KR20220047319A - 감소된 면역자극 특성을 갖는 rna 조합물 및 조성물 - Google Patents

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프레데릭 체베스시어-튀네센
요하네스 루츠
토마스 슈라케
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큐어백 아게
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Abstract

본 발명은 특히 (i) 적어도 하나의 치료 RNA를 포함하는 제1 성분 및 (ii) 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제를 포함하는 제2 성분을 포함하는 조합물에 관한 것이다. 적어도 하나의 치료 RNA 및 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다. 두 성분의 조합물은 첫 번째 성분의 면역자극 특성을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 투여 후 발현을 촉진할 수 있다. 추가로, 제1 및 제2 의약적 용도, 및 질병, 장애 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.

Description

감소된 면역자극 특성을 갖는 RNA 조합물 및 조성물
본 발명은 특히 (i) 적어도 하나의 치료 RNA를 포함하는 제1 성분 및 (ii) 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체(RNA sensing pattern recognition receptor)의 적어도 하나의 길항제를 포함하는 제2 성분을 포함하는 조합물에 관한 것이다. 적어도 하나의 치료 RNA 및 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다. 추가로, 제1 및 제2 의약적 용도, 및 질병, 장애 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법이 제 공된다.
RNA 기반 치료제는 예를 들어 수동 및 능동 면역 요법, 단백질 대체 요법 또는 유전 공학에서 사용될 수 있다. 따라서 치료 RNA는 매우 다양한 질병, 장애 또는 상태의 치료를 위한 매우 특이적이고 개별적인 치료 옵션을 제공할 가능성이 있다.
백신으로 사용되는 것 외에도, RNA 분자는 예를 들어 환자의 성장 인자 또는 효소와 같은 결손되거나 돌연변이된 단백질을 대체하기 위한 단백질 대체 요법과 같은 대체 요법을 위한 치료제로도 사용될 수 있다. 그러나 안전하고 효과적인 RNA 기반 대체 요법의 성공적인 개발은 백신과 다른 전제 조건을 기반으로 한다. 코딩 RNA를 단백질 대체 요법에 적용할 때, 치료 코딩 RNA는 투여된 RNA 분자 및 암호화된 단백질에 대해 발현 수준 및 기간 측면에서 관심 단백질의 충분한 발현을 부여해야하고, 치료할 환자의 염증을 방지하고 특정 면역 반응을 피하기 위해 선천성 면역 시스템의 최소한의 자극을 부여해야한다.
치료 RNA의 고유한 면역자극 특성이 백신의 바람직한 특징으로 여겨질 수 있는 반면, 이러한 효과는 대체 요법에서 바람직하지 않은 합병증을 유발할 수 있다. RNA 치료제를 장기간에 걸쳐 반복적으로 투여해야 하는 만성 질환의 치료에 특히 그렇다. 선천성 면역 반응을 이끌어내는 치료 RNA의 잠재적인 능력은 생체 내 적용에 대한 제한을 나타낼 수 있다.
선천 및/또는 적응 면역계의 면역 반응의 유도 및/또는 향상은 수많은 질병에서 중요한 역할을 한다. 외래 또는 손상 관련 핵산을 감지하는 데 특화된 일부 선천성 면역 수용체가 확인되었다. 이러한 핵산 감지 면역 수용체 그룹 중 하나는 별개의 면역 세포 하위 집합 및 특정 체세포의 엔도리소좀 구획에 우선적으로 위치한 패턴 인식 수용체(PRR)인 톨 유사 수용체(TLR)이다. 후자의 수용체는 병원체 관련 분자 패턴(PAMP) 및 위험 관련 분자 패턴(DAMP)을 식별하는 역할을 한다. PPR은 병원체에 대한 1차 방어 역할을 하며 전-염증성 사이토카인, 케모카인 및 인터페론뿐만 아니라 B 및 T 세포의 생산을 활성화하여 적응성 면역의 활성화 및 진행을 제어한다. PPR 중에서 톨-유사 수용체(TLR)가 특히 중요하다. 30년 이상 전에 그들의 발견은 선천성 면역, 염증 및 사이토카인 유도의 조절에 대한 지식을 향상시켰다. 핵산 감지 수용체의 자극은 일반적으로 사이토카인(예: 타입 I 인터페론) 및 케모카인을 유도하여 인접 세포에 경보를 울리고, 예를 들어 면역 세포를 모집한다. 예를 들어, TLR3, TLR7, TLR8 및 TL R9는 엔도사이토시스를 통해 세포에 의해 흡수되고 엔도솜으로 전달되는 핵산 (예를 들어: RNA)을 인식하는 세포내 TLR이다. 추가 핵산 감지 면역 수용체는 헬리카제의 RIG-I 패밀리(예: RIG-I, MDA5, LGP2), NOD 유사 수용체, PKR, OAS, SAMHD1, ADAR1, IFIT1 및/또는 IFIT5를 포함한다.
따라서 톨유사 수용체 7 및 8과 같은 RNA에 의해 주로 매개되는 선천성 면역 반응의 유도는 RNA 기반 치료제의 효과를 손상시킬 수 있고 따라서 치료 효능을 감소시킬 수 있다. 특정 사이토카인 프로필의 유도가 예방 백신에 유리할 수 있더라도, 예를 들어 열과 아픔을 특징으로 하는 RNA 백신에 대한 반응원성(reactogenicity)은 피해야 한다. 따라서 열과 아픔을 피하면서 적응 면역 반응을 지원하기 위해 선천성 면역 반응을 유도하는 것 사이의 균형을 찾는 것이 업계에서 도전이다.
당업계에서, 그 문제는 변형된 RNA 뉴클레오티드를 사용함으로써 부분적으로 해결되었다. 변형된 뉴클레오티드를 도입함으로써 치료 RNA는 생체 내에서 감소된 선천 면역 자극을 나타낼 수 있다. 그러나 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 치료 RNA는 종종 생체 내에서 감소된 발현 또는 감소된 활성을 나타내는데 왜냐하면 변형은 또한 유익한 RNA-결합 단백질의 동원을 방지할 수 있고 따라서 치료 RNA의 활성, 예를 들어 단백질 번역을 방해할 수 있기 때문이다.
선행 기술은 유전자 요법에 사용되는 변형 메신저 RNA(mmRNA) 치료제 또는 DNA와 같은 내인성 및/또는 외인성 핵산에 의해 유도된 TLR 매개 면역 반응을 방지 및/또는 억제하는 길항제로서 변형된 CpG 모티프를 갖는 면역 조절 올리고뉴클레오티드 (IRO)의 용도를 설명한다 (WO2017136399). 메틸화되지 않은 데옥시시티딘-데옥시구아노신(CpG) 디뉴클레오티드를 포함하는 작은 합성 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)는 TLR9에 의한 인식을 통해 박테리아 DNA의 면역 자극 활성을 모방할 수 있다 (Pohar et al, Selectivity of Human TLR9 for Double CpG Motifs and Implications for the Recognition of Genomic DNA, J Immunol March 1, 2017, 198 (5) 2093-2104 and El-Zayat et al Toll-like receptors activation, signaling, and targeting: an overview, Bulletin of the National Research Centre (2019) 43:187).
위의 내용을 요약하자면, 치료 RNA의 면역자극 특성을 감소시키는 것과 동시에, 예를 들어, 세포에서 이러한 RNA의 번역 가능성 및/또는 적응 면역 반응 유도같은, 효능을 유지하는 것과 같은 문제가 있다. 그러나 대부분의 치료 환경에서 두가지 특징 (감소되거나 낮은 면역자극 특성, 높은 생체 내 번역 속도)은 RNA 약제를 위해 가장 중요하다.
위에 요약된 목적은 본 발명의 청구된 주제에 의해 해결된다.
명확성과 가독성을 위해 다음 정의가 제공된다. 이러한 정의에 대해 언급된 모든 기술적 특징은 본 발명의 모든 실시예에서 읽을 수 있다.
숫자의 맥락에서 백분율은 각 항목의 총 수에 대한 상대적인 것으로 이해해야 한다. 다른 경우에, 문맥에 따라 백분율은 중량 백분율(wt.-%)로 이해되어야 한다.
약: 용어 "약"은 매개변수 또는 값이 반드시 동일할 필요는 없는 경우, 즉 100% 동일할 때 사용된다. 따라서, "약"은 매개변수 또는 값이 0.1%에서 20%까지 벗어날 수 있음을, 바람직하게는 0.1%에서 10%까지 벗어날 수 있음을 의미하며, 특히 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%까지 벗어날 수 있음을 의미한다. 통상의 기술자는 예를 들어 특정 매개변수 또는 값은 매개변수가 결정된 방법에 따라 약간 다를 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어 만약 특정 매개변수 또는 값이 본원에서 예를 들어 "약 1000 뉴클레오티드"의 길이를 가진다고 정의되면, 길이는 0.1% 내지 20%까지 벗어날 수 있고, 바람직하게 0.1% 내지 10%까지; 특히, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%까지 벗어날 수 있다. 따라서 통상의 기술자는 특정예에서 길이가 1 내지 200 뉴클레오티드까지 벗어날 수 있으며, 바람직하게 1 내지 100 뉴클레오티드까지, 특히, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 뉴클레오티드까지 벗어날 수 있다.
적응 면역 반응(Adaptive immune response): 본원에 사용된 용어 "적응성 면역 반응"은 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 면역 체계(적응성 면역 체계)의 항원 특이적 반응을 나타내기 위한 것이다. 항원 특이성은 특정 병원체 또는 병원체에 감염된 세포에 맞는 반응을 생성할 수 있도록 한다. 이러한 맞춤형 반응을 수행하는 능력은 일반적으로 "기억 세포"(B-세포)에 의해 신체에서 유지된다. 본 발명의 맥락에서, 항원은 본 발명의 조합물/조성물의 적어도 하나의 치료 RNA에 의해 제공될 수 있다.
항체, 항체 단편 (Antibody, antibody fragment): 본원에 사용되어진, 용어 "항체"는 온전한 항체 및 항체 단편 둘 다를 포함한다. 일반적으로, 온전한 "항체"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린이다. 항체는 임의의 인간 클래스: IgG, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함한, 어떤 면역글로불린 클래스의 멤버일 수 있다. 일반적으로, 온전한 항체는 사량체이다. 각각의 사량체는 두 개의 동일한 폴리펩타이드 사슬 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 "경쇄" 사슬과 "중쇄" 사슬을 가지고 있다. "항체 단편"은 항체의 항원 결합 또는 가변 영역과 같은 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab ', F(ab') 2 및 Fv 단편; 집단; 테트라 (Tetra); 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함한다. 예를 들어, 항체 단편은 단리된 단편, 경쇄 및 중쇄 가변 영역으로 이루어진 "Fv" 단편, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩타이드 링커에 의해 함께 연결된 재조합 단일 쇄 폴리펩티드 분자("ScFv 단백질") 및 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 구성된 최소 인식 단위를 포함한다. 항체의 항원 결합 단편의 예는 Fab 단편, Fab '단편, F(ab') 2 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 디아바디, dAb 단편, 단편 Fd', Fd 단편 및 분리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 치료 RNA에 의해 암호화될 수 있는 적합한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 혼합물 또는 칵테일, 인간 또는 인간화 항체, 키메라 항체, Fab 단편, 또는 이중특이적 항체를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 항체는 본 발명의 조합물/조성물의 적어도 하나의 치료 RNA에 의해 제공될 수 있다.
작용제 (Agonist): "작용제"라는 용어는 세포의 수용체에 결합하고 반응을 유도하는 물질에 사용된다. 작용제는 종종 리간드와 같은 자연 발생 물질의 작용을 모방한다.
길항제 (Antagonist): "길항제"라는 용어는 일반적으로 작용제의 효과를 약화시키는 물질을 의미한다.
항원 (Antigen): 본원에 사용된 용어 "항원"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 면역계, 바람직하게는 적응성 면역계에 의해 인식될 수 있고, 예를 들어 적응성 면역 반응의 일부로서 항체 및/또는 항원 특이적 T 세포의 형성에 의한, 항원 특이적 면역 반응을 유발할 수 있는 물질을 지칭하기 위한 것이다. 전형적으로, 항원은 MHC에 의해 T-세포에 제시될 수 있는 펩티드 또는 단백질이거나 이를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 암 항원으로부터 유래된 펩티드 또는 단백질의 단편, 변이체 및 유도체는 항원으로 이해될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 항원은 제공된 치료 RNA (예를 들어, 코딩 RNA, 레플리콘 RNA, mRNA)의 번역 산물일 수 있다. 용어 "항원 펩티드 또는 단백질"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 적응 면역 반응을 제공하기 위해 신체의 적응 면역 시스템을 자극할 수 있는 (항원) 단백질에서 파생된 펩티드 또는 단백질을 의미한다. 따라서 "항원 펩티드 또는 단백질"은 그것이 유래된 단백질의 적어도 하나의 에피토프 또는 항원(예를 들어, 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 원생동물 항원)을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 항원은 본 발명의 조합물/조성물의 적어도 하나의 치료 RNA에 의해 제공될 수 있다.
담체 (Carrier): 용어 "담체"는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 오일, 지질, 지질 함유 소포, 미소구체, 리포솜 캡슐화, 또는 제약 제제에 사용하기 위해 당업계에 널리 공지된 기타 물질을 포괄한다. 담체, 부형제 또는 희석제의 특성은 특정 적용을 위한 투여 경로에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다. 이들 물질을 함유하는 약제학적으로 허용되는 제형의 제조는 예를 들어, Remington 's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990에 기재되어 있다.
양이온성, 양이온화 가능한 (Cationic, cationisable): 특정 맥락에서 다른 의미가 명확하지 않은 한, "양이온성(cationic)"이라는 용어는 각 구조가 영구적으로 또는 영구적으로가 아닌 특정 조건, 예를 들어, pH에 반응하여 양전하를 띠는 것을 의미한다. 따라서 "양이온성"이라는 용어는 "영구적으로 양이온성" 및 "양이온화 가능한(cationisable)"을 모두 커버한다. 본원에 사용된 용어 "양이온화 가능한"은 화합물, 기(group) 또는 원자가 더 낮은 pH에서 양전하를 띠고 그 환경의 더 높은 pH에서 하전되지 않음을 의미한다. 또한 pH 값을 결정할 수 없는 비수성 환경에서 양이온화 가능한 화합물, 기 또는 원자는 높은 수소 이온 농도에서 양전하를 띠고 수소 이온의 낮은 농도 또는 활성에서는 전하를 띠지 않는다. 이는 양이온화 또는 다중양이온화 가능한 화합물의 개별 특성, 특히 pH 또는 수소 이온 농도가 하전되거나 하전되지 않은 각각의 양이온화 가능한 기 또는 원자의 pKa에 의존한다. 희석된 수성 환경에서, 양전하를 갖는 양이온화 가능한 화합물, 기 또는 원자의 분율은 당업자에게 잘 알려진 소위 Henderson-Hasselbalch 방정식을 사용하여 추정될 수 있다. 예를 들어, 화합물 또는 모이어티가 양이온화될 수 있는 경우, 약 1 내지 9, 바람직하게는 4 내지 9, 5 내지 8 또는 심지어 6 내지 8의 pH 값에서 양으로 하전되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게 9 이하, 8 이하, 7 이하의 pH 값에서, 가장 바람직하게는 생리학적 pH 값, 예를 들어 약 7.3 내지 7.4, 즉 생리학적 조건하, 특히 생체내 세포의 생리학적 염 조건하에서 양으로 하전되는 것이 바람직하다. 구현예에서, 양이온화 가능한 화합물 또는 모이어티는 생리학적 pH 값, 예를 들어 약 7.0-7.4에서 주로 중성인 것이 바람직하지만, 더 낮은 pH 값에서 양전하를 띠게 되는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 양이온화 가능한 화합물 또는 모이어티에 대한 바람직한 pKa의 범위는 약 5 내지 약 7이다.
으로부터 유래된 (Derived from): 핵산의 맥락에서 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "로부터 유래된", 즉 (다른) 핵산 "으로부터 유래된" 핵산은 (다른) 핵산에서 유래된 핵산을 의미하고, 유래된 핵산과 예를 들어, 적어도 약 70%, 80, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 약 99% 서열 상동성을 공유한다. 당업자는 서열 동일성이 일반적으로 동일한 유형의 핵산, 즉 DNA 서열 또는 RNA 서열에 대해 계산된다는 것을 알고 있다. 따라서, DNA가 RNA로부터 "유래"되거나 RNA가 DNA로부터 "유래"되는 경우, 첫 번째 단계에서 RNA 서열이 상응하는 DNA 서열로 전환되거나 (특히 서열 전체에 걸쳐 U를 T로 대체함으로써) 또는, 그 반대로, DNA 서열은 상응하는 RNA 서열로 변환된다(특히 서열 전체에 걸쳐 T를 U로 대체함으로써)는 것으로 이해된다. 그 후, DNA 서열의 서열 동일성 또는 RNA 서열의 서열 동일성이 결정된다. 바람직하게, 핵산"으로부터 유래된" 핵산은 또한 그것이 유래된 핵산과 비교하여 변형된 것, 예를 들어 RNA 안정성을 더욱 증가시키기 위해 및/또는 단백질 생산을 연장 및/또는 증가시키기 위해 변형된 핵산을 의미한다. 아미노산 서열의 맥락에서, "로부터 유래된"이라는 용어는 (또 다른) 아미노산 서열로부터 유래된 서열이 아미노산 서열이 예를 들어, 적어도 약 70%, 80, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 약 99% 유래된 아미노산 서열과 서열 동일성을 공유한다는 것을 의미한다.
CRISPR-연관 단백질 (CRISPR-associated protein): 용어 "CRISPR-연관 단백질" 또는 "CRISPR-연관 엔도뉴클레아제"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이다. "CRISPR 관련 단백질"이라는 용어는 외부 DNA 요소에 대해 적응 면역을 부여하기 위해 원핵생물에 의해 사용되는 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템의 일부 (및 이들의 상동체, 변이체, 단편, 또는 유도체)인 RNA-유도 엔도뉴클레아제를 나타낸다. CRISPR-연관 단백질은 Cas9, Cpf1(Cas12), C2c1, C2c3, C2c2, Cas13, CasX 및 CasY를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 용어 "CRISPR-연관 단백질"은 야생형 단백질뿐만 아니라 이의 상동체, 변이체, 단편 및 유도체를 포함한다. 따라서 Cas9, Cpf1(Cas12), C2c1, C2c3 및 C2c2, Cas13, CasX 및 CasY를 코딩하는 인공 핵산 분자를 언급할 때 상기 인공 핵산 분자는 각각의 야생형 단백질, 또는 그의 상동체, 변이체, 단편 및 유도체를 코딩할 수 있다. Cas9 및 Cas12(Cpf1) 외에도 Cas13, CasX 및 CasY를 포함하여 본 발명의 맥락에서 유전 공학에 적합한 여러 다른 CRISPR 관련 단백질이 존재한다. 본 발명의 맥락에서, CRISPR-연관 단백질은 본 발명의 조합물 또는 조성물의 적어도 하나의 치료 RNA에 의해 제공될 수 있다.
단편 (Fragment): 핵산 서열 또는 아미노산(aa) 서열의 맥락에서 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "단편"은 전형적으로 예를 들어 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 전장 서열의 더 짧은 부분일 수 있다. 단편은 일반적으로 전장 서열 내에서 대응 스트레치와 동일한 시퀀스로 이루어진다. 단백질 또는 펩티드와 관련하여 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "단편"은, 일반적으로, 본 명세서에 정의된 바와 같은 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함하며, 이는 그의 아미노산 서열(또는 그의 코딩된 핵산 분자)과 관련하여 원래의 (천연) 단백질의 아미노산 (또는 이의 암호화된 핵산 분자) 과 비교하여 N-말단 및/또는 C-말단이 잘린 서열을 포함한다. 따라서 이러한 절단은 aa 수준에서 또는 이에 따라 핵산 수준에서 발생할 수 있다. 본원에 정의된 바와 같은 단편에 대한 서열 상동성은 그러므로 바람직하게는 본원에 정의된 전체 단백질 또는 펩티드를 또는 그러한 단백질 또는 펩티드의 전체 (코딩) 핵산 분자를 지칭할 수 있다. 항원성 단백질 또는 펩티드의 단편은 이러한 단백질 또는 펩티드의 적어도 하나의 에피토프를 포함할 수 있다. 또한, 세포외 도메인, 세포내 도메인 또는 막횡단 도메인과 같은 단백질의 도메인 및 단백질의 단축 또는 절단된 버전은 단백질의 단편을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
이종성 (Heterologous): 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 맥락에서 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "이종성" 또는 "이종성 서열"은 서열(예를 들어, DNA, RNA, 아미노산)이 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 다른 유전자, 다른 대립유전자, 다른 종으로부터 유래된 서열을 지칭하는 것으로 의도된다. 2개의 서열이 동일한 유전자 또는 동일한 대립유전자에서 유래할 수 없는 경우 일반적으로 "이종성"인 것으로 이해된다. 즉, 이종 서열이 동일한 유기체로부터 유도될 수 있지만, 이들은 자연적으로(자연에서) 예를 들어, 동일한 RNA 또는 단백질에서와 같이, 동일한 핵산 분자에서 발생하지 않는다.
(서열의) 상동성 (Identity (of a sequence)): 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 관련하여 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "상동성"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 두 서열이 동일한 비율을 나타내기 위한 것으로 의도된다. 두 서열이 동일한 비율을 결정하려면, 예를 들어 본원에 정의된 핵산 서열 또는 아미노산 (aa) 서열, 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 핵산 서열에 의해 코딩되는 aa 서열 또는 aa 서열 그 자체, 상기 서열들은 연속적으로 서로 비교하기 위해 서열을 정렬할 수 있다. 그러므로 예를 들어 제1 서열의 위치는 제2 서열의 대응되는 위치와 비교될 수 있다. 첫 번째 서열에서 위치가 두 번째 서열의 위치에서와 같이 동일한 잔기에 의해 점유되는 경우, 두 서열은 이 위치에서 동일하다. 그렇지 않은 경우, 이 위치에서 서열이 다르다. 첫 번째 서열과 비교하여 두 번째 서열에서 삽입이 발생하는 경우, 간격은 추가 정렬을 허용하기 위해 첫 번째 서열에 삽입될 수 있다. 첫 번째 서열과 비교하여 두 번째 서열에서 결실이 발생하면, 간격은 추가 정렬을 허용하기 위해 두 번째 서열에 삽입될 수 있다. 두 서열이 동일한 비율은 동일한 위치의 수를 하나의 서열에서만 차지하는 위치들을 포함하는 총 위치 수로 나눈 함수이다. 두 서열이 동일한 비율은 예를 들어, BLAST 프로그램에 통합된 알고리즘같은, 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
면역 반응 (Immune response): 용어 "면역 반응"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 특정 항원에 대한 적응 면역계의 특이적 반응(소위 특이적 또는 적응 면역 반응) 또는 선천성 면역계의 비특이적 반응(소위 비특이적 또는 선천성 면역 반응), 또는 이들의 조합을 지칭하기 위한 것이다.
면역계 (Immune system): 용어 "면역계"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 유기체를 감염으로부터 보호할 수 있는 유기체의 시스템을 지칭하기 위한 것이다. 병원체가 유기체의 물리적 장벽을 통과하는 데 성공하여 이 유기체에 들어가면 선천 면역계는 즉각적이지만 비특이적인 반응을 제공한다. 병원체가 이 선천적 반응을 회피하면 척추동물은 두 번째 보호층인 적응 면역 체계를 갖게된다. 여기에서 면역 체계는 병원체에 대한 인식을 개선하기 위해 감염 중 반응을 조정한다. 이 개선된 반응은 병원체가 제거된 후에도 면역학적 기억의 형태로 유지되며 적응 면역 체계가 이 병원체와 마주칠 때마다 더 빠르고 더 강력한 공격을 할 수 있도록 한다. 이에 따르면 면역계는 선천과 후천면역계로 나뉜다. 이 두 부분 각각은 일반적으로 소위 체액 (humoral) 및 세포 (cellular) 구성 요소를 포함한다.
치료: 용어 "치료"는 일반적으로 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근 방식을 말하며, 여기에는 증상의 완화 또는 질병 진행의 지연 또는 개선이 포함될 수 있다.
메신저 RNA (Messenger RNA (mRNA)): "메신저 RNA"(mRNA)라는 용어는 한 유형의 RNA 분자를 의미한다. 생체 내에서 DNA의 전사는 일반적으로 mRNA로 약칭되는 소위 메신저 RNA로 처리되어야 하는 소위 미성숙 RNA를 초래한다. 전형적으로, mRNA는 5'-캡, 5'-UTR, 오픈 리딩 프레임/코딩 서열, 3'-UTR 및 폴리(A)를 포함한다.
뉴클레오시드 (Nucleoside): 용어 "뉴클레오시드"는 일반적으로 당, 일반적으로 리보스 또는 데옥시리보스와 퓨린 또는 피리미딘 염기로 구성된 화합물을 나타낸다.
뉴클레오티드 (Nucleotide): 용어 "뉴클레오티드"는 일반적으로 당에 부착된 포스페이트 기를 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다.
핵산 서열, RNA 서열 (Nucleic acid sequence, RNA sequence): 용어 "핵산 서열" 또는 "RNA 서열"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 각각의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 연속의 특정 순서 및 개별 순서를 나타내기 위한 것이다.
(서열의) 변이체 (Variant (of a sequence)): 핵산 서열과 관련해 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "변이체"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 다른 핵산 서열로부터 유래된 핵산 서열의 변이체를 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 핵산 서열의 변이체는 변이체가 유래된 핵산 서열과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 삽입, 추가 및/또는 치환을 나타낼 수 있다. 핵산 서열의 변이체는 변이체가 유래된 핵산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 동일할 수 있다. 변이체는 바람직하게는 변이체가 유래된 서열의 기능의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상을 보유했다는 점에서 기능적 변이체이다. 핵산 서열의 "변이체"는 이러한 핵산 서열의 적어도 10, 20, 30, 50, 75 또는 100개 뉴클레오티드의 스트레치에 걸쳐 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 뉴클레오티드 상동성을 가질 수 있다.
단백질 또는 펩티드와 관련하여 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "변이체"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 하나 이상의 치환, 삽입 및/또는 결실된 아미노산(들)과 같은 하나 이상의 돌연변이(들)에서 원래 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드 변이체를 지칭하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 이들 단편 및/또는 변이체는 전장 천연 단백질과 비교하여 동일한 생물학적 기능 또는 특이적 활성, 예를 들어, 그것의 특정 항원 특성을 갖는다. 본원에 정의된 단백질 또는 펩티드의 "변이체"는 천연, 즉 돌연변이되지 않은 생리학적 서열과 비교하여 보존적 아미노산 치환(들)을 포함할 수 있다. 단백질 또는 펩티드의 "변이체"는 이러한 단백질 또는 펩티드의 적어도 10, 20, 30, 50, 75 또는 100개 아미노산의 스트레치에 걸쳐 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 아미노산 상동성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 단백질의 변이체는 단백질의 기능적 변이체를 포함하고, 이는 변이체가 동일한 효과 또는 기능을 발휘하거나 또는 유래된 단백질로서 효과 또는 기능의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 발휘하는 것을 의미한다.
발명에 대한 간략한 설명
본 발명은 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제를 포함하는 성분의 병용-투여(co-administration)가, 예를 들어 상응하는 치료 RNA 단독 투여와 비교하여 치료 RNA에 의해 유도되는 감소된 (선천적) 면역 자극을 초래한다는 발견에 기초한다. 놀랍게도, 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체 중 적어도 하나의 길항제를 포함하는 성분의 병용-투여가 바람직하게 치료 RNA에 의해 코딩되는 펩티드 또는 단백질의 발현을 증가 및/또는 연장한다.
실시예 섹션에 요약된 바와 같이, 본 발명자들은 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드의 첨가가 병용-투여된 면역 자극 RNA 서열("RNA애쥬반트")에 대한 면역억제 효과를 갖는다는 것을 발견하였다(예를 들어, 도 1A 참조). 또한, 본 발명자들은 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드는 RNA 감지 수용체에 의해 일반적으로 유발되는 원치 않는 부작용인 RNA의 면역자극을 효율적으로 길항했음을 보여주었다(예: 실시예 2 (시험관 내), 또는 실시예 3 (생체 내) 참조). 여기에서 사용된 올리고뉴클레오티드는 선천성 면역 반응에 관여하는 RNA 감지 패턴 인식 수용체, 톨-유사 수용체 (TLR)를 길항하는 것으로 설명되어 있다 (Schmitt et al. 2017. RNA 23:1344-135 참조). 본 발명은 적어도 하나의 RNA 감지 수용체의 적어도 하나의 길항제 및 적어도 하나의 치료 RNA를 포함하는 조합물 또는 조성물이 상기 적어도 하나의 치료 RNA의 면역자극 특성을 감소시킬 수 있다는 것을 보여주는 발면에 기초한다. 예기치 않게 길항 올리고뉴클레오티드의 첨가는 또한 병용-투여된 치료 RNA의 코딩된 단백질의 발현을 증가 및/또는 연장시켰으며, 이는 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 길항제(예를 들어, TLR7 길항제) 및 치료 RNA(예를 들어 mRNA)을 포함하는 조합물 또는 조성물이 대부분의 RNA 기반 약제에서 가장 중요한 특징인 면역 자극 감소 및 단백질 발현 증가 및/또는 연장을 초래한다.
제1 측면에서, 본 발명은 (i) 적어도 하나의 치료 RNA를 포함하는 적어도 하나의 제1 성분 및 (ii) 적어도 하나의 RNA의 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제를 포함하는 제2 성분을 포함하는 조합물에 관한 것이다.
제2 측면에서, 본 발명은 (i) 적어도 하나의 치료 RNA, 바람직하게 제1 측면에 기재된 바와 같은, 적어도 하나의 치료 RNA; (ii) 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제, 바람직하게 제1 측면에 기재된 바와 같은, 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제, 및 선택적으로 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조합물을 포함하거나 이로 이루어진 약학적 조성물에 관한 것이다.
제3 측면에서, 본 발명은 제1 측면의 조합물의 제1 및 제2 성분을 포함하고/하거나 제2 측면의 조성물을 포함하는 키트 또는 부품의 키트(kit of parts)에 관한 것이다.
제4 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 제1 측면의 조합물, 제2 측면의 조성물, 또는 제3 측면의 키트 또는 부품의 키트에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 만성적 의학적 치료에서 의약 또는 백신으로서 사용하기 위한 제1 측면의 조합물, 제2 측면의 조성물, 또는 제3 측면의 키트 또는 부품의 키트에 관한 것이다. 다른 측면은 질병, 장애 또는 상태를 치료하거나 예방하는 방법, 치료 RNA의 (선천적) 면역 자극을 감소시키는 방법, 치료 RNA 조성물의 반응원성을 감소시키는 방법, 및 (코딩) 치료 RNA에 의해 암호화된 펩티드 또는 단백질의 발현을 증가 및/또는 연장시키는 방법에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 출원은 본 출원 설명의 일부인 전자 형식의 시퀀스 목록과 함께 제출된다(WIPO 표준 ST.25). 본 출원과 함께 제출된 서열 목록의 전자 형식에 포함된 정보는 그 전체가 참조로 여기에 포함된다.많은 시퀀스의 경우 시퀀스 목록은 추가 세부 정보도 제공하며, 예를 들어, 특정 구조적 특징, 서열 변형, GenBank 식별자 또는 추가 세부 정보와 관련하여. 특히, 이러한 정보는 WIPO 표준 ST.25 시퀀스 목록에서 숫자 식별자 <223>으로 제공된다. 따라서, 상기 숫자 식별자 <223> 아래에 제공된 정보는 여기에 그 전체가 명시적으로 포함되며 근본적인 발명의 설명의 필수적인 부분으로 이해되어야 한다.
조합물 (Combination)
제1 측면에서, 본 발명은 그 중에서도 치료 RNA를 포함하는 제1 성분 및 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 길항제를 포함하는 제2 성분을 포함하는 조합물에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, "조합물"이라는 용어는 바람직하게는 적어도 하나의 치료 RNA (여기서는 "제1 성분"이라 함) 및 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제 (여기서는 "제2 성분"이라 함)의 복합된 발생을 의미한다. 그러므로 상기 조합물은 이러한 모든 구성요소를 하나의 동일한 구성 또는 혼합물로 포함하는 하나의 구성으로 발생하거나 (다만 별도의 실체로서), 부품의 키트로 발생할 수 있으며, 여기서 서로 다른 구성요소는 이러한 부품의 키트의 다른 부분을 형성한다 (제3 측면에서 정의된 바와 같이). 따라서, 조합물의 제1 및 제2 성분의 투여는 하기에 추가로 개괄된 바와 같이 동일한 투여 부위 또는 다른 투여 부위에서 동시에 또는 시차를 두고 발생할 수 있다. 성분들은 복합 제형으로 함께 투여될 수 있으며 (제2 측면의 맥락에서 추가로 기재된 바와 같이), 또는 하기에 개괄된 바와 같이 상이한 개별 제형으로 (및 선택적으로 제형화 후에 조합되어) 제형화될 수 있다.
제1 측면에서, 상기 조합물은 (i) 적어도 하나의 치료 RNA를 포함하는 적어도 하나의 제1 성분; (ii) 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제를 포함하는 적어도 하나의 제2 성분을 포함한다.
하기에서는, 제2 성분의 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제의 유리한 실시양태 및 특징을 설명한다. 특히, 본 발명의 조합물 (제1 측면)의 맥락에서 기재된 상기 적어도 하나의 길항제의 모든 기재된 실시양태 및 특징은 마찬가지로 약학적 조성물(제2 측면)의 적어도 하나의 길항제, 또는 키트 또는 부품 키트(제3 측면), 또는 본원에 기재된 임의의 추가 측면(예: 의약적 용도, 치료 방법)에 적용될 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 "패턴 인식 수용체"(PRR)라는 용어는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 선천 면역계의 일부인 수용체를 지칭하기 위한 것으로 의도된다. 생식선으로 인코딩된 PRR은 병원체 관련 분자 패턴(PAMPs)이라고 하는 보존된 구조의 인식을 통해 미생물 특이적 분자(예: 박테리아 또는 바이러스 DNA 또는 RNA)의 존재를 감지하는 역할을 한다. 최근 증거에 따르면 PRR은 손상 관련 분자 패턴(DAMPs)이라고 하는 손상된 세포에서 방출된 내인성 분자를 인식하는 역할도 한다. 현재 4가지 다른 클래스의 PRR 패밀리가 확인되었다. 이 패밀리에는 톨 유사 수용체(TLR) 및 C형 렉틴 수용체(CLR)와 같은 막횡단 단백질과 레티노산 유도성 유전자(RIG)-I-유사 수용체(RLRs)와 NOD-유사 수용체(NLRs)와 같은 세포질 단백질이 포함된다. 위치에 따라 PRR은 막 결합 PRR과 세포질 PRR로 나눌 수 있으며 대식세포와 DC뿐만 아니라 다양한 비전문 면역 세포에서도 발현된다(Takeuchi and Akira 2010. Pattern Recognition Receptors and Inflammation, Cell, Volume 140, ISSUE 6, P805-820).
본 발명의 맥락에서 전형적인 패턴 인식 수용체"(PRR)는 Toll-유사 수용체, NOD-유사 수용체, RIG-I 유사 수용체, PKR, OAS1, IFIT1 및 IFIT5이다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 비특이적(또는 특이적이지 않은)면역 시스템으로도 알려진 용어 "선천적 면역 시스템"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어, 일반적으로 비특이적 방식으로 다른 유기체에 의한 감염으로부터 숙주를 방어하는 세포 및 메커니즘을 포함하는 시스템을 의미하는 것을 내포한다. 이것은 선천적 시스템의 세포가 일반적인 방식으로 병원체를 인식하고 반응할 수 있지만 적응 면역 시스템과 달리 숙주에 오래 지속되거나 보호적인 면역을 부여하지 않는다는 것을 의미한다. 선천성 면역 시스템은 예를 들어 "패턴 인식 수용체"(PRR)의 리간드(예: PAMP) 또는 리포폴리사카라이드, TNF-알파, CD40 리간드, 또는 사이토카인, 모노카인, 림포카인, 인터류킨, 또는 케모카인, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-베타, TNF-알파, 성장 인자, 및 hGH, 인간 톨-유사 수용체 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10의 리간드, 쥐 톨-유사 수용체 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 또는TLR13의 리간드, NOD-유사 수용체의 리간드, RIG-I 유사 수용체의 리간드, 면역자극 핵산, 면역자극 RNA(isRNA), CpG-DNA, 항균제, 항바이러스제, PKR 및 OAS1의 리간드(예: 긴 이중 가닥 RNA) 또는 IFIT1 및 IFIT5의 리간드(5'ppp RNA)와 같은 기타 보조 물질에 의해 활성화될 수 있다.
일반적으로 선천적 면역계의 반응(예: RNA 감지 후)에는 사이토카인이라고 하는 특수 화학적 매개체를 비롯한 화학적 요인의 생성; 보체 캐스케이드의 활성화; 특별한 백혈구에 의한 장기, 조직, 혈액 및 림프액에 존재하는 이물질의 식별 및 제거; 적응 면역 체계의 활성화; 및/또는 감염원에 대한 물리적 및 화학적 장벽으로 작용을 통해 감염 부위로 면역 세포를 모집하는 것이 포함된다. 전형적으로, 단백질 합성은 또한 선천 면역 반응 동안 감소된다. 염증 반응은 종양 괴사 인자(TNF), 인터루킨(IL)-1 및 IL-6과 같은 전염증성 사이토카인에 의해 조정된다. 이 사이토카인은 염증 조직의 세포 사멸을 조절하고, 혈관 내피 투과성을 수정하고, 혈액 세포를 염증 조직으로 모집하고, 급성기 단백질의 생산을 유도하는 다면 발현 단백질 (pleiotropic proteins)이다.
PRR은 다양한 병원체 관련 분자 패턴(PAMPs)에 의해 활성화될 수 있으며, 예를 들어 리포프로테인, 탄수화물, 리포폴리사카라이드, 및 다양한 유형의 핵산 (DNA, RNA, dsRNA, 캡핑되지 않은 RNA 또는 5' ppp RNA)에 이르는 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 원생동물에서 파생된 PAMPs가 있다. PPR은 세포의 다른 구획에 존재할 수 있다(예: 엔도솜의 막에 위치하거나 세포질에 위치). PAMP를 감지하면 PRR은 특히 예를 들어 사이토카인, 케모카인의 발현으로 이어지는 신호 캐스케이드를 촉발한다. 예를 들어, 톨 유사 수용체 3(TLR-3)은 일반적으로 긴 이중 가닥 RNA(>40 bp)를 감지하며 특정 세포 유형의 표면에서도 발현된다. 인간 면역계에서 TLR7의 발현은 일반적으로 B 세포 및 PDC로 제한되며, TLR8은 골수성 면역 세포에서 우선적으로 발현된다. 결과적으로, TLR7 리간드는 B 세포 활성화 및 형질세포양 수지상 세포(PDC)에서 다량의 IFN-알파 생성을 유도하는 반면, TLR8은 골수성 면역 세포에서 다량의 IL-12p70 분비를 유도한다. TLR8은 ssRNA를 선택적으로 검출하는 반면, TLR7은 주로 dsRNA의 짧은 스트레치(stretche)를 검출하지만 특정 ssRNA 올리고뉴클레오티드도 수용할 수 있다는 것이 당업계에서 입증되었다. TLR9 수용체는 주로 인간 B 세포 및 형질세포양 수지상 세포에서 발현되며 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는 단일 가닥 DNA를 검출한다. 사이토카인 유도에 추가로, 예를 들어, PKR 및 OAS1와 같은, 선천성 면역계의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 일부는 작용제 (예: dsRNA, 5’ppp RNA)의 결합 시 단백질 번역을 억제할 수 있다. 예를 들어, 긴 이중 가닥 RNA의 결합은 PKR을 활성화하여 eIF2a를 인산화하여 mRNA 분자의 번역을 억제하도록 교시된다. IFIT1 및 IFIT5는 5' ppp RNA에 결합하여 eIF2a의 차단을 유도하여 mRNA 분자의 번역을 억제하도록 교시된다(reviewed in Hartmann, G. "Nucleic acid immunity." Advances in immunology. Vol. 133. Academic Press, 2017. 121-169).
따라서, 본 발명의 맥락에서, 본 명세서에 사용된 용어 "RNA 감지 패턴 인식 수용체"는 RNA를 감지할 수 있는 PRR의 부류를 지칭한다. 이러한 맥락에서 "감지"는 RNA에 결합하고 결과적으로 다운스트림 신호 전달 캐스케이드(예: 사이토카인 유도 또는 번역 억제)를 촉발하는 수용체의 능력으로 이해된다.
따라서, "적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 길항제"라는 용어는 본 발명의 치료 RNA에 의해 유도된 PRRs-매개 면역 반응을 억제 및/또는 저지할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 또한, 이러한 길항제는 작용제(예: 면역 자극 RNA 종)의 효과(예: PRR 매개 면역 반응)를 약화시킬 수 있다.
따라서, 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체는 바람직하게 RNA 작용제의 결합 시 바람직하게 사이토카인을 유도한다. 이러한 RNA 작용제는 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 RNA, 또는 5' 트리포스페이트 RNA(5' ppp RNA)일 수 있다.
대안으로 또는 추가로, 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체는 RNA 작용제의 결합 시 번역을 억제할 수 있다. 이러한 RNA 작용제는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 5' 트리포스페이트 RNA(5' ppp RNA)일 수 있다.
유리하게는, 제2 성분의 적어도 하나의 길항제는 RNA 작용제의 결합 시 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 사이토카인 유도를 감소시키고/시키거나 RNA 작용제의 결합 시 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체에 의해 번역 억제를 감소시킨다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA 및 제2 성분의 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제는 제2 성분의 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제와 조합없이 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA의 투여와 비교해 감소된 선청성 면역 반응을 초래한다.
따라서, 세포, 조직 또는 유기체에 대한 조합물의 투여(즉, 제1 및 제2 성분의 투여)는 상응하는 제1 성분만의 투여와 비교하여 감소된 (선천성) 면역 자극을 초래한다.
추가 실시양태에서, 세포, 조직 또는 유기체에 대한 조합물의 투여 (즉, 제1 및 제2 성분의 투여)는 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 본원에 정의된 바와 같음)를 포함하고 동일한 RNA 서열을 갖는 대조군 RNA의 투여와 비교하여 본질적으로 동일하거나 적어도 필적하는 (선천성) 면역 자극을 초래한다.
위에서 설명한 선천성 면역 반응의 유도 또는 활성화 또는 자극은 일반적으로 사이토카인의 유도를 측정하여 결정된다.
바람직하게는, 감소된 선천 면역 자극은 바람직하게는 란테스(Rantes), MIP-1 알파, MIP-1 베타, McP1, TNF알파, IFN감마, IFN알파, IFN베타, IL-12, IL-6, 또는 IL-8로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 수준을 감소하는 것을 특징으로 한다.
용어 "적어도 하나의 사이토카인의 감소된 수준"은 본 발명에 따른 조합물의 투여가 대조군(예를 들어, 제1 성분만)과 비교하여 사이토카인의 유도를 특정 백분율로 감소시키는 것으로 이해되어야 한다.
따라서, 본 발명의 맥락에서 감소된 선천성 면역 자극은 바람직하게는 바람직하게는 란테스(Rantes), MIP-1 알파, MIP-1 베타, McP1, TNF알파, IFN감마, IFN알파, IFN베타, IL-12, IL-6, 또는 IL-8로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인의 감소된 수준을 특징으로 하며, 여기서 적어도 하나의 사이토카인의 감소된 수준은 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 의 감소이다. 바람직하게, 적어도 하나의 사이토카인의 감소된 수준은 적어도 30%의 감소이다.
특정 세포/장기/조직에서 치료적 RNA에 의해 (선천성) 면역 자극 (즉, 란테스(Rantes), MIP-1 알파, MIP-1 베타, McP1, TNF알파, IFN감마, IFN알파, IFN베타, IL-12, IL-6, 또는 IL-8의 유도)을 평가하는 방법은 업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 전형적으로, 제2 성분과 조합된 치료 RNA의 (선천성) 면역 자극은 치료 RNA 단독으로 (또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 대조군 RNA와), 즉, (추가적인) 제2 성분의 투여없이, (선천성) 면역 자극을 비교한다. 유효한 비교를 위해서는 동일한 조건(예: 동일한 세포주, 동일한 유기체, 동일한 적용 경로, 동일한 검출 방법, 동일한 양의 치료 RNA, 동일한 RNA 서열 등)을 사용해야 한다(가능한 경우). 당업자는 본 발명의 조합과 각각의 대조군 RNA(치료 RNA 단독 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하고 동일한 RNA 서열을 갖는 대조군 RNA)의 비교를 수행하는 방법을 이해한다.
본 발명의 맥락에서, 사이토카인의 유도는 세포, 조직 또는 유기체, 바람직하게는 hPBMC, Hela 세포 또는 HEK 세포로의 조합물의 투여에 의해 측정된다. 이러한 맥락에서 hPBMC가 바람직하다. hPBMC, Hela 세포 또는 HEK 세포에 조합물(또는 상응하는 대조군)을 투여하면 사이토카인 수준을 측정하기 위한 어세이가 수행된다. 배양 배지 또는 상등액으로 분비되는 사이토카인은 비드 기반 사이토카인 어세이 (예: 사이토메트릭 비드 어레이 (CBA)), ELISA 및 웨스턴 블롯과 같은 기술로 정량화할 수 있다
바람직하게는, 비드 기반 사이토카인 어세이, 가장 바람직하게는 사이토메트릭 비드 어레이 (CBA)가 조합물 (및 이들의 상응하는 대조군)의 투여 후 세포에서 사이토카인의 유도를 측정하기 위해 수행된다.
CBA는 동일한 샘플에서 여러 사이토카인을 정량화할 수 있다. CBA 시스템은 유세포 분석 및 항체 코팅 비드가 제공하는 광범위한 형광 검출을 사용하여 사이토카인을 포착한다. 어레이의 각 비드에는 고유한 형광 강도가 있어 비드를 동시에 혼합하고 획득할 수 있다. 이러한 맥락에서 적절한 CBA 분석은 Reynolds 등의 2012년 BD Bioscience 애플리케이션 노트,“Quantification of Cytokines Using BD™ Cy-tometric Bead Array on the BD™ FACSVerse System and Analysis in FCAP Array™ Software”에 기술되어 있다. 사이토카인 수준을 결정하기 위한 예시적인 CBA 어레이는 본 발명의 실시예 섹션에 기술되어 있다.
다양한 구현예에서, 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체는 엔도솜 수용체 또는 세포질 수용체이다. 바람직한 구현예에서 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체는 엔도솜 수용체이다. 예시적인 엔도솜 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 비제한적 목록은 TLR3, TLR7, 또는 TLR8을 포함한다. 이러한 맥락에서, "엔도솜(endosomal)"은 엔도솜에 국한되거나 엔도솜 막에 국한된 것으로 이해되어야 한다. 예시적인 세포질 RNA감지 패턴 인식 수용체의 비 제한적인 목록은 RIG1, MDA5, NLRP3, 또는 NOD2을 포함한다.
다양한 구현예에서, 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체는 단일 가닥 RNA(sRNA)에 대한 수용체 및/또는 이중 가닥 RNA(dsRNA)에 대한 수용체이다. dsRNA에 대한 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 비제한적인 목록에는 TLR3, RIG1, MDA5, NLRP3, 또는 NOD2을 포함한다. ssRNA에 대한 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 비제한적인 목록에는 TRL7, TLR8, RIG1, NLRP3, 또는 NOD2을 포함한다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 제2 성분은 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체는 톨-유사 수용체 (TLR), 및/또는 레티노산-유도성 유전자-I-유사 수용체 (RLR), 및/또는 NOD-유사 수용체 및/또는 PKR, OAS, SAMHD1, ADAR1, IFIT1 및/또는 IFIT5로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 제2 성분은 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체는PKR, OAS, SAMHD1, ADAR1, IFIT1 및/또는 IFIT5로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 톨-유사 수용체는 TLR3, TLR7, TLR8 및/또는 TLR9로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 톨-유사 수용체는 TLR7 및/또는 TLR8로부터 선택된다. 따라서 본 발명의 맥락에서, 바람직하게 "적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제"는 TLR3, TLR7, TLR8 및/또는 TLR9, 바람직하게 TLR7 및/또는 TLR8로부터 선택된 톨-유사 수용체의 길항제이다.
바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 레티노산-유도성 유전자-I-유사 수용체(RLR)는 RIG-1, MDA5, LGP2, cGAS, AIM2, NLRP3, 및/또는 NOD2로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시양태에서, RLR은 RIG-1 및/또는 MDA5이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, "적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제"는 RIG-1, MDA5, LGP2, cGAS, AIM2, NLRP3, 및/또는 NOD2, 바람직하게 RIG-1, MDA5로부터 선택된 레티노산-유도성 유전자-I-유사 수용체(RLR)이다.
본 발명의 맥락에서, 본원에 정의된 제2 성분의 적어도 하나의 길항제는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체(analogue), 핵산, 펩티드, 단백질, 항체, 소분자, 지질, 또는 이들 중 임의의 것의 단편, 변이체 또는 유도체로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 길항제는 치환된 퀴놀린 화합물, 치환된 퀴나졸 화합물, 삼환식 TLR 억제제(예를 들어, 미안세린, 데시프라민, 시클로벤자프린, 이미프리민, 케토티펜, 및 아미트립틸린), 백시니아 바이러스 A52R 단백질 (US 20050244430), 폴리믹신-B(LPS-생체 활성의 특정 억제제), BX795, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, CU-CPT8m, CU-CPT9a, CU-CPT9b, CU-CPT9c, CU-CPT9d, CU-CPT9e, CU-CPT9f, CLI-095, RDP58, ST2825, ML120B, PHA-408, 인슐린 (임상시험 NCT01 151605), CpG-유도 면역 반응을 억제하는 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), G가 풍부한 ODN, TTAGGG 모티브를 가진 ODN을 포함하는 TLR 길항제이다. 일부 실시양태에서, TLR 길항제는 특허 또는 특허 출원 US20050119273, WO2014052931, WO2014108529, US20140094504, US20120083473, US8729088 및 US20090215908에 기술된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, TLR 억제제는 ST2 항체; sST2-Fc (기능성 뮤린 가용성 ST2-인간 IgG1 Fc 융합 단백질; Biochemical and Biophysical Research Communications, 29 December 2006, vol. 351 , no. 4, 940-946 참조); CRX-526 (코릭사(Corixa)); 지질 IVA; RSLA (로도박터 스페로이데스 지질 A); E5531 ((6-0-{2-데옥시-6-0-메틸-4-O-포스포노-3-0-[(R)-3-Z-도덱-5-엔도일옥시데클]-2-[3-옥소-테트라데카노일아미노]- -O-포스포노-α-D-글루코피라노오스 사나트륨염); E5564 (α-D-글루코피라노오스,3-0-데실-2-데옥시-6-O-[2-데옥시-3-0-[(3R)-3-메톡시데실]-6-O-메틸-2-[[(11Z)-1-옥소-11-옥타데세닐]아미노]-4-O-포스포노- -D-글루코피라노실]-2-[(1,3 - 디옥소테트라데실)아미노]-1-(인산이수소), 사나트륨 염); 화합물 4a(히드로신나모일-L-발릴 피롤리딘; PNAS, June 24, 2003, vol. 100, no. 13, 7971- 7976 참조); CPG 52364 (콜레이 제약 그룹); LY294002(2-(4-모르폴리닐)-8-페닐-4H-1-벤조피란-4-온); PD98059(2-(2-아미노-3-메톡시페닐)-4H-1-벤조피란-4-온); 클로로퀸; (TLR7/8의 길항제와 같은 프로필렌 스페이서를 갖는 C2 이량체(표 A 참조) 및 면역 조절 올리고뉴클레오티드 (미국 특허 출원 공개 번호 2008/0089883 참조)를 포함한다. 추가의 적합한 TLR 길항제는 Patinote et al.(Patinote et al, Agonist and antagonist ligands of toll-like receptors 7 and 8: Ingenious tools for therapeutic purposes, Eur J Med Chem. 2020 May 1; 193: 112238.)에서 기술된다.
따라서, 본 발명의 맥락에서 길항제로 사용될 수 있는 적절한 화학적 화합물, 예를 들어, 작은 분자 화합물은, 클로로퀸, CU-CPT9a, 히드록시클로로퀸, 퀴나크린, 모네신, 바필로마이신 Al, 워트만닌, β-아미노아르테에테르 말레에이트, (+)-모르피난, 9-아미노아크리딘, 4-아미노퀴놀린, 4-아미노퀴놀린즈(4-aminoquinolines), 7,8,9-10-테트라하이드로 6H-시클로헵타[b]퀴놀린-l 1- 일아민; 1-메틸-2,3-디히드로-1H-피롤로[2,3-b]퀴놀린-4-일아민; 1,6-디메틸-2,3-디히드로-1H-피롤로[2,3-b]퀴놀린-4-일아민; 6-브로모-1-메틸-2,3-디히드로-1H-피롤로[2,3-b]퀴놀린-4-일아민; 1-메틸-2,3,4,5-테트라히드로-1H-아제피노[2,3-b]퀴놀린-6-일아민; 3,3-디메틸-3,4-디히드로-아크리딘-9-일아민; 1-벤질-2,3-디히드로-1H-피롤로[2,3-b]퀴놀린-4-일아민; 6-메틸-1-페닐-2,3-디히드로-1H-피롤로[2,3-b]퀴놀린-4-일아민; N*2*,N*2*-디메틸-퀴놀린-2,4-디아민, 2,7-디메틸-디벤조[b,g][1,8]나프티리딘-11-일아민; 2,4-디메틸-벤조[b][1,8]나프티리딘-5-일아민; 7-플루오로-2,4-디메틸-벤조[b][1,8]나프티리딘-5-일아민; 1,2,3,4-테트라하이드로-아크리딘-9-일아민 타크린 하이드로클로리데하이드레이트; 2,3-디히드로-1H-시클로펜타[b]퀴놀린-9-일아민; 2,4,9-트리메틸-벤조[b][1,8]나프티리딘-5-일아민; 9-아미노-3,3-디메틸-1,2,3,4-테트라히드로-아크리딘-1-올 및 7-에톡시-N*3*-푸란-2-일메틸-아크리딘-3,9-디아민; 퀴나졸린, N,N-디메틸-N'-{2-[4-(4-메틸-피페라진-1-일)-페닐]-3,4-디히드로-퀴나졸린-4-일}-에탄-1,2 ,-디아민; N'-[6,7-디메톡시-2-(4-페닐-피페라진-1-일)-퀴나졸린-4-일]-N,N-디메틸-에탄-1,2-디아민; N'-[6,7-디메톡시-2-(4-메틸-피페라진-1-일)-퀴나졸린-4-일]-N,N-디메틸에탄-1,2-디아민; N,N-디메틸-N'-(2-페닐-퀴나졸린-4-일)-에탄-1,2-디아민; 디메틸-(2-{2-[4-(4-메틸-피페라진-1-일)-페닐]-퀴나졸린-4-일옥시}-에틸)-아민; N'-(2-바이페닐-4-일-퀴나졸린-4-일)-N,N-디메틸-에탄-1,2-디아민 및 디메틸-[2-(2-페닐-퀴나졸린-4-일옥시)- 에틸]-아민, 스타틴, 아토르바스타틴으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서 적합한 화학적 화합물, 예를 들어, 소분자 화합물은 클로로퀸 (C18H26ClN3), 항염증성을 갖는 항말라리아제, 잠재적인 화학 감작 및 방사선 감작 활성 또는 Toll-유사 수용체 8의 강력하고 선택적 억제제인 CU-CPT9a(C17H15NO2) (표 A 참조)로부터 선택될 수 있다. (Zhang, S. et al, 2018. Small-molecule inhibition of TLR8 through stabilization of its resting state. Nat Chem Biol, 14(1): 58-64 and Mohamed et al, effect of toll-like receptor 7 and 9 targeted therapy to prevent the development of hepatocellular carcinoma, Liver International (2015).
표 A: 본 발명의 바람직한 작은 분자 길항제들
Figure pct00001
바람직한 실시양태에서, 조합물의 제2 성분의 "적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제"는 핵산이다.
용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 핵산 성분을 포함하는, 바람직하게는 이루어진 분자를 지칭하도록 의도된다. 핵산 분자라는 용어는 바람직하게는 DNA 및 RNA 또는 이들의 혼합물을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드라는 용어와 동의어로 사용되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 핵산 또는 핵산 분자는 당/포스페이트-백본의 포스포디에스테르-결합에 의해 서로 공유결합적으로 연결된 뉴클레오티드 단량체(천연 및/또는 변형)를 포함하거나 이로 구성된 중합체이다. 적합한 변형 뉴클레오티드의 예는 LNA 또는 PNA 뉴클레오티드이다. 용어 "핵산"은 또한 본원에 정의된 바와 같은 염기-변형, 당-변형 또는 백본-변형된 DNA 또는 RNA 분자와 같은 변형된 핵산 분자를 포함한다. 용어 "핵산"은 또한 단일 가닥, 이중 가닥 및 분지형 핵산 분자를 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 조합물의 제2 성분의 "적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제"는 단일 가닥 핵산, 예를 들어 단일 가닥 RNA이다.
대안적 실시양태에서, 조합물의 제2 성분의 "적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제"는 이중 가닥 핵산, 예를 들어 이중 가닥 RNA이다.
바람직한 실시양태에서, 조합물의 제2 성분의 "적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제"는 DNA 뉴클레오티드, RNA 뉴클레오티드, PNA 뉴클레오티드 및/또는 LNA 뉴클레오티드, 또는 임의의 이들의 유사체 또는 유도체로부터 선택된 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진 핵산이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 조합물의 제2 성분의 "적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제"는 단일 가닥 핵산이며, 여기서 상기 핵산은 DNA 뉴클레오티드, RNA 뉴클레오티드, PNA 뉴클레오티드 및/또는 LNA 뉴클레오티드, 또는 임의의 이들의 유사체 또는 유도체로부터 선택된 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다.
특히 바람직한 실시양태에서, 조합물의 제2 성분의 "적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제"는 이중 가닥 핵산이며, 여기서 상기 핵산은 DNA 뉴클레오티드, RNA 뉴클레오티드, PNA 뉴클레오티드 및/또는 LNA 뉴클레오티드, 또는 임의의 이들의 유사체 또는 유도체로부터 선택된 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다.
본원에 사용된 용어 "LNA 뉴클레오티드"는 변형된 RNA 뉴클레오티드를 지칭한다. LNA 뉴클레오티드는 잠긴(locked) 핵산이다. LNA 뉴클레오티드의 리보스 모이어티는 2' 산소와 4' 탄소를 연결하는 추가 브릿지로 변형될 수 있다. 이 다리는 A형 이중체 (A-form duplexes)에서 종종 발견되는 3'-엔도(북쪽) 형태의 리보스를 잠근다. LNA 뉴클레오티드는 예를 들어 올리고뉴클레오티드에서 DNA 또는 RNA 잔기와 혼합될 수 있다. LNA 뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA와 혼성화한다. LNA 뉴클레오티드를 포함하는 올리고머는 화학적으로 합성되며 상업적으로 이용 가능하다. 잠긴 리보스 형태는 기본 스태킹 및 백본 사전 구성(pre-organization)을 향상시킨다.
본원에 사용된 용어 "PNA 뉴클레오티드"는 변형된 핵산을 지칭한다. DNA와 RNA에는 디옥시리보스와 리보스 당 백본이 있다. PNA의 백본은 반복되는 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로 구성되며 펩티드 결합으로 연결된다. 따라서, PNA는 펩티드처럼, 즉 N-말단에서 C-말단으로 그려진다. PNA는 더 높은 결합 강도를 나타낸다. PNA 올리고머는 또한 상보적 DNA에 대한 결합에서 더 큰 특이성을 나타내며, PNA/DNA 염기 불일치는 DNA/DNA 이중체에서 유사한 불일치보다 더 불안정하다. 이 결합 강도와 특이성은 PNA/RNA 이중체에도 적용된다. PNA는 뉴클레아제나 프로테아제에 의해 쉽게 인식되지 않으며 PNA도 넓은 pH 범위에서 안정적이다.
특정 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 혼성 RNA 핵산이고, 여기서 상기 혼성 RNA 핵산은 RNA 뉴클레오티드 및 추가로 적어도 하나의 DNA, LNA 또는 PNA 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 핵산은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 유도체를 포함한다.
용어 "유사체" 또는 "유도체"는 일반적으로 변형된 염기 및/또는 당을 갖는 임의의 퓨린 및/또는 피리미딘 뉴클레오티드 또는 뉴클레오사이드를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 변형된 염기는 구아닌, 시토신, 아데닌, 티민 또는 우라실이 아닌 염기이다. 변형된 당은 리보스 또는 2' 데옥시리보스가 아니고 올리고뉴클레오티드의 백본에서 사용할 수 있는 모든 당이다.
실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체는 백본 변형된 뉴클레오티드, 당, 변형된 뉴클레오티드 및/또는 염기 변형된 뉴클레오티드 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
본 발명의 맥락에서 백본 변형은 뉴클레오티드 백본의 포스페이트가 화학적으로 변형된 변형이다. 본 발명의 맥락에서 당 변형은 뉴클레오티드의 당의 화학적 변형이다. 본 발명의 맥락에서 염기 변형은 뉴클레오티드의 염기 모이어티의 화학적 변형이다.
실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 성분의 핵산 내로 혼입될 수 있는 뉴클레오티드 유사체/변형물은 바람직하게는 2-아미노-6-클로로퓨린리보사이드-5'-트리포스페이트, 2-아미노퓨린-리보사이드-5'-트리포스페이트; 2-아미노아데노신-5'-트리포스페이트, 2'-아미노-2'-데옥시시티딘-트리포스페이트, 2-티오시티딘-5'-트리포스페이트, 2-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 2'-플루오로티미딘-5'-트리포스페이트, 2 '-O-메틸-이노신-5'-트리포스페이트 4-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴시티딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴루리딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5'-트리포스페이트, 5- 브로모우리딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도시티딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도-2' -데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도우리딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸우리딘-5'-트리포스페이트, 5 -프로피닐-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-프로피닐-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 6-아자시티딘-5'-트리포스페이트, 6-아자우리딘-5'-트리포스페이트, 6-클로로퓨린리보사이드-5'-트리포스페이트, 7-데아자아데노신-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 8-아자아데노신-5'-트리포스페이트, 8-아지도아데노신-5'-트리포스페이트, 벤즈이미다졸-리보사이드-5'-트리포스페이트, N1-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, N1-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, N6-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, O6-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, 슈도우리딘-5'- 트리포스페이트, 또는 퓨로마이신-5'-트리포스페이트, 크산토신-5'-트리포스페이트로부터 선택된다. 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5'-트리포스페이트, 및 슈도우리딘- 5'-트리포스페이트, 피리딘-4-온 리보뉴클레오사이드, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈두우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시우리딘, 3- 메틸우리딘, 5-카복시메틸-우리딘, 1-카복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸- 4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2- 티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디히드로우리딘, 디히드로슈도우리딘, 2-티오-디히드로우리딘, 2-티오-디히드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈두우리딘, 및 4 -메톡시-2-티오-슈도우리딘, 5-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포르밀시티딘, N4-메틸시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로 슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 제불린, 5-아자-제불린, 5-메틸-제불린, 5-아자-2-티오-제불린, 2-티오-제불린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시- 슈도이소시티딘, 및 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6- 디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, N6-글리시닐카바모일아데노신, N6-트레오닐카바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 2-메톡시-아데닌, 메틸요이노신 와이부토신, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7- 메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8- 옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, 및 N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-아데노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-시티딘, 5'-O-(1-티오포스페이트)-구아노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)- 우리딘, 5'-O-(1-티오포스페이트)-슈도우리딘, 6-아자-시티딘, 2-티오-시티딘, 알파-티오-시티딘, 슈도-이소-시티딘, 5-아미노알릴-우리딘, 5-요오도-우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 5,6-디히드로우리딘, 알파-티오-우리딘, 4-티오-우리딘, 6-아자-우리딘, 5-히드록시-우리딘, 데옥시-티미딘, 5-메틸-우리딘, 피롤로-시티딘, 이노신, α-티오-구아노신, 6-메틸-구아노신, 5-메틸-시티딘, 8-옥소-구아노신, 7-데아자-구아노신, N1-메틸-아데노신, 2-아미노-6-클로로-퓨린, N6- 메틸-2-아미노-퓨린, 슈도-이소-시티딘, 6-클로로-퓨린, N6-메틸-아데노신, α-티오-아데노신, 8-아지도-아데노신, 7-데아자-아데노신으로 이루어진 염기-변형된 뉴클레오티드의 그룹으로부터 선택된 염기 변형을 위한 뉴클레오티드가 특히 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체는 박테리아 tRNA에서 발견되는 변형된 뉴클레오티드로부터 선택된다. 특히 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체는 1-메틸아데노신, 2-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, 2'-O-메틸아데노신, 2-메틸티오-N6-메틸아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, N6-트레오닐카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐카르바모일아데노신, N6-메틸-N6-트레오닐카르바모일아데노신, N6-히드록시노르발릴카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-히드록시노르발릴카르바모일아데노신, 이노신, 3-메틸시티, 2'-O-메틸시티딘, 2-티오시티딘, N4-아세틸시티딘, 리시딘, 1-메틸구아노신, 7-메틸구아노신, 2'-O-메틸구아노신, 퀴오신, 에폭시퀴오신, 7-시아노-7-데아자구아노신, 7-아미노메틸-7-데아자구아노신, 슈도우리딘, 디히드로우리딘, 5-메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘', 5-히드록시우리딘, 5-메톡시우리딘, 우리딘 5-옥시아세트산, 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 5-아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-셀레누리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘, 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오우리딘, 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸우리딘으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 적어도 하나의 2'-치환된 RNA 뉴클레오티드(리보뉴클레오시드)를 포함한다.
용어 "2'-치환된 리보뉴클레오사이드"는 일반적으로 오탄당 모이어티의 2' 위치에 있는 하이드록실기가 치환되어 2'-치환된 또는 2'-O-치환된 리보뉴클레오사이드를 생성하는 리보뉴클레오사이드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이러한 치환은 1 내지 6개의 포화 또는 불포화 탄소 원자를 함유하는 저급 히드로카르빌( hydrocarbyl) 기, 할로겐 원자, 또는 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 아릴 기로 이루어지며, 여기서 이러한 히드로카르빌 또는 아릴 기는 비치환되거나 또는 예를 들어, 할로, 히드록시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 알콕시, 카르복실, 카르보알콕시 또는 아미노 기로 치환될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 적어도 하나의 당 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 당 변형된 뉴클레오티드는 적어도 하나의 2' 리보스 변형된 (리보뉴클레오시드) RNA 뉴클레오티드이다.
2'-O-치환된 리보뉴클레오사이드의 예는 비제한적으로 2'-아미노, 2'-플루오로, 2'-알릴, 2'-O-알킬 및 2'-프로파길 리보뉴클레오사이드, 2'-O-메틸리보뉴클레오사이드 및 2'-O-메톡시에톡시리보뉴클레오사이드를 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산의 적어도 하나의 2' 리보스 변형된 RNA 뉴클레오티드는 2'-O-메틸화 RNA 뉴클레오티드(2'-O-메틸리보뉴클레오티드)이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 적어도 하나의 2' 리보스 변형된 RNA 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기 적어도 하나의 2' 리보스 변형된 RNA 뉴클레오티드는 2'-O-메틸화 RNA 뉴클레오티드이다. 바람직하게는, 2'-O-메틸화 RNA 뉴클레오티드는 2'-O-메틸화 구아노신(Gm), 2'-O-메틸화 우라실(Um), 2'-O-메틸화 아데노신(Am), 2'-O-메틸화 시토신(Cm), 또는 임의의 이러한 뉴클레오티드의 2'-O-메틸화 유사체로부터 선택될 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 적어도 하나의 2'-O-메틸화 RNA 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 2'- O-메틸화된 RNA 뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나 또는 상기 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 2'-O-메틸화 RNA 뉴클레오티드는 2'-O-메틸화 구아노신(Gm), 2'-O-메틸화 우라실(Um), 2'-O-메틸화 아데노신(Am), 2'-O-메틸화 시토신(Cm) 또는 임의의 이러한 뉴클레오티드의 2'-O-메틸화 유사체로부터 선택될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 적어도 하나의 2'-O-메틸화 RNA 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 바람직하게는, 적어도 하나의 2'-O-메틸화 RNA 뉴클레오티드는 핵산의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치하지 않는다.
바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 적어도 하나 이상의 트리뉴클레오티드 M-X-Y 모티프를 포함하며,
여기서 M은 Gm, Um, 또는 Am으로부터 선택되고, 바람직하게는 M은 Gm이고;
여기서 X는 G, A, 또는 U로부터 선택되고, 바람직하게는 X는 G 또는 A이고; 그리고
여기서 Y는 G, A, U, C, 또는 디히드로우리딘으로부터 선택되고, 바람직하게는 Y는 C이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 트리뉴클레오티드 M-X-Y 모티프 중 적어도 하나 이상을 포함하고,
여기서 M은 Gm이고;
여기서 X는 G 또는 A이고; 그리고
여기서 Y는 C이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 본원에 정의된 바와 같은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 트리뉴클레오티드 M-X-Y 모티프를 포함하고, 여기서 각 M-X-Y 모티프는 여기에 기재된 바와 같이 독립적으로 정의될 수 있다.
특정 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 본원에 정의된 바와 같은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 트리뉴클레오티드 M-X-Y 모티프를 포함하고, 여기서 상기 트리뉴클레오티드 모티프는 3' 말단 및/또는 5' 말단에 위치하지 않는다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 하기 화학식 I에 따른 하나 이상의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
Figure pct00002
여기서 N은 본원에 정의된 임의의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체, 바람직하게는 G, A, U, C, Gm, Am, Um, Cm, 또는 본원에 정의된 바와 같은 변형된 뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택되고;
여기서 W는 0 또는 1 내지 15의 정수이고, 바람직하게는 W는 1 내지 10, 가장 바람직하게는 1 내지 5의 정수이고;
여기서 Z는 0 또는 1 내지 15의 정수이고, 바람직하게는 Z는 1 내지 10, 가장 바람직하게는 1 내지 5의 정수이고;
여기서 M, X, 및 Y는 본원에 정의된 바와 같이 선택된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 화학식 I에 따른 하나 이상의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
여기서 N은 G, A, U, C로부터 독립적으로 선택되고;
여기서 W는 1 내지 10의 정수이고;
여기서 Z는 1 내지 10의 정수이고;
여기서 M은 Gm이고;
여기서 X는 G이고;
그리고 Y는 C이다.
화학식 I로부터 유래될 수 있는 예시적인 핵산 서열은 다음과 같다:
5'-MXYNNNNNNNN-3'
5'-NMXYNNNNNNN-3'
5'-NNMXYNNNNNN-3'
5'-NNNMXYNNNNN-3'
5'-NNNNMXYNNNN-3'
5'-NNNNNMXYNNN-3'
5'-NNNNNNMXYNN-3'
5'-NNNNNNNMXYN-3'
5'-NNNNNNNNMXY-3'
5'-MXYNNNNNNN-3'
5'-NMXYNNNNNN-3'
5'-NNMXYNNNNN-3'
5'-NNNMXYNNNN-3'
5'-NNNNMXYNNN-3'
5'-NNNNNMXYNN-3'
5'-NNNNNNMXYN-3'
5'-NNNNNNNMXY-3'
5'-MXYNNNNNN-3'
5'-NMXYNNNNN-3'
5'-NNMXYNNNN-3'
5'-NNNMXYNNN-3'
5'-NNNNMXYNN-3'
5'-NNNNNMXYN-3'
5'-NNNNNNMXY-3'
5'-MXYNNNNN-3'
5'-NMXYNNNN-3'
5'-NNMXYNNN-3'
5'-NNNMXYNN-3'
5'-NNNNMXYN-3'
5'-NNNNNMXY-3'
등
특히 바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 화학식 I에 따른 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 각각은 화학식 I에 따른 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 핵산 서열은 동일하거나 서로 독립적으로 선택될 수 있다.
이와 관련하여, 화학식 I로부터 유래될 수 있는 예시적인 핵산 서열은 다음과 같다:
5'-NNNNNMXYMXYNNNNNNNNNNNMXYN-3'
5'-NNNNNMXYMXYNNNNNNNNMXYN-3'
5'-NNMXYNNNNNMXYNNNMXYNNN-3'
5'-NNNMXYMXYNNNNNNNNNMXYN-3'
5'-NNMXYNNNMXYNNNMXYNNN-3'
5'-NNNMXYMXYNNNNNNMXYN-3'
5'-MXYNNNNNNNNNNNNNMXY-3'
5'-MXYNNNNNNNNNNNNNMXY-3'
5'-NNMXYNNNNNMXYNNNMN-3'
5'-MXYNNNNNNNNNNNMXY-3'
5'-NNMXYNNNMXYNNNNN -3'
5'-MXYNNNNNNNNNMXY-3'
등.
특히 바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 트리포스페이트 기가 없는 5' 말단을 함유한다. 즉, 제2 성분의 핵산의 5' 말단은 모노포스페이트기 또는 디포스페이트기 또는 히드록실기를 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 두 번째 성분의 핵산에 5' 말단 트리포스페이트가 결핍되어 있다는 것이 특히 중요하다. 그와 같이 5' ppp 기는 투여 시 (RIG-1을 통해) 잠재적으로 선천성 면역 반응을 자극하기 때문이다.
따라서, 구현예에서 제2 성분의 핵산은 합성 방법(예: RNA 합성)을 사용하여 생성된다. 제2 성분의 핵산이 효소적 과정(예: RNA 시험관내 전사)을 사용하여 생성되는 구현예에서, 트리포스페이트 기가 없는 5' 말단을 포함하는 핵산을 얻기 위해 핵산의 5' ppp 기를 제거해야 할 수 있다(예: 포스파타제 처리 사용하여).
대안적인 구현예에서, 제2 성분의 핵산은 5' 말단에 트리포스페이트 기를 함유하고, 여기서 이러한 5' 트리포스페이트 기를 함유한 핵산은 합성 방법 또는 효소 공정을 사용하여 생성될 수 있다.
제2 성분의 핵산은 1 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 3 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 3 내지 약 50개의 뉴클레오티드, 약 3 내지 약 25개의 뉴클레오티드, 약 5 내지 약 25개의 뉴클레오티드, 약 5 내지 약 15, 또는 약 5 내지 약 10개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 약 3 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 5 내지 약 25개 뉴클레오티드, 약 5 내지 약 15개, 또는 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 특히 바람직한 실시양태에서, 제2 성분 성분의 핵산은 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
다양한 특정 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 44, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
바람직한 특정 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 6개 뉴클레오티드, 7개 뉴클레오티드, 8개 뉴클레오티드, 9개 뉴클레오티드, 10개 뉴클레오티드, 11개 뉴클레오티드, 또는 12개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 바람직하게는, 제2 성분의 핵산은 9개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명의 맥락에서 RNA 올리고뉴클레오티드는 RNA 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 하나의 화학적으로 변형된 RNA 뉴클레오티드를 포함한다. RNA 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 200개 뉴클레오티드를 초과하지 않는 길이를 갖는 짧은 RNA 분자이다. 전형적으로, RNA 올리고뉴클레오티드는 빌딩 블록, 천연 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오시드의 보호된 포스포르아미다이트를 사용하여 화학적으로 합성된다.
올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드 잔기는 다수의 공지된 뉴클레오시드간 연결 중 임의의 것에 의해 서로 커플링될 수 있다. 이러한 뉴클레오시드간 연결에는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 실록산, 카르보네이트, 카르보알콕시, 아세트아미데이트, 카르바메이트, 모르폴리노, 보라노, 티오에테르, 가교 포스포아미데이트, 가교 메틸렌 포스포네이트, 가교 포스포로티오에이트 및 설폰 뉴클레오사이드간 연결을 포함하며, 이로 제한되지 않는다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 또한 하나 이상의 입체특이적 뉴클레오시드간 연결(예를 들어, (Rp)- 또는 (5)-포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 또는 포스포트리에스테르 연결)을 갖는 폴리뉴클레오시드를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 포스포디에스테르 결합이 바람직하다.
올리고뉴클레오티드 사슬 조립은 "합성 주기"라고 하는 일상적인 절차에 따라 3'-말단에서 5'-말단 방향으로 진행된다. 단일 합성 주기가 완료되면 성장하는 사슬에 하나의 뉴클레오티드 잔기가 추가된다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 제2 성분의 핵산은 단일 가닥 합성 RNA 올리고뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 제2 성분의 길항제, 바람직하게는 핵산은 2개 이상의 상이한 핵산, 예를 들어, 본원에서 "분지형"으로 지칭되는 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 링커에 연결된 본원에 정의된 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 성분의 길항제, 바람직하게는 핵산은 2개 이상의 상이한 핵산, 예를 들어, 예를 들어 본원에 정의된 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기서, 상기 2개 이상의 핵산, 예를 들어 올리고뉴클레오티드는 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, π-스태킹 상호작용, 수소 결합 및 이들의 조합과 같이 비공유적으로 연결된다. 이러한 비공유 결합의 비제한적인 예는 Watson-Crick 염기 쌍, Hoogsteen 염기 쌍 및 염기 적층을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 성분의 길항제, 바람직하게는 핵산은 CpG, C*pG, C*pG* 및 CpG*로부터 선택된 모티프를 포함하고, 여기서 C는 2'-데옥시시티딘, G는 2'-데옥시 구아노신, C*는 2'-데옥시티미딘, 1-(2'-데옥시-BD-리보푸라노실)-2-옥소-7-데아자-8-메틸-퓨린, 5- Me-dC, 2'-디데옥시-5-할로시토신, 2'-디데옥시-5-니트로시토신, 아라비노시티딘, 2'-데옥시-2'-치환 아라비노시티딘, 2'-O-치환 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5- 히드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘, 2'-O-치환된 리보뉴클레오티드(비제한적으로, 2'-O-Me-5-Me-C, 2'-O-(2-메톡시에틸)-리보뉴클레오티드 또는 2'-O-메리보뉴클레오티드) 또는 기타 시토신 뉴클레오티드 도체이고, G*는 2'-데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환-아라비노구아노신, 2'-O-치환-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 2' -O-치환된 리보뉴클레오티드(비제한적으로, 2'-O-(2-메톡시에틸)- 리보뉴클레오티드드; 또는 2'-O-Me-리보뉴클레오티드를 포함) 또는 기타 구아닌 뉴클레오티드 유도체이고, 그리고 는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오사이드간 연결이다.
일부 실시양태에서, 제2 성분의 길항제, 바람직하게는 핵산은 7-데아자구아노신(c7G) 및 하나 이상의 UpG-함유 모티프를 포함한다.
당업계에서는 박테리아 tRNATyr 서열 단편이 TLR 길항제로 기능할 수 있음을 보여주었다(Schmitt et al 2017. RNA 23:1344-135). 따라서, 구현예에서, 제2 성분의 핵산은 박테리아 tRNA 서열로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직하게는, 핵산 서열은 박테리아 tRNATyr 서열이거나 그로부터 유래된다.
실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 박테리아 tRNATyr 서열로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 핵산 서열은 tRNATyr의 D-루프이거나 또는 그로부터 유래된다. 바람직한 실시양태에서, 핵산 서열은 대장균의 tRNATyr의 D-루프이거나 그로부터 유래된다.
바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산은 RNA 올리고뉴클레오티드, 즉 대장균의 tRNATyr의 D-루프의 단편이고, 여기서 단편은 약 5 내지 약 15개 뉴클레오티드의 길이를 갖고, 여기서 핵산 서열은 적어도 하나의 2'-O-메틸화 RNA 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 하나의 M-X-Y 모티프를 포함하고, 선택적으로 RNA 올리고뉴클레오티드에는 트리포스페이트 5' 말단이 없고, 선택적으로 M-X-Y 모티프는 RNA 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 위치하지 않는다.
본 발명의 실시양태에서, 제2 성분, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드의 핵산은 서열번호: 85-165, 또는 이들 서열 중 임의의 것의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 이러한 적합한 핵산 서열 각각에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 식별자 <223> 하에 제공된 세부사항에서도 찾을 수 도 있다.
본 발명의 실시양태에서, 제2 성분의 핵산, 바람직하게 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 85- 100, 149-165 또는 이들 서열 중 임의의 것의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명의 보다 바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 핵산, 바람직하게 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 85-87, 149-165, 또는 표 B, 행 1-20, 이들 서열 중 임의의 것의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
그 맥락에서 특히 선호되는 것은, 서열번호: 85 또는 표 B, 행 1에 따른 핵산 서열, 또는 이들 서열 중 임의의 것의 단편과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열이다.
하기 표(표 B)에서 제2 성분의 적합한 핵산 서열이 제공되며, 여기서 변형된 뉴클레오티드(예: Gm)가 표시되고; 바람직하게는, 표 B에 제공된 서열은 RNA 올리고뉴클레오티드이다. RNA 올리고뉴클레오티드 5'-GAG CGmG CCA-3'(표 B, 1행 참조)이 특히 바람직하며, 여기서 상기 RNA 올리고뉴클레오티드의 위치 5는 2'-O-메틸화 구아노신(Gm)이다. 이러한 적합한 핵산 서열 각각에 관한 추가 정보는 서열 목록, 특히 식별자 <223> 하에 제공된 세부사항에서 찾을 수도 있다.
표 B. 본 발명의 바람직한 올리고뉴클레오티드 길항제들
Figure pct00003
*포스포로티오에이트(PTO) 백본, d= 데옥시, A6m=N6-메틸아데노신, 4Ac=N4-아세틸시토신, mE= 7-데아자-2'-O-메틸-구아닌
본 발명의 다른 실시양태에서, 제2 성분의 핵산, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 IRS-954 (DV-1079), IRO-5, IRS 2088, IRS 869, INH-ODN-2114, INH-ODN 4024, INH-ODN 4084-F, IRS-661, IRS-954, INH-ODN-24888, IHN-ODN 2088, ODN 20958, IHN-ODN-21595, IHN-ODN-20844, IHN-ODN-24991, IHN-ODN-105870, IHN-ODN-105871, ODN A151, G-ODN, ODN INH-1, ODN INH-18, ODN 4084-F, INH-4, INH-13, (pS-) ST-ODN, INH-ODN 21 14, CMZ 203-84, CMZ 203-85, CMZ 203-88, CMZ 203-88-1, CMZ 203-91, ODN 4084, ODN INH-47, CpG-52364 (콜레이 제약 (Coley Pharmaceutical)의 퀴나졸린 유도체), IMO-3100, IMO-8400, IMO-8503 (억제 RNA/DNA 하이브리드 올리고뉴클레오티드), ODN 2087, ODN 20959, SM934, IMO-4200, IMO-9200, DV-1179, VTX-763, TMX-302, TMX-306, 및 Schmitt et al. (Schmitt et al 2017. RNA 23:1344-135.), Robbins et al. (Robbins et al 2007. Molecular therapy Vol 15 No 9, 1663-1669.), WO2008017473 (특히 표 2 및 표 6, 서열번호: 195-201), WO2009141146 (서열번호: 4-56), WO2010105819, US2009087388 (표 4 및 표 6), WO2017136399 (표 4) 및 WO2008033432 (표 1-5 및 표 8)에 개시된 추가 올리고뉴클레오티드로부터 선택될 수 있다.
추가의 특정 실시양태에서, 제2 성분의 핵산, 바람직하게 올리고뉴클레오티드는 공개된 PCT 출원 WO2009055076, 특히 WO2009055076의 청구항 44 내지 45에서 찾을 수 있다. WO2009055076의 개시, 특히 WO2009055076의 청구항 44 내지 45에 관한 개시가 본원에 참조로 포함된다.
제1 성분: 치료 RNA (Therapeutic RNA)
하기에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA의 유리한 실시양태 및 특징이 설명된다. 특히, 본 발명의 조합물(제1 측면)의 맥락에서 기술된 상기 치료 RNA의 모든 기술된 실시양태 및 특징은 마찬가지로 약학적 조성물의 치료 RNA(제2 측면), 또는 키트 또는 부품의 키트(제3 측면) 및 본 발명의 추가 측면에 마찬가지로 적용될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA는 코딩 RNA, 비-코딩 RNA, 원형 RNA(circRNA), RNA 올리고뉴클레오티드, 소형 간섭 RNA(siRNA), 소형 헤어핀 RNA (shRNA), 안티센스 RNA(asRNA), CRISPR/Cas9 가이드 RNA, mRNA, 리보스위치, 면역자극 RNA(isRNA), 리보자임, RNA 앱타머, 리보솜 RNA(rRNA), 트랜스퍼 RNA(tRNA), 바이러스 RNA(vRNA), 레트로바이러스 RNA, 소형 핵 RNA(snRNA), 자가 복제 RNA, 레플리콘 RNA, 소형 핵성 RNA(snoRNA), 마이크로 RNA(miRNA) 및 Piwi-상호작용 RNA(piRNA)로부터 선택된다.
용어 "RNA"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 리보핵산 분자, 즉 뉴클레오티드로 구성된 중합체로 의도되었다. 이러한 뉴클레오티드는 일반적으로 소위 백본을 따라 서로 연결된 아데노신-모노포스페이트, 우리딘-모노포스페이트, 구아노신-모노포스페이트 및 시티딘-모노포스페이트 단량체이다. 백본은 전형적으로 제1 단량체의 당, 즉 리보스 및 제2 인접 단량체의 포스페이트 모이어티 사이의 포스포디에스테르 결합에 의해 형성된다. 단량체의 특정 연속을 RNA 서열이라고 한다.
용어 "치료 RNA"는 치료 양상(modality)을 제공하는 임의의 RNA, 특히 상기 정의된 바와 같은 임의의 RNA에 관한 것이다. 그 맥락에서 용어 "치료적"은 "치료적 기능을 제공하는 것" 또는 "치료 또는 투여에 적합한 것"으로 이해되어야 한다. 그러나 그러한 맥락에서 "치료적"은 특정 치료 양상으로 제한되는 것으로 전혀 이해되어서는 안된다. 치료 양상의 예는 펩티드 또는 단백질(여기서 상기 펩티드 또는 단백질은 특정 치료 기능을 가진다. 예를 들어, 백신용 항원, 또는 단백질 대체 치료를 위한 효소)을 암호화하는 코딩 서열의 제공 (상기 치료 RNA를 통해)일 수 있다. 추가 치료 양상은 유전 공학일 수 있으며, 여기서 RNA는 예를 들어 DNA 및/또는 RNA를 조작하기 위한 요소들을 제공하거나 조정한다. 일반적으로, "치료 RNA"라는 용어는 대상체(예: 동물, 인간)에게 투여하기에 적합하지 않은 천연 RNA 추출물 또는 RNA 제제(예: 박테리아에서 얻거나 식물에서 얻음)를 포함하지 않는다. 치료 목적에 적합하기 위해, 본 발명의 RNA는 인공, 비천연 RNA일 수 있다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA는 인공 RNA이다.
본 명세서에서 "인공 RNA"라는 용어는 자연적으로 발생하지 않는 RNA를 가리키는 것으로 의도된다. 즉, 인공 RNA는 비천연 RNA 분자로 이해될 수 있다. 이러한 RNA 분자는 개별 서열(예: G/C 함량 변형 코딩 서열, UTR)로 인해 및/또는 기타 변형, 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드의 구조적 변형때문에 비천연일 수 있다. 인공 RNA는 원하는 인공 뉴클레오티드 서열에 상응하도록 유전 공학에 의해 설계 및/또는 생성될 수 있다. 이러한 맥락에서 인공 RNA는 자연적으로 발생하지 않을 수 있는 서열, 즉 적어도 하나의 뉴클레오티드/변형에 의해 야생형 서열과 다르다.
실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA는 RNA 올리고뉴클레오티드, 소형 간섭 RNA(siRNA), 소형 헤어핀 RNA (shRNA), 안티센스 RNA(asRNA), CRISPR/Cas9 가이드 RNA, 리보스위치, 리보자임, RNA 앱타머, 리보솜 RNA(rRNA), 트랜스퍼 RNA(tRNA), 소형 핵 RNA(snRNA), 소형 핵성 RNA(snoRNA), 마이크로 RNA(miRNA) 및 Piwi-상호작용 RNA(piRNA)로부터 선택되는 비-코딩 RNA이다.
실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA는 비-코딩 RNA, 바람직하게는 CRISPR/Cas9 가이드 RNA 또는 소형 간섭 RNA(siRNA)이다.
본원에 사용된 용어 "가이드 RNA"(gRNA)는 관심 표적 DNA 서열에 CRISPR-연관 단백질/CRISPR-연관 엔도뉴클레아제를 표적화할 수 있는 임의의 RNA 분자에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, 가이드 RNA라는 용어는 가장 넓은 의미로 이해되어야 하며, crRNA("CRISPR RNA" 또는 "타겟터-RNA" 또는 "crRNA" 또는 "crRNA 반복부")를 포함하는 2-분자 gRNA (“tracrRNA/crRNA”)를 포함할 수 있고 상응하는 tracrRNA (“트랜스-작용 CRISPR RNA” 또는 “활성제-RNA” 또는 “tracrRNA”) 분자 또는 단일 분자 gRNAs을 포함할 수 있다. "sgRNA"는 전형적으로 "루프" 서열을 통해 tracrRNA의 5' 말단에 그의 3' 말단에서 연결된 crRNA를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 가이드 RNA는 본 발명의 조합물/조성물의 적어도 하나의 치료 RNA에 의해 제공될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA는 코딩 RNA이다. 가장 바람직하게는, 상기 코딩 RNA는 mRNA, (코딩) 자가-복제 RNA, (코딩) 원형 RNA, (코딩) 바이러스 RNA, 또는 (코딩) 레플리콘 RNA로부터 선택될 수 있다.
코딩 RNA는 상기 코딩 RNA가 적어도 하나의 아미노산 서열로 번역되는 적어도 하나의 서열(cds)을 포함하는 것을 특징으로 하는 임의의 유형의 RNA 구축물 (예를 들어, 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 원형 이중 가닥 RNA, 또는 원형 단일 가닥 RNA)일 수 있다 (예를 들어 세포에 투여 시).
본원에 사용된 용어 "코딩 서열", "코딩 영역", 또는 "cds"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있는 여러 뉴클레오티드의 서열을 가리키는 것을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, cds는 바람직하게는 시작 코돈으로 시작하고 바람직하게는 하나의 종결 코돈으로 끝나는 다수의 뉴클레오티드 트리플렛으로 구성된 RNA 서열이다. 실시양태에서, RNA의 cds는 하나 또는 둘 이상의 정지 코돈으로 종결될 수 있다. 2개 이상의 종결 코돈의 제1 종결 코돈은 TGA 또는 UGA일 수 있고, 2개 이상의 종결 코돈의 제2 종결 코돈은 TAA, TGA, TAG, UAA, UGA 또는 UAG로부터 선택될 수 있다.
실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA는 원형 RNA이다. 본원에 사용된 "원형 RNA" 또는 "circRNA"는 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질을 암호화할 수 있는 원형 폴리뉴클레오티드 컨스트럭트로서 이해되어야 한다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 상기 circRNA는 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 cd를 포함한다. circRNA는 예를 들어, US6210931, US5773244, WO1992/001813, WO2015/034925 및 WO2016/011222에 제공된 바와 같은 방법을 포함하는, 업계에서 제공되는 다양한 방법을 사용하여 합성될 수 있으며, circRNA 합성에 관한 개시 내용은 참고로 여기에 포함된다.
실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA는 레플리콘 RNA이다. 용어 "레플리콘 RNA"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 최적화된 자가 복제 RNA가 되도록 의도되었다. 이러한 구성은 예를 들어, 알파바이러스(예: SFV, SIN, VEE 또는 RRV)로부터 파생된 레플리카제 요소를 포함하고 구조적 바이러스 단백질의 관심 핵산 및 코딩 서열의 치환을 포함한다. 대안적으로, 레플리카제는 독립적인 RNA 컨스트럭트에 제공될 수 있다. 레플리카제의 다운스트림은 레플리콘 RNA의 복제를 제어하는 서브-게놈 프로모터일 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA는 메신저 RNA(mRNA)이다. 본 발명의 맥락에서 전형적인 mRNA(메신저 RNA)는 예를 들어 세포에 생체 내 투여 후에 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열로 번역되는 코딩 서열을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA, 특히 코딩 RNA 또는 mRNA는 시험관내 전사된 RNA이다. 그 맥락에서 적합하게는, 치료 RNA는 시험관내 전사된 코딩 RNA 또는 시험관내 전사된 mRNA이다.
시험관내 전사된 RNA는 RNA 시험관내 전사에 의해 얻어지는 RNA로 이해되어야 한다.
"RNA 시험관내 전사" 또는 "시험관내 전사"라는 용어는 RNA가 무세포 시스템(시험관내)에서 합성되는 과정에 관한 것이다. RNA는 선형화된 플라스미드 DNA 주형 또는 PCR 증폭된 DNA 주형인 적절한 DNA 주형의 DNA-의존성 RNA 시험관내 전사에 의해 얻을 수 있다. RNA 시험관내 전사를 제어하기 위한 프로모터는 임의의 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. DNA 의존성 RNA 중합효소의 특정 예는 T7, T3, SP6 또는 Syn5 RNA 중합효소이다. 바람직한 실시양태에서, DNA 주형은 RNA 시험관내 전사의 대상이 되기 전에 적합한 제한 효소로 선형화된다.
RNA 시험관내 전사에 일반적으로 사용되는 시약에는 다음이 포함된다: 박테리오파지 인코딩된 RNA 중합효소(T7, T3, SP6 또는 Syn5)와 같은 각각의 RNA 중합효소에 대한 높은 결합 친화도를 갖는 프로모터 서열을 갖는 DNA 주형(선형 플라스미드 DNA 또는 PCR 생성물); 4개의 염기(아데닌, 시토신, 구아닌 및 우라실)에 대한 리보뉴클레오티드 트리포스페이트(NTP); 선택적으로, 정의된 캡 유사체;선택적으로, 본원에 정의된 추가 변형된 뉴클레오티드; DNA 주형 내의 프로모터 서열에 결합할 수 있는 DNA-의존성 RNA 중합효소(예: T7, T3, SP6, 또는 Syn5 RNA 중합효소); 선택적으로, 임의의 잠재적으로 오염된 RNase를 비활성화하기 위한 리보뉴클레아제(RNase) 억제제; 선택적으로, 피로포스페이트를 분해하기 위한 피로포스파타제; 중합효소의 보조인자로 Mg2+ 이온을 공급하는 MgCl2; 항산화제(예: DTT) 및/또는 최적 농도의 스페르미딘과 같은 폴리아민도 함유할 수 있는 적절한 pH 값을 유지하기 위한 완충액(TRIS 또는 HEPES), 예를 들어, WO2017/109161에 개시된 TRIS-시트레이트를 포함하는 완충 시스템.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 제1 성분, 특히 코딩 RNA 또는 mRNA의 적어도 하나의 치료 RNA는 시험관내 전사된 RNA이고, 여기서 시험관내 전사된 RNA는 서열 최적화된 뉴클레오티드 혼합물을 사용하는 시험관내 RNA 전사에 의해 수득가능하다.
이러한 맥락에서, RNA 시험관내 전사에 사용되는 뉴클레오티드 혼합물은 하기에 정의된 바와 같이 변형된 뉴클레오티드를 추가로 함유할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, RNA 시험관내 전사 반응에 사용되는 뉴클레오티드 혼합물(즉, 혼합물 중 각 뉴클레오티드의 분획)은 바람직하게는 WO2015/188933에 기재된 바와 같이 주어진 RNA 서열(최적화된 NTP 혼합물)에 대해 본질적으로 최적화된다. 최적화된 NTP 혼합물을 사용하는 공정에 의해 수득된 RNA는 감소된 면역 자극 특성을 특징으로 하며, 이는 본 발명의 맥락에서 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA, 특히 코딩 RNA 또는 mRNA는 정제된 RNA(예를 들어, 정제된, 시험관내 전사된 mRNA)이다.
본원에 사용된 용어 "정제된 RNA"는 특정 정제 단계 (예: (RP)-HPLC, TFF, Oligo d(T) 정제, 침전 단계) 후에 출발 물질 (예를 들어 시험관 내 전사된 RNA 또는 합성 RNA)보다 더 높은 순도를 갖는 치료용 RNA로 이해되어야 한다. 정제된 RNA에 본질적으로 존재하지 않는 일반적인 불순물은 펩티드 또는 단백질(예: RNA 시험관내 전사에서 유래된 효소, 예: RNA 중합효소, RNase, 피로포스파타제, 제한 엔도뉴클레아제, DNase), 스페르미딘, BSA, 중단 (abortive) RNA 서열, RNA 단편(짧은 이중 가닥 RNA 단편, 중단 서열 등), 유리 뉴클레오티드(변형된 뉴클레오티드, 기존 NTP, 캡 유사체), 주형 DNA 단편, 완충 성분(HEPES, TRIS, MgCl2) 등을 포함한다. 예를 들어 발효 과정에서 파생될 수 있는 기타 잠재적 불순물은 박테리아성 불순물 (바이오버든 (bioburden), 박테리아 DNA), 또는 정제 과정에서 파생된 불순물(유기 용매 등)을 포함한다. 따라서, 이와 관련하여 "RNA 순도의 정도"는 100%에 최대한 가깝게 되는 것이 바람직하다. 전장 RNA 전사체의 양이 가능한 100%에 가까운 것이 RNA 순도의 정도에 대해서도 바람직하다. 따라서 본원에 사용된 "정제된 RNA"는 70%, 80%, 85%, 매우 특히 90%, 95%, 그리고 가장 바람직하게는 99% 이상의 순도를 갖는다. 더욱이, 본원에 사용된 "정제된 RNA"는 추가로 또는 대안적으로 70%, 80%, 85% 초과, 매우 특히 90%, 95% 초과, 가장 바람직하게는 99% 초과의 전장 RNA의 양을 가질 수 있다. 본원에 정의된 이러한 정제된 RNA는 감소된 면역 자극 특성(비정제된 RNA와 비교하여)을 특징으로 하며, 이는 본 발명의 맥락에서 특히 바람직하다.
전장 RNA의 순도의 정도 또는 양은 예를 들어 분석용 HPLC에 의해 결정될 수 있으며, 여기서 위에 제공된 백분율은 크로마토그램에서 원하는 RNA에 대한 피크 면적과 모든 피크의 총 면적 사이의 비율에 해당한다. 대안적으로, 순도는 다른 수단, 예를 들어 분석적 아가로스 겔 전기영동 또는 모세관 겔 전기영동에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 특히 의학적 적용을 위해, 약제학적 등급 RNA를 제공하는 것이 필요할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, RNA 제조는 바람직하게 WO2016/180430에 기재된 과정에 따라 DNA 및 RNA 수준에 대한 다양한 품질 관리 단계를 구현하는 현행 GMP(우수 제조 관행) 하에 수행된다. 수득된 RNA 생성물은 바람직하게는 RP-HPLC(WO2008/077592에 기재된 바와 같음) 및/또는 접선 유동 여과(WO2016/193206에 기재된 바와 같음)를 사용하여 정제된다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA, 특히 코딩 RNA 또는 mRNA는 GMP-등급 RNA 또는 제약-등급 RNA이다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA, 특히 코딩 RNA 또는 mRNA는 정제된 RNA(예를 들어, 정제된, 시험관내 전사된 mRNA)이고, 여기서 정제된 RNA는 RP-HPLC 및/또는 TFF 및/또는 올리고 d(T) 정제에 의해 정제된다. 바람직하게는 정제된 RNA는 (RP)-HPLC 정제된 RNA이다.
본원에 정의된 "정제된 RNA" 또는 본원에 정의된 "제약 등급 RNA"는 우수한 안정성 특성(시험관내, 생체내) 및 개선된 효율성(예: 생체내 RNA의 더 나은 번역성)을 가질 수 있으며 따라서 어떤 의료 목적에든 특히 적합하다. 또한, 이러한 RNA는 감소된 면역 자극 특성(비정제 RNA와 비교하여)을 특징으로 하며, 이는 본 발명의 맥락에서 바람직하다.
특정 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA, 특히 코딩 RNA 또는 mRNA는 시험관내 전사된 RNA, 정제된 RNA, 제약 등급 RNA이다. 이러한 RNA는 감소된 면역 자극 특성을 특징으로 하며(예를 들어, 정제되지 않은 시험관내 전사된 RNA와 비교하여), 따라서 본 발명의 맥락에서 특히 적합하다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA, 예를 들어, 코딩 RNA 또는 mRNA는 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열(cds)을 포함한다.
유리하게는, 코딩 RNA 또는 mRNA의 코딩된 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 발현은 세포, 조직 또는 유기체 내로 투여시, 제2 성분의 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제와 조합없이 코딩 RNA 또는 mRNA의의 코딩된 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 발현과 비교하여, 제2 성분의 하나 이상의 RNA 감지 수용체의 하나 이상의 길항제와의 조합에 의해 증가 또는 연장된다.
따라서, 세포, 조직 또는 유기체에 대한 조합물의 투여(즉, 제1 및 제2 성분의 투여)는 상응하는 제1 성분/치료 RNA 단독의 투여와 비교하여 증가되거 연장된 펩티드/단백질 발현을 초래한다.
특정 세포/기관/조직에 치료 RNA의 발현을 (즉, 단백질 발현을) 평가하는 방법, 및 발현의 기간을 결정하는 방법은 통상의 기술자들에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 단백질 발현은 항체 기반 검출 방법(웨스턴 블롯, FACS) 또는 정량적 질량 분석법을 사용하여 결정할 수 있다. 예시적인 방법은 실시예 섹션에서 제공된다. 전형적으로, 제2 성분과 조합된 치료 RNA의 발현은 치료 RNA 단독(또는 제1 성분 단독), 즉, 제2 성분의 (추가) 투여 없이의 발현과 비교된다. 유효한 비교를 위해서는 동일한 조건(예: 동일한 세포주, 동일한 유기체, 동일한 적용 경로, 동일한 검출 방법, 동일한 양의 치료 RNA, 동일한 RNA 서열)을 사용해야 한다(가능한 경우). 당업자는 본 발명의 조합과 각각의 대조군 RNA(예를 들어, 치료 RNA 단독 또는 제1 성분 단독)의 비교를 수행하는 방법을 이해한다.
본 발명의 조합물의 "증가된 단백질 발현"은 위에서 설명한 바와 같이 다양한 잘 확립된 발현 어세이 (예: 항체 기반 검출 방법)에 의해 결정될 수 있는 상응하는 대조군(제1 성분 단독 또는 치료 RNA 단독)과 비교하여 발현의 백분율 증가로 이해되어야 한다.
따라서, 세포, 조직 또는 유기체에 대한 조합물의 투여(즉, 제1 및 제2 성분의 투여)는 상응하는 제1 성분/치료 RNA만의 투여와 비교하여 증가된 발현을 초래하며, 여기서 상기 세포, 조직 또는 유기체에서의 발현의 증가 퍼센트는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상이다.
본 발명의 조합물의 "연장된 단백질 발현"은 단백질 발현의 추가적인 기간으로 이해되어야 하며, 여기서 본 발명의 조합물의 발현은 상응하는 대조군(제1 성분 단독 또는 치료 RNA 단독)과 비교하여 여전히 검출가능하며, 이는 위에서 설명한 바와 같은 잘 확립된 발현 어세이 (예를 들어. 항체-기반 검출 방법)에 의해 결정될 수 있다.
따라서, 세포, 조직, 또는 유기체에 조합물의 투여 (즉, 제1 성분 및 제2 성분의 투여)는 상응하는 제1 성분/치료 RNA 단독의 투여와 비교하여 연장된 단백질 발현을 초래하며, 여기서 상기 세포, 조직, 또는 유기체에서 단백질 발현의 추가적인 기간은 적어도 5h, 10h, 20h, 25h, 30h, 35h, 40h, 45h, 50h, 55h, 60h, 65h, 70h, 75h, 80h, 85h, 95h, 90h, 또는 10h 이상이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 코딩 RNA 또는 mRNA의 코딩된 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 발현은 세포, 조직 또는 유기체로 투여 시 제2 성분의 적어도 하나의 RNA 감지 수용체의 적어도 하나의 길항제와의 조합에 의해 제2 성분의 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제와 조합없이 코딩 RNA 또는 mRNA의 코딩된 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 발현과 비교하여, 증가되거나 연장되며, 반면, 적어도 하나의 코딩 RNA 또는 mRNA와 제2 성분의 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제와의 조합물의 동시 투여에서 제2 성분의 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제와 조합없이 제1 성분의 적어도 하나의 코딩 RNA 또는 mRNA의 투여와 비교하여, 감소된 선천성 면역 반응을 이끈다.
바람직한 실시양태에서, 코딩 RNA 또는 mRNA의 cds는 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질을 암호화하고, 여기서 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질은 치료 펩티드 또는 단백질이거나 그로부터 유래된다.
다양한 실시양태에서, 코딩된 펩티드 또는 단백질, 예를 들어, 치료 펩티드 또는 단백질의 길이는 적어도 약 20, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 또는 1500개이거나 그 이상의 아미노산일 수 있다.
실시양태에서, 적어도 하나의 치료 펩티드 또는 단백질은 항체, 인트라바디, 수용체, 수용체 작용제, 수용체 길항제, 결합 단백질, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제, 샤페론, 수송 단백질, 이온 채널, 막 단백질, 분비 단백질, 전사 인자, 효소, 펩타이드 또는 단백질 호르몬, 성장 인자, 구조 단백질, 세포질 단백질, 세포골격 단백질, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 원생동물 항원, 알레르겐, 종양 항원, 또는 이들 중 임의의 것의 단편, 변이체 또는 조합이거나 이들로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 RNA 또는 mRNA에 의해 코딩되는 항체는 모든 항체로부터 선택될 수 있으며, 예를 들어, 재조합 방법에 의해 생성되거나 자연적으로 발생되고 선행기술로부터 통상의 기술자에게 알려진 모든 항체로부터 선택될 수 있고, 특히 항체는 치료 목적 또는 진단 또는 연구 목적으로 사용되고(될 수 있고) 또는 특정 질병과 함께 발견되는, 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 WO2008083949에 또한 기술된 바와 같은 암 질병, 감염성 질병 등과 함께 발견되는 항체로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 본 발명에 따른 RNA 또는 mRNA에 의해 코딩되는 항체는 일반적으로 당업자에게 공지된 모든 항체, 예를 들어, 자연 발생 항체 또는 면역화에 의해 숙주 유기체에서 생성된 항체, (통상) 면역화에 의해 숙주 유기체에서 생성된 항체 또는 자연 발생 항체로부터 분리 및 확인된 재조합 방법에 의해 제조된 항체, 또는 분자 생물학 방법의 도움으로 생성된 항체, 뿐만 아니라 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 이중특이성 항체, 인트라바디, 즉 세포에서 발현되고 가능하게는 특정 세포 구획에 국한된 항체, 및 상기 언급된 항체의 단편을 포함한다. 지금까지 항체라는 용어는 가장 넓은 의미로 이해되어야 합니다. 이러한 맥락에서, 항체는 일반적으로 경쇄 및 중쇄를 포함하며, 둘 다 가변 및 불변 도메인을 갖는다.
실시양태에 따르면, 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 치료 RNA의 cds는 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 (치료) 펩티드 또는 단백질, 및 추가로 적어도 하나의 추가의 이종성 펩티드 또는 단백질 요소를 암호화한다.
적합하게는, 적어도 하나의 추가의 이종성 펩티드 또는 단백질 요소는 분비 신호 펩티드, 막횡단 요소, 다량체화 도메인, VLP 형성 서열, 핵 국소화 신호(NLS), 펩티드 링커 요소, 자가-절단 펩티드, 면역 보조제 서열 또는 수지상 세포 표적화 서열로부터 선택될 수 있다.
바람직한 실시양태에 따르면, 제1 성분의 치료 RNA는 적어도 하나의 cds를 포함하고, 여기서 cds는 본원에 명시된 바와 같은 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질을 암호화한다. 그 맥락에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 임의의 cds는 적합한 cds로 이해될 수 있고 따라서 치료 RNA에 포함될 수 있다.
실시양태에서, cds의 길이는 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 또는 6000 뉴클레오티드 길이를 적어도 가질 수 있고 또는 그 이상일 수 있다. 실시양태에서, cds의 길이는 약 300 내지 2000 뉴클레오티드 범위일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA는 변형 및/또는 안정화된 RNA, 바람직하게는 변형 및/또는 안정화된 코딩 RNA 또는 변형 및/또는 안정화된 mRNA이다.
따라서 제1 성분의 치료 RNA는 "안정화된 인공 RNA", 즉 생체내 분해에 대한 개선된 내성을 나타내는 RNA 및/또는 생체내 개선된 안정성을 나타내는 RNA, 및/또는 생체내 개선된 번역성을 나타내는 RNA로 제공될 수 있다.
하기에서, 제1 성분의 치료 RNA를 "안정화"시키기에 적합하게 변형이 기술된다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA의 적어도 하나의 cds는 코돈 변형된 cds이고, 역서 적어도 하나의 코돈 변형된 cds에 의해 암호화된 아미노산 서열은 바람직하게 상응하는 야생형 cds에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 변형되지 않는다.
용어 "코돈 변형된 코딩 서열"은 상응하는 야생형 cds와 비교하여 적어도 하나의 코돈 (하나의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드의 트리플렛(triplets))이 상이한 코딩 서열에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서 코돈 변형된 cds는 생체내 분해에 대한 개선된 내성 및/또는 생체내 개선된 안정성, 및/또는 생체내 개선된 번역성을 나타낸다. 코돈 변형은 동일한 아미노산을 코딩하는 다중 코돈이 코딩 서열을 최적화/수정하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있기 때문에 유전 코드의 축퇴성(degeneracy)을 이용한다(표 1).
특히 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA의 적어도 하나의 cds는 코돈 변형된 cds이고, 여기서 코돈 변형된 cds는 C 최대화 cds, CAI 최대화 cds, 인간 코돈사용빈도 적응된 (codon usage adapted) cds, G/C 함량 변형된 cds, 및 G/C 최적화된 cds, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA가 변형될 수 있고, 여기서 적어도 하나의 cds의 C 함량은 상응하는 야생형 cds의 C 함량(본원에서 "C 최대화된 코딩 서열"로 지칭됨)과 비교하여 증가, 바람직하게는 최대화될 수 있다. C 최대화된 cds에 의해 암호화된 아미노산 서열은 바람직하게는 각각의 야생형 핵산 cds에 의해 암호화된 아미노산 서열과 비교하여 변형되지 않는다. C 최대화 핵산 서열의 생성은 WO2015/062738에 따른 방법을 사용하여 수행할 수 있으며, WO2015/062738의 개시내용은 참조로 포함된다.
실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA가 변형될 수 있고, 여기서 적어도 하나의 cds의 G/C 함량은 상응하는 야생형 cds의 G/C 함량과 비교하여 변형될 수 있다(본원에서 "G/C 함량 변형된 코딩 서열"로 지칭됨). 이러한 맥락에서, 용어 "G/C 최적화" 또는 "G/C 함량 변형"은 상응하는 야생형 RNA와 비교하여 변형된, 바람직하게는 증가된 수의 구아노신 및/또는 시토신 뉴클레오티드를 포함하는 RNA에 관한 것이다. 이러한 증가된 수는 A 또는 T 뉴클레오티드를 함유하는 코돈을 G 또는 C 뉴클레오티드를 함유하는 코돈으로 치환함으로써 생성될 수 있다. 유리하게는, 증가된 G/C 함량을 갖는 RNA 서열은 상응하는 야생형 서열 또는 증가된 A/U 함량을 갖는 서열보다 더 안정하다(이는 생체내에서 증가된 번역을 초래할 수 있음). G/C 함량 변형된 cds에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 바람직하게는 각각의 야생형 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 변형되지 않는다. 바람직하게는, 적어도 하나의 cds의 G/C 함량은 상응하는 야생형 서열의 cds의 G/C 함량과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 바람직하게는 적어도 40% 증가된다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA가 변형될 수 있고, 여기서 적어도 하나의 cds의 G/C 함량은 상응하는 야생형 cds의 G/C 함량과 비교하여 최적화될 수 있다(본원에서 "G /C 함량 최적화된 코딩 서열”로 언급됨). 그 맥락에서 "최적화"는 G/C 함량이 바람직하게는 본질적으로 가능한 가장 높은 G/C 함량으로 증가되는 cds를 지칭한다. G/C 함량 최적화된 cds에 의해 암호화된 아미노산 서열은 바람직하게는 각각의 야생형 cds에 의해 암호화된 아미노산 서열과 비교하여 변형되지 않는다. 유리하게는, G/C 함량 최적화된 코딩 서열을 갖는 RNA 서열은 상응하는 야생형 서열보다 더 안정하다(이는 생체내에서 증가된 번역을 초래할 수 있음). G/C 함량 최적화된 코딩 서열의 생성은 WO2002/098443에 따라 수행될 수 있으며, WO2002/098443의 개시 내용은 여기에 참조로 포함된다.
실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA가 변형될 수 있고, 여기서 적어도 하나의 cds의 코돈은 인간 코돈사용빈도에 적응될 수 있다(본원에서 "인간 코돈 사용빈도 적응된 코딩 서열"로 지칭됨). 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈은 대상체, 예를 들어, 인간에서 서로 다른 빈도로 발생한다. 따라서, 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈의 빈도가 인간 코돈 사용빈도에 따른 해당 코돈의 자연 발생 빈도에 상응하도록 cds가 변형되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 아미노산 Ala의 경우, 야생형 cds는 바람직하게는 코돈 "GCC"가 0.40의 빈도로 사용되고, 코돈 "GCT"가 0.28의 빈도로 사용되며, 코돈 "GCA"가 0.22의 빈도로 사용되고 코돈 "GCG"는 0.10 등의 빈도로 사용되는 방식으로 바람직하게 조정된다 (표 1 참조). 따라서, 이러한 절차(Ala에 대해 예시됨)는 인간 코돈 사용빈도에 적합한 서열을 얻기 위해 cds에 의해 인코딩된 각 아미노산에 적용된다. 유리하게는, 인간 코돈 사용빈도 적응된 코딩 서열을 갖는 RNA 서열은 상응하는 야생형 서열보다 생체내에서 더 안정하거나 더 나은 번역성을 나타낼 수 있다.
각 아미노산에 대해 표시된 각각의 코돈 빈도를 갖는 인간 코돈 사용빈도
아미노산 코돈 빈도 (frequency) 아미노산 코돈 빈도 (frequency)
Ala GCG 0.10 Pro CCG 0.11
Ala GCA 0.22 Pro CCA 0.27
Ala GCT 0.28 Pro CCT 0.29
Ala GCC* 0.40 Pro CCC* 0.33
Cys TGT 0.42 Gln CAG* 0.73
Cys TGC* 0.58 Gln CAA 0.27
Asp GAT 0.44 Arg AGG 0.22
Asp GAC* 0.56 Arg AGA* 0.21
Glu GAG* 0.59 Arg CGG 0.19
Glu GAA 0.41 Arg CGA 0.10
Phe TTT 0.43 Arg CGT 0.09
Phe TTC* 0.57 Arg CGC 0.19
Gly GGG 0.23 Ser AGT 0.14
Gly GGA 0.26 Ser AGC* 0.25
Gly GGT 0.18 Ser TCG 0.06
Gly GGC* 0.33 Ser TCA 0.15
His CAT 0.41 Ser TCT 0.18
His CAC* 0.59 Ser TCC 0.23
Ile ATA 0.14 Thr ACG 0.12
Ile ATT 0.35 Thr ACA 0.27
Ile ATC* 0.52 Thr ACT 0.23
Lys AAG* 0.60 Thr ACC* 0.38
Lys AAA 0.40 Val GTG* 0.48
Leu TTG 0.12 Val GTA 0.10
Leu TTA 0.06 Val GTT 0.17
Leu CTG* 0.43 Val GTC 0.25
Leu CTA 0.07 Trp TGG* 1
Leu CTT 0.12 Tyr TAT 0.42
Leu CTC 0.20 Tyr TAC* 0.58
Met ATG* 1 Stop TGA* 0.61
Asn AAT 0.44 Stop TAG 0.17
Asn AAC* 0.56 Stop TAA 0.22
*: 특정 아미노산에 대해 가장 빈번한 인간 코돈
실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA가 변형될 수 있고, 여기서 코돈 적응 지수(CAI)는 적어도 하나의 cds (본원에서 "CAI 최대화 코딩 서열"로 지칭됨)에서 증가되거나 바람직하게는 최대화될 수 있다. 따라서, 예를 들어 인간 세포에서 비교적 희귀한 야생형 핵산 서열의 모든 코돈이 예를 들어 인간 세포에서 빈번한 각각의 코돈으로 코돈으로 교환되는 것이 바람직하며, 여기서 빈번한 코돈은 상대적으로 희귀한 코돈과 동일한 아미노산을 코딩한다. 적절하게는, 가장 빈번한 코돈이 각각의 코딩된 아미노산 (표 1 참조, 가장 빈번한 인간 코돈은 별표로 표시됨)에 사용된다. 적절하게는, RNA는 적어도 하나의 cds를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 cds의 코돈 적응 지수(CAI)는 적어도 0.5, 적어도 0.8, 적어도 0.9 또는 적어도 0.95이다. 가장 바람직하게는, 적어도 하나의 cds의 코돈 적응 지수(CAI)는 1이다. 예를 들어, 아미노산 Ala의 경우, 야생형 cds는 가장 빈번한 인간 코돈 "GCC"가 항상 상기 아미노산에 사용되는 방식으로 조정된다. 따라서, 이러한 절차(Ala에 대해 예시됨)는 CAI 최대화된 cds를 얻기 위해 cds에 의해 암호화된 각 아미노산에 적용된다.
실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA(코딩 RNA 또는 mRNA)는 바람직하게는 RNA를 안정화 및/또는 코딩된 펩티드 또는 단백질의 발현을 향상시키는 5'-캡 구조의 추가에 의해 변형될 수 있다. 5'-캡 구조는 치료 RNA가 선형, 예를 들어 선형 mRNA 또는 선형 레플리콘 RNA인 실시태양에서 특히 중요하다. 따라서 바람직한 실시태양에서, 제1 성분의 치료 RNA, 바람직하게 mRNA는 5'-캡 구조를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 5'-캡 구조는 m7G(m7G(5')ppp(5')G), cap0, cap1, cap2, 변형된 cap0 또는 변형된 cap1 구조이다.
본 명세서에 사용된 용어 "5'-캡 구조"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 RNA, 예를 들어 mRNA의 5'-말단에 위치한 5' 변형된 뉴클레오티드, 특히 구아닌 뉴클레오티드를 가리키는 것으로 의도된다. 일반적으로 5'-캡 구조는 5'-5'-트리포스페이트 결합을 통해 RNA에 연결된다.
본 발명의 맥락에서 적합한 5'-캡 구조는 cap0(첫 번째 뉴클레오베이스의 메틸화, 예를 들어 m7GpppN), cap1 (m7GpppN의 인접 뉴클레오티드의 리보스의 추가 메틸화), cap2(m7GpppN의 다운스트림에 있는 2번째 뉴클레오티드의 리보스의 추가 메틸화), cap3(m7GpppN의 다운스트림에 있는 3번째 뉴클레오티드의 리보스의 추가 메틸화), cap4(m7GpppN의 다운스트림에 있는 4번째 뉴클레오티드의 리보스의 추가 메틸화), ARCA(항-역 캡 유사체), 변형 ARCA(예: 포스포티오에이트 변형 ARCA), 이노신, N1-메틸-구아노신, 2'-플루오로-구아노신, 7-데아자-구아노신, 8-옥소-구아노신, 2-아미노-구아노신 , LNA-구아노신, 및 2-아지도-구아노신이다.
5'-cap(cap0 또는 cap1) 구조는 cap 유사체를 사용하여 화학적 RNA 합성 또는 RNA 시험관 내 전사(공동 전사 캡핑)에서 형성될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "캡 유사체"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어, 핵산 분자의 5'-말단에 통합될 때, 번역 또는 국소화 (localization)를 촉진하고/하거나 핵산 분자, 특히 RNA 분자의 분해를 방지한다는 점에서 캡 기능을 갖는 비중합성(non-polymerizable) 디-뉴클레오티드 또는 트리-뉴클레오티드를 지칭하는 것으로 의도된다. 비중합성은 캡 유사체가 5' 말단에만 통합될 것임을 의미하며, 왜냐하면 5'트리포스페이트가 없기 때문이고 그러므로 템플릿 의존적 RNA 중합효소에 의해 3' 방향으로 확장될 수 없다. 캡 유사체의 예는 m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC; 메틸화되지 않은 캡 유사체(예: GpppG); 디메틸화된 캡 유사체(예: m2,7GpppG), 트리메틸화된 캡 유사체(예: m2,2,7GpppG), 디메틸화된 대칭 캡 유사체(예: m7Gpppm7G), 또는 항 역방향 (anti reverse) 캡 유사체(예: ARCA; m7,2’OmeGpppG, m7,2’dGpppG, m7,3’OmeGpppG, m7,3’dGpppG 및 이들의 테트라포스페이트 유도체)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 하나이며 이에 제한되지 않는다. 추가 캡 유사체는 이전에 기술되었다(WO2008/016473, WO2008/157688, WO2009/149253, WO2011/015347, 및 WO2013/059475). 이러한 맥락에서 추가의 적합한 캡 유사체는 WO2017/066793, WO2017/066781, WO2017/066791, WO2017/066789, WO2017/053297, WO2017/066782, WO2018/075827 및 WO2017/066797에 기재되어 있고, 캡 유사체를 언급하는 개시는 본원에 참조로 포함된다. 바람직한 캡 아날로그는 공동 전사적으로 cap0 구조를 생성하기 위한 디-뉴클레오티드 캡 유사체 m7G(5')ppp(5')G(m7G) 또는 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G이다.
실시양태에서, 변형된 cap1 구조는 WO2017/053297, WO2017/066793, WO2017/066781, WO2017/066791, WO2017/066789, WO2017/066782, WO2018/075827 및 WO2017/066797에 개시된 바와 같은 트리-뉴클레오티드 캡 유사체를 사용하여 생성된다. 특히, WO2017/053297의 청구항 1 내지 5에 개시된 구조로부터 유도가능한 임의의 캡 구조는 변형된 cap1 구조를 공동-전사적으로 생성하는데 적합하게 사용될 수 있다. 또한, WO2018075827의 청구항 1 또는 청구항 21에 정의된 구조로부터 유도된 임의의 캡 구조는 변형된 cap1 구조를 생성하는데 적합하게 사용될 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA, 바람직하게는 mRNA는 cap1 구조를 포함한다. cap1 구조는 효소적으로 또는 공동-전사적으로 형성될 수 있다 (예: m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG 유사체를 사용하여). RNA, 바람직하게는 mRNA를 포함하는 cap1 구조는 본 발명의 맥락에서 증가된 번역 효율 및 선천성 면역계의 감소된 자극을 포함하는 몇 가지 유리한 특징을 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 5'-캡 구조는 본원에 정의된 바와 같은 RNA 시험관내 전사 반응에서 본원에 정의된 바와 같은 트리-뉴클레오티드 캡 유사체를 사용하여 공동-전사적으로 추가될 수 있다. 제1 성분의 RNA가 cap1 구조를 포함하는 것이 유리하며, 여기서 상기 cap1 구조는 공동-전사 캡핑에 의해 얻어질 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 치료 RNA의 cap1 구조는 트리-뉴클레오티드 캡 유사체 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG을 사용하여 공동-전사 캡핑을 사용하여 형성된다. 이러한 맥락에서 선호되는 cap1 유사체는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG이다.
이론에 구속되지 않고, 공동-전사 캡핑을 사용하여 cap1 구조를 생성하는 유리한 효과는 효소 캡핑에 비해 개선된 캡핑 효율에 의해 설명될 수 있고, 및/또는 효소 캡핑은 중간 cap1 구조를 생성할 수도 있다 (예: 5' 캡의 부분 메틸화 및/또는 5' 캡 뒤의 리보스 부분).
다른 실시양태에서, 5'-캡 구조는 cap0 또는 cap1 또는 cap2 구조를 생성하기 위해 캡핑 효소(예를 들어, 백시니아 바이러스 캡핑 효소 및/또는 캡 의존성 2'-O-메틸트랜스퍼라제)를 사용한 효소적 캡핑을 통해 형성된다. 5'-캡 구조(cap0 또는 cap1)는 WO2016/193226에 개시된 방법 및 수단을 사용하여 고정된 캡핑 효소 및/또는 캡-의존성 2'-O-메틸트랜스퍼라제를 사용하여 추가할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA(종)의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%는 캡핑 어세이를 사용하여 결정된 바와 같은 cap1 구조를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA(종)의 약 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만은 캡핑 어세이를 사용하여 결정된 바와 같은 cap1 구조를 포함하지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA(종)의 약 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만은 캡핑 어세이를 이용하여 결정된 cap0 구조를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 코딩 RNA(종)의 약 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만은 캡핑 어세이를 사용하여 결정된 cap1 중간체 구조를 포함한다.
"치료 RNA 종"이라는 용어는 "하나의 단일 분자"를 의미하는 것으로 제한되지 않고 본질적으로 동일한 RNA 치료 분자의 앙상블을 포함하는 것으로 이해된다. 이 용어는 바람직하게는 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 본질적으로 동일한 코딩 RNA 분자의 복수 (plurality)와 관련될 수 있다.
캡핑 정도 또는 cap1 중간체의 존재를 결정하기 위해, 공개된 PCT 출원 WO2015101416, 특히 공개된 PCT 출원 WO2015101416의 청구항 27 내지 46에 기재된 바와 같은 캡핑 어세이가 사용될 수 있다. 치료 RNA의 캡핑 정도를 결정하는 데 사용할 수 있는 다른 캡핑 분석은 PCT/EP2018/08667 또는 공개된 PCT 출원 WO2014/152673 및 WO2014152659에 설명되어 있다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA(코딩 RNA 또는 mRNA)는 5' 말단 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA) 캡 구조를 포함한다. 이러한 실시양태에서, RNA는 5' 말단 m7G 캡, 및 m7GpppN의 인접한 뉴클레오티드의 리보스의 추가 메틸화를 포함한다, 이 경우, 2'O 메틸화된 아데노신.
다른 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA(코딩 RNA 또는 mRNA)는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG) 캡 구조를 포함한다. 이러한 실시양태에서, RNA는 5' 말단 m7G 캡, 및 인접한 뉴클레오티드의 리보스의 추가 메틸화를 포함한다, 이 경우에 2'-O-메틸화 구아노신.
따라서, 본 발명의 맥락에서 치료 코딩 RNA가 언급될 때마다, 상기 코딩 RNA 또는 mRNA 서열의 첫 번째 뉴클레오티드, 즉 m7G(5')ppp 구조의 뉴클레오티드 다운스트림은 2'-O-메틸화 구아노신 또는 2'-O-메틸화 아데노신일 수 있다.
RNA의 안정성 또는 효율성은 또한 예를 들어 제1 성분의 치료 RNA의 변형된 포스페이트 백본에 의해 영향을 받을 수 있다. 백본 변형은 RNA의 뉴클레오티드의 백본의 포스페이트가 화학적으로 변형된 변형일 수 있다. 바람직하게 사용될 수 있는 뉴클레오티드는 예를 들어, 바람직하게는 포스페이트 백본에 포함된 적어도 하나의 포스페이트 산소가 황 원자로 대체된 포스포로티오에이트-변형된 포스페이트 백본을 포함한다. 안정화된 RNA는 예를 들어 비이온성 포스페이트 유사체, 예를 들어, 하전된 포스포네이트 산소가 알킬 또는 아릴기로 대체된 알킬 및 아릴 포스포네이트, 또는 하전된 산소 잔기가 알킬화된 형태로 존재하는 포스포디에스테르 및 알킬포스포트리에스테르를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 백본 변형은 일반적으로 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트 및 포스포로티오에이트(예: 시티딘-5'-O-(1-티오포스페이트))로 이루어진 군으로부터 변형을 포함한다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 백본 변형된 뉴클레오티드, 당 변형된 뉴클레오티드 및/또는 염기 변형된 뉴클레오티드 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다 .
본 발명의 맥락에서 백본 변형은 뉴클레오티드 백본의 포스페이트가 화학적으로 변형된 변형이다. 본 발명의 맥락에서 당 변형은 RNA의 뉴클레오티드 당의 화학적 변형이다. 본 발명의 맥락에서 염기 변형은 RNA의 뉴클레오티드의 염기 모이어티의 화학적 변형이다. 이러한 맥락에서, 뉴클레오티드 유사체 또는 변형은 바람직하게는 전사 및/또는 번역에 적용 가능한 뉴클레오티드 유사체/변형된 뉴클레오티드로부터 선택된다. 바람직하게는, 선천성 면역계의 감소된 자극을 나타내는 뉴클레오티드 유사체/변형된 뉴클레오티드가 선택된다(이러한 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNA의 생체내 투여 후).
실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 RNA에 혼입될 수 있는 뉴클레오티드 유사체/변형은 바람직하게는 2-아미노-6-클로로퓨린리보사이드-5'-트리포스페이트, 2-아미노퓨린-리보사이드-5'-트리포스페이트; 2-아미노아데노신-5'-트리포스페이트, 2'-아미노-2'-데옥시시티딘-트리포스페이트, 2-티오시티딘-5'-트리포스페이트, 2-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 2'-플루오로티미딘-5'-트리포스페이트, 2 '-O-메틸-이노신-5'-트리포스페이트 4-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴시티딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴루리딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5'-트리포스페이트, 5- 브로모우리딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도시티딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도-2' -데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도우리딘-5'-트리포스페이트, 5-요오도-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸우리딘-5'-트리포스페이트, 5 -프로피닐-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-프로피닐-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 6-아자시티딘-5'-트리포스페이트, 6-아자우리딘-5'-트리포스페이트, 6-클로로퓨린리보사이드-5 '-트리포스페이트, 7-데아자아데노신-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 8-아자아데노신-5'-트리포스페이트, 8-아지도아데노신-5'-트리포스페이트, 벤즈이미다졸-리보사이드-5'-트리포스페이트, N1-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, N1-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, N6-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, O6-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, 슈도우리딘-5'- 트리포스페이트, 또는 퓨로마이신-5'-트리포스페이트, 크산토신-5'-트리포스페이트. 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5'-트리포스페이트, 및 슈도우리딘- 5'-트리포스페이트, 피리딘-4-온 리보뉴클레오시드, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈두우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시우리딘, 3- 메틸우리딘, 5-카복시메틸-우리딘, 1-카복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸- 4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2- 티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디히드로우리딘, 디히드로슈도우리딘, 2-티오-디히드로우리딘, 2-티오-디히드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 및 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 5-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포르밀시티딘, N4 -메틸시티딘, 5-하이드록시메틸시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 제불린, 5-아자-제불린, 5-메틸-제불린, 5-아자-2-티오-제불린, 2-티오-제불린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시- 슈도이소시티딘, 및 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6- 디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, N6-글리시닐카바모일아데노신, N6-트레오닐카바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 2-메톡시-아데닌, 메틸요이노신 와이부토신, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7- 메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8- 옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, 및 N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-아데노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-시티딘, 5'-O-(1-티오포스페이트)-구아노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-우리딘, 5'-O-(1-티오포스페이트)-슈도우리딘, 6-아자-시티딘, 2-티오-시티딘, 알파-티오-시티딘, 슈도-이소-시티딘, 5-아미노알릴-우리딘, 5-요오도-우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 5,6-디히드로우리딘, 알파-티오-우리딘, 4-티오-우리딘, 6-아자-우리딘, 5-히드록시-우리딘, 데옥시-티미딘, 5-메틸-우리딘, 피롤로-시티딘, 이노신, 알파-티오-구아노신, 6-메틸-구아노신, 5-메틸-시티딘, 8-옥소-구아노신, 7-데아자-구아노신, N1-메틸-아데노신, 2-아미노-6-클로로-퓨린, N6-메틸- 2-아미노-퓨린, 슈도-이소-시티딘, 6-클로로-퓨린, N6-메틸-아데노신, 알파-티오-아데노신, 8-아지도-아데노신, 7-데아자-아데노신으로부터 선택된다.
실시양태에서, 적어도 하나의 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, N1-에틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 5-메틸우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디히드로슈도우리딘, 2-티오-디히드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디히드로슈도우리딘, 5-메톡시우리딘 및 2'-O-메틸 우리딘으로부터 선택된다.
실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA의 cds에 있는 우라실의 100%는 화학적 변형, 바람직하게는 우라실의 5번 위치에 있는 화학적 변형을 가진다. 실시양태에서, cds내의 우라실 뉴클레오티드의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%는 화학적 변형, 바람직하게는 상기 우라실 뉴클레오티드의 5번 위치에 화학적 변형을 갖는다. 이러한 변형은 본 발명의 맥락에서 적합하며, 그 이유는 천연 우라실의 감소가 세포에 투여 시 제1 성분에 의해 잠재적으로 야기되는 (이러한 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 RNA의 생체 내 투여 후) 선천성 면역계의 자극을 감소할 수 있기 때문이다.
적합하게는, 제1 성분의 치료 RNA, 특히 상기 치료 RNA의 cds는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 슈도우리딘(ψ), N1-메틸슈도우리딘(m1ψ), 5-메틸시토신, 및 5-메톡시우리딘으로부터 선택될 수 있으며, 여기서 슈도우리딘(ψ)이 바람직하다.
본 발명의 맥락에서, 제1 성분의 치료 RNA, 바람직하게 mRNA는 본원에 정의된 5'-캡 구조, 바람직하게는 Cap1 구조를 포함하고 본원에 정의된 임의의 변형된 뉴클레오티드가 없는 것이 바람직하다. 따라서, 제1 성분의 치료 RNA는 5'-캡 구조, 및 A, U, G, C 뉴클레오티드를 포함하는 RNA 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 RNA 서열은 임의의 변형된 뉴클레오티드가 없다.
대안적 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA, 바람직하게 mRNA는 본원에 정의된 5'-캡 구조, 바람직하게는 Cap1 구조를 포함하고, 추가로 본원에 정의된 바와 같은 변형된 뉴클레오티드, 바람직하게는 슈도우리딘(ψ), N1 - 메틸슈도우리딘(m1ψ), 5-메틸시토신 및 5-메톡시우리딘으로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
실시양태에서, 치료(코딩) RNA의 리보솜 결합 부위의 서열 환경에서 A/U 함량은 각각의 야생형 핵산의 리보솜 결합 부위 환경에서 A/U 함량과 비교하여 증가될 수 있다. 이 변형(리보솜 결합 부위 주변의 증가된 A/U 함량)은 리보솜이 RNA에 결합하는 효율을 증가시킨다. 리보솜 결합 부위에 대한 리보솜의 효과적인 결합은 차례로 RNA의 효율적인 번역 효과를 갖는다.
따라서, 특히 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료적 (코딩) RNA는 리보솜 결합 부위를 포함하며, 이는 "코작 서열"로도 지칭되며, 서열번호: 3 또는 4 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 동일한 서열을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA, 바람직하게는 mRNA는 적어도 하나의 폴리(A) 서열, 및/또는 적어도 하나의 폴리(C) 서열, 및/또는 적어도 하나의 히스톤 스템- 루프 서열/구조를 포함한다.
따라서, 제1 성분의 치료적 (코딩) RNA는 적어도 하나의 폴리(N) 서열, 예를 들어, 적어도 하나의 폴리(A) 서열, 적어도 하나의 폴리(U) 서열, 적어도 하나의 폴리(C) 서열, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 치료적 (코딩) RNA는 적어도 하나의 폴리(A) 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "폴리(A) 서열", "폴리(A) 테일" 또는 "3'-폴리(A) 테일"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 일반적으로 최대 약 1000개의 아데노신 뉴클레오티드로 구성된 코딩 RNA의 3'-말단에 위치한 아데노신 뉴클레오티드 서열인 것으로 의도된다. 상기 폴리(A) 서열은 본질적으로 단독중합체, 예를 들어 100 아데노신 뉴클레오티드의 폴리(A) 서열은 100 개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 다른 실시양태에서, 폴리(A) 서열은 아데노신 뉴클레오티드와 상이한 적어도 하나의 뉴클레오티드에 의해 중단될 수 있다.
본원에 정의된 3' UTR의 하류에 적절하게 위치한 폴리(A) 서열은 약 10 내지 약 500개의 아데노신 뉴클레오티드, 약 30 내지 약 500개의 아데노신 뉴클레오티드, 약 30 내지 약 200개의 아데노신 뉴클레오티드, 또는 약 50 내지 약 150개의 아데노신 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 적합하게는, 폴리(A) 서열의 길이는 적어도 약 30, 50, 64, 75, 100, 200, 300, 400, 또는 500개 이상의 아데노신 뉴클레오티드일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리(A) 서열은 약 50 내지 약 250개의 아데노신을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 폴리(A) 서열은 약 64개의 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 폴리(A) 서열은 약 100개의 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 정의된 폴리(A) 서열은 치료 RNA(예: mRNA)의 3' 말단에 적합하게 위치한다. 따라서 RNA의 3' 말단 뉴클레오티드(즉, 폴리뉴클레오티드 사슬의 마지막 3' 말단 뉴클레오티드)는 적어도 하나의 폴리(A) 서열의 3' 말단 A 뉴클레오티드인 것이 바람직하다. "3' 말단에 위치"라는 용어는 정확히 3' 말단에 위치하는 것으로 이해되어야 한다. 즉, RNA의 3' 말단은 A 뉴클레오티드로 끝나는 폴리(A) 서열로 구성된다.
바람직하게는, 제1 성분의 치료 RNA의 폴리(A) 서열은 RNA 시험관내 전사 동안 DNA 주형으로부터 수득된다. 다른 실시양태에서, 폴리(A) 서열은 DNA 주형으로부터 반드시 전사될 필요 없이 화학적 합성의 일반적인 방법에 의해 시험관내에서 수득된다. 다른 실시양태에서, 폴리(A) 서열은 상업적으로 입수가능한 폴리아데닐화 키트 및 당업계에 공지된 상응하는 프로토콜을 사용하여 만들어지거나, 또는 대안적으로 고정된 폴리(A)중합효소를 사용하여, 예를 들어 WO2016/174271에 기술된 방법 및 수단을 사용하여 만들어진다.
따라서, 치료 RNA는 효소적 폴리아데닐화에 의해 수득된 폴리(A)서열을 포함할 수 있으며, 여기서 대부분의 RNA 분자는 약 100(+/-10) 내지 약 500(+/-50), 바람직하게는 약 250(+/- 25) 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다.
실시양태에서, 치료 RNA는 주형 DNA로부터 유래된 폴리(A) 서열을 포함할 수 있고, WO2016/091391에 기재된 바와 같이 효소적 폴리아데닐화에 의해 생성된 적어도 하나의 추가 폴리(A) 서열을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA는 적어도 하나의 폴리(C) 서열을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 적합하게는 3' 말단에 또는 3' 말단에 근접하여 위치한 폴리(C) 서열은 약 10 내지 200개의 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 100개의 시토신 뉴클레오티드, 또는 약 10 내지 50개의 시토신 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리(C) 서열은 약 30개의 시토신 뉴클레오티드를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA는 적어도 하나의 히스톤 스템-루프(histone stem-loop)를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "히스톤 스템-루프"("hsl"로 약칭됨)는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 히스톤 mRNA에서 주로 발견되는 핵산 서열을 가리키는 것으로 의도된다.
히스톤 스템-루프 서열/구조는 WO2012/019780에 개시된 바와 같은 히스톤 스템-루프 서열로부터 적절하게 선택될 수 있으며, 그 개시내용은 히스톤 스템-루프 서열/히스톤 스템-루프 구조에 관한 개시가 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 히스톤 스템-루프 서열은 바람직하게는 WO2012/019780의 화학식 (I) 또는 (II)로부터 유래될 수 있다. 추가의 바람직한 실시양태에 따르면, 코딩 RNA는 특허 출원 WO2012/019780의 특정 화학식 (Ia) 또는 (IIa) 중 적어도 하나로부터 유래된 적어도 하나의 히스톤 스템-루프 서열을 포함할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA는 적어도 하나의 히스톤 스템-루프 서열을 포함하고, 여기서 상기 히스톤 스템-루프 서열은 서열번호: 1 또는 2 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA는 3'-말단 서열 요소를 포함한다. 상기 3'-말단 서열 요소는 폴리(A) 서열 및 히스톤-스템-루프 서열, 및 임의로 폴리(C) 서열을 포함하며, 여기서 상기 서열 요소는 본 발명의 RNA의 3' 말단에 위치한다.
따라서, 제1 성분의 치료 RNA는 서열번호: 7 내지 38, 또는 이의 단편 또는 변이체와 동일하거나 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 3' 말단 서열 요소를 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA는 서열번호: 5 또는 6, 또는 그의 단편 또는 변이체에 따른 5'-말단 서열 요소를 포함할 수 있다. 이러한 5'-말단 서열 요소는 예를 들어, T7 RNA 중합효소의 결합 부위를 포함한다. 또한, 상기 5'-말단 시작 서열의 첫 번째 뉴클레오티드는 바람직하게는 2'-O-메틸화를 포함할 수있으며, 예를 들어, 2'-O-메틸화 구아노신 또는 2'-O-메틸화 아데노신을 포함할 수 있다.
제1 성분의 치료 RNA, 바람직하게는 mRNA는 cds, 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함할 수 있다. UTR(비번역 영역)은 RNA 턴오버, 안정성 및/또는 국소화를 결정하는 조절 서열 요소 또는 모티프를 보유할 수 있다. UTR은 또한 번역을 향상시키는 서열 요소 또는 모티프를 보유할 수 있다. RNA의 의학적 적용에서 cds를 하나 이상의 펩타이드 또는 단백질로 번역하는 것은 치료 효능에 가장 중요하다. 3'-UTR 및/또는 5'-UTR의 특정 조합은 상기 정의된 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현을 향상시킬 수 있다. 상기 UTR 조합을 포함하는 RNA는 대상체에 투여 후 코딩된 펩티드 또는 단백질의 신속하고 일시적인 발현을 유리하게 가능하게 한다.
따라서, 제1 성분의 치료 RNA, 바람직하게는 mRNA는 3'-UTR 및/또는 5'-UTR의 특정 조합을 포함할 수 있으며, 그 결과 치료 단백질(예: CRISPR-연관 엔도뉴클레아제 또는 항원)의 (향상된) 번역이 생생성되고, 따라서 치료적으로 관련된 세포 또는 조직에서 단백질이 발현된다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA, 바람직하게는 mRNA는 적어도 하나의 이종 5'-UTR 및/또는 적어도 하나의 이종 3'-UTR을 포함한다. 상기 5'-UTR 또는 3'-UTR은 자연적으로 발생하는 유전자로부터 유래되거나 합성 조작될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, RNA는 적어도 하나의 (이종) 3'-UTR 및/또는 적어도 하나의 (이종) 5'-UTR에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 cds를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA는 적어도 하나의 이종 3'-UTR을 포함한다.
용어 "3'-비번역 영역" 또는 "3'-UTR" 또는 "3'-UTR 요소"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 단백질로 번역되지 않는 cds의 3'(즉, 다운스트림)에 위치한 RNA의 일부를 지칭하기 위한 것으로 의도된다. 3'-UTR은 RNA, 예를 들어 cds와 말단 폴리(A) 서열 사이에 위치한 mRNA의 일부일 수 있다. 3'-UTR은 조절 요소(regulatory elements)라고도 하는 유전자 발현을 제어하기 위한 요소를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 예를 들어, 리보솜 결합 부위, miRNA 결합 부위 등일 수 있다.
바람직하게는, 제1 성분의 치료 RNA, 바람직하게는 mRNA는 3'-UTR을 포함하며, 이는 반감기가 향상된(즉, 안정한 RNA를 제공하는) RNA와 관련된 유전자로부터 유도될 수 있다.
일부 실시양태에서, 3'-UTR은 하나 이상의 폴리아데닐화 신호, 세포 내 위치의 RNA 안정성에 영향을 미치는 단백질에 대한 결합 부위, 또는 하나 이상의 miRNA 또는 miRNA에 대한 결합 부위를 포함한다.
마이크로RNA(또는 miRNA)는 핵산 분자의 3'-UTR에 결합하고 핵산 분자 안정성을 감소시키거나 번역을 억제함으로써 유전자 발현을 하향 조절하는 19-25개 뉴클레오티드 길이의 비암호화 RNA이다. 예를 들어, 마이크로RNA는 RNA를 조절하여 단백질 발현을 조절하는 것으로 알려져 있으며, 예를 들면, 간에서(miR-122), 심장에서(miR-ld, miR-149), 내피 세포에서(miR-17-92, miR-126), 지방 조직에서(let-7, miR-30c), 신장에서(miR-192, miR-194, miR-204), 골수 세포에서(miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), 근육에서(miR- 133, miR-206, miR-208) 및 폐 상피 세포(let-7, miR-133, miR-126). 제1 성분의 치료적 RNA는 하나 이상의 마이크로RNA 표적 서열, 마이크로RNA 서열, 또는 마이크로RNA 시드를 포함할 수 있다. 이러한 서열은 예를 들어 US2005/0261218 및 US2005/0059005에 교시된 것과 같은 알려진 마이크로RNA에 해당할 수 있다.
따라서, 원하는 세포 유형 또는 조직에 치료 RNA의 발현 또는 활성을 조정하기 위해 miRNA 또는 위에서 정의한 miRNA에 대한 결합 부위를 3'-UTR에서 제거하거나 3'-UTR에 도입할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA, 바람직하게는 mRNA는 적어도 하나의 이종 3'-UTR을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 이종 3'-UTR은 PSMB3, ALB7, 알파-글로빈 (“muag”로 지칭됨), CASP1, COX6B1, GNAS, NDUFA1 및 RPS9로부터 선택된 유전자 또는 이들 유전자 중 어느 하나의 상동체, 단편, 또는 변이체 의 3’-UTR 로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다.
이러한 맥락에서 특히 바람직한 핵산 서열은 공개된 PCT 출원 WO2019/077001A1, 특히 WO2019/077001A1의 청구항 9로부터 유래될 수 있다. WO2019/077001A1의 제9항의 상응하는 3'-UTR 서열은 본원에 참조로 포함된다(예를 들어, WO2019/077001A1의 서열 번호: 23 내지 34, 또는 이의 단편 또는 변이체).
다른 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA, 바람직하게는 mRNA는 본원에 참조로 포함되는 3'-UTR 서열에 관한 WO2016/107877의 개시내용인 WO2016/107877에 기재된 바와 같은 3'-UTR을 포함한다. 적합한 3'-UTR은 WO2016/107877의 서열번호: 1 내지 24 및 서열번호: 49 내지 318 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다. 다른 구현예에서, 치료적 RNA는 WO2017/036580에 기술된 바와 같은 3'-UTR을 포함하며, WO2017/036580의 개시내용은 3'-UTR 서열과 관련하여 본원에 참조로 포함된다. 적합한 3'-UTR은 WO2017/036580의 서열번호: 152 내지 204 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다. 다른 실시양태에서, 치료 RNA는 WO2016/022914에 기재된 바와 같은 3'-UTR을 포함하며, WO2016022914의 개시내용은 본원에 참조로 포함되는 3'-UTR 서열에 관한 것이다. 특히 바람직한 3'-UTR은 WO2016/022914의 서열번호: 20 내지 36 에 따른 핵산 서열, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다.
바람직한 실시양태에서, 사용하기 위한 조성물의 코딩 RNA는 적어도 하나의 이종 5'-UTR을 포함한다.
용어 "5'-비번역 영역" 또는 "5'-UTR" 또는 "5'-UTR 요소"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 단백질로 번역되지 않는, cds의 5'(즉, "업스트림")에 위치한 RNA의 일부를 가리키는 것으로 의도된다. 5'-UTR은 cds의 5'에 위치한 RNA의 일부일 수 있다. 일반적으로, 5'-UTR은 전사 시작 부위에서 시작하여 cds의 시작 코돈 앞에서 끝난다. 5'-UTR은 조절 요소라고 하는 유전자 발현을 제어하기 위한 요소를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 예를 들어 리보솜 결합 부위, miRNA 결합 부위 등이 될 수 있다. 5'-UTR은 예를 들어, 5'-캡 구조의 효소적 또는 전사 후 추가(위 참조)에 의해 전사 후 변경될 수 있다.
바람직하게는, 제1 성분의 치료학적 RNA, 바람직하게는 mRNA는 5'-UTR을 포함하며, 이는 반감기가 향상된(즉, 안정한 RNA를 제공하는) RNA와 관련된 유전자로부터 유도될 수 있다.
일부 실시양태에서, 5'-UTR은 세포 내 위치의 RNA 안정성에 영향을 미치는 단백질에 대한 하나 이상의 결합 부위, 또는 하나 이상의 miRNA 또는 miRNA에 대한 결합 부위 (상기 정의된 바와 같은)를 포함한다.
따라서, 상기 정의된 바와 같은 miRNA 또는 miRNA에 대한 결합 부위는 원하는 세포 유형 또는 조직에 치료 RNA의 발현 또는 활성을 맞춤화하기 위해 5'-UTR에서 제거되거나 5'-UTR로 도입될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA, 바람직하게는 mRNA는 적어도 하나의 이종 5'-UTR을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 이종 5'-UTR은 HSD17B4, RPL32, ASAH1, ATP5A1, MP68, NDUFA4, NOSIP, RPL31, SLC7A3, TUBB4B, 및 UBQLN2, 또는 이들 유전자의 상동체, 단편, 또는 변이체로부터 선택된 유전자의 인간 및/또는 뮤린 5’-UTR로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다. 이러한 맥락에서 특히 바람직한 핵산 서열은 공개된 PCT 출원 WO2019/077001A1, 특히 WO2019/077001A1의 청구항 9로부터 유래될 수 있다. WO2019/077001A1의 제9항의 상응하는 5'-UTR 서열은 본원에 참조로 포함된다(예를 들어, WO2019/077001A1의 서열 번호: 1-20, 또는 이의 단편 또는 변이체).
적합하게는, 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA, 바람직하게는 mRNA는 다음의 3'-UTR/5'-UTR 조합으로부터 선택된 3'-UTR 및/또는 5'-UTR에 작동가능하게 연결된, 본원에 구체화된 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 cds를 포함한다: a-1 (HSD17B4/PSMB3), a-2 (NDUFA4/PSMB3), a-3 (SLC7A3/PSMB3), a-4 (NOSIP/PSMB3), a-5 (MP68/PSMB3), b-1 (UBQLN2/RPS9), b-2 (ASAH1/RPS9), b-3 (HSD17B4/RPS9), b-4 (HSD17B4/CASP1), b-5 (NOSIP/COX6B1), c-1 (NDUFA4/RPS9), c-2 (NOSIP/NDUFA1), c-3 (NDUFA4/COX6B1), c-4 (NDUFA4 /NDUFA1), c-5 (ATP5A1/PSMB3), d-1 (Rpl31/PSMB3), d-2 (ATP5A1/CASP1), d-3 (SLC7A3/GNAS), d-4 (HSD17B4/NDUFA1), d-5 (Slc7a3/Ndufa1), e-1 (TUBB4B/RPS9), e-2 (RPL31/RPS9), e-3 (MP68/RPS9), e-4 (NOSIP/RPS9), e-5 (ATP5A1/RPS9), e-6 (ATP5A1/COX6B1), f-1 (ATP5A1/GNAS), f-2 (ATP5A1/NDUFA1), f-3 (HSD17B4/COX6B1), f-4 (HSD17B4/GNAS), f-5 (MP68/COX6B1), g-1 (MP68/NDUFA1), g-2 (NDUFA4/CASP1), g-3 (NDUFA4/GNAS), g-4 (NOSIP/CASP1), g-5 (RPL31/CASP1), h-1 (RPL31/COX6B1), h-2 (RPL31/GNAS), h-3 (RPL31/NDUFA1), h-4 (Slc7a3/CASP1), h-5 (SLC7A3/COX6B1), i-1 (SLC7A3/RPS9), i-2 (RPL32/ALB7), i-2 (RPL32/ALB7), 또는 i-3 (α-글로빈 유전자/-).
이러한 맥락에서, 상기 정의된 적합한 5'-UTR 서열은 서열번호: 44-65, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있거나 그로부터 유래될 수 있고, 상기 정의된 바와 같은 적합한 3'-UTR 서열은 서열번호: 66-81, 185, 186이거나, 또는 이로부터 유래될 수 있다.
다른 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA, 바람직하게는 mRNA는 본원에 참조로 포함된 5'-UTR 서열에 관한 WO2013/143700의 개시내용인 WO2013/143700에 기재된 바와 같은 5'-UTR을 포함한다. 특히 바람직한 5'-UTR은 WO2013/143700의 서열번호: 1-1363, 서열번호: 1395, 서열번호: 1421 및 서열번호: 1422로부터 유래된 핵산 서열, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다. 다른 실시양태에서, 치료 RNA는 WO2016/107877에 기재된 바와 같은 5'-UTR을 포함하며, WO2016/107877의 개시내용은 5'-UTR 서열과 관련하여 본원에 참조로 포함된다. 특히 바람직한 5'-UTR은 WO2016/107877의 서열 25 내지 30 및 서열 319 내지 382에 따른 핵산 서열, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다. 다른 구현예에서, 치료적 RNA는 WO2017/036580에 기술된 바와 같은 5'-UTR을 포함하고, WO2017/036580의 개시내용은 5'-UTR 서열과 관련하여 본원에 참조로 포함된다. 특히 바람직한 5'-UTR은 WO2017/036580의 서열번호: 1 내지 151에 따른 핵산 서열, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다. 다른 실시양태에서, 치료 RNA는 WO2016/022914에 기재된 바와 같은 5'-UTR을 포함하고, WO2016/022914의 개시내용은 5'-UTR 서열과 관련하여 본원에 참조로 포함된다. 특히 바람직한 5'-UTR은 WO2016/022914의 서열번호: 3 내지 19에 따른 핵산 서열, 또는 이들 서열의 단편 또는 변이체이다.
실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA, 바람직하게는 mRNA는 바람직하게는 5'-에서 3'-방향으로 하기 요소를 포함한다:
A) 5’-캡 구조, 바람직하게 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA) 또는m7G(5')ppp(5')(2'OMeG);
B) 5’-말단 시작 요소, 바람직하게 서열번호 5 또는 6 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택됨;
C) 선택적으로, 바람직하게는 본원에 명시된 바와 같은 5'-UTR, 예를 들어 서열번호 44 내지 65로부터 선택됨;
D) 리보솜 결합 부위, 바람직하게는 서열번호 3 또는 4 또는 이의 단편 또는 변이체로부터 선택됨;
E) 본원에 명시된 바와 같은 적어도 하나의 치료 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열;
F) 3'-UTR, 바람직하게는 본원에 명시된 바와 같음, 예를 들어 서열번호 66 내지 81로부터 선택됨;
G) 선택적으로, 약 50 내지 약 500개의 아데노신을 포함하는 폴리(A) 서열;
H) 선택적으로, 약 10 내지 약 100개의 시토신을 포함하는 폴리(C) 서열;
I) 선택적으로, 히스톤 스템-루프(서열), 바람직하게는 서열번호 1 또는 2로부터 선택됨;
J) 선택적으로, 3'-말단 서열 요소 서열번호 7 내지 38.
바람직하게는, 제1 성분의 치료 RNA, 바람직하게는 mRNA는 약 50 내지 약 20000개의 뉴클레오티드, 또는 약 500 내지 약 10000개의 뉴클레오티드, 또는 약 1000 내지 약 10000개의 뉴클레오티드, 또는 바람직하게는 약 1000 내지 약 5000개의 뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 제1 성분(예: 치료용 RNA) 및 제2 성분(예: 핵산 길항제)은 서로 부착된다.
유리하게는, 그러한 부착은 담체에서 복합제형을 단순화할 수 있다(아래에서 설명됨). 이상적으로는, 제1 및 제2 성분이 비공유 결합을 통해 서로 부착되어 생체 내 투여 후 분리가 가능하다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 정의된 제1 성분 및 본원에 정의된 제2 성분을 포함하는 화합물에 관한 것이다.
제1 및/또는 제2 성분의 제형화:
하기에서는, 제2 성분의 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제의 제형화/복합체화에 관한 유리한 실시형태 및 특징을 설명한다. 추가로, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA의 제형화/복합체화에 관한 유리한 실시양태 및 특징이 기재되어 있다. "조합물"(제1 측면)의 맥락에서 제형에 관한 모든 기재된 실시양태 및 특징은 마찬가지로 "조성물"(제2 측면) 또는 "부품의 키트 또는 키트"(제3 측면)에 적용가능하다.
바람직한 실시양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 제2 성분의 핵산 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA는 하나 이상의 양이온성 또는 다중양이온성 화합물, 바람직하게는 양이온성 또는 다중양이온성 중합체, 양이온성 또는 다중양이온성 폴리사카라이드, 양이온성 또는 다중양이온성 지질, 양이온성 또는 다중양이온성 단백질, 또는 양이온성 또는 다중양이온성 펩티드, 또는 이들의 임의의 조합와 착화되거나(complexed) 회합되거나(associated) 적어도 부분적으로 착화되거나 부분적으로 회합된다.
실시양태에서, 본원에 정의된 제2 성분의 핵산은 하나 이상의 양이온성 또는 다중양이온성 화합물, 바람직하게는 양이온성 또는 다중양이온성 중합체, 양이온성 또는 다중양이온성 다당류, 양이온성 또는 다중양이온성 지질, 양이온성 또는 다중양이온성 단백질, 또는 양이온성 또는 다중양이온성 펩티드, 또는 이들의 임의의 조합에 부착된다. 적합하게는, 제2 성분의 치료적 RNA는 이러한 양이온성 또는 다중양이온성 화합물과 복합체를 형성하거나 회합된다.
본원에 사용된 용어 "양이온성 또는 다중양이온성 화합물"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 pH 값 범위, 약 1 내지 9, 약 3 내지 8 범위의 pH 값에서, 약 4 내지 8 범위의 pH 값에서, 약 5 내지 8 범위의 pH 값에서, 보다 바람직하게는 약 6 내지 8 범위의 pH 값에서, 더욱 더 바람직하게는 약 7 내지 8 범위의 pH 값에서, 가장 바람직하게는 생리학적 pH, 예를 들어 약 7.2 내지 약 7.5 범위에서 양전하를 띠는 하전 분자를 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 양이온성 성분, 예를 들어, 양이온성 펩티드, 양이온성 단백질, 양이온성 폴리머, 양이온성 다당류, 양이온성 지질은 생리학적 조건 하에서 양으로 하전된 임의의 양으로 하전된 화합물 또는 중합체일 수 있다. "양이온성 또는 다중양이온성 펩타이드 또는 단백질"은 적어도 하나의 양으로 하전된 아미노산, 또는 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산, 예를 들어, Arg, His, Lys 또는 Orn로부터 선택된 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서, "다중양이온성 (polycationic)”성분은 또한 주어진 조건에서 하나 이상의 양전하를 나타내는 범위 내에 있다.
양이온성 또는 다중양이온성 화합물, 특히 바람직한 것은 양이온성 또는 다중양이온성 펩티드 또는 이의 단편의 단백질의 다음 목록에서 선택될 수 있다: 프로타민, 뉴클레오린, 스페르민 또는 스페르미딘, 또는 폴리-L-리신(PLL)과 같은 기타 양이온성 펩티드 또는 단백질, 폴리-아르기닌, 염기성 폴리펩티드, HIV-결합 펩티드, HIV-1 Tat(HIV), Tat 유래 펩티드, 페네트라틴(Penetratin)을 포함하는 세포 투과 펩티드(CPP), VP22 유래 또는 유사 펩티드, HSV VP22 (단순 포진(Herpes simplex)), MAP, KALA 또는 단백질 전달 도메인(PTD), PpT620, 프롤린이 풍부한 펩티드, 아르기닌이 풍부한 펩티드, 리신이 풍부한 펩티드, MPG-펩티드(들), Pep-1, L-올리고머, 칼시토닌 펩티드(들), 안테나피디아 유래 펩타이드 (Antennapedia-derived peptides), pAntp, pIsl, FGF, 락토페린, 트랜스포탄( Transportan), 부포린(Buforin)-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, hCT-유래 펩티드, SAP, 또는 히스톤. 더 바람직하게, 상기 코딩 RNA는 하나 이상의 다중양이온과 복합체화되며, 바람직하게 프로타민(protamine) 또는 올리고펙타민(oligofectamine)과, 가장 바람직하게 프로타민과 복합체화된다.
제1 및/또는 제2 성분에 대한 착화제로서 사용될 수 있는 추가의 바람직한 양이온성 또는 다중양이온성 화합물은 양이온성 다당류, 예를 들어, 키토산, 폴리브렌 등; 양이온성 지질, 예를 들어 DOTMA, DMRIE, 디-C14-아미딘, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: 디올레일 포스파티딜에탄올-아민, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS, DIMRI, DOTAP, DC-6-14, CLIP1, CLIP6, CLIP9, 올리고펙타민; 또는 양이온성 또는 다중양이온성 중합체, 예를 들어 베타-아미노산-폴리머 또는 역 폴리아미드 등과 같은 변형된 폴리아미노산, PVP 등과 같은 변형된 폴리에틸렌, pDMAEMA 등과 같은 변형된 아크릴레이트, pAMAM 등과 같은 변형된 아미도아민, 디아민 말단 개질된 1,4 부탄디올 디아크릴레이트-코-5-아미노-1-펜탄올 중합체 등과 같은 변형된 폴리베타아미노에스테르(PBAE), 폴리프로필아민 덴드리머 또는 pAMAM 기반 덴드리머 등과 같은 덴드리머, PEI, 폴리(프로필렌이민) 등과 같은 폴리이민(들), 폴리알릴아민, 시클로덱스트린계 중합체, 덱스트란계 중합체 등과 같은 당 주쇄계 중합체, PMOXA-PDMS 공중합체 등과 같은 실란 주쇄계 중합체, 하나 이상의 양이온성 블록(예를 들어, 상기 언급된 양이온성 중합체로부터 선택됨) 및 하나 이상의 친수성 또는 소수성 블록(예: 폴리에틸렌글리콜)의 조합으로 이루어진 블록중합체; 등을 포함할 수 있다.
제1 및/또는 제2 성분의 복합체화에 사용될 수 있는 바람직한 양이온성 또는 다중양이온성 단백질 또는 펩티드는 특허 출원 WO2009/030481 또는 WO2011/026641의 화학식 (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x 로부터 유도될 수 있고, 이에 관한 WO2009/030481 또는 WO2011/026641의 개시 내용이 참조로 여기에 포함된다.
다양한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 성분의 하나 이상의 양이온성 또는 다중양이온성 펩티드는 서열번호: 39 내지 43, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 제2 성분의 길항제, 바람직하게는 핵산은 서열번호: 39 내지 43 로부터 선택된 하나 이상의 양이온성 또는 다중양이온성 펩티드 또는 이들의 조합과 복합체화되거나 회합되거나 또는 적어도 부분적으로 복합체화되거나 부분적으로 회합된다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA, 바람직하게 mRNA는 서열번호: 39 내지 43 로부터 선택된 하나 이상의 양이온성 또는 다중양이온성 펩티드 또는 이들의 조합과 복합체화되거나 회합되거나 또는 적어도 부분적으로 복합체화되거나 부분적으로 회합된다.
실시양태에서, 본원에 정의된 제2 성분의 핵산은 하나 이상의 양이온성 또는 다중양이온성 중합체와 복합체를 형성하거나 회합되거나 적어도 부분적으로 복합체화되거나 부분적으로 회합된다.
실시양태에서, 본원에 정의된 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA, 바람직하게 mRNA는 하나 이상의 양이온성 또는 다중양이온성 중합체와 복합체를 형성하거나 회합되거나 적어도 부분적으로 복합체화되거나 부분적으로 회합된다.
따라서, 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 성분은 하나 이상의 중합체성 담체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "중합체성 담체"는 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 다른 화합물(예: 첫 번째, 두 번째 성분)의 수송 및/또는 복합체화를 촉진하는 화합물을 가리키는 것으로 의도된다. 중합체성 담체는 전형적으로 중합체로 형성된 담체이다. 중합체성 담체는 공유 또는 비공유 상호작용에 의해 그것의 카고 (cargo) (예: RNA)에 회합될 수 있다. 중합체는 공중합체와 같은 다른 소단위를 기반으로 존재할 수 있다.
이러한 맥락에서 적합한 중합체성 담체는 예를 들어, 폴리아크릴레이트, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리락티드, 폴리락티드-폴리글리콜리드 공중합체, 폴리카프로락톤, 덱스트란, 알부민, 젤라틴, 알지네이트, 콜라겐, 키토산, 시클로덱스트린, 프로타민, PEG화 프로타민, PEG화 PLL 및 폴리에틸렌이민(PEI), 디-미딜프로피온산 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 폴리(에틸렌 이민) 비스카르바메이트(PEIC), 폴리(L-리신)(PLL), 히스티딘 변형 PLL, 폴리(N-비닐피롤리돈)(PVP), 폴리(프로필렌이민(PPI) , 폴리(아미도아민)(PAMAM), 폴리(아미도 에틸렌이민)(SS-PAEI), 트리에틸렌테트라민(TETA), 폴리(β-아미노에스테르), 폴리(4-하이드록시-L-프로인 에스테르)(PHP), 폴리(알릴아민), 폴리(α-[4-아미노부틸]-L-글리콜산(PAGA), 폴리(D,L-락트산-코-글리콜리드산(PLGA), 폴리(N-에틸-4-비닐피리디늄 브로마이드), 폴리(포스파젠)(PPZ), 폴리(포스포에스테르)(PPE), 폴리(포스포아미데이트)(PPA), 폴리(N-2-하이드록시프로필메타크릴아미드)(pHPMA), 폴리(2-(디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트)(pDMAEMA), 폴리(2-아미노에틸 프로필렌 포스페이트) PPE_EA), 갈락토실화 키토산, N-도데실화 키토산, 히스톤, 콜라겐 및 덱스트란-스페민를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 중합체는 PEG와 같으나 이에 제한되지 않는 불활성 중합체일 수 있다. 한 실시양태에서, 중합체는 PEI, PLL, TETA, 폴리(알릴아민), 폴리(N-에틸-4-비닐피리디늄 브로마이드), pHPMA 및 pDMAEMA와 같으나 이에 제한되지 않는 양이온성 중합체일 수 있다. 한 실시양태에서, 중합체는 DSP, DTBP 및 PEIC와 같으나 이에 제한되지 않는 생분해성 PEI일 수 있다. 한 실시양태에서, 중합체는 히스틴 변형된 PLL, SS-PAEI, 폴리(β-아미노에스테르), PHP, PAGA, PLGA, PPZ, PPE, PPA 및 PPE-EA와 같으나 이에 제한되지 않는 생분해성일 수 있다.
적합한 중합체성 담체는 이황화 가교결합된 양이온성 화합물에 의해 형성된 중합체성 담체일 수 있다. 이황화 가교 결합된 양이온성 화합물은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 중합청 담체는 추가 성분 (예: 리피도이드 화합물)을 또한 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 중합체성 담체는 (-SH 기를 통해) 이황화 결합에 의해 가교된, 양이온성 펩티드, 단백질 또는 중합체 및 선택적으로 본원에 정의된 추가 성분의 혼합물을 포함할 수 있다.
이와 관련하여, 공개된 PCT 출원 WO2012/013326의 화학식 (Ia) {(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa’)x(Cys)y} 및 화학식 (lb) Cys{(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x}Cys에 따른 중합체성 담체가 바람직하며, 이에 관한 WO2012/013326의 개시내용은 참조로서 통합된다.
실시양태에서, 적어도 하나의 코딩 RNA를 복합체화하는데 사용되는 중합체성 담제는 공개된 PCT 출원 WO2011/026641의 화학식 (L-P1-S-[S-P2-S]n-S-P3-L)에 따른 중합체성 담체 분자로부터 유래될 수 있으며, WO2011/026641의 개시내용이 참조로 여기에 포함된다.
실시양태에서, 중합체성 담체 화합물은 펩티드 요소 CysArg12Cys(서열 번호: 39) 또는 CysArg12(서열 번호: 40) 또는 TrpArg12Cys(서열 번호: 41)에 의해 형성되거나 이를 포함하거나 이로 구성된다. 다른 실시양태에서, 중합체성 담체 화합물은 서열번호: 42 또는 43에 따른 펩티드 요소에 의해 형성되거나 이를 포함하거나 이로 이루어진다.
특히 바람직한 실시양태에서, 중합체성 담체 화합물은 (R12C)-(R12C) 이량체, (WR12C)-(WR12C) 이량체, 또는 (CR12)-(CR12C)-(CR12) 삼량체로 이루어지며, 여기서 이량체 또는 삼량체의 요소 내의 개별 펩티드 요소(예: (WR12C)) 또는 (예: (CR12))는 -SH 그룹을 통해 연결된다.
바람직한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 성분의 양이온성 또는 다중양이온성 중합체는 HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)7-S-PEG5000-OH (펩티드 단량체의 서열번호: 42) 를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체 및/또는 HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)4-S-PEG5000-OH (펩티드 모노머의 서열번호: 43)를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체이다.
실시양태에서, 제1 및/또는 제2 성분은 공개된 PCT 출원 WO2017/212008A1, WO2017/212006A1, WO2017/212007A1, 및 WO2017/212009A1에 기재된 바와 같이, 중합체성 담체와 복합체화되거나 회합되며, 선택적으로, 적어도 하나의 지질 또는 리피도이드와 복합체화되거나 회합되며, WO2017/212008A1, WO2017/212006A1, WO2017/212007A1, 및 WO2017/212009A1의 개시내용이 본원에 참조로 포함된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 중합체성 담체(제1 및/또는 제2 성분의)는 펩티드 중합체, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체, 및 지질, 바람직하게는 리피도이드이다.
리피도이드(또는 리피도이트)는 지질 유사 화합물, 즉 지질 유사 물리적 특성을 갖는 양친매성(amphiphilic) 화합물이다. 리피도이드는 바람직하게는 2개 이상의 양이온성 질소 원자 및 2개 이상의 친유성 꼬리를 포함한다. 많은 통상적인 양이온성 지질과 대조적으로, 리피도이드는 가수분해성 연결기, 특히 가수분해성 에스테르, 아미드 또는 카바메이트기를 포함하는 연결기가 없을 수 있다. 리피도이드의 양이온성 질소 원자는 양이온화 가능하거나 영구적으로 양이온성일 수 있거나, 두 유형의 양이온성 질소가 화합물에 존재할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 지질이라는 용어는 리피도이드도 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명의 일부 구체예에서, 리피도이드는 PEG 모이어티를 포함할 수 있다.
적합하게는, 리피도이드는 양이온성이며, 이는 이것이 양이온화 가능하거나 영구적으로 양이온성임을 의미한다. 한 실시양태에서, 리피도이드는 양이온화가능하고, 즉 이는 하나 이상의 양이온화가능한 질소 원자를 포함하지만 영구적인 양이온성 질소 원자는 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 리피도이드의 양이온성 질소 원자 중 적어도 하나는 영구적으로 양이온성이다. 선택적으로, 리피도이드는 2개의 영구적인 양이온성 질소 원자, 3개의 영구적인 양이온성 질소 원자, 또는 심지어 4개 이상의 영구적인 양이온성 질소 원자를 포함한다.
실시양태에서, 리피도이드는 공개된 PCT 특허 출원 WO2017/212009A1의 페이지 50-54의 표에 제공된 리피도이드의 리피도이드, 및 이에 관련된 특정 개시 내용이 참조로 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 리피도이드는 3-C12-OH, 3-C12-OH-cat, 3-C12-아미드, 3-C12-아미드 모노메틸, 3-C12-아미드 디메틸, RevPEG(10)-3-C12-OH, RevPEG(10)-DLin-pA벤조산, 3C12아미드-TMA cat., 3C12아미드-DMA, 3C12아미드-NH2, 3C12아미드-OH, 3C12에스테르-OH, 3C12 에스테르-아민, 3C12에스테르-아민, 3C12에스테르-DMA,2 , 3C12-린-아미드-DMA, 2C12-스펌-아미드-DMA 또는 3C12-스펌-아미드-DMA(공개된 PCT 특허 출원 WO2017/212009A1(50-54페이지) 표 참조)중에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 본 발명의 맥락에서 특히 바람직한 리피도이드는 3-C12-OH 또는 3-C12-OH-cat이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 명시된 바와 같은 리피도이드를 포함하는 펩티드 중합체는 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA 및/또는 제2 성분의 적어도 하나의 길항제 (예: 핵산)를 N/P 비율 약 0.1 내지 약 20, 또는 약 0.2 내지 약 15, 약 2 내지 약 15, 또는 약 2 내지 약 12을 갖는 복합체를 형성하기 위해 복합체화하는데 사용되며, 여기서 N/P 비율은 양이온성 펩티드 또는 중합체의 염기성 기의 질소 원자 대 핵산의 포스페이트 기에 대한 몰비로 정의된다. 이러한 맥락에서, 공개된 PCT 특허 출원 WO2017/212009A1의 개시, 특히 WO2017/212009A1의 청구항 1 내지 10, 및 이와 관련된 특정 개시는 참고로 여기에 포함된다.
특정 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA, 바람직하게 mRNA는 중합체성 담체, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체 및 리피도이드, 바람직하게는 3-C12-OH 및/또는 3-C12-OH-cat와 복합체화되거나 회합된다.
특정 실시양태에서, 제2 성분의 적어도 하나의 길항제, 바람직하게 핵산은 중합체성 담체, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체 및 리피도이드, 바람직하게는 3-C12-OH 및/또는 3-C12-OH-cat와 복합체화되거나 회합된다.
추가의 적합한 리피도이드는 공개된 PCT 특허 출원 WO2010/053572로부터 유래될 수 있다. 특히, 공개된 PCT 특허 출원 WO2010/053572의 청구항 1 내지 297로부터 유도가능한 리피도이드가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있으며, 예를 들어, 본원에 기재된 펩티드 중합체 또는 지질 나노입자에 통합될 수 있다 (아래에 설명됨). 따라서, 공개된 PCT 특허 출원 WO2010/053572의 청구항 1 내지 297, 및 이와 관련된 특정 개시내용은 참고로 여기에 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 제1 화합물의 적어도 하나의 치료 RNA, 바람직하게는 mRNA는 하나 이상의 지질(예를 들어, 양이온성 지질 및/또는 중성 지질)과 복합체를 형성하거나, 부분적으로 복합체를 형성하거나, 캡슐화하거나, 부분적으로 캡슐화하거나, 회합하여 리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜을 형성한다.
바람직한 실시양태에서, 제2 화합물의 적어도 하나의 길항제, 바람직하게 핵산은 하나 이상의 지질 (예를 들어, 양이온성 지질 및/또는 중성 지질)과 복합체를 형성하거나, 캡슐화하거나, 부분적으로 캡슐화하거나, 회합하여 리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜을 형성한다.
리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포좀은 - 제1 화합물의 치료 RNA 또는 제2 화합물의 길항제 (예:핵산)가 혼입된- 리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜의 내부 공간에 완전히 또는 부분적으로 위치하거나 막 내부에 위치하거나 막의 외부 표면과 연관될 수 있다. 상기 제1 화합물의 치료 RNA, 또는 상기 제2 화합물의 길항제의 혼입은 "캡슐화(encapsulation)"로 본원에서 언급되며 여기서 상기 본원에 정의된 치료 RNA/본원에 정의된 길항제 (예: 핵산)은 전체적으로 리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜의 내부 공간 안에 완전히 함유된다. 리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜 안으로 제1 성분 및/또는 제2 성분을 혼입하는 목적은 예를 들어, 치료 RNA를 분해하는 효소 및/또는 화학물질, 치료 RNA의 빠른 배출을 야기하는 시스템 또는 수용체를 포함하는 환경으로부터 상기 성분을 보호하기 위한 것이다. 게다가 리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜 안으로 제1 및/또는 제2 성분을 혼입하는 것은 RNA의 흡수를 촉진할 수 있고, 따라서 이들의 치료 효과를 향상할 수 있다.
이러한 맥락에서, 용어 "복합체화된" 또는 "회합된"은 하나 이상의 지질이 공유 결합없이 더 큰 복합체 또는 회합물과 본원에 정의된 제1 성분의 치료 RNA 또는 본원에 정의된 제2 성분 (예를 들어, 핵산)의 필수적인 안정적인 조합을 나타낸다.
"LNP"로도 지칭되는 용어 "지질 나노입자"는 임의의 특정 형태로 제한되지 않으며, 양이온성 지질 및 임의로 하나 이상의 추가 지질이 예를 들어 수성 환경 및/또는 RNA의 존재에서 조합될 때 생성되는 임의의 형태를 포함한다. 예를 들어, 리포솜, 지질 복합체, 리포플렉스 등이 LNP 범위 내에 있다.
리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스 및/또는 나노리포솜은 직경이 수백 나노미터일 수 있고 분리된 일련의 동심 이중층을 포함할 수 있는 다중층 소포 (a multilamellar vesicle (MLV)), 직경이 50nm 미만일 수 있는 작은 단세포 소포(small unicellular vesicle (SUV)) 및 직경이 50nm 내지 500nm일 수 있는 큰 단층 소포(large unilamellar vesicle (LUV))와 같은 다양한 크기를 가질 수 있지만, 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 LNP는 하나 이상의 이중층의 막에 의해 외부 매질로부터 격리된 내부 물 공간을 갖는 미세한 소포로서 적합하게 특징지어진다. LNP의 이중층 막은 일반적으로 공간적으로 분리된 친수성 및 소수성 도메인을 포함하는 합성 또는 천연 기원의 지질과 같은 양친매성 분자에 의해 형성된다. 리포솜의 이중층 막은 또한 양친매성 중합체 및 계면활성제(예: 폴리머로솜, 니오솜 등)에 의해 형성될 수 있다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA 및/또는 제2 성분의 적어도 하나의 길항제(예를 들어, 핵산)는 하나 이상의 지질과 복합체를 형성함으로써 지질 나노입자(LNP)를 형성한다..
LNP는 전형적으로 적어도 하나의 양이온성 지질 및 중성 지질, 하전 지질, 스테로이드 및 중합체 접합 지질(예: PEG화 지질)로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 포함한다. 본원에 정의된 적어도 하나의 치료 RNA/본원에 정의된 적어도 하나의 길항제 (예: 핵산)는 LNP의 지질 부분 또는 LNP의 일부 또는 전체 지질 부분에 의해 둘러싸인 수성 공간에 캡슐화될 수 있다. 적어도 하나의 치료적 RNA/적어도 하나의 길항제(예를 들어, 핵산) 또는 이의 일부는 또한 LNP와 회합 및 복합체화될 수 있다. LNP는 핵산이 부착되거나 하나 이상의 핵산이 캡슐화된 입자를 형성할 수 있는 임의의 지질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, LNP는 하나 이상의 양이온성 지질, 및 하나 이상의 안정화 지질을 포함한다. 안정화 지질에는 중성 지질 및 PEG화 지질이 포함된다. LNP의 양이온성 지질은 양이온화될 수 있다. 즉, pH가 지질의 이온화 가능한 기의 pK 미만으로 낮아질수록 양성자가 되지만, 더 높은 pH 값에서 점진적으로 더 중성이 된다. pK 미만의 pH 값에서 지질은 음전하를 띤 핵산과 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 양이온성 지질은 pH 감소에 대해 양전하를 띠는 쌍성 이온성 (zwitterionic) 지질을 포함한다.
이러한 지질에는 DSDMA, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), 1,2-디올레오일트리메틸 암모늄 프로판 클로라이드(DOTAP)(N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 및 1,2-디올레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염으로도 알려짐), N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), N,N-디메틸-2,3-디올레일옥시)프로필아민(DODMA), ckk-E12, ckk, 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 1,2-디-일-리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(γ-DLenDMA), 98N12-5, 1, 2-디리놀레일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-디리놀레옥시-3-모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레오일티오-3-디메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), ICE(이미다졸-기반), HGT5000, HGT5001, DMDMA, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, KLin-K DLin-K-XTC2-DMA, XTC(2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란) HGT4003, 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1 ,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 또는 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올(DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오(DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3] -디옥솔란(DLin-K-DMA) 또는 이의 유사체, (3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라히드로-3aH-시클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민, (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(MC3), ALNY-100((3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라히드로-3aH-시클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민)), 1,1'-(2-(4- (2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸아잔디일)디도데칸-2-올 (C12-200), 2,2- 디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C2-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA), NC98-5(4,7,13-트리스(3-옥소-3-(운데실아미노)프로필)-N1,N16-디운데실-4,7,10,13-테트라아자헥사데칸-1,16-디아미드), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노) 부타노에이트(DLin-M-C3-DMA), 3-((6Z,9Z,28Z),31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일옥시)-N,N-디메틸프로판-1-아민(MC3 에테르), 4-((6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타- 6,9,28,31-테트라엔-19-일옥시)-N,N-디메틸부탄-1-아민(MC4 에테르), 리포펙틴® (DOTMA 및 1,2-디올레오일-sn-3포스포에탄올아민(DOPE)을 포함하는 상업적으로 입수가능한 양이온성 리포솜, 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재 GIBCO/BRL로부터); 리포펙타민®(N-(1-(2,3디올레일옥시)프로필)-N-(2-(스페르민카르복스아미도)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA) 및 (DOPE)를 포함하는 상업적으로 입수 가능한 양이온성 리포솜, GIBCO/BRL로부터); 및 트랜스펙탐®(에탄올 중 디옥타데실아미도글리실 카르복시스페민(DOGS)을 포함하는 상업적으로 입수 가능한 양이온성 지질, 위스콘신주 매디슨 소재 Promega Corp.) 또는 임의의 상기 조합이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 추가의 적합한 양이온성 지질은 국제 특허 공개 WO2010/053572(및 특히, 단락 [00225]에 기재된 CI 2-200) 및 WO2012/170930에 기재된 것들을 포함하며, 이들 둘 모두는 참고로 HGT4003, HGT5000, HGTS001, HGT5001, HGT5002(US20150140070A1 참조)가 본원에 포함된다.
실시양태에서, 상기 양이온성 지질은 아미노 지질일 수 있다.
대표적인 아미노 지질은 1,2-디리놀레옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-디리놀레옥시-3모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오- 3-디메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), 1,2 -디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올(DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1 ,2-프로판디올(DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA) 및 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA); 디리놀레일-메틸-4-디메틸아미노부티레이트(DLin-MC3-DMA); MC3(US20100324120)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
한 실시양태에서 본원에 정의된 적어도 하나의 치료 RNA/본원에 정의된 길항제 (예를 들어 핵산)은 아미노알코올 리피도이드로 제형화될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 아미노알코올 리피도이드는 미국 특허 번호 8,450,298,에 기술된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 그 전체가 여기에 참고로 포함된다. 적절한 (이온화 가능한) 지질은 공개된 PCT 특허 출원 WO2017/075531A1의 청구항 1-24 및 표 1, 2, 및 3에 정의된 바와 같은 화합물일 수 있으며, 특정 개시 내용은 본원에 참고로 포함된다.
다른 실시양태에서, 적합한 지질은 공개된 PCT 특허 출원 WO2015/074085A1(즉, ATX-001 내지 ATX-032 또는 청구항 1 내지 26에 명시된 화합물), 미국 출원번호 61/905,724 및 15/614,499 또는 미국 특허 번호 9,593,077 및 9,567,296로 부터 선택되며, 본원에 참고로 포함된다.
다른 실시양태에서, 적합한 양이온성 지질은 공개 PCT 특허 출원 WO2017/117530A1 (즉, 지질 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 청구범위에 명시된 바와 같은 화합물)롤부터 선택될 수 있으며, 특정 개시내용은 참고로 본원에 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 이온화 가능한 지질/양이온성 지질은 공개된 PCT 특허 출원 WO2018/078053A1에 개시된 지질(즉, WO2018/078053A1의 화학식 I, II, 및 III에서 유래된 지질, 또는 WO2018/078053A1의 청구항 1 내지 12에 명시된 바와 같은 지질)에 개시된 지질로부터 또한 선택될 수 있으며, 이에 관한 WO2018/078053A1의 특정 개시 내용은 참고로 여기에 포함된다. 이러한 맥락에서, WO2018/078053A1의 표 7에 개시된 지질 (예를 들어, 화학식 I-1 내지 I-41로부터 유래된 지질) 및 WO2018/078053A1의 표 8에 개시된 지질(예를 들어, 화학식 II-1 내지 II-36에서 유래된 지질)은 본 발명의 맥락에서 적절하게 사용될 수 있다. 따라서, WO2018/078053A1의 화학식 I-1 내지 화학식 I-41 및 화학식 II-1 내지 화학식 II-36, 및 이와 관련된 특정 개시내용은 참고로 여기에 포함된다.
바람직한 실시양태에서, 양이온성 지질은 공개된 PCT 특허 출원 WO2018/078053A1의 화학식 III로부터 유래될 수 있다. 따라서, WO2018/078053A1의 화학식 III, 및 이와 관련된 특정 개시 내용은 참고로 여기에 포함된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본원에 정의된 적어도 하나의 치료 RNA/본원에 정의된 길항제 (예를 들어 핵산)은 하나 이상의 지질과 복합체를 형성함으로써 LNP를 형성하고, 여기서 LNP의 양이온성 지질은 공개된 PCT 특허 출원 WO2018/078053A1의 표 9의 III-1 내지 III-36의 구조로부터 선택된다. 따라서, WO2018/078053A1의 화학식 III-1 내지 III-36, 및 이와 관련된 구체적인 개시내용은 참고로 여기에 포함된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본원에 정의된 적어도 하나의 치료 RNA/본원에 정의된 길항제 (예를 들어 핵산)은 하나 이상의 지질과 복합체를 형성하여 LNP를 형성하고, 여기서 LNP는 하기 양이온성 지질을 포함한다:
Figure pct00004
특정 실시양태에서, 양이온성 지질(예를 들어 III-3)은 LNP의 총 지질 함량에 대해 약 30 내지 약 95몰%의 양으로 LNP에 존재한다. LNP 내에 하나 이상의 양이온성 지질이 포함된 경우 이러한 비율은 결합된 양이온성 지질에 적용된다.
다른 적합한(양이온성 또는 이온화 가능한) 지질은 공개된 특허 출원 WO2009/086558, WO2009/127060, WO2010/048536, WO2010/054406, WO2010/088537, WO2010/129709, WO2011/153493, WO 2013/063468, US2011/0256175, US2012/0128760, US2012/0027803, US8158601, WO2016/118724, WO2016/118725, WO2017/070613, WO2017/070620, WO2017/099823, WO2012/040184, WO2011/153120, WO2011/149733, WO2011/090965, WO2011/043913, WO2011/022460, WO2012/061259, WO2012/054365, WO2012/044638, WO2010/080724, WO2010/21865, WO2008/103276, WO2013/086373, WO2013/086354, 및 미국 특허 번호 7,893,302, 7,404,969, 8,283,333, 8,466,122 및 8,569,256 및 미국 특허 공개 번호 US2010/0036115, US2012/0202871, US2013/0064894, US2013/0129785, US2013/0150625, US20130178541, US2013/0225836, US2014/0039032 및 WO2017/112865에 개시된다. 이러한 맥락에서, WO2009/086558, WO2009/127060, WO2010/048536, WO2010/054406, WO2010/088537, WO2010/129709, WO2011/153493, WO 2013/063468, US2011/0256175, US2012/0128760, US2012/0027803, US8158601, WO2016/118724, WO2016/118725, WO2017/070613, WO2017/070620, WO2017/099823, WO2012/040184, WO2011/153120, WO2011/149733, WO2011/090965, WO2011/043913, WO2011/022460, WO2012/061259, WO2012/054365, WO2012/044638, WO2010/080724, WO2010/21865, WO2008/103276, WO2013/086373, WO2013/086354, 미국 특허 번호 7,893,302, 7,404,969, 8,283,333, 8,466,122 및 8,569,256 및 미국 특허 공개 번호 US2010/0036115, US2012/0202871, US2013/0064894, US2013/0129785, US2013/0150625, US20130178541, US2013/0225836 및 US2014/0039032 및 WO2017/112865의 특히 LNP에 적합한 (양이온성) 지질과 관련된 개시내용은 참고로 여기에 포함된다.
LNP는 2개 이상의 (상이한) 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 양이온성 지질은 상이한 유리한 특성에 기여하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 아민 pKa, 화학적 안정성, 순환 반감기(half-life in circulation), 조직 내 반감기(half-life in tissue), 조직 내 순 축적(net accumulation in tissue), 독성 또는 면역 자극과 같은 특성이 다른 양이온성 지질을 LNP에 사용할 수 있다.
LNP in vivo 특성 및 거동은 친수성 고분자 코팅, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 LNP 표면에 입체 안정화를 부여하기 위해 추가하여 변형될 수 있다. 또한, LNP는 리간드(예: 항체, 펩타이드 및 탄수화물)를 표면 또는 부착된 PEG 사슬의 말단에 부착함으로써(예: PEG화된 지질 또는 PEG화된 콜레스테롤을 통해) 특정 표적화에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이러한 PEG 사슬을 사용하여 본 발명의 길항제에 부착할 수 있다.
일부 실시양태에서, LNP는 중합체 접합 지질(polymer conjugated lipid)을 포함한다. 용어 "중합체 접합 지질"은 지질 부분과 고분자 부분을 모두 포함하는 분자를 나타낸다. 중합체 접합 지질의 예는 PEG화된 지질이다. 용어 "PEG화된 지질"은 지질 부분 및 폴리에틸렌 글리콜 부분 둘 다를 포함하는 분자를 지칭한다. PEG화된 지질은 당업계에 공지되어 있으며 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-s-DMG) 등을 포함한다.
다양한 실시양태에서, LNP는 폴리에틸렌 글리콜-지질(PEG화된 지질)인 안정화-지질을 포함한다. 적합한 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-변형 포스파티딜에탄올아민, PEG-변형 포스파티딘산, PEG-변형 세라마이드(예: PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20), PEG-변형 디알킬아민, PEG-변형 디아실글리세롤, PEG-변형 디알킬글리세롤을 포함한다. 대표적인 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-c-DOMG, PEG-c-DMA, PEG-s-DMG, PEG-DMG, PEG-DSG, PEG-DSPE, PEG-DOMG를 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 N-[(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카르바밀]-1,2-디미리스틸옥슬프로필-3-아민 (PEG-c-DMA)이다. 바람직한 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-2000-DMG이다. 한 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜-지질은 PEG-c-DOMG)이다. 다른 실시양태에서, LNP는 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-다이미리스토일글리세롤(PEG-DMG)과 같은 PEG화된 디아실글리세롤(PEG-DAG), PEG화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE), 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트(PEG-S-DMG)와 같은 PEG 숙시네이트 디아실글리세롤(PEG-S-DAG), PEG화된 세라마이드 (PEG-cer), 또는 ω-메톡시(폴리에톡시)에틸-N-(2,3디(테트라데카녹시)프로필)카바메이트 또는 2,3-디(테트라데카녹시)프로필-N-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)카바메이트와 같은 PEG 디알콕시프로필카바메이트를 포함한다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 공개된 PCT 특허 출원 WO2018/078053A1의 화학식 (IV)로부터 유도된 PEG화된 지질이 바람직하다. 따라서, 공개된 PCT 특허 출원 WO2018/078053A1의 화학식 (IV)로부터 유래된 PEG화된 지질, 및 이에 관한 각각의 개시내용은 참고로 여기에 포함된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 치료 RNA 및/또는 제2 성분의 적어도 하나의 길항제는 하나 이상의 지질과 복합체를 형성함으로써 LNP를 형성하고, 여기서 LNP는 PEG화된 지질을 포함하고, 여기서 PEG 지질은 바람직하게는 공개된 PCT 특허 출원 WO2018/078053A1의 화학식 (IVa)로부터 유도된다. 따라서, 공개된 PCT 특허 출원 WO2018/078053A1의 화학식 (IVa)로부터 유래된 PEG화된 지질, 및 이에 관한 각각의 개시내용은 참고로 본원에 포함된다.
특히 바람직한 실시양태에서 PEG 지질은 화학식 (IVa)의 것이며,
Figure pct00005
여기서 n은 30 내지 60의 범위의 평균 값을 가지며, 예를 들어 약 30±2, 32±2, 34±2, 36±2, 38±2, 40±2, 42±2, 44±2, 46±2, 48±2, 50±2, 52±2, 54±2, 56±2, 58±2, 또는 60±2 평균값을 갖는다. 가장 바람직한 실시양태에서 n은 약 49이다.
이러한 맥락에서 적합한 PEG-지질의 추가 예는 US2015/0376115A1 및 WO2015/199952에 제공되며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 포함된다.
일부 실시양태에, LNP는 LNP에서 지질의 총 몰을 기준으로 약 3, 2, 또는 1 몰% 미만의 PEG 또는 PEG-변형된 지질을 포함한다. 추가 실시양태에서, LNP는 몰 기준으로 PEG-변형된 지질의 약 0.1% 내지 약 20%를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, LNP는 몰 기준으로 약 1.0% 내지 약 2.0%의 PEG-변형된 지질을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 양이온성 지질 대 PEG화된 지질의 몰비는 약 100:1 내지 약 25:1 범위이다.
바람직한 실시양태에서, LNP는 입자의 형성 동안 또는 제조 공정 동안 입자의 형성을 안정화시키는 하나 이상의 추가 지질(예를 들어, 중성 지질 및/또는 하나 이상의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체)을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, LNP는 하나 이상의 중성 지질 및/또는 하나 이상의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체를 포함한다.
적합한 안정화 지질은 중성 지질 및 음이온성 지질을 포함한다. 용어 "중성 지질"은 생리학적 pH에서 전하를 띠지 않거나 중성 쌍성 이온성 형태로 존재하는 다수의 지질 종의 임의의 하나를 지칭한다. 대표적인 중성 지질은 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라마이드, 스핑고미엘린, 디하이드로 스핑고미엘린, 세팔린 및 세레브로사이드를 포함한다.
실시양태에서, LNP는 하나 이상의 중성 지질을 포함하며, 여기서 중성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(DOPE) 포스파티딜에탄올아민(DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아리오일-2-올레오일포스파티디에탄올아민(SOPE), 및 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포포에탄올아민(transDOPE), 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, LNP는 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM으로부터 선택된 중성 지질을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 중성 지질에 대한 양이온성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1의 범위이다. 바람직한 실시양태에서, 중성 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)이다. DSPC에 대한 양이온성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 8:1 범위일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 스테로이드는 콜레스테롤이다. 양이온성 지질 대 콜레스테롤의 몰비는 약 2:1 내지 1:1 범위일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 콜레스테롤은 PEG화될 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 지질은 지질 화합물이거나 화학식 III, 바람직하게 III-3으로부터 유도되고, 중성 지질은 DSPC, 스테로이드는 콜레스테롤이고, PEG화된 지질은 화학식 (IVa)의 화합물이다.
바람직한 실시양태에서, 리포솜, 지질 나노입자, 리포플렉스 및/또는 나노리포솜은 바람직하게는 (i) 적어도 하나의 양이온성 지질; (ii) 적어도 하나의 중성 지질; (iii) 적어도 하나의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체; 및 (iv) 적어도 하나의 응집 감소 지질을 포함하거나, 이로 이루어지며, 여기서 바람직하게 (i) 내지 (iv)은 약 20-60% 양이온성 지질, 5-25% 중성 지질, 25-55% 스테롤, 및 0.5-15% PEG-지질의 몰비로 존재한다.
구체적인 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA 및/또는 제2 성분의 적어도 하나의 길항제(예를 들어, 핵산)는 하나 이상의 지질과 복합체를 형성함으로써 LNP를 형성하고, 여기서 LNP는
(i) 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 양이온성 지질, 바람직하게 지질 III-3;
(ii) 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 중성 지질, 바람직하게는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC);
(iii) 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체, 바람직하게는 콜레스테롤; 및
(iv) 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 PEG-지질, 예를 들어, PEG-DMG 또는 PEG-cDMA, 바람직하게는 화학식 (IVa)의 PEG화된 지질, 여기서 바람직하게는 (i) 내지 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질; 5-25% 중성 지질; 25-55% 스테롤; 0.5-15% PEG-지질의 몰비를 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA 및/또는 제2 성분의 적어도 하나의 길항제(예를 들어, 핵산)는 하나 이상의 지질과 복합체를 형성함으로써 LNP를 형성하고, 여기서 LNP는 대략 50:10:38.5:1.5의 몰비를 갖고, 바람직하게는 47.5:10:40.8:1.7 또는 더 바람직하게는 47.4:10:40.9:1.7의 몰비를 갖는다 (즉, 양이온성 지질(바람직하게는 지질 III-3), DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질의 비율 (mol%) ((바람직하게는 n = 49인 화학식 (IVa)의 PEG-지질), 에탄올에 가용화됨).
다양한 실시양태에서, 본원에 정의된 LNP는 약 50nm 내지 약 200nm, 약 50nm 내지 약 150nm, 또는 약 50nm 내지 약 100nm의 평균 직경을 갖는다. 여기에 사용된 바와 같이, 평균 직경은 당업계에 일반적으로 공지된 동적 광산란(dynamic light scattering)에 의해 결정되는 z-평균으로 나타낼 수 있다. LNP의 다분산 지수(PDI)는 0.1 내지 0.5의 범위에 있는 것이 적합하다. 특정 실시양태에서, PDI는 0.2 미만이다. 전형적으로, PDI는 당업계에 통상적으로 공지된 동적 광산란에 의해 결정된다.
바람직한 실시양태에서, 조합물의 투여, 바람직하게 제1 성분 및 제2 성분의 투여는 본질적으로 동시적이다.
그 맥락에서 "동시"는 조합물의 제1 및 제2 성분의 투여가 동시에 일어날 수 있고 적시에 시차를 둔 방식이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 상기 동시 투여는 하기에 추가로 개괄된 바와 같이 동일한 투여 부위/투여 경로 또는 상이한 투여 부위/투여 경로일 수 있다.
다른 바람직한 실시양태에서, 조합물의 투여, 바람직하게 제1 성분 및 제2 성분의 투여는 순차적이다.
그 맥락에서 "순차적"은 조합물의 제1 및 제2 성분의 투여는 동시가 아니라 적시에 시차를 두고 발생할 수 있다는 것으로 이해되어야 한다. 상기 "순차적" 투여는 하기에 추가로 개괄된 바와 같이, 동일한 투여 부위에 또는 상이한 투여 부위 중 하나일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 조합물의 투여, 즉 제1 성분 및/또는 제2 성분의 (순차적 또는 동시적)의 투여는 1회 이상, 예를 들어 1일 1회 이상, 1주일에 1회 이상, 한달에 한번 이상 수행된다. 유리하게는, 본 발명의 조합은 반복 투여에, 예를 들어, 만성 투여용으로 적합하다.
조합물은 경구, 비경구, 흡입 스프레이, 국소, 직장, 비강, 협측(buccally), 질 또는 이식된 저장소(implanted reservoir)를 통해 투여될 수 있다. 여기에 사용된 용어 비경구는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 척추강내, 간내, 병변내, 두개내, 경피, 피내, 폐내, 복강내, 심장내, 동맥내, 안구내, 유리체내, 망막하, 종양내를 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 조합물의 투여, 특히 제1 성분 및/또는 제2 성분의 투여 (순차적 또는 동시적)는 정맥내로 수행된다. 특히 실시양태에서, 조합물은 만성 치료로서 정맥내 투여된다(예를 들어, 1회 이상, 예를 들어 1일 1회 또는 1회 이상, 1주일에 1회 또는 1회 이상, 월 1회 또는 1회 이상).
특히 바람직한 실시양태에서, 조합물은 하기 특징들에 의해 특징지어진다:
(I) 여기에 정의되어진 적어도 하나의 제1 성분, 바람직하게 치료 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 mRNA, 예를 들어, 항체, 효소, 항원으로, 여기서 선택적으로 상기 mRNA는 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않고, 여기서 상기 mRNA는 Cap1 구조(바람직하게 공동-전사 캡핑에 의해 얻을 수 있음)를 포함하며, 여기서 상기 제1 성분은 지질 나노입자 또는 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체로 제형화된다.
(II) 여기에 정의되어진 적어도 하나의 제2 성분, 바람직하게는 적어도 하나의 2'-O-메틸화 RNA 뉴클레오티드를 포함하는, 바람직하게 화학식 I에 따른 핵산 서열을 포함하는 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드로, 여기서 상기 제2 성분은 지질 나노입자 또는 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체로 제형화된다.
일부 실시양태에서, 세포, 조직 또는 유기체에 대한 조합물의 투여는 예를 들어 상응하는 제1 성분 단독의 투여와 비교하여 증가된 발현을 초래한다. 특히, (선천성) 면역 자극의 감소는 제1 성분의 번역을 촉진한다.
조성물
제2 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 제1 성분 및 본원에 정의된 바와 같은 제2 성분을 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 약학적 조성물은
(i) 적어도 하나의 치료 RNA;
(ii) 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제, 및
선택적으로, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체
를 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직하게는, 적어도 하나의 치료 RNA는 "제1 성분"으로 조합물의 맥락에서 설명된 바와 같고, 적어도 하나의 길항제는 "제2 성분"으로 조합물의 맥락에서 설명된 바와 같다. 따라서 조합의 제1 성분과 관련하여 (제1 측면의 맥락에서) 상기 기재된 실시양태는 조성물의 적어도 하나의 치료 RNA에 또한 적용될 수 있다. 추가적으로, 조합의 제2 성분과 관련하여 (제1 측면의 맥락에서) 상기 기재된 실시양태는 조성물의 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제에 또한 적용될 수 있다.
바람직한 측면에서, 제2 측면의 약학적 조성물은 제1 측면의 맥락에서 정의된 조합물, 및 선택적으로 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체를 초함하거나 이로 이루어진다.
본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한 담체" 또는 "약학적으로 허용가능한 부형제"는 바람직하게는 제1 및/또는 제2 성분의 액체 또는 비-액체 기반을 포함한다. 제1 및/또는 제2 성분이 액체 형태로 제공되는 경우, 담체는 물, 예를 들어, 발열원 없는(pyrogen-free) 물; 등장 식염수 또는 완충(수용성) 용액, 예. 인산염, 구연산염 등 완충 용액일 수 있다. 물 또는 바람직하게는 버퍼, 더 바람직하게 수성 버퍼는 나트륨 염, 바람직하게는 50mM 이상의 나트륨 염, 칼슘 염, 바람직하게는 0.01mM 이상의 칼슘 염, 및 선택적으로 칼륨 염, 바람직하게는 3mM 이상의 칼륨 염을 함유하여 사용될 수 있다. 따라서 바람직한 실시양태에서, 나트륨, 칼슘 및 선택적으로 칼륨 염은 할로겐화물의 형태로 발생할 수 있으며, 예를 들어, 수산화물, 탄산염, 탄산수소염 또는 황산염 형태의 염화물, 요오드화물 또는 브롬화물 등. 나트륨 염의 예는 NaCl, NaI, NaBr, Na2CO3, NaHCO3, Na2SO4를 포함하고, 선택적 칼륨 염의 예는 KCl, KI, KBr, K2CO3, KHCO3, K2SO4를 포함하고, 칼슘 염의 예는 CaCl2, CaI2, CaBr2, CaCO3, CaSO4, Ca(OH)2을 포함한다. 특히, 적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 본원에 정의된 제1 및 제2 성분, 조합 또는 조성물의 유효성을 방해하지 않고 세포, 세포 배양, 조직, 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템과 양립가능한 물질을 가리킨다.
본 발명의 약학적 조성물의 추가 유리한 실시양태 및 특징은 하기에 기재되어 있다. 특히, 약학적 조성물의 맥락에서 설명된 실시양태 및 특징들은 마찬가지로 제1 측면의 조합 및/또는 제3 측면의 키트 또는 부품의 키트에 적용될 수 있다.
따라서, 약학적 조성물은
(i) 적어도 하나의 치료 RNA, 여기서, 적어도 하나의 치료 RNA는 제1 측면의 맥락에서 정의된 바와 같은 "제1 성분"다;
(ii) 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제, 여기서 적어도 하나의 길항제는 제1 측면의 맥락에서 정의된 바와 같은 "제2 성분"이고;
선택적으로, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하거나 이로 이루어진다.
바람직한 실시양태에서, 약학적 조성물은
(i) 적어도 하나의 치료 RNA, 여기서, 적어도 하나의 치료 RNA는 "제1 성분"이다;
(ii) 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제, 여기서 적어도 하나의 길항제는 "제2 성분", 바람직하게는 핵산이다.
조성물은 적합하게는 명시된 바와 같이 안전하고 효과적인 양의 치료 RNA를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "안전하고 효과적인 양"은 치료 RNA, 바람직하게 mRNA의 양이 투여 후 암호화된 단백질의 발현 및/또는 활성을 초래하기에 충분한 것을 의미한다. 동시에, "안전하고 효과적인 양"은 상기 치료 RNA의 투여로 인한 심각한 부작용을 피할 수 있을 만큼 충분히 적다.
추가로, 상기 조성물은 적합하게는 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제, 바람직하게 본원에 명시된 핵산의 안전하고 효과적인 양을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "안전하고 효과적인 양"은 길항제, 바람직하게 핵산의 양이 투여 후 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 길항작용을 일으키기에 충분한 것을 의미한다. 동시에, "안전하고 효과적인 양"은 상기 길항제 투여로 인해 야기되는 심각한 부작용을 피할 수 있을 만큼 충분히 적다.
조성물의 제1 및 제2 성분의 "안전하고 효과적인 양"은 또한 치료할 특정 상태, 또한 치료될 환자의 나이 및 신체 상태, 상태의 중증도, 치료 기간, 수반되는 요법의 성질, 사용되는 특정 약학적으로 허용가능한 담체 등과 관련하여 다양할 수 있다. 게다가, 본원에 기술된 제1 및 제2 성분의 "안전하고 효과적인 양"은 적용 경로(예: 정맥내, 근육내), 적용 장치(바늘 주사, 주사 장치) 및/또는 복합체화/제형화 (예: 중합체성 담체 또는 LNP 와 관련된 RNA)에 따라 달라질 수 있다. 게다가, 조성물의 "안전하고 효과적인 양"은 치료 대상체(유아, 면역 저하 인간 대상체 등)의 상태에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "조성물"은 특정 성분 (예를 들어, 본원에 정의된 제1 성분, 예를 들어 mRNA 및/또는 본원에 정의된 제2 성분, 예를 들어 핵산)이 선택적으로 임의의 추가 성분과 함께, 일반적으로 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 통합되어질 수 있는 임의의 유형의 조성물을 지칭한다. 상기 조성물은 분말 또는 과립과 같은 건조된 조성물 또는 동결건조 형태와 같은 고체 단위일 수 있다. 조성물은 액체 형태일 수 있으며, 각 성분은 독립적으로 용해된 또는 분산된 (예를 들어 현탁 또는 유화) 형태로 혼입될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체", "환자" 또는 "개인"은 일반적으로 인간 및 비-인간 동물 및 바람직하게 키메라 및 형질전환된 동물 및 질병 모델을 포함한 포유동물을 포함한다. 조성물, 바람직하게 약학적 조성물이 투여되는 대상체는 인간 및/또는 다른 영장류; 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개와 같은 상업적으로 관련된 포유동물을 포함하는 포유동물; 및/또는 가금류, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조와 같은 상업적으로 관련된 조류를 포함하는 조류를 포함하는 것으로 간주되나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 용어 "대상체 (subject)"는 비-인간 영장류 또는 인간, 가장 바람직하게는 인간을 지칭한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 맥락에서 "치료가 필요한 대상체" 또는 "이것이 필요한 대상체"는 인간 대상체이다.
실시양태에서, 조성물은 상기 정의된 바와 같은 다수의 적어도 하나 이상의 치료 RNA 종을 포함할 수 있고, 여기서 각각의 치료 RNA 종, 예를 들어 각각의 mRNA 종은 정의된 바와 같이 상이한 치료 펩티드 또는 단백질을 코딩할 수 있다.
실시양태에서, 조성물은 상기 정의된 바와 같은 제1 조성물의 상이한 치료 RNA 종의 하나 이상 또는 다수를 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "RNA 종"은 단 하나의 단일 분자를 지칭하는 것으로 의도되지 않는다. 용어 "RNA 종"은 본질적으로 동일한 RNA 분자의 앙상블로 이해되어야 하며, 여기서 RNA 앙상블로서 이해되어야 하며, 여기서 RNA 앙상블의 RNA 분자의 각각, 다시 말해 RNA 종의 각각의 분자는 본질적으로 동일한 핵산 서열을 갖는, 동일한 치료 단백질(치료 RNA가 코딩 RNA 인 실시양태에서)을 암호화한다. 그러나 RNA 앙상블의 RNA 분자는 효소적 또는 화학적 제조 공정으로 인해 야기될 수 있는 길이 또는 질이 달라질 수 있다.
실시양태에서, 조성물은 제1 성분의 하나 초과되거나 다수의 상이한 치료 RNA 종을 포함하고, 여기서 하나 초과 또는 다수의 상이한 치료 RNA 종은 각각 상이한 단백질을 코딩하는 코딩 RNA 종으로부터 선택된다.
실시양태에서, 조성물은 제1 성분의 하나 초과 또는 다수의 상이한 치료 RNA 종을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 하나 초과 또는 다수의 상이한 치료 RNA 종은 코딩 RNA 종 (예를 들어, CRISPR 관련 엔도뉴클레아제를 코딩하는 mRNA)로부터 선택되고, 적어도 하나는 비-코딩 RNA 종(예를 들어, 가이드 RNA)으로부터 선택된다.
실시양태에서, 조성물은 하나 초과 또는 다수의 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 개의 제2 성분의 상이한 길항제들을, 바람직하게 상기 정의된 바와 같은 핵산 종을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "핵산 종"은 단 하나의 단일 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도되지 않는다. 제2 성분의 맥락에서 용어 "핵산 종"은 본질적으로 동일한 핵산 분자의 앙상블로서 이해되어야 하며, 여기서 이러한 앙상블의 핵산 분자의 각각은 본질적으로 동일한 핵산 서열을 가진다.
바람직한 실시양태에서, 조성물은 제1 성분의 치료 RNA, 바람직하게 mRNA, 및 제2 성분의 길항제, 바람직하게 핵산을 포함하며, 여기서 상기제1 성분 및/또는 상기 제2 성분은 적어도 하나 이상의 양이온성 또는 다중양이온성 화합물, 바람직하게는 양이온성 또는 다중양이온성 중합체, 양이온성 또는 다중양이온성 다당류, 양이온성 또는 다중양이온성 지질, 양이온성 또는 다중양이온성 단백질, 또는 양이온성 또는 다중양이온성 펩티드, 또는 이들의 임의의 조합과 복합체화되거나 회합되거나 적어도 부분적으로 복합체화되거나 또는 부분적으로 회합된다. 본원에 정의된 담체에 대한 복합체화/회합 ("제형화")는 세포 내로 치료 RNA 및/또는 길항제의 흡수를 촉진한다.
본원에 사용되어진 용어 "양이온성 또는 다중양이온성 화합물"은 당업자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어 pH 값 범위, 약 1 내지 9, 약 3 내지 8 범위의 pH 값에서, 약 4 내지 8 범위의 pH 값에서, 약 5 내지 8 범위의 pH 값에서, 보다 바람직하게는 약 6 내지 8 범위의 pH 값에서, 더욱 더 바람직하게는 약 7 내지 8 범위의 pH 값에서, 가장 바람직하게는 생리학적 pH, 예를 들어 약 7.2 내지 약 7.5 범위에서 양전하를 띠는 하전 분자를 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 양이온성 성분, 예를 들어, 양이온성 펩티드, 양이온성 단백질, 양이온성 폴리머, 양이온성 다당류, 양이온성 지질 (리피도이드 포함)은 생리학적 조건 하에서 양으로 하전된 임의의 양으로 하전된 화합물 또는 중합체일 수 있다. "양이온성 또는 다중양이온성 펩타이드 또는 단백질"은 적어도 하나의 양으로 하전된 아미노산, 또는 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산, 예를 들어, Arg, His, Lys 또는 Orn로부터 선택된 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서, "다중양이온성 (polycationic)”성분은 또한 주어진 조건에서 하나 이상의 양전하를 나타내는 범위 내에 있다.
양이온성 또는 다중양이온성 화합물, 특히 이러한 맥락에서 바람직한 것은 양이온성 또는 다중양이온성 펩티드 또는 이의 단편의 단백질의 다음 목록에서 선택될 수 있다: 프로타민, 뉴클레오린, 스페르민 또는 스페르미딘, 또는 폴리-L-리신(PLL)과 같은 기타 양이온성 펩티드 또는 단백질, 폴리-아르기닌, 염기성 폴리펩티드, HIV-결합 펩티드, HIV-1 Tat(HIV), Tat 유래 펩티드, 페네트라틴(Penetratin)을 포함하는 세포 투과 펩티드(CPP), VP22 유래 또는 유사 펩티드, HSV VP22 (단순 포진(Herpes simplex)), MAP, KALA 또는 단백질 전달 도메인(PTD), PpT620, 프롤린이 풍부한 펩티드, 아르기닌이 풍부한 펩티드, 리신이 풍부한 펩티드, MPG-펩티드(들), Pep-1, L-올리고머, 칼시토닌 펩티드(들), 안테나피디아 유래 펩타이드 (Antennapedia-derived peptides), pAntp, pIsl, FGF, 락토페린, 트랜스포탄(Transportan), 부포린(Buforin)-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, hCT-유래 펩티드, SAP, 또는 히스톤.
형질감염제(transfection agent) 또는 복합체화제(complexation agent)로 사용될 수 있는 추가의 바람직한 양이온성 또는 다중양이온성 화합물은 양이온성 다당류, 예를 들어, 키토산, 폴리브렌 등; 양이온성 지질, 예를 들어 DOTMA, DMRIE, 디-C14-아미딘, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: 디올레일 포스파티딜에탄올-아민, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS, DIMRI, DOTAP, DC-6-14, CLIP1, CLIP6, CLIP9, 올리고펙타민; 또는 양이온성 또는 다중양이온성 중합체, 예를 들어 베타-아미노산-폴리머 또는 역 폴리아미드 등과 같은 변형된 폴리아미노산, PVP 등과 같은 변형된 폴리에틸렌, pDMAEMA 등과 같은 변형된 아크릴레이트, pAMAM 등과 같은 변형된 아미도아민, 디아민 말단 개질된 1,4 부탄디올 디아크릴레이트-코-5-아미노-1-펜탄올 중합체 등과 같은 변형된 폴리베타아미노에스테르(PBAE), 폴리프로필아민 덴드리머 또는 pAMAM 기반 덴드리머 등과 같은 덴드리머, PEI, 폴리(프로필렌이민) 등과 같은 폴리이민(들), 폴리알릴아민, 시클로덱스트린계 중합체, 덱스트란계 중합체 등과 같은 당 주쇄계 중합체, PMOXA-PDMS 공중합체 등과 같은 실란 주쇄계 중합체, 하나 이상의 양이온성 블록(예를 들어, 상기 언급된 양이온성 중합체로부터 선택됨) 및 하나 이상의 친수성 또는 소수성 블록(예: 폴리에틸렌글리콜)의 조합으로 이루어진 블록중합체; 등을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 적어도 하나의 치료 RNA 및 적어도 하나의 길항제를 포함하는 조성물은 별도로 제형화된다. 따라서, 제1 성분(제1 측면에서 정의됨) 및 제2 성분(제1 측면에서 정의됨)은 개별 독립체로 제형화(복합체화/회합화)될 수 있다. 성분들의 제형화/복합체화는 동일(예를 들어, 두 성분이 중합체성 담체에 모두 복합체화됨)할 수 있거나, 상이(예를 들어, 하나의 성분은 LNP에 캡슐화된 상태이고, 다른 성분은 고분자 입자에 복합체화됨)할 수 있다.
실시양태에서, 적어도 하나의 치료 RNA 및 적어도 하나의 길항제를 포함하는 조성물은 공동-제형화된다. 따라서, 제1 성분(제1 측면에서 정의됨) 및 제2 성분(제1 측면에서 정의됨)은 하나의 독립체로 제형화(복합체화/회합화)될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 성분의 제형화/복합체화는 동일하다 (예를 들어, 두 성분이 모두 LNP내에 존재).
바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 치료 RNA 및 적어도 하나의 길항제를 포함하는 조성물은 적어도 하나의 치료 RNA 및 적어도 하나의 길항제가 동일한 세포에 의해 흡수되도록 보장하기 위해 하나의 입자에 둘다 존재할 가능성을 증가시키기 위해 공동-제형화된다.
그 맥락에서, 제형화에 적합한 양이온성 또는 다중양이온성 화합물은 제1 측면의 맥락에서 정의된 바와 같은 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 조성물의 제1 성분 및 제2 성분은 동일한 양이온성 또는 다중양이온성 화합물, 또는 상이한 양이온성 또는 다중양이온성 화합물과 복합체화되거나 회합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 조성물의 제1 및 제2 성분은 동일한 양이온성 또는 다중양이온성 화합물 내에 복합체화되거나 회합될 수 있다(즉, "공동-제형화됨"). 다른 실시양태에서, 조성물의 제1 및 제2 성분은 상이한 양이온성 또는 다중양이온성 화합물 내에서 복합체화되거나 회합될 수 있다.
조성물의 바람직한 실시양태에서, (제1 및/또는 제2 성분의)중합체성 담체는 펩티드 중합체, 바람직하게 본원에 정의된 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체이며, 지질, 바람직하게 리피도이드이다. 바람직한 실시양태에서, 조성물의 제1 성분 및 제2 성분은 동일한 중합체성 화합물 내에 복합체화되거나 회합될 수 있다 (즉, "공동-제형화됨"). 다른 실시양태에서, 조성물의 제1 및 제2 성분은 상이한 중합체성 화합물 내에 복합체화되거나 회합될 수 있다 (즉, "개별적으로 제형화됨").
조성물의 바람직한 실시양태에서, 제1 화합물의 적어도 하나의 치료 RNA, 바람직하게 mRNA는 하나 이상의 지질 (예를 들어 양이온성 지질 및/또는 중성 지질)과 복합체화되거나, 부분적으로 복합체화되거나, 캡슐화되거나, 부분적으로 캡슐화되거나 또는 회합되어 리포솜 지질 나노입자 (LNP), 리포플렉스, 및/또는 나노리포솜을 형성하고/하거나, 제2 성분의 적어도 하나의 길항제, 바람직하게 핵산은 하나 이상의 지질 (예를 들어 양이온성 지질 및/또는 중성 지질)과 복합체화되거나, 부분적으로 복합체화되거나, 캡슐화되거나, 부분적으로 캡슐화되거나 또는 회합되어 리포솜 지질 나노입자 (LNP), 리포플렉스, 및/또는 나노리포솜을 형성한다.
적절한 리포솜/지질 나노입자는 제1 측면의 맥락에서 제공된 개시사항들로부터 유도될 수 있다.
조성물의 제1 및 제2 성분은 동일한 지질 나노입자 내에, 또는 상이한 지질 나노입자들과 복합체화되거나 회합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 조성물의 제1 및 제2 성분은 동일한 지질 나노입자 내에서 복합체화되거나 회합될 수 있다(즉 "공동-제형화됨"). 상기 언급된 바와 같이, 공동-제형화는 적어도 하나의 치료 RNA 및 적어도 하나의 길항제가 동일한 세포에 의해 흡수되도록 보장하기위해 하나의 입자에 둘다 존재할 가능성을 증가시키는 것이다.
조성물의 바람직한 실시양태에서, 제1 화합물의 적어도 하나의 치료 RNA는 mRNA이고, 제2 성분의 적어도 하나의 길항제는 RNA 올리고뉴클레오티드이며, 본원에 정의된 바와 같이 리포솜/지질 나노입자로 공동-제형화된다.
조성물 (또는 조합물)의 실시양태에서 제2 성분의 적어도 하나의 길항제, 바람직하게 본원에 정의된 핵산 대 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA의 몰비는 약 1:1 내지 약 100:1 범위, 또는 약 20:1 내지 약 80:1범위이다.
조성물 (또는 조합물)의 바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 적어도 하나의 길항제, 바람직하게 본원에 정의된 핵산 대 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA의 몰비는 약 200:1 내지 약 1:1, 또는 약 100:1 내지 약 1:1, 또는 약 90:1 내지 약 1:1, 또는 약 80:1 내지 약 1:1, 또는 약 70:1 내지 약 1:1, 또는 약 60:1 내지 약 1:1, 또는 약 50:1 내지 약 1:1, 또는 약 40:1 내지 약 1:1, 또는 약 30:1 내지 약 1:1, 또는 약 20:1 내지 약 1:1, 또는 약 10:1 내지 약 1:1, 또는 약 5:1 내지 약 1:1, 또는 약 4:1 내지 약 1:1, 또는 약 3:1 내지 약 1:1, 또는 약 2:1 내지 약 1:1 범위 또는 약 1:1 내지 약 1:200 범위, 또는 약 1:1 내지 약 1:100, 또는 약 1:1 내지 약 1:90, 또는 약 1:1 내지 약 1:80, 또는 약 1:1 내지 약 1:70, 또는 약 1:1 내지 약 1:60, 또는 약 1:1 내지 약 1:50, 또는 약 1:1 내지 약 1:40, 또는 약또는 약 1:30 범위, 또는 약 1:1 내지 약 1:20 범위 또는 약 1:1 내지 약 1:10 범위, 또는 약 1:1 내지 약 1:5 범위, 또는 약 1:1 내지 약 1:4 범위, 또는 약 1:1 내지 약 1:3 범위, 또는 약 1:1 내지 약 1:2 범위이다.
조성물의 특정 실시양태에서, 제2 성분의 적어도 하나의 길항제, 바람직하게 본원에 정의되어진 핵산 대 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA의 몰비는 약 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1　, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1 or 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50; 1:59, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100이다.
조성물(또는 조합물)의 실시양태에서 제2 성분의 적어도 하나의 길항제, 바람직하게 본원에 정의된 핵산 대 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA의 중량 대 중량비는 약 1:1 내지 약 1:30 범위, 또는 약 1:2 내지 약 1:20 범위이다.
조성물 (또는 조합물)의 바람직한 실시양태에서, 제2 성분의 적어도 하나의 길항제, 바람직하게 본원에 정의된 핵산, 대 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA의 중량 대 중량비는 약 1:1 내지 약 1:20, 또는 약 1:1 내지 약 1:15, 또는 약 1:1 내지 약 1:10, 또는 약 1:1 내지 약 1:9, 또는 약 1:1 내지 약 1:8, 또는 약 1:1 내지 약 1:7, 또는 약 1:1 내지 약 1:6, 또는 약 1:1 내지 약 1:5, 또는 약 1:1 내지 약 1:4, 또는 약 1:1 내지 약 1:3, 또는 약 1:1 내지 약 1:2 범위, 또는 약 10:1 내지 약 1:1 범위, 또는 약 9:1 내지 약 1:1, 또는 약 8:1 내지 약 1:1, 또는 약 7:1 내지 약 1:1, 또는 약 6:1 내지 약 1:1, 또는 약 5:1 내지 약 1:1, 또는 약 4:1 내지 약 1:1, 또는 약 3:1 내지 약 1:1, 또는 약 2:1 내지 약 1:1 범위이다.
조성물의 특정 실시양태에서, 제2 성분의 적어도 하나의 길항제, 바람직하게 본원에 정의된 핵산, 대 제2 성분의 적어도 하나의 치료 RNA의 중량 대 중량비는 약 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 또는 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1이다.
특히 바람직하게는 제2 성분의 적어도 하나의 길항제, 바람직하게 본원에 정의된 핵산 대 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA의 중량 대 중량비는 약 1:2 내지 약 1:20범위이며, 특별히 약 1:5, 1:10, 또는 1:15 범위이다.
따라서, 적어도 하나의 길항제의 질량 백분율, 특히 조성물 또는 조합물 내의 제2 성분의 핵산의 질량 백분율 (전체 핵산의 질량%)은 약 40%, 35%, 30%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%이다.
조성물 (또는 조합물)의 실시양태에서, 제1 화합물의 치료 RNA는 약 20ng 내지 약 1000μg, 약 0.2μg 내지 약 1000μg, 약 0.2μg 내지 약 900μg, 약 0.2μg 내지 약 800μg, 약 0.2μg 내지 약 700μg, 약 0.2μg 내지 약 600μg, 약 0.2μg 내지 약 500μg, 약 0.2μg 내지 약 400μg, 약 0.2μg 내지 약 300μg, 약 0.2μg 내지 약 100μg, 약 0.2μg 내지 약 100μg, 약 0.2μg 내지 약 80μg, 약 0.2μg 내지 약 60μg, 약 0.2μg 내지 약 40μg, 약 0.2μg 내지 약 20μg, 약 0.2μg 내지 약 10μg, 약 0.2μg 내지 약 5μg, 약 0.2μg 내지 약 2μg양으로, 특히, 약 0.2μg, 0.4μg, 약 0.6μg, 약 0.8μg, 약 1μg, 약 1.2μg, 약 1.4μg, 약 1.6μg, 약 1.8μg, 약 2μg, 약 3μg, 약 4μg, 약 5μg, 약 6μg, 약 7μg, 약 8μg, 약 9μg, 약 10μg, 약 11μg, 약 12μg, 약 14μg, 약 16μg, 약 18 μg, 약 20μg, 약 40μg, 약 60μg, 약 80μg, 약 100μg의 양으로 제공된다.
조성물 (또는 조합물)의 실시양태에서, 제1 화합물의 치료 RNA는 약 20μg 내지 약 200mg, 약 0.2mg 내지 약 200mg, 약 0.2mg 내지 약 180mg, 약 0.2mg 내지 약 160mg, 약 0.2mg 내지 약 140mg, 약 0.2mg 내지 약 120mg, 약 0.2mg 내지 약 100mg, 0.2mg 내지 약 80mg, 약 0.2mg 내지 약 60mg, 약 0.2mg 내지 약 50mg, 약 0.2mg 내지 약 40mg, 약 0.2mg 내지 약 30mg, 약 0.2mg 내지 약 20mg, 약 0.2mg 내지 약 10mg, 약 1mg 내지 약 10mg의 양으로, 특별히 약 0.2mg, 약 0.4mg, 약 0.6mg, 약 0.8mg, 약 1mg, 약 1.2mg, 약 1.4mg, 약 1.6mg, 약 1.8mg, 약 2mg, 약 3mg, 약 4mg, 약 5mg, 약 6mg, 약 7mg, 약 8mg, 약 9mg, 약 10mg, 약 11mg, 약 12mg, 약 14mg, 약 16mg, 약 18mg, 약 20mg, 약 40mg, 약 60mg, 약 80mg, 약 100mg의 양으로 제공된다.
조성물 (또는 조합물)의 실시양태에서, 제2 화합물의 길항제, 바람직하게 핵산은 약 1ng 내지 약 50μg, 2ng 내지 약 100μg, 약 2ng 내지 약 80μg, 2ng 내지 약 60μg, 약 2ng 내지 약 40μg, 약 2ng 내지 약 20μg, 약 2ng 내지 약 10μg, 약 2ng 내지 약 5μg, 약 2ng 내지 약 2μg의 양으로 제공되고, 특별히, 약 2ng, 약 4ng, 약 6ng, 약 8ng, 약 10ng, 약 12ng, 약 14ng, 약 16ng, 약 18ng, 약 20ng, 약 30ng, 약 40ng, 약 50ng, 약 60ng, 약 70ng, 약 80ng, 약 90ng, 약 100ng, 약 110ng, 약 140ng, 약 160ng, 약 180ng, 약 200ng, 약 400ng, 약 600ng, 약 800ng, 약 1000ng의 양으로 제공된다.
조성물 (또는 조합물)의 실시양태에서, 제2 화합물의 길항제, 바람직하게 핵산은 약 2μg 내지 약 20mg, 약 20μg 내지 약 20mg, 약 20μg 내지 약 18mg, 약 20μg 내지 약 16mg, 약 20μg 내지 약 14mg, 약 20μg 내지 약 12mg, 약 20μg 내지 약 10mg, 약 20μg 내지 약 8mg, 약 20μg 내지 약 6mg, 약 20μg 내지 약 4mg, 약 20μg 내지 약 2mg, 약 20μg 내지 약 1mg의 양으로 제공되며, 특별히, 약 2μg, 약 4μg, 약 6μg, 약 8μg, 약 10μg, 약 12μg, 약 14μg, 약 16μg, 약 18μg, 약 20μg, 약 30μg, 약 40μg, 약 50μg, 약 60μg, 약 70μg, 약 80μg, 약 90μg, 약 100μg, 약 110μg, 약 140μg, 약 160μg, 약 180μg, 약 200μg, 약 400μg, 약 600μg, 약 800μg, 약 1000μg의 양으로 제공된다.
바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 약 20ng 내지 약 100μg의 본원에 정의된 제1 화합물의 치료 RNA, 바람직하게 mRNA 및 약 0.2ng 내지 약 10μg의 본원에 정의된 제2 화합물의 길항제, 바람직하게 핵산을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 약 200μg 내지 약 200mg의 본원에 정의된 제1 화합물의 치료 RNA, 바람직하게 mRNA, 및 약 20μg 내지 약 20mg의 본원에 정의된 제2 화합물의 길항제, 바람직하게 핵산 길항제를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 제1 및 제2 성분을 포함하는 조성물은 링거 또는 링거-락테이트 용액으로 투여된다.
바람직한 실시양태에서, 세포, 조직 또는 유기체에 대한 조성물의 투여는 상응하는 제1 성분 단독 투여에 비해 제1 성분(상기 조성물에 포함됨)의 치료 RNA의 증가된 또는 연장된 또는 적어도 비교할만한 활성을 초래한다.
그 맥락에서 용어 "활성"의 의미는 제1 성분의 치료 RNA의 치료 양상에 의존한다. 따라서, "활성"은 제1 성분의 치료 RNA의 치료 효과에 밀접하게 연결된다. 치료 RNA는 코딩 RNA인 실시양태에서, "활성"은 세포, 조직 또는 유기체에 투여 후 일어나는 발현, 예를 들어 단백질 발현으로 이해되어야 하며, 여기서 상기 단백질은 투여된 코딩 RNA (예를 들어, mRNA)의 cds에 의해 제공된다. 치료 RNA가 항원을 암호화하는 코딩 RNA인 실시양태에서, "활성"은 세포, 조직, 또는 유기체에 튜여 후 발생하는 발현, 예를 들어 단백질 발현으로 이해되어야 하며, 여기서 상기 단백질은 코딩 RNA (예: mRNA)의 CDS에 의해 제공되며/제공되거나 항원 특이적 면역 반응 (예: B-세포 반응 및/또는 T-세포 반응)의 유도를 제공한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 세포, 조직 또는 유기체에 조성물의 투여는 대조군으로 상응하는 제1 성분의 투여에 비해 제1 성분의 치료 RNA (조성물에 포함되는)의 증가된 또는 연장된 활성을 초래한다.
다른 특히 바람직한 실시양태에서, 세포, 조직, 또는 유기체에 조성물의 투여는 대조군으로 상응하는 제1 성분의 투여와 비교하여 상기 조성물에 포함된 제1 성분의 치료 RNA (비-변형된 뉴클레오티드 포함)의 증가된 또는 연장된 활성을 초래한다(여기서 상기 RNA는 변형된 뉴클레오티드를 포함하고 동일한 RNA 서열을 가진다.).
따라서, 조성물의 바람직한 실시양태에서, 치료 RNA의 활성 (또는 상응하는 대조군의 활성)은 발현, 바람직하게 단백질 발현이고, 바람직하게 코딩 치료 RNA, 예를 들어 mRNA의 단백질 발현이다. 발현은 제1 측면의 맥락에서 정의된 바와 같이 결정될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 세포, 조질, 또는 유기체로 조성물의 투여는 대조군으로 치료 RNA 또는 제1 성분의 투여와 비교하여 감소된 (선천성) 면역 자극을 초래한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 세포, 조직 또는 유기체로 조성물의 투여는 변형된 뉴클레오티드(예를 들어 본원에 정의된 바와 같은)를 포함하는, 및 동일한 RNA 서열을 갖는 대조군 RNA의 투여와 비교하여 본질적으로 동일한 또는 적어도 비교할만한 (선천성) 면역 자극을 초래한다.
바람직하게, 조성물의 감소된 면역 자극은 란테스(Rantes), MIP-1 알파, MIP-1 베타, McP1, TNF알파, IFN감마, IFN알파, IFN베타, IL-12, IL-6, 또는 IL-8 로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 감소된 수준이다.
바람직한 실시양태에서, 조성물의 투여는 바람직하게 1회 이상, 예를 들어 1일 1회 또는 1회 이상, 1주 1회 또는 1회 이상, 월 1회 또는 1회 이상 수행된다. 유리하게는, 본 발명의 조성물은 반복 투여에 적합하며, 예를 들어 만성 투여를 위해 적합하다.
조성물은 경구, 비경구, 흡입 스프레이, 국소, 직장, 비강, 협측(buccally), 질 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수 있다. 여기에 사용된 용어 비경구는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 척추강내, 간내, 병변내, 두개내, 경피, 피내, 폐내, 복강내, 심장내, 동맥내, 안구내, 유리체내, 망막하, 종양내를 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 조성물의 투여는 정맥내로 (intravenously) 수행된다. 특히 실시양태에서, 조성물은 만성 치료로서 정맥내 투여된다(예를 들어, 1회 이상, 예를 들어 1일 1회 또는 1회 이상, 1주일에 1회 또는 1회 이상, 월 1회 또는 1회 이상).
특히 바람직한 실시양태에서, 약학적 조성물은 다음을 포함한다.
(I) 적어도 하나의 제1 성분, 바람직하게 치료 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 mRNA, 예를 들어, 항체, 효소, 항원으로, 여기서 선택적으로, 바람직하게, 상기 mRNA는 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않고, 여기서 상기 mRNA는 Cap1 구조(바람직하게 공동-전사 캡핑에 의해 얻을 수 있음)를 포함하며, 그리고
(II) 적어도 하나의 제2 성분, 바람직하게는 적어도 하나의 2'-O-메틸화 RNA 뉴클레오티드를 포함하는, 바람직하게 화학식 I에 따른 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드, 및
여기서, 바람직하게, 상기 조성물의 상기 제1 성분 및 상기 제2 성분은 본원에 정의되어진 지질 나노입자로 공동-제형화되고 본원에 정의되어진 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체로 공동-제형화된다.
키트 또는 부품 키트 (Kit or kit of parts)
제3 측면에서, 본 발명은 키트 또는 부품 키트를 제공하며, 바람직하게 조합물의 개별 성분(예: 제1 측면의 맥락에서 정의된 바와 같이) 및/또는 약학적 조성물(예: 제2 측면의 맥락에서 정의된 바와 같이)을 포함하는 키트 또는 부품 키트를 포함한다.
특히, 본 발명의 제1 및 제2 측면에 관한 실시양태는 본 발명의 제3 양태의 실시양태에도 마찬가지로 적용되며, 본 발명의 제3 측면에 관한 실시양태는 본 발명의 제1 및 제2 측면의 실시양태에도 마찬가지로 적용된다.
제3 측면의 바람직한 실시양태에서, 키트 또는 부품 키트는 제1 측면의 맥락에서 정의되어진 적어도 하나의 제1 성분 및 적어도 하나의 제2 성분을 포함하며/하거나 제2 측면의 맥락에서 정의되어진 적어도 하나의 조성물, 선택적으로 가용화를 위한 액체 비히클을 포함하는, 선택적으로 성분들의 투여 및/또는 용량에 대한 정보를 제공하는 기술 설명서를 포함하는 조성물을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 키트 또는 부품 키트는 다음을 포함한다:
(a) 본원에 정의되어진 적어도 하나의 제1 성분, 바람직하게 예를 들어 항체, 효소, 항원 등과 같은 치료 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 mRNA, 바람직하게 여기서 상기 mRNA는 변형된 뉴클레오티드를 포함하지 않고, 바람직하게 여기서 상기 mRNA는 Cap1 구조를 포함하고, 바람직하게 여기서 상기 제1 성분은 지질 나노입자로 또는 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체로 제형화된다.
(b) 본원에 정의되어진 적어도 하나의 제2 성분, 바람직하게 적어도 하나의 2'-O-메틸화 RNA 뉴클레오티드를 포함하는 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드, 바람직하게 화학식 I에 따른 핵산 서열을 포함하고, 바람직하게 여기서 상기 제2 성분은 지질 나노입자로 또는 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체로 제형화된다.
(c) 선택적으로, (a) 및/또는 (b)를 가용화하기 위한 액체 비히클, 및 선택적으로 성분들의 투여 및 용량에 대한 정보를 제공하기 위한 기술 설명서.
바람직한 실시양태에서, 키트 또는 부품 키트는 다음을 포함한다:
(a) 제2 측면의 맥락에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 조성물;
(b) 선택적으로, 가용화를 위한 액체 비히클, 및 선택적으로 성분들의 투여 및 용량에 대한 정보를 제공하기 위한 기술 설명서.
제1 및 제2 성분의 맥락에서 개시되어진 실시양태 및 특징들, 또는 제2 측면의 조성물은 키트 또는 부품 키트의 RNA 및/또는 조성물에 마찬가지로 적용된다.
키트 또는 부품 키트는 제1 또는 제2 성분, 조성물의 맥락에서 기술되어진 바와 같은 추가 성분들을 더 포함할 수 있으며, 특히, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 완충액 등을 더 포함할 수 있다.
상기 키트 또는 부품 키트의 기술 설명서는 투여 및 용량 및 환자 그룹에 관한 정보를 포함할 수 있다. 그러한 키트, 바람직하게 부품 키트는 예를 들어 본원에 언급되어진 임의의 적용(applications) 또는 의약적 용도(medical uses)에 적용될 수 있다.
바람직하게, 키트 또는 부품 키트의 개별적인 성분들은 동결건조된 형태로 제공되어질 수 있다. 상기 키트는 제1 성분의 치료 RNA 및/또는 제2 성분의 길항제, 바람직하게 핵산, 및/또는 제2 측면의 조성물을 가용화하기 위한 비히클 (예를 들어, 약학적으로 허용가능한 완충 용액)을 일부로서 추가로 함유할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 키트 또는 부품 키트는 링거 또는 링거 락테이트 용액을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 키트 또는 부품 키트는 주사 바늘, 마이크로니들, 주사 장치, 카테터, 임플란트 전달 장치, 또는 미세 캐뉼러를 포함한다.
임의의 상기 키트는 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같은 적용 또는 의약적 용도에서 사용될 수 있다.
의약적 용도 (Medical use):
추가 측면은 제공된 조합물, 조성물 또는 키트의 제1 의약적 용도에 관한 것이다.
아래에 기술되어진 실시양태들 ("치료 방법"의 맥락에서)은 또한 본원에 기술되어진 바와 같이 제1 의약적 용도 및 추가의 의약적 용도에 적용가능하다.
따라서, 본 발명은 의약으로서 사용을 위한 제1 측면의 맥락에서 정의되어진 조합물, 의약으로서 사용을 위한 제2 측면에서 정의되어진 조성물, 및 의약으로 사용을 위한 제3 측면에서 정의되어진 키트 또는 부품 키트를 제공한다.
특히, 상기 조합물, 조성물, 또는 키트 또는 부품 키트는 인간 의학적 목적을 위해 사용될 수 있으며, 그리고 또한 수의학적 의학적 목적을 위해, 바람직하게 인간 의학적 목적을 위해 사용될 수 있다.
특히, 상기 조합물, 조성물, 또는 키트 또는 부품 키트는 인간 의학적 목적을 위한 의약으로 사용하기 위한 것이며, 여기서 상기 조합물, 조성물, 또는 키트 또는 부품 키트는 특히 어린 유아, 신생아, 면역저하된 수용자, 뿐만 아니라, 임산부 및 수유부 및 노약자에게도 적합할 수 있다.
추가 측면은 제공된 조합물, 조성물 또는 키트의 추가 의약적 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 의약으로서 사용을 위한 제1 측면의 맥락에서 정의되어진 조합물, 의약으로서 사용을 위한 제2 측면에서 정의되어진 조성물, 및 만성적 의학적 치료로 사용을 위한 제3 측면에서 정의되어진 키트 또는 부품 키트를 제공한다.
용어 "만성적 의학적 치료"는 조합물, 조성물, 또는 키트 또는 부품 키트를 1회 이상, 예를 들어 1일 1회 이상, 1주일에 1회 이상, 1달에 1회이상 투여가 필요한 치료에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 감염, 또는 그러한 감염과 관련된 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제1 측면의 맥락에서 정의되어진 조합물, 제2 측면에서 정의되어진 조성물, 및 제3 측면에서 정의되어진 키트 또는 부품 키트를 제공한다. 바람직하게, 감염은 바이러스 감염, 박테리아 감염, 원생동물 감염으로부터 선택된다. 따라서, 상기 실시양태에서, 상기 치료 RNA는 적어도 하나의 항원을 암호화한다.
본 발명은 종양 질병의 또는 그러한 종양 질병에 관련된 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제1 측면의 맥락에 정의되어진 조합물, 제2 측면에서 정의되어진 조성물, 및 제3 측면에서 정의되어진 키트 또는 부품 키트를 추가로 제공한다.
따라서, 상기 실시양태에서, 치료 RNA는 적어도 하나의 종양 또는 암 항원 및/또는 적어도 하나의 치료 항체 (예를 들어, 체크포인트 억제제(checkpoint inhibitor))를 암호화할 수 있다.
본 발명은 유전적 장애 또는 상태의 치료 또는 예방에 사용을 위한 제1 측면의 맥락에서 정의되어진 조합물, 제2 측면에서 정의되어진 조성물, 및 제3 측면에서 정의되어진 키트 또는 부품 키트를 추가로 제공한다.
본 발명은 단백질 또는 효소의 결핍 또는 단백질 대체의 치료 또는 예방에 사용을 위한 제1 측면의 맥락에서 정의되어진 조합물, 제2 측면에서 정의되어진 조성물, 및 제3 측면에서 정의되어진 키트 또는 부품 키트를 추가로 제공한다. 따라서, 상기 실시양태에서, 치료 RNA는 적어도 하나의 단백질 또는 효소를 암호화한다. 이러한 맥락에서 "단백질 또는 효소 결핍"은 적어도 하나의 단백질이 부족한 질병 또는 결핍, 예를 들어, A1AT 결핍, 으로 이해되어야 한다.
치료 방법 및 전달 방법:
본 발명의 추가 측면은 질병, 장애, 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
상기 기술되어진 실시양태 (제1 의약적 용도 및 추가 의약적 용도의 맥락에서)는 본원에 기술되어진 치료 방법에 또한 적용가능하다.
제3 측면의 바람직한 실시양태에서, 제1 측면의 조합물, 제2 측면의 조성물, 또는 제2 측면의 키트 또는 부품 키트를 대상체에 적용하거나 투여하는 단계를 포함하는 장애, 질병, 또는 상태를 치료하는 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
조합물은 바람직하게 "공동-투여"로 투여된다. 용어 "공동-투여"는 일반적으로 시간상 충분히 근접하게 적어도 2개의 상이한 물질들을 투여하는 것을 가리킨다. 공동-투여는 동시 투여 뿐만 아니라, 단일 용량으로 또는 개별 용량으로 임의의 순서로 적어도 2가지 상이한 물질을 최대 수일 간격으로 시간적으로 간격을 두고 투여하는 것을 지칭한다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분 및 제2 성분의 적용 또는 투여는 본질적으로 동시에(본원에 정의되어진 바와 같이) 수행된다.
일부 실시양태에서 본원에 정의되어진 길항제 및 치료 RNA는 동일한 조성물의 일부로 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서 본원에 정의되어진 길항제 및 치료 RNA는 상이한 조성물로 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서 길항제 및 치료 RNA는 동일한 투여 경로에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 길항제 및 치료 RNA는 상이한 투여 경로로 투여된다.
바람직한 실시양태에서, 제1 성분 및 제2 성분의 적용 또는 투여는 순차적으로 (본원에 정의되어진 바와 같이) 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 길항제는 치료 RNA 전에 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료 RNA는 길항제 전에 투여된다. 일부 실시양태에서, 길항제 및 치료 RNA는 동일한 투여 경로에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 길항제 및 치료 RNA는 상이한 투여 경로를 통해 투여된다.
바람ㄹ직한 실시양태에서, 제1 측면의 조합물, 제2 측면의 조성물, 제3 측면의 키트 또는 부품 키트의 적용 또는 투여는 한번 이상 수행되며, 예를 들어 1일 1회 이상, 1주 1회 이상, 1달 1회 이상 수행된다 (본원에 기술되어진 바와 같이).
투여는 경구, 비경구, 흡입 스프레이, 국소, 직장, 비강, 협측(buccally), 질 또는 이식된 저장소(implanted reservoir)를 통해 투여될 수 있다. 여기에 사용된 용어 비경구는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 척추강내, 간내, 병변내, 두개내, 경피, 피내, 폐내, 복강내, 심장내, 동맥내, 안구내, 유리체내, 망막하, 종양내를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 적용 또는 투여 단계는 피하로, 정맥내로, 근육내로, 관절내로, 활액내로, 흉골내로, 척추강내로, 간내로, 병변내로, 두개내로, 경피로, 피내로, 폐내로, 복강내로, 심장내로, 동맥내로, 안구내로, 유리체내로, 망막하로, 종양내로이다.
바람직한 실시양태에서, 필요한 개체는 포유류 개체이며, 예를 들어, 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개; 및/또는 가금류, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조와 같은 상업적으로 관련된 조류를 포함하는 조류이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 필요로 하는 대상체는 인간 대상체이다.
치료 RNA의 (선천성) 면역 자극을 감소 또는 억제하는 방법:
본 발명의 추가 측면은 치료 RNA에 의해 유도된 (선천성) 면역 자극을 감소 또는 억제하는 방법에 관한 것이다. 치료 RNA에 의해 유도된 면역 억제를 감소 또는 억제하여, 투여 시 효율 (예: 치료 RNA의 번역, 치료 RNA의 활성)이 증가될 수 있다. 따라서, 본원에 개시되어진 "치료 RNA의 (선천성) 면역 자극을 감소 또는 억제하는 방법"은 또한 "치료 RNA의 효율을 증가시키는 방법"으로 이해되어야 한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 치료 RNA (본원에 정의됨), 및 추가록 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제는 추가적으로, 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제와 별도의 독립체로 제공되거나 (예: 제1 측면의 조합물의 맥락에서 설명된 바와 같이) 또는 적어도 하나의 치료 RNA를 포함하는 단일 조성물로 제공될 수 있다.
유리하게는, 상기 길항제의 투여는 (예를 들어, 예를 들어 치료 코딩 RNA의 번역에 영향을 미치지 않으면서) 치료 RNA에 의해 유도될 수 있는 선천성 면역 자극을 감소시킨다. 적절하게는, 선천성 면역 반응의 자극을 감소시키는 것은 치료 RNA의 다양한 의학적 적용에 유리할 수 있다. 특히, 방법은 치료 RNA의 만성적 투여를 가능하게 하거나, 또는 예를 들어, 항원 (예를 들어, 바이러스 항원, 종양 항원)을 암호화하는 치료 RNA의 치료적 효과를 향상시키거나 개선시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 치료 RNA의 선천성 면역 반응을 감소시키는 것은 치료 RNA의 증가된 효율을 유도한다 (예를 들어, 세포 또는 대상체에 투여 시).
더욱이, 그 맥락에서, 상기 방법은 코딩 치료 RNA(예를 들어 항원을 코딩하는 cds를 포함하는)의 반응원성(reactogenicity)의 감소를 허용한다. 반응원성이라는 용어는 예를 들어 부작용, 특히 과도한 면역 반응 및 관련 징후 및 증상-발열, 주사 부위의 팔 통증 등,을 일으키는 백신의 특성을 가리킨다. 반응원성의 다른 징후들은 일반적으로 멍, 홍반, 경화 및 부종을 포함한다.
따라서, 치료 RNA의 (선천성) 면역 자극을 감소 또는 억제하는 방법은 또한 코딩 치료 RNA의 반응원성을 감소 또는 억제하는 방법으로 이해되며, 여기서 상기 코딩 RNA는 항원을 코딩하는 cds를 포함한다.
(코딩) 치료 RNA의 발현을 증가 및/또는 연장하는 방법:
본 발명의 추가 측면은 코딩 치료 RNA를 증가 및/또는 연장시키는 방법에 관한 것이다. 코딩 치료 RNA의 발현을 증가 및/또는 연장시켜 투여 시 효율 (예를 들어, 치료 RNA의 번역, 치료 RNA의 활성)이 실질적으로 증가될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 "(코딩) 치료 RNA의 발현을 증가 및/또는 연장하는 방법"은 또한 "(코딩) 치료 RNA의 효율을 증가시키는 방법"으로 이해되어야 한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 코딩 치료 RNA (본원에 정의된 바와 같이), 및 추가적으로 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제는 추가적으로, 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제와 별도의 독립체로 제공되거나 (예: 제1 측면의 조합물의 맥락에서 설명된 바와 같이) 또는 적어도 하나의 치료 RNA를 포함하는 단일 조성물로 제공될 수 있다.
유리하게는, 상기 길항제의 투여는 치료 RNA에 의해 유도될 수 있는 단백질 번역의 억제를 감소시킨다. 적절하게는, 증가 및/또는 연장은 치료 RNA의 다양한 의학적 적용에 유리할 수 있다. 특히, 상기 방법은 예를 들어 치료 RNA의 만성적 투여를 가능하게 하거나 예를 들어 항원 (예를 들어, 바이러스 항원, 종양 항원)을 암호화하는 치료 RNA의 치료 효과를 향상시키거나 개선할 수 있다. 따라서, 본 발명의 치료 RNA를 증가 및/또는 연장시키는 것은 치료 RNA의 증가된 효율을 이끈다 (예를 들어, 세포 또는 대상체에 투여 시).
목록 및 표에 대한 간략한 설명
표 A: 본 발명의 바람직한 소분자 길항제
표 B: 본 발명의 바람직한 올리고뉴클레오티드 길항제
표 1: 각 아미노산에 대해 표시된 각각의 코돈 빈도를 갖는 인간 코돈 사용빈도 (codon usage)
표 2: 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드와 DOTAP 제형을 위한 RNA 컨스트럭트의 조합
표 3: 생체 내 발현 및 면역 자극 분석을 위한 PpLuc mRNA 및 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드의 컨스트럭트 및 용량
표 4: 생체 내 발현 및 면역 자극 분석을 위한 주사 스케쥴 (Injection schedule)
표 5: 생체 내 면역 자극 분석을 위한 시점 및 실험 설정
도 1A는 시험관내 PBMC에서 면역자극성 비코딩 RNA("RNA애쥬반트")에 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드("Gm18")의 추가의 면역억제 효과를 보여준다. 캡핑되지 않은 면역자극 비코딩 RNA 및 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드의 DOTAP 공동-형질감염 (co-transfection)은 PBMC 상청액에서 CBA 어레이에 의해 측정된 면역자극 비코딩 RNA의 형질감염과 비교하여 사이토카인 반응의 감소를 보여준다.
비히클= DOTAP 단독; 추가 세부사항은 실시예 2에서 제공된다.
도 1B는 시험관내 PBMC에서 PpLuc mRNA에 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드("Gm18")의 추가의 면역억제 효과를 보여준다. 캡핑된 코딩 PpLuc mRNA 및 올리고뉴클레오티드의 DOTAP 공동-형질감염은 PBMC 상청액에서 CBA 어레이로 측정한 PpLuc mRNA만의 형질감염과 비교하여 사이토카인 반응의 감소를 보여준다. 비히클 = DOTAP 단독; 추가 세부사항은 실시예 2에 제공된다.
도 2는 129Sv 마우스에서 LNP의 정맥내 주사 후 6시간 및 24시간에 2'-O-메틸화 RNA("Gm18") 올리고뉴클레오티드의 혼합물이 있거나 없는 mRNA로부터의 PpLuc 발현을 보여준다. PpLuc 발현을 정량화하기 위해 루시페린 3mg의 정맥내 주사 후 5분부터 3분 동안 생물발광을 기록했다. 2'-O-메틸화 RNA 올리고뉴클레오티드의 투여는 두 용량 (mRNA 10 μg 또는 mRNA 30 μg)에서 2'-O-메틸화 RNA 올리고뉴클레오티드없이 PpLuc mRNA와 비교하여 주사 후 24 시간에 PpLuc의 발현을 증가시킨다. 추가 세부사항은 실시예 2에 제공된다.
도 3은 마우스에서 LNP로 제형화된 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드("Gm18")의 혼합물이 있거나 없는 PpLuc mRNA의 단일 정맥내 주사 후 간 용해물에서 PpLuc의 발현을 보여준다. 간은 10㎍ 또는 30㎍의 mRNA 주사 후 24시간에 수집되었다. 2'-O-메틸화 RNA 올리고뉴클레오티드의 첨가는 어느 용량에서든 2'-O-메틸화 RNA 올리고뉴클레오티드가 없는 PpLuc mRNA와 비교하여 주입 후 24시간에 PpLuc의 발현을 증가시킨다. 추가 세부사항은 실시예 3에 제공된다.
도 4A는 마우스에서 LNP로 제형화된 주사 6시간 후 PpLuc mRNA에 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드("Gm18")를 첨가하는 면역억제 효과를 나타낸다. CBA어레이는 mRNA + 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드로 공동-제형화되어 또는 mRNA 단독으로 제형화되어 유도된 사이토카인 수준 (란테스, IL6, MCP1, MCP-1ß, TNFα 및 IFNγ)을 비교하기 위해 정맥 내 주사 6시간 후에 얻어진 혈청으로 수행하였다. 모든 사이토카인 수준은 용량-의존적인 방식으로 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드의 혼합에 의해 강력하게 감소된다. 추가 세부사항은 실시예 3에 제공된다.
도 4B는 마우스에서 LNP로 제형화된 주사 24시간 후 PpLuc mRNA에 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드("Gm18")의 첨가의 면역억제 효과를 보여준다. mRNA + 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드의 공동-제형화에 의해 또는 mRNA 단독 제형화에 의해 유도된 INFα의 수준을 비교하기 위해 정맥 주사 24시간 후 에 얻은 혈청으로 ELISA를 수행하였다. INFα 수준은 용량-의존적인 방식으로 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드의 혼합에 의해 강력하게 감소된다. 추가 세부사항은 실시예 3에 제공된다.
그림 5A는 시험관 내에서 PBMC의 PpLuc mRNA에 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드 변이체, RNA 올리고뉴클레오티드, DNA 올리고뉴클레오티드 및 소분자를 추가할 때의 면역억제 효과를 보여준다. 캡핑된 코딩 PpLuc mRNA와 올리고뉴클레오티드 및 소분자의 DOTAP 공동-형질감염은 PBMC 상청액에서 CBA 어레이로 측정하여, PpLuc mRNA만의 형질감염과 비교하여 사이토카인 반응(IFN-α)의 감소를 보여준다. 비히클 = DOTAP 단독; 추가 세부사항은 실시예 4에 제공된다.
도 5B는 시험관 내에서 PBMC에서 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드("Gm18"), 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드 변이체, RNA 올리고뉴클레오티드, DNA 올리고뉴클레오티드 및 소분자의 혼합이 있거나 없는 mRNA로부터 PpLuc mRNA로의 PpLuc 발현을 보여준다. PpLuc 발현을 정량화하기 위해 루시페린 3mg의 정맥 내 주사 후 5분부터 시작하여 3분 동안 생물발광을 기록했다. 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드("Gm18"), 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드 변이체, RNA 올리고뉴클레오티드, DNA 올리고뉴클레오티드 및 소분자의 추가는 혼합물이 없는 PpLuc mRNA와 비교하여 형질감염 24시간후에 PpLuc의 발현을 증가시킨다.
하기 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 보다 명확하게 이해하고 실시할 수 있도록 하기 위한 것이다. 본 발명은 단지 본 발명의 단일 측면의 예시로서 의도된 예시된 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않으며, 기능적으로 동등한 방법은 본 발명의 범위 내에 있다. 실제로, 본 명세서에 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명, 첨부 도면 및 하기 실시예로부터 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다.
실시예 1: RNA 컨스트럭트 생성
1.1. DNA 템플레이트 제작
루시퍼라제를 암호화하는 DNA 서열을 준비하고 후속 RNA 시험관내 전사에 사용하였다. 상기 DNA 서열은 GC 최적화된 cds를 도입함으로써 야생형 cds 서열을 변형함으로써 제조되었다. 서열은 UTR 서열, 아데노신의 스트레치, 히스톤-스템-루프 구조, 및 선택적으로 30개 시토신의 스트레치를 포함하는 플라스미드 벡터에 도입되었다. 획득한 플라스미드 DNA는 일반적인 프로토콜을 사용하여 박테리아에서 형질전환 및 증식되었으며 플라스미드 DNA는 추출, 정제되고, 아래에 요약된 바와 같이 후속 RNA 시험관내 전사에 사용되었다.
면역자극 비-코딩 RNA를 암호화하는 DNA 서열을 제조하고 후속 RNA 시험관내 전사에 사용하였다. 획득한 플라스미드 DNA를 일반적인 프로토콜을 사용하여 박테리아에서 형질전환 및 증식시키고 플라스미드 DNA를 추출, 정제하고 후속 RNA 시험관내 전사에 사용하였다.
1.2. 플라스미드 DNA 템플레이트에서 RNA 시험관 내 전사:
1.2.1. PPluc를 인코딩하는 mRNA의 제조:
섹션 1.1에 따라 제조된 DNA 플라스미드를 제한 효소를 사용하여 효소적으로 선형화하고 적절한 버퍼 조건 하에서 뉴클레오티드 혼합물(ATP/GTP/CTP/UTP) 및 캡 유사체(예, m7GpppG 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG))의 존재 하에 T7 RNA 중합효소를 사용하여 DNA 의존성 RNA 시험관내 전사에 사용했다. 얻어진 RNA를 RP-HPLC(PureMessenger®; WO2008/077592)를 이용하여 정제하여 시험관 내 및 생체 내 실험에 사용하였다.
1.2.2. 면역자극 비코딩 RNA의 제조:
섹션 1.1에 따라 제조된 DNA 플라스미드는 제한 효소를 사용하여 효소적으로 선형화되었고 적절한 버퍼 조건 하에 뉴클레오티드 혼합물(ATP/GTP/CTP/UTP)의 존재 하에 T7 RNA 중합효소를 사용하여 DNA 의존성 RNA 시험관내 전사에 사용되었다. 얻어진 비-코딩 RNA를 RP-HPLC(PureMessenger®; WO2008/077592)로 정제하여 시험관 내 및 생체 내 실험에 사용하였다.
실시예 2: 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드 및 RNA의 동시 형질감염에 의한 인간 말초혈액 단핵 세포(PBMC)의 면역자극
하기에 기술된 실시예의 경우, 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드(9-mer)는 Biomers(biomers.net GmbH, Germany)에 의해 합성되었습니다: 5’-GAG CGmG CCA-3’ (SEQ ID NO 85), 또한 본원에 “Gm18”로 언급됨.
2.1 인간 PBMC의 준비
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 표준 Ficoll-Hypaque 밀도 구배 원심분리(Ficoll 1.078g/ml)에 의해 건강한 지원자의 헤파린 처리된 혈액에서 분리되었다. PBMC는 10% 열-비활성화 FCS가 보충된 RPMI 1640에 재현탁되었다. 계수 후, 세포는 소태아 혈청, 10% DMSO에 ml당 5천만 세포로 재현탁되고 동결되었다. 사용하기 전에 세포를 해동한다.
2.2 PBMC 자극
형질감염 실험을 위해, 웰당 2 x 105 인간 PBMC를 X-Vivo 15 배지(Lonza)에서 96웰 플레이트의 각 웰에 접종했다. 면역자극성 비암호화 RNA와 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드(서열번호 85)를 모두 포함하는 DOTAP 복합체의 제조를 위해, 올리고뉴클레오티드를 먼저 면역자극성 비암호화 RNA에 25%의 중량 백분율로 첨가했다. PpLuc mRNA와 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드를 모두 포함하는 DOTAP 복합체를 준비하기 위해 올리고뉴클레오티드를 먼저 PpLuc mRNA에 25%의 중량 백분율로 추가했습니다. 따라서 PpLuc mRNA 대 올리고뉴클레오타이드의 몰비는 1:45(MW(올리고뉴클레오티드) = 2907g/mol, MW(PpLuc mRNA) = 652377g/mol)였다. 올리고뉴클레오티드가 있거나 없는 면역자극성 비암호화 RNA 또는 PpLuc mRNA를 함유하는 DOTAP 복합체는 RNA애쥬반트 1μg당 또는 mRNA 1μg당 DOTAP 3μl의 비율로 형성되었다. PBMC는 37°C에서 가습된 5% CO2 분위기에서 200μl의 총 부피로 0.25μg/ml의 올리고뉴클레오티드가 있거나 없는 1μg/ml의 면역자극성 비암호화 RNA 또는 mRNA와 함께 밤새 배양되었다. 배경 자극을 정량화하기 위해 PBMC를 DOTAP 단독("비히클") 또는 배지 단독과 함께 인큐베이션했다. 형질감염 24시간 후, 상청액을 수집하였다.
표 2: 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드와 DOTAP 제형화를 위한 RNA 컨스트럭트의 조합
RNA ID RNA 디자인 Gm18 올리고뉴클레오티드
5'-캡 구조 UTR 디자인
5'-UTR/
3'-UTR 		3' 말단에 위치한 폴리(A) 서열
면역자극성 비-코딩 RNA
(서열번호: 84)		 / / / 5'-GAG CGmG CCA-3'
면역자극성 비-코딩 RNA
(서열번호: 84)		 / / / /
PpLuc mRNA
(서열번호: 82)		 mCap RPL32/ALB7 A64N5C30.Hs_HSL 5'-GAG CGmG CCA-3'
PpLuc mRNA
(서열번호: 82)		 mCap RPL32/ALB7 A64N5C30.Hs_HSL /
2.3 세포측정 비드 어레이(Cytometric bead array (CBA))
2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드 없이 또는 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드로 자극된 PBMC로부터 수집된 상청액에서, IFN-α, IFN-γ, TNF의 농도는 다음 키트를 사용하여 제조업체의 지침(BD Biosciences)에 따라 Cytometric Bead Array(CBA)에 의해 측정되었다: Human Soluble Protein Master Buffer Kit(카탈로그 번호 558264), Assay Diluent(카탈로그 번호 560104), Human IFN-α Flex Set(카탈로그 번호 560379), Human IFN-γ Flex Set(카탈로그 번호 558269) , 인간 TNF Flex 세트(카탈로그 번호 560112); BD Biosciences의 모든 키트. 데이터는 FCAP Array v3.0 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 분석되었다.
2.4 결과: 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드 첨가의 면역억제 효과
인간 PBMC에서 면역자극성 비-코딩 RNA("RNA애쥬반트")와 함께 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드("Gm18")의 DOTAP 공동-형질감염은 면역자극 비코딩 RNA만의 형질감염과 비교하여 사이토카인 INF-α, INF-γ 및 TNF의 감소된 분비에 의해 증명된 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드의 면역억제 효과를 입증한다(도 1A).
인간 PBMC에서 캡핑된 코딩 PpLuc mRNA와 함께 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드("Gm18")의 DOTAP 공동-형질감염은 PpLuc mRNA만의 형질감염과 비교하여 사이토카인 INF-α, INF-γ 및 TNF의 감소된 분비에 의한 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드의 면역억제 효과를 입증한다 (도 1B).
결과는 본원에서 시험된 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드가 RNA의 면역자극을 감소시킬 수 있음을 나타내며, 이는 올리고뉴클레오티드 및 치료 RNA를 포함하는 조합물 또는 조성물이 감소된 면역자극 특성을 나타낼 수 있음을 시사한다.
실시예 3: 생체 내에서 LNP를 갖는 2'O-메틸화 올리고뉴클레오티드와 조합된 PpLuc mRNA의 면역자극
아래에 설명된 실시예의 경우 9-mer 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드(9-mer)가 Biomers(biomers.net GmbH, Germany)에 의해 합성되었다: 5'-GAG CGmG CCA-3'(서열번호 85).
3.1 PpLuc mRNA 컨스트럭트의 생성
PpLuc를 인코딩하는 mRNA 컨스트럭는 실시예 1에 따라 생성되었다.
3.2 LNP 제형화
PpLuc mRNA와 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드를 모두 포함하는 지질 나노입자(LNP)의 제조를 위해 먼저 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드를 20% 또는 6.7%의 중량 백분율로 PpLuc mRNA에 추가했습니다(표 3 참조). 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드의 혼합물이 있거나 없는 PpLuc mRNA를 함유하는 LNP는 양이온성 지질, 콜레스테롤, PEG-지질 및 중성 지질을 사용하여 제조되었다. mRNA를 시트레이트 버퍼, pH 4에서 1g/L로 희석했다. Nanoassemblr(PrecisionNanoSystems)를 사용하여 에탄올성 지질 용액을 1:3(vol/vol)의 비율로 RNA 수용액과 혼합했다. 그 다음, 에탄올을 제거하고 완충액을 투석에 의해 9% 수크로스를 포함하는 10mM HEPES(pH 7.4)로 교체했다. 마지막으로, LNP-제형화된 RNA를 0.2g/L로 조정하였다.
표 3: 생체 내 발현 및 면역 자극 분석을 위한 PpLuc mRNA 및 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드의 컨스트럭트 및 용량
그룹 캡 구조 5'UTR 3`UTR mRNA 용량 올리고의 %질량 LNP 제형
@0.2g/L
1 Cap1 HSD17B4 PSMB3 30 μg 0 A
2 Cap1 HSD17B4 PSMB3 10 μg 0 A
3 Cap1 HSD17B4 PSMB3 30 μg 20% B
4 Cap1 HSD17B4 PSMB3 10 μg 20% B
5 Cap1 HSD17B4 PSMB3 30 μg 6.7% C
6 Cap1 HSD17B4 PSMB3 10 μg 6.7% C
표 4: 생체 내 발현 및 면역 자극 분석을 위한 주사 스케쥴
RNA 제형 주사 농도 스케쥴
PpLuc mRNA (서열번호: 83)
 A 0.2 g/l 4 마우스/ 그룹; 10 μg 및 30 μg 용량 (i.v.)
PpLuc mRNA (서열번호: 83)
및
2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드
(서열번호 85)

올리고의 %질량: 20%		 B 0.2 g/l 4 마우스/ 그룹; 10 μg 및 30 μg 용량 (i.v.)
PpLuc mRNA (서열번호: 83)
및
2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드
(서열번호 85)

올리고의 %질량: 6.7%		 C 0.2 g/l 4 마우스/ 그룹; 10 μg 및 30 μg 용량 (i.v.)
3.3 마우스에서 PpLuc mRNA, 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드 및 LNP의 정맥 주사
생체 내 실험을 위해, 8주령 암컷 마우스(약 25g, 스트레인 129SV)에 다양한 LNP 제형을 주사했다(표 4 및 5 참조). 그룹당 4마리의 동물을 사용하였다. 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드가 있거나 없는 10μg 또는 30μg의 mRNA를 0.2g/l의 농도로 정맥 주사했다. 생물발광 영상화를 LNP 주사 후 6시간 및 24시간에 수행하였다. 혈액은 LNP 주사 6시간 후 및 LNP 주사 24시간 후 최종적으로 샘플링되었다. 그 직후, 마우스를 희생시키고 간을 수집하여 1.5 ml PP 튜브에 넣고 분석(<-70°C)까지 동결 및 보관하였다.
3.4 생체 내 이미징에서 발현 분석
2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드("Gm18") 혼합물이 있거나 없는 LNP-제형화된 PpLuc mRNA의 단일 정맥 주사 후 6시간 및 24시간 후에 PpLuc의 발현이 가시화되었다. PpLuc 발현은 3 mg의 루시페린 정맥내 주사 후 5분부터 시작하여 3분 동안 기록된 생물발광 이미지로부터 정량화되었다 (표 5 참조). 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오타이드("Gm18")의 추가는 두 용량(10μg 또는 30μg의 mRNA)에서 Gm18이 없는 PpLuc mRNA와 비교하여 주입 후 24시간에 PpLuc의 발현을 증가시킨다(도 2 참조).
표 5: 생체 내 면역 자극 분석을 위한 시점 및 실험 설정
그룹 (PpLuc mRNA을 포함하는) 제형 정맥 내 주사: 생체내 이미징 혈청 샘플링 24시에 수집된 기관
1 A 30 μg 6 및 24 시간 6 및 24 시간 간
2 A 10 μg 6 및 24 시간 6 및 24 시간 간
3 B 30 μg 6 및 24 시간 6 및 24 시간 간
4 B 10 μg 6 및 24 시간 6 및 24 시간 간
5 C 30 μg 6 및 24 시간 6 및 24 시간 간
6 C 10 μg 6 및 24 시간 6 및 24 시간 간
3.5 세포 용해물의 발현 분석
조직 용해물을 준비하기 위해 먼저 스틸 비드를 각 간에 추가했다. 냉동 간을 조직 용해기에 장착하고 3분 동안 진탕했다. 그런 다음, 800㎕의 용해 완충액(25mM Tris-HCl pH 7.5, 2mM EDTA, 10%(w/v) 글리세롤, 1%(w/v) Triton X-100, 2mM DTT 및 1mM PMSF)을 추가했다. 조직 용해를 6분 더 계속했다. 샘플을 10분 동안 4°C에서 13500rpm에서 원심분리했다. 각 상청액 20㎕를 백색 LIA 분석 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 플레이트 판독기(Berthold Technologies TriStar2 LB 942)에 도입하고 반딧불이 루시퍼라제에 대한 기질로서 루시페린을 함유하는 Beetle-Juice(PJK GmbH) 웰당 50㎕를 주입하였다. 루시퍼라제 활성은 상대 광 단위(RLU)로 정량화되었다. 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드를 추가하면 두 용량(10 μg 또는 30 μg)에서 올리고뉴클레오티드가 없는 PpLuc mRNA와 비교하여 주입 후 24시간에 용해물에서 PpLuc의 발현이 증가한다. (도 3 참조).
3.6 면역자극-CBA 분석 및 ELISA에 대한 영향
면역 자극에 대한 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드의 영향을 분석하기 위해, Cytometric Bead 어레이(CBA)에 의해 LNP 주사 후 6시간에 수집된 혈액의 혈청에서 IFNγ, TNFα, IL-6, MIP-1β, RANTES 및 MCP1의 농도를 측정했고, 단락 2.3에 설명된 대로 수행했다. 2'-O-메틸화 RNA 올리고뉴클레오티드를 PpLuc mRNA에 추가하면 용량 의존적 방식으로 모든 염증성 사이토카인의 방출이 크게 감소한다 (도 4A 참조). 면역 자극에 대한 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드의 영향을 추가로 평가하기 위해 ELISA에 의해 LNP 주사 후 24시간에 수집된 혈액의 혈청에서 IFNα의 농도를 측정했다. PpLuc mRNA에 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드를 추가하면 용량 의존적 방식으로 IFNα의 방출이 크게 감소한다(도 4B 참조).
결과 요약(실시예 1 내지 3):
실시예 2, 도 1에 기술된 시험관 내 실험의 결과는 본원에 사용된 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드("Gm18")가 병용-투여된 RNA의 면역자극을 길항한다는 것, 즉, 일반적으로 RNA 감지 패턴 인식 수용체에 의해 촉발되는 것을 보여준다. 따라서 올리고뉴클레오티드는 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 길항제 역할을 한다. 결과는 올리고뉴클레오티드 길항제 및 치료 RNA를 포함하는 조합물 또는 조성물이 치료용 RNA의 면역자극 특성을 유리하게 감소시킨다는 것을 보여준다. 실시예 3, 도 2 내지 4에 기재된 생체내 실험의 결과는 본원에 사용된 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드가 생체내에서도 RNA의 면역자극을 길항한다는 것을 나타낸다. 예상외로, 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드의 첨가는 또한 RNA 코딩된 단백질의 발현을 증가/연장시키며, 이는 올리고뉴클레오티드 길항제 및 치료 RNA를 포함하는 조합물 또는 조성물이 감소된 면역자극 외에도 생체내에서 증가된 발현 및/또는 활성-대부분의 RNA 기반 의약품에서 가장 중요한 기능-을 보여준다는 것을 시사한다.
4. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 면역 자극 및 RNA 및 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드 변이체, RNA 올리고뉴클레오티드, DNA 올리고뉴클레오티드 및 소분자의 동시 형질감염에 의한 발현 효율
아래에 설명된 실시예의 경우 상이한 올리고뉴클레오티드 및 소분자들이 Biomers(biomers.net GmbH, 독일), Invivogen(https://www.invivogen.com/, 미국) 또는 Miltenyi Biotec(miltenyibiotec.com/DE- ko/, 독일)에 의해 합성되었다(표 6).
4.1 PpLuc mRNA 컨스트럭트의 생성
PpLuc를 인코딩하는 mRNA 컨스트럭트는 실시예 1에 따라 생성되었다.
표 6: 합성된 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드 변이체, RNA 올리고뉴클레오티드, DNA 올리고뉴클레오티드 및 소분자
이름 서열 서열번호 이에 의해 합성됨
Gm 18 GAGCGmGCCA 85 Biomers
Gm 18 변이체 1 G*A*G*C*Gm*G*C*C*A 187 Biomers
Gm 18 변이체 2 GAGCUmGCCA 153 Biomers
Gm 18 변이체 3 GCGmGCCAAA 188 Biomers
Gm 18 변이체 4 G*C*Gm*G*C*C*A*A*A 189 Biomers
RNA 올리고 1 Am*Um*A*Am*Um*U*U*U*Um*Um*G*G*U*Am*Um*U*U 201 Biomers
RNA 올리고 2 GAmUmUAmUGmUCCGGmUmUAmUGmUAUU 107 Biomers
RNA 올리고 3 UUGAUGmUGmUUUAGUCGCUAUU 204 Biomers
RNA 올리고 4 GGU GGG GUU CCC GAGCGmG CCA AAG GGA 205 Biomers
RNA 올리고 5 UmGmCmUmCmCmUmGmGmAmGmGmGmGmUmUmGmU 203 Biomers
DNA 올리고 1 T*C*C*T*G*G*C*G*G*G*G*A*A*G*T 193 Miltenyi Biotec
DNA 올리고 2 T*A*A*T*G*G*C*G*G*G*G*A*A*G*T 194 Miltenyi Biotec
소분자 1 C17H15NO2 Invivogen
소분자 2 C18H26ClN3 Invivogen
* = 포스포로티오에이트 백본, Nm= 메틸화된 뉴클레오티드(G,U, C 또는 A)
4.2 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드 변이체, RNA- 및 DNA 올리고뉴클레오티드 및 소분자로 공동- 형질감염된 PMBC의 발현 및 면역 자극 분석
인간 PBMC의 제조는 실시예 2.1에 따라 수행하였다. 형질감염 실험을 위해 웰당 2 x 105 인간 PBMC를 X-Vivo 15 배지(Lonza)에서 96웰 플레이트의 각 웰에 접종했다. 길항제(2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드 변이체, RNA 올리고뉴클레오티드, DNA 올리고뉴클레오티드 또는 소분자)와 PpLuc mRNA(서열번호 82, 표 2에 나타낸 것과 동일한 RNA 디자인)를 모두 포함하는 DOTAP(비히클) 복합체의 제조를 위해, 길항제를 우선 PpLuc mRNA에 20%(1:5 mRNA: 올리고/소분자)의 중량%로 첨가하였다. 따라서 길항제에 대한 PpLuc mRNA의 몰비는 1:45였다(MW(올리고뉴클레오티드) = 2907 g/mol, MW(PpLuc mRNA) = 652377 g/mol). PpLuc mRNA와 길항제를 포함하는 DOTAP 복합체를 mRNA 1㎍당 DOTAP 5㎕의 비율로 형성하고 100ng을 형질감염시켰다. PBMC를 37°C의 가습된 5% CO2 분위기에서 총 200μl의 길항제 0.25μg/ml와 함께 mRNA와 함께 또는 없이 밤새 배양하였다. 배경 자극을 정량화하기 위해 PBMC를 DOTAP 단독("비히클") 또는 RPMI("배지") 단독으로 인큐베이션했다. 형질감염 24시간 후, 상청액을 수집하고 세포를 용해시키고 -80℃에서 보관하였다. 2.3에 따라 Cytrometric bead assay(CBA)를 수행하였다. 발현 분석은 BioTek SynergyHT 플레이트 판독기에서 상대 광 단위(RLU)로 측정되는 루시페라제 활성을 측정하여 수행했다. PpLuc 활성은 50μL의 용해물 및 200μL의 루시페린 완충액(75μM 루시페린, 25mM 글리실글리신, pH 7.8(NaOH), 15mM MgSO4, 2mM ATP)을 사용하여 5초 측정 시간에 측정된다.
4.3 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드 변이체, RNA- 및 DNA 올리고뉴클레오티드 및 소분자로 공동-형질감염된 PMBC의 면역억제 효과 및 발현 효율 분석
인간 PBMC에서 캡핑된 코딩 PpLuc mRNA와 함께 2'-O-메틸화 올리고뉴클레오타이드, RNA 올리고뉴클레오타이드, DNA 올리고뉴클레오타이드 및 소분자의 변이체의 DOTAP 공동-형질감염은 PpLuc mRNA 단독의 형질감염에 비해 사이토카인 IFN-α의 분비 감소로 입증되는 면역억제 효과를 PBMCs 상층액에서 CBA 어레이로 측정하여 입증한다 (도 4A).
2'-O-메틸화 올리고뉴클레오티드 변이체, RNA 및 DNA 올리고뉴클레오티드 및 소분자를 추가하면 PpLuc mRNA 자체와 비교하여 형질감염 후 24시간에 PBMC에서 PpLuc의 발현이 증가된다(도 4B).
SEQUENCE LISTING <110> CureVac AG <120> RNA combinations and compositions with decreased immunostimulatory properties <130> CU01P300WO1 <160> 212 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> histone stem-loop sequence <400> 1 caaaggctct tttcagagcc acca 24 <210> 2 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> histone stem-loop sequence mRNA <400> 2 caaaggcucu uuucagagcc acca 24 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak <400> 3 gccgccacca tgg 13 <210> 4 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak mRNA <400> 4 gccgccacca ugg 13 <210> 5 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 5'-end <400> 5 gggaga 6 <210> 6 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 5'-end <400> 6 aggaga 6 <210> 7 <211> 128 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end A64-N5-C30-histoneSL-N5 <400> 7 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaugcauc cccccccccc cccccccccc cccccccccc aaaggcucuu uucagagcca 120 ccagaauu 128 <210> 8 <211> 124 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end histoneSL-A100 <400> 8 caaaggcucu uuucagagcc accaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaa 124 <210> 9 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end A100 <400> 9 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 100 <210> 10 <211> 134 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A64-N5-C30-histoneSL-N5 <400> 10 auuaauaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa ugcauccccc cccccccccc cccccccccc ccccccaaag gcucuuuuca 120 gagccaccag aauu 134 <210> 11 <211> 134 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A64-N5-C30-histoneSL-N5 <400> 11 agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa ugcauccccc cccccccccc cccccccccc ccccccaaag gcucuuuuca 120 gagccaccag aauu 134 <210> 12 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-histoneSL-A64-N5 <400> 12 auuaaucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagaauu 99 <210> 13 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-histoneSL-A64-N5 <400> 13 agaucucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagaauu 99 <210> 14 <211> 110 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N12-A64-N5-histoneSL-N5 <400> 14 auuaauagau cuaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaugca ucaaaggcuc uuuucagagc caccagaauu 110 <210> 15 <211> 110 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N12-A64-N5-histoneSL-N5 <400> 15 auuaauagau cuaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaugca ucaaaggcuc uuuucagagc caccagaauu 110 <210> 16 <211> 130 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-histoneSL-A100 <400> 16 auuaaucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa 130 <210> 17 <211> 130 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-histoneSL-A100 <400> 17 agaucucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa 130 <210> 18 <211> 106 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A100 <400> 18 auuaauaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 106 <210> 19 <211> 106 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A100 <400> 19 agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 106 <210> 20 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end A75-histoneSL <400> 20 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaacaaag gcucuuuuca gagccacca 99 <210> 21 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end U3-A75-histoneSL <400> 21 uuuaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaca aaggcucuuu ucagagccac ca 102 <210> 22 <211> 178 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end A154-histoneSL <400> 22 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaacaaagg cucuuuucag agccacca 178 <210> 23 <211> 181 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end U3-A154-histoneSL <400> 23 uuuaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacaa aggcucuuuu cagagccacc 180 a 181 <210> 24 <211> 101 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N2-A75-histoneSL <400> 24 agaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaacaa aggcucuuuu cagagccacc a 101 <210> 25 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end histoneSL-A75 <400> 25 caaaggcucu uuucagagcc accaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 99 <210> 26 <211> 170 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end histoneSL-A146 <400> 26 caaaggcucu uuucagagcc accaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 170 <210> 27 <211> 136 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N8-A64-N5-C30-histoneSL-N5 <400> 27 agauuaauaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaugcauccc cccccccccc cccccccccc ccccccccaa aggcucuuuu 120 cagagccacc agaauu 136 <210> 28 <211> 131 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N8-A64-N5-C30-histoneSL <400> 28 agauuaauaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaugcauccc cccccccccc cccccccccc ccccccccaa aggcucuuuu 120 cagagccacc a 131 <210> 29 <211> 105 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N8-A64-N5-C4-histoneSL <400> 29 agauuaauaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaugcauccc ccaaaggcuc uuuucagagc cacca 105 <210> 30 <211> 115 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N8-A64-N5-C14-histoneSL <400> 30 agauuaauaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaugcauccc cccccccccc ccaaaggcuc uuuucagagc cacca 115 <210> 31 <211> 129 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A64-N5-C30-histoneSL <400> 31 agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa ugcauccccc cccccccccc cccccccccc ccccccaaag gcucuuuuca 120 gagccacca 129 <210> 32 <211> 103 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A64-N5-C4-histoneSL <400> 32 agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa ugcauccccc aaaggcucuu uucagagcca cca 103 <210> 33 <211> 113 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A64-N5-C14-histoneSL <400> 33 agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa ugcauccccc cccccccccc aaaggcucuu uucagagcca cca 113 <210> 34 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A64-histoneSL-N5 <400> 34 agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa caaaggcucu uuucagagcc accagaauu 99 <210> 35 <211> 123 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end A64-N5-C30-histoneSL <400> 35 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaugcauc cccccccccc cccccccccc 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cccucuuccc uucagcuugc uuagauguuc caaauuuagu 180 aagcuuaagg cggccuacag aagaaaaaga aaaaaaaggc cacaaaaguu cccucucacu 240 uucaguaaau aaaauaaaag cagcaacaga aauaaagaaa uaaaugaaau ucaaaaugaa 300 auaaauauug uguugugcag cauuaaaaaa ucaauaaaaa uuaaaaauga gca 353 <210> 74 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ndufa1 3'-UTR <400> 74 ggaagcattt tcctggctga ttaaaagaaa ttactcagct atggtcatct gttcctgtta 60 gaaggctatg cagcatatta tatactatgc gcatgttatg aaatgcataa taaaaaattt 120 taaaaaatct aaa 133 <210> 75 <211> 133 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ndufa1 3'-UTR <400> 75 ggaagcauuu uccuggcuga uuaaaagaaa uuacucagcu auggucaucu guuccuguua 60 gaaggcuaug cagcauauua uauacuaugc gcauguuaug aaaugcauaa uaaaaaauuu 120 uaaaaaaucu aaa 133 <210> 76 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPS9 3'-UTR <400> 76 gtccacctgt ccctcctggg ctgctggatt gtctcgtttt cctgccaaat aaacaggatc 60 agcgctttac 70 <210> 77 <211> 70 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPS9 3'-UTR <400> 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guucacgacc cugggcuacc ucaucugcgg cuuccgggug 840 guccugaugu accgguucga ggaggagcug uuccugcgga gccugcagga cuacaagauc 900 cagagcgcgc ugcucgugcc gacccuguuc agcuucuucg ccaagagcac ccugaucgac 960 aaguacgacc ugucgaaccu gcacgagauc gccagcgggg gcgccccgcu gagcaaggag 1020 gugggcgagg ccguggccaa gcgguuccac cucccgggca uccgccaggg cuacggccug 1080 accgagacca cgagcgcgau ccugaucacc cccgaggggg acgacaagcc gggcgccgug 1140 ggcaaggugg ucccguucuu cgaggccaag gugguggacc uggacaccgg caagacccug 1200 ggcgugaacc agcggggcga gcugugcgug cgggggccga ugaucaugag cggcuacgug 1260 aacaacccgg aggccaccaa cgcccucauc gacaaggacg gcuggcugca cagcggcgac 1320 aucgccuacu gggacgagga cgagcacuuc uucaucgucg accggcugaa gucgcugauc 1380 aaguacaagg gcuaccaggu ggcgccggcc gagcuggaga gcauccugcu ccagcacccc 1440 aacaucuucg acgccggcgu ggccgggcug ccggacgacg acgccggcga gcugccggcc 1500 gcgguggugg ugcuggagca cggcaagacc augacggaga aggagaucgu cgacuacgug 1560 gccagccagg ugaccaccgc caagaagcug cggggcggcg ugguguucgu ggacgagguc 1620 ccgaagggcc ugaccgggaa gcucgacgcc cggaagaucc gcgagauccu gaucaaggcc 1680 aagaagggcg gcaagaucgc cguguaagac uagugcauca cauuuaaaag caucucagcc 1740 uaccaugaga auaagagaaa gaaaaugaag aucaauagcu uauucaucuc uuuuucuuuu 1800 ucguuggugu aaagccaaca cccugucuaa aaaacauaaa uuucuuuaau cauuuugccu 1860 cuuuucucug ugcuucaauu aauaaaaaau ggaaagaacc uagaucuaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa augcaucccc 1980 cccccccccc cccccccccc cccccccaaa ggcucuuuuc agagccacca gaauu 2035 <210> 83 <211> 1929 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PpLuc <400> 83 aggagagucc cgcagucggc guccagcggc ucugcuuguu cgugugugug ucguugcagg 60 ccuuauucaa gcuuaccaug gaggacgcca agaacaucaa gaagggcccg gcgcccuucu 120 acccgcugga ggacgggacc gccggcgagc agcuccacaa ggccaugaag cgguacgccc 180 uggugccggg cacgaucgcc uucaccgacg cccacaucga ggucgacauc accuacgcgg 240 aguacuucga gaugagcgug cgccuggccg aggccaugaa gcgguacggc cugaacacca 300 accaccggau cguggugugc ucggagaaca gccugcaguu cuucaugccg gugcugggcg 360 cccucuucau cggcguggcc gucgccccgg cgaacgacau cuacaacgag cgggagcugc 420 ugaacagcau ggggaucagc cagccgaccg ugguguucgu gagcaagaag ggccugcaga 480 agauccugaa cgugcagaag aagcugccca ucauccagaa gaucaucauc auggacagca 540 agaccgacua ccagggcuuc cagucgaugu acacguucgu gaccagccac cucccgccgg 600 gcuucaacga guacgacuuc gucccggaga gcuucgaccg ggacaagacc aucgcccuga 660 ucaugaacag cagcggcagc accggccugc cgaagggggu ggcccugccg caccggaccg 720 ccugcgugcg cuucucgcac gcccgggacc ccaucuucgg caaccagauc aucccggaca 780 ccgccauccu gagcguggug ccguuccacc acggcuucgg cauguucacg acccugggcu 840 accucaucug cggcuuccgg gugguccuga uguaccgguu cgaggaggag cuguuccugc 900 ggagccugca ggacuacaag auccagagcg cgcugcucgu gccgacccug uucagcuucu 960 ucgccaagag cacccugauc gacaaguacg accugucgaa ccugcacgag aucgccagcg 1020 ggggcgcccc gcugagcaag gaggugggcg aggccguggc caagcgguuc caccucccgg 1080 gcauccgcca gggcuacggc cugaccgaga ccacgagcgc gauccugauc acccccgagg 1140 gggacgacaa gccgggcgcc gugggcaagg uggucccguu cuucgaggcc aagguggugg 1200 accuggacac cggcaagacc cugggcguga accagcgggg cgagcugugc gugcgggggc 1260 cgaugaucau gagcggcuac gugaacaacc cggaggccac caacgcccuc aucgacaagg 1320 acggcuggcu gcacagcggc gacaucgccu acugggacga ggacgagcac uucuucaucg 1380 ucgaccggcu gaagucgcug aucaaguaca agggcuacca gguggcgccg gccgagcugg 1440 agagcauccu gcuccagcac cccaacaucu ucgacgccgg cguggccggg cugccggacg 1500 acgacgccgg cgagcugccg gccgcggugg uggugcugga gcacggcaag accaugacgg 1560 agaaggagau cgucgacuac guggccagcc aggugaccac cgccaagaag cugcggggcg 1620 gcgugguguu cguggacgag gucccgaagg gccugaccgg gaagcucgac gcccggaaga 1680 uccgcgagau ccugaucaag gccaagaagg gcggcaagau cgccguguga ggacuagucc 1740 cuguucccag agcccacuuu uuuuucuuuu uuugaaauaa aauagccugu cuuucagauc 1800 uaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaugcau cccccccccc cccccccccc cccccccccc caaaggcucu uuucagagcc 1920 accagaauu 1929 <210> 84 <211> 547 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Immune stimulatory RNA <400> 84 gggagaaagc ucaagcuuau ccaaguaggc uggucaccug uacaacguag ccgguauuuu 60 uuuuuuuuuu uuuuuuuuga ccgucucaag guccaaguua gucugccuau aaaggugcgg 120 auccacagcu gaugaaagac uugugcggua cgguuaaucu ccccuuuuuu uuuuuuuuuu 180 uuuuuaguaa augcgucuac ugaauccagc gaugaugcug gcccagaucu ucgaccacaa 240 gugcauauag uagucaucga gggucgccuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uggcccaguu 300 cugagacuuc gcuagagacu acaguuacag cugcaguagu aaccacugcg gcuauugcag 360 gaaaucccgu ucagguuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuccgc ucacuaugau uaagaaccag 420 guggaguguc acugcucucg aggucucacg agagcgcucg auacaguccu uggaagaauc 480 uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uugugcgacg aucacagaga acuucuauuc augcaggucu 540 gcucuag 547 <210> 85 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 85 gagcngcca 9 <210> 86 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7mer oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 86 agcngcc 7 <210> 87 <211> 5 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5mer oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 87 gcngc 5 <210> 88 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 26mer oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 88 gugggguucc cgagcngcca aaggga 26 <210> 89 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 26mer oligonucleotide 17 A <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 89 gugggguucc cgagangcca aaggga 26 <210> 90 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 26mer oligonucleotide 17 G <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 90 gugggguucc cgaggngcca aaggga 26 <210> 91 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 26mer oligonucleotide 17 U <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 91 gugggguucc cgagungcca aaggga 26 <210> 92 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 26mer oligonucleotide 17 A <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <400> 92 gugggguucc cgagcngcca aaggga 26 <210> 93 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 26mer oligonucleotide 17 C <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <400> 93 gugggguucc cgagcngcca aaggga 26 <210> 94 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 26mer oligonucleotide 17 U <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <400> 94 gugggguucc cgagcngcca aaggga 26 <210> 95 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 26mer oligonucleotide 19 A <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 95 gugggguucc cgagcnacca aaggga 26 <210> 96 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 26mer oligonucleotide 19 C <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 96 gugggguucc cgagcnccca aaggga 26 <210> 97 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 26mer oligonucleotide 19 U <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 97 gugggguucc cgagcnucca aaggga 26 <210> 98 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 26mer oligonucleotide 20 A <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 98 gugggguucc cgagcngaca aaggga 26 <210> 99 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 26mer oligonucleotide 20 G <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 99 gugggguucc cgagcnggca aaggga 26 <210> 100 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 26mer oligonucleotide 20 U <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 100 gugggguucc cgagcnguca aaggga 26 <210> 101 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gal-mU <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (17)..(19) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <400> 101 cnacacaaan cagcgannnu u 21 <210> 102 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gal-mC <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <400> 102 nuananaaau nagngauuuu u 21 <210> 103 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gal-mG <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 103 cuacacaaau cancnauuuu u 21 <210> 104 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gal-mA <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <220> <221> modified_base <222> (7)..(9) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <400> 104 cuncncnnnu cngcgnuuuu u 21 <210> 105 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NP-mU <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (6)..(7) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (9)..(11) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (13)..(14) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <400> 105 ggancnnann ncnncggagu u 21 <210> 106 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NP-mC <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <400> 106 ggaunuuauu unuunggagu u 21 <210> 107 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Luc-mU <220> <221> modified_base <222> (3)..(4) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (13)..(14) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <400> 107 gannangncc ggnnangnau u 21 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN 2216 (PO) <400> 108 gggggacgat cgtcgggggg 20 <210> 109 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN M362 (PO) <400> 109 tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25 <210> 110 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN 6295 (PO) <400> 110 taacgttgag gggcat 16 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN 1826 (PO) <400> 111 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 112 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRS-954 (DV-1079) <400> 112 ugcuccugga gggguugu 18 <210> 113 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRO-5 <400> 113 cuaucugacg uucucugu 18 <210> 114 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRS 2088 <400> 114 uccuggcggg gaagu 15 <210> 115 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRS 869 <400> 115 uccuggaggg guugu 15 <210> 116 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INH-ODN-2114 <400> 116 uccuggaggg gaagu 15 <210> 117 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INH-ODN 4024 <400> 117 uccuggaugg gaagu 15 <210> 118 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INH-ODN 4084-F <400> 118 ccuggauggg aa 12 <210> 119 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRS-661 <400> 119 ugcuugcaag cuugcaagca 20 <210> 120 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRS-954 <400> 120 ugcuccugga gggguugu 18 <210> 121 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INH-ODN-24888 <400> 121 uccuggcggg gaagu 15 <210> 122 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IHN-ODN 2088 <400> 122 uccuggcggg gaagu 15 <210> 123 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN A151 <400> 123 uuaggguuag gguuaggguu aggg 24 <210> 124 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-ODN <400> 124 cuccuauugg ggguuuccua u 21 <210> 125 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN INH-1 <400> 125 ccuggauggg aauucccauc cagg 24 <210> 126 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN INH-18 <400> 126 ccuggauggg aacuuaccgc ugca 24 <210> 127 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INH-4 <400> 127 uucccaucca ggccuggaug ggaa 24 <210> 128 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INH-13 <400> 128 cuuaccgcug caccuggaug ggaa 24 <210> 129 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (pS-) ST-ODN <400> 129 ucgucguuuu gucguuuugu cguu 24 <210> 130 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INH-ODN 21 14 <400> 130 uccuggaggg gaagu 15 <210> 131 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Endosomal TLR Targets TLR7 <400> 131 uccuggaggg guugu 15 <210> 132 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Endosomal TLR Targets TLR9 <400> 132 ugcuugcaag cuugcaagca 20 <210> 133 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Endosomal TLR Targets TLR7 and 9 <400> 133 ugcuccugga gggguugu 18 <210> 134 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified ORN 1 <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <400> 134 gnuacuuacc ug 12 <210> 135 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified ORN 2 <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 135 ccgagccnaa ggcacc 16 <210> 136 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified ORN 3 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <400> 136 nnuacuuacc ug 12 <210> 137 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified ORN 4 <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 137 nauacuuacc ug 12 <210> 138 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified ORN 5 <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <400> 138 ccgngccgau uguacc 16 <210> 139 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified ORN 6 <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <400> 139 ccgagccgnu uguacc 16 <210> 140 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified ORN 7 <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <400> 140 ccgagccgan uguacc 16 <210> 141 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified ORN 8 <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <400> 141 ccgagccgau nguacc 16 <210> 142 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified ORN 9 <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 142 ccgagccgau unuacc 16 <210> 143 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified ORN 10 <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 143 ccgagccnau uguacc 16 <210> 144 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified ORN 11 <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <400> 144 ccgagccgau uguanc 16 <210> 145 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified ORN 12 <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <400> 145 ccgagccgau uguanc 16 <210> 146 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified ORN 13 <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <400> 146 ccgagcngau uguacc 16 <210> 147 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified ORN 14 <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 147 ccgagccncu uguccc 16 <210> 148 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified ORN 15 <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <400> 148 ccgagccgcu ugnccc 16 <210> 149 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 149 gagangcca 9 <210> 150 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 150 gaggngcca 9 <210> 151 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Am <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <400> 151 gagungcca 9 <210> 152 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Cm <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <400> 152 gagcngcca 9 <210> 153 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Um <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <400> 153 gagcngcca 9 <210> 154 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 154 gagcnacca 9 <210> 155 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 155 gagcnccca 9 <210> 156 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 156 gagcnucca 9 <210> 157 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 157 gagcngaca 9 <210> 158 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 158 gagcnggca 9 <210> 159 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 159 gagcnguca 9 <210> 160 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 160 gagcgncca 9 <210> 161 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 161 gagcggnca 9 <210> 162 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 162 gagcggcna 9 <210> 163 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 163 gagnggcca 9 <210> 164 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 164 gancggcca 9 <210> 165 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 165 gngcggcca 9 <210> 166 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRS-954 (DV-1079) <400> 166 tgctcctgga ggggttgt 18 <210> 167 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRO-5 <400> 167 ctatctgacg ttctctgt 18 <210> 168 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRS 2088 <400> 168 tcctggcggg gaagt 15 <210> 169 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRS 869 <400> 169 tcctggaggg gttgt 15 <210> 170 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INH-ODN-2114 <400> 170 tcctggaggg gaagt 15 <210> 171 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INH-ODN 4024 <400> 171 tcctggatgg gaagt 15 <210> 172 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INH-ODN 4084-F <400> 172 cctggatggg aa 12 <210> 173 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRS-661 <400> 173 tgcttgcaag cttgcaagca 20 <210> 174 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRS-954 <400> 174 tgctcctgga ggggttgt 18 <210> 175 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INH-ODN-24888 <400> 175 tcctggcggg gaagt 15 <210> 176 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IHN-ODN 2088 <400> 176 tcctggcggg gaagt 15 <210> 177 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN A151 <400> 177 ttagggttag ggttagggtt aggg 24 <210> 178 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G-ODN <400> 178 ctcctattgg gggtttccta t 21 <210> 179 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN INH-1 <400> 179 cctggatggg aattcccatc cagg 24 <210> 180 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN INH-18 <400> 180 cctggatggg aacttaccgc tgca 24 <210> 181 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INH-4 <400> 181 ttcccatcca ggcctggatg ggaa 24 <210> 182 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INH-13 <400> 182 cttaccgctg cacctggatg ggaa 24 <210> 183 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (pS-) ST-ODN <400> 183 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 184 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INH-ODN 21 14 <400> 184 tcctggaggg gaagt 15 <210> 185 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ndufa1(G51C) 3'-UTR <400> 185 ggaagcattt tcctggctga ttaaaagaaa ttactcagct atggtcatct cttcctgtta 60 gaaggctatg cagcatatta tatactatgc gcatgttatg aaatgcataa taaaaaattt 120 taaaaaatct aaa 133 <210> 186 <211> 133 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ndufa1(G51C) 3'-UTR <400> 186 ggaagcauuu uccuggcuga uuaaaagaaa uuacucagcu auggucaucu cuuccuguua 60 gaaggcuaug cagcauauua uauacuaugc gcauguuaug aaaugcauaa uaaaaaauuu 120 uaaaaaaucu aaa 133 <210> 187 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm PTO (Gm18 variant 1) <220> <221> modified_base <222> (1)..(9) <223> wherein all internucleotidelinkages are phosphothioate linkages <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 187 gagcngcca 9 <210> 188 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm (Gm18 variant 3) <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 188 gcngccaaa 9 <210> 189 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm PTO (Gm18 variant 4) <220> <221> modified_base <222> (1)..(9) <223> wherein all internucleotidelinkages are phosphothioate linkages <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 189 gcngccaaa 9 <210> 190 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 190 ccgagcngc 9 <210> 191 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer oligonucleotide Gm, m6a <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> wherein n is N6-methyladenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> wherein n is N6-methyladenosine <400> 191 gngcngccn 9 <210> 192 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12mer oligonucleotide Gm, ac4c <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> wherein n is 4-acetylcytidine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> wherein n is 4-acetylcytidine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> wherein n is 4-acetylcytidine <400> 192 gagcnngcnc na 12 <210> 193 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN 2088 PTO (DNA oligo 1) <220> <221> modified_base <222> (1)..(15) <223> wherein all internucleotidelinkages are phosphothioate linkages <400> 193 tcctggcggg gaagt 15 <210> 194 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN 2088 control (ODN 20959) PTO (DNA oligo 2) <220> <221> modified_base <222> (1)..(15) <223> wherein all internucleotidelinkages are phosphothioate linkages <400> 194 taatggcggg gaagt 15 <210> 195 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN 2088 control (ODN 2087) PTO <220> <221> modified_base <222> (1)..(15) <223> wherein all internucleotidelinkages are phosphothioate linkages <400> 195 tcctgagctt gaagt 15 <210> 196 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN 2088 control (ODN 20958) PTO <220> <221> modified_base <222> (1)..(15) <223> wherein all internucleotidelinkages are phosphothioate linkages <400> 196 tcctaacaaa aaaat 15 <210> 197 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRS-954 (DV-1079) PTO <220> <221> modified_base <222> (1)..(18) <223> wherein all internucleotidelinkages are phosphothioate linkages <400> 197 tgctcctgga ggggttgt 18 <210> 198 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRS-661 PTO <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> wherein all internucleotidelinkages are phosphothioate linkages <400> 198 tgcttgcaag cttgcaagca 20 <210> 199 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INH-ODN-24888 PTO Em PTO <220> <221> modified_base <222> (1)..(15) <223> wherein all internucleotidelinkages are phosphothioate linkages <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> wherein n is 7-deaza-2'-O-methyl-guanine <400> 199 tcctggcngg gaagt 15 <210> 200 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRO-5 <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <400> 200 ctatctnncg ttctctgt 18 <210> 201 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SM-MePS PTO (RNA oligo 1) <220> <221> modified_base <222> (1)..(17) <223> wherein all internucleotidelinkages are phosphothioate linkages <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (9)..(10) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <400> 201 nnannuuunn ggunnuu 17 <210> 202 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12mer oligonucleotide Um PTO <220> <221> modified_base <222> (1)..(12) <223> wherein all internucleotidelinkages are phosphothioate linkages <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <400> 202 ganacuuacc ug 12 <210> 203 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18mer oligonucleotide Um, Gm, Cm, Am (RNA oligo 5) <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (5)..(6) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (8)..(9) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(14) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <220> <221> modified_base <222> (15)..(16) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 203 nnnnnnnnnn nnnnnnnu 18 <210> 204 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2OMe 2 xG(S) (RNA oligo 3) <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <220> <221> modified_base <222> (8)..(8) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 204 uugaununuu uagucgcuau u 21 <210> 205 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27mer oligonucleotide Gm (RNA oligo 4) <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated guanosine <400> 205 ggugggguuc ccgagcngcc aaaggga 27 <210> 206 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10-mer (Um) <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (8)..(10) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <400> 206 ggncnacnnn 10 <210> 207 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (mU)21 <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <400> 207 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn n 21 <210> 208 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (mU)15 <220> <221> modified_base <222> (1)..(15) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <400> 208 nnnnnnnnnn nnnnn 15 <210> 209 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (mU)10 <220> <221> modified_base <222> (1)..(10) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <400> 209 nnnnnnnnnn 10 <210> 210 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gal-mU <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <220> <221> modified_base <222> (17)..(19) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated uracil <400> 210 cnacacaaan cagcgannnu u 21 <210> 211 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gal-mC <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <220> <221> modified_base <222> (4)..(4) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <220> <221> modified_base <222> (11)..(11) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <220> <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated cytosine <400> 211 nuananaaau nagngauuuu u 21 <210> 212 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gal-mA <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <220> <221> modified_base <222> (5)..(5) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <220> <221> modified_base <222> (7)..(9) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> n can be any nucleotide, wherein the nucleotide is 2-O-methylated, preferably a 2-O-methylated adenosine <400> 212 cuncncnnnu cngcgnuuuu u 21

Claims (94)

  1. (i) 적어도 하나의 치료 RNA를 포함하는 적어도 하나의 제1 성분; 및
    (ii) 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제를 포함하는 적어도 하나의 제2 성분을 포함하거나 이로 이루어진 조합물.
  2. 제1항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체는 RNA 작용제의 결합시 사이토카인을 유도하는 조합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체는 RNA 작용제의 결합 시 번역을 억제하는 조합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 여기서 제2 성분의 적어도 하나의 길항제는
    RNA 작용제의 결합 시 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체에 의한 사이토카인 유도를 감소하고/감소하거나
    RNA 작용제의 결합 시 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체에 의한 변역 억제를 감소시키는 조합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 여기서 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA와 제2 성분의 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제의 조합물의 투여는
    제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA를 제2 성분의 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제와의 조합없이 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA의 투여와 비교하여 감소된 선천성 면역 반응으로 이끄는 조합물.
  6. 제5항에 있어서, 여기서 선천성 면역 반응의 유도는 사이토카인의 유도를 측정하여 결정되는 조합물.
  7. 제6항에 있어서, 여기서 사이토카인은 IFN-a, TNF-a, IP-10, IFN-g, IL-6, IL-12, IL-8, 란테스, MIP-1 알파, MIP-1 베타, McP1, 또는 IFN베타로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조합.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 여기서 사이토카인의 유도는 세포, 조직 또는 유기체, 바람직하게 hPBMCs, Hela 세포 또는 HEK 세포로 상기 조합물을 투여하여 측정되는 조합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체는 엔도솜 수용체 또는 세포질 수용체이고, 바람직하게 엔도솜 수용체인 조합물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체는 단일 가닥 RNA(ssRNA)에 대한 수용체 및/또는 이중 가닥 RNA(dsRNA)에 대한 수용체인 조합물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체는 톨-유사 수용체(TLR), 레티노산-유도성 유전자-I-유사 수용체(RLR), NOD-유사 수용체, PKR, OAS, SAMHD1, ADAR1, IFIT1 및/또는 IFIT5로부터 선택된 조합물.
  12. 제11항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 톨-유사 수용체는 TLR3, TLR7, TLR8 및/또는 TLR9로부터 선택된 조합물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 톨-유사 수용체는 TLR8 및/또는 TLR9로부터, 가장 바람직하게 TLR7 및/또는 TLR8로부터 선택된 조합물.
  14. 제11항에 있어서, 여기서 레티노산-유도성 유전자-I-유사 수용체는 RIG-1, MDA5, LGP2, cGAS, AIM2, NLRP3, NOD2로부터, 바람직하게 RIG1 및/또는 MDA5로부터 선택된 조합물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 여기서 제2 성분의 적어도 하나의 길항제는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 핵산, 펩티드, 단백질, 소분자, 지질 또는 이들 중 임의의 것의 단편, 변이체, 또는 유도체로부터 선택된 조합물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 여기서 제2 성분의 적어도 하나의 길항제는 핵산인 조합물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 여기서 제2 성분의 적어도 하나의 길항제는 단일 가닥 핵산인 조합물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 여기서 제2 성분의 핵산은 DNA 뉴클레오티드, RNA 뉴클레오티드, PNA 뉴클레오티드 및/또는 LNA 뉴클레오티드, 또는 이들 중 임의의 것의 유사체 또는 유도체로부터 선택된 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진 조합물.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 여기서 제2 성분의 핵산은 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 조합물.
  20. 제19항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드 유사체는 백본 변형된 뉴클레오티드, 당 변형된 뉴클레오티드 및/또는 염기 변형된 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 조합물.
  21. 제19항 또는 제20항 중 어느 하나에 있어서, 여기서 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 적어도 하나의 유사체는 1-메틸아데노신, 2-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, 2'-O-메틸아데노신, 2-메틸티오-N6-메틸아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, N6-트레오닐카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카르바모일아데노신, N6-메틸-N6-트레오닐카르바모일아데노신, N6-히드록시노르발릴카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-히드록시노르발릴 카르바모일아데노신, 이노신, 3-메틸시티딘, 2'-O-메틸시티딘, 2-티오시티딘, N4-아세틸시티딘, 리시딘, 1-메틸구아노신, 7-메틸구아노신, 2'-O-메틸구아노신, 퀴오신, 에폭시퀴오신, 7-시아노-7-데아자구아노신, 7-아미노메틸-7-데아자구아노신, 슈도우리딘, 디히드로우리딘, 5-메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘', 5-히드록시우리딘, 5-메톡시우리딘, 우리딘 5-옥시아세트산, 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 5- 아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-셀레누리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5 -(이소펜테닐아미노메틸)우리딘, 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오우리딘, 또는 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸우리딘로부터 선택된 조합물.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 당 변형된 뉴클레오티드, 바람직하게 2' 리보스 변형된 RNA 뉴클레오티드인 조합물.
  23. 제22항에 있어서, 여기서 상기 2' 리보스 변형된 RNA 뉴클레오티드는 2'-O-메틸화 RNA 뉴클레오티드인 조합물.
  24. 제23항에 있어서, 여기서 2'-O-메틸화 RNA 뉴클레오티드는 2'-O-메틸화 구아노신(Gm), 2'-O-메틸화 우라실(Um), 2'-O-메틸화 아데노신(Am), 2'-O-메틸화 시토신(Cm), 또는 이들 임의의 뉴클레오티드의 2'-O-메틸화 유사체로부터 선택된 조합물.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 여기서 제2 성분의 핵산은 적어도 하나 이상의 트리뉴클레오티드 M-X-Y 모티프를 포함하며,
    여기서 M은 Gm, Um, 또는 Am으로부터 선택되고, 바람직하게 M은 Gm이고;
    여기서 X는 G, A, 또는 U로부터 선택되고, 바람직하게는 X는 G 또는 A이고; 그리고 여기서 Y는 G, A, U, C, 또는 디히드로우리딘으로부터 선택되고, 바람직하게는 여기서 Y는 C인, 조합물.
  26. 제16항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    여기서 제2 성분의 핵산은 다음 화학식 I에 따른 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며:
    Figure pct00006

    여기서 N은 G, A, U, C, Gm, Am, Um, Cm, 또는 변형된 뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택되고;
    여기서 W는 0 또는 1 내지 15의 정수이고;
    여기서 Z는 0 또는 1 내지 15의 정수이고;
    여기서 M, X, 및 Y는 제25항에 정의되어진 것으로부터 선택되는 조합물.
  27. 제16항 내지 제26항 중 어느 하나에 있어서, 여기서 제2 성분의 핵산은 화학식 I에 따른 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 화학식 I에 따른 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 핵산 서열의 각각은 동일하거나 서로 독립적으로 선택될 수 있는 조합물.
  28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 성분의 핵산이 트리포스페이트 기가 결여된 5' 말단을 함유하는 것인 조합물.
  29. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 성분의 핵산이 5' 말단에 트리포스페이트 기를 함유하는 조합물.
  30. 제16항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 성분의 핵산이 약 3 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 5 내지 약 25개 뉴클레오티드, 약 5 내지 약 15개, 또는 약 5 내지 약 10개 뉴클레오티드의 길이를 갖고, 바람직하게는 약 5 내지 약 15개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 조합물.
  31. 제16항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 성분의 핵산이 5개 뉴클레오티드, 6개 뉴클레오티드, 7개 뉴클레오티드, 8개 뉴클레오티드, 9개 뉴클레오티드, 10개 뉴클레오티드, 11개 뉴클레오티드, 12개 뉴클레오티드, 또는 13개 뉴클레오티드 길이를 갖고, 바람직하게는 9개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 조합물.
  32. 제16항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 제2 성분의 핵산이 단일 가닥 올리고뉴클레오티드인 조합물.
  33. 제32항에 있어서, 여기서 단일 가닥 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드인 조합물.
  34. 제16항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 제2 성분의 핵산이 박테리아 tRNA, 바람직하게는 박테리아 tRNATyr로부터 유래된 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 조합물.
  35. 제34항에 있어서, 여기서 핵산 서열은 박테리아 tRNATyr이거나 이로부터 유래된, 바람직하게는 박테리아 tRNATyr의 D-루프로부터 유래된, 가장 바람직하게는 대장균 tRNATyr의 D-루프이거나 그로부터 유래된 것인 조합물.
  36. 제16항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 제2 성분의 핵산은 서열번호 85 내지 212로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 또는 이들 서열의 단편을 포함하거나 이들로 이루어진 조합물.
  37. 제36항에 있어서, 제2 성분의 핵산은 서열번호 85 내지 87, 149 내지 212로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 또는 임의의 이들 서열의 단편을 포함하거나 이들로 이루어지며, 바람직하게 여기서 제2 성분의 핵산은 5’-GAG CGmG CCA-3’(서열번호 : 85)에 따른 핵산 서열과 동일하거나 적어도 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 또는 이의 단편을 포함하거나 이로 이루어지는 조합물.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 여기서 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA는 코딩 RNA, 비-코딩 RNA, 원형 RNA(circRNA), RNA 올리고뉴클레오티드, 소형 간섭 RNA(siRNA), 소형 헤어핀 RNA (shRNA), 안티센스 RNA(asRNA), CRISPR/Cas9 가이드 RNA, mRNA, 리보스위치, 리보자임, RNA 앱타머, 리보솜 RNA(rRNA), 트랜스퍼 RNA(tRNA), 바이러스 RNA(vRNA), 레트로바이러스 RNA, 소형 핵 RNA(snRNA), 자가 복제 RNA, 레플리콘 RNA, 소형 핵성 RNA(snoRNA), 마이크로 RNA(miRNA) 및 Piwi-상호작용 RNA(piRNA)로부터 선택되는 조합물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA는 시험관 내 전사된 RNA인 조합물.
  40. 제39항에 있어서, 여기서 시험관 내 전사된 RNA는 서열 최적화된 뉴클레오티드 혼합물을 사용하는 RNA 시험관 내 전사에 의해 수득되는 조합물.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA는 정제된 RNA인 조합물.
  42. 제41항에 있어서, 여기서 정제된 RNA가 RP-HPLC 및/또는 TFF 및/또는 올리고 d(T) 정제에 의해 정제된 것인 조합물.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA가 코딩 RNA인 조합물.
  44. 제43항에 있어서, 코딩 RNA가 mRNA, 자가-복제 RNA, 원형 RNA, 바이러스 RNA, 또는 레플리콘 RNA로부터 선택되는 조합물.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA가 mRNA인 조합물.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 코딩 RNA 또는 mRNA가 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 조합물.
  47. 제46항에 있어서, 여기서 코딩 RNA 또는 mRNA의 암호화된 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 발현이
    제2 성분의 적어도 하나의 RNA 감지 패턴 인식 수용체의 적어도 하나의 길항제와의 조합이 없는 코딩 RNA 또는 mRNA의 암호화된 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 발현과 비교해, 세포, 조직 또는 유기체 내로 투여 시
    제2 성분의 적어도 하나의 RNA 감지 수용체의 적어도 하나의 길항제와의 조합에 의해 증가 또는 연장되는, 조합물.
  48. 제46항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질이 치료 펩티드 또는 단백질이거나 그로부터 유래된 것인 조합물.
  49. 제48항에 있어서, 여기서 치료 펩티드 또는 단백질은 항체, 인트라바디, 수용체, 수용체 작용제, 수용체 길항제, 결합 단백질, CRISPR-연관 엔도뉴클레아제, 샤페론, 수송 단백질, 이온 채널, 막 단백질, 분비 단백질, 전사 인자, 효소, 펩타이드 또는 단백질 호르몬, 성장 인자, 구조 단백질, 세포질 단백질, 세포골격 단백질, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 원생동물 항원, 알레르겐, 종양 항원, 또는 이들 중 임의의 것의 단편, 변이체 또는 조합이거나 이들로부터 유래된 조합물.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 코딩 서열이 코돈 변형된 코딩 서열이고, 여기서 적어도 하나의 코돈 변형된 코딩 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열이 바람직하게 상응하는 야생형 코딩 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 비교하여 변형되지 않는 조합물.
  51. 제50항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 코돈 변형된 코딩 서열이 C 최대화된 코딩 서열, CAI 최대화된 코딩 서열, 인간 코돈 사용빈도에 적응된 코딩 서열(human codon usage adapted coding sequence), G/C 함량 변형된 코딩 서열, 및 G/C 최적화된 코딩 서열, 또는 이의 임의의 조합물로부터 선택되는 조합물.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA, 바람직하게는 mRNA는 5'-캡 구조를 포함하는 조합물.
  53. 제52항에 있어서, 여기서 5'-캡 구조가 cap0, cap1, cap2, 변형된 cap0 또는 변형된 cap1 구조인 조합물.
  54. 제53항에 있어서, 여기서 5'-캡 구조가 cap1 구조인 조합물.
  55. 제54항에 있어서, 여기서 cap1 구조가 트리뉴클레오티드 cap1 유사체를 사용한 공동-전사 캡핑에 의해 수득가능한 것인 조합물.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분의 치료 RNA(종)의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%가 캡핑 검출 어세이를 사용하여 결정되어지는 cap1 구조를 포함하는 조합물.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 조합물.
  58. 제57항에 있어서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 슈도우리딘(ψ), N1-메틸슈도우리딘(m1ψ), 5-메틸시토신, 및/또는 5-메톡시우리딘으로부터 선택되는 조합물.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA, 바람직하게는 mRNA는 적어도 하나의 폴리(A) 서열 및/또는 적어도 하나의 폴리(C) 서열, 및/또는 적어도 하나의 히스톤 스템-루프 서열/구조를 포함하는 조합물.
  60. 제59항에 있어서, 여기서 폴리(A) 서열이 치료 RNA의 3' 말단에 위치하고, 및/또는 여기서 RNA의 3' 말단이 A 뉴클레오티드로 종결되는 폴리(A) 서열로 이루어지는 조합물.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA, 바람직하게는 mRNA가 적어도 하나의 이종 5'-UTR 및/또는 적어도 하나의 이종 3'-UTR을 포함하는 조합물.
  62. 제61항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 이종 3'-UTR이 PSMB3, ALB7, 알파-글로빈, CASP1, COX6B1, GNAS, NDUFA1 및 RPS9로부터 선택된, 또는 이들 유전자 중 임의의 하나의 상동체, 단편 또는 변이체로부터 선택된 유전자의 3'-UTR로부터 유래된 핵산 서열을 포함하는 조합물.
  63. 제61항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 이종 5'-UTR이 HSD17B4, RPL32, ASAH1, ATP5A1, MP68, NDUFA4, NOSIP, RPL31, SLC7A3, TUBB4B 및 UBQLN2로부터 선택된, 또는 이들 유전자 중 임의의 하나의 상동체, 단편 또는 변이체로부터 선택된 유전자의 5'-UTR로부터 유래된 핵산 서열을 포함하는 조합물.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 성분의 적어도 하나의 길항제, 바람직하게는 핵산, 및/또는 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA는
    하나 이상의 양이온성 또는 다중양이온성 화합물, 바람직하게 양이온성 또는 다중양이온성 중합체, 양이온성 또는 다중양이온성 다당류, 양이온성 또는 다중양이온성 지질, 양이온성 또는 다중양이온성 단백질, 또는 양이온성 또는 다중양이온성 펩티드, 또는 이들의 임의의 조합과
    복합체화되거나 회합되거나 적어도 부분적으로 복합체화되거나 부분적으로 회합되는 조합물.
  65. 제64항에 있어서, 여기서 하나 이상의 양이온성 또는 다중양이온성 펩티드가 서열번호: 39 내지 43, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 조합물.
  66. 제64항에 있어서, 여기서 양이온성 또는 다중양이온성 중합체가
    HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)7-S-PEG5000-OH (펩티드 단량체의 서열번호: 42)를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체, 및/또는
    HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)4-S-PEG5000-OH (펩티드 단량체의 서열번호: 43)을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜/펩티드 중합체인 조합물.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 지질 및/또는 리피도이드를 추가로 포함하는 조합물.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 제2 성분의 적어도 하나의 길항제, 바람직하게는 핵산, 및/또는 제1 성분의 적어도 하나의 치료 RNA는
    하나 이상의 지질과 복합체화되거나, 부분적으로 복합체화되거나, 캡슐화되거나, 부분적으로 캡슐화되거나, 또는 회합되어 리포솜, 지질 나노입자 (LNP), 리포플렉스, 및/또는 나노리포솜을, 바람직하게 지질 나노입자 (LNP)를 형성하는 조합물.
  69. 제68항에 있어서, 여기서 LNP가
    (i) 적어도 하나의 양이온성 지질, 바람직하게는 지질 III-3;
    (ii) 적어도 하나의 중성 지질, 바람직하게는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC);
    (iii) 적어도 하나의 스테로이드 또는 스테로이드 유사체, 바람직하게는 콜레스테롤; 및
    (iv) 적어도 하나의 PEG-지질, 바람직하게는 화학식 (IVa)의 PEG화된 지질을,
    바람직하게는 여기서 (i) 내지 (iv)는 약 20-60% 양이온성 지질; 5-25% 중성 지질; 25-55% 스테롤; 0.5-15% PEG-지질의 몰비인 조합물.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 하나에 정의된 조합물, 및
    선택적으로 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하거나 이로 이루어진 약학적 조성물.
  71. 제70항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 치료 RNA 및 적어도 하나의 길항제는 별도로 제형화되는 것인 약학적 조성물.
  72. 제71항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 치료 RNA 및 적어도 하나의 길항제는 적어도 하나의 치료 RNA 및 적어도 하나의 길항제가 같은 세포에 흡수되는 것을 보장하기 위해 하나의 입자에 모두 존재할 가능성을 증가시키기 위해 공동-제형화되는 약학적 조성물.
  73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 길항제, 바람직하게는 핵산 대 적어도 하나의 치료 RNA의 몰 비가 약 1:1 내지 약 100:1의 범위, 또는 약 20:1 내지 약 80:1의 범위인 약학적 조성물.
  74. 제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 적어도 하나의 길항제, 바람직하게는 핵산 대 하나 적어도 하나의 치료 RNA의 중량 대 중량 비가 약 1:1 내지 약 1:30의 범위, 또는 약 1:2 내지 약 1:10의 범위인 약학적 조성물.
  75. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 세포, 조직 또는 유기체에 대한 조성물의 투여는
    상응하는 치료 RNA 만의 투여와 비교하여 치료 RNA의 본질적으로 동일하거나 적어도 필적하는 활성을 초래하는 것인 약학적 조성물.
  76. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 세포, 조직 또는 유기체에 대한 조성물의 투여는
    예를 들어 상응하는 치료 RNA만의 투여와 비교하여 치료 RNA의 증가된 활성을 초래하는 것인 약학적 조성물.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 여기서 치료 RNA의 활성이 코딩된 펩티드 또는 단백질의 발현, 바람직하게는 단백질 발현인 약학적 조성물.
  78. 제70항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 세포, 조직 또는 유기체에 대한 조성물의 투여는 상응하는 치료 RNA만의 투여와 비교하여 감소된 (선천적) 면역 자극을 초래하는 것인 약학적 조성물.
  79. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 정의된 적어도 하나의 제1 및 제2 성분, 및/또는 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항에 정의된 적어도 하나의 약학적 조성물을 포함하고,
    선택적으로 가용화를 위한 액체 비히클, 선택적으로, 성분의 투여 및/또는 용량에 대한 정보를 제공하는 기술 설명서를 포함하는 키트 또는 부품 키트.
  80. 의약으로 사용을 위한 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항의 조합물, 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항의 약학적 조성물, 또는 제79항의 키트 또는 부품 키트.
  81. 만성적 의학적 치료에 사용을 위한 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항의 조합물, 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항의 약학적 조성물, 또는 제79항의 키트 또는 부품 키트.
  82. 제81항에 있어서, 조합물, 조성물, 키트 또는 부품 키트의 만성 의학적 치료를 위한 투여는 1회 이상, 예를 들어, 1일 1회 이상, 1주일에 1회 이상, 1달에 1회 이상인
    만성적 의학적 치료에 사용을 위한 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항의 조합물, 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항의 약학적 조성물, 또는 제79항의 키트 또는 부품 키트.
  83. 감염, 바람직하게 바이러스 감염, 박테리아 감염, 또는 원생동물 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항의 조합물, 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항의 약학적 조성물, 또는 제79항의 키트 또는 부품 키트.
  84. 종양 질환, 또는 그러한 종양 질환과 관련된 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항의 조합물, 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항의 약학적 조성물, 또는 제79항의 키트 또는 부품 키트.
  85. 유전적 장애 또는 상태의 치료 또는 예방에 사용을 위한 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항의 조합물, 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항의 약학적 조성물, 또는 제79항의 키트 또는 부품 키트.
  86. 단백질 또는 효소 결핍의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항의 조합물, 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항의 약학적 조성물, 또는 제79항의 키트 또는 부품 키트.
  87. 장애, 질병, 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위한 방법으로,
    여기서 상기 방법은 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 정의되어진 조합물, 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항에 정의되어진 약학적 조성물, 또는 제79항에 정의되어진 키트 또는 부품 키트를 이를 필요로 하는 대상체에 적용하거나 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 여기서 제1 성분 및 제2 성분의 투여는 본질적으로 동시적인 방법.
  89. 제87항에 있어서, 여기서 제1 성분 및 제2 성분의 투여가 순차적인 방법.
  90. 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 조합물, 약학적 조성물, 키트 또는 부품 키트의 투여는 1회 이상, 예를 들어 1일 1회 이상, 1주일에 1회 이상, 1달에 1회 이상 수행되는 방법.
  91. 제86항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 투여 또는 적용은 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액내, 비강내, 경구, 흉골내, 척추강내, 간내, 병변내, 두개내, 경피, 피내, 폐내, 복강내, 심장내, 동맥내, 안구내, 유리체내, 망막하, 또는 종양내로 되는 방법.
  92. 제86항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 필요로 하는 대상체는 포유류 대상체, 바람직하게 인간 대상체인 방법.
  93. 치료 RNA의 (선천성) 면역 자극을 감소시키는 방법으로, 여기서 상기 방법은
    제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 정의되어진 조합물, 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항에 정의되어진 약학적 조성물, 또는 제79항에 정의되어진 키트 또는 부품 키트를 이를 필요로 하는 대상체에 적용하거나 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  94. (코딩) 치료 RNA에 의해 암호화되는 펩티드 또는 단백질의 발현을 증가 및/또는 연장하는 방법으로 여기서 상기 방법은
    제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 정의되어진 조합물, 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항에 정의되어진 약학적 조성물, 또는 제79항에 정의되어진 키트 또는 부품 키트를 이를 필요로 하는 대상체에 적용하거나 투여하는 단계를 포함하는 방법.
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