KR20220047946A

KR20220047946A - 마크로파지-1 항원 억제제를 포함하는 폐 손상 질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20220047946A
Application number: KR1020220043584A
Authority: KR
Inventors: 박인원; 김필한
Original assignee: 서울대학교병원; 한국과학기술원
Priority date: 2019-05-24
Filing date: 2022-04-07
Publication date: 2022-04-19
Also published as: KR20200135043A; KR102563078B1

Abstract

본 발명은 폐 모세혈관 내의 중성구(neutrophil)에서의 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 발현 또는 활성 억제제를 포함하고 폐의 미세순환 장애를 개선하는 폐 손상 질환 예방 또는 치료용 조성물, 스크리닝 방법, 폐 손상 장애 여부 진단을 위한 정보 제공 방법, 폐 미세순환 장애 여부 진단용 조성물 및 키트에 관한 것으로, 본 발명에 일 실시예에 따른 조성물은, 폐 모세혈관 내의 중성구에서의 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성을 억제함으로써 적혈구가 폐 모세혈관을 원활하게 통과할 수 있게 하여 폐 미세순환 장애 개체에서 가스 교환을 증가시켜 폐의 미세순환 장애를 개선할 수 있는바, 폐 손상 질환을 예방 또는 치료용 조성물로서 우수한 효과가 있다.

Description

마크로파지-1 항원 억제제를 포함하는 폐 손상 질환 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for prevention or treatment of lung damage diseases comprising inhibitor of macrophage-1 antigen}

본 명세서에는 폐 모세혈관 내의 중성구(neutrophil)에서의 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 발현 또는 활성 억제제를 포함하고 폐의 미세순환 장애를 개선하는 폐 손상 질환 예방 또는 치료용 조성물, 스크리닝 방법, 폐 손상 장애 여부 진단을 위한 정보 제공 방법, 폐 미세순환 장애 여부 진단용 조성물 및 키트가 개시된다.

패혈증(sepsis)은 입원 중 발생하는 사망의 가장 큰 부분을 차지하는 것으로(Torio CM, Moore BJ. National Inpatient Hospital Costs: The Most Expensive Conditions by Payer, 2013: Statistical Brief #204. Healthcare Cost and Utilization Project (HCUP) Statistical Briefs, Rockville (MD), 2016; Hall MJ, Levant S, DeFrances CJ. Trends in inpatient hospital deaths: National Hospital Discharge Survey, 2000-2010. NCHS Data Brief 2013(118): 1-8.), 병원균 침입에 대한 숙주의 난독반응(dysregulated response)로 특징지어지는 증후군이며, 생명을 위협하는 여러 가지 장기 기능 부전(dysfunction)을 이끄는 혈류역학적 변화를 수반한다(Singer M, Deutschman CS, Seymour CW, Shankar-Hari M, Annane D, Bauer M, Bellomo R, Bernard GR, Chiche JD, Coopersmith CM, Hotchkiss RS, Levy MM, Marshall JC, Martin GS, Opal SM, Rubenfeld GD, van der Poll T, Vincent JL, Angus DC. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA 2016: 315(8): 801-810; Angus DC, van der Poll T. Severe sepsis and septic shock. N Engl J Med 2013: 369(9): 840-851). 패혈증에 의해 손상되는 장기 중 폐가 가장 먼저, 또한 가장 자주 손상되며, 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS) 또는 급성 폐 손상(acute lung injury, ALI) 여부는 패혈증 환자의 사망 가능성을 예측하는 가장 중요한 인자이다(Lagu T, Rothberg MB, Shieh MS, Pekow PS, Steingrub JS, Lindenauer PK. Hospitalizations, costs, and outcomes of severe sepsis in the United States 2003 to 2007. Crit Care Med 2012: 40(3): 754-761.). 패혈증으로 인한 급성 폐 손상 치료를 목적으로 하는 집중적인 연구 노력에도 불구하고, 미세순환에 목적을 둔 효과적인 치료법은 없는 실정이다(Thompson BT, Chambers RC, Liu KD. Acute Respiratory Distress Syndrome. N Engl J Med 2017: 377(6): 562-572). 사강(dead space)을 측정하는 것이 급성 폐 손상에 있어 유의미한 임상적 데이터를 제공할 수 있다는 것이 알려져 있으나(Nuckton TJ, Alonso JA, Kallet RH, Daniel BM, Pittet JF, Eisner MD, Matthay MA. Pulmonary dead-space fraction as a risk factor for death in the acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med 2002: 346(17): 1281-1286), 현재까지는 폐 골격의 손상 측면에서 혈액에서 산소 공급은 일어나지만(ventilate) 관류(perfuse)되지는 않는 가설에 머물러 있을 뿐이다. 특히, 급성 호흡 곤란 증후군은 폐 손상과 미세순환 사이의 관련성에 대해 명확히 규명되지 않은 증후군이다(Ryan D, Frohlich S, McLoughlin P. Pulmonary vascular dysfunction in ARDS. Ann Intensive Care 2014: 4: 28). 최근, 한 연구에서 체외(ex vivo) 연구로 제한되었던 폐혈관 내 혈전의 증거가 보고되었으나, 중성구 유입의 생체 내(in vivo) 과정과 이에 따른 폐 미세순환의 교란 요인은 아직 연구된 바 없다(Matthay MA, Ware LB, Zimmerman GA. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest 2012: 122(8): 2731-2740; Yuan Y, Alwis I, Wu MCL, Kaplan Z, Ashworth K, Bark D, Jr., Pham A, McFadyen J, Schoenwaelder SM, Josefsson EC, Kile BT, Jackson SP. Neutrophil macroaggregates promote widespread pulmonary thrombosis after gut ischemia. Sci Transl Med 2017: 9(409)).

중성구의 조절되지 않는 모집(recruitment) 및 활성화는 사이토카인과 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 포함하는 염증 매개체의 방출을 통해 조직 손상을 유도할 수 있다(Grommes J, Soehnlein O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol Med 2011: 17(3-4): 293-307; Matute-Bello G, Downey G, Moore BB, Groshong SD, Matthay MA, Slutsky AS, Kuebler WM, Acute Lung Injury in Animals Study G. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am J Respir Cell Mol Biol 2011: 44(5): 725-738). 그러나, 폐 마이크로순환에서 중성구 자체의 구체적인 동적 요소에 대한 종래 연구 결과는 대부분은 전신 순환을 관찰하여 얻은 추측에 제한된다(Phillipson M, Kubes P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med 2011: 17(11): 1381-1390). 중성구의 직경은 폐 모세혈관의 직경보다 크기 때문에, 중성구는 모세혈관을 통과하기 위해 변형되어야 하며, 이는 상대적으로 오랜 시간이 걸리는 과정이다(Doerschuk CM. Mechanisms of leukocyte sequestration in inflamed lungs. Microcirculation 2001: 8(2): 71-88). 중성구 격리(neutrophil sequestration)이라 불리는 이 과정은 원래 폐 내에서 자유롭게 순환하는 중성구 그룹보다는 세포에 대한 것으로 설명되었으며, 어느 정도 육안으로 볼 수 있는 방사선 모델링 영상 장치를 사용하여 관찰된 바 있다(MacNee W, Selby C. New perspectives on basic mechanisms in lung disease. 2. Neutrophil traffic in the lungs: role of haemodynamics, cell adhesion, and deformability. Thorax 1993: 48(1): 79-88). 실제로, 이전의 연구는 폐 모세혈관에서 중성구 격리를 입증하였지만, 중성구 격리가 급성 폐 손상, 또는 급성 호흡 곤란 증후군으로 이어지는 과정에 대한 메커니즘은 알려진 바 없다(Kuebler WM, Borges J, Sckell A, Kuhnle GE, Bergh K, Messmer K, Goetz AE. Role of L-selectin in leukocyte sequestration in lung capillaries in a rabbit model of endotoxemia. Am J Respir Crit Care Med 2000: 161(1): 36-43; Lien DC, Henson PM, Capen RL, Henson JE, Hanson WL, Wagner WW, Jr., Worthen GS. Neutrophil kinetics in the pulmonary microcirculation during acute inflammation. Lab Invest 1991: 65(2): 145-159).

이에, 본 발명자들은 폐 손상 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 연구하기 위해, 폐 미세순환 장애를 가진 모델의 중성구를 맞춤 설계된 비디오-속력 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 관찰하고, 상기 중성구에서 폐 미세순환 장애를 개선하기 위한 타겟을 탐색하여, 본 발명을 완성하였다.

일 측면에서, 본 발명의 목적은, 폐 모세혈관 내의 중성구(neutrophil)에서의 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 발현 또는 활성을 억제함으로써 적혈구가 폐 모세혈관을 원활하게 통과할 수 있게 하여 폐 미세순환 장애 개체에서 가스 교환을 증가시켜 폐의 미세순환 장애를 개선할 수 있는, 폐 손상 질환 예방 또는 치료용 조성물 및 폐 손상 질환 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 폐 미세순환 장애 여부 진단에 유용한 폐 미세순환 장애 여부 진단 정보를 제공하는 방법, 폐 미세순환 장애 여부 진단용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.

일 측면에서, 본 발명은, 폐 모세혈관 내의 중성구(neutrophil)에서의 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 발현 또는 활성 억제제를 포함하고, 폐의 미세순환 장애 개선 조성물인, 폐 손상 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은, (a) 폐 손상 모델을 준비하는 단계; (b) 상기 폐 손상 모델에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 시험물질이 상기 폐 손상 모델의 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 발현 또는 활성을 억제하는지 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 폐 손상 질환 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은, 시험대상의 폐 모세혈관으로부터 분리된 중성구(neutrophil)에서 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 발현 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 폐 미세순환 장애 여부 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은, 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 mRNA 또는 단백질 검출 시약을 포함하는 폐 미세순환 장애 여부 진단용 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은, 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 mRNA 또는 단백질 검출 시약을 포함하는 폐 미세순환 장애 여부 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에 일 실시예에 따른 조성물은, 폐 모세혈관 내의 중성구(neutrophil)에서의 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 발현 또는 활성을 억제함으로써 적혈구가 폐 모세혈관을 원활하게 통과할 수 있게 하여 폐 미세순환 장애 개체에서 가스 교환을 증가시켜 폐의 미세순환 장애를 개선할 수 있는바, 폐 손상 질환을 예방 또는 치료용 조성물로서 우수한 효과가 있다. 또한, 폐 모세혈관으로부터 분리된 중성구에서 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성을 측정함으로써 폐 미세순환 장애 여부를 보다 빠르고 간편하며 정확하게 진단할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 급성 폐 손상 마우스 모델(ALI 마우스 모델)을 이용하여 중성구가 고갈된 폐 손상 마우스 모델(N-Dep+LPS 마우스 모델)을 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 대조군 마우스 모델(PBS), ALI 마우스 모델(LPS), 상기 실시예 2의 중성구 제거 모델(N-Dep 마우스 모델 및 N-Dep+LPS 마우스 모델) 각각의 폐 미세순환을 본 발명의 일 실시예에 따른 이미징 시스템에 의해 촬영하고 이로부터 수득한 이미지를 이미지 처리 과정에 따라 처리된 결과를 나타낸 도이다. 도 2에서 초록색(Capillary, TMR Dextran)은 해부학적 모세혈관을, 붉은색(Functional, DiD-RBC)은 기능적 모세혈관(Functional capillary)을, 심홍색(magenta)(LysM, LysM^GFP/+)은 중성구를 나타내고, 흰색 별표(*)는 사강(dead space)을, 흰색 화살촉은 갇힌 또는 격리된 중성구를 나타낸다. 도 2에서 Merge는 해부학적 모세혈관, 기능적 모세혈관 및 중성구 이미징을 모두 합한 것이고, 확대(Magnified) 이미지는 해부학적 모세혈관 및 중성구 이미징을 모두 합한 것이며, 도 2의 확대(Magnified) 이미지에서의 스케일 바는 20 μm, 나머지 이미지에서의 스케일 바는 100 μm 이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 대조군 마우스 모델(PBS), ALI 마우스 모델(LPS), 상기 실시예 2의 중성구 제거 모델(N-Dep 마우스 모델 및 N-Dep+LPS 마우스 모델) 각각의 기능적 모세혈관 분율(Functional capillary ratio, FCR)을 나타낸 그래프이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 대조군 마우스 모델(PBS), ALI 마우스 모델(LPS), 상기 실시예 2의 중성구 제거 모델(N-Dep 마우스 모델 및 N-Dep+LPS 마우스 모델) 각각의 단위면적(512 X 512 μm)당 중성구의 수를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 마우스 모델의 좌심실(left ventricle, LV)과 폐(lung) 각각으로부터 중성구를 분리하는 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 마우스 모델의 좌심실(left ventricle, LV, 붉은색)과 폐(Lung, 파란색) 각각으로부터 분리된 중성구에 대하여 유세포 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 6a 내지 6d는 본 발명의 일 실시예에 따른 대조군(PBS) 마우스 모델 및 ALI 마우스 모델(LPS) 각각의 좌심실(left ventricle, LV)과 폐(lung) 각각으로부터 분리된 중성구에서 CD11a, CD11b, CD18 및 CD62L 각각의 발현량을 비교한 그래프이다. 도 6a 내지 6d에서 MFI는 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity)를 나타낸다.
도 7a 및 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 대조군(PBS) 마우스 모델 및 ALI 마우스 모델(LPS) 각각의 격리된 중성구, 및 상기 중성구에서 CD11b 및 CD18 각각의 세포 표면에서의 발현을 in vivo 상에서 시각화한 결과를 나타낸 도이다. 도 7a 및 도 7b에서 붉은색(Ly6G+)은 중성구를, 초록색(CD11b 또는 CD18)은 중성구에서 CD11b 및 CD18 각각의 세포 표면에서의 발현을 나타내며, Merge는 중성구와 CD11b의 발현, 또는 중성구와 CD18의 발현을 각각 합한 도이다. 도 7a 및 7b의 스케일 바는 100 μm 이다.
도 8a 내지 8d는 본 발명의 일 실시예에 따른 ALI 마우스 모델(LPS)과 대조군 마우스 모델(PBS) 간의 CD11b 또는 CD18을 발현하는 중성구의 수를 비교한 그래프이다. 도 8a는 단위면적(512 X 512 μm)당 CD11b를 발현하는 중성구의 수를, 도 8b는 전체 중성구의 수에 대한 CD11b를 발현하는 중성구의 수의 비율을, 도 8c는 단위면적(512 X 512 μm)당 CD18을 발현하는 중성구의 수를, 도 8d는 전체 중성구의 수에 대한 CD18을 발현하는 중성구의 수의 비율을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 CLP 마우스 모델(Fc), 항-Mac-1 마우스 모델(Anti-CD11b) 및 압식시맙 마우스 모델 모델(Abc), 및 정상군(Sham) 마우스 모델(Sham)의 폐 미세순환을 본 발명의 일 실시예에 따른 이미징 시스템에 의해 촬영하고 이로부터 수득한 이미지를 이미지 처리 과정에 따라 처리된 결과를 나타낸 도이다. 도 9에서 초록색(Capillary, TMR Dextran)은 해부학적 모세혈관을, 붉은색(Functional, DiD-RBC)은 기능적 모세혈관(Functional capillary)을, 심홍색(magenta)(Ly6G)은 중성구를 나타내고, 흰색 별표(*)는 사강(dead space)을 나타낸다. 도 9에서 Merge는 해부학적 모세혈관, 기능적 모세혈관 및 중성구 이미징을 모두 합한 것이고, 스케일 바는 100 μm 이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 CLP 마우스 모델(Fc), 항-Mac-1 마우스 모델(Anti-CD11b) 및 압식시맙 마우스 모델 모델(Abc), 및 정상군(Sham) 마우스 모델(Sham)의 기능적 모세혈관 분율(FCR)을 비교한 그래프이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 CLP 마우스 모델(Fc), 항-Mac-1 마우스 모델(Anti-CD11b) 및 압식시맙 마우스 모델 모델(Abc), 및 정상군(Sham) 마우스 모델(Sham)의 본 발명의 일 실시예에 따라 중성구(Ly6G+ 세포)의 수를 비교한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 압식시맙 투여 전 CLP 마우스 모델(pre-Abc) 및 압식시맙 투여 후 CLP 마우스 모델(post-Abc)의 폐 미세순환을 본 발명의 일 실시예에 따른 이미징 시스템에 의해 촬영하고 이로부터 수득한 이미지를 이미지 처리 과정에 따라 처리된 결과를 나타낸 도이다. 도 11에서 초록색(Capillary, FITC Dextran)은 해부학적 모세혈관을, 붉은색(Functional, DiD-RBC)은 기능적 모세혈관(Functional capillary)을, 심홍색(magenta)(LysM, LysM^GFP/+)은 중성구를 나타내고, 흰색 화살촉은 적혈구 관류의 회복을 나타낸다. 도 11에서 Merge는 해부학적 모세혈관, 기능적 모세혈관 및 중성구 이미징을 모두 합한 것이고, 스케일 바는 100 μm 이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 압식시맙 투여 전 CLP 마우스 모델(pre-Abc) 및 압식시맙 투여 후 CLP 마우스 모델(post-Abc)의 기능적 모세혈관 분율(FCR)을 비교한 그래프이다.
도 13a 및 도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따른 정상군 마우스 모델(Sham), 압식시맙 투여 전 CLP 마우스 모델(Fc) 및 압식시맙 투여 후 CLP 마우스 모델(Abc)의 동맥혈에서의 산소 분압 및 이산화탄소 분압을 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

일 측면에서, 본 발명은 폐 손상 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물로서, 상기 조성물은 유효성분으로서 폐 모세혈관 내의 중성구(neutrophil)에서의 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는, 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 유효성분으로서 폐 모세혈관 내의 중성구(neutrophil)에서의 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 폐의 미세순환 장애 개선용 조성물을 제공한다.

본 명세서의 일 측면에 있어서, 미세순환(microcirculation)은 모세동맥, 모세정맥, 모세혈관, 모세림프관 등의 소혈관에서 볼 수 있는 혈액순환으로서 미소순환 또는 모세순환이라고도 하며, 조직 가운데서 물질 대사의 중심이 되는 곳이고 필요한 물질의 공급과 배출이 행해진다. 본 발명의 일 측면에 있어서 미세순환은 폐 내 미세순환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 예방 또는 치료 대상이 되는 개체는 폐 손상 질환 예방 또는 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체이든 적용 가능하다. 구체적으로 상기 개체는 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물 또는 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 개체는 미세순환 장애, 미소순환 장애, 모세순환 장애 또는 말초순환 장애를 갖는 개체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 중성구(neutrophil)는 주로 골수에서 만들어지는 과립백혈구(과립구)의 일종으로 단핵구와 같은 계열의 세포로서, 사람의 혈액에서는 백혈구의 50~70%, 과립구의 약 90%를 차지하며, 호중구, 중성호성백혈구, 호중성 백혈구라고도 한다. 상기 중성구는 조직이 손상되거나 미생물에 감염되면 손상 또는 감염 부위에 최초로 도달하는 백혈구로, 손상 또는 감염 부위에서는 인터류킨8(IL8) 등의 여러 가지 주화성인자가 만들어지고, 그로 인해 중성구가 유인되어 상기 중성구가 강한 급성염증 반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 상기 중성구의 기능 중 가장 현저한 것은 세균의 포식과 살균이다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 중성구는 폐 모세혈관 내의 중성구일 수 있다.

상기 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)은 인테그린 패밀리에 속하는 접착분자로, 중성구, 단구, 대식세포, 활성화 림프구의 일부 등에서 발현하는 당단백질이며, CD11b(αM 사슬, 분자량 약 170,000 Da)과 CD18(β2 사슬, 분자량 약 95,000 Da)이 비공유결합한 헤테로이합체로 CD11b/CD18로 불리기도 한다. 상기 마크로파지-1 항원은 세포 내의 분비과립에도 저장되며 활성화에 따라 급속히 세포 표면에서 발현되기도 한다. 상기 αM사슬에는 2가 금속이온 결합부위가 3군데 존재하고, 이 분자의 접착은 2가 금속이온 의존적이며, 배위자는 ICAM-1, iC3b, 피브리노겐, 혈액응고 X인자, LPS(지질다당) 등이다. 상기 분자를 매개로 한 접착은, 백혈구의 혈관내피세포에 대한 접착 및 조직으로의 침윤, 식작용 등에 관여하고 있으며, 상기 분자는 세포질부분에서 세포골격이나 단백질인산화효소 등과 회합하고, 백혈구의 호흡 폭발(respiratory burst, oxidative burst) 등에서 신호전달에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 중성구 제거는 폐 미세순환 장애를 개선하지만, 박테리아 사멸(bacterial clearance) 효과 및 전신 염증 반응의 개선이 불명확하기 때문에 패혈증에 있어서 치료로 인해 유도된 중성구 제거의 효과는 불분명하다. 이에, 본 발명자들은 폐 손상을 완화할 수 있는 중성구의 하위집단(subpopulation)을 탐색 및 평가하였으며, 유세포 분석 결과 내피 세포 및 다양한 응고 인자에서 ICAM-1과 반응하는 Mac-1 (CD11b/CD18)이 폐 손상 모델의 폐의 격리된 중성구에서 발현량이 증가함을 확인하였다.

본 명세서에서 "유전자의 발현"이라 함은 전사, 번역 및 번역 후 변형 등을 포함하는 최광의의 개념이다.

본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 유효성분으로서 폐 모세혈관 내의 중성구에서의 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성 억제제를 포함할 수 있다.

상기 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성 억제제는 마크로파지-1 항원을 코딩하는 mRNA의 번역을 억제하는 물질일 수 있으며, 구체적으로 마크로파지-1 항원을 코딩하는 mRNA의 적어도 일부에 결합하는 올리고뉴클레오티드일 수 있고, siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성 억제제는 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 현상을 유도하는 siRNA, shRNA 및 miRNA 중 어느 하나 이상일 수 있으며, 마크로파지-1 항원을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현을 억제하기 위해 상기 마크로파지-1 항원을 코딩하는 mRNA의 간섭을 유도하는 RNAi현상을 이용하여 폐 손상 예방 또는 치료 효과를 가져올 수 있다. miRNA는 세포 내에 존재하는 작은 RNA(endogenous small RNA)의 일종으로 단백질을 합성하지 않는 DNA에서 유래되어 헤어핀-구조 전사체(hairpin-shaped transcript)로부터 생성이 된다. miRNA는 표적 mRNA의 3'-UTR의 상보적 서열(sequence)에 결합하여 그 mRNA의 번역 억제 또는 불안정화를 유도하여, 궁극적으로 그 표적 mRNA의 단백질 합성을 억제하는 리프레서(repressor) 역할을 하게 된다. 하나의 miRNA는 여러 개의 mRNA를 타겟팅하며, mRNA 역시 여러 개의 miRNA에 의해 조절될 수 있다고 알려져 있다. RNAi 현상을 유도하는 다른 RNA로 19 내지 27 mer 내외의 짧은 RNA인 short interfering RNA(siRNA)가 있으며, 짧은 헤어핀(short hairpin) 구조를 가지는 shRNA가 있다.

상기 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성 억제제는 중성구에서의 마크로파지-1 항원에 특이적으로 결합하는 펩티드(peptide)를 포함할 수 있고, 구체적으로 중성구에서의 마크로파지-1 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 구체적으로 CD11b 또는 CD18에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있고, 보다 구체적으로 하기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 CD11b에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 하기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 펩티드에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 BC bioscience 사의 BD Pharmingen^TM(Catalog Number: BD 553307)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[서열번호 1] CD11b의 아미노산 서열 (Integrin alpha-M isoform 1 precursor)

1 malrvlllta ltlchgfnld tenamtfqen argfgqsvvq lqgsrvvvga pqeivaanqr

61 gslyqcdyst gscepirlqv pveavnmslg lslaattspp qllacgptvh qtcsentyvk

121 glcflfgsnl rqqpqkfpea lrgcpqedsd iaflidgsgs iiphdfrrmk efvstvmeql

181 kksktlfslm qyseefrihf tfkefqnnpn prslvkpitq llgrthtatg irkvvrelfn

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1141 mmseggppga epq

[서열번호 2] CD11b의 아미노산 서열 (Integrin alpha-M isoform 2 precursor)

1 malrvlllta ltlchgfnld tenamtfqen argfgqsvvq lqgsrvvvga pqeivaanqr

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181 kksktlfslm qyseefrihf tfkefqnnpn prslvkpitq llgrthtatg irkvvrelfn

241 itngarknaf kilvvitdge kfgdplgyed vipeadregv iryvigvgda frseksrqel

301 ntiaskpprd hvfqvnnfea lktiqnqlre kifaiegtqt gssssfehem sqegfsaait

361 sngpllstvg sydwaggvfl ytskekstfi nmtrvdsdmn daylgyaaai ilrnrvqslv

421 lgapryqhig lvamfrqntg mwesnanvkg tqigayfgas lcsvdvdsng stdlvligap

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1141 mseggppgae pq

또는, 상기 항체는 구체적으로 압식시맙(Abciximab)일 수 있고, 상기 압식시맙은 ISU abxis 사의 압식시맙(Clotinab)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성 억제제는 상기 조성물의 총 부피를 기준으로 0.2 내지 20 mg/mL 포함될 수 있고, 구체적으로 0.2 mg/mL 이상, 0.3 mg/mL 이상, 0.4 mg/mL 이상, 0.5 mg/mL 이상, 0.6 mg/mL 이상, 0.7 mg/mL 이상, 0.8 mg/mL 이상, 0.9 mg/mL 이상, 1 mg/mL 이상, 1.1 mg/mL 이상, 1.2 mg/mL 이상, 1.3 mg/mL 이상, 1.4 mg/mL 이상, 1.5 mg/mL 이상, 1.6 mg/mL 이상, 1.7 mg/mL 이상, 1.8 mg/mL 이상, 1.9 mg/mL 이상, 2 mg/mL 이상, 3 mg/mL 이상, 4 mg/mL 이상, 5 mg/mL 이상, 6 mg/mL 이상, 7 mg/mL 이상, 8 mg/mL 이상, 9 mg/mL 이상, 10 mg/mL 이상, 15 mg/mL 이상 또는 20 mg/mL 이상 포함될 수 있고, 20 mg/mL 이하, 15 mg/mL 이하, 10 mg/mL 이하, 9 mg/mL 이하, 8 mg/mL 이하, 7 mg/mL 이하, 6 mg/mL 이하, 5 mg/mL 이하, 4 mg/mL 이하, 3.9 mg/mL 이하, 3.8 mg/mL 이하, 3.7 mg/mL 이하, 3.6 mg/mL 이하, 3.5 mg/mL 이하, 3.4 mg/mL 이하, 3.3 mg/mL 이하, 3.2 mg/mL 이하, 3.1 mg/mL 이하, 3 mg/mL 이하, 2.9 mg/mL 이하, 2.8 mg/mL 이하, 2.7 mg/mL 이하, 2.6 mg/mL 이하, 2.5 mg/mL 이하, 2.4 mg/mL 이하, 2.3 mg/mL 이하, 2.2 mg/mL 이하, 2.1 mg/mL 이하, 2 mg/mL 이하, 1.5 mg/mL 이하, 1 mg/mL 이하, 0.5 mg/mL 이하 또는 0.2 mg/mL 이하 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 미세순환 장애는 미세순환이 정상이 아닌 경우를 말하며, 백혈구, 적혈구, 혈소판, 림프구 등이 모세혈관을 원활하게 통과하지 못하여 미세순환이 정상적으로 이루어지지 않는 것을 의미한다. 구체적으로 상기 미세순환 장애는 하기 식 1에 따른 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR)이 미세순환 장애가 없는 정상군의 기능적 모세혈관 분율의 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하인 것일 수 있고, 또는 상기 미세순환 장애는 기능적 모세혈관 분율이 0.4 이하, 0.38 이하, 0.36 이하, 0.34 이하, 0.32 이하, 0.3 이하, 0.28 이하, 0.26 이하, 0.24 이하, 0.22 이하, 0.2 이하, 0.18 이하, 0.16 이하, 0.14 이하, 0.12 이하, 0.1 이하, 0.08 이하, 0.06 이하, 0.04 이하 또는 0.02 이하일 수 있으나, 상기 미세순환 장애 여부를 판단하기 위한 기능적 모세혈관 분율의 범위는 미세순환 장애 여부를 측정하는 모세혈관이 분포한 개체의 장기의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 상기 범위에 제한되는 것이 아니다.

[식 1]

기능적 모세혈관 분율 = 기능적 모세혈관의 면적 / 전체 모세혈관의 면적

상기 미세순환 장애 개선은 폐의 전체 모세혈관 중 적혈구가 통과하는 기능적 모세혈관의 비율을 증가시키는 것일 수 있고, 구체적으로 하기 식 1에 따른 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR)을 증가시키는 것일 수 있다.

[식 1]

상기 기능적 모세혈관(functional capillary)은 모세혈관 중 모세혈관의 기능, 예를 들어 확산에 의해 혈액과 조직 사이에서 산소, 이산화탄소, 영양분 및 기타 물질을 교환하는 기능이 원활히 일어나는 모세혈관을 의미한다. 상기 기능적 모세혈관은 백혈구, 적혈구, 혈소판, 림프구 등의 혈류 내 타겟 요소가 이동하는, 또는 통과하는 모세혈관일 수 있다. 전체 모세혈관 중 기능적 모세혈관이 많을수록 개체의 미세순환이 원활하거나 미세순환 장애가 없다는 것을 의미한다.

상기 기능적 모세혈관 면적 측정은 상기 혈류 내 타겟 요소가 이동하는 복수의 이동 이미지로부터 동일한 타겟 요소를 판별하여 기능적 모세혈관의 면적을 측정하는 것일 수 있고, 상기 혈류 내 타겟 요소의 시간 차에 따른 위치 차이로부터 이동 거리를 측정함으로써 계산되는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 복수의 이동 이미지 각각으로부터 개체의 모세혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 이동 경로를 측정하고, 복수의 혈류 내 타겟 요소의 이동 경로로부터 기능적 모세혈관의 면적을 측정하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 시간 차(t)를 갖고 촬영된 이미지를 바탕으로 복수의 이미지들을 상호간에 비교함으로써, 동일한 혈류 내 타겟 요소를 용이하게 판별 및 추적하여 단일 혈류 내 타겟 요소의 이동 경로를 측정하고, 이와 동일한 방법으로 수득한 복수의 혈류 내 타겟 요소의 이동 경로로부터 기능적 모세혈관의 면적을 측정할 수 있다.

상기 폐 손상 질환은 폐의 미세순환 장애에 의한 질환일 수 있고, 구체적으로 폐 혈관 수축, 천식, 호흡지체, 호흡 곤란 증후군(respiratory distress syndrome, RDS), 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis, CF), 알레르기성 비염(allergic rhinitis, AR), 폐 고혈압증, 기종, 만성 폐색성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 폐이식 거부증, 폐 감염, 기관지염 및 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 질환일 수 있으나, 폐의 미세순환 장애에 의해 발병하는 질환이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 측면에 따른 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성 억제제는 정상 대조군, 또는 상기 억제제 투여 전 비교군에 비하여 개체의 폐 모세혈관에서의 기능적 모세혈관 분율(FCR, %)을 증가시키는 것일 수 있고, 구체적으로 1.1 배 이상, 1.2 배 이상, 1.3 배 이상, 1.4 배 이상, 1.5 배 이상, 1.6 배 이상, 1.7 배 이상, 1.8 배 이상, 1.9 배 이상, 2 배 이상, 2.1 배 이상, 2.2 배 이상, 2.3 배 이상, 2.4 배 이상, 2.5 배 이상, 2.6 배 이상, 2.7 배 이상, 2.8 배 이상, 2.9 배 이상 또는 3 배 이상 증가시키는 것일 수 있으나, 상기 개체의 폐 미세순환 장애가 개선될 정도의 기능적 모세혈관 분율의 증가 정도라면 상기 범위에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 폐 미세순환 장애를 가진 CLP 마우스 모델(CLP 마우스 모델 또는 pre-Abc 마우스 모델)은 정상군(Sham)에 비하여 FCR이 50% 이상 감소하였다가 Mac-1 발현 또는 활성을 억제 시(항-Mac-1 마우스 모델, 압식시맙 마우스 모델 또는 post-Abc 마우스 모델) 다시 FCR이 약 2 배 이상 증가하여 폐 미세순환 장애가 개선되는바, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 폐 손상 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있음을 알 수 있었다(실험예 4-2 및 도 10a, 및 실험예 4-3 및 도 12).

본 발명의 일 측면에 따른 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성 억제제는 정상 대조군, 또는 상기 억제제 투여 전 비교군에 비하여 개체의 폐 모세혈관에서의 단위면적(512 X 512 μm)당 격리된 중성구의 수를 감소시키는 것일 수 있고, 구체적으로 정상 대조군, 또는 상기 억제제 투여 전 비교군의 폐 모세혈관에서의 단위면적(512 X 512 μm)당 격리된 중성구의 수를 기준으로 그 감소 정도가 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상 또는 55% 이상일 수 있으나, 상기 개체의 폐 미세순환 장애가 개선될 정도의 폐 모세혈관에서의 단위면적(512 X 512 μm)당 격리된 중성구의 수의 감소 정도라면 상기 범위에 제한되지 않는다.

상기와 같은 측면에서, 상기 조성물은, 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 상기 조성물을 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구 투여제로 제제화할 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 제재로서는 정제, 환제, 과립제, 연, 경 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제, 시럽제, 펠렛제 등을 들 수 있다. 본 발명의 유효성분을 제제화하기 위해서는 상법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 폐 손상 질환, 구체적으로 폐 미세순환 장애로 인한 폐 손상 질환, 보다 구체적으로 폐 미세순환 장애로 인해 폐 모세혈관 내에서 격리된 중성구의 수가 증가하거나, 사강(dead space)이 증가하거나,또는 모세혈관을 통과하는 적혈구의 수가 감소된 개체의 폐 손상 질환을 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다. 상기 폐 손상 질환으로는 폐 혈관 수축, 천식, 호흡지체, 호흡 곤란 증후군(respiratory distress syndrome, RDS), 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis, CF), 알레르기성 비염(allergic rhintis, AR), 폐 고혈압증, 기종, 만성 폐색성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 폐이식 거부증, 폐 감염, 기관지염, 암 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물은 경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다.

또한, 상기 조성물 또는 조성물 내의 유효성분의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 상기 투여량은 0.001 mg/kg/일 내지 2000 mg/kg/일, 구체적으로는 0.5 mg/kg/일 내지 1500 mg/kg/일 일 수 있고, 보다 구체적으로 0.001 mg/kg/일 이상, 0.01 mg/kg/일 이상, 0.1 mg/kg/일 이상, 0.5 mg/kg/일 이상, 1 mg/kg/일 이상, 10 mg/kg/일 이상, 50 mg/kg/일 이상, 100 mg/kg/일 이상, 150 mg/kg/일 이상, 200 mg/kg/일 이상, 250 mg/kg/일 이상, 300 mg/kg/일 이상, 350 mg/kg/일 이상, 400 mg/kg/일 이상, 450 mg/kg/일 이상, 500 mg/kg/일 이상, 550 mg/kg/일 이상, 600 mg/kg/일 이상, 650 mg/kg/일 이상, 700 mg/kg/일 이상, 750 mg/kg/일 이상, 800 mg/kg/일 이상, 850 mg/kg/일 이상, 900 mg/kg/일 이상, 950 mg/kg/일 이상, 1000 mg/kg/일 이상, 1050 mg/kg/일 이상, 1100 mg/kg/일 이상, 1150 mg/kg/일 이상, 1200 mg/kg/일 이상, 1250 mg/kg/일 이상, 1300 mg/kg/일 이상, 1350 mg/kg/일 이상, 1400 mg/kg/일 이상, 1450 mg/kg/일 이상, 1500 mg/kg/일 이상, 1550 mg/kg/일 이상, 1600 mg/kg/일 이상, 1650 mg/kg/일 이상, 1700 mg/kg/일 이상, 1750 mg/kg/일 이상, 1800 mg/kg/일 이상, 1850 mg/kg/일 이상, 1900 mg/kg/일 이상 또는 1950 mg/kg/일 이상일 수 있고, 2000 mg/kg/일 이하, 1950 mg/kg/일 이하, 1900 mg/kg/일 이하, 1850 mg/kg/일 이하, 1800 mg/kg/일 이하, 1750 mg/kg/일 이하, 1700 mg/kg/일 이하, 1650 mg/kg/일 이하, 1600 mg/kg/일 이하, 1550 mg/kg/일 이하, 1500 mg/kg/일 이하, 1450 mg/kg/일 이하, 1400 mg/kg/일 이하, 1350 mg/kg/일 이하, 1300 mg/kg/일 이하, 1250 mg/kg/일 이하, 1200 mg/kg/일 이하, 1150 mg/kg/일 이하, 1100 mg/kg/일 이하, 1050 mg/kg/일 이하, 1000 mg/kg/일 이하, 950 mg/kg/일 이하, 900 mg/kg/일 이하, 850 mg/kg/일 이하, 800 mg/kg/일 이하, 750 mg/kg/일 이하, 700 mg/kg/일 이하, 650 mg/kg/일 이하, 600 mg/kg/일 이하, 550 mg/kg/일 이하, 500 mg/kg/일 이하, 450 mg/kg/일 이하, 400 mg/kg/일 이하, 350 mg/kg/일 이하, 300 mg/kg/일 이하, 250 mg/kg/일 이하, 200 mg/kg/일 이하, 150 mg/kg/일 이하, 100 mg/kg/일 이하, 50 mg/kg/일 이하, 10 mg/kg/일 이하, 1 mg/kg/일 이하, 0.5 mg/kg/일 이하, 0.1 mg/kg/일 이하 또는 0.01 mg/kg/일 이하일 수 있다.

상기 식품 조성물은 건강 식품 조성물일 수 있으며, 본 발명의 마크로파지-1 항원 발현 또는 활성 억제제를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 녹차 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 0.04 중량%, 구체적으로 0.02 내지 0.03 중량%일 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 0.1 중량%일 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) 폐 손상 모델을 준비하는 단계; (b) 상기 폐 손상 모델에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 시험물질이 상기 폐 손상 모델의 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 발현 또는 활성에 미치는 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 폐 손상 질환 예방, 개선 또는 치료물질 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 미세순환, 미세순환 장애, 중성구, 마크로파지-1 항원, 폐 손상 질환에 대한 설명은 상술한 바와 같다.

상기 폐 손상 모델은 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물일 수 있으며, 구체적으로 패혈증(sepsis)으로 인해 폐가 손상된 비인간동물일 수 있으며, 보다 구체적으로 LPS 투여로 패혈증을 유발시킨 비인간동물 또는 맹장에 천자(puncture)를 만들고 이를 결찰(ligation)시킨 비인간동물인 CLP(맹장 결찰 및 천자, cecal ligation and puncture) 모델일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예로, "상대적 발현량"은 시험물질을 처리하기 전의 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성에 대한 시험물질을 처리한 후 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성을 비교하였을 때 발현 또는 활성이 억제된 정도일 수 있다. 또는, "상대적 발현량"은 시험 물질을 처리한 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성을 시험 물질을 처리하지 않은 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성과 비교하였을 때의 발현이 억제된 정도일 수 있다. 상기 상대적 발현량은 예컨대, mRNA의 상대적 발현량 또는 단백질의 상대적 발현량을 포함할 수 있다.

상기 (c) 단계는 폐 손상 모델에 시험물질을 처리하기 전과 후의 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성을 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 또는, 상기 (c) 단계는 시험물질을 처리한 폐 손상 모델과 시험물질을 처리하지 않은 폐 손상 모델의 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성을 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 상기 스크리닝 방법은 상기 (c) 단계의 발현 또는 활성을 측정한 결과 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성이 시험물질을 처리하기 전에 비하여 감소한 경우, 상기 시험물질을 폐 손상 질환 예방, 개선 또는 치료물질로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 폐 손상 질환 예방, 개선 또는 치료물질로 판정하는 단계는 상기 (c) 단계의 발현 또는 활성을 측정한 결과 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성(상대적 발현량)이 약 10% 이상 감소한 경우, 폐 손상 질환 예방, 개선 또는 치료물질로 판정하는 것을 포함할 수 있다. 즉, 시험물질을 처리하기 전의 폐 손상 모델의 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성 정도에 대한 시험물질을 처리한 후 폐 손상 모델의 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성 정도를 비교하였을 때 발현 또는 활성이 약 10% 이상 감소한 경우, 폐 손상 질환 예방, 개선 또는 치료물질로 판정할 수 있다. 또는, 시험 물질을 처리한 폐 손상 모델의 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성 정도를 시험 물질을 처리하지 않은 폐 손상 모델의 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성 정도와 비교하였을 때의 발현이 약 10% 이상 증가한 경우, 폐 손상 질환 예방, 개선 또는 치료물질로 판정할 수 있다. 예를 들어, 상기 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성(상대적 발현량)이 시험물질 처리 전에 비하여 10% 이상, 11% 이상, 12% 이상, 13% 이상, 14% 이상, 15% 이상, 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 20% 이상, 21% 이상, 22% 이상, 23% 이상, 24% 이상, 25% 이상, 26% 이상, 27% 이상, 28% 이상, 29% 이상, 30% 이상, 31% 이상, 32% 이상, 33% 이상, 34% 이상, 35% 이상, 36% 이상, 37% 이상, 38% 이상, 39% 이상, 40% 이상, 41% 이상, 42% 이상, 43% 이상, 44% 이상, 45% 이상, 46% 이상, 47% 이상, 48% 이상, 49% 이상, 50% 이상, 51% 이상, 52% 이상, 53% 이상, 54% 이상, 55% 이상, 56% 이상, 57% 이상, 58% 이상, 59% 이상, 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상 또는 90% 이상 감소한 경우, 폐 손상 질환 예방, 개선 또는 치료물질로 판정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 발현 또는 활성 정도는 통계적 유의성을 확보한 상태에서 측정된 결과이다. 통계적 유의성이라는 개념은 생물학적 통계분석법을 통하여 유의적인 차이를 보이는 경우로, 정량적인 경우 p value가 0.05 미만으로 차이가 나는 경우를 포함한다.

또한, 일 실시예로서, 상기 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성 정도는, 공지의 기술, 예컨대, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 엘라이자(ELISA), 웨스턴블럿(Western Blot) 또는 이뮨 블럿(Immune Blot)을 이용하여 확인할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) 폐 손상 모델을 준비하는 단계; (b) 상기 폐 손상 모델에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 시험물질이 상기 폐 손상 모델의 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 발현 또는 활성에 미치는 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 폐의 미세순환 장애 개선 물질 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 폐 손상 모델, 미세순환, 미세순환 장애, 중성구, 마크로파지-1 항원, 상대적 발현량에 대한 설명은 상술한 바와 같다.

또한, 상기 스크리닝 방법은 상기 (c) 단계의 발현 또는 활성을 측정한 결과 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성이 시험물질을 처리하기 전에 비하여 감소한 경우, 상기 시험물질을 폐의 미세순환 장애 개선 물질로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 폐의 미세순환 장애 개선 물질로 판정하는 단계는 상기 (c) 단계의 발현 또는 활성을 측정한 결과 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성(상대적 발현량)이 약 10% 이상 감소한 경우, 폐의 미세순환 장애 개선 물질로 판정하는 것을 포함할 수 있다. 즉, 시험물질을 처리하기 전의 폐 손상 모델의 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성 정도에 대한 시험물질을 처리한 후 폐 손상 모델의 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성 정도를 비교하였을 때 발현 또는 활성이 약 10% 이상 감소한 경우, 폐의 미세순환 장애 개선 물질로 판정할 수 있다. 또는, 시험 물질을 처리한 폐 손상 모델의 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성 정도를 시험 물질을 처리하지 않은 폐 손상 모델의 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성 정도와 비교하였을 때의 발현이 약 10% 이상 감소한 경우, 폐의 미세순환 장애 개선 물질로 판정할 수 있다. 예를 들어, 상기 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성(상대적 발현량)이 시험물질 처리 전에 비하여 10% 이상, 11% 이상, 12% 이상, 13% 이상, 14% 이상, 15% 이상, 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 20% 이상, 21% 이상, 22% 이상, 23% 이상, 24% 이상, 25% 이상, 26% 이상, 27% 이상, 28% 이상, 29% 이상, 30% 이상, 31% 이상, 32% 이상, 33% 이상, 34% 이상, 35% 이상, 36% 이상, 37% 이상, 38% 이상, 39% 이상, 40% 이상, 41% 이상, 42% 이상, 43% 이상, 44% 이상, 45% 이상, 46% 이상, 47% 이상, 48% 이상, 49% 이상, 50% 이상, 51% 이상, 52% 이상, 53% 이상, 54% 이상, 55% 이상, 56% 이상, 57% 이상, 58% 이상, 59% 이상, 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상 또는 90% 이상 감소한 경우, 폐의 미세순환 장애 개선 물질로 판정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 발현 또는 활성 정도는 통계적 유의성을 확보한 상태에서 측정된 결과이다. 통계적 유의성이라는 개념은 생물학적 통계분석법을 통하여 유의적인 차이를 보이는 경우로, 정량적인 경우 p value가 0.05 미만으로 차이가 나는 경우를 포함한다.

본 발명의 일 실시예는 상기 폐 모세혈관 내의 중성구에서의 마크로파지-1 항원을 폐 미세순환 장애 여부를 진단할 수 있는 바이오마커로서 제공할 수 있으므로, 본 발명의 다른 일 실시예는 이를 이용하여 폐 미세순환 장애 진단용 조성물 또는 키트를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 일 실시예는 이를 이용한 폐 미세순환 장애 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공할 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 시험대상의 폐 모세혈관으로부터 분리된 중성구(neutrophil)에서 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 발현 또는 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 폐 미세순환 장애 여부 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공할 수 있다.

일 실시예로서, 상기 방법은 상기 시험대상의 폐 모세혈관으로부터 분리된 중성구에서의 마크로파지-1 항원 발현 또는 활성 정도를 정상 대조군의 폐 모세혈관으로부터 분리된 중성구에서의 마크로파지-1 항원 발현 또는 활성 정도와 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 일 실시예로서 상기 방법은 상기 시험대상의 폐 모세혈관으로부터 분리된 중성구에서의 마크로파지-1 항원 발현 또는 활성 정도가 정상 대조군의 폐 모세혈관으로부터 분리된 중성구에서의 마크로파지-1 항원 발현 또는 활성 정도보다 높은 경우 폐 미세순환 장애가 있는 것으로 정보를 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 시험대상의 폐 모세혈관으로부터 분리된 중성구에서의 마크로파지-1 항원 발현 또는 활성 정도가 정상 대조군의 폐 모세혈관으로부터 분리된 중성구에서의 마크로파지-1 항원 발현 또는 활성 정도보다 10% 이상, 11% 이상, 12% 이상, 13% 이상, 14% 이상, 15% 이상, 16% 이상, 17% 이상, 18% 이상, 19% 이상, 20% 이상, 21% 이상, 22% 이상, 23% 이상, 24% 이상, 25% 이상, 26% 이상, 27% 이상, 28% 이상, 29% 이상, 30% 이상, 31% 이상, 32% 이상, 33% 이상, 34% 이상, 35% 이상, 36% 이상, 37% 이상, 38% 이상, 39% 이상, 40% 이상, 41% 이상, 42% 이상, 43% 이상, 44% 이상, 45% 이상, 46% 이상, 47% 이상, 48% 이상, 49% 이상, 50% 이상, 51% 이상, 52% 이상, 53% 이상, 54% 이상, 55% 이상, 56% 이상, 57% 이상, 58% 이상, 59% 이상, 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상 또는 90% 이상 높은 경우, 폐 미세순환 장애가 있는 것으로 판단할 수 있다. 상기 발현 또는 활성 정도는 통계적 유의성을 확보한 상태에서 측정된 결과이다. 통계적 유의성이라는 개념은 생물학적 통계분석법을 통하여 유의적인 차이를 보이는 경우로, 정량적인 경우 p value가 0.05 미만으로 차이가 나는 경우를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 mRNA 또는 단백질 검출 시약을 포함하는 폐 미세순환 장애 여부 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 mRNA 또는 단백질 검출 시약을 포함하는 폐 미세순환 장애 여부 진단용 키트를 제공할 수 있으며, 상기 키트는 상술된 미세순환 장애 여부 진단을 위한 정보 제공 방법이 기재되어 있는 지시서를 더 포함할 수 있다.

일 실시예로서, 상기 폐 미세순환 장애 여부 진단용 조성물 또는 키트에 포함되는 마크로파지-1 항원의 mRNA 또는 단백질 검출 시약은 마크로파지-1 항원에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 프로브 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 실시예로서 상기 마크로파지-1 항원 단백질 검출 시약은 마크로파지-1 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 프로브 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 "프로브(probe)"란 유전자의 표적 부위와 상보적으로 결합할 수 있는 서열의 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 또는 폴리뉴클레오티드와 이에 결합된 표지 물질을 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "프라이머(primer)"란 유전자의 표적 부위에 해당하는 특정 영역을 PCR을 이용하여 증폭하기 위하여 사용하는 유전자 특정 영역의 말단에 상보적으로 결합할 수 있는 서열의 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그 변이체를 의미한다. 상기 프라이머는 특정 영역 말단과 완전히 상보적일 것을 요구하지 않으며, 상기 말단에 혼성화되어 이중사슬 구조를 형성할 정도로 상보적이라면 사용될 수 있다.

본 명세서에서 "혼성화(hybridization)"란 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다.

혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 뿐 아니라 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다.

본 명세서에서 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"란 복수개의 뉴클레오티드의 중합체를 의미하는 것으로, 통상적인 의미의 수십개의 뉴클레오티드의 중합체인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 광의의 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

한편, 하기 실시예 및 실험예에서의 모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 표준 지침에 따라 수행되었고, KAIST (프로토콜 No. KA2014-30 및 KA2016-55)의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인을 받았다.

또한, 하기 실험예에서의 모든 데이터는 각 군의 값을 각각 나타내기 위해 적절한 평균 ±SD 또는 중간값 ±사분범위(interquartile range)로 표시된다. 평균 또는 중간값 간의 통계적 차이는 unpaired 2-tailed Student's t-test, Mann-Whitney test, post hoc Holm-Sidak 의 다중 비교를 사용한 one-way ANOVA, 또는 post hoc Dunn의 다중 비교를 사용한 Kruskal-Wallis test에 의해 적절하게 결정되었다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정되었으며, Prism 6.0 (GraphPad)로 분석을 수행하였다.

[실시예 1] 패혈증으로 유발된 급성 폐 손상 마우스 모델 준비

폐 손상 질환 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 연구하기 위해, 패혈증으로 유발된 급성 폐 손상 마우스 모델을 하기와 같은 방법으로 준비하였다.

본 실시예에서 사용된 모든 마우스는 12시간 : 12시간(12:12h)의 명:암 주기(light:dark cycle) 하에서 환기가 되고 온도(22.5 ℃)와 습도(52.5%)가 조절된 우리에 개별적으로 수용되었고 표준 식단과 물을 임의로(ad libitum) 제공하였다. 생후 8 내지 20주 된 수컷 마우스 (20 ~ 30 g)을 실험군으로 하였다. LysM^GFP/+ 마우스는 미국 로체스터 대학(University of Rochester)의 김민수 교수로부터 제공받았다(이하, LysM^GFP/+ 마우스 모델이라 함).

상기 LysM^GFP/+ 마우스에 고용량의 LPS 를 투여한 마우스 모델 또는 CLP(맹장 결찰 및 천자, cecal ligation and puncture) 마우스 모델을 패혈증으로 유발된 급성 폐 손상(acute lung injury, ALI) 마우스 모델로 하여 하기 실험을 수행하였다.

상기 고용량의 LPS 투여 모델의 경우, 모세혈관 촬영 3 내지 6 시간 전, 상기 LysM^GFP/+ 마우스에 LPS (10 mg/kg, E.coli 혈청형 055:B5, L2880, Sigma-Aldrich)를 복막(peritoneum)에 복강 내 투여하였다(이하, ALI 마우스 모델이라 하며, ALI 마우스 모델 중 LPS 투여 3 시간 후의 마우스 모델은 LPS 3h 마우스 모델, LPS 투여 6 시간 후의 마우스 모델은 LPS 6h 마우스 모델이라 함). 대조군으로는 동량의 PBS를 복막에 주사한 마우스(이하, 대조군 또는 PBS 마우스 모델이라 함)를 준비하였다.

CLP 모델은 앞에서 설명한 방법에 따라 경험이 풍부한 단일 실험자가 수행하였다. 구체적으로, 상기 LysM^GFP/+ 마우스의 맹장(막창자, cecum)의 75%를 6-0 검은 실크(black silk)로 단단히 묵고, 21-게이지 바늘로 맹장 말단에 이중 구멍이 뚫린 단일 천자(puncture)를 만들었다. 그런 다음, 상기 맹장을 부드럽게 짜내어 대변을 밀어내기 위한 구멍(puncture)이 개방되어 있는지를 확인하였다. 상기 맹장은 복강으로 교체되었고, 복부 절개는 4-0 검은 실크로 봉합하였다. 정상군(Shame group)은 맹장 결찰 및 천자를 제외하고는 동일한 수술 과정을 거쳤다.

[실시예 2] 중성구 제거 모델(N-Dep 모델 및 N-Dep+LPS 모델) 준비

폐 미세순환 장애에 의한 폐 손상에 있어 중성구의 영향을 확인하기 위해, 중성구가 고갈된 마우스 모델(이하, 중성구 제거 모델)을 준비하였다. 구체적으로, 폐 생체 내 이미징 촬영 24 시간 전에 상기 실시예 1의 LysM^GFP/+ 마우스에 항-Ly6G+ 단일 클론 항체(monoclonal antibody)(Clone 1A8, 551459, BD Biosciences) 200 μg을 복강 내 주입함으로써 중성구가 고갈된 폐 손상이 없는 마우스 모델(이하, N-Dep 모델)을 준비하였다. 또한 마찬가지 방법으로 상기 실시예 1의 급성 폐 손상 마우스 모델에 상기 실시예 1의 과정으로 급성 폐 손상 마우스 모델을 제조하기 24 시간 전에, 항-Ly6G+ 단일 클론 항체(monoclonal antibody)(Clone 1A8, 551459, BD Biosciences) 200 μg을 복강 내 주입함으로써 중성구가 고갈된 폐 손상 마우스 모델(이하, N-Dep+LPS 모델)을 준비하였다.

[실시예 3] 중성구 표지화(labeling) 및 생체 내 폐 이미징

(1) 중성구 표지화(labeling)

In vivo 상에서 폐 내 격리된 중성구(sequestered neutrophil)의 분자적 발현을 시각화하기 위해, 이미징 2 시간 전에, 발광형광단(fluorophore)인 Alexa Fluor 555 (A-20005, ThermoFisher Scientific)가 결합된 25 μg의 CD11b (Clone M1/70, 553307, BD Biosciences) 및 25 μg의 CD18 (Clone GAME-46, 555280, BD Biosciences) 각각을 상기 실시예 1의 마우스 모델의 꼬리를 통해 주입하여 중성구를 라벨링(labeling)하였다.

또한, 상기 실시예 1의 마우스 모델의 적혈구(erythrocyte) 및 맥관 구조(vasculature)을 형광 염색하였다. 구체적으로, 적혈구는 심장 천자(cardiac puncture)를 통해 수득하고, 그런 다음으로 Vybrant DiD (V22887, ThermoFisher Scientific)으로 제품 정보 시트에 기재된 방법에 따라 라벨링하였다. 그런 다음 촬영 직전에 상기 실시예 1의 마우스 모델의 꼬리 정맥의 혈관 카테터를 통해 상기 5천만 카운트(count)의 DiD-라벨링된 적혈구를 주입하였다. 또한, 맥관 구조를 시각화하기 위해, 덱스트란 염료(extran dye)가 결합된 FITC (분자량 2M Da, Sigma-Aldrich) 또는 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine, TMR)을 상기 실시예 1의 마우스 모델에 상기와 동일한 혈관 카테터를 통해 주입하였다.

상기 마우스 모델에 발광형광단이 결합된 CD11b 및 CD18, DiD-라벨링된 적혈구, 덱스트란 염료가 결합된 FITC 또는 TMR를 주입하는 과정은 하기 생체 내 폐 이미징에 설명되었다.

(2) 생체 내 폐 이미징

다음과 같이 생체 내 폐 이미징을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1의 LysM^GFP/+ 마우스 모델, ALI 마우스 모델, PBS 마우스 모델 및 정상군(Shame group) 마우스 모델, 상기 실시예 2의 N-Dep 마우스 모델 및 N-Dep+LPS 마우스 모델, 상기 실시예 3의 Mac-1 억제 마우스 모델을 케타민(Ketamine)(80 mg/kg) 및 질라진(Xylazine)(12 mg/kg)으로 마취한 후, 라이트닝 가이드와이어(lightning guidewire)로 20 게이지 혈관 카테터를 사용하여 삽관을 하고 인공호흡기(MouseVent, Kent Scientific)에 연결하였다. 상기 호흡은 24~30 mmHg의 흡기압, 분당 120~130의 호흡수(respiratory rate), 및 2cmH₂O의 호기말 양압(positive-end expiratory pressure, PEEP)로 세팅되어 수행되었다. 마취 상태를 유지하기 위해 2% 이소플루란(isoflurane)을 투여(delivery)하였으며, 산소 공급과 생존 상태를 모니터하기 위해 맥박 산소 측정법(pulse oximetry)를 적용하였다. 항온 시스템(RightTemp, Kent Scientific)의 열침을 직장(rectum)으로 주입하고, 피드백-조절식 열 패트(feedback-regulated heating pad)를 사용하여 체온을 37.0℃로 유지하였다. 꼬리 정맥은 상기 (1)의 염료, 적혈구 및 중성구의 정맥 주입을 위해 PE-10 튜브에 부착된 30-게이지 바늘로 캐뉼러가 삽입되었다(cannulated). 그런 다음, 마우스 모델을 오른쪽으로 옆으로 누운 자세를 취하게 하고, 왼쪽 개흉술(thoracotomy)을 수행하였다. 늑골이 노출될 때까지 피부 및 근육을 절개하고, 3번째 늑골과 4번째 늑골 사이를 절개하여 흉막(pleura)을 노출시켰다. 개흉술 후, 하기 실험예의 이미징 윈도우를 흉막 표면에 적용하고, 폐 이미징 윈도우에 연결된 튜브를 통해 펌프(DOA-P704-AA, GAST) 및 조절기(NVC 2300a, EYELA)로 음의 흡기 압력(negative suction pressure)을 가하였다.

[실험예 1] 중성구 제거 모델에서의 폐 미세순환 촬영

폐 이미징 윈도우(pulmonary imaging window)를 통해 in vivo 상 폐 미세순환을 시각화하기 위해, 맞춤형 비디오-속력 레이저-스캐닝 공초점 현미경 시스템(custom-built video-rate laser-scanning confocal microscopy system)을 구현하였다.

이미징 시스템

구체적으로, 3 종의 연속 레이저 모듈 (488 nm (MLD488, 코볼트), 561 nm (Jive, 코볼트), 640 nm (MLD640, 코볼트)의 파장)을 다색 형광 이미징(imaging)을 위한 여기 경량 광원(excitation light source)으로 활용하였다. 레이저 빔은 다이크로닉 빔 분리장치(diachronic beam splitter)(DBS1; FF593-Di03, DSB2; FF520-Di02, Semrock)에 의해 동일 선상으로(collinearly) 통합되었으며, 다지점(multi-edge) 다이크로닉 빔 분리장치(DBS3; Di01-R405/488/561/635, Semrock)에 의해 레이저-빔 스캐너로 전송되었다. 상기 레이저 스캐닝부는 36 개의 측면(MC-5, 알루미늄 코팅, Lincoln Laser)이 있는 회전 다각형 거울을 사용한 X축 스캐닝과 검류계 스캐닝 거울(galvanometer scanning mirror)(6230H, Cambridge Technology)를 사용한 Y축 스캔 등 2개의 축으로 구성되었다. 상용화된 대물렌즈(LUCPLFLN, 20X, NA 0.45, Olympus, LUCPLFLN, 40X, NA 0.6, Olympus, LCPLFLN100XLCD, 100X, NA 0.85, Olympus)를 통해 상기 실시예 1의 대조군 마우스 모델(PBS), ALI 마우스 모델(LPS), 상기 실시예 2의 중성구 제거 모델(N-Dep 마우스 모델 및 N-Dep+LPS 마우스 모델) 각각의 폐로 2차원 래스터(raster) 스캐닝 레이저 빔을 옮겼다. 상기 대물렌즈에 의해 XYZ 변환 3D 단계(3DMS, Sutter Instrument)에서 상기 마우스 모델의 폐에서 방출된 형광 신호를 미리 감지하였다. 스캐닝되지 않은(de-scanned) 3색 형광 신호를 다이크로닉 빔 분리장치(DBS4; FF560-Di01, DBS5; FF649-Di01, Semrock)로 스펙트럼으로 분할한 다음, 대역필터(band pass filter)(BPF1; FF02-525/50, BPF2; FF01-600/37, BPF3; FF01-685/40, Semrock)를 통해 광전자 증배관(photomultiplier)(PMT; R9110, Hamamatsu)으로 검출하였다. 각각의 PMT의 전압 출력은 10 MHz의 샘플링 속력에서 8 비트 해상도(resolution)를 갖는 3-채널 프레임 그래버(frame grabber)(Solios, Matrox)에 의해 디지털화되었다. Matrox Imaging Library(MIL9, Matrox)와 Visual C#을 기반으로 한 맞춤형 영상 소프트웨어를 사용하여 30 Hz의 프레임률(frame rate)과 512 X 512 픽셀의 프레임 크기로 영상 속력의 영화가 실시간으로 표시되고 기록되었다.

이미지 처리

상기 이미징 시스템을 이용하여 촬영된 이미지는 프레임 당 512 X 512 픽셀의 초당 30 프레임의 획득 속력으로 표시되고 저장되었다. 실시간 이미지 프레임은 대조도(contrast) 및 신호-대-노이즈 비율(signal-to-noise ratio)을 개선하기 위해 MATLAB (Mathworks) 코드를 사용하여 평균 30 프레임 이상을 얻었다. 운동 인공물(motion artifact)를 최소화하기 위해, 평균화 전에 각 프레임을 이미지 등록 알고리즘(image registration algorithm)으로 처리하였다. 3차원 재구성을 이용한 이미지 렌더링(rendering), 중성구의 트랙 분석, 트랙 변위 표시는 IMARIS 8.2(Bitplane)로 실시하였다.

상기 실시예 1의 대조군 마우스 모델(PBS), ALI 마우스 모델(LPS), 상기 실시예 2의 중성구 제거 모델(N-Dep 마우스 모델 및 N-Dep+LPS 마우스 모델) 각각의 폐 미세순환을 상기 이미징 시스템에 의해 촬영하고 이로부터 수득한 이미지를 상기 이미지 처리 과정에 따라 처리된 결과는 도 2와 같다. 이 때, 상기 실시예 2의 중성구 제거 모델 중 N-Dep+LPS 마우스 모델은 LPS 주입 6 시간 후에 상기 방법에 의해 이미지 시스템에 의해 촬영한 것이다. 한편, 패혈증으로 유발된 급성 폐 손상 마우스 모델은 급성 폐 손상 초기에 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR; 전체 모세혈관 면적에 대한 기능적 모세혈관 면적으로 계산됨)이 감소하는데, 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군(PBS)과는 달리 ALI 마우스 모델(LPS)은 적혈구가 모세혈관을 통과하지 못하는 사강(dead space)이 형성되고, 격리된 중성구가 증가함을 확인하였다. 이에 반해, 중성구 제거 모델(N-Dep 마우스 모델 및 N-Dep+LPS 마우스 모델)은 적혈구가 모세혈관을 통과하여 미세순환이 원활하게 일어나는 기능적 모세혈관이 보다 증가하여 사강(dead space) 및 격리된 중성구가 감소하여 FCR이 증가하고 폐 미세순환 장애가 개선됨을 확인하였다.

[실험예 2] 중성구 제거 모델의 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR) 확인

기능적 모세혈관 분율(FCR) 비교

상기 실험예 1로부터 중성구 제거 모델에서 폐 미세순환 장애가 개선됨을 확인하였는바, 이를 정량화된 데이터로 확인하기 위해, 상기 실험예 1의 이미징 시스템 및 이미지 처리를 통해 수득한 모세혈관에서 이동하는 DiD-라벨링된 적혈구의 실시간 영상을 사용하여 기능적 모세혈관 이미지를 분석하였다. 영상의 색상을 분할한 후, DiD를 검출하는 채널의 순차 이미지를 반경 2 픽셀의 중간값 필터(median filter)로 처리하여 신호-대-노이즈 비율을 증가시켰다. 적혈구에 의해 관류되는 기능적 모세혈관을 보여주기 위해 600 내지 900 프레임 (20 내지 30 초)의 최대 투사 강도(maximal intensity projection)를 생성하였다. 기능적 모세혈관 분율(Functional capillary ratio, FCR)을 하기 식 1에 의해 계산하였다.

[식 1]

기능적 모세혈관 분율 = 기능적 모세혈관의 면적 / 전체 모세혈관의 면적.

상기 식 1에서 전체 모세혈관 면적은 덱스트란 신호에 의해 감지된 혈관 면적이고, 기능적 모세혈관 면적은 DiD-라벨링된 적혈구가 이동하는 면적을 의미한다. 상기 기능적 모세혈관 분율을 계산하기 위한 모든 이미지 처리는 ImageJ(https://imagej.nih.gov/ij/)에 의해 수행되었으며, 그 결과는 도 3a와 같다(n (field의 개수) = 30, 마우스 1 마리 당 10 FOV(Field of View), 각 그룹당 3마리, P < 0.05, post hoc Holm-Sidak의 다중 비교 test를 사용한 one-way ANOVA, 데이터는 평균 ±s.d이다).

도 3a에 나타난 바와 같이, 대조군(PBS) 마우스 모델에 비하여 ALI 마우스 모델(LPS)의 FCR(%)이 50% 이상 감소하여 폐 손상에 의해 폐 미세순환 장애가 발생함을 확인하였으며, 상기 ALI 마우스 모델(LPS)과 비교할 때 중성구 제거 모델(N-Dep 마우스 모델 및 N-Dep+LPS 마우스 모델)은 FCR(%)이 약 3 배 이상 증가하여 상기 폐 미세순환 장애가 개선됨을 확인하였다.

조직학적 분석(histological analysis)

상기 실시예 1의 대조군 마우스 모델(PBS), ALI 마우스 모델(LPS), 상기 실시예 2의 중성구 제거 모델(N-Dep 마우스 모델 및 N-Dep+LPS 마우스 모델) 각각의 단위면적(512 X 512 μm)당 중성구의 수를 비교하기 위해 조직학적 분석을 수행하였다.

구체적으로, 상기 마우스 모델의 생체 내 이미징 후 폐 조직을 채취하고, 4% 파라포름알데히드로 관류(perfusion) 및 고정(fixation) 작업을 수행한 후, 4% 파라포름알데히드에서 하룻밤 동안 추가로 고정시켰다. H&E (hematoxylin and eosin) 염색(staining)을 위해, 표준 절차를 사용하여 상기 고정시킨 조직을 처리하고, 파라핀에 넣은 다음 4 μm 섹션(section)으로 잘라내어 종래 방법으로 H&E 염색을 수행하였으며, 그 결과는 도 3b와 같다(n (field의 개수) = 30, 마우스 1 마리 당 10 FOV(Field of View), 각 그룹당 3마리, P < 0.05, post hoc Holm-Sidak의 다중 비교 test를 사용한 one-way ANOVA, 데이터는 평균 ±s.d이다). 도 3b에서 cells/field는 단위면적(512 X 512 μm)당 중성구의 수로서, 상기 filed는 단위면적(512 X 512 μm)을 의미한다.

또한, 도 3b에 나타난 바와 같이, 중성구(LysM+ 세포)의 수는 상기 실시예 2의 중성구 제거 모델 준비 과정에서 일정 수준으로 감소하였으나, 도 2의 확대(Magnified) 이미지를 고려하면, 혈관 외 공간에서 폐 대식세포(alveolar macrophage)로 추정되는 대식세포(LysM+ 세포)의 잔해로 인해 중성구가 완전히 고갈되지 못한 것을 확인하였다.

도 3a 및 도 3b의 결과를 종합하면, 대부분 혈관 내 중성구인 LysM+ 세포의 수가 감소하면 폐 미세순환에서 기능적 모세혈관 분율(FCR)이 개선된다는 것을 알 수 있었다. 또한, 중성구가 전신 염증 발생 시 폐 미세순환에서 집락(aggregates)의 주요 성분이자 혈액 흐름의 1차적 차단제(blockers)로서 기능함을 알 수 있었다.

[실험예 3] 폐 손상 질환 예방 또는 치료를 위한 모세혈관 내 중성구의 타겟 탐색

상기 실험예 2로부터 미세순환을 이루는 모세혈관 내 중성구의 수를 감소시키는 경우 미세순환 장애가 개선되어 폐 손상 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있으나, 이러한 중성구 감소 전략은 임상적으로 수행하기에 어려움이 있다. 이에, 폐 손상 질환 예방 또는 치료를 위한 격리된 중성구에서의 타겟을 탐색하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다. 이 때, 본 발명자들은 이미 폐 모세혈관을 통과한 좌심실 유래 중성구의 인테그린(integrin) 발현 패턴과 폐 유래 중성구의 패턴이 다를 것이라는 가설을 세웠다.

유세포 분석(Flow cytometry)

먼저, 상기 실시예 1의 대조군(PBS) 마우스 모델 및 ALI 마우스 모델(LPS) 각각의 좌심실(left ventricle, LV)과 폐(lung) 각각으로부터 중성구를 분리하고, 상기 좌심실 유래 중성구와 폐 유래 중성구의 인테그린 발현을 조사하기 위해, 상기 분리된 2 종의 중성구에 대하여 유세포 분석(flow cytometry)을 수행하였다.

먼저, 폐의 격리된 중성구를 분리하기 위해, 폐를 관류(perfusion) 없이 채취하고 침지(digest)시켰다. 그런 다음, 폐를 PBS 용액에 넣고 잘게 다진 뒤 40 μm 필터로 여과시키고 4 ℃에서 30 분간 염색하였다. 한편, 좌심실로부터 중성구를 분리하기 위해, 마우스 모델의 좌심실로부터 주사를 이용하여 혈액 100 μl을 추출한 다음, 적혈구를 용혈시켜 유세포 분석기(FACS)(BD, LSRFortessa^TM)를 이용하여 중성구 1.0 X 10⁶ cells를 분리하였다. 본 실험예에서 사용된 클론 항체는 Ly6G-FITC (1A8, 551460, BD Biosciences), CD11a-BV510 (M17/4, 563669, BD Biosciences) CD11b-PE-Cy7 (M1/70, 552850, BD Biosciences), CD18-APC (C71/16, 562828, BD Biosciences), CD62L (MEL-14, 560514, BD Biosciences), Viability Dye eFluor 506 (65-0866-14, ThermoFisher Scientific)이며, 염색된 세포는 LSR Fortessa flow cytometer(BD Biosciences)로 분석되었다. 그런 다음, Flowjo (FlowJo, LLC)을 이용하여 Ly6G+에 게이트된(gated) 상기 분리된 2 종의 중성구에 대하여 유세포 분석을 수행하였으며, 그 결과는 도 5 및 도 6a 내지 6d와 같다(각 그룹(군, group) 당 n (마우스의 수) = 5, *P < 0.05, Mann-Whitney test, MFI는 평균 형광 강도를 나타냄, 데이터는 평균 ±s.d이다).

도 5 및 도 6a 내지 6d로부터, 대조군(PBS)의 중성구에 비하여 ALI 마우스 모델(LPS)의 중성구에서 CD11b 및 CD18의 발현량이 보다 높고, 동일 마우스 모델에서 폐 유래 중성구가 좌심실 유래 중성구에 비하여 CD11b 및 CD18 발현량이 보다 높음을 확인하였다 (n = 5 per each group, * P < 0.05, Mann-Whitney test). MFI, mean fluorescence intensity. Data are means ± s.d.).

생체 내 이미징

상기 실시예 1의 대조군(PBS) 마우스 모델 및 ALI 마우스 모델(LPS) 각각의 격리된 중성구에서의 인테그린을 상기 실험예 1의 방법으로 촬영하고 이미징 처리하였다. 도 7a 및 도 7b는 중성구, 중성구에서 CD11b 및 CD18 각각의 세포 표면에서의 발현을 in vivo 상에서 시각화한 결과이다.

도 7a 및 도 7b에 나타난 바와 같이, 대조군(PBS)에서는 매우 적은 수의 중성구가 확인되었고, 중성구의 표면에서 CD11b 및 CD18은 거의 발현되지 않았다. 이에 반해, ALI 마우스 모델(LPS)에서는 매우 많은 수의 중성구가 확인되었고, 중성구의 표면에서 CD11b 및 CD18의 발현량이 매우 높음을 확인하였다.

CD11b 또는 CD18을 발현하는 중성구의 수 비교

상기 실시예 1의 ALI 마우스 모델(LPS)과 대조군 마우스 모델(PBS) 간의 CD11b 또는 CD18을 발현하는 중성구의 수를 비교하였으며, 그 결과는 도 8a 내지 8d과 같다.(n (field의 개수) = 9, 마우스 1 마리 당 3 FOV(Field of View), 각 그룹당 3마리, *P < 0.05, Mann-Whitney test, 데이터는 평균 ±s.d이다) 도 8a 및 도 8c의 filed는 단위면적(512 X 512 μm)을 의미한다.

도 8a 내지 도 8d에 나타난 바와 같이, 단위면적당 중성구 표면에서 CD11b를 발현하는 중성구의 수(CD11b+ Ly6G+ cells per field)가 대조군(PBS)은 거의 없는 반면, ALI 마우스 모델(LPS)은 약 300 개이고(도 8a), 단위면적당 중성구 표면에서 CD18을 발현하는 중성구의 수(CD18+ Ly6G+ cells per field)도 역시 대조군(PBS)은 약 40 개이나, ALI 마우스 모델(LPS)은 약 330 개로 약 8 배 정도로 큰 차이가 남을 확인하였다(도 8c). 또한, 전체 중성구에 대한 중성구 표면에서 CD11b를 발현하는 중성구의 비율(CD11b+ Ly6G+ / total Ly6G+)은 대조군(PBS)은 0.05 정도이나, ALI 마우스 모델(LPS)은 이의 약 16 배에 달하는 0.8이고(도 8b), 전체 중성구에 대한 중성구 표면에서 CD18을 발현하는 중성구의 비율(CD18b+ Ly6G+ / total Ly6G+)은 대조군(PBS)은 약 0.4, ALI 마우스 모델(LPS)은 이의 약 2 배 이상인 0.9임을 확인하였다(도 8d). 이를 통해 폐 손상으로 인해 미세순환을 이루는 모세혈관 내 중성구의 표면에서 CD11b 및 CD18의 발현량이 매우 증가함을 알 수 있었다.

상기 결과로부터, 미세순환 내에서 순환하는 중성구에 비하여 폐 손상으로 인해 폐에서 격리된 중성구는 Mac-1 (CD11b/CD18) 인테그린의 발현량이 증가함을 확인하였다.

[실험예 4] Mac-1 억제에 따른 폐 손상 개선 효과 확인

상기 실험예 3으로부터 폐 손상으로 인해 폐에서 격리된 중성구는 Mac-1 (CD11b/CD18) 인테그린의 발현량이 증가함을 확인하였는바, 상기 실시예 3에서 제조한 Mac-1 억제 마우스 모델에서 Mac-1 발현 또는 활성 억제제 의해 폐 손상, 나아가 미세순환 장애가 개선되는지를 확인하였다. 하기 실험예에서는 패혈증으로 인해 폐 손상된 마우스 모델을 사용하되, 이를 다양한 균에 의한 패혈증 모델로 확장하고자, 상기 실시예 1의 CLP 모델을 패혈증 모델로 사용하였다.

[실험예 4-1] Mac-1 억제 마우스 모델 준비

폐 손상 질환에 있어서의 Mac-1 활성 억제의 효과를 확인하기 위해, Mac-1의 활성을 억제시킨 마우스 모델(이하, Mac-1 억제 모델)을 준비하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1의 CLP 마우스 모델 준비 1 시간 후, 생체 내 이미징 5 시간 전에 항-CD11b 항체(5 mg/kg, Clone M1/70, 553307, BD Biosciences)를 복강 내 주입함으로써 Mac-1 활성이 억제된 마우스 모델인 항-Mac-1 모델을 준비하였다. 또한, 또 다른 Mac-1 억제 모델로, 상기 항-Mac-1 모델과 동일한 방법으로 실시예 1의 CLP 마우스 모델에 압식시맙(Abciximab)(10 mg/kg, Clotinab, ISU Abxis)을 주입하여 압식시맙 모델을 준비하였다.

[실험예 4-2] Mac-1 억제에 의한 폐 미세순환 장애 개선 효과 확인

상기 실험예 1과 동일한 방법으로, 상기 실시예 1의 CLP 마우스 모델(도 9 및 10에서 Fc), 상기 실험예 4-1의 항-Mac-1 마우스 모델(도 9 및 10에서 Anti-CD11b) 및 압식시맙 모델(도 9 및 10에서 Abc), 및 정상군(Sham) 마우스 모델(도 9 및 10에서 Sham)의 폐 미세순환을 촬영하고, 이를 바탕으로 상기 실험예 2와 동일한 방법으로 기능적 모세혈관 분율(FCR)을 측정하고 조직학적 분석을 수행하여 미세순환을 정량화하였으며, 그 결과는 도 9 및 도 10과 같다(n (field의 개수) = 14-25, 각 그룹당 3마리, *P < 0.05, two-tailed t-test, 데이터는 평균 ±s.d이다).

도 9에 나타난 바와 같이, 정상군(Sham)과는 달리 CLP 마우스 모델(Fc)은 적혈구가 모세혈관을 통과하지 못하는 사강(dead space)이 형성되었다가, Mac-1 활성이 억제(항-Mac-1 마우스 모델 및 압식시맙 마우스 모델)되면 적혈구가 모세혈관을 통과하여 미세순환이 원활하게 일어나는 기능적 모세혈관이 보다 증가하여 사강(dead space)이 감소함에 따라 폐 미세순환 장애가 개선됨을 확인하였다.

또한, 도 10a에 나타난 바와 같이, 정상군(Sham)에 비하여 CLP 마우스 모델(Fc)의 FCR(%)이 50% 이상 감소하여 폐 손상에 의해 폐 미세순환 장애가 발생함을 확인하였으며, 상기 CLP 마우스 모델(Fc)과 비교할 때 Mac-1 억제 모델(항-Mac-1 마우스 모델 및 압식시맙 마우스 모델)은 FCR(%)이 약 2 배 이상 증가하여 상기 폐 미세순환 장애가 개선됨을 확인하였다.

조직학적 분석 결과도 마찬가지로, 도 9 및 도 10b에 나타난 바와 같이, 중성구(Ly6G+ 세포)의 수는 정상군(Sham)에 비해 상기 CLP 마우스 모델(Fc)에서 격리된 중성구가 증가하였다가, 다시 Mac-1 억제에 의해(항-Mac-1 마우스 모델 및 압식시맙 마우스 모델) 격리된 중성구의 수가 다시 정상군에 상응하는 정도로 회복됨을 확인하였다.

[실험예 4-3] Mac-1 억제 전후 비교를 통한 폐 미세순환 장애 개선 효과 확인

상기 실험예 4-2로부터 Mac-1 발현 또는 활성 억제를 통해 미세순환 장애를 개선할 수 있음을 확인하였는바, 압식시맙 투여 전후 비교를 통해 그 효과를 다시 한 번 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1의 CLP 마우스 모델을 제조한지 6 시간 후(이하, pre-Abc 마우스 모델이라 함)에 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 폐 미세순환을 촬영하고, 상기 실험예 2와 동일한 방법으로 기능적 모세혈관 분율(FCR)을 측정하였다. 그런 다음, 상기 실험예 4-1의 방법으로 압식시맙을 상기 CLP 마우스 모델에 투여하고(이하, post-Abc 마우스 모델이라 함), 30 분 후에 상기와 동일한 방법으로 폐 미세순환 촬영 및 기능적 모세혈관 분율(FCR) 측정을 수행하였으며, 그 결과는 도 11 및 도 12와 같다(n (field의 개수) = 20 및 24, 마우스 1 마리 당 6~8 FOV(Field of View), 각 그룹당 3마리, *P < 0.05, two-tailed t-test, 데이터는 평균 ±s.d이다).

도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이, 폐 손상 마우스 모델(CLP 마우스 모델)은 압식시맙 투여 전에는 전체 모세혈관 중에서 기능적 모세혈관이 차지하는 비중(FCR)이 20%가 채 안되어 적혈구가 통과하지 못하는 모세혈관이 매우 많으나, 압식시맙 투여로 Mac-1 발현 또는 활성 억제 시, 기능적 모세혈관 분율(FCR)이 약 2 배 이상 증가하는 등 모세혈관을 통과하는 적혈구의 수가 급증함을 확인하였다.

또한, 상기 pre-Abc 마우스 모델 및 post-Abc 마우스 모델의 동맥혈에서의 산소 분압 및 이산화탄소 분압을 측정하기 위해, 동맥혈 가스 분석을 수행하였다. 구체적으로, 22 게이지 바늘이 들어간 1 mL의 주사기를 헤파린으로 코팅하고 상기 정상군 마우스 모델(Sham)(n = 8), pre-Abc 마우스 모델(Fc)(n = 10) 및 post-Abc 마우스 모델(Abc)(n = 6) 각각의 심장의 좌심실에 도입하였다. 그 후 약 200 μl의 혈액이 i-STAT 소형 혈액 분석기(i-STAT handheld blood analyzer)(G3 카트리지, Abbott Point of Care Inc.)로 샘플링되고 분석되었으며, 상기 마우스 모델들을 혈액 샘플링 직후 CO₂ 챔버로 안락사시켰다. 상기 동맥혈 가스 분석 결과는 도 13a 및 도 13b와 같다(*P < 0.05, post hoc Dunn의 다중 비교 test를 사용한 Kruskal-Wallis test, 데이터는 평균 ±s.d이다).

도 13a 및 13b에 나타난 바와 같이, 정상군(Sham)에 비하여 CLP 마우스 모델(Fc, pre-Abc 마우스 모델에 해당)의 동맥 내 산소 분압은 감소하고(도 13a), 이산화탄소 분압은 증가하였는바(도 13b), 상기 폐 손상 마우스 모델(CLP 마우스 모델)에서의 기능적 모세혈관 분율의 감소는 저산소증(hypoxemia) 및 과탄산혈증(hypercapnia)에 따른 결과임을 확인하였다. 저산소증 및 과탄산혈증에 의한 폐 미세순환 장애는 압식시맙 투여에 따른 Mac-1 발현 또는 활성 억제에 의하여 개선되었는데, 이는 post-Abc 마우스 모델(Abc)의 동맥 내 산소 분압 및 이산화탄소 분압이 정상군에 상응하는 정도로 변화하는 것을 통해 확인할 수 있다(도 13a 및 13b). 이를 통해 Mac-1 발현 또는 활성 억제를 통해 폐 미세순환 장애 개체에서 가스 교환을 증가시켜 폐 미세순환 장애를 개선할 수 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 일 측면에 따른 중성구에서의 Mac-1 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 조성물은 폐의 미세순환 장애를 개선하여 폐 손상 질환을 예방 또는 치료하는 우수한 효과가 있다.

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Glu Ala Leu Arg Gly Cys 130 135 140 Pro Gln Glu Asp Ser Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser 145 150 155 160 Ile Ile Pro His Asp Phe Arg Arg Met Lys Glu Phe Val Ser Thr Val 165 170 175 Met Glu Gln Leu Lys Lys Ser Lys Thr Leu Phe Ser Leu Met Gln Tyr 180 185 190 Ser Glu Glu Phe Arg Ile His Phe Thr Phe Lys Glu Phe Gln Asn Asn 195 200 205 Pro Asn Pro Arg Ser Leu Val Lys Pro Ile Thr Gln Leu Leu Gly Arg 210 215 220 Thr His Thr Ala Thr Gly Ile Arg Lys Val Val Arg Glu Leu Phe Asn 225 230 235 240 Ile Thr Asn Gly Ala Arg Lys Asn Ala Phe Lys Ile Leu Val Val Ile 245 250 255 Thr Asp Gly Glu Lys Phe Gly Asp Pro Leu Gly Tyr Glu Asp Val Ile 260 265 270 Pro Glu Ala Asp Arg Glu Gly Val Ile Arg Tyr Val Ile Gly Val Gly 275 280 285 Asp Ala Phe Arg Ser Glu Lys Ser Arg Gln Glu Leu Asn Thr Ile Ala 290 295 300 Ser Lys Pro Pro Arg Asp His Val Phe Gln Val Asn Asn Phe Glu Ala 305 310 315 320 Leu Lys Thr Ile Gln Asn Gln Leu Arg Glu Lys Ile Phe Ala Ile Glu 325 330 335 Gly Thr Gln Thr Gly Ser Ser Ser Ser Phe Glu His Glu Met Ser Gln 340 345 350 Glu Gly Phe Ser Ala Ala Ile Thr Ser Asn Gly Pro Leu Leu Ser Thr 355 360 365 Val Gly Ser Tyr Asp Trp Ala Gly Gly Val Phe Leu Tyr Thr Ser Lys 370 375 380 Glu Lys Ser Thr Phe Ile Asn Met Thr Arg Val Asp Ser Asp Met Asn 385 390 395 400 Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Ala Ala Ala Ile Ile Leu Arg Asn Arg Val 405 410 415 Gln Ser Leu Val Leu Gly Ala Pro Arg Tyr Gln His Ile Gly Leu Val 420 425 430 Ala Met Phe Arg Gln Asn Thr Gly Met Trp Glu Ser Asn Ala Asn Val 435 440 445 Lys Gly Thr Gln Ile Gly Ala Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val 450 455 460 Asp Val Asp Ser Asn Gly Ser Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly Ala Pro 465 470 475 480 His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys Pro Leu 485 490 495 Pro Arg Gly Gln Arg Ala Arg Trp Gln Cys Asp Ala Val Leu Tyr Gly 500 505 510 Glu Gln Gly Gln Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu 515 520 525 Gly Asp Val Asn Gly Asp Lys Leu Thr Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro 530 535 540 Gly Glu Glu Asp Asn Arg Gly Ala Val Tyr Leu Phe His Gly Thr Ser 545 550 555 560 Gly Ser Gly Ile Ser Pro Ser His Ser Gln Arg Ile Ala Gly Ser Lys 565 570 575 Leu Ser Pro Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ser Leu Ser Gly Gly Gln 580 585 590 Asp Leu Thr Met Asp Gly Leu Val Asp Leu Thr Val Gly Ala Gln Gly 595 600 605 His Val Leu Leu Leu Arg Ser Gln Pro Val Leu Arg Val Lys Ala Ile 610 615 620 Met Glu Phe Asn Pro Arg Glu Val Ala Arg Asn Val Phe Glu Cys Asn 625 630 635 640 Asp Gln Val Val Lys Gly Lys Glu Ala Gly Glu Val Arg Val Cys Leu 645 650 655 His Val Gln Lys Ser Thr Arg Asp Arg Leu Arg Glu Gly Gln Ile Gln 660 665 670 Ser Val Val Thr Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Ser Gly Arg Pro His Ser 675 680 685 Arg Ala Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Ser Thr Arg Arg Gln Thr Gln 690 695 700 Val Leu Gly Leu Thr Gln Thr Cys Glu Thr Leu Lys Leu Gln Leu Pro 705 710 715 720 Asn Cys Ile Glu Asp Pro Val Ser Pro Ile Val Leu Arg Leu Asn Phe 725 730 735 Ser Leu Val Gly Thr Pro Leu Ser Ala Phe Gly Asn Leu Arg Pro Val 740 745 750 Leu Ala Glu Asp Ala Gln Arg Leu Phe Thr Ala Leu Phe Pro Phe Glu 755 760 765 Lys Asn Cys Gly Asn Asp Asn Ile Cys Gln Asp Asp Leu Ser Ile Thr 770 775 780 Phe Ser Phe Met Ser Leu Asp Cys Leu Val Val Gly Gly Pro Arg Glu 785 790 795 800 Phe Asn Val Thr Val Thr Val Arg Asn Asp Gly Glu Asp Ser Tyr Arg 805 810 815 Thr Gln Val Thr Phe Phe Phe Pro Leu Asp Leu Ser Tyr Arg Lys Val 820 825 830 Ser Thr Leu Gln Asn Gln Arg Ser Gln Arg Ser Trp Arg Leu Ala Cys 835 840 845 Glu Ser Ala Ser Ser Thr Glu Val Ser Gly Ala Leu Lys Ser Thr Ser 850 855 860 Cys Ser Ile Asn His Pro Ile Phe Pro Glu Asn Ser Glu Val Thr Phe 865 870 875 880 Asn Ile Thr Phe Asp Val Asp Ser Lys Ala Ser Leu Gly Asn Lys Leu 885 890 895 Leu Leu Lys Ala Asn Val Thr Ser Glu Asn Asn Met Pro Arg Thr Asn 900 905 910 Lys Thr Glu Phe Gln Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Met 915 920 925 Val Val Thr Ser His Gly Val Ser Thr Lys Tyr Leu Asn Phe Thr Ala 930 935 940 Ser Glu Asn Thr Ser Arg Val Met Gln His Gln Tyr Gln Val Ser Asn 945 950 955 960 Leu Gly Gln Arg Ser Leu Pro Ile Ser Leu Val Phe Leu Val Pro Val 965 970 975 Arg Leu Asn Gln Thr Val Ile Trp Asp Arg Pro Gln Val Thr Phe Ser 980 985 990 Glu Asn Leu Ser Ser Thr Cys His Thr Lys Glu Arg Leu Pro Ser His 995 1000 1005 Ser Asp Phe Leu Ala Glu Leu Arg Lys Ala Pro Val Val Asn Cys Ser 1010 1015 1020 Ile Ala Val Cys Gln Arg Ile Gln Cys Asp Ile Pro Phe Phe Gly Ile 1025 1030 1035 1040 Gln Glu Glu Phe Asn Ala Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Asp Trp 1045 1050 1055 Tyr Ile Lys Thr Ser His Asn His Leu Leu Ile Val Ser Thr Ala Glu 1060 1065 1070 Ile Leu Phe Asn Asp Ser Val Phe Thr Leu Leu Pro Gly Gln Gly Ala 1075 1080 1085 Phe Val Arg Ser Gln Thr Glu Thr Lys Val Glu Pro Phe Glu Val Pro 1090 1095 1100 Asn Pro Leu Pro Leu Ile Val Gly Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu 1105 1110 1115 1120 Leu Ala Leu Ile Thr Ala Ala Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg 1125 1130 1135 Gln Tyr Lys Asp Met Met Ser Glu Gly Gly Pro Pro Gly Ala Glu Pro 1140 1145 1150 Gln <210> 2 <211> 1152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Integrin alpha-M isoform 2 precursor <400> 2 Met Ala Leu Arg Val Leu Leu Leu Thr Ala Leu Thr Leu Cys His Gly 1 5 10 15 Phe Asn Leu Asp Thr Glu Asn Ala Met Thr Phe Gln Glu Asn Ala Arg 20 25 30 Gly Phe Gly Gln Ser Val Val Gln Leu Gln Gly Ser Arg Val Val Val 35 40 45 Gly Ala Pro Gln Glu Ile Val Ala Ala Asn Gln Arg Gly Ser Leu Tyr 50 55 60 Gln Cys Asp Tyr Ser Thr Gly Ser Cys Glu Pro Ile Arg Leu Gln Val 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Thr 85 90 95 Thr Ser Pro Pro Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Val His Gln Thr 100 105 110 Cys Ser Glu Asn Thr Tyr Val Lys Gly Leu Cys Phe Leu Phe Gly Ser 115 120 125 Asn Leu Arg Gln Gln Pro Gln Lys Phe Pro Glu Ala Leu Arg Gly Cys 130 135 140 Pro Gln Glu Asp Ser Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser 145 150 155 160 Ile Ile Pro His Asp Phe Arg Arg Met Lys Glu Phe Val Ser Thr Val 165 170 175 Met Glu Gln Leu Lys Lys Ser Lys Thr Leu Phe Ser Leu Met Gln Tyr 180 185 190 Ser Glu Glu Phe Arg Ile His Phe Thr Phe Lys Glu Phe Gln Asn Asn 195 200 205 Pro Asn Pro Arg Ser Leu Val Lys Pro Ile Thr Gln Leu Leu Gly Arg 210 215 220 Thr His Thr Ala Thr Gly Ile Arg Lys Val Val Arg Glu Leu Phe Asn 225 230 235 240 Ile Thr Asn Gly Ala Arg Lys Asn Ala Phe Lys Ile Leu Val Val Ile 245 250 255 Thr Asp Gly Glu Lys Phe Gly Asp Pro Leu Gly Tyr Glu Asp Val Ile 260 265 270 Pro Glu Ala Asp Arg Glu Gly Val Ile Arg Tyr Val Ile Gly Val Gly 275 280 285 Asp Ala Phe Arg Ser Glu Lys Ser Arg Gln Glu Leu Asn Thr Ile Ala 290 295 300 Ser Lys Pro Pro Arg Asp His Val Phe Gln Val Asn Asn Phe Glu Ala 305 310 315 320 Leu Lys Thr Ile Gln Asn Gln Leu Arg Glu Lys Ile Phe Ala Ile Glu 325 330 335 Gly Thr Gln Thr Gly Ser Ser Ser Ser Phe Glu His Glu Met Ser Gln 340 345 350 Glu Gly Phe Ser Ala Ala Ile Thr Ser Asn Gly Pro Leu Leu Ser Thr 355 360 365 Val Gly Ser Tyr Asp Trp Ala Gly Gly Val Phe Leu Tyr Thr Ser Lys 370 375 380 Glu Lys Ser Thr Phe Ile Asn Met Thr Arg Val Asp Ser Asp Met Asn 385 390 395 400 Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Ala Ala Ala Ile Ile Leu Arg Asn Arg Val 405 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1030 1035 1040 Glu Glu Phe Asn Ala Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Asp Trp Tyr 1045 1050 1055 Ile Lys Thr Ser His Asn His Leu Leu Ile Val Ser Thr Ala Glu Ile 1060 1065 1070 Leu Phe Asn Asp Ser Val Phe Thr Leu Leu Pro Gly Gln Gly Ala Phe 1075 1080 1085 Val Arg Ser Gln Thr Glu Thr Lys Val Glu Pro Phe Glu Val Pro Asn 1090 1095 1100 Pro Leu Pro Leu Ile Val Gly Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu 1105 1110 1115 1120 Ala Leu Ile Thr Ala Ala Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg Gln 1125 1130 1135 Tyr Lys Asp Met Met Ser Glu Gly Gly Pro Pro Gly Ala Glu Pro Gln 1140 1145 1150

Claims

유효성분으로서 폐 모세혈관 내의 중성구(neutrophil)에서의 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는, 저산소증 또는 과탄산혈증에 의한 폐 미세순환 장애 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성 억제제는 중성구에서의 마크로파지-1 항원에 특이적으로 결합하는 항체인, 조성물.
제2항에 있어서,
상기 항체는 압식시맙(abciximab)인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 미세순환 장애 개선은 폐의 전체 모세혈관 중 적혈구가 통과하는 기능적 모세혈관의 비율을 증가시키는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 미세순환 장애 개선은 하기 식 1에 따른 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR)을 증가시키는 것인, 조성물:
[식 1]
기능적 모세혈관 분율 = 기능적 모세혈관의 면적 / 전체 모세혈관의 면적.
(a) 폐 손상 모델을 준비하는 단계;
(b) 상기 폐 손상 모델에 시험물질을 처리하는 단계; 및
(c) 상기 시험물질이 상기 폐 손상 모델의 하기 식 1에 따른 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR)에 미치는 변화를 측정하는 단계;를 포함하는, 폐의 미세순환 장애 개선 물질 스크리닝 방법:
[식 1]
기능적 모세혈관 분율 = 기능적 모세혈관의 면적 / 전체 모세혈관의 면적.
제6항에 있어서,
상기 (a) 단계의 폐 손상 모델은 패혈증(sepsis) 모델인, 스크리닝 방법.
제6항에 있어서,
상기 (a) 단계의 폐 손상 모델은 기능적 모세혈관 분율이 0.4 이하인, 스크리닝 방법.
제6항에 있어서,
상기 (c) 단계의 기능적 모세혈관의 면적은 혈류 내 타겟 요소가 이동하는 복수의 이동 이미지로부터 동일한 타겟 요소를 판별하여 측정하는 것으로서,
상기 복수의 이동 이미지로부터 개체의 모세 혈관을 통과하는 혈류 내 타겟 요소의 시간에 따른 이동 경로를 측정하고,
복수의 혈류 내 타겟 요소의 이동 경로로부터 기능적 모세 혈관의 면적을 측정하는 것인, 스크리닝 방법.
제6항에 있어서,
상기 (c) 단계는 폐 손상 모델에 시험물질을 처리하기 전과 후의 기능적 모세혈관 분율을 비교하는 단계를 포함하는, 스크리닝 방법.
제6항에 있어서,
상기 (c) 단계의 기능적 모세혈관 분율을 측정한 결과 기능적 모세혈관 분율이 시험물질 처리 전에 비하여 증가한 경우, 상기 시험물질을 폐 손상 질환 예방, 개선 또는 치료물질로 판정하는 단계를 더 포함하는, 스크리닝 방법.
(a) 폐 손상 모델을 준비하는 단계;
(b) 상기 폐 손상 모델에 시험물질을 처리하는 단계; 및
(c) 상기 시험물질이 상기 폐 손상 모델의 하기 식 1에 따른 기능적 모세혈관 분율(Functional Capillary Ratio, FCR) 에 미치는 변화를 측정하는 단계;를 포함하는, 폐의 미세순환 장애 개선 물질 스크리닝 방법:
[식 1]
기능적 모세혈관 분율 = 기능적 모세혈관의 면적 / 전체 모세혈관의 면적.
제6항 또는 제12항에 있어서,
상기 스크리닝 방법은 (d) 상기 시험물질이 상기 폐 손상 모델의 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원(macrophage-1 antigen, Mac-1)의 발현 또는 활성에 미치는 변화를 측정하는 단계;를 추가로 포함하는, 스크리닝 방법.
제13항에 있어서,
상기 (d) 단계는 폐 손상 모델에 시험물질을 처리하기 전과 후의 폐 모세혈관 내의 중성구에서 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성을 비교하는 단계를 포함하는, 스크리닝 방법.
제13항에 있어서,
상기 (c) 단계의 발현 또는 활성을 측정한 결과 마크로파지-1 항원의 발현 또는 활성이 시험물질 처리 전에 비하여 감소한 경우, 상기 시험물질을 폐 손상 질환 예방, 개선 또는 치료물질로 판정하는 단계를 더 포함하는, 스크리닝 방법.