화(ethoxylated) 알킬 페놀, 에톡시화지방산, 알콕시화 선형 알코올, 환방향족(polyaromatic) 술포네이트, 소듐 알킬 아릴 술포네이트, 글리세릴에스테르, 말레산 무수물 공중합체, 포스페이트 에스테르, 아릴 술폰산과 포름알데히드의 축합 반응 생성물, 알킬아릴 술폰산과 포름알데히드의 축합반응 생성물, 에틸렌 옥시드와 지방산 에스테르의 첨가 반응 생성물, 에틸렌 옥시드와 지방산 에스테르의 첨가 반응 생성물의 염, 축합된(condensed) 나프탈렌의 술포네이트, 에틸렌 옥시드와 지방산 에스테르의 첨가 반응 생성물, 에틸렌 옥시드와 지방산 에스테르의 첨가 반응 생성물의 염, 리그닌 유도체, 나프탈렌 포름알데히드 축합물, 이소데실술포숙신산 하프 에스테르(half ester)의 소듐염, 폴리카르복실레이트, 소듐 알킬벤젠술포네이트, 술폰화 나프탈렌의 소듐염, 술폰화 나프탈렌의 암모늄염, 폴리아크릴산의 염, 페놀술폰산의 염 또는 나프탈렌 술폰산의 염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 농약 조성물은 습윤제, 결합제, 충진제(filler) 또는 유기 첨가 제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 습윤제는 상기 농약 조성물에 약 0.1 내지 5% 범위로 포함될 수 있으며, 구체적인 예로, 알킬 나프탈렌 술포네이트, 소듐 알킬 나프탈렌 술포네이트, 술폰화 알킬카르복실레이트의 소듐염, 폴리옥시알킬화 에틸 페놀, 폴리옥시에톡시 화(polyoxyethoylated) 지방성 알코올, 폴리옥시에톡시화 지방성 아민, 리그닌 유 도체, 알칸 술포네이트, 알킬벤젠 술포네이트, 폴리카르복시산의 염, 술포숙신산의 에스테르의 염, 알킬나프탈렌술포네이트, 알킬벤젠술포네이트, 알킬폴리글리콜 에 테르 술포네이트, 알킬 에테르 포스페이트, 알킬 에테르 술페이트 또는 알킬 술포 숙신산 모노에스테르일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 결합제는 상기 농약 조성물에 약 0.1 내지 7%의 범위로 포함될 수 있으며, 구체적인 예로, 폴리비닐 알코올, 리그닌 유도체, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리알킬피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로오스, 크산탄검, 폴리에톡시화 지방산, 폴리에톡시화 지방성 알코올, 에틸렌 옥시드 공중합체, 프로필렌 옥시드 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 옥시드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 충진제는 상기 농약 조성물에 약 0.1 내지 10%의 범위로 포함될 수 있으며, 구체적인 예로, 벤토나이트, 서브-벤토나이트(sub-bentonite), 아타풀자이 트(attapulgite), 카올리나이트(kaolinite), 몬모릴로나이트, 보크사이트, 수화된 알루미나(hydrated alumina), 하소된(calcined) 알루미나, 규조토(diatomaceous earth), 백악(chalk), 백토(fuller's earth), 돌로마이트, 규조토(kieselguhr), 황 토(loess), 프로필리트(prophyllite), 탈크(talc), 버미큘라이트(vermiculite), 석 회암(limestone), 천연 및 합성 실리케이트(silicate), 실리카(silica) 또는 고령 토(china clay)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유기 첨가제는 상기 농약 조성물에 약 0.01 내지 50%의 범위로 포함될 수 있으며, 구체적인 예로, 다량 영양소(macronutrient), 미량 영양소 퇴비 비료(micronutrient compost fertilizer), 천연 원소(natural element), 천연 유기 체(natural organism), 트리코데르마(trichoderma), 부식산(humic acid) 추출물, 바실러스 투린지엔시스(bacillus thuringiensis), 바이러스, 천연 곰팡이, 식물 추출물, 제충국, 생물학적 제어 산물(biological control product), 천연 오일, 천연 추출물, 광물 또는 요소 군일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 미량 영양소는 아연, 철, 망간, 구리, 보론, 코발트, 바나듐, 셀레늄, 실리콘 또는 니켈 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 다량 영양소는 질소, 인, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항균제를 제공한다.
본 발명에서의 용어, "항균제"란, 미생물을 사멸시키거나 혹은 발육을 억제하는 물질을 의미하며, 방부제, 살균제 및 항생제를 총칭하는 것이다.
본 발명의 박테리오파지는 에르위니아 아밀로보라에 대하여 특이적으로 높은 항균 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 에르위니아 피리폴리애도 동시 사멸시킬 수 있으며, 우수한 내열성, 내산성 및 내자외선성을 갖는다. 따라서, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 상기 항균제는 기존의 항균물질에 비하여 약물 내성 또는 저항성을 유도하지 않아 안전하며, 제품수명(life cycling)이 긴 신규 항균제로서 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제를 제공한다.
본 발명에서의 용어, "소독제"란, 병원세균의 살균을 목적으로 하는 약제를 의미하며, 본 발명에서의 용어, "세척제"란, 세정의 목적에 사용되는 약제를 의미한다.
본 발명의 박테리오파지는 에르위니아 아밀로보라에 대하여 특이적으로 높은 항균 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 에르위니아 피리폴리애도 사멸시킬 수 있으며, 우수한 내열성, 내산성 및 내자외선성을 갖는다. 따라서, 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 상기 소독제 또는 세척제는 기존의 약제에 비하여 우수한 살균 활성을 가지며, 제품수명(life cycling)이 긴 신규 소독제 또는 세척제로서 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 박테리오파지를 처리하는 단계를 포함하는 에르위니아 아밀로보라 및 에르위니아 피리폴리애를 동시 용균하는 방법을 제공한다.
본 발명에서의 용어, "용균"이란, 박테리아의 세포벽 또는 세포질막이 파괴되어 박테리아가 용해되는 현상을 의미하며, 박테리아가 사멸되는 현상을 의미한 다.
구체적으로, 상기 박테리아를 용균하는 방법은 본 발명의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 농약 조성물, 항균제, 소독제 또는 세척제의 유효량을 박테리아에 처리하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 박테리오파지를 처리하는 단계를 포함하는 과수 화상병 및 가지검은마름병을 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명에서의 용어, "과수 화상병"은 에르위니아 아밀로보라에 의해 발생하는 식물병으로, 꽃, 잎, 가지, 열매, 줄기에 발생하며 새 가지에 특히 발병이 많다. 처음 잎의 가장자리에서 발생하여 잎맥을 따라 진전하면 잎은 시들고 흑색으로 변하여 마른다. 꽃은 처음에 수침상(水浸狀)으로 되고 시들면서 흑갈색으로 변하여 떨어지거나 그대로 매달려 있다. 새 가지에 발병되면 처음에는 끝에서 시작하여 아래 쪽으로 진전되면서 갑자기 시들어 말라죽는다. 줄기나 열매도 처음에는 수침상 의 병반이 생기고 움푹 들어가며 열매는 시든다. 또한, 곤충이나 비바람에 의해 전 염되어 꽃, 꿀샘, 기공, 피목, 상처 등을 통해 기주체로 침입하기 때문에 전염성이 높다.
본 발명에서의 용어, "가지검은마름병"은 에르위니아 피리폴리애에 의해 발생하는 식물병으로 꽃은 물에 데친 것 같아서 후에 갈변하여 꽃자루로 번지며, 이병된 꽃자루는 잘 떨어지지 않고, 유과는 물에 데친 것 같이 되며, 진한 갈색으로 변하며 표면에 진물이 생기며, 과총은 꽃 하나 또는 전체가 갈변하여 죽으며 진물이 생겨 아래 가지로 병반이 번지고, 신초는 갈색으로 변하여 진물이 생긴다. 진물은 아침에 생겨 햇빛이 나면 말라버리나 자세히 보면 흔적을 볼 수 있다. 잎은 기공이나 상처로 침입하여 처음에는 잎자루에서 엽맥을 따라 갈색 괴사반점이 나타나며 중간 엽맥이나 엽병으로 번져 진한 갈색의 병반을 형성하고, 줄기는 수침상으로 되어 번지며 진물이 흘러내리고, 오래된 병반은 거북등처럼 갈라지는 현상을 가진다.
본 발명에서의 용어, "방제"란, 작물에 피해를 주는 각종 병해충을 예방하고 구제하는 것을 의미한다.
구체적으로, 상기 과수 화상병을 방제하는 방법은 본 발명의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 농약 조성물, 항균제, 소독제 또는 세척제의 유효량을 식물의 기부(basal) 또는 식물의 잎 부분에 처리하는 단계를 포함할 수 있으며, 더욱 구체적으로 식물의 병증 부위에 처리하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 박테리오파지는 Erwinia amylovora (에르위니아 아밀로보라) 및 Erwinia pyrifoliae (에르위니아 피리폴리애)에 특이적인 동시 사멸능을 가지며, 내산성, 내열성 및 내자외선성이 우수하므로, 과수 화상병 또는 가지검은마름병의 예방 또는 치료에 활용할 수 있을 뿐만 아니라, 항균제, 소독제, 또는 세척제 등에도 광범위하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따라 분리된 박테리오파지에 대한 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 분리된 박테리오파지의 감염 효능을 스팟 어세이 법에 따라 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 분리된 박테리오파지 내열성 및 내산성에 대한 효과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이 들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자 에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예 1: 샘플링 및 박테리오파지 분리
박테리오파아지는 숙주 박테리아가 존재하는 환경 주위에 높은 확률로 존재한다. 그래서 화상병 및 가지검은마름병이 발병한 농가 주위의 하천, 유출수, 농수로 등에서 샘플을 채취하여 에르위니아 피리폴리애 (Erwinia pyrifoliae) 균주에 대해 박테리오파지를 스크리닝 하였다.
부유물 제거를 위해 샘플을 8,000 g, 10분, 4 ℃의 조건으로 원심분리하고 pore size 0.45 μm로 여과 후 애르위니아 피리폴리애 액체배지와 1:1로 혼합하여 박테리오파지 증폭을 위하여 하룻밤동안 배양하였다. 배양된 균액을 원심분리하고 10배로 희석하여 10 μL씩 애르위니아 피리폴리애 균주에 스팟 어세이 (spot assay)하여 박테리오파지 유무를 확인하였다. 모양이 다른 플라크를 각각 5회 이상 더블레이어 어세이 (double layer assay)로 계대 배양하여 단일 박테리오파지로 확립하였다.
실시예 2: 스팟 어세이 (spot assay) 및 더블레이어 어세이 (double layer assay)
스팟 어세이의 경우 기존 방법에 변형을 가하여 수행하였다. 구체적으로, 하룻밤 배양한 숙주 세균 100 μL (109 CFU/mL)를 3 mL의 Top NB agar (0.375% agar)와 혼합하여 일반 NB 아가(agar) 배지 플레이트에 부어 균질하게 펴주었다. 상온에서 10분간 굳힌 후, 박테리오파지 용액 10 μL를 숙주세균과 균질하게 섞인 아가층에 떨어트리고, 27 ℃ 배양기에서 하룻밤 배양하여 플라크 유무를 조사하였다. 더블레이어 어세이 또한 기존 방법에 변형을 가하여 수행하였다. 구체적으로, 스팟 어세이와 마찬가지로 하룻밤 배양한 숙주세균 100 μL (109 CFU/mL)를 3 mL의 Top NB 아가(0.375% agar)와 혼합하고, 박테리오파지 용액 100 μL를 첨가하여 균질하게 섞어주었다. 이후, 일반 NB 아가 배지 플레이트에 부어 균질하게 펴주고 상온에서 10분간 굳힌 후, 27 ℃ 배양기에서 하룻밤 배양하여 플라크 유무를 조사하였다.
실시예 3: 박테리오파지 형태 분석
박테리오파지의 형태학적 분석은 투과전자현미경을 검경을 통하여 진행하였다. 박테리오파지 용액을 구리 그리드에 1분간 부착시키고 2% 우라닐 아세테이트 (uranyl acetate) 용액으로 10초 동안 염색하였다. 서울대학교 NICEM (National Instrumentation Center for Environmental Management)에서 120kV로 운영되는 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscope)를 사용하여 5개의 박테리오파지 (pEp_SNUABM_03, pEp_SNUABM_04, pEp_SNUABM_08, pEp_SNUABM_11 및 pEp_SNUABM_12)의 형태를 관찰하였다.
실시예 4: 박테리오파지 DNA 추출 및 분별 중합효소 연쇄반응 (PCR)
박테리오파지 DNA 추출은 기존 방법에 변형을 가하여 수행하였다. 구체적으로, 박테리오파지 용액 1 mL을 DNase I과 Rnase H 각 1 μL와 혼합하여 37 ℃에서 1 시간동안 반응시키고, EDTA를 처리하여 뉴클레이즈(Nuclease) 활성을 억제하였다. 그 후, 프로테네이즈(Proteinase) K 5 μL를 혼합하여 박테리오파지 외피 단백질을 용해시키고, 페놀-클로로포름-이소프로판올(Phenol-chloroform-isopropanol) 용액을 이용하여 DNA를 분리하였다. 최종적으로 에탄올을 활용하여 DNA를 석출시키고, 원심분리 (14,000 g, 10 분, 4 ℃)하여 Tris-EDTA 용액에 추출하였다.
박테리오파지 분별을 위하여 기존 중합효소 연쇄반응(PCR) 방법에 변형을 가하여 수행하였다. 사용한 프라이머는 OPL5 (5'-ACGCAGGCAC-3'), RAPD5 (5'-AACGCGCAAC-3'), P1 (5'-CCGCAGCCAA-3'), P2 (5'-AACGGGCAGA-3')이며, 반응 과정은 4반복 [94 ℃ (45초), 30 ℃ (120초), 72 ℃ (60초)] 이후, 26반복 [94 ℃ (5초), 36 ℃ (30초), 72 ℃ (30초)], 72 ℃ 10분을 이용하였고, 아가로오스 젤에 전기영동하여 패턴의 차이를 통하여 박테리오파지를 분별하였다.
실시예 5: 박테리오파지 DNA 서열 시퀀싱 및 유전정보 분석
박테리오파지 DNA를 Illumina HIseq 2500 platform을 이용하여 Macrogen에서 서열 분석을 실시하였다. CLC genomic workbench (v6.5.1)를 이용하여 어셈블(assemble)하고, 말단서열은 PCR을 이용하여 박테리오파지의 DNA가 원형인지 선형인지 판단하였다. 각 DNA의 예상되는 유전부위 (Open reading frame; ORF)들을 GenMarkS, RAST, Prokka 소프트웨어를 이용하여 예측하고, Protein BLAST를 이용하여 각 ORF의 기능을 예측하였다. tRNA의 유무는 tRNAscan-SE 소프트웨어를 이용하여 예측하고, 독성유전자와 항생제 내성 유전자의 유무를 Virulence Finder와 Res Finder를 이용하여 분석하였다.
분석이 완료된 박테리오파지 염기서열은 하기 표 1에서 확인할 수 있듯이, 미국 NCBI (National Center for Biotechnology Information)산하 GenBank에 등록하였다.
실시예 6: 박테리오파지 혼합용액 제작 및 특허기탁
박테리오파지 혼합 용액을 “에르위니아 박테리오파지 혼합용액 에르위가드 (Erwinia phage cocktail Erwiguard)”의 명칭으로 농촌진흥청 씨앗은행에 기탁번호 KACC 87002 로 기탁하였다.
분리된 박테리오파지의 정보 및 이들 혼합 용액의 조성은 하기 표 1과 같다.
Strain Taxonomy NCBI accession number Composition(%)
1 pEp_SNUABM_03 Autographiviridae MT822284 20
2 pEp_SNUABM_04 Autographiviridae MT822285 20
3 pEp_SNUABM_08 Siphoviridae MT822286 20
4 pEp_SNUABM_11 Autographiviridae MT822287 20
5 pEp_SNUABM_12 Autographiviridae; Ningirsuvirus MT822288 20
실시예 7: 박테리오파지 5종 및 칵테일의 세균 억제 효능 확인
상기 실시예 1 내지 6에서 신규 분리한 박테리오파지 5종(pEp_SNUABM_03, pEp_SNUABM_04, pEp_SNUABM_08, pEp_SNUABM_11 및 pEp_SNUABM_12)과 가지검은마름병균 에르위니아 피리폴리애 KACC 13945와 화상병균 에르위니아 아밀로보라 TS3128을 각각 혼합 배양하여 생육 억제능을 평가하였다.
실시예 7-1: 실험균주 준비
에르위니아 피리폴리애와 에르위니아 아밀로보라를 각각 뉴트리언트 아가(Nutrient agar)에서 27℃, 18시간 평판배양한 후, 성장한 콜로니를 뉴트리언트 브로쓰(Nutrient broth) 10 mL에 접종하여 2 x 105 CFU/mL 농도로 현탁하여 균원 시료로 사용하였다.
실시예 7-2: 박테리오파지 준비
박테리오파지를 더블레이어 법으로 증폭하여 여과(pore size: 0.45 μm)하여 무균 상태로 준비하였다. 박테리오파지 5종과 PBS에 골고루 현탁하여 1 x 108 PFU/mL 농도로 준비하였으며, 박테리오파지 칵테일 용액은 각각 20% 비율로 동일하게 혼합하여 박테리오파지 시료로 사용하였다.
실시예 7-3: 혼합배양
미리 준비한 에르위니아 피리폴리애 균원 시료액과 에르위니아 아밀로보라 균원 시료액에 5종 박테리오파아지 또는 혼합 칵테일 용액 100에 첨가하여 0시간부터 8시간까지 27℃ 배양기에서 혼합배양하였다.
실시예 7-4: 생장 억제능 확인
각각 반응시간대의 혼합액 100 μL를 회수하고 PBS로 다단계 희석하여 발현균수를 분석하였다.
그 결과, 하기 표 2에서 보는 바와 같이 본 발명의 신규 박테리오파지는 에르위니아 피리폴리애와 에르위니아 아밀로보라와 각각 혼합 배양하였을 때, 유해세균의 정상적인 생장을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다.
구분 E. amylovora
Control pEp_SNUABM-3 pEp_SNUABM-4 pEp_SNUABM-8 pEp_SNUABM-11 pEp_SNUABM-12 Cocktail
0시간 2.57 x 105 2.57 x 105 2.57 x 105 2.57 x 105 2.57 x 105 2.57 x 105 2.57 x 105
2시간 1.01 x 106 7.20 x 105 7.30 x 105 8.00 x 105 7.20 x 105 8.00 x 105 5.00 x 105
4시간 1.80 x 106 1.50 x 106 2.00 x 105 1.20 x 106 1.10 x 106 1.30 x 106 2.00 x 103
6시간 6.23 x 106 1.20 x 103 3.90 x 103 6.50 x 106 3.90 x 103 1.80 x 104 2.00 x 103
8시간 2.00 x 107 1.00 x 103 3.70 x 103 1.50 x 107 6.30 x 104 2.00 x 104 1.60 x 103
구분 E. pyrifoliae
Control pEp_SNUABM-3 pEp_SNUABM-4 pEp_SNUABM-8 pEp_SNUABM-11 pEp_SNUABM-12 Cocktail
0시간 2.30 x 105 2.30 x 105 2.30 x 105 2.30 x 105 2.30 x 105 2.30 x 105 2.30 x 105
2시간 5.37 x 105 1.00 x 102 1.00 x 102 6.30 x 105 5.50 x 103 1.00 x 102 1.00 x 102
4시간 1.93 x 106 1.00 x 102 1.00 x 102 1.60 x 106 8.40 x 103 1.00 x 102 1.00 x 102
6시간 7.20 x 106 3.00 x 103 5.00 x 102 2.90 x 106 4.70 x 104 5.00 x 102 3.00 x 102
8시간 2.30 x 107 1.10 x 103 1.40 x 103 8.30 x 106 2.20 x 105 3.10 x 103 8.00 x 102
구체적으로 상기 표 2에서 보는 바와 같이, 박테리오파지 처리군은 에르위니아 아밀로보라가 초기 2.57 x 105 CFU/mL에서 8시간 이후 2.00 x 107 CFU/mL로 크게 증가하였으나, 박테리오파지 5종(pEp_SNUABM_03, pEp_SNUABM_04, pEp_SNUABM_08, pEp_SNUABM_11, pEp_SNUABM_12) 처리군은 각각 1.00 x 103, 3.70 x 103, 1.50 x 107, 6.30 x 104, 2.00 x 104 CFU/mL로 큰 균 억제 효능을 보였다. 특히, 5종 혼합 칵테일 처리군은 4시간 이후부터 균 성장을 억제하였으며 최종적으로 8시간 이후 1.60 x 103 CFU/mL로 박테리오파지 단일 처리군에 비하여 매우 증대된 세균 억제 효능을 보이는 것을 확인하였다.
또한, 에르위니아 피리폴리애는 초기 2.30 x 105 CFU/mL에서 8시간 이후 2.30 x 107 CFU/mL로 크게 증가하였으나, 박테리오파지 5종(pEp_SNUABM_03, pEp_SNUABM_04, pEp_SNUABM_08, pEp_SNUABM_11, pEp_SNUABM_12) 처리군은 각각 1.10 x 103, 1.40 x 103, 8.30 x 106, 2.20 x 105, 3.10 x 103 CFU/mL로 매우 큰 균 억제 효능을 보였다. 특히, 모든 박테리오파지 처리군에서 2시간 이후부터 빠른 균 억제 효능을 보였으며, 5종 혼합 칵테일 처리군의 총 균수는 최종적으로 8시간 이후 8.00 x 102 CFU/mL로 박테리오파지 단일 처리군에 비하여 매우 증대된 세균 억제 효능을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8: 박테리오파지 감염 효능 분석
상기 실시예 1 내지 6을 통해 신규 분리된 박테리오파지 5종(pEp_SNUABM_03, pEp_SNUABM_04, pEp_SNUABM_08, pEp_SNUABM_11 및 pEp_SNUABM_12)과 그 혼합 칵테일 박테리오파지 용액의 가지검은마름병균과 화상병균에 대한 감염 효능을 평가하였다.
구체적으로, 감염 효능의 경우 최근 분리된 (2019년, 2020년) 에르위니아 아밀로보라 (E. amylovora) 92종, 에르위니아 피리폴리애 (E. pyrifoliae) 24종에 대하여 스팟 어세이 방법으로 감염능에 따라 다음과 같이 0~4점을 부여하여 분석을 진행하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
구분 감염능
pEp_SNUABM_03 pEp_SNUABM_04 pEp_SNUABM_08 pEp_SNUABM_11 pEp_SNUABM_12 cocktail
E.amylovora 98.91%
(91/92)		 97.83%
(90/92)		 2.17%
(2/92)		 76.09%
(70/92)		 2.17%
(2/92)		 98.91%
(91/92)
E.pyrifoliae 91.67%(22/24) 95.83%
(23/24)		 33.33%
(8/24)		 79.17%
(19/24)		 95.83%
(23/24)		 100.00%
(24/24)
그 결과, 상기 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 신규 분리된 5종 박테리오파지를 단일로 처리하였을 때는 화상병균 (E. amylovora)과 가지검은마름병균 (E. pyrifoliae)을 각각 1~98%, 52~100% 감염하는 것으로 확인할 수 있었다. 특히, 박테리오파지 칵테일 용액의 경우에는 화상병균 1주를 제외한 모든 병원성 균주에 대하여 효과적으로 감염 효능을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9: 박테리오파지의 내열성 및 내산성 검증
본 발명의 신규 분리된 박테리오파지 5종(pEp_SNUABM_03, pEp_SNUABM_04, pEp_SNUABM_08, pEp_SNUABM_11, pEp_SNUABM_12)의 내열성 및 내산성을 평가하였다.
구체적으로, 에르위니아 피리폴리에와 에르위니아 아밀로보라를 각각 뉴트리언트 아가에서 27 ℃, 18시간 평판배양한 후, 성장한 콜로니를 뉴트리언트 브로쓰 10 mL에 접종하여 2 x 105 CFU/mL 농도로 현탁하여 균원 시료로 사용하였다. 다음으로, 박테리오파지를 더블레이어법으로 증폭하여 여과 (pore size: 0.45 μm)하여 무균 상태로 준비하였다. 박테리오파지 5종과 PBS에 골고루 현탁하여 1 x 108 PFU/mL 농도로 준비하였다.
내열성을 검증하기 위해, 4, 20, 30, 40, 50 ℃의 온도 조건에서 박테리오파지 5종 용액을 1시간 동안 배양하고, 십진희석한 각 용액 100 μL와 실험균주를 혼합하여 실시예 2에서 기술된 더블레이어 어세이법으로 하루 배양하여 박테리오파지 농도를 계산하였다.
또한, 내산성 검증을 위해 각각의 산도조건(pH4, 5, 6, 7, 8, 9)에서 박테리오파지 5종 용액을 1시간 동안 배양하고, 십진희석한 각 용액 100 μL와 실험균주를 혼합하여 실시예 2에서 기술된 더블레이어 어세이법으로 하루 배양하여 박테리오파지 농도를 계산하여 도 3에 결과를 나타내었다.
그 결과, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 박테리오파지 5종 전부 일반적인 과일의 생육 적정 조건인 20~30 ℃에서 매우 뛰어난 내열성을 보였으며, 매우 높은 온도라고 할 수 있는 40 ℃ 에서도 매우 안정적인 모습을 보였다. 또한, 박테리오파지 5종 전부 이상적인 과수원 토양 산도(pH 6~7)을 포함하여 극한의 조건에서도 매우 안정적인 내산성을 보였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
농업생명공학연구원 KACC87002BP 20201109

Claims (9)

  1. pEp_SNUABM_03(NCBI accession number: MT822284), pEp_SNUABM_04(NCBI accession number: MT822285), pEp_SNUABM_08(NCBI accession number: NB184886), pEp_SNUABM_11(NCBI accession number: MT822287) 및 pEp_SNUABM_12(NCBI accession number: MT822288)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고, Erwinia amylovora (에르위니아 아밀로보라) 및 Erwinia pyrifoliae (에르위니아 피리폴리애)에 동시 사멸능을 갖는, 박테리오파지.
  2. 제1항에 있어서, pEp_SNUABM_03(NCBI accession number: MT822284), pEp_SNUABM_04(NCBI accession number: MT822285), pEp_SNUABM_08(NCBI accession number: NB184886), pEp_SNUABM_11(NCBI accession number: MT822287) 및 pEp_SNUABM_12(NCBI accession number: MT822288) 5종을 모두 포함하는 박테리오파지 박테리오파지는 수탁번호 KACC87002BP로 기탁된, 박테리오파지 에르위니아 파지 칵테일 에르위카드(Erwinia phage cocktail Erwiguard)인 것인, 박테리오파지.
  3. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 농약 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 박테리오파지는 과수 화상병 (fire blight) 및 가지검은마름병의 예방 또는 치료에 사용되는 것인, 농약 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 농약 조성물은 수간주사 조성물, 생물제제 조성물, 비 료 조성물, 영양 조성물, 식물 강화 조성물, 식물 보호 조성물, 토양 개량 조성물 (soil conditioner composition), 및 생산량 증가 조성물 (yield enhancer composition)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 것인, 농약 조성물.
  6. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항균제.
  7. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제.
  8. 제1항의 박테리오파지를 처리하는 단계를 포함하는 Erwinia amylovora (에르 위니아 아밀로보라) 및 Erwinia pyrifoliae (에르위니아 피리폴리애) 동시 용균 방법.
  9. 제1항의 박테리오파지를 처리하는 단계를 포함하는 과수 화상병 및 가지검은마름병을 방제하는 방법.
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