KR20220057542A

KR20220057542A - 펩타이드 내포 페리틴

Info

Publication number: KR20220057542A
Application number: KR1020227007173A
Authority: KR
Inventors: 이페이 이노우에; 켄이치로 이토; 마유미 도쿠야마
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 2019-09-05
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2022-05-09
Also published as: CN114341156A; EP4056233A4; EP4056233A1; JPWO2021045210A1; US20220401560A1; WO2021045210A1

Abstract

본 발명은 세포막의 파괴, 면역원성 및 독성을 회피할 수 있는 펩타이드의 송달 수단을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 이하 (1) 내지 (3)을 제공한다. (1) 펩타이드가 3 내지 19개의 아미노산 잔기로 구성되고, 또한 하기 조건: a) -10.2≤X≤5.9, 및 445≤Y≤2524 (여기서, X는 pH 9에서의 펩타이드의 전하를 나타내고, Y는 펩타이드의 화학식량을 나타낸다)을 충족시키는, 펩타이드 내포 페리틴. (2) 상기 펩타이드 내포 페리틴을 포함하는, 펩타이드의 세포내 송달제. (3) 상기 펩타이드 내포 페리틴의 제조 방법.

Description

펩타이드 내포 페리틴

본 발명은 펩타이드 내포 페리틴 등에 관한 것이다.

세포내의 단백질이나 핵산을 표적으로 하고, 생리 활성을 갖는 펩타이드는 의약품으로서의 응용이 기대되고 있다 (비특허문헌 1). 하지만, 이들 펩타이드의 대부분은 세포막 투과성에 과제를 안고 있고, 다양한 세포내로의 송달 기술이 검토되고 있다.

리포솜으로 대표되는 나노 입자·마이크로 입자에, 목적 펩타이드를 내포시키고, 리포솜과 세포막을 융합시킴으로써, 목적 펩타이드를 세포내로 송달하는 접근법 (approach)이 보고되어 있다 (특허문헌 1). 또한, 세포막 투과성을 갖는 분자나 펩타이드와 융합시키고, 세포막을 투과 또는 엔도솜에 의해 세포에 취입시키고, 목적 펩타이드를 세포내로 송달하는 접근법도 보고되어 있다 (비특허문헌 2).

그런데, 페리틴은 동식물에서 미생물까지 보편적으로 존재하는, 복수의 단량체로 구성되는 내강 (內腔)을 갖는 구상 단백질이다. 사람 등의 동물에서는, 페리틴을 구성하는 단량체로서 H 쇄 및 L 쇄의 2종의 단량체가 존재하는 것, 및 페리틴은 24개의 단량체로 구성되는 다량체 (대부분의 경우, H 쇄 및 L 쇄의 혼합물)로서, 외경 12nm의 바구니 형상의 형태 및 내경 7nm의 내강을 갖는 것이 알려져 있다. 페리틴은 생체 또는 세포 중의 철 원소의 항상성 (homeostasis)에 깊이 관여하고 있고, 그 내강 중에 철을 보유할 수 있으므로, 철의 수송·저장 등의 생리학적 기능의 역할을 맡는 것이 알려져 있다. 또한, 페리틴은 트랜스페린 수용체 제시 세포에 취입되는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 3).

페리틴은 또한 그 내강 중에 저분자 유기 화합물을 봉입하는 DDS 담체 (특허문헌 2)로서의 응용이 검토되고 있고, 또한 전자 디바이스의 제작에도 이용되고 있다.

특허문헌 1: 미국 특허 제4,515,736호 특허문헌 2: 중국 특허출원공개 제106110333호 공보

비특허문헌 1: Y. Hayashi et al. ACS Chem. Biol. 2012; 7 (3): 607-613 비특허문헌 2: Z. Guo et al. Biomed Rep. 2016; 4 (5): 528-534 비특허문헌 3: L. Li et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107 (8): 3505-10

상술한 바와 같이, 목적 펩타이드를 세포내에 송달하는 접근법으로서는, 리포솜 또는 세포 투과성 펩타이드의 사용이 보고되어 있다. 하지만, 리포솜 및 세포 투과성 펩타이드는 통상 중성의 pH 영역에서는 양으로 하전 (荷電)하고 있기 때문에, 세포막과의 상호 작용에 의해 세포막을 파괴한다는 과제가 있다. 또한, 리포솜에 대해서는, 리포솜이 면역원성을 나타낼 수 있는 것, 및 리포솜의 대사물이 독성을 나타낼 수 있다는 과제도 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 세포막의 파괴, 면역원성 및 독성을 회피할 수 있는 펩타이드의 송달 수단을 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 예의 검토한 결과, 소정의 펩타이드를 페리틴에 내포할 수 있는 것, 이러한 소정의 펩타이드의 사용에 의해 펩타이드 내포 페리틴을 제작할 수 있는 것, 및 이러한 펩타이드 내포 페리틴의 사용에 의해 소정의 펩타이드를 특정한 세포의 세포내에 송달할 수 있음을 발견하였다.

페리틴은 중성의 pH 영역에서는 음에 대전하고 있고, 또한 트랜스페린 수용체를 개재하여 특정한 세포에 받아들여진다. 따라서, 소정의 펩타이드를 내포하고 있는 페리틴의 사용에 의해, 세포막을 파괴하지 않고, 소정의 펩타이드를 세포내에 송달시킴으로써, 상기 과제를 해결할 수 있다. 또한, 페리틴은 사람 등의 포유 동물에 천연에 존재하는 천연 단백질이기 때문에, 페리틴의 종류 (페리틴이 유래하는 포유 동물종)와, 펩타이드 내포 페리틴이 투여되는 포유 동물종을 일치시킴으로써, 면역원성의 과제를 해결할 수 있다. 또한, 페리틴은 천연 아미노산으로 구성되어 있고, 천연 아미노산의 대사물도 생체 중에 존재하는 천연 물질인 것에 비추어보면, 천연 아미노산의 대사물에는 세포 독성도 염려되지 않기 때문에, 대사 물에 의한 세포 독성의 과제도 해결할 수 있다.

이상과 같이, 본 발명자들은 상기 과제를 해결하는 것에 성공하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 이하와 같다.

〔1〕펩타이드가 3 내지 19개의 아미노산 잔기로 구성되고, 또한 하기 조건:

a) -10.2≤X≤5.9, 및 445≤Y≤2524;

(여기서, X는 pH 9에서의 펩타이드의 전하를 나타내고, Y는 펩타이드의 화학식량을 나타낸다)

를 충족시키는, 펩타이드 내포 페리틴.

〔2〕〔1〕에 있어서, 펩타이드가 4 내지 16개의 아미노산 잔기로 구성되는, 펩타이드 내포 페리틴.

〔3〕〔1〕 또는 〔2〕에 있어서, 펩타이드가 하기 조건:

b) -10.2≤X≤0.0, 및 445≤Y≤2524; 또는

c) 3.7≤X≤5.9, 및 445≤Y≤2524

(여기서, X 및 Y는 〔1〕과 동일하다)

를 충족시키는, 펩타이드 내포 페리틴.

〔4〕펩타이드의 세포내 송달제로서,

펩타이드 내포 페리틴을 포함하고,

펩타이드가 3 내지 19개의 아미노산 잔기로 구성되고, 또한 하기 조건:

a) -10.2≤X≤5.9, 및 445≤Y≤2524;

를 충족시키는, 펩타이드의 세포내 송달제.

〔5〕〔4〕에 있어서, 펩타이드가 사람 세포의 세포내에 송달되는, 펩타이드의 세포내 송달제.

〔6〕〔4〕 또는 〔5〕에 있어서, 펩타이드가 암세포의 세포내에 송달되는, 펩타이드의 세포내 송달제.

〔7〕펩타이드 내포 페리틴의 제조 방법으로서,

1) 펩타이드의 존재하에 또는 부재하에 페리틴을 pH 3.0 이하의 완충액 중에서 방치하여 페리틴을 해리시키는 것; 및

2) 해리한 페리틴 및 펩타이드를 pH 5.0 이상 10.0 이하의 완충액 중에 공존시켜서 펩타이드 내포 페리틴을 생성하는 것

을 포함하고,

a) -10.2≤X≤5.9, 및 445≤Y≤2524;

를 충족시키는, 제조 방법.

본 발명의 펩타이드 내포 페리틴은 세포막을 파괴하지 않고, 소정의 펩타이드를 세포내에 송달할 수 있다. 본 발명의 펩타이드 내포 페리틴은 또한 면역원성 및 대사물에 의한 세포 독성의 쌍방을 회피할 수 있다. 본 발명의 펩타이드 내포 페리틴은 또한 소정의 펩타이드를 트랜스페린 수용체 제시 세포 (특히, 트랜스페린 수용체의 발현량이 높은 세포)의 세포내에 특이적 및 재현 좋게 송달할 수 있다.

[도 1] 도 1은 칼럼 크로마토그래피에 의한 페리틴 (FTH) 및 펩타이드 (PKC-F)의 복합체의 형성의 확인을 나타내는 도면이다.
[도 2] 도 2는 페리틴 (FTH)에 내포된 펩타이드 (PKC-F)에 대한 LC-MS 분석의 결과를 나타내는 도면이다.
[도 3] 도 3은 펩타이드 (PKC-F)에 대한 LC-MS 분석의 결과를 나타내는 도면이다.
[도 4] 도 4는 펩타이드 (PKC-F) 내포 페리틴 (FTH)의 투과형 전자 현미경 (TEM)상을 나타내는 도면이다.
[도 5] 도 5는 펩타이드 (PKC-F) 비내포 페리틴 (FTH) 및 펩타이드 (PKC-F)내포 페리틴 (FTH)의 표면 전하의 비교를 나타내는 도면이다.
[도 6] 도 6은 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의한 트랜스페린 수용체 (TfR) 제시 세포 (SKBR-3 세포) 내로의 펩타이드 (PKC-F)의 취입의 측정 결과를 나타내는 도면이다. 펩타이드 (PKC-F)는 페리틴 (FTH)에 내포되어 있는 상태 (시험 대상) 및 펩타이드 (PKC-F)만의 상태 (음성 대조군)에서 사용되었다.
[도 7] 도 7은 2광자 여기 형광 현미경에 의한, 트랜스페린 수용체 TfR 제시 세포 (SKBR-3 세포) 내로의 펩타이드 (PKC-F)의 취입의 측정 결과를 나타내는 도면이다. 펩타이드 (PKC-F)는 페리틴 (FTH)에 내포되어 있는 상태 (시험 대상) 및 펩타이드 (PKC-F)만의 상태 (음성 대상)에서 사용되었다.
[도 8] 도 8은 칼럼 크로마토그래피에 의한 페리틴 (FTH) 및 펩타이드 (FAM-SV40)의 복합체의 형성의 확인을 나타내는 도면이다.
[도 9] 도 9는 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의한 트랜스페린 수용체 TfR제시 세포 (SKBR-3 세포) 내로의 펩타이드 (FAM-SV40)의 취입의 측정 결과를 나타내는 도면이다. 펩타이드 (FAM-SV40)는, 페리틴 (FTH)에 내포되어 있는 상태 (시험 대상) 및 펩타이드 (FAM-SV40)만의 상태 (음성 대상)에서 사용되었다.
[도 10] 도 10은 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의한 트랜스페린 수용체 TfR 제시 세포 (TfR 발현량이 많은 SKBR-3 세포 및 TfR 발현량이 낮은 HEK293E 세포) 간에서의 펩타이드 (FAM-SV40)의 취입의 비교를 나타내는 도면이다.
[도 11] 도 11은 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의한 트랜스페린 수용체 TfR 제시 세포 (TfR 발현량이 많은 SKBR-3 세포 및 TfR 발현량이 낮은 HEK293E 세포) 간에서의 펩타이드 (FAM-SV40)의 취입의 비교를 나타내는 도면이다. 도 10의 결과가 도 11에 플롯되어 있다.
[도 12] 도 12는 탈회합·재회합 프로세스를 행한 경우에서의 펩타이드 (ClAc-FHC) 내포 페리틴 (FTH) 유래의 펩타이드 (ClAc-FHC)의 MS 피크의 존재 (A),및 탈회합·재회합 프로세스를 행하지 않은 경우에서의 이 MS 피크의 비존재 (B)를 나타내는 도면이다.
[도 13] 도 13은 탈회합·재회합 프로세스를 행한 경우에서의 펩타이드 (EGFR, cyloRGDfV 또는 FGF3-FP16) 내포 페리틴 (FTH) 유래의 펩타이드 (EGFR, cyloRGDfV 또는 FGF3-FP16)의 MS 피크의 존재를 나타내는 도면이다.
[도 14] 도 14는 탈회합·재회합 프로세스를 행한 경우에서의 펩타이드 (히메니스타틴 I, Ex10 또는 ανβ6) 내포 페리틴 (FTH) 유래의 펩타이드 (히메니스타틴 I, Ex10 또는 ανβ6)의 MS 피크의 존재를 나타내는 도면이다.
[도 15] 도 15는 탈회합·재회합 프로세스를 행한 경우에서의 펩타이드 (NRP-1-2, 뮤레파바딘 또는 Pakti-L1) 내포 페리틴 (FTH) 유래의 펩타이드 (NRP-1-2, 뮤레파바딘 또는 Pakti-L1)의 MS 피크의 존재를 나타내는 도면이다.
[도 16] 도 16은 탈회합·재회합 프로세스를 행한 경우에서의 펩타이드 (NS, GRP78-3 또는 FBO0032) 내포 페리틴 (FTH) 유래의 펩타이드 (NS, GRP78-3 또는 FBP0032)의 MS 피크의 존재를 나타내는 도면이다.
[도 17] 도 17은 탈회합·재회합 프로세스를 행한 경우에서의 펩타이드 (FBP0033) 내포 페리틴 (FTH) 유래의 펩타이드 (FBP0033)의 MS 피크의 존재를 나타내는 도면이다.
[도 18] 도 18은 페리틴 (FTH)에서의 각종 펩타이드의 내포의 가부에 대해 펩타이드의 pH 9에서의 펩타이드의 전하와 펩타이드의 화학식량의 사이의 상관성을 나타내는 도면이다 (시행수 3회). ●: 3회 다 재현성 좋게 내포가 확인된 펩타이드; △: 내포를 확인할 수 있는 경우가 2회 이하였던 펩타이드; ×: 1회도 내포를 확인할 수 없는 펩타이드. 즉, a) -10.2≤pH 9에서의 펩타이드의 전하 (X≤5.9, 및 445≤펩타이드의 화학식량 (Y)≤2524의 조건을 충족시키는 펩타이드를 페리틴에 내포할 수 있었다. 또한, 상기 조건을 충족시키는 펩타이드 중, b) -10.2≤X≤0.0, 및 445≤Y≤2524, 또는 c) 3.7≤X≤5.9, 및 445≤Y≤2524의 조건을 충족시키는 펩타이드는 페리틴에 재현성 좋게 내포할 수 있었다.
[도 19] 도 19는 칼럼 크로마토그래피에 의한 페리틴 (FTL) 및 펩타이드 (PKC-F)의 복합체의 형성의 확인을 나타내는 도면이다.

본 발명은 펩타이드가 3 내지 19개의 아미노산 잔기로 구성되고, 또한 하기 조건:

a) -10.2≤X≤5.9, 및 445≤Y≤2524;

를 충족시키는, 펩타이드 내포 페리틴을 제공한다.

펩타이드를 구성하는 아미노산은 아미노기 및 카복시기의 쌍방을 갖는 화합물인 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 펩타이드를 구성하는 아미노산은 단백질을 구성하는 천연 아미노산 (20종의 L-α-아미노산)이라도, 단백질을 구성하지 않는 비천연 아미노산이라도 좋다. 천연 아미노산으로서는, 예를 들어, L-알라닌 (A), L-아스파라긴 (N), L-시스테인 (C), L-글루타민 (Q), L-이소류신 (I), L-류신 (L), L-메티오닌 (M), L-페닐알라닌 (F), L-프롤린 (P), L-세린 (S), L-트레오닌 (T), L-트립토판 (W), L-타이로신 (Y), L-발린 (V), L-아스파르트산 (D), L-글루탐산 (E), L-아르기닌 (R), L-히스티딘 (H), L-라이신 (K) 및 글리신 (G)을 들 수 있다. 비천연 아미노산으로서는, 예를 들어, L 체 또는 D 체의 임의의 비천연 아미노산 (예, α-아미노산, β-아미노산 및 γ-아미노산)을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 비천연 아미노산으로서는, 예를 들어, 2,4-디아미노부탄산 (Dab), 2,3-디아미노프로피온산 (Dap), 오르니틴, 호모히스티딘, 호모페닐알라닌, 사이클로류신, 1-아미노사이클로헥산카복실산, 카복시사이클로프로필아민, 2-아미노사이클로헥산 카복실산, 1-아미노사이클로부탄카복실산, 3차-류신, 노르발린, 노르류신, 피로글루타민, 페니실라민, 호모아미노산, 4-아미노부틸산, 6-아미노헥산산, 7-아미노헵탄산, 4-아미노-3-하이드록시부티르산, 5-아미노레불린산, D-2-아미노아디프산, 및 상기 천연 아미노산 및 비천연 아미노산의 수식 화합물 (예를 들어, N-메틸화 등의 N-알킬화 화합물, 카보벤족시아미노화 화합물, 3차-부톡시카보닐화 화합물, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐화 화합물이나 아지드화 화합물)을 들 수 있다.

펩타이드는 천연 아미노산만으로 구성되어 있어도 좋고, 비천연 아미노산만으로 구성되어 있어도 좋고, 천연 아미노산 및 비천연 아미노산의 혼합물로 구성되어 있어도 좋다. 펩타이드는 또한 N 말단 아미노기 및 C 말단 카복시기가 보호된 것이라도, 보호되어 있지 않은 것이라도 좋다. N-말단 아미노기의 보호기로서는, 예를 들어, 알킬카보닐기 (아실기) (예, 아세틸기, 프로폭시기, 3차-부톡시카보닐기 등의 부톡시카보닐기), 알킬옥시카보닐기 (예, 플루오레닐메톡시카보닐기), 아릴옥시카보닐기, 아릴알킬 (아랄킬)옥시카보닐기 (예, 벤질옥시카보닐기)를 들 수 있다. C-말단 카복시기의 보호기로서는, 예를 들어, 에스테르 또는 아미드를 형성 가능한 기를 들 수 있다. 에스테르 또는 아미드를 형성 가능한 기로서는, 예를 들어, 알킬옥시기 (예, 메틸옥시, 에틸옥시, 프로필옥시, 부틸옥시, 펜틸옥시, 헥실옥시), 아릴옥시기 (예, 페닐옥시, 나프틸옥시), 아랄킬옥시기 (예, 벤질옥시), 아미노기를 들 수 있다.

펩타이드는 주쇄가 아미드 결합 및 탄소쇄로 구성되어 있어도 좋다. 탄소쇄로서는, 예를 들어, 알킬렌 (예, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌 등의 C1∼C6 알킬렌), 사이클로알킬렌 (예, 사이클로프로필렌, 사이클로부틸렌, 사이클로펜틸렌, 사이클로헥실렌, 사이클로헵틸렌, 사이클로옥틸렌 등의 C3~C8사이클로알킬렌), 아릴렌 (예, 페닐렌, 나프틸렌 등의 C6~C12 아릴렌)을 들 수 있다. 또는, 펩타이드는 주쇄가 아미드 결합 이외의 결합 구조 및/또는 탄소쇄 이외의 쇄 구조를 포함하도록 구성되어 있어도 좋다. 아미드 결합 이외의 결합 구조로서는, 예를 들어, N-알킬아미드 결합 (예, N-메틸아미드 결합, N-에틸아미드 결합 등의, 질소 원자 위에 C1~C6 알킬을 갖는 아미드 결합), 에스테르 결합, 에테르 결합, 디설파이드 결합, 티오에테르 결합 및 티오에스테르 결합을 들 수 있다. 탄소쇄 이외의 쇄 구조로서는, 예를 들어, 헤테로환 (예, 옥사졸, 메틸옥사졸, 티아졸, 트리아졸)을 포함하는 구조를 들 수 있다.

펩타이드는 또한 직쇄상 또는 분기상 또는 환상의 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 환상의 구조를 갖는 펩타이드는 N 말단 아미노산 잔기와 C 말단 아미노산 잔기가 아미드 결합을 통해 환화한 것이라도 좋다. 또한, 복수 (예, 2개)의 시스테인 잔기를 포함하는 펩타이드는, 시스테인 잔기의 측쇄에 있는 티올기를 통해 디설파이드 결합을 형성함으로써, 환상의 구조를 형성할 수 있다. 또한, 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 펩타이드라도, N 말단 아미노산 잔기 또는 C 말단 아미노산 잔기 중 어느 하나와 결합함으로써, 환상의 구조를 형성할 수도 있다.

펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기 수는 3 내지 19개이다. 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기 수는 바람직하게는 4개 이상이라도 좋다. 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기 수는 또한 18개 이하, 바람직하게는 17개 이하, 보다 바람직하게는 16개 이하라도 좋다. 보다 구체적으로, 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기 수는 3 내지 18개, 3 내지 17개, 3 내지 16개, 4 내지 18개, 4 내지 17개, 또는 4 내지 16개라도 좋다.

본 발명에 있어서, 페리틴에 내포되는 펩타이드는 도 18에 나타나는 바와 같이 하기 조건을 충족시킨다.

a) -10.2≤X≤5.9, 및 445≤Y≤2524;

펩타이드의 화학식량의 값은, 펩타이드의 조성식에 기초하여 원자량과 원자수의 곱의 총합으로서 구할 수 있다.

pH 9에서의 펩타이드의 전하는 ChemAxon (O. Toure et. al., Oil Gas Sci. Technol. 2013, 68, 281-297)을 이용하여 평가할 수 있지만 (실시예 참조), ChemAxon에서의 평가를 원하지 않는 경우 (예를 들어, ChemAxon에서의 평가가 곤란한 또는 정확성이 결여되는 극히 특수한 펩타이드가 사용되는 경우), L. Settimo et. al., Pharm. Res. 2014, 31, 1082-1095.에 기재되는 실험적 수법에 의해 평가해도 좋다.

이론에 의해 본 발명이 구속되는 것을 바라지 않지만, 상기 조건을 충족시키는 펩타이드가 페리틴에 내포되는 이유로서는, 이하를 생각할 수 있다.

(1) -10.2≤X의 조건이 바람직한 이유

pH 5보다 높은 pH의 수용액 중에서 페리틴은 강하게 음으로 대전한다. 그 때문에, 페리틴의 내포에 사용되는 용액의 pH (예, pH 9)에서는, 중성에서 양으로 대전한 분자는 페리틴에 내포되기 쉽고, 강한 음으로 대전한 분자는 페리틴에 내포되기 어렵다고 생각된다. 그 때문에, -10.2>X의 강하게 음으로 대전한 펩타이드는 페리틴과의 전기적 반발에 의해 페리틴에 내포되기 어렵다고 생각된다. 한편, -10.2≤X의 펩타이드에서는, 펩타이드-페리틴 간의 음 전하의 반발보다도 페리틴이 바구니 형상의 초분자 구조를 형성하는 힘 쪽이 강하기 때문에, 페리틴에 내포되었을 가능성이 있다.

(2) X≤5.9의 조건이 바람직한 이유

너무나도 강하게 양으로 대전한 펩타이드는, 전기적 상호 작용에 의해 페리틴의 안팎에 펩타이드가 흡착하고, 페리틴의 바구니 형상 구조의 형성을 방해하여, 내포되지 않을 가능성이 있다. 또한, 강하게 양으로 대전한 펩타이드는 응집하기 쉽고, 페리틴에 내포할 수 없는 사이즈의 입자를 형성하여, 내포되지 않을 가능성도 있다.

(3) 445≤Y의 조건이 바람직한 이유

화학식량이 너무나도 작은 펩타이드는, 페리틴이 바구니 형상 구조를 형성하고 있는 도중에, 페리틴 내부로부터 확산에 의해 유출되어 버려, 내포되기 어려울 가능성이 있다.

(4) Y≤2524의 조건이 바람직한 이유

페리틴 내강의 직경은 7nm이고, 화학식량이 크기 때문에, 벌크한 분자는 페리틴에 내포되기 어렵다고 생각된다.

바람직하게는, 페리틴에 의한 펩타이드의 내포에 관한 재현성의 향상 등의 관점에서, 펩타이드는 하기 조건을 충족시킨다:

b) -10.2≤X≤0.0, 및 445≤Y≤2524, 또는 c) 3.7≤X≤5.9, 및 445≤Y≤2524

(5) 0.0<X<3.7을 제외한 이유

화학식량이 어느 정도 크고, 그다지 대전하고 있지 않은 펩타이드는, 펩타이드 분자 자체가 응집하고, 페리틴에 내포할 수 없는 사이즈의 입자를 형성하므로, 페리틴에 내포되기 어렵다고 생각된다.

본 발명에서는, 페리틴으로서, 여러 동물에 유래하는 페리틴을 사용할 수 있다. 페리틴이 유래하는 동물로서는, 예를 들어, 포유 동물 또는 조류 (예, 닭)를 들 수 있지만, 포유 동물이 바람직하다. 포유 동물로서는, 예를 들어, 영장류 (예, 사람, 원숭이, 침팬지), 설치류 (예, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 토끼), 가축 및 사역용의 포유 동물 (예, 소, 돼지, 양, 염소, 말)을 들 수 있다.

사람 등의 동물에서는, 페리틴을 구성하는 페리틴 단량체로서 페리틴 H 쇄 및 L 쇄의 2종의 단량체가 존재하는 것, 및 페리틴은 24개의 단량체로 구성되는 다량체 (대부분의 경우, H 쇄 및 L 쇄의 혼합물)인 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명에서는, 페리틴 H 쇄만으로 구성되는 페리틴, 페리틴 L 쇄만으로 구성되는 페리틴, 및 페리틴 H 쇄 및 L 쇄의 혼합물로 구성되는 페리틴을 사용할 수 있다.

페리틴 단량체로서는, 천연 페리틴 단량체, 또는 24량체의 형성능을 갖는 그 유전자 조작 페리틴 단량체의 어느 것도 사용할 수 있다. 예를 들어, 유전자 조작 페리틴 단량체는, 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 간의 플렉서블 링커 영역에서 개변되어 있어도 좋다. 이러한 유전자 조작 페리틴 단량체로서는, 예를 들어, 페리틴 단량체를 구성하는 6개의 α-헬릭스 중의 N 말단부터 세어 1번째와 2번째 사이, 2번째와 3번째 사이, 3번째와 4번째 사이, 4번째와 5번째 사이, 또는 5번째와 6번째 사이의 플렉서블 링커 영역에 기능성 펩타이드가 삽입된 페리틴 단량체를 들 수 있다 (예, 미국 특허출원공개 제2016/0060307호; Jae Og Jeon et al., ACS Nano (2013), 7 (9), 7462-7471; Sooji Kim et al., Biomacromolecules (2016), 17 (3), 1150-1159; Young Ji Kang et al., Biomacromolecules (2012), 13 (12), 4057-4064 참조). 예를 들어, 사람 페리틴 H 쇄 (서열 번호 1) 및 사람 페리틴 L 쇄 (서열 번호 2)에서는, 6개의 α-헬릭스 중 N 말단부터 세어 1 내지 6번째의 α-헬릭스는, 표 1에 나타나는 바와 같다. 따라서, 사람 페리틴 H 쇄 (서열 번호 1)의 플렉서블 링커 영역은 1번째와 2번째 사이의 플렉서블 링커 영역 (43 내지 49 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역), 2번째와 3번째 사이의 플렉서블 링커 영역 (78 내지 96 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역), 3번째와 4번째 사이의 플렉서블 링커 영역 (125 내지 127 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역), 4번째와 5번째 사이의 플렉서블 링커 영역 (138 위치의 아미노산 잔기의 위치), 또는 5번째와 6번째 사이의 플렉서블 링커 영역 (160 내지 164 위치의 아미노산 잔기의 영역)이다. 또한, 사람 페리틴 L 쇄 (서열 번호 2)의 플렉서블 링커 영역은 1번째와 2번째 사이의 플렉서블 링커 영역 (38 내지 45 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역), 2번째와 3번째 사이의 플렉서블 링커 영역 (74 내지 92 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역), 3번째와 4번째 사이의 플렉서블 링커 영역 (121 내지 123 위치의 아미노산 잔기로 이루어진 영역), 4번째와 5번째 사이의 플렉서블 링커 영역 (134 위치의 아미노산 잔기의 위치), 또는 5번째와 6번째 사이의 플렉서블 링커 영역 (155 내지 159 위치의 아미노산 잔기의 영역)이다.

[표 A]

유전자 조작 페리틴 단량체는 또한 그 N 말단 영역 및/또는 C 말단 영역에서 개변되어 있어도 좋다. 페리틴 단량체의 N 말단은 다량체의 표면 위에 노출되고, 그 C 말단은 표면 위에 노출될 수 없다. 따라서, 페리틴 단량체의 N 말단에 부가되는 펩타이드 부분은 다량체의 표면에 노출되어, 다량체의 외부에 존재하는 표적 재료와 상호 작용할 수 있다 (예, 국제공개 제2006/126595호). 한편, 페리틴 단량체의 C 말단은 그 아미노산 잔기를 개변함으로써, 페리틴 내강 중에 내포되는 유기 화합물과 상호 작용할 수 있다 (예, Y. J. Kang, Biomacromolecules. 2012, vol. 13 (12), 4057). 이러한 유전자 조작 페리틴 단량체로서는, 예를 들어, N 말단 또는 C 말단에 기능성 펩타이드가 부가된 페리틴 단량체를 들 수 있다.

바람직하게는, 페리틴은 임상 응용의 관점에서 사람 페리틴이다. 사람 페리틴으로서, 사람 페리틴 H 쇄만으로 구성되는 사람 페리틴, 사람 페리틴 L 쇄만으로 구성되는 사람 페리틴, 및 사람 페리틴 H 쇄 및 L 쇄의 혼합물로 구성되는 사람 페리틴을 사용할 수 있다.

바람직하게는, 사람 페리틴 H 쇄는 이하라도 좋다:

(A1) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(B1) 서열 번호 1의 아미노산 서열에 있어서, 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 및 부가로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 또는 몇개의 아미노산 잔기의 수식을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 24량체 형성능을 갖는 단백질; 또는

(C1) 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 24량체 형성능을 갖는 단백질.

바람직하게는, 사람 페리틴 L 쇄는 이하라도 좋다:

(A2) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(B2) 서열 번호 2의 아미노산 서열에 있어서, 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 및 부가로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 또는 몇 개의 아미노산 잔기의 수식을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 24량체 형성능을 갖는 단백질; 또는

(C2) 서열 번호 2의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 24량체 형성능을 갖는 단백질.

상기 (B1) 및 (B2)에서는, 아미노산 잔기의 결실, 치환, 부가 및 삽입으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1, 2, 3 또는 4종의 수식에 의해 1개 또는 몇 개의 아미노산 잔기를 개변할 수 있다. 아미노산 잔기의 수식은 아미노산 서열 중의 1개의 영역에 도입되어도 좋지만, 복수의 다른 영역에 도입되어도 좋다. 용어 「1 또는 몇 개」는 단백질의 활성을 크게 손상시키지 않는 개수를 나타낸다. 용어 「1 또는 몇 개」가 나타내는 수는, 예를 들어, 1 내지 50개, 바람직하게는 1 내지 40개, 보다 바람직하게는 1 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 20개, 특히 바람직하게는 1 내지 10개, 또는 1 내지 5개 (예, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개)이다.

상기 (C1) 및 (C2)에서는, 단백질의 동일성 %의 산출은 알고리즘 blastp에 의해 행할 수 있다. 보다 구체적으로, 폴리펩타이드의 동일성의 산정 %는 National Center for Biotechnology information (NCBI)에서 제공되어 있는 알고리즘 blastp에 있어서, 디폴트 설정의 Scoring Parameters (Matrix: BLOSUM62; Gap Costs: Existence=11 Extension=1; Compositional Adjustments: Conditional compositional score matrix adjustment)를 사용하여 행할 수 있다.

아미노산 서열에 있어서 변이를 도입해야 할 아미노산 잔기의 위치는, 당업자에게 명확하지만, 서열 얼라인먼트를 더 참고로 하여 특정되어도 좋다. 구체적으로, 당업자는 1) 복수의 아미노산 서열을 비교하고, 2) 상대적으로 보존되어 있는 영역 및 상대적으로 보존되어 있지 않은 영역을 명백하게 하고, 다음으로, 3) 상대적으로 보존되어 있는 영역 및 상대적으로 보존되어 있지 않은 영역으로부터 각각 기능에 중요한 역할을 할 수 있는 영역 및 기능에 중요한 역할을 할 수 없는 영역을 예측할 수 있으므로, 구조·기능의 상관성을 인식할 수 있다. 따라서, 당업자는 서열 얼라이먼트를 이용함으로써 아미노산 서열에 있어서 변이를 도입해야 할 위치를 특정할 수 있고, 또한 기지의 2차 및 3차 구조 정보를 병용하여, 아미노산 서열에 있어서 변이를 도입해야 할 아미노산 잔기의 위치를 특정할 수도 있다. 바람직하게는, 변이의 도입 부위로서, 상기 플렉서블 링커 영역, 및 N 말단 및 C 말단 영역을 이용할 수 있다.

아미노산 잔기가 치환에 의해 변이되는 경우, 아미노산 잔기의 치환은 보존적 치환이라도 좋다. 본 명세서 중에서 사용되는 경우, 용어 「보존적 치환」이란, 소정의 아미노산 잔기를, 유사의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 말한다. 유사의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당해 분야에서 주지이다. 예를 들어, 이러한 패밀리로서는, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전성 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β 위치 분기 측쇄를 갖는 아미노산 (예, 트레오닌, 발린, 이소류신), 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘), 하이드록실기 (예, 알코올성, 페놀성) 함유 측쇄를 갖는 아미노산 (예, 세린, 트레오닌, 타이로신), 및 유황 함유 측쇄를 갖는 아미노산 (예, 시스테인, 메티오닌)을 들 수 있다. 바람직하게는, 아미노산의 보존적 치환은 아스파르트산과 글루탐산 사이에서의 치환, 아르기닌과 라이신과 히스티딘 사이에서의 치환, 트립토판과 페닐알라닌 사이에서의 치환, 페닐알라닌과 발린 사이에서의 치환, 류신과 이소류신과 알라닌 사이에서의 치환, 및 글리신과 알라닌 사이에서의 치환이라도 좋다.

유전자 조작 페리틴 단량체는 또한 기능성 펩타이드를 포함하는 유전자 조작 페리틴 단량체라도 좋다. 기능성 펩타이드로서는, 목적 단백질과 융합된 경우에 임의의 기능을 목적 단백질에 부가할 수 있는 펩타이드를 사용할 수 있다. 이러한 기능성 펩타이드로서는, 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 펩타이드, 프로테아제 분해성 펩타이드, 안정화 펩타이드, 세포 투과성 펩타이드를 들 수 있다.

생체 유기 분자로서는, 예를 들어, 단백질 (예, 올리고 펩타이드 또는 폴리펩타이드), 핵산 (예, DNA 또는 RNA, 또는 뉴클레오시드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드), 당질 (예, 모노사카라이드, 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드), 지방질을 들 수 있다. 생체 유기 분자는 또한 세포 표면 항원 (예, 암 항원, 심질환 마커, 당뇨병 마커, 신경 질환 마커, 면역 질환 마커, 염증 마커, 호르몬, 감염증 마커)라도 좋다. 생체 유기 분자는 또한 질환 항원 (예, 암 항원, 심질환 마커, 당뇨병 마커, 신경 질환 마커, 면역 질환 마커, 염증 마커, 호르몬, 감염증 마커)라도 좋다. 이러한 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 펩타이드로서는, 단백질에 대한 결합능을 갖는 펩타이드 (예, F. Danhier et al., Mol. Pharmaceutics, 2012, vol. 9, No. 11, p. 2961; C-H. Wu et al., Sci. transl. Med., 2015, vol 7, No. 290, 290-91; L. Vannucci et. al. Int. J. Nanomedicine. 2012, vol.7, p. 1489; J. Cutrera et al., Mol. Ther. 2011, vol. 19 (8), p. 1468; R. Liu et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2017, vol. 110-111, p. 13 참조), 핵산에 대한 결합능을 갖는 펩타이드 (예, R. Tan et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92, p. 5282; R. Tan et. al. Cell, 1993, vol. 73, p. 1031; R. Talanian et. al. Biochemistry. 1992, vol. 31, p. 6871 참조), 당질에 대한 결합능을 갖는 펩타이드 (예, K. Oldenburg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, No. 12, p. 5393-5397; K. Yamamoto et. al., J. Biochem., 1992, vol. 111, p. 436; A. Baimiev et. al., Mol. Biol. (Moscow), 2005, vol. 39, No. 1, p. 90. 참조), 지질에 대한 결합능을 갖는 펩타이드 (예, O. Kruse et. al., B Z. Naturforsch., 1995, vol. 50c, p. 380; O. Silva et. al., Sci. Rep., 2016, vol. 6, 27128; A. Filoteo et. al., J. Biol. Chem., 1992, vol. 267, No. 17, p. 11800 참조) 등의 다양한 펩타이드가 보고되어 있다.

기능성 펩타이드로서 프로테아제 분해성 펩타이드가 사용되는 경우, 프로테아제로서는, 예를 들어, 카스파아제나 카텝신 등의 시스테인 프로테아제 (D. McIlwain1 et al., Cold Spring Harb Perspect Biol., 2013, vol. 5, a008656; V. Stoka et al., IUBUM Life. 2005, vol. 57, No. 4-5p. 347), 콜라게나아제 (G. Lee et al., Eur J Pharm Biopharm., 2007, vol. 67, No. 3, p. 646), 트롬빈이나 Xa 인자 (R. Jenny et al., Protein Expr. Purif., 2003, vol. 31, p. 1; H. Xu et al., J. Virol., 2010, vol. 84, No. 2, p. 1076), 바이러스 유래 프로테아제 (C. Byrd et al., Drug Dev. Res., 2006, vol. 67, p. 501)를 들 수 있다.

프로테아제 분해성 펩타이드로서는, 여러가지 펩타이드가 보고되어 있다 (예, E. Lee et al., Adv. Funct. Mater., 2015, vol. 25, p. 1279; G. Lee et al., Eur J Pharm Biopharm., 2007, vol. 67, No. 3, p. 646; Y. Kang et al., Biomacromolecules, 2012, vol. 13, No. 12, p. 4057; R. Talanian et al., J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, p. 9677; Jenny et al., Protein Expr. Purif., 2003, vol. 31, p. 1; H. Xu et al., J. Virol., 2010, vol. 84, No. 2, p. 1076 참조). 따라서, 본 발명에서는, 이러한 펩타이드 또는 그것들의 변이 펩타이드 (예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 또는 이러한 펩타이드 또는 그것들의 변이 펩타이드의 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩타이드를 프로테아제 분해성 펩타이드로서 사용할 수 있다.

안정화 펩타이드로서는, 다양한 펩타이드가 보고되어 있다 (예, X. Meng et al., Nanoscale, 2011, vol.3, No. 3, p. 977; E. falvo et al., Biomacromolecules, 2016, vol. 17, No. 2, p. 514 참조). 따라서, 본 발명에서는, 이러한 펩타이드 또는 그것들의 변이 펩타이드 (예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 또는 이러한 펩타이드 또는 그것들의 변이 펩타이드의 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩타이드를 안정화 펩타이드로서 사용할 수 있다.

세포 투과성 펩타이드로서는, 다양한 펩타이드가 보고되어 있다 (예, Z. Guo et al. Biomed. Rep., 2016, vol. 4, No. 5, p. 528 참조). 따라서, 본 발명에서는, 이러한 펩타이드 또는 그것들의 변이 펩타이드 (예, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환 등의 변이), 또는 이러한 펩타이드 또는 그것들의 변이 펩타이드의 아미노산 서열을 1개 또는 복수 갖는 펩타이드를 세포 투과성 펩타이드로서 사용할 수 있다.

기능성 펩타이드로서는, 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 펩타이드가 바람직하다. 생체 유기 분자에 대한 결합능을 갖는 펩타이드로서는, 단백질에 대한 결합능을 갖는 펩타이드가 보다 바람직하다.

본 발명은 또한 상술한 펩타이드 내포 페리틴을 포함하는 펩타이드 송달제를 제공한다.

본 발명의 펩타이드 송달제는 페리틴과 트랜스페린 수용체 제시 세포와의 사이의 상호 작용을 통해 펩타이드 내포 페리틴 중의 펩타이드를 트랜스페린 수용체 제시 세포의 내부에 송달할 수 있다. 트랜스페린 수용체 제시 세포로서는, 예를 들어, 표피 기저층, 췌 내분비 조직, 뇌하수체, 태반, 뇌내 피질, 선조체, 신장 근위 요세관, 식도, 자궁 경관, 위점막 상피, 흉부 상피 등의 조직 및 부위에 존재하는 세포, 및 적혈구, 혈아세포, 뇌 모세혈관 내피 세포, 간 세포, 쿠퍼 세포, 해마 뉴런 등의 세포를 들 수 있다. 트랜스페린 수용체 제시 세포로서는, 임의의 포유 동물에 유래하는 세포를 이용할 수 있다. 이러한 포유 동물로서는, 예를 들어, 영장류 (예, 사람, 원숭이, 침팬지), 설치류 (예, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 토끼), 가축 및 사역용의 포유 동물 (예, 소, 돼지, 양, 염소, 말)을 들 수 있다. 임상 응용이라는 관점에서, 포유 동물은 바람직하게는 사람이다.

본 발명의 펩타이드 송달제는 또한 트랜스페린 수용체 제시 세포 전반의 내부에 펩타이드를 송달할 수 있지만, 트랜스페린 수용체의 발현량이 높은 세포의 내부에 펩타이드를 보다 특이적 및 재현 좋게 송달할 수 있다. 따라서, 트랜스페린수용체 제시 세포로서는, 트랜스페린 수용체의 발현량이 높은 세포가 바람직하다. 트랜스페린 수용체의 발현량이 높은 세포로서는, 예를 들어, 상술한 트랜스페린 수용체 제시 세포 중, 표피 기저층, 췌 내분비 조직, 뇌하수체, 태반 등의 조직 및 부위에 존재하는 세포, 및 적혈구, 혈아 세포, 뇌 모세혈관 내피 세포, 줄기 세포, 쿠퍼 세포 등의 세포를 들 수 있다.

특정한 실시 형태에서는, 트랜스페린 수용체 제시 세포는 특정한 질환의 원인이 될 수 있는 세포라도 좋다. 이러한 특정한 질환으로서는, 예를 들어, 암, 백혈병, 악성 림프종을 들 수 있지만, 암이 바람직하다. 암으로서는, 예를 들어, 유방암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 폐암 (예, 편평 상피암, 선암 및 대세포암 등의 비소세포암, 및 소세포암), 소화기계 암 (예, 위암, 소장암, 대장암, 직장암), 췌장암, 신장암, 흉선암, 비장암, 갑상선암, 부신암, 전립선암, 방광암, 골암, 피부암, 뇌종양, 흑색종을 들 수 있지만, 유방암이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 송달제는 이러한 특정한 질환의 예방 또는 치료에 유용하다.

본 발명은 또한 하기 1) 및 2)를 포함하는 상술한 펩타이드 내포 페리틴의 제조 방법을 제공한다:

1) pH 3.0 이하의 완충액 중에 페리틴을 방치하여 페리틴을 해리시키는 것 (탈회합 프로세스); 및

2) 해리한 페리틴 및 펩타이드를 pH 5.0 이상 10.0 이하의 완충액 중에 공존시켜서 펩타이드 내포 페리틴을 생성하는 것 (재회합 프로세스).

상기 1)에서는, pH 3.0이하의 완충액 중에 페리틴을 방치함으로써, 페리틴 (24량체)을 페리틴 단량체에 탈회합시킬 수 있다. 완충액 중에서의 페리틴의 방치는 펩타이드의 존재하에 또는 부재하에 행할 수 있다. 완충액 중에서의 페리틴의 방치가 펩타이드의 부재하에 행하여질 경우, 상기 2) 앞에 펩타이드가 완충액 중에 첨가된다.

완충액으로서는, pH 3.0이하의 산성 조건에 대응할 수 있는 임의의 완충액을 사용할 수 있다. 이러한 완충액으로서는, 예를 들어, 글리신 완충액; 시트르산 완충액; 아세트산 완충액; 인산 완충액; 탄산 완충액; 붕산 완충액; 주석산 완충액; MES (2-모르폴리노에탄설폰산) 완충액을 들 수 있다.

1)에서 사용되는 완충액의 pH는 바람직하게는 2.8 이하, 보다 바람직하게는 2.6 이하, 보다 더 바람직하게는 2.5 이하이다. pH의 측정은 pH 분석계 (LAQUA, F-72, Horiba)와 pH 전극 (9680S-10D)을 사용한 25℃에서의 계측에 의해 행할 수 있다.

pH 3.0 이하의 완충액 중에서의 페리틴의 방치 시간은 페리틴의 탈회합에 요하는 시간인 한 특별히 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 이러한 시간은 pH 등의 조건에 의해서도 다르지만, 펩타이드 내포 페리틴의 제작 효율 및 펩타이드 내포 페리틴의 제작 시간의 단축 등의 관점에서, 예를 들어, 1분 내지 10시간이고, 바람직하게는 2분 내지 5시간, 보다 바람직하게는 3분 내지 2시간, 보다 더 바람직하게는 4분 내지 1시간, 특히 바람직하게는 5 내지 30분간이다.

1)의 종료 후, 완충액의 교환, 또는 완충액 또는 염기의 추가에 의해, 2)의 조작을 행할 수 있다. 예를 들어, 완충액의 교환은 1)의 조작 후의 완충액을 중화 및 방치하고, 그 다음에, 해리한 페리틴 및 펩타이드를 포함하는 상청을 회수한 후, pH 5.0 이상 10.0 이하의 완충액과 혼합함으로써 행할 수 있다. pH 5.0 이상 10.0 이하의 완충액으로서는, 예를 들어, Tris 완충액, HEPES 완충액, 인산 완충 액, 붕산 완충액, 시트르산 완충액, 탄산 완충액, 글리신 완충액을 들 수 있다.

2)에서 사용되는 완충액의 pH는 바람직하게는 pH 5.0 이상 9.5 이하, 보다 바람직하게는 pH 5.0 이상 9.2 이하, 보다 더 바람직하게는 pH 5.0 이상 9.0 이하이다.

해리한 페리틴 및 펩타이드의 완충액 중에서의 방치 시간은 페리틴의 재회합에 요하는 시간인 한 특별히 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 이러한 시간은 pH 등의 조건에 의해서도 다르지만, 펩타이드 내포 페리틴의 제작 효율 및 펩타이드 내포 페리틴의 제작 시간의 단축 등의 관점에서, 예를 들어, 10분 내지 72시간이고, 바람직하게는 20분 내지 48시간, 보다 바람직하게는 30분 내지 24시간이다.

[실시예]

다음에 실시예를 나타내어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: 페리틴의 조제>

사람 유래 페리틴 H 쇄 (FTH (서열 번호 1))를 코딩하는 DNA를 전합성하였다. 전합성된 DNA를 주형으로 하여, 5'-GAAGGAGATATACATATGACGACCGCGTCCACCTCG-3' (서열 번호 3) 및 5'-CTCGAATTCGGATCCTTAGCTTTCATTATCACTGTC-3' (서열 번호 4)을 프라이머로 하여 PCR을 행하였다. 또한, pET20 (머크사)을 주형으로 하여, 5'-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3' (서열 번호 5) 및 5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3' (서열 번호 6)을 프라이머로 하여 PCR을 행하였다. 각각 얻어진 PCR 산물을 Wizard DNA Clean-Up System (프로메가사)으로 정제한 후, In-Fusion HD Cloning Kit (타카라 바이오사)로, 50℃, 15분간의 In-Fusion 효소 처리함으로써, FTH를 코딩하는 유전자가 탑재된 발현 플라스미드 (pET20-FTH)를 구축하였다.

계속하여, 구축한 pET20-FTH를 도입한 Escherichia ColiBL21 (DE3)을 LB 배지 (10g/l의 Bacto-typtone, 5g/l Bacto-yeast extract, 5g/l의 NaCl, 100mg/l의 암피실린 포함) 100ml, 37℃에서 24시간 플라스크 배양하였다. 얻어진 균체를 초음파 파쇄한 후, 상청을 60℃에서 20분간 가열하였다. 가열 후 얻어진 상청을, 50mM의 TrisHCl 완충액 (pH 8.0)으로 평형화된 HiPerp Q HP 칼럼 (GE healthcare사)에 주입하고, 0mM 내지 500mM NaCl을 포함하는 50mM Tris Hcl 완충액 (pH 8.0)으로 염 농도구배를 줌으로써, 목적 단백질을 분리 정제하였다. 그 단백질을 포함하는 용액의 용매를 Vivaspin 20-100K (GE healthcare사)를 사용한 원심 한외여과로 10mM의 TrisHCl 완충액 (pH 8.0)으로 치환하였다. 그 용액을, 10mM의 TrisHCl 완충액 (pH 8.0)으로 평형화된 HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 칼럼 (GE healthcare사)에 주입하고, 사이즈에 따라 FTH를 분리 정제하였다. 그 FTH를 포함하는 용액을 Vivaspin 20-100K (GE healthcare사)을 사용한 원심 한외여과로 농축하고, 함유 단백질 농도를 단백질 어세이 CBB 용액 (나카라이테스크사)으로, 소 알부민을 표준으로서 결정하였다. 결과, 배양액 100ml당, 5mg/ml의 FTH를 포함하는 용액 1ml을 얻을 수 있었다. 한편, pH의 측정은 pH 분석계 (LAQUA, F-72, Horiba)와 pH 전극 (9680S-10D)을 사용하여, 25℃에서 행하였다.

<실시예 2: 형광 수식된 펩타이드의 내포 검토 (1)>

페리틴을 사용한 펩타이드 송달을 위해, 형광색소 플루오레세인 (FAM)으로 수식된 펩타이드 (5 (6)-FAM-RFARKGALRQKNVHEVKN (서열 번호 9), PKC-F, 화학식량 2524, 표 3)이 내포된 FTH의 구축을 시도하였다.

최종 농도 5mg/ml의 FTH (화학식량 509421)와 최종 농도 0.5mM의 펩타이드를 포함하는 50mM 글리신 염산염 완충액 (pH 2.3) 0.5ml을, 실온에서 15분간 방치하였다. 그 후, 1M의 트리스 염산염 완충액 (pH 9.0) 50μl을 첨가하여 중화하고, 3시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 원심 분리 (15,000rpm, 1분간)한 후, 상청을 회수하고, 10mM 트리스 염산염 완충액 (pH 8)으로 3ml까지 용량을 늘렸다. 그 용액을, 10mM의 TrisHCl 완충액 (pH 8.0)으로 평형화된 HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 칼럼 (GE healthcare사)에 주입하고, 유속 1.3ml/분으로, 사이즈에 따라 24량체의 FTH를 분리 정제하였다. 정제된 페리틴을 10mM의 TrisHCl 완충액 (pH 8.0)으로 평형화된 HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR 칼럼 (GE healthcare사)을 사용하여 유속 0.5ml/분으로 분석한 바, FTH만으로는 확인되지 않는 480nm의 흡광이 FTH의 피크와 같은 위치에 확인되고, FTH와 펩타이드가 복합체를 형성하고 있는 것을 알 수 있었다 (도 1).

그 FTH를 포함하는 용액을 Vivaspin 20-100K (GE healthcare사)를 사용한 원심 한외여과로 0.25ml까지 농축하였다. 용액 중에 펩타이드가 함유되는 것은 LC-MS 분석으로 확인하였다. LC-MS 분석을 위해, 샘플 용액 50μl에 1M 글리신 염산염 완충액 (pH 2.3) 50μl을 첨가하여 실온에서 15분간 방치하였다. 그 용액에 900μl의 에탄올을 첨가하고, 격하게 교반한 후, 원심 분리 (15000rpm, 5분간)에 의해 상청을 회수하였다. 그 상청을 분석하였다. 이번에, LC-MS로서, LCMS-2020 (시마즈 세사쿠쇼), 칼럼은 Inertsil (등록상표） ODS-3, 입자직경 2μm, 2.1mmｘ50mm (GL science)을 사용하였다. 그리고, 칼럼에 제공된 샘플 10μl을, 용액 A (0.1% 포름산/99.9% 아세토니트릴)과 용액 B (50% 물/50% 아세토니트토릴)의 혼합비가 95 대 5에서 95 대 5가 되도록 유속 0.2ml/분, 10분간 걸쳐서 용출시켰다. 또한, 함유 단백질 농도는 단백질 어세이 CBB 용액 (나카라이테스크사)으로, 소 알부민을 표준으로서 결정하였다. 또한, 내포하는 펩타이드의 농도는 PKC-F에 수식된 형광색소 FAM의 480nm의 흡광으로부터 결정하였다.

그 결과, LC-MS의 분석으로부터, 페리틴 내포된 펩타이드 (도 2)와 표품 펩타이드 (도 3)의 보유 시간은 함께 3.9분간으로 같고, MS 스펙트럼도 동등하고, 페리틴 내포 조작에 의해 PKC-F는 분해되지 않고, 내포되어 있는 것이 확인되었다. 그리고, 4.3mg/ml (8.5μM)의 FTH와 0.18mg/ml (72μM)의 펩타이드를 포함하는 용액 0.25ml을 얻을 수 있었다. 이 때의 몰비로부터 페리틴 1개당 평균 8.5개의 PKC-F가 내포되어 있었다.

<실시예 3: 형광 수식된 펩타이드를 내포한 페리틴의 형상>

정제된 PKC-F 내포 FTH가 바구니 형상을 나타내는 것은, 도 4에 나타내는 바와 같이, 3% 인 텅스텐산 염색에 의한 투과형 전자 현미경 (TEM)상에 의해 확인하였다. 이 때의 펩타이드 내포 FTH의 직경은 12nm이고, 천연형 사람 페리틴과 같은 사이즈이고, 펩타이드 내포에 의해 페리틴의 고차 구조를 크게 손상되지 않는 것을 알 수 있었다.

계속하여, 그 PKC-F 내포 FTH 복합체를 최종 농도 50mM의 인산 완충액 (pH 6 또는 7), 아세트산 완충액 (pH 4 또는 5) 또는 트리스 염산염 완충액 (pH 8)에 각각 FTH량으로서 최종 농도 0.1g/l가 되도록 현탁하고, 그 완충액 중, 25℃에서의 표면 전하를 제타사이저 나노 ZS (마루반사)로 측정하였다. 측정은 샘플 750μl을 DTS1070 셀에 넣고, Material 설정 (RI: 1.450, Absorption: 0.001), Dispersant 설정 (Temperature: 25℃, Viscosity: 0.8872cP, RI: 1.330, Dielectric constant: 78.5), Smoluchowski model (Fκa value: 1.50)로 행하여졌다. 그 결과, 펩타이드 내포 처리되어 있지 않은 FTH와 PKC-F 내포 FTH 복합체의 표면 전하는 동등하고, FTH 표면에 펩타이드가 흡착함으로써 복합화하고 있는 것은 아님을 알 수 있었다 (도 5).

<실시예 4: 형광 수식된 펩타이드 내포 페리틴을 사용한 세포 취입 시험 (1)>

얻어진 PKC-F 내포 FTH를 사용하여, 페리틴에 의한 PKC-F의 세포내로의 수송성을 평가하였다.

평가용 배지 (Opti-MEM^TM (Thermo Fisher Scientific사)+1% 비필수 아미노산 용액 (Thermo Fisher Scientific사)+1% 페니실린-스트렙토마이신 (나카라이테스크사))에 PKC-F 내포 FTH의 최종 농도가 100nM (PKC-F 농도 0.86μM), 200nM (PKC-F 농도 1.72μM) 또는 400nM (PKC-F 농도 3.44μM)이 되도록 각각 첨가된 배지 100μl 중에서, 사람 유방암 유래인 SKBR-3 세포 (20,000 세포/웰, 96-웰 플레이트)에 첨가하여, 37℃에서 배양하였다. 이 SKBR-3 세포는 트랜스페린 수용체 TfR가 발현되어 있다. 또한, 음성 대조군으로서, FTH 내포되어 있지 않은 펩타이드가 최종 농도 0.86μM, 1.72μM 또는 3.44μM로 첨가된 배지에서 SKBR-3 세포를 동일하게 배양하였다. 각각 24시간 배양 후, 인산 완충 생리 식염수 100μl로 2회 세정하고, Trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich사) 50μl 중에서 37℃, 10분간 방치하였다. 그 후, Opti-MEM^TM 배지 100μl를 첨가하고, 형광 활성화 세포 분류 (FACS)용 플레이트에 세포를 옮기고, 400xg, 5분간 원심 분리하였다. 각 세포를 FACS용 완충액 (Attune^TM Focusing Fluid, Thermo Fisher Scientific사)에 현탁하고, FACS (Attune NxT, Thermo Fisher Scientific사)로 분석하였다.

그 결과, PKC-F 내포 FTH에서는 농도 의존적인 형광 강도의 변화가 확인 (도6)되고, 농도 의존적으로 세포로의 취입량이 증가하고 있는 것이 시사되었다.

같은 조건으로 조정된 세포를 2광자 여기 형광 현미경 (CQ-1, 요코카와 덴키 가부시키가이샤)으로 관찰한 바, PKC-F 내포 FTH에서만 세포내의 형광을 관찰할 수 있고, 농도 의존적인 PKC-F 내포 FTH의 세포로의 취입을 확인할 수 있었다 (도 7). 한편, 페리틴에 내포되어 있지 않은 PKC-F에서는, 세포내로 수송은 확인되지 않았다.

이상의 것으로부터, FTH에서 내포함으로써, TfR 제시 세포내에 펩타이드를 송달할 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 5: 형광 수식된 펩타이드의 내포 검토 (2)>

페리틴을 사용한 펩타이드 송달의 범용성을 조사하기 위해, PKC-F 이외의 펩타이드를 페리틴에 내포시켜 세포내로의 수송을 시도하였다.

우선, 형광 수식된 2종류의 펩타이드〔 (5 (6)-FAM-CGGPKKKRKVG (서열 번호 10), FAM-SV40, 화학식량 1516, 및 5 (6)-FAM-CGGKRPAAIK KAGQAKKKKG (서열 번호 11), FAM-Np, 화학식량 384)〕이 내포된 FTH의 구축을 시도하였다. 최종 농도 5mg/ml의 FTH (화학식량 509421)와 최종 농도 0.5mM의 펩타이드를 포함하는 50mM 글리신 염산염 완충액 (pH 2.3) 0.5ml을, 실온에서 15분간 방치하였다. 그 후, 1M의 트리스 염산염 완충액 (pH 9.0) 50μl을 첨가하여 중화하고, 3시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 원심 분리 (15,000rpm, 1분간)한 후, 상청을 회수하고, 10mM 트리스 염산염 완충 액 (pH 8)으로 3ml까지 용량을 늘렸다. 그 용액을, D-PBS (-) (후지 필름 와코 쥰야쿠 (주))로 평형화된 HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR 칼럼 (GE healthcare사)을 사용하여 유속 0.5ml/분으로 사이즈에 따라 24량체의 FTH를 분리 정제하였다. 이 때, FAM-SV40의 내포 조작을 행한 페리틴에서는 430nm의 흡광이 페리틴 24량체와 같은 용출 위치에 확인되고, 페리틴 내에 FAM-SV40이 내포되어 있는 것이 시사되었다 (도 8). 하지만, FAM-Np의 내포 조작을 행한 페리틴에서는 480nm의 흡광은 확인되지 않고, FAM-Np가 내포되어 있지 않은 것을 알 수 있었다. 이것은 물성 등의 차이에 의해 페리틴에 내포가 어려운 펩타이드가 존재하는 것을 시사한다.

그 다음에, 정제된 페리틴에 내포된 FAM-SV40 펩타이드량의 정량을 480nm의 흡광, 페리틴량 알부민을 표준으로 한 CBB 염색에 의한 정량을 행하였다.

그 결과, 6.3mg/ml (12μM)의 FTH와 0.09mg/ml (30μM)의 FAM-SV40 펩타이드를 포함하는 용액 0.3ml을 얻을 수 있었다. 이 때의 몰비로부터 페리틴 1개당 평균 2.5개의 FAM-SV40이 내포되어 있었다.

<실시예 6: 형광 수식된 펩타이드 내포 페리틴을 사용한 세포 취입 시험 (2)>

얻어진 FAM-SV40 내포 FTH의 세포로의 취입을 평가하였다. 평가용 배지 (Opti-MEM^TM (Thermo Fisher Scientific사)+1% 비필수 아미노산 용액 (Thermo Fisher Scientific사)+1% 페니실린-스트렙토마이신 (나카라이테스크사))에 FAM-SV40 내포 FTH의 최종 농도가 100nM (FAM-SV40 농도 250nM), 200nM (FAM-SV40 농도 500nM) 또는 400nM (FAM-SV40 농도 1000nM)이 되도록 각각 첨가된 배지 100μl 중에서, SKBR-3 세포 (20,000 세포/웰, 96-웰 플레이트)에 첨가하고, 37℃에서 배양하였다. 또한, 음성 대조군으로서, FTH 내포되어 있지 않은 펩타이드가 최종 농도 250nM, 500nM 또는 1000nM으로 첨가된 배지에서 SKBR-3 세포를 동일하게 배양하였다. 각각 24시간 배양 후, 인산 완충 생리 식염수 100μl로 2회 세정하고, Trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich사) 50μl 중에서 37℃, 10분간 방치하였다.

그 후, Opti-MEM^TM 배지 100μl를 첨가하여, 형광 활성화 세포 분류 (FACS)용 플레이트에 세포를 옮기고, 400xg, 5분간 원심 분리하였다. 각 세포를 FACS용 완충액 (Attune^TM Focusing Fluid, Thermo Fisher Sceintific사)에 현탁하고, FACS (Attune NxT, Thermo Fisher Scientific사)로 분석하였다. 결과적으로, FAM-SV40 내포 FTH에서만 농도 의존적인 형광 강도의 상승을 관찰할 수 있었던 한편, FAM-SV40만으로는, 형광은 확인되지 않았다 (도 9).

이상의 것으로부터, FTH에 내포됨으로써, 종래 막투과할 수 없는 펩타이드도 세포내에 송달할 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 7: TfR 발현량에 의한 펩타이드 송달량의 의존성의 확인>

페리틴에 내포함으로써, 목적의 펩타이드를, 트랜스페린 수용체 (TfR) 제시 세포에 특이적으로 송달할 수 있음을 확인하기 위해, TfR의 발현량이 다른 세포주를 사용하여, FTH의 취입 효율의 TfR 의존성을 평가하였다.

이번의 평가에서는, TfR 발현량이 많은 세포 SKBR3 (발현 강도 449.7 TPM, 데이터베이스 「The Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas. org/)」 참조)와 TfR 발현량이 적은 세포 HEK293 세포 (발현 강도 74.5 TPM, 데이터베이스 「The Human Protein Atlas」 참조)의 아주 (亞株)인 HEK293E 세포를 사용하였다.

먼저 SKBR3 세포와 HEK293E 세포로부터 PureLink (등록상표) RNA Mini 키트 (Thermo Fisher Scientific사)를 사용하여 전체 RNA를 회수하였다. 50ng의 각 세포 유래의 전체 RNA와 2μL의 SuperScript^TM VILO^TM Master Mix (Thermo Fisher Scientific사)를 혼합하고, 전량 10μL가 되도록 물을 첨가하였다. 25℃에서 10분, 42℃에서 60분, 85℃에서 5분 인큐베이트한 후, 115μL의 물을 첨가하여 희석함으로써 0.4ng/μL의 cDNA 용액을 얻었다. 각 cDNA 용액 5μL에 TaqMan (등록상표) Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems사), 물 4.8μL, 25μM의 프라이머 믹스를 첨가하여, 정량 PCR 용액을 조제하였다. TfR 유전자용 프라이머 믹스는 (Forward: TGGCAGTTCAGAATGATGGA (서열 번호 26), Reverse: AGGCTGAACCGGGTATATGA (서열 번호 27))을 혼합하여 사용하였다. 내표 (內標)로서는 18S rRNA를 정량하였다. 18S rRNA용 유전자용 프라이머 믹스는 (Forward: TGAGAAACGGCTACCACATC (서열 번호 28), Reverse: TTACAGGGCCTCGAAAGAGT (서열 번호 29))을 혼합하여 사용하였다. 정량 PCR (StepOnePlus^TM 시스템, Applied Biosystems사)에 의해, TfR의 mRNA의 발현량을 확인한 바, SKBR3 세포의 TfR 발현량은 HEK293E 세포의 3.2배 높았다.

평가용 배지 (Opti-MEM^TM (Thermo Fisher Scientific사)+1% 비필수 아미노산 용액 (Thermo Fisher Scientific사)+1% 페니실린-스트렙토마이신 (나카라이테스크사))에 FAM-SV40 내포 FTH의 최종 농도가 0에서 800nM (FAM-SV40 농도 2μM)가 되도록 각각 첨가된 배지 100μl 중에서, 각 세포 (20,000 세포/웰, 96-웰 플레이트)에 첨가하여, 37℃에서 배양하였다. 각각 24시간 배양 후, 인산 완충 생리 식염수 100μl로 2회 세정하고, Trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich사) 50μl 중에서 37℃, 10분간 방치하였다.

그 후, Opti-MEM^TM 배지 100μl을 첨가하고, 형광 활성화 세포 분류 (FACS)용 플레이트에 세포를 옮기고, 400xg, 5분간 원심 분리하였다. 각 세포를 FACS용 완충액 (Attune^TM Focusing Fluid, Thermo Fisher Scientific사)에 현탁하고, FACS (Attune NxT, Thermo Fisher Scientific사)로 분석하였다.

그 결과, FAM-SV40 내포 FTH를 100nM으로 포함하는 배지에서 배양된 SKBR3 세포의 90% 이상이 형광을 발하고 있고, 대부분의 세포가 FAM-SV40 내포 FTH를 취입하고 있는 것이 시사되었다. 그리고, 그 비율은 같은 조건으로 얻어진 HEK293E 세포의 60배이었다 (도 10). HEK293E 세포의 경우, 90% 이상의 세포가 형광을 발하게 되기 위해서는, FAM-SV40 내포 FTH를 800nM 이상의 고농도로 포함하는 배지에서 배양할 필요가 있었다 (도 11). 이들 결과는, TfR 발현량이 많은 세포 SKBR3은 보다 효율적으로 페리틴을 세포내에 취입한 것을 시사한다.

즉, 페리틴에 내포함으로써, 목적의 펩타이드를, 대상 세포의 TfR 발현량에 따라서 세포내에 송달량을 제어 가능한 것을 알 수 있었다.

<실시예 8: 페리틴에 내포 가능한 펩타이드의 탐색 (1)>

탈회합·재회합 프로세스에 의해 페리틴에 내포 가능한 펩타이드의 탐색을 행하였다. 탈회합·재회합 프로세스에서는, 최종 농도 5mg/ml의 FTH와 최종 농도 0.5mM의 펩타이드를 포함하는 50mM 글리신 염산염 완충액 (pH 2.3) 1ml을, 실온에서 15분간 방치하였다. 그 후, 1M의 트리스 염산염 완충액 (pH 9.0) 310μl을 첨가하여 중화하고, 3시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 50mM 트리스 염산염 완충액 (pH 8.0) 1.2ml을 첨가하여, 원심 분리 (15,000rpm, 1분간)한 후, 상청 2.5ml을 50mM 트리스 염산염 완충액 (pH 8)으로 평형화된 탈염 칼럼 PD-10 (Sephadex G-25 충전품, GE 헬스케어사)에 제공하고, 3.0ml의 50mM 트리스 염산염 완충액 (pH 8.0)으로 용출하고, 봉입되지 않은 펩타이드와 페리틴을 분리하였다. 그 용액 전량 (3.0ml)을 Vivaspin 20-100K (GE healthcare사)를 사용한 원심 한외여과로 0.1ml에 농축하였다. 그 농축액에 10ml의 50mM 트리스 염산염 완충액을 첨가하여 농축하는 조작을 2회 반복함으로써, PD-10으로 전부 제거할 수 없었던 펩타이드를 제거하고, 샘플 용액 0.1ml을 얻었다. LC-MS 분석 때문에, 샘플 용액 50μl에 1M 글리신 염산염 완충액 (pH 2.3) 50μl을 첨가하여 실온에서 15분간 방치하였다. 그 용액에 900μl의 에탄올을 첨가하고, 격하게 교반한 후, 원심 분리 (15000rpm, 5분간)에 의해 상청을 회수하였다. 그 상청을 분석하였다. 이번에, LC-MS로서, LCMS-2020 (시마즈 세사쿠쇼), 칼럼은 Inertsil (등록상표） ODS-3, 입자직경 2μm, 2.1mmｘ50mm (GL science)를 사용하였다. 그리고, 칼럼에 제공된 샘플 10μl를, 용액 A (0.1% 포름산/99.9% 아세토니트릴)와 용액 B (50% 물/50% 아세토니트릴)의 혼합비가 95 대 5에서 95 대 5가 되도록 유속 0.2ml/분, 10분간에 걸쳐서 용출시켰다.

이번 내포 검토에 사용한 펩타이드의 일람을 표 1에 나타낸다. 펩타이드의 페리틴으로의 내포는 탈회합·재회합 프로세스에 의한 페리틴 내로의 펩타이드 내포 조작을 행한 샘플과, 단순히 페리틴과 펩타이드를 혼합한 샘플을 각각 조제하고, LC-MS에 의해 검출된 펩타이드의 양을 비교하였다. 예를 들어, ClAc-FHC는 보유 시간 0.8분간으로 용출하고, 탈회합·재회합 프로세스에서는 m/z=445에 ClAc-FHC (화학식량 445) 유래의 피크를 확인할 수 있었다 (도 12의 A). 하지만, 탈회합·재회합 프로세스를 행하지 않은 단순한 펩타이드와 페리틴의 혼합만으로는 그 피크를 관찰할 수 없었다 (도 12의 B). 이번, 탈회합·재회합 프로세스에서 펩타이드가 내포된 FTH의 LC-MS의 결과를 도 13 내지 도 17에 나타낸다.

이번 평가된 펩타이드의 페리틴으로의 내포 가부는 다음 표 2에 나타낸다.

<실시예 9: 페리틴에 내포 가능한 물성의 검토>

이번, 페리틴에 내포된 펩타이드 및 내포할 수 없었던 펩타이드에 대해 하기의 각 물성 값과 페리틴으로의 펩타이드의 내포 가부와의 상관 관계를 조사하였다.

(1) 펩타이드의 길이 (쇄 길이)

(2) 펩타이드의 화학식량

(3) 소수성도 (Hydrophobicity)

(4) GRAVY

(5) 평균 친수성도 (Average of hydrophilicity)

(6) 펩타이드에 차지하는 친수성 아미노산의 비율 (Ratio of hydrophilic residues/total number of residues)

(7) pH 9에서의 펩타이드의 전하

상기 (1) 내지 (7)의 물성 값은 이하의 방법에 기초하여 결정하였다.

(1) 펩타이드의 길이 (쇄 길이)

펩타이드의 길이는 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기의 총수에 기초하여 결정하였다.

(2) 펩타이드의 화학식량

펩타이드의 조성식에 기초하여 원자량과 원자수의 곱의 총합으로서 결정하였다.

(3) 소수성도

펩타이드의 소수성도 (Hydrophobicity)는 SSRCalc Hydrophobicity에 기초하여 산출하였다 (O. V. Krokhin Anal. Chem. (2006), 78 (22) 7785-7795). 이번에, Prot pi (https://www.protpi.ch/Calculator/PeptideTool)을 사용하여, 300 옹스트롬 C18 칼럼, 0.1% TFA 용출 조건의 데이터베이스를 사용하여 산출하였다.

(4) GRAVY

GRAVY (grand average of hydropathy)는 각 아미노산 잔기의 수치요법 값 (hydropathy score)을 가산하고, 그리고 서열의 길이로 나눔으로써 계산하였다 (J, Kyte and R. F. Doolittle, J Mol Biol. 1982 157 (1) 105-32).

(5) 평균 친수성도

평균 친수성도 (Average of hydrophilicity)는 각 아미노산 잔기의 친수도 값 (hydrophilicity score)을 가산하고, 그리고 서열의 길이로 나눔으로써 계산하였다 (Hopp and Woods Proc Natl Acad Sci USA. 1981 78 (6) 3824-8).

(6) 펩타이드에 차지하는 친수성 아미노산의 비율

펩타이드에서 차지하는 친수성 아미노산의 비율 (Ratio of hydrophilic residues/total number of residues)은 펩타이드를 구성하는 전체 아미노산 중, 친수성 아미노산 (H, C, T, S, K, Q, E, D, N 및 R)이 차지하는 비율을 평가함으로써 결정하였다.

(7) pH 9에서의 펩타이드의 전하

pH 9에서의 펩타이드의 전하는 펩타이드를 구성하는 각 아미노산 잔기의 측쇄, 수식기, N 말단의 아미노기 또는 그 보호기, C 말단의 카복시기 또는 그 보호기를 포함하는 모든 관능기의 전하에 대해 각 관능기의 해리 상수 (pKa)와 전하의 양과 음을 각각 사용하여 pH 9로 하여, 이하의 식을 이용하여 산출하였다.

각 아미노산의 pKa의 평가는 ChemAxon (https://chemaxon.com/)을 이용하였다 (O. Toure et. al., Oil Gas Sci. Technol. 2013, 68, 281-297).

페리틴으로의 내포의 검토에서 사용된 펩타이드의 상기 각 물성 값과 페리틴으로의 펩타이드의 내포 가부와의 관계는, 이하와 같다.

물성 값 (1) 내지 (7)은 상기와 같다.

시행수는 3회이다. A는 3회 모두 내포가 확인된 펩타이드, B는 내포를 확인할 수 있는 경우가 2회 이하인 펩타이드, C는 1회도 내포를 확인할 수 없었던 펩타이드를 각각 나타낸다.

그 결과, pH 9.0에서의 전하와 화학식량의 관계식과 펩타이드의 내포 용이성과의 사이에 상관성이 발견되었다 (도 18).

즉, a) -10.2≤pH 9에서의 펩타이드의 전하 (X)≤5.9, 및 445≤펩타이드의 화학식량 (Y)≤2524의 조건을 충족시키는 펩타이드를 페리틴에 내포할 수 있었다 (도 18).

또한, 상기 조건을 충족시키는 펩타이드 중, b) -10.2≤X≤0.0, 및 445≤Y≤2524, 또는 c) 3.7≤X≤5.9, 및 445≤Y≤2524의 조건을 충족시키는 펩타이드는 페리틴에 재현성 좋게 내포할 수 있었다 (도 18).

<실시예 10: 페리틴의 조제 (2)>

사람 유래 페리틴 L 쇄 (FTL (서열 번호 2))를 코딩하는 DNA를 전합성하였다. 전합성된 DNA를 주형으로 하여, 5'－GAAGGAGATATACATATGAGCTCCCAGATTCGTCAG-3' (서열 번호 7) 및 5'-CTCGAATTCGGATCCTTAGTCGTGCTTGAGAGTGAG-3' (서열 번호 8)을 프라이머로 하여 PCR을 행하였다. 또한, pET20 (머크사)을 주형으로 하여, 5'-TTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3' (서열 번호 5) 및 5'-TTTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCG-3' (서열 번호 6)을 프라이머 하여 PCR을 행하였다. 각각 얻어진 PCR 산물을 Wizard DNA Clean-Up System (프로메가사)으로 정제한 후, In-Fusion HD Cloning Kit (타카라 바이오사)로, 50℃, 15분간의 In-Fusion 효소 처리함으로써, FTL을 코딩하는 유전자가 탑재된 발현 플라스미드 (pET20-FTL)를 구축하였다.

계속해서, 구축한 pET20-FTL을 도입한 Escherichia coliBL21 (DE3)을 LB 배지 (10g/l의 Bacto-typtone, 5g/l Bacto-yeast extract, 5g/l의 NaCl, 100mg/l의 암피리딘을 포함함) 100ml, 37℃에서 24시간 플라스크 배양하였다. 얻어진 균체를 초음파 파쇄한 후, 상청을 60℃에서 20분간 가열하였다. 가열 후 얻어진 상청을, 50mM의 TrisHCl 완충액 (pH 8.0)으로 평형화된 HiPerp Q HP 칼럼 (GE healthcare사)에 주입하고, 0mM 내지 500mM NaCl을 포함하는 50mM TrisHCl 완충액 (pH 8.0)으로 염 농도구배를 줌으로써, 목적 단백질을 분리 정제하였다. 그 단백질을 포함하는 용액의 용매를 Vivaspin 20-100K (GE healthcare사)를 사용한 원심 한외여과로 10mM의 TrisHCl 완충액 (pH 8.0)으로 치환하였다. 그 용액을, 10mM의 TrisHCl 완충 액 (pH 8.0)으로 평형화된 HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 칼럼 (GE healthcare사)에 주입하고, 사이즈에 따라 FTL을 분리 정제하였다. 그 FTH를 포함하는 용액을 Vivaspin 20-100K (GE healthcare사)을 사용한 원심 한외여과로 농축하고, 함유 단백질 농도를 단백질 어세이 CBB 용액 (나카라이테스크사)으로, 소 알부민을 표준으로서 결정하였다. 결과, 배양액 100ml당, 3mg/ml의 FTL을 포함하는 용액 1ml을 얻을 수 있었다.

<실시예 11: 형광 수식된 펩타이드의 내포 검토>

형광색소 플루오레세인 (FAM)으로 수식된 펩타이드 (5 (6)-FAM-RFARKGALRQKNVHEVKN (서열 번호 9), PKC-F, 화학식량 2524)가 내포된 FTL을 구축하였다.

최종 농도 5mg/ml의 FTL (화학식량 480466)과 최종 농도 0.5mM의 펩타이드를 포함하는 50mM 글리신 염산염 완충액 (pH 2.3) 0.5ml을, 실온에서 15분간 방치하였다. 그 후, 1M의 트리스 염산염 완충액 (pH 9.0) 50μl을 첨가하여 중화하고, 3시간 실온에서 방치하였다. 방치 후, 원심 분리 (15,000rpm, 1분간)한 후, 상청을 회수하고, 10mM 트리스 염산염 완충액 (pH 8)으로 3ml까지 용량을 늘렸다. 그 용액을, D-PBS (-) (후지 필름 와코 쥰야쿠 (주))로 평형화된 HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 칼럼 (GE healthcare사)에 주입하고, 유속 1.3ml/분으로, 사이즈에 따라 24량체의 FTL을 분리 정제하였다. 정제된 페리틴을, PBS로 평형화된 HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR 칼럼 (GE healthcare사)을 사용하여 유속 0.5ml/분으로 분석한 바, FTL만으로는 확인되지 않는 480nm의 흡광이 FTL의 피크와 같은 위치에 확인되고, 펩타이드가 FTL에 내포되어 있었다 (도 19). 이상의 것으로부터 FTL에서도 펩타이드가 내포 가능한 것을 알 수 있었다.

<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Peptide-encapsulating ferritin <130> PAMA-21658 <150> JP2019-162119 <151> 2019-09-05 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser 20 25 30 Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala 35 40 45 Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg 50 55 60 Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn 100 105 110 Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro 115 120 125 His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys 130 135 140 Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly 145 150 155 160 Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu 165 170 175 Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser 180 <210> 2 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala 1 5 10 15 Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu 20 25 30 Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val 35 40 45 Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu 50 55 60 Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln 65 70 75 80 Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala 85 90 95 Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu 100 105 110 Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp 115 120 125 Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys 130 135 140 Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala 145 150 155 160 Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp 165 170 175 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAAGGAGATATACATATGACGACCGCGTCCACCTCG <400> 3 gaaggagata tacatatgac gaccgcgtcc acctcg 36 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A primer for amplifying DNA encoding human ferritin heavy chain <400> 4 ctcgaattcg gatccttagc tttcattatc actgtc 36 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A primer for amplifying the vector pET20 <400> 5 tttcatatgt atatctcctt cttaaagtta aac 33 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A primer for amplifying the vector pET20 <400> 6 tttggatccg aattcgagct ccgtcg 26 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A primer for amplifying DNA encoding human ferritin light chain <400> 7 gaaggagata tacatatgag ctcccagatt cgtcag 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A primer for amplifying DNA encoding human ferritin light chain <400> 8 ctcgaattcg gatccttagt cgtgcttgag agtgag 36 <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of the peptide PKC-F which is to be tested for encapsulation with ferritin <400> 9 Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gln Lys Asn Val His Glu Val 1 5 10 15 Lys Asn <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of the peptide SV40 which is to be tested for encapsulation with ferritin <400> 10 Cys Gly Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly 1 5 10 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of the peptide Np which is to be tested for encapsulation with ferritin <400> 11 Cys Gly Gly Lys Arg Pro Ala Ala Ile Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys 1 5 10 15 Lys Lys Lys Gly 20 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of the peptide EGFR which is to be tested for encapsulation with ferritin <400> 12 His Thr Ser Asp 1 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of the peptide cyloRGDfV which is to be tested for encapsulation with ferritin <400> 13 Arg Gly Asp Phe Val 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of the peptide FGF3-FP16 which is to be tested for encapsulation with ferritin <400> 14 Val Leu Trp Leu Lys Asn Arg 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of the peptide Hymenistatin I which is to be tested for encapsulation with ferritin <400> 15 Pro Pro Tyr Val Pro Leu Ile Ile 1 5 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of the peptide Ex10 which is to be tested for encapsulation with ferritin <400> 16 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of the peptide Rx10 which is to be tested for encapsulation with ferritin <400> 17 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of the peptide avb6 which is to be tested for encapsulation with ferritin <400> 18 Ser Pro Arg Gly Asp Leu Ala Val Leu Gly His Lys Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of the peptide NRP-1-2 which is to be tested for encapsulation with ferritin <400> 19 Gly Gly Lys Arg Pro Ala Arg Gly Gly Lys Arg Pro Ala Arg 1 5 10 <210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of the peptide Pakti-L1 which is to be tested for encapsulation with ferritin. A sulfur atom in side chain of cysteine residue is covalently linked to an acetyl group. <400> 20 Tyr Ile Leu Val Arg Asn Arg Leu Leu Arg Val Asp Cys Gly 1 5 10 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of the peptide NS which is to be tested for encapsulation with ferritin <400> 21 Gln Met Ala Arg Ile Pro Lys Arg Leu Ala Arg His Gln Met Ala Arg 1 5 10 15 <210> 22 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of the peptide GRP78-3 which is to be tested for encapsulation with ferritin <400> 22 Gly Ile Arg Leu Arg Gly Gly Ile Arg Leu Arg Gly Gly Ile Arg Leu 1 5 10 15 Arg Gly <210> 23 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of the peptide FBP0032 which is to be tested for encapsulation with ferritin. Two cysteine residues are covalently linked via disulfide bridge. X at position 1 indicates 4-pentynoic acid. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 23 Xaa Gly Gln Lys Gly Cys Lys Lys Thr Pro Lys Leu Ala Ser Leu Ser 1 5 10 15 Cys Thr Gly Phe 20 <210> 24 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of the peptide FBP0033 which is to be tested for encapsulation with ferritin. Two cysteine residues are covalently linked via disulfide bridge. X at position 1 indicates 4-pentynoic acid. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 24 Xaa Gly Arg Pro Gly Cys Gly Pro Arg Lys Pro Arg Thr Pro Lys Lys 1 5 10 15 Cys Gly Ser His 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A primer for amplifying DNA encoding transferrin receptor (TfR) <400> 25 tggcagttca gaatgatgga 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A primer for amplifying DNA encoding transferrin receptor (TfR) <400> 26 aggctgaacc gggtatatga 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A primer for amplifying DNA encoding 18S rRNA <400> 27 tgagaaacgg ctaccacatc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A primer for amplifying DNA encoding 18S rRNA <400> 28 ttacagggcc tcgaaagagt 20

Claims

펩타이드가 3 내지 19개의 아미노산 잔기로 구성되고, 또한 하기 조건:
a) -10.2≤X≤5.9, 및 445≤Y≤2524;
(여기서, X는 pH 9에서의 펩타이드의 전하를 나타내고, Y는 펩타이드의 화학식량을 나타낸다)
을 충족시키는, 펩타이드 내포 페리틴.
제1항에 있어서, 펩타이드가 4 내지 16개의 아미노산 잔기로 구성되는, 펩타이드 내포 페리틴.
제1항 또는 제2항에 있어서, 펩타이드가 하기 조건:
b) -10.2≤X≤0.0, 및 445≤Y≤2524; 또는
c) 3.7≤X≤5.9, 및 445≤Y≤2524
(여기서, X 및 Y는 제 1 항과 동일하다)
을 충족시키는, 펩타이드 내포 페리틴.
펩타이드의 세포내 송달제로서,
펩타이드 내포 페리틴을 포함하고,
펩타이드가 3 내지 19개의 아미노산 잔기로 구성되고, 또한 하기 조건:
a) -10.2≤X≤5.9, 및 445≤Y≤2524;
(여기서, X는 pH 9에서의 펩타이드의 전하를 나타내고, Y는 펩타이드의 화학식량을 나타낸다)
을 충족시키는, 펩타이드의 세포내 송달제.
제4항에 있어서, 펩타이드가 사람 세포의 세포내에 송달되는, 펩타이드의 세포내 송달제.
제4항 또는 제5항에 있어서, 펩타이드가 암세포의 세포내에 송달되는, 펩타이드의 세포내 송달제.
펩타이드 내포 페리틴의 제조 방법으로서,
1) 펩타이드의 존재하에 또는 부재하에 페리틴을 pH 3.0 이하의 완충액 중에서 방치하여 페리틴을 해리시키는 것; 및
2) 해리한 페리틴 및 펩타이드를 pH 5.0 이상 10.0 이하의 완충액 중에 공존시켜서 펩타이드 내포 페리틴을 생성하는 것
을 포함하고,
펩타이드가 3 내지 19개의 아미노산 잔기로 구성되고, 또한 하기 조건:
a) -10.2≤X≤5.9, 및 445≤Y≤2524;
(여기서, X는 pH 9에서의 펩타이드의 전하를 나타내고, Y는 펩타이드의 화학식량을 나타낸다)
을 충족시키는, 제조 방법.