KR20220026581A - Cbl-b 억제를 위한 치환된 벤질-트리아졸 화합물, 및 이의 추가의 용도 - Google Patents

Cbl-b 억제를 위한 치환된 벤질-트리아졸 화합물, 및 이의 추가의 용도 Download PDF

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아서 티. 샌즈
네일 에프. 벤스
크리스토프 더블유. 자프
프레드릭 코헨
첸보 왕
토마스 커민스
히로코 타나카
헌터 슈나토나
마리오 카르도조
달리아 와이스
제니파 고슬링
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누릭스 테라퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

유비퀴틴 프로테아좀 경로에서 E3 효소 Cbl-b를 억제하는데 사용하기 위한 화학식 I의 화합물, 조성물 및 방법이 개시되어 있다. 상기 화합물, 조성물 및 방법을 사용하여 면역계를 조절하고, 면역계 조절에 순응하는 질환을 치료할 수 있고, 생체내, 시험관내, 또는 생체외에서 세포 치료용으로 사용될 수 있다. Cbl-b 억제제 및 암 백신을 포함하는 약제학적 조성물뿐만 아니라 Cbl-b 억제제 및 암 백신을 사용하여 암을 치료하는 방법; 및 Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물뿐만 아니라 Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스를 사용하여 암을 치료하는 방법이 또한 개시된다.
화학식 I
Figure pct00253

Description

CBL-B 억제를 위한 치환된 벤질-트리아졸 화합물, 및 이의 추가의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119하에 2019년 6월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/866,914호; 2019년 7월 30일에 출원된 제62/880,285호; 2019년 8월 19일에 출원된 제62/888,845호; 및 2019년 8월 19일에 출원된 제62/888,870호의 이점을 특허청구하고, 여기서 각각의 내용은 전체가 본원에 참고로 포함된다.
분야
Cbl-b 효소 억제용 화합물 및 조성물, 및 면역계의 조절, 질환의 치료, 및 생체내, 시험관내 또는 생체외에서 세포의 치료에서의 이의 사용 방법이 본원에 제공된다. Cbl-b 효소의 억제제와 암 백신의 조합을 포함하는 약제학적 조성물, 키트(kit) 및 암을 치료하는 방법; 및 Cbl-b 효소의 억제제와 종양 용해성 바이러스의 조합을 포함하는 약제학적 조성물, 키트 및 암을 치료하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
유비퀴틴 프로테아좀 경로는 단백질의 기능과 이화 작용의 조절에 관여하는 복잡한 시스템이다. 진핵 세포의 단백질은 76개의 아미노산, 8.5킬로달톤의 단백질인 유비퀴틴과 접합된다. 유비퀴틴화로 공지된 이 접합은 표적 단백질의 변경된 기능 또는 분해를 초래한다. 표적 단백질의 유비퀴틴화는 유비퀴틴과 E1, E2 및 E3 효소로 공지진 일련의 효소를 포함하는 결합된 일련의 반응을 통해 발생한다. 유비퀴틴은 유비퀴틴 활성화 효소 또는 E1 효소에 의해 활성화된다. 그런 다음, 유비퀴틴은 유비퀴틴 접합 효소 또는 E2 효소로 전달된다. 마지막으로, 유비퀴틴 리가제 또는 E3 효소는 E2 효소로부터 표적 단백질로 유비퀴틴의 전달을 촉진한다. 표적 단백질의 폴리유비퀴틴화는 주로 프로테아좀에 의한 유비퀴틴 접합 단백질의 분해로 이어지는 신호로서 작용하며, 여기서 그것은 단백질 분해를 겪는다. E3 리가제에 의한 유비퀴틴화는 또한 변경된 단백질 활성, 상호작용 또는 국소화를 초래할 수 있다. 유비퀴틴화는 세포 분열, DNA 복구, 세포 신호 전달을 포함하는 다양한 생물학을 조절한다.
세포 내 단백질의 합성과 분해는 세포 주기 조절, 세포 증식, 세포 자멸사 및 많은 다른 세포 과정에 중요하다. 따라서, 유비퀴틴 프로테아좀 경로를 조절하는 능력은 질환 과정에 개입하는 풍부한 기회를 제공한다. 개입을 위한 메커니즘은 종양 유전자 산물의 분해 향상, 종양 억제 단백질의 분해 감소, 면역 세포 반응의 조절, 및 항종양 면역 반응의 조절을 포함할 수 있다.
치료용 암 백신은 수많은 임상 시험에서 평가되었다. 그러나, 단지 2개의 치료용 암 백신이 미국에서 사용이 허가되었다. 특히, 칼메트(Calmett)의 바실러스(Bacillus) 및 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)의 구에린(Guerin) 균주는 방광암 치료용으로 승인되었고, 생체외 활성화된 자가 세포 백신은 전립선암 치료용으로 승인되었다. 그럼에도 불구하고, 암 백신으로 치료받은 환자의 반응률과 전체 생존율은 바람직한 것보다 상당히 낮다. 따라서, 당업계에서 요구되는 것은 암 백신의 효능을 개선하는 방법이다.
암을 치료하기 위해 종양 용해성 바이러스를 사용하는 수많은 임상 시험이 수행되었지만, 하나의 종양 용해성 바이러스만이 미국과 유럽에서 사용이 허가되었다. 특히, 탈리모겐 라헤르파렙벡(talimogene laherparepvec)은 흑색종 치료용으로 승인된 유전자 변형된 단순 포진 바이러스이다. 그러나, 탈리모겐 라헤르파렙벡조차도 전체 생존을 개선하거나 내장 전이 환자에게 이익을 주는 것으로 나타나지 않았다. 따라서, 당업계에서 요구되는 것은 종양 용해성 바이러스 요법의 효능을 개선하는 방법이다.
대략 35개의 E2 효소와 500개 이상의 E3 효소가 인간 게놈에 인코딩(encoding)되어 있다. 카시타스 B-계통 림프종 원종양유전자-b(Cbl-b)는 T-세포 활성화를 부정적으로 조절하는 E3 유비퀴틴 리가제이다(Wallner et al., Clin Dev Immunol, 2012: 692639). 따라서, E2 또는 E3 효소를 조절하는 제제의 발견은 특정 E2 또는 E3 효소가 관여하는 질환 과정에 대해 지시된 요법의 가능성을 제공한다. 이 특허 출원은 이러한 E3 효소 중 하나인 카시타스 B-계통 림프종 원종양유전자-b(Cbl-b)를 억제하는 제제; 암 백신과 조합하여 사용하기 위한, Cbl-b를 억제하는 제제, 및 및 Cbl-b 억제제 및 암 백신을 포함하는 약제학적 조성물; 및 종양 용해성 바이러스와 조합하여 사용하기 위한, Cbl-b를 억제하는 제제, 및 Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
Cbl-b 효소 억제용 화합물 및 조성물, 및 면역계의 조절, 질환의 치료, 및 생체내, 시험관내 또는 생체외에서의 세포의 치료에서의 이의 사용 방법이 본원에 개시된다. 암 치료에서 Cbl-b 억제제를 사용하는 방법도 본원에 개시되어 있다. 간단히 말해서, Cbl-b 억제제는 단독으로 또는 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor), 항종양제 및 방사선 요법과의 병용 요법의 일부로서 암을 갖는 개체(individual)에게 투여될 수 있다. 추가로, 본원에 개시된 화합물 또는 조성물로 생체내 및/또는 시험관내 처리된 세포는 암을 치료하기 위한 입양 세포 요법에 사용될 수 있다.
화학식 I의 화합물 또는 이의 호변이성체(tautomer), 또는 전술한 것 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염이 본원에 개시된다:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 화학식 I에서,
Figure pct00002
는
Figure pct00003
또는
Figure pct00004
이고;
Z1은 CH 또는 N이고;
Z2는 CH 또는 N이고;
R1은 -CF3 또는 사이클로프로필이고;
R2는 -CF3 또는 사이클로프로필이고;
R3은 H, C1-C2 알킬, 또는 C1-C2 할로알킬이고;
R4는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 4원 내지 8원 헤테로사이클릴, 또는 C3-C6 사이클로알킬이고, 여기서 상기 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬 그룹은 임의로 1 내지 5개의 R6 그룹으로 치환되고; 또는
R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께, 각각 임의로 1 내지 5개의 R6 그룹으로 치환되는 C3-C5 사이클로알킬 또는 4원 내지 6원 헤테로사이클릴을 형성하고;
R5는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이고;
각각의 R6은 독립적으로 C1-C6 알킬, 할로, 하이드록시, -O(C1-C6 알킬), -CN, C1-C6 알킬-CN, C1-C6 알킬-OH, 또는 C1-C6 할로알킬이고; 또는
동일한 탄소 원자에 부착된 2개의 R6 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 C3-C6 사이클로알킬 또는 스피로 4원 내지 6원 헤테로사이클릴을 형성하고;
X는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알킬-OH, C1-C6 알킬-CN, 1 내지 5개의 R8 그룹으로 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬, 또는
Figure pct00005
이고;
Figure pct00006
는 4원 내지 7원 헤테로사이클릴 또는 5원 내지 8원 헤테로아릴이고, 이 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴은 각각 N, O 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 내지 2개의 추가 헤테로원자를 임의로 함유하고, 이 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴은 각각 임의로 1 내지 5개의 R8 그룹으로 치환되고;
각각의 R7은 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-OH, 또는 C1-C6 할로알킬이고; 또는
2개의 R7 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 C3-C5 사이클로알킬 또는 3원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성하고;
각각의 R8은 독립적으로 할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-CN, C1-C6 알킬-OH, C1-C6 할로알킬, -CN, 옥소, 또는 -O(C1-C6 알킬)이고; 또는
2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 또는 융합된(fused) C3-C5 사이클로알킬 또는 3원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성한다.
일부 구현예에서,
Figure pct00007
는
Figure pct00008
이다. 일부 구현예에서, Z1은 CH이다. 일부 구현예에서, Z1은 N이다
일부 구현예에서,
Figure pct00009
는
Figure pct00010
Figure pct00011
또는
Figure pct00012
이다.
일부 구현예에서,
Figure pct00013
는
Figure pct00014
이다. 일부 구현예에서, Z2는 CH이다. 일부 구현예에서, Z2는 N이다.
일부 구현예에서,
Figure pct00015
는
Figure pct00016
Figure pct00017
또는
Figure pct00018
이다.
일부 구현예에서, R3은 H, C1-C2 알킬, 또는 C1-C2 할로알킬이고; R4는 H, C1-C3 알킬, C1-C3 할로알킬, 4원 내지 6원 헤테로사이클릴, 또는 C4-C5 사이클로알킬이고; 여기서, 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬 그룹은 임의로 1 내지 3개의 R6 그룹으로 치환되고; 또는 R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 C4-C5 사이클로알킬 또는 4원 내지 6원 헤테로사이클릴을 형성하고, 이들 각각은 임의로 1 내지 3개의 R6 그룹으로 치환된다. 일부 구현예에서, R3은 H, -CH3, 또는 -CF3이고; R4는 H, -CH3, -CF3, 사이클로부틸, 또는
Figure pct00019
이고; 또는 R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께
Figure pct00020
Figure pct00021
를 형성하고, 이들 각각은 임의로 1 내지 3개의 R6 그룹으로 치환된다. 일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 메틸인 1개의 R6 그룹으로 치환되어
Figure pct00022
을 형성한다. 일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 1개의 R6 그룹으로 치환되어
Figure pct00023
을 형성한다. 일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 1개의 R6 그룹으로 치환되어
Figure pct00024
을 형성한다. 일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 1개의 R6 그룹으로 치환되어
Figure pct00025
을 형성한다. 일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 2개의 R6 그룹으로 치환되어
Figure pct00026
을 형성한다.
일부 구현예에서, 각각의 R6은 독립적으로 C1-C3 알킬, 할로, 하이드록시, -O(C1-C3 알킬), -CN, C1-C3 알킬-CN, C1-C3 알킬-OH, 또는 C1-C3 할로알킬이고; 또는 동일한 탄소 원자에 부착된 2개의 R6 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 C3-C6 사이클로알킬 또는 스피로 4원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 구현예에서, 각각의 R6은 독립적으로 -CH3, F, 하이드록시, -OCH3, -CN, -CH2CN, -CH2OH, 또는 -CF3이고; 또는 동일한 탄소 원자에 부착된 2개의 R6 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 사이클로프로필을 형성한다. 일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 사이클로부틸을 형성하고, 이는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 사이클로프로필을 형성하는 2개의 R6 그룹으로 치환되어
Figure pct00027
을 형성한다.
일부 구현예에서, R5는 H, C1-C3 알킬, C1-C3 할로알킬, 또는 C3-C4 사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, R5는 H, -CH3, -CHF2, 또는 사이클로프로필이다.
일부 구현예에서, X는 H, C1-C3 알킬, C1-C3 할로알킬, C1-C3 알킬-OH, C1-C3 알킬-CN, 또는 1 내지 3개의 R8 그룹으로 임의로 치환된 C3-C5 사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, X는 H 또는 -CH3이다. 일부 구현예에서, X는
Figure pct00028
이다.
일부 구현예에서,
Figure pct00029
는 4원 내지 6원 헤테로사이클릴 또는 5원 내지 6원 헤테로아릴이고, 이들 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴 각각은 임의로 N, O 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 2개의 추가의 헤테로원자를 함유하고, 이들 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴 각각은 임의로 1 내지 5개의 R8 그룹으로 치환된다. 일부 구현예에서,
Figure pct00030
는 4원 내지 5원 헤테로사이클릴 또는 5원 내지 6원 헤테로아릴이고, 이들 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴 각각은 임의로 N 및 O로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 추가의 헤테로원자를 함유하고, 이들 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴 각각은 임의로 1 내지 5개의 R8 그룹으로 치환된다.
일부 구현예에서, X는
Figure pct00031
이다.
일부 구현예에서, Y는 O이다. 일부 구현예에서, Y는 CH2, CHR8, 또는 C(R8)2이다.
일부 구현예에서, 각각의 R7은 독립적으로 H, C1-C3 알킬, C1-C3 알킬-OH, 또는 C1-C3 할로알킬이고; 또는 2개의 R7 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 C3-C5 사이클로알킬 또는 3원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 구현예에서, 각각의 R7은 독립적으로 H, -CH3, -CH2OH, 또는 -CF3이고; 또는 2개의 R7 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 사이클로프로필 또는 옥세타닐을 형성한다.
일부 구현예에서, 각각의 R8은 독립적으로 할로, C1-C3 알킬, C1-C3 알킬-CN, C1-C3 알킬-OH, C1-C3 할로알킬, -CN, 옥소, 또는 -O(C1-C3 알킬)이고; 또는 2개의 R8 그룹은 이들이 결합된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 또는 융합된 C3-C5 사이클로알킬 또는 스피로 또는 융합된 3원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 구현예에서, 각각의 R8은 독립적으로 F, -CH3, -CH2CH3, -CH2CN, -CH2OH, -CF3, -CN, 옥소, 또는 -OCH3이고; 또는 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 또는 융합된 사이클로프로필 또는 옥세타닐을 형성한다.
표 1의 화합물로부터 선택되는 화합물, 또는 이의 호변이성체, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염도 또한 본원에 개시된다. 상기 또는 본원에 개시된 임의의 화합물로부터 선택되는 화합물, 또는 이의 호변이성체, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 부형제도 또한 본원에 개시된다.
면역 세포의 활성을 조절하는 방법도 또한 본원에 개시되며, 상기 방법은 면역 세포를 상기 또는 본원에 개시된 임의의 화합물 또는 이의 호변이성체, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함한다.
이를 필요로 하는 개체에서 Cbl-b 활성의 억제에 반응하는 암을 치료하는 방법이 또한 본원에 개시되며, 상기 방법은 상기 또는 본원에 개시된 임의의 화합물 또는 이의 호변이성체, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
이를 필요로 하는 개체에서 Cbl-b 활성을 억제하는 방법이 또한 본원에 개시되며, 상기 방법은 상기 또는 본원에 개시된 임의의 화합물 또는 이의 호변이성체, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
이를 필요로 하는 개체에서 Cbl-b 활성과 관련된 질환 또는 상태(condition)를 치료 또는 예방하기 위한 방법이 또한 본원에 개시되며, 상기 방법은 상기 또는 본원에 개시된 임의의 화합물 또는 이의 호변이성체, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
변형된 면역 세포를 생산하는 방법이 또한 본원에 개시되며, 상기 방법은 면역 세포를 함유하는 세포 집단(cell population)을 상기 또는 본원에 개시된 임의의 화합물 또는 이의 호변이성체, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량의 존재하에 배양하는 단계를 포함한다.
Cbl-b 억제제를 포함하는 변형된 면역 세포가 또한 본원에 개시되며, 여기서 Cbl-b 억제제는 상기 또는 본원에 개시된 임의의 화합물, 또는 이의 호변이성체 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염이다.
단리된 변형된 면역 세포가 또한 본원에 개시되며, 여기서 상기 면역 세포는 상기 또는 본원에 개시된 임의의 화합물, 또는 이의 호변이성체 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염과 접촉되었거나 접촉된다.
단리된 변형된 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 포함하는 조성물이 또한 본원에 개시되며, 여기서 상기 면역 세포는 상기 또는 본원에 개시된 임의의 화합물, 또는 이의 호변이성체 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염과 접촉되었거나 접촉된다.
비정상적인 세포 증식을 억제하는 방법이 또한 본원에 개시되며, 상기 방법은 유효량의 단리된 변형된 면역 세포를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 면역 세포는 상기 또는 본원에 개시된 임의의 화합물, 또는 이의 호변이성체 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염과 접촉되었거나 접촉된다.
비정상적인 세포 증식을 억제하는 방법이 또한 본원에 개시되며, 상기 방법은 단리된 변형된 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 면역 세포는 상기 또는 본원에 개시된 임의의 화합물, 또는 이의 호변이성체 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염과 접촉되었거나 접촉된다.
비정상적인 세포 증식을 억제하는 방법이 또한 본원에 개시되며, 상기 방법은 상기 또는 본원에 개시된 임의의 화합물, 또는 이의 호변이성체, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
면역 세포 및 Cbl-b 억제제를 함유하는 세포 집단을 포함하는 세포 배양 조성물이 또한 본원에 개시되며, 여기서 상기 Cbl-b 억제제는 상기 또는 본원에 개시된 임의의 화합물, 또는 이의 호변이성체 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Cbl-b 억제제 및 애쥬번트(adjuvant) 및 항원 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 본원에 개시되며, 여기서 상기 Cbl-b 억제제는 상기 또는 본원에 개시된 임의의 화합물, 또는 이의 호변이성체 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염이다.
본원에 개시된 임의의 변형된 면역 세포, 본원에 개시된 세포 집단을 포함하는 임의의 조성물, 본원에 개시된 임의의 세포 배양 조성물, 또는 본원에 개시된 임의의 약제학적 조성물을 포함하는 제조 물품(article of manufacture)이 또한 본원에 개시된다.
본원에 개시된 임의의 변형된 면역 세포, 또는 본원에 개시된 세포 집단을 포함하는 임의의 조성물을 포함하는 키트가 또한 본원에 개시된다.
Cbl-b 활성과 관련된 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서 Cbl-b 억제제의 용도가 또한 본원에 개시되며, 여기서 상기 Cbl-b 억제제는 상기 또는 본원에 개시된 임의의 화합물, 또는 이의 호변이성체 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염이다.
본원에 개시된 임의의 구현예에서, Cbl-b 단백질은 포유류 Cbl-b 또는 인간 Cbl-b일 수 있다.
Cbl-b 억제제 화합물, 백신, 및 Cbl-b 억제제 및 백신을 포함하는 조성물, 및 암의 치료에서 이의 사용 방법이 본원에 개시된다. Cbl-b 억제제와 암 백신은 암을 갖는 개체에게 투여될 수 있다.
또한, Cbl-b 억제제 화합물, 종양 용해성 바이러스, 및 Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스를 포함하는 조성물, 및 암의 치료에서 이들의 사용 방법이 본원에 개시된다. Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스는 암을 갖는 개체에게 투여될 수 있다.
면역화 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 유효량의 소분자 Cbl-b 억제제를 투여하는 단계 및 상기 개체에게 유효량의 백신을 투여하는 단계를 포함한다.
암을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 암을 갖는 개체에게 유효량의 소분자 Cbl-b 억제제를 투여하는 단계 및 상기 개체에게 유효량의 종양 용해성 바이러스를 투여하는 단계를 포함한다.
암을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 암을 갖는 개체에게 면역 세포의 활성화 임계치를 감소시킬 수 있는 제제의 유효량을 투여하는 단계, 및 유효량의 치료용 암 백신을 상기 개체에게 투여하는 단계; 또는 상기 개체에게 유효량의 종양 용해성 바이러스를 투여하는 단계를 포함한다.
암 백신 및 소분자 Cbl-b 억제제를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공되며, 임의로 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.
암 치료용 키트가 본원에 제공되며, 상기 키트는 (a) 소분자 Cbl-b 억제제; (b) 치료용 암 백신; 및 (c) 개체에서 암을 치료하기 위한 유효량의 Cbl-b 억제제 및 치료용 암 백신의 투여를 위한 설명서(instruction)를 포함한다.
암 치료용 키트가 본원에 제공되며, 상기 키트는 (a) 소분자 Cbl-b 억제제 및 치료용 암 백신을 포함하는 약제학적 조성물; 및 (b) 개체에서 암을 치료하기 위한 Cbl-b 억제제 및 치료용 암 백신을 포함하는 유효량의 약제학적 조성물의 투여를 위한 설명서를 포함한다.
종양 용해성 바이러스 및 소분자 Cbl-b 억제제를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공되며, 임의로 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.
암 치료용 키트가 본원에 제공되며, 상기 키트는 (a) 소분자 Cbl-b 억제제; (b) 종양 용해성 바이러스; 및 (c) 개체에서 암을 치료하기 위한 유효량의 Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스의 투여를 위한 설명서를 포함한다.
암 치료용 키트가 본원에 제공되며, 상기 키트는 (a) 소분자 Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물; 및 (b) 개체에서 암을 치료하기 위한 소분자 Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물의 투여를 위한 설명서를 포함한다.
그리고, 이를 필요로 하는 대상체에서 세포 요법을 통해 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 질환을 치료하기 위한 하나 이상의 치료 세포의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계; 및 유효량의 Cbl-b 억제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 Cbl-b 억제제는 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물이며, 치료 세포에 의한 치료는 Cbl-b 억제제와의 조합에 의해 증강된다.
도 1은 카플란-마이어 플롯(Kaplan-Meier plot)으로 표시된 마우스의 조건부 생존율을 도시한다.
도 2는 개체 마우스의 종양 용적을 도시한다.
도 3 및 4는 개체 종양의 종양 용적을 도시한다.
Cbl-b 효소를 억제하는 화합물 및 약제학적 조성물, 및 이러한 화합물 및 약제학적 조성물을 사용하는 치료 방법이 본원에 제공된다. 화합물 및 조성물은 면역계를 조절하고, 질환의 치료, 및 생체내, 시험관내, 또는 생체외에서 세포의 치료 방법에 사용될 수 있다. 또한, 암 백신 및 Cbl-b 효소를 억제하는 화합물을 포함하는 약제학적 조성물, 및 이러한 화합물, 암 백신 및 약제학적 조성물을 사용하는 치료 방법이 본원에 제공된다. 종양 용해성 바이러스 및 Cbl-b 효소를 억제하는 화합물을 포함하는 약제학적 조성물, 및 이러한 화합물, 종양 용해성 바이러스 및 약제학적 조성물을 사용하는 치료 방법이 또한 본원에 제공된다.
T-세포 활성화와 T-세포 내성은 자가면역을 방지하면서 종양에 대한 면역 반응을 조절하는 엄격하게 제어된 과정이다. 내성은 면역계가 "자기" 항원을 발현하는 세포를 공격하는 것을 방지한다. 말초 내성 동안, "자기" 항원을 인식하는 T-세포(즉, 자기 반응성 T-세포)는 기능적으로 비반응성이 되거나 흉선 외부에서 "자기" 항원을 마주친 후 결실된다. 따라서, 말초 내성 과정은 자가면역 질환을 예방하는 데 중요하다. 일반적으로, 암 세포는 암 세포의 표면에서 발현되는 종양 항원을 인식하는 활성화된 T-세포에 의해 제거된다. 그러나, 암에서 종양의 미세 환경은 암 세포에 대한 T-세포의 내성을 지원할 수 있고, 이는 암 세포가 면역계에 의한 인식과 제거를 피할 수 있도록 한다. 종양의 면역감시를 피하는 암 세포의 능력은 통제되지 않은 종양의 성장에 기여할 수 있다. 따라서, T-세포 내성은 T-세포 기능 장애의 한 형태일 수 있다. T-세포 기능 장애의 일반적인 원리는 당업계에 익히 공지되어 있다(참조: Schietinger et al., Trends Immunol., 35: 51-60, 2014). 통제되지 않은 종양 성장에 기여할 수 있는 추가 유형의 T-세포 기능 장애는 T-세포 고갈, T-세포 노화 및/또는 T-세포 아네르기를 포함한다. 따라서, 예를 들어, T-세포 활성화를 증가시키고, T-세포 증식을 증가시키고, T-세포 내성을 감소시키고/시키거나 T-세포 고갈을 감소시킴으로써 T-세포 기능 장애를 치료하는 것은 암의 예방 또는 치료에 유익하다. 면역계의 추가 세포는 면역 감시 동안 암 세포의 인식 및 제거에 중요하다. 예를 들어, 자연 살해(NK) 세포는 암 세포를 동정하고 사멸시킬 수 있는 선천적 면역계의 림프구이다(참조: Martinez-Losato et al., Clin Cancer Res., 21: 5048-5056, 2015). 최근 연구는 또한 별개의 표현형과 기능을 갖는 B-세포 서브세트가 항종양 반응에서 다양한 역할을 보여준다는 것을 보여준다(참조: Saravaria et al., Cell Mol Immunol., 14: 662-674, 2017). 종양 감시에서 이들의 역할로 인해, NK-세포 및 B-세포는 또한 암의 예방 또는 치료를 위한 치료 표적으로서 순응할 수 있다.
Cbl-b는 면역 활성화의 부정적인 조절 인자로서의 기능으로 인해 면역계에서 중요한 역할을 하는 RING형 E3 리가제이다. Cbl-b는 T-세포의 활성화를 감소시켜 T-세포 내성을 향상시키는 데 중요한 역할을 갖는다. 연구는, cbl-b 결핍 T-세포가 항원 인식 수용체 및 공자극 분자(예: CD28)에 의한 활성화에 대한 낮은 임계값을 나타낸다는 것을 밝혀냈다. 예를 들어, T-세포에서 Cbl-b의 손실은 T-세포 활성화 및 증식 동안 CD28 공자극의 요건을 분리시킨다(참조: Bachmaier et al., Nature, 403:211-216, 2000). 이러한 cbl -b-/- T-세포는 T-세포가 기능적으로 불활성화되고 T-세포 증식이 크게 손상되는 내성 메커니즘인 T-세포 아네르기에 크게 내성이 있다(참조: Jeon et al., Immunity, 21:167-177, 2004; 및 Schwartz et al., Annu Rev Immunol., 21:305-34, 2003). 이를 지지하여, cbl-b 녹아웃 마우스에서 Cbl-b의 손실은 손상된 T-세포 내성의 유도 및 악화된 자가면역을 초래하였다(참조: Jeon et al., Immunity, 21:167-177, 2004). 중요하게는, 마우스에서 Cbl-b의 손실은 주로 세포독성 T-세포에 의존하는 강력한 항종양 반응을 초래했다. 한 연구는 cbl -b-/- CD8+ T-세포는 T 조절 세포 매개 억제에 내성이 있고, 향상된 활성화 및 종양 침윤을 나타냄을 보여주었다. 나이브 cbl -b-/- CD8+ T-세포의 치료적 전달은 확립된 종양의 거부 반응을 매개하기에 충분하였다(참조: Loeser et al., J Exp Med., 204:879-891, 2007). 최근 연구는 Cbl-b는 또한 NK-세포 활성화에서 역할을 한다는 것을 나타냈다. Cbl-b의 유전적 결실 또는 이의 E3 리가제 활성의 표적화된 불활성화는 NK-세포가 마우스 모델에서 전이성 종양을 자발적으로 거절하도록 했다(참조: Paolino et al., Nature, 507: 508-512, 2014).
Cbl-b의 강력한 억제제이고, 암과 같은 질환을 치료하기 위한 신규한 접근법에 사용될 수 있는 화합물 및 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 화합물 및 조성물은 T-세포, NK-세포 및 B-세포의 활성화 증가와 같은 면역계를 조절하는 방법, 및 생체내, 시험관내 또는 생체외에서 이러한 세포의 치료에 사용될 수 있다.
I. 정의
본원에 개시된 약제의 "유효량"은 구체적으로 기술된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 기술된 목적과 관련하여 경험적이고 일상적인 방식으로 결정될 수 있다. 제제의 "유효량" 또는 "충분한 양"은 유익한 임상 결과를 포함하여 유익한 결과와 같은 목적하는 생물학적 효과를 내기에 적절한 양이다. 일부 구현예에서, 용어 "유효량"은 개체(예: 인간과 같은 포유동물)의 질환 또는 장애를 "치료하는데" 효과적인 제제의 양을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "Cbl-b"는 Cbl-b 단백질을 지칭한다. 상기 용어는 또한 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함하여 Cbl-b의 천연 변이체를 포함한다. 상기 용어는 또한 재조합 Cbl-b 단백질 또는 이의 절단된 변이체와 같은 Cbl-b의 비천연 변이체를 포함하며, 이들은 일반적으로 천연 Cbl-b 또는 Cbl-b의 천연 변이체의 결합 능력(예: E2 효소에 결합하는 능력)을 보유한다.
"약제학적 제형" 및 "약제학적 조성물"이라는 용어는 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하게 되도록 하는 형태로 존재하며, 제형 또는 조성물이 투여되는 개체에게 허용될 수 없도록 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제형 또는 조성물은 무균일 수 있다. 이러한 제형 또는 조성물은 종양 용해성 바이러스를 포함하는 것을 제외하고는 무균일 수 있다.
본원에서 사용되는 "부형제"는 사용된 용량 및 농도로 이에 노출되는 세포 또는 포유동물에 대해 비독성인 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 비히클, 또는 안정제를 포함한다. 종종 생리학적으로 허용되는 부형제는 pH 완충 수용액이다.
약제학적 조성물에 기재된 화합물 또는 약제학적 조성물에 대한 청구항에 기재된 화합물에 대한 언급은 약제학적 조성물의 다른 요소 없이, 즉 담체, 부형제 등 없이 약제학적 조성물에 인용된 화학식에 의해 기재된 화합물을 지칭한다.
질환을 "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 프로토콜을 수행하는 것을 지칭하며, 이는 임상 결과를 포함하여 개체에게 유익하거나 목적하는 결과를 수득하기 위한 노력에서 개체(인간 또는 달리)에게 하나 이상의 치료제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 유익한 또는 목적하는 임상 결과는 하나 이상의 증상의 완화 또는 개선, 질환 정도의 감소, 질환의 안정된 (즉, 악화되지 않은) 상태, 질환 확산의 예방, 질환 진행의 지연 또는 늦춤, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해(부분적이든 전체적이든)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료받고 있지 않은 개체의 예상된 생존과 비교하여 생존을 연장시킴을 의미할 수 있다. 또한, "치료하는" 및 "치료"는 단일 투여량의 치료제 또는 치료제들의 투여에 의해 일어날 수 있거나, 일련의 투여량의 치료제 또는 치료제들의 투여시에 일어날 수 있다. "치료하는" 또는 "치료"는 징후 또는 증상의 완전한 완화를 필요로 하지 않으며, 치유를 필요로 하지 않는다. "치료"는 또한 치료되는 개체 또는 세포의 자연적인 과정을 변경하도록(즉, 임상적 개입의 부재하에 발생하는 개체 또는 세포의 과정을 변경하도록) 설계된 하나 이상의 치료제를 개체에게 투여하는 것과 같은 임상적 개입을 지칭할 수 있다. 용어 "치료제"는 Cbl-b 억제제, 변형된 면역 세포, 또는 이들의 조성물을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 "개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 치료 목적을 위한 "포유동물"은 인간; 비인간 영장류; 가정용 및 농장 동물; 및 동물원, 스포츠 또는 애완동물, 예를 들어, 개, 말, 토끼, 소, 돼지, 햄스터, 저빌, 마우스, 흰족제비, 래트, 고양이 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는 용어 "T-세포 기능 장애"는 항원 자극에 대한 면역 반응성이 감소된 상태를 지칭한다. 용어 "T-세포 기능 장애"는 항원 인식이 일어날 수 있는 T-세포 고갈 및/또는 T-세포 아네르기 둘 모두의 공통 요소를 포함하지만, 후속 면역 반응은 종양 성장을 조절하는 데 비효과적이다. 용어 "T-세포 기능 장애"는 또한 항원 인식에 대한 불응성 또는 비반응성, 예를 들어, 항원 인식을 다운스트림 T-세포 이펙터 기능, 예를 들어, 증식, 사이토카인 생산 및/또는 표적 세포 사멸로 번역하는 능력의 손상을 포함한다.
용어 "T-세포 아네르기"는 T-세포 수용체를 통해 전달되는 불완전하거나 불충분한 신호로 인한 항원 자극에 대한 무반응 상태를 지칭한다. "T-세포 아네르기"는 또한 공자극의 부재하에서 항원에 의한 자극시 발생할 수 있으며, 그 결과 공자극 맥락에서도 항원에 의한 후속 활성화에 대해 불응성이 되는 세포를 초래한다.
용어 "T-세포 고갈"은 암 동안 발생할 수 있는 지속된 TCR 신호전달로 인한 T-세포 기능 장애의 상태를 지칭한다. 이는 불완전하거나 결핍된 신호전달을 통해서가 아니라 지속된 신호전달로부터 발생한다는 점에서 아네르기와 구별된다. 이것은 불량한 이펙터 기능, 억제성 수용체의 지속된 발현 및 기능적 이펙터 또는 메모리 T-세포와는 다른 전사 상태에 의해 정의된다.
"T-세포 기능 장애 장애"는 항원 자극에 대한 T-세포의 감소된 반응성을 특징으로 하는 장애 또는 상태이다. 감소된 반응성은 종양의 비효율적인 제어를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "T-세포 기능 장애 장애"는 혈액암 또는 비혈액암과 같은 암을 포함한다. 일부 구현예에서, "T-세포 기능 장애 장애"는 T-세포가 아네르기이거나, 사이토카인을 분비하거나, 증식시키거나, 또는 세포 용해 활성을 수행하는 능력이 감소된 것이다.
"T-세포 기능을 향상시키는 것"은 T-세포가 지속적 또는 증폭된 생물학적 기능을 갖도록 유도, 유발 또는 자극하거나 고갈된 또는 불활성 T-세포를 갱신 또는 재활성화하는 것을 의미한다. 향상된 T-세포 기능의 예로는 Cbl-b 억제제로 치료 전 T-세포의 상태에 비해 증가된 T-세포 활성화(예: 증가된 사이토카인 생산, T-세포 활성화 마커(activation marker)의 증가된 발현 등), 증가된 T-세포 증식, 감소된 T-세포 고갈 및/또는 감소된 T-세포 내성을 포함한다. T-세포 기능의 향상을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
"증식"은 본원에서 세포의 증식을 지칭하기 위해 사용된다. 증가된 증식은 기준선 값에 비해 더 많은 수의 세포의 생산을 포함한다. 감소된 증식은 기준선 값에 비해 감소된 수의 세포의 생산을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 T-세포와 같은 면역 세포이고, 증가된 증식이 목적시된다. 일부 구현예에서, 세포는 암 세포이고, 감소된 증식이 목적시된다.
본원에서 사용되는 "알킬"은 포화된 선형(즉, 비분지된) 또는 분지된 1가 탄화수소 쇄 또는 이들의 조합을 지칭한다. 특정 알킬 그룹은 지정된 수의 탄소 원자를 갖는 것들, 예를 들어, 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹("C1-C20 알킬"), 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹("C1-C10" 알킬), 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹("C1-C8 알킬"), 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹("C1-C6 알킬"), 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹("C2-C6 알킬"), 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹("C1-C4 알킬")이다. 알킬 그룹의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등의 동족체 및 이성체와 같은 그룹을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "알케닐"은 올레핀 불포화의 적어도 하나의 부위를 갖는(즉, 화학식 C=C의 적어도 하나의 모이어티를 갖는) 불포화된 선형(즉, 비분지된) 또는 분지된 1가 탄화수소 쇄 또는 이들의 조합을 지칭한다. 특정 알케닐 그룹은 지정된 수의 탄소 원자를 갖는 것들, 예를 들어, 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 그룹("C2-C20 알케닐"), 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 그룹("C2-C10 알케닐"), 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 그룹("C2-C8 알케닐"), 2 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 그룹("C2-C6 알케닐") 또는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알케닐("C2-C4 알케닐")이다. 알케닐 그룹은 "시스" 또는 "트랜스" 배열, 또는 대안적으로 "E" 또는 "Z" 배열일 수 있다. 알케닐 그룹의 예는 에테닐(또는 비닐), 프로프-1-에닐, 프로프-2-에닐(또는 알릴), 2-메틸프로프-1-에닐, 부트-1-에닐, 부트-2-에닐, 부트-3-에닐, 부타-1,3-디에닐, 2-메틸부타-1,3-디에닐, 이들의 동족체 및 이성체 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "알키닐"은 아세틸렌 불포화의 적어도 하나의 부위를 갖는(즉, 화학식 C≡C의 적어도 하나의 모이어티를 갖는) 불포화된 선형(즉, 비분지된) 또는 분지형 1가 탄화수소 쇄 또는 이들의 조합을 지칭한다. 특정 알키닐 그룹은 지정된 수의 탄소 원자를 갖는 것들, 예를 들어, 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 알키닐 그룹("C2-C20 알키닐"), 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알키닐 그룹("C2-C10 알키닐"), 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알키닐 그룹("C2-C8 알키닐"), 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알키닐 그룹("C2-C6 알키닐"), 또는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알키닐 그룹("C2-C4 알키닐")이다. 알키닐 그룹의 예는 에티닐(또는 아세틸레닐), 프로프-1-이닐, 프로프-2-이닐 (또는 프로파르길), 부트-1-이닐, 부트-2-이닐, 부트-3-이닐, 이들의 동족체 및 이성체 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "알킬렌"은 알킬과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2가성을 갖는다. 특정 알킬렌 그룹은 1 내지 6개의 탄소 원자("C1-C6 알킬렌"), 1 내지 5개의 탄소 원자("C1-C5 알킬렌"), 1 내지 4개의 탄소 원자("C1-C4 알킬렌") 또는 1 내지 3개의 탄소 원자("C1-C3 알킬렌")를 갖는 것들이다. 알킬렌 그룹의 예는 메틸렌(-CH2-), 에틸렌(-CH2CH2-), 프로필렌(-CH2CH2CH2-), 부틸렌(-CH2CH2CH2CH2-) 등의 그룹을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "사이클로알킬"은 비방향족, 포화 또는 불포화된, 사이클릭 1가 탄화수소 구조를 지칭한다. 특정 사이클로알킬 그룹은 지정된 수의 고리형(즉, 환) 탄소 원자를 갖는 것들, 예를 들어, 3 내지 12개의 고리형 탄소 원자를 갖는 사이클로알킬 그룹("C3-C12 사이클로알킬")이다. 특정 사이클로알킬은 3 내지 8개의 고리형 탄소 원자를 갖는 사이클릭 탄화수소("C3-C8 사이클로알킬") 또는 3 내지 6개의 고리형 탄소 원자를 갖는 사이클릭 탄화수소("C3-C6 사이클로알킬")이다. 사이클로알킬은 사이클로헥실과 같은 하나의 환 또는 아다만틸과 같은 다수의 환으로 구성될 수 있지만, 아릴(즉, 방향족) 그룹은 제외된다. 하나 이상의 환을 포함하는 사이클로알킬은 융합, 스피로, 또는 브릿징될 수 있거나 이들의 조합일 수 있다. 사이클로알킬 그룹의 예는 사이클로프로필
Figure pct00032
, 사이클로부틸
Figure pct00033
, 사이클로펜틸
Figure pct00034
, 사이클로헥실
Figure pct00035
, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐, 사이클로헵틸
Figure pct00036
, 노르보르닐 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "사이클로알킬렌"은 사이클로알킬과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2가성을 갖는다. 특정 사이클로알킬렌 그룹은 3 내지 12개의 고리형 탄소 원자("C3-C12 사이클로알킬렌"), 3 내지 8개의 고리형 탄소 원자("C3-C8 사이클로알킬렌"), 또는 3 내지 6개의 고리형 탄소 원자("C3-C6 사이클로 알킬렌")를 갖는 것들이다. 사이클로알킬렌 그룹의 예로는 사이클로프로필렌
Figure pct00037
, 사이클로부틸렌
Figure pct00038
, 사이클로펜틸렌
Figure pct00039
, 사이클로헥실렌
Figure pct00040
, 1,2-사이클로헥세닐렌, 1,3-사이클로헥세닐렌, 1,4-사이클로헥세닐렌, 사이클로헵틸렌
Figure pct00041
, 노르보르닐렌 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "아릴"은 단일 환(예: 페닐) 또는 하나 이상의 축합 환이 방향족이 아닐 수 있는 다수의 축합 환(예: 나프틸 또는 안트릴)을 갖는 방향족 카보사이클릭 그룹을 지칭한다. 특정 아릴 그룹은 6 내지 14개의 고리형(즉, 환) 탄소 원자를 갖는 것들("C6-C14 아릴")이다. 적어도 하나의 환이 비방향족인 하나 이상의 환을 갖는 아릴 그룹은 방향족 환 위치 또는 비방향족 환 위치에서 모 구조에 연결될 수 있다. 하나의 변형에서, 적어도 하나의 환이 비방향족인 하나 이상의 환을 갖는 아릴 그룹은 방향족 환 위치에서 모 구조에 연결된다. 아릴의 예는 페닐, 나프틸, 1-나프틸, 2-나프틸, 1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-6-일
Figure pct00042
등과 같은 그룹을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"카보사이클릴" 또는 "카보사이클릭"은 모든 환 구성원이 탄소 원자인 방향족 또는 비방향족 1가 사이클릭 그룹, 예를 들어, 사이클로헥실, 페닐, 1,2-디하이드로나프틸 등을 지칭한다.
본원에서 사용되는 "아릴렌"은 아릴과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2가성을 갖는다. 특정 아릴렌 그룹은 6 내지 14개의 고리형 탄소 원자를 갖는 것들("C6-C14 아릴렌")이다. 아릴렌의 예로는 페닐렌, o-페닐렌(즉, 1,2-페닐렌), m-페닐렌(즉, 1,3-페닐렌), p-페닐렌(즉, 1,4-페닐렌), 나프틸렌, 1,2-나프틸렌, 1,3-나프틸렌, 1,4-나프틸렌, 2,7-나프틸렌, 2,6-나프틸렌 등과 같은 그룹을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "헤테로아릴"은 1 내지 14개의 고리형 탄소 원자 및 질소(N), 산소(O), 및 황(S)과 같은 헤테로원자를 함유하지만 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 고리형 헤테로원자를 갖는 불포화된 방향족 사이클릭 그룹을 지칭한다. 헤테로아릴 그룹은 단일 환(예: 피리딜 또는 이미다졸릴) 또는 적어도 하나의 축합 환이 방향족인 다수의 축합 환(예: 인돌리지닐, 인돌릴, 또는 퀴놀리닐)을 가질 수 있다. 특정 헤테로아릴 그룹은 1 내지 12개의 고리형 탄소 원자 및 질소(N), 산소(O) 및 황(S)으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 6개의 고리형 헤테로원자를 갖는 5원 내지 14원 환("5원 내지 14원 헤테로아릴"); 1 내지 8개의 고리형 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 고리형 헤테로원자를 갖는 5원 내지 10원 환("5원 내지 10원 헤테로아릴"); 또는 1 내지 5개의 고리형 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 고리형 헤테로원자를 갖는 5원, 6원 또는 7원 환("5원 내지 7원 헤테로아릴")이다. 하나의 변형에서, 헤테로아릴은 1 내지 6개의 고리형 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 고리형 헤테로원자를 갖는 모노사이클릭 방향족 5원, 6원 또는 7원 환을 포함한다. 또 다른 변형에서, 헤테로아릴은 1 내지 12개의 고리형 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 6개의 고리형 헤테로원자를 갖는 폴리사이클릭 방향족 환을 포함한다. 적어도 하나의 환이 비방향족인 하나 이상의 환을 갖는 헤테로아릴 그룹은 방향족 환 위치 또는 비방향족 환 위치에서 모 구조에 연결될 수 있다. 헤테로아릴의 예는 피리딜, 벤즈이미다졸릴, 벤조트리아졸릴, 벤조[b]티에닐, 퀴놀리닐, 인돌릴, 벤조티아졸릴 등과 같은 그룹을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. "헤테로아릴"은 또한 방향족 호변이성체 구조
Figure pct00043
(1H-1,2,4-트리아졸-5-올-1-일)를 갖는
Figure pct00044
(2,4-디하이드로-3H-1,2,4-트리아졸-3-온-2-일)과 같은 모이어티를 포함한다.
본원에서 사용되는 "헤테로사이클릴" 및 "헤테로사이클릭 그룹"은 지정된 원자 및 헤테로원자의 수를 갖거나, 또는 원자 또는 헤테로원자의 수가 지정되지 않은 경우, 적어도 3개의 고리형 원자, 1 내지 14개의 고리형 탄소 원자, 및 질소, 산소, 및 황과 같은 헤테로원자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 고리형 헤테로원자를 갖는 비방향족 포화된 또는 부분적으로 불포화된 사이클릭 그룹을 지칭한다. 헤테로사이클릭 그룹은 단일 환(예: 테트라하이드로티오페닐, 옥사졸리디닐) 또는 복수의 축합 환(예: 데카하이드로퀴놀리닐, 옥타하이드로벤조[d]옥사졸릴)을 가질 수 있다. 복수의 축합 환은 바이사이클릭, 트리사이클릭 및 쿼드라사이클릭 환, 및 브릿징된 또는 스피로사이클릭 환 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 헤테로사이클릭 그룹의 예는 아지리디닐, 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 옥사졸리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 디옥사닐, 3,6-디하이드로-2H-피라닐, 2,3-디하이드로-1H-이미다졸릴 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "헤테로아릴렌"은 헤테로아릴과 동일한 잔기를 지칭하지만, 2가성을 갖는다. 특정 헤테로아릴렌 그룹은 1 내지 12개의 고리형 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 6개의 고리형 헤테로원자를 갖는 5원 내지 14원 환("5원 내지 14원 헤테로아릴렌"); 1 내지 8개의 고리형 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 고리형 헤테로원자를 갖는 5원 내지 10원 환("5원 내지 10원 헤테로아릴렌"); 또는 1 내지 5개의 고리형 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 고리형 헤테로원자를 갖는 5원, 6원 또는 7원 환("5원 내지 7원 헤테로아릴렌")이다. 헤테로아릴렌의 예는 피리딜렌, 벤즈이미다졸릴렌, 벤조트리아졸릴렌, 벤조[b]티에닐렌, 퀴놀리닐렌, 인돌릴렌, 벤조티아졸릴렌 등과 같은 그룹을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"할로" 또는 "할로겐"은 원자 번호 9 내지 85를 갖는 17족 계열의 원소를 지칭한다. 할로 그룹은 플루오로(F), 클로로(Cl), 브로모(Br) 및 요오도(I)를 포함한다.
"할로알킬", "할로알킬렌", "할로아릴", "할로아릴렌", "할로헤테로아릴", 및 유사한 용어는 적어도 하나의 할로 그룹으로 치환된 모이어티를 지칭한다. 할로알킬 모이어티 또는 다른 할로 치환된 모이어티가 하나 이상의 할로겐으로 치환된 경우, 이는 부착된 할로겐 모이어티의 수에 상응하는 접두사를 사용함으로써 참조될 수 있다. 예를 들어, 디할로아릴, 디할로알킬, 트리할로아릴, 트리할로알킬 등은 반드는 아니지만 동일한 할로일 수 있는 2개("디") 또는 3개("트리")의 할로 그룹으로 치환된 아릴 및 알킬을 지칭하며, 따라서, 예를 들어, 할로아릴 그룹 4-클로로-3-플루오로페닐은 디할로아릴의 범위 내에 있다. 알킬 그룹의 각 수소(H)가 할로 그룹으로 치환된 할로알킬 그룹의 서브세트는 "퍼할로알킬"로서 지칭된다. 특정 퍼할로알킬 그룹은 트리플루오로알킬(-CF3)이다. 유사하게, "퍼할로알콕시"는 할로겐이 알콕시 그룹의 알킬 모이어티를 구성하는 탄화수소에서 각 수소(H)의 위치를 차지하는 알콕시 그룹을 지칭한다. 퍼할로알콕시 그룹의 예는 트리플루오로메톡시(-OCF3)이다. "할로알킬"은 모노할로알킬, 디할로알킬, 트리할로알킬, 퍼할로알킬, 및 알킬 그룹에서 가능한 임의의 다른 수의 할로 치환체를 포함하고, 할로알킬렌, 할로아릴, 할로아릴렌, 할로헤테로아릴 등과 같은 다른 그룹에 대해서도 유사하다.
"아미노"는 그룹 -NH2를 지칭한다.
"옥소"는 그룹 =O, 즉 탄소 또는 다른 화학 원소에 이중으로 결합된 산소 원자를 지칭한다.
"임의로 치환된"은 달리 명시되지 않는 한, 그룹이 비치환되거나, 또는 그 그룹에 대해 나열된 하나 이상(예: 1, 2, 3, 4, 또는 5개)의 치환체에 의해 치환됨을 의미하며, 여기서 치환체는 동일하거나 상이할 수 있다. 하나의 구현예에서, 임의로 치환된 그룹은 비치환된다. 하나의 구현예에서, 임의로 치환된 그룹은 하나의 치환체를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 임의로 치환된 그룹은 2개의 치환체를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 임의로 치환된 그룹은 3개의 치환체를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 임의로 치환된 그룹은 4개의 치환체를 갖는다. 일부 구현예에서, 임의로 치환된 그룹은 1 내지 2개, 1 내지 3개, 1 내지 4개, 또는 1 내지 5개의 치환체를 갖는다. 복수의 치환체가 존재하는 경우, 다르게 명시되지 않는 한, 각 치환체는 독립적으로 선택된다. 예를 들어, 그룹 -N(C1-C4 알킬)(C1-C4 알킬) 상의 각 (C1-C4 알킬) 치환체는 -N(CH3)(CH2CH3) 등과 같은 그룹을 생성하기 위해 서로 독립적으로 선택될 수 있다.
본원의 개시내용 이외에, 용어 "치환된"은 특정 그룹 또는 라디칼을 변형시키기 위해 사용되는 경우, 특정 그룹 또는 라디칼의 하나 이상의 수소 원자(H)가 각각 서로 독립적으로 본원에 정의된 바와 같은 동일하거나 상이한 치환체 그룹으로 대체된다는 것을 또한 의미할 수 있다. 일부 구현예에서, 치환되는 그룹은 1, 2, 3, 또는 4개의 치환체, 1, 2, 또는 3개의 치환체, 1 또는 2개의 치환체, 또는 1개의 치환체를 갖는다.
치환체는 달리 명시되지 않는 한, 지정된 그룹 또는 라디칼 상의 임의의 화학적으로 가능한 위치에 부착될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, -C1-C8 알킬-OH는, 예를 들어, -CH2CH2OH, -CH(OH)-CH3, -CH2C(OH)(CH3)2 등을 포함한다. 추가의 예로서, 하나의 구현예에서, -C1-C6 알킬-OH는, 예를 들어, -CH2CH2OH, -CH(OH)-CH3, -CH2C(OH)(CH3)2 등을 포함한다. 추가의 예로서, 하나의 구현예에서, -C1-C6 알킬-CN은, 예를 들어, -CH2CH2CN, -CH(CN)-CH3, -CH2C(CN)(CH3)2 등을 포함한다.
원소의 특정 동위원소가 화학식으로 지시되지 않는 한, 본 개시내용은, 예를 들어, 화합물의 중수소화 유도체(여기서, H는 2H, 즉 중수소(D)일 수 있다)와 같은 본원에서 개시된 화합물의 모든 동위원소를 포함한다. 중수소화 화합물은 약동학적(ADME) 특성에 바람직한 변화를 제공할 수 있다. 동위원소는 구조 내의 임의의 또는 모든 위치에서 동위원소 치환을 가질 수 있거나 구조 내의 임의의 또는 모든 위치에서 천연 풍부함으로 존재하는 원자를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 "소분자"는 분자량이 1,000 달톤 이하인 화합물을 지칭한다.
수소 원자는 불소와 같은 밀접한 생체 등가체로 대체될 수도 있고, 단, 이러한 교체는 안정한 화합물을 초래한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 화합물의 임의의 거울상이성체 또는 부분입체이성체 형태, 및 시스/트랜스 또는 E/Z 이성체를 포함하는 임의의 또는 모든 입체화학적 형태를 포함한다. 입체화학이 화학 구조 또는 명칭으로 명시적으로 표시되지 않는 한, 구조 또는 명칭은 도시된 화합물의 모든 가능한 입체이성체를 포함하도록 의도된다. 또한, 특정 입체화학적 형태가 도시되어 있는 경우, 모든 다른 입체화학적 형태뿐만 아니라 개시된 화합물의 둘 이상의 입체화학적 형태의 임의의 비율의 혼합물을 포함하여 개시된 화합물의 일반적인 비-입체특이적 형태 및 임의의 비율의 혼합물이 또한 화합물의 라세미, 비-라세미, 에난티오농축, 및 스칼레믹 혼합물이 포함되도록 본 개시내용에 의해 기재되고 포함되는 것으로 이해된다. 이의 특정 입체화학적 형태를 포함하여 실질적으로 순수한 화합물의 조성물과 같은 개시된 화합물을 포함하는 조성물이 또한 의도된다. 화합물의 라세미, 비-라세미, 에난티오농축, 및 스칼레믹 혼합물이 본 개시내용에 의해 포함되도록 임의의 비율로 개시된 화합물의 둘 이상의 입체화학적 형태의 혼합물을 포함하는 조성물을 포함하여 개시된 화합물의 임의의 비율의 혼합물을 포함하는 조성물도 또한 본 개시내용에 포함된다, 입체화학이 분자의 다른 부분 또는 부분들에 대해서가 아니라 분자의 한 부분 또는 부분들에 대해 명시적으로 표시되는 경우, 구조는 입체화학이 명시적으로 표시되지 않은 부분 또는 부분들에 대해 가능한 모든 입체이성체를 포함하는 것으로 의도된다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 화합물의 임의의 및 모든 호변이성체 형태를 포함한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 화합물의 모든 염 및 화합물의 이러한 염을 사용하는 방법을 포함하는 것으로 의도된다. 하나의 구현예에서, 화합물의 염은 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 약물 또는 약제로서 인간 및/또는 동물에게 투여될 수 있고, 투여시 유리 화합물(즉, 중성 화합물 또는 비염 화합물)의 생물학적 활성의 적어도 일부를 보유하는 염이다. 염기성 화합물의 목적하는 염은 화합물을 산으로 처리함으로써 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 무기산의 예는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산 및 인산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 유기산의 예는 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 석신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 설폰산, 및 살리실산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 염기성 화합물과 아미노산의 염, 예를 들어, 아스파르테이트 염 및 글루타메이트 염도 또한 제조될 수 있다. 산성 화합물의 목적하는 염은 화합물을 염기로 처리함으로써 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 산 화합물의 무기 염의 예는 알칼리 금속 및 알칼리 토금속 염, 예를 들어, 나트륨 염, 칼륨 염, 마그네슘 염 및 칼슘 염; 암모늄 염; 및 알루미늄 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 산 화합물의 유기 염의 예는 프로카인, 디벤질아민, N-에틸피페리딘, N,N'-디벤질에틸렌디아민 및 트리에틸아민 염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 산성 화합물과 아미노산의 염, 예를 들어, 리신 염도 또한 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염의 목록의 경우, 예를 들어, 문헌[P. H. Stahl and C. G. Wermuth (eds.) "Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection and Use" Wiley-VCH, 2011 (ISBN: 978-3-90639-051-2)]을 참조한다. 몇몇 약제학적으로 허용되는 염은 또한 문헌[참조: Berge, J. Pharm. Sci. 66:1 (1977)]에 개시되어 있다.
생물학적 실시예 1, 8 및/또는 12에 기재된 바와 같이, Cbl-b 억제의 IC50 값을 측정하는데 사용되는 Cbl-b 활성 검정(Cbl-b 억제 검정)은 N-말단 비오티닐화된 Avi-태그된 Cbl-b를 포함하는 혼합물, BODIPY FL로 태그된 형광 표지된 억제제 프로브(실시예 54) 및 검정 완충액을 사용한다. 하나의 구현예에서, Cbl-b의 억제에 대해 IC50을 측정하는데 사용되는 Cbl-b 활성 검정(Cbl-b 억제 검정)은 0.5nM Cbl-b("높은" 최종 농도)와 함께 생물학적 실시예 1, 8 및/또는 12에 기재된 조건을 사용한다. 또 다른 구현예에서, Cbl-b의 억제에 대해 IC50을 측정하는데 사용되는 Cbl-b 활성 검정(Cbl-b 억제 검정)은 0.125nM Cbl-b("낮은" 최종 농도)와 함께 생물학적 실시예 1, 8 및/또는 12에 기재된 조건을 사용한다.
명확성을 위해, 별도의 구현예의 맥락에서 기재되는 본원에 개시된 특정 특징들이 또한 단일 구현예로 조합하여 제공될 수 있음을 이해할 것이다. 반대로, 간략화를 위해, 단일 구현예의 맥락에서 기재되는 본원에 개시된 다양한 특징들이 또한 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위조합으로 제공될 수 있다. 변수에 의해 표현되는 화학 그룹에 관련된 구현예의 모든 조합은 본 개시내용에 구체적으로 포함되며, 각각 및 모든 조합이 이러한 조합이 안정한 화합물(즉, 생물학적 활성을 위해 단리, 특성화 및 시험될 수 있는 화합물)인 화합물을 포함하는 정도로 개별적이고 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시되어 있다. 또한, 이러한 변수를 기재하는 구현예에 열거된 화학 그룹의 모든 하위조합은 또한 본 개시내용에 구체적으로 포함되며, 화학 그룹의 이러한 하위조합 각각 및 모두가 본원에서 개별적이고 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
본원에서 "포함하는"으로서 기재된 측면 및 구현예는 구현예"로 이루어진" 및 구현예"로 본질적으로 이루어지는"을 포함하는 것으로 이해된다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 경우, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 달리 지시되지 않거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, "하나의" 부형제는 하나 이상의 부형제를 포함한다.
"약"의 값에 대한 언급은 그 값의 90% 내지 110%를 포함한다. 예를 들어, 약 500억 개의 세포는 450억 내지 550억 개의 세포를 지칭하며, 500억 개의 세포를 포함한다. 예를 들어, "약 100도"의 온도는 약 90도 내지 약 110도의 온도를 지칭한다.
화합물의 수치 범위가 제공되는 경우, 명시적으로 제외되지 않는 한, "a" 및 "b"로 지정된 수치 범위 내의 모든 화합물이 포함된다. 예를 들어, 화합물 9-13에 대한 언급은 화합물 9, 10, 11, 12 및 13을 지칭한다.
II. 화합물
한 측면에서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 호변이성체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 제공된다:
화학식 I
Figure pct00045
상기 화학식 I에서,
Figure pct00046
는
Figure pct00047
또는
Figure pct00048
이고;
Z1은 CH 또는 N이고;
Z2는 CH 또는 N이고;
R1은 -CF3 또는 사이클로프로필이고;
R2는 -CF3 또는 사이클로프로필이고;
R3은 H, C1-C2 알킬, 또는 C1-C2 할로알킬이고;
R4는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 4원 내지 8원 헤테로사이클릴, 또는 C3-C6 사이클로알킬이고, 여기서 상기 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬 그룹은 임의로 1 내지 5개의 R6 그룹으로 치환되고; 또는
R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께, 각각 임의로 1 내지 5개의 R6 그룹으로 치환되는 C3-C5 사이클로알킬 또는 4원 내지 6원 헤테로사이클릴을 형성하고;
R5는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이고;
각각의 R6은 독립적으로 C1-C6 알킬, 할로, 하이드록시, -O(C1-C6 알킬), -CN, C1-C6 알킬-CN, C1-C6 알킬-OH, 또는 C1-C6 할로알킬이고; 또는
동일한 탄소 원자에 부착된 2개의 R6 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 C3-C6 사이클로알킬 또는 스피로 4원 내지 6원 헤테로사이클릴을 형성하고;
X는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알킬-OH, C1-C6 알킬-CN, 1-5개의 R8 그룹으로 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬, 또는
Figure pct00049
이고;
Figure pct00050
는 4원 내지 7원 헤테로사이클릴 또는 5원 내지 8원 헤테로아릴이고, 이 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴은 각각 N, O 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 내지 2개의 추가 헤테로원자를 임의로 함유하고, 이 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴은 각각 임의로 1 내지 5개의 R8 그룹으로 치환되고;
각각의 R7은 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-OH, 또는 C1-C6 할로알킬이고; 또는
2개의 R7 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 C3-C5 사이클로알킬 또는 3원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성하고;
각각의 R8은 독립적으로 할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-CN, C1-C6 알킬-OH, C1-C6 할로알킬, -CN, 옥소, 또는 -O(C1-C6 알킬)이고; 또는
2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 또는 융합된 C3-C5 사이클로알킬 또는 3원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성한다.
일부 구현예에서,
Figure pct00051
(즉, 환 A 모이어티)는
Figure pct00052
이다. 일부 구현예에서, Z1은 CH이다. 다른 구현예에서, Z1은 N이다. 일부 구현예에서, R1은 -CF3이다. 다른 구현예에서, R1은 사이클로프로필이다. 일부 구현예에서, 환 A 모이어티는
Figure pct00053
이다. 일부 구현예에서, Z2는 CH이다. 다른 구현예에서, Z2는 N이다. 일부 구현예에서, R2는 -CF3이다. 일부 구현예에서, R2는 사이클로프로필이다. 일부 구현예에서, 환 A 모이어티는
Figure pct00054
로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 환 A 모이어티는
Figure pct00055
이다. 일부 구현예에서, 환 A 모이어티는
Figure pct00056
이다. 일부 구현예에서, 환 A 모이어티는
Figure pct00057
이다. 일부 구현예에서, 환 A 모이어티는
Figure pct00058
이다. 일부 구현예에서, 환 A 모이어티는
Figure pct00059
이다. 일부 구현예에서, 환 A 모이어티는
Figure pct00060
이다. 일부 구현예에서, 환 A 모이어티는
Figure pct00061
이다. 일부 구현예에서, 환 A 모이어티는
Figure pct00062
이다.
일부 구현예에서, R3은 H, C1-C2 알킬, 또는 C1-C2 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R3은 H, -CH3, 또는 -CF3이다.
일부 구현예에서, R3은 H이다.
일부 구현예에서, R3은 C1-C2 알킬이다. 일부 구현예에서, R3은 메틸이다. 일부 구현예에서, R3은 에틸이다.
일부 구현예에서, R3은 C1-C2 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R3은 1 내지 5개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C2 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R3은 1 내지 3개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C2 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R3은 C1 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R3은 C2 할로알킬이다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로, 브로모 및 플루오로 원자로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로 및 플루오로 원자로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 모두 플루오로 원자이다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로 원자와 플루오로 원자의 조합이다. 일부 구현예에서, R3은 -CF3, -CCl3, -CF2Cl, -CFCl2, -CHF2, -CH2F, -CHCl2, -CH2Cl, 또는 -CHFC1이다. 일부 구현예에서, R3은 -CF3이다.
일부 구현예에서, R4는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 4원 내지 8원 헤테로사이클릴, 또는 C3-C6 사이클로알킬이고, 여기서 상기 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬 그룹은 임의로 1 내지 5개의 R6 그룹으로 치환된다. 일부 구현예에서, R4는 H, C1-C3 알킬, C1-C3 할로알킬, 4원 내지 6원 헤테로사이클릴, 또는 C4-C5 사이클로알킬이고, 여기서 상기 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬 그룹은 임의로 1 내지 3개의 R6 그룹으로 치환된다. 일부 구현예에서, R4는 H, -CH3, -CF3, 사이클로부틸, 또는
Figure pct00063
이다.
일부 구현예에서, R4는 H이다.
일부 구현예에서, R4는 C1-C6 알킬이다. 일부 구현예에서, R4는 C1-C3 알킬이다. 일부 구현예에서, R4는 메틸, 에틸, n-프로필, 또는 이소프로필이다. 일부 구현예에서, R4는 -CH3이다.
일부 구현예에서, R4는 C1-C6 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R4는 1 내지 7개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C6 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R4는 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R4는 1 내지 7개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R4는 1 내지 5개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C2 할로알킬이다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로, 브로모 및 플루오로 원자로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로 원자 및 플루오로 원자로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 모두 플루오로 원자이다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로 원자와 플루오로 원자의 조합이다. 일부 구현예에서, R4는 -CF3, -CCl3, -CF2Cl, -CFCl2, -CHF2, -CH2F, -CHCl2, -CH2F, 또는 -CHFC1이다. 일부 구현예에서, R4는 -CF3이다.
일부 구현예에서, R4는 1 내지 5개의 R6 그룹에 의해 임의로 치환된 4원 내지 8원 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, R4는 1 내지 3개의 R6 그룹에 의해 임의로 치환된 4원 내지 6원 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, R4는 1 내지 2개의 R6 그룹에 의해 임의로 치환된 4원 헤테로사이클릴이다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 5개의 R6 그룹으로 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 4개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 3개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 2개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 비치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 2개의 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 산소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 2개의 산소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 산소 원자 및 하나의 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 황 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 질소 원자 및 하나의 황 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, R4는 옥세타닐, 아제티디닐, 테트라하이드로푸라닐, 디옥솔라닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 피페리디닐, 이속사졸리디닐, 또는 테트라하이드로피라닐이고, 이들 각각은 임의로 1 내지 5개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, R4는 다음과 같다:
Figure pct00064
일부 구현예에서, R4는
Figure pct00065
이다.
일부 구현예에서, R4는 1 내지 5개의 R6 그룹에 의해 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, R4는 1 내지 3개의 R6 그룹에 의해 임의로 치환된 C4-C5 사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 5개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 4개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 3개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 2개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 하나의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 비치환된다. 일부 구현예에서, R4는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 또는 사이클로헥실이고, 이들 각각은 임의로 1 내지 5개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, R4는 사이클로프로필 또는 사이클로부틸이다. 일부 구현예에서, R4는 사이클로부틸이다.
일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 C3-C5 사이클로알킬 또는 4원 내지 6원 헤테로사이클릴을 형성하며, 이들 각각은 임의로 1 내지 5개의 R6 그룹으로 치환된다. 일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 C4-C5 사이클로알킬 또는 4원 내지 6원 헤테로사이클릴을 형성하며, 이들 각각은 임의로 1 내지 3개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께
Figure pct00066
,
Figure pct00067
또는
Figure pct00068
을 형성하고, 이들 각각은 임의로 1 내지 3개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께, 메틸인 1개의 R6 그룹으로 치환되어
Figure pct00069
를 형성한다.
일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 1 내지 5개의 R6 그룹에 의해 임의로 치환된 C3 내지 C5 사이클로알킬을 형성한다. 일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 1 내지 3개의 R6 그룹에 의해 임의로 치환된 C4-C5 사이클로알킬을 형성한다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 5개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 4개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 3개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 2개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 하나의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 비치환된다. 일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께
Figure pct00070
또는
Figure pct00071
을 형성하고, 이들 각각은 임의로 1 내지 3개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께, 메틸인 1개의 R6 그룹에 의해 치환되어
Figure pct00072
을 형성한다. 일부 구현예에서,
Figure pct00073
의 메틸 그룹이 부착된 탄소 원자에서의 절대 입체화학은 (R)-이다(칸- 잉골드-프리로그 규칙(Cahn-Ingold-Prelog rules)을 사용). 일부 구현예에서,
Figure pct00074
의 메틸 그룹이 부착된 탄소 원자에서의 절대 입체화학은 (S)-이다.
일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 1 내지 5개의 R6 그룹에 의해 임의로 치환된 4원 내지 6원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 1 내지 3개의 R6 그룹에 의해 임의로 치환된 4원 내지 6원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 5개의 R6 그룹으로 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 4개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 3개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 2개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 비치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 2개의 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 산소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 2개의 산소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 산소 원자 및 하나의 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 황 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 질소 원자 및 하나의 황 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, R4는 옥세타닐, 아제티디닐, 테트라하이드로푸라닐, 디옥솔라닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 피페리디닐, 이속사졸리디닐, 또는 테트라하이드로피라닐이고, 이들 각각은 임의로 1 내지 5개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께
Figure pct00075
또는
Figure pct00076
를 형성하고, 이들 각각은 임의로 1 내지 3개의 R6 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께
Figure pct00077
를 형성한다. 일부 구현예에서, R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께
Figure pct00078
를 형성한다.
일부 구현예에서, 각각의 R6은 독립적으로 C1-C6 알킬, 할로, 하이드록시, -O-(C1-C6 알킬), -CN, C1-C6 알킬-CN, C1-C6 알킬-OH, 또는 C1-C6 할로알킬이다. 일부 구현예에서, 각각의 R6은 독립적으로 C1-C3 알킬, 할로, 하이드록시, -O-(C1-C3 알킬), -CN, C1-C3 알킬-CN, C1-C3 알킬-OH, 또는 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, 각각의 R6은 독립적으로 -CH3, 플루오로(F), 하이드록시, -OCH3, -CN, -CH2CN, -CH2OH, 또는 -CF3이다.
일부 구현예에서, R6은 C1-C6 알킬이다. 일부 구현예에서, R6은 C1-C3 알킬이다. 일부 구현예에서, R6은 메틸, 에틸, n-프로필, 또는 이소프로필이다. 일부 구현예에서, R6은 -CH3이다.
일부 구현예에서, R6은 할로이다. 일부 구현예에서, R6은 클로로, 플루오로, 또는 브로모이다. 일부 구현예에서, R6은 클로로 또는 플루오로이다. 일부 구현예에서, R7은 플루오로이다.
일부 구현예에서, R6은 하이드록실이다.
일부 구현예에서, R6은 -O(C1-C6 알킬)이다. 일부 구현예에서, R6은 -O-(C1-C3 알킬)이다. 일부 구현예에서, R6은 -O(메틸), -O(에틸), -O(n-프로필), 또는 -O(이소프로필)이다. 일부 구현예에서, R6은 -OCH3 또는 -OCH2CH3이다. 일부 구현예에서, R6은 -OCH3이다.
일부 구현예에서, R6은 -CN이다. 일부 구현예에서, R6은 C1-C6 알킬-CN이다. 일부 구현예에서, R6은 C1-C3 알킬-CN이다. 일부 구현예에서, R6은 -CH2CN, -CH2CH2-CN, -CH2CH2CH2-CN, 또는 -C(CH3)2-CN이다. 일부 구현예에서, R6은 -CH2CN이다.
일부 구현예에서, R6은 C1-C6 알킬-OH이다. 일부 구현예에서, R6은 C1-C3 알킬-OH이다. 일부 구현예에서, R6은 -CH2OH, -CH2CH2-OH, -CH2CH2CH2-OH, 또는 -C(CH3)2-OH이다. 일부 구현예에서, R6은 -CH2OH이다.
일부 구현예에서, R6은 C1-C6 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R6은 1 내지 7개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C6 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R6은 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R6은 1 내지 7개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R6은 1 내지 5개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로, 브로모 및 플루오로 원자로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로 원자 및 플루오로 원자로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 모두 플루오로 원자이다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로 원자와 플루오로 원자의 조합이다. 일부 구현예에서, R6은 -CF3, -CCl3, -CF2Cl, -CFCl2, -CHF2, -CH2F, -CHCl2, -CH2Cl, 또는 -CHFC1이다. 일부 구현예에서, R6은 -CF3이다.
일부 구현예에서, 동일한 탄소 원자에 부착된 2개의 R6 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 C3-C6 사이클로알킬 또는 스피로 4원 내지 6원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 구현예에서, 동일한 탄소 원자에 부착된 2개의 R6 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 C3-C6 사이클로알킬 또는 스피로 4원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성한다.
일부 구현예에서, 동일한 탄소 원자에 부착된 2개의 R6 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 C3-C6 사이클로알킬을 형성한다. 일부 구현예에서, 동일한 탄소 원자에 부착된 2개의 R6 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 C3-C5 사이클로알킬을 형성한다. 일부 구현예에서, 동일한 탄소 원자에 부착된 2개의 R6 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 C3-C4 사이클로알킬을 형성한다. 일부 구현예에서, 동일한 탄소 원자에 부착된 2개의 R6 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 사이클로프로필, 사이클로부틸, 또는 사이클로펜틸을 형성한다. 일부 구현예에서, 동일한 탄소 원자에 부착된 2개의 R6 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 사이클로프로필을 형성한다.
일부 구현예에서, 동일한 탄소 원자에 부착된 2개의 R6 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 4원 내지 6원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 구현예에서, 동일한 탄소 원자에 부착된 2개의 R6 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 4원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 2개의 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 산소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 2개의 산소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 산소 원자 및 하나의 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 황 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 질소 원자 및 하나의 황 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 동일한 탄소 원자에 부착된 2개의 R6 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 옥세타닐, 아제티디닐, 테트라하이드로푸라닐, 디옥솔라닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 피페리디닐, 이속사졸리디닐 또는 테트라하이드로피라닐을 형성한다.
일부 구현예에서, R5는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, R5는 H, C1-C3 알킬, C1-C3 할로알킬, 또는 C3-C4 사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, R5는 H, -CH3, -CHF2, 또는 사이클로프로필이다.
일부 구현예에서, R5는 H이다.
일부 구현예에서, R5는 C1-C6 알킬이다. 일부 구현예에서, R5는 C1-C3 알킬이다. 일부 구현예에서, R5는 메틸, 에틸, n-프로필, 또는 이소프로필이다. 일부 구현예에서, R5는 -CH3이다.
일부 구현예에서, R5는 C1-C6 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R5는 1 내지 7개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C6 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R5는 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R5는 1 내지 7개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R5는 1 내지 5개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로, 브로모 및 플루오로 원자로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로 원자 및 플루오로 원자로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 모두 플루오로 원자이다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로 원자와 플루오로 원자의 조합이다. 일부 구현예에서, R5는 -CF3, -CCl3, -CF2Cl, -CFCl2, -CHF2, -CH2F, -CHCl2, -CH2Cl, 또는 -CHFC1이다. 일부 구현예에서, R5는 -CHF2이다.
일부 구현예에서, R5는 C3-C6 사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, R5는 C3-C5 사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, R5는 C3-C4 사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, R5는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 또는 사이클로펜틸이다. 일부 구현예에서, R5는 사이클로프로필이다.
일부 구현예에서, X는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알킬-OH, C1-C6 알킬-CN, 또는 1 내지 5개의 R8 그룹으로 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, X는 H, C1-C3 알킬, C1-C3 할로알킬, C1-C3 알킬-OH, C1-C3 알킬-CN, 또는 1 내지 3개의 R8 그룹으로 임의로 치환된 C3-C5 사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, X는 H 또는 -CH3이다.
일부 구현예에서, X는 H이다.
일부 구현예에서, X는 C1-C6 알킬이다. 일부 구현예에서, X는 C1-C3 알킬이다. 일부 구현예에서, X는 메틸, 에틸, n-프로필, 또는 이소프로필이다. 일부 구현예에서, X는 -CH3이다.
일부 구현예에서, X는 C1-C6 할로알킬이다. 일부 구현예에서, X는 1 내지 7개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C6 할로알킬이다. 일부 구현예에서, X는 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, X는 1 내지 7개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, X는 1 내지 5개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로, 브로모 및 플루오로 원자로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로 원자 및 플루오로 원자로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 모두 플루오로 원자이다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로 원자와 플루오로 원자의 조합이다. 일부 구현예에서, X는 -CF3, -CCl3, -CF2Cl, -CFCl2, -CHF2, -CH2F, -CHCl2, -CH2Cl, 또는 -CHFC1이다. 일부 구현예에서, X는 -CF3이다.
일부 구현예에서, X는 C1-C6 알킬-OH이다. 일부 구현예에서, X는 C1-C3 알킬-OH이다. 일부 구현예에서, X는 -CH2OH, -CH2CH2-OH, -CH2CH2CH2-OH, 또는 -C(CH3)2-OH이다. 일부 구현예에서, X는 -CH2OH이다.
일부 구현예에서, X는 C1-C6 알킬-CN이다. 일부 구현예에서, X는 C1-C3 알킬-CN이다. 일부 구현예에서, X는 -CH2CN, -CH2CH2-CN, -CH2CH2CH2-CN, 또는 -C(CH3)2-CN이다. 일부 구현예에서, X는 -CH2CN이다.
일부 구현예에서, X는 1 내지 5개의 R8 그룹에 의해 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, X는 1 내지 3개의 R8 그룹에 의해 임의로 치환된 C3-C5 사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 5개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 4개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 3개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 2개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 하나의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 사이클로알킬은 비치환된다. 일부 구현예에서, X는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 또는 사이클로펜틸이고, 이들 각각은 임의로 1 내지 5개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, X는 사이클로프로필이다.
일부 구현예에서, X는
Figure pct00079
이고, 여기서
Figure pct00080
로서 제시된 환 B 모이어티는 4원 내지 7원 헤테로사이클릴 또는 5원 내지 8원 헤테로아릴이고, 이 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴은 각각 N, O 및 S로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1 내지 2개의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하고, 이 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴은 각각 1 내지 5개의 R8 그룹으로 임의로 치환된다. 일부 구현예에서, 환 B 모이어티는 4원 내지 6원 헤테로사이클릴 또는 5원 내지 6원 헤테로아릴이고, 이 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴은 각각 N, O 및 S로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1 내지 2개의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하고, 이 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴은 각각 1 내지 5개의 R8 그룹으로 임의로 치환된다. 일부 구현예에서, 환 B 모이어티는 4원 내지 5원 헤테로사이클릴 또는 5원 내지 6원 헤테로아릴이고, 이 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴은 각각 N 및 O로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하고, 이 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴은 각각 1 내지 5개의 R8 그룹으로 임의로 치환된다.
일부 구현예에서, 환 B 모이어티는 N, O 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 2개의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는 4원 내지 7원 헤테로사이클릴이고, 여기서 헤테로사이클릴은 임의로 1 내지 5개의 R8 그룹으로 치환된다. 일부 구현예에서, 환 B 모이어티는 N, O 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 2개의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는 4원 내지 6원 헤테로사이클릴이고, 여기서 헤테로사이클릴은 임의로 1 내지 5개의 R8 그룹으로 치환된다. 일부 구현예에서, 환 B 모이어티는 N 및 O로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는 4원 내지 5원 헤테로사이클릴이고, 여기서 헤테로사이클릴은 임의로 1 내지 5개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 5개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 4개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 3개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 2개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 비치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 2개의 추가의 헤테로원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 추가의 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 2개의 추가 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 추가로 하나의 산소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 추가로 2개의 산소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 산소 원자 및 하나의 질소 원자를 추가로 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 추가로 하나의 황 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 추가의 헤테로원자를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 아제티디닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 피페리디닐, 또는 이속사졸리디닐이고, 이들 각각은 임의로 1 내지 5개의 R8 그룹에 의해 치환된다.
일부 구현예에서, 환 B 모이어티는 N, O 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 내지 2개의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는 5원 내지 8원 헤테로아릴이고, 여기서 헤테로아릴은 임의로 1 내지 5개의 R8 그룹으로 치환된다. 일부 구현예에서, 환 B 모이어티는 N, O 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 내지 2개의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는 5원 내지 6원 헤테로아릴이고, 여기서 헤테로아릴은 임의로 1 내지 5개의 R8 그룹으로 치환된다. 일부 구현예에서, 환 B 모이어티는 N 및 O로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는 5원 내지 6원 헤테로아릴이고, 여기서 헤테로아릴은 임의로 1 내지 5개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 5개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 4개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 3개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 2개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 하나의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 비치환된다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 2개의 추가의 헤테로원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 하나의 추가의 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 2개의 추가 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 추가로 하나의 산소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 추가로 2개의 산소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 하나의 산소 원자 및 하나의 추가의 질소 원자를 추가로 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 추가로 하나의 황 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 추가의 헤테로원자를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴은 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 이속사졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 트리아졸릴, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 또는 트리아질이고, 이들 각각은 임의로 1 내지 5개의 R8 그룹에 의해 치환된다.
일부 구현예에서, 환 B 모이어티는
Figure pct00081
이고, 여기서 Y는 O, CH2, CHR8, 또는 C(R8)2이고, X는
Figure pct00082
이다. 일부 구현예에서, Y는 산소(O)이다. 다른 구현예에서, Y는 CH2, CHR8, 또는 C(R8)2이다. 일부 구현예에서, Y는 CH2이다. 일부 구현예에서, Y는 CHR8이다. 일부 구현예에서, Y는 C(R8)2이다. 일부 구현예에서, 환 B 모이어티는 총 1 내지 5개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 환 B 모이어티는 총 1 내지 3개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 따라서, Y가 CHR8인 경우, 환 B 모이어티는 최대 4개의 추가 R8 그룹으로 치환될 수 있다. 유사하게, Y가 CH(R8)2이면, 환 B 모이어티는 최대 3개의 추가 R8 그룹으로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 환 B 모이어티는 5개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 환 B 모이어티는 4개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 환 B 모이어티는 3개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 환 B 모이어티는 2개의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 환 B 모이어티는 하나의 R8 그룹에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 환 B 모이어티는 비치환된다. 일부 구현예에서, 환 B 모이어티는
Figure pct00083
이고, 여기서 각각의 R8은 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다.
일부 구현예에서, 각각의 R7은 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-OH, 또는 C1-C6 할로알킬이다. 일부 구현예에서, 각각의 R7은 독립적으로 H, C1-C3 알킬, C1-C3 알킬-OH, 또는 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, 각각의 R7은 독립적으로 H, -CH3, -CH2OH, 또는 -CF3이다.
일부 구현예에서, 두 R7 그룹은 수소(H)이다. 일부 구현예에서, 하나의 R7 그룹은 H이다. 일부 구현예에서, 하나의 R7 그룹은 H이고, 다른 R7 그룹은 C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-OH, 또는 C1-C6 할로알킬이다. 일부 구현예에서, 하나의 R7 그룹은 H이고, 다른 R7 그룹은 C1-C6 알킬이다. 일부 구현예에서, 하나의 R7 그룹은 H이고, 다른 R7 그룹은 C1-C3 알킬이다. 일부 구현예에서, 하나의 R7 그룹은 H이고, 다른 R7 그룹은 -CH3이다.
일부 구현예에서, R7은 C1-C6 알킬이다. 일부 구현예에서, R7은 C1-C3 알킬이다. 일부 구현예에서, R7은 메틸, 에틸, n-프로필, 또는 이소프로필이다. 일부 구현예에서, 하나의 R7 그룹은 메틸, 에틸, n-프로필, 또는 이소프로필이고, 다른 R7 그룹은 H이다. 일부 구현예에서, R7은 -CH3이다.
일부 구현예에서, R7은 C1-C6 알킬-OH이다. 일부 구현예에서, R7은 C1-C3 알킬-OH이다. 일부 구현예에서, R7은 -CH2OH, -CH2CH2-OH, -CH2CH2CH2-OH, 또는 -C(CH3)2-OH이다. 일부 구현예에서, R7은 -CH2OH이다. 일부 구현예에서, 하나의 R7 그룹은 C1-C6 알킬-OH이고, 다른 R7 그룹은 H이다. 일부 구현예에서, 하나의 R7 그룹은 C1-C3 알킬-OH이고, 다른 R7 그룹은 H이다. 일부 구현예에서, 하나의 R7 그룹은 -CH2OH, -CH2CH2-OH, -CH2CH2CH2-OH, 또는 -C(CH3)2-OH이고, 다른 R7 그룹은 H이다. 일부 구현예에서, 하나의 R7 그룹은 -CH2OH이고, 다른 R7 그룹은 H이다.
일부 구현예에서, R7은 C1-C6 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R7은 1 내지 7개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C6 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R7은 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R7은 1 내지 7개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R7은 1 내지 5개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로, 브로모 및 플루오로 원자로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로 원자 및 플루오로 원자로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 모두 플루오로 원자이다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로 원자와 플루오로 원자의 조합이다. 일부 구현예에서, R7은 -CF3, -CCl3, -CF2Cl, -CFCl2, -CHF2, -CH2F, -CHCl2, -CH2F, 또는 -CHFC1이다. 일부 구현예에서, R7은 -CF3이다.
일부 구현예에서, 2개의 R7 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 C3-C5 사이클로알킬 또는 3원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R7 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 사이클로프로필 또는 옥세타닐을 형성한다.
일부 구현예에서, 2개의 R7 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 C3-C5 사이클로알킬을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R7 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 사이클로프로필 또는 사이클로부틸을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R7 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 사이클로프로필을 형성한다.
일부 구현예에서, 2개의 R7 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 3 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R7 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 3원 내지 4원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 2개의 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 산소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 2개의 산소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 산소 원자 및 하나의 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 황 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 질소 원자 및 하나의 황 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, R7은 아지리디닐, 옥시라닐, 옥세타닐, 아제티디닐, 테트라하이드로푸라닐, 디옥솔라닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 또는 이속사졸리디닐이다.
일부 구현예에서, 각각의 R8은 독립적으로 할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-CN, C1-C6 알킬-OH, C1-C6 할로알킬, -CN, 옥소, 또는 -O(C1-C6 알킬)이다. 일부 구현예에서, 각각의 R8은 독립적으로 할로, C1-C3 알킬, C1-C3 알킬-CN, C1-C3 알킬-OH, C1-C3 할로알킬, -CN, 옥소, 또는 -O(C1-C3 알킬)이다. 일부 구현예에서, 각각의 R8은 독립적으로 플루오로(F), -CH3, -CH2CH3, -CH2CN, -CH2OH, -CF3, -CN, 옥소 또는 -OCH3이다.
일부 구현예에서, R8은 할로이다. 일부 구현예에서, R8은 클로로, 플루오로, 또는 브로모이다. 일부 구현예에서, R8은 클로로 또는 플루오로이다. 일부 구현예에서, R8은 플루오로이다.
일부 구현예에서, R8은 C1-C6 알킬이다. 일부 구현예에서, R8은 C1-C3 알킬이다. 일부 구현예에서, R8은 메틸, 에틸, n-프로필, 또는 이소프로필이다. 일부 구현예에서, R8은 -CH3 또는 -CH2CH3이다.
일부 구현예에서, R8은 -CN이다. 일부 구현예에서, R8은 C1-C6 알킬-CN이다. 일부 구현예에서, R8은 C1-C3 알킬-CN이다. 일부 구현예에서, R8은 -CH2CN, -CH2CH2-CN, -CH2CH2CH2-CN, 또는 -C(CH3)2-CN이다. 일부 구현예에서, R8은 -CH2CN이다.
일부 구현예에서, R8은 C1-C6 알킬-OH이다. 일부 구현예에서, R8은 C1-C3 알킬-OH이다. 일부 구현예에서, R8은 -CH2OH, -CH2CH2-OH, -CH2CH2CH2-OH, 또는 -C(CH3)2-OH이다. 일부 구현예에서, R8은 -CH2OH이다.
일부 구현예에서, R8은 C1-C6 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R8은 1 내지 7개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C6 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R8은 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R8은 1 내지 7개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, R8은 1 내지 5개의 할로겐 원자를 함유하는 C1-C3 할로알킬이다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로, 브로모 및 플루오로 원자로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로 원자 및 플루오로 원자로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 모두 플루오로 원자이다. 일부 구현예에서, 할로겐 원자는 클로로 원자와 플루오로 원자의 조합이다. 일부 구현예에서, R8은 -CF3, -CCl3, -CF2Cl, -CFCl2, -CHF2, -CH2F, -CHCl2, -CH2F, 또는 -CHFC1이다. 일부 구현예에서, R8은 -CF3이다.
일부 구현예에서, R8은 옥소이다.
일부 구현예에서, R8은 -O(C1-C6 알킬)이다. 일부 구현예에서, R8은 -O-(C1-C3 알킬)이다. 일부 구현예에서, R8은 -O(메틸), -O(에틸), -O(n-프로필), 또는 -O(이소프로필)이다. 일부 구현예에서, R8은 -OCH3 또는 -OCH2CH3이다. 일부 구현예에서, R8은 -OCH3이다.
일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 또는 융합된 C3-C5 사이클로알킬 또는 3원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 또는 융합된 사이클로프로필 또는 옥세타닐을 형성한다.
일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 또는 융합된 C3-C5 사이클로알킬을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 C3-C5 사이클로알킬을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 사이클로프로필을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 사이클로부틸을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 사이클로펜틸을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 융합된 C3-C5 사이클로알킬을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 융합된 사이클로프로필을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 융합된 사이클로부틸을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 융합된 사이클로펜틸을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 또는 융합된 사이클로프로필을 형성한다.
일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 또는 융합된 3원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 3원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 옥세타닐을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 융합된 3원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 융합된 옥세타닐을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 또는 융합된 옥세타닐을 형성한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 2개의 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 산소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 2개의 산소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 산소 원자 및 하나의 질소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 황 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릴은 하나의 질소 원자 및 하나의 황 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 아지리디닐, 옥시라닐, 옥세타닐, 아제티디닐, 테트라하이드로푸라닐, 디옥솔라닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 또는 이속사졸리디닐을 형성한다. 일부 구현예에서, 2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 융합된 아지리디닐, 옥시라닐, 옥세타닐, 아제티디닐, 테트라하이드로푸라닐, 디옥솔라닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 또는 이속사졸리디닐을 형성한다.
일부 구현예에서, X는
Figure pct00084
이다. 일부 구현예에서, X는
Figure pct00085
이다. 일부 구현예에서, X는
Figure pct00086
이다. 일부 구현예에서, X는
Figure pct00087
이다. 일부 구현예에서, X는
Figure pct00088
이다. 일부 구현예에서, X는
Figure pct00089
이다. 이들 구현예 중 어느 하나에서, 두 R7 그룹은 모두 수소(H)일 수 있다. 이들 구현예 중 어느 하나에서, 하나의 R7 그룹은 H일 수 있고, 하나의 R7 그룹은 -CH3일 수 있다. 이들 구현예 중 어느 하나에서, 두 R7 그룹은 -CH3일 수 있다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-A 또는 I-B의 화합물이다:
[화학식 I-A]
Figure pct00090
[화학식 I-B]
Figure pct00091
상기 식에서,
R1, R2, R3, R4, R5, Z1, Z2 및 X는 화학식 I의 화합물에 대해 기재된 바와 같다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-a 또는 I-b의 화합물이다:
[화학식 I-a]
Figure pct00092
[화학식 I-b]
Figure pct00093
상기 식에서,
R1, R2, R5, R6, Z1, Z2 및 X는 화학식 I의 화합물에 대해 기재된 바와 같다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 I-C, I-D, I-E, I-F, I-G, I-H 또는 I-J의 화합물이다:
[화학식 I-C]
Figure pct00094
[화학식 I-D]
Figure pct00095
[화학식 I-E]
Figure pct00096
[화학식 I-F]
Figure pct00097
[화학식 I-G]
Figure pct00098
[화학식 I-H]
Figure pct00099
[화학식 I-I]
Figure pct00100
[화학식 I-J]
Figure pct00101
상기 식에서,
R3, R4, R5 및 X는 화학식 I의 화합물에 대해 기재된 바와 같다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 II-A, II-B, II-C, II-D, II-E, II-F, II-G, 또는 II-H의 화합물이다:
[화학식 II-A]
Figure pct00102
[화학식 II-B]
Figure pct00103
[화학식 II-C]
Figure pct00104
[화학식 II-D]
Figure pct00105
[화학식 II-E]
Figure pct00106
[화학식 II-F]
Figure pct00107
[화학식 II-G]
Figure pct00108
[화학식 II-H]
Figure pct00109
상기 식에서,
R3, R4, R5, R7, R8 및 환 B 모이어티는 화학식 I의 화합물에 대해 기재된 바와 같다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 III-A, III-B, III-C, III-D, III-E, III-F, III-G, 또는 III-H의 화합물이다:
[화학식 III-A]
Figure pct00110
[화학식 III-B]
Figure pct00111
[화학식 III-C]
Figure pct00112
[화학식 III-D]
Figure pct00113
[화학식 III-E]
Figure pct00114
[화학식 III-F]
Figure pct00115
[화학식 III-G]
Figure pct00116
[화학식 III-H]
Figure pct00117
상기 식에서,
R3, R4, R5, R7, R8 및 Y는 화학식 I의 화합물에 대해 기재된 바와 같다.
일부 구현예에서, 화합물은 화학식 IV-A, IV-B, IV-C, IV-D, IV-E, IV-F, IV-G, 또는 IV-H의 화합물이다:
[화학식 IV-A]
Figure pct00118
[화학식 IV-B]
Figure pct00119
[화학식 IV-C]
Figure pct00120
[화학식 IV-D]
Figure pct00121
[화학식 IV-E]
Figure pct00122
[화학식 IV-F]
Figure pct00123
[화학식 IV-G]
Figure pct00124
[화학식 IV-H]
Figure pct00125
상기 식에서,
R3, R4 및 R5는 화학식 I의 화합물에 대해 기재된 바와 같고, X는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알킬-OH, C1-C6 알킬-CN, 또는 1 내지 5개의 R8 그룹으로 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, X는 H이다. 일부 구현예에서, X는 C1-C6 알킬이다. 일부 구현예에서, X는 C1-C6 할로알킬이다. 일부 구현예에서, X는 C1-C6 알킬-OH이다. 일부 구현예에서, X는 C1-C6 알킬-CN이다. 일부 구현예에서, X는 1 내지 5개의 R8 그룹에 의해 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬이다.
[표 1]
Figure pct00126
Figure pct00127
Figure pct00128
Figure pct00129
Figure pct00130
일부 구현예에서, 표 1의 화합물 번호 1 내지 53으로부터 선택된 화합물, 또는 이의 호변이성체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 제공된다.
한 측면에서, 본원에 기재된 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 다른 측면에서, 화학식 I의 화합물을 제조하기 위한 중간체 화합물이 본원에 제공된다. 검정 프로브이고, 임의로, 예를 들어, 형광 표지로 태깅된 화합물도 또한 본원에 제공된다. 추가의 측면에서, Cbl-b의 억제를 검정하는 방법이 본원에 제공된다. 하나의 변형에서, Cbl-b를 형광 표지로 태깅된 검정 프로브와 같은 검정 프로브로 예비배양하는 단계, 이어서 Cbl-b/검정 프로브 혼합물을 후보 혼합물에 노출시키는 단계, 이어서 검정 프로브가, 예를 들어, FRET 신호 검출을 사용하여 후보 화합물에 의해 대체되는지 및 어느 정도 대체되는지를 결정하는 단계를 포함하는, Cbl-b의 억제를 검정하는 방법이 본원에 제공된다.
하기 반응식은 본원에 개시된 화합물을 합성하는 방법을 기재한다. 최종 화합물의 라세미 혼합물과 같은 합성 동안 생산된 입체이성체의 혼합물은 키랄 고정상과 조합된 초임계 유체 크로마토그래피, 키랄 컬럼 크로마토그래피, 또는 당업계에 공지된 다른 방법과 같은 일반적인 크로마토그래피 방법을 사용하여 각각의 거울상이성체로 분리될 수 있다.
[반응식 I]
Figure pct00131
화학식 I-5 또는 I-6의 중간체 화합물은 반응식 I에 요약된 바와 같이 합성될 수 있고, 여기서 R3 및 R4는 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, Y1은 H이고, 적절한 에스테르의 일부를 형성하고, 또는 카복실산의 또 다른 적합한 보호 그룹이다. 그룹 R3 및 R4는 화학식 I-1과 같은 아릴아세트산을 NaH, i-PrMgCl, KO-t-Bu 또는 LHMDS와 같은 염기로 탈양성자화한 후, 친전자체, 예를 들어, 알킬 브로마이드 또는 포름알데히드, 또는 비스-친전자체, 예를 들어, 2-메틸-1,3-디브로모 프로판 또는 에피클로로하이드린(R3 및 R4가 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 사이클로알킬 그룹을 형성하는 화합물을 제공하기 위해)으로 처리함으로써 설치될 수 있다. 예를 들어, R3 및 R4가 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 사이클로펜틸 그룹을 형성하는 화학식 I-2의 특정 화합물은 상업적 공급원으로부터 직접 수득될 수 있다. R3 및 R4가 각각 하이드록시메틸인 화학식 I-2의 화합물은 미쓰노부 사이클릭화(Mitsunobu cyclization)에 의해 옥세탄 환을 형성한다. 트리아졸 어셈블리는 하이드라지드의 형성, 사이클릭화 및 탈황화에 의해 수행되어 화학식 I-5의 화합물을 제공할 수 있다. 화학식 I-5의 화학식 I-6의 화합물로의 후속적 전환은 암모니아 및 구리, 또는 Boc 카바메이트 및 팔라듐을 사용한 아민화에 이어서 탈보호에 의해 달성될 수 있다.
[반응식 II]
Figure pct00132
중간체 I-5는 반응식 II에 예시된 바와 같이 추가로 정교화될 수 있다. R3 및 R4가 옥소 치환된 환(I-5a)을 형성하는 경우, 케톤은 시아노-올레핀 II-1로 상동화될 수 있고, 올레핀은 환원되어 시아노메틸 치환된 중간체 II-2를 형성한다. R3 및 R4가 하이드록실 치환된 환을 형성하는 경우, 하이드록실 그룹은 친전자체로 알킬화되어 화학식 II-3을 수득한 다음, 트리아졸 II-4로 전환될 수 있다. 입체화학은 미쓰노부 반응에 이어 유사한 알킬화에 의해 역전되어 화학식 II-7 및 II-8과 같은 중간체를 수득할 수 있다. 추가의 치환은 화학식 II-10 및 II-11을 수득하기 위한 메실화 및 치환에 의해 하이드록실 그룹을 니트릴 그룹으로 전환함으로써 달성될 수 있다.
[반응식 III]
Figure pct00133
R3 및 R4가 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 테트라하이드로푸란 환을 형성하는 화합물은 반응식 III에 예시된 바와 같이 조립될 수 있다. 브로마이드 III-1은 팔라듐 촉매 작용하에서 활성화된 디하이드로피란과 결합하여 올레핀 III-2를 수득할 수 있다. 올레핀 III-2는 에폭시화될 수 있고, 루이스산 촉매된 환 축소에 적용되어 알데히드 III-3을 형성할 수 있다. 카복실산을 수득하기 위한 알데히드 III-3의 산화에 이어, 반응식 I에 개략된 바와 같이 트리아졸 정교화로 중간체 III-4를 수득한다.
[반응식 IV]
Figure pct00134
반응식 IV는 환 A 모이어티가 인돌론 환이고, R1, R3, R4, R5, R7, R8, Z1, 및 환 B 모이어티가 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 바와 같은 화합물의 어셈블리를 예시한다. 화학식 IV-1은 아닐린 I-6과 직접 축합시켜 중간체 IV-4를 수득할 수 있다. 이어서, 화학식 IV-4의 화합물을 환원성 아민화 조건하에서 환 B 모이어티를 함유하는 헤테로사이클로 처리하여 화학식 IV-5의 화합물을 수득한다. 대안적으로, 단계의 순서를 전환할 수 있고, 화학식 IV-1 및 환 B 모이어티를 함유하는 헤테로사이클에 의한 환원적 아민화는 중간체 IV-2를 수득한다. 이어서, 화학식 IV-2의 중간체를 아닐린 I-6과 축합시켜 화학식 IV-5의 화합물을 수득할 수 있다. 특정 구현예에서, 화학식 IV-2는 사이클릭화되어 인돌론 IV-3을 형성한 다음, 팔라듐 촉매 작용하에 브롬화물 I-5에 결합된다.
[반응식 V]
Figure pct00135
반응식 V는 두 R7 그룹이 독립적으로 C1-C6 알킬 유도체이고, R1, R3, R4, R7, R8, Z1 및 환 B 모이어티가 화학식 I의 화합물에 대해 정의되는 바와 같은 중간체 화합물의 합성을 예시한다. 화학식 V-1의 케톤은 Ti(OEt)4와 같은 강력한 탈수제를 사용하여 환 B 모이어티를 함유하는 헤테로사이클과 축합시킨 후 시아나이드를 첨가하여 화학식 V-2와 같은 스트레커(Strecker) 중간체를 수득한다. 그런 다음, 상응하는 그리냐르 시약(Grignard reagent)을 첨가하여 제2 R7 치환체를 설치하여 4차 화합물 V-3을 생성한 다음, 이것을 브롬화물 I-5에 결합시켜 화학식 V-4의 화합물을 수득할 수 있다.
[반응식 VI]
Figure pct00136
반응식 VI은 화학식 VI-5의 화합물의 합성을 개략적으로 개요하고, 여기서 R2, R3, R4, R5, Z2, 및 X는 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 바와 같고; Rb는 적합한 에스테르의 일부를 형성하거나 카복실산의 또 다른 적절한 보호 그룹이고; Yb는 알킬 그룹, 예를 들어, 메틸, 사이클로알킬 그룹, 예를 들어, 사이클로프로필, 할로알킬 그룹, 예를 들어, 브로모메틸, 또는 -CHO이고; Yc는 하이드록실 또는 NH2이다. 화학식 VI-1의 메틸 피리딘 또는 피리미딘은 화학식 I-5 또는 I-6의 중간체 화합물에 결합하기 위해 X가 메틸인 중간체 VI-4로 직접 운반된다. 대안적으로, 메틸 그룹은 SeO2에 의한 산화로 활성화시켜 알데히드를 제공하거나, Br2로 활성화시켜 화학식 VI-2의 브로모메틸 유도체를 형성할 수 있다. 이어서, X에서 아미노 그룹은 치환된 아민에 의한 환원적 아민화 또는 치환에 의해 설치되어 화합물 VI-3을 제공하고, 이어서 염기성 조건하에서 에스테르 가수분해하여 Yc가 OH인 화합물 VI-4를 수득할 수 있다. 이어서, 산 VI-4를 HATU 및 T3P와 같은 커플링 시약으로 아민 I-6에 결합하여 아미드 VI-5를 수득하고; Yc가 NH2인 아미드 VI-4는 팔라듐 촉매 작용하에서 브롬화물 I-5와 결합한다.
화합물 1, 3, 4, 17 및 35-53은 생물학적 실시예 1의 Cbl-b 억제 검정에서 5nM 이하의 IC50 값을 나타내며, 하나의 구현예에서 약제학적 조성물 및 본원에 개시된 방법에서 사용된다. 화합물 8, 15 및 25-34는 생물학적 실시예 1의 Cbl-b 억제 검정에서 5nM 초과 내지 20nM 사이의 IC50 값을 나타내며, 하나의 구현예에서 약제학적 조성물 및 본원에 개시된 방법에서 사용된다. 화합물 5, 6, 14, 16 및 19-24는 생물학적 실시예 1의 Cbl-b 억제 검정에서 20nM 초과 내지 100nM 사이의 IC50 값을 나타내며, 하나의 구현예에서 약제학적 조성물 및 본원에 개시된 방법에서 사용된다. 화합물 2, 7, 9-13 및 18은 생물학적 실시예 1의 Cbl-b 억제 검정에서 100nM 초과의 IC50 값을 나타내며, 하나의 구현예에서 약제학적 조성물 및 본원에 개시된 방법에서 사용된다.
다양한 구현예에서, 그리고 본원에서 추가로 기재되는 바와 같이, 본원에 제공된 화합물(및 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은 생물학적 실시예 1의 Cbl-b 억제 검정에 의해 결정된 바와 같이, 5nM 이하, 5nM 초과 내지 20nM 사이, 20nM 초과 내지 100nM 사이 또는 100nM 초과의 IC50 값을 갖는다. 추가의 구현예에서, 그리고 본원에서 추가로 기재되는 바와 같이, 본원에 제공된 화합물(및 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은 생물학적 실시예 1의 Cbl-b 억제 검정에 의해 결정된 바와 같이, 5nM 이하의 IC50 값을 갖는다. 추가의 구현예에서, 그리고 본원에서 추가로 기재되는 바와 같이, 본원에 제공된 화합물(및 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은 생물학적 실시예 1의 Cbl-b 억제 검정에 의해 결정된 바와 같이 5nM 초과 내지 20nM 사이의 IC50 값을 갖는다. 추가의 구현예에서, 그리고 본원에서 추가로 기재되는 바와 같이, 본원에 제공된 화합물(및 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은 생물학적 실시예 1의 Cbl-b 억제 검정에 의해 결정된 바와 같이 20nM 초과 내지 100nM의 IC50 값을 갖는다. 추가의 구현예에서, 및 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 화합물(및 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물, 및 화합물 또는 조성물을 사용하는 방법)은 생물학적 실시예 1의 Cbl-b 억제 검정에 의해 결정된 바와 같이, 100nM 초과의 IC50 값을 갖는다.
항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 공자극된 면역 세포(예: T-세포)로부터의 IL-2 분비를 위해, 본원에 제공된 화합물(및 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물)은 1μmol 또는 0.3μmol의 억제제 농도에서 기준선에 비해 20배 미만, 20 내지 35배, 또는 35배 초과의 변화를 유도한다.
항-CD3 항체로 자극된 면역 세포(예: T-세포)로부터의 IL-2 분비를 위해, 본원에 제공된 화합물(및 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물)은 3μmol 또는 1μmol의 억제제 농도에서 기준선에 비해 0.70배 미만, 0.70 내지 1.1배, 또는 1.1배 초과의 변화를 유도한다.
항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 공자극된 면역 세포(예: T-세포)의 세포 표면에서의 CD25 염색을 위해, 본원에 제공된 화합물(및 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물)은 1μmol 또는 0.3μmol의 억제제 농도에서 기준선에 비해 1.24배 미만, 1.24 내지 1.39배, 또는 1.39배 초과의 변화를 유도한다.
항-CD3 항체로 자극된 면역 세포(예: T-세포)의 세포 표면에서의 CD25 염색을 위해, 본원에 제공된 화합물(및 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물)은 3μmol 또는 1μmol의 억제제 농도에서 기준선에 비해 1.5배 미만, 1.5 내지 2.5배, 또는 2.5배 초과의 변화를 유도한다.
III. 용도 및 방법
예를 들어, 면역 세포를 본원에 기재된 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물의 유효량과 접촉시킴으로써 면역 세포(예: T-세포, B-세포 또는 NK-세포)의 활성을 조절하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에서 "변형된 면역 세포"로 지칭되는 조절된 활성을 갖는 상기 면역 세포를 생산하는 시험관내 방법이 또한 제공되며, 여기서 상기 변형된 면역 세포는 생체외 방법에 의해 이를 필요로 하는 개체(예: 암을 갖는 개체)에게 투여될 수 있다. 또한, 이를 필요로 하는 개체(예: 암을 갖는 개체)에서 반응을 조절하는 생체내 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 본원에 기재된 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물의 유효량의 투여를 포함한다. 또한, 본 개시내용은 암을 갖는 개체에서 생체내 림프구 조절 후 림프구의 확대된 집단을 생산하는 시험관내 방법을 제공하며, 여기서 림프구 조절은 본원에 기재된 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물의 유효량을 개체에게 투여한 결과로서 발생한다. 이어서, 림프구의 확대된 집단을 암을 갖는 개체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포 또는 림프구의 확대된 집단은 말초 혈액 단핵 세포를 포함하는 혈액 샘플 또는 종양 침윤성 림프구(TIL)를 포함하는 종양 생검과 같은 개체로부터 수득된 면역 세포를 포함하는 생물학적 샘플로부터 생산된다.
추가로, 치료 활성 물질로서 사용하기 위한 Cbl-b 억제제가 제공된다. Cbl-b 활성과 관련된 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 Cbl-b 억제제가 제공된다. 또한, 암을 치료하는 데 사용하기 위한 Cbl-b 억제제가 제공된다. Cbl-b 활성과 관련된 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서 Cbl-b 억제제의 용도가 추가로 제공된다. 암 치료용 약제의 제조에서 Cbl-b 억제제의 용도도 또한 제공된다. 또한, 본 개시내용은 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제, 항종양제, 및 방사선 요법을 포함하는 암을 치료하기 위한 병용 요법의 일부로서 Cbl-b 억제제를 포함하는 치료 방법, 약제 및 용도를 제공한다.
본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도의 일부 구현예에서, 암은 림프종(lymphoma), 백혈병(leukemia) 또는 골수종(myeloma)과 같은 혈액암(hematologic cancer)이다. 본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도의 다른 구현예에서, 암은 육종(sarcoma), 암종(carcinom), 또는 흑색종(melanoma)과 같은 비혈액암(non-hematologic cancer)이다.
혈액암은 하나 이상의 백혈병, 예를 들어, B-세포 급성 림프성 백혈병(B-cell acute lymphoid leukemia; "BALL"), T-세포 급성 림프성 백혈병(T-cell acute lymphoid leukemia; "TALL"), 급성 림프성 백혈병(acute lymphoid leukemia; ALL); 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia; CML) 및 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia; CLL)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 만성 백혈병; B-세포 전림프구성 백혈병(B-cell prolymphocytic leukemia), 모세포성 형질세포양 수지상 세포 신생물(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 모세포 백혈병(hairy cell leukemia), 소세포 또는 거대 세포 여포성 림프종(small cell- or a large cell-follicular lymphoma), 악성 림프증식성 상태(malignant lymphoproliferative conditions), MALT 림프종, 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma), 변연부 림프종(Marginal zone lymphoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 골수이형성(myelodysplasia) 및 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 형질모세포성 림프종(plasmablastic lymphoma), 형질세포양 수지상 세포 신생물(plasmacytoid dendritic cell neoplasm), 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 및 골수성 혈액 세포의 비효율적인 생산(또는 이형성증)에 의해 결합된 다양한 혈액학적 상태인 "전백혈병(preleukemia)"을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가의 혈액암 또는 혈액학적 상태를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
비혈액암은 신경모세포종(neuroblastoma), 신장 세포 암종(renal cell carcinoma), 결장암(colon cance), 결장직장암(colorectal cancer), 유방암(breast cancer), 상피 편평 세포암(epithelial squamous cell cancer), 흑색종(melanoma), 위암(stomach cancer), 뇌암(brain cancer), 폐암(lung cancer)(예: NSCLC), 췌장암(pancreatic cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 전립선암(prostate cancer), 고환암(testicular cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 자궁암(uterine cancer), 부신암(adrenal cancer) 및 두경부암(head and neck cancer)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 암과 같은 질환 또는 장애의 치료에서 Cbl-b 억제제의 투여의 효능은 종양 크기 또는 종양 수의 감소 및/또는 생존율과 같은 임상 결과를 평가함으로써 측정된다. 특정 구현예에서, "암을 치료하는"은 기재된 바와 같이(참조: 예를 들어, Eisenhauer et al., Eur J Cancer, 45:228-247, 2009; 및 Nishino et al., Am J Roentgenol, 195: 281-289, 2010) 고형 종양에서의 반응 평가 기준(RECIST 버전 1.1)에 따라 치료 섭생에 대한 환자의 반응을 평가하는 것을 포함한다. RECIST 1.1에 기초한 객관적인 항종양 반응을 결정하기 위한 반응 기준은 완전 반응(CR); 부분 반응(PR); 진행성 질환(PD); 및 안정한 질환(SD)을 포함한다.
A. 세포의 단리 및 처리
본원의 방법에서 생산되고 사용되는 면역 세포(예: 변형된 면역 세포)의 제조 및 처리 방법이 제공된다. 본원에서 사용되는 용어 "변형된 면역 세포"는 면역 세포 또는 상기 면역 세포의 활성을 조절하기 위해 유효량의 Cbl-b 억제제와 배양, 인큐베이팅 및/또는 접촉된 면역 세포를 포함하는 세포 집단을 지칭한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 입양 면역 요법 방법과 관련된 경우와 같은 면역 요법에 사용될 수 있다.
1. 샘플
일부 구현예에서, 변형될 면역 세포 또는 변형될 면역 세포를 포함하는 세포 집단은 생물학적 샘플, 예를 들어, 개체(예: 인간)로부터 수득되거나 유래된 것과 같은 샘플로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 면역 세포가 단리되는 개체는 특정 질환 또는 상태(예: 암)를 갖거나, 세포 요법을 필요로 하거나, 또는 세포 요법이 투여되는 개체이다. 개체는 일부 구현예에서 면역 세포가 단리, 처리 및/또는 변형되는 입양 세포 요법과 같은 특별한 치료적 개입을 필요로 하는 인간이다. 따라서, 일부 구현예에서, 개체로부터 단리된 세포는 1차 세포(예: 1차 인간 세포)이다. 본원에서 사용되는 용어 "1차 세포"는 포유류의 생물학적 유체 또는 조직(예: 인간의 생물학적 유체 또는 조직)으로부터 직접 단리된 세포를 지칭한다.
일부 구현예에서, 변형될 면역 세포는 조혈 세포, 다능성 줄기 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, T-세포, B-세포 및/또는 NK-세포이다. 본원에서 사용되는 용어 "조혈 세포"는 조혈 줄기 세포 및 조혈 전구 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포는 이종 세포 집단 또는 이종 세포 집단을 포함하는 조성물에 존재한다. 예를 들어, 변형될 면역 세포는 조직 또는 기관으로부터 유래된 분화된 세포와 같은 세포를 포함하는 이종 세포 집단에 존재하는 조혈 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포는 균질한 세포 집단 또는 균질한 세포 집단을 포함하는 조성물에 존재한다. 예를 들어, 변형될 면역 세포는 조혈 세포만을 포함하는 균질한 세포 집단에 존재하는 조혈 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포 또는 변형될 면역 세포를 포함하는 세포 집단은 면역 세포의 하나 이상의 서브세트를 포함한다. 예를 들어, 면역 세포의 하나 이상의 서브세트는 CD4+ 세포, CD8+ 세포, 및 이들의 하위 집단, 예를 들어, 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화 가능성, 확대, 국소화, 지속 능력, 표면 마커 프로파일, 사이토카인 분비 프로파일 및/또는 분화 정도에 의해 정의된 것들일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물학적 샘플은 개체로부터 직접 채취된 조직, 체액 및 기타 샘플, 및 분리, 원심분리, 유전자 공학(genetic engineering)(예: 재조합 키메라 수용체(recombinant chimeric receptor)를 인코딩하는 바이러스 벡터(vector)에 의한 형질 도입), 세척 및/또는 배양과 같은 하나 이상의 처리 단계로부터 생성되는 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접 수득되는 샘플 또는 처리되는 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀과 같은 체액, 및 이로부터 유도된 처리된 샘플을 포함하여 조직 및 기관의 샘플(예: 종양을 함유하는 조직 또는 기관으로부터의 샘플)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 생물학적 유체 샘플 또는 생물학적 조직 샘플이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 생물학적 조직 샘플이다.
일부 측면에서, 면역 세포가 유도되거나 단리되는 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이거나, 성분채집 또는 백혈구 성분채집 산물로부터 유래된다.
예시적인 생물학적 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장 및 기타 림프 조직, 간, 폐, 위, 장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도선, 또는 기타 기관 및/또는 이들로부터 유래된 세포를 포함한다. 생물학적 샘플은 세포 요법(예: 입양 세포 요법)의 맥락에서 자가 공급원(즉, 세포 요법을 필요로 하는 개체로부터 수득되거나 유래된) 및 동종 공급원(즉, 개체로부터 또는 세포 요법을 필요로 하는 개체 이외의 공급원으로부터 수득되거나 유래된) 샘플을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형될 면역 세포 또는 변형될 면역 세포를 포함하는 세포 집단은 세포주(예: T-세포주, B-세포주, NK-세포주 등)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포 또는 변형될 면역 세포를 포함하는 세포 집단은 마우스, 래트, 비인간 영장류, 또는 돼지와 같은 이종 공급원으로부터 수득된다.
2. 세포 처리 및 분리
일부 구현예에서, 변형될 면역 세포의 분리는 하나 이상의 제조 및/또는 세포 분리 단계를 포함한다. 하나 이상의 세포 분리 단계는 비친화성 기반 분리 또는 친화성 기반 분리일 수 있다. 예로서, 비친화성 기반 분리는 변형될 면역 세포를 포함하는 조성물의 원심분리일 수 있다. 일부 구현예에서, 비친화성 기반 분리 방법은 적혈구를 용해시켜 말초 혈액으로부터 백혈구의 제조 및 퍼콜(Percoll) 또는 피콜 구배(Ficoll gradient)를 통한 원심분리와 같은 밀도 기반 세포 분리 방법을 포함한다. 친화성 기반 분리 방법은 변형될 면역 세포를 포함하는 조성물을 항체 코팅 비드와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 항체 코팅 비드는 변형될 면역 세포의 표면에서 발현되는 마커에 결합하는 항체로 코팅된 자기 비드(예: 캘리포니아주 칼스배드의 Life Technologies가 판매하는 Dynabeads®, 캘리포니아 오번의 Miltenyi Biotec Inc.가 판매하는 MACS® 마이크로비드; 캐나다 BC 밴쿠버의 Stemcell Technologies가 판매하는 EasySep™ Direct RapidSpheres™)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, T-세포의 특정 하위 집단, 예를 들어, 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어, CD4+, CD8+ 등에 대해 양성이거나, 그렇지 않으면 이를 발현하는 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리된다. 양성 선택은 표적 세포(예: 변형될 면역 세포)가 시약에 결합되고 추가 사용을 위해 유지되는 기술에 기초할 수 있다. 예를 들어, CD3+인 T-세포는 항-CD3 항체에 접합된 자기 비드(예: MACS® CD3 인간 마이크로비드)를 사용하여 양성으로 선택될 수 있다. 음성 선택은 시약에 결합되지 않은 표적 세포(예: 변형될 면역 세포)가 유지되는 기술에 기초할 수 있다. 예를 들어, 전체 인간 1차 T-세포는 음성 선택을 이용하여 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)로부터 단리될 수 있으며, 여기서 표면 마커 CD14, CD15, CD16, CD19, CD34, CD36, CD56, CD123 및 CD235a에 대한 항체의 칵테일은 이들 표면 마커를 발현하는 세포를 제거하기 위한 자기 비드에 의해 샘플을 통과시키고 후속 처리를 위해 샘플에 잔류하는 세포를 보유하기 전에 PBMC를 포함하는 샘플에서 배양된다. 일부 구현예에서, 면역 세포 또는 변형될 면역 세포를 포함하는 세포 집단은, 예를 들어, 원하지 않는 성분을 제거하고 목적하는 성분을 농축시키고/시키거나 특정 시약에 민감한 세포를 용해 또는 제거하기 위해 하나 이상의 시약의 존재하에 세척, 원심분리 및/또는 배양된다. 일부 예에서, 면역 세포는 밀도, 부착 특성, 크기, 감도 및/또는 특정 성분에 대한 내성과 같은 하나 이상의 특성에 기초하여 분리된다. 세포 분리 단계는 특정 세포의 100% 농축 또는 제거를 필요로 하지 않는다. 일부 구현예에서, 특정 유형의 면역 세포(예: CD4+ T-세포)의 양성 선택 또는 농축은 이러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시킴을 지칭한다. 일부 구현예에서, 음성 선택에 의해서와 같이 관심이 없는 특정 유형의 세포의 제거 또는 고갈은 이러한 세포의 수 또는 백분율을 감소시킴을 지칭한다.
일부 구현예에서, 면역 세포 또는 면역 세포를 포함하는 세포 집단은, 예를 들어, 성분채집 또는 백혈구 성분채집에 의해 개체의 순환 혈액으로부터 수득된다. 일부 측면에서, 변형될 면역 세포를 포함하는 샘플은 T-세포, B-세포 및 NK-세포를 포함하는 림프구, 및 단핵구, 과립구, 적혈구 및/또는 혈소판을 함유하며, 일부 측면에서, 적혈구와 혈소판 이외의 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 개체로부터 수집된 혈액 세포는, 예를 들어, 혈장 분획을 제거하고, 변형될 면역 세포를 포함하는 세포 집단을 후속 처리 단계에 적합한 완충액 또는 배지에 배치하기 위해 세척된다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포를 포함하는 세포 집단은 인산염 완충 식염수로 세척된다. 일부 구현예에서, 세척 용액은 칼슘 및/또는 마그네슘이 결여된다. 일부 측면에서, 세척 단계는 반자동화 "관류(flow-through)" 원심분리기에 의해 달성된다. 일부 측면에서, 세척 단계는 접선 유동 여과에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포 또는 변형될 면역 세포를 함유하는 세포 집단은 세척 후 다양한 적절한 완충액, 예를 들어, 칼슘 및/또는 마그네슘 부재 인산염 완충 식염수에 재현탁된다. 일부 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분이 제거되고, 변형될 면역 세포 또는 변형될 면역 세포를 포함하는 세포 집단이 적절한 세포 배양 배지에 직접 재현탁된다.
상기 조혈 세포를 함유하는 세포 집단을 함유하는 샘플(예: PBMC를 포함하는 샘플)로부터 조혈 세포와 같은 면역 세포를 처리 및/또는 분리하는 대표적인 방법은 본원의 생물학적 실시예 2 및 생물학적 실시예 3에 기재되어 있다. 면역 세포, 예를 들어, 조혈 세포, 다능성 줄기 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, T-세포, B-세포 및/또는 NK-세포를 처리 및/또는 분리하는 방법 및 기술은 당업계에서 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 제2017/0037369호, 미국 특허 출원 제2012/0148553호; 미국 특허 제6,461,645호; 미국 특허 제6,352,694호; 및 미국 특허 제7,776,562호를 참조한다.
3. 배양 및 치료
면역 세포를 본원에 기재된 유효량의 Cbl-b 억제제와 접촉시킴으로써 상기 기재된 처리된 및/또는 분리된 면역 세포와 같은 면역 세포의 활성을 조절하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, 본원에 기재된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 유효량의 Cbl-b 억제제의 존재하에 면역 세포(예: 상기 기재된 처리된 및/또는 분리된 면역 세포)를 함유하는 세포 집단을 배양하여 면역 세포의 활성을 조절하고 이에 의해 변형된 면역 세포를 생산함으로써 생산된 변형된 면역 세포가 또한 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 변형될 면역 세포(예: 상기 기재된 처리된 및/또는 분리된 면역 세포)는 상기 면역 세포를 본원에 제공된 Cbl-b 억제제와 접촉시키기 전에 적절한 배양 배지에서 배양 및/또는 배양된다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포는 상기 면역 세포를 본원에 제공된 Cbl-b 억제제와 접촉시키는 동시에 적절한 배양 배지에서 배양 및/또는 배양된다.
변형될 처리된 및/또는 분리된 면역 세포, 또는 변형될 면역 세포를 포함하는 세포 집단은 시험관내에서 분화 및/또는 확장될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포는 조혈 세포, 다능성 줄기 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, T-세포, B-세포 및/또는 NK-세포이다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포는 면역 세포의 분화 및/또는 확장 전에 본원에 기재된 Cbl-b 억제제를 포함하는 적절한 세포 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포는 면역 세포의 분화 및/또는 확장 후에 본원에 기재된 Cbl-b 억제제를 포함하는 적절한 세포 배양 배지에서 배양된다. 면역 세포는 상기 면역 세포의 활성을 조절하는데 효과적인 양으로 본원에 제공된 Cbl-b 억제제와 접촉시 변형된다(즉, 변형된 면역 세포). 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포는 시험관내에서 분화 및/또는 확장되지 않았고, 따라서 Cbl-b 억제제와 접촉된 변형된 면역 세포와 동일한 세포 유형이다. 예를 들어, T-세포는 T-세포의 분화 없이 Cbl-b 억제제를 포함하는 적절한 배지에서 배양될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 변형될 면역 세포는 시험관내에서 분화 및/또는 확장되고, 따라서 Cbl-b 억제제와 접촉된 변형된 면역 세포와 상이한 세포 유형이다. 예를 들어, 조혈 세포는 Cbl-b 억제제 및 조혈 세포의 성숙한 조혈 세포로의 분화를 구동하는 다른 제제를 포함하는 적절한 배지에서 배양될 수 있다. 따라서, 본원의 구현예의 일부 측면에서, 변형된 면역 세포는 조혈 세포, 다능성 줄기 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, T-세포, B-세포, 및/또는 NK-세포이다. 면역 세포의 확장 및/또는 분화 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 제WO 2007/037083호를 참조한다.
Cbl-b 억제제의 유효량은 기준 샘플과 비교하여 면역 세포의 활성을 조절하기에 충분한 Cbl-b 억제제의 양 또는 농도이다. 기준 샘플은 Cbl-b 억제제와 접촉되지 않는 면역 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포를 포함하는 조성물(예: 세포 배양 배지)에 첨가되는 Cbl-b 억제제의 농도는 약 1pM 내지 약 100μM, 약 5pM 내지 약 100μM, 약 10pM 내지 약 100μM, 약 20pM 내지 약 100μM, 약 40pM 내지 약 100μM, 약 60pM 내지 약 100μM, 약 80pM 내지 약 100μM, 약 1nM 내지 약 100μM, 약 3nM 내지 약 100μM, 약 10nM 내지 약 100μM, 약 15nM 내지 약 100μM, 약 20nM 내지 약 100μM, 약 40nM 내지 약 100μM, 약 60nM 내지 약 100μM, 약 80nM 내지 약 100μM, 약 0.1μM 내지 약 100μM, 약 0.1μM 내지 약 90μM, 약 0.1μM 내지 약 80μM, 약 0.1μM 내지 약 70μM, 약 0.1μM 내지 약 60μM, 약 0.1μM 내지 약 50μM, 약 0.1μM 내지 약 40μM, 약 0.1μM 내지 약 30μM, 약 0.1μM 내지 약 20μM, 약 0.1μM 내지 약 10μM, 약 0.2μM 내지 약 10μM, 또는 약 0.3μM 내지 약 8μM이다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포를 포함하는 조성물(예: 세포 배양 배지)에 첨가되는 Cbl-b 억제제의 농도는 약 1pM, 약 2pM, 약 3pM, 약 4pM, 약 5pM, 약 10pM, 약 20pM, 약 30pM, 약 40pM, 약 50pM, 약 60pM, 약 70pM, 약 80pM, 약 90pM, 약 1nM, 약 3nM, 약 5nM, 약 10nM, 약 20nM, 약 40nM, 약 50nM, 약 80nM, 약 0.1μM, 약 0.2μM, 약 0.3μM, 약 0.4μM, 약 0.5μM, 약 1μM, 약 5μM, 약 10μM, 약 15μM, 약 20μM, 약 25μM, 약 30μM, 약 40μM , 약 50μM, 약 60μM, 약 70μM, 약 80μM, 약 90μM, 또는 약 100μM이다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포를 포함하는 조성물(예: 세포 배양 배지)에 첨가되는 Cbl-b 억제제의 농도는 약 0.3μM, 약 1μM 또는 약 4μM이다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포를 포함하는 조성물(예: 세포 배양 배지)에 첨가되는 Cbl-b 억제제의 농도는 약 1μM 또는 약 8μM이다.
유효량의 Cbl-b 억제제는 기준 샘플과 비교하여 면역 세포의 활성을 조절하기에 충분한 시간 동안 면역 세포와 접촉한다. 기준 샘플은 Cbl-b 억제제와 접촉되지 않는 면역 세포일 수 있지만, 면역 세포 및 Cbl-b 억제제를 포함하는 조성물(예: 세포 배양 배지)과 동일한 시간 동안 배양된다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제는 약 1분 내지 약 1시간, 약 5분 내지 약 1시간, 약 10분 내지 약 1시간, 약 15분 내지 약 1시간, 약 20분 내지 약 1시간, 약 30분 내지 약 1시간, 약 45분 내지 약 1시간, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 1시간 내지 약 4시간, 약 1시간 내지 약 6시간, 약 1시간 내지 약 8시간, 약 1시간 내지 약 12시간, 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 24시간, 약 6시간 내지 약 7시간, 약 6시간 내지 약 24시간, 약 8시간 내지 약 24시간, 약 10시간 내지 약 24시간, 약 15시간 내지 약 24시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 또는 약 36시간 내지 약 48시간 동안 면역 세포와 접촉되고/되거나 이와 함께 배양된다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제는 약 1분, 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 22시간, 또는 약 24시간 동안 면역 세포와 접촉되고/되거나 이와 함께 배양된다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제는 약 1일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 7일, 또는 약 6일 내지 약 7일 동안 면역 세포와 접촉되고/되거나 이와 함께 배양된다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제는 약 7일 내지 약 14일, 약 14일 내지 약 21일, 또는 약 21일 내지 약 28일 동안 면역 세포와 접촉되고/되거나 이와 함께 배양된다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제는 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6 일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 또는 약 14일 동안 면역 세포와 접촉되고/되거나 이와 함께 배양된다.
일부 구현예에서, 면역 세포 또는 면역 세포를 포함하는 세포 집단은 면역 세포의 증식, 확장, 활성화 및/또는 생존을 유도하기에 적절한 조건하에서 배양된다. 배양 동안 적절한 조건은 세포 배양 배지 중 하나 이상의 배지의 사용, 온도, 배양 시간, 자극제(예: 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체)의 존재, 및 성장 인자, 사이토카인, 케모카인 및/또는 재조합 가용성 수용체와 같은 임의의 다른 유익한 제제의 존재를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 면역 세포의 증식, 확장, 활성화 및/또는 생존을 유도하기에 적절한 조건은 면역 세포(예: NK-세포)를 활성화시킬 수 있는 제제를 포함하는 자극 조건의 제공을 포함한다. 예를 들어, T-세포의 증식, 확장, 활성화 및/또는 생존을 유도하기에 적절한 조건은 T-세포에서 세포내 신호전달을 활성화할 수 있는 자극 조건의 제공을 포함한다. T-세포의 완전한 활성화는 일반적으로 본원에서 "TCR"(신호 1)로서 지칭된 T-세포 수용체에 의한 항원의 인식 및 CD28(신호 2)과 같은 공자극 인자의 인식을 필요로 한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제는 T-세포에서 TCR 복합체 매개 세포내 신호전달 캐스케이드를 켜거나 개시한다. 예를 들어, 제1 제제는 T-세포를 활성화시키기 위해 TCR 복합체의 성분에 결합할 수 있고, 제2 제제는 T-세포의 표면 상의 공자극 분자에 결합하여 활성화된 T-세포를 자극할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 제제는 CD3에 특이적으로 결합함으로써 T-세포에서 TCR/CD3 복합체 관련 신호를 자극하였다(예: 항-CD3 항체). 추가 구현예에서, T-세포의 표면 상의 공자극 분자는 CD28일 수 있고, 제2 제제는 CD28에 특이적으로 결합한다(예: 항-CD28 항체). 이러한 제제는 항체, 2가 항체 단편, 및 결합 분자, 예를 들어, TCR 복합체 성분에 특이적인 것들(예: 항-CD3 항체) 및/또는 공자극 수용체에 특이적인 것들(예: 항-CD28 항체)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, CD3에 특이적으로 결합하는 제제는 항-CD3 항체, 항-CD3 항체의 2가 항체 단편(예: (Fab)2' 단편 또는 2가 scFv 단편), 항-CD3 항체의 1가 항체 단편(예: Fab 단편, Fv 단편 또는 scFv 단편) 또는 CD3 결합 분자(예: 압타머)이다. 일부 구현예에서, CD28에 특이적으로 결합하는 제제는 항-CD28 항체, 항-CD28 항체의 2가 항체 단편(예: (Fab)2' 단편 또는 2가 scFv 단편), 항-CD28 항체의 1가 항체 단편(예: Fab 단편, Fv 단편 또는 scFv 단편) 및 CD28 결합 분자(예: 압타머)이다. 본원에 제공된 하나 이상의 제제(예: 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체)는, 예를 들어, 비드와 같은 고체 지지체에 결합될 수 있거나 항-Fc 항체와 가교결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 확장 방법 단계는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체를 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지에 첨가되는 자극제는 IL-2, IL-7, IL-15, 및 IL-21 중 하나 이상과 같지만, 이에 제한지 않는 하나 이상의 사이토카인을 포함한다. 예를 들어, IL-2는 면역 세포 및 제제, 예를 들어, 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체를 포함하는 세포 배양 배지에 적어도 약 10 단위/mL의 농도로 첨가될 수 있다.
일부 구현예에서, T-세포의 증식, 확장, 활성화 및/또는 생존을 유도하기에 적절한 조건은 T-세포 수용체(TCR) 복합체 및 본원에 기재된 Cbl-b 억제제를 통해 세포내 신호전달을 활성화시킬 수 있는 자극 조건 또는 제제의 제공을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포 또는 면역 세포를 포함하는 세포 집단은 CD3에 특이적으로 결합함으로써 T-세포에서 TCR/CD3 복합체 관련 신호를 자극하는 제1 제제(예: 항-CD3 항체)와 함께 배양된다. 추가의 구현예에서, 면역 세포 또는 면역 세포를 포함하는 세포 집단은 CD3에 특이적으로 결합함으로써 T-세포에서 TCR/CD3 복합체-관련 신호를 자극하는 제1 제제(예: 항-CD3 항체), 공자극 분자 CD28에 결합하는 제2 제제(예: 항-CD28 항체), 및 Cbl-b 억제제와 함께 약 1pM 내지 약 100μM(예: 약 0.3μM, 약 1μM, 또는 약 4μM)의 농도로 배양된다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제의 존재하에서 T-세포의 증식, 확장, 활성화 및/또는 생존을 유도하기에 적합한 조건은 공자극 분자(예: CD28)를 통한 자극을 필요로 하지 않는다. T-세포를 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시키면, T-세포가 활성화 상태에 들어가는데 필요한 공자극의 필요성을 우회할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포 또는 면역 세포를 포함하는 세포 집단은 CD3에 특이적으로 결합함으로써 T-세포에서 TCR/CD3 복합체 관련 신호를 자극하는 제1 제제(예: 항-CD3 항체) 및 Cbl-b 억제제와 함께 약 0.001μM 내지 약 1,000μM, 약 0.01μM 내지 약 100μM, 약 0.1μM 내지 약 10μM, 또는 약 0.1μM 내지 약 50μM (예: 약 1μM 또는 약 8μM)의 농도로 배양된다.
면역 세포의 활성을 조절하는 방법의 일부 구현예에서, 면역 세포는 T-세포이고, T-세포의 활성을 조절하는 것은 T-세포 활성화의 증가 및/또는 T-세포 증식의 증가를 포함한다. 본원의 구현예에서 고려되는 T-세포는 항-CD3 항체와 같은 TCR 복합체의 성분에 결합하는 활성화제의 존재하 및 항-CD28 항체와 같은 공자극 분자에 결합하는 자극제의 존재하에서도 내성 상태일 수 있다. 일부 구현예에서, T-세포의 활성을 조절하는 방법은 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체의 존재하에 유효량의 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, T-세포의 활성을 조절하는 방법은 T-세포를 유효량의 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 T-세포는 이전에 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체와 접촉된다. 일부 구현예에서, 공자극 CD28 분자를 통한 자극은 T-세포의 활성을 조절하는 데(예: T-세포 활성화를 증가시키고/시키거나 T-세포 증식을 증가시키는 데) 필요하지 않다. 일부 구현예에서, T-세포의 활성을 조절하는 방법은 항-CD3 항체 단독의 존재하에 T-세포를 유효량의 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, T-세포의 활성을 조절하는 방법은 T-세포를 유효량의 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 T-세포는 이전에 T-세포를 활성화시키는 하나 이상의 제제(예: 항-CD3 항체)와 접촉되었고, 상기 제제는 CD28 공자극 분자를 자극하는 제제(예: 항-CD28 항체)를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 T-세포이고, T-세포의 활성을 조절하는 것은 증강된 T-세포 활성화 및/또는 증강된 T-세포 증식을 포함한다. 예를 들어, 본원의 구현예에서 고려되는 T-세포는 T-세포를 활성화시키는 제제(예: 항-CD3 항체)의 존재하, 및 일부 추가 구현예에서 T-세포를 자극하는 제제(예: 항-CD28 항체)의 존재하에서와 같은 활성화된 상태로 존재할 수 있다. T-세포를 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시키면, 활성화에 필요한 임계치를 낮출 수 있고, 따라서 활성화제(예: 항-CD3 항체)의 존재하 및 일부 추가의 구현예에서, 자극제(예: 항-CD28 항체)의 존재하에 있는 T-세포의 활성화 및/또는 증식을 증강시킬 수 있다. 일부 구현예에서, T-세포의 활성을 조절하는 방법은 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체의 존재하에 유효량의 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 T-세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, T-세포의 활성을 조절하는 방법은 T-세포를 유효량의 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 T-세포는 이전에 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체와 접촉되었다. 일부 구현예에서, 공자극 CD28 분자를 통한 자극은 T-세포의 활성을 조절하는 데(예: T-세포 활성화를 증강시키고/시키거나 T-세포 증식을 증강시키는 데) 필요하지 않다. 일부 구현예에서, T-세포의 활성을 조절하는 방법은 항-CD3 항체 단독의 존재하에 T-세포를 유효량의 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, T-세포의 활성을 조절하는 방법은 T-세포를 유효량의 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 T-세포는 이전에 T-세포를 활성화시키는 하나 이상의 제제(예: 항-CD3 항체)와 접촉되었다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 T-세포이고, T-세포의 활성을 조절하는 것은 감소된 T-세포 고갈, 감소된 T-세포 내성 및/또는 감소된 T-세포 아네르기를 포함하여 감소된 T-세포 기능 장애를 포함한다. T-세포 기능 장애의 일반적인 원리는 당업계에 익히 공지되어 있다(참조: 예를 들어, Schietinger et al., Trends Immunol., 35:51-60, 2014). 면역 내성은 면역계의 정상적인 기능의 일부인 과정이다. 항원 특이적 면역 내성은 항원에 대한 반응성의 감소를 특징으로 하며, 이는 그 항원에 대한 이전의 노출에 의해 유도된다. 특정 림프구(예: T-세포)가 항원을 만나면 림프구가 활성화되어 항원 특이적 면역 반응을 일으킬 수 있거나, 림프구(예: T-세포)가 비활성화되거나 제거되어 대신에 항원 특이적 면역 내성을 유도할 수 있다. 일부 측면에서, 내성은 클론 아네르기, 말초 클론 결실, T-세포의 억제 및/또는 다른 형태의 항원 특이적 내성에 의해 야기될 수 있다. 일부 구현예에서, 내성은 아네르기의 유도에 기인하거나 그에 의해 특성화될 수 있다. 일부 측면에서, 아네르기는 공자극의 부재하에 항원에 대한 T-세포의 노출로부터 발생할 수 있다. 공자극 신호의 부재하에 TCR 단독에 의한 연장된 항원 인식은 아네르기(즉, 기능적 무반응성)로 이어질 수 있다. 아네르기성 T-세포는 후속적 항원 챌린지에 불응성일 수 있고 다른 면역 반응을 억제할 수 있다. 일반적으로, 자연 환경에서 내성은 자기 항원에 대한 비반응성 또는 비생산적 반응성에 관여한다. 그러나, 일부 경우에, "비-자가" 항원에 대한 내성이 유발될 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 말초 조직에서 자가 항원을 인식하는 성숙한 T-세포가 이들 항원에 후속적으로 반응할 수 없게 되는 동일한 메커니즘은 또한 암 세포에 의해 발현되는 것들과 같은 외래 또는 "비-자가" 항원에 대한 비반응성을 조절할 수 있다. 따라서, 본원의 구현예에서 고려되는 T-세포는 CD28과 같은 공자극 분자에 결합하는 제제와 같은 자극제의 존재하에서도 내성 상태에 있을 수 있다. 본원에 제공된 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 T-세포를 접촉시키는 것은 T-세포 내성, T-세포 아네르기, 및/또는 T-세포 고갈과 같은 T-세포 기능 장애의 측면을 우회할 수 있다. 일부 구현예에서, T-세포의 활성을 조절하는(예: T-세포 내성을 감소시키고, T-세포 아네르기를 감소시키고/시키거나 T-세포 고갈을 감소시키는) 방법은 T-세포를 유효량의 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 본원의 방법의 일부 구현예에서, T-세포의 활성을 조절하는 것(예: T-세포 내성을 감소시키고, T-세포 아네르기를 감소시키고/시키거나 T-세포 고갈을 감소시키는 것)은 T-세포를 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체의 존재하에 유효량의 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 본원의 방법의 일부 구현예에서, T-세포의 활성을 조절하는(예: T-세포 내성을 감소시키고, T-세포 아네르기를 감소시키고/시키거나 T-세포 고갈을 감소시키는) 방법은 T-세포를 유효량의 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 T-세포는 이전에 항-CD28 항체와 조합하여 항-CD3 항체와 접촉되었다. 일부 구현예에서, 공자극 CD28 분자를 통한 자극은 T-세포의 활성을 조절하는 데(예: T-세포 내성을 감소시키고, T-세포 아네르기를 감소시키고/시키거나 T-세포 고갈을 감소시키는 데) 필요하지 않다. 본원의 방법의 일부 구현예에서, T-세포의 활성을 조절하는(예: T-세포 내성을 감소시키고, T-세포 아네르기를 감소시키고/시키거나 T-세포 고갈을 감소시키는) 방법은 T-세포를 항-CD3 항체 단독의 존재하에 유효량의 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, T-세포의 활성을 조절하는(예: T-세포 내성을 감소시키고, T-세포 아네르기를 감소시키고/시키거나 T-세포 고갈을 감소시키는) 방법은 T-세포를 유효량의 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 T-세포는 이전에 항-CD3 항체 단독과 같은 T-세포를 활성화시키는 하나 이상의 제제와 접촉되었다.
T-세포 활성화 및 T-세포 내성은 면역 반응을 조절하는 엄격하게 통제된 과정이다. 따라서, T-세포의 활성을 조절하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 T-세포의 조절 활성은 증가된 T-세포 활성화, 증가된 T-세포 증식, 감소된 T-세포 고갈, 및/또는 감소된 T-세포 내성을 포함한다. 일부 구현예에서, T-세포의 활성을 조절하는 방법(예: 증가된 T-세포 활성화, 증가된 T-세포 증식, 감소된 T-세포 고갈, 및/또는 감소된 T-세포 내성)은 T-세포를 유효량의 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 본원의 방법의 일부 구현예에서, T-세포 활성을 조절하는 것(예: T-세포 활성화를 증가시키고, T-세포 증식을 증가시키고, T-세포 고갈을 감소시키고/시키거나 T-세포 내성을 감소시키는 것)은 T-세포를 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체의 존재하에 유효량의 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 본원의 방법의 일부 구현예에서, T-세포의 활성을 조절하는(예: T-세포 활성화를 증가시키고, T-세포 증식을 증가시키고, T-세포 고갈을 감소시키고/시키거나 T-세포 내성을 감소시키는) 방법은 T-세포를 유효량의 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 T-세포는 이전에 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체와 접촉되었다. 일부 구현예에서, 공자극 CD28 분자를 통한 자극은 T-세포의 활성을 조절하는 데(예: T-세포 활성화를 증가시키고, T-세포 증식을 증가시키고, T-세포 고갈을 감소시키고/시키거나 T-세포 내성을 감소시키는 데) 필요하지 않다. 본원의 방법의 일부 구현예에서, T-세포의 활성을 조절하는(예: T-세포 활성화를 증가시키고, T-세포 증식을 증가시키고, T-세포 고갈을 감소시키고/시키거나 T-세포 내성을 감소시키는) 방법은 T-세포를 항-CD3 항체 단독의 존재하에 본원에 제공된 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, T-세포의 활성을 조절하는(예: T-세포 활성화를 증가시키고, T-세포 증식을 증가시키고, T-세포 고갈을 감소시키고/시키거나 T-세포 내성을 감소시키는) 방법은 T-세포를 유효량의 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 T-세포는 이전에 T-세포를 활성화시키는 하나 이상의 제제(예: 항-CD3 항체)와 접촉되었다.
본원의 방법의 일부 구현예에서, 증가된 T-세포 활성화는 활성화된 T-세포 미세환경(예: 골수 세포)에서 T-세포 또는 주변 면역 세포로부터 하나 이상의 사이토카인 생산의 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-18, TNFα, 및 GM-CSF를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-2, IFN-γ, TNFα 및 GM-CSF 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 케모카인이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 케모카인은 IP-10, 에오탁신, GRO 알파, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, MCP-1 및 MCP-3을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 사이토카인의 발현 증가는 ELISA로 측정될 수 있다.
본원의 방법의 일부 구현예에서, 증가된 T-세포 활성화는 하나 이상의 T-세포 활성화 마커의 증가된 세포 표면 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 T-세포 활성화 마커는 CD25, CD44, CD62L, CD69, CD152(CTLA4), CD154, CD137, 및 CD279를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, T-세포 활성화 마커는 CD25, CD69 및 CTLA4 중 하나 이상이다. 세포 표면 마커의 발현 증가는 FACS로 측정될 수 있다.
증가된 T-세포 활성화, 증가된 T-세포 증식, 감소된 T-세포 고갈, 및/또는 감소된 T-세포 내성을 실험적으로 결정하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 일부 구현예에서, T-세포 활성화를 결정하는 대표적인 방법은 본원에 제공된 생물학적 실시예 2에서 찾을 수 있다. 일부 구현예에서, 증가된 T-세포 활성화, 증가된 T-세포 증식, 감소된 T-세포 고갈, 및/또는 감소된 T-세포 내성을 결정하는 대표적인 시험관내 및 생체내 방법이 본원에 제공된 생물학적 실시예 3에서 찾을 수 있다.
면역 세포의 활성을 조절하는 방법의 일부 구현예에서, 면역 세포는 B-세포이고, B-세포의 조절 활성은 증가된 B-세포 활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 B-세포 활성화는 하나 이상의 B-세포 활성화 마커의 증가된 세포 표면 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 B-세포 활성화 마커는 CD69, CD86 및 MHC 부류 II(예: HLA-DR)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, B-세포 활성화 마커는 CD69이다. 세포 표면 마커의 발현 증가는 FACS로 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 증가된 B-세포 활성화는 ERK, JNK, 및 Syk에 의해 매개되는 것들과 같은 신호 전달 경로에서 단백질의 증가된 활성화를 포함한다. 상기 단백질의 활성화의 증가는 당업계에서 이용가능한 항인산화 항체와 같은 시약을 사용하여 단백질 상에서 인산화 수준의 측정에 의해 검출될 수 있다.
면역 세포의 활성을 조절하는 방법의 일부 구현예에서, 면역 세포는 NK-세포이고, NK-세포의 조절 활성은 증가된 NK-세포 활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 NK-세포 활성화는 하나 이상의 사이토카인의 분비를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IFN-γ, TNFα 및 MIP-1β를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 사이토카인의 발현 증가는 ELISA로 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 증가된 NK-세포 활성화는 하나 이상의 NK-세포 활성화 마커의 증가된 세포 표면 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 NK-세포 활성화 마커는 CD69 및 CD107a를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 세포 표면 마커의 발현 증가는 FACS로 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, NK-세포 활성화의 증가는 원발성 종양 세포를 포함하는 종양 세포와 같은 표적 세포, 및 K562 세포주와 같은 세포주 유래 종양 세포의 사멸 증가를 포함한다.
증가된 B-세포 활성화 및 NK-세포 활성화를 실험적으로 결정하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다(참조: 예를 들어, Fauriat et al., Blood. 115: 2167-76, 2010; Beano et al., J. Transl. Med. 6: 25, 2008; Claus et al., J. Immunol. Methods, 341: 154-64, 2009; and Fujisaki et al., Cancer Res. 69: 4010-4017, 2009). 일부 구현예에서, B-세포 활성화를 결정하는 대표적인 방법은 본원에 제공된 생물학적 실시예 3에서 찾을 수 있다. 일부 구현예에서, NK-세포 활성화를 결정하는 대표적인 방법은 본원에 제공된 생물학적 실시예 3에서 찾을 수 있다.
T-세포, B-세포 또는 NK-세포와 같은 면역 세포의 활성 조절은 관심 파라미터(예: 사이토카인 분비)의 기준선 값을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, Cbl-b 억제제와 접촉된 세포의 시험관내 실험으로부터 수득된 샘플에서와 같은 T-세포 활성화는 기준선 값을 결정하기 위해 상기 Cbl-b 억제제와 접촉 또는 투여 전에 측정될 수 있다. 이어서, 상기 Cbl-b 억제제와 접촉 또는 투여한 후 T-세포 활성화에 대한 참조 값이 수득된다. Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물의 접촉 또는 투여로 인한 T-세포 활성화의 양을 결정하기 위해, 참조 값을 기준선 값과 비교한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 면역 세포(예: T-세포) 활성화는 기준선 값과 비교하여 샘플에서 적어도 0.1배 증가되고, 여기서 기준선 값은 면역 세포(예: T-세포)와 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물을 접촉시키기 전에 수득된다. 일부 구현예에서, 면역 세포(예: T-세포) 활성화는 기준선 값에 비해 적어도 약 0.1배, 약 0.2배, 약 0.3배, 약 0.4배, 약 0.5배, 약 0.6배, 약 0.7배, 약 0.8배, 약 0.9배, 약 1배, 약 2배, 약 4배, 약 6배, 약 8배, 약 10배, 약 20배, 약 30배, 약 40배, 약 50배, 약 75배, 또는 약 100배(예: 약 0.1배 내지 약 100배, 또는 약 1배 내지 약 100배) 증가된다. 면역 세포 활성화는 사이토카인 분비의 증가, 활성화 마커(예: 세포 표면 마커)의 세포 표면 발현의 증가, 또는 다운스트림 신호 전달 경로에서 단백질의 인산화 증가와 같은 활성화의 생물학적 마커를 측정함으로써 평가될수 있다. 면역 세포의 활성화를 나타내는 기준선 값에 대한 배수는 시험되는 파라미터 및 면역 세포가 처리되는 조건에 대해 결정될 수 있다. 예를 들어, T-세포 활성화를 측정하기 위해, 기준선 값은 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체로 자극된 T-세포로부터 수득될 수 있고, 여기서 세포는 Cbl-b 억제제와 함께 배양되지 않는다. 이어서, 참조 값은 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체로 자극된 T-세포로부터 수득되고, 여기서 T-세포는 Cbl-b 억제제와 접촉되었거나 접촉되어 있다. 이어서, 면역 세포 활성화에 대한 양성 반응은 수득된 참조 값에 의해 결정될 수 있다. 유사한 참조 값 측정치를 수득하여 T-세포 활성화, T-세포 증식, T-세포 고갈, T-세포 내성, B-세포 활성화 및/또는 NK-세포 활성화를 평가하기 위해 기준선 값과 비교할 수 있다. 이들 파라미터의 측정치는 당업계에 익히 공지된 기술, 및 생물학적 실시예 2 및 3에 제공된 기술을 이용하여 수득될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "기준선" 또는 "기준선 값"은 본원에 개시된 치료제(예: 본원에 기재된 Cbl-b 억제제를 포함하는 조성물)의 투여 전 또는 치료제의 투여 개시시의 측정치 또는 특성을 지칭할 수 있다. 기준선 값은 면역 세포 기능의 증가 또는 감소(예: T-세포 활성화의 증가, T-세포 증식의 증가, T-세포 고갈의 감소, 및/또는 T-세포 내성의 감소)를 결정하기 위해 참조 값과 비교될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "참조" 또는 "참조 값"은 본원에 개시된 치료제(예: 본원에 기재된 Cbl-b 억제제를 포함하는 조성물)의 투여 후 측정치 또는 특성을 지칭할 수 있다. 참조 값은 실험 시간 과정, 투여 섭생, 또는 치료 사이클 동안, 또는 실험 시간 과정, 투여 섭생, 또는 치료 사이클의 완료시에 1회 이상 측정될 수 있다. "참조값"은 절대값, 상대 값, 상한치 및/또는 하한치를 갖는 값, 값의 범위, 평균값, 중앙값, 평균값, 또는 기준선 값과 비교된 값일 수 있다. 유사하게, "기준선 값"은 절대값, 상대 값, 상한치 및/또는 하한치를 갖는 값, 값의 범위, 평균값, 중앙값, 평균값 또는 참조 값과 비교된 값일 수 있다. 참조 값 및/또는 기준선 값은 하나의 샘플(예: 개체로부터 수득된 하나의 샘플), 2개의 상이한 샘플(예: 2명의 상이한 개체로부터 수득된 샘플) 또는 샘플의 그룹(예: 2, 3, 4, 5명 이상의 개체의 그룹으로부터 수득된 샘플)으로부터 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, Cbl-b 억제제의 존재하에 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체로 자극된 T-세포에 의한 사이토카인 분비(예: IL-2 분비)에 의해 측정된 T-세포 활성화에 대한 양성 반응은 Cbl-b 억제제의 부재하에 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체로 자극된 T-세포로부터 수득된 사이토카인 분비(예: IL-2 분비)의 기준선 값의 적어도 2.5배이다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제의 존재하에 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체로 자극된 T-세포에 의한 표면 마커 발현(예: CD25 표면 마커 염색)에 의해 측정된 T-세포 활성화에 대한 양성 반응은 Cbl-b 억제제의 부재하에 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체로 자극된 T-세포로부터 수득된 표면 마커 발현(예: CD25 표면 마커 염색)의 기준선 값의 적어도 1.3배이다. 일부 구현예에서, 기준선 값은 항-CD3 항체 단독으로 자극된 T-세포로부터 수득될 수 있고, 여기서 세포는 Cbl-b 억제제와 함께 배양되지 않는다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제의 존재하에 항-CD3 항체 단독으로 자극된 T-세포에 의한 사이토카인 분비(예: IL-2 분비)에 의해 측정된 T-세포 활성화에 대한 양성 반응은 Cbl-b 억제제의 부재하에 항-CD3 항체 단독으로 자극된 T-세포로부터 수득된 사이토카인 분비(예: IL-2 분비)의 기준선 값의 적어도 0.1배이다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제의 존재하에 항-CD3 항체 단독으로 자극된 T-세포에 의한 표면 마커 발현(예: CD25 표면 마커 염색)에 의해 측정된 T-세포 활성화에 대한 양성 반응은 Cbl-b 억제제의 부재하에 항-CD3 항체 단독으로 자극된 T-세포로부터 수득된 표면 마커 발현(예: CD25 표면 마커 염색)의 기준선 값의 적어도 0.6배이다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물의 유효량의 존재하에 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 배양하여 면역 세포의 활성을 조절하고, 이에 의해 변형된 면역 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 변형된 면역 세포를 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T-세포, B-세포, 또는 자연 살해(NK) 세포이다.
변형된 면역 세포를 생산하는 방법의 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포는 조혈 세포, 다능성 줄기 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, T-세포, B-세포, 및 NK-세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 면역 세포를 면역 세포에 의해 발현되는 활성화 단백질에 결합하는 사이토카인 또는 항체(예: 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체)와 같은 자극제와 함께 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포는 면역 세포를 함유하는 세포 집단 내에 있고, 여기서 세포 집단은 개체로부터의 샘플로서 수득된다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포는 면역 세포를 함유하는 세포 집단 내에 있고, 여기서 세포 집단은 개체로부터의 생물학적 샘플(예: 혈액 샘플, 골수 샘플 등)을 배양함으로써 수득된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉시킴으로써 변형되어, 변형된 면역 세포를 생산한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 조혈 세포, 다능성 줄기 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, T-세포, B-세포 및 NK-세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 변형된 면역 세포와 동일한 세포 유형이다. 예를 들어, 면역 세포는 불활성 T-세포일 수 있고, 변형된 면역 세포는 활성화된 T-세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 변형된 면역 세포와 상이한 세포 유형이다. 예를 들어, 면역 세포는 조혈 줄기 세포일 수 있고, 변형된 면역 세포는 조혈 줄기 세포로부터 분화된 NK-세포일 수 있다. 변형된 면역 세포를 생산하는 방법의 일부 구현예에서, 상기 방법은 변형된 면역 세포를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포를 함유하는 세포 집단, 면역 세포 또는 변형된 면역 세포는 개체(예: 인간)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 면역 세포 또는 변형된 면역 세포는 각각 인간 면역 세포 또는 인간 변형된 면역 세포이다.
유효량의 Cbl-b 억제제의 존재하에 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 배양하여 면역 세포의 활성을 조절함으로써 변형된 면역 세포를 생산하는 것과 같은 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생산된 변형된 면역 세포가 본원에 추가로 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 Cbl-b 억제제는 세포막 투과성이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 제공된 변형된 면역 세포는 변형된 면역 세포의 세포질에서와 같이 본원에 기재된 Cbl-b 억제제를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 단리된 변형된 면역 세포가 본원에 제공되고, 여기서 변형된 면역 세포는 본원에 기재된 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉되었거나 접촉되어 있다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 T-세포, B-세포, 또는 자연 살해(NK) 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 조혈 세포, 다능성 줄기 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, T-세포, B-세포, 또는 NK-세포이다.
단리된 변형된 면역 세포의 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 T-세포이고, T-세포는 T-세포 활성화의 증가, T-세포 증식의 증가, T-세포 고갈의 감소, 및/또는 T-세포 내성의 감소를 나타낸다. 일부 구현예에서, 증가된 T-세포 활성화는 활성화된 T-세포 미세환경(예: 골수 세포)에서 T-세포 또는 주변 면역 세포로부터 하나 이상의 사이토카인의 생산 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-18, TNFα 및 GM-CSF를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-2, IFN-γ, TNFα 및 GM-CSF로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 케모카인이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 케모카인은 IP-10, 에오탁신, GRO 알파, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, MCP-1 및 MCP-3을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 증가된 T-세포 활성화는 하나 이상의 T-세포 활성화 마커의 증가된 세포 표면 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 T-세포 활성화 마커는 CD25, CD44, CD62L, CD69, CD152(CTLA4), CD154, CD137, 및 CD279를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 T-세포 활성화 마커는 CD25, CD69, 및 CTLA4를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, T-세포 활성화 마커는 CD25 및/또는 CD69이다. 일부 구현예에서, T-세포는 항-CD3 항체와 접촉되었거나 접촉되어 있다. 일부 구현예에서, T-세포는 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체와 접촉되었거나 접촉되어 있다.
단리된 변형된 면역 세포의 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 NK-세포이고, NK-세포는 증가된 NK-세포 활성화를 나타낸다. 일부 구현예에서, NK-세포 활성화의 증가는 하나 이상의 사이토카인(예: IFN-γ, TNFα 및/또는 MIP-1β)의 분비 증가를 포함한다. 일부 구현예에서, 증가된 NK-세포 활성화는 하나 이상의 NK-세포 활성화 마커(예: CD69 및/또는 CD107a)의 증가된 세포 표면 발현을 포함한다.
단리된 변형된 면역 세포의 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 B-세포이고, B-세포는 증가된 B-세포 활성화를 나타낸다. 일부 구현예에서, 증가된 B-세포 활성화는 하나 이상의 B-세포 활성화 마커(예: CD69, CD86 및/또는 HLA-DR)의 증가된 세포 표면 발현을 포함한다.
본원에 제공된 방법 또는 변형된 면역 세포의 임의의 구현예 중 일부에서, 면역 세포 또는 변형된 면역 세포는 포유류 세포(예: 인간 세포)이다. 일부 구현예에서, 면역 세포 또는 변형된 면역 세포는 인간 세포이다.
일부 측면에서, 배양은 문헌(참조: 미국 특허 제6,040,177호; Klebanoff et al., J Immunother., 35: 651-660, 2012; Terakura et al., Blood, 119: 72-82, 2012; 및 Wang et al., J Immunother., 35: 689-701. 2012)에 기재된 것들과 같은 기술에 따라 수행된다.
본원에 제공된 변형될 면역 세포 또는 변형된 면역 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 재조합 키메라 수용체를 발현하도록 조작(engineering)될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 N-말단에서 C-말단까지 세포외 리간드 결합 도메인, 막관통 도메인, 세포내 공자극 도메인, 및 활성화 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 N-말단에서 C-말단까지 세포외 리간드 결합 도메인, 막관통 도메인 및 활성화 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 면역 세포는 본원에 제공된 Cbl-b 억제제와의 접촉 전, 도중 또는 후에 재조합 키메라 수용체(예: CAR)를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형될 면역 세포는 T-세포(예: CD4+ T-세포 또는 CD8+ T-세포)이다. 추가의 구현예에서, T-세포는 CAR과 같은 재조합 키메라 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 변형된 T-세포(예: CD4+ T-세포 또는 CD8+ T-세포)이다. 추가의 구현예에서, 변형된 T-세포는 CAR과 같은 재조합 키메라 수용체를 포함한다. 재조합 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포를 생산하는 방법은 벡터(예: 바이러스 벡터)를 통해 면역 세포(예: T-세포)에 재조합 키메라 수용체(예: CAR)를 인코딩하는 핵산의 도입에 의해서와 같이 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 제WO 2017/096329호 및 미국 공보 제US 2017/0204372호를 참조한다.
특히, 본 개시내용은 림프구의 확대된 집단을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 암을 갖는 개체로부터 림프구를 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계로서, 상기 개체가 단일 요법으로서 또는 병용 요법의 일부로서 Cbl-b 억제제의 유효량을 투여받았거나 투여받고 있는, 단계, 및 (b) 적어도 하나의 T-세포 성장 인자를 포함하는 세포 배양 배지에서 림프구를 배양하여 림프구의 확대된 집단을 생산하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 림프구는 종양 침윤성 림프구(TIL)이다. 특정 구현예에서, 림프구는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 T-세포 성장 인자는 IL-2, IL-7, IL-15, 및 IL-21로 이루어진 그룹 중 하나 이상을 포함하며, 임의로 적어도 하나의 T-세포 성장 인자는 IL-2를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 항-CD3 항체, 또는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 둘 다를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 Cbl-b 억제제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 조사된 피더 세포(irradiated feeder cell)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 개체는 인간 환자이다. 또한, 상기 언급된 방법에 의해 생산된 TIL의 확대된 집단 및 생리학적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 조성물이 본 개시내용에 의해 제공된다.
일부 구현예에서, 변형될 또는 변형된 면역 세포(즉, 변형된 면역 세포)의 단리 및 처리를 위한 방법은 단리, 배양(예: Cbl-b 억제제와 함께 배양) 및/또는 조작(예: 면역 세포에 재조합 키메라 수용체를 인코딩하는 핵산의 도입) 전 또는 후에 세포를 동결시키는(예: 동결보존하는) 단계를 포함한다. 당업계에 공지된 다양한 동결 용액 및 파라미터가 사용될 수 있다.
B. 입양 세포 요법
본원에 기재된 방법에 의해 생산된 림프구의 확대 집단과 같은 변형된 면역 세포, 또는 이의 조성물은 암을 갖는 개체와 같은 이를 필요로 하는 개체의 치료 방법에서 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 치료 방법은 입양 세포 요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 본원에 기재된 바와 같이 개체로부터 세포를 단리시키고, 이들을 제조, 처리, 배양 및/또는 조작하고, 동결보존 전 또는 후에 이들을 동일한 개체에 재도입하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 방법은 본원에 기재된 바와 같이 개체로부터 세포를 단리시키고, 이들을 제조, 처리, 배양 및/또는 조작하고, 동결보존 전 또는 후에 이들을 상이한 개체에 재도입하는 단계를 포함한다.
따라서, 일부 측면에서, 개체에서 면역 반응을 조절하는 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 본원에 기재된 변형된 면역 세포 또는 이의 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체(예: T-세포 기능 장애 장애를 갖는 개체)에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 개체는 암을 갖는다. 일부 구현예에서, Cbl-b 활성의 억제에 반응성인 암을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에 기재된 변형된 면역 세포 또는 이의 조성물의 유효량을 Cbl-b 활성의 억제에 반응성인 암을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 비정상적 세포 증식을 억제하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에 기재된 변형된 면역 세포 또는 이의 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "비정상적 세포 증식"은 과형성(hyperplasia) 또는 암 세포 증식을 포함한다. 암 세포는 혈액암 또는 비혈액암으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 림프종, 백혈병 또는 골수종과 같은 혈액암이다. 다른 구현예에서, 암 세포는 육종, 암종, 또는 흑색종과 같은 비혈액암으로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 암 또는 T-세포 기능 장애 장애를 갖는 개체와 같은 치료를 필요로 하는 개체는 본원에 제공된 변형된 면역 세포를 포함하는 조성물이 약 100만 내지 약 1000억 개의 세포의 범위, 예를 들어, 100만 내지 약 500억 개의 세포(예: 약 500만 개의 세포, 약 2500만 개의 세포, 약 5억 개의 세포, 약 10억 개의 세포, 약 50억 개의 세포, 약 200억 개의 세포, 약 300억 개의 세포, 약 400억 개의 세포, 또는 상기 값 중 임의의 2개로 정의된 범위), 예를 들어, 약 1,000만 내지 약 1,000억 개의 세포(예: 약 2,000만 개 세포, 약 3,000만 개 세포, 약 4,000만 개 세포, 약 6,000만 개 세포, 약 7,000만 개 세포, 약 8,000만 개 세포, 약 9,000만 개 세포, 약 100억 개 세포, 약 250억 개 세포, 약 500억 개 세포, 약 750억 개 세포, 약 900억 개 세포, 또는 상기 값 중 임의의 2개로 정의되는 범위), 일부 경우에, 약 1억 개 세포 내지 약 500억 개 세포(예: 약 1억 2000만 개 세포, 약 2억 5000만 개 세포, 약 3억 5000만 개 세포, 약 4억 5000만 개 세포, 약 6억 5000만 개 세포, 약 8억 개 세포, 약 9억 개 세포, 약 30억 개 세포, 약 300억 개 세포, 약 450억 개 세포) 또는 이들 범위 사이의 임의의 값으로 투여된다.
변형된 면역 세포 및 이의 조성물은 표준 투여 기술, 제형 및/또는 장치를 사용하여 투여된다. 조성물의 저장 및 투여를 위한 주사기 및 바이알(vial)과 같은 제형 및 장치가 제공된다. 변형된 면역 세포를 포함하는 제형 또는 약제학적 조성물은 정맥내, 복강내, 피하, 또는 근육내 투여를 위한 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 비경구적 투여된다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하, 및 복강내 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 사용하여 대상체에게 투여된다. 변형된 면역 세포의 조성물은 무균 액체 제제, 예를 들어, 등장성 수용액, 현탁액, 유액, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공될 수 있으며, 이는 일부 측면에서, 선택된 pH로 완충될 수 있다. 점성 조성물은 특정 조직과의 더 긴 접촉 기간을 제공하기 위해 적절한 점도 범위 내에서 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은, 예를 들어, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 멸균 주사 가능한 용액은, 예를 들어, 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제, 예를 들어, 멸균수, 생리 식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과의 혼합물로 변형된 면역 세포를 용매에 혼입시킴으로써 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 하나 이상의 추가의 치료제와 동시 투여되거나, 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여된다. 예를 들어, 본 개시내용의 일부 치료 섭생에서, 변형된 면역 세포 및 Cbl-b 억제제 둘 다는 이를 필요로 하는 포유류 대상체(mammalian subject)에게 투여되며, 여기서 Cbl-b 억제제는 화학식 I, I-a, I-b, I-A 내지 I-J, II-A 내지 II-H, III-A 내지 III-H 또는 IV-A 내지 IV-H의 화합물, 또는 이의 임의의 변형이다. 따라서, 일부 구현예에서, 치료 섭생은 입양 세포 요법 및 화학 요법 둘 모두를 포함한다.
변형된 면역 세포가 개체(예: 인간)에게 투여된 후, 변형된 면역 세포 집단의 생물학적 활성은 당업계에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 평가할 파라미터는 생체내(예: 이미징에 의해) 또는 생체외(예: ELISA 또는 유세포 계측법에 의해)에서 변형된 면역 세포 또는 다른 면역 세포의 항원에 대한 특이적 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 파괴하는 변형된 면역 세포의 능력은 세포독성 검정을 사용하여 측정될 수 있다(참조: 예를 들어, Kochenderfer et al., J. Immuntherapy, 32:689-702, 2009; 및 Herman et al. J. Immunological Methods, 285: 25-40, 2004). 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포의 생물학적 활성은 또한 IL-2 및 IFNγ와 같은 특정 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 검정함으로써 측정될 수 있다.
C. Cbl-b 억제제의 투여
일부 측면에서, Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물은 면역 반응을 조절하고, 질환 또는 상태(예: 암 및/또는 비정상적 세포 증식)를 치료하고/하거나 개체에서 Cbl-b 활성을 억제하기 위해 개체에게 직접 투여될 수 있다. Cbl-b 억제제는 표 1의 화합물, 이의 호변이성체 또는 전술한 것 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 반응을 조절하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에 제공된 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물의 유효량을 개체에게 투여하여 개체에서 면역 반응을 조절하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 개체는 본원에 기재된 혈액암 또는 비혈액암과 같은 암을 갖는다.
일부 구현예에서, Cbl-b 활성의 억제에 반응성인 암을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에 제공된 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물의 유효량을 개체에게 투여하여 Cbl-b 활성의 억제에 반응성인 암을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 본원에 기재된 것과 같은 혈액암 또는 비혈액암이다.
일부 구현예에서, 비정상적 세포 증식(예: 과형성)을 억제하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에 제공된 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물의 유효량을 개체에게 투여하여 개체에서 비정상적 세포 증식을 억제하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, Cbl-b 활성을 억제하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에 제공된 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물의 유효량을 개체에게 투여하여 개체에서 Cbl-b 활성을 억제하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 이를 필요로 하는 개체(예: T-세포 기능 장애 장애를 갖는 개체)에서 면역 반응의 조절, 개체에서 질환 또는 상태(예: 개별 암 및/또는 비정상적 세포 증식)의 치료 및/또는 개체에서 Cbl-b 활성의 억제에서, 활성제의 적절한 용량은 상기 정의된 바와 같이 치료될 상태, 질환 또는 장애의 유형, 상태, 질환 또는 장애의 중증도 및 과정, 제제가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 요법, 대상체의 임상 병력 및 Cbl-b 억제제에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의존할 것이다.
Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물은 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 개체에게 적절하게 투여된다. 일부 구현예에서, 치료는 Cbl-b 억제제 또는 조성물의 다중 투여를 포함하며, 여기서 투여 사이의 간격은 다양할 수 있다. 예를 들어, 제1 투여와 제2 투여 사이의 간격은 약 1개월이고, 후속 투여 사이의 간격은 약 3개월이다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제는 균일한 투여량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 Cbl-b 억제제는 개체의 체중(예: mg/kg)에 기초한 고정 투여량으로 개체에게 투여된다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 암은 혈액암이다. 예를 들어, 혈액암은 림프종, 백혈병 또는 골수종일 수 있다. 본 개시내용의 다른 양태에서, 암은 비혈액 암이다. 특히, 비혈액암은 암종, 육종 또는 흑색종일 수 있다.
일부 구현예에서, Cbl-b 억제제는 하나 이상의 추가의 치료제와 동시 투여되거나, 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여된다. 예를 들어, 본 개시내용의 일부 치료 섭생에서, Cbl-b 억제제 및 변형된 면역 세포는 둘 모두 이를 필요로 하는 포유류 대상체에게 투여되며, 여기서 Cbl-b 억제제는 화학식 I, I-a, I-b, I-A 내지 I-J, II-A 내지 II-H, III-A 내지 III-H 또는 IV-A 내지 IV-H의 화합물 또는 이의 임의의 변형이다. 따라서, 일부 구현예에서, 치료 섭생은 입양 세포 요법 및 화학 요법 둘 모두를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원의 방법(예: 개체에서 면역 반응을 조절하는 방법)에서 Cbl-b 억제제 투여의 효능은 처리된 개체로부터 단리된 샘플(예: 혈액 샘플)에 존재하는 면역 세포의 생물학적 활성을 측정함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 세포 독성 검정에서 표적 세포를 파괴하는 Cbl-b 억제제로 치료 후 개체에서 단리된 면역 세포의 능력을 측정하여 치료 효능을 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플(예: 혈액 샘플)에 존재하는 면역 세포의 생물학적 활성은 IL-2 및 IFNγ와 같은 특정 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 검정함으로써 측정될 수 있다.
본 개시내용은 암을 갖는 개체에게 유효량의 Cbl-b 억제제를 투여하는 단계 및 유효량의 추가의 치료제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 유효량의 Cbl-b 억제제를 개체에게 투여하는 단계 및 유효량의 추가의 치료제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 추가로, 본 개시내용은 유효량의 Cbl-b 억제제를 개체에게 투여하는 단계 및 유효량의 추가의 치료제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 항암 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 유효량의 Cbl-b 억제제를 암을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 추가로 제공되며, 여기서 개체는 유효량의 추가의 치료제를 투여받았거나 투여받고 있다.
이전 단락의 방법의 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제 및 추가의 치료제는 임의의 순서로 연속적으로 투여된다. 본원에서 사용되는 용어 "연속적으로", "연속으로" 및 "순차적으로"는 추가의 치료제 후에 Cbl-b 억제제의 투여, 또는 Cbl-b 억제제 후에 추가의 치료제의 투여를 지칭한다. 예를 들어, 연속적 투여는 추가의 치료제의 투여를 포함하는 유도 후 치료 단계가 이어지는 유도 단계(1차 요법) 동안 추가의 치료제의 부재하에 Cbl-b 억제제의 투여를 포함할 수 있다. 상기 방법은 Cbl-b 억제제 또는 추가의 치료제의 투여를 포함하는 유지 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 연속적 투여는 Cbl-b 억제제의 투여를 포함하는 유도 후 치료 단계가 이어지는 유도 단계(1차 요법) 동안 Cbl-b 억제제의 부재하에 추가의 치료제의 투여를 포함할 수 있다. 상기 방법은 Cbl-b 억제제 또는 추가의 치료제의 투여를 포함하는 유지 단계를 추가로 포함할 수 있다.
병용 요법 방법의 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제 및 추가의 치료제가 동시에 투여된다. 본원에서 사용되는 용어 "동시에", "동시에" 및 "병렬로"는 동일한 의사의 진찰 중 또는 동일한 치료 단계 동안 Cbl-b 억제제 및 추가의 치료제의 투여를 지칭한다. 예를 들어, Cbl-b 억제제 및 추가의 치료제는 둘 모두 유도 단계, 치료 단계 및 유지 단계 중 하나 이상 동안 투여될 수 있다. 그러나, 동시 투여는 Cbl-b 억제제 및 추가의 치료제가 단일 제형 또는 약제학적 조성물에 함께 존재하거나 Cbl-b 억제제 및 추가의 치료제가 정확하게 동시에 투여될 것을 요구하지 않는다.
1. Cbl-b 억제제와 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 병용 요법
본 개시내용의 병용 요법 방법의 일부 구현예에서, 추가의 치료제는 면역 체크포인트 억제제를 포함한다. 용어 "면역 체크포인트"는 면역 세포의 활성화를 방지하는 신호전달 경로를 지칭하는 반면, 용어 "면역 체크포인트 억제제"는 면역 체크포인트를 방해하여 면역 세포의 활성화에 대한 브레이크를 제거하는 화합물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 적어도 하나의 억제성 체크포인트 분자의 길항제이다. 특정 구현예에서, 억제성 체크포인트 분자는 PD-1 (CD279), PD-L1 (CD274), CTLA-4 (CD125), LAG3 (CD223), PVR (CD155), PVRL2 (CD112), PVRL3 (CD113), TIGIT, TIM3 (CD366) 및 VISTA로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1 (CD279), PD-L1 (CD274) 및 CTLA-4 (CD152)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 억제성 체크포인트 분자의 길항제이다.
PD-1은 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)을 지칭한다. 본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도에 적합한 PD-1 길항제는 암 세포 또는 항원 제시 세포(antigen presenting cell) 상에서 발현된 PD-L1의 림프구(T-세포, B-세포 및/또는 NK-세포) 상에서 발현된 PD-1에의 결합을 차단하는 임의의 화학적 화합물 또는 생물학적 분자를 포함한다. PD-1 및 이의 리간드의 대체 명칭 또는 동의어는 PD-1의 경우 CD279, PDCD1, PD1 및 SLEB2를 포함하고, 프로그램된 세포 사멸 1 리간드 1(PD-L1)의 경우 CD274, PDCD1L1, PDL1, B7H1, B7-4 및 B7-H를 포함한다. 인간 대상체가 치료되는 일부 구현예에서, PD-1 길항제는 인간 PD-L1의 인간 PD-1에 대한 결합을 차단한다. 성숙한 형태의 인간 PD-1의 아미노산 서열은 NCBI 유전자좌 번호 NP_005009의 잔기 21-288로서 제시된다. 성숙한 형태의 인간 PD-L1의 아미노산 서열은 NCBI 유전자좌 번호 NP_054862의 잔기 19-290으로서 제시된다.
CTLA-4는 세포독성 T 림프구 관련 단백질 4를 지칭한다. 본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도에 적합한 CTLA-4 길항제는 림프구(T-세포, B-세포 및/또는 NK-세포) 상에서 발현된 CTLA-4의 항원 제시 세포 상에서 발현된 리간드(CD80 및/또는 CD86)에의 결합을 차단하는 임의의 화학적 화합물 또는 생물학적 분자를 포함한다. CTLA-4의 대체 명칭 또는 동의어는 CD152, CTLA4, ALPS5, CELIAC3, GRD4, GSE 및 IDDM12를 포함한다. 인간 대상체가 치료되는 일부 구현예에서, CTLA-4 길항제는 인간 CTLA-4의 인간 리간드에의 결합을 차단한다. 성숙한 형태의 인간 CTLA-4의 아미노산 서열은 NCBI 유전자좌 번호 NP_005205의 잔기 36-223으로서 제시된다.
LAG3은 림프구 활성화 유전자 3 단백질을 지칭한다. 본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도에 적합한 LAG3 길항제는 림프구(T-세포, B-세포 및/또는 NK-세포) 상에서 발현되는 LAG3의 항원 제시 세포 상에서 발현된 리간드(MHC 부류 II)에의 결합을 차단하는 임의의 화학적 화합물 또는 생물학적 분자를 포함한다. LAG3은 CD223으로도 공지되어 있다. 인간 대상체가 치료되는 일부 구현예에서, LAG3 길항제는 인간 LAG3의 인간 리간드에의 결합을 차단한다. 성숙한 형태의 인간 LAG3의 아미노산 서열은 NCBI 유전자좌 번호 NP_002277의 잔기 23-525로서 제시된다.
PVR은 폴리오바이러스 수용체를 지칭한다. 본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도에 적합한 PVR 길항제는 암 세포 또는 항원 제시 세포 상에서 발현되는 PVR의 림프구(T-세포, B-세포, 및/또는 NK-세포) 상에서 발현되는 TIGIT에의 결합을 차단하는 임의의 화학적 화합물 또는 생물학적 분자를 포함한다. PVR의 대체 명칭 또는 동의어는 CD155, PVS, HVED, NECL5, 넥틴-유사 단백질 5 및 TAGE4를 포함한다. 인간 대상체가 치료되는 일부 구현예에서, PVR 길항제는 인간 PVR의 인간 TIGIT에의 결합을 차단한다. 인간 PVR의 복수의 이소형이 있다. 인간 PVR의 알파 이소형의 아미노산 서열은 NCBI 유전자좌 번호 NP_006496에 제시된다. 인간 PVR의 베타 이소형의 아미노산 서열은 NCBI 유전자좌 번호 NP_001129240에 제시된다. 인간 PVR의 감마 이소형의 아미노산 서열은 NCBI 유전자좌 번호 NP_001129241에 제시된다. 인간 PVR의 델타 이소형의 아미노산 서열은 NCBI 유전자좌 번호 NP_001129242에 제시된다.
PVRL2는 폴리오바이러스 수용체 관련 2를 지칭한다. 본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도에 적합한 PVRL2 길항제는 암 세포 또는 항원 제시 세포 상에서 발현되는 PVRL2의 림프구(T-세포, B-세포 및/또는 NK-세포)에서 발현되는 TIGIT에의 결합을 차단하는 임의의 화학적 화합물 또는 생물학적 분자를 포함한다. PVRL2의 대체 명칭 또는 동의어는 CD112, NECTIN2, HVEB, 헤르페스 바이러스 진입 중재자 B, PRR2 및 PVRR2를 포함한다. 인간 대상체가 치료되는 일부 구현예에서, PVRL2 길항제는 인간 PVRL2의 인간 TIGIT에의 결합을 차단한다. 인간 PVRL2의 알파 이소형의 아미노산 서열은 NCBI 유전자좌 번호 NP_002847에 제시된다. 인간 PVRL2의 델타 이소형의 아미노산 서열은 NCBI 유전자좌 번호 NP_001036189에 제시된다.
PVRL3은 폴리오바이러스 수용체 관련 3을 지칭한다. 본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도에 적합한 PVRL3 길항제는 암 세포 또는 항원 제시 세포 상에서 발현되는 PVRL3의 림프구(T-세포, B-세포 및/또는 NK-세포) 상에서 발현되는 TIGIT에의 결합을 차단하는 임의의 화학적 화합물 또는 생물학적 분자를 포함한다. PVRL3의 대체 명칭 또는 동의어에는 CD113, NECTIN3, PRR3 및 PVRR3을 포함한다. 인간 대상체가 치료되는 일부 구현예에서, PVRL3 길항제는 인간 PVRL3의 인간 TIGIT에 대한 결합을 차단한다. 인간 PVRL3의 이소형 1의 아미노산 서열은 NCBI 유전자좌 번호 NP_056295에 제시된다. 인간 PVRL3의 이소형 2의 아미노산 서열은 NCBI 유전자좌 번호 NP_001230215에 제시된다. 인간 PVRL3의 이소형 3의 아미노산 서열은 NCBI 유전자좌 번호 NP_001230217에 제시된다.
TIGIT는 Ig 및 ITIM 도메인 단백질을 포함하는 T-세포 면역수용체를 지칭한다. 본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도에 적합한 TIGIT 길항제는 림프구(T-세포, B-세포 또는 NK-세포) 상에서 발현되는 TIGIT의 암 세포 또는 항원 제시 세포 상에서 발현되는 리간드(CD112, CD113 및/또는 CD155)에의 결합을 차단하는 임의의 화학적 화합물 또는 생물학적 분자를 포함한다. TIGIT의 대체 명칭 또는 동의어는 VSIG9, V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 9, VSTM3, V-세트 및 막관통 도메인 함유 3, 및 워싱턴 대학 세포 부착 분자(WUCAM)를 포함한다. 인간 대상체가 치료되는 일부 구현예에서, TIGIT 길항제는 인간 TIGIT의 인간 리간드에의 결합을 차단한다. 성숙한 형태의 인간 TIGIT의 아미노산 서열은 NCBI 유전자좌 번호: NP_776160의 잔기 22-244로서 제시된다.
TIM3은 T-세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-3 단백질을 지칭한다. 본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도에 적합한 TIM3 길항제는 림프구(T-세포, B-세포 또는 NK-세포) 상에서 발현되는 TIM3의 항원 제시 세포 상에서 발현되는 리간드(갈렉틴-9 포스파티딜세린)에의 결합을 차단하는 임의의 화학적 화합물 또는 생물학적 분자를 포함한다. TIM3의 대체 명칭 또는 동의어는 CD366, HAVCR2, A형 간염 바이러스 세포 수용체 2, KIM3, 및 SPTCL을 포함한다. 인간 대상체가 치료되는 일부 구현예에서, TIM3 길항제는 인간 TIM3의 인간 리간드에의 결합을 차단한다. 성숙한 형태의 인간 TIM3의 아미노산 서열은 NCBI 유전자좌 번호 NP_116171의 잔기 22-301로서 제시된다.
VISTA는 T-세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제를 지칭한다. 본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도에 적합한 VISTA 길항제는 림프구(T-세포, B-세포 및/또는 NK-세포) 상에서 발현되는 VIST의 암 세포 또는 항원 제시 세포 상에서 발현되는 리간드에의 결합을 차단하는 임의의 화학적 화합물 또는 생물학적 분자를 포함한다. VISTA의 대체 명칭 또는 동의어는 VSIR, V-세트 면역조절 수용체, PD-1H, B7H5, GI24, PP2135, SISP1, 및 Dies1을 포함한다. 인간 대상체가 치료되는 일부 구현예에서, VISTA 길항제는 인간 VIST의 인간 리간드에의 결합을 차단한다. 성숙한 형태의 인간 VISTA의 아미노산 서열은 NCBI 유전자좌 번호: NP_071436의 잔기 33-311로서 제시된다.
면역 체크포인트 억제제는 생물학적 분자일 수 있다. 예를 들어, 면역 체크포인트 억제제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 항체 또는 단편은 모노클로날 항체(mAb), 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체일 수 있고, 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 특정 구현예에서, 인간 불변 영역은 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 이중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab'-SH, F(ab')2, scFv, 및 Fv 단편으로 이루어진 그룹 중 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 억제성 체크포인트 분자는 PD-1을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 세미플리맙, 및 이들의 바이오시밀러(biosimilar)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙(머크 앤드 캄파니(Merck & Co.)에 의해 KEYTRUDA®로서 판매되는 MK-3475)이다. 하나의 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙(BMS-936558 또는 MDX-1106, 브리스톨 마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb)에 의해 OPDIVO®로서 판매됨)이다. 하나의 구현예에서, 항-PD-1 항체는 세미플리맙(REGN2810, Regeneron)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 또는 세미플리맙의 변이체이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 억제성 체크포인트 분자는 PD-L1을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙 및 이들의 바이오시밀러로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙(제넨테크사(Genentech, Inc.)에 의해 TECENTRIQ®으로 판매됨)이다. 하나의 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 아벨루맙(이엠디 세로노 인크(EMD Serono, Inc.) 및 화이자, 인크(Pfizer, Inc.)에 의해 BAVENCIO®로 판매됨)이다. 하나의 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 두르발루맙(아스트라제네카(AstraZeneca)에 의해 IMFINZI®로서 판매되는 MEDI4736)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 또는 두르발루맙의 변이체이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 억제성 체크포인트 분자는 CTLA-4를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 이필리무맙, 트레멜리무맙 및 이들의 바이오시밀러로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 항-CTLA4 항체는 이필리무맙(MDX-010 또는 BMS-734016, 브리스톨 마이어스 스퀴브에 의해 YERVOY®로서 판매됨)이다. 하나의 구현예에서, 항-CTLA4 항체는 트레멜리무맙(티실리무맙, CP-675,206, 아스트라제네카에 의해 개발됨)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙의 변이체이다.
일부 구현예에서, 모노클로날 항체는 경쇄 CDR의 외부에 위치된 위치에 3, 2 또는 1개의 보존적 아미노산 치환 및/또는 중쇄 CDR의 외부에 위치된 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것(예: 변이체 위치는 프레임워크 영역 또는 불변 영역에 위치된다)을 제외하고 "참조" 항체의 서열과 동일한 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 "변이체" 항체이다. 즉, 참조 항체 및 변이체 항체는 동일한 CDR 서열을 포함하지만, 각각 이들의 전장 경쇄 서열 및 중쇄 서열에 3개 또는 6개 이하의 다른 위치에 보존적 아미노산 치환을 갖기 때문에 서로 상이하다. 변이체 항체는 하기 특성과 관련하여 참조 항체와 실질적으로 동일하다: 억제성 체크포인트 분자에 대한 결합 친화도 및 억제성 체크포인트 분자의 이의 리간드에 대한 결합을 차단하는 능력.
다른 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 면역글로불린 분자의 Fc 영역과 같은 불변 영역에 융합된 이의 리간드 중 하나의 억제성 체크포인트 분자 결합 도메인을 포함하는 면역접합체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "바이오시밀러"는 연방 의약국(FDA) 승인된 참조 제품과 유사하지만, 안전성 및 효능에서 임상적으로 의미 있는 차이가 없는 생물학적 산물을 지칭한다. 예를 들어, 임상적으로 불활성인 성분에서, 바이오시밀러 제품과 참조 제품 사이에 차이(예: 제형의 부형제의 차이, 글리코실화의 사소한 차이 등)가 있을 수 있다. 임상적으로 의미 있는 특성은 약동학적 및 약력학적 연구를 통해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오시밀러 제품은 FDA에 의해 결정된 상호교환가능한 제품이다.
2. Cbl-b 억제제와 항종양제를 포함하는 병용 요법
본 개시내용의 병용 요법 방법의 일부 구현예에서, 추가의 치료제는 항종양제를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항종양제" 및 "항종양제"는 세계 보건 기구에 의해 개발된 해부학적 치료 화학 분류 시스템(ATC) 코드 L01에 따라 분류된 치료제를 지칭한다. 특정 구현예에서, 항종양제는 세포독성 항생제(ATC 코드 L01D), 식물 알칼로이드(ATC 코드 L01C), 항대사물질(antimetabolite)(ATC 코드 L01B), 알킬화제(ATC 코드 L01A), 및 기타 항종양제(ATC 코드 L01X)로 이루어진 그룹 중 하나로 분류된다. 일부 구현예에서, 항종양제는 생물학적 분자와는 대조적으로 소분자 약물(예: 암 화학요법제)이다.
세포독성 항생제는 본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도에 적합한 항종양제이다. 일부 구현예에서, 세포독성 항생제는 익사베필론, 미토마이신, 플리카마이신, 블레오마이신, 픽산트론, 암루비신, 발루비신, 피라루비신, 미토크산트론, 이다루비신, 조루비신, 아클라루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 독소루비신 및 닥티노마이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
식물 알칼로이드는 본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도에 적합한 항종양제이다. 일부 구현예에서, 식물 알칼로이드는 트라벡테딘, 카바지탁셀, 파클리탁셀 폴리글루멕스, 도세탁셀, 파클리탁셀, 데메콜신, 테니포사이드, 에토포사이드, 빈타폴리드, 빈플루닌, 비노렐빈, 빈데신, 빈크리스틴 및 빈블라스틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
항대사물질은 본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도에 적합한 항종양제이다. 일부 구현예에서, 항대사물질은 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 또는 엽산 유사체이다. 일부 구현예에서, 항대사물질은 플록수리딘, 트리플루리딘, 테가푸르, 플루오로우라실, 데시타빈, 아자시티딘, 카페시타빈, 겜시타빈, 카모푸르, 테가푸르, 플루오로우라실, 시타라빈, 넬라라빈, 클로파라빈, 플루다라빈, 클라드리빈, 티오구아닌, 머캅토퓨린, 프랄라트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드 및 메토트렉세이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
알킬화제는 본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도에 적합한 항종양제이다. 일부 구현예에서, 알킬화제는 다카바진, 테모졸로미드, 피포브로만, 미토브로니톨, 에토글루시드, 우라실 머스타드, 라니무스틴, 니무스틴, 포테무스틴, 스트렙토조신, 세무스틴, 로무스틴, 카무스틴, 카보쿠온, 트리아지쿠온, 티오테파, 만노설판, 트레오설판, 부설판, 벤다무스틴, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 이포스파미드, 메클로레타민, 멜팔란, 클로람부실, 및 사이클로포스파미드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 항종양제는 백금 화합물(ATC 코드 L01XA), 메틸하이드라진(ATC 코드 L01XB), 증감제(ATC 코드 L01XD), 단백질 키나제 억제제(ATC 코드L01XE) 및 기타 제제(ATC 코드 L01XA)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
백금 화합물은 본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도에 적합한 항종양제이다. 일부 구현예에서, 백금 화합물은 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 사트라플라틴 및 폴리플라틸렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
3. Cbl-b 억제제 및 방사선 요법을 포함하는 병용 요법
본 개시내용은 암을 갖는 개체에게 유효량의 Cbl-b 억제제를 투여하는 단계 및 유효량의 방사선 요법을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 유효량의 Cbl-b를 개체에게 투여하는 단계 및 유효량의 방사선 요법을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 추가로, 본 개시내용은 암을 갖는 개체에게 유효량의 Cbl-b 억제제를 투여하는 단계 및 유효량의 방사선 요법을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 항암 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 암을 갖는 개체에게 유효량의 Cbl-b 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 추가로 제공되며, 여기서 개체는 유효량의 방사선 요법을 받았거나 받고 있다.
일부 구현예에서, 방사선 요법은 외부 빔(beam) 방사선 요법이다. 다른 구현예에서, 방사선 요법은 내부 방사선 요법이다. 일부 구현예에서, 방사선 요법은 절제 방사선 요법이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 병용 요법 섭생은 Cbl-b 억제제, 방사선 요법, 및 면역 체크포인트 억제제 및 항종양제 중 하나 또는 둘 모두의 투여를 포함한다.
유효량의 Cbl-b 억제제 및 유효량의 암 백신을 포함하는 병용 요법을 암을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 암을 치료하기 위한 암 백신과 조합하여 사용하기 위한 Cbl-b 억제제를 포함하는 약제 및 암을 치료하는 데 사용하기 위한 Cbl-b 억제제 및 암 백신을 둘 모두 포함하는 약제가 또한 제공된다. 암 백신과 함께 투여되는 경우, 개체에서 암을 치료하기 위한 약제의 제조에서 Cbl-b 억제제의 용도가 추가로 제공된다. 암을 치료하기 위한 약제(들)의 제조에서 Cbl-b 억제제 및 암 백신의 용도가 추가로 제공된다. 유효량의 Cbl-b 억제제 및 유효량의 종양 용해성 바이러스를 포함하는 병용 요법을 암을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법도 또한 본원에 제공된다. 암을 치료하기 위한 종양 용해성 바이러스와 조합하여 사용하기 위한 Cbl-b 억제제를 포함하는 약제 및 암을 치료하는 데 사용하기 위한 Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스 둘 다를 포함하는 약제도 또한 제공된다. 종양 용해성 바이러스와 조합하여 투여되는 경우, 개체에서 암을 치료하기 위한 약제의 제조에서 Cbl-b 억제제의 용도가 또한 제공된다. 또한, 암을 치료하기 위한 약제(들)의 제조에서 Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스의 용도가 제공된다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제는 "소분자"이다.
본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도의 일부 구현예에서, 암은 림프종, 백혈병, 또는 골수종과 같은 혈액암이다. 본 개시내용의 치료 방법, 약제 및 용도의 다른 구현예에서, 암은 육종, 암종, 또는 흑색종과 같은 비혈액암이다.
혈액암은 B-세포 급성 림프성 백혈병("BALL"), T-세포 급성 림프성 백혈병("TALL"), 급성 림프성 백혈병(ALL)과 같은 하나 이상의 백혈병; 만성 골수성 백혈병(CML) 및 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 만성 백혈병; B-세포 전림프구성 백혈병, 모세포성 형질세포-유사 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 모세포 백혈병, 소세포 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 상태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연대 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성 및 골수이형성 증후군, 비호지킨 림프종, 형질아구성 림프종, 형질세포-유사 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 및 골수성 혈액 세포의 비효과적인 생산(또는 이형성)에 의해 통합된 혈액학적 상태의 다양한 집합인 "전백혈병"을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가의 혈액암 또는 혈액학적 상태를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
비혈액암은 신경모세포종, 신장 세포 암종, 결장암, 결장직장암, 유방암, 상피 편평 세포암, 흑색종, 위암, 뇌암, 폐암(예: NSCLC), 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 전립선암, 고환암, 갑상선암, 자궁암, 부신암, 및 두경부암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 암의 치료에서 활성화 임계치 감소제 또는 공자극 요건(costimulation requirement) 감소제, 예를 들어, Cbl-b 억제제의 투여의 효능은 종양 크기 또는 종양 수의 감소 및/또는 생존율과 같은 임상 결과를 평가함으로써 측정된다. 일부 구현예에서, "암을 치료하는"은 기재된 바와 같이(참조: 예를 들어, Eisenhauer et al., Eur J Cancer, 45:228-247, 2009; and Nishino et al., Am J Roentgenol, 195: 281-289, 2010)), 고형 종양에서의 반응 평가 기준(RECIST 버전 1.1)에 따라 치료 섭생에 대한 환자의 반응을 평가하는 것을 포함한다. RECIST 1.1에 기초한 객관적인 항종양 반응을 결정하기 위한 반응 기준은 완전 반응(CR); 부분 반응(PR); 진행성 질환(PD); 및 안정한 질환(SD)을 포함한다.
면역 세포(예: T-세포, B-세포 및/또는 NK-세포)의 활성화 임계치를 감소시키는 제제(활성화 임계치 감소제)의 유효량 및 유효량의 암 백신을 포함하는 병용 요법을 암을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 암을 치료하기 위한 암 백신과 병용하여 사용하기 위한 활성화 임계치 감소제를 포함하는 약제, 및 암을 치료하는 데 사용하기 위한 활성화 임계치 감소제 및 암 백신 둘 모두를 포함하는 약제도 제공된다. 또한, 암 백신과 함께 투여되는 경우, 개체에서 암을 치료하기 위한 약제의 제조에서 활성화 임계치 감소제의 용도가 제공된다. 또한, 암을 치료하기 위한 약제(들)의 제조에서 활성화 임계치 감소제 및 암 백신의 용도가 제공된다. 면역 세포(예: T-세포, B-세포 및/또는 NK-세포)의 활성화 임계치를 감소시키는 제제(활성화 임계치 감소제)의 유효량 및 유효량의 종양 용해성 바이러스를 포함하는 병용 요법을 암을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 암을 치료하기 위한 종양 용해성 바이러스와 병용하여 사용하기 위한 활성화 임계치 감소제를 포함하는 약제, 및 암을 치료하는 데 사용하기 위한 활성화 임계치 감소제 및 종양 용해성 바이러스 둘 모두를 포함하는 약제도 또한 제공된다. 또한, 종양 용해성 바이러스와 조합하여 투여되는 경우, 개체에서 암을 치료하기 위한 약제의 제조에서 활성화 임계치 감소제의 용도가 제공된다. 또한, 암을 치료하기 위한 약제(들)의 제조에서 활성화 임계치 감소제 및 종양 용해성 바이러스의 용도가 제공된다. 일부 구현예에서, 활성화 임계치를 감소시키는 제제(활성화 임계치 감소제)는 면역 세포(예: T-세포, B-세포 및/또는 NK-세포)의 공자극 요건을 감소시키는 제제(공자극 요건 감소제)이다. 일부 구현예에서, 활성화 임계치를 감소시키는 제제(활성화 임계치 감소제)는 종양 면역 감시를 촉진하는 제제이다. 일부 구현예에서, 활성화 임계치를 감소시키는 제제(활성화 임계치 감소제)는 Cbl-b 억제제이다. 일부 구현예에서, 공자극 요건을 감소시키는 제제는 Cbl-b 억제제이다. 일부 구현예에서, 종양 면역 감시를 촉진하는 제제는 Cbl-b 억제제이다.
일부 구현예에서, Cbl-b 억제제와 같은 활성화 임계치 감소제는 T-세포 활성화 및/또는 T-세포 증식을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제와 같은 활성화 임계치 감소제는 T-세포 고갈, T-세포 내성 및/또는 T-세포 아네르기를 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, Cbl-b 억제제와 같은 활성화 임계치 감소제는 활성화된 T-세포 미세환경(예: 골수 세포)에서 T-세포 또는 주위 면역 세포에 의한 하나 이상의 사이토카인의 생산을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-18, TNFα 및 GM-CSF를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-2, IFN-γ, TNFα 및 GM-CSF 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 케모카인이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 케모카인은 IP-10, 에오탁신, GRO 알파, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, MCP-1 및 MCP-3을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 사이토카인의 발현 증가는 ELISA로 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, Cbl-b 억제제와 같은 활성화 임계치 감소제는 하나 이상의 T-세포 활성화 마커의 세포 표면 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 T-세포 활성화 마커는 CD25, CD44, CD62L, CD69, CD152(CTLA4), CD154, CD137, 및 CD279를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, T-세포 활성화 마커는 CD25, CD69 및 CTLA4 중 하나 이상이다. 세포 표면 마커의 발현 증가는 FACS로 측정될 수 있다.
증가된 T-세포 활성화, 증가된 T-세포 증식, 감소된 T-세포 고갈, 및/또는 감소된 T-세포 내성을 실험적으로 결정하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 일부 구현예에서, T-세포 활성화를 결정하는 대표적인 방법은 본원에 제공된 생물학적 실시예 9 및/또는 생물학적 실시예 12에서 찾을 수 있다. 일부 구현예에서, 증가된 T-세포 활성화, 증가된 T-세포 증식, 감소된 T-세포 고갈 및/또는 감소된 T-세포 내성을 결정하는 대표적인 시험관내 및 생체내 방법은 생물학적 실시예 10 및/또는 생물학적 실시예 13에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, Cbl-b 억제제와 같은 활성화 임계치 감소제는 B-세포 활성화를 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 증가된 B-세포 활성화는 하나 이상의 B-세포 활성화 마커의 증가된 세포 표면 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 B-세포 활성화 마커는 CD69, CD86 및 MHC 부류 II(예: HLA-DR)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, B-세포 활성화 마커는 CD69이다. 세포 표면 마커의 발현 증가는 FACS로 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 증가된 B-세포 활성화는 ERK, JNK, 및 Syk에 의해 매개되는 것들과 같은 신호 전달 경로에서 단백질의 증가된 활성화를 포함한다. 단백질의 활성화 증가는 당업계에서 이용가능한 항인산화 항체와 같은 시약을 사용하여 단백질 상에서 인산화 수준의 측정으로 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, Cbl-b 억제제와 같은 활성화 임계치 감소제는 NK-세포 활성화를 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 증가된 NK-세포 활성화는 하나 이상의 사이토카인의 분비를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IFN-γ, TNFα 및 MIP-1β를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 사이토카인의 발현 증가는 ELISA로 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 증가된 NK-세포 활성화는 하나 이상의 NK-세포 활성화 마커의 증가된 세포 표면 발현을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 NK-세포 활성화 마커는 CD69 및 CD107a를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 세포 표면 마커의 발현 증가는 FACS로 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, NK-세포 활성화의 증가는 원발성 종양 세포를 포함하는 종양 세포와 같은 표적 세포, 및 K562 세포주와 같은 세포주 유래 종양 세포의 사멸 증가를 포함한다.
증가된 B-세포 활성화 및 NK-세포 활성화를 실험적으로 결정하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다.
T-세포, B-세포 또는 NK-세포와 같은 면역 세포의 활성의 조절은 관심 파라미터(예: 사이토카인 분비)의 기준선 값을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, Cbl-b 억제제와 접촉된 세포의 시험관내 실험으로부터 수득된 샘플에서와 같은 T-세포 활성화는 기준선 값을 결정하기 위해 상기 Cbl-b 억제제와 접촉 또는 투여 전에 측정될 수 있다. 이어서, 상기 Cbl-b 억제제와 접촉 또는 투여한 후 T-세포 활성화에 대한 참조 값이 수득된다. Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물의 접촉 또는 투여로 인한 T-세포 활성화의 양을 결정하기 위해, 참조 값을 기준선 값과 비교한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 면역 세포(예: T-세포) 활성화는 기준선 값과 비교하여 샘플에서 적어도 0.1배 증가되고, 여기서 기준선 값은 면역 세포(예: T-세포)와 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물을 접촉시키기 전에 수득된다. 일부 구현예에서, 면역 세포(예: T-세포) 활성화는 기준선 값에 비해 적어도 약 0.1배, 약 0.2배, 약 0.3배, 약 0.4배, 약 0.5배, 약 0.6배, 약 0.7배, 약 0.8배, 약 0.9배, 약 1배, 약 2배, 약 4배, 약 6배, 약 8배, 약 10배, 약 20배, 약 30배, 그러나 약 약 50배 이하 증가된다. 면역 세포 활성화는 사이토카인 분비의 증가, 활성화 마커(예: 세포 표면 마커)의 세포 표면 발현의 증가, 또는 다운스트림 신호 전달 경로에서 단백질의 인산화 증가와 같은 활성화의 생물학적 마커를 측정함으로써 평가될 수 있다. 면역 세포 활성화를 나타내는 기준선 값에 대한 배수는 시험되는 파라미터 및 면역 세포가 처리되는 조건에 대해 결정될 수 있다. 예를 들어, T-세포 활성화를 측정하기 위해, 기준선 값은 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체로 자극된 T-세포로부터 수득될 수 있고, 여기서 세포는 Cbl-b 억제제와 함께 배양되지 않는다. 이어서, 참조 값은 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체로 자극된 T-세포로부터 수득되고, 여기서 T-세포는 Cbl-b 억제제와 접촉되었거나 접촉되어 있다. 이어서, 면역 세포 활성화에 대한 양성 반응은 수득된 참조 값에 의해 결정될 수 있다. 유사한 참조 값 측정치를 수득하여 T-세포 활성화, T-세포 증식, T-세포 고갈, T-세포 내성, B-세포 활성화 및/또는 NK-세포 활성화를 평가하기 위해 기준선 값과 비교할 수 있다. 이들 파라미터의 측정치는 당업계에 익히 공지된 기술을 이용하여 수득될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "기준선" 또는 "기준선 값"은 본원에 개시된 치료제(예: 본원에 기재된 Cbl-b 억제제를 포함하는 조성물)의 투여 전 또는 치료제의 투여 개시시의 측정치 또는 특성을 지칭할 수 있다. 기준선 값은 면역 세포 기능의 증가 또는 감소(예: T-세포 활성화의 증가, T-세포 증식의 증가, T-세포 고갈의 감소, 및/또는 T-세포 내성의 감소)를 결정하기 위해 참조 값과 비교될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "참조" 또는 "참조 값"은 본원에 개시된 치료제(예: 본원에 기재된 Cbl-b 억제제를 포함하는 조성물)의 투여 후 측정치 또는 특성을 지칭할 수 있다. 참조 값은 실험 시간 과정, 투여 섭생, 또는 치료 사이클 동안, 또는 실험 시간 과정, 투여 섭생, 또는 치료 사이클의 완료시에 1회 이상 측정될 수 있다. "참조값"은 절대값, 상대 값, 상한치 및/또는 하한치를 갖는 값, 값의 범위, 평균값, 중앙값, 평균값, 또는 기준선 값과 비교된 값일 수 있다. 유사하게, "기준선 값"은 절대값, 상대 값, 상한치 및/또는 하한치를 갖는 값, 값의 범위, 평균값, 중앙값, 평균값 또는 참조 값과 비교된 값일 수 있다. 참조 값 및/또는 기준선 값은 하나의 샘플(예: 개체로부터 수득된 하나의 샘플), 2개의 상이한 샘플(예: 2명의 상이한 개체로부터 수득된 샘플) 또는 샘플의 그룹(예: 2, 3, 4, 5명 이상의 개체의 그룹으로부터 수득된 샘플)으로부터 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, Cbl-b 억제제의 존재하에 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체로 자극된 T-세포에 의한 사이토카인 분비(예: IL-2 분비)에 의해 측정된 T-세포 활성화에 대한 양성 반응은 Cbl-b 억제제의 부재하에 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체로 자극된 T-세포로부터 수득된 사이토카인 분비(예: IL-2 분비)의 기준선 값의 적어도 2.5배이다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제의 존재하에 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체로 자극된 T-세포에 의한 표면 마커 발현(예: CD25 표면 마커 염색)에 의해 측정된 T-세포 활성화에 대한 양성 반응은 Cbl-b 억제제의 부재하에 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체로 자극된 T-세포로부터 수득된 표면 마커 발현(예: CD25 표면 마커 염색)의 기준선 값의 적어도 1.3배이다. 일부 구현예에서, 기준선 값은 항-CD3 항체 단독으로 자극된 T-세포로부터 수득될 수 있고, 여기서 세포는 Cbl-b 억제제와 함께 배양되지 않는다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제의 존재하에 항-CD3 항체 단독으로 자극된 T-세포에 의한 사이토카인 분비(예: IL-2 분비)에 의해 측정된 T-세포 활성화에 대한 양성 반응은 Cbl-b 억제제의 부재하에 항-CD3 항체 단독으로 자극된 T-세포로부터 수득된 사이토카인 분비(예: IL-2 분비)의 기준선 값의 적어도 0.1배이다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제의 존재하에 항-CD3 항체 단독으로 자극된 T-세포에 의한 표면 마커 발현(예: CD25 표면 마커 염색)에 의해 측정된 T-세포 활성화에 대한 양성 반응은 Cbl-b 억제제의 부재하에 항-CD3 항체 단독으로 자극된 T-세포로부터 수득된 표면 마커 발현(예: CD25 표면 마커 염색)의 기준선 값의 적어도 0.6배이다.
본 개시내용은 암을 갖는 개체에게 유효량의 Cbl-b 억제제를 투여하는 단계 및 유효량의 암 백신을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 유효량의 Cbl-b 억제제를 개체에게 투여하는 단계 및 유효량의 암 백신을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 추가로, 본 개시내용은 암을 갖는 개체에게 유효량의 Cbl-b 억제제를 투여하는 단계 및 유효량의 암 백신을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 항암 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 암을 갖는 개체에게 유효량의 Cbl-b 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 추가로 제공되며, 여기서 개체는 유효량의 암 백신을 받았거나 받고 있다. 또한, 본 개시내용은 암을 갖는 개체에게 유효량의 Cbl-b 억제제를 투여하는 단계 및 유효량의 종양 용해성 바이러스를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 유효량의 Cbl-b 억제제를 개체에게 투여하는 단계 및 유효량의 종양 용해성 바이러스를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 개체를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 추가로, 본 개시내용은 암을 갖는 개체에게 유효량의 Cbl-b 억제제를 투여하는 단계 및 유효량의 종양 용해성 바이러스를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 항암 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 암을 갖는 개체에게 유효량의 Cbl-b 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 추가로 제공되며, 여기서 개체는 유효량의 종양 용해성 바이러스를 받았거나 받고 있다.
이전 단락의 방법의 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제 및 암 백신은 임의의 순서로 연속적으로 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에서 사용되는 용어 "연속적으로", "연속으로" 및 "순차적으로"는 암 백신 후 Cbl-b 억제제의 투여, 또는 Cbl-b 억제제 후 암 백신의 투여를 지칭한다. 예를 들어, 연속적인 투여는 유도 단계(1차 요법) 동안 암 백신의 부재하에 Cbl-b 억제제의 투여를 포함할 수 있고, 그 후 암 백신 및 Cbl-b 억제제 둘 다의 투여를 포함하는 유도 후 치료 단계가 이어진다. 상기 방법은 Cbl-b 억제제의 투여 또는 추가 투여량의 암 백신의 투여를 포함하는 유지 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 연속적인 투여는 유도 단계(1차 요법) 동안 Cbl-b 억제제의 부재하에 암 백신의 투여를 포함할 수 있고, 그 후 Cbl-b 억제제의 투여를 포함하는 유도 후 치료 단계가 이어진다. 상기 방법은 Cbl-b 억제제 또는 암 백신의 추가 투여량의 투여를 포함하는 유지 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이전 단락의 방법의 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스는 임의의 순서로 연속적으로 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에서 사용되는 용어 "연속적으로", "연속으로" 및 "순차적으로"는 종양 용해성 바이러스 후 Cbl-b 억제제의 투여, 또는 Cbl-b 억제제 후 종양 용해성 바이러스의 투여를 지칭한다. 예를 들어, 연속적인 투여는 유도 단계(1차 요법) 동안 종양 용해성 바이러스의 부재하에 Cbl-b 억제제의 투여를 포함할 수 있고, 그 후 종양 용해성 바이러스 및 Cbl-b 억제제 둘 다의 투여를 포함하는 유도 후 치료 단계가 이어진다. 상기 방법은 Cbl-b 억제제의 투여 또는 추가 투여량의 종양 용해성 바이러스의 투여를 포함하는 유지 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 연속적인 투여는 유도 단계(1차 요법) 동안 Cbl-b 억제제의 부재하에 종양 용해성 바이러스의 투여를 포함할 수 있고, 그 후 Cbl-b 억제제의 투여를 포함하는 유도 후 치료 단계가 이어진다. 상기 방법은 Cbl-b 억제제 또는 종양 용해성 바이러스의 추가 투여량의 투여를 포함하는 유지 단계를 추가로 포함할 수 있다.
병용 요법 방법의 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제 및 암 백신은 동시에 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에서 사용되는 용어 "동시에", "동시에" 및 "병렬로"는 동일한 의사의 진찰 중 또는 동일한 치료 단계 동안 Cbl-b 억제제 및 암 백신의 투여를 지칭한다. 예를 들어, Cbl-b 억제제 및 암 백신 둘 다는 유도 단계, 치료 단계 및 유지 단계 중 하나 이상 동안 투여될 수 있다. 그러나, 동시 투여는 Cbl-b 억제제 및 암 백신이 단일 제형 또는 약제학적 조성물에 함께 존재해야 하거나 Cbl-b 억제제 및 암 백신이 정확하게 동시에 투여되어야 함을 요구하지 않는다. 병용 요법 방법의 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스는 동시에 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에서 사용되는 용어 "동시에", "동시에" 및 "병렬로"는 동일한 의사의 진찰 중 또는 동일한 치료 단계 동안 Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스의 투여를 지칭한다. 예를 들어, Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스는 둘 모두 유도 단계, 치료 단계 및 유지 단계 중 하나 이상 동안 투여될 수 있다. 그러나, 동시 투여는 Cbl-b 억제제와 종양 용해성 바이러스가 단일 제형 또는 약제학적 조성물에 함께 존재해야 하거나 Cbl-b 억제제와 종양 용해성 바이러스가 정확하게 동시에 투여되어야 함을 요구하지 않는다.
일부 측면에서, 치료는 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물의 다중 투여를 포함하고, 여기서 투여 사이의 간격은 다양할 수 있다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제는 개체에게 균일 용량으로 투여된다(예: mg/성인 또는 mg/소아). 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제는 개체의 체중(예: mg/kg)에 기초한 고정 투여량으로 개체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 병용 요법의 효능은 치료된 개체로부터 단리된 샘플에 존재하는 면역 세포의 생물학적 활성을 측정함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 치료 후 개체로부터 단리된 면역 세포의 세포독성 검정을 사용하여 표적 세포를 파괴하는 능력을 사용하여 치료 효능을 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플에 존재하는 면역 세포의 생물학적 활성은 IL-2 및 IFNγ와 같은 특정 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 검정함으로써 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "암 백신"은 달리 명시되지 않는 한, 암을 치료할 (및 임의로 암의 재발을 예방할) 목적으로 암을 갖는 개체에게 투여되는 "치료적 암 백신을 지칭한다. 대조적으로, "예방적 암 백신"(예방적 암 백신)은 암을 예방하거나 개체의 암 발병 위험을 감소시킬 목적으로 암이 없는 개인에게 투여되어야 한다. 예방적 암 백신의 예는 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma)을 예방하기 위한 인간 유두종 바이러스 백신 및 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)을 예방하기 위한 B형 간염 바이러스 백신이다. 암 백신은 약제학적으로 허용되는 부형제 및 적어도 하나의 종양 항원, 예를 들어, 종양 특이적 항원 또는 종양 관련 항원을 포함하는 면역원성 조성물이다. 본원에서 사용되는 용어 "종양 용해성 바이러스" 및 "OV"는 암 세포를 감염시키고 사멸시키는 바이러스를 지칭한다. 암 세포의 사망은은 직접적인 세포 용해 및 항종양 면역의 유도 둘 모두의 결과이다. 일부 구현예에서, "종양 용해성 바이러스"는 암 세포에서 선택적으로 복제되는 복제 적격 바이러스이다. 다른 구현예에서, "종양 용해성 바이러스"는 복제-결핍 바이러스이며, 이는 종양 용해성 바이러스의 유전 공학 또는 불활성화(예: UV 조사 또는 열)의 결과로서 암 세포 내에서 복제되지 않는다.
일부 구현예에서, 종양 항원은 동일한 유형의 많은 암에 공통인 "공유 종양 항원"을 포함한다. 공유 종양 항원의 비제한적인 예는 유방암 항원 HER2, 전립선암 항원 PAP 및 PSA, 및 흑색종 항원 MART-1 및 MAGE이다. 다른 구현예에서, 종양 항원은 종양-특이적 DNA 변경(예: 체세포 돌연변이)의 결과로서 발생하는 "신생항원"을 포함한다. 이와 같이, 신생항원은 전형적으로 정상 포유류 게놈에 존재하지 않는 아미노산 서열을 포함한다(Schumacher and Schreiber, Science, 348:69-74, 2015). 신생항원의 비제한적인 예는 BRAF V600E, KRAS G12D, KRAS G12V, PIK3CA H1047R 및 PIC3CA E545K이다. 이제 종양 특이적 신생항원 데이터베이스(TSNAdb)를 자유롭게 이용 가능하다(Wu et al., Genomics Proteomics Bioinformatics 16:276-282, 2018).
다양한 기술이 Cbl-b 억제제와 같은 활성화 임계치 감소제를 포함하는 병용 요법의 일부로서 암 백신에 포함시키기 위한 신생항원의 동정에 적합하다. 예를 들어, 신생항원은 개체로부터 수득된 종양 생검으로부터 DNA를 단리하고, DNA를 서열분석하고, 하나 이상의 신생항원을 동정하기 위해 서열의 계산적 분석을 포함하는 방법으로 동정될 수 있다(Aldous and Dong, Bioorg Med Chem, 26:2842-2849, 2018). 일부 구현예에서, 계산적 분석은 종양 세포에 의해 발현된 적어도 하나의 HLA 대립유전자에 결합할 것으로 예측되며, 적어도 하나의 미스센스 돌연변이를 포함하는 길이가 8 내지 11개 아미노산인 펩티드를 동정하는 단계를 포함한다(Wu et al., Genomics Proteomics Bioinformatics 16:276-282, 2018). 암 백신에 신생항원을 포함시키는 것은 내성을 극복하고 자가면역 위험을 줄이는 데 유리한 것으로 여겨진다.
본 개시내용의 방법, 약제 및 용도에 사용하기에 적합한 암 백신 플랫폼은 합성 펩티드, 재조합 단백질, 핵산(DNA 또는 mRNA), 미생물 벡터, 종양 세포 및 항원 제시 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(참조: 예를 들어, DeMaria and Bilusic, Hematol Oncol Cin North Am, 33: 199-214, 2019; and Maeng and Berzofsky, F1000Research 2019, 8(F1000 Faculty Rev): 654, 2019).
일부 구현예에서, 암 백신의 종양 항원은 적어도 하나의 합성 펩티드 또는 재조합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성 펩티드는 길이가 적어도 8개의 아미노산이고, 특정 구현예에서, 길이가 80개 미만의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 복수의 합성 펩티드를 포함하거나, 종양 항원은 합성 펩티드 또는 2개, 3개 또는 그 이상의 에피토프의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질을 포함한다. "에피토프"는 항체 또는 B-세포 수용체에 의해 결합되거나 또는 종양 세포 또는 수지상 세포와 같은 세포의 표면 상의 주요 조직적합성 복합체 분자(MHC 부류 I 또는 부류 II)에 의한 T-세포 수용체에 의한 결합을 위해 제시되는 항원의 일부이다. 일부 구현예에서, 에피토프는 종양 항원 서열(1차 구조)의 인접 아미노산으로 구성된 "선형 에피토프"이다. 일부 구현예에서, 에피토프는 종양 항원(3차 구조)의 비인접 아미노산으로 구성된 "형태 에피토프"이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 선형 에피토프(들) 및 형태 에피토프(들) 둘 다를 포함하는 재조합 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 종양 항원은 DNA 또는 mRNA 분자에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 미생물 벡터의 핵산에 의해 인코딩되거나, 달리 말하면, 암 백신은 미생물 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 미생물 벡터는 살아있는 약독화된 미생물 벡터이다. 하나의 구현예에서, 살아있는 약독화된 미생물 벡터는 Organon USA, Inc.(Roseland, NJ)에 의해 시판되는 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)의 칼메트 및 구에린의 바실러스(BCG; Bacillus of Calmette and Guerin) 균주의 생배양 제제인 TICE® BCG이다. TICE® BCG는 멸균 식염수(예: 약제학적으로 허용되는 부형제)로 재구성시 방광내 사용에 대해 연방 의약국(FDA) 승인을 받았고, 방광암 제자리 암종의 치료 및 예방, 및 경요도 절제술 후 원발성 또는 재발성 단계 Ta 및/또는 T1 유두 종양의 예방에 지시된다.
일부 구현예에서, 미생물 벡터는 재조합 바이러스 벡터 또는 재조합 박테리아 벡터와 같은 재조합 미생물 벡터이다. 본 개시내용의 병용 요법에 사용하기에 적합한 재조합 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 폭스바이러스 및 헤르페스바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(Chulpanova et al., Biomedicines, 6:94, 2018). 일부 구현예에서, 미생물 벡터는 재조합 박테리아 벡터이다. 본 개시내용의 병용 요법에 사용하기에 적합한 재조합 박테리아 벡터는 클로스트리듐(Clostridium)(씨. 노비이(C. novyi)), 리스테리아(Listeria)(예: 엘. 모노사이토게네스(L. monocytogenes)), 슈도모나스(Pseudomonas)(예: 피. 아에루기노사(P. aeruginosa)) 및 살모넬라(Salmonella)(에스. 티피무리움(S. typhimurium))를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(Toussant et al., Expert Rev Vaccines, 12: 1139-1154, 2013).
일부 구현예에서, 암 백신은 합성 펩티드 또는 재조합 단백질과 같은 종양 항원과 접촉된 항원 제시 세포(APC)를 포함한다. 일부 구현예에서, APC는 종양 항원을 인코딩하는 핵산으로 형질감염된다. 일부 구현예에서, APC는 사이토카인을 인코딩하는 핵산으로 형질감염된다. 일부 구현예에서, APC는 수지상 세포 또는 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 하나의 구현예에서, 암 백신은 Dendreon Corp. (Seattle, WA)에 의해 판매되는 PROVENGE®(시풀류셀-T)이다. PROVENGE®는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자에 결합된 전립선산 포스파타제로 구성된 PAP-GM-CSF 융합 단백질로 활성화된 락테이트화 링거액(예: 약제학적으로 허용되는 부형제) 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함한다. PROVENGE®는 무증상 또는 최소 증후성 전이성 전립선암 치료를 위한 정맥내 주입에 대해 연방 의약국(FDA) 승인되었다.
일부 구현예에서, 암 백신은 사멸된 종양 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 암 백신은 종양 세포 용해물을 포함한다. 일부 구현예에서, 암 백신은 종양 세포 용해물과 접촉된 APC를 포함한다.
본 개시내용의 방법, 약제 및 용도에 사용하기에 적합한 암 백신의 애주번트는 FDA 승인된 허가 제품의 애주번트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특히, 현재 FDA 승인된 허가 제품의 애주번트는 알루미늄 염, 모노포스포릴 지질 A, 수중유 에멀젼(예: 수중 스쿠알렌 에멀젼 MF59 또는 AS03), 사포닌 및 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함한다.
본 개시내용의 방법, 약제 및 용도에 사용하기에 적합한 종양 용해성 바이러스는 아데노바이러스, 콕사키바이러스, 에코바이러스, 계두 바이러스, 단순 포진 바이러스, 마라바 바이러스, 홍역 바이러스, 점액종 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 파보바이러스, 폴리오바이러스, 레트로바이러스, 레오바이러스, 세네카 밸리 바이러스(Seneca Valley virus), 세밀리키 포레스트 바이러스, 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 및 소포성 구내염 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(참조: 예를 들어, Russell and Peng, Chin Clin Oncol, 7: 16, 2018; and Sivanandam et al., Molecular Therapy Oncolytics, 13: 93-106).
일부 구현예에서, 종양 용해성 바이러스는 유전적으로 조작되지 않는다(비재조합 바이러스). 일부 구현예에서, 비재조합 바이러스는 에코바이러스(예: 리그비르), 뉴캐슬병 바이러스, 파보바이러스, 레오바이러스, 또는 세네카 밸리 바이러스이다.
일부 구현예에서, 종양 용해성 바이러스는 하나 이상의 유전자 결실, 하나 이상의 유전자 삽입, 또는 하나 이상의 유전자 결실과 하나 이상의 유전자 삽입을 포함하도록 유전자 조작된 재조합 바이러스이다. 일부 구현예에서, 재조합 바이러스는 숙주 세포 특이성 및/또는 종양 세포 세포독성을 변경하도록 유전적으로 조작되었다. 일부 구현예에서, 재조합 종양 용해성 바이러스는 숙주 세포의 반응(예: 항바이러스 반응)을 억제하는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 바이러스 유전자의 기능적 결실 및/또는 숙주 세포의 반응(예: 항종양 반응)을 촉진하는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 도입유전자(transgene)의 삽입에 의해 유전적으로 조작되었다(참조: 예를 들어, Guo et al., Frontiers in Immunology, 8: Article 555, 2017; 및 Lin et al., Oncology Letters, 15: 4053-4060, 2018). 일부 구현예에서, 재조합 바이러스는 형광 단백질과 같은 검출 가능한 마커를 인코딩하는 도입유전자의 삽입에 의해 추가로 조작된다. 바람직한 항종양 반응은 선천적 면역 반응 및 적응성 면역 반응 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 종양 용해성 바이러스는 HSV 타입-1과 같은 재조합 단순 포진 바이러스(HSV)이다. 하나의 구현예에서, 재조합 종양 용해성 바이러스는 Amgen Inc.(Thousand Oaks, CA)에 의해 판매되는 탈리모겐 라헤르파렙벡 또는 T-VEC로도 공지된 IMLYGIC®이다. IMLYGIC®은 ICP34.5 및 ICP47 유전자의 기능적 결실 및 인간 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 인코딩하는 핵산의 삽입을 포함하는 재조합 HSV-1이다. IMLYGIC®은 재발성 흑색종 환자의 절제 불가능한 피부, 피하 및 결절성 병변의 병변내 주사(종양내 투여)에 의한 국소 치료용으로 연방 의약국(FDA) 승인되었다. 또한, IMLYGIC®은 국소 또는 원격 전이성인 절제 불가능한 흑색종(단계 IIIB, IIIC, 또는 IVM1a)을 갖는 성인의 치료용으로 유럽 의약청(EMA)의 승인을 받았다. 특히, EMA 승인 제품은 초음파 유도로 가시성, 촉지성 또는 검출 가능한 피부, 피하, 및/또는 결절성 병변으로의 병변내 주사(종양내 투여)로 투여되어야 한다.
일부 구현예에서, 재조합 종양 용해성 바이러스는 혈청형 5 아데노바이러스와 같은 재조합 아데노바이러스이다. 하나의 구현예에서, 재조합 아데노바이러스는 이전에 Onyx-015로서 공지된 온코린(H101)이다. 온코린은 바이러스 E1B-55k 및 바이러스 E3 유전자의 불활성화(기능적 결실)에 의해 조작된 혈청형 5 아데노바이러스이다. 온코린은 화학요법(항종양제 요법)과 함께 두경부암 치료용으로 중국 식품의약국에 의해 승인받았다.
일부 구현예에서, 재조합 종양 용해성 바이러스는 재조합 폭스바이러스이다. 일부 구현예에서, 폭스바이러스는 백시니아 바이러스 또는 계두 바이러스이다. 일부 구현예에서, 백시니아 바이러스는 변형된 백시니아 앙카라이다. 일부 구현예에서, 재조합 백시니아 바이러스는 숙주 세포의 반응(예: 항바이러스 반응)을 억제하는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 바이러스 유전자의 기능적 결실 및/또는 숙주 세포의 반응(예: 항종양 반응)을 촉진하는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 도입유전자의 결실에 의해 유전자 조작되었다(참조: 예를 들어, Guo et al., Journal of ImmunoTherapy of Cancer, 7:6, 2019). 하나의 구현예에서, 재조합 백시니아 바이러스는 펙사스티모겐 데바시렙벡으로도 공지된 Pexa-Vec 및 바이러스 티미딘 키나제 유전자의 불활성화(기능적 결실) 및 인간 GM-CSF 및 베타-갈락토시다제를 인코딩하는 도입유전자의 삽입에 의해 조작된 백시니아 바이러스인 JX-594이다(참조: Heo et al., Nat Med, 19: 329-336, 2013). 또 다른 구현예에서, 재조합 백시니아 바이러스는 바이러스 티미딘 키나제 및 백시니아 성장 인자 유전자의 기능적 결실 및 케모카인, CXCL11을 인코딩하는 도입유전자의 삽입을 포함한다(참조: 예를 들어, Liu et al., OncoImmunology, 5: 3, e1091554, 2016; and Liu et al., Nature Communications, 8: 14754, 2017).
본 개시내용의 병용 요법의 추가 구현예는 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 추가의 치료제는 면역 체크포인트 억제제, 화학요법(항종양제), 방사선 요법, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 적어도 하나의 억제성 면역 체크포인트 분자의 길항제이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 억제성 면역 체크포인트 분자는 PD-1 (CD279), PD-L1 (CD274) 및 CTLA4 (CD152)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 면역 체크포인트 억제제는 치료적 생물학적 제품일 수 있다. 예를 들어, 면역 체크포인트 억제제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 항체 또는 단편은 모노클로날 항체(mAb), 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체일 수 있고, 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 특정 구현예에서, 인간 불변 영역은 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 이중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab'-SH, F(ab')2, scFv, 및 Fv 단편으로 이루어진 그룹 중 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 화학요법은 적어도 하나의 항종양제(즉, WHO ATC 코드 L01)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항종양제는 세포독성 항생제, 식물 알칼로이드, 항대사물질, 알킬화제, 다른 항종양제, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 화학요법과 관련하여 사용되는 바와 같이, 항종양제는 "치료적 생물학적 제품"과 대조적으로 "약물"이다.
일부 구현예에서, 방사선 요법은 외부 빔 방사선 요법이다. 다른 구현예에서, 방사선 요법은 내부 방사선 요법이다. 일부 구현예에서, 방사선 요법은 절제 방사선 요법이다.
본원에서 사용되는 용어 "바이오시밀러"는 연방 의약국(FDA) 승인된 참조 제품과 유사하지만, 안전성 및 효능에 임상적으로 의미 있는 차이가 없는 생물학적 제품을 지칭한다. 예를 들어, 임상적으로 불활성 성분에서 바이오시밀러 제품과 참조 제품 사이에 차이(예: 제형의 부형제의 차이, 글리코실화의 사소한 차이 등)가 있을 수 있다. 임상적으로 의미 있는 특성은 약동학적 및 약력학적 연구를 통해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오시밀러 제품은 FDA에 의해 결정된 바와 같은 상호교환가능한 제품이다. 일부 구현예에서, 암 백신은 FDA 승인 제품의 바이오시밀러이다.
IV. 조성물, 제형 및 투여 경로
본원에 개시된 임의의 화합물, 또는 이의 염, 또는 이의 용매화물의 약제학적 조성물은 본 개시내용에 포함된다. 따라서, 본 개시내용은 Cbl-b 억제제, 또는 본원에 개시된 이의 임의의 변형, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 또는 이의 호변이성체, 또는 이의 입체이성체 또는 입체이성체의 혼합물, 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 비히클 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하며, 여기서 Cbl-B 억제제는 화학식 I, I-a, I-b, I-A 내지 I-J, II-A 내지 II-H, III-A 내지 III-H, 또는 IV-A 내지 IV-H의 화합물이다. 일부 구현예에서, 화합물은 표 1의 화합물 번호 1 내지 53으로부터 선택되는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 또는 이의 호변이성체, 또는 이의 입체이성체 또는 입체이성체의 혼합물이다. 한 측면에서, 약제학적으로 허용되는 염은 무기산 또는 유기산으로 형성된 염과 같은 산 부가염이다.
본원에 개시된 화합물 및 조성물은 질환 또는 장애의 치료에 충분한 수준의 화합물을 제공하는 임의의 적합한 형태 및 임의의 적합한 경로로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제 및/또는 추가의 치료제는 장 투여(enteral administration)로 투여된다. 특정 구현예에서, 장 투여는 경구 투여이다. 다른 구현예에서, Cbl-b 억제제 및/또는 추가의 치료제는 비경구 투여로 투여된다. 특정 구현예에서, 비경구 투여는 종양내 주사이다. 특정 구현예에서, 비경구 투여는 정맥내, 복강내 및 피하로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로에 의해서이다.
적합한 투여 경로는 경구 투여, 장 투여, 피하 주사, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 근육내 주사, 흉골내 주사, 복강내 주사, 병소내 주사, 관절내 주사, 종양내 주사 또는 주입 기술을 포함하는 비경구 투여를 포함한다. 화합물 및 조성물은 또한 설하, 점막 투여, 협측 투여, 피하, 척추 투여, 경막외 투여, 뇌실에의 투여, 흡입(예: 미스트 또는 스프레이로서), 비강 투여, 질내 투여, 직장 투여, 국소 투여, 또는 경피 투여, 또는 지속 방출 또는 연장 방출 메카니즘에 의해 투여될 수 있다. 화합물 및 조성물은 필요에 따라 통상적인 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 애주번트 및 비히클을 함유하는 단위 투여 제형으로 투여될 수 있다. 화합물 및 조성물은 특정 또는 영향을 받은 기관 또는 조직에 직접 투여될 수 있다. 화합물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 애주번트 및 비히클과 혼합되어 목적하는 투여 경로에 적합한 조성물을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물은 항원 및 애주번트 중 하나 또는 둘 다와 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 암 항원이다.
본원에 개시된 특정 구현예, 특히 제형이 본원에 기재된 경로를 포함할 뿐만 아니라 본원에 기재된 임의의 다른 투여 경로(예: 경구, 장, 위 등)를 포함하여 주사 또는 다른 비경구 투여용으로 사용되는 구현예에서, 이 방법에 사용되는 제형 및 제제는 멸균성이다. 멸균성 약제학적 제형은 당업자에게 공지된 의약품 등급 멸균화 표준(United States Pharmacopeia Chapters 797, 1072, and 1211; California Business & Professions Code 4127.7; 16 California Code of Regulations 1751, 21 Code of Federal Regulations 211)에 따라 배합되거나 제조된다. "멸균성" 제형은 멸균이거나 모든 살아있는 미생물과 이들의 포자를 함유하지 않거나 본질적으로 함유하지 않는다. 약제학적 제형의 멸균화 방법의 예는 멸균 여과막을 통한 멸균 여과, 감마선과 같은 방사선에의 노출, 및 열 멸균화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
경구 투여는 이의 구현 용이성 및 환자의 순응성으로 인해 유리하다. 환자가 삼키는 데 어려움이 있는 경우, 영양 튜브, 영양 주사기 또는 위루 형성술을 통한 약물의 도입을 사용하여 장내 투여를 달성할 수 있다. 활성 화합물 및, 존재하는 경우, 다른 공투여되는 제제는 영양 튜브, 영양 주사기 또는 위루 형성술을 통한 투여를 위한 제형에 적합한 임의의 다른 약제학적으로 허용되는 부형제로 장내 투여될 수 있다.
정맥내 투여는 또한 화합물 또는 조성물을 가능한 한 신속하게 혈류로 전달하고 위장관으로부터의 흡수의 필요성을 피하기 위해 유리하게 사용될 수 있다.
본원에 사용하기 위한 기재된 화합물 및 조성물은 고체 형태, 액체 형태, 에어로졸 형태, 또는 정제, 환제, 캐플릿, 캡슐(예: 경질 젤라틴 캡슐 또는 연질 탄성 젤라틴 캡슐), 분말 혼합물, 과립, 주사제, 용액, 좌제, 관장제, 결장 세척제, 에멀젼, 분산액, 식품 프리믹스, 카쉐, 트로키, 로젠지, 검, 연고, 습포제(찜질제), 페이스트, 분말, 드레싱, 크림, 패치, 에어로졸(예: 비강 스프레이 또는 흡입제), 겔, 현탁액(예: 수성 또는 비수성 액체 현탁액, 수중유 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼), 엘릭서 또는 투여 경로에 적합한 다른 형태로 투여될 수 있다. 화합물 및 조성물은 또한 리포좀 제형으로 투여될 수 있다. 화합물은 또한 프로드럭으로서 투여될 수 있고, 여기서 프로드럭은 치료된 대상체에서 치료적으로 유효한 형태로 변환된다.
또한, 약제학적 제형은 방부제, 가용화제, 안정제, 재습윤제, 유화제, 감미료, 염료, 조절제, 및 삼투압 조정용 염, 완충제, 코팅제 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 화합물을 포함하는 제형은 또한 가치 있는 치료 특성을 갖는 다른 물질을 함유할 수 있다. 약제학적 제형은 공지된 약제학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 추가의 제형 및 투여 방법은 당업계에 공지되어 있다. 적합한 제형은, 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 문헌[참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, 21st ed. (2005)]에서 찾을 수 있다.
주사 가능한 제제, 예를 들어, 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액은 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사 가능한 제제는 또한 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 가능한 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 프로필렌 글리콜의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매는 물, 식염수, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 또한, 멸균성 불휘발성 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이 목적을 위해, 합성 모노 글리세라이드 또는 디-글리세라이드를 포함한 임의의 블랜드 불휘발성 오일이 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산은 주사제의 제조에 사용될 수 있다.
경구 투여용 고체 투여 형태는 캡슐, 정제, 환제, 분말 및 과립을 포함할 수 있다. 이러한 고체 투여 형태에서, 활성 화합물은 수크로스, 락토스, 탈크 또는 전분과 같은 적어도 하나의 불활성 희석제와 혼합될 수 있다. 이러한 투여 형태는 또한 불활성 희석제 이외의 추가의 부형제 물질, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제를 포함할 수 있다. 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 투여 형태는 또한 완충제를 포함할 수 있다. 정제 및 환제는 장용 코팅으로 추가로 제조될 수 있다. 연질 쉘을 갖는 겔 캡슐에 허용되는 부형제는, 예를 들어, 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체 폴리-올 등이다.
경구 투여용 액체 투여 형태는 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 물과 같은 당업계에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유하는 엘릭서를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 사이클로덱스트린, 및 감미료, 향미제 및 방향제와 같은 추가 제제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 화합물은 또한 적절한 경우 순수한 형태로 투여될 수 있다.
화합물 및 조성물은 또한 리포좀 형태로 투여될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 리포좀은 일반적으로 인지질 또는 다른 지질 물질로부터 유래된다. 리포좀은 수성 매질에 분산된 단층 또는 다층 수화된 액정에 의해 형성된다. 리포좀을 형성할 수 있는 임의의 생리학적으로 허용 가능하고 대사 가능한 지질이 사용될 수 있다. 리포좀 형태의 본 조성물은 본원에 개시된 화합물 이외에 안정화제, 방부제, 부형제 등을 함유할 수 있다. 유용한 지질은 천연 및 합성 둘 모두의, 인지질 및 포스파티딜 콜린(레시틴)을 포함한다. 리포좀을 형성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Gregoriadis, G. Ed., Liposome Technology, Third Edition: Liposome Technology: Liposome Preparation and Related Techniques, CRC Press, Boca Raton, Florida (2006); and Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.W., p. 33 et seq (1976)]을 참조한다.
단일 투여 형태를 생산하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 활성 성분이 투여되는 환자 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 임의의 특정 환자에 대한 특정 투여량 수준은 사용되는 특정 화합물; 환자의 연령, 체중, 체면적, 체질량 지수(BMI), 일반적인 건강 상태, 성별 및 식이; 투여 시간 및 사용된 투여 경로; 배설율; 및 있는 경우, 사용된 약물 조합을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것으로 이해될 것이다. 화합물은 단위 투여 제형으로 투여될 수 있다. 선택된 약제학적 단위 용량은 환자, 대상체 또는 개체에게 충분한 농도의 약물을 제공하도록 제조 및 투여된다.
본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 화합물이 유일한 활성 약제학적 제제로서 투여될 수 있지만, 이들은 또한 하나 이상의 다른 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 추가의 활성제가 본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 화합물과 조합하여 사용되는 경우, 추가의 활성제는 일반적으로 본원에 참조로 포함된 문헌[참조: Physicians' Desk Reference (PDR) 71st Edition (2017)]에 지시된 치료량으로, 또는 당업자에게 공지되거나 각 환자에 대해 경험적으로 결정된 바와 같은 이러한 치료적으로 유용한 양으로 사용될 수 있다.
본원에 개시된 2종 이상의 화합물 및 조성물의 조합이 또한 사용될 수 있다. 2종 이상의 화합물 또는 조성물은 투여 직전에 함께 혼합되어 함께 투여될 수 있다. 2종 이상의 화합물 또는 조성물은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로로 동시에 투여될 수 있다. 2종 이상의 화합물 또는 조성물은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로로 연속적으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 키트 형태는 화합물의 혼합물 또는 조성물로서, 동시에 투여되는 별개의 화합물 또는 조성물로서, 또는 연속적으로 투여되는 별개의 화합물 또는 조성물로서 투여하기 위한 인쇄된 또는 전자 설명서와 함께 개별 화합물 또는 조성물로서 2개 이상의 화합물 또는 조성물을 함유할 수 있다. 3개 이상의 화합물 또는 조성물이 투여되는 경우, 이들은 화합물 또는 조성물의 혼합물로서, 동시에 투여되는 별개의 화합물 또는 조성물로서, 연속적으로 투여되는 별개의 화합물 또는 조성물로서, 2개 이상이 동시에 투여될 수 있고 나머지는 동시 투여 전 또는 후, 또는 혼합 투여, 동시 투여, 및 연속 투여의 임의의 다른 가능한 조합으로 연속적으로 투여되는 별개의 화합물 또는 조성물로서 투여될 수 있다.
본원에 개시된 화합물은 한 측면에서 정제된 형태로 존재할 수 있고, 정제된 형태의 화합물을 포함하는 조성물이 본원에 개시된다. 본원에 개시된 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물, 예를 들어 실질적으로 순수한 화합물의 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 화합물 또는 이의 염을 함유하는 조성물은 실질적으로 순수한 형태이다. 하나의 변형에서, "실질적으로 순수한"은 35% 이하의 불순물을 함유하는 조성물을 지칭하고, 여기서 불순물은 조성물에 투여되는 화합물(또는 화합물의 조합이 사용되는 경우, 화합물), 또는 화합물(또는 조합이 사용되는 경우, 화합물)의 염 또는 용매화물 이외의 화합물을 나타낸다. 임의의 첨가된 비히클, 담체 또는 부형제의 중량은 이러한 계산으로부터 배제되며, 첨가된 비히클, 담체 또는 부형제는 불순물로 간주되지 않는다. 예를 들어, 표 1의 화합물로부터 선택되는 실질적으로 순수한 화합물의 조성물은 35% 이하의 불순물을 함유하는 조성물을 지칭하고, 여기서 불순물은 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물 이외의 화합물을 나타낸다. 하나의 변형에서, 실질적으로 순수한 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물의 조성물이 제공되며, 여기서 상기 조성물은 25% 이하의 불순물을 함유한다. 다른 변형에서, 실질적으로 순수한 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물의 조성물이 제공되며, 여기서 상기 조성물은 20% 이하의 불순물을 함유한다. 또 다른 변형에서, 실질적으로 순수한 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물의 조성물이 제공되며, 여기서 상기 조성물은 10% 이하의 불순물을 함유한다. 추가의 변형에서, 실질적으로 순수한 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물의 조성물이 제공되며, 여기서 상기 조성물은 5% 이하의 불순물을 함유한다. 다른 변형에서, 실질적으로 순수한 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물의 조성물이 제공되며, 여기서 상기 조성물은 3% 이하의 불순물을 함유한다. 또 다른 변형에서, 실질적으로 순수한 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물의 조성물이 제공되며, 여기서 상기 조성물은 1% 이하의 불순물을 함유한다. 추가의 변형에서, 실질적으로 순수한 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물의 조성물이 제공되며, 여기서 상기 조성물은 0.5% 이하의 불순물을 함유한다. 또 다른 변형에서, 실질적으로 순수한 화합물의 조성물은 조성물이 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 3% 이하, 또는 1% 이하의 불순물을 함유함을 의미한다. 불순물은 목적하는 입체화학적 형태와 상이한 입체화학적 형태의 화합물일 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 순수한 (S)-화합물의 조성물은 조성물이 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 3% 이하, 또는 1% 이하의 (R)-형태의 화합물을 함유함을 의미한다. 대안적으로, 본원에서 사용되는 바와 같이, "거울상이성체 과량(ee)"은, 예를 들어, 단일 입체 중심을 함유하는 키랄 물질의 순도를 나타내는 무차원 몰 비를 지칭한다. 예를 들어, 0인 거울상이성체 과량은 라세미체(예: 거울상이성체의 50:50 혼합물, 또는 하나의 거울상이성체가 다른 것에 비해 과량 없음)를 나타낸다. 추가의 예로서, 99인 거울상이성체 과량은 거의 입체순수한 거울상이성체 화합물(즉, 하나의 거울상이성체가 다른 것에 비해 큰 과량)임을 나타낸다. 거울상이성체 과량 백분율, % ee = ([(R)-화합물]-[(S)-화합물])/([(R)-화합물] + [(S)-화합물]) x 100, 여기서 (R)-화합물 > (S)-화합물이고; 또는 % ee = ([(S)-화합물]-[(R)-화합물])/([(S)-화합물] + [(R)-화합물]) x 100, 여기서 (S)-화합물>(R)-화합물이다. 더욱이, 본원에서 사용되는 바와 같이, "부분입체이성체 과량(de)"은 하나 이상의 입체 중심을 함유하는 키랄 물질의 순도를 나타내는 무차원 몰 비를 지칭한다. 예를 들어, 부분입체이성체 과량 0은 부분입체이성체의 등몰 혼합물을 나타낸다. 추가의 예로서, 99인 부분입체이성체 과량은 거의 입체순수한 부분입체이성체 화합물(즉, 하나의 부분입체이성체가 다른 것에 비해 큰 과량)을 나타낸다. 부분입체이성체 과량은 ee와 유사한 방법을 통해 계산될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, de는 일반적으로 퍼센트 de(% de)로서 보고된다. % de는 % ee와 유사한 방식으로 계산될 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 것들 또는 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 것들과 같은 변형된 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물은 본원에 기재된 Cbl-b 억제제 또는 이의 조성물과 접촉되었거나 접촉되어 있는 변형된 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 항-CD3 항체 단독과 접촉되었거나 접촉되어 있다. 일부 구현예에서, 변형된 면역 세포는 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체와 접촉되었거나 접촉되어 있다. 본원에 기재된 변형된 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 포함하는 제공된 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 면역 세포 및 Cbl-b 억제제를 함유하는 세포 집단을 포함하는 세포 배양 조성물도 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 조혈 세포, 다능성 줄기 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, T-세포, B-세포 및 NK-세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포이다. 일부 구현예에서, 세포 배양 조성물은 항-CD3 항체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 조성물은 항-CD28 항체와 조합된 항-CD3 항체를 추가로 포함한다. 면역 세포를 함유하는 세포 조성물을 배양하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있으며, 본원에서 고려된다.
본원에 기재된 변형된 면역 세포 또는 조성물, 예를 들어, 변형된 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 포함하는 조성물 또는 약제학적 조성물은 적합한 용기(container)에 제공될 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알(예: 이중 챔버 바이알), 주사기(예: 단일 또는 이중 챔버 주사기), 백(bag)(예: 정맥내 백), 및 튜브(예: 시험관)를 포함한다. 용기는 유리 및 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 포함하는 조성물(예: 세포 배양 조성물)은 배양 베쎌(culture vessel)에 제공된다. 본원에서 제공되는 배양 베쎌은 튜브(예: 시험관), 접시(예: 조직 배양 접시), 백, 멀티웰 플레이트(multiwell plate)(예: 6-웰 조직 배양 플레이트) 및 플라스크(예: 세포 배양 플라스크)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 임의의 용도를 위한 본원에 기재된 조성물이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 Cbl-b 활성과 관련된 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 암을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 것이다.
암 백신과 함께 사용하기 위한 본원에 개시된 임의의 화합물, 또는 이의 염 또는 용매화물의 약제학적 조성물은 본 개시내용에 포함된다. 따라서, 본 개시내용은 암 백신과 함께 사용하기 위한 Cbl-b 억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하고, 여기서 Cbl-b 억제제는 국제 특허 출원 WO 2019/148005의 화합물 1-719(이의 "a" 및 "b" 변이체를 포함) 또는 그 안에 개시된 화학식 I-A, 화학식 I, 화학식 II-A, 화학식 II, 화학식 III-A, 화학식 III 또는 화학식 IV 중 어느 하나의 화합물, 또는 이의 임의의 변형, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 또는 이의 호변이성체, 또는 이의 입체이성체 또는 입체이성체의 혼합물이다. 또한, 종양 용해성 바이러스와 조합하여 사용하기 위한 본원에 개시된 임의의 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물의 약제학적 조성물이 본 개시내용에 포함된다. 따라서, 본 개시내용은 종양 용해성 바이러스와 조합하여 사용하기 위한 Cbl-b 억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하고, 여기서 Cbl-b 억제제는 국제 특허 출원 WO 2019/148005의 화합물 1-719(이의 "a" 및 "b" 변이체를 포함) 또는 그 안에 개시된 화학식 I-A, 화학식 I, 화학식 II-A, 화학식 II, 화학식 III-A, 화학식 III 또는 화학식 IV 중 어느 하나의 화합물, 또는 이의 임의의 변형, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 또는 이의 호변이성체, 또는 이의 입체이성체 또는 입체이성체의 혼합물이다. 조성물은 약제학적으로 허용되는 비히클 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 소분자 Cbl-b 억제제 및 암 백신 둘 모두를 포함한다. 또한, 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 소분자 Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 화합물은 하기 특허 출원에 개시된 Cbl-b 억제제로부터 선택되는 화합물이다: 미국 특허 출원 제62/866,914호의 화합물 1 내지 53 또는 그 안의 화학식 I의 화합물; 미국 특허 출원 제62/880,285호의 화합물 1 내지 53 또는 그 안의 화학식 I의 화합물; 또는 이의 임의의 변형, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물, 또는 이의 호변이성체, 또는 이의 입체이성체 또는 입체이성체의 혼합물.
한 측면에서, 약제학적으로 허용되는 염은 무기산 또는 유기산으로 형성된 염과 같은 산 부가염이다.
본원에 개시된 화합물, 백신, 및 조성물은 질환 또는 장애의 치료에 충분한 수준의 화합물, 백신, 또는 조성물을 제공하는 임의의 적합한 형태 및 임의의 적절한 경로로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제 및/또는 암 백신은 장 투여로 투여된다. 본원에 개시된 화합물, 종양 용해성 바이러스, 및 조성물은 질환 또는 장애의 치료에 충분한 수준의 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물을 제공하는 임의의 적합한 형태 및 임의의 적절한 경로로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, Cbl-b 억제제 및/또는 종양 용해성 바이러스는 장 투여로 투여된다. 일부 구현예에서, 장 투여는 경구 투여이다. 다른 구현예에서, Cbl-b 억제제 및/또는 암 백신은 비경구 투여로 투여된다. 다른 구현예에서, Cbl-b 억제제 및/또는 종양 용해성 바이러스는 비경구 투여로 투여된다. 일부 구현예에서, 비경구 투여는 종양내 주사이다. 일부 구현예에서, 비경구 투여는 정맥내, 복강내 및 피하로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로에 의해서이다.
적합한 투여 경로는 경구 투여, 장 투여, 피하 주사, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 근육내 주사, 흉골내 주사, 복강내 주사, 병변내 주사, 관절내 주사, 종양내 주사 또는 주입 기술을 포함하는 비경구 투여를 포함한다. 화합물, 백신 및 조성물은 또한 설하, 점막 투여, 협측 투여, 피하, 척추 투여, 경막외 투여, 뇌실에의 투여, 흡입(예: 미스트 또는 스프레이로서), 비강 투여, 질내 투여, 직장 투여, 국소 투여, 또는 경피 투여, 또는 지속 방출 또는 연장 방출 메커니즘에 의해 투여될 수 있다. 화합물, 백신, 및 조성물은 필요에 따라 통상적인 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 애주번트 및 비히클을 함유하는 단위 용량 제형으로 투여될 수 있다. 화합물, 백신, 및 조성물은 특정 또는 영향을 받은 기관 또는 조직에 직접 투여될 수 있다. 화합물 및/또는 백신은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 애주번트 및 비히클과 혼합되어 목적하는 투여 경로에 적합한 조성물을 형성할 수 있다. 화합물, 종양 용해성 바이러스 및 조성물은 또한 설하, 점막 투여, 협측 투여, 피하, 척추 투여, 경막외 투여, 뇌실에의 투여, 흡입(예: 미스트 또는 스프레이로서), 비강 투여, 질내 투여, 직장 투여, 국소 투여 또는 경피 투여, 또는 지속 방출 또는 연장 방출 메카니즘에 의해 투여될 수 있다. 화합물, 종양 용해성 바이러스, 및 조성물은 필요에 따라 통상적인 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 애주번트 및 비히클을 함유하는 단위 용량 제형으로 투여될 수 있다. 화합물, 종양 용해성 바이러스, 및 조성물은 특정 또는 영향을 받은 기관 또는 조직에 직접 투여될 수 있다. 화합물 및/또는 종양 용해성 바이러스는 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 애주번트 및 비히클과 혼합되어 목적하는 투여 경로에 적합한 조성물을 형성할 수 있다.
본원에 개시된 특정 구현예, 특히 제형이 주사 또는 본원에 나열된 경로를 포함할 뿐만 아니라 본원에 기재된 임의의 다른 투여 경로(예: 경구, 장내, 위)를 포함하는 다른 비경구 투여용으로 사용되는 구현예에서, 상기 방법에 사용된 제형 및 제제는 특정 암 백신에 미생물 벡터가 존재한다는 것을 제외하고 무균성이다. 이러한 제제를 제조하기 위해, 제형 또는 제제의 모든 성분은 미생물 벡터와 조합하기 전에 멸균 방식으로 제조된다. 본원에 개시된 특정 구현예, 특히 제형이 주사 또는 본원에 나열된 경로를 포함할 뿐만 아니라 본원에 기재된 임의의 다른 투여 경로(예: 경구, 장내, 위 등)를 포함하는 다른 비경구 투여용으로 사용되는 구현예에서, 이 방법에 사용되는 제형 및 제제는 종양 용해성 바이러스의 존재를 제외하고 무균성이다. 이러한 제제를 제조하기 위해, 제형 또는 제제의 모든 성분은 종양 용해성 바이러스와 조합하기 전에 멸균 방식으로 제조된다. 멸균 약제학적 제형은 당업자에게 공지된 의약품 등급 멸균화 표준(United States Pharmacopeia Chapters 797, 1072, and 1211; California Business & Professions Code 4127.7; 16 California Code of Regulations 1751, 21 Code of Federal Regulations 211)에 따라 배합되거나 제조된다. "멸균성" 제형은 무균이거나 모든 살아있는 미생물과 이들의 포자를 함유하지 않거나 본질적으로 함유하지 않는다. 약제학적 제형의 멸균화 방법의 예는 멸균 여과막을 통한 멸균 여과, 감마선과 같은 방사선에의 노출, 및 열 멸균화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
경구 투여는 이의 구현 용이성 및 환자 순응성으로 인해 유리하다. 환자가 삼키는 데 어려움이 있는 경우, 영양 튜브, 영양 주사기 또는 위루 형성술을 통한 약물의 도입을 사용하여 장내 투여를 달성할 수 있다. 활성 화합물, 백신, 또는 조성물 및, 존재하는 경우, 다른 공투여된 제제는 영양 튜브, 영양 주사기 또는 위루 형성술을 통한 투여를 위한 제형에 적합한 임의의 다른 약제학적으로 허용되는 부형제로 장내 투여될 수 있다. 활성 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물 및, 존재하는 경우, 다른 공투여된 제제는 영양 튜브, 영양 주사기, 또는 위루 형성술을 통한 투여를 위한 제형에 적합한 임의의 다른 약제학적으로 허용되는 부형제로 장내 투여될 수 있다.
정맥내 투여는 또한 화합물, 백신, 또는 조성물을 가능한 한 신속하게 혈류로 전달하고, 위장관으로부터의 흡수에 대한 필요성을 회피하기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 정맥내 투여는 또한 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물을 가능한 한 신속하게 혈류로 전달하고 위장관으로부터의 흡수에 대한 필요성을 회피하기 위해 유리하게 사용될 수 있다.
본원에 사용하기 위한 기재된 화합물, 백신 및 조성물은 고체 형태, 액체 형태, 에어로졸 형태, 또는 정제, 환제, 캐플릿, 캡슐(예: 경질 젤라틴 캡슐 또는 연질 탄성 젤라틴 캡슐), 분말 혼합물, 과립, 주사제, 용액, 좌제, 관장제, 결장 세척제, 에멀젼, 분산액, 식품 프리믹스, 카쉐, 트로키, 로젠지, 검, 연고, 습포제(찜질제), 페이스트, 분말, 드레싱, 크림, 패치, 에어로졸(예: 비강 스프레이 또는 흡입제), 겔, 현탁액(예: 수성 또는 비수성 액체 현탁액, 수중유 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼), 엘릭서, 또는 투여 경로에 적합한 다른 형태로 투여될 수 있다. 화합물, 백신 및 조성물은 또한 리포좀 제형으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용하기 위한 기재된 화합물, 종양 용해성 바이러스 및 조성물은 고체 형태, 액체 형태, 에어로졸 형태, 또는 정제, 환제, 캐플릿, 캡슐(예: 경질 젤라틴 캡슐 또는 연질 탄성 젤라틴 캡슐), 분말 혼합물, 과립, 주사제, 용액, 좌제, 관장제, 결장 세척제, 에멀젼, 분산액, 식품 프리믹스, 카쉐, 트로키, 로젠지, 검, 연고, 습포제(찜질제), 페이스트, 분말, 드레싱, 크림, 패치, 에어로졸(예: 비강 스프레이 또는 흡입제), 겔, 현탁액(예: 수성 또는 비수성 액체 현탁액, 수중유 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼), 엘릭서, 또는 투여 경로에 적합한 다른 형태로 투여될 수 있다. 화합물, 종양 용해성 바이러스 및 조성물은 또한 리포좀 제형으로 투여될 수 있다. 화합물은 또한 프로드럭으로서 투여될 수 있고, 여기서 프로드럭은 치료된 대상체에서 치료적으로 유효한 형태로 전환된다.
또한, 약제학적 제형은 방부제, 가용화제, 안정제, 재습윤제, 유화제, 감미료, 염료, 조정제, 및 삼투압 조정용 염, 완충제, 코팅제 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 화합물, 백신, 또는 조성물을 포함하는 제형은 또한 가치 있는 치료 특성을 갖는 다른 물질을 함유할 수 있다. 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물을 포함하는 제형은 또한 가치 있는 치료 특성을 갖는 다른 물질을 함유할 수 있다. 약제학적 제형은 공지된 약제학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 추가의 제형 및 투여 방법은 당업계에 공지되어 있다. 적합한 제형은, 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 문헌[참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, 21st ed. (2005)]에서 찾을 수 있다.
주사 가능한 제제, 예를 들어, 소분자 Cbl-b 억제제의 무균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사 가능한 제제는 또한 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 가능한 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 프로필렌 글리콜 중 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매는 물, 식염수, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 또한, 멸균 불휘발성 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이 목적을 위해, 합성 모노글리세라이드 또는 디-글리세라이드를 포함한 임의의 블랜드 불휘발성 오일이 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산은 주사제의 제조에 사용될 수 있다.
경구 투여용 고체 투여 형태는 캡슐, 정제, 환제, 분말 및 과립을 포함할 수 있다. 이러한 고체 투여 형태에서, 활성 화합물, 백신, 또는 조성물은 수크로스, 락토스, 탈크 또는 전분과 같은 적어도 하나의 불활성 희석제와 혼합될 수 있다. 이러한 고체 투여 형태에서, 활성 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물은 수크로스, 락토스, 탈크 또는 전분과 같은 적어도 하나의 불활성 희석제와 혼합될 수 있다. 이러한 투여 형태는 또한 불활성 희석제 이외의 추가의 부형제 물질, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제를 포함할 수 있다. 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 투여 형태는 또한 완충제를 포함할 수 있다. 정제 또는 환제는 추가로 장용 코팅으로 제조될 수 있다. 연질 쉘을 갖는 겔 캡슐에 허용되는 부형제는, 예를 들어, 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체 폴리-올 등이다.
경구 투여용 액체 투여 형태는 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 물과 같은 당업계에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유하는 엘릭서를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 추가의 제제, 예를 들어, 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 사이클로덱스트린, 및 감미제, 향미제 및 방향제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 화합물은 또한 적절한 경우 순수한 형태로 투여될 수 있다.
화합물, 백신, 및 조성물은 또한 리포좀의 형태로 투여될 수 있다. 화합물, 종양 용해성 바이러스, 및 조성물은 또한 리포좀의 형태로 투여될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 리포좀은 일반적으로 인지질 또는 다른 지질 물질로부터 유래된다. 리포좀은 수성 매질에 분산된 단층 또는 다층 수화된 액정에 의해 형성된다. 리포좀을 형성할 수 있는 임의의 생리학적으로 허용 가능하고 대사 가능한 지질이 사용될 수 있다. 리포좀 형태의 본 조성물은 본원에 개시된 화합물 또는 백신 이외에 안정화제, 방부제, 부형제 등을 함유할 수 있다. 리포좀 형태의 본 조성물은 본원에 개시된 화합물 또는 종양 용해성 바이러스 이외에 안정화제, 방부제, 부형제 등을 함유할 수 있다. 유용한 지질은 천연 및 합성 둘 모두의, 인지질 및 포스파티딜 콜린(레시틴)을 포함한다. 리포좀을 형성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Gregoriadis, G. Ed., Liposome Technology, Third Edition: Liposome Technology: Liposome Preparation and Related Techniques, CRC Press, Boca Raton, Florida (2006); and Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.W., p. 33 et seq (1976)]을 참조한다.
단일 투여 형태를 생산하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 활성 성분이 투여되는 환자 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 임의의 특정 환자의 특정 투여량 수준은 사용되는 특정 화합물 또는 백신; 환자의 연령, 체중, 체면적, 체질량 지수(BMI), 일반적인 건강 상태, 성별 및 식이; 투여 시간 및 사용된 투여 경로; 배설율; 및, 존재하는 경우, 사용된 약물 조합을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것으로 이해될 것이다. 화합물, 백신, 및 조성물은 단위 투여 제형으로 투여될 수 있다. 그러나, 임의의 특정 환자의 특정 투여량 수준은 사용되는 특정 화합물 또는 종양 용해성 바이러스; 환자의 연령, 체중, 체면적, 체질량 지수(BMI), 일반적인 건강 상태, 성별 및 식이; 투여 시간 및 사용된 투여 경로; 배설율; 및, 존재하는 경우, 사용된 약물 조합을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것으로 이해될 것이다. 화합물, 종양 용해성 바이러스 및 조성물은 단위 투여 제형으로 투여될 수 있다. 선택된 약제학적 단위 용량은 환자, 대상체 또는 개체에게 충분한 농도의 약물을 제공하도록 제조 및 투여된다.
본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 화합물, 백신 및 조성물은 유일한 활성 약제학적 제제로서 투여될 수 있지만, 이들은 또한 하나 이상의 다른 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 추가 활성제가 본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 화합물, 백신, 또는 조성물과 조합하여 사용되는 경우, 추가 활성제는 일반적으로 본원에 참조로 포함된 문헌[참조: Physicians' Desk Reference (PDR) 71st Edition (2017)]에 제시된 치료량, 또는 당업자에게 공지된 바와 같거나 각 환자에 대해 경험적으로 결정되는 바와 같은 이러한 치료적으로 유용한 양으로 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 화합물, 종양 용해성 바이러스 및 조성물이 유일한 활성 약제학적 제제로서 투여될 수 있지만, 이들은 또한 하나 이상의 다른 제제와 함께 조합하여 사용될 수 있다. 추가 활성제가 본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물과 조합하여 사용되는 경우, 추가 활성제는 일반적으로 본원에 참조로 포함된 문헌[참조: Physicians' Desk Reference (PDR) 71st Edition (2017)]에 제시된 치료량, 또는 당업자에게 공지된 바와 같거나 각 환자에 대해 경험적으로 결정되는 바와 같은 이러한 치료적으로 유용한 양으로 사용될 수 있다.
본원에 개시된 화합물, 백신, 및 조성물의 둘 이상의 조합이 또한 사용될 수 있다. 둘 이상의 화합물, 백신, 또는 조성물은 투여 직전에 함께 혼합되고 함께 투여될 수 있다. 2종 이상의 화합물, 백신, 또는 조성물은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로로 동시에 투여될 수 있다. 2종 이상의 화합물, 백신, 또는 조성물은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로로 연속적으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 키트 형태는 개별 화합물, 백신, 또는 조성물로서 2종 이상의 화합물, 백신, 또는 조성물을, 화합물, 백신, 또는 조성물의 혼합물로서, 동시에 투여되는 별도의 화합물, 백신 또는 조성물로서, 또는 연속적으로 투여되는 별도의 화합물, 백신 또는 조성물로서 투여하기 위한 인쇄된 또는 전자 설명서와 함께 함유할 수 있다. 3개 이상의 화합물, 백신, 또는 조성물이 투여되는 경우, 이들은 화합물, 백신, 또는 조성물의 혼합물로서, 동시에 투여되는 별도의 화합물, 백신, 또는 조성물로서, 연속적으로 투여되는 별도의 화합물, 백신, 또는 조성물로서, 2개 이상이 동시에 투여될 수 있고 나머지는 동시 투여 전 또는 후, 또는 혼합 투여, 동시 투여 및 연속 투여의 임의의 다른 가능한 조합으로 연속적으로 투여되는 별도의 화합물, 백신 또는 조성물로서 투여될 수 있다. 본원에 개시된 2종 이상의 화합물, 종양 용해성 바이러스, 및 조성물의 조합이 또한 사용될 수 있다. 2종 이상의 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물은 투여 직전에 함께 혼합되어 함께 투여될 수 있다. 2종 이상의 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로로 동시에 투여될 수 있다. 2종 이상의 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로로 연속적으로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 키트 형태는 개별 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물로서 2종 이상의 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물을, 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물의 혼합물로서, 동시에 투여되는 별도의 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물로서, 또는 연속적으로 투여되는 별도의 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물로서 투여하기 위한 인쇄된 또는 전자 설명서와 함께 함유할 수 있다. 3개 이상의 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물이 투여되는 경우, 이들은 화합물, 종양 용해성 바이러스 또는 조성물의 혼합물로서, 동시에 투여되는 별도의 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물로서, 연속적으로 투여되는 별도의 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물로서, 2종 이상이 동시에 투여될 수 있고 나머지는 동시 투여 전 또는 후, 또는 혼합 투여, 동시 투여 및 연속 투여의 임의의 다른 가능한 조합으로 연속적으로 투여되는 별도의 화합물, 종양 용해성 바이러스 또는 조성물로서 투여될 수 있다.
본원에 기재된 약제학적 조성물 및 방법에 사용하기 위한 본원에 개시된 화합물은 한 측면에서 정제된 형태로 존재할 수 있고, 정제된 형태의 화합물을 포함하는 조성물이 본원에 개시된다. 본원에 개시된 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물, 예를 들어, 실질적으로 순수한 화합물의 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 화합물 또는 이의 염을 함유하는 조성물은 실질적으로 순수한 형태이다. 하나의 변형에서, "실질적으로 순수한"은 35% 이하의 불순물을 함유하는 조성물을 지칭하고, 여기서 불순물은 조성물에 투여되는 화합물(또는 화합물의 조합이 사용되는 경우, 화합물), 또는 화합물(또는 조합이 사용되는 경우, 화합물)의 염 또는 용매화물 이외의 화합물을 나타낸다. 임의의 첨가된 비히클, 담체 또는 부형제의 중량은 이러한 계산으로부터 배제되며, 첨가된 비히클, 담체 또는 부형제는 불순물로서 간주되지 않는다. 예를 들어, 표 1의 화합물로부터 선택되는 실질적으로 순수한 화합물의 조성물은 35% 이하의 불순물을 함유하는 조성물을 지칭하고, 여기서 불순물은 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물 이외의 화합물을 나타낸다. 하나의 변형에서, 실질적으로 순수한 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물의 조성물이 제공되며, 여기서 상기 조성물은 25% 이하의 불순물을 함유한다. 다른 변형에서, 실질적으로 순수한 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물의 조성물이 제공되며, 여기서 상기 조성물은 20% 이하의 불순물을 함유한다. 또 다른 변형에서, 실질적으로 순수한 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물의 조성물이 제공되며, 여기서 상기 조성물은 10% 이하의 불순물을 함유한다. 추가의 변형에서, 실질적으로 순수한 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물의 조성물이 제공되며, 여기서 상기 조성물은 5% 이하의 불순물을 함유한다. 다른 변형에서, 실질적으로 순수한 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물의 조성물이 제공되며, 여기서 상기 조성물은 3% 이하의 불순물을 함유한다. 또 다른 변형에서, 실질적으로 순수한 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물의 조성물이 제공되며, 여기서 상기 조성물은 1% 이하의 불순물을 함유한다. 추가의 변형에서, 실질적으로 순수한 화합물 또는 이의 염 또는 용매화물의 조성물이 제공되며, 여기서 상기 조성물은 0.5% 이하의 불순물을 함유한다. 또 다른 변형에서, 실질적으로 순수한 화합물의 조성물은 조성물이 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 3% 이하, 또는 1% 이하의 불순물을 함유함을 의미한다. 불순물은 목적하는 입체화학적 형태와 상이한 입체화학적 형태로 배합될 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 순수한 (S)-화합물의 조성물은 조성물이 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 3% 이하, 또는 1% 이하의 (R)-형태의 화합물을 함유함을 의미한다. 대안적으로, 본원에서 사용되는 바와 같이, "거울상이성체 과량(ee)"은, 예를 들어, 단일 입체 중심을 함유하는 키랄 물질의 순도를 나타내는 무차원 몰 비를 지칭한다. 예를 들어, 0인 거울상이성체 과량은 라세미체(예: 거울상이성체의 50:50 혼합물, 또는 하나의 거울상이성체가 다른 것에 비해 과량 없음)를 나타낸다. 추가의 예로서, 99인 거울상이성체 과량은 거의 입체순수한 거울상이성체 화합물(즉, 하나의 거울상이성체가 다른 것에 비해 큰 과량)임을 나타낸다. 거울상이성체 과량 백분율, % ee = ([(R)-화합물]-[(S)-화합물])/([(R)-화합물] + [(S)-화합물]) x 100, 여기서 (R)-화합물 > (S)-화합물이고; 또는 % ee = ([(S)-화합물]-[(R)-화합물])/([(S)-화합물] + [(R)-화합물]) x 100, 여기서 (S)-화합물 > (R)-화합물이다. 더욱이, 본원에서 사용되는 바와 같이, "부분입체이성체 과량(de)"은 하나 이상의 입체 중심을 함유하는 키랄 물질의 순도를 나타내는 무차원 몰 비를 지칭한다. 예를 들어, 부분입체이성체 과량 0은 부분입체이성체의 등몰 혼합물을 나타낸다. 추가의 예로서, 99인 부분입체이성체 과량은 거의 입체순수한 부분입체이성체 화합물(즉, 하나의 부분입체이성체가 다른 것에 비해 큰 과량)을 나타낸다. 부분입체이성체 과량은 ee와 유사한 방법을 통해 계산될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, de는 일반적으로 퍼센트 de(% de)로서 보고된다. % de는 % ee와 유사한 방식으로 계산될 수 있다.
본원에 개시된 화합물, 백신, 또는 조성물은 적합한 용기에 제공될 수 있다. 본원에 개시된 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 조성물은 적합한 용기에 제공될 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알(예: 이중 챔버 바이알), 주사기(예: 단일 또는 이중 챔버 주사기), 백(예: 정맥내 백), 및 튜브(예: 시험관)를 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다.
V. 제조 물품 또는 키트
본원에 기재된 화합물, 약제학적 조성물, 세포, 변형된 면역 세포, 세포 집단, 세포 조성물, 세포 배양물, 또는 세포 배양 조성물 중 임의의 것을 포함하는 제조 물품이 또한 제공된다. 제조 물품은 화합물, 약제학적 조성물, 세포, 변형된 면역 세포, 세포 집단, 세포 조성물, 세포 배양물, 또는 세포 배양 조성물에 적합한 용기 또는 패키징 재료를 포함한다. 적합한 용기의 예는 병, 바이알, 주사기, 정맥내 백 또는 튜브를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 세포, 변형된 면역 세포, 세포 집단, 세포 조성물, 세포 배양물 또는 세포 배양 조성물의 경우, 적합한 용기는 튜브, 접시, 백, 멀티웰 플레이트 또는 플라스크를 포함하지만 이에 제한되지 않는 배양 베쎌일 수 있다.
본원에 기재된 화합물, 약제학적 조성물, 세포, 변형된 면역 세포, 세포 집단, 세포 조성물, 세포 배양물 또는 세포 배양 조성물 중 임의의 것을 포함하는 키트도 또한 제공된다. 키트는 병, 바이알, 주사기, 정맥내 백, 또는 튜브를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적합한 용기 또는 패키징 재료에 화합물, 약제학적 조성물, 세포, 변형된 면역 세포, 세포 집단, 세포 조성물, 세포 배양물, 또는 세포 배양 조성물을 함유할 수 있다. 키트는 튜브, 접시, 백, 멀티웰 플레이트, 또는 플라스크를 포함하지만 이에 제한되지 않는 배양 베쎌에 세포, 변형된 면역 세포, 세포 집단, 세포 조성물, 세포 배양물 또는 세포 배양 조성물을 함유할 수 있다. 키트는 단일 투여 형태 또는 다중 투여 형태로 개체에게 투여하기 위한 화합물, 약제학적 조성물, 세포, 변형된 면역 세포, 세포 집단, 세포 조성물, 세포 배양물 또는 세포 배양 조성물을 포함할 수 있다. 키트는 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 화합물, 약제학적 조성물, 세포, 변형된 면역 세포, 세포 집단, 세포 조성물, 세포 배양물 또는 세포 배양 조성물을 개체에게 투여하기 위한 설명서 또는 라벨을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 바늘, 주사기, 튜브 또는 정맥내 백을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 화합물, 약제학적 조성물, 세포, 변형된 면역 세포, 세포 집단, 세포 조성물, 세포 배양물, 또는 세포 배양 조성물을 개체에게 투여하기 위한 장치를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 본원에 개시된 화합물, 약제학적 조성물, 세포, 변형된 면역 세포, 세포 집단, 세포 조성물, 세포 배양물, 또는 세포 배양 조성물 중 어느 하나를 생산하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 화합물, 백신, 또는 약제학적 조성물을 포함하는 제조 물품도 또한 제공된다. 제조 물품은 화합물, 백신, 또는 약제학적 조성물에 적합한 용기 또는 패키징 재료를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 약제학적 조성물을 포함하는 제조 물품도 또한 제공된다. 제조 물품은 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 약제학적 조성물에 적합한 용기 또는 패키징 재료를 포함한다. 적합한 용기의 예는 병, 바이알, 주사기, 정맥내 백 또는 튜브를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 화합물, 백신, 또는 약제학적 조성물 중 임의의 것을 포함하는 키트도 또한 제공된다. 키트는 병, 바이알, 주사기, 정맥내 백, 또는 튜브를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적합한 용기 또는 패키징 재료에 화합물, 백신, 또는 약제학적 조성물을 함유할 수 있다. 키트는 단일 투여 형태 또는 다중 투여 형태로 개체에게 투여하기 위한 화합물, 백신, 또는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 키트는 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 화합물, 백신, 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하기 위한 설명서 또는 라벨을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 바늘, 주사기, 튜브, 또는 정맥내 백을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 화합물, 백신, 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하기 위한 장치를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 본원에 개시된 임의의 화합물, 백신, 또는 약제학적 조성물을 생산하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 약제학적 조성물을 포함하는 키트도 또한 제공된다. 키트는 병, 바이알, 주사기, 정맥내 백, 또는 튜브를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적합한 용기 또는 패키징 재료에 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 약제학적 조성물을 함유할 수 있다. 키트는 단일 투여 형태 또는 다중 투여 형태로 개체에게 투여하기 위한 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 키트는 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하기 위한 설명서 또는 라벨을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 바늘, 주사기, 튜브 또는 정맥내 백을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 약제학적 조성물을 개체에게 투여하기 위한 장치를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 본원에 개시된 임의의 화합물, 종양 용해성 바이러스, 또는 약제학적 조성물을 생산하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용은 하기 실시예를 참조하여 보다 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 이들은 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시 목적을 위한 것이며, 이에 비추어 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 제안되며, 본 출원의 취지 및 범위 내 및 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되어야 한다는 것이 이해된다.
실시예
일반적인 작업과정(work-up) 절차 1
일반적인 작업과정 절차 1은 EtOAc 또는 DCM과 같은 유기 용매를 사용하여 수용액을 2 내지 3회 추출하는 것을 지칭한다. 합한 유기 추출물을 황산나트륨 또는 무수 황산마그네슘으로 건조시키거나, 염수, 포화 염화암모늄 수용액, 또는 포화 중탄산나트륨 수용액으로 세척한 후, 건조, 여과 및 진공하에 농축시켰다.
정제 절차
크로마토그래피 A는 헥산 또는 석유 에테르 중 EtOAc의 혼합물로 용출되는, 전형적으로 미리 포장된 카트리지에서 실리카 겔에서의 정제를 지칭하고; 크로마토그래피 B는 DCM 중 MeOH의 혼합물에 의한 용출을 지칭하며; 크로마토그래피 C는 물 중 아세토니트릴의 혼합물로 용출되는 C18 상 실리카 겔의 사용을 지칭하고; 크로마토그래피 D는 에탄올, EtOAc 및 헥산의 혼합물에 의한 용출을 지칭한다. 입체화학 없이 인출된 화합물을 생물학적 실시예에서 라세미 또는 부분입체이성체 혼합물로서 시험하였다. 실시예에서 사용되는 약어는 다음을 포함한다: DAST: (디에틸아미노)황 트리플루오라이드; DMF: 디메틸포름아미드; EDC: N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드; HATU: 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드헥사플루오로포스페이트; T3P: 프로필포스폰산 무수물; XPhos: 2-디사이클로헥실포스피노-2',4',6'-트리이소프로필비페닐; Xantphos: 4,5-비스(디페닐포스피노)-9,9-디메틸크산텐; NBS: N-브로모석신이미드; NCS: N-클로로석신이미드; BPO: 벤조일 퍼옥사이드; THF: 테트라하이드로푸란; EtOAc: 에틸 아세테이트; DCM: 디클로로메탄; MeOH: 메탄올; DIEA: N,N -디이소프로필에틸아민; LHMDS: 리튬 헥사메틸디실라잔.
실시예 A 및 실시예 B: (R)-3-((3- 브로모페닐 )( 사이클로부틸 ) 메틸 )-4- 메틸 -4H-1,2,4-트리아졸(A) 및 (S)-3-((3- 브로모페닐 )( 사이클로부틸 ) 메틸 )-4- 메틸 -4H-1,2,4-트리아졸(B)
Figure pct00137
단계 1: 메틸 2-(3- 브로모페닐 )-2- 사이클로부틸아세테이트의 합성. DMF(100mL) 중의 메틸 2-(3-브로모페닐)아세테이트(10.0g, 43.7mmol)의 혼합물에 0℃에서 t-BuOK(6.4g, 57mmol)를 분량으로 첨가하고, 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 브로모사이클로부탄(7.1g, 52mmol)을 상기 용액에 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 포화 수성 NH4Cl에 붓고, 일반적인 작업과정 절차 1을 사용하였다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(10.2g, 82%)을 수득하였다. (C13H15BrO2)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 283.0; 실측치, 283.0.
단계 2: 2 -(3- 브로모페닐 )-2- 사이클로부틸아세토하이드라지드의 합성. 하이드라진(20mL) 및 EtOH(80mL) 중의 메틸 2-(3-브로모페닐)-2-사이클로부틸아세테이트(10.2g, 36.0mmol)의 혼합물을 80℃에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 염수로 세척하고, 건조시키고, 진공하에 농축시켜 표제 화합물(10.5g, 조악함)을 수득하였다. (C12H15BrN2O)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 283.0; 실측치, 283.0.
단계 3 및 단계 4: 5 -[(3- 브로모페닐 )( 사이클로부틸 ) 메틸 ]-4- 메틸 -1,2,4- 트리아졸 -3-티올의 합성. THF(100mL) 중 2-(3-브로모페닐)-2-사이클로부틸아세토하이드라지드(10.5g, 37.1mmol) 및 MeNCS(3.30g, 45.2mmol)의 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반했다. 상기 혼합물에 물(100mL) 중 NaOH(8.0g)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 HCl(1N)로 pH 약 4로 산성화하고, 일반적인 작업과정 절차 1에 따라 표제 화합물(11.0g, 조악함)을 수득하고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다. (C14H16BrN3S)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 338.0; 실측치, 338.0.
단계 5: 3 -[(3- 브로모페닐 )( 사이클로부틸 ) 메틸 ]-4- 메틸 -1,2,4- 트리아졸의 합성. DCM(20.0mL) 중 5-[(3-브로모페닐)(사이클로부틸)메틸]-4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-티올(2.0g, 5.9mmol)의 용액에 아세트산(4.0mL) 및 H2O2(3.4g, 30mmol)를 실온에서 적가했다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하고, 잔류물을 물로 희석하였다. 수용액을 포화 중탄산나트륨 수용액으로 염기성화하고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 건조시키고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 B로 정제하여 표제 화합물(1.3g, 72%)을 수득하였다. (C14H16BrN3)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 306.1; 실측치, 306.2.
단계 6: (R)-3-((3- 브로모페닐 )( 사이클로부틸 ) 메틸 )-4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리 아졸 및 (S)-3-((3- 브로모페닐 )( 사이클로부틸 ) 메틸 )-4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸의 합성. 라세미 화합물인 3-((3-브로모페닐)(사이클로부틸)메틸)-4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸(4.0g)을 이하의 조건[컬럼: Lux 5u 셀룰로스-4, AXIA 팩화, 2.12*25cm, 5μm; 이동상 A: CO2, 이동상 B: MeOH(2mM NH3-MeOH); 유량: 40mL/분; 구배: 30% B; 220nm]으로 prep-키랄-SFC에 의해 분리하여 키랄-SFC에서 체류 시간이 더 짧은 (S)-3-((3-브로모페닐)(사이클로부틸)메틸)-4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸(1.65g) 및 키랄-SFC에서 체류 시간이 더 긴 (R)-3-((3-브로모페닐)(사이클로부틸)메틸)-4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸(1.68g)을 수득하였다.
(S)-3-((3- 브로모페닐 )( 사이클로부틸 ) 메틸 )-4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 . (C14H16BrN3)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 306.1, 실측치, 306.1. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.35 (s, 1H), 7.59 - 7.36 (m, 2H), 7.34 - 7.20 (m, 2H), 4.23 (d, J = 10.8Hz, 1H), 3.42 (s, 3H), 3.17 - 3.07 (m, 1H), 2.13 - 1.95 (m, 1H), 1.87 - 1.56 (m, 5H).
3-[(R)-(3- 브로모페닐 )( 사이클로부틸 ) 메틸 ]-4- 메틸 -1,2,4- 트리아졸: (C14H16BrN3)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 306.1, 실측치, 306.1. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.34 (s, 1H), 7.48 - 7.39 (m, 2H), 7.33 - 7.25 (m, 2H), 4.23 (d, J = 10.5Hz, 1H), 3.42 (s, 3H), 3.21 - 3.01 (m, 1H), 2.1 - 2 (m, 1H), 1.89 - 1.55 (m, 5H).
실시예 C: (R)-4,4- 디플루오로 -3- 메틸피페리딘 하이드로클로라이드
Figure pct00138
단계 1: 1 - 벤질 -4,4- 디플루오로 -3- 메틸피페리딘의 합성. 1-벤질-3-메틸피페리딘-4-온(200g, 983mmol)과 HF(194g, 9.68mol, 176.00mL, 100% 순도)의 혼합물에 -78℃에서 스테인레스-스틸 오토클레이브에서 SF4(240g, 2.22mol)를 첨가했다. 이어서, 반응 혼합물을 15℃로 가온하고, 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 포화 수성 Na2CO3(2.0L)에 적가하고, EtOAc(200mL×4)로 추출하고, 여과하고, 건조하고, 여과한 후, 진공하에 농축시켜 표제 화합물(211g, 조악함)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.24 - 7.23 (m, 5H), 3.46 (s, 2H), 2.70 - 2.63 (m, 2H), 2.23 - 2.21 (m, 1H), 1.97- 1.92 (m, 4H), 0.91 (d, J = 6.4Hz, 3H).
단계 2: (R)-1- 벤질 -4,4- 디플루오로 -3- 메틸피페리딘의 합성. 이소프로필 아세테이트(9L) 중의 1-벤질-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘(613g, 2.42mol)의 용액에 (2R,3R)-2,3-비스[(4-메틸벤조일)옥시]부탄디오산·수화물(979g, 2.42mol)을 30℃에서 첨가했다. 혼합물을 30℃에서 2시간 동안 교반한 후, 70℃로 2시간 동안 가열하였다. 혼합물을 30℃로 12시간 동안 냉각시켰다. 혼합물을 여과하고, 여액을 1N 수산화나트륨 수용액으로 pH 8-9로 조정한 후, EtOAc(3 x 1500mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고 진공하에 농축시켜 표제 화합물(377g, 1.67mol, 수율, 90.1% 순도)을 수득하였다. 이 잔류물(377g, 1.67mol)을 이소프로필 아세테이트(5.6L)에 용해하고, 그 용액에 (2S,3S)-2,3-비스[(4-메틸벤조일)옥시]부탄디오산(646g, 1.67mol)을 30℃에서 서서히 첨가했다. 혼합물을 30℃에서 2시간 동안 교반한 후, 70℃로 2시간 동안 가열하였다. 혼합물을 30℃로 12시간 동안 냉각시켰다. 침전물을 여과에 의해 수집한 후, 1N 수성 수산화나트륨에 용해시켜 pH 8 내지 9로 만들고, EtOAc(3 x 200mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고 진공하에 농축시켜 표제 화합물(125g, 33.1% 수율, 98.6% 순도)을 수득하고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용했다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.34 - 7.25 (m, 5H), 3.51 (s, 2H), 2.69 - 2.66 (m, 2H), 2.22 - 2.21 (m, 1H), 2.02 - 1.96 (m, 4H), 0.91 (d, J = 6.8Hz, 3H).
단계 3: (R)-4,4- 디플루오로 -3- 메틸피페리딘 하이드로클로라이드의 합성. MeOH(2.5L) 중의 (R)-1-벤질-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘(115g, 510.48mmol)의 용액에 N2하에서 Pd/C(40g, 순도 10%)를 첨가했다. 현탁액을 진공하에서 탈기시키고, H2로 3회 퍼징하였다. 반응 혼합물을 H2(50psi) 하에 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과한 후, 15℃로 냉각시키고, HCl/디옥산(4M, 114.85mL)을 첨가한 후, 15℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시켜 표제 화합물(50.11g, 292mmol, 57.2% 수율)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.86 (s, 1H), 9.55 (s, 1H), 3.51 (s, 2H), 3.43 - 3.32 (m, 2H), 3.32 - 3.29 (m, 1H), 2.71 - 2.68 (m, 1H), 2.51 - 2.49 (m, 1H), 2.27 - 2.24 (m, 2H), 0.98 (d, J = 6.8, 3H).
실시예 D: (R)-6-((4,4- 디플루오로 -3- 메틸피페리딘 -1-일) 메틸 )-4-( 트리플루오로메틸 )이소인돌린-1-온
Figure pct00139
DCM(300mL) 중 실시예 C(5.00g, 29.1mmol)의 교반 용액에 트리에틸아민(24.2mL, 175mmol) 및 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드(37.1g, 175mmol)를 첨가하였다. 현탁액을 10분 동안 교반한 후, 0℃로 냉각시킨 후, 20mL의 DCM 중 실시예 K(9.47g, 29.1mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 약 12시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 잔류물을 MeOH(100mL)에 용해시킨 후, 암모니아(MeOH 중 7N, 100mL)를 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 조악한 반응 혼합물을 농축한 후, 크로마토그래피 B로 정제하여 표제 화합물(7.10g, 70.0%)을 수득하였다; 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) δ 8.05 (s, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 4.64 (s, 2H), 3.68 (s, 2H), 2.87 - 2.63 (m, 2H), 2.40 (td, J = 11.5, 3.3Hz, 1H), 2.22 - 1.94 (m, 4H), 1.09 - 0.98 (m, 3H). LCMS: C16H17F5N2O 필요치: 348, 실측치: m/z = 349 [M+H]+.
실시예 E: (S)-6-((3- 메틸피페리딘 -1-일) 메틸 )-4-( 트리플루오로메틸 ) 이소인돌린 -1-온
Figure pct00140
DCM(250mL) 중의 (3S)-3-메틸피페리딘 하이드로클로라이드(4.0g, 29.4mmol)의 교반 용액에 트리에틸아민(25mL, 176mmol) 및 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드(37.5g, 176.9mmol)를 첨가했다. 현탁액을 10분 동안 교반한 후, 0℃로 냉각시켰다. 20mL의 DCM 중 실시예 K(9.6g, 29.4mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 약 12시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 조악한 산물을 MeOH(100mL)에 용해시킨 후, 암모니아(MeOH 중 7N, 100mL)를 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 용액을 농축시키고 크로마토그래피 B로 정제하여 6-{[(3S)-3-메틸피페리딘-1-일]메틸}-4-(트리플루오로메틸)-2,3-디하이드로이소인돌-1-온(4.1g, 45%)을 수득했다: 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.18 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.16 (s, 1H), 4.58 (s, 2H), 4.04 (s, 2H), 3.14 - 2.98 (m, 3H), 2.43 (s, 1H), 2.18 - 2.10 (m, 1H), 2.04 - 1.73 (m, 2H), 1.34 (t, J = 7.3Hz, 1H), 1.05 (qd, J = 13.9, 12.9, 4.4Hz, 1H), 0.89 (d, J = 6.6Hz, 3H). LCMS: C16H19F3N2O 필요치: 312, 실측치: m/z = 313 [M+H]+.
실시예 F: 4- 사이클로프로필 -1-옥소- 2H,3H - 피롤로[3,4-c]피리딘 -6- 카브알데히드
Figure pct00141
단계 1: 3 -아미노-6- 클로로 -2- 요오도피리딘 -4-카 복실산의 합성. DMF(1.4L) 중 5-아미노-2-클로로피리딘-4-카복실산(100.0g, 579.47mmol)의 용액에 N-요오도석신이미드(195.6g, 869.21mmol)를 0 내지 10℃에서 분량으로 첨가했다. 30분 동안 교반한 후, 혼합물을 80℃로 가열하고, 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물을 첨가하여 급냉시키고, 이어서 일반적인 작업과정 절차 1에 따라 표제 화합물(140.0g, 조악함)을 수득하고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 2: 메틸 3-아미노-6- 클로로 -2- 요오도피리딘 -4-카 복실레이트의 합성. MeOH(90.0mL) 및 DCM(900.0mL) 중 3-아미노-6-클로로-2-요오도피리딘-4-카복실산 (70.0g, 234.80mmol)의 혼합물에 TMSCHN2(176.1mL, 헥산 중 2M)을 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 잔류물을 석유 에테르 중 15% EtOAc로 연마하였다. 고체를 여과로 수집하고 건조시켜 표제 화합물(65.0g)을 수득하였다.
단계 3: 메틸 3-아미노-6- 클로로 -2- 사이클로프로필피리딘 -4-카 복실레이트 의 합성. 디옥산(1.5L) 중의 메틸 3-아미노-6-클로로-2-요오도피리딘-4-카복실레이트(45.0g, 144.23mmol), 사이클로프로필보론산(49.6g, 576.92mmol), K2CO3(59.7g, 432.69mmol) 및 Pd(dppf)Cl2(10.5g, 14.42mmol)의 탈기된 혼합물을 N2 분위기하에 100℃에서 16시간 동안 교반하였다. 고체를 여과로 제거하고 여액을 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc 및 물에 용해시키고 일반적인 작업과정 절차 1을 수행한 후, 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(22.1g, 3단계에 걸쳐 67%)을 수득하였다.
단계 4: 메틸 6- 클로로 -2- 사이클로프로필 -3- 요오도피리딘 -4-카 복실레이트 의 합성. DCM(1.5L) 중의 메틸 3-아미노-6-클로로-2-사이클로프로필피리딘-4-카복실레이트(25.0g, 110.62mmol)의 혼합물에 t-BuONO(17.0g, 169.00mmol) 및 BF3·Et2O(19.0g, 264.70mmol)를 N2 분위기하에 0℃에서 연속적으로 적가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 헥산의 첨가에 의해 급냉시켰다. 고체를 여과에 의해 수집하고 건조시켜 6-클로로-2-사이클로프로필-4-(메톡시카보닐)피리딘-3-디아조늄 테트라플루오로보레이트(33.4g)를 황색 고체로서 수득하고, 이를 물(250.0mL) 중 KI(34.1g, 205.52mmol)의 혼합물에 50℃에서 분량으로 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료되면, 일반적인 작업과정 절차 1을 수행하고, 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(23.0g, 2단계에 걸쳐 62%)을 수득하였다.
단계 5: 메틸 6- 클로로 -2- 사이클로프로필 -3- 메틸피리딘 -4-카 복실레이트의 합성. 디옥산(500mL) 중의 메틸 6-클로로-2-사이클로프로필-3-요오도피리딘-4-카복실레이트(23.0g, 68.05mmol), 메틸보론산(16.3g, 272.20mmol), Pd(dppf)Cl2(4.9g, 6.81mmol) 및 K2CO3(28.2g, 204.15mmol)의 탈기된 혼합물을 N2 분위기하에 90℃에서 16시간 동안 교반하였다. 고체를 여과 제거하고 여액을 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc 및 물에 용해시키고 일반적인 작업과정 절차 1을 수행한 후, 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(12.5g, 83%)을 수득하였다.
단계 6: 메틸 3-( 브로모메틸 )-6- 클로로 -2- 사이클로프로필피리딘 -4-카 복실 레이트의 합성. CCl4(150.0mL) 중의 메틸 6-클로로-2-사이클로프로필-3-메틸피리딘-4-카복실레이트(12.5g, 55.56mmol), NBS(19.8g, 111.11mmol) 및 디벤조일 퍼옥사이드(4.0g, 16.67mmol)의 혼합물을 N2 분위기하에 80℃에서 16시간 동안 교반하였다. 고체를 여과 제거하고 여액을 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(7.8g, 50%)을 수득하였다.
단계 7: 6 - 클로로 -4- 사이클로프로필 - 2H,3H - 피롤로[3,4-c]피리딘 -1-온의 합 성. NH3(MeOH 중 7M, 80.0mL) 중의 메틸 3-(브로모메틸)-6-클로로-2-사이클로프로필피리딘-4-카복실레이트(7.8g, 25.83mmol)의 혼합물을 N2 분위기하에 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 고체를 수집하고, MeOH로 세척하여 표제 화합물(5.0g, 92.1%)을 수득하였다.
단계 8: 4 - 사이클로프로필 -6- 에테닐 - 2H,3H - 피롤로[3,4-c]피리딘 -1-온의 합 성. THF/물(v/v, 10/1, 220.0mL) 중의 6-클로로-4-사이클로프로필-2H,3H-피롤로[3,4-c]피리딘-1-온(4.3g, 43.96mmol), 칼륨 비닐트리플루오로보레이트(11.8g, 87.91mmol), Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2(3.6g, 4.39mmol) 및 Cs2CO3(20.8g, 131.88mmol)의 탈기된 혼합물을 N2 분위기하에 80℃에서 4시간 교반했다. 용매를 진공하에 제거하였다. 잔류물을 EtOAc 및 물로 용해시킨 후, 일반적인 작업과정 절차 1을 수행하고, 생성된 잔류물을 크로마토그래피 B로 정제하여 표제 화합물(3.5g, 87%)을 수득하였다.
단계 9: 4 - 사이클로프로필 -1-옥소-2H,3H- 피롤로[3,4-c]피리딘 -6-카브알데히드의 합성. THF(50mL) 및 물(20mL) 중의 4-사이클로프로필-6-에테닐-2H,3H-피롤로[3,4-c]피리딘-1-온(3.5g, 17.50mmol) 및 4-메틸모르폴린 N-옥사이드(6.1g, 52.50mmol)의 용액에 0℃에서 K2OsO4·2H2O(127.4mg, 0.35mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 NaHSO3(10.2g)을 첨가하여 급냉시키고, 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물에 물(300.0mL)을 첨가하고, 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 수성 층을 수집하여 4-사이클로프로필-6-(1,2-디하이드록시에틸)-2H,3H-피롤로[3,4-c]피리딘-1-온(350mL)의 조악한 용액을 수득하였다.
실리카 겔(65.6g)로 충전된 3구 플라스크에 물(32.8mL) 중의 NaIO4(7.5g, 35.00mmol)의 용액을 격렬하게 교반하면서 적가하였다. 실온에서 20분 동안 교반한 후, 혼합물에 4-사이클로프로필-6-(1,2-디하이드록시에틸)-2H,3H-피롤로[3,4-c]피리딘-1-온의 조악한 용액(물 중 350.0mL)을 격렬하게 교반하면서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 고체를 여과 제거하고, 여액을 DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(1.7g, 2단계에 걸쳐 48%)을 수득하였다. (C11H10N2O2)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 203.1; 실측치 203.2. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.97 (s, 1H), 9.15 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 4.67 (s, 2H), 2.29 - 2.21 (m, 1H), 1.22 - 1.14 (m, 4H).
실시예 G: (R)-4- 사이클로프로필 -6-((4,4- 디플루오로 -3- 메틸피페리딘 -1-일)메틸)-2,3-디하이드로-1H-피롤로[3,4-c]피리딘-1-온
Figure pct00142
DCM(17mL) 중 실시예 C(840mg, 4.16mmol), 실시예 F(783mg, 4.57mmol) 및 트리에틸아민(636μL, 4.56mmol)의 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 후, 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드(969mg, 4.57mmol)를 첨가하였다. 1.5시간 후, 추가의 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드(177mg)를 첨가하였다. 반응물을 밤새 교반한 후, 수성 중탄산나트륨으로 급냉시키고, DCM을 사용하여 일반적인 작업과정 절차 1을 수행하였다. 잔류물을 크로마토그래피 B, 이어서 크로마토그래피 C로 정제하여 표제 화합물(626mg, 47%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 8.90 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 4.52 (s, 2H), 3.68 (d, J = 1.8Hz, 2H), 2.75 (t, J = 14.5Hz, 2H), 2.37 - 2.26 (m, 1H), 2.18 - 1.84 (m, 5H), 1.09 - 0.96 (m, 4H), 0.92 (d, J = 6.4Hz, 3H). LCMS: C17H21F2N3O 필요치 321.2, 실측치 322.3 [M+H]+.
실시예 H: (S)-4- 사이클로프로필 -6-((3- 메틸피페리딘 -1-일) 메틸 )-2,3- 디하이드로 -1H-피롤로[3,4-c]피리딘-1-온
Figure pct00143
DCE(34mL) 중 용액 4-사이클로프로필-1-옥소-2H,3H-피롤로[3,4-c]피리딘-6-카브알데히드(1.0g, 4.95mmol), (3S)-3-메틸피페리딘 하이드로클로라이드(804mg, 5.93mmol) 및 트리에틸아민(0.69mL, 4.56mmol)을 실온에서 15분 동안 교반한 후, 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드(1.36g, 6.43mmol)를 첨가하였다. 반응물을 밤새 교반한 후, 수성 중탄산나트륨으로 급냉시키고, DCM을 사용하여 일반적인 작업과정 절차 1을 수행하였다. 잔류물을 크로마토그래피 B로 정제하여 표제 화합물(1.1g, 77%)을 수득하였다. LCMS: C17H23N3O 필요치 285.2, 실측치 286.2 [M+H]+. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) δ 7.68 (s, 1H), 6.45 (s, 1H), 4.57 (s, 2H), 3.69 (s, 2H), 2.83 (t, J = 12.5Hz, 2H), 2.05 - 1.98 (m, 1H), 1.94 (ddd, J = 12.9, 8.3, 4.7Hz, 1H), 1.72 (d, J = 9.0Hz, 3H), 1.33 - 1.18 (m, 3H), 1.06 (dt, J = 8.1, 3.2Hz, 2H), 0.86 (d, J = 5.7Hz, 5H).
실시예 I 및 실시예 J: (R)-3-( 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일)메틸)아닐린(I) 및 (S)-3-( 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 )아닐린(J)
Figure pct00144
단계 1: 3급 -부틸 N-[3-[ 사이클로부틸 (4- 메틸 -1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 ]페닐]카바메이트의 합성. 디옥산(26.0mL) 중의 3-[(3-브로모페닐)(사이클로부틸)메틸]-4-메틸-1,2,4-트리아졸(1.3g, 4.3mmol), 3급-부틸 카바메이트(547.1mg, 4.67mmol), XPhos Pd G3(718.7mg, 0.85mmol), XPhos(404.9mg, 0.85mmol) 및 Cs2CO3(2.8g, 8.5mmol)의 탈기된 혼합물을 N2 분위기하에 90℃에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하고, 잔류물을 물로 희석하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 잔류물을 크로마토그래피 B로 정제하여 3급-부틸 N-[3-[사이클로부틸(4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸]페닐]카바메이트(1.0g, 68%)를 수득하였다. (C19H26N4O2)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 343; 실측치, 343.
단계 2: (R)-3-( 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 )아닐린 및 (S)-3-( 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 )아닐린의 합성. 1,4-디옥산(4M, 10mL) 중 HCl 중 3급-부틸 N-[3-[사이클로부틸(4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸]페닐]카바메이트(1.0g, 2.9mmol)의 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하였다. 잔류물을 MeOH에 용해시키고 진공하에 농축하기 전에 암모니아로 pH 약 10으로 염기성화하였다. 잔류물을 크로마토그래피 C로 정제하여 3-(사이클로부틸(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸)아닐린(450mg)을 수득하고, 이를 다음 조건하: [(컬럼: CHIRAL ART 셀룰로스-SB, 2*25cm, 5㎛; 이동상 A: CO2, 이동상 B: EtOH; 유량: 40mL/분; 구배: 40% B; 220nm]에 prep-키랄-SFC로 추가로 분리하여 키랄-SFC에서의 체류 시간이 더 짧은 (S)-3-(사이클로부틸(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸)아닐린(215.3mg) 및 키랄-SFC에서의 체류 시간이 더 긴 (R)-3-(사이클로부틸(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸)아닐린(217.6mg)을 수득하였다.
(S)-3-( 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 )아닐린: (C14H18N4)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 243, 실측치, 243. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.29 (s, 1H), 6.92 (t, J = 7.5Hz, 1H), 6.41 - 6.33 (m, 3H), 5.01 (s, 2H), 3.91 (d, J = 10.5Hz, 1H), 3.35 (s, 3H), 3.15 - 3.05 (m, 1H), 2.07 (m, 1H), 2.10 - 1.66 (m, 5H).
(R)-3-( 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 )아닐린: (C14H18N4)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 243, 실측치, 243. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.29 (s, 1H), 6.92 (t, J = 7.5Hz, 1H), 6.41 - 6.33 (m, 3H), 5.01 (s, 2H), 3.91 (d, J = 10.5Hz, 1H), 3.35 (s, 3H), 3.15 - 3.05 (m, 1H), 2.07 (m, 1H), 2.10 - 1.66 (m, 5H).
실시예 K: 메틸 2-( 브로모메틸 )-5- 포르밀 -3-( 트리플루오로메틸 ) 벤조에이트
Figure pct00145
단계 1: 3 -( 메톡시카보닐 )-4- 메틸 -5-( 트리플루오로메틸 )벤조산의 합성. 디메틸포름아미드(200mL) 중의 메틸 5-브로모-2-메틸-3-(트리플루오로메틸)벤조에이트(18.0g, 60.8mmol), 옥살산(11.5g, 91.2mmol), 아세트산 무수물(9.3g, 91.2mmol) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민(11.8g, 91.2mmol)의 탈기된 용액에 Pd(OAc)2(1.4g, 6.1mmol) 및 XantPhos(1.8g, 3.0mmol)를 첨가했다. 혼합물을 질소하에 100℃에서 16시간 동안 교반하였다. HCl(1M, 300mL)을 pH 약 3까지 첨가하여 반응물을 급냉시켰다. 수용액을 EtOAc(250mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고 농축시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 C로 정제하여 표제 화합물(7.5g, 47%)을 수득하였다.
단계 2: 4 -( 브로모메틸 )-3-( 메톡시카보닐 )-5-( 트리플루오로메틸 )벤조산의 합성. CCl4(160mL) 중의 4-메틸-3-(메톡시카보닐)-5-(트리플루오로메틸)벤조산(8g, 30.5mmol) 및 NBS(8.2g, 46mmol)의 교반 용액에 BPO(2.2g, 9mmol)를 첨가하였다. 용액을 80℃에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 B로 정제하여 표제 화합물(8.0g, 77%)을 수득하였다. (C11H8BrF3O4)[M-H]-에 대한 MS(ESI) 계산치, 339; 실측치, 339.
단계 3: 메틸 2-( 브로모메틸 )-5-( 하이드록시메틸 )-3-( 트리플루오로메틸 ) 벤 조에이트의 합성. 테트라하이드로푸란(30mL) 중 4-(브로모메틸)-3-(메톡시카보닐)-5-(트리플루오로메틸)벤조산(2.65g, 7.77mmol)의 교반 용액에 보란(19.4mL, 19.4mmol, 테트라하이드로푸란 중 1M)을 첨가하였다. 용액을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 이어서, MeOH(10mL)를 첨가하여 반응물을 급냉시켰다. 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(1.40g, 84%)을 수득하였다.
단계 4: 메틸 2-( 브로모메틸 )-5- 포르밀 -3-( 트리플루오로메틸 ) 벤조에이트의 합성. 에틸 아세테이트(70mL) 중 메틸 2-(브로모메틸)-5-(하이드록시메틸)-3-(트리플루오로메틸)벤조에이트(7.1g, 21.71mmol)의 교반 용액에 2-요오독시벤조산(9.1g, 32.5mmol)을 첨가하였다. 반응물을 70℃에서 3시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하고 여액을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(6.6g, 94%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 10.12 (s, 1H), 8.56 (d, J = 1.8Hz, 1H), 8.45 (d, J = 1.8Hz, 1H), 5.07 (s, 2H), 3.96 (s, 3H).
실시예 L: 3-[1-(3- 브로모페닐 )-3- 메틸사이클로부틸 ]-4- 메틸 -1,2,4- 트리아졸
Figure pct00146
단계 1: 메틸 1-(3- 브로모페닐 )-3- 메틸사이클로부탄 -1-카 복실레이트의 합성. DMF(100mL) 중의 메틸 2-(3-브로모페닐)아세테이트(5.0g, 21.8mmol) 및 1,3-디브로모-2-메틸프로판(4.7g, 21.8mmol)의 교반 용액에 수소화나트륨(파라핀 오일 중 60%)(1.7g, 43.6mmol)을 0℃에서 첨가했다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 포화 수성 NH4Cl에 붓고, 일반적인 작업과정 1이 사용되었다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(4.0g, 65%)을 수득하였다.
단계 2: 1 -(3- 브로모페닐 )-3- 메틸사이클로부탄 -1-카 보하이드라지드의 합성. 에탄올(100mL) 중의 메틸 1-(3-브로모페닐)-3-메틸사이클로부탄-1-카복실레이트(4.0g, 141mmol)의 교반 용액에 하이드라진 수화물(6.9mL, 70.6mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 80℃에서 약 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하고 일반적인 작업과정 1을 사용하였다. 잔류물을 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 3: 5 -[1-(3- 브로모페닐 )-3- 메틸사이클로부틸 ]-4- 메틸 -1,2,4-트리아졸-3-티올의 합성. THF(100mL) 중의 1-(3-브로모페닐)-3-메틸사이클로부탄-1-카보하이드라지드(3.2g, 11.3mmol)의 용액에 메틸 이소티오시아네이트(2.5g, 33.90mmol)를 첨가했다. 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 용액을 실온으로 냉각시킨 후, 물(10mL) 중 수산화칼륨(3.2g, 56.5mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 용액을 1M HCl로 약 7의 pH로 중화시킨 후, DCM으로 3회 추출하였다. 층을 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 조악한 물질을 다음 단계에서 사용하였다.
단계 4: 3 -[1-(3- 브로모페닐 )-3- 메틸사이클로부틸 ]-4- 메틸 -1,2,4- 트리아졸 의 합성. 메틸렌 클로라이드(50mL) 및 아세트산(7mL) 중의 5-[1-(3-브로모페닐)-3-메틸사이클로부틸]-4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-티올(3.8g, 11.3mmol)의 용액에 0℃에서 과산화수소(3mL, 30%)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 증발 건조시켰다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 잔류물을 크로마토그래피 B로 정제하여 표제 화합물(2.30g, 3단계에 걸쳐 54%)을 수득하였다.
실시예 M: 3-(( 1s,3s )-1-(3- 브로모페닐 )-3- 메틸사이클로부틸 )-4- 메틸 -4H-1,2,4-트리아졸
Figure pct00147
3-[1-(3-브로모페닐)-3-메틸사이클로부틸]-4-메틸-1,2,4-트리아졸의 혼합물을 크로마토그래피 B를 통해 추가로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) δ 7.99 (s, 1H), 7.56 (d, J = 1.8Hz, 1H), 7.41 (dd, J = 7.2, 1.8Hz, 1H), 7.26 - 7.24 (m, 2H), 3.20 (s, 3H), 2.90 - 2.79 (m, 2H), 2.76 - 2.52 (m, 3H), 1.16 (d, J = 5.5Hz, 3H). LCMS: C14H16BrN3 필요치: 306, 실측치: m/z = 307 [M+H]+.
실시예 N: 2- 사이클로프로필 -6- 메틸피리미딘 -4-카 복스아미드의 합성
Figure pct00148
단계 1: 메틸 2- 사이클로프로필 -6- 메틸피리미딘 -4-카 복실레이트의 합성. 사이클로프로필 아연 브로마이드(테트라하이드로푸란 중 0.5M 용액 16.2mL, 8.1mmol, 1.5당량)를 메틸 2-클로로-6-메틸피리미딘-4-카복실레이트(1.0g, 5.4mmol, 1당량), 테트라키스트리페닐포스핀팔라듐(0)(500mg, 0.43mmol, 0.08당량), 및 테트라하이드로푸란(30mL)의 용액에 첨가하였다. 생성되는 용액을 24시간 동안 환류 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시킨 후, 포화 NH4Cl(75mL) 및 에틸 아세테이트(50mL)에 부었다. 상을 분리시키고, 수성 상을 에틸 아세테이트(2x10mL)로 추출하였다. 합한 유기상을 건조시키고(황산나트륨), 여과하고, 셀라이트 상에서 농축시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 510mg의 표제 화합물을 수득하였다.
단계 2: 2 - 사이클로프로필 -6- 메틸피리미딘 -4-카 복실산의 합성. 메틸 2-사이클로프로필-6-메틸피리미딘-4-카복실레이트(500mg, 2.6mmol, 1당량), LiOH·H2O(330mg, 7.8mmol, 3당량), 테트라하이드로푸란(6mL) 및 물(2mL)의 혼합물을 17시간 동안 격렬하게 교반하였다. 혼합물을 황산나트륨으로 포화된 0.1N HCl(50mL)에 부었다. 산물을 15% i-PrOH/CHCl3(3x10mL)로 추출하고 농축시켜 242mg의 표제 화합물을 수득하였다.
단계 3: 2 - 사이클로프로필 -6- 메틸피리미딘 -4-카복스아미드 의 합성. DCM(20mL) 중 2-사이클로프로필-6-메틸피리미딘-4-카복실산(2.0g, 11.2mmol)의 용액에 0℃에서 이소부틸 클로로포르메이트(1.6mL, 12.3mmol)를 첨가했다. 용액을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. NH4OH를 첨가하고, 용액을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 1에 따라 표제 화합물(492mg, 25%)을 수득하였다.
실시예 O: (R)-6-((2- 메틸모르폴리노 ) 메틸 )-4-( 트리플루오로메틸 ) 이소인돌린 -1-온
Figure pct00149
단계 1: 메틸 2-( 브로모메틸 )-5-[[(2R)-2- 메틸모르폴린 -4-일] 메틸 ]-3-( 트 리플루오로메틸)벤조에이트의 합성: 테트라하이드로푸란(10mL) 중의 실시예 K(1.0g, 3.1mmol), (2R)-2-메틸모르폴린(311mg, 3.08mmol) 및 티탄 에톡사이드(1.4g, 6.1mmol)의 용액을 N2 분위기하에 0℃에서 1시간 동안 교반했다. 아세트산(350μL, 6.15mmol) 및 NaBH3CN(290mg, 4.61mmol)을 상기 혼합물에 연속적으로 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 C로 정제하여 표제 화합물(1.0g, 79%)을 수득하였다.
단계 2: (R)-6-((2- 메틸모르폴리노 ) 메틸 )-4-( 트리플루오로메틸 ) 이소인돌린 -1-온의 합성: NH3(10mL, MeOH 중 7M) 중의 메틸 2-(브로모메틸)-5-[[(2R)-2-메틸모르폴린-4-일]메틸]-3-(트리플루오로메틸)벤조에이트(1.0g, 2.4mmol)의 용액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 C로 정제하여 표제 화합물(704mg, 90%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.88 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 4.53 (s, 2H), 3.78 - 3.67 (m, 1H), 3.78 - 3.60 (m, 2H), 3.60 - 3.42 (m, 2H), 2.72 - 2.55 (m, 2H), 2.13 - 2.03 (m, 1H), 1.82 - 1.72 (m, 1H), 1.02 (d, J = 6.3Hz, 3H). MS C15H17F3N2O2 필요치: 315, 실측치: m/z = 315 [M+H]+.
실시예 P 및 실시예 Q: 6-[[(2S)-2- 에틸모르폴린 -4-일] 메틸 ]-4-( 트리플루오 로메틸)-2,3-디하이드로이소인돌-1-온(P) 및 6-[[(2R)-2- 에틸모르폴린 -4-일] 메틸 ]-4-(트리플루오로메틸)-2,3-디하이드로이소인돌-1-온(Q)
Figure pct00150
단계 1: 메틸 2-( 브로모메틸 )-5-[(2- 에틸모르폴린 -4-일) 메틸 ]-3-( 트리플루오로메틸 )벤조에이트의 합성. 테트라하이드로푸란(10mL) 중 2-에틸모르폴린(299mg, 2.60mmol), 실시예 K(845mg, 2.60mmol) 및 티탄 에톡사이드(1.1mL, 5.2mmol)의 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. NaBH3CN(245mg, 3.9mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하고, 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(880mg, 80%)을 수득하였다. MS: C17H21BrF3NO3 필요치: 423, 실측치: m/z= 424[M+H]+.
단계 2: 6 -[[(2S)-2- 에틸모르폴린 -4-일] 메틸 ]-4-( 트리플루오로메틸 )-2,3- 디하이드로이소인돌 -1-온(P) 및 6-[[(2R)-2- 에틸모르폴린 -4-일] 메틸 ]-4-( 트리플루오 로메틸)-2,3-디하이드로이소인돌-1-온(Q)의 합성. NH3(10.0mL, MeOH 중 7M) 중 메틸 2-(브로모메틸)-5-[(2-에틸모르폴린-4-일)메틸]-3-(트리플루오로메틸)벤조에이트(1.0g, 2.36mmol)의 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 C로 정제하여 6-((2-에틸모르폴리노)메틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온(480mg, 62%)을 수득하였다. 라세미 6-((2-에틸모르폴리노)메틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온(480mg)을 SFC(Chiralpak, 이동상 A: MeOH 중 8mmol/L NH3, 이동상 B: IPA)로 분해하여 표제 화합물을 수득하였다.
6-[[(2S)-2- 에틸모르폴린 -4-일] 메틸 ]-4-( 트리플루오로메틸 )-2,3- 디하이드로이소인돌 -1-온(173mg). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.85 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 4.51 (s, 2H), 3.80 - 3.60 (m, 3H), 3.52 - 3.42 (m, 1H), 3.32 - 3.28 (m, 1H), 2.68 - 2.57 (m, 2H), 2.12 - 2.02 (m, 1H), 1.80 (t, J = 10.5Hz, 1H), 1.46 - 1.27 (m, 2H), 0.83 (t, J = 7.5Hz, 3H). MS (ESI): C16H19F3N2O2 필요치: 328 실측치: m/z = 329 [M+H]+.
6-[[(2R)-2- 에틸모르폴린 -4-일] 메틸 ]-4-( 트리플루오로메틸 )-2,3- 디하이드로이소인돌 -1-온(170mg). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.85 (s, 1H), 7.86 (s, 2H), 4.51 (s, 2H), 3.77 - 3.57 (m, 3H), 3.52 - 3.42 (m, 1H), 3.31 - 3.29 (m, 1H), 2.68 - 2.57 (m, 2H), 2.12 - 2.02 (m, 1H), 1.80 (t, J = 10.5Hz, 1H), 1.46 - 1.27 (m, 2H), 0.83 (t, J = 7.5Hz, 3H). MS (ESI): C16H19F3N2O2 필요치: 328 실측치: m/z = 329 [M+H]+.
실시예 R: 4- 사이클로프로필 -6-[[(2R)-2- 메틸모르폴린 -4-일] 메틸 ]- 2H,3H - 피롤로[3,4-c]피리딘 -1-온
Figure pct00151
MeOH(24mL) 중 실시예 F(650mg, 3.33mmol), (2R)-2-메틸모르폴린(450mg, 4.50mmol) 및 CH3COOH(198mg, 3.33mmol)의 교반 혼합물에 0℃에서 TEA(335mg, 3.33mmol)를 첨가하고, 실온에서 질소 분위기하에 16시간 동안 교반하였다. 이어서, NaBH3CN(629mg, 9.99mmol)을 0℃에서 상기 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 잔류물을 크로마토그래피 C로 정제하여 표제 화합물(509mg, 53%)을 수득하였다. (C16H21N3O2)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 288.2; 실측치, 288.2. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.89 (s, 1H), 7.40 (s, 1H), 4.51 (s, 2H), 3.74 - 3.71 (m, 1H), 3.64 (s, 2H), 3.60 - 3.47 (m, 2H), 2.71 - 2.60 (m, 2H), 2.13 - 2.06 (m, 2H), 1.91 - 1.71 (m, 1H), 1.09 - 0.97 (m, 7H).
실시예 S: (R)-2-(4-((3-옥소-7-( 트리플루오로메틸 ) 이소인돌린 -5-일) 메틸 )모르폴린-2-일)아세토니트릴
Figure pct00152
단계 1: 3급 -부틸 (2S)-2-[( 메탄설포닐옥시 ) 메틸 ]모르폴린-4-카 복실레이 트의 합성. DCM(35mL) 중 3급-부틸 (2S)-2-(하이드록시메틸)모르폴린-4-카복실레이트(3.5g, 16.1mmol) 및 트리에틸아민(4.6mL, 32.2mmol)의 용액에 0℃에서 메탄설포닐 클로라이드(1.9mL, 24.16mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기하에 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 잔류물을 크로마토그래피 B로 정제하여 표제 화합물(4.5g, 94%)을 수득하였다.
단계 2: (2S)-모르폴린-2- 일메틸 메탄설포네이트 HCl 염의 합성. HCl(디옥산 중 4M, 10mL) 중의 3급-부틸 (2S)-2-[(메탄설포닐옥시)메틸]모르폴린-4-카복실레이트(950mg)의 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공하에 농축시켜 표제 화합물을 수득하였고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 3: 메틸 2-( 브로모메틸 )-5-[[(2S)-2-[( 메탄설포닐옥시 ) 메틸 ] 모르폴린-4-일] 메틸 ]-3-( 트리플루오로메틸 ) 벤조에이트의 합성. 테트라하이드로푸란(15mL) 중의 (2S)-모르폴린-2-일메틸 메탄설포네이트 HCl 염(600mg, 3.08mmol) 및 메틸 2-(브로모메틸)-5-포르밀-3-(트리플루오로메틸)벤조에이트(1.0g, 3.01mmol)의 용액에 티탄 에톡사이드(1.4g, 6.15mmol)를 0℃에서 첨가하고, 질소 분위기하에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물에 NaBH3CN(290mg, 4.61mmol)을 첨가하고, 질소 분위기하에 실온에서 추가 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 C로 정제하여 표제 화합물(800mg, 51%)을 수득하였다. MS: C17H21BrF3NO6S 필요치 503; 실측치: m/z= 504[M+H]+.
단계 4: (S)-(4-((3-옥소-7-( 트리플루오로메틸 ) 이소인돌린 -5-일) 메틸 )모르폴린-2-일)메틸 메탄설폰산의 합성. NH3(MeOH 중 7M, 8mL) 중의 메틸 2-(브로모메틸)-5-[[(2S)-2-[(메탄설포닐옥시)메틸]모르폴린-4-일]메틸]-3-(트리플루오로메틸)벤조에이트(800mg, 1.59mmol)의 혼합물을 질소 분위기하에 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 증발 후, 잔류물을 크로마토그래피 C로 정제하여 표제 화합물을 수득하고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 5: (R)-2-(4-((3-옥소-7-( 트리플루오로메틸 ) 이소인돌린 -5-일) 메틸 )모르폴린-2-일)아세토니트릴의 합성. DMF(10mL) 중의 (S)-(4-((3-옥소-7-(트리플루오로메틸)이소인돌린-5-일)메틸)모르폴린-2-일)메틸 메탄설포네이트(460mg, 1.13mmol), KCN(110mg, 1.69mmol) 및 KI(280mg, 1.69mmol)의 혼합물을 질소 분위기하에 100℃에서 16시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 잔류물을 크로마토그래피 C로 정제한 후, 물 중의 아세토니트릴을 사용하는 Prep-HPLC로 정제하여 표제 화합물(189mg, 49%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.88 (s, 1H), 7.91 - 7.87 (m, 2H), 4.54 (s, 2H), 3.85 - 3.54 (m, 5H), 2.81 - 2.64 (m, 4H), 2.19 - 1.90 (m, 2H). LCMS: C16H16F3N3O2 필요치: 339, 실측치: m/z = 340 [M+H]+.
실시예 T: ( 1s,3s )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 사이클로부탄 -1-올
Figure pct00153
단계 1: ( 1s,3s )-1-(3- 브로모페닐 )-3- 하이드록시사이클로부탄 -1-카 복실산 의 합성. 이소프로필 마그네슘 브로마이드(THF 중 2M, 375mL)의 용액에 THF(500mL) 중의 2-(3-브로모페닐)아세트산(75g, 348mmol)의 용액을 0℃에서 적가하였다. 2-(클로로메틸)옥시란(48g, 523mmol)을 질소하에 0℃에서 상기 혼합물에 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반한 후, 더 많은 이소프로필 마그네슘 브로마이드(THF 중 2M, 375mL)를 30분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 천천히 60℃로 가열하고, 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 실온으로 냉각시키고, 5N HCl로 서서히 급냉시켰다. 일반적인 작업과정 절차 1에 이어 크로마토그래피 B로 표제 화합물(36g, 38%)을 수득하였다.
단계 2: 2 -(( 1s,3s )-1-(3- 브로모페닐 )-3- 하이드록시사이클로부탄 -1-카보닐)-N-메틸하이드라진-1-카보티오아미드의 합성. DMF(100mL) 중의 (1s,3s)-1-(3-브로모페닐)-3-하이드록시사이클로부탄-1-카복실산(5.0g, 14.7mmol), 4-메틸-3-티오세미카바지드(1.8g, 17.5mmol) 및 DIEA(5.7g, 44.2mmol)의 용액에 0℃에서 HATU(7.2g, 19.1mmol)를 분량으로 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1을 사용하여 표제 화합물을 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
단계 3: ( 1s,3s )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(5- 머캅토 -4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일)사이클로부탄-1-올의 합성. NaOH(1M, 160mL) 중 2-((1s,3s)-1-(3-브로모페닐)-3-하이드록시사이클로부탄-1-카보닐)-N-메틸하이드라진-1-카보티오아미드의 용액을 실온에서 질소 분위기하에 16시간 동안 교반하였다. 수성 상을 HCl(2N)로 pH 약 3으로 산성화하였다. 일반적인 작업과정 절차 1에 따라 표제 화합물을 수득하였고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 4: ( 1s,3s )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 사이 클로부탄-1-올의 합성. HNO3(40mL, 1N) 중의 (1s,3s)-3-(3-브로모페닐)-3-(5-머캅토-4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부탄-1-올(4.5g, 13.2mmol) 및 NaNO2(5.4g, 79.4mmol)의 혼합물을 질소 분위기하에 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 잔류물을 크로마토그래피 C로 정제하여 표제 화합물(500mg, 3단계에 걸쳐 3%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.29 (s, 1H), 7.47 - 7.29 (m, 4H), 5.30 (d, J = 6.9Hz, 1H), 4.25 - 4.18 (m, 1H), 3.17 (s, 3H), 3.04 - 2.97 (m, 2H), 2.74 - 2.67 (m, 2H). LCMS: C13H14BrN3O 필요치: 308, 실측치: m/z = 310 [M+H]+.
실시예 U: 3-(( 1s,3s )-1-(3- 브로모페닐 )-3- 메톡시사이클로부틸 )-4- 메틸 -4H-1,2,4-트리아졸
Figure pct00154
단계 1: 메틸 ( 1s,3s )-1-(3- 브로모페닐 )-3- 하이드록시사이클로부탄 -1-카 복실레이트의 합성. DCM(300mL) 및 MeOH(30mL) 중의 (1s,3s)-1-(3-브로모페닐)-3-하이드록시사이클로부탄-1-카복실산(20g, 74mmol)의 교반 용액에 TMSCHN2(헥산 중 2M, 55mL)를 0℃에서 적가하고, 혼합물을 질소 분위기하에 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(9.5g, 44%)을 수득하였다.
단계 2: 메틸 ( 1s,3s )-1-(3- 브로모페닐 )-3- 메톡시사이클로부탄 -1-카 복실 레이트의 합성. DMF(25mL) 중의 메틸 (1s,3s)-1-(3-브로모페닐)-3-하이드록시사이클로부탄-1-카복실레이트(1.53g, 5.2mmol)의 교반 용액에 NaH(218mg, 10.5mmol, 60%)를 0℃에서 분량으로 첨가하고, 질소 분위기하에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물에 MeI(1.52g, 10.5mmol)를 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(1.4g, 90%)을 수득하였다.
단계 3: ( 1s,3s )-1-(3- 브로모페닐 )-3- 메톡시사이클로부탄 -1-카 복실산의 합성. THF(15mL) 중의 (1s,3s)-1-(3-브로모페닐)-3-메톡시사이클로부탄-1-카복실레이트(1.4g, 4.6mmol)의 용액에 0℃에서 물(5mL) 중 LiOH(0.5g, 18.7mmol)의 용액을 첨가했다. 혼합물을 질소 분위기하에 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 잔류물을 물로 희석하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수집된 수성 상을 HCl(1N)에 의해 pH 3-4로 산성화하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 건조시키고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 4: 2 -(( 1s,3s )-1-(3- 브로모페닐 )-3- 메톡시사이클로부탄 -1-카보닐)-N-메틸하이드라진-1-카보티오아미드의 합성. DMF(15mL) 중의 (1s,3s)-1-(3-브로모페닐)-3-메톡시사이클로부탄-1-카복실산(1.1g, 3.8mmol) 및 4-메틸-3-티오세미카바지드(0.5g, 4.6mmol)의 교반 용액에 0℃에서 HATU(2.1g, 5.5mmol) 및 DIEA(1.4mL, 7.7mmol)를 첨가하고, 혼합물을 질소 분위기하에 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 물을 첨가하여 혼합물을 급냉시켰다. 일반적인 작업과정 절차 1에 따라 표제 화합물을 수득하였고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 5: 5 -(( 1s,3s )-1-(3- 브로모페닐 )-3- 메톡시사이클로부틸 )-4- 메틸 -4H-1,2,4-트리아졸-3-티올의 합성. NaOH(1N, 물 중 24mL) 중의 2-((1s,3s)-1-(3-브로모페닐)-3-메톡시사이클로부탄-1-카보닐)-N-메틸하이드라진-1-카보티오아미드(2.4g, 조악함)의 용액을 질소 분위기하에 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 HCl(1N)에 의해 pH 약 3으로 산성화하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 건조시키고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하였고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 6: 3 -(( 1s,3s )-1-(3- 브로모페닐 )-3- 메톡시사이클로부틸 )-4- 메틸 -4H-1,2,4-트리아졸의 합성. 5-((1s,3s)-1-(3-브로모페닐)-3-메톡시사이클로부틸)-4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-티올(1.4g, 조악함) 및 NaNO2(2.7g, 39.5mmol)의 혼합물에 0℃에서 HNO3(1N, 40mL)을 적가하고, 혼합물을 질소 분위기하에 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 잔류물을 크로마토그래피 C로 정제하여 표제 화합물(460mg, 4단계에 걸쳐 30%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.31 (s, 1H), 7.49 - 7.43 (m, 2H), 7.36 - 7.32 (m, 2H), 4.09 - 3.99 (m, 1H), 3.19 (s, 3H), 3.12 (s, 3H), 3.07 - 3.01 (m, 2H), 2.79 - 2.72 (m, 2H). MS: C14H16BrN3O 필요치: 322, 실측치: m/z = 322 [M+H]+.
실시예 V: ( 1r,3r )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 사이클로부탄 -1-올
Figure pct00155
단계 1: 2 -(( 1r,3r )-1-(3- 브로모페닐 )-3- 하이드록시사이클로부탄 -1-카보닐)-N-메틸하이드라진-1-카보티오아미드의 합성: DMF(40mL) 중의 (1r,3r)-1-(3-브로모페닐)-3-하이드록시사이클로부탄-1-카복실산(850mg, 3.32mmol), 4-메틸-3-티오세미카바지드(418mg, 3.98mmol) 및 DIEA(1.7mL, 9.99mmol)의 혼합물에 0℃에서 HATU(1651mg, 4.34mmol)를 분량으로 첨가하고, 혼합물을 N2 분위기하에 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 건조시키고, 농축시켜 표제 화합물을 수득하고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 2: ( 1r,3r )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(5- 머캅토 -4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일)사이클로부탄-1-올의 합성: 2-((1r,3r)-1-(3-브로모페닐)-3-하이드록시사이클로부탄-1-카보닐)-N-메틸하이드라진-1-카보티오아미드(1.5g, 4.19mmol)의 용액에 NaOH 용액(1N, 물 중 25mL)을 0℃에서 적가하고, 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 HCl(1N)에 의해 pH 5-6으로 산성화시키고, 일반적인 작업과정 1을 수행하였다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(410mg, 34%)을 수득하였다. C13H14BrN3OS[M+H]+에 대한 MS 계산치, 340; 실측치, 340.
단계 3: ( 1r,3r )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 사이클로부탄 -1-올의 합성: (1r,3r)-3-(3-브로모페닐)-3-(5-머캅토-4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부탄-1-올(410mg, 1.20mmol) 및 NaNO2(510mg, 7.39mmol)의 혼합물에 HNO3(7mL, 1N)를 0℃에서 적가하고, 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 여과 및 증발 후, 잔류물을 크로마토그래피 C로 정제하여 표제 화합물(192mg, 52%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.39 (s, 1H), 7.47 - 7.44 (m, 1H), 7.34 - 7.29 (m, 2H), 7.14 - 7.11 (m, 1H), 5.29 (d, J = 6.9Hz, 1H), 4.06 - 4.01 (m, 1H), 3.32 - 3.19 (m, 2H), 3.19 (s, 3H), 2.47 - 2.40 (m, 2H). C13H14BrN3O [M+H]+에 대한 MS 계산치 308; 실측치, 308.
실시예 W: 3-(( 1r,3r )-1-(3- 브로모페닐 )-3- 메톡시사이클로부틸 )-4- 메틸 -4H-1,2,4-트리아졸
Figure pct00156
단계 1: (1r,3r)-3-(3- 브로모페닐 )-3-( 메톡시카보닐 ) 사이클로부틸 4- 니트 로벤조에이트의 합성: THF(50mL) 중 메틸 (1s,3s)-1-(3-브로모페닐)-3-하이드록시사이클로부탄-1-카복실레이트(5.0g, 17.5mmol) 및 4-니트로벤조산(5.9g, 35.0mmol)의 교반 용액에 실온에서 PPh3(9.2g, 35.0mmol) 및 디에틸 아조디카복실레이트(8.8g, 50.5mmol)를 연속적으로 적가하고, 혼합물을 질소 분위기하에 16시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하였다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(4.8g, 63%)을 수득하였다. C19H16BrNO6[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 434; 실측치, 434.
단계 2: (1r,3r)-1-(3- 브로모페닐 )-3- 하이드록시사이클로부탄 -1-카 복실산 의 합성. THF(60mL) 중의 (1r,3r)-3-(3-브로모페닐)-3-(메톡시카보닐)사이클로부틸 4-니트로벤조에이트(4.8g, 11.0mmol)의 용액에 H2O(20mL) 중의 LiOH(1.1g, 44.2mmol)를 첨가했다. 혼합물을 질소 분위기하에 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하고, 수성 상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수집된 수성 상을 HCl(1N)에 의해 pH 3-4로 산성화하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 건조시키고, 진공하에 농축시켜 표제 화합물을 제공하고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 3: 메틸 (1r,3r)-1-(3- 브로모페닐 )-3- 하이드록시사이클로부탄 -1-카복실레이트의 합성: DCM(25mL) 및 MeOH(2.5mL) 중의 (1r,3r)-1-(3-브로모페닐)-3-하이드록시사이클로부탄-1-카복실산(2.5g, 9.2mmol)의 교반 용액에 TMSCHN2(헥산 중 2M, 7.5mL)를 0℃에서 적가하고, 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하였다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(1.5g, 2단계에 걸쳐 47%)을 수득하였다. C12H13BrO3[M+H]+에 대해 MS 계산치, 285; 실측치, 285.
단계 4: 메틸 ( 1r,3r )-1-(3- 브로모페닐 )-3- 메톡시사이클로부탄 -1-카 복실 레이트의 합성: DMF(25mL) 중의 메틸 (1r,3r)-1-(3-브로모페닐)-3-하이드록시사이클로부탄-1-카복실레이트(1.5g, 5.2mmol)의 교반 용액에 0℃에서 NaH(218mg, 10.5mmol, 60%)를 분량으로 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기하에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물에 MeI(1.5g, 10.5mmol)를 0℃에서 적가하고, 혼합물을 질소 분위기하에 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(1.4g, 90%)을 수득하였다. C13H15BrO3[M+H]+에 대한 MS 계산치, 299; 실측치, 299.
단계 5: ( 1r,3r )-1-(3- 브로모페닐 )-3- 메톡시사이클로부탄 -1-카 복실산의 합성: THF(15mL) 중의 (1r,3r)-1-(3-브로모페닐)-3-메톡시사이클로부탄-1-카복실레이트(1.4g, 4.6mmol)의 용액에 0℃에서 H2O(5mL) 중의 LiOH(0.45g, 18.7mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 질소 분위기하에 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 잔류물을 물로 희석하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수집된 수용액을 HCl(1N)에 의해 pH 3-4로 산성화하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 건조시키고, 진공하에 농축시켜 표제 화합물을 제공하고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 6: 2 -((1r,3r)-1-(3- 브로모페닐 )-3- 메톡시사이클로부탄 -1-카보닐)-N-메틸하이드라진-1-카보티오아미드의 합성: DMF(15mL) 중의 (1r,3r)-1-(3-브로모페닐)-3-메톡시사이클로부탄-1-카복실산(1.1g, 3.8mmol) 및 4-메틸-3-티오세미카바지드(0.5g, 4.6mmol)의 교반 용액에 0℃에서 HATU(2.1g, 5.5mmol) 및 DIEA(1.0g, 7.7mmol)를 첨가하고, 혼합물을 질소 분위기하에 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하여 반응 혼합물을 급냉시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 건조시키고, 진공하에 농축시켜 표제 화합물을 제공하고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 7: 5 -((1r,3r)-1-(3- 브로모페닐 )-3- 메톡시사이클로부틸 )-4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-티올의 합성: NaOH(1N, 물 중 30mL) 중의 2-((1r,3r)-1-(3-브로모페닐)-3-메톡시사이클로부탄-1-카보닐)-N-메틸하이드라진-1-카보티오아미드의 용액을 질소 분위기하에 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 HCl(1N)에 의해 pH 약 3으로 산성화하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고 건조시켰다. 여과 및 증발 후, 잔류물을 크로마토그래피 C로 정제하여 표제 화합물(430mg, 3단계에 걸쳐 23%)을 수득하였다. C14H16BrN3OS[M+H]+에 대해 MS 계산치, 354; 실측치, 354.
단계 8: 3 -(( 1r,3r )-1-(3- 브로모페닐 )-3- 메톡시사이클로부틸 )-4- 메틸 -4H-1,2,4-트리아졸의 합성: 5-((1r,3r)-1-(3-브로모페닐)-3-메톡시사이클로부틸)-4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-티올(430mg, 1.21mmol) 및 NaNO2(838mg, 12.10mmol)의 혼합물에 HNO3(1N, 13mL)를 0℃에서 적가하고, 혼합물을 질소 분위기하에 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 잔류물을 크로마토그래피 C로 정제하여 표제 화합물(184mg, 47%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.40 (s, 1H), 7.48 - 7.45 (m, 1H), 7.35 - 7.31 (m, 2H), 7.19 - 7.17 (m, 1H), 3.88 - 3.79 (m, 1H), 3.34 - 3.26 (m, 2H), 3.20 (s, 3H), 3.17 (s, 3H), 2.46 - 2.43 (m, 2H). C14H16BrN3O [M+H]+에 대한 MS 계산치, 322; 실측치, 322.
실시예 X 및 실시예 Y: ( 1s,3s )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일)사이클로부탄-1-카보니트릴(X) 및 ( 1r,3r )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(4-메 틸 -4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부탄-1-카보니트릴(Y)
Figure pct00157
단계 1: ( 1s,3s )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 사이 클로부틸 메탄설포네이트의 합성. DCM(10mL) 중의 (1s,3s)-3-(3-브로모페닐)-3-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부탄-1-올(1.2g, 3.8mmol) 및 트리에틸아민(788.0mg, 7.79mmol)의 혼합물에 0℃에서 메탄설포닐 클로라이드(0.74mL, 4.67mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 용매를 진공하에 제거하였다. 잔류물을 크로마토그래피 C로 정제하여 표제 화합물(1.0g, 66%)을 수득하였다.
단계 6: ( 1s,3s )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 사이 클로부탄-1-카보니트릴(X) 및 ( 1r,3r )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트 리아졸-3-일)사이클로부탄-1-카보니트릴(Y)의 합성. 디메틸설폭사이드(20mL) 중의 (1s,3s)-3-(3-브로모페닐)-3-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸 메탄설포네이트(800mg, 2.07mmol), KCN(269mg, 4.14mmol), 및 K2CO3(572mg, 4.14mmol)의 혼합물을 질소 분위기하에 120℃에서 16시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1에 이어 크로마토그래피 C에 의해 산물의 혼합물을 수득하였다. 혼합물을 Prep-HPLC로 분리하여 표제 화합물 (1s,3s)-3-(3-브로모페닐)-3-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부탄-1-카보니트릴(187mg) 및 (1r,3r)-3-(3-브로모페닐)-3-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부탄-1-카보니트릴(258mg)을 수득하였다.
( 1s,3s )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 사이클로부탄 -1-카보니트릴. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.38 (s, 1H), 7.53 - 7.48 (m, 2H), 7.38 - 7.26 (m, 2H), 3.64 - 3.52 (m, 1H), 3.31 - 3.23 (m, 2H), 3.19 (s, 3H), 3.18 - 3.12 (m, 2H). MS(ESI): C14H13BrN4 필요치: 316, 실측치: m/z = 317 [M+H]+.
( 1r,3r )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 사이클로부탄 -1-카보니트릴. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.43 (s, 1H), 7.52 - 7.47 (m, 1H), 7.42 (t, J = 1.5Hz, 1H), 7.35 (t, J = 7.8Hz, 1H), 7.23 - 7.20 (m, 1H), 3.38 - 3.30 (m, 3H), 3.18 (s, 3H), 3.06 - 2.97 (m, 2H). MS(ESI): C14H13BrN4 필요치: 316, 실측치: m/z = 317 [M+H]+.
실시예 Z: 3-[5- (3-브로모페닐)스피로[2.3]헥산 -5-일]-4- 메틸 -1,2,4- 트리아졸
Figure pct00158
단계 1: 5 - (3-브로모페닐)스피로[2.3]헥산 -5-카 보니트릴의 합성. 무수 DMF(38mL) 중의 NaH(오일 중 60%, 1.7g, 44.0mmol)의 현탁액에 0℃에서 무수 DMF(2mL) 중의 1,1-비스(브로모메틸)사이클로프로판(5.0g, 22mmol)의 용액에 이어서 무수 DMF(4mL) 중의 2-(3-브로모페닐)아세토니트릴(4.31g, 22mmol)의 용액을 첨가하고, 생성된 현탁액을 60℃에서 15시간 동안 교반했다. 혼합물을 0℃로 냉각시킨 후, 물 및 EtOAc로 희석하였다. 일반적인 작업과정 절차 1에 이어 크로마토그래피 A로 표제 화합물(4.4g, 76%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.68 (t, J = 1.9Hz, 1H), 7.50 - 7.45 (m, 2H), 7.29 (t, J = 8.0Hz, 1H), 3.01 - 2.94 (m, 2H), 2.78 - 2.71 (m, 2H), 0.80 - 0.73 (m, 2H), 0.64 - 0.56 (m, 2H).
단계 2: 5 - (3-브로모페닐)스피로[2.3]헥산 -5-카 복실산의 합성. 에탄올(90mL) 중 5-(3-브로모페닐)스피로[2.3]헥산-5-카보니트릴(5.0g, 19.2mmol)의 용액에 물(20mL) 중 NaOH(6.1g, 154mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 환류하에 40시간 동안 교반하였다. 용액을 감압하에 농축시키고, 잔류물을 빙냉 2M 수성 HCl로 중화시켰다. 일반적인 작업과정 절차 1로 표제 화합물(5.2g, 97%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 11.09 (s, 1H), 7.49 (t, J = 2.1Hz, 1H), 7.40 (dt, J = 7.9, 1.0Hz, 1H), 7.30 - 7.26 (m, 1H), 7.21 (t, J = 7.9Hz, 1H), 2.96 - 2.89 (m, 2H), 2.74 - 2.65 (m, 2H), 0.56 (dd, J = 9.6, 6.5Hz, 2H), 0.42 (dd, J = 9.5, 6.5Hz, 2H). MS: C13H13BrO2 필요치: 280, 실측치: m/z = 279 [M-H]-.
단계 3: 5 - (3-브로모페닐)스피로[2.3]헥산 -5-카 보하이드라지드의 합성. 무수 DCM(185mL) 중 5-(3-브로모페닐)스피로[2.3]헥산-5-카복실산(5.23g, 18.6mmol) 및 Et3N(6mL, 43mmol)의 용액에 0℃에서 이소부틸 클로로포르메이트(2.7mL, 21mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 하이드라진(물 중 55%, 6.5mL, 74mmol)을 신속하게 첨가하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 1시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하고 상을 분리하였다. 유기 상을 염수로 세척한 후, 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켜 표제 화합물을 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
단계 4: 5 -[5- (3-브로모페닐)스피로[2.3]헥산 -5-일]-4- 메틸 -1,2,4-트리아졸-3-티올의 합성. THF(120mL) 중 5-(3-브로모페닐)스피로[2.3]헥산-5-카보하이드라지드(6.1g, 18.6mmol)의 용액에 메틸 이소티오시아네이트(4.1g, 56mmol)를 첨가하고, 생성된 용액을 65℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, 물(20mL) 중 NaOH(5.21g, 130mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 12시간 동안 환류 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 3M 수성 HCl로 pH를 약 5로 조정하였다. 일반적인 작업과정 절차 1은 표제 화합물을 수득하였고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
단계 5: 3 -[5- (3-브로모페닐)스피로[2.3]헥산 -5-일]-4- 메틸 -1,2,4- 트리아졸 의 합성. 혼합물 DCM(90mL) 및 AcOH(12mL) 중 5-[5-(3-브로모페닐)스피로[2.3]헥산-5-일]-4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-티올(7.1g, 18.6mmol)의 용액에 0℃에서 H2O2(물 중 30%, 5mL, 49mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온으로 가온하고, 2.5시간 동안 교반하였다. 추가의 H2O2(물 중 30%, 4mL, 35mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 2M 수성 NaOH로 pH를 약 13 내지 14로 조정하였다. 일반적인 작업과정 절차 1과 크로마토그래피 B가 사용되었다. 생성된 물질을 Et2O에 현탁시키고 5분 동안 초음파 처리하였다. 생성된 현탁액을 여과하고, Et2O로 세척하고, 공기 건조시켜 표제 화합물(2.80g, 3단계에 걸쳐 47%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.05 (s, 1H), 7.50 - 7.46 (m, 1H), 7.38 (dt, J = 7.3, 1.9Hz, 1H), 7.24 - 7.16 (m, 2H), 3.24 (d, J = 12.9Hz, 2H), 3.21 (s, 3H), 2.71 (d, J = 12.9Hz, 2H), 0.61 - 0.55 (m, 2H), 0.55 - 0.49 (m, 2H). MS: C15H16BrN3 필요치: 317, 실측치: m/z = 318 [M+H]+.
실시예 AA: (S)-4-( 트리플루오로메틸 )-6-((3-( 트리플루오로메틸 )피페리딘-1-일)메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00159
주위 온도에서 100mL 환저 플라스크에서, 실시예 K(911mg, 2.80mmol) 및 (S)-3-(트리플루오로메틸)피페리딘 하이드로클로라이드(533mg, 2.81mmol)를 DCM(10mL)에 용해시켰다. 트리에틸아민(2.0mL, 14mmol)을 첨가하고, 이어서 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드(1.79g, 8.44mmol)를 첨가하였다. 반응물을 주위 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 염화암모늄 수용액 및 DCM을 첨가하고, 일반적인 작업과정 절차 1을 수행했다. 이 조악한 물질에 주위 온도에서 MeOH 중의 암모니아(7M, 10mL, 70mmol)를 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 크로마토그래피 B로 정제하여 표제 화합물(605mg, 59%)을 수득하였다. (C16H16F6N2O)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 367; 실측치, 368.
실시예 AB: (R)-6-(2-(2- 메틸모르폴리노 )프로판-2-일)-4-( 트리플루오로메틸 )이소인돌린-1-온
Figure pct00160
단계 1: 메틸 5- 브로모 -2- 메틸 -3-( 트리플루오로메틸 ) 벤조에이트의 합성. 아세트산(100mL) 중의 메틸 2-메틸-3-(트리플루오로메틸)벤조에이트(15g, 73mmol)의 혼합물에 HNO3(46g) 및 브롬(12.8g, 80.1mmol)을 첨가하였다. 이어서, AgNO3(16.1g, 물 중 2.5M)을 약 30분에 걸쳐 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(14.0g, 70%)을 수득하였다.
단계 2: 메틸 5- 브로모 -2-( 브로모메틸 )-3-( 트리플루오로메틸 ) 벤조에이트의 합성. CCl4(150mL) 중 메틸 5-브로모-2-메틸-3-(트리플루오로메틸)벤조에이트(14.0g, 47.1mmol), NBS(16.8g, 94.4mmol) 및 BPO(2.3g, 8.9mmol)의 혼합물을 80℃에서 5시간 동안 교반하였다. 이어서, 고체를 여과 제거하였다. 여액을 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(11.2g, 63%)을 수득하였다.
단계 3: 6 - 브로모 -4-( 트리플루오로메틸 )-2,3- 디하이드로 -1H- 이소인돌 -1-온의 합성. THF(50mL) 중의 메틸 5-브로모-2-(브로모메틸)-3-(트리플루오로메틸)벤조에이트(11.2g, 29.8mmol)의 교반 용액에 NH3(MeOH 중 7M, 50mL)를 첨가했다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공하에 농축시켰다. 일반적인 작업과정 절차 1에 이어 크로마토그래피 A로 표제 화합물(8.1g, 53%)을 수득하였다. (C9H5BrF3NO)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 280.0; 실측치, 280.1.
단계 4: 6 -아세틸-4-( 트리플루오로메틸 ) 이소인돌린 -1-온의 합성. 디옥산 (100.0mL) 중의 6-브로모-4-(트리플루오로메틸)-2,3-디하이드로이소인돌-1-온(9.6g, 34mmol), 트리부틸(1-에톡시에테닐)스탄난(18.6mg, 51.6mmol) 및 Pd(dppf)Cl2·CH2Cl2(2.8g, 3.4mmol)의 혼합물을 질소 분위기하에 100℃에서 16시간 동안 교반하였다. 용매를 증발로 제거하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 잔류물에 HCl(1N, 100.0mL) 및 THF(200.0mL)를 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기하에 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 유기 용매를 진공하에 제거하였다. 일반적인 작업과정 절차 1에 이어 크로마토그래피 A로 표제 화합물(4.2g, 50%)을 수득하였다. (C11H8F3NO2)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 244.1; 실측치, 244.0.
단계 5: 2 -[(2R)-2- 메틸모르폴린 -4-일]-2-[3-옥소-7-( 트리플루오로메틸 )-1,2-디하이드로이소인돌-5-일]프로판니트릴의 합성. 테트라하이드로푸란(20.0mL) 중의 6-아세틸-4-(트리플루오로메틸)-2,3-디하이드로이소인돌-1-온(650mg, 2.67mmol), (2R)-2-메틸모르폴린(270mg, 2.67mmol) 및 Ti(OEt)4(1.2g, 5.4mmol)의 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 트리메틸실릴 시아나이드(398mg, 4.01mmol)를 상기 혼합물에 첨가하고, 질소 분위기하에 60℃에서 16시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 잔류물을 크로마토그래피 C로 정제하여 2-[(2R)-2-메틸모르폴린-4-일]-2-[3-옥소-7-(트리플루오로메틸)-1,2-디하이드로이소인돌-5-일]프로판니트릴(550.0mg, 58%)을 수득하였다. (C17H18F3N3O2)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 354.1; 실측치, 354.0.
단계 6: (R)-6-(2-(2- 메틸모르폴리노 )프로판-2-일)-4-( 트리플루오로메틸 ) 이 소인돌린-1-온의 합성. 테트라하이드로푸란(20.0mL) 중의 2-[(2R)-2-메틸모르폴린-4-일]-2-[3-옥소-7-(트리플루오로메틸)-1,2-디하이드로이소인돌-5-일]프로판니트릴(550mg, 1.55mmol)의 탈기된 용액에 메틸마그네슘 브로마이드(31.0mL, 테트라하이드로푸란 중 3M)를 -60℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 질소 분위기하에 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NH4Cl 수용액으로 0℃에서 급냉시켰다. 일반적인 작업과정 절차 1에 이어 크로마토그래피 C로 표제 화합물(135.3mg, 33%)을 수득하였다. (C17H21F3N2O2)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 343.2; 실측치, 343.2. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.86 (s, 1H), 8.02 (s, 2H), 4.52 (s, 2H), 3.74 (d, J = 10.8Hz, 1H), 3.49 - 3.43 (m, 2H), 2.55 - 2.52 (m, 1H), 2.46 - 2.38 (m, 1H), 2.27 - 2.23 (m, 1H), 1.95 - 1.88 (m, 1H), 1.36 (s, 6H), 1.01 (d, J = 6.3Hz, 3H). 19F NMR (282 MHz, DMSO-d 6 ) δ -60.11.
실시예 AC: 3-(3-(3- 브로모페닐 ) 옥세탄 -3-일)-4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸
Figure pct00161
단계 1: 메틸 2-(3- 브로모페닐 )-3- 하이드록시 -2-( 하이드록시메틸 ) 프로파노 에이트의 합성. 무수 DMF(190mL) 중의 메틸 2-(3-브로모페닐)아세테이트(12.6mL, 80.0mmol)의 용액에 파라포름알데히드(9.6g, 320mmol), 이어서 NaOMe(864mg, 16.0mmol)를 첨가하고, 생성된 현탁액을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 물질을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(5.75g, 25%)을 수득하였다.
단계 2: 메틸 3-(3- 브로모페닐 ) 옥세탄 -3-카 복실레이트의 합성. 무수 PhMe(90mL) 중의 메틸 2-(3-브로모페닐)-3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로파노에이트(5.2g, 17.9mmol)의 용액에 아연 비스(디메틸디티오카바메이트)(6.0g, 19.7mmol)에 이어, Ph3P(9.4g, 36mmol)를 첨가하였고, 생성된 현탁액을 0℃로 냉각시켰다. 이어서, 디에틸 아조디카복실레이트(5.6mL, 36mmol)를 적가하고, 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 혼합물을 DCM으로 희석하고, 실리카 겔을 첨가하고, 혼합물을 감압하에 농축시켰다. 물질을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(923mg, 19%)을 수득하였다.
단계 3: 3 -(3- 브로모페닐 ) 옥세탄 -3-카 보하이드라지드의 합성. MeOH(10mL) 중의 메틸 3-(3-브로모페닐)옥세탄-3-카복실레이트(762mg, 2.81mmol)의 용액에 하이드라진(H2O 중 55%, 1.0mL, 11mmol)을 첨가하고, 용액을 16시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 감압하에 증발시킨 후 감압하에서 60시간 동안 건조시켜 표제 화합물(765mg, 100%)을 수득하였다. MS: C10H11BrN2O2 필요치: 270, 실측치: m/z=271[M+H]+.
단계 4: 5 -[3-(3- 브로모페닐 ) 옥세탄 -3-일]-4- 메틸 -1,2,4- 트리아졸 -3- 티올의 합성. THF(30mL) 중의 3-(3-브로모페닐)옥세탄-3-카보하이드라지드(969mg, 3.57mmol)의 용액에 메틸 이소티오시아네이트(287mg, 3.93mmol)를 첨가하고, 생성된 용액을 2시간 동안 65℃에서 교반하였다. 이어서, 물(9mL) 중 KOH(2.41g, 42.9mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 15시간 동안 환류 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 2M 수성 HCl로 pH를 약 2로 조정하였다. 혼합물을 EtOAc로 희석하고 상을 분리하였다. 수성 상을 EtOAc로 추출하고, 합한 유기 상을 염수로 세척한 다음, 건조시키고, 여과하고, 감압하에서 농축시켜 표제 화합물을 수득하고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 5: 3 -(3-(3- 브로모페닐 ) 옥세탄 -3-일)-4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸의 합 성. DCM(25mL) 및 AcOH(2.5mL) 중의 5-[3-(3-브로모페닐)옥세탄-3-일]-4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-티올(1.2g, 3.6mmol)의 용액에 0℃에서 H2O2(물 중 30%, 1.8mL, 18mmol)를 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 DCM 및 물로 희석한 후, 2M 수성 NaOH로 pH를 약 13 내지 14로 조정하였다. 상을 분리하고, 수성 상을 DCM으로 2회 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 세척한 다음, 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 물질을 크로마토그래피 B로 정제하였다. 생성된 물질을 Et2O에 현탁시키고, 15분 동안 초음파 처리하였다. 생성된 현탁액을 여과하고, Et2O로 세척하고, 공기 건조시켜 표제 화합물(635mg, 2단계에 걸쳐 60%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.13 (s, 1H), 7.50 (t, J = 1.8Hz, 1H), 7.48 (ddd, J = 7.9, 1.9, 1.0Hz, 1H), 7.27 (t, J = 7.8Hz, 1H), 7.17 (ddd, J = 7.9, 1.9, 1.0Hz, 1H), 5.52 (d, J = 6.3Hz, 2H), 5.05 (d, J = 6.3Hz, 2H), 3.23 (s, 3H). MS: C12H12BrN3O 필요치: 293, 실측치: m/z = 294 [M+H]+.
실시예 AD 및 실시예 AE : 2- ((1s,3s)-3-(3-브로모페닐)-3- (4- 메틸 -4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)아세토니트릴(AD) 및 2-(( 1r,3r )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)아세토니트릴(AE)
Figure pct00162
단계 1: 1 -(3- 브로모페닐 )-3,3- 디메톡시 - 사이클로부탄카보니트릴의 합성. DMF(60mL) 중 NaH(오일 중 60% 분산액, 3.7g, 91mmol)의 용액에 0℃에서 15분 동안 DMF(10mL) 중 2-(3-브로모페닐)아세토니트릴(9.0g, 46mmol)의 용액에 이어, 1,3-디브로모-2,2-디메톡시-프로판(10.0g, 38mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃로 가열하고, 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 냉각시키고, MeOH로 희석한 다음, 휘발성 물질을 감압하에 증발시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(7.3g, 64%)을 수득하였다.
단계 2: 1 -(3- 브로모페닐 )-3,3- 디메톡시 - 사이클로부탄카복실산의 합성. EtOH(43mL) 중의 1-(3-브로모페닐)-3,3-디메톡시-사이클로부탄카보니트릴(8.5g, 29mmol)의 용액에 수성 NaOH(물 중 1M, 43mL, 110mmol)를 첨가하고, 혼합물을 15시간 동안 85℃로 가열하였다. 휘발성 물질을 감압하에 증발시킨 후, 1M 수성 HCl 을 사용하여 pH를 1 내지 2로 조정하였다. 수성 층을 EtOAc로 4회 추출하고, 합한 유기 상을 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켜 표제 화합물(8.6g, 95%)을 수득하고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 3: 1 -(3- 브로모페닐 )-3,3- 디메톡시사이클로부탄 -1-카 보하이드라지드 의 합성. DCM(250mL) 중 1-(3-브로모페닐)-3,3-디메톡시-사이클로부탄카복실산(8.5g, 27mmol)의 용액에 0℃에서 TEA(7.5mL, 54mmol)에 이어서 이소부틸 클로로포르메이트(3.8mL, 39.7mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 -30℃로 냉각시킨 후, 하이드라진 수화물(10.5mL, 108mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고 40분 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 조악한 물질을 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 4: 5 -(1-(3- 브로모페닐 )-3,3- 디메톡시사이클로부틸 )-4- 메틸 -4H-1,2,4-트리아졸-3-티올의 합성. THF(230mL) 중의 조악한 물질의 교반 용액에 메틸 이소티오시아네이트(5.9g, 80.9mmol)를 첨가하고, 혼합물을 66℃에서 1시간 동안 교반한 후, 실온으로 냉각시켰다. 이어서, 물(30mL) 중 수산화칼륨(순도 85%, 8.9g, 135mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 66℃에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물의 pH를 1M 수성 HCl로 약 7로 조정한 후, DCM으로 희석하였다. 상을 분리하고, 수성 상을 DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 조악한 물질을 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 5: 3 -(3- 브로모페닐 )-3-(4- 메틸 -1,2,4- 트리아졸 -3-일) 사이클로부탄온 의 합성. DCM(100mL) 중 조악한 물질의 교반 용액에 0℃에서 H2O2(물 중 30%, 6.9mL, 67mmol)에 이어서, 아세트산(15mL)을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 추가의 H2O2(물 중 30%, 4.0mL, 40mmol)를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 1M 수성 NaOH로 희석하고 pH를 14로 조정하였다. 상을 분리하고, 수성 상을 EtOAc로 3회 세척하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 물질을 크로마토그래피 B로 정제하여 표제 화합물(6.8g, 4단계에 걸쳐 72%)을 수득하였다.
단계 6: 2 -(3-(3- 브로모페닐 )-3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 사이클로 부틸리덴)아세토니트릴의 합성. 무수 THF(82mL) 중 3-(3-브로모페닐)-3-(4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부탄온(4.9g, 16mmol) 및 2-디에톡시포스포릴아세토니트릴(3.11mL, 19.2mmol)의 혼합물에 t-BuOK(THF 중 1M, 19.2mL, 19.2mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1은 조악한 표제 화합물을 수득하였고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
단계 7: 2 -(( 1s,3s )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일)사이클로부틸)아세토니트릴 및 2-(( 1r,3r )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(4- 메틸 -4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)아세토니트릴의 합성. THF(160mL) 및 i-PrOH(30mL) 중의 조악한 2-(3-(3-브로모페닐)-3-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸리덴)아세토니트릴에 NaBH4(1.5g, 40mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 18시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 감압하에 증발시키고, 혼합물을 EtOH(100mL)로 희석하였다. 용액을 2시간 동안 교반한 후, 감압하에 증발시켰다. 거울상이성체는 45℃에서 CO2에서 IPA로 용출하는 Lux 셀룰로스-2 컬럼에서 SFC에 의해 분해되어 2-((1s,3s)-3-(3-브로모페닐)-3-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)아세토니트릴(480mg) 및 2-((1r,3r)-3-(3-브로모페닐)-3-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)아세토니트릴(420mg)을 수득하였다.
2-(( 1s,3s )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 사이클로부틸 )아세토니트릴: 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.03 (s, 1H), 7.34 - 7.30 (m, 1H), 7.26 (t, J = 1.7Hz, 1H), 7.16 (t, J = 7.9Hz, 1H), 7.10 - 7.06 (m, 1H), 3.18 (s, 3H), 3.17 - 3.10 (m, 2H), 2.82 - 2.69 (m, 1H), 2.55 - 2.43 (m, 4H). MS: C15H15BrN4 필요치: 330, 실측치: m/z = 331 [M+H]+.
2-(( 1r,3r )-3-(3- 브로모페닐 )-3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 사이클로부틸 )아세토니트릴: 1H NMR (500 MHz, C6D6) δ 7.58 (s, 1H), 7.56 (t, J = 1.8Hz, 1H), 7.30 - 7.27 (m, 1H), 6.98 (ddd, J = 7.9, 1.8, 1.0Hz, 1H), 6.87 (t, J = 7.9Hz, 1H), 2.62 - 2.55 (m, 2H), 2.46 - 2.39 (m, 2H), 2.37 (s, 3H), 2.20 - 2.09 (m, 1H), 1.86 (d, J = 7.3Hz, 2H). MS: C15H15BrN4 필요치: 330, 실측치: m/z = 331 [M+H]+.
실시예 AF : 3-(1-(3- 브로모페닐 )-3,3- 디플루오로사이클로부틸 )-4- 메틸 -4H-1,2,4-트리아졸
Figure pct00163
단계 1: 메틸 1-(3- 브로모페닐 )-3,3- 디플루오로사이클로부탄 -1-카 복실레 이트의 합성. 메틸렌 클로라이드(100mL) 중 메틸 1-(3-브로모페닐)-3-옥소사이클로부탄-1-카복실레이트(2.50g, 8.83mmol)의 교반 용액에 1,1,1-트리플루오로-N,N-비스(2-메톡시에틸)-λ4-설판아민(톨루엔 중 50%, 11.7g, 26.49mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 약 16시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(2.50g, 93%)을 수득하였다.
단계 2: 1 -(3- 브로모페닐 )-3,3- 디플루오로사이클로부탄 -1-카 보하이드라지 드의 합성. 에탄올(80mL) 중 메틸 1-(3-브로모페닐)-3,3-디플루오로사이클로부탄-1-카복실레이트(2.50g, 8.19mmol)의 교반 용액에 하이드라진 수화물(8. mL, 81.94mmol)을 첨가했다. 혼합물을 80℃에서 약 16시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 잔류물을 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
단계 3: 5 -[1-(3- 브로모페닐 )-3,3- 디플루오로사이클로부틸 ]-4- 메틸 -1,2,4-트리아졸-3-티올의 합성. THF(80mL) 중의 1-(3-브로모페닐)-3,3-디플루오로사이클로부탄-1-카보하이드라지드(2.50g, 8.19mmol)의 용액에 메틸 이소티오시아네이트(0.60g, 8.19mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고, 물(40mL) 및 수산화칼륨(2.30g, 40.95mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 80℃에서 36시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 조악한 물질을 다음 단계에서 사용하였다.
단계 4: 3 -[1-(3- 브로모페닐 )-3,3- 디플루오로사이클로부틸 ]-4- 메틸 -1,2,4-트리아졸의 합성. 메틸렌 클로라이드(80mL) 및 아세트산(5mL) 중의 5-[1-(3-브로모페닐)-3,3-디플루오로사이클로부틸]-4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-티올(2.9mg, 8.19mmol)의 교반 용액에 과산화수소(1.8mL, 16.38mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 B로 정제하여 표제 화합물(1.3g, 3단계에 걸쳐 44%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) δ 8.19 (s, 1H), 7.47 (dt, J = 7.9, 1.4Hz, 1H), 7.43 (t, J = 1.9Hz, 1H), 7.29 (d, J = 1.6Hz, 1H), 7.27 (d, J = 7.9Hz, 1H), 3.74 (dt, J = 14.4, 12.5Hz, 2H), 3.38 - 3.31 (m, 2H), 3.18 (s, 3H). MS: C13H12BrF2N3 필요치: 327, 실측치: m/z = 328 [M+H]+.
실시예 1: 2-(3-((R)-사이클로부틸(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸)페닐)-6-(((R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00164
디옥산(3.5mL) 중의 Cs2CO3(639mg, 1.96mmol), XantPhos(77.1mg, 0.133mmol), 실시예 D(231mg, 0.662mmol), 실시예 A(200mg, 0.653mmol), 및 팔라듐 아세테이트(15.3mg, 0.0682mmol)의 혼합물을 밀폐 베쎌에서 120℃에서 1시간 동안 가열하였다. 냉각 후, 반응물을 물 및 DCM으로 희석하였다. 여과 후, 산물을 DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 에틸 아세테이트와 DCM의 혼합물 중 MeOH의 구배를 사용하는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 이어서 크로마토그래피 C로 표제 화합물(198mg, 0.346mmol, 53% 수율)을 수득하였다. (C30H32F5N5O)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 574.6; 실측치, 574.5. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.07 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.90 (t, J = 2.0Hz, 1H), 7.77 (dt, J = 8.3, 1.5Hz, 1H), 7.41 (t, J = 7.9Hz, 1H), 7.13 - 7.08 (m, 1H), 5.07 (s, 2H), 4.15 (d, J = 10.6Hz, 1H), 3.74 (s, 2H), 3.43 (s, 3H), 3.33 (ddd, J = 17.4, 15.2, 7.3Hz, 1H), 2.78 (dd, J = 26.0, 10.2Hz, 2H), 2.40 (t, J = 11.3Hz, 1H), 2.24 - 2.21 (m, 1H), 2.14 - 2.11 (m, 3H), 1.90 - 1.83 (m, 5H), 1.81 - 1.73 (m, 1H), 1.00 (d, J = 6.3Hz, 3H).
실시예 2: 2-(3-((S)-사이클로부틸(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸)페닐)-6-(((R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00165
이 C-N 결합 형성은 실시예 B 및 실시예 D를 사용하여 실시예 1과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(171mg, 0.299mmol, 46% 수율)을 수득하였다. (C30H32F5N5O)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 574.6; 실측치, 574.5. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.07 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.90 (t, J = 2.0Hz, 1H), 7.77 (dt, J = 8.3, 1.5Hz, 1H), 7.41 (t, J = 7.9Hz, 1H), 7.13 - 7.08 (m, 1H), 5.07 (s, 2H), 4.15 (d, J = 10.6Hz, 1H), 3.74 (s, 2H), 3.43 (s, 3H), 3.33 (ddd, J = 17.4, 15.2, 7.3Hz, 1H), 2.78 (dd, J = 26.0, 10.2Hz, 2H), 2.40 (t, J = 11.3Hz, 1H), 2.24 - 2.20 (m, 1H), 2.14 - 2.04 (m, 3H), 1.92 - 1.83 (m, 5H), 1.81 - 1.73 (m, 1H), 1.00 (d, J = 6.3Hz, 3H).
실시예 3: 2 -(3-((R)- 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 )페닐)-6-(((S)-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00166
이 C-N 결합 형성은 실시예 A 및 실시예 E를 사용하여 실시예 1과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(44.8mg, 0.0833mmol, 38%의 수율)을 수득했다. (C30H34F3N5O) [M+H]+에 대한 MS (ESI) 계산치, 538; 실측치, 539. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.06 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.89 (dd, J = 4.9, 2.9Hz, 2H), 7.77 (dd, J = 8.1, 2.2Hz, 1H), 7.40 (t, J = 7.9Hz, 1H), 7.09 (d, J = 7.7Hz, 1H), 5.05 (s, 2H), 4.14 (d, J = 10.6Hz, 1H), 3.64 (s, 2H), 3.42 (s, 3H), 3.37 - 3.24 (m, 1H), 2.77 (t, J = 9.6Hz, 2H), 2.26 - 2.18 (m, 2H), 1.91 - 1.62 (m, 9H), 1.61 - 1.50 (m, 1H), 0.99 - 0.90 (m, 1H), 0.86 (d, J = 6.1Hz, 3H).
실시예 4: 2 -(3-((S)- 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 )페닐)-6-(((S)-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00167
이 C-N 결합 형성은 실시예 B 및 실시예 E를 사용하여 실시예 1과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(60mg, 38% 수율)을 수득했다. (C30H34F3N5O) [M+H]+에 대한 MS (ESI) 계산치, 538; 실측치, 539. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.06 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.89 (dd, J = 4.9, 2.9Hz, 2H), 7.77 (dd, J = 8.1, 2.2Hz, 1H), 7.40 (t, J = 7.9Hz, 1H), 7.09 (d, J = 7.7Hz, 1H), 5.05 (s, 2H), 4.14 (d, J = 10.6Hz, 1H), 3.64 (s, 2H), 3.42 (s, 3H), 3.37 - 3.24 (m, 1H), 2.77 (t, J = 9.6Hz, 2H), 2.26 - 2.18 (m, 2H), 1.91 - 1.62 (m, 9H), 1.61 - 1.50 (m, 1H), 0.99 - 0.90 (m, 1H), 0.86 (d, J = 6.1Hz, 3H).
실시예 5: 2-(3-((S)-사이클로부틸(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸)페닐)-4-사이클로프로필-6-(((R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-2,3-디하이드로-1H-피롤로[3,4-c]피리딘-1-온
Figure pct00168
이 C-N 결합 형성은 실시예 B 및 실시예 G를 사용하여 실시예 1과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(10mg, 12% 수율)을 수득하였다. (C31H36F2N6O) [M+H]+에 대한 MS (ESI) 계산치, 547.3; 실측치, 547.5. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.06 (s, 1H), 7.91 (t, J = 2.0Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 8.2, 2.2Hz, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.41 (t, J = 7.9Hz, 1H), 7.13 - 7.08 (m, 1H), 5.02 (s, 2H), 4.14 (d, J = 10.6Hz, 1H), 3.71 (s, 2H), 3.42 (s, 3H), 3.32 (ddd, J = 16.1, 11.3, 7.8Hz, 1H), 2.80 (dd, J = 23.8, 10.1Hz, 2H), 2.41 (t, J = 10.8Hz, 1H), 2.05 (td, J = 11.0, 9.6, 4.1Hz, 1H), 1.88 - 1.73 (m, 6H), 1.20 - 1.06 (m, 4H), 0.99 (d, J = 6.2Hz, 3H).
실시예 6: 2-(3-((S)-사이클로부틸(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸)페닐)-4-사이클로프로필-6-(((S)-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-2,3-디하이드로-1H-피롤로[3,4-c]피리딘-1-온
Figure pct00169
C-N 결합의 형성은 실시예 B 및 실시예 H를 사용하여 실시예 1의 단계 4와 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(2.9mg, 3.5% 수율)을 수득하였다. (C31H38N6O)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 511.3; 실측치, 511.6. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.04 (s, 1H), 7.88 (d, J = 2.0Hz, 1H), 7.77 (dd, J = 8.3, 2.2Hz, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.39 (t, J = 7.9Hz, 1H), 7.08 (d, J = 7.7Hz, 1H), 4.99 (s, 2H), 4.12 (d, J = 10.6Hz, 1H), 3.59 (s, 2H), 3.40 (s, 3H), 3.30 (dq, J = 12.8, 8.1Hz, 1H), 2.76 (d, J = 7.9Hz, 2H), 1.90 - 1.79 (m, 3H), 1.79 - 1.49 (m, 6H), 1.15 - 1.03 (m, 4H), 0.94 - 0.86 (m, 1H), 0.84 (d, J = 6.1Hz, 3H).
실시예 7: 2 -(3-((4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일)( 옥세탄 -3-일) 메틸 )페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00170
단계 1: 메틸 2-(3- 니트로페닐 )-2-( 옥세탄 -3-일)아세테이트의 합성. 메틸 2-(3-니트로페닐)아세테이트(1.00g, 5.14mmol)를 임의의 발열을 제어하기 위해 수조에서 주위 온도에서 DMF(6mL)에 용해시켰다. 3-요오도옥세탄(450μL, 5.14mmol)을 첨가한 후, 칼륨 3급-부톡사이드(711mg, 6.33mmol)를 분랑으로 첨가하였다. 반응물을 1시간 동안 교반한 후, 포화 염화암모늄 용액, 1N HCl 및 DCM의 용액을 첨가하였다. 산물을 DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 크로마토그래피 A로 정제하여 메틸 2-(3-니트로페닐)-2-(옥세탄-3-일)아세테이트(227mg, 0.904mmol, 18% 수율)를 수득하였다.
단계 2: 2 -(3- 니트로페닐 )-2-( 옥세탄 -3-일) 아세토하이드라지드의 합성. 메틸 2-(3-니트로페닐)-2-(옥세탄-3-일)아세테이트(227mg, 0.904mmol)를 에탄올(1.9mL)에 용해시켰다. 하이드라진 수화물(385μL, 6.18mmol)을 첨가하고, 혼합물을 40℃에서 밤새 가열하였다. 반응물을 농축시킨 후, 산물을 DCM 중 MeOH의 구배를 사용하는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 단리시켜 2-(3-니트로페닐)-2-(옥세탄-3-일)아세토하이드라지드(186mg, 0.742mmol, 82% 수율)를 수득하였다.
단계 3: 4 - 메틸 -5-((3- 니트로페닐 )( 옥세탄 -3-일) 메틸 )-4H-1,2,4- 트리아졸 -3-티올의 합성. 2-(3-니트로페닐)-2-(옥세탄-3-일)아세토하이드라지드(186mg, 0.742mmol)에 주위 온도에서 THF(2mL)를 첨가하였다. 메틸 티오이소시아네이트(152μL, 2.22mmol)를 첨가하고 반응물을 50℃로 가열하였고, 이때 반응 혼합물은 균일해졌다. 2시간 동안 교반한 후, 반응물을 냉각시키고, 1N NaOH(1.5mL)를 첨가하였다. 반응물을 50℃로 4시간 동안 가열한 후, 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM으로 1회 세척한 후, 1N HCl을 사용하여 산성화하였다. 산물을 DCM으로 4회 추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 크로마토그래피를 통해 정제하여 4-메틸-5-((3-니트로페닐)(옥세탄-3-일)메틸)-4H-1,2,4-트리아졸-3-티올(171mg, 0.557mmol, 75% 수율)을 수득하였다.
단계 4: 3 -((4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일)( 옥세탄 -3-일) 메틸 )아닐린의 합성. 라니 니켈(물 중 슬러리, 1.35g)을 주위 온도에서 4-메틸-5-((3-니트로페닐)(옥세탄-3-일)메틸)-4H-1,2,4-트리아졸-3-티올(171mg, 0.557mmol)에 첨가했다. 에탄올(4.5mL)을 첨가하고, 반응물을 78℃로 45분 동안 가열하였다. 냉각 후, 혼합물을 여과하고 농축시켜 표제 화합물을 수득하였고, 이것을 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 5: 2 -(3-((4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일)( 옥세탄 -3-일) 메틸 )페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온의 합성. 이 반응은 실시예 10의 단계 7과 유사한 방식으로 수행하여 2-(3-((4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)(옥세탄-3-일)메틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온(38.8mg, 32% 수율)을 수득하였다. (C22H19F3N4O2)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 429; 실측치, 429. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 8.36 (s, 1H), 8.07 (d, J = 7.6Hz, 1H), 8.03 (d, J = 7.7Hz, 1H), 7.92 (t, J = 1.9Hz, 1H), 7.85 - 7.76 (m, 2H), 7.40 (t, J = 7.9Hz, 1H), 7.02 (d, J = 7.7Hz, 1H), 5.20 (s, 2H), 4.80 - 4.68 (m, 2H), 4.53 - 4.43 (m, 2H), 4.28 (t, J = 6.3Hz, 1H), 3.93 - 3.82 (m, 1H), 3.38 (s, 3H).
실시예 8 및 9: (R)-2-(3-( 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 )페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온 및 (S)-2-(3-( 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00171
라세미체 2-(3-(사이클로부틸(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온(29mg)을 3-요오도옥세탄 대신에 브로모사이클로부탄을 사용하여 실시예 7의 단계 1-6에 따라 합성하였다. 이 라세미 혼합물을 IG 컬럼 및 용매로서 MeOH 및 CO2를 사용하여 SFC를 통해 분리하여 체류 시간이 더 긴 (R)-2-(3-(사이클로부틸(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸)-3-일)메틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온(5.9mg) 및 체류 시간이 더 짧은 (S)-2-(3-(사이클로부틸(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온(6.1mg)을 수득하였다.
(R)-2-(3-( 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 )페닐)-4-( 트 리플루오로메틸)이소인돌린-1-온 (C23H21F3N4O)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 427; 실측치, 427. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 8.32 (s, 1H), 8.07 (d, J = 7.6Hz, 1H), 8.03 (d, J = 7.7Hz, 1H), 7.92 (t, J = 2.0Hz, 1H), 7.84 - 7.72 (m, 2H), 7.38 (t, J = 7.9Hz, 1H), 7.04 (d, J = 7.7Hz, 1H), 5.19 (s, 2H), 4.23 (d, J = 10.6Hz, 1H), 3.43 (s, 3H), 3.22 (dt, J = 17.9, 8.2Hz, 1H), 2.18 - 2.04 (m, 1H), 1.90 - 1.64 (m, 5H).
(S)-2-(3-( 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 )페닐)-4-( 트 리플루오로메틸)이소인돌린-1-온 (C23H21F3N4O)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 427; 실측치, 427. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 8.32 (s, 1H), 8.07 (d, J = 7.6Hz, 1H), 8.03 (d, J = 7.7Hz, 1H), 7.91 (d, J = 1.9Hz, 1H), 7.83 - 7.73 (m, 2H), 7.38 (t, J = 7.9Hz, 1H), 7.04 (d, J = 7.7Hz, 1H), 5.19 (s, 2H), 4.23 (d, J = 10.6Hz, 1H), 3.43 (s, 3H), 3.22 (dt, J = 17.6, 8.6Hz, 1H), 2.16 - 2.05 (m, 1H), 1.89 - 1.65 (m, 5H).
실시예 10: 2 -(3-(3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 테트라하이드로푸란 -3-일)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00172
단계 1: 4 -(3- 니트로페닐 )-3,6- 디하이드로 -2H-피란의 합성. 인산칼륨 수화물(3.18g, 15.0mmol), 1-브로모-3-니트로벤젠(1.01g, 4.98mmol), 2-(3,6-디하이드로-2H-피란-4-일)-4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란(1.25g, 5.96mmol) 및 PdCl2dppf(184mg, 0.251mmol)를 디옥산(14mL)과 물(1mL)의 혼합물에 현탁시켰다. 질소로 퍼징한 후, 혼합물을 90℃에서 밤새 가열하였다. 냉각 후, 혼합물을 여과하고 DCM으로 세정했다. 조악한 여액을 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 4-(3-니트로페닐)-3,6-디하이드로-2H-피란(913mg, 4.45mmol, 89% 수율)을 수득하였다.
단계 2: 3 -(3- 니트로페닐 ) 테트라하이드로푸란 -3- 카브알데히드의 합성. 탄산나트륨(130mg, 1.23mmol) 및 4-(3-니트로페닐)-3,6-디하이드로-2H-피란(104mg, 0.506mmol)을 주위 온도에서 DCM(10mL)에 현탁시켰다. mCPBA(77%, 255mg, 1.14mmol)를 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 포화 탄산나트륨 용액을 첨가한 후, DCM을 증발시키고, 조악한 6-(3-니트로페닐)-3,7-디옥사비사이클로[4.1.0]헵탄을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 건조, 여과 및 농축 후, 수득된 조악한 물질을 주위 온도에서 DCM(10mL)에 용해시켰다. 삼불화붕소 에테레이트(1.0mL, 8.1mmol)를 첨가하고, 반응물을 15분 동안 교반하였다. 포화 중탄산나트륨 용액을 첨가하고, 산물을 DCM으로 3회 추출하였다. 건조, 여과 및 농축 후, 조악한 물질을 크로마토그래피 A로 정제하여 3-(3-니트로페닐)테트라하이드로푸란-3-카브알데히드(59.4mg, 0.269mmol, 53% 수율)를 수득하였다.
단계 3: 3 -(3- 니트로페닐 ) 테트라하이드로푸란 -3-카 복실산의 합성. 3-(3-니트로페닐)테트라하이드로푸란-3-카브알데히드(59.4mg, 0.269mmol)를 주위 온도에서 3급-부탄올(1mL)에 용해시켰다. 2-메틸부트-2-엔(0.50mL)을 첨가한 후, 물(1mL) 중 아염소산나트륨(약 80%, 110mg, 1.21mmol) 및 인산이수소칼륨(95.9mg, 0.705mmol)의 용액을 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, 반응물을 물 및 DCM으로 희석하였다. 산물을 DCM으로 3회 추출하였다. 유기 층을 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 크로마토그래피 B로 정제하여 3-(3-니트로페닐)테트라하이드로푸란-3-카복실산(48.5mg, 0.204mmol, 76% 수율)을 수득하였다.
단계 4: 4 - 메틸 -5-(3-(3- 니트로페닐 ) 테트라하이드로푸란 -3-일)-4H-1,2,4- 트리아졸 -3-티올의 합성. 3-(3-니트로페닐)테트라하이드로푸란-3-카복실산(48.5mg, 0.204mmol) 및 HATU(94.4mg, 0.248mmol)를 주위 온도에서 DMF(0.5mL)에 용해시켰다. DIEA(89μL, 0.51mmol)를 첨가하고, 반응물을 1분 동안 교반하였다. N-메틸하이드라진카보티오아미드(32.1mg, 0.305mmol)를 첨가하고, 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 1N 수산화나트륨 용액(0.42mL)을 첨가하고, 반응물을 밤새 교반하였다. 추가의 1N 수산화나트륨 용액(0.44mL)을 첨가하고, 반응물을 50℃에서 밤새 가열하였다. 1N HCl을 첨가하고, 목적하는 산물을 DCM으로 3회 추출하였다. 잔류물을 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 크로마토그래피 A로 4-메틸-5-(3-(3-니트로페닐)테트라하이드로푸란-3-일)-4H-1,2,4-트리아졸-3-티올(33.6mg, 0.110mmol, 54% 수율)을 수득하였다.
단계 5: 4 - 메틸 -3-(3-(3- 니트로페닐 ) 테트라하이드로푸란 -3-일)-4H-1,2,4- 트 리아졸의 합성. 4-메틸-5-(3-(3-니트로페닐)테트라하이드로푸란-3-일)-4H-1,2,4-트리아졸-3-티올(33.6mg, 0.110mmol)을 주위 온도에서 DCM(0.4mL) 및 아세트산(168μL)의 혼합물에 용해시켰다. 과산화수소 용액(35%, 30μL, 0.34mmol)을 첨가하고, 반응물을 2시간 동안 교반하였다. 용매의 증발 후, 물질을 DCM 및 물로 희석하고, 수산화칼륨의 펠릿 1개를 첨가하였다. 산물을 DCM으로 4회 추출한 후, 디클로로메탄과 MeOH의 4:1 혼합물로 1회 추출하였다. 합한 유기 층을 건조, 여과 및 농축시켜 4-메틸-3-(3-(3-니트로페닐)테트라하이드로푸란-3-일)-4H-1,2,4-트리아졸(25.4mg, 84% 수율)을 수득하였고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 6: 3 -(3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 테트라하이드로푸란 -3-일)아닐린의 합성. 4-메틸-3-(3-(3-니트로페닐)테트라하이드로푸란-3-일)-4H-1,2,4-트리아졸(25.4mg, 0.0926mmol)을 에틸 아세테이트(1mL) 및 MeOH(1mL)의 혼합물에 용해시켰다. 탄소상 팔라듐(10%, 습식, 5.7mg)을 첨가하고, 반응물을 수소 벌룬을 사용하여 수소화하였다. 주위 온도에서 밤새 교반한 후, 반응물을 신선한 수소 충전 벌룬으로 추가 8시간 동안 교반하였다. 여과 및 농축 후, 조악한 3-(3-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)테트라하이드로푸란-3-일)아닐린을 수득하고, 이를 다음 단계에서 직접 사용하였다.
단계 7: 2 -(3-(3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 테트라하이드로푸란 -3-일)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온의 합성. 3-(3-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)테트라하이드로푸란-3-일)아닐린(24.0mg, 0.093mmol) 및 메틸 2-(브로모메틸)-3-(트리플루오로메틸)벤조에이트(33.0mg, 0.111mmol)를 주위 온도에서 아세토니트릴(0.5mL)에 용해시켰다. 질산은(물 중 1M, 120μL, 0.120mmol)을 적가한 후, 트리에틸아민(13μL, 0.093mmol)을 적가하였다. 밤새 교반한 후, 염수, 포화 중탄산나트륨 용액 및 DCM을 첨가하였다. 반응물을 여과하고 DCM으로 3회 추출하였다. 조악한 물질을 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 크로마토그래피 B를 사용한 정제, 이어서 역상 HPLC 정제에 의해 표제 화합물(5.0mg, 13% 수율)을 제공하였다. (C22H19F3N4O2)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 429.4; 실측치, 429.3. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.13 (s, 1H), 8.07 (d, J = 7.7Hz, 1H), 7.96 (d, J = 7.8Hz, 1H), 7.88 (t, J = 2.1Hz, 1H), 7.79 - 7.69 (m, 2H), 7.45 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.03 (dt, J = 8.0, 1.1Hz, 1H), 5.08 (s, 2H), 4.49 (d, J = 8.8Hz, 1H), 4.33 (d, J = 8.8Hz, 1H), 4.09 (td, J = 8.1, 6.6Hz, 1H), 4.01 (td, J = 8.4, 5.7Hz, 1H), 3.24 (s, 3H), 2.98 (ddd, J = 12.7, 8.3, 6.5Hz, 1H), 2.66 (ddd, J = 13.2, 7.8, 5.8Hz, 1H).
실시예 11: 2 -(3-(1-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 사이클로펜틸 )페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00173
단계 1: 1 -(3- 브로모페닐 )-N-[( 메틸카바모티오일 )아미노] 사이클로펜탄 -1-카복스아미드의 합성. DMF(30mL) 중 1-(3-브로모페닐)사이클로펜탄-1-카복실산(2.5g, 9.3mmol), 1-아미노-3-메틸티오우레아(1.3g, 12mmol), HOBt(1.9g, 14mmol), EDC(2.7g, 14mmol) 및 트리에틸아민(1.9g, 19mmol)의 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하여 반응 혼합물을 급냉시켰다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고, 진공하에 건조시켜 표제 화합물(2.5g, 조악함)을 수득하고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다. (C14H18BrN3OS) [M+Na]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 356.3; 실측치, 377.8.
단계 2: 5 -[1-(3- 브로모페닐 )사이클로 펜틸 ]-4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3- 티 올의 합성. NaOH(1M, 100.0mL)의 교반 용액에 실온에서 1-(3-브로모페닐)-N-[(메틸카바모티오일) 아미노]사이클로펜탄-1-카복스아미드(2.5g, 조악함)를 분량으로 첨가했다. 혼합물을 40℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 pH 약 3까지 HCl(1N)을 첨가하여 급냉시켰다. 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 2회 세척하였다. 고체를 진공하에 건조시켜 표제 화합물(2.5g, 조악함)을 수득하였고, 이를 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다. (C14H16BrN3S)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 338.3; 실측치, 338.2.
단계 3: 3 -(1-(3- 브로모페닐 ) 사이클로펜틸 )-4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸의 합 성. 5-[1-(3-브로모페닐)사이클로펜틸]-4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-티올(2.5g, 조악함) 및 NaNO2(5.1g, 74mmol)의 교반 혼합물에 HNO3(1N, 75.0mL)을 0℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 포화 NaHCO3 수용액으로 급냉시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과 및 증발 후, 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(1.9g, 3단계에 걸쳐 67%)을 수득하였다.
단계 4: 2 -(3-(1-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 사이클로펜틸 )페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온의 합성. 디옥산(0.6mL) 중의 나트륨 3급-부톡사이드(38.7mg, 0.403mmol), 3-(1-(3-브로모페닐)사이클로펜틸)-4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸(50.1mg, 0.164mmol), 4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온(39.0mg, 0.194mmol), XantPhos(9.5mg, 0.0164mmol), 및 Pd2(dba)3(10.7mg, 0.0117mmol)의 혼합물을 106℃에서 밤새 가열하였다. 추가의 XantPhos(9.7mg, 0.017mmol) 및 Pd2(dba)3(10.2mg, 0.0111mmol)를 첨가하고, 혼합물을 106℃에서 추가 24시간 동안 가열하였다. 조악한 반응 혼합물을 크로마토그래피 A에 이어, 역상 HPLC로 정제하여 표제 화합물(14.9mg, 0.0349mmol, 21% 수율)을 수득하였다. (C23H21F3N4O)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 427.4; 실측치, 427.5. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.07 - 8.02 (m, 2H), 7.93 (dt, J = 7.8, 0.9Hz, 1H), 7.86 (t, J = 2.0Hz, 1H), 7.75 - 7.69 (m, 1H), 7.64 (ddd, J = 8.2, 2.2, 0.9Hz, 1H), 7.39 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.01 (ddd, J = 7.9, 1.9, 0.9Hz, 1H), 5.05 (d, J = 1.5Hz, 2H), 3.17 (s, 3H), 2.66 - 2.56 (m, 2H), 2.34 - 2.23 (m, 2H), 1.82 (tdd, J = 9.9, 6.3, 2.3Hz, 4H).
실시예 12: (S)-N-(3-( 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 )페닐)-2-사이클로프로필-6-메틸피리미딘-4-카복스아미드
Figure pct00174
에틸 아세테이트(0.5mL) 중 실시예 J(24.4mg, 0.101mmol) 및 2-사이클로프로필-6-메틸피리미딘-4-카복실산(18.8mg, 0.101mmol)의 혼합물에 주위 온도에서 T3P 용액(에틸 아세테이트 중 1.47M, 103μL, 0.151mmol), 이어서 피리딘(42μL, 0.52mmol)을 첨가하였다. 반응물을 밤새 교반하였다. 농축 후, 조악한 물질을 역상 HPLC로 정제하여 (S)-N-(3-(사이클로부틸(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸)페닐)-2-사이클로프로필-6-메틸피리미딘-4-카복스아미드(33.5mg, 0.0832mmol, 82% 수율)를 수득하였다. (C23H26N6O)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 403.5; 실측치, 403.4. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 9.93 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.73 - 7.64 (m, 2H), 7.35 (t, J = 7.8Hz, 1H), 7.07 (dd, J = 7.7, 1.4Hz, 1H), 4.09 (d, J = 10.6Hz, 1H), 3.39 (s, 3H), 3.34 - 3.23 (m, 1H), 2.54 (s, 3H), 2.33 (tt, J = 8.1, 4.7Hz, 1H), 2.26 - 2.17 (m, 1H), 1.92 - .69 (m, 5H), 1.26 - 1.08 (m, 4H).
실시예 13: (R)-N-(3-( 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 )페닐)-2-사이클로프로필-6-메틸피리미딘-4-카복스아미드
Figure pct00175
이 화합물은 실시예 I를 사용하여 실시예 12와 유사한 방식으로 합성하여 표제 화합물(34.6mg, 0.0860mmol, 86% 수율)을 수득하였다. (C23H26N6O)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 403.5; 실측치, 403.4. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 9.93 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.73 - 7.65 (m, 2H), 7.35 (t, J = 7.9Hz, 1H), 7.07 (dt, J = 7.8, 1.3Hz, 1H), 4.09 (d, J = 10.6Hz, 1H), 3.39 (s, 3H), 3.28 (ddd, J = 15.2, 10.5, 7.4Hz, 1H), 2.54 (s, 3H), 2.33 (tt, J = 8.1, 4.7Hz, 1H), 2.25 - 2.17 (m, 1H), 1.91 - 1.71 (m, 5H), 1.17 (ddt, J = 34.6, 8.2, 2.9Hz, 4H).
실시예 14: 2-(3-((S)-사이클로부틸(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸)페닐)-6-(1-((R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일)에틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00176
단계 1: 6 -(1-((R)-4,4- 디플루오로 -3- 메틸피페리딘 -1-일)에틸)-4-( 트리플루 오로메틸)이소인돌린-1-온의 합성. MeOH 중의 실시예 AB 단계 4(49.7mg, 0.206mmol), (R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘(101mg, 0.586mmol) 및 트리에틸아민(82μL, 0.588mmol)을 100℃에서 1분 동안 마이크로파 처리하였다. 수소화시아노붕소나트륨(20.3mg, 0.323mmol)을 첨가하고, 반응물을 80℃에서 30분 동안, 이어서 100℃에서 12시간 동안 마이크로파 처리하였다. 과량의 환원제는 1N HCl을 몇 방울 첨가하여 분해했다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 조악한 물질을 크로마토그래피 B로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.
단계 2: 2-(3-((S)-사이클로부틸(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸)페닐)-6-(1-((R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일)에틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온의 합성. 이 커플링 반응은 6-(1-((R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일)에틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온(49.7mg, 0.206mmol) 및 실시 예 B를 사용하여 실시예 1과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(6mg, 0.010mmol, 2단계에 걸쳐 5%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.04 (s, 1H), 8.01 (d, J = 2.2Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.88 (d, J = 2.4Hz, 1H), 7.74 (ddd, J = 8.3, 2.4, 1.0Hz, 1H), 7.38 (t, J = 7.9Hz, 1H), 7.07 (d, J = 7.7Hz, 1H), 5.04 (d, J = 1.6Hz, 2H), 4.12 (d, J = 10.7Hz, 1H), 3.88 - 3.74 (m, 1H), 3.40 (s, 3H), 3.33 - 3.20 (m, 1H), 2.81 (m, 2H), 2.68 (m, 2H), 2.32 (dd, J = 25.6, 13.2Hz, 1H), 2.24 - 1.98 (m, 3H), 1.92 - 1.67 (m, 6H), 1.40 (dd, J = 6.8, 1.8Hz, 3H), 0.97 (d, J = 6.5Hz, 3H), 0.92 (d, J = 6.5Hz, 3H). C31H34F5N5O[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 588; 실측치, 588.
실시예 15: 2 -(3-((S)- 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 )페닐)-6-(((R)-2-메틸모르폴리노)메틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00177
단계 1: 2 -{3-[(S)- 사이클로부틸 (4- 메틸 -1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 ]페닐}-3-옥소-7-(트리플루오로메틸)-1H-이소인돌-5-카브알데히드. 3-[(S)-사이클로부틸(4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸]아닐린(148mg, 0.61mmol) 및 메틸 2-(브로모메틸)-5-포르밀-3-(트리플루오로메틸)벤조에이트(203mg, 0.63mmol)를 아세토니트릴(6mL) 및 물(1mL)에 용해시켰다. 질산은(140mg, 0.81mmol)에 이어, 트리에틸아민(86μL, 0.62mmol)을 첨가하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 조악한 물질을 크로마토그래피 B로 정제하여 표제 화합물(143mg, 51%)을 수득하였다.
단계 2: 2 -{3-[(R)- 사이클로부틸 (4- 메틸 -1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 ]페닐}-3-옥소-7-(트리플루오로메틸)-1H-이소인돌-5-카브알데히드. 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드(23mg, 0.11mmol)를 2-{3-[(S)-사이클로부틸(4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸]페닐}-3-옥소-7-(트리플루오로메틸)-1H-이소인돌-5-카브알데히드(30mg, 0.07mmol) 및 (2R)-2-메틸모르폴린 하이드로클로라이드(18mg, 0.15mmol)의 DCM(1mL) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 현탁액을 농축시키고, 크로마토그래피 C를 사용하여 정제하여 표제 화합물(14.4mg, 0.0267mmol, 40% 수율)을 수득하였다. (C29H32F3N5O2)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 540.3; 실측치, 540.5. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.04 (s, 1H), 7.98 (d, J = 1.6Hz, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.87 (t, J = 2.0Hz, 1H), 7.75 (ddd, J = 8.2, 2.3, 1.0Hz, 1H), 7.38 (t, J = 7.9Hz, 1H), 7.07 (dt, J = 7.9, 1.2Hz, 1H), 5.04 (s, 2H), 4.12 (d, J = 10.7Hz, 1H), 3.78 (ddd, J = 11.3, 3.4, 1.7Hz, 1H), 3.65 (d, J = 1.9Hz, 2H), 3.61 - 3.51 (m, 2H), 3.40 (d, J = 1.8Hz, 3H), 3.35 - 3.23 (m, 1H), 2.70 (dd, J = 11.3, 2.1Hz, 1H), 2.67 - 2.60 (m, 1H), 2.25 - 2.15 (m, 1H), 2.10 - 2.08 (m, 1H), 1.91 - 1.79 (m, 5H), 1.79 - .69 (m, 1H), 1.05 (dd, J = 6.2, 1.8Hz, 3H).
실시예 16: 2-(3-((S)-사이클로부틸(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸)페닐)-6-(1-((S)-3-메틸피페리딘-1-일)에틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00178
단계 1: (S)-6-아세틸-2-(3-( 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일)메틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온의 합성. 실시예 AB의 단계 4(83.1mg, 0.342mmol) 및 (S)-3-((3-브로모페닐)(사이클로부틸)메틸)-4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸(101mg, 0.328mmol)을 사용하여, C-N 결합 형성을 실시예 1과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(18mg, 12% 수율)을 수득하였다.
단계 2: 2 -(3-((S)- 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 )페닐)-6-(1-((S)-3-메틸피페리딘-1-일)에틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온의 합성. 이 환원적 아민화 반응을 실시예 14의 단계 1과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(2.4mg, 12%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3 ) δ 8.04 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.87 (t, J = 2.0Hz, 1H), 7.75 (ddd, J = 8.2, 2.3, 0.9Hz, 1H), 7.38 (t, J = 7.9Hz, 1H), 7.09 - 7.04 (m, 1H), 5.04 (s, 2H), 4.12 (d, J = 10.6Hz, 1H), 3.68 (m, 1H), 3.40 (s, 3H), 3.32 - 3.12 (m, 1H), 2.20 - 2.05 (m, 2H), 2.87 (m, 2H), 2.68 (m, 2H), 1.89 - .57 (m, 10H), 1.39 (br s, 3H), 0.86 (m, 1H), 0.86 (d, J = 6.0Hz, 3H), 0.79 (d, J = 6.2Hz, 3H). C31H36F3N5O [M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 552; 실측치, 553.
실시예 17: 2 -(3-((R)- 사이클로부틸 (4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일) 메틸 )페닐)-6-(((R)-2-메틸모르폴리노)메틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00179
이 화합물은 2-{3-[(R)-사이클로부틸(4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸]페닐}-3-옥소-7-(트리플루오로메틸)-1H-이소인돌-5-카브알데히드(30mg, 0.066mmol) 및 (R)-2-메틸모르폴린(18mg, 0.13mmol)을 사용하여 실시예 15와 유사한 방식으로 합성하여 2-(3-((R)-사이클로부틸(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)메틸)페닐)-6-(((R)-2-메틸모르폴리노)메틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온(14.1mg, 0.0261mmol, 39% 수율)을 수득하였다. (C29H32F3N5O2) [M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 540.3; 실측치, 540.5. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.04 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.89 (q, J = 0.8Hz, 1H), 7.87 (t, J = 2.0Hz, 1H), 7.75 (ddd, J = 8.2, 2.3, 1.0Hz, 1H), 7.38 (t, J = 7.9Hz, 1H), 7.07 (dt, J = 7.7, 1.3Hz, 1H), 5.04 (d, J = 1.5Hz, 2H), 4.12 (d, J = 10.6Hz, 1H), 3.78 (ddd, J = 11.4, 3.4, 1.7Hz, 1H), 3.65 (d, J = 1.8Hz, 2H), 3.61 - 3.54 (m, 2H), 3.40 (s, 3H), 3.35 - 3.22 (m, 1H), 2.70 (dt, J = 11.2, 2.1Hz, 1H), 2.63 (dt, J = 11.4, 2.0Hz, 1H), 2.25 - 2.16 (m, 1H), 2.11 - 2.06 (m, 1H), 1.90 - 1.79 (m, 5H), 1.79 - 1.70 (m, 1H), 1.06 (d, J = 6.3Hz, 3H).
실시예 18: 2 -(3-(1- 사이클로부틸 -1-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일)에틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00180
단계 1: 메틸 2-(3- 브로모페닐 )-2- 사이클로부틸아세테이트의 합성. 이 알킬화는 메틸 2-(3-브로모페닐)-2-사이클로부틸아세테이트(493μL, 3.14mmol) 및 브로모사이클로부탄(293μL, 3.04mmol)을 사용하여 실시예 7의 단계 1과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(454mg, 1.60mmol, 53% 수율)을 수득하였다.
단계 2: 메틸 2-(3- 브로모페닐 )-2- 사이클로부틸프로파노에이트의 합성. 메틸 2-(3-브로모페닐)-2-사이클로부틸아세테이트(454mg, 1.60mmol)를 0℃에서 THF(5mL)에 용해시켰다. LHMDS(THF 중 1M, 2.0mL, 2.0mmol)를 첨가하고, 반응물을 30분 동안 교반하였다. 메틸 요오다이드(149μL, 2.39mmol)를 THF(0.5mL) 용액으로서 첨가하였다. 반응물을 주위 온도로 가온하고 2시간 동안 교반하였다. 물과 헥산을 첨가하고, 산물을 헥산으로 3회 추출하였다. 합한 헥산 층을 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 크로마토그래피 A에 의한 정제에 의해 표제 화합물(293mg, 0.986mmol, 62% 수율)을 수득하였다.
단계 3: 2 -(3- 브로모페닐 )-2- 사이클로부틸프로판산의 합성. 메틸 2-(3-브로모페닐)-2-사이클로부틸프로파노에이트(91.4mg, 0.308mmol)를 THF(1mL)에 주위 온도에서 용해시켰다. 1N LiOH(0.35mL, 0.35mmol)를 첨가한 후 MeOH(0.35mL)를 첨가하였다. 반응물을 밤새 64℃로 가열하였다. THF 및 MeOH를 감압하에 제거하였다. 1N HCl로 중화 후, 잔류물을 DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고, 여과하고, 농축하고, 산물을 정제 없이 사용하였다.
단계 4 및 5: 3 -(1-(3- 브로모페닐 )-1- 사이클로부틸에틸 )-4- 메틸 -4H-1,2,4-트리아졸의 합성. 실시예 10의 단계 4 및 5에 따라, 표제 화합물(47.0mg, 0.147mmol, 2단계에 걸쳐 49% 수율)을 제공하였다.
단계 6: 2 -(3-(1- 사이클로부틸 -1-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일)에틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온의 합성. 실시예 11의 단계 4에 따라, 표제 화합물(14.4mg, 0.0327mmol, 22% 수율)을 제공하였다. (C24H23F3N4O) [M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 441.2; 실측치, 441.6. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3 ) δ 8.21 (s, 1H), 8.07 (d, J = 7.6Hz, 1H), 7.96 (d, J = 7.8Hz, 1H), 7.78 (t, J = 2.0Hz, 1H), 7.75 (t, J = 7.8Hz, 1H), 7.71 (dd, J = 8.1, 2.2Hz, 1H), 7.45 (t, J = 8.0Hz, 1H), 6.95 (dt, J = 7.9, 1.2Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 3.52 - 3.38 (m, 1H), 3.11 (s, 3H), 2.04 - 1.99 (m, 3H), 1.91 - 1.80 (m, 2H), 1.76 (s, 3H), 1.70 - 1.55 (m, 1H).
실시예 19 및 실시예 20: 6-(((R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-2-(3-((1s,3S)-3-메틸-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온(19) 및 6-(((R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-2-(3-((1r,3R)-3-메틸-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온(20)
Figure pct00181
1,4-디옥산(5.00mL) 중 실시예 D(200mg, 0.57mmol), Xantphos(66mg, 0.11mmol) 및 실시예 L(176mg, 0.57mmol)의 용액에 Pd(OAc)2(12.89mg, 0.06mmol) 및 Cs2CO3(561mg, 1.72mmol)를 첨가했다. 혼합물을 120℃에서 1시간 동안 교반하였다. 용액을 셀라이트를 통해 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 C로 정제하여 6-{[(3R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일]메틸}-2-{3-[3-메틸-1-(4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸]페닐}-4-(트리플루오로메틸)-3H-이소인돌-1-온(142mg, 44%)을 수득하였다. 이성체는 이동상으로 CO2와 MeOH를 포함하는 IG 컬럼을 사용하여 SFC를 통해 분리하여 피크 1(52mg)과 피크 2(19mg)를 수득하였다.
6-(((R)-4,4- 디플루오로 -3- 메틸피페리딘 -1-일) 메틸 )-2-(3-(( 1s,3S )-3- 메틸 -1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.05 (t, J = 2.1Hz, 1H), 8.02 (s, 2H), 7.93 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.70 (dd, J = 8.0, 2.2Hz, 1H), 7.47 (d, J = 8.0Hz, 1H), 7.21 (d, J = 7.8, 1.3Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 3.74 (s, 2H), 3.26 (s, 3H), 3.22 (s, 3H), 2.95 - 2.86 (m, 2H), 2.78 (dd, J = 26.4, 9.4Hz, 1H), 2.72 - 2.60 (m, 4H), 2.40 (t, J = 11.6Hz, 1H), 2.12 - 2.02 (m, 2H), 1.20 - 1.11 (m, 3H), 1.00 (d, J = 6.4Hz, 3H). LCMS: C30H32F5N5O 필요치: 573, 실측치: m/z = 574 [M+H]+.
6-(((R)-4,4- 디플루오로 -3- 메틸피페리딘 -1-일) 메틸 )-2-(3-(( 1r,3R )-3- 메틸 -1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.10 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.72 - 7.65 (m, 1H), 7.48 - 7.41 (m, 1H), 7.11 - 7.05 (m, 1H), 5.08 (s, 2H), 3.74 (s, 2H), 3.26 (s, 3H), 3.20 (s, 3H), 2.78 (d, J = 25.0Hz, 2H), 2.53 - 2.29 (m, 5H), 2.07 (s, 2H), 1.17 (d, J = 5.7Hz, 3H), 1.01 (d, J = 5.8Hz, 3H). LCMS: C30H32F5N5O 필요치: 573, 실측치: m/z = 574 [M+H]+.
실시예 21 및 실시예 22: 2 - 사이클로프로필 -6- 메틸 -N-{3-[( 1r,3s )-3- 메틸 -1-(4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸]페닐}피리미딘-4-카복스아미드(21) 및 2- 사이클로프로필 -6- 메틸 -N-{3-[( 1s,3r )-3- 메틸 -1-(4- 메틸 -1,2,4- 트리아졸 -3-일)사이클로부틸]페닐}피리미딘-4-카복스아미드(22)
Figure pct00182
1,4-디옥산(2mL) 중의 실시예 L, Xantphos(57mg, 0.10mmol) 및 실시예 N(87mg, 0.49mmol)의 용액에 팔라듐(II) 아세테이트(11mg, 0.05mmol) 및 Cs2CO3(479mg, 1.47mmol)를 첨가했다. 혼합물을 질소하에 120℃에서 1시간 동안 교반하였다. 잔류물을 셀라이트를 통해 여과하고 농축시켰다. 이성체를 HPLC(0.1% 트리플루오로아세트산을 포함하는 물 중 15-98% 아세토니트릴)로 분리하였다. 화합물을 중화시켜(PL-HCO3 MP SPE) 실시예 21(42mg, 19%) 및 실시예 22(14mg, 7%)를 수득하였다.
2- 사이클로프로필 -6- 메틸 -N-{3-[( 1r,3s )-3- 메틸 -1-(4- 메틸 -1,2,4- 트리아졸 -3-일)사이클로부틸]페닐}피리미딘-4-카복스아미드: 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 9.97 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.79 - 7.75 (m, 1H), 7.75 - 7.70 (m, 1H), 7.63 (dd, J = 2.0Hz, 1H), 7.38 (dd, J = 7.9Hz, 1H), 7.08 - 6.98 (m, 1H), 3.23 (s, 3H), 3.19 - 3.14 (m, 2H), 2.49 - 2.42 (m, 2H), 2.36 - 2.28 (m, 2H), 1.28 - 1.20 (m, 2H), 1.19 - 1.10 (m, 8H). LCMS: C23H26N6O 필요치: 402, 실측치: m/z = 403 [M+H]+.
2- 사이클로프로필 -6- 메틸 -N-{3-[( 1s,3r )-3- 메틸 -1-(4- 메틸 -1,2,4- 트리아졸 -3-일)사이클로부틸]페닐}피리미딘-4-카복스아미드. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 9.99 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.85 - 7.73 (m, 3H), 7.41 (dd, J = 7.9Hz, 1H), 7.17 (d, J = 7.7, 1.4Hz, 1H), 3.19 (s, 3H), 2.93 - 2.84 (m, 2H), 2.66 - 2.61 (m, 2H), 2.35 (tt, J = 8.1, 4.7Hz, 1H), 2.13 (s, 1H), 1.21 (dt, J = 4.7, 3.0Hz, 2H), 1.19 - 1.10 (m, 8H). LCMS: C23H26N6O 필요치: 402, 실측치: m/z = 403 [M+H]+.
실시예 23: 2-(3-((1s,3R)-3-메틸-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-6-(((S)-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00183
1,4-디옥산(10.00mL) 중 실시예 M(385mg, 1.26mmol), Xantphos(145mg, 0.25mmol) 및 실시예 E(392.71mg, 1.26mmol)의 용액에 Pd(OAc)2(28.23mg, 0.13mmol) 및 Cs2CO3(1.23g, 3.77mmol)를 첨가했다.. 혼합물을 질소하에 120℃에서 1시간 동안 교반하였다. 잔류물을 셀라이트를 통해 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 B에 이어, 크로마토그래피 C로 정제하여 표제 화합물(250mg, 37%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ 8.30 (s, 1H), 8.08 (d, J = 2.1Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.69 (dd, J = 8.2, 2.1Hz, 1H), 7.45 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.13 (d, J = 7.8Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 3.66 (s, 2H), 3.23 (s, 3H), 2.91 - 2.83 (m, 2H), 2.73 (t, J = 11.0Hz, 2H), 2.61 - 2.54 (m, 3H), 1.95 (t, J = 11.1Hz, 1H), 1.71 - 1.60 (m, 4H), 1.54 - 1.44 (m, 1H), 1.10 (d, J = 5.1Hz, 3H), 0.94 - 0.85 (m, 1H), 0.83 (d, J = 6.0Hz, 3H). LCMS: C30H34F3N5O 필요치: 537, 실측치: m/z = 538 [M+H]+.
실시예 24: 2-(3-((1s,3S)-3-메틸-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-6-(((R)-2-메틸모르폴리노)메틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00184
이 커플링 반응은 실시예 M(50mg, 0.16mmol) 및 실시예 O(56mg, 0.16mmol)를 반응물로서 사용하여 실시예 23과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(10mg, 11%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.07 - 8.01 (m, 2H), 7.94 (s, 1H), 7.74 - 7.67 (m, 1H), 7.47 (dd, J = 8.0Hz, 1H), 7.40 - 7.37 (m, 1H), 7.21 (d, J = 7.8Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 3.81 (d, J = 11.5Hz, 1H), 3.66 (d, J = 34.3Hz, 6H), 3.22 (s, 3H), 2.96 - 2.83 (m, 3H), 2.70 - 2.58 (m, 4H), 1.18 - 1.13 (m, 3H), 1.09 (d, J = 6.2Hz, 3H). LCMS: C29H32F3N5O2 필요치: 539, 실측치: m/z = 540 [M+H]+.
실시예 25: 4-사이클로프로필-2-(3-((1s,3R)-3-메틸-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-6-(((S)-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-2,3-디하이드로-1H-피롤로[3,4-c]피리딘-1-온
Figure pct00185
이 커플링 반응은 실시예 M(50mg, 0.16mmol) 및 실시예 H(47mg, 0.16mmol)를 반응물로서 사용하여 실시예 23과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(10mg, 11%)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.03 (d, J = 2.1Hz, 2H), 7.78 (dd, J = 8.1, 2.2Hz, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.48 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.25 - 7.18 (m, 1H), 5.06 (s, 2H), 3.82 (s, 2H), 3.23 (s, 3H), 3.01 - 2.85 (m, 3H), 2.71 - 2.61 (m, 4H), 1.82 - 1.62 (m, 6H), 1.21 - 1.09 (m, 7H), 0.90 (d, J = 6.4Hz, 4H). LCMS: C31H38N6O 필요치: 510, 실측치: m/z = 511 [M+H]+.
실시예 26: 4-사이클로프로필-6-(((R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-2-(3-((1s,3S)-3-메틸)-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-2,3-디하이드로-1H-피롤로[3,4-c]피리딘-1-온
Figure pct00186
이 커플링 반응은 실시예 M(50mg, 0.16mmol) 및 실시예 G(52mg, 0.16mmol)를 반응물로서 사용하여 실시예 23과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(15mg, 16%)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.05 (dd, J = 2.1Hz, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.81 - 7.74 (m, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.48 (dd, J = 8.0Hz, 1H), 7.25 - 7.19 (m, 1H), 5.05 (s, 2H), 3.72 (s, 2H), 3.23 (s, 3H), 2.95 - 2.75 (m, 6H), 2.66 (d, J = 7.3Hz, 4H), 2.42 (t, J = 11.7Hz, 2H), 2.15 - 2.02 (m, 2H), 1.19 - 1.06 (m, 5H), 1.00 (d, J = 6.2Hz, 4H). LCMS: C31H36F2N6O 필요치: 546, 실측치: m/z = 547 [M+H]+.
실시예 27: 6-(((S)-2-에틸모르폴리노)메틸)-2-(3-((1s,3R)-3-메틸-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00187
이 커플링 반응은 실시예 M(50mg, 0.16mmol) 및 실시예 P(54mg, 0.16mmol)를 반응물로서 사용하여 실시예 23과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(25mg, 24%)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.05 (dd, J = 2.0Hz, 1H), 8.03 (s, 2H), 7.94 (s, 1H), 7.72 - 7.68 (m, 1H), 7.47 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.21 (dt, J = 7.9, 1.2Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 3.83 (d, J = 11.2Hz, 2H), 3.71 (s, 2H), 3.61 (t, J = 11.4Hz, 2H), 3.38 (d, J = 23.7Hz, 1H), 3.22 (s, 3H), 2.97 - 2.85 (m, 2H), 2.78 (d, J = 10.6Hz, 1H), 2.72 - 2.61 (m, 4H), 1.53 - 1.35 (m, 2H), 1.17 - 1.14 (m, 3H), 0.91 (t, J = 7.5Hz, 3H). LCMS: C30H34F3N5O2 필요치: 553, 실측치: m/z = 554 [M+H]+.
실시예 28: 6-(((R)-2-에틸모르폴리노)메틸)-2-(3-((1s,3S)-3-메틸-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00188
이 커플링 반응은 실시예 M(50mg, 0.16mmol) 및 실시예 Q(54mg, 0.16mmol)를 반응물로서 사용하여 실시예 23과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(16mg, 17%)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.05 (dd, J = 2.1Hz, 1H), 8.02 (d, J = 4.3Hz, 2H), 7.93 (s, 1H), 7.74 - 7.69 (m, 1H), 7.47 (dd, J = 8.0Hz, 1H), 7.21 (dd, J = 7.7, 1.2Hz, 1H), 5.08 (d, J = 1.4Hz, 2H), 3.86 - 3.79 (m, 2H), 3.68 (s, 2H), 3.65 - 3.55 (m, 2H), 3.44 - 3.34 (m, 1H), 3.22 (s, 3H), 2.95 - 2.85 (m, 2H), 2.71 - 2.58 (m, 4H), 1.51 - 1.36 (m, 2H), 1.15 (d, J = 5.6Hz, 3H), 0.91 (t, J = 7.5Hz, 4H). LCMS: C30H34F3N5O2 필요치: 553, 실측치: m/z = 554 [M+H]+.
실시예 29: 4-사이클로프로필-2-(3-((1s,3S)-3-메틸-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-6-(((R)-2-메틸모르폴리노)메틸)-2,3-디하이드로-1H-피롤로[3,4-c]피리딘-1-온
Figure pct00189
이 커플링 반응은 실시예 M(51mg, 0.17mmol) 및 실시예 R(48mg, 0.17mmol)을 반응물로서 사용하여 실시예 23과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(9mg, 10%)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.05 - 8.04 (m, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.81 - 7.75 (m, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.48 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.24 - 7.18 (m, 1H), 5.05 (s, 2H), 3.85 - 3.77 (m, 2H), 3.65 (s, 2H), 3.64 - 3.58 (m, 2H), 3.23 (s, 3H), 2.95 - 2.86 (m, 4H), 2.76 (dd, J = 11.3, 2.1Hz, 1H), 2.73 - 2.61 (m, 4H), 1.19 - 0.98 (m, 10H). LCMS: C30H36N6O2 필요치: 512, 실측치: m/z = 513 [M+H]+.
실시예 30: 2-((R)-4-((2-(3-((1s,3S)-3-메틸-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-3-옥소-7-(트리플루오로메틸)이소인돌린-5-일)메틸)모르폴린-2-일)아세토니트릴
Figure pct00190
이 커플링 반응은 실시예 M(50mg, 0.16mmol) 및 실시예 S(55mg, 0.16mmol)를 반응물로서 사용하여 실시예 23과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(14mg, 13%)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.04 (d, J = 2.1Hz, 1H), 8.03 (s, 2H), 7.93 (s, 1H), 7.70 (dd, J = 8.2, 2.1Hz, 1H), 7.47 (dd, J = 8.0Hz, 1H), 7.24 - 7.19 (m, 1H), 5.09 (s, 2H), 3.94 - 3.87 (m, 1H), 3.85 - 3.77 (m, 1H), 3.77 - 3.64 (m, 3H), 3.22 (s, 3H), 2.96 - 2.78 (m, 3H), 2.75 - 2.53 (m, 6H), 2.27 (t, J = 11.3, 3.4Hz, 1H), 2.12 - 2.03 (m, 1H), 1.14 (d, J = 11.6, 5.4Hz, 3H). LCMS: C30H31F3N6O2 필요치: 564, 실측치: m/z =565 [M+H]+.
실시예 31: 6-(((R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-2-(3-((1s,3S)-3-하이드록시-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00191
1,4-디옥산(1mL) 중의 실시예 T(50mg, 0.16mmol), Xantphos(18mg, 0.03mmol) 및 실시예 D(56mg, 0.16mmol)의 용액에 Pd(OAc)2(4mg, 0.02mmol) 및 Cs2CO3(160mg, 0.49mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 질소하에 120℃에서 1시간 동안 교반하였다. 잔류물을 셀라이트를 통해 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 물 중의 아세토니트릴을 사용하는 예비 HPLC로 정제하여 표제 화합물(5mg, 5.0%)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.02 (dd, J = 13.7, 3.3Hz, 3H), 7.93 (s, 1H), 7.71 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.46 (dd, J = 8.0Hz, 1H), 7.18 (d, J = 7.8Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 4.45 (q, J = 7.4Hz, 1H), 3.74 (s, 2H), 3.37 (d, J = 6.9Hz, 1H), 3.23 (s, 3H), 3.18 - 3.07 (m, 2H), 2.88 (dd, J = 11.5, 9.1Hz, 2H), 2.85 - 2.71 (m, 4H), 2.41 (d, J = 12.3Hz, 1H), 2.10 - 2.04 (m, 2H), 1.00 (d, J = 6.3Hz, 3H). LCMS: C29H30F5N5O2 필요치: 575, 실측치: m/z = 576 [M+H]+.
실시예 32: 2-(3-((1s,3R)-3-하이드록시-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-6-(((S)-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-4-(트리플루오로메틸)이소 인돌린 -1-온
Figure pct00192
이 커플링 반응은 실시예 T(50mg, 0.16mmol) 및 실시예 E(50mg, 0.16mmol)를 반응물로서 사용하여 실시예 31과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(8mg, 9%)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.03 (s, 1H), 8.00 (t, J = 2.0Hz, 2H), 7.92 (s, 1H), 7.71 (ddd, J = 8.2, 2.2, 0.9Hz, 1H), 7.46 (dd, J = 8.0Hz, 1H), 7.17 (ddd, J = 7.9, 1.9, 0.9Hz, 1H), 5.08 (d, J = 1.6Hz, 2H), 4.45 (s, 1H), 3.66 (s, 2H), 3.38 (d, J = 9.5Hz, 1H), 3.23 (s, 3H), 3.12 (ddt, J = 9.8, 7.3, 2.7Hz, 2H), 2.88 (ddd, J = 9.7, 8.0, 2.8Hz, 2H), 2.79 (s, 2H), 1.78 - 1.52 (m, 7H), 0.87 (d, J = 6.2Hz, 3H). LCMS: C29H32F3N5O2 필요치: 539, 실측치: m/z = 540 [M+H]+.
실시예 33: 6-(((R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-2-(3-((1s,3S)-3-메톡시-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00193
1,4-디옥산(1mL) 중의 실시예 U(50mg, 0.16mmol), Xantphos(18mg, 0.03mmol) 및 실시예 D(56mg, 0.16mmol)의 용액에 Pd(OAc)2(4mg, 0.02mmol) 및 Cs2CO3(160mg, 0.49mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 질소하에 120℃에서 1시간 동안 교반하였다. 잔류물을 셀라이트를 통해 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 물 중의 아세토니트릴을 사용한 예비 HPLC로 정제하여 표제 화합물(4mg, 4%)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.04 (s, 2H), 8.00 (t, J = 2.1Hz, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.75 - 7.68 (m, 1H), 7.47 (dd, J = 8.0Hz, 1H), 7.24 - 7.17 (m, 1H), 5.09 (s, 2H), 4.16 (q, J = 7.5Hz, 1H), 3.77 (s, 2H), 3.26 (s, 3H), 3.24 (s, 3H), 3.18 - 3.08 (m, 2H), 3.00 - 2.72 (m, 7H), 2.52 - 2.38 (m, 2H), 1.00 (d, J = 6.3Hz, 3H). LCMS: C30H32F5N5O2 필요치: 589, 실측치: m/z = 590 [M+H]+.
실시예 34: 6-(((R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-2-(3-(트랜스-3-하이드록시-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00194
이 커플링 반응은 실시예 D(57mg, 0.16mmol) 및 실시예 V(51mg, 0.16mmol)를 사용하여 실시예 31과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(26mg, 28% 수율)을 수득하였다. (C29H30F5N5O2) [M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 576.3; 실측치, 576.5. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d3) δ 8.27 (s, 2H), 8.10 (s, 1H), 7.84 (t, J = 2.0Hz, 1H), 7.67 (dd, J = 8.2, 2.1Hz, 1H), 7.43 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.06 (d, J = 7.8Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 4.20 (p, J = 7.4Hz, 2H), 3.36 (ddt, J = 9.5, 7.1, 3.0Hz, 2H), 3.23 (s, 3H), 3.18 - 3.06 (m, 1H), 3.03 - 2.95 (m, 1H), 2.72 - 2.59 (m, 1H), 2.60 - 2.49 (m, 2H), 2.26 - 2.04 (m, 4H), 1.01 (d, J = 5.9Hz, 4H).
실시예 35: 2-(3-((1r,3S)-3-하이드록시-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-6-(((S)-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00195
이 커플링 반응은 실시예 E(85mg, 0.27mmol) 및 실시예 V(67mg, 0.22mmol)를 사용하여 실시예 31과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(26mg, 28% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.10 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.88 (t, J = 2.0Hz, 1H), 7.70 (ddd, J = 8.2, 2.3, 0.9Hz, 1H), 7.44 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.07 (ddd, J = 7.8, 1.9, 0.9Hz, 1H), 5.07 (d, J = 1.6Hz, 2H), 4.23 (p, J = 7.5Hz, 1H), 3.64 (s, 2H), 3.47 - 3.33 (m, 3H), 3.24 (s, 3H), 2.77 (t, J = 9.4Hz, 2H), 2.64 - 2.46 (m, 2H), 1.76 - 1.62 (m, 5H), 1.62 - 1.50 (m, 1H), 1.00 - 0.90 (m, 1H), 0.87 (d, J = 6.1Hz, 3H). LCMS: C29H32F3N5O2 필요치 539.3, 실측치 540.5 [M+H]+.
실시예 36: 6-(((R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-2-(3-(트랜스-3-메톡시-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00196
이 커플링 반응은 실시예 D(57mg, 0.16mmol) 및 실시예 W(53mg, 0.16mmol)를 사용하여 실시예 33과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(43mg, 46% 수율)을 수득하였다. (C30H32F5N5O2) [M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 590.3; 실측치, 590.5. 1H NMR (500 MHz, 아세토니트릴-d3) δ 8.19 (s, 2H), 8.09 (s, 1H), 7.85 (t, J = 2.0Hz, 1H), 7.70 - 7.66 (m, 1H), 7.43 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.04 (dt, J = 7.7, 1.2Hz, 1H), 5.08 (s, 2H), 4.06 (s, 3H), 3.92 (p, J = 7.1Hz, 1H), 3.37 (ddt, J = 9.5, 6.9, 2.6Hz, 2H), 3.23 (s, 3H), 3.22 (s, 3H), 3.17 - 2.91 (br s, 4H), 2.55 (ddt, J = 9.9, 7.4, 2.6Hz, 2H), 1.00 (d, J = 6.1Hz, 3H).
실시예 37: 2-(3-((1r,3S)-3-메톡시-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)페닐)-6-(((S)-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00197
이 커플링 반응은 실시예 E(61mg, 0.19mmol) 및 실시예 W(50mg, 0.16mmol)를 사용하여 실시예 33과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(430mg, 34% 수율)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.11 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.88 (t, J = 2.1Hz, 1H), 7.71 (ddd, J = 8.2, 2.2, 0.9Hz, 1H), 7.45 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.05 (ddd, J = 7.8, 1.8, 0.9Hz, 1H), 5.07 (s, 2H), 3.95 (p, J = 7.2Hz, 1H), 3.64 (s, 2H), 3.39 (ddd, J = 11.6, 5.8, 2.5Hz, 2H), 3.26 (s, 3H), 3.25 (s, 3H), 2.77 (t, J = 9.4Hz, 2H), 2.61 - 2.51 (m, 2H), 1.75 - 1.62 (m, 4H), 1.60 - 1.51 (m, 2H), 0.93 (q, J = 13.4, 12.5Hz, 1H), 0.87 (d, J = 6.1Hz, 3H). LCMS: C30H34F3N5O2 필요치 553.3, 실측치 554.5 [M+H]+.
실시예 38: (1R,3s)-3-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)-3-(3-(6-(((S)-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-1-옥소-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-2-일)페닐)사이클로부탄-1-카보니트릴
Figure pct00198
1,4-디옥산(1mL) 중의 실시예 X(50mg, 0.16mmol), Xantphos(18mg, 0.03mmol) 및 실시예 E(49mg, 0.16mmol)의 용액에 Pd(OAc)2(4mg, 0.02mmol) 및 Cs2CO3(160mg, 0.49mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 질소하에 120℃에서 1시간 동안 교반하였다. 잔류물을 셀라이트를 통해 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 물 중의 아세토니트릴을 사용한 예비 HPLC로 정제하여 표제 화합물(5mg, 4%)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.09 (d, J = 4.0Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.95 (dd, J = 2.1Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.79 (dd, J = 8.1, 2.2Hz, 1H), 7.53 - 7.49 (m, 1H), 7.16 (d, J = 8.2Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 3.64 (s, 2H), 3.52 - 3.31 (m, 4H), 3.27 - 3.21 (m, 3H), 3.21 - 3.08 (m, 4H), 2.77 (dd, J = 9.6Hz, 2H), 1.76 - 1.51 (m, 3H), 0.87 (d, J = 6.1Hz, 4H). LCMS: C30H31F3N6O 필요치: 548, 실측치: m/z = 549 [M+H]+.
실시예 39: (1S,3r)-3-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)-3-(3-(6-(((S)-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-1-옥소-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-2-일)페닐)사이클로부탄-1-카보니트릴
Figure pct00199
이 커플링 반응은 실시예 Y(50mg, 0.16mmol) 및 실시예 E(50mg, 0.16mmol)를 반응물로서 사용하여 실시예 38과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(15mg, 16%)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.14 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.87 (dd, J = 2.1Hz, 1H), 7.84 - 7.76 (m, 1H), 7.48 (dd, J = 8.0Hz, 1H), 7.09 (d, J = 7.8, 1.2Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 3.64 (s, 2H), 3.49 - 3.41 (m, 2H), 3.38 - 3.29 (m, 1H), 3.22 (s, 4H), 3.08 (td, J = 9.2, 2.4Hz, 2H), 2.77 (dd, J = 9.6Hz, 3H), 1.77 - 1.51 (m, 6H), 0.87 (d, J = 6.2Hz, 4H). LCMS: C30H31F3N6O 필요치: 548, 실측치: m/z = 549 [M+H]+.
실시예 40: (1R,3r)-3-(3-(6-(((R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-1-옥소-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-2-일)페닐)-3-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부탄-1-카보니트릴
Figure pct00200
이 커플링 반응은 실시예 Y(50mg, 0.16mmol) 및 실시예 D(55mg, 0.16mmol)를 반응물로서 사용하여 실시예 38과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(11mg, 10%)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.23 (s, 2H), 8.15 (s, 1H), 7.87 (t, J = 2.0Hz, 1H), 7.80 (dd, J = 8.1, 2.1Hz, 1H), 7.49 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.13 - 7.08 (m, 1H), 5.14 (s, 2H), 4.16 (s, 3H), 3.50 - 3.30 (m, 2H), 3.23 (s, 3H), 3.21 - 3.04 (m, 3H), 2.75 - 2.42 (m, 6H), 1.03 (d, J = 6.0Hz, 3H). LCMS: C30H29F5N6O 필요치: 584, 실측치: m/z = 585 [M+H]+.
실시예 41: 6-[[(3R)-4,4-디플루오로-3-메틸-1-피페리딜]메틸]-2-[3-[5-(4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-일)스피로[2.3]헥산-5-일]페닐]-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00201
무수 1,4-디옥산(3mL) 중의 실시예 D(104mg, 0.300mmol), 실시예 Z(105mg, 0.33mmol), 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)(13.7mg, 0.015mmol), Xantphos(17mg, 0.03mmol) 및 Cs2CO3(293mg, 0.9mmol)의 현탁액을 N2로 15분 동안 살포시킨 후, 혼합물을 110℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, DCM으로 희석한 후, 실리카 겔을 첨가하였다. 혼합물을 감압하에 농축시켰다. 물질을 크로마토그래피 B로 정제하고, 예비 HPLC로 추가 정제하여 표제 화합물(89mg, 51%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.40 (s, 1H), 8.08 (t, J = 2.0Hz, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.69 (ddd, J = 8.2, 2.2, 0.9Hz, 1H), 7.44 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.03 (ddd, J = 7.7, 1.9, 0.9Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 3.79 - 3.72 (m, 2H), 3.24 (s, 3H), 3.20 (d, J = 12.9Hz, 2H), 2.80 - 2.69 (m, 4H), 2.35 - 2.28 (m, 1H), 2.16 - 1.91 (m, 4H), 0.93 (d, J = 6.6Hz, 3H), 0.65 - 0.55 (m, 2H), 0.52 - 0.44 (m, 2H). MS: C31H32F5N5O 필요치: 585, 실측치: m/z = 586 [M+H]+.
실시예 42: 6 -[[(3S)-3- 메틸 -1- 피페리딜 ] 메틸 ]-2-[3-[5- (4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-일)스피로 [2.3]헥산-5-일]페닐]-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00202
이 커플링 반응은 실시예 E(93mg, 0.30mmol) 및 실시예 Z(105mg, 0.33mmol)를 반응물로서 사용하여 실시예 42와 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물을 포르메이트 염(49mg, 27%)으로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.20 (s, 1H), 8.09 (t, J = 2.0Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.70 (ddd, J = 8.2, 2.2, 0.9Hz, 1H), 7.45 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.03 (ddd, J = 7.9, 1.9, 0.9Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 3.66 (s, 2H), 3.25 (s, 3H), 3.20 (d, J = 12.9Hz, 2H), 2.80 - 2.69 (m, 4H), 1.94 (td, J = 11.0, 2.6Hz, 1H), 1.73 - 1.55 (m, 5H), 1.54 - 1.43 (m, 1H), 0.92 - 0.84 (m, 1H), 0.83 (d, J = 6.3Hz, 3H), 0.64 - 0.56 (m, 2H), 0.54 - 0.44 (m, 2H). MS: C31H34F3N5O 필요치: 549, 실측치: m/z = 550 [M+H]+.
실시예 43: (R)-2-(3-(5- (4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)스피로[2.3]헥산 -5-일)페닐)-6-((2-메틸모르폴리노)메틸)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00203
1,4-디옥산(1mL) 중의 실시예 Z(51mg, 0.16mmol), Xantphos(18mg, 0.03mmol) 및 실시예 O(51mg, 0.16mmol)의 용액에 Pd(OAc)2(3mg, 0.02mmol) 및 Cs2CO3(160mg, 0.49mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 질소하에 120℃에서 1시간 동안 교반하였다. 일반적인 작업과정 절차 1이 사용되었다. 잔류물을 물 중의 아세토니트릴을 이용한 예비 HPLC로 정제하여 표제 화합물(37mg, 42%)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.13 (br s, 2H), 8.10 (s, 1H), 8.02 (t, J = 2.1Hz, 1H), 7.69 - 7.65 (m, 1H), 7.44 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.13 (dt, J = 7.8, 1.3Hz, 1H), 5.08 (s, 2H), 4.29 - 3.45 (m, 5H), 3.84 (s, 4H), 3.30 - 3.17 (m, 5H), 3.04 - 2.72 (m, 2H), 1.09 (d, J = 6.3Hz, 3H), 0.67 - 0.57 (m, 2H), 0.57 - 0.45 (m, 2H). (C30H32F3N5O2) [M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 552; 실측치, 552.
실시예 44: (S)-2-(3-(5-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)스피로[2.3]헥산-5-일)페닐)-4-(트리플루오로메틸)-6-((3-(트리플루오로메틸)피페리딘-1-일)메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00204
이 커플링 반응은 실시예 AA(63mg, 0.17mmol) 및 실시예 Z(50mg, 0.16mmol)를 반응물로서 사용하여 실시예 43과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물을 포르메이트 염(32mg, 33%)으로서 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.10 (s, 1H), 8.02 (d, J = 2.0Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.68 (dd, J = 8.1, 2.1Hz, 1H), 7.44 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.12 (d, J = 8.8Hz, 1H), 5.06 (s, 2H), 3.70 (s, 2H), 3.24 (d, J = 8.2Hz, 2H), 3.23 (s, 3H), 3.04 - 2.93 (m, 1H), 2.81 (d, J = 11.5Hz, 1H), 2.77 (d, J = 12.1Hz, 2H), 2.46 (q, J = 13.9, 12.1Hz, 1H), 2.11 - 2.00 (m, 3H), 1.75 (d, J = 13.7Hz, 1H), 1.64 - 1.51 (m, 1H), 1.32 (qd, J = 12.5, 4.3Hz, 1H), 0.61 (dd, J = 9.7, 6.6Hz, 2H), 0.51 (dd, J = 9.3, 6.4Hz, 2H). (C31H31F6N5O) [M+H]+에 대한 MS (ESI) 계산치, 604; 실측치, 604.
실시예 45: (R)-2-(3-(5-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)스피로[2.3]헥산-5-일)페닐)-6-(2-(2-메틸모르폴리노)프로판-2-일)-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00205
이 커플링 반응은 실시예 AB(53mg, 0.16mmol) 및 실시예 Z(50mg, 0.16mmol)를 반응물로서 사용하여 실시예 43과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물을 포르메이트 염(26mg, 24%)으로서 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.13 (s, 2H), 8.08 (s, 1H), 8.00 (d, J = 2.1Hz, 1H), 7.64 (dd, J = 8.2, 2.2Hz, 1H), 7.40 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.08 (dd, J = 7.8, 1.7Hz, 1H), 5.03 (s, 2H), 3.73 (dt, J = 11.0, 2.4Hz, 1H), 3.58 - 3.46 (m, 2H), 3.24 - 3.16 (m, 5H), 2.77 - 2.69 (m, 2H), 2.54 (dt, J = 11.2, 2.3Hz, 1H), 2.47 (dt, J = 11.3, 2.2Hz, 1H), 2.27 (td, J = 11.2, 3.1Hz, 1H), 1.37 (s, 3H), 1.37 (s, 3H), 0.99 (d, J = 6.2Hz, 3H), 0.58 (dd, J = 9.5, 6.4Hz, 2H), 0.47 (dd, J = 9.4, 6.4Hz, 2H). (C32H36F3N5O2) [M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 580; 실측치, 581.
실시예 46: 6 -[[(3S)-3- 메틸 -1- 피페리딜 ] 메틸 ]-2-[3-[3-(4- 메틸 -1,2,4- 트리아졸 -3-일)옥세탄-3-일]페닐]-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00206
무수 1,4-디옥산(2.5mL) 중의 실시예 AC(78mg, 0.25mmol), 실시예 E(80mg, 0.27mmol), 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)(11mg, 0.012mmol), Xantphos(14.5mg, 0.025mmol) 및 Cs2CO3(244mg, 0.75mmol)의 현탁액을 N2로 15분 동안 살포시킨 후, 혼합물을 110℃에서 17시간 동안 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, DCM으로 희석한 후, 실리카 겔을 첨가하였다. 혼합물을 감압하에 농축시켰다. 물질을 크로마토그래피 B로 정제하고, 예비 HPLC로 추가 정제하여 표제 화합물(39mg, 30%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.50 (s, 1H), 8.00 - 7.95 (m, 2H), 7.92 (s, 1H), 7.79 (ddd, J = 8.2, 2.3, 1.0Hz, 1H), 7.50 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.10 (ddd, J = 7.9, 2.0, 0.9Hz, 1H), 5.40 (d, J = 6.1Hz, 2H), 5.21 (s, 2H), 5.11 (d, J = 6.1Hz, 2H), 3.65 (s, 2H), 3.27 (s, 3H), 2.77 - 2.67 (m, 2H), 1.93 (td, J = 11.3, 2.8Hz, 1H), 1.70 - 1.55 (m, 4H), 1.54 - 1.42 (m, 1H), 0.92 - 0.83 (m, 1H), 0.82 (d, J = 6.3Hz, 3H). MS: C28H30F3N5O2 필요치: 525, 실측치: m/z = 526 [M+H]+.
실시예 47: 6-[[(3R)-4,4-디플루오로-3-메틸-1-피페리딜]메틸]-2-[3-[3-(4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-일)옥세탄-3-일]페닐]-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-1-온
Figure pct00207
이 커플링 반응은 실시예 D(69mg, 0.20mmol) 및 실시예 AC(64mg, 0.22mmol)를 반응물로서 사용하여 실시예 46과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(74mg, 66%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.50 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.97 (t, J = 2.0Hz, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.79 (ddd, J = 8.2, 2.2, 0.9Hz, 1H), 7.51 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.11 (ddd, J = 7.9, 2.0, 0.9Hz, 1H), 5.40 (d, J = 6.1Hz, 2H), 5.22 (s, 2H), 5.11 (d, J = 6.1Hz, 2H), 3.82 - 3.69 (m, 2H), 3.27 (s, 3H), 2.83 - 2.67 (m, 2H), 2.32 (t, J = 10.1Hz, 1H), 2.19 - 1.88 (m, 4H), 0.93 (d, J = 6.6Hz, 3H). MS: C28H28F5N5O2 필요치: 561, 실측치: m/z = 562 [M+H]+.
실시예 48: 2 -(( 1R,3s )-3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일)-3-(3-(6-(((S)-3 -메틸피페리딘-1-일)메틸)-1-옥소-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-2-일)페닐)사이클로부틸)아세토니트릴
Figure pct00208
실시예 AD(78mg, 0.25mmol), 실시예 E(91mg, 0.28mmol), 트리스(디벤질리덴 아세톤)디팔라듐(0)(11mg, 13μmol), Xantphos(15mg, 25μmol) 및 Cs2CO3(244mg, 0.750mmol)의 혼합물에 탈기된 디옥산(2.5mL)을 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 110℃로 18시간 동안 가열하였다. 휘발성 물질을 감압하에 증발시키고, 물질을 크로마토그래피 B에 이어, 예비 HPLC로 정제하여 표제 화합물(36mg, 26%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.41 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.87 (t, J = 1.8Hz, 1H), 7.70 (dd, J = 8.0, 1.5Hz, 1H), 7.45 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.04 (d, J = 7.9Hz, 1H), 5.19 (s, 2H), 3.65 (s, 2H), 3.28 (s, 3H), 3.20 - 3.10 (m, 2H), 2.74 (d, J = 6.4Hz, 2H), 2.73 - 2.67 (m, 2H), 2.64 - 2.53 (m, 1H), 2.50 - 2.45 (m, 2H), 1.94 (td, J = 11.7, 2.6Hz, 1H), 1.72 - 1.56 (m, 4H), 1.54 - 1.41 (m, 1H), 0.91 - 0.84 (m, 1H), 0.82 (d, J = 6.2Hz, 3H). MS: C31H33F3N6O 필요치: 562, 실측치: m/z = 563 [M+H]+.
실시예 49: 2-((1S,3s)-3-(3-(6-(((R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-1-옥소-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-2-일)페닐)-3-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)아세토니트릴
Figure pct00209
이 커플링 반응은 실시예 AD(78mg, 0.22mmol) 및 실시예 D(82mg, 0.25mmol)를 반응물로서 사용하여 실시예 48과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(53mg, 40%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.41 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.86 (t, J = 1.9Hz, 1H), 7.70 (dd, J = 7.9, 1.6Hz, 1H), 7.45 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.04 (d, J = 7.7Hz, 1H), 5.20 (s, 2H), 3.81 - 3.69 (m, 2H), 3.28 (s, 3H), 3.19 - 3.13 (m, 2H), 2.80 - 2.70 (m, 4H), 2.63 - 2.54 (m, 1H), 2.50 - 2.44 (m, 2H), 2.36 - 2.28 (m, 1H), 2.18 - 1.88 (m, 4H), 0.93 (d, J = 6.6Hz, 3H). MS: C31H31F5N6O 필요치: 598, 실측치: m/z = 599 [M+H]+.
실시예 50: 2 -(( 1S,3r )-3-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아졸 -3-일)-3-(3-(6-(((S)-3 -메틸피페리딘-1-일)메틸)-1-옥소-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-2-일)페닐)사이클로부틸)아세토니트릴
Figure pct00210
이 커플링 반응은 실시예 AE(78mg, 0.22mmol) 및 실시예 E(91mg, 0.28mmol)를 반응물로서 사용하여 실시예 48과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(34mg, 24%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.32 (s, 1H), 8.06 (t, J = 1.9Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.72 (ddd, J = 8.0, 2.0, 0.6Hz, 1H), 7.47 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.17 (dd, J = 7.8, 0.9Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 3.66 (s, 2H), 3.25 (s, 3H), 2.96 - 2.86 (m, 2H), 2.84 - 2.67 (m, 7H), 1.94 (t, J = 10.0Hz, 1H), 1.70 - 1.55 (m, 4H), 1.53 - 1.42 (m, 1H), 0.92 - 0.84 (m, 1H), 0.83 (d, J = 6.2Hz, 3H). MS: C31H33F3N6O 필요치: 562, 실측치: m/z = 563 [M+H]+.
실시예 51: 2-((1R,3r)-3-(3-(6-(((R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일)메틸)-1-옥소-4-(트리플루오로메틸)이소인돌린-2-일)페닐)-3-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸)아세토니트릴
Figure pct00211
이 커플링 반응은 실시예 AE(78mg, 0.22mmol) 및 실시예 D(82mg, 0.25mmol)를 반응물로서 사용하여 실시예 48과 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(65mg, 48%)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.27 (s, 1H), 8.00 (t, J = 1.9Hz, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.67 (dd, J = 8.2, 1.4Hz, 1H), 7.42 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.13 (ddd, J = 7.7, 1.7, 0.8Hz, 1H), 5.17 (s, 2H), 3.79 - 3.65 (m, 2H), 3.19 (s, 3H), 2.93 - 2.81 (m, 2H), 2.77 - 2.61 (m, 7H), 2.27 (t, J = 10.6Hz, 1H), 2.15 - 1.82 (m, 4H), 0.88 (d, J = 6.5Hz, 3H). MS: C31H31F5N6O 필요치: 598, 실측치: m/z = 599 [M+H]+.
실시예 52: 2-{3-[3,3-디플루오로-1-(4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸]페닐}-6-{[(3R)-4,4-디플루오로-3-메틸피페리딘-1-일]메틸}-4-(트리플루오로메틸)-3H-이소인돌-1-온
Figure pct00212
1,4-디옥산(1mL) 중의 실시예 AF(100mg, 0.30mmol), Xantphos(35mg, 0.06mmol) 및 실시예 D(106.14mg, 0.30mmol)의 용액에 Pd(OAC)2(7mg, 0.03mmol) 및 Cs2CO3(0.30g, 0.91mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 질소하에 120℃에서 1시간 동안 교반하였다. 잔류물을 셀라이트를 통해 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 B에 이어, 크로마토그래피 C로 정제하여 표제 화합물(9mg, 55%)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.13 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.75 (dd, J = 8.1, 2.2Hz, 1H), 7.50 (d, J = 8.0Hz, 1H), 7.18 (dd, J = 7.7, 1.8Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 3.83 - 3.68 (m, 4H), 3.42 (td, J = 14.3, 11.0Hz, 2H), 3.30 (s, 3H), 2.78 (dd, J = 26.0, 10.1Hz, 2H), 2.40 (t, J = 11.1Hz, 2H), 2.14 - 1.99 (m, 3H), 1.00 (d, J = 6.2Hz, 3H). MS: C29H28F7N5O 필요치: 595, 실측치: m/z = 596 [M+H]+.
실시예 53: 2-{3-[3,3-디플루오로-1-(4-메틸-1,2,4-트리아졸-3-일)사이클로부틸]페닐}-6-{[(2R)-2-메틸모르폴린-4-일]메틸}-4-(트리플루오로메틸)-3H-이소인돌-1-온
Figure pct00213
이 커플링 반응은 실시예 AF(100mg, 0.30mmol) 및 실시예 O(106mg, 0.30mmol)를 반응물로서 사용하여 실시예 52와 유사한 방식으로 수행하여 표제 화합물(9mg, 55%)을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 아세토니트릴-d 3) δ 8.13 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.99 (t, J = 2.1Hz, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.76 (dd, J = 8.3, 2.1Hz, 1H), 7.50 (dd, J = 8.0Hz, 1H), 7.18 (dd, J = 7.9, 1.8Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 3.90 - 3.54 (m, 6H), 3.50 - 3.36 (m, 2H), 3.30 (s, 3H), 2.87 - 2.57 (m, 2H), 2.27 - 2.07 (m, 3H), 1.11 (dd, J = 15.3, 6.2Hz, 3H). MS: C28H28F5N5O2 필요치: 561, 실측치: m/z = 562 [M+H]+.
실시예 54: (R)-6-사이클로프로필-5-(17-(5,5-디플루오로-7,9-디메틸-5H-5λ 4 ,6λ 4 -디피롤로[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]디아자보리닌-3-일)-15-옥소-5,8,11-트리옥사-2,14-디아자헵타데실)-N-(3-(1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)프로판-2-일)페닐)피콜린아미드
Figure pct00214
단계 1: 메틸 6- 사이클로프로필 -5-( 하이드록시메틸 )피리딘-2-카 복실레이 트의 합성. 톨루엔(40mL) 및 물(4mL) 중의 메틸 6-클로로-5-(하이드록시메틸)피리딘-2-카복실레이트(Gangadasu, B. et al., Tetrahedron 2006, 62, 8398-8403)(1.0g, 5.0mmol), 칼륨 사이클로프로필트리플루오로보라누이드(2.1g, 14.1mmol), Pd(dppf)Cl2(770mg, 1.05mmol) 및 K3PO4(3.8g, 18.1mmol)의 혼합물을 질소하에 16시간 동안 100℃로 가열했다. 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후 여과하였다. 여액을 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 A로 정제하여 표제 화합물(834.0mg, 81%)을 수득하였다. LCMS: C11H13NO3 필요치 207.2, 실측치 207.9[M+H]+.
단계 2: 6 - 사이클로프로필 -5-( 하이드록시메틸 )피리딘-2-카 복실산의 합성. THF(6mL) 및 물(2mL) 중의 메틸 6-사이클로프로필-5-(하이드록시메틸)피리딘-2-카복실레이트(170.0mg, 0.82mmol) 및 LiOH(45.0mg, 1.88mmol)의 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물의 pH를 HCl(1N)로 약 5로 조정하였다. 혼합물을 진공하에 증발시켜 표제 화합물(200.0mg, 조악함)을 수득하고, 이를 정제 없이 사용하였다. (C10H11NO3) [M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 194.1, 실측치, 193.9.
단계 3: 6 - 사이클로프로필 -5-( 하이드록시메틸 )-N-[3-[(2R)-1-(4- 메틸 -4H-1,2,4-트리아졸-3-일)프로판-2-일]페닐]피리딘-2-카복스아미드의 합성. DMF(3mL) 중 6-사이클로프로필-5-(하이드록시메틸)피리딘-2-카복실산(200.0mg, 조악함)의 혼합물에 DIEA(1mL, 6.05mmol), 3-[(2R)-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)프로판-2-일]아닐린(173.6mg, 0.80mmol) 및 HATU(883.0mg, 2.32mmol)를 첨가했다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 크로마토그래피 C로 정제한 후, Prep-HPLC로 정제하여 표제 화합물(31.6mg, 10%)을 수득하였다. (C22H25N5O2)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 392.2, 실측치, 392.2.
단계 4: (R)-6- 사이클로프로필 -5- 포르밀 -N-(3-(1-(4- 메틸 -4H-1,2,4- 트리아 졸-3-일)프로판-2-일)페닐)피콜린아미드의 합성. 메틸렌 클로라이드(30mL) 중의 (R)-6-사이클로프로필-5-(하이드록시메틸)-N-(3-(1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)프로판-2-일)페닐)피콜린아미드(3.1g, 7.9mmol)의 용액에 0℃에서 데스-마틴 시약(4.0g, 9.5mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반한 후, 포화 수성 NaHCO3의 첨가에 의해 급냉시켰다. 수성 상을 EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 염수로 세척하고, 건조시키고, 여과하였다. 여액을 농축시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 B로 정제하여 표제 화합물(1.8g, 58%)을 수득하였다. (C22H23N5O2)[M+H]+에 대한 MS(ESI) 계산치, 390.2; 실측치 390.2.
단계 5. (R)-5-(13-아미노-5,8,11-트리옥사-2- 아자트리데실 )-6- 사이클로프로필 -N-(3-(1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)프로판-2-일)페닐)피콜린아미드의 합성. 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드(0.05g, 0.23mmol)를 3급 부틸 N-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에틸)카바메이트(45mg, 0.15mmol) 및 (R)-6-사이클로프로필-5-포르밀-N-(3-(1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)프로판-2-일)페닐)피콜린아미드(60mg, 0.15mmol)를 함유하는 DCM(1.00mL) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 농축 후, 조악한 반응 혼합물을 0.1% TFA를 함유하는 물 중의 아세토니트릴로 용출시키는 역상 예비 HPLC(Waters 5mM CSH C18 컬럼, 50x50mm)로 정제하였다. 목적하는 분획을 합하고 농축시켜 3급-부틸 (R)-(1-(2-사이클로프로필-6-((3-(1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)프로판-2-일)페닐)카바모일)피리딘-3-일)-5,8,11-트리옥사-2-아자트리데칸-13-일)카바메이트를 수득하고, 이를 실온에서 DCM/TFA 1:1 용액으로 처리하였다. 1시간 후, 반응물을 농축시켜 표제 화합물(51mg)을 수득하였다. LCMS: C30H43N7O4 필요치 m/z= 565, 실측치 566 [M+H]+.
단계 6. (R)-6-사이클로프로필-5-(17-(5,5-디플루오로-7,9-디메틸-5H-5λ 4 ,6λ 4 -디피롤로[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]디아자보리닌-3-일)-15-옥소-5,8,11-트리옥사-2,14-디아자헵타데실)-N-(3-(1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)프로판-2-일)페닐)피콜린아미드의 합성. 트리에틸아민(0.01mL, 6.08mg, 0.06mmol)을 HATU(17mg, 0.05mmol) 및 3-(5,5-디플루오로-7,9-디메틸-5H-5λ4,6λ4-디피롤로[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]디아자보리닌-3-일)프로판산(9mg, 0.03mmol)을 함유하는 DMF 용액(1mL)에 첨가했다. 실온에서 5분 동안 교반한 후, 5-(13-아미노-5,8,11-트리옥사-2-아자트리데칸-1-일)-6-사이클로프로필-N-{3-[(2R)-1-(4-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-3-일)프로판-2-일]페닐}피리딘-2-카복스아미드(17mg, 0.03mmol)를 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 조악한 반응 혼합물을 0.1% TFA를 함유하는 물 중의 아세토니트릴로 용출시키는 역상 예비 HPLC로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다. 1H NMR(500 MHz, 메탄올-d 4) δ 8.00 (s, 2H), 7.67 (t, J = 2.0Hz, 1H), 7.55 - 7.45 (m, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.33 (t, J = 7.9Hz, 1H), 7.05 (d, J = 7.7Hz, 1H), 6.97 (d, J = 4.0Hz, 1H), 4.57 (s, 2H), 3.82 (dd, J = 5.7, 4.2Hz, 2H), 3.68 (hd, J = 3.9, 2.6Hz, 4H), 3.65 - 3.62 (m, 3H), 3.61 (s, 3H), 3.60 - 3.56 (m, 2H), 3.48 (t, J = 5.6Hz, 3H), 3.39 (q, J = 6.2, 5.6Hz, 3H), 3.34 (s, 4H), 3.18 (t, J = 7.8Hz, 3H), 2.59 (t, J = 7.7Hz, 2H), 2.47 (s, 3H), 2.35 (tt, J = 8.3, 4.7Hz, 1H), 2.24 (s, 3H), 1.46 (d, J = 6.7Hz, 3H), 1.37 - 1.28 (m, 2H), 1.19 (dt, J = 8.2, 3.3Hz, 3H). LCMS: C44H56BF2N9O5 필요치 m/z = 840, 실측치 841 [M+H]+.
생물학적 실시예
다음 약어가 적용된다: ACT(입양 세포 요법); AUC(곡선하 면적); Cmpd(화합물); CP(세포 증식); E/T(이펙터:표적 세포 비율); ID(식별); MFI(평균 형광 세기); mpk(mg/kg); PBMC(말초 혈액 단핵 세포); TIL(종양 침윤성 림프구); Ub(유비퀴틴).
생물학적 실시예 1: 후보 억제제에 의한 Cbl -b 억제의 평가
후보 화합물은 Cbl-b에 결합된 형광단 표지된 프로브(실시예 54)를 대체하는 능력에 의해 입증된 바와 같이, E3 유비퀴틴-단백질 리가제인 Cbl-b에 결합하고 억제하는 능력에 대해 평가되었다.
재료 및 방법
Cbl -b 치환 검정( Cbl -b 억제 검정)
후보 화합물이 공지된 억제제를 대체하여 Cbl-b 활성을 억제하는 능력은 후보 화합물의 존재하에서 Cbl-b와 형광단 표지된 프로브의 상호작용을 모니터링함으로써 측정되었다. N-말단에 Avitag를 함유하는 Cbl-b의 절단된 변이체(UniProt 번호 Q13191; 서열번호 1)를 BirA 비오틴 리가제와 함께 공발현시키고 표준 프로토콜을 사용하여 정제하였다(참조: Dou et al., Nature Structural and Molecular Biology, 8: 982-987, 2013; Avidity LLC).
Cbl -b 아미노산 잔기 36-427:
Figure pct00215
형광 표지된 억제제 프로브를 합성하고 BODIPY FL로 태그하였다(실시예 54). Cbl-b 치환 검정은 1% DMSO(최종 농도) 중 후보 화합물의 존재하에 1시간 동안 20mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl, 0.01% Triton X-100, 0.01% BSA 및 0.5mM TCEP를 함유하는 검정 완충제에서 0.5nM Cbl-b 또는 0.125nM Cbl-b(최종 농도, 각각 "높음" 및 "낮음"으로 표시됨)를 사전-배양함으로써 10μL의 반응 용적에서 실온에서 384-웰 플레이트에서 수행되었다. 후보 화합물의 존재하에 배양 후, 플레이트를 150nM 형광 표지 억제제 프로브 및 2nM 스트렙타비딘-테르븀(Cisbio)(최종 농도)으로 구성된 대략적인 EC40 결합 포화의 존재하에 추가로 1시간 동안 배양하였다. 1시간 배양 후, 플레이트를 Envision 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 사용하여 520/620nm에서 TR-FRET 신호에 대해 판독하였다. TR-FRET 신호의 존재는 프로브가 화합물 후보에 의해 Cbl-b로부터 대체되지 않았음을 나타냈다. FRET 신호의 부재는 프로브가 화합물 후보에 의해 Cbl-b로부터 대체되었음을 나타냈다.
화합물은 IC50에 대해 다음과 같이 빈 A 내지 D로 순위가 매개졌다: A는 ≤5nM을 나타내고; B는 5nM<IC50≤20nM을 나타내고; C는 20nM<IC50≤100nM을 나타내고; D는 IC50 > 100nM을 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00216
생물학적 실시예 2: Cbl -b 억제제에 의한 T-세포 활성화의 평가
cbl-b 유전자의 유전적 녹아웃에 의한 T-세포와 마우스 둘 모두에서의 Cbl-b 기능의 상실은 T-세포 활성화 및 아네르기에 대한 T-세포 내성에 대한 CD28 공자극 요건의 상실을 초래한다(참조: Bachmaier et al., Nature, 403: 211-216, 2000; 및 Jeon et al., Immunity, 21: 167-177, 2004). 본원에 기재된 Cbl-b 억제제는 T-세포를 활성화시키는 이들의 능력에 대해 평가되었다.
재료 및 방법
1차 인간 전체 T-세포 활성화의 정제 및 평가
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 전체 인간 1차 T-세포는 제조자의 프로토콜(Miltenyi Biotec 카탈로그 #130-096-535 (즉, 표면 마커 CD14, CD15, CD16, CD19, CD34, CD36, CD56, CD123 및 CD235a에 대한 항체의 칵테일을 PBMC와 함께 배양한 후, 자기 비드로 샘플을 통과시켜 이러한 표면 마커를 발현하는 세포를 제거한다) 또는 Stemcell Technologies 카탈로그 #17951)에 따라 상업용 키트를 사용하는 음성 선택을 사용하여 PMBC로부터 단리시켜 유세포 계측법에 의해 평가된 바와 같이 >95% CD3+ 세포를 산출하였다. 세포를 37℃ 5% CO2에서 밤새 휴지시켰다. Cbl 억제제를 웰당 1x105 세포에 첨가하고, 플레이트를 최종 DMSO 농도 <0.1%로 표시된 농도(표 3)에서 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 배양하였다. 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체(항-CD3/항-CD28)로 자극된 샘플의 경우, 시험된 Cbl-b 억제제의 농도는 1μM 및 0.3μM이었다. 항-CD3 항체 단독(항-CD3)으로 자극된 샘플의 경우, 시험된 Cbl-b 억제제의 농도는 3μM 및 1μM이었다. Cbl-b 억제제와의 배양 후, 1차 인간 전체 T-세포를 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3) 단독 또는 가용성 항-CD28 항체(28.2)(Life Technologies)와 함께 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3)로 자극하였다. 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3)를 포함하는 플레이트를 제조하기 위해, 96-웰 환저 조직 배양 플레이트를 인산염 완충 식염수(PBS)에서 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 10μg/mL로 100μL의 항-CD3 항체(OKT3)로 코팅했다. 플레이트를 PBS로 1회 세척한 후, 가용성 항-CD28 항체(28.2)를 포함하거나 포함하지 않는 세포를 최종 농도 5μg/mL로 각 웰에 첨가하였다. 무세포 상청액을 수거하고 유세포 계측법에 의한 표면 마커 평가를 위해 세포 집단을 염색하기 전에 세포를 48시간 동안 자극하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 ELISA(R&D Systems, Peprotech 또는 Life Technologies) 또는 Luminex 멀티플렉스 키트(Procarta Life Technologies)에 의해 IL-2를 포함한 사이토카인 분비에 대해 상청액을 분석하였다. 세포를 항-CD25 항체(BD Biosciences)로 염색하여 활성화 표면 마커의 수준을 평가하였다.
결과
판독치는 기준선에 대한 배수 변화로 보고되었다. 본 연구의 기준선은 항-CD3 항체 및 가용성 항-CD28 항체로 자극된 전체 인간 T-세포로부터 수득된 측정치였고, 여기서 세포는 Cbl-b 억제제와 함께 배양되지 않았다(표 3). 항-CD3/항-CD28로 자극된 T-세포의 경우, IL-2 분비의 기준선에 비해 2.5배 초과의 변화 및 CD25 표면 염색의 기준선에 비해 1.3배 초과의 변화가 유의하고 양성 반응으로 간주되었다(표 3). 항-CD3 단독으로 자극된 T-세포의 경우, IL-2 분비의 기준선에 비해 0.1배 초과의 변화 및 CD25 표면 염색의 기준선에 비해 0.6배 초과의 변화가 유의하고 양성 반응으로 간주되었다(표 3). 화합물은 다음과 같이 이들의 판독치에 따라 빈에 순위가 매겨겼다:
항-CD3 항체와 항-CD28 항체의 공자극에 의한 IL-2 분비의 경우, 빈은 다음과 같다: C는 < 20배를 나타내고, B는 20 내지 35배를 나타내며, A는 >35배를 나타내고;
항-CD3 항체 자극에 의한 IL-2 분비의 경우, 빈은 다음과 같다: C는 <0.70배를 나타내고, B는 0.70 내지 1.1배를 나타내며, A는 >1.1배를 나타내고;
항-CD3 항체와 항-CD28 항체의 공자극에 의한 CD25 염색의 경우, 빈은 다음과 같다: C는 <1.24배를 나타내고, B는 1.24 내지 1.39배를 나타내며, A는 >1.39배를 나타내고;
항-CD3 항체 자극에 의한 CD25 염색의 경우, 빈은 다음과 같다: C는 <1.5배를 나타내고, B는 1.5 내지 2.5배를 나타내며, A는 >2.5배를 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00217
Figure pct00218
결론
Cbl-b 억제제는 항-CD3 항체 단독 또는 항체와의 조합으로 자극된 T-세포에서 IL-2 분비를 향상시켰다. 표면 활성화 마커인 CD25의 발현은 항-CD3 항체 단독 또는 항-CD28 항체와의 조합으로 자극된 T-세포에서 증가되었다. 이러한 결과는 동정된 Cbl-b 억제제가 T-세포를 활성화하는 능력을 가지며, 이러한 활성화가 항-CD28 항체에 의한 공자극을 필요로 하지 않음을 나타낸다.
생물학적 실시예 3: Cbl -b 억제제의 면역조절 효과의 평가
스크리닝 검정으로부터 동정된 Cbl-b 억제제는 증강된 IL-2 분비 및 CD25 표면 활성화 마커의 발현에 의해 입증된 바와 같이, 시험관내에서 전체 인간 T-세포를 활성화하는 능력을 입증했다. T-세포에 의한 추가 사이토카인 분비 및 T-세포 상의 표면 활성화 마커의 발현을 평가하기 위해 추가의 시험관내 연구가 수행되었다. T-세포 증식을 증가시키고, T-세포 고갈을 감소시키고, T-세포 아네르기를 감소시키는 Cbl-b 억제제의 능력과 같은, 본원에 기재된 Cbl-b 억제제와 접촉된 T-세포에 대한 추가 면역조절 효과가 평가되었다. 본원에 기재된 것들과 같은 Cbl-b 억제제의 생체내에서 T-세포를 활성화시키는 능력도 또한 평가되었다. B-세포 및 NK-세포를 활성화시키는 Cbl-b 억제제의 능력과 같은 Cbl-b 억제제에 의한 다른 면역조절 효과가 평가되었다.
1차 인간 전체 T-세포 활성화의 정제 및 평가
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 전체 인간 1차 T-세포는 제조자의 프로토콜(Miltenyi Biotec 카탈로그 #130-096-535 (즉, 표면 마커 CD14, CD15, CD16, CD19, CD34, CD36, CD56, CD123 및 CD235a에 대한 항체의 칵테일을 PBMC와 함께 배양한 후, 자기 비드로 샘플을 통과시켜 이러한 표면 마커를 발현하는 세포를 제거한다) 또는 Stemcell Technologies 카탈로그 #17951)에 따라 상업용 키트를 사용하는 음성 선택을 사용하여 PMBC로부터 단리시켜 유세포 계측법에 의해 평가된 바와 같이 >95% CD3+ 세포를 산출하였다. 세포 증식의 측정을 위해, 항-CD3 단독으로 또는 항-CD28 항체와 조합으로의 자극에 의한 활성화 전에 세포를 제조자의 프로토콜에 따라 Cell Trace Violet(Invitrogen)으로 표지하였다. Cbl 억제제를 최종 DMSO 농도 <0.1%로 웰당 1x105 세포로 복수의 농도(예: 10μM, 1.11μM, 또는 0.123μM)에서 첨가되었다. 플레이트를 5% CO2 중에서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. Cbl-b 억제제와의 배양 후, 1차 인간 전체 T-세포를 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3) 단독 또는 가용성 항-CD28 항체(28.2)(Life Technologies)와 함께 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3)로 자극하였다. 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3)를 포함하는 플레이트를 제조하기 위해, 96-웰 환저 조직 배양 플레이트를 인산염 완충 식염수(PBS)에서 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 10μg/mL로 100μL의 항-CD3 항체(OKT3)로 코팅했다. 플레이트를 PBS로 세척한 후, 가용성 항-CD28 항체(28.2)를 포함하거나 포함하지 않는 세포를 최종 농도 5μg/mL로 각 웰에 첨가하였다. 무세포 상청액을 수거하고 유세포 계측법에 의한 표면 마커 평가를 위해 세포 집단을 염색하기 전에 세포를 48시간 동안 자극하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 ELISA(R&D Systems, Peprotech 또는 Life Technologies) 또는 Luminex 멀티플렉스 키트(Procarta Life Technologies)에 의해 사이토카인 분비(예: GM-CSF, IFNγ 및 TNFα)에 대해 상청액을 분석하였다. 세포를 항-CD69(BD Biosciences)로 염색하여 활성화 표면 마커의 수준을 평가하였다. 증식은 유세포 계측법으로 측정하였고, 데이터는 FlowJo v7.6.5 또는 v10으로 분석하였다. 판독치는 기준선에 대한 배수 변화로 보고되었다. 일부 구현예에서, 기준선은 항-CD3 항체 단독으로 자극된 전체 인간 T-세포로부터 수득된 측정치이며, 여기서 세포는 Cbl-b 억제제와 함께 배양되지 않았다. 일부 구현예에서, 기준선은 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 자극된 전체 인간 T-세포로부터 수득된 측정치였으며, 여기서 세포는 Cbl-b 억제제와 함께 배양되지 않았다.
1차 인간 T-세포에 대한 Cbl-b 억제제 효과는 동종 혼합 림프구 반응(MLR)의 맥락에서 또한 평가되었다. 동종 미성숙 수지상 세포는 하기 조건하에서 생성되었다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 단핵구는 제조자의 프로토콜(Stemcell Technologies 카탈로그 #17858)에 따라 상업용 키트를 사용하는 양성 선택을 사용하여 PMBC로부터 단리되어 유세포 계측법에 의해 평가된 바와 같이 >95% CD14+ 세포를 산출하였다. 단핵구를 30ng/mL의 재조합 인간 GM-CSF 및 20ng/mL의 재조합 인간 IL-4와 함께 7일 동안 배양하여 미성숙 수지상 세포를 생성하였다. 단핵구 및 T-세포는 말초 혈액으로부터 신선하게 단리되거나 동결된 스톡으로부터 해동되었다. 인간 T-세포를 단리시키고, CFSE로 표지하고, 상기 기재된 바와 같이 억제제와 함께 배양하였다. Cbl-b 억제제를 다중 농도(예: 10μM 또는 1.11μM)에서 최종 DMSO 농도 <0.1%로 웰당 2x103개의 동종 미성숙 수지상 세포와의 공배양물로 1x105 T-세포에 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 5일 동안 배양하였다. T-세포의 증식은 유세포 계측법에 의해 평가되었다.
Cbl-b 억제제는 T-세포(예: GM-CSF, IFNγ, TNFα)로부터 사이토카인의 분비 및/또는 T-세포의 활성화를 나타내는 T-세포 상의 세포 표면 마커(예: CD69)의 표면 발현을 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하기 위해 시험되었다. Cbl-b 억제제는 또한 T-세포 증식을 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하기 위해 시험되었다. Cbl-b 억제제는 공자극의 존재하에서 조건이 프라이밍에 차선인 경우 T-세포 활성화에 대한 영향에 대해 시험되었다.
T-세포 고갈의 인간 T-세포 시험관내 모델
T-세포 고갈은 만성 감염 또는 암에 반응하여 T-세포 기능장애를 일으키는 불량한 이펙터 반응 및 억제성 수용체 발현의 지속된 수준을 갖는 세포로 특성화되었다. T-세포 고갈의 시험관내 모델은 동종 및 자가 모델을 포함한다. 자가 모델에서 골수 세포와 SEB(스타필로코컬 에테로톡신(Staphylococcal enterotoxin) B, Millipore)를 사용하여 항-CD3 자극된 T-세포를 자극하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 단핵구는 제조자의 프로토콜에 따라 CD16 고갈이 없는 StemCell Technologies EasySep 인간 단핵구 농축 키트(카탈로그 #19058)를 사용한 음성 선택을 사용하여 상업용 키트로 단리시켰다. 단리된 단핵구는 50ng/mL의 재조합 인간 M-CSF(R&D System 또는 Peprotech)와 함께 완전 배지(예: 첨가제가 없는 RPMI 1640, 10% HI FBS, 1X 글루타민 및 1X β-머캅토에탄올)에서 배양하였다. 세포를 웰당 2x 106 세포로 플레이팅하고(0일째), 5일 동안 배양하고, 2일째에 신선한 배지 및 사이토카인을 공급하였다. 5일째에, IFNγ를 100ng/mL로 첨가하고, 세포를 밤새 배양하였다. 동일한 공여자의 1차 인간 T-세포를 제조자의 프로토콜에 따라 Stemcell Technologies EasySep 인간 T-세포 단리 키트(카탈로그 #17951)를 이용한 음성 선택을 사용하여 상업용 키트를 사용하여 PBMC로부터 단리시켰다. 순도는 CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD19, CD14, CD56 및 CD3(BD Biosciences)에 대한 유세포 계측법에 의한 표면 마커 검출에 의해 확인되었다. 3 x106개 세포/mL T-세포를 10μg/mL의 플레이트-결합 항-CD3 항체(클론 UCHT-1)로 5일 동안 자극하였다. 이것은 골수 세포의 생성과 병행하여 이루어졌다. 6일째에, 웰당 2.5 x 104개의 T-세포, 웰당 12.5 x 103개 골수 세포 및 SEB 항원(0.1μg/mL)을 환저 96-웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 시험 제제(예: Cbl-b 억제제 화합물) 또는 대조군(예: 항-PD1 항체와 같은 체크포인트 중화 항체)을 표시된 농도(예: 10μM)로 웰에 첨가하였다. 세포를 3일 동안 배양하고, 이때 무세포 상청액을 수집하고, ELISA(R&D Systems, Peprotech 또는 Life Technologies) 또는 Luminex 멀티플렉스 키트(Procarta Life Technologies)에 의해 분비된 사이토카인(예: GM-CSF, IFNγ, 및 IL-2)에 대해 평가했다. T-세포를 체크포인트 억제제(예: CTLA4)를 포함하는 표면 마커의 패널에 대해 염색하고, Cbl-b 억제제의 효과에 대해 유세포 계측법으로 평가하였다.
Cbl-b 억제제를 시험하여 골수 세포의 존재하에 고갈된 T-세포(예: GM-CSF, IFNγ, 및 IL-2)로부터 사이토카인의 분비를 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하였고, 이는 T-세포 고갈의 감소를 나타냈다. Cbl-b 억제제는 고갈된 T-세포의 활성화 후 체크포인트 조절 인자 발현 수준에 미치는 영향에 대해서도 시험되었다.
T-세포 아네르기의 인간 T-세포 시험관내 모델
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 전체 인간 1차 T-세포는 제조자의 프로토콜(Miltenyi Biotec 카탈로그 #130-096-535 (즉, 표면 마커 CD14, CD15, CD16, CD19, CD34, CD36, CD56, CD123 및 CD235a에 대한 항체의 칵테일을 PBMC와 함께 배양한 후, 자기 비드로 샘플을 통과시켜 이러한 표면 마커를 발현하는 세포를 제거한다) 또는 Stemcell Technologies 카탈로그 #17951)에 따라 상업용 키트를 사용하는 음성 선택을 사용하여 PBMC로부터 단리시켜 유세포 계측법에 의해 평가된 바와 같이 >95% CD3+ 세포를 산출하였다. 세포를 고정화된 항-CD3 항체(OKT3) 및 가용성 항-CD28 항체(28.2)로 2일 동안 활성화시키고, 이때 세포를 세척하고 자극 부재하에 3일 동안 휴지시켰다. 이어서, 이들은 이오노마이신(Sigma)으로 18 내지 24시간 동안 처리하여 아네르기를 유발하였다. 샘플로부터 이오노마이신을 제거하기 위해 2회 세척한 후, Cbl-b 억제제 화합물을 표시된 농도(예: 10, 1.11 및 0.37μM)로 세포에 첨가하고 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 24시간 동안 재도전하였고, 이때 무세포 상청액을 수집하고, 제조자의 프로토콜에 따라 EISA(R&D Systems 또는 Peprotech) 또는 Luminex 멀티플렉스 키트(Procarta Life Technologies)에 의해 사이토카인(예: IFNγ)에 대해 평가했다.
Cbl-b 억제제는 아네르기 T-세포로부터 사이토카인(예: IFNγ)의 분비를 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하기 위해 시험되었고, 이는 감소된 T-세포 내성을 나타냈다.
Cbl -b 억제제의 생체내 활성
Cbl-b 억제제의 약력학적 프로파일을 결정하는 방법은 C57BL/6 또는 BALB/c 마우스와 같은 적격 면역계를 갖는 마우스의 균주에 Cbl-b 억제제를 투여함으로써 수행되었다. Cbl-b 억제제는 적절한 제형에 용해되며, 이전의 약동학 및 내약성 연구에 의해 공지된 바와 같이, 정맥내(IV), 복강내(IP), 피하(SC), 또는 경구(PO)와 같은 다양한 경로 중 하나에 의해 적절한 투여량 수준 및 빈도(예: 1일당 2회의 BID 또는 1일당 3회의 TID)로 투여되었다. Cbl-b 억제제의 투여 후, T-세포 및 간접적으로 다른 면역 세포(예: 사이토카인 생산을 통해)를 IV 또는 IP와 같은 경로에 의해 동물당 2μg 또는 10μg과 같은 규정된 양으로 PBS 중의 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여에 의해 생체내에서 자극하였다(참조: Hirsh et al., J. Immunol., 1989; Ferran et al., Eur. J. Immunol., 1990). 추가 연구 대조군 아암은 비히클 제형 단독(즉, Cbl-b 억제제 및 항-CD3 항체를 포함하지 않는 제형), Cbl-b 억제제만을 함유하는 제형, 항-CD3 항체 단독, PBS 단독, 또는 이들 제제의 조합을 함유하는 제형으로 처리된 마우스의 그룹을 포함했다. 이어서, 면역 활성화의 수준을 혈장 사이토카인 수준 및/또는 면역 세포(예: T-세포) 상의 활성화 마커의 발현의 분석에 의해 평가하였다. 혈액 또는 림프 기관(예: 비장)은 규정된 시점(예: 8시간 또는 24시간)에서 수집되었다. 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 사이토카인 수준의 결정을 위한 혈장을 수집하기 위해 혈액 샘플을 처리하였다. 측정된 사이토카인은 IL-2, IFNγ 및 TNFα를 포함하였다. 추가의 혈액 샘플 및 림프 조직은 CD25 및/또는 CD69와 같은 세포 유형 특이적 마커 및 활성화 마커의 발현을 결정하기 위한 표준 방법을 사용하여 면역 세포(예: T-세포)의 유세포 계측 분석을 위해 처리되었다. Cbl-b 억제제 투여에 의한 면역 자극의 증강은 혈장에서 사이토카인의 상대적 농도 또는 적절한 그룹(예: Cbl-b 억제제 및 2㎍의 항-CD3 항체로 처리된 마우스 대 비히클 및 2㎍의 항-CD3 항체로 처리된 마우스) 사이에서 면역 세포 상의 활성화 마커의 발현 수준을 비교하여 평가되었다.
Cbl-b 억제제를 시험하여 항-CD3 항체로 자극된 처리된 마우스로부터 수득된 혈액에서 사이토카인(예: IL-2, IFNγ, 및 TNFα)의 수준을 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하였고, 이는 면역 반응의 조절을 나타냈다. Cbl-b 억제제는 또한 항-CD3 항체로 자극된 처리된 마우스로부터 단리된 T-세포(예: CD25 및/또는 CD69) 상의 세포 표면 마커의 발현을 유도 또는 증강시키는 이들의 능력을 결정하기 위해 시험되었고, 이는 면역 반응의 조절을 나타냈다.
B-세포 활성화 검정
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 인간 1차 B-세포는 제조자 프로토콜(Stemcell Technologies 카탈로그 #17954)에 따라 상업용 키트를 사용하는 음성 선택을 사용하여 PBMC로부터 단리되어 유세포 계측법으로 평가된 >95% CD20+ 세포를 산출하였다. 1차 인간 B-세포를 96-웰 플레이트에서 웰당 0.7 내지 1 x 105로 10μM 내지 1nM 범위의 투여량으로 Cbl-b 억제제와 함께 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 최종 DMSO 농도 <0.5%로 배양했다. 세포를 항-IgM으로 37℃, 5% CO2에서 20시간 동안 자극하였다. 성숙한 CD20+ IgD+ B-세포 상의 표면 활성화 마커는 항-CD69 항체(BD Biosciences)를 사용하여 FACS에 의해 모니터링되었다.
Cbl-b 억제제는 B-세포의 활성화를 나타내는 B-세포 상의 세포 표면 마커(예: CD69)의 표면 발현을 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하기 위해 시험되었다.
1차 인간 NK -세포의 정제 및 활성화.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 제조사의 프로토콜(Miltenyi Biotec 카탈로그 #130-092-657 또는 Stemcell Technologies 카탈로그 #17955)에 따라 상업용 키트를 사용한 음성 선택을 이용하여 PBMC로부터 전체 인간 1차 NK-세포를 단리시켜 유세포 계측법에 의해 평가된 바와 같이 >92% CD56+, CD3-세포를 산출하였다. 세포를 IL-2(60ng/mL)와 함께 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양하였다. Cbl-b 억제제는 자극 1시간 전에 첨가되며 37℃ 5% CO2에서 특정 농도(예: 10μM, 1μM 또는 0.1μM)에서 최종 DMSO 농도 <0.1%로 배양하였다. NK-세포는 유세포 계측법으로 측정 가능한 적핵(K562 NucRed)을 갖도록 조작된 표적 세포와 공배양하였다. K562 NucRed 세포는 IncuCyte NucLight Red 렌티바이러스 시약(카탈로그 #4476)과 함께 K562 세포를 형질도입함으로써 생산되었고 5일 동안 선택되었다. 클론 집단은 표준 조직 배양 기술을 사용하여 단리 및 확장되었고, 개별 클론은 NK-세포 사멸 검정에서 야생형 K562 세포와의 비교로 검증되었다. 세포를 NK(이펙터 세포)와 K562 NucRed(표적 세포)의 표시된 비율(예: 5:1, 1:1, 1:5)로 6시간 동안 혼합하였다. 무세포 상청액을 수집하고, 제조자의 프로토콜에 따라 ELISA 또는 Luminex 멀티플렉스 키트에 의해 사이토카인 분비(예: TNFα, IFNγ, 또는 MIP1β)에 대해 분석하였다. IFNγ 분비는 R&D Systems ELISA 키트(카탈로그 #DY285)를 사용하여 평가하였고, TNFα 분비는 R&D Systems ELISA 키트(카탈로그 #DY210)를 사용하여 평가하였고, MIP1β 분비는 R&D Systems ELISA 키트(카탈로그 #DY271)를 사용하여 평가했다.
생물학적 실시예 4: 암 치료를 위한 면역 체크포인트 억제제와 조합된 Cbl -b 억제제의 평가
종양 미세환경은 항종양 면역 반응을 피하는 메커니즘으로 T-세포 억제 경로를 이용한다. PD-1, PD-L1 및 CTLA-4의 억제제와 같은 면역 체크포인트 억제제를 사용하면 일부 종양 유형에 대해 매우 효과적이고 내구성 있는 반응을 초래했다(참조: Marshall and Djamgoz, Front Oncol, 8:315, 2018). 그러나, 면역 체크포인트 억제제 단일 요법에 대한 반응은 보편적이지 않고, 따라서 암 환자의 소수에게만 도움이 된다(참조: Lv et al., Journal for Immuno Therapy of Cancer, 7:159, 2019). 이 실시예는 면역 체크포인트 억제제와 Cbl-b 억제제를 포함하는 암 치료용 병용 요법의 평가를 기재한다.
간단히 말하면, 병용 요법을 동계 종양이 성장된 적격 면역계를 갖는 마우스(예: C57BL/6 또는 BALB/c 마우스)의 균주에서 시험하였다. 동계 뮤린 종양 세포를 피하 주사하였다: BALB/c 마우스의 CT26 결장암 세포; C57BL/6 마우스의 TC-1 폐암 세포; 또는 C57BL/6 마우스의 MC-38 결장암 세포. 종양은 100-200mm3까지 성장하도록 허용되었고, 그 시점에서 동물을 무작위화하고 치료를 시작하였다. 대안적으로, 종양 세포 이식 후 1 내지 3일 이내에 예방적 설정으로 치료를 투여하였다. Cbl-b 억제제는 적절한 제형에 용해되었고, 이전의 약동학 및 내약성 연구에 의해 공지된 바와 같이 투여량 수준 및 빈도로 투여되었다. Cbl-b 억제제 제형은 경구(PO) 또는 비경구(예: IV, IP, SC, 또는 종양당 1 내지 3개 주사 부위에서 종양내) 투여되었다. 면역 체크포인트 억제제 제형은 3일 마다(예: 1일, 4일 및 7일째) IP 주사에 의해 투여되었다. 병용 요법을 받은 마우스의 시험군 이외에, 본 연구는 비히클 제형 단독, Cbl-b 억제제 제형 단독, 또는 면역 체크포인트 억제제 단독을 투여받은 마우스의 대조군을 포함하였다.
반응의 수준은 종양 성장을 측정하고 시험 마우스 대 대조군 마우스의 종양 성장을 비교함으로써 평가되었다. 면역 활성화의 수준은 종양 침윤성 림프구(TIL)의 분석을 위해 종양을 수집하여 평가되었다. TIL 및 림프 조직은 세포 계통, 세포 유형 특이적 마커의 발현, 및 그랜자임 B, PD-1, TIM3 및 LAG3과 같은 활성화 마커의 발현을 결정하기 위한 표준 방법을 사용한 유세포 계측 분석을 위해 처리되었다. 병용 요법에 의한 항종양 면역 반응의 증강은 종양내 면역 세포 집단의 상대적인 백분율과 시험군 및 연구군 마우스에서 면역 세포 상의 활성화 마커의 발현의 상대적인 수준을 비교함으로써 평가되었다.
생물학적 실시예 5: 암 치료를 위한 항종양제와 조합된 Cbl -b 억제제의 평가
화학요법은 예후에 영향을 미치는 조절 면역 세포 및 이펙터 면역 세포의 균형과 함께 종양 침윤성 림프구에 대해 긍정적인 면역학적 효과를 갖는 것으로 보고되었다(Lazzari et al., Ther Adv Med Oncol, 10:1-12, 2018). 또한, 종양 항원 제시를 증진시킴으로써 종양내 T-세포 레퍼토리를 증가시키기 위해 화학요법이 고려된다. 이 실시예는 항종양제와 Cbl-b 억제제를 포함하는 암 치료용 병용 요법의 평가에 대해 기재한다.
간단히 말하면, 병용 요법을 동계 종양이 성장된 적격 면역계를 갖는 마우스(예: C57BL/6 또는 BALB/c 마우스)의 균주에서 시험하였다. 동계 뮤린 종양 세포를 피하 주사하였다: BALB/c 마우스의 CT26 결장암 세포; 또는 C57BL/6 마우스의 TC-1 폐암 세포. 종양은 약 120mm3까지 성장하도록 허용되었고, 그 시점에서 동물을 무작위화하고 치료를 시작하였다. Cbl-b 억제제는 적절한 제형에 용해되었고, 이전의 약동학 및 내약성 연구에 의해 공지된 바와 같은 적절한 투여량 수준 및 빈도로 투여되었다. Cbl-b 억제제 제형은 경구(PO) 또는 비경구(예: IV, IP, SC, 또는 종양당 1 내지 3개 주사 부위에서 종양내) 투여되었다. 항종양제(예: 겜시타빈 및/또는 옥살리플라틴)는 3일 또는 4일 마다 1회 IP 주사에 의해 투여되었다. 병용 요법을 받은 마우스의 시험군 이외에, 본 연구는 비히클 제형 단독, Cbl-b 억제제 제형 단독, 또는 항종양제 단독을 받은 마우스의 대조군을 포함하였다.
반응의 수준은 종양 성장을 측정하고 시험 마우스 대 대조군 마우스의 종양 성장을 비교함으로써 평가되었다. 면역 활성화의 수준은 종양 침윤성 림프구(TIL)의 분석을 위해 종양을 수집하여 평가되었다. TIL 및 림프 조직은 세포 계통, 세포 유형 특이적 마커의 발현 및 그랜자임 B, PD-1, TIM3 및 LAG3과 같은 활성화 마커의 발현을 결정하기 위한 표준 방법을 사용한 유세포 계측 분석을 위해 처리되었다. 병용 요법에 의한 항종양 면역 반응의 증강은 종양내 면역 세포 집단의 상대적인 백분율과 시험군 및 연구군 마우스에서 면역 세포 상의 활성화 마커의 발현의 상대적인 수준을 비교함으로써 평가되었다.
생물학적 실시예 6: 암 치료를 위한 방사선 요법과 조합된 Cbl -b 억제제의 평가
국소 종양을 표적으로 하는 절제 방사선 요법은 정상 조직에 대한 손상을 제한하고 종양 항원의 존재를 증가시킴으로써 T-세포 수용체 레퍼토리의 다양성을 향상시키는 능력을 갖는다(참조: Lee et al., Blood, 114:589-595, 2009). 한 부위에서의 방사선 요법은 조사되지 않은 원격 부위 종양의 퇴행으로 이어질 것으로 보고되었다(참조: Ngwa et al., Nat Rev Cancer, 18:313-322, 2018). 국소화 요법의 전신 효과는 "압스코팔 효과(abscopal effect)"라고 불리며, 방사선 요법의 맥락에서 면역계가 관여하는 것으로 여겨진다. 이 실시예는 방사선 요법과 Cbl-b 억제제를 포함하는 암 치료용 병용 요법의 평가를 기재한다.
간단히 말하면, 병용 요법을 동계 종양이 성장된 적격 면역계를 갖는 마우스(예: C57BL/6 또는 BALB/c 마우스)의 균주에서 시험하였다. 동계 뮤린 종양 세포를 피하 주사하였다: BALB/c 마우스의 CT26 결장암 세포; 또는 C57BL/6 마우스의 B16-F10 흑색종 세포. 종양은 약 80mm3까지 성장하도록 허용되었고, 그 시점에서 동물을 무작위화하고 치료를 시작하였다. 일부 연구에서, 종양 세포는 양 옆구리 모두에 이식되었고, 단지 하나의 종양만이 압스코팔 효과를 평가하기 위해 처리되었다. Cbl-b 억제제는 적절한 제형에 용해되었고, 이전의 약동학 및 내약성 연구에 의해 공지된 바와 같은 적절한 투여량 수준 및 빈도로 투여되었다. Cbl-b 억제제 제형은 경구(PO) 또는 비경구(예: IV, IP, SC, 또는 종양당 1 내지 3개 주사 부위에서 종양내) 투여되었다. 방사선 요법은 X선 기반 초점 빔 조사 장치를 사용하여 20그레이의 선량으로 1회 투여되었다. 병용 요법을 받은 마우스의 시험군 이외에, 본 연구는 비히클 제형 단독, Cbl-b 억제제 제형 단독, 또는 방사선 요법 단독을 받은 마우스의 대조군을 포함하였다.
반응의 수준은 종양 성장을 측정하고 시험 마우스 대 대조군 마우스의 종양 성장을 비교함으로써 평가되었다. 면역 활성화의 수준은 종양 침윤성 림프구(TIL)의 분석을 위해 종양을 수집하여 평가되었다. TIL 및 림프 조직은 세포 계통, 세포 유형 특이적 마커의 발현 및 그랜자임 B, PD-1, TIM3 및 LAG3과 같은 활성화 마커의 발현을 결정하기 위한 표준 방법을 사용한 유세포 계측 분석을 위해 처리되었다. 병용 요법에 의한 항종양 면역 반응의 증강은 종양내 면역 세포 집단의 상대적인 백분율과 시험군 및 연구군 마우스에서 면역 세포 상의 활성화 마커 발현의 상대적인 수준을 비교함으로써 평가되었다.
생물학적 실시예 7: 암 치료를 위한 입양 세포 요법과 조합된 Cbl -B 억제제의 평가
자가 종양 특이적 T-세포를 이용하는 입양 세포 요법(ACT)은 T-세포의 자연적인 기능을 이용하여 표적 세포를 특이적으로 인식 및 제거한다(Hinrichs and Rosenberg, Immunol Rev, 257:56-71, 2014). 종양 침윤성 림프구(TIL)의 특이성은 돌연변이된 유전자의 산물로부터 유래된 신생 항원을 포함하는 종양 관련 항원을 인식하는 능력에 기인한다. 이 실시예는 ACT로 암을 치료하기 위한 TIL의 생체외 확장 전에 Cbl-b 억제제를 사용한 생체내 림프 조절 프로그램의 평가를 기재한다.
동계 종양이 성장된 적격 면역계를 갖는 마우스(예: C57BL/6 또는 BALB/c 마우스)의 균주를 이용하였다. 동계 뮤린 종양 세포를 피하 또는 정맥내 주사하였다: BALB/c 마우스의 4T1 유방암 세포; BALB/c 마우스의 RENCA 신장암 세포; C57BL/6 마우스의 B16-F10 흑색종 세포; C57BL/6 마우스의 3LL 폐암 세포; 또는 C57BL/6 마우스의 MC-38 결장암 세포. 종양은 약 50-600mm3까지 성장하도록 허용되었고, 그 시점에서 동물을 무작위화하고 치료를 시작하였다. Cbl-b 억제제는 적절한 제형에 용해되었고, 이전의 약동학 및 내약성 연구에 의해 공지된 바와 같이 적절한 투여량 수준 및 빈도로 투여되었다. Cbl-b 억제제 제형은 경구(PO) 또는 비경구(예: IV, IP, SC, 또는 종양당 1 내지 3회의 주사 부위에서 종양내) 투여되었다. 종양 수거 전에 Cbl-b 억제제를 투여받은 마우스의 시험군 이외에, 대조군 마우스는 비히클 제형 단독을 투여받았거나 종양 수거 전에 처리되지 않은 채로 방치되었다. 종양 조직은 원발성 종양 또는 전이를 수반하는 조직(예: 폐)으로부터 수거하였다. 조직을 잘게 자르고, TIL의 확장에 적합한 조건하에서 하나 이상의 외인성 T-세포 성장 인자(예: IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21)의 존재 또는 부재하에 배지에서 배양하였다. TIL의 확장은 Cbl-b 억제제의 존재 또는 부재하에 수행되었다. 확장된 TIL은 기억, 이펙터 및 줄기에 대한 마커(예: CD95, TCF7, CD62L, CD44 등)의 발현을 측정함으로써 유세포 계측 분석에 의해 표현형에 대해 평가되었다. TIL의 성공적인 확장시, Cbl-b 억제제의 존재 또는 부재하에 종양 보유 마우스는 TIL을 주입하여 TIL 생착 및 항종양 면역 반응에 대한 림프구 조절 및/또는 후속적 생체내 치료의 효과를 평가했다.
ACT의 항종양 효능은 종양 측정을 통해 평가하여 TIL에 의한 종양 성장 억제 수준을 결정하였다.
생물학적 실시예 8: 후보 억제제에 의한 Cbl -b 억제의 평가
후보 화합물은 Cbl-b에 결합된 형광단 표지된 프로브를 대체하는 능력에 의해 입증된 바와 같이, E3 유비퀴틴-단백질 리가제인 Cbl-b에 결합하고 억제하는 능력에 대해 평가되었다.
재료 및 방법
Cbl -b 치환 검정( Cbl -b 억제 검정)
후보 화합물이 공지된 억제제를 대체하여 Cbl-b 활성을 억제하는 능력은 후보 화합물의 존재하에서 Cbl-b와 형광단 표지된 프로브의 상호작용을 모니터링함으로써 측정되었다. 잔기 36-427 및 N-말단에 Avitag를 함유하는 Cbl-b의 절단된 변이체(UniProt 번호 Q13191)를 BirA 비오틴 리가제와 함께 공발현시키고 표준 프로토콜을 사용하여 정제하였다(참조: Dou et al., Nature Structural and Molecular Biology, 8: 982-987, 2013; Avidity LLC).
형광 표지된 억제제 프로브를 합성하고 BODIPY FL로 태그하였다. Cbl-b 치환 검정은 1% DMSO(최종 농도) 중 후보 화합물의 존재하에 1시간 동안 20mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl, 0.01% Triton X-100, 0.01% BSA 및 0.5mM TCEP를 함유하는 검정 완충제에서 0.5nM Cbl-b 또는 0.125nM Cbl-b(최종 농도, 각각 "높음" 및 "낮음"으로 표시됨)를 사전-배양함으로써 10μL의 반응 용적에서 실온에서 384-웰 플레이트에서 수행되었다. 후보 화합물의 존재하에 배양 후, 플레이트를 150nM 형광 표지된 억제제 프로브 및 2nM 스트렙타비딘-테르븀(Cisbio)(최종 농도)으로 구성된 대략적인 EC40 결합 포화의 존재하에 추가로 1시간 동안 배양하였다. 1시간 배양 후, 플레이트를 Envision 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 사용하여 520/620nm에서 TR-FRET 신호에 대해 판독하였다. TR-FRET 신호의 존재는 프로브가 화합물 후보에 의해 Cbl-b로부터 대체되지 않았음을 나타냈다. FRET 신호의 부재는 프로브가 화합물 후보에 의해 Cbl-b로부터 대체되었음을 나타냈다.
결과
Cbl-b 활성 검정에 대해 생성된 데이터를 표준 방법을 사용하여 분석하여 시험된 화합물의 IC50 값을 결정하였다. 표 8-1에서 화합물은 IC50에 대해 다음과 같이 빈에 순위가 매겨졌다: A는 <1nM을 나타내고; B는 1nM 내지 5nM을 나타내며; C는 >5nM을 나타낸다.
[표 8-1]
Figure pct00219
생물학적 실시예 9: Cbl -b 억제제에 의한 T-세포 활성화의 평가
Cbl-b 억제제는 T-세포를 활성화하는 능력에 대해 평가되었다.
재료 및 방법
1차 인간 전체 T-세포 활성화의 정제 및 평가
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 전체 인간 1차 T-세포는 제조자의 프로토콜(Miltenyi Biotec 카탈로그 #130-096-535 (즉, 표면 마커 CD14, CD15, CD16, CD19, CD34, CD36, CD56, CD123 및 CD235a에 대한 항체의 칵테일을 PBMC와 함께 배양한 후, 자기 비드로 샘플을 통과시켜 이러한 표면 마커를 발현하는 세포를 제거한다) 또는 Stemcell Technologies 카탈로그 #17951)에 따라 상업용 키트를 사용하는 음성 선택을 사용하여 PMBC로부터 단리시켜 유세포 계측법에 의해 평가된 바와 같이 >95% CD3+ 세포를 산출하였다. 세포를 37℃ 5% CO2에서 밤새 휴지시켰다. Cbl 억제제를 웰당 1x105 세포에 첨가하고, 플레이트를 최종 DMSO 농도 <0.1%로 표시된 농도(표 9-1)에서 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 배양하였다. 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체(항-CD3/항-CD28)로 자극된 샘플의 경우, 시험된 Cbl-b 억제제의 농도는 1μM 및 0.3μM이었다. 항-CD3 항체 단독(항-CD3)으로 자극된 샘플의 경우, 시험된 Cbl-b 억제제의 농도는 3μM 및 1μM이었다. Cbl-b 억제제와의 배양 후, 1차 인간 전체 T-세포를 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3) 단독 또는 가용성 항-CD28 항체(28.2)(Life Technologies)와 함께 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3)로 자극하였다. 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3)를 포함하는 플레이트를 제조하기 위해, 96-웰 환저 조직 배양 플레이트를 인산염 완충 식염수(PBS)에서 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 10μg/mL로 100μL의 항-CD3 항체(OKT3)로 코팅했다. 플레이트를 PBS로 1회 세척한 후, 가용성 항-CD28 항체(28.2)를 포함하거나 포함하지 않는 세포를 최종 농도 5μg/mL로 각 웰에 첨가하였다. 무세포 상청액을 수거하고 유세포 계측법에 의한 표면 마커 평가를 위해 세포 집단을 염색하기 전에 세포를 48시간 동안 자극하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 ELISA(R&D Systems, Peprotech 또는 Life Technologies) 또는 Luminex 멀티플렉스 키트(Procarta Life Technologies)에 의해 IL-2를 포함한 사이토카인 분비에 대해 상청액을 분석하였다. 세포를 항-CD25 항체(BD Biosciences)로 염색하여 활성화 표면 마커의 수준을 평가하였다.
결과
판독치는 기준선에 대한 배수 변화로 보고되었다. 본 연구의 기준선은 항-CD3 항체 및 가용성 항-CD28 항체로 자극된 전체 인간 T-세포로부터 수득된 측정치였고, 여기서 세포는 Cbl-b 억제제와 함께 배양되지 않았다(표 9-1). 항-CD3/항-CD28로 자극된 T-세포의 경우, IL-2 분비의 기준선에 비해 2.5배 초과의 변화 및 CD25 표면 염색의 기준선에 비해 1.3배 초과의 변화가 유의하고 양성 반응으로 간주되었다. 항-CD3 단독으로 자극된 T-세포의 경우, IL-2 분비의 기준선에 비해 0.1배 초과의 변화 및 CD25 표면 염색의 기준선에 비해 0.6배 초과의 변화가 유의하고 양성 반응으로 간주되었다.
화합물은 다음과 같이 이들의 판독치에 따라 빈에 순위가 매겨겼다: 항-CD3 항체와 항-CD28 항체의 공자극에 의한 IL-2 분비의 경우, 빈은 다음과 같다: C는 < 10배를 나타내고, B는 10 내지 15배를 나타내며, A는 >15배를 나타내고; 항-CD3 항체 자극에 의한 IL-2 분비의 경우, 빈은 다음과 같다: C는 ≤0.330배를 나타내고, B는 0.34 내지 0.66배를 나타내며, A는 >0.66배를 나타내고; 항-CD3 항체와 항-CD28 항체의 공자극에 의한 CD25 염색의 경우, 빈은 다음과 같다: C는 ≤1.24배를 나타내고, B는 1.25 내지 1.39배를 나타내며, A는 >1.39배를 나타내고; 항-CD3 항체 자극에 의한 CD25 염색의 경우, 빈은 다음과 같다: C는 ≤1.04배를 나타내고, B는 1.05 내지 1.14배를 나타내며, A는 >1.14배를 나타낸다.
[표 9-1]
Figure pct00220
Cbl-b 억제제는 항-CD3 항체 단독 또는 항-CD28 항체와의 조합으로 자극된 T-세포에 의해 IL-2 분비를 향상시켰다. T 세포의 표면 상에서 CD25 활성화 마커의 발현은 항-CD3 항체 단독 또는 항-CD28 항체와의 조합으로 자극된 경우 증가되었다. 이러한 결과는 동정된 Cbl-b 억제제가 T-세포를 활성화하는 능력을 가지며, 이러한 활성화가 항-CD28 항체에 의한 공자극을 필요로 하지 않았음을 나타낸다.
생물학적 실시예 10: Cbl -b 억제제의 면역조절 효과의 평가
스크리닝 검정으로부터 동정된 Cbl-b 억제제는 증강된 IL-2 분비 및 CD25 표면 활성화 마커의 발현에 의해 입증된 바와 같이, 시험관내에서 전체 인간 T-세포를 활성화하는 능력을 입증했다.
T-세포에 의한 추가 사이토카인 분비 및 T-세포 상의 표면 활성화 마커의 발현을 평가하기 위해 추가의 시험관내 연구가 수행되었다. T-세포 증식을 증가시키고, T-세포 고갈을 감소시키고, T-세포 아네르기를 감소시키는 Cbl-b 억제제의 능력과 같은, 본원에 기재된 Cbl-b 억제제와 접촉된 T-세포에 대한 추가 면역조절 효과가 평가되었다. 본원에 기재된 것들과 같은 Cbl-b 억제제의 생체내에서 T-세포를 활성화시키는 능력도 또한 평가되었다. B-세포 및 NK-세포를 활성화시키는 Cbl-b 억제제의 능력과 같은 Cbl-b 억제제에 의한 다른 면역조절 효과가 평가되었다.
1차 인간 전체 T-세포 활성화의 정제 및 평가
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 전체 인간 1차 T-세포는 제조자의 프로토콜(Miltenyi Biotec 카탈로그 #130-096-535 (즉, 표면 마커 CD14, CD15, CD16, CD19, CD34, CD36, CD56, CD123 및 CD235a에 대한 항체의 칵테일을 PBMC와 함께 배양한 후, 자기 비드로 샘플을 통과시켜 이러한 표면 마커를 발현하는 세포를 제거한다) 또는 Stemcell Technologies 카탈로그 #17951)에 따라 상업용 키트를 사용하는 음성 선택을 사용하여 PMBC로부터 단리시켜 유세포 계측법에 의해 평가된 바와 같이 >95% CD3+ 세포를 산출하였다. 세포 증식의 측정을 위해, 항-CD3 단독으로 또는 항-CD28 항체와 조합으로의 자극에 의한 활성화 전에 세포를 제조자의 프로토콜에 따라 Cell Trace Violet(Invitrogen)으로 표지하였다. Cbl 억제제를 최종 DMSO 농도 <0.1%로 웰당 1x105 세포로 복수의 농도(예: 10μM, 1.11μM, 또는 0.123μM)에서 첨가되었다. 플레이트를 5% CO2 중에서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. Cbl-b 억제제와의 배양 후, 1차 인간 전체 T-세포를 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3) 단독 또는 가용성 항-CD28 항체(28.2)(Life Technologies)와 함께 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3)로 자극하였다. 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3)를 포함하는 플레이트를 제조하기 위해, 96-웰 환저 조직 배양 플레이트를 인산염 완충 식염수(PBS)에서 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 10μg/mL로 100μL의 항-CD3 항체(OKT3)로 코팅했다. 플레이트를 PBS로 세척한 후, 가용성 항-CD28 항체(28.2)를 포함하거나 포함하지 않는 세포를 최종 농도 5μg/mL로 각 웰에 첨가하였다. 무세포 상청액을 수거하고 유세포 계측법에 의한 표면 마커 평가를 위해 세포 집단을 염색하기 전에 세포를 48시간 동안 자극하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 ELISA(R&D Systems, Peprotech 또는 Life Technologies) 또는 Luminex 멀티플렉스 키트(Procarta Life Technologies)에 의해 사이토카인 분비(예: GM-CSF, IFNγ 및 TNFα)에 대해 상청액을 분석하였다. 세포를 항-CD69(BD Biosciences)로 염색하여 활성화 표면 마커의 수준을 평가하였다. 증식은 유세포 계측법으로 측정하였고, 데이터는 FlowJo v7.6.5 또는 v10으로 분석하였다. 판독치는 기준선에 대한 배수 변화로 보고되었다. 일부 구현예에서, 기준선은 항-CD3 항체 단독으로 자극된 전체 인간 T-세포로부터 수득된 측정치이며, 여기서 세포는 Cbl-b 억제제와 함께 배양되지 않았다. 일부 구현예에서, 기준선은 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 자극된 전체 인간 T-세포로부터 수득된 측정치였으며, 여기서 세포는 Cbl-b 억제제와 함께 배양되지 않았다.
1차 인간 T-세포에 대한 Cbl-b 억제제 효과는 동종 혼합 림프구 반응(MLR)의 맥락에서 또한 평가되었다. 동종 미성숙 수지상 세포는 하기 조건하에서 생성되었다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 단핵구는 제조자의 프로토콜(Stemcells 카탈로그 #17858)에 따라 상업용 키트를 사용하는 양성 선택을 사용하여 PMBC로부터 단리되어 유세포 계측법에 의해 평가된 바와 같이 >95% CD14+ 세포를 산출하였다. 단핵구를 30ng/mL의 재조합 인간 GM-CSF 및 20ng/mL의 재조합 인간 IL-4와 함께 7일 동안 배양하여 미성숙 수지상 세포를 생성하였다. 단핵구 및 T-세포는 말초 혈액으로부터 신선하게 단리되거나 동결된 스톡으로부터 해동되었다. 인간 T-세포를 단리시키고, CFSE로 표지하고, 상기 기재된 바와 같이 억제제와 함께 배양하였다. Cbl-b 억제제를 다중 농도(예: 10μM 또는 1.11μM)에서 최종 DMSO 농도 <0.1%로 웰당 2x103개의 동종 미성숙 수지상 세포와의 공배양물로 1x105 T-세포에 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 5일 동안 배양하였다. T-세포의 증식은 유세포 계측법에 의해 평가되었다.
Cbl-b 억제제는 T-세포로부터 사이토카인(예: GM-CSF, IFNγ 및 TNFα)의 분비 및/또는 T-세포의 활성화를 나타내는 T-세포 상의 세포 표면 마커(예: CD69)의 표면 발현을 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하기 위해 시험되었다. Cbl-b 억제제는 또한 T-세포 증식을 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하기 위해 시험되었다. Cbl-b 억제제는 공자극의 존재하에서 조건이 프라이밍에 차선인 경우 T-세포 활성화에 대한 영향에 대해 시험되었다.
T-세포 고갈의 인간 T-세포 시험관내 모델
T-세포 고갈은 만성 감염 또는 암에 반응하여 T-세포 기능장애를 일으키는 불량한 이펙터 반응 및 억제성 수용체 발현의 지속된 수준을 갖는 세포로 특성화되었다. T-세포 고갈의 시험관내 모델은 동종 및 자가 모델을 포함한다. 자가 모델에서 골수 세포와 SEB(스타필로코컬 에테로톡신 B, Millipore)를 사용하여 항-CD3 자극된 T-세포를 자극하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 단핵구는 제조자의 프로토콜에 따라 CD16 고갈이 없는 StemCells EasySep 인간 단핵구 농축 키트(카탈로그 #19058)를 사용한 음성 선택을 사용하여 상업용 키트로 단리시켰다. 단리된 단핵구는 50ng/mL의 재조합 인간 M-CSF(R&D System 또는 Peprotech)와 함께 완전 배지(예: 첨가제가 없는 RPMI 1640, 10% HI FBS, 1X 글루타민 및 1X β-머캅토에탄올)에서 배양하였다. 세포를 웰당 2x 106 세포로 플레이팅하고(0일째), 5일 동안 배양하고, 2일째에 신선한 배지 및 사이토카인을 공급하였다. 5일째에, IFNγ를 100ng/mL로 첨가하고, 세포를 밤새 배양하였다. 동일한 공여자의 1차 인간 T-세포를 제조자의 프로토콜에 따라 Stemcell Technologies EasySep 인간 T-세포 단리 키트(카탈로그 #17951)를 이용한 음성 선택을 사용하여 상업용 키트를 사용하여 PBMC로부터 단리시켰다. 순도는 CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD19, CD14, CD56 및 CD3(BD Biosciences)에 대한 유세포 계측법에 의한 표면 마커 검출에 의해 확인되었다. 3 x106개 세포/mL T-세포를 10μg/mL의 플레이트-결합 항-CD3 항체(클론 UCHT-1)로 5일 동안 자극하였다. 이것은 골수 세포의 생성과 병행하여 이루어졌다. 6일째에, 웰당 2.5 x 104개의 T-세포, 웰당 12.5 x 103개 골수 세포 및 SEB 항원(0.1μg/mL)을 환저 96-웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 시험 제제(예: Cbl-b 억제제 화합물) 또는 대조군(예: 항-PD1 항체와 같은 체크포인트 중화 항체)을 표시된 농도(예: 10μM)로 웰에 첨가하였다. 세포를 3일 동안 배양하고, 이때 무세포 상청액을 수집하고, ELISA(R&D Systems, Peprotech 또는 Life Technologies) 또는 Luminex 멀티플렉스 키트(Procarta Life Technologies)에 의해 분비된 사이토카인(예: GM-CSF, IFNγ, 및 IL-2)에 대해 평가했다. T-세포를 체크포인트 억제제(예: CTLA4)를 포함하는 표면 마커의 패널에 대해 염색하고, Cbl-b 억제제의 효과에 대해 유세포 계측법으로 평가하였다.
Cbl-b 억제제를 시험하여 골수 세포의 존재하에 고갈된 T-세포로부터 사이토카인(예: GM-CSF, IFNγ, 및 IL-2)의 분비를 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하였고, 이는 T-세포 고갈의 감소를 나타냈다. Cbl-b 억제제는 고갈된 T-세포의 활성화 후 체크포인트 조절 인자 발현 수준에 미치는 영향에 대해서도 시험되었다.
T-세포 아네르기의 인간 T-세포 시험관내 모델
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 전체 인간 1차 T-세포는 제조자의 프로토콜(Miltenyi Biotec 카탈로그 #130-096-535 (즉, 표면 마커 CD14, CD15, CD16, CD19, CD34, CD36, CD56, CD123 및 CD235a에 대한 항체의 칵테일을 PBMC와 함께 배양한 후, 자기 비드로 샘플을 통과시켜 이러한 표면 마커를 발현하는 세포를 제거한다) 또는 Stemcell Technologies 카탈로그 #17951)에 따라 상업용 키트를 사용하는 음성 선택을 사용하여 PMBC로부터 단리시켜 유세포 계측법에 의해 평가된 바와 같이 >95% CD3+ 세포를 산출하였다. 세포를 고정화된 항-CD3 항체(OKT3) 및 가용성 항-CD28 항체(28.2)로 2일 동안 활성화시키고, 이때 세포를 세척하고 자극 부재하에 3일 동안 휴지시켰다. 이어서, 이들은 이오노마이신(Sigma)으로 18 내지 24시간 동안 처리하여 아네르기를 유발하였다. 샘플로부터 이오노마이신을 제거하기 위해 2회 세척한 후, Cbl-b 억제제 화합물을 표시된 농도(예: 10, 1.11 및 0.37μM)로 세포에 첨가하고 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 24시간 동안 재도전하였고, 이때 무세포 상청액을 수집하고, 제조자의 프로토콜에 따라 EISA(R&D Systems 또는 Peprotech) 또는 Luminex 멀티플렉스 키트(Procarta Life Technologies)에 의해 사이토카인(예: IFNγ)에 대해 평가했다.
Cbl-b 억제제는 아네르기 T-세포로부터 사이토카인(예: IFNγ)의 분비를 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하기 위해 시험되었고, 이는 감소된 T-세포 내성을 나타냈다.
Cbl-b 억제제의 생체내 활성
Cbl-b 억제제의 약력학적 프로파일을 결정하는 방법은 C57BL/6 또는 BALB/c 마우스와 같은 적격 면역계를 갖는 마우스의 균주에 Cbl-b 억제제를 투여함으로써 수행되었다. Cbl-b 억제제는 적절한 제형에 용해되었고, 정맥내(IV), 복강내(IP), 피하(SC), 또는 경구(PO)와 같은 다양한 경로 중 하나에 의해 이전의 약동학 및 내약성 연구에 의해 공지된 바와 같이, 적절한 투여량 수준 및 빈도(예: 1일당 2회의 BID 또는 1일당 3회의 TID)로 투여되었다. Cbl-b 억제제의 투여 후, T-세포 및 간접적으로 다른 면역 세포(예: 사이토카인 생산을 통해)를 IV 또는 IP와 같은 경로에 의해 동물당 2μg 또는 10μg과 같은 규정된 양으로 PBS 중의 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여에 의해 생체내에서 자극하였다(참조: Hirsh et al., J. Immunol., 1989; Ferran et al., Eur. J. Immunol., 1990). 추가 연구 대조군 아암은 비히클 제형 단독(즉, Cbl-b 억제제 및 항-CD3 항체를 포함하지 않는 제형), Cbl-b 억제제만을 함유하는 제형, 항-CD3 항체 단독, PBS 단독, 또는 이들 제제의 조합을 함유하는 제형으로 처리된 마우스의 그룹을 포함했다. 이어서, 면역 활성화의 수준을 혈장 사이토카인 수준 및/또는 면역 세포(예: T-세포) 상의 활성화 마커의 발현의 분석에 의해 평가하였다. 혈액 또는 림프 기관(예: 비장)은 규정된 시점(예: 8시간 또는 24시간)에서 수집되었다. 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 사이토카인 수준의 결정을 위한 혈장을 수집하기 위해 혈액 샘플을 처리하였다. 측정된 사이토카인은 IL-2, IFNγ 및 TNFα를 포함하였다. 추가의 혈액 샘플 및 림프 조직은 CD25 및/또는 CD69와 같은 세포 유형 특이적 마커 및 활성화 마커의 발현을 결정하기 위한 표준 방법을 사용하여 면역 세포(예: T-세포)의 유세포 계측 분석을 위해 처리되었다. Cbl-b 억제제 투여에 의한 면역 자극의 증강은 혈장에서 사이토카인의 상대적 농도 또는 적절한 그룹(예: Cbl-b 억제제 및 2㎍의 항-CD3 항체로 처리된 마우스 대 비히클 및 2㎍의 항-CD3 항체로 처리된 마우스) 사이에서 면역 세포 상의 활성화 마커의 발현 수준을 비교하여 평가되었다.
Cbl-b 억제제를 시험하여 항-CD3 항체로 자극된 처리된 마우스로부터 수득된 혈액에서 사이토카인(예: IL-2, IFNγ, 및 TNFα)의 수준을 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하였고, 이는 면역 반응의 조절을 나타냈다. Cbl-b 억제제는 또한 항-CD3 항체로 자극된 처리된 마우스로부터 단리된 T-세포(예: CD25 및/또는 CD69) 상의 세포 표면 마커의 발현을 유도 또는 증강시키는 이들의 능력을 결정하였고, 이는 면역 반응의 조절을 나타냈다.
B-세포 활성화 검정
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 인간 1차 B-세포는 제조자 프로토콜(Stemcell Technologies 카탈로그 #17954)에 따라 상업용 키트를 사용하는 음성 선택을 사용하여 PBMC로부터 단리되어 유세포 계측법으로 평가된 >95% CD20+ 세포를 산출하였다. 1차 인간 B-세포를 96-웰 플레이트에서 웰당 0.7 내지 1 x 105로 10μM 내지 1nM 범위의 투여량으로 Cbl-b 억제제와 함께 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 최종 DMSO 농도 <0.5%로 배양했다. 세포를 항-IgM으로 37℃, 5% CO2에서 20시간 동안 자극하였다. 성숙한 CD20+ IgD+ B-세포 상의 표면 활성화 마커는 항-CD69 항체(BD Biosciences)를 사용하여 FACS에 의해 모니터링되었다.
Cbl-b 억제제는 B-세포의 활성화를 나타내는 B-세포 상의 세포 표면 마커(예: CD69)의 표면 발현을 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하기 위해 시험되었다.
1차 인간 NK -세포의 정제 및 활성화.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 제조사의 프로토콜(Miltenyi Biotec 카탈로그 #130-092-657 또는 Stemcell Technologies 카탈로그 #17955)에 따라 상업용 키트를 사용한 음성 선택을 이용하여 PBMC로부터 전체 인간 1차 NK-세포를 단리시켜 유세포 계측법에 의해 평가된 바와 같이 >92% CD56+, CD3-세포를 산출하였다. 세포를 IL-2(60ng/mL)와 함께 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양하였다. Cbl-b 억제제는 자극 1시간 전에 첨가되며 37℃ 5% CO2에서 특정 농도(예: 10μM, 1μM 또는 0.1μM)에서 최종 DMSO 농도 <0.1%로 배양하였다. NK-세포는 유세포 계측법으로 측정 가능한 적핵(K562 NucRed)을 갖도록 조작된 표적 세포와 공배양하였다. K562 NucRed 세포는 IncuCyte NucLight Red 렌티바이러스 시약(카탈로그 #4476)과 함께 K562 세포를 형질도입함으로써 생산되었고 5일 동안 선택되었다. 클론 집단은 표준 조직 배양 기술을 사용하여 단리 및 확장되었고, 개별 클론은 NK-세포 사멸 검정에서 야생형 K562 세포와의 비교로 검증되었다. 세포를 NK(이펙터 세포)와 K562 NucRed(표적 세포)의 표시된 비율(예: 5:1, 1:1, 1:5)로 6시간 동안 혼합하였다. 무세포 상청액을 수집하고, 제조자의 프로토콜에 따라 ELISA 또는 Luminex 멀티플렉스 키트에 의해 사이토카인 분비(예: TNFα, IFNγ, 또는 MIP1β)에 대해 분석하였다. IFNγ 분비는 R&D Systems ELISA 키트(카탈로그 #DY285)를 사용하여 평가하였고, TNFα 분비는 R&D Systems ELISA 키트(카탈로그 #DY210)를 사용하여 평가하였고, MIP1β 분비는 R&D Systems ELISA 키트(카탈로그 #DY271)를 사용하여 평가했다.
생물학적 실시예 11: 후보 억제제에 의한 Cbl -b 억제의 평가
후보 화합물은 Cbl-b에 결합된 형광단 표지된 프로브를 대체하는 능력에 의해 입증된 바와 같이, E3 유비퀴틴-단백질 리가제인 Cbl-b에 결합하고 억제하는 능력에 대해 평가되었다.
재료 및 방법
Cbl-b 치환 검정(Cbl-b 억제 검정)
후보 화합물이 공지된 억제제를 대체하여 Cbl-b 활성을 억제하는 능력은 후보 화합물의 존재하에서 Cbl-b와 형광단 표지된 프로브의 상호작용을 모니터링함으로써 측정되었다. 잔기 36-427 및 N-말단에 Avitag를 함유하는 Cbl-b의 절단된 변이체(UniProt 번호 Q13191)를 BirA 비오틴 리가제와 함께 공발현시키고 표준 프로토콜을 사용하여 정제하였다(참조: Dou et al., Nature Structural and Molecular Biology, 8: 982-987, 2013; Avidity LLC).
형광 표지된 억제제 프로브를 합성하고 BODIPY FL로 태그하였다. Cbl-b 치환 검정은 1% DMSO(최종 농도) 중 후보 화합물의 존재하에 1시간 동안 20mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl, 0.01% Triton X-100, 0.01% BSA 및 0.5mM TCEP를 함유하는 검정 완충제에서 0.5nM Cbl-b 또는 0.125nM Cbl-b(최종 농도, 각각 "높음" 및 "낮음"으로 표시됨)를 사전-배양함으로써 10μL의 반응 용적에서 실온에서 384-웰 플레이트에서 수행되었다. 후보 화합물의 존재하에 배양 후, 플레이트를 150nM 형광 표지 억제제 프로브 및 2nM 스트렙타비딘-테르븀(Cisbio)(최종 농도)으로 구성된 대략적인 EC40 결합 포화의 존재하에 추가로 1시간 동안 배양하였다. 1시간 배양 후, 플레이트를 Envision 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 사용하여 520/620nm에서 TR-FRET 신호에 대해 판독하였다. TR-FRET 신호의 존재는 프로브가 화합물 후보에 의해 Cbl-b로부터 대체되지 않았음을 나타냈다. FRET 신호의 부재는 프로브가 화합물 후보에 의해 Cbl-b로부터 대체되었음을 나타냈다.
결과
Cbl-b 활성 검정에 대해 생성된 데이터를 표준 방법을 사용하여 분석하여 시험된 화합물의 IC50 값을 결정하였다. 표 11-1에서 화합물은 IC50에 대해 다음과 같이 빈에 순위가 매겨졌다: A는 <1nM을 나타내고; B는 1nM 내지 5nM을 나타내며; C는 >5nM을 나타낸다.
[표 11-1]
Figure pct00221
생물학적 실시예 12: Cbl -b 억제제에 의한 T-세포 활성화의 평가
Cbl-b 억제제는 T-세포를 활성화하는 능력에 대해 평가되었다.
재료 및 방법
1차 인간 전체 T-세포 활성화의 정제 및 평가
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 전체 인간 1차 T-세포는 제조자의 프로토콜(Miltenyi Biotec 카탈로그 #130-096-535 (즉, 표면 마커 CD14, CD15, CD16, CD19, CD34, CD36, CD56, CD123 및 CD235a에 대한 항체의 칵테일을 PBMC와 함께 배양한 후, 자기 비드로 샘플을 통과시켜 이러한 표면 마커를 발현하는 세포를 제거한다) 또는 Stemcell Technologies 카탈로그 #17951)에 따라 상업용 키트를 사용하는 음성 선택을 사용하여 PMBC로부터 단리시켜 유세포 계측법에 의해 평가된 바와 같이 >95% CD3+ 세포를 산출하였다. 세포를 37℃ 5% CO2에서 밤새 휴지시켰다. Cbl 억제제를 웰당 1x105 세포에 첨가하고, 플레이트를 최종 DMSO 농도 <0.1%로 표시된 농도(표 12-1)에서 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 배양하였다. 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체(항-CD3/항-CD28)로 자극된 샘플의 경우, 시험된 Cbl-b 억제제의 농도는 1μM 및 0.3μM이었다. 항-CD3 항체 단독(항-CD3)으로 자극된 샘플의 경우, 시험된 Cbl-b 억제제의 농도는 3μM 및 1μM이었다. Cbl-b 억제제와의 배양 후, 1차 인간 전체 T-세포를 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3) 단독 또는 가용성 항-CD28 항체(28.2)(Life Technologies)와 함께 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3)로 자극하였다. 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3)를 포함하는 플레이트를 제조하기 위해, 96-웰 환저 조직 배양 플레이트를 인산염 완충 식염수(PBS)에서 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 10μg/mL로 100μL의 항-CD3 항체(OKT3)로 코팅했다. 플레이트를 PBS로 1회 세척한 후, 가용성 항-CD28 항체(28.2)를 포함하거나 포함하지 않는 세포를 최종 농도 5μg/mL로 각 웰에 첨가하였다. 무세포 상청액을 수거하고 유세포 계측법에 의한 표면 마커 평가를 위해 세포 집단을 염색하기 전에 세포를 48시간 동안 자극하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 ELISA(R&D Systems, Peprotech 또는 Life Technologies) 또는 Luminex 멀티플렉스 키트(Procarta Life Technologies)에 의해 IL-2를 포함한 사이토카인 분비에 대해 상청액을 분석하였다. 세포를 항-CD25 항체(BD Biosciences)로 염색하여 활성화 표면 마커의 수준을 평가하였다.
결과
판독치는 기준선에 대한 배수 변화로 보고되었다. 본 연구의 기준선은 항-CD3 항체 및 가용성 항-CD28 항체로 자극된 전체 인간 T-세포로부터 수득된 측정치였고, 여기서 세포는 Cbl-b 억제제와 함께 배양되지 않았다(표 12-1). 항-CD3/항-CD28로 자극된 T-세포의 경우, IL-2 분비의 기준선에 비해 2.5배 초과의 변화 및 CD25 표면 염색의 기준선에 비해 1.3배 초과의 변화가 유의하고 양성 반응으로 간주되었다. 항-CD3 단독으로 자극된 T-세포의 경우, IL-2 분비의 기준선에 비해 0.1배 초과의 변화 및 CD25 표면 염색의 기준선에 비해 0.6배 초과의 변화가 유의하고 양성 반응으로 간주되었다.
화합물은 다음과 같이 이들의 판독치에 따라 빈에 순위가 매겨겼다: 항-CD3 항체와 항-CD28 항체의 공자극에 의한 IL-2 분비의 경우, 빈은 다음과 같다: C는 ≤ 10배를 나타내고, B는 11 내지 15배를 나타내며, A는 >15배를 나타내고; 항-CD3 항체 자극에 의한 IL-2 분비의 경우, 빈은 다음과 같다: C는 ≤0.33배를 나타내고, B는 0.34 내지 0.66배를 나타내며, A는 >0.66배를 나타내고; 항-CD3 항체와 항-CD28 항체의 공자극에 의한 CD25 염색의 경우, 빈은 다음과 같다: C는 ≤1.24배를 나타내고, B는 1.25 내지 1.39배를 나타내며, A는 >1.39배를 나타내고; 항-CD3 항체 자극에 의한 CD25 염색의 경우, 빈은 다음과 같다: C는 ≤1.04배를 나타내고, B는 1.05 내지 1.14배를 나타내며, A는 >1.14배를 나타낸다.
[표 12-1]
Figure pct00222
Cbl-b 억제제는 항-CD3 항체 단독 또는 항-CD28 항체와의 조합으로 자극된 T-세포에 의해 IL-2 분비를 향상시켰다. T 세포의 표면 상에서 CD25 활성화 마커의 발현은 항-CD3 항체 단독 또는 항-CD28 항체와의 조합으로 자극된 경우 증가되었다. 이러한 결과는 동정된 Cbl-b 억제제가 T-세포를 활성화하는 능력을 가지며, 이러한 활성화가 항-CD28 항체에 의한 공자극을 필요로 하지 않았음을 나타낸다.
생물학적 실시예 13: Cbl -b 억제제의 면역조절 효과의 평가
스크리닝 검정으로부터 동정된 Cbl-b 억제제는 증강된 IL-2 분비 및 CD25 표면 활성화 마커의 발현에 의해 입증된 바와 같이, 시험관내에서 전체 인간 T-세포를 활성화하는 능력을 입증했다.
T-세포에 의한 추가 사이토카인 분비 및 T-세포 상의 표면 활성화 마커의 발현을 평가하기 위해 추가의 시험관내 연구가 수행되었다. T-세포 증식을 증가시키고, T-세포 고갈을 감소시키고, T-세포 아네르기를 감소시키는 Cbl-b 억제제의 능력과 같은, 본원에 기재된 Cbl-b 억제제와 접촉된 T-세포에 대한 추가 면역조절 효과가 평가되었다. 본원에 기재된 것들과 같은 Cbl-b 억제제의 생체내에서 T-세포를 활성화시키는 능력도 또한 평가되었다. B-세포 및 NK-세포를 활성화시키는 Cbl-b 억제제의 능력과 같은 Cbl-b 억제제에 의한 다른 면역조절 효과가 평가되었다.
1차 인간 전체 T-세포 활성화의 정제 및 평가
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 전체 인간 1차 T-세포는 제조자의 프로토콜(Miltenyi Biotec 카탈로그 #130-096-535 (즉, 표면 마커 CD14, CD15, CD16, CD19, CD34, CD36, CD56, CD123 및 CD235a에 대한 항체의 칵테일을 PBMC와 함께 배양한 후, 자기 비드로 샘플을 통과시켜 이러한 표면 마커를 발현하는 세포를 제거한다) 또는 Stemcell Technologies 카탈로그 #17951)에 따라 상업용 키트를 사용하는 음성 선택을 사용하여 PMBC로부터 단리시켜 유세포 계측법에 의해 평가된 바와 같이 >95% CD3+ 세포를 산출하였다. 세포 증식의 측정을 위해, 항-CD3 단독으로 또는 항-CD28 항체와 조합으로의 자극에 의한 활성화 전에 세포를 제조자의 프로토콜에 따라 Cell Trace Violet(Invitrogen)으로 표지하였다. Cbl 억제제가 최종 DMSO 농도 <0.1%로 복수의 농도(예: 10μM, 1.11μM, 또는 0.123μM)에서 웰당 1x105 세포로 첨가되었다. 플레이트를 5% CO2 중에서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. Cbl-b 억제제와의 배양 후, 1차 인간 전체 T-세포를 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3) 단독 또는 가용성 항-CD28 항체(28.2)(Life Technologies)와 함께 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3)로 자극하였다. 플레이트-결합 항-CD3 항체(OKT3)를 포함하는 플레이트를 제조하기 위해, 96-웰 환저 조직 배양 플레이트를 인산염 완충 식염수(PBS)에서 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 10μg/mL로 100μL의 항-CD3 항체(OKT3)로 코팅했다. 플레이트를 PBS로 세척한 후, 가용성 항-CD28 항체(28.2)를 포함하거나 포함하지 않는 세포를 최종 농도 5μg/mL로 각 웰에 첨가하였다. 무세포 상청액을 수거하고 유세포 계측법에 의한 표면 마커 평가를 위해 세포 집단을 염색하기 전에 세포를 48시간 동안 자극하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 ELISA(R&D Systems, Peprotech 또는 Life Technologies) 또는 Luminex 멀티플렉스 키트(Procarta Life Technologies)에 의해 사이토카인 분비(예: GM-CSF, IFNγ 및 TNFα)에 대해 상청액을 분석하였다. 세포를 항-CD69(BD Biosciences)로 염색하여 활성화 표면 마커의 수준을 평가하였다. 증식은 유세포 계측법으로 측정하였고, 데이터는 FlowJo v7.6.5 또는 v10으로 분석하였다. 판독치는 기준선에 대한 배수 변화로 보고되었다. 일부 구현예에서, 기준선은 항-CD3 항체 단독으로 자극된 전체 인간 T-세포로부터 수득된 측정치이며, 여기서 세포는 Cbl-b 억제제와 함께 배양되지 않았다. 일부 구현예에서, 기준선은 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 자극된 전체 인간 T-세포로부터 수득된 측정치였으며, 여기서 세포는 Cbl-b 억제제와 함께 배양되지 않았다.
1차 인간 T-세포에 대한 Cbl-b 억제제 효과는 동종 혼합 림프구 반응(MLR)의 맥락에서 또한 평가되었다. 동종 미성숙 수지상 세포는 하기 조건하에서 생성되었다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 단핵구는 제조자의 프로토콜(StemCells 카탈로그 #17858)에 따라 상업용 키트를 사용하는 양성 선택을 사용하여 PMBC로부터 단리되어 유세포 계측법에 의해 평가된 바와 같이 >95% CD14+ 세포를 산출하였다. 단핵구를 30ng/mL의 재조합 인간 GM-CSF 및 20ng/mL의 재조합 인간 IL-4와 함께 7일 동안 배양하여 미성숙 수지상 세포를 생성하였다. 단핵구 및 T-세포는 말초 혈액으로부터 신선하게 단리되거나 동결된 스톡으로부터 해동되었다. 인간 T-세포를 단리시키고, CFSE로 표지하고, 상기 기재된 바와 같이 억제제와 함께 배양하였다. Cbl-b 억제제를 다중 농도(예: 10μM 또는 1.11μM)에서 최종 DMSO 농도 <0.1%로 웰당 2x103개의 동종 미성숙 수지상 세포와의 공배양물로 1x105 T-세포에 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 5일 동안 배양하였다. T-세포의 증식은 유세포 계측법에 의해 평가되었다.
Cbl-b 억제제는 T-세포로부터 사이토카인(예: GM-CSF, IFNγ, TNFα)의 분비 및/또는 T-세포의 활성화를 나타내는 T-세포 상의 세포 표면 마커(예: CD69)의 표면 발현을 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하기 위해 시험되었다. Cbl-b 억제제는 또한 T-세포 증식을 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하기 위해 시험되었다. Cbl-b 억제제는 공자극의 존재하에서 조건이 프라이밍에 차선인 경우 T-세포 활성화에 대한 영향에 대해 시험되었다.
T-세포 고갈의 인간 T-세포 시험관내 모델
T-세포 고갈은 만성 감염 또는 암에 반응하여 T-세포 기능장애를 일으키는 불량한 이펙터 반응 및 억제성 수용체 발현의 지속된 수준을 갖는 세포로 특성화되었다. T-세포 고갈의 시험관내 모델은 동종 및 자가 모델을 포함한다. 자가 모델에서 골수 세포와 SEB(스타필로코컬 에테로톡신 B, Millipore)를 사용하여 항-CD3 자극된 T-세포를 자극하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 단핵구는 제조자의 프로토콜에 따라 CD16 고갈이 없는 StemCells EasySep 인간 단핵구 농축 키트(카탈로그 #19058)를 사용한 음성 선택을 사용하여 상업용 키트로 단리시켰다. 단리된 단핵구는 50ng/mL의 재조합 인간 M-CSF(R&D System 또는 Peprotech)와 함께 완전 배지(예: 첨가제가 없는 RPMI 1640, 10% HI FBS, 1X 글루타민 및 1X β-머캅토에탄올)에서 배양하였다. 세포를 웰당 2x 106 세포로 플레이팅하고(0일째), 5일 동안 배양하고, 2일째에 신선한 배지 및 사이토카인을 공급하였다. 5일째에, IFNγ를 100ng/mL로 첨가하고, 세포를 밤새 배양하였다. 동일한 공여자의 1차 인간 T-세포를 제조자의 프로토콜에 따라 Stemcell Technologies EasySep 인간 T-세포 단리 키트(카탈로그 #17951)를 사용한 음성 선택을 사용하여 상업용 키트로 PBMC로부터 단리시켰다. 순도는 CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD19, CD14, CD56 및 CD3(BD Biosciences)에 대한 유세포 계측법에 의한 표면 마커 검출에 의해 확인되었다. 3 x106개 세포/mL T-세포를 10μg/mL의 플레이트-결합 항-CD3 항체(클론 UCHT-1)로 5일 동안 자극하였다. 이것은 골수 세포의 생성과 병행하여 이루어졌다. 6일째에, 웰당 2.5 x 104개의 T-세포, 웰당 12.5 x 103개 골수 세포 및 SEB 항원(0.1μg/mL)을 환저 96-웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 시험 제제(예: Cbl-b 억제제 화합물) 또는 대조군(예: 항-PD1 항체와 같은 체크포인트 중화 항체)을 표시된 농도(예: 10μM)로 웰에 첨가하였다. 세포를 3일 동안 배양하고, 이때 무세포 상청액을 수집하고, ELISA(R&D Systems, Peprotech 또는 Life Technologies) 또는 Luminex 멀티플렉스 키트(Procarta Life Technologies)에 의해 분비된 사이토카인(예: GM-CSF, IFNγ, 및 IL-2)에 대해 평가했다. T-세포를 체크포인트 억제제(예: CTLA4)를 포함하는 표면 마커의 패널에 대해 염색하고, Cbl-b 억제제의 효과에 대해 유세포 계측법으로 평가하였다.
Cbl-b 억제제를 시험하여 골수 세포의 존재하에 고갈된 T-세포로부터 사이토카인(예: GM-CSF, IFNγ, 및 IL-2)의 분비를 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하였고, 이는 T-세포 고갈의 감소를 나타냈다. Cbl-b 억제제는 고갈된 T-세포의 활성화 후 체크포인트 조절 인자 발현 수준에 미치는 영향에 대해서도 시험되었다.
T-세포 아네르기의 인간 T-세포 시험관내 모델
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 전체 인간 1차 T-세포는 제조자의 프로토콜(Miltenyi Biotec 카탈로그 #130-096-535 (즉, 표면 마커 CD14, CD15, CD16, CD19, CD34, CD36, CD56, CD123 및 CD235a에 대한 항체의 칵테일을 PBMC와 함께 배양한 후, 자기 비드로 샘플을 통과시켜 이러한 표면 마커를 발현하는 세포를 제거한다) 또는 Stemcell Technologies 카탈로그 #17951)에 따라 상업용 키트를 사용하는 음성 선택을 사용하여 PMBC로부터 단리시켜 유세포 계측법에 의해 평가된 바와 같이 >95% CD3+ 세포를 산출하였다. 세포를 고정화된 항-CD3 항체(OKT3) 및 가용성 항-CD28 항체(28.2)로 2일 동안 활성화시키고, 이때 세포를 세척하고 자극 부재하에 3일 동안 휴지시켰다. 이어서, 이들은 이오노마이신(Sigma)으로 18 내지 24시간 동안 처리하여 아네르기를 유발하였다. 샘플로부터 이오노마이신을 제거하기 위해 2회 세척한 후, Cbl-b 억제제 화합물을 표시된 농도(예: 10, 1.11 및 0.37μM)로 세포에 첨가하고 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 24시간 동안 재도전하였고, 이때 무세포 상청액을 수집하고, 제조자의 프로토콜에 따라 EISA(R&D Systems 또는 Peprotech) 또는 Luminex 멀티플렉스 키트(Procarta Life Technologies)에 의해 사이토카인(예: IFNγ)에 대해 평가했다.
Cbl-b 억제제는 아네르기 T-세포로부터 사이토카인(예: IFNγ)의 분비를 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하기 위해 시험되었고, 이는 감소된 T-세포 내성을 나타냈다.
Cbl-b 억제제의 생체내 활성
Cbl-b 억제제의 약력학적 프로파일을 결정하는 방법은 C57BL/6 또는 BALB/c 마우스와 같은 적격 면역계를 갖는 마우스의 균주에 Cbl-b 억제제를 투여함으로써 수행되었다. Cbl-b 억제제는 적절한 제형에 용해되며, 정맥내(IV), 복강내(IP), 피하(SC), 또는 경구(PO)와 같은 다양한 경로 중 하나에 의해 이전의 약동학 및 내약성 연구에 의해 공지된 바와 같이, 적절한 투여량 수준 및 빈도(예: 1일당 2회의 BID 또는 1일당 3회의 TID)로 투여되었다. Cbl-b 억제제의 투여 후, T-세포 및 간접적으로 다른 면역 세포(예: 사이토카인 생산을 통해)를 IV 또는 IP와 같은 경로에 의해 동물당 2μg 또는 10μg과 같은 규정된 양으로 PBS 중의 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여로 생체내에서 자극하였다(참조: Hirsh et al., J. Immunol., 1989; Ferran et al., Eur. J. Immunol., 1990). 추가 연구 대조군 아암은 비히클 제형 단독(즉, Cbl-b 억제제 및 항-CD3 항체를 포함하지 않는 제형), Cbl-b 억제제만을 함유하는 제형, 항-CD3 항체 단독, PBS 단독, 또는 이들 제제의 조합을 함유하는 제형으로 처리된 마우스의 그룹을 포함했다. 이어서, 면역 활성화의 수준을 혈장 사이토카인 수준 및/또는 면역 세포(예: T-세포) 상의 활성화 마커의 발현의 분석에 의해 평가하였다. 혈액 또는 림프 기관(예: 비장)은 규정된 시점(예: 8시간 또는 24시간)에서 수집되었다. 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 사이토카인 수준의 결정을 위한 혈장을 수집하기 위해 혈액 샘플을 처리하였다. 측정된 사이토카인은 IL-2, IFNγ 및 TNFα를 포함하였다. 추가의 혈액 샘플 및 림프 조직은 CD25 및/또는 CD69와 같은 세포 유형 특이적 마커 및 활성화 마커의 발현을 결정하기 위한 표준 방법을 사용하여 면역 세포(예: T-세포)의 유세포 계측 분석을 위해 처리되었다. Cbl-b 억제제 투여에 의한 면역 자극의 증강은 혈장에서 사이토카인의 상대적 농도 또는 적절한 그룹(예: Cbl-b 억제제 및 2㎍의 항-CD3 항체로 처리된 마우스 대 비히클 및 2㎍의 항-CD3 항체로 처리된 마우스) 사이에서 면역 세포 상의 활성화 마커의 발현 수준을 비교하여 평가되었다.
Cbl-b 억제제를 시험하여 항-CD3 항체로 자극된 처리된 마우스로부터 수득된 혈액에서 사이토카인(예: IL-2, IFNγ, 및 TNFα)의 수준을 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하였고, 이는 면역 반응의 조절을 나타냈다. Cbl-b 억제제는 또한 항-CD3 항체로 자극된 처리된 마우스로부터 단리된 T-세포 상의 세포 표면 마커(예: CD25 및/또는 CD69)의 발현을 유도 또는 증강시키는 이들의 능력을 결정하였고, 이는 면역 반응의 조절을 나타냈다.
B-세포 활성화 검정
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 인간 1차 B-세포는 제조자 프로토콜(Stemcell Technologies 카탈로그 #17954)에 따라 상업용 키트를 사용하는 음성 선택을 사용하여 PBMC로부터 단리되어 유세포 계측법으로 평가된 >95% CD20+ 세포를 산출하였다. 1차 인간 B-세포를 96-웰 플레이트에서 웰당 0.7 내지 1 x 105로 10μM 내지 1nM 범위의 투여량으로 Cbl-b 억제제와 함께 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 최종 DMSO 농도 <0.5%로 배양했다. 세포를 항-IgM으로 37℃, 5% CO2에서 20시간 동안 자극하였다. 성숙한 CD20+ IgD+ B-세포 상의 표면 활성화 마커는 항-CD69 항체(BD Biosciences)를 사용하여 FACS에 의해 모니터링되었다.
Cbl-b 억제제는 B-세포의 활성화를 나타내는 B-세포(예: CD69) 상의 세포 표면 마커의 표면 발현을 유도 또는 증강시키는 능력을 결정하기 위해 시험되었다.
1차 인간 NK -세포의 정제 및 활성화.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 1) 건강한 인간 공여자의 버피 코트로부터 말초 혈액 조혈 세포를 분리하기 위해 Ficoll-Paque™(GE Healthcare)를 사용하거나; 또는 2) LeukoPak 공여로부터 직접 수득되었다. 제조사의 프로토콜(Miltenyi Biotec 카탈로그 #130-092-657 또는 Stemcell Technologies 카탈로그 #17955)에 따라 상업용 키트를 사용한 음성 선택을 이용하여 PBMC로부터 전체 인간 1차 NK-세포를 단리시켜 유세포 계측법에 의해 평가된 바와 같이 >92% CD56+, CD3-세포를 산출하였다. 세포를 IL-2(60ng/mL)와 함께 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양하였다. Cbl-b 억제제는 자극 1시간 전에 첨가되며 37℃ 5% CO2에서 특정 농도(예: 10μM, 1μM 또는 0.1μM)에서 최종 DMSO 농도 <0.1%로 배양하였다. NK-세포는 유세포 계측법으로 측정 가능한 적핵(K562 NucRed)을 갖도록 조작된 표적 세포와 공배양하였다. K562 NucRed 세포는 IncuCyte NucLight Red 렌티바이러스 시약(카탈로그 #4476)과 함께 K562 세포를 형질도입함으로써 생산되었고 5일 동안 선택되었다. 클론 집단은 표준 조직 배양 기술을 사용하여 단리 및 확장되었고, 개별 클론은 NK-세포 사멸 검정에서 야생형 K562 세포와의 비교로 검증되었다. 세포를 NK(이펙터 세포)와 K562 NucRed(표적 세포)의 표시된 비율(예: 5:1, 1:1, 1:5)로 6시간 동안 혼합하였다. 무세포 상청액을 수집하고, 제조자의 프로토콜에 따라 ELISA 또는 Luminex 멀티플렉스 키트에 의해 사이토카인 분비(예: TNFα, IFNγ, 또는 MIP1β)에 대해 분석하였다. IFNγ 분비는 R&D Systems ELISA 키트(카탈로그 #DY285)를 사용하여 평가하였고, TNFα 분비는 R&D Systems ELISA 키트(카탈로그 #DY210)를 사용하여 평가하였고, MIP1β 분비는 R&D Systems ELISA 키트(카탈로그 #DY271)를 사용하여 평가했다.
생물학적 실시예 14: 암 치료를 위한 종양 용해성 바이러스와 조합된 Cbl -b 억제제의 평가
종양 용해성 바이러스는 암 세포를 우선적으로 감염시키고 사멸시키고 숙주의 항종양 면역 반응을 자극한다. 이 실시예는 마우스의 암을 치료하기 위한 종양 용해성 바이러스 및 Cbl-b 억제제를 포함하는 병용 요법의 평가를 기재한다.
재료 및 방법
간단히 말해서, 병용 요법은 동계 MC-38 세포 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스에서 시험되었다. MC-38 세포는 디메틸하이드라진의 피하 주사에 의해 유도된 뮤린 선암에서 유래되었다(참조: Cameron et al., J Exp Med, 171:249-263, 1990). MC-38 세포를 피하 또는 복강내로 주사하였다. 종양은 약 5 내지 7일 동안 성장하도록 허용되었고, 그 시점에서 동물을 무작위화하고, 치료를 개시하였다.
백시니아 바이러스와 같은 종양 용해성 바이러스는 약 108 내지 109 플라그 형성 단위의 투여량으로 복강내 투여되었다(참조: Puhlmann et al., Cancer Gene Therapy, 7:66-73,2000). Cbl-b 억제제는 적절한 제형에 용해되었고, 이전의 약동학 및 내약성 연구에 의해 공지된 바와 같이 적절한 투여량 수준 및 빈도로 투여되었다. 초기 연구에서, 적절한 비히클 중의 Cbl-b 억제제 또는 비히클만을 0일째(=MC-38 주입 후 5 내지 7일)부터 시작하여 1일 2회(BID) 180mg/kg의 투여량으로 경구 투여했다(PO). 추가의 연구에서, Cbl-b 억제제 제형을 경구(PO) 또는 비경구(예: IV, IP, SC, 또는 종양당 1 내지 3개의 주사 부위에 종양내) 투여하였다. 병용 요법(Cbl-b 억제제 제형 + 종양 용해성 바이러스)을 투여받은 마우스의 시험군에 더하여, 이 연구에는 비히클 제형 + DPBS, Cbl-b 억제제 제형 + DPBS, 또는 비히클 제형 + 종양 용해성 바이러스를 투여받은 마우스의 대조군이 포함되었다.
반응의 수준은 종양 성장을 측정하고 시험 마우스 대 대조군 마우스의 종양 성장을 비교함으로써 평가되었다. 또한, 면역 활성화의 수준은 종양 침윤성 림프구(TIL)의 분석을 위해 종양을 수집하여 평가되었다. 추가 실험에서, PBMC 또는 비장 세포도 수집하였다. TIL 및 임의로 다른 림프구 샘플을 표준 방법을 사용하여 유세포 계측 분석을 위해 처리하여 항원 특이성, 세포 유형 특이적 마커의 발현, 및 그란자임 B, CD25, CD69, PD-1 및 LAG3과 같은 활성화 마커의 발현을 결정했다. 병용 요법에 의한 항종양 면역 반응의 증강은 종양내 면역 세포 집단의 상대적 백분율, 및 시험군 및 연구군 마우스에서 면역 세포 상의 활성화 마커 발현의 상대적 수준을 비교하여 평가되었다.
생물학적 실시예 15: 백신 조합의 평가
재료 및 방법
0일째(D0)에, 마우스의 오른쪽 옆구리에 50,000개 TC-1 세포/마우스를 피하 이식하였다. 13일 후(D13), 종양 측정치가 약 50 내지 100mm3이 되었을 때, 적절한 그룹의 마우스(그룹당 15마리의 마우스)에 HPV16 백신을 주사하였다(s.c, 총 2회 투여량, D13 및 20일째(D20)). 화합물 23을 0.5% 메틸셀룰로스, 0.2% 폴리소르베이트 80으로 재구성하고, D13 내지 47일(D47)까지 지시된 투여량으로 경구 투여하였다. 백신을 투여받은 마우스 그룹은 또한 경구 비히클(0.5% 메틸셀룰로스, 0.2% 폴리소르베이트 80)을 투여받았다. IACUC 가이드라인에 따라, 종양이 1500 내지 2000mm3를 초과할 때, 마우스를 안락사시켰다. 로그 순위(Mantel-Cox) 테스트를 사용하여 GraphPad Prism을 사용하여 생존율을 비교했다. ** = 61일째 치료 대 비히클 + 백신 대조군의 p<0.001.
TC-1 세포는 인간 유두종 바이러스 균주 16(HPV16) 초기 단백질 6 및 7(E6 및 E7) 및 활성화된 h-ras 암유전자에 의한 마우스 폐 상피 세포의 안정한 형질감염에 의해 유도되었다. 세포는 Dr.T-C Wu(존스 홉킨스 대학)에서 수득되었다. (참조: Lin KY, Guarnieri FG, Staveley-O'Carroll KF, Levitsky HI, August JT, Pardoll DM, et al. Treatment of established tumors with a novel vaccine that enhances major histocompatibility class II presentation of tumor antigen. Cancer Res 1996;56:21-6).
HPV16 백신은 다음과 같이 제조되었다: HPV16E749-57의 CTL 에피토프(9개 아미노산 (aa) 펩티드, RAHYNIVTF, 100㎍/마우스, 서열번호 2)를 합성 T 헬퍼 에피토프 PADRE(13 aa 펩티드, aK-Cha-VAAWTLKAAa, 서열번호 3, 여기서 "a"는 D-알라닌이고, Cha는 L-사이클로헥실알라닌이고, 20㎍/마우스) 및 QuilA 애주번트(20㎍/마우스)와 혼합하였다.
결과
화합물 23의 항종양 치료 반응을 평가하기 위해, TC-1 동계 마우스 모델을 사용하였다. 이 모델은 불량하게 면역원성이고, 이펙터 CD8+ T 세포 면역 반응을 생성하기 위해 백신접종이 필요하다(참조: Cancer Immunol Res. 2017 Sep; 5(9):755-766). HPV16 예방접종은 E7 종양 항원에 대한 CD8+ T 세포 반응을 생성한다. 도 a와 b는 생존 및 종양 성장에 대한 화합물 23과 조합된 백신의 효과를 보여준다. 백신 단독은 마우스의 종양 성장 및 생존에 최소한의 영향을 미쳤지만(도 1 및 2), 백신과 조합된 화합물 23은 종양 진행의 상당한 감속을 초래하고(도 2), 생존 기간의 연장과 관련되었다(도 1). 이러한 결과는 화합물 23이 백신에 의해 유도된 E7-특이적 CD8+ T-세포 반응을 유의하게 개선시켜 종양 보유 마우스의 항종양 반응 및 생존 기간의 연장을 초래한다는 것을 입증한다.
생물학적 실시예 16: 단일 제제 암 요법
재료 및 방법
마우스의 양 옆구리 모두에 100,000개의 결장 암종 CT26 종양 세포를 이식하였다. 8일 후(D8), 종양이 약 50mm3로 측정되었을 때, 적절한 그룹로부터의 마우스(그룹당 12마리의 마우스)를 화합물 23(30mg/kg) 또는 비히클 대조군으로 경구(PO) 처리하였다. 치료는 28일째(D28)까지 매일 계속되었다. 화합물 23을 0.5% 메틸셀룰로스, 0.2% 폴리소르베이트 80으로 재구성하였다. 마우스 그룹에 경구 비히클(0.5% 메틸셀룰로스, 0.2% 폴리소르베이트 80)을 투여하였다. 종양 성장 억제(TGI)는 다음과 같이 계산되었다: (1-(약물 처리군의 중앙값 종양 용적/비히클 처리군의 중앙값 종양 용적)) x 100. 비히클 및 화합물 23 곡선은 2원 ANOVA 본페로니의 다중 비교 시험을 사용하는 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 비교되었다.
화합물 23의 항종양 치료 반응을 평가하기 위해, CT26 동계 마우스 모델을 사용하였다. 도 3 및 4는 CT26 종양 성장에 대한 화합물 23의 효과를 나타내며, 여기서 개별 종양의 종양 용적이 도시되어 있다(양쪽 옆구리 모두로부터의 종양 용적이 포함되었다). 이러한 결과는 화합물 23이 비히클 대조군에 비해 확립된 종양의 성장을 유의하게 억제한다(TGI 68%)는 것을 입증한다.
식별 인용에 의해 본원에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원, 및 공개된 특허 출원의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
전술한 개시내용의 측면이 이해의 명확성을 위해 예시 및 예로서 일부 상세히 기재되었지만, 특정 변경 및 변형이 실시될 것이라는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 설명 및 실시예는 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

Claims (255)

  1. 화학식 I의 화합물 또는 이의 호변이성체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    화학식 I
    Figure pct00223

    상기 화학식 I에서,
    Figure pct00224
    는
    Figure pct00225
    또는
    Figure pct00226
    이고;
    Z1은 CH 또는 질소이고;
    Z2는 CH 또는 질소이고;
    R1은 -CF3 또는 사이클로프로필이고;
    R2는 -CF3 또는 사이클로프로필이고;
    R3은 수소, C1-C2 알킬, 또는 C1-C2 할로알킬이고;
    R4는 수소, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 4원 내지 8원 헤테로사이클릴, 또는 C3-C6 사이클로알킬이고,
    여기서 상기 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬 그룹은 임의로 1 내지 5개의 R6 그룹으로 치환되고; 또는
    R3 및 R4는 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 각각 임의로 1 내지 5개의 R6 그룹으로 치환되는 C3-C5 사이클로알킬 또는 4원 내지 6원 헤테로사이클릴을 형성하고;
    R5는 수소, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, 또는 C3-C6 사이클로알킬이고;
    각각의 R6은 독립적으로 C1-C6 알킬, 할로, 하이드록시, -O(C1-C6 알킬), -CN, C1-C6 알킬-CN, C1-C6 알킬-OH, 또는 C1-C6 할로알킬이고; 또는
    동일한 탄소 원자에 부착된 2개의 R6 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 C3-C6 사이클로알킬 또는 스피로 4원 내지 6원 헤테로사이클릴을 형성하고;
    X는 수소, C1-C6 알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알킬-OH, C1-C6 알킬-CN, 1-5개의 R8 그룹으로 임의로 치환된 C3-C6 사이클로알킬, 또는
    Figure pct00227
    이고;
    Figure pct00228
    는 4원 내지 7원 헤테로사이클릴 또는 5원 내지 8원 헤테로아릴이고, 여기서 각각의 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴은 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 내지 2개의 추가 헤테로원자를 임의로 함유하고, 각각의 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴은 임의로 1 내지 5개의 R8 그룹으로 치환되고;
    각각의 R7은 독립적으로 수소, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-OH, 또는 C1-C6 할로알킬이고; 또는
    2개의 R7 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 C3-C5 사이클로알킬 또는 3원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성하고;
    각각의 R8은 독립적으로 할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알킬-CN, C1-C6 알킬-OH, C1-C6 할로알킬, -CN, 옥소, 또는 -O(C1-C6 알킬)이고; 또는
    2개의 R8 그룹은 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 또는 융합된(fused) C3-C5 사이클로알킬 또는 3원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성한다.
  2. 제1항에 있어서,
    Figure pct00229
    이
    Figure pct00230
    인, 화합물.
  3. 제2항에 있어서, Z1이 CH인, 화합물.
  4. 제3항에 있어서,
    Figure pct00231
    가
    Figure pct00232
    또는
    Figure pct00233
    인, 화합물.
  5. 제2항에 있어서, Z1이 N인, 화합물.
  6. 제5항에 있어서,
    Figure pct00234
    가
    Figure pct00235
    또는
    Figure pct00236
    인, 화합물.
  7. 제1항에 있어서,
    Figure pct00237
    가
    Figure pct00238
    인, 화합물.
  8. 제7항에 있어서, Z2가 CH인, 화합물.
  9. 제8항에 있어서,
    Figure pct00239
    가
    Figure pct00240
    또는
    Figure pct00241
    인, 화합물.
  10. 제7항에 있어서, Z2가 N인, 화합물.
  11. 제10항에 있어서,
    Figure pct00242
    가
    Figure pct00243
    또는
    Figure pct00244
    인, 화합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3이 수소, C1-C2 알킬, 또는 C1-C2 할로알킬이고;
    R4가 수소, C1-C3 알킬, C1-C3 할로알킬, 4원 내지 6원 헤테로사이클릴, 또는 C4-C5 사이클로알킬이고,
    여기서, 상기 헤테로사이클릴 또는 사이클로알킬 그룹은 임의로 1 내지 3개의 R6 그룹으로 치환되고; 또는
    R3과 R4가 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 각각 임의로 1 내지 3개의 R6 그룹으로 치환된 C4-C5 사이클로알킬 또는 4원 내지 6원 헤테로사이클릴을 형성하는, 화합물.
  13. 제12항에 있어서,
    R3이 수소, -CH3 또는 -CF3이고;
    R4가 수소, -CH3, -CF3, 사이클로부틸, 또는
    Figure pct00245
    이고; 또는
    R3 및 R4가 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 각각 임의로 1 내지 3개의 R6 그룹으로 치환된
    Figure pct00246
    또는
    Figure pct00247
    을 형성하는, 화합물.
  14. 제13항에 있어서, R3 및 R4가 이들이 부착된 탄소 원자와 함께
    Figure pct00248
    을 형성하는, 화합물.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 R6이 독립적으로 C1-C3 알킬, 할로, 하이드록시, -O(C1-C3 알킬), -CN, C1-C3 알킬-CN, C1-C3 알킬-OH, 또는 C1-C3 할로알킬이고; 또는
    동일한 탄소 원자에 부착된 2개의 R6 그룹이 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 C3-C6 사이클로알킬 또는 스피로 4원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성하는, 화합물.
  16. 제15항에 있어서,
    각각의 R6이 독립적으로 -CH3, 플루오로, 하이드록시, -OCH3, -CN, -CH2CN, -CH2OH, 또는 -CF3이고; 또는
    동일한 탄소 원자에 부착된 2개의 R6 그룹이 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 스피로 사이클로프로필을 형성하는, 화합물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, R5가 수소, C1-C3 알킬, C1-C3 할로알킬, 또는 C3-C4 사이클로알킬인, 화합물.
  18. 제17항에 있어서, R5가 수소, -CH3, -CHF2, 또는 사이클로프로필인, 화합물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    X가 수소, C1-C3 알킬, C1-C3 할로알킬, C1-C3 알킬-OH, C1-C3 알킬-CN, 또는 임의로 1 내지 3개의 R8 그룹으로 치환된 C3-C5 사이클로알킬인, 화합물.
  20. 제19항에 있어서, X가 수소 또는 -CH3인, 화합물.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, X가
    Figure pct00249
    인, 화합물.
  22. 제21항에 있어서,
    Figure pct00250
    가 4원 내지 6원 헤테로사이클릴 또는 5원 내지 6원 헤테로아릴이며, 여기서, 각각의 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴은 질소, 산소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 내지 2개의 추가 헤테로원자를 임의로 함유하며, 각각의 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴은 임의로 1 내지 5개의 R8 그룹으로 치환되는, 화합물.
  23. 제22항에 있어서,
    Figure pct00251
    가 4원 내지 5원 헤테로사이클릴 또는 5원 내지 6원 헤테로아릴이며, 여기서, 각각의 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴은 질소 및 산소로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개의 추가 헤테로원자를 임의로 함유하며, 각각의 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴은 임의로 1 내지 5개의 R8 그룹으로 치환되는, 화합물.
  24. 제21항 또는 제22항에 있어서, X가
    Figure pct00252
    인, 화합물.
  25. 제24항에 있어서, Y가 산소인, 화합물.
  26. 제24항에 있어서, Y가 -CH2-, -CHR8-, 또는 -C(R8)2-인, 화합물.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 R7이 독립적으로 수소, C1-C3 알킬, C1-C3 알킬-OH, 또는 C1-C3 할로알킬이고; 또는
    2개의 R7 그룹이 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 C3-C5 사이클로알킬 또는 3원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성하는, 화합물.
  28. 제27항에 있어서,
    각각의 R7이 독립적으로 수소, -CH3, -CH2OH, 또는 -CF3이고; 또는
    2개의 R7 그룹이 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 사이클로프로필 또는 옥세타닐을 형성하는, 화합물.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 R8이 독립적으로 할로, C1-C3 알킬, C1-C3 알킬-CN, C1-C3 알킬-OH, C1-C3 할로알킬, -CN, 옥소, 또는 -O(C1-C3 알킬)이고; 또는
    2개의 R8 그룹이 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 또는 융합된 C3-C5 사이클로알킬 또는 스피로 또는 융합된 3원 내지 5원 헤테로사이클릴을 형성하는, 화합물.
  30. 제29항에 있어서,
    각각의 R8이 독립적으로 플루오로, -CH3, -CH2CH3, -CH2CN, -CH2OH, -CF3, -CN, 옥소 또는 -OCH3이고; 또는
    2개의 R8 그룹이 이들이 부착된 탄소 원자 또는 원자들과 함께 스피로 또는 융합된 사이클로프로필 또는 옥세타닐을 형성하는, 화합물.
  31. 표 1의 화합물로부터 선택된 화합물, 또는 이의 호변이성체(tautomer), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  33. 면역 세포의 활성을 조절하는 방법으로서, 상기 방법이 면역 세포를 유효량의 Cbl-b 억제제와 접촉시켜 면역 세포의 활성을 조절하는 단계를 포함하고, 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 면역 세포가 T-세포, B-세포, 또는 자연 살해(NK) 세포를 포함하는, 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 면역 세포가 포유류 대상체(mammalian subject)의 혈액 샘플로부터 단리되었거나 단리되는, 방법.
  36. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 면역 세포가 암을 갖는 포유류 대상체의 종양으로부터 단리되었거나 단리되는 종양 침윤성 림프구(TIL)인, 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 T-세포를 포함하고, 상기 T-세포의 조절 활성이 증가된 T-세포 활성화, 증가된 T-세포 증식, 감소된 T-세포 고갈 및 감소된 T-세포 내성 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 증가된 T-세포 활성화가 사이토카인의 생산 증가를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 사이토카인이 IL-2, IFN-γ, TNFα 및 GM-CSF로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 방법.
  40. 제37항 또는 제38항에 있어서, T-세포 활성화의 증가가 하나 이상의 T-세포 활성화 마커(activation marker)의 세포 표면 발현의 증가를 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 T-세포 활성화 마커가 CD25, CD69 및 CTLA4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 방법.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T-세포가 단독으로 또는 항-CD28 항체와 조합하여 항-CD3 항체와 접촉되었거나 접촉되는, 방법.
  43. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포를 IL-2 단독으로 또는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체와 조합하여 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  44. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 NK-세포를 포함하고, NK-세포의 조절 활성이 증가된 NK-세포 활성화를 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, NK-세포 활성화의 증가가 사이토카인의 생산 증가를 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 사이토카인이 IFN-γ, TNFα 및 MIP1β로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 방법.
  47. 제33항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 B-세포를 포함하고, B-세포의 조절 활성이 증가된 B-세포 활성화를 포함하고, 임의로 증가된 B-세포 활성화가 CD69의 증가된 발현을 포함하는, 방법.
  48. 제33항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 인간 면역 세포인, 방법.
  49. 제33항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 재조합 키메라 수용체(recombinant chimeric receptor)를 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 재조합 키메라 수용체가 키메라 항원 수용체인, 방법.
  51. 변형된 면역 세포의 생산 방법으로서, 유효량의 Cbl-b 억제제의 존재하에 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 배양하여 면역 세포의 활성을 조절하고, 이에 의해 변형된 면역 세포를 생산하는 단계를 포함하고, 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 면역 세포를 항-CD3 항체와 단독으로 또는 항-CD28 항체와 조합하여 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 면역 세포를 IL-2와 단독으로 또는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체와 조합하여 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 면역 세포를 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 포유류 대상체의 혈액 샘플로부터 단리되었거나 단리되고, 또는 상기 면역 세포가 암을 갖는 포유류 대상체의 종양으로부터 단리되었거나 단리된 종양 침윤성 림프구(TIL)인, 방법.
  56. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 조혈 세포, 다능성 줄기세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, T-세포, B-세포 및 NK-세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포인, 방법.
  57. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 면역 세포가 조혈 세포, 다능성 줄기 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, T-세포, B-세포 및 NK-세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포인, 방법.
  58. 제51항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 종양 침윤성 림프구(TIL)인, 방법.
  59. 제51항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 인간 면역 세포인, 방법.
  60. 제51항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포 또는 변형된 면역 세포가 재조합 키메라 수용체를 포함하는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 재조합 키메라 수용체가 키메라 항원 수용체인, 방법.
  62. 제51항 내지 제61항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산되는 변형된 면역 세포.
  63. Cbl-b 억제제를 포함하는 변형된 면역 세포로서, 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 변형된 면역 세포.
  64. 단리된 변형된 면역 세포로서, 상기 면역 세포가 Cbl-b 억제제와 접촉되었거나 접촉되고, 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 단리된 변형된 면역 세포.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 면역 세포가 포유류 대상체의 혈액 샘플로부터 단리되었거나 단리되고, 또는 상기 면역 세포가 암을 갖는 포유류 대상체의 종양으로부터 단리되었거나 단리되는 종양 침윤성 림프구(TIL)인, 변형된 면역 세포.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 면역 세포가 Cbl-b 억제제와 접촉되기 전에 상기 면역 세포가 암을 갖는 포유류 대상체의 종양으로부터 단리된 종양 침윤성 림프구(TIL)인, 변형된 면역 세포.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 면역 세포가 T-세포이고, 상기 T-세포가 T-세포 활성화의 증가, T-세포 증식의 증가, T-세포 고갈의 감소 및 T-세포 내성의 감소 중 하나 이상을 나타내는, 변형된 면역 세포.
  68. 제67항에 있어서, T-세포 활성화의 증가가 사이토카인의 생산 증가를 포함하는, 변형된 면역 세포.
  69. 제68항에 있어서, 상기 사이토카인이 IL-2, IFN-γ, TNFα, 및 GM-CSF로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 변형된 면역 세포.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, T-세포 활성화의 증가가 하나 이상의 T-세포 활성화 마커의 세포 표면 발현의 증가를 포함하는, 변형된 면역 세포.
  71. 제70항에 있어서, 상기 T-세포 활성화 마커가 CD25, CD69 및 CTLA4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 변형된 면역 세포.
  72. 제67항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T-세포가 단독으로 또는 항-CD28 항체와 조합하여 항-CD3 항체와 접촉되었거나 접촉되는, 변형된 면역 세포.
  73. 제67항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T-세포가 단독으로 또는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체와 조합하여 IL-2와 접촉되었거나 접촉되는, 변형된 면역 세포.
  74. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 면역 세포가 NK-세포이고, 상기 NK-세포가 증가된 NK-세포 활성화를 나타내는, 변형된 면역 세포.
  75. 제74항에 있어서, NK-세포 활성화의 증가가 사이토카인의 생산 증가를 포함하는, 변형된 면역 세포.
  76. 제75항에 있어서, 상기 사이토카인이 IFN-γ, TNFα 및 MIP1β로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 변형된 면역 세포.
  77. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 면역 세포가 B-세포이고, 상기 B-세포가 증가된 B-세포 활성화를 나타내며, 임의로, 증가된 B-세포 활성화가 CD69의 발현 증가를 포함하는, 변형된 면역 세포.
  78. 제64항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 면역 세포가 인간 면역 세포인, 변형된 면역 세포.
  79. 제64항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 면역 세포가 재조합 키메라 수용체를 포함하는, 변형된 면역 세포.
  80. 제79항에 있어서, 상기 재조합 키메라 수용체가 키메라 항원 수용체인, 변형된 면역 세포.
  81. 제62항 내지 제80항 중 어느 한 항에 따른 변형된 면역 세포를 함유하는 세포 집단을 포함하는 조성물.
  82. 제81항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
  83. 제81항에 있어서, 상기 조성물이 배양 베쎌(culture vessel) 내에 있는, 조성물.
  84. 제83항에 있어서, 상기 배양 베쎌이 튜브, 접시, 백(bag), 멀티웰 플레이트(multiwell plate) 또는 플라스크인, 조성물.
  85. 제81항 또는 제82항에 있어서, 상기 조성물이 적합한 용기(container) 내에 있는, 조성물.
  86. 제85항에 있어서, 상기 적합한 용기가 병, 바이알(vial), 주사기, 정맥내 백 또는 튜브인, 조성물.
  87. 면역 반응을 조절하는 방법으로서, 상기 방법이 제62항 내지 제80항 중 어느 한 항에 따른 변형된 면역 세포의 유효량 또는 제81항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체(individual)에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 개체가 암을 갖는, 방법.
  89. Cbl-b 활성의 억제에 반응하는 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 제62항 내지 제80항 중 어느 한 항에 따른 변형된 면역 세포의 유효량 또는 제81항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 유효량을 Cbl-b 활성의 억제에 반응성인 암을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 암이 혈액암(hematologic cancer)인, 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 혈액암이 림프종(lymphoma), 백혈병(leukemia) 또는 골수종(myeloma)인, 방법.
  92. 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 암이 비혈액암(non-hematologic cancer)인, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 비혈액암이 육종(sarcoma), 암종(carcinoma) 또는 흑색종(melanoma)인, 방법.
  94. 비정상적인 세포 증식을 억제하는 방법으로서, 상기 방법이 제62항 내지 제80항 중 어느 한 항에 따른 변형된 면역 세포의 유효량 또는 제81항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 비정상적인 세포 증식이 과형성(hyperplasia) 또는 암 세포 증식인, 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 암 세포가 혈액암으로부터 유래되는, 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 혈액암이 림프종, 백혈병 또는 골수종인, 방법.
  98. 제95항에 있어서, 상기 암 세포가 비혈액암으로부터 유래되는, 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 비혈액암이 육종, 암종 또는 흑색종인, 방법.
  100. 면역 반응을 조절하는 방법으로서, 상기 방법이 Cbl-b 억제제의 유효량을 개체에게 투여하여 개체의 면역 반응을 조절하는 단계를 포함하고, 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 방법.
  101. Cbl-b 활성을 억제하는 방법으로서, 상기 방법이 유효량의 Cbl-b 억제제를 개체에게 투여하여 개체의 Cbl-b 활성을 억제하는 단계를 포함하고, 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 방법.
  102. Cbl-b 활성의 억제에 반응성인 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 유효량의 Cbl-b 억제제를 개체에게 투여하여 Cbl-b 활성의 억제에 반응성인 암을 치료하는 단계를 포함하고, 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 방법.
  103. 제102항에 있어서, 상기 암이 혈액암이고, 임의로 상기 혈액암이 림프종, 백혈병 또는 골수종인, 방법.
  104. 제102항에 있어서, 상기 암이 비혈액암이고, 임의로 상기 비혈액암이 육종, 암종 또는 흑색종인, 방법.
  105. 제100항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl-b 억제제가 장 투여에 의해 투여되고, 임의로 상기 장 투여가 경구 투여인, 방법.
  106. 제100항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl-b 억제제가 비경구 투여에 의해 투여되고, 임의로 상기 비경구 투여가 종양내 투여인, 방법.
  107. 제102항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 제62항 내지 제80항 중 어느 한 항에 따른 변형된 면역 세포의 유효량 또는 제81항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 유효량을 개체에게 투여하여 암을 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  108. 비정상적인 세포 증식을 억제하는 방법으로서, 상기 방법이 유효량의 Cbl-b 억제제를 개체에게 투여하여 개체의 비정상적인 세포 증식을 억제하는 단계를 포함하고, 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 방법.
  109. 제108항에 있어서, 상기 비정상적인 세포 증식이 과형성 또는 암 세포 증식인, 방법.
  110. 제109항에 있어서, 상기 암 세포가 혈액암으로부터 유래되고, 임의로 상기 혈액암이 림프종, 백혈병, 또는 골수종인, 방법.
  111. 제109항에 있어서, 상기 암 세포가 비혈액암으로부터 유래되고, 임의로 상기 비혈액암이 육종, 암종 또는 흑색종인, 방법.
  112. 제108항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl-b 억제제가 장 투여(enteral administration)에 의해 투여되고, 임의로 상기 장 투여가 경구 투여인, 방법.
  113. 제108항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl-b 억제제가 비경구 투여에 의해 투여되고, 임의로 상기 비경구 투여가 종양내 주사이거나 상기 비경구 투여가 정맥내, 복강내 및 피하로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로에 의한 것인, 방법.
  114. 제100항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 Cbl-b 억제제의 투여 후에 T-세포 활성화의 증가, T-세포 증식의 증가, T-세포 고갈의 감소, 및 T-세포 내성의 감소 중 하나 이상을 갖는, 방법.
  115. 제114항에 있어서, T-세포 활성화의 증가는 사이토카인의 생산 증가를 포함하는, 방법.
  116. 제115항에 있어서, 상기 사이토카인이 IL-2, IFN-γ, TNFα, 및 GM-CSF로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 방법.
  117. 제114항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, T-세포 활성화의 증가가 하나 이상의 T-세포 활성화 마커의 세포 표면 발현의 증가를 포함하는, 방법.
  118. 제117항에 있어서, 상기 T-세포 활성화 마커가 CD25, CD69 및 CTLA4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 방법.
  119. 제100항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 Cbl-b 억제제의 투여 후 NK-세포 활성화의 증가를 갖는, 방법.
  120. 제119항에 있어서, NK-세포 활성화의 증가가 사이토카인의 생산 증가를 포함하는, 방법.
  121. 제120항에 있어서, 상기 사이토카인이 IFN-γ, TNFα 및 MIP1β로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 방법.
  122. 제100항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 Cbl-b 억제제의 투여 후 증가된 B-세포 활성화를 갖고, 임의로 증가된 B-세포 활성화가 CD69의 발현 증가를 포함하는, 방법.
  123. 면역 세포 및 Cbl-b 억제제를 함유하는 세포 집단(cell population)을 포함하는 세포 배양 조성물로서, 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물 인, 세포 배양 조성물.
  124. 제123항에 있어서, 상기 면역 세포가 조혈 세포, 다능성 줄기 세포, 골수 전구 세포, 림프 전구 세포, T-세포, B-세포 및 NK-세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포인, 세포 배양 조성물.
  125. 제123항 또는 제124항에 있어서, 항-CD3 항체를 단독으로 또는 항-CD28 항체와 조합하여 추가로 포함하는 세포 배양 조성물.
  126. 제123항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 재조합 키메라 수용체를 포함하는 조작된(engineered) 면역 세포인, 세포 배양 조성물.
  127. 제126항에 있어서, 상기 재조합 키메라 수용체가 키메라 항원 수용체인, 세포 배양 조성물.
  128. Cbl-b 억제제 및 보조제 및 항원 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 약제학적 조성물.
  129. 제128항에 있어서, 상기 항원이 암 항원인, 약제학적 조성물.
  130. 제62항 내지 제80항 중 어느 한 항에 따른 변형된 면역 세포, 제81항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 제123항 내지 제127항 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 조성물, 또는 제32항에 따른 약제학적 조성물을 포함하는 제조 물품(article of manufacture).
  131. 제130항에 있어서, 상기 변형된 면역 세포 또는 세포 배양 조성물이 튜브, 접시, 백, 멀티웰 플레이트 또는 플라스크 내에 있는, 제조 물품.
  132. 제130항에 있어서, 상기 변형된 면역 세포 또는 약제학적 조성물이 병, 바이알, 주사기, 정맥내 백 또는 튜브에 있는, 제조 물품.
  133. 제62항 내지 제80항 중 어느 한 항에 따른 변형된 면역 세포 또는 제81항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 키트(kit).
  134. 제133항에 있어서, 상기 변형된 면역 세포가 튜브, 접시, 백, 멀티웰 플레이트 또는 플라스크 내에 있는, 키트.
  135. 제133항에 있어서, 상기 변형된 면역 세포가 병, 바이알, 주사기, 정맥내 백 또는 튜브에 있는, 키트.
  136. 제133항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트가 제87항 내지 제99항 중 어느 한 항의 방법에 따라 변형된 면역 세포 또는 조성물을 개체에게 투여하기 위한 설명서(instruction)를 포함하는, 키트.
  137. 제32항의 약제학적 조성물을 포함하는 키트.
  138. 제137항에 있어서, 상기 키트가 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항의 방법에 따라 약제학적 조성물을 개체에게 투여하기 위한 설명서를 포함하는, 키트.
  139. 제123항 내지 제127항 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 조성물을 포함하는 키트.
  140. 제139항에 있어서, 상기 키트가 제51항 내지 제61항 중 어느 한 항의 방법에 따라 변형된 면역 세포를 생산하기 위한 설명서를 포함하는, 키트.
  141. Cbl-b 활성과 관련된 질환 또는 상태(condition)를 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 Cbl-b 억제제를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 방법.
  142. Cbl-b 활성과 관련된 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서 Cbl-b 억제제의 용도로서, 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 용도.
  143. 암을 치료하기 위한 약제의 제조에서 Cbl-b 억제제의 용도로서, 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 용도.
  144. Cbl-b 활성과 관련된 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 Cbl-b 억제제로서, 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, Cbl-b 억제제.
  145. 암 치료에 사용하기 위한 Cbl-b 억제제로서, 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, Cbl-b 억제제.
  146. 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이
    암을 갖는 개체에게 유효량의 Cbl-b 억제제를 투여하는 단계로서, 여기서 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 단계, 및
    상기 개체에게 유효량의 추가의 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  147. 제146항에 있어서, 상기 Cbl-b 억제제 및 상기 추가의 치료제가 임의의 순서로 연속적으로 투여되는, 방법.
  148. 제146항에 있어서, 상기 Cbl-b 억제제 및 상기 추가의 치료제가 동시에 투여되는, 방법.
  149. 제146항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가의 치료제가 면역 체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 포함하는, 방법.
  150. 제149항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 PD-1(CD279), PD-L1(CD274), CTLA-4(CD125), LAG3(CD223), PVR(CD155), PVRL2(CD112), PVRL3(CD113), TIGIT, TIM3(CD366) 및 VISTA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 억제성 체크포인트 분자의 길항제인, 방법.
  151. 제149항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 PD-1(CD279), PD-L1(CD274) 및 CTLA-4(CD152)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 억제성 체크포인트 분자의 길항제인, 방법.
  152. 제151항에 있어서, 상기 적어도 하나의 억제성 체크포인트 분자가 PD-1을 포함하고, 임의로 상기 면역 체크포인트 억제제가 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 세미플리맙 및 이들의 바이오시밀러(biosimilar)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  153. 제151항에 있어서, 상기 적어도 하나의 억제성 체크포인트 분자가 PD-L1을 포함하고, 임의로 상기 면역 체크포인트 억제제가 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙, 및 이들의 바이오시밀러로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  154. 제151항에 있어서, 상기 적어도 하나의 억제성 체크포인트 분자가 CTLA-4를 포함하고, 임의로 상기 면역 체크포인트 억제제가 이필리무맙, 트레멜리무맙 및 이들의 바이오시밀러로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  155. 제149항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 억제제가 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 임의로 상기 항체 또는 단편이 인간 또는 인간화되는, 방법.
  156. 제146항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가의 치료제가 항종양제를 포함하는, 방법.
  157. 제156항에 있어서, 상기 항종양제가 세포독성 항생제, 식물 알칼로이드, 항대사물질, 알킬화제 및 기타 항종양제로 이루어진 그룹 중 하나로서 분류되는, 방법.
  158. 제157항에 있어서, 상기 항종양제가 세포독성 항생제를 포함하고, 임의로 상기 세포독성 항생제가 익사베필론, 미토마이신, 플리카마이신, 블레오마이신, 픽산트론, 암루비신, 발루비신, 피라루비신, 미토크산트론, 이다루비신, 조루비신, 아클라루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 독소루비신, 및 닥티노마이신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  159. 제157항에 있어서, 상기 항종양제가 식물 알칼로이드를 포함하고, 임의로 상기 식물 알칼로이드가 트라벡테딘, 카바지탁셀, 파클리탁셀 폴리글루멕스, 도세탁셀, 파클리탁셀, 데메콜신, 테니포사이드, 에토포사이드, 빈타폴리드, 빈플루닌, 비노렐빈, 빈데신, 빈크리스틴 및 빈블라스틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  160. 제157항에 있어서, 상기 항종양제가 항대사물질(antimetabolite)을 포함하고, 임의로 상기 항대사물질이 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 또는 엽산 유사체이고, 임의로 상기 항대사물질이 플록수리딘, 트리플루리딘, 테가푸르, 플루오로우라실, 데시타빈, 아자시티딘, 카페시타빈, 겜시타빈, 카모푸르, 테가푸르, 플루오로우라실, 시타라빈, 넬라라빈, 클로파라빈, 플루다라빈, 클라드리빈, 티오구아닌, 머캅토퓨린, 프랄라트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드 및 메토트렉세이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  161. 제157항에 있어서, 상기 항종양제가 알킬화제를 포함하고, 임의로 상기 알킬화제가 다카바진, 테모졸로미드, 피포브로만, 미토브로니톨, 에토글루시드, 우라실 머스타드, 라니무스틴, 니무스틴, 포테무스틴, 스트렙토조신, 세무스틴, 로무스틴, 카무스틴, 카보쿠온, 트리아지쿠온, 티오테파, 만노설판, 트레오설판, 부설판, 벤다무스틴, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 이포스파미드, 메클로레타민, 멜팔란, 클로람부실, 및 사이클로포스파미드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  162. 제157항에 있어서, 상기 항종양제가 백금 화합물, 단백질 키나제 억제제 및 다른 약제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다른 항종양제를 포함하는, 방법.
  163. 제162항에 있어서, 상기 항종양제가 백금 화합물을 포함하고, 임의로 상기 백금 화합물이 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 사트라플라틴 및 폴리플라틸렌으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  164. 제162항에 있어서, 상기 항종양제가 단백질 키나제 억제제를 포함하는, 방법.
  165. 제162항에 있어서, 상기 항종양제가 다른 제제를 포함하는, 방법.
  166. 제146항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 방사선 요법을 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  167. 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이
    암을 갖는 개체에게 유효량의 Cbl-b 억제제를 투여하는 단계로서, 여기서 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 단계, 및
    상기 개체에게 유효량의 방사선 요법을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  168. 제166항 또는 제167항에 있어서, 상기 방사선 요법이 외부 빔(beam) 방사선 요법인, 방법.
  169. 제166항 또는 제167항에 있어서, 상기 방사선 요법이 내부 방사선 요법인, 방법.
  170. 제146항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl-b 억제제가 장 투여에 의해 투여되고, 임의로 상기 장 투여가 경구 투여인, 방법.
  171. 제146항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cbl-b 억제제가 비경구 투여에 의해 투여되고, 임의로 상기 비경구 투여가 종양내 주사이거나, 상기 비경구 투여가 정맥내, 복강내 및 피하로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로에 의한 것인, 방법.
  172. 제146항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 혈액암인, 방법.
  173. 제172항에 있어서, 상기 혈액암이 림프종, 백혈병 또는 골수종인, 방법.
  174. 제146항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 비혈액암인, 방법.
  175. 제174항에 있어서, 상기 비혈액암이 암종, 육종 또는 흑색종인, 방법.
  176. 종양 침윤성 림프구(TIL)의 확대된 집단을 생산하는 방법으로서, 상기 방법이
    (a) 제146항 내지 제175항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 처리된 개체로부터 TIL을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계, 및
    (b) 적어도 하나의 T-세포 성장 인자를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL을 배양하여 TIL의 확대된 집단을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  177. 제176항에 있어서, 적어도 하나 이상의 T-세포 성장 인자가 IL-2를 포함하는, 방법.
  178. 제176항 또는 제177항에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 항-CD3 항체, 또는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 둘 모두를 추가로 포함하는, 방법.
  179. 제176항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 Cbl-b 억제제를 추가로 포함하는, 방법.
  180. 제176항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 조사된 피더 세포(irradiated feeder cell)를 추가로 포함하는, 방법.
  181. 제146항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 인간 환자인, 방법.
  182. 제176항 내지 제181항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 TIL의 확대된 집단 및 생리학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 조성물.
  183. 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 암을 갖는 개체에게 제182항에 따른 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  184. 제183항에 있어서, 유효량의 Cbl-b 억제제를 개체에게 계속 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  185. 종양 침윤성 림프구(TIL)의 확대된 집단을 생산하는 방법으로서, 상기 방법이
    (a) 유효량의 Cbl-b 억제제가 투여되었거나 투여되고 있는 암을 갖는 개체로부터 TIL을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계로서, 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 단계; 및
    (b) 적어도 하나의 T-세포 성장 인자를 포함하는 세포 배양 배지에서 TIL을 배양하여 TIL의 확대된 집단을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  186. 제185항에 있어서, 상기 적어도 하나의 T-세포 성장 인자가 IL-2를 포함하는, 방법.
  187. 제185항 또는 제186항에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 항-CD3 항체, 또는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 둘 모두를 추가로 포함하는, 방법.
  188. 제185항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 Cbl-b 억제제를 추가로 포함하는, 방법.
  189. 제185항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 비혈액암이고, 임의로 상기 비혈액암이 육종, 암종 또는 흑색종인, 방법.
  190. 제185항 내지 제189항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 인간 환자인, 방법.
  191. 제185항 내지 제190항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 TIL의 확대된 집단 및 생리학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 조성물.
  192. 암을 치료하는 방법으로서, 암을 갖는 개체에게 제191항의 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  193. 제192항에 있어서, 유효량의 Cbl-b 억제제를 계속 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  194. 면역화 방법으로서, 상기 방법이
    이를 필요로 하는 개체에게 유효량의 소분자 Cbl-b 억제제를 투여하는 단계, 및
    유효량의 백신을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  195. 제194항에 있어서, 상기 면역화가
    암을 갖는 환자에게 유효량의 소분자 Cbl-b 억제제를 투여하는 단계, 및
    유효량의 치료용 암 백신을 상기 개인에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법인, 방법.
  196. 제195항에 있어서, 상기 Cbl-b 억제제 및 상기 암 백신이 연속적으로 투여되는, 방법.
  197. 제195항에 있어서, 상기 Cbl-b 억제제 및 상기 암 백신이 동시에 투여되는, 방법.
  198. 제195항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 백신이 적어도 하나의 종양 항원 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물인, 방법.
  199. 제198항에 있어서, 상기 적어도 하나의 종양 항원이 적어도 하나의 합성 펩티드 또는 재조합 단백질을 포함하는, 방법.
  200. 제198항 또는 제199항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 애쥬번트(adjuvant)를 추가로 포함하는, 방법.
  201. 제200항에 있어서, 상기 애쥬번트가 알루미늄 염, 스쿠알렌 및 사포닌으로 이루어진 그룹의 하나 이상의 성분을 포함하는, 방법.
  202. 제198항 또는 제199항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 항원 제시 세포(antigen presenting cell; APC)를 추가로 포함하고, 임의로 상기 APC가 수지상 세포이고, 임의로 상기 암 백신이 PROVENGE인, 방법.
  203. 제195항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 백신이 미생물 벡터(vector)를 포함하고, 임의로 상기 미생물 벡터가 TICE-BCG인, 방법.
  204. 제203항에 있어서, 상기 미생물 벡터가 재조합 바이러스 벡터 또는 재조합 박테리아 벡터인, 방법.
  205. 제195항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 백신이 사멸된 암 세포 또는 암 세포 용해물을 포함하는, 방법.
  206. 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이
    암을 갖는 개체에게 유효량의 소분자 Cbl-b 억제제를 투여하는 단계, 및
    유효량의 종양 용해성 바이러스를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  207. 제206항에 있어서, 상기 Cbl-b 억제제 및 상기 종양 용해성 바이러스가 연속적으로 투여되는, 방법.
  208. 제206항에 있어서, 상기 Cbl-b 억제제 및 상기 종양 용해성 바이러스가 동시에 투여되는, 방법.
  209. 제206항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스가 아데노바이러스, 콕사키 바이러스, 에코바이러스, 계두 바이러스, 단순 포진 바이러스, 마라바 바이러스, 홍역 바이러스, 점액종 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 파보바이러스, 폴리오바이러스, 레트로바이러스, 레오바이러스, 세네카 밸리 바이러스, 세밀리키 포레스트 바이러스, 백시니아 바이러스 및 소포성 구내염 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 바이러스인, 방법.
  210. 제206항 내지 제209항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스가 적어도 하나의 바이러스 유전자의 기능적 결실 및 적어도 하나의 도입유전자(transgene)의 삽입 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 재조합 바이러스인, 방법.
  211. 제210항에 있어서, 상기 재조합 바이러스가 적어도 하나의 바이러스 유전자의 기능적 결실 및 적어도 하나의 도입유전자의 삽입을 포함하는, 방법.
  212. 제210항 또는 제211항에 있어서, 상기 도입유전자가 인간 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 인코딩(encoding)하는, 방법.
  213. 제206항 내지 제210항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스가 유전자도입 혈청형 5 아데노바이러스인, 방법.
  214. 제206항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스가 유전자도입 단순 포진 바이러스 유형-1(HSV-1)이고, 임의로 상기 유전자도입 HSV-1이 탈리모겐 라헤르파렙벡(talimogene laherparepvec)인, 방법.
  215. 제206항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스가 유전자도입 백시니아 바이러스(vaccinia virus)이고, 임의로 상기 유전자도입 백시니아 바이러스가 펙사스티모겐 데바시렙벡인, 방법.
  216. 제206항 내지 제210항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스가 비재조합 종양 용해성 바이러스이고, 임의로 상기 비재조합 종양 용해성 바이러스가 에코바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 파보바이러스, 레오바이러스 및 세네카 밸리 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 바이러스인, 방법.
  217. 제195항 내지 제216항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 혈액암인, 방법.
  218. 제217항에 있어서, 상기 혈액암이 림프종, 백혈병 또는 골수종인, 방법.
  219. 제217항에 있어서, 상기 암이 비혈액암인, 방법.
  220. 제219항에 있어서, 상기 비혈액암이 암종, 육종 또는 흑색종인, 방법.
  221. 제194항 내지 제220항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소분자 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 방법.
  222. 제194항 내지 제221항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소분자 Cbl-b 억제제가 표 1의 화합물로부터 선택된 화합물, 또는 이의 호변이성체, 이의 입체이성체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 방법.
  223. 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이
    암을 갖는 개체에게 면역 세포의 활성화 임계치를 낮출 수 있는 제제의 유효량을 투여하는 단계, 및
    유효량의 치료용 암 백신을 상기 개체에게 투여하는 단계; 또는
    유효량의 종양 용해성 바이러스를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  224. 제223항에 있어서, 상기 제제가 면역 세포의 공자극 요건(costimulation requirement)을 추가로 감소시킬 수 있는, 방법.
  225. 제223항 또는 제224항에 있어서, 상기 제제가 종양 면역 감시를 추가로 촉진할 수 있는, 방법.
  226. 제223항 내지 제225항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 소분자, Cbl-b 억제제인, 방법.
  227. 암 백신 및 소분자 Cbl-b 억제제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 임의로 상기 조성물이 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  228. 암을 치료하기 위한 키트로서, 상기 키트가
    (a) 소분자 Cbl-b 억제제;
    (b) 치료용 암 백신;
    (c) 개체에서 암을 치료하기 위해 유효량의 Cbl-b 억제제 및 치료용 암 백신의 투여를 위한 설명서를 포함하는, 키트.
  229. 암을 치료하기 위한 키트로서, 상기 키트가
    (a) 소분자 Cbl-b 억제제 및 치료용 암 백신을 포함하는 약제학적 조성물; 및
    (b) 개체에서 암을 치료하기 위해 Cbl-b 억제제 및 치료용 암 백신을 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 투여하기 위한 설명서를 포함하는, 키트.
  230. 제223항 내지 제229항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 백신이 적어도 하나의 종양 항원 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  231. 제230항에 있어서, 상기 적어도 하나의 종양 항원이 적어도 하나의 합성 펩티드 또는 재조합 단백질을 포함하는, 방법, 조성물, 또는 키트.
  232. 제230항 또는 제231항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 애쥬번트를 추가로 포함하는, 방법, 조성물, 또는 키트.
  233. 제232항에 있어서, 상기 애쥬번트가 알루미늄 염, 스쿠알렌 및 사포닌으로 이루어진 그룹의 하나 이상의 성분을 포함하는, 방법, 조성물, 또는 키트.
  234. 제230항 또는 제231항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 항원 제시 세포(APC)를 추가로 포함하고, 임의로 상기 APC가 수지상 세포이고, 임의로 상기 암 백신이 PROVENGE인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  235. 제230항에 있어서, 상기 암 백신이 미생물 벡터를 포함하고, 임의로 상기 미생물 벡터가 TICE-BCG인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  236. 제235항에 있어서, 상기 미생물 벡터가 재조합 바이러스 벡터 또는 재조합 박테리아 벡터인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  237. 제223항 내지 제230항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 백신이 사멸된 암 세포 또는 암 세포 용해물을 포함하는, 방법, 조성물, 또는 키트.
  238. 종양 용해성 바이러스 및 소분자 Cbl-b 억제제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 임의로 상기 조성물이 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  239. 암을 치료하기 위한 키트로서, 상기 키트가
    (a) 소분자 Cbl-b 억제제;
    (b) 종양 용해성 바이러스;
    (c) 개체에서 암을 치료하기 위한 Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스의 유효량을 투여하기 위한 설명서를 포함하는, 키트.
  240. 암을 치료하기 위한 키트로서, 상기 키트가
    (a) 소분자 Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물; 및
    (b) 개체의 암을 치료하기 위한 소분자 Cbl-b 억제제 및 종양 용해성 바이러스를 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 투여하기 위한 설명서를 포함하는, 키트.
  241. 제223항 내지 제226항 또는 제238항 내지 제240항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스가 아데노바이러스, 콕사키 바이러스, 에코바이러스, 계두 바이러스, 단순 포진 바이러스, 마라바 바이러스, 홍역 바이러스, 점액종 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 파보바이러스, 폴리오바이러스, 레트로바이러스, 레오바이러스, 세네카 밸리 바이러스, 세밀리키 포레스트 바이러스, 백시니아 바이러스 및 소포성 구내염 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 바이러스인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  242. 제223항 내지 제226항 또는 제238항 내지 제240항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스가 적어도 하나의 바이러스 유전자의 기능적 결실 및 적어도 하나의 도입유전자의 삽입 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 재조합 바이러스인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  243. 제242항에 있어서, 상기 재조합 바이러스가 적어도 하나의 바이러스 유전자의 기능적 결실 및 적어도 하나의 도입유전자의 삽입을 포함하는, 방법, 조성물, 또는 키트.
  244. 제242항 또는 제243항에 있어서, 상기 도입유전자가 인간 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 인코딩하는, 방법, 조성물, 또는 키트.
  245. 제223항 내지 제226항 또는 제238항 내지 제242항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스가 유전자도입 혈청형 5 아데노바이러스인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  246. 제223항 내지 제226항 또는 제238항 내지 제244항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스가 유전자도입 단순 포진 바이러스 유형-1(HSV-1)이고, 임의로 상기 유전자도입 HSV-1이 탈리모겐 라헤르파렙벡인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  247. 제223항 내지 제226항 또는 제238항 내지 제244항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스가 유전자도입 백시니아 바이러스이고, 임의로 유전자도입 백시니아 바이러스가 펙사스티모겐 데바시렙벡인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  248. 제223항 내지 제226항 또는 제238항 내지 제244항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 용해성 바이러스가 비재조합 종양 용해성 바이러스이고, 임의로 상기 비재조합 종양 용해성 바이러스가 에코바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 파보바이러스, 레오바이러스 및 세네카 밸리 바이러스(Seneca Valley virus)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 바이러스인, 방법.
  249. 제223항 내지 제248항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 혈액암인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  250. 제249항에 있어서, 상기 혈액암이 림프종, 백혈병 또는 골수종인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  251. 제223항 내지 제248항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 비혈액암인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  252. 제251항에 있어서, 상기 비혈액암이 암종, 육종 또는 흑색종인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  253. 제223항 내지 제252항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소분자 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  254. 제223항 내지 제253항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소분자 Cbl-b 억제제가 표 1의 화합물로부터 선택된 화합물, 또는 이의 호변이성체, 이의 입체이성체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 방법, 조성물, 또는 키트.
  255. 이를 필요로 하는 대상체에서 세포 요법을 통해 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이
    질환을 치료하기 위해 하나 이상의 치료 세포의 유효량을 개체에게 투여하는 단계; 및
    유효량의 Cbl-b 억제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 Cbl-b 억제제가 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 화합물이며, 상기 치료 세포에 의한 치료가 Cbl-b 억제제와의 조합에 의해 증강되는, 방법.

KR1020227001977A 2019-06-26 2020-06-26 Cbl-b 억제를 위한 치환된 벤질-트리아졸 화합물, 및 이의 추가의 용도 KR20220026581A (ko)

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