CN108559718B - 一株捕食植物病原细菌的叶柄粘球菌及其在细菌性病害生物防治中的应用 - Google Patents

一株捕食植物病原细菌的叶柄粘球菌及其在细菌性病害生物防治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株捕食植物病原细菌的叶柄粘球菌及其在细菌性病害生物防治中的应用。一株拮抗植物病原细菌的粘细菌BS,保藏号为CCTCCNO.M2017496。本发明所述的叶柄粘球菌BS通过捕食的方式抑制白菜软腐病菌、马蹄莲软腐病菌、番茄青枯病菌、马铃薯黑胫病菌以及梨火疫病菌等多种植物病原细菌的生长，显示出粘细菌BS广谱的抗病原细菌能力。盆栽实验显示粘细菌BS能够有效的抑制胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum)对土豆和马蹄莲的侵染，降低软腐病的发病率，可用于植物病原细菌所引起的植物病害的生物防治。

Description

一株捕食植物病原细菌的叶柄粘球菌及其在细菌性病害生物 防治中的应用
技术领域
本发明属于应用微生物学领域，涉及一株捕食植物病原细菌的叶柄粘球菌及其在细菌性病害生物防治中的应用。
背景技术
植物病害是农作物优质高产的重要制约因素之一，据估计全球主要农作物的平均病害损失约占总产量的近14％，每年直接经济损失高达数千亿美元。为了应对植物病害所造成的危害，目前化学农药防治和作物育种已成为重要的手段，然而化学农药所带来的环境污染和育种周期长等特点的限制，使得环境友好型生防手段成为研究的焦点。微生物生物防治技术具有高效、无污染且土壤定值能力强等特点，符合农业可持续发展的要求，已逐渐成为植物病害防治的重要手段。
细菌性软腐病能引起十字花科作物、番茄、马铃薯、瓜类等植物软腐病的发生，如白菜软腐病和马蹄莲软腐病，该病症是由胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum,简称Pcc)引起。该病害在前期干旱、后期多雨或灌水不当的情况下，易造成植物根部腐烂，从而给农民带来较大的经济损失。
细菌性萎蔫病于各地普遍发生，特别是在南方及多雨年份发生较为严重。发病严重时造成植株青枯死亡，导致减产甚至绝收，如番茄青枯病，发病时导致全株萎蔫。此病症由细菌青枯假单胞菌Pseudomanas solanacearum(Smith)侵染引起。能够侵染包括番茄、茄子、辣椒、马铃薯以及生姜等在内的多种作物。
梨火疫病是欧洲梨树上的毁灭性病害，属危险性病害，也是我国重要的检疫对象。梨火疫病菌的寄主范围广，能危害梨、苹果、山楂、木旬子以及李树等40多个属220多种植物。该病由Erwinia amylovora引起，当植物花、果实和叶片受火疫菌侵染后很快变黑褐色枯萎，犹如火烧一般。
菊花枯萎病菌拉丁学名为菊欧文氏菌Dickeya chrysanthemi，菊欧氏菌是一种软腐病菌，常危害植物的肉质部分，如块茎、插枝、肉质叶。该病菌也能在植株的木质部定殖并形成***侵染，因此，也是一种维管束致萎蔫病菌，其特殊的侵染方式造成目前常用的化药方法无法对其进行有效防治。
伤流溃疡病(Dickeya fangzhongdai)也属细菌性病害，具有隐蔽性、爆发性和毁灭性的特点，外观症状出现前无法判断是否有该病，症状一旦出现后造成无法弥补的损失。轻者枝条枯死、树干产生病斑，严重时整个植株死亡。目前在梨树等果树类植物中已造成严重的经济损失。另外由Dickeya solani引起的黑胫病也是一种较为严重的细菌性病害，病菌可以在土壤中的植株残体上或贮藏期间的病薯上越冬。常见的有马铃薯黑胫病，甘蓝黑胫病，天竺葵黑胫病等。
传统的病害防治方法如轮作的栽培方式可以有效降低发病程度，但是不能根本上解决病害，化学农药虽然能根本去除病害，但也给环境带来巨大的污染和破坏，同时通过生物链富集也会对人体健康造成威胁。因此，通过寻求新型的防病、治病手段，达到有效的控制病原细菌病害，已成为生产实践中迫切需要解决的课题。基于生物防治的高效、安全、环保等优点以及人们对粮食以及生食蔬菜的需求，采取生物防治方法已经成为人们关注的焦点问题。
目前微生物生防菌主要为真菌类的哈茨木霉、寡雄腐霉、粘帚霉和拟青霉等，细菌类的芽孢杆菌和假单胞菌等，另外还包括一些放线菌和病毒的弱毒株系等。粘细菌(myxobacteria)是一类具有复杂的多细胞行为和形态的原核生物，具有复杂的多细胞行为特征以及丰富的产次级代谢产物的产生能力。粘细菌作为新型生防菌株具有优于已报道生防菌的特征，包括良好的微生物捕食能力、土壤定殖能力、能够产生丰富的新型次级代谢产物、能够产生抗逆性强的粘孢子以及参与土壤有机物代谢等，这些特征使得粘细菌作为生防菌具有良好的优势。目前对于粘细菌发育学特征及次级代谢产物的研究较多，而粘细菌在植物病原菌的生物防治方面的研究和应用较少，其中作为专利保护的主要是广东省微生物所申请的Myxococcus sp.e-3-1,Polyangium sp.8#-3和Cystobacter sp.XJ9-1在制备捕食和抑制植物病原细菌的药物中的应用(201611095485.2)等。因此，粘细菌在防治植物病原细菌病害方面具有较大的应用空间。然而不同种属菌株之间的抗菌效果存在较大的差异，如芽孢杆菌在抗植物病原菌方面显示不同的抗菌特性，相关菌株也均申请了专利保护(201380042989.6；201410164779.0及201510666311.6等)。因此基于现有生防菌的专利保护现状，尤其粘细菌作为一类具有应用潜力的生防微生物，不同特性且具有良好的生防能力的新型粘细菌的筛选及专利保护对于植物病害的生物防治具有重要的意义。
发明内容
本发明提供一株粘细菌Myxococcus stipitatus BS在防治植物病原细菌中的应用。
一株拮抗植物病原细菌的粘细菌BS,分类命名为叶柄粘球菌(Myxococcusstipitatus)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏日期为2017年9月12日，其保藏号为CCTCCNO：M2017496。
本发明所述的粘细菌菌株BS的培养物、菌株菌液、菌株发酵培养液或发酵培养液的过滤液。
本发明所述的粘细菌BS为活性成分的生物菌剂和生物肥料。
本发明所述的粘细菌BS在防治植物病原细菌中的应用，其中所述的病原细菌包括胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种Pectobacterium carolovora subsp.Carolovora，青枯假单胞菌Pseudomanas solanacearum(Smith)，菊欧文氏菌Dickeya chrysanthemi，伤流溃疡病菌Dickeya fangzhongdai，黑胫病菌Dickeya solani或梨火疫病菌Erwinia amylovora(Ea)。
本发明所述的粘细菌菌株BS的培养物、菌株菌液、菌株发酵培养液或发酵培养液的过滤液在防治植物病原细菌中的应用，其中，所述的病原细菌包括胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种Pectobacterium carolovora subsp.Carolovora，青枯假单胞菌Pseudomanassolanacearum(Smith)，菊欧文氏菌Dickeya chrysanthemi，伤流溃疡病菌Dickeyafangzhongdai，黑胫病菌Dickeya solani或梨火疫病菌Erwinia amylovora。
所述的应用，优选将所述的粘细菌BS进行培养，得到菌株培养物、菌株菌液、菌株发酵培养液或发酵培养液的过滤液；用所得到的菌株培养物、菌株菌液、菌株发酵培养液或发酵培养液的过滤液应用于所述的植物病原细菌的生物防治。
本发明中粘细菌Myxococcus stipitatus BS在盆栽实验中对胡萝卜软腐果胶杆菌所引起的土豆和马蹄莲软腐病均显示出良好的生防效果。
有益效果
本发明采用兔粪子实体诱导法成功的从所采集的土样中筛选到一株粘细菌菌株BS，经鉴定为叶柄粘球菌(Myxococcus stipitatus)，该菌在生长过程中能够以多种植物病原细菌为食物，裂解病原菌为自身生长繁殖提供营养物质。该粘细菌对多种植物病原细菌良好的捕食能力显示其对病原细菌的广谱抗性。基于捕食实验及土豆和马蹄莲盆栽实验，表明本发明涉及的粘细菌Myxococcus stipitatus BS在植物病原细菌防治方面具有巨大的应用潜力。
附图说明
图1菌株纯化流程图
图2菌株的特性图片
a图为菌株BS形成的子实体结构图；b图为菌株BS菌落形态图；c图为菌株BS菌体形态图(100×)；D图为菌体透射电镜图。
图3 Myxococcus stipitatus BS对多种病原细菌具有良好的捕食能力
a粘细菌BS对多种植物病原细菌的平板捕食实验；b BS捕食多种植物病原细菌后病原细菌活菌数据统计。植物病原细菌为梨火疫病菌；梨树伤流溃疡病菌；菊花枯萎病菌；茄科黑胫病菌；马蹄莲软腐病菌和番茄青枯病菌。
图4菌株BS培养发酵液对Pcc生长的影响。
CK为起始Pcc的菌体量；BS上清为菌株BS上清液；热失活为对菌株BS上清液进行100℃热处理后的上清液。
图5盆栽实验中菌株BS对马蹄莲软腐病的防治效果。
a盆栽实验中马蹄莲的生长情况；b盆栽实验中马蹄莲根茎球的腐烂情况分析。
生物材料保藏信息
叶柄粘球菌BS(Myxococcus stipitatus BS),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏日期为2017年9月12日，保藏号为CCTCC NO：M2017496。
具体实施方式
实施例1.菌株的分离纯化
1.1样品采集后室温下自然风干(减少霉菌及杂菌的污染)。
从安徽等地采集土样样品在室温条件下自然风干。
1.2粘细菌子实体的诱导
1.2.1粪粒诱导平板法：将风干的土样盛大约20克于培养皿内，在土样表面半埋入3-4个灭过菌的兔粪，加入25μg/ml***灭菌的放线菌酮(25mg/ml)或多菌灵(30mg/l)，浸泡6h后，倒去残液，30℃保温培养，48h后开始观察粪球上子实体的形成。
1.2.2酵母诱导平板法：以WCX(放线菌酮25mg/ml)培养基作为基础培养基，倒入无菌平板，在培养基表面用酵母划十字线，在十字线中心放少量土样，30℃恒温培养，72h后开始观察子实体的形成。
1.3兔粪诱导子实体的形成
1.3.1粘细菌的分离纯化
①用毛细管尖端挑取1.2.1诱导出的子实体，接种于YWCX(WCX培养基：0.1％CaCl2·2H2O；1.5％Agar；25μg/ml放线菌酮溶液；0.1％的结晶紫；pH值7.2)培养基上(用灭菌酵母交叉划线)，30℃培养。
②如发现蠕虫，将初步分离纯化的菌落接种于VY/4(安琪酵母0.5％，CaCl2·2H2O0.1％，维生素B12 0.5μg/ml，琼脂粉1.5％，0.1％的结晶紫；pH 7.2；)斜面培养基上，置-80℃冰箱冷冻48h，取出后立即再采用YWCX培养基反复转接法，直至得到纯菌株。
③用毛细管尖端及时挑取疑似菌落边缘的细菌，反复转接于含VY/4培养基的平板，30℃恒温保湿培养。如发现蠕虫，将初步分离纯化的菌落接种于VY/4斜面培养基上置-80℃冰箱冷冻48h。
1.4 LB培养基验证纯度
将纯化后的粘细菌BS接种于LB培养基(tryptone 1％，NaCl 1％，yeast extract0.5％)中，30℃振荡培养过夜培养液澄清即表明该粘细菌为纯菌株。
1.5菌种菌株的功能验证与菌种保藏
1.5.1将纯化的菌株BS接种到VY/4固体平板培养基上，查看透明圈的形成情况。
1.5.2兔粪真空干燥保藏法。将纯化的菌种接种到经高温灭菌消毒的食草兔粪上，30℃培养5–8d，当子实体出现的时候，将长有子实体的兔粪放入到真空干燥器中保存。
实施例2.菌株的鉴定
2.1形态学特征
分离筛选得到的粘细菌BS经革兰氏染色显示阴性，通过结晶紫染色在油镜下观察发现单菌的形态呈杆状，无鞭毛，两端呈透明状，透射电镜下观察菌体周围有一层粘液层；通过光镜10×观察发现该菌株在生长的过程具有群体效应，生长后期菌落聚集在一起形成子实体(图2)。
2.2鉴定
通过对该菌株16S rDNA的PCR扩增，得到该菌的16S rDNA基因序列，登录NCBI(www.ncbi.nlm.nih.govPblastP)，获取与实验菌株相似的典型菌株的16S rDNA序列。将所得测序结果与数据库中已知序列利用BLAST软件在GenBank数据库中进行比对，通过序列比对分析及常规的生理生化分析，将该菌株初步鉴定为Myxococcus stipitatus，命名为BS。发明专利(201611095485.2)所述的粘细菌Myxococcus sp.e-3-1分离自新疆阿克苏盐碱地土壤，根据文献报道该地区土壤盐度为233.8g/kg(张鲜姣等，2012)，说明该菌能够在较高的盐度条件下生长。本发明所述的粘细菌Myxococcus stipitatus BS在233.8g/kg以及200g/kg的盐度条件下不生长，表明本发明所述的Myxococcus stipitatus BS在生长特性方面与发明专利(201611095485.2)所述的粘细菌Myxococcus sp.e-3-1存在明显差别，并非同一种细菌。
实施例3.粘细菌(Myxococcus stipitatus BS)对植物病原细菌捕食作用的研究3.1菌株BS对多种植物病原细菌捕食作用研究。
Ea、Dickeya fangzhongdai、Dickeya chrysanthemi、Dickeya solani、Pcc、RS接种于LB液体培养基(tryptone 1％,NaCl 1％,yeast extract 0.5％)中，30℃过夜培养，8000rpm离心3min，收集菌体，用无菌水重悬使其OD600为10。将其悬滴至TPM(10mM Tris-HCl[pH7.6],1mM KH2PO4[pH 7.6],8mM MgSO4))固体平板上吹干待用。将菌株BS(CCTCCM2017496)接种到CYE液体培养基(Casitione 1％，Yaest extract 0.5％MgSO4·7H2O0.1％pH 7.2-7.6)中，30℃培养2天，8000rpm离心3min，收集菌体，用无菌水重悬菌体，菌体浓度为108cells/l，悬滴于吹干的病原细菌菌苔上，30℃培养3-5天观察粘细菌扩展情况，以不接粘细菌为阴对照。培养1天后，可观察到粘细菌能够以植物病原细菌为营养物质扩散性生长。培养3天后，粘细菌能够完全扩散至病原细菌菌落边缘，并且在跨过的区域形成子实体，说明粘细菌具有良好的捕食特性。此时将整个菌落刮取，通过稀释涂布法于LB固体平板中统计植物病原细菌的残留量。各种病原细菌的残留量从之前数量级108下降到106。结果表明粘细菌BS对多种植物病原细菌均显示出良好的捕食能力，显示其良好的广谱抗病原细菌能力(图3)。
3.2菌株BS发酵培养液对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种Pcc生长的影响
将菌株BS(CCTCC M2017496)接种到CYE液体培养基(Casitione 1％，Yaestextract 0.5％MgSO4·7H2O 0.1％pH 7.2-7.6)中，30℃培养2天，8000rpm离心5min，收集上清液且用细菌滤器除去残留的细菌菌体，用上清发酵液与Pcc混菌后静置30℃培养16h后，稀释涂布统计Pcc残留量，以热煮沸处理和生理盐水对照。数据表明BS的发酵液对Pcc的生长也具有部分抑制作用(图4)。
3.3菌株BS的次生代谢产物对Pcc生长的影响
参照发明专利(201611095485.2)中的制备方法，在VY/2培养基(5g安琪活性酵母，加水煮沸10min，待冷却后加入1g MgSO4,1g CaCl2,调pH至7.4，定容至1L，高温湿热灭菌)中接种粘细菌BS，30℃，于180rpm培养5天，8000rpm离心，收集菌体和发酵液上清。发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取12h，萃取液旋转蒸发后，用甲醇溶解萃取物，得到发酵液萃取物。菌体用丙酮浸泡后超声波破碎，然后用乙酸乙酯萃取12h，萃取液旋蒸后，用甲醇溶解萃取物，得到菌体破碎液萃取物。发酵液萃取物和菌体破碎液萃取物用甲醇分别溶解成50mg/mL和100mg/mL浓度。接种病原菌到LB液体培养基180rpm，30℃培养到对数期。将对数期的植物病原菌(Pcc)溶液按体积比1：100比例与50℃左右的3mL LB半固体琼脂培养基(0.75％agar)混合，摇均后铺板。在平板上粘附已滴加5uL不同浓度的发酵液萃取物或者菌体破碎液萃取物溶液的6mm直径滤纸片。与37℃培养24-36h后测定抑菌圈直径。结果发现发酵液萃取物在50mg/ml浓度对Pcc的抑菌圈为5.5±0.3mm，菌体破碎液萃取物在50mg/ml浓度对Pcc的抑菌圈为6.5±0.5mm。该抑菌性质相比较发明专利(201611095485.2)中涉及的Myxococcussp.e-3-1存在明显差别，即在Myxococcus sp.e-3-1中次级代谢物具有良好的抑菌作用，而本专利涉及的Myxococcus stipitatus BS的抗菌效果主要通过粘细菌的捕食作用实现的。
实施例4.粘细菌(Myxococcus stipitatus BS)抗植物病原细菌的应用评估
为了研究本发明所涉及的粘细菌BS在实际应用过程对植物病原细菌的生防作用，本发明选取胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pcc)作为研究材料，以土豆块实验和马蹄莲盆栽实验验证粘细菌BS在土壤环境下的生防能力。
4.1软腐病侵染土豆块实验
将3.1收集的菌体用无菌水重悬至浓度为3×108接种于感染软腐病Pcc的土壤中，通过马铃薯块茎感染病原菌程度(组织腐烂，计算腐烂率)评估Myxococcus stipitatus BS防治的效果，以不接BS的和化学药剂处理作为参照。在室温放置第5天后，Pcc组腐烂率达到45.05％，而加粘细菌Myxococcus stipitatus BS组腐烂率为0，而在第10后，Pcc组别的腐烂率达到96.71％，几乎完全腐烂，而粘细菌处理组的发病率在18.39％(表1)。说明在土壤环境条件下，粘细菌BS能够很好的抑制病原菌Pcc的侵染，降低软腐病的发病率。
表1菌株BS对马铃薯块茎软腐病的防治效果
处理 初始发病率(％) 第五天发病率(％) 第十天发病率(％)
水 0±0 2.15±0.029a 27.51±0.113b
Pcc 0±0 45.05±0.104b 96.71±0.156a
Pcc+Agricultural-streptomycin 0±0 14.98±0.065a 88.69±0.088a
Agricultural-streptomycin 0±0 0±0a 13.59±0.04b
BS 0±0 0.93±0.012a 14.78±0.152b
Pcc+BS 0±0 0±0a 18.39±0.183b
4.2马蹄莲盆栽实验
将菌株BS摇瓶发酵3天，接种于被软腐病侵染的彩色马蹄莲的根部，一组加水浸泡另一组不加水同时灌溉BS菌悬液，对照为清水。在植物生长过程中观察发病情况，后期统计马蹄莲块茎腐烂状况。数据表明加BS菌悬液的处理组，植株长势很好，不发病，而对照组发病严重，部分植株死亡。后期收集马蹄莲块茎，统计块茎腐烂情况。结果表明两个对照组的块茎均空壳，腐烂。而BS菌悬液处理组的块茎基本完好，且部分块茎长出新球(图5)。说明在土壤环境中，粘细菌BS能够抑制Pcc对马蹄莲根部的侵染，降低软腐病的发病率，即使在高湿度的环境条件下，依然显示出良好的生物防治效率，显示出菌株BS良好的生防潜力。

Claims (6)

1.一株拮抗植物病原细菌的粘细菌BS,分类命名为叶柄粘球菌（Myxococcusstipitatus），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏日期为2017年9月12日，其微生物保藏号为CCTCCNO. M2017496。
2.权利要求1所述的粘细菌菌株BS的培养物、菌株菌液、菌株发酵培养液或发酵培养液的过滤液。
3.权利要求1所述的粘细菌BS为活性成分的生物菌剂或生物肥料。
4.权利要求1所述的粘细菌BS在防治植物病原细菌中的应用，其中所述的病原细菌选自胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum），青枯假单胞菌（Pseudomanas solanacearum (Smith) ），菊欧文氏菌（Dickeya chrysanthemi），伤流溃疡病菌（Dickeya fangzhongdai），黑胫病菌（Dickeyasolani）或梨火疫病菌（Erwinia amylovora）。
5.权利要求2所述的粘细菌菌株BS的培养物、菌株菌液、菌株发酵培养液或发酵培养液的过滤液在防治植物病原细菌中的应用，其中，所述的病原细菌选自 胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum），青枯假单胞菌（Pseudomanas solanacearum (Smith) ），菊欧文氏菌（Dickeya chrysanthemi），伤流溃疡病菌（Dickeya fangzhongdai），黑胫病菌（Dickeya solani）或梨火疫病菌（Erwiniaamylovora）。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征是，包括将权利要求1所述的粘细菌BS进行培养，得到菌株培养物、菌株菌液、菌株发酵培养液或发酵培养液的过滤液；用所得到的菌株培养物、菌株菌液、菌株发酵培养液或发酵培养液的过滤液应用于所述的植物病原细菌的生物防治。
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