KR20220063839A - 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 중간엽 줄기세포 배양액 및 이의 제조방법 - Google Patents

상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 중간엽 줄기세포 배양액 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 중간엽 줄기세포 배양액 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 알긴산나트륨을 이용한 3차원 배양방법에 의해 고함량의 성장인자 및 사이토카인을 포함하는 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 중간엽 줄기세포 배양액 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 중간엽 줄기세포 배양액 및 이의 제조방법{Mesenchymal stem cell culture media for promoting wound healing or skin regeneration, and preventing alopecia or activating hair growth and a method for preparing the same}
본 발명은 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 중간엽 줄기세포 배양액 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 알긴산나트륨을 이용한 3차원 배양방법에 의해 고함량의 성장인자 및 사이토카인을 포함하는 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 중간엽 줄기세포 배양액 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
일반적인 창상의 치유는 손상된 조직 및 침입한 병원균의 제거와 손상된 조직의 재형성이 필요한 연속과정으로 1) 백혈구 등의 염증세포가 모여들어 외부에서 침입한 균과 죽은 조직 등을 제거하는 염증과정, 2) 백혈구가 분비한 성장인자의 자극에 의해 상처주위의 상피세포가 이동하고 증식하여 손상된 부분을 덮고 진피층의 섬유세포가 콜라겐을 축적시켜 새로운 모세혈관을 생성하고 흠을 채워 상피화가 일어나는 증식과정, 3) 염증세포가 사라지고 임시로 생성된 육아조직이 원래의 피부조직에 가깝게 성숙되는 성숙과정을 거치게 된다. 이러한 복구 과정은 다양한 성장 인자 및 사이토카인 - 인슐린양성장인자(Insulin-like Growth Factor; IGF), 형질전환성장인자 (Transforming Growth Factor beta; TGF-β), 혈관내피세포성장인자 (Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF), 염기성 섬유아세포성장인자(basic Fibroblast Growth Factor; bFGF), 혈소판유래성장인자(Platelet derived Growth Factor; PDGF), 신경성장인자(Nerve Growth Factor; NGF), 과립구 단핵구 콜로니 자극인자(Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor; GM-CSF), 표피세포성장인자(Epidermal Growth Factor; EGF), 간세포성장인자(Hepatocyte Growth Factor; HGF)의 작용을 통하여 진행되며, 또한 염증성 세포, 섬유아세포, 케라티노사이트 및 내피 세포와 같은 상이한 형태의 세포들의 상호 작용을 통하여 진행된다.
일반적인 상처는 상기 창상 치유 과정의 순차적인 진행을 통하여 쉽게 치유될 수 있으며, 피부의 재생 또는 창상 치료는 염증반응(inflammation), 재상피화(re-epithelialization), 육아조직의 형성(granulation), 섬유조 직형성(fibroplasia), 창상조직의 수축(contraction) 등 여러 가지 과정을 통해 이루어진다(Freedberg et al., J. Clin. Psychol., 57: 433-455, 2001). 피부 재생의 일련의 과정들은 각질세포(keratinocytes), 섬유아세포(fibroblasts), 내피세포(endothelial cells), 대식세포(macrophage), 혈소판(platelets) 등과 같은 여러 세포들의 협력에 의해서 이루어지며 이러한 세포들의 이동, 침윤, 증식, 분화와 같은 복합적인 진행은 다양한 성장 인자, 사이토카인, 케모카인에 의해서 조절 받기에 생물학적 인자나 화학물질의 유효성이 알려져 있다.
그러나, 상기 성장인자, 사이토카인을 이용한 창상 치유 기술은 이들 단백질을 생산, 분리하는 데 많은 비용이 소요되며, 창상 치유 과정에는 이들 단백질들이 복합적으로 작용하기에 한 가지 종류의 단백질만을 사용할 경우 창상치료제로 부분적인 창상 완화를 제공하지만, 치유기간이 길고 치료에 대한 반응이 최적에 미치지 못하는 등 비효과적이라는 점 때문에 실제 상용화에 문제점이 있다.
한편, 모발은 피부 부속 기관의 하나로 생태학적으로 상피에서 유래하며, 태생 2개월째부터 형성된다. 모발의 종류는 그 굵기에 따라 가는 모발의 세모(Vellus hair)와 굵고 딱딱한 경모(terminal hair)로 분류된다. 모발의 성장은 주기적이며 일시적으로 탈모되지 않는다. 각 모낭은 활동과 정지의 간헐적인 단계를 거친다. 성장기(growing phase), 즉 생장기(anagen) 동안 모구의 세포는 활발히 분화하여 성장 모발을 형성한다. 인간의 두발은 85%가 3～6년의 성장기 두발이고, 5%가 두발의 퇴화가 시작되어 2～3주간 진행되는 퇴행기며, 나머지 10%가 두발의 성장이 멈추는 3～4개월간의 휴지기로 하루 평균 50～100여개 정도가 빠진다. 탈모의 원인으로는 유전, 영양장애, 내분비장애, 조직 장애, 모낭충, 두부의 압박, 비듬, 자가 면역, 국소감염 등을 들 수 있다. 탈모는 모발형성에 밀접한 모낭에서의 호르몬, 단백질 등의 대사 작용의 이상과 현대사회로 들어서면서 여성들의 사회활동 증가로 인한 스트레스 증가 및 서구화된 식습관에서 오는 영양의 불균형 등 탈모에 직·간접적으로 영향을 미칠 수 있는 많은 사회 문화적인 요인들의 변화에서 기인하는 것으로 생각되고 있다(J. Kor. Soc. Cosm. Vol. 13, No. 3(2007) p.1366-1375).
현재 탈모 예방 및 치료는 의학적 접근법과 한의학적 접근법으로 나누어 볼 수 있다. 의학적 접근법으로는 약물 요법, 수술적 방법, 영양요법, 식이요법 등이 있다. 현재 모발 성장을 촉진하는 약물로는 미국 Food and Drug Administration (FDA)에서 공인 받은 Minoxidil(MXD)과 Finasteride가 있으며 치료를 중단하면 원래대로 돌아가고 오랫동안 사용하면 피부염 등의 부작용이 보고되고 있다(Kaufman K.D.(1996) Elsevier Science, 363－365). 따라서, 탈모 방지 및 모발 성장 촉진 효과가 우수하며 장기간 사용에도 부작용이 전혀 없는 탈모 방지 및 모발 성장 촉진용 조성물의 개발이 필요한 실정이다.
최근 줄기세포 연구가 활발해지면서 줄기세포가 피부세포로 분화가 가능하고 피부세포보다 활성이 높아 더 많은 양의 다양한 성장인자를 분비하고, 면역반응까지 조절할 수 있다는 것이 밝혀지면서 줄기세포를 당뇨를 유발한 쥐의 창상 부위에 이식하여 당뇨성 창상을 치료하는 방법이 시도되고 있다(J Diabetes Res. 2013; 2013:647107, Diabetes. 2013 Jul;62(7):2588-94, Plast Reconstr Surg. 2011 Oct;128(4):872-80). 또한, 중간엽 줄기세포는 배양 과정에서 다양한 성장인자 및 생리활성물질을 분비하는 것으로 알려지면서, 이를 배양한 줄기세포배양액은 의약품이나 화장품 조성물 등의 임상적 용도로 사용이 가능하다.
그러나, 중간엽 줄기세포를 배양하기 위해서는 통상적으로 소혈청을 사용하는데, 소혈청이 함유된 배양액은 임상적 적용이 부적당하다. 즉, 세포 배양액의 임상적 적용을 위해서는 소혈청과 같은 동물 유래 단백질의 사용이 제한되므로, 줄기세포의 배양에는 소혈청을 배제하는 것이 바람직하다. 소혈청 단백질은 줄기세포의 증식 및 유지를 위해서 반드시 필요하므로, 무혈청 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하면서도 고농도의 생리활성물질을 함유하는 배양액을 얻을 수 있는 방법이 요구된다.
이에, 본 발명자들은 부작용이 적고 피부에 임상적 적용이 가능한 줄기세포 배양액 및 이를 제조하는 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 해조류에서 추출되는 알긴산나트륨을 이용하여 무혈청 배지에서 3차원 배양으로 중간엽 줄기세포 배양액을 수득할 수 있고, 상기 수득한 중간엽 줄기세포 배양액에서 상처 치유 및 탈모 억제 효능을 나타내는 성장인자 및 사이토카인이 고농도로 분비되고, 우수한 피부세포 및 모유두세포 증식 촉진 효과를 나타냄을 확인하였다. 이에 상기 방법에 따라 수득한 배양액을 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진을 위해 이용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진하는 고함량의 성장인자 및 사이토카인을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양액의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는, 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 중간엽 줄기세포의 현탁액과 알긴산나트륨 용액을 혼합한 후, 상기 혼합 현탁액을 2가 양이온을 포함하는 용액에 떨어뜨려 비드를 형성하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)의 비드 형성 후, bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(epidermal growth factor) 중 어느 하나 이상을 첨가한 무혈청 배지에서 3차원 배양하여 중간엽 줄기세포 배양액을 수득하는 단계를 포함하는, 성장인자 및 사이토카인을 함유한 중간엽 줄기세포 배양액 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는, 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는, 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 피부 외용제를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는, 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 방법에 따라 낮은 점성도를 가지는 알긴산나트륨을 이용하여 3차원 배양으로 수득한 중간엽 줄기세포 배양액에서 상처 치유 및 탈모 억제 효능을 나타내는 성장인자 및 사이토카인이 고농도로 분비되고, 우수한 피부세포 및 모유두세포 증식 촉진 효과가 나타나므로, 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 중간엽 줄기세포 배양액은 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에서 이용한 알긴산나트륨은 천연물에서 유래하여 공정 중 동물유래 물질을 배제할 수 있으므로, 안전한 조성물을 얻을 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 3차원 배양방법에 의해 수득된 중간엽 줄기세포 배양액(3D CM)에 함유된 성장인자 및 사이토카인 양상을 어레이를 이용하여 확인한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 3차원 배양방법에 의해 수득된 중간엽 줄기세포 배양액(3D CM)에 함유된 성장인자 및 사이토카인 양상을 ELISA를 이용하여 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 비교예에 따라 2차원 배양방법에 의해 수득된 중간엽 줄기세포 배양액(2D CM) 및 본 발명의 일 실시예에 따라 3차원 배양방법에 의해 수득된 중간엽 줄기세포 배양액(3D CM)에 함유된 성장인자 및 사이토카인 양상을 어레이를 이용하여 비교한 도이다.
도 4는 본 발명의 일 비교예 및 일 실시예에 따라 2,000 CPS 이상 및 300 CPS 이하의 알긴산나트륨으로 3차원 배양하여 수득한 중간엽 줄기세포 배양액에 함유된 HGF의 함량을 확인한 도이다.
이하, 본 발명의 용어를 하기와 같이 정의한다.
본 명세서에서 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)"는 자기 증식이 가능하고 다분화능을 가지고 있으며, CD73+, CD90+, CD105+, CD14-, CD20-, CD34-, CD45- 인 세포 표현형을 나타내는 세포를 의미하고, 지방, 골수, 제대혈, 간, 근육등에서 분리될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에서 "줄기세포 배양액"은 줄기세포를 배양한 세포배양 상등액을 지칭한다. 줄기세포 배양액은 줄기세포 배양 과정에서 세포로부터 분비되는 여러 가지 생리활성물질을 함유하고 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은
(1) 중간엽 줄기세포의 현탁액과 알긴산나트륨 용액을 혼합한 후, 상기 혼합 현탁액을 2가 양이온을 포함하는 용액에 떨어뜨려 비드를 형성하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)의 비드 형성 후, bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(epidermal growth factor) 중 어느 하나 이상을 첨가한 무혈청 배지에서 3차원 배양하여 중간엽 줄기세포 배양액을 수득하는 단계를 포함하는, 성장인자 및 사이토카인을 함유한 중간엽 줄기세포 배양액 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 (1)에서 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 제대혈, 간 또는 근육으로부터 분리될 수 있고, 보다 구체적으로 지방으로부터 분리될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 특히, 지방 유래 줄기세포는 비교적 접근이 수월하고 채취가 간단하며 한 개체로부터 다량을 얻을 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 (1)에서 중간엽 줄기세포는 기질배지 및 증식배지에서 배양한 후 계대 배양할 수 있고, 보다 구체적으로 다음의 단계로 배양할 수 있다:
a) 중간엽 줄기세포를 기질배지에서 배양한 후 증식배지에서 배양하는 단계; 및
b) 상기 세포를 증식배지에서 계대 배양하는 단계.
상기 증식배지는 기질배지에 bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(epidermal growth factor) 중 어느 하나 이상을 첨가하여 배양하는 것이 바람직하다.
상기 배양방법에 있어서, 단계 b)에서 세포를 증식배지에서 1 계대 이상 배양하는 것이 바람직하고, 2계대 이상 배양하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 상기 증식배지는 기질배지에 bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(epidermal growth factor) 중 어느 하나 이상을 첨가하는 것이 바람직하고, 구체적으로 상기 bFGF는 0.1 ~ 100 ng/ml, 상기 EGF는 0.1 ~ 100 ng/ml 첨가하는 것이 바람직하고, 상기 bFGF는 0.3 ~ 10 ng/ml, 상기 EGF는 1 ~ 10 ng/ml 첨가하는 것이 보다 바람직하며, 상기 bFGF는 0.5 ~ 5 ng/ml, 상기 EGF는 3 ~ 7 ng/ml 첨가하는 것이 보다 더 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 (a)에서 알긴산나트륨 용액은 300 CPS 이하의 점성도를 가지는 것이 바람직하다. 상기 알긴산나트륨은 천연추출물로, 갈조류의 종류, 채취 시기, 방법에 의해 점성도가 달라져 제조사별로 상기 점성도의 기준이 다를 수 있다. 예컨대, 제조사에 따라 240 CPS 미만의 점성도를 낮은 점성도 기준으로, 240 내지 3500 CPS를 중간 점성도 기준으로, 3500 CPS 초과의 점성도를 높은 점성도 기준으로 할 수 있고, 200 CPS 미만의 점성도를 낮은 점성도 기준으로, 200 내지 500 CPS를 중간 점성도 기준으로, 500 CPS 초과의 점성도를 높은 점성도 기준으로 할 수 있며, 300 CPS 이하의 점성도를 낮은 점성도 기준으로, 2000 CPS 이상의 점성도를 중간 점성도 기준으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 300 CPS 이하의 점성도를 낮은 점성도 기준으로, 2000 CPS 이상의 점성도를 중간 점성도 기준으로 하여 판매하는 알긴산나트륨을 구입하여 사용하였고, 상기 낮은 점성도를 가지는 알긴산나트륨 용액을 이용한 중간엽 줄기세포 배양액 내 상처 치유 및 모발 성장 촉진 효능을 나타내는 성장인자 또는 사이토카인의 함량이 현저히 높아짐을 확인하였다.
이에 상기 낮은 점성도 기준을 벗어난 경우, 예컨대, 중간 또는 높은 점성도를 가지는 알긴산나트륨 용액, 구체적으로 2000 CPS 이상의 점성도를 가지는 알긴산나트륨 용액을 혼합하여 배양하는 경우 중간엽 줄기세포 배양액 내 상처 치유 및 모발 성장 촉진 효능을 나타내는 성장인자 또는 사이토카인의 분비가 적어 중간엽 줄기세포 배양액의 효능이 떨어질 수 있음을 새로이 확인하였다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 (a)에서 2가 양이온은 Ca2+, Mg2+, Sr2+ 또는 Ba2+일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 2가 양이온을 포함하는 용액의 예로는 염화칼슘(CaCl2), 젖산칼슘(C6H10O6Ca·5H2O), 염화마그네슘(MgCl2), 염화스트론듐(SrCl2) 또는 염화바륨(BaCl2)을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 단계 (a)에서 2가 양이온을 포함하는 용액은 0.5 내지 3 중량%의 농도를 가지는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 (2)에서 무혈청 배지에 bFGF 또는 EGF 중 어느 하나 이상을 첨가하는 것이 바람직하고, 구체적으로 상기 bFGF는 0.1 ~ 100 ng/ml, 상기 EGF는 0.1 ~ 100 ng/ml 첨가하는 것이 바람직하고, 상기 bFGF는 0.3 ~ 10 ng/ml, 상기 EGF는 1 ~ 10 ng/ml 첨가하는 것이 보다 바람직하며, 상기 bFGF는 0.5 ~ 5 ng/ml, 상기 EGF는 3 ~ 7 ng/ml 첨가하는 것이 보다 더 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 (2)에서 3차원 배양은 3회 이상 배양액을 얻는 것이 바람직하고, 구체적으로 2일 내지 4일 간격으로, 보다 구체적으로 3일 간격으로 배지를 교환하면서 3회 이상 배양액을 얻는 것이 바람직하다. 특히, 한정된 수의 세포에서 다량의 줄기세포 배양액을 얻고 배양액 중에 포함되어 있는 상처 치유 및 모발 성장 촉진 효능을 나타내는 성장인자 및 사이토카인의 함량을 높이기 위해서는 3회 이상 배양액을 얻는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 성장인자 및 사이토카인은 상처 치유 및 모발 성장 촉진 효능을 나타내는 것으로, 구체적으로 EGF, IL-6, VEGF, HGF, MIP-1α, MCP-1, MMP 및 TIMP인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 상기 EGF는 세포 증식 촉진, 혈관형성 촉진, 모발 성장 촉진, 모발 성장의 스위치 역할을 수행한다. 상기 IL-6는 항-염증 기능, 모발 성장 유도 기능에 관여한다. 상기 VEGF는 혈관형성 촉진 및 모발 성장 촉진 기능에 관여한다. 상기 HGF는 항-염증, 세포 이동 및 증식 촉진, 세포사멸 억제, 혈관형성 촉진, 모발 성장 촉진 기능에 관여한다. 상기 MIP-1α는 혈관형성 촉진, 콜라겐형성 촉진, 모발 성장 촉진 기능에 관여한다. 상기 MCP-1은 세포이동 및 증식 촉진, 혈관형성 촉진, 모발 성장 촉진 기능에 관여한다. 상기 MMP는 기질단백질 분해, 조직 리모델링, 세포이동 촉진, 섬유화 억제 기능에 관여한다. 상기 TIMP는 세포 증식 촉진 및 세포사멸 억제 기능에 관여한다. 특히, 상기 중간엽 줄기세포 배양액은 상처 치유 및 모발 성장 촉진 효능을 나타내는 성장인자 및 사이토카인을 2차원 배양방법으로 배양하여 수득한 중간엽 줄기세포 배양액에 비해 고함량으로 포함하고 있어, 현저히 우수한 효능을 나타낸다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 본 발명의 방법에 따라 낮은 점성도를 가지는 알긴산나트륨을 이용하여 3차원 배양으로 수득한 중간엽 줄기세포 배양액에서 상처 치유 및 탈모 억제 효능을 나타내는 성장인자 및 사이토카인이 고농도로 분비되고, 우수한 피부세포 및 모유두세포 증식 촉진 효과를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 중간엽 줄기세포 배양액은 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 배양은 다음 과정에 따라 실시될 수 있으며, 세포배양에 사용되는 배지는 이에 한정되지 않는다.
(1) 중간엽 줄기세포의 배양
해당 조직에서 얻은 중간엽 줄기세포를 기질배지에 현탁시켜 10,000 ~ 40,000 cells/cm2의 농도로 배양용기에 접종한 후 배양한다. 기질배지는 10% 우혈청이 포함되어 있는 DMEM 또는 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth) 배지로, 약 24시간 배양한다.
(2) 증식배지(expansion media)에서의 배양
기질배지를 제거한 후, 증식배지에서 배양하여 부착성 세포를 증식시킨다. 증식배지는 10% 우혈청, 0.1~100 ng/㎖ 농도의 EGF(epidermal growth factor) 및/또는 0.1~100 ng/㎖ 농도의 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 DMEM 또는 DMEM/F12로, 부착성인 중간엽 줄기세포를 신속하게 증식시켜 세포 양을 단기간에 대량으로 증가시키는 작용을 한다.
(3) 계대 배양
세포가 배양용기 바닥의 80 내지 90%를 채우면 증식배지를 제거하고 트립신 처리를 통해 세포를 배양용기에서 떼어낸다. 계대배양을 위해서는 세포를 1 : 3 ~ 1 : 4로 희석하여 새로운 배양용기에서 증식배지와 함께 배양한다. 이와 같은 방법으로 추가적인 계대배양이 가능하다.
(4) 알긴산염 비드에서 3차원 배양
배양한 세포는 PBS로 3회 이상 세척하여 FBS를 제거해주고, 300 CPS 이하의 점성도를 가지는 알긴산나트륨 용액과 혼합한다. 상기 혼합액을 0.5 내지 3% 2가 양이온 포함 용액, 예컨대 염화칼슘 용액에 떨어뜨려 세포-알긴산염 비드를 형성한다. 상기 세포-알긴산염 비드를 염화나트륨 용액으로 1회 세척한 후 0.1 ~ 100 ng/㎖ 농도의 EGF(epidermal growth factor) 및/또는 0.1 ~ 100 ng/㎖ 농도의 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 DMEM 또는 DMEM/F12로 세포-알긴산염 비드 형태로 배양한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 중간엽 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는, 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 중간엽 줄기세포 배양액에는 상처 치유 및 모발 성장 촉진 효능을 나타내는 성장인자 및 사이토카인, 구체적으로 EGF, IL-6, VEGF, HGF, MIP-1α, MCP-1, MMP 및 TIMP가 고함량으로 포함되어 있다.
본 발명에서는 본 발명의 방법에 따라 낮은 점성도를 가지는 알긴산나트륨을 이용하여 3차원 배양으로 수득한 중간엽 줄기세포 배양액에서 상처 치유 및 탈모 억제 효능을 나타내는 성장인자 및 사이토카인이 고농도로 분비되고, 우수한 피부세포 및 모유두세포 증식 촉진 효과를 나타냄을 확인하였으므로, 상기 중간엽 줄기세포 배양액을 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 약학 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 배양액을 약학 조성물로 사용하는 경우, 배양액을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.
약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 주사용 멸균수, 일반 식염수 또는 인산염 완충 식염수, 슈크로스, 히스티딘, 염 및 폴리솔베이트 등과 같은 여러 성분을 함유할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 일반 의약품 제제의 형태, 예를 들어, 임상투여 시 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다.
단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 적용되는 질환의 종류에 따라 투여경로가 결정되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 의약 조성물은 발모촉진 또는 탈모의 예방 및 치료에 사용되기 때문에 두피에 국소적으로 적용되는 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 발모 촉진용 의약 조성물은 국소 투여용 외용제 또는 주사제인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 투여 시간, 투여 경로 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 중간엽 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는, 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 피부 외용제를 제공한다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 중간엽 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는, 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 중간엽 줄기세포 배양액에는 상처 치유 및 모발 성장 촉진 효능을 나타내는 성장인자 및 사이토카인, 구체적으로 EGF, IL-6, VEGF, HGF, MIP-1α, MCP-1, MMP 및 TIMP가 고함량으로 포함되어 있다.
본 발명에서는 본 발명의 방법에 따라 낮은 점성도를 가지는 알긴산나트륨을 이용하여 3차원 배양으로 수득한 중간엽 줄기세포 배양액에서 상처 치유 및 탈모 억제 효능을 나타내는 성장인자 및 사이토카인이 고농도로 분비되고, 우수한 피부세포 및 모유두세포 증식 촉진 효과를 나타냄을 확인하였으므로, 상기 중간엽 줄기세포 배양액을 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 피부 외용제 또는 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 배양액을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
또한, 상기 배양액이 피부 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.
본 발명에서, 상기 배양액을 화장품으로 사용하는 경우, 상기 배양액을 유효성분으로 함유하여 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 또는 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수; 훼이셜 로션 또는 바디로션 등과 같은 유액; 영양 크림, 수분 크림 또는 아이 크림 등과 같은 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제; 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있다.
또한, 상기 화장품은 상기 배양액에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포의 배양 방법
지방 조직은 보통 지방 흡입술로 얻을 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 지방 흡입에 의해 얻어진 지방 조직으로부터 다음과 같이 지방 줄기세포를 분리하였다: 혈액을 제거하기 위해 지방 조직을 같은 부피의 KRB 용액으로 3 ~ 4회 세척하였다. 지방 조직과 같은 부피의 콜라게나제 용액을 넣어 37℃ 수욕에서 반응시켰다. 이를 원심분리용 튜브에 옮겨 넣고 20℃, 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액인 지방층을 제거하고, 아래층인 콜라게나제 용액을 흔들리지 않도록 조심해서 분리하였다. 기질배지를 넣어 현탁한 후, 20℃, 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이때, 아래에 가라앉는 것이 스트로마혈관 분획으로, 상층액을 제거하였다. 스트로마-혈관 분획을 기질배지에 현탁하여 배양용기에 접종하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액 제거 후 인산염 완충용액으로 세척하고, 기질배지(10% FBS가 함유된 DMEM/F12 배지), 또는 기질배지에 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 1 ng/㎖ 또는 표피세포 성장인자(EGF) 5 ng/㎖, 또는 섬유아세포 성장인자(bFGF) 1 ng/㎖와 표피세포 성장인자(EGF) 5 ng/㎖ 농도로 포함된 증식배지를 이용하여 증식시켰다. 지방 줄기세포가 배양용기의 80 ~ 90% 정도로 자라면 트립신 처리하여 단일 세포로 분리하여 수득하였다. 얻어진 세포를 증식배지로 1 : 3 ∼ 1 : 4로 희석하여 계대 배양을 실시하였다.
<실시예 2> 인간 지방 줄기세포를 알긴산염(alginate) 비드에서 3차원 배양하는 방법
상기 <실시예 1>에서 트립신 처리하여 단일세포로 얻어진 줄기세포를 DMEM/F12(페놀레드 미포함) 배지로 3회 세척하여 FBS를 제거하였다. 8.0 × 107 개/㎖이 되도록 DMEM/F12(페놀레드 미포함) 용액을 첨가하여 세포를 현탁하였다. 준비된 세포현탁액을 300 CPS 이하의 낮은 점성도를 가지는 알긴산나트륨(sodium alginate, Sigma-Aldrich) 2% 용액 9.5 ㎖와 혼합하였다. 세포-알긴산나트륨 혼합액을 1% 염화칼슘 용액에 떨어뜨려 세포-알긴산염 비드를 형성하였다. 5분 후 0.15 M 염화나트륨 용액으로 1회 세척한 후, 1 ng/㎖ 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 및 5 ng/ml 표피세포 성장인자(EGF)가 포함된 DMEM/F12(페놀레드 미포함)를 세포 4 × 107 개 당 500 ㎖가 되도록 첨가하였다. 72시간 후 세포 배양액을 회수하고 새 배지를 첨가하는 방법으로 2회 더 세포 배양액을 회수하여 냉장 보관하였다.
<비교예 1> 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 2차원 배양하는 방법
상기 <실시예 1>에서 트립신 처리하여 단일세포로 얻어진 줄기세포를 DMEM/F12 배지로 3회 세척하여 FBS를 제거하였다. 8.0 × 107 개/㎖ 줄기세포에 DMEM/F12 용액을 첨가하여 세포를 현탁하여 접종하였다. 그 다음, 1 ng/㎖ 염기성 섬유아세포 성장인자 및 5 ng/㎖ 표피세포 성장인자가 포함된 DMEM/F12 용액을 세포 4.0 × 107 개 당 500 ㎖가 되도록 첨가하였다. 72시간 후 세포 배양액을 회수하고 새 배지를 첨가하는 방법으로 2 ~ 11회 더 세포 배양액을 회수하여 냉장 보관하였다.
<비교예 2> 중간 점성도의 알긴산염(alginate) 비드에서 3차원 배양하는 방법
2000 CPS 이상의 중간 점성도를 가지는 알긴산나트륨(Sigma-Aldrich)을 사용하는 것을 제외하고 상기 <실시예 1> 및 <실시예 2>와 동일한 방법으로 3차원 배양(3D)하여 줄기세포 배양액을 회수하고 냉장 보관하였다.
여기서, 알긴산나트륨은 일반적으로 낮은 점성도 및 중간 점성도, 또는 낮은 점성도, 중간 점성도 및 높은 점성도로 구분된다, 그러나, 알긴산나트륨은 천연추출물로, 갈조류의 종류, 채취 시기, 방법에 의해 점성도가 달라져 제조사별로 상기 점성도의 기준을 달리하여 판매한다. 이에 제조사 B의 중간 점성도의 기준인 2000 CPS 이상의 점성도를 가지는 알긴산나트륨을 중감 점성도의 알긴산나트륨으로 채택하였다.
<실험예 1> 줄기세포 배양액에 함유된 성장인자 및 사이토카인 어레이
상기 <실시예 2>에서 회수한 줄기세포 배양액에 함유된 다양한 성장인자 및 사이토카인을 사이토카인 어레이(Cytokine array)를 이용하여 분석하였다.
구체적으로, 멤브레인이 들어있는 플레이트의 각 웰에 상기 <실시예 2>에서 회수한 줄기세포 배양액 1 ㎖씩을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척액 I으로 3회, 세척액 II로 2회 세척한 후 검출 항체 용액을 1 ㎖씩 첨가한 후 4℃에서 하룻밤 동안 반응하였다. 세척액 I으로 3회, 세척액 II로 2회 세척한 후 스트렙타아비딘(streptavidin)이 결합된 호스래디쉬-퍼옥시다제 용액을 1 ㎖씩 첨가한 후 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척액 I으로 3회, 세척액 II로 2회 세척한 후 플라스틱 시트(plastic sheet)에 멤브레인을 놓고 검출 용액을 뿌려 발색시켰다. 다른 플라스틱 시트로 잘 덮은 후, LAS 500 기기에 넣고 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 2>의 알긴산나트륨을 이용하여 3차원 배양(3D)으로 얻은 줄기세포 배양액에서 상처 치유 및 탈모 억제 효능을 나타내는 성장인자 및 사이토카인, EGF, IL-6, MIP-1α, MCP-1, MMP 및 TIMP의 함량이 현저히 높게 나타남을 확인하였다.
<실험예 2> 줄기세포 배양액에 함유된 성장인자 및 사이토카인 정성분석
상기 <실험예 1> 에서 확인된 성장인자 및 사이토카인을 포함하여 줄기세포에서 분비된다고 알려진 대표적인 성장인자인 VEGF와 EGF를 효소결합면역흡착법 (ELISA)를 변형하여 분석하였다.
구체적으로, 96-웰 플레이트의 각 웰에 상기 <실시예 2>에서 회수한 줄기세포 배양액 100 ㎕씩을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척액으로 4회 세척한 후 성장인자를 인지할 수 있는 검출 항체 용액을 100 ㎕씩 첨가한 후 2시간 동안 반응시켰다. 세척액으로 4회 세척한 후 스트렙타아비딘이 결합된 호스래디쉬-퍼옥시다제 용액을 100 ㎕씩 첨가한 후 실온에서 20분 동안 반응시킨 후 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 2>의 알긴산나트륨을 이용하여 3차원 배양(3D)으로 얻은 줄기세포 배양액에서 상처 치유 및 탈모 억제 효능을 나타내는 성장인자 및 사이토카인, EGF, IL-6, VEGF, HGF, MIP-1α, MCP-1, MMP 및 TIMP이 함유되어 있음을 검증하였다.
<실험예 3> 2D 배양으로 획득한 줄기세포 배양액 및 3D 배양으로 획득한 줄기세포 배양액에 함유된 성장인자 및 사이토카인 비교
상기 <실시예 2> 및 <비교예 1>에서 회수한 줄기세포 배양액에 함유된 다양한 성장인자 및 사이토카인 중 MIP-1을 사이토카인 어레이(Cytokine array)를 이용하여 상기 <실험예 1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 수행하여 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 <비교예 1>의 2차원 배양(2D)으로 얻은 줄기세포 배양액과 비교하여 상기 <실시예 2>의 알긴산나트륨을 이용하여 3차원 배양(3D)으로 얻은 줄기세포 배양액에 고함량의 MIP-1α이 포함되어 있음을 확인하였다.
<실험예 4> 줄기세포 배양액에 함유된 HGF의 정량
상기 <실시예 2> 및 <비교에 2>에서 회수한 줄기세포 배양액에 함유된 대표적인 상처 치유 및 탈모 억제 효능을 나타내는 성장인자인 HGF를 효소결합면역흡착법(ELISA, R&D system)을 이용하여 분석하였다.
구체적으로, 96-웰 플레이트의 각 웰에 상기 <실시예 2>에서 회수한 줄기세포 배양액 100 ㎕씩을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척액으로 4회 세척한 후 성장인자를 인지할 수 있는 검출 항체 용액을 100 ㎕씩 첨가한 후 2시간 동안 반응시켰다. 세척액으로 4회 세척한 후 스트렙타아비딘이 결합된 호스래디쉬-퍼옥시다제 용액을 100 ㎕씩 첨가한 후 실온에서 20분 동안 반응시키고 기질용액(H2O2 및 테트라메틸 벤지딘)을 넣어 발색시켰다. 2 N H2SO4 용액을 넣어 발색반응을 멈춘 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 <비교예 2>의 2000 CPS 이상의 중간 점성도를 가지는 알긴산나트륨으로 3차원 배양(3D)하여 얻은 줄기세포 배양액과 비교하여 상기 <실시예 2>의 300 CPS 이하의 낮은 점성도를 가지는 알긴산나트륨을 이용하여 3차원 배양(3D)으로 얻은 줄기세포 배양액에서 HGF의 함량이 현저히 높게 나타남을 확인하였다
<실험예 5> 줄기세포 배양액의 피부세포 증식, 모유두세포 증식 촉진 효과 확인
상기 <실시예 2>에서 회수한 줄기세포 배양액의 피부세포 증식, 모유두세포 증식 촉진 효과를 확인하였다.

Claims (12)

  1. (1) 중간엽 줄기세포의 현탁액과 알긴산나트륨 용액을 혼합한 후, 상기 혼합 현탁액을 2가 양이온을 포함하는 용액에 떨어뜨려 비드를 형성하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)의 비드 형성 후, bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(epidermal growth factor) 중 어느 하나 이상을 첨가한 무혈청 배지에서 3차원 배양하여 중간엽 줄기세포 배양액을 수득하는 단계를 포함하고,
    상기 상기 bFGF는 0.1 ~ 100 ng/㎖, 상기 EGF는 0.1 ~ 100 ng/㎖ 첨가되는 것인,
    성장인자 및 사이토카인을 함유한 중간엽 줄기세포 배양액 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (1)에서 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 제대혈, 간 및 근육으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 분리된 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (1)에서 중간엽 줄기세포는,
    a) 중간엽 줄기세포를 기질배지에서 배양한 후 증식배지에서 배양하는 단계; 및
    b) 상기 세포를 증식배지에서 계대 배양하는 단계를 거쳐 배양한 중간엽 줄기세포이고,
    여기에서 상기 증식배지는 기질배지에 bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(epidermal growth factor) 중 어느 하나 이상을 첨가한 것인, 제조방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 단계 b)에서 2계대 이상 배양하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (a)에서 알긴산나트륨 용액은 300 CPS 이하의 점성도를 가지는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (a)에서 2가 양이온은 Ca2+, Mg2+, Sr2+, Ba2+로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (a)에서 2가 양이온을 포함하는 용액은 0.5 내지 3 중량%의 농도를 가지는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (2)에서 3차원 배양은 2 내지 4일 간격으로 배지를 교환하면서 3회 이상 줄기세포 배양액을 얻는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 성장인자 및 사이토카인은 EGF, IL-6, VEGF, HGF, MIP-1α, MCP-1, MMP 및 TIMP인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 중간엽 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는, 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 약학 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 중간엽 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는, 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 피부 외용제.
  12. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 중간엽 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는, 상처 치유 또는 피부 재생, 및 탈모 예방 또는 모발 성장 촉진용 화장료 조성물.
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