KR20220006013A - 보체 경로 억제제를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

보체 경로 억제제를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 Download PDF

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KR20220006013A
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Abstract

CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 CD59 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질을 제공한다. 또한, CD59 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질을 제공한다. 상기 단백질은 보체 관련 경로를 효율적으로 조절할 수 있다. 따라서, 상기 융합단백질 이량체는 안질환, 특히 황반 변성의 치료 및 예방에 효과적으로 활용할 수 있어 산업적 활용 가능성이 높다.

Description

보체 경로 억제제를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도{FUSION PROTEIN COMPRISING COMPLEMENT PATHWAY INHIBITOR AND USE THEREOF}
보체 경로 억제 단백질을 포함하는 융합단백질 및 이를 이용한 안질환, 구체적으로 황반 변성 치료용 조성물에 관한 것이다.
황반 변성은 브루크막, 맥락막, 신경 망막 및/또는 망막 색소 상피의 이상과 관련된 중앙 시력의 상실을 특징으로 하는 질병을 의미한다. 망막의 중심에 직경이 약 1/3 내지 1/2 cm인 황반이 존재한다. 망막 아래에, 섬유 조직 내에 묻힌 혈관의 집합체인 맥락막, 및 맥락막층 위에 색소 상피(PE)가 존재한다. 이때, 맥락막 혈관은 망막에 영양을 제공한다. 맥락막 및 PE는 눈의 전방에서 발견된다.
황반 변성 중 하나인 노인성 황반 변성(AMD)은 시야의 중앙부에서 시각의 진행성 상실, 색 식별력의 변화, 및 비정상적인 암 순응 및 민감도와 연관된 질환이다. AMD는 크게 건성 또는 습성 AMD로 구분된다. 건성 AMD는 읽기, 운전 또는 안면 인식과 같은 활동에 사용되는 미세 시력을 위해 요구되는 중앙 망막 또는 황반의 위축성 세포 사멸과 연관된다. 상기 건성 AMD 환자의 약 10-20%는 습성 AMD로서 알려진 AMD의 제2형으로 진행한다.
두 형태의 발병에서 가장 유의한 위험 인자는 연령 및 망막 색소 상피 뒤에서 비정상적인 세포외 침착물인 결정체(drusen)의 침착이다. 결정체는 AMD와 관련된 특징적인 침착물이다. 상기 결정체는 보체 활성화제, 억제제, 활성화-특이적 보체 단편, 및 말단 경로 인자, 예를 들어 세포막 공격 복합체(MAC 또는 C5b-9)를 포함한다고 알려져 있다. 뿐만 아니라, 습성 AMD는 맥락막 혈관신생(CNV)과 연관되어 있다. 새로운 맥락막 혈관 형성의 발병기전은 거의 알려지지 않았지만, 염증, 허혈, 및 혈관신생 인자의 국소 생산과 같은 요소가 중요한 것으로 생각된다.
한편, 보체계는 미생물 감염에 대한 선천 면역의 중대한 성분이고, 정상적으로 혈청 내에 비활성 상태로 존재하는 단백질의 집단을 포함한다. 상기 단백질은 전통적인 경로, 렉틴 경로 및 대체 경로를 통해 활성화된다. 미생물 표면의 분자는 상기 경로를 활성화시켜 C3-전환효소로 알려진 프로테아제 복합체의 형성시킬 수 있다.
보체 경로의 활성화는 백혈구 화학주성, 대식세포, 호중구, 혈소판, 비만세포 및 내피세포의 활성화, 증가된 혈관 투과성, 세포 용해, 및 조직 손상에서 염증 반응을 매개하는 보체 단백질의 생물학적 활성 단편, 예를 들어 C3a 및 C5a 과민독소(Anaphylatoxin) 및 C5b-9 세포막 공격 복합체(MAC)를 생성한다. 또한, 안질환 중 일부는 보체가 관련되어 있다는 점이 보고된 바 있다(일본특허출원 제2007-536964호). 그러나, 현재까지도 안질환, 특히 황반 변성을 효과적으로 치료하기 위한 약물에 대한 니즈가 증가되고 있어, 황반 변성 치료제에 대한 연구는 계속되고 있는 실정이다.
일본특허출원 제2007-536964호
이에 본 발명자들은 안질환, 특히 황반 변성을 효과적으로 치료 및 예방하기 위하여 연구한 결과, 보체 관련 경로를 차단하는 융합단백질이 황반 변성 치료제로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 측면은 CRIg(Complement receptor of the immunoglobulin superfamily)의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 CD59 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 융합단백질 또는 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 안질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
보체 관련 경로 억제 단백질인, CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 CD59 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질은 보체 관련 기작을 효율적으로 억제할 수 있다. 따라서, 보체계에 의해 유발되는 안질환을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다. 따라서, 상기 융합단백질은 효율적으로 황반 변성, 특히, 건성 황반 변성 및 습성 황반 변성을 모두 효과적 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 C2.01, C2.02, C2.03, C2.05, C2.06, C2.07 및 C2.08의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 C2.09, C2.10, C2.11, C2.12, C2.10m, C2.11m 및 C2.12m의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 C2.13, C2.14, C2.15 및 C2.16의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 C2.04, C2.01m, C2.04m, C2.05m 및 C2.07m의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 융합단백질의 모식도를 나타낸 도이다. CRIg-Fc(왼쪽), CRIg-Fc-CD59(가운데), CD59-Fc-CRIg(오른쪽)를 의미한다.
도 6a는 인간 C3b에 대한 C2.01, C2.03, C2.04의 결합 친화도를 비아코어 분석을 통해 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 6b는 마우스 C3b에 대한 C2.01m 및 C2.04m의 결합 친화도를 비아코어 분석을 통해 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 7a는 인간 C3b에 대한 C2.01, C2.11, C2.12 및 hIgG1의 결합 친화도를 ELISA를 통해 나타낸 그래프이다.
도 7b는 마우스 C3b에 대한 C2.01, C2.11, C2.12 및 hIgG1의 결합 친화도를 ELISA를 통해 나타낸 그래프이다.
도 7c는 인간 C3b에 대한 C2.04, C2.10 및 C2.11의 결합 친화도를 ELISA를 통해 나타낸 그래프이다.
도 7d는 C9에 대한 C2.04, C2.10 및 C2.11의 결합 친화도를 ELISA를 통해 나타낸 그래프이다.
도 8은 C2.11의 고전 보체 경로 억제 효과를 용혈 분석(CH50)을 통하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 C2.11의 대체 보체 경로 억제 효과를 용혈 분석(AH50)을 통하여 나타낸 그래프이다.
CRIg 세포외도메인을 포함하는 융합단백질
본 발명의 일 측면은 CRIg(Complement receptor of the immunoglobulin superfamily)의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 CD59 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "CRIg"는 VSIG4 유전자에서 코딩되는 면역글로불린 보체 수용체를 의미하며, Protein Z39Ig라고도 명명된다. 상기 CRIg는 보체 수용체의 4종류 중 제4형 보체 수용체에 속하는 수용체로서, 간장 내에서 식균작용을 하는 쿠퍼(Kupffer) 세포와 같은 대식세포의 표면상에 발현된다. 상기 CRIg는 면역글로불린 도메인을 포함하는 세포외 부위와 결합되어 있는 막단백질(Integral Membrane Protein)이다. CRIg은 보체 단편인 C3b와 iC3b와 결합하며, 인체내로 들어온 박테리아나 혈액내의 감염균을 식균세포가 인지하고 제거하도록 기능한다.
상기 CRIg는 CRIg 동형체(isoform) 또는 스플라이싱된 형태(spliced form)를 포함한다. 상기 동형체는, CRIg isoform 1, 2 또는 3을 포함한다. 상기 스플라이싱된 형태는 CRIg(L) 또는 CRIg(S)를 포함한다. 상기 CRIg(L)은 V 및 C2-타입 말단 Ig 도메인을 포함하고, CRIg(S)는 V-타입 도메인만을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 CRIg(S)는 서열번호 36의 서열을 포함할 수 있다.
상기 CRIg 세포외도메인은 수용체의 막관통도메인 및 세포질도메인 부분을 제외한 부분일 수 있다.
상기 CRIg는 CRIg 세포외도메인의 단편을 포함할 수 있다. 상기 CRIg의 세포외도메인의 단편이란, CRIg의 세포외도메인과 동등 또는 유사의 활성을 가지는 절단형을 의미한다. 구체적으로, 상기 단편은 C3b 또는 iC3b와 결합하여 보체 작용 또는 식균 작용을 촉진하는 활성을 가지는 CRIg의 단편을 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 CRIg는 서열번호 28, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37 또는 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 구체적으로, 사람 CRIg은 서열번호 35, 서열번호 36 또는 서열번호 72의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 마우스 CRIg은 서열번호 37의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 사람 CRIg 세포외도메인은 서열번호 28 또는 서열번호 67의 아미노산 서열 포함할 수 있으며, 마우스 CRIg 세포외도메인은 서열번호 61의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "CD59"는 막-결합 조절기로서 자연적으로 발생하는 막 공격 복합체(MAC)형성을 감소시키는 막 결합 억제제이다. 상기 CD59는 CD59 유전자에서 코딩되며, MAC-저해 단백질(MAC-IP), 반응성 용해 막 저해제(MIRL), 또는 프로펙틴(protectin)이라고도 명명된다.
상기 CD59는 GPI(glycophosphatidylinositol) 앵커를 통해 숙주세포에 부착하며, C9가 보체 막 공격 복합체(MAC)을 형성하는 것을 저해하고 CD59-CD9 복합체를 세포 내 이입시킨다. 노인성 황반 변성(AMD)에서, 질환 중증도는 보체 캐스케이드의 말단 단계인 막 공격 복합체(MAC)의 형성 및 MAC 형성에 관여하는 막 결합 조절 단백질인 CD59의 감소된 발현과 상관관계가 있다.
상기 CD59는 CD59의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 CD59의 변이체는 CD59와 동등 또는 유사의 활성을 가지는 변이체를 포함한다. 이는 당업자에게 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 상기 CD59 변이체는 인간 CD59 단백질의 일부 아미노산이 결실, 변경, 치환 및/또는 부가되거나 또는 인간 CD59의 야생형 당쇄가 변경되는 것일 수 있다.
상기 CD59의 변이체는 야생형 CD59의 서열의 적어도 5개 이상, 적어도 10개 이상, 적어도 15개 이상, 또는 적어도 20개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 이때, 상기 인간 CD59는 서열번호 24 또는 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 CD59 변이는 천연 CD59 단백질에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 24의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 CD59 변이는 서열번호 24의 아미노산 서열에서 66번째 및/또는 69번째 아미노산 또는 다른 아미노산으로 치환될 수 있다.
일 구체예로, 서열번호 24의 66번째 아미노산인 라이신이 다른 아미노산으로 변경된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 라이신(K)은 알라닌(A), 알지닌(R), 아스파라진(N), 아스파르트산(D), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 글라이신(G), 히스티딘(H), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프로린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 타이로신(Y) 및 발린(V)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게, 상기 CD59의 변이체는 서열번호 24의 66번째 아미노산이 알라닌(A) 또는 글루타민(Q)으로 치환된 형태일 수 있다.
또 다른 구체예로, 서열번호 24의 69번째 아미노산인 히스티딘이 다른 아미노산으로 변경된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 히스티딘(H) 은 알라닌(A), 알지닌(R), 아스파라진(N), 아스파르트산(D), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 글라이신(G), 라이신(K), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프로린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 타이로신(Y) 및 발린(V)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게, 상기 CD59의 변이체는 서열번호 24의 69번째 아미노산이 글루타민(Q)으로 치환된 형태일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 CD59 변이체는 서열번호 24의 아미노산 서열에서 K66Q, K66A, H69Q 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환이 일어난 것일 수 있다.
상기 CD59 변이체는 CD59의 활성 또는 기능을 변화시키는 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 변이는 CD59의 활성을 조절하거나 또는 당화를 저해하는 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 K66Q 또는 H69Q는 단백질의 활성을 항상 유지하도록 조절하는 변이일 수 있다. 또한, 상기 K66A는 단백질의 당화를 조절하는 변이일 수 있다.
구체적으로, 상기 CD59 변이체는 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 63 또는 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 CD59 변이체가 두개 이상이 포함된 이량체 또는 삼량체 형태일 수 있다. 구체적으로, CD59 변이체 이량체는 서열번호 65의 서열을 포함할 수 있다. 또한, CD59 변이체 삼량체는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, CD59 변이체는 CD59 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편은 CD59와 동등 또는 유사의 활성을 가지는 절단형을 의미한다. 구체적으로, 상기 숙주세포와 결합하여 보체 막 공격 복합체를 저해하는 CD59의 세포외도메인 또는 이의 단편일 수 있다.
상기 CD59 단편은 천연 CD59의 N 말단 및/또는 C 말단의 일부가 절단된 형태일 수 있다. 구체적으로, 천연 CD59의 N-말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개 또는 28개의 아미노산이 결실된 것을 포함할 수 있다.
또한, 천연 CD59의 C-말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개 또는 28개의 아미노산이 결실된 것을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 CD59 단편의 일 구체예는, 서열번호 24의 26번째 내지 128번째 서열을 가지는 것일 수 있다. 상기 CD59 단편의 일 구체예는 서열번호 24의 26번째 내지 102번째의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다. 또한, 상기 CD59 단편의 일 구체예는 서열번호 24의 26번째 내지 95번째의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 CD59 단편은 신호 서열(without signal peptide) 또는 C-말단 프로펩타이드가 제거된 형태일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 CD59의 변이체는 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 68, 또는 서열번호 69의 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있다. 이때, CD59의 변이체는 상기 항상 활성화된 상태일 수 있다.
이때, 상기 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 CD59 또는 이의 변이체는 링커를 통해 결합된 것일 수 있다.
또한, 상기 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편과 면역글로불린 단편은 링커를 통해 결합된 것일 수 있다. 상기 링커는 두 개의 단백질을 연결시켜준다. 링커의 일 구체예로는 1개 내지 50개의 아미노산, 알부민 또는 이의 단편, 또는 면역글로불린의 Fc 도메인 등을 포함할 수 있다. 이때, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CH1)은 포함하지 않는 단백질을 의미한다. 상기 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM 일 수 있으며, 바람직하게는 IgG1 일 수 있다. 본 명세서에서 Fc 도메인은 힌지 영역을 제외한, CH2 및 CH3 도메인을 포함한 영역을 지칭할 수 있다.
상기 융합단백질은 구체적으로 하기 구조식(I) 또는 (II)로 이루어진 것일 수 있다:
N'-X-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-Y-C'(I)
N'-Y-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-X-C'(II)
이때, 상기 구조식(I) 및 (II)에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 X는 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편이고,
상기 Y는 CD59 또는 이의 변이체이며,
상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,
상기 n 및 m은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
상기 CD59 또는 이의 변이체, 상기 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편 및 Fc 도메인은 상술한 바와 같다. 구체적으로 상기 Fc 도메인은 면역글로불린 Fc 중쇄의 CH2 및 CH3 영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인뿐만 아니라, Fc 도메인 변이체일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 용어 "Fc 도메인 변이체"는 야생형 Fc 도메인의 당쇄 형태(Glycosylation pattern)와 다르거나, 야생형 Fc 도메인에 비해 증가된 당쇄, 야생형 Fc 도메인에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거(Deglycosylate)된 형태일 수 있다. 또한 무당쇄(Aglycosylated) Fc 도메인도 포함된다. Fc 도메인 혹은 변이체는 배양조건 혹은 호스트의 유전자 조작을 통해 조정된 숫자의 시알산(Sialic acid), 퓨코실화(Fucosylation), 당화(Glycosylation)를 갖도록 한 것일 수 있다.
또한, 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린의 Fc 도메인의 당쇄를 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 면역글로불린 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역이 혼합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 상기 Fc 도메인의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "Fc 도메인 변이체"는 야생형 Fc 도메인의 당쇄가 변경되거나, Fc 도메인간의 서열이 혼합된 Fc 도메인이거나, 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산이 결실, 변경, 치환 및/또는 부가된 것을 의미한다. 상기 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산의 결실, 변경, 치환 및/또는 부가는 당업자에게 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 Fc 도메인 변이체는 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산 서열이 치환 및/또는 부가된 것일 수 있다.
상기 치환 및/또는 부가에 의해 도입되는 "아미노산"은 라이신(K), 알라닌(A), 알지닌(R), 아스파라진(N), 아스파르트산(D), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 글라이신(G), 히스티딘(H), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프로린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 타이로신(Y) 및 발린(V)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 Fc 도메인 변이는 항체의 활성 또는 기능을 조절하는 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 Fc 도메인 변이는 항체의 이펙터 기능(effector function) 또는 항체 세포 독성(antibody cytotoxic activities)을 조절하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 Fc 도메인 변이체는 DANG 변이 또는 NG 변이를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 IgG1 Fc 도메인에서 265번째 서열이 D에서 A로 치환된 것, 297번째 서열이 N에서 G로 치환된 것 또는 이의 조합일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 Fc 도메인은 서열번호 5, 서열번호 19 및 서열번호 62로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 Fc 도메인은 서열번호 42 또는 서열번호 56의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
상기 펩타이드 링커(1)은 5 내지 80개의 연속된 아미노산, 20 내지 60개의 연속된 아미노산, 또는 25 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 30 내지 40개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 펩타이드 링커(1)은 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 펩타이드 링커(1)은 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 하나, 두 개, 세 개 또는 네 개의의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커(1)는 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있다. 한 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커(1)이 서열번호 29 또는 34의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 펩타이드 링커(2)는 1 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 3 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 5 내지 15개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커(2)는 (G4S)n 또는 (이때, n은 1 내지 10의 정수) 포함할 수 있다. 이때, (G4S)n에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 일 실시예로, 상기 펩타이드 링커(2)가 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 33의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 이량체를 구성하는 융합단백질은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 11, 서열번호 18 및 서열번호 22으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 융합단백질은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 11, 서열번호 18 및 서열번호 22으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이때, 동일성은, 예를 들어, 퍼센트 상동성, NCBI(National Center of Biotechnology Information)의 BlastN software과 같은 상동성 비교 소프트웨어를 통해 결정될 수 있다.
융합단백질 이량체
본 발명의 다른 측면은, CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 CD59 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질 두 개가 결합된 이량체를 제공한다.
이때, 이량체를 구성하는 융합단백질 간의 결합은 링커 내에 존재하는 시스테인에 의해 이황화 결합에 의해 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이량체를 구성하는 융합단백질은 동일한 것일 수도 있으나, 서로 상이한 융합단백질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이량체는 동형이량체(Homodimer)인 것일 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 11, 서열번호 18 또는 서열번호 22와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 48, 서열번호 55 및 서열번호 59로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 신호서열(Signal sequence) 또는 리더 서열(Leader sequence)을 코딩하는 핵산을 추가적으로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "신호서열"은 목적 단백질의 분비를 지시하는 신호펩타이드를 의미한다. 상기 신호펩타이드는 숙주 세포에서 번역된 후에 절단된다. 구체적으로, 상기 신호서열은 ER(Endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열이다.
상기 신호서열은 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하나, 그보다 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩타이드는 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다. 중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩타이드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다.
개시 이후에, 신호서열은 흔히 신호 펩티다아제(Signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(Lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호서열은 tPa(Tissue Plasminogen Activation), HSV gDs(Signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D), 또는 성장 호르몬(Growth hormone)의 분비신호서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포에서 사용되는 분비 신호서열을 사용할 수 있다. 또한, 상기 신호서열은 야생형 신호서열을 사용하거나, 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적재된 벡터
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는 상기 벡터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 벡터는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(Retrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 백시니아 바이러스(Vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(Baculovirus) 등)이 될 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 명세서에서 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은, DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다. 유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(Bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함할 수 있다.
융합단백질을 발현하는 형질전환된 세포
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
상기 형질전환 세포의 숙주세포로서, 원핵세포, 진핵세포, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 원핵세포의 일 예로는 대장균을 사용할 수 있다. 또한, 진핵세포의 일 예로는 효모를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
또한, 숙주세포로 발현벡터를 도입하는 경우, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(Dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(Electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 융합단백질의 치료제로서의 특성을 최적하거나 기타 다른 목적을 위해 호스트 세포가 갖고 있는 당화(Glycosylation) 관련 유전자를 당업자에게 알려져 있는 방법을 통해 조작하여 융합단백질의 당쇄 패턴(예를 들어, 시알산, 퓨코실화, 당화)을 조정할 수 있다.
융합단백질 생산 방법
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계를 포함하는 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 CD59 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 생산 방법은 i) 상기 형질전환 세포를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 ii) 상기 배양물로부터 융합단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 형질전환 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(Fed batch 또는 Repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
융합단백질 또는 이의 이량체의 용도
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 또는 상기 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 안질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
상기 융합단백질 및 융합단백질 이량체는 상술한 바와 같다.
본 명세서에서 사용한 용어, "안질환"은 눈을 발병 부위로 하는 질병을 총칭하는 것일 수 있다. 상기 안질환은 보체 활성 또는 혈관신생으로 인해 촉발 또는 악화되는 안질환 또는 과도한 혈관신생을 주요 병증으로 포함하는 안질환을 의미할 수 있다.
상기 안질환은 노화-관련 황반 변성(AMD), 지도모양 위축증(GA), 맥락막 혈관신생(CNV), 포도막염, 당뇨병성 및 다른 허혈-관련 망막증, 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 힙펠-린다우병, 눈의 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐색(CRVO), 각막 혈관신생 및 망막 혈관신생으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
상기 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편, CD59 또는 이의 변이체는 상술한 바와 같다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 안질환 치료용 또는 예방용 약학 조성물에서 그 유효성분은 안질환 치료 활성을 나타내거나, 특히, 황반 변성에 치료 효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량% 내지 20.0 중량% 범위 내에서 결정될 것이다. 본 명세서에서 사용한 용어, "유효량"이란 안질환의 상태 개선 또는 치료(Treatment) 효과, 특히 황반 변성의 상태 개선 또는 치료 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "치료"는 치료학적 처리 및 예방적 처리를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 이때, 예방은 개체의 병리학적 상태 또는 질환을 완화시키거나 감소시키는 의미로 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 용어 "치료"는 인간을 포함한 포유류에서 질환을 치료하기 위한 적용이나 어떠한 형태의 투약을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 질환 또는 질환의 진행을 억제하거나 늦추는 것을 포함하며; 손상되거나, 결손된 기능을 회복시키거나, 수리하여, 질환을 부분적이거나 완전하게 완화시키거나; 또는 비효율적인 프로세스를 자극하거나; 심각한 질환을 완화하는 의미를 포함한다.
생체이용률과 같은 약동학적 파라미터(Pharmacokinetic parameters) 및 클리어런스율(Clearance rate)과 같은 기본적인 파라미터(Underlying parameters)도 효능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, "향상된 효능"(예를 들어, 효능의 개선)은 향상된 약동학적 파라미터 및 향상된 효능에 기인할 수 있으며, 시험 동물 또는 인간 대상체에서 클리어런스율 및 안질환 치료 또는 개선과 같은 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구체예에서 치료학적으로 유효한 양은 안질환을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.
이때, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(Phosphate Buffered Saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ug/kg 내지 10 g/kg 범위, 또는 0.01 mg/kg 내지 1 g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1 일 1 회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본원 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
상기 약학 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다. 본원의 약학 조성물은 유효성분 이외에, 안질환, 특히 황반 변성 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 안질환을 치료하기 위한 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 CD59 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질 또는 이의 이량체의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 안질환 치료 또는 예방용 약제를 제조하기 위한 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 CD59 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질 또는 이의 이량체의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 CD59 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질 또는 이의 이량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 안질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
상기 융합단백질, 이량체 및 안질환은 상술한 바와 같다. 이때, 상기 개체는 안질환을 앓고 있는 개체일 수 있다. 또한 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 융합단백질 또는 융합단백질 이량체의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 융합단백질 또는 융합단백질 이량체는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 융합단백질은 보체 경로, 식균 작용 및/또는 혈관신생을 저해할 수 있다. 따라서, 습성 또는 건성 황반 변성과 같은 안질환에 효과적으로 활용할 수 있다. 특히, CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 CD59 또는 이의 변이체를 조합한 경우가, 하나를 포함한 경우보다 효과가 더 높고 시너지 효과 또한 존재하는 것이 확인되었다. 따라서, 상기 융합단백질은 보체경로 및 혈관신생을 효과적으로 저해하여 건성 및 습성 황반 변성을 효과적으로 치료할 수 있다.
이하, 본원 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본원 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본원 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. CRIg를 포함하는 융합단백질의 제조
Code Format Description 해당서열
C2.01 Fc-fusion hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG 서열번호 1
C2.02 Fc-fusion hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG-hu CD59(K66Q) 서열번호 2
C2.03 Fc-fusion hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG-hu CD59(H69Q) 서열번호 3
C2.04 Fc-fusion hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG-hu CD59(H69Q) without c-terminal propeptide 서열번호 4
C2.05 Fc-fusion hu IgG1 Fc DANG 서열번호 5
C2.06 Fc-fusion hu IgG1 Fc DANG-hu CD59(K66Q) 서열번호 6
C2.07 Fc-fusion hu IgG1 Fc DANG-hu CD59(H69Q) 서열번호 7
C2.08 Fc-fusion hu IgG1 Fc DANG-hu CD59(K66A)2 서열번호 8
C2.09 Fc-fusion hu IgG1 Fc DANG-hu CD59(K66A)3 서열번호 9
C2.10 Fc-fusion hu CD59(H69Q)-hu IgG1 Fc DANG 서열번호 10
C2.11 Fc-fusion hu CD59(H69Q)-hu IgG1 Fc DANG-hu CRIg 서열번호 11
C2.12 Fc-fusion hu IgG1 Fc DANG-hu CRIg 서열번호 12
C2.13 recombinant protein hu CD59(26 내지 102)-his tag 서열번호 13
C2.14 recombinant protein his tag-hu CD59(26 내지 102) 서열번호 14
C2.15 recombinant protein hu CD59(26 내지 95)-his tag 서열번호 15
C2.16 recombinant protein his tag-hu CD59(26 내지 95) 서열번호 16
C2.01m Fc-fusion mu CRIg-mu IgG2a Fc DANG 서열번호 17
C2.04m Fc-fusion mu CRIg-mu IgG2a Fc DANG-mu CD59a 서열번호 18
C2.05m Fc-fusion mu IgG2a Fc DANG 서열번호 19
C2.07m Fc-fusion mu IgG2a Fc DANG-mu CD59a 서열번호 20
C2.10m Fc-fusion mu CD59a-mu IgG2a Fc DANG 서열번호 21
C2.11m Fc-fusion mu CD59a-mu IgG2a Fc DANG-mu CRIg 서열번호 22
C2.12m Fc-fusion mu IgG2a Fc DANG-mu CRIg 서열번호 23
C2.01(서열번호 1)은 사람 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 283) 및 링커 및 DANG 변이(D265A, N297G)를 통해 이펙터 기능을 제거한 사람 IgG1 Fc로 구성된다. C2.02(서열번호 2)는 사람 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 283), 링커 및 사람 IgG1 Fc DANG, 링커 및 항상 활성화된 형태가 되도록 66번 라이신(K)를 글루타민(Q)으로 변이한 CD59(K66Q)로 구성된다.
C2.03(서열번호 3)은 사람 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 283), 링커, 사람 IgG1 Fc DANG 및 항상 활성화된 형태가 되도록 69번 히스티딘(H)을 글루타민(Q)으로 변이한 CD59(H69Q)로 구성된다.
C2.04(서열번호 4)는 사람 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 283), 링커, 사람 IgG1 Fc DANG, 링커 및 항상 활성화된 형태가 되도록 69번 히스티딘(H)를 글루타민(Q)으로 변이한 CD59(H69Q)에서 c-말단 프로펩타이드(c-terminal propeptide)(103 내지 128)가 제거된 것으로 구성된다.
C2.05(서열번호 5)는 사람 IgG1 Fc DANG으로 구성된다.
C2.06(서열번호 6)은 사람 IgG1 Fc DANG, 링커 및 항상 활성화된 형태가 되도록 66번 라이신(K)을 글루타민(Q)으로 변이한 CD59(K66Q)로 구성된다.
C2.07(서열번호 7)은 사람 IgG1 Fc DANG, 링커 및 활성화된 형태가 되도록 69번 히스티딘(H)을 글루타민(Q)으로 변이한 CD59(H69Q)로 구성된다.
C2.08(서열번호 8)은 사람 IgG1 Fc DANG, 링커, 당화를 막기위해 66번 라이신(K)을 알라닌(A)으로 변이한 CD59(K66A), 링커 및 당화를 막기위해 66번 라이신(K)을 알라닌(A)으로 변이한 CD59(K66A)로 구성된다.
C2.09(서열번호 9)는 사람 IgG1 Fc DANG, 링커, 당화를 막기위해 66번 라이신(K)을 알라닌(A)으로 변이한 CD59(K66A), 링커, 당화를 막기위해 66번 라이신(K)을 알라닌(A)으로 변이한 CD59(K66A), 링커 및 당화를 막기위해 66번 라이신(K)을 알라닌(A)으로 변이한 CD59(K66A)로 반복 구성된다.
C2.10(서열번호 10)은 항상 활성화된 형태가 되도록 69번 히스티딘(H)을 글루타민(Q)으로 변이한 CD59(H69Q), 링커 및 사람 IgG1 Fc DANG으로 구성된다.
C2.11(서열번호 11)은 항상 활성화된 형태가 되도록 69번 히스티딘(H)을 글루타민(Q)으로 변이한 CD59(H69Q), 링커, 사람 IgG1 Fc DANG 및 사람 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 283)으로 구성된다.
C2.12(서열번호 12)는 사람 IgG1 Fc DANG ?? 사람 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 283)으로 구성된다.
C2.13(서열번호 13)은 사람 CD59 단백질(26 내지 102) 및 폴리 히스티딘 태그로 구성된다.
C2.14(서열번호 14)는 폴리 히스티딘 태그 및 사람 CD59 단백질(26 내지 102)로 구성된다.
C2.15(서열번호 15)은 사람 CD59 단백질(26 내지 95) 및 폴리 히스티딘 태그 로 구성된다.
C2.16(서열번호 16)은 폴리 히스티딘 태그 및 사람 CD59 단백질(26 내지 95) 로 구성된다.
C2.01m(서열번호 17)은 마우스 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 187), 링커 및 DANG 변이(D265A, N297G)를 통해 이펙터 기능을 제거한 마우스 IgG2a Fc로 구성된다.
C2.04m(서열번호 18)은 마우스 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 187), 링커, 마우스 IgG2a Fc DANG 후면에 링커 및 마우스 CD59a를 추가한 것으로 구성된다.
C2.05m(서열번호 19)은 마우스 IgG2a Fc DANG만으로 구성된다.
C2.07m(서열번호 20)은 마우스 IgG2a Fc DANG, 링커 및 마우스 CD59a로 구성된다.
C2.10m(서열번호 21)은 마우스 CD59a, 링커 및 마우스 IgG2a Fc DANG로 구성된다.
C2.11m(서열번호 22)은 마우스 CD59a, 링커, 마우스 IgG2a Fc DANG, 링커 및 마우스 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 187)로 구성된다.
C2.12m(서열번호 23)은 마우스 IgG2a Fc DANG, 링커 및 마우스 CRIg 단백질의 세포외도메인 영역(20 내지 187)로 구성된다.
[서열번호 1] hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG
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[서열번호 2] hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG -hu CD59(K66Q)
RPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLP GGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGG SLQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCW Q FEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLENGGTSLSEKTVLLLVTPFLAAAWSLHP
[서열번호 3] hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG -hu CD59(H69Q)
RPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLP GGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGGS LQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWKFE Q CNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLENGGTSLSEKTVLLLVTPFLAAAWSLHP
[서열번호 4] hu CRIg- hu IgG1 Fc DANG -hu CD59(H69Q) without c-terminal propeptide
RPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLPGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGG GGGSGGGG SLQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWKFEQCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLEN
[서열번호 5] hu IgG1 Fc DANG
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
[서열번호 6] hu IgG1 Fc DANG -hu CD59(K66Q)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGGS LQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWQFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLENGGTSLSEKTVLLLVTPFLAAAWSLHP
[서열번호 7] hu IgG1 Fc DANG -hu CD59(H69Q)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGG SLQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWKFEQCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLENGGTSLSEKTVLLLVTPFLAAAWSLHP
[서열번호 8] hu IgG1 Fc DANG -hu CD59(K66A)2
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SSGGGGSGGGGS LQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWAFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLEN SSGGGGSGGGGSGGGGS LQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWAFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLEN
[서열번호 9] hu IgG1 Fc DANG -hu CD59(K66A)3
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SSGGGGSGGGGS LQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWAFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLEN SSGGGGSGGGGSGGGGS LQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWAFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLEN SSGGGGSGGGGSGGGGS LQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWAFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLEN
[서열번호 10] hu CD59(H69Q)-hu IgG1 Fc DANG
LQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWKFEQCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLEN GGGGS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
[서열번호 11] hu CD59(H69Q)-hu IgG1 Fc DANG -hu CRIg
LQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWKFEQCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLEN GGGGS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGGS RPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLPG
[서열번호 12] hu IgG1 Fc DANG -hu CRIg
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GGGGSGGGGS RPILEVPESVTGPWKGDVNLPCTYDPLQGYTQVLVKWLVQRGSDPVTIFLRDSSGDHIQQAKYQGRLHVSHKVPGDVSLQLSTLEMDDRSHYTCEVTWQTPDGNQVVRDKITELRVQKLSVSKPTVTTGSGYGFTVPQGMRISLQCQARGSPPISYIWYKQQTNNQEPIKVATLSTLLFKPAVIADSGSYFCTAKGQVGSEQHSDIVKFVVKDSSKLLKTKTEAPTTMTYPLKATSTVKQSWDWTTDMDGYLGETSAGPGKSLPG
[서열번호 13] hu CD59(26-102)-his tag
LQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWKFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLENHHHHHHHH
[서열번호 14] his tag-hu CD59(26-102)
HHHHHHHHLQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWKFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNFNEQLEN
[서열번호 15] hu CD59(26-95)-his tag
LQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWKFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCNHHHHHHHH
[서열번호 16] his tag-hu CD59(26-95)
HHHHHHHHLQCYNCPNPTADCKTAVNCSSDFDACLITKAGLQVYNKCWKFEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCKKDLCN
[서열번호 17] mu CRIg-mu IgG2a Fc DANG
HPTLKTPESVTGTWKGDVKIQCIYDPLRGYRQVLVKWLVRHGSDSVTIFLRDSTGDHIQQAKYRGRLKVSHKVPGDVSLQINTLQMDDRNHYTCEVTWQTPDGNQVIRDKIIELRVRKYNPPRINTEAPTTLHSSLEATTIMSSTSDLTTNGTGKLEETIAGSGRNLP GGGGSEPRGPTIKPCPPCKCP APNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[서열번호 18] mu CRIg-mu IgG2a Fc DANG -mu CD59a
HPTLKTPESVTGTWKGDVKIQCIYDPLRGYRQVLVKWLVRHGSDSVTIFLRDSTGDHIQQAKYRGRLKVSHKVPGDVSLQINTLQMDDRNHYTCEVTWQTPDGNQVIRDKIIELRVRKYNPPRINTEAPTTLHSSLEATTIMSSTSDLTTNGTGKLEETIAGSGRNLPGGGGS EPRGPTIKPCPPCKCP APNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG GGGGSGGGGS LTCYHCFQPVVSSCNMNSTCSPDQDSCLYAVAGMQVYQRCWKQSDCHGEIIMDQLEETKLKFRCCQFNLCNKS
[서열번호 19] mu IgG2a Fc DANG
APNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
[서열번호 20] mu IgG2a Fc DANG -mu CD59a
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG GGGGSGGGG SLTCYHCFQPVVSSCNMNSTCSPDQDSCLYAVAGMQVYQRCWKQSDCHGEIIMDQLEETKLKFRCCQFNLCNKS
[서열번호 21] mu CD59a-mu IgG2a Fc DANG
LTCYHCFQPVVSSCNMNSTCSPDQDSCLYAVAGMQVYQRCWKQSDCHGEIIMDQLEETKLKFRCCQFNLCNKS GGGGS EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG
[서열번호 22] mu CD59a-mu IgG2a Fc DANG -mu CRIg
LTCYHCFQPVVSSCNMNSTCSPDQDSCLYAVAGMQVYQRCWKQSDCHGEIIMDQLEETKLKFRCCQFNLCNKS GGGGS EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG GGGGSGGGGS HPTLKTPESVTGTWKGDVKIQCIYDPLRGYRQVLVKWLVRHGSDSVTIFLRDSTGDHIQQAKYRGRLKVSHKVPGDVSLQINTLQMDDRNHYTCEVTWQTPDGNQVIRDKIIELRVRKYNPPRINTEAPTTLHSSLEATTIMSSTSDLTTNGTGKLEETIAGSGRNLPG
[서열번호 23] mu IgG2a Fc DANG -mu CRIg
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYGSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG GGGGSGGGGS HPTLKTPESVTGTWKGDVKIQCIYDPLRGYRQVLVKWLVRHGSDSVTIFLRDSTGDHIQQAKYRGRLKVSHKVPGDVSLQINTLQMDDRNHYTCEVTWQTPDGNQVIRDKIIELRVRKYNPPRINTEAPTTLHSSLEATTIMSSTSDLTTNGTGKLEETIAGSGRNLPG
제조예 2. 인간 단백질 및 마우스 단백질(C2.10m 내지 C2.12m)의 제조
제조예 2.1. 벡터 구성과 플라스미드 맥시-프렙
하기 표 2 및 표 3은 사용한 시약 및 장비를 기재하였다.
시약 제조사 Catalog#
pTT5 chempartner
In-Fusion HD cloning kit Clontech 639648
Accuprime pfx DNA polymerase Invitrogen 12344-04
Gel DNA fragment purication Kit TaKaRa D823A
FastDigest® BamHI Fermentas FD0055
FastDigest® EcoRI Fermentas FD0275
장비 및 도구 제조사 모델명
생물 안전 작업대 NUAIRE LabGard class II
원심분리기 Eppendorf 5424
젤 이미징 시스템 Tanon 2500R
PCR을 통해 합성한 DNA 단편을 증폭시키고, PCR 생성물을 젤로 정제하였다. 제한효소 EcoRI와 BamHI로 pTT5 벡터를 자르고 난 후 젤을 정제하였다. In-Fusion Kit를 이용해 각각의 PCR 생성물과 선형 벡터를 연결하였다. 생성된 벡터를 ECOS101 DH5α competent cell에 형질전환 시키고, 100 μg/ml 엠피실린을 함유하는 2xYT 한천 판에 배양하였다. 모든 조작 과정은 표준 형질 전환 프로토콜을 따라 수행하였다. 콜로니 PCR로 양성 재조합체를 확인하고, 재조합 플라스미드를 sequence-verify sequencing를 수행하였다. 단일 콜로니를 선택하여 100 μg/ml 엠피실린을 함유하는 5 mL 2 x YT 배지에 종균을 접종하였다. 37℃에서 8시간 동안 흔들며 배양하였다.
이후, 종균을 1:1,000의 비율로 200 mL의 선택적 2 x YT 배지에 희석하였다. 37℃에서 16시간 동안 흔들면서 배양하였다. 4℃ 4,700 rpm에서 10분동안 원심 분리하여 박테리아 세포를 수확하였다. 12 mL의 RES-EF 용액에 박테리아 펠릿을 재부유시켰다. 그 후, 12 mL의 LYS-EF 용액을 첨가하고, 밀봉한 튜브를 힘차게 뒤집어 완전히 혼합한 뒤, 실온에서 5분간 배양하였다. 12 mL의 NEU-EF 용액을 용해물에 첨가하고, 힘차게 뒤집어 빠르게 완전히 혼합하였다.
NucleoBond® Xtra 컬럼 필터에 용해물을 주입하기 전, 필터의 막힘을 방지하기 위해 용해물 튜브를 3번 정도 뒤집어 침전물의 균질한 현탁을 제조하였다. 그 후, 10 mL의 필터 세척 용액 FIL-EF로 NucleoBond® Xtra 컬럼 필터와 NucleoBond® Xtra 컬럼을 세척하였다. NucleoBond® Xtra 컬럼 필터를 빼내거나 컬럼을 거꾸로 뒤집어 제거하였다. 90 mL의 세척 용액 ENDO로 NucleoBond® Xtra 컬럼을 세척하였다.
45 mL의 세척 용액 WASH-EF로 NucleoBond® Xtra 컬럼을 세척하였다. 15 mL의 용출 용액 ELU로 플라스미드 DNA를 용출시켰다. 용출액은 50 mL 원심분리 튜브에 수집하였다. 10.5 mL의 상온 이소프로판올을 첨가하여 용출된 플라스미드 DNA를 침전시켰다. 볼텍스 후, 혼합물을 2분간 그대로 방치하였다.
그 후, 5 mL의 70% 에탄올을 펠릿에 첨가하였다. 파이펫 팁을 이용해 튜브에서 에탄올을 조심스럽게 완전히 제거하였다. 펠릿을 상온(20-25℃)에서 건조시켰다. 그 후, DNA 펠릿을 1,000 μl의 H2O로 용해시켰다.
제조예 2.2. 세포 형질 주입과 단백질 발현
하기 표 4에 사용한 재료 및 시약 기재하였다.
재료 및 시약 제조사(Product #)
293F cells Invitrogen(R790-07)
OPM 293 OPM(81075-001)
Pluronic® F-68, 10%(100X) Gibco(24040-032)
1 mg/ml PEI Polyscience(23966)
OPTI MEM I Gibco(31985088)
Peptone(20x) FLUKA(P0521-1KG)
셰이커 플라스크
ISF1-X 배양기 셰이커 Kuhner shaker
완전 배지를 넣은 293F seed strain을 130 rpm, 37℃ 8% CO2의 배양기 셰이커에서 유지하였다. 세포를 0.3 내지 0.4x106 cells/ml의 밀도로 배양하고, 매 2 내지 3일마다 배지를 교환하였다. 형질 주입 24시간 전, 새로 계대 배양한 293F 세포를 2.6x106 cells/ml로 준비하였다. 준비한 세포는 130 rpm, 37℃ CO2의 배양기 셰이커에서 배양하였다. 형질 주입 당일, 새로운 배지를 사용하여 5.0 x 106 cells/ml의 밀도로 세포를 조정하였다. 3 L 셰이커 플라스크에서 1 L의 총 부피로 수행하였다. 0.4 mg HC 및 0.6 mg LC 플라스미드를 50 ml OPTI MEM I으로 희석하고, 0.22 μm 필터로 여과하였다. 그 후, 2 mg PEI를 50 mL OPTI MEM I으로 희석하여 형질 주입 시약을 준비하였다.
희석된 PEI를 DNA 혼합물에 첨가한 뒤, 즉시 혼합하였다. 이후 15분간 상온에서 배양하였다. 2.6x106 cells/ml로 준비한 293F 세포에 DNA-PEI 혼합물을 첨가하였다. 이후 세포는 130 rpm, 37℃ 8% CO2의 배양기 셰이커에서 24시간 동안 계속 배양하였다. 형질 주입 24시간 후, 최종 농도가 0.5%가 되도록 배양액의 1/20에 10% peptone을 첨가하였다. 이후 세포는 130 rpm, 37℃ 8% CO2의 배양기 셰이커에서 계속 배양하였다. 형질 주입 후 2 내지 5일 기간에 매일 세포 밀도/생존 능력을 측정하고 기록하였다. 형질 주입 7일 후 또는 세포 생존 능력이 70% 미만에서 정제를 위해 세포를 수확하였다.
제조예 2.3. 단백질 정제(C2.01 내지 C2.03, C2.05 내지 C2.12 및 C2.10m 내지 C2.12m)
하기 표 5 내지 표 7은 단백질 정제를 위해 사용한 시약, 각 용액의 구성 및 장비를 기술하였다.
시약 제조사 Catalog#
Mabselect SuRe GE Healthcare 11003493
Tris SIGMA 77-86-1
NaCl ACROS ORGANIVS 7647-14-5
Sodium citrate Adamas-beta 76198B
Citric acid GENERAL-Reagent G83162B
Arginine VETEC V900343-500G
Succinic acid Sigma-Aldrich S9512-500G
Triton X-100 ABCONE X10010-1L
TRITON X-114 SIGMA-ALDRICH X114
Millex-GP Filter Unit 0.22 μm Sterile MILLIPORE SLGP033RS
NaOH Merck B146369740
용액 A 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0
용액 B 25 mM Tris, 150 mM NaCl,0.1% Triton X-100, 0.1% Triton X-114 pH 8.0
용액 C 100 mM Sodium Citrate, 150 mM NaCl, pH 3.0
용액 D 1 M Arginine, 400 mM Succinic acid, pH 9.0
용액 E 20 mM PB pH 6.5, 1 M(NH4)2SO4
용액 F 20 mM PB pH 6.5, 25% isopropyl alcohol
최종용액 20 mM HEPES, pH 7.5, 240 mM sucrose 또는 20mM his acetate pH 5.5, 240 mM sucrose
기기 제조사 모델명
AKTA Pure GE Healthcare 29-0182-24
원심분리기 Beckman J-26xp
젤 이미징 시스템 Tanon 2500R
Sartopore 2 filter Sartorius 5445307H9-OO-A
Mabselect sure 컬럼을 이용하여 단백질을 정제하였다. 구체적으로, 2,000xg, 4℃에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 수확하였다. 그 후, Sartopore 2 필터로 상층액을 여과하였다. 용액 A로 평형화된 5 ml MabSelect Sure 컬럼으로 정화된 상층액을 로딩하였다. 그 후, A280 흡광도가 기준치에 도달할 때까지 용액 A로 컬럼을 세척하였다. 10 CV 용액 B로 컬럼을 세척하였다. 10 CV 용액 A로 컬럼을 세척하였다. 6 CV 용액 C로 결합된 단백질을 용출하고, 1/6 부피의 용액 D를 넣어 용출한 물질을 중화하고, SDS-PAGE와 SEC-HPLC 분석을 진행하였다.
그 후, HIC 컬럼을 통한 단백질을 정제하였다. 그 후, 밤새 4℃에서 용액 E에 대해 단백질을 투석하였다. 용액 E로 평형화된 HIC 컬럼에 상층액을 로딩하였다. 그 후, A280 흡광도가 기준치에 도달할 때까지 용액 E로 컬럼을 세척하였다. 기울기 용리(10 CV 용액 F 0%-40%)로 결합된 단백질을 용출하였다. 2 CV 100% 용액 F로 결합된 단백질을 용출하고, SDS-PAGE 분석을 진행하였다.
단백질을 정제한 후 해당 단백질들을 한 군데로 모아준 후, 밤새 4℃에서 최종 용액에 대해 단백질을 투석하였다. 그 후, SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 것과 같이, 정제된 C2.01 내지 C2.03, C2.05 내지 C2.12 및 C2.10m 내지 C2.12m 단백질을 SDS-PAGE로 확인하였다.
제조예 2.4. 단백질 정제(C2.13 내지 C2.16)
하기 표 8 내지 표 10에 단백질 정제를 위해 사용한 시약, 용액의 구성 및 장비를 기술하였다.
시약 제조사 Cat.# Lot#
His TrapTM excel cytiva 17371206 10301622
PBS Ambion AM9626 148053
NaCl ACROS ORGANIVS 7647-14-5 A0303894
Tris Base VETEC V900483-1KG WXBC3183V
NaOH Merck B146369740 1.06469.1000
Imidazole Sangon 228-32-4 FC11BA0017
Aarginine GENERAL-REAGENT G80826C P1123594
Succinic acid GENERAL-REAGENT G14056D P10416
Sodium citrate Alfa Aesar 45556 S06A037
Triton X-114 Sigma 114-500ml MKBM5296V
Triton X-100 Sigma 100-100ml SLBJ8129V
기기 제조사 Model code
AKTA pure GE Healthcare 11001313
HPLC Waters E2695
Centrifuge Beckman J-26xp
용액A PBS, pH 7.4
용액B PBS, pH 7.4 + 0.1% Triton X-114 + 0.1% Triton X-100
용액C PBS, 500mM Imidazole, pH 7.4
regeneration buffer 0.5M NaOH
His TrapTM excel 컬럼을 통해 단백질을 정제하였다. 구체적으로, 4,000 rpm으로 30분간 원심 분리하여 상층액을 수확하였다. 그 후, Sartopore 2 필터로 상층액을 여과하였다. 용액 A로 평형화된 1 ml His TrapTM excel 컬럼으로 정화된 상층액을 로딩하였다. 용액 C로 해당 단백질을 용출한 뒤, SDS-PAGE 분석을 진행하였다. 최종 용액에 대해 단백질을 투석하고, MILLEX_MP 0.22 μm 멤브레인으로 여과하였다. 그 후, SDS-PAGE 및 SEC-HPLC 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 것과 같이, C2.13, C2.14, C2.15 및 C2.16 단백질이 성공적으로 합성되었음을 확인하였다.
제조예 3. 인간 단백질(C2.04) 및 마우스 단백질(C2.01m, C2.04m, C2.05m, C2.07m)의 제조
제조예 3.1. 단백질의 제조
하기 표 11에 사용한 재료 및 시약을 기술하였다.
재료 및 시약 제조사 Cat. #
Expi293FTM Cells Gibco A14527
Expi293TM Expression System Kit Gibco A14635
MabSelect SuRe GE Lifesciences 17543803
Superdex 200 increase 10/300 GE Lifesciences 28990944
MPCTM Ceramic Hydroxyfluoroapatite Bio-rad 1570200
단백질 서열에 해당하는 DNA 단편을 Genewiz(No. 80-383034849)에서 합성하였다. 해당 DNA 단편을 PCR로 증폭시키고, 선형화된 pcDNA3.3 발현 벡터로 넣어주었다. 시퀀싱을 통해 구조를 검증한 뒤, 대규모의 플라스미드 제조과정으로 세포 형질 주입을 수행하기에 충분한 양의 DNA를 수득하였다.
먼저 2 L의 세포 배양 배지에서 95% 이상 생존한 2.94x106 cells/mL의 Expi293F 세포를 준비한다. 플라스미드 DNA와 ExpiFectamineTM 293 시약을 먼저 Opti-MEM에 희석한 다음 혼합하여 세포 배양 배지에 첨가하였다. 세포 배양은 150 rpm의 교반 속도로 platform shaker에서 진행하였다. 온도는 37℃ CO2 농도는 8%로 유지하였다. 형질 주입 후 18 내지 20시간이 지나면 인헨서 1과 인헨서 2를 세포 배양 배지에 첨가하였다.
세포 배양 6일 후, 세포를 4,000 rpm, 25℃에서 10분간 원심분리하였다. 정제 및 젤 전기영동을 위해 상층액을 수집하였다. 상층액은 NuPAGETM 4-12% Bis-Tris Protein Gels(ThermoFisher)에 관한 설명에 따라 SDS-PAGE 젤에 로딩하였다. 단백질의 분자량 측정을 위하여 단백질 시료와 함께 PageRulerTM Unstained Protein Ladder(ThermoFisher)이 사용되었다. 각 단백질의 남은 상층액은 이후 진행되는 정제과정에 사용되었다.
단백질 정제는 다음과 같은 공정으로 수행하였다. 구체적으로, 단백질 A 컬럼(Protein A 컬럼)은 MabSelect Sure resin과 사전에 포장되었다. 세포 배양액을 로딩하기 이전에, 컬럼은 0.1 M Tris, pH 7.0으로 평형화 시켰다. 세포 배양액 로딩 후, 컬럼을 0.1 M Tris, pH 7.0으로 세척한 다음 0.1 M glycine, pH 3.5을 이용해 용출하였다. 용출한 물질에 0.1 M Tris, pH 9.0을 첨가하여 중화하였다. 이어서 시료를 PBS 용액(Sangon Biotech, B548117-0500)에서 투석하였다.
시료를 로딩하기 이전에, SEC 컬럼(GE lifesciences, Superdex 200 increase 10/300)은 PBS로 평형화시켰다. 로딩 후, PBS로 시료를 용출하고 크로마토그래피를 통해 수집하였다. 각 peak를 분석하기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다. 각 시료는 제형 용액(10mM Sodium phosphate, 0.3 내지 0.4 M NaCl, pH 6.8)에서 투석하였다.
CHT 컬럼은 CHT resin(Bio-rad, MPCTM Ceramic Hydroxyfluoroapatite)과 사전에 포장되었고, 시료를 로딩하기 전 용액 A(10 mM Sodium phosphate, 30 mM NaCl, pH 6.8)으로 평형화시켰다. 로딩 후, 컬럼을 30% 용액 B(10 mM Sodium phosphate, 1 M NaCl, pH 6.8)로 용출시키고, 30%-90%의 선형 구배 용액 B 및 최종 100% 용액 B로 용출하였다. 용출물은 SDS-PAGE로 특성화되었고, 시료는 제형 용액(10 mM Sodium phosphate, 0.3-0.4 M NaCl, pH 6.8)에서 투석하였다. 최종 단백질은 0.2 μm 필터로 여과하고, 1.5 mL 튜브에 0.5 mL씩 무균 상태로 분주하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 것과 같이, C2.04, C2.01m, C2.04m, C2.05m 및 C2.07m 단백질이 성공적으로 합성되었음을 확인하였다.
제조예 3.2. 단백질의 특성 분석
나노 드롭(Nano Drop)을 이용해 단백질의 농도를 280 nm에서 측정하였다. 단백질의 순도는 SDS-PAGE 및 HPLC-SEC로 확인하였다.
SDS-PAGE 시료는 15 μL의 정제된 단백질과 5 μL의 4x 로딩 버퍼를 혼합하고, 5분간 끓여 제조하였다. 혼합된 시료의 15 μL를 NuPAGE Bis-Tris Mini Gels 4-12% 겔에 로딩하였다. SEC-HPLC 분석을 진행하기 위해 80μL의 정제된 단백질을 HPLC system 1260 Infinity II의 TSKgel G3000SWxl 컬럼에 로딩하였고, pH 7.0, 50 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨을 실행 버퍼(running buffer)로 사용하였다.
실험예 1. 융합단백질의 결합력 확인
실험예 1.1. 비아코어 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석 기법
융합단백질 이량체의 결합력을 확인하기 위하여, Biacore 8K(GE Healthcare, 29129951)기기를 사용하여 제조한 융합단백질의 물성을 분석하였다.
하기 표 12에 사용한 재료 및 시약을 기술하였다.
시약 제조사 Cat #
CM5 sensor chip GE Healthcare 29-1496-03
HBS-EP+ buffer (10 X) GE Healthcare BR-1006-69
Amine coupling kit GE Healthcare BR-1006-33
Human antibody Capture Kit GE Healthcare 29234600
10mM Glycine 1.5 GE Healthcare BR-1003-54
C3b Complement Technology A114
실험예 1.2. CM5 센서 칩에 항 인간 면역글로불린 G(Fc) 항체 고정
100 mL 10x HBS-EP+ 완충액과 900 mL Milli-Q 물을 섞어 1 L 1x HBS-EP+ 완충액을 준비하였다. 420초 동안 50 mM NHS와 200 mM EDC를 1:1 비율로 섞은 후 10 uL/min의 유속으로 CM5 칩을 활성화시켰다. 10,000 RU 정도의 고정 레벨을 도달하기 위해 10 uL/min의 속도로 400초 동안 25 ug/mL의 항 인간 면역글로불린 G(Fc) 항체(pH 5.0 아세테이트)을 주입시켰다. 남겨진 활성화된 에스테르 그룹 들은 10 uL/min의 속도로 420초 동안 1 M 에타놀아민(pH 8.5)을 주입시켜 블록시켰다. 기초선을 안정시키기 위해 센서칩을 1xHBS-EP+를 사용하여 10 uL/분의 속도로 16시간 동안 세척하였다.
실험예 1.3. 결합 역동학 측정
기초선 안정화를 위해 샘플 스텝과 재생 스텝으로 이루어진 스타트업 사이클을 3번 수행하였다. 샘플 스텝: 1x HBS-EP+ 완충액을 flow cell에 30 uL/min의 유속으로 120초 동안 주입한후 120초 동안의 분열 단계와 30초 동안의 안정 단계를 거쳤다. 재생 스텝은 3초 동안 30 uL/min의 속도로 10 mM Glycine pH 1.5가 flow cell에 주입되었고 그 후 30초의 안정화 단계를 가졌다.
그 후, 다음과 같은 방식대로 결합 역동학 측정을 수행하였다:
C3b stock solution은 1x HBS-EP+ 완충액을 사용하여 50 nM로 희석하였다. 그 후, 50 nM 용액은 0.78125 nM 로 희석시켰다. 샘플 스텝에서 희석된 항원들은 flow cell에 30 uL/min의 속도로 주입하였다. 2개의 0 nM 항원(1x HBS-EP+ 완충액)을 사용하여 Reference signal에서 제거하였다. 180초 동안 결합시키고, 400초 동안 분리시켰다. 분리시간 후 60초 동안의 안정화 단계를 수행하였다. 재생 스텝으로는 flow cells에 30 uL/min의 속도로 30초 동안 10 mM의 pH 1.5 글리신(Glycine)을 주입한 후 60초 동안의 안정화 단계를 가졌다.
실험예 1.4. 분석 및 결과
샘플 값에서 reference와 0 nM 값들을 뺀 후 Biacore Insight Evaluation Software(Version 2.0.15.12933)와 1:1 결합 모델 곡선 맞춤(binding model for curved fitting)을 이용하여 결합 역동학을 계산하였다.
하기 표 13에 테스트 물질들의 결합 친화도를 기술하였다.
Capture 1 Solution Analyte 1 Solution ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
0.5 ug/mL C2.01 Human C3b 3.47E+06 1.21E-02 3.47E-09
2 ug/mL C2.03 Human C3b 9.10E+06 4.66E-02 5.12E-09
2 μg/mL C2.04 Human C3b 4.44E+05 3.48E-03 7.84E-09
5 μg/mL C2.01m Mouse C3b 2.00E+05 2.03E-08 1.02E-13
5 μg/mL C2.04m Mouse C3b 1.25E+05 1.23E-07 9.87E-13
그 결과, 표 13, 도 6a 및 도 6b에 나타낸 것과 같이, 인간 및 마우스의 C2.01, C2.03, C2.02, C2.01m 및 C2.04m 모두 C3b와 높은 결합력을 가지는 것을 확인하였다.
실험예 2. 융합단백질 이량체 및 보체 단백질의 결합 친화도 확인
일 구체예의 융합단백질 이량체의 보체 경로 저해 여부를 확인하기 위하여, 효소면역분석법을 통해 일 실시예의 융합단백질 이량체과 C3b 단백질 및 C9 단백질과의 결합 여부를 효소 면역 측정법으로 확인하였다.
구체적으로, C3b 단백질의 결합 여부를 확인하기 위해, 인간 C3b 단백질을 플레이트에 고정하고, C2.01, C2.04, C2.10, C2.11, 및 C2.12을 결합시켰다. 다음으로, 항-인간 면역글로불린 G 항체 및 항-겨자무과산화효소(HRP) 항체를 순차적으로 결합시켜 결합 친화도를 확인하였다. 또한, 마우스 C3b 단백질을 플레이트에 고정하고 C2.01m, C2.11m, 및 C2.12m를 결합시킨 뒤, 같은 방법으로 결합 친화도를 확인하였다.
더불어, C9 단백질과 CD59의 결합 여부를 확인하기 위해, C9 단백질을 플레이트에 고정하고 상기와 같은 방법으로 C2.04, C2.10, 및 C2.11의 결합을 확인하였다.
그 결과, C2.01, C2.04, C2.10, C2.11, 및 C2.12가 농도 의존적인 방법(Concentration dependent manner)으로 인간 C3b에 결합함을 확인하였다(도 7a 및 7c). 또한, C2.01m, C2.11m, 및 C2.12m가 농도 의존적인 방법으로 마우스 C3b에 결합함을 확인하였다(도 7b). 또한, C2.04, C2.10, 및 C2.11 모두 농도 의존적인 방법으로 C9 단백질에 결합함을 확인하였다(도 7d). 이러한 결과는, 일 양상의 조성물이 CRIg 및 CD59가 각각 C3b 및 C9에 효과적으로 결합함을 의미한다.
실험예 3. 용혈 분석을 통한 고전적 보체 경로 억제 효과 분석: CH50
하기 표 14에 사용한 시약을 기술하였다.
Reagent Vendor
Factor B-Dpl serum Comptech
Sheep RBC Yuduo biolody
Hemolysin Yuduo biolody
Gelatin Veronal Buffer (GVB; 5 mM Barbital) Boston bioproducts
Assay plate Corning
일 구체예의 융합단백질 이량체가 고전 보체 경로를 억제하는지 여부를 확인하기 위하여, C2.11의 용혈 분석(CH50)을 수행하였다.
구체적으로, 양의 적혈구를 TBS에 10분동안 400xg로 원심분리하고, 이 과정을 2번 반복한 뒤, 30분 동안 4℃에서 1 mL 20% 양 적혈구와 용혈소를 배양하였다. 다음으로, 10분 동안 400xg에서 원심분리기를 사용하여 양 적혈구를 TBS로 세척하였고, 이 과정을 2 번 반복한 뒤, 10분 동안 400xg에서 원심분리기를 사용하여 양 적혈구를 GVB++ 완충액으로 세척함으로서 적혈구를 민감화시켰다. 다음으로, GVB++ 완충액을 사용하여 민감해진 양 적혈구를 1x109/mL의 농도로 조정하였다.
C2.11의 CH50을 분석하기 위하여, 4.5%의 인간 Factor B가 결핍된 혈청(factor-B depleted serum)을 96-well plate에 추가하였다(50 μL/well). 그 후, 웰에 다양한 농도로 C2.11을 처리하였다. 4℃에서 30분 동안 배양한 후, 민감해진 양 적혈구를 추가하였다(2.5 x 106/well, 50 uL/well). 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 10분 동안 600xg에서 원심분리하여 상층액 110 uL를 수집한 후, OD415 값을 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 것과 같이, C2.11가 고전적 보체 경로에 의한 용혈작용을 억제시킴을 확인하였다.
실험예 4. 용혈 분석을 통한 대체 보체 경로 억제 효과 분석: AH50
하기 표 15에 사용한 시약을 기술하였다.
Reagent Vendor
C1q-depleted serum Comptech
Rabbit RBC Yuduo biolody
Gelatin Veronal Buffer (5 mM Barbital) Boston bioproducts
Assay plate Corning
일 구체예의 융합단백질 이량체가 대체 보체 경로를 억제하는지 여부를 확인하기 위하여, C2.11의 용혈 분석(AH50)을 수행하였다.
구체적으로, 토끼 적혈구 3 mL을 TBS로 10분동안 400xg에서 원심분리기를 사용하여 세척하고, 이 과정을 2번 반복한 후, 토끼 적혈구를 GVB_EGTA 완충액으로 10분 동안 400xg에서 원심분리기를 사용하여 다시 한번 세척함으로서 적혈구를 민감화시켰다. 다음으로, 토끼 적혈구의 농도를 GVB EGTA 완충액을 사용하여 1x109 cells/mL로 조정하였다.
AH50을 분석하기 위하여, 15% 인간 C1q-결핍 혈청을 96-well plate에 추가하였다(50 uL/well). 그 후, 웰에 다양한 농도로 C2.11을 처리하였다. 4℃에서 30분동안 배양한 후 토끼 적혈구를 추가하였다(2x106/well, 50 uL/well). 37℃에서 1.5시간동안 배양하고 10분동안 600xg에서 원심분리시켰다. 상층액 110 uL를 수집후 OD415 값을 측정하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 것과 같이, C2.11이 농도의존적으로 대체 보체 경로에 의한 용혈작용을 억제시키는 것을 확인하였다.
<110> Kanaph Therapeutics <120> FUSION PROTEIN COMPRISING COMPLEMENT PATHWAY INHIBITOR AND USE THEREOF <130> SPD21-049KNP <150> KR 10-2020-0083536 <151> 2020-07-07 <160> 72 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 496 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu CRIg-hu IgG1 Fc DANG <400> 1 Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly 1 5 10 15 Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln 20 25 30 Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile 35 40 45 Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln 50 55 60 Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln 65 70 75 80 Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val 85 90 95 Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr 100 105 110 Glu Leu Arg Val Gln Lys Leu Ser Val Ser Lys Pro Thr Val Thr Thr 115 120 125 Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Val Pro Gln Gly Met Arg Ile Ser Leu 130 135 140 Gln Cys Gln Ala Arg Gly Ser Pro Pro 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Ala Asp Cys Lys Thr Ala 1 5 10 15 Val Asn Cys Ser Ser Asp Phe Asp Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala Gly 20 25 30 Leu Gln Val Tyr Asn Lys Cys Trp Ala Phe Glu His Cys Asn Phe Asn 35 40 45 Asp Val Thr Thr Arg Leu Arg Glu Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys 50 55 60 Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe Asn Glu Gln Leu Glu Asn Ser Ser Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln 85 90 95 Cys Tyr Asn Cys Pro Asn Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr Ala Val Asn 100 105 110 Cys Ser Ser Asp Phe Asp Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala Gly Leu Gln 115 120 125 Val Tyr Asn Lys Cys Trp Ala Phe Glu His Cys Asn Phe Asn Asp Val 130 135 140 Thr Thr Arg Leu Arg Glu Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys Lys Lys 145 150 155 160 Asp Leu Cys Asn Phe Asn Glu Gln Leu Glu Asn Ser Ser Gly Gly Gly 165 170 175 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln Cys Tyr 180 185 190 Asn Cys Pro Asn Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr Ala Val Asn Cys Ser 195 200 205 Ser Asp Phe Asp Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala Gly Leu Gln Val Tyr 210 215 220 Asn Lys Cys Trp Ala Phe Glu His Cys Asn Phe Asn Asp Val Thr Thr 225 230 235 240 Arg Leu Arg Glu Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys Lys Lys Asp Leu 245 250 255 Cys Asn Phe Asn Glu Gln Leu Glu Asn 260 265 <210> 67 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CRIg extracellular domain <400> 67 Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly 1 5 10 15 Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln 20 25 30 Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile 35 40 45 Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln 50 55 60 Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln 65 70 75 80 Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val 85 90 95 Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr 100 105 110 Glu Leu Arg Val Gln Lys Leu Ser Val Ser Lys Pro Thr Val Thr Thr 115 120 125 Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Val Pro Gln Gly Met Arg Ile Ser Leu 130 135 140 Gln Cys Gln Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ile Ser Tyr Ile Trp Tyr Lys 145 150 155 160 Gln Gln Thr Asn Asn Gln Glu Pro Ile Lys Val Ala Thr Leu Ser Thr 165 170 175 Leu Leu Phe Lys Pro Ala Val Ile Ala Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys 180 185 190 Thr Ala Lys Gly Gln Val Gly Ser Glu Gln His Ser Asp Ile Val Lys 195 200 205 Phe Val Val Lys Asp Ser Ser Lys Leu Leu Lys Thr Lys Thr Glu Ala 210 215 220 Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr Val Lys Gln 225 230 235 240 Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr Leu Gly Glu Thr Ser 245 250 255 Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro 260 <210> 68 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu CD59 fragment(CD59 26-102) <400> 68 Leu Gln Cys Tyr Asn Cys Pro Asn Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr Ala 1 5 10 15 Val Asn Cys Ser Ser Asp Phe Asp Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala Gly 20 25 30 Leu Gln Val Tyr Asn Lys Cys Trp Lys Phe Glu His Cys Asn Phe Asn 35 40 45 Asp Val Thr Thr Arg Leu Arg Glu Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys 50 55 60 Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe Asn Glu Gln Leu Glu Asn 65 70 75 <210> 69 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hu CD59 fragment(CD59 26-95) <400> 69 Leu Gln Cys Tyr Asn Cys Pro Asn Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr Ala 1 5 10 15 Val Asn Cys Ser Ser Asp Phe Asp Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala Gly 20 25 30 Leu Gln Val Tyr Asn Lys Cys Trp Lys Phe Glu His Cys Asn Phe Asn 35 40 45 Asp Val Thr Thr Arg Leu Arg Glu Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys 50 55 60 Lys Lys Asp Leu Cys Asn 65 70 <210> 70 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD59-Origin <400> 70 Leu Gln Cys Tyr Asn Cys Pro Asn Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr Ala 1 5 10 15 Val Asn Cys Ser Ser Asp Phe Asp Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala Gly 20 25 30 Leu Gln Val Tyr Asn Lys Cys Trp Lys Phe Glu His Cys Asn Phe Asn 35 40 45 Asp Val Thr Thr Arg Leu Arg Glu Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys 50 55 60 Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe Asn Glu Gln Leu Glu Asn Gly Gly Thr 65 70 75 80 Ser Leu Ser Glu Lys Thr Val Leu Leu Leu Val Thr Pro Phe Leu Ala 85 90 95 Ala Ala Trp Ser Leu His Pro 100 <210> 71 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse CD59a without N-term signal peptide and C-term propeptide <400> 71 Leu Thr Cys Tyr His Cys Phe Gln Pro Val Val Ser Ser Cys Asn Met 1 5 10 15 Asn Ser Thr Cys Ser Pro Asp Gln Asp Ser Cys Leu Tyr Ala Val Ala 20 25 30 Gly Met Gln Val Tyr Gln Arg Cys Trp Lys Gln Ser Asp Cys His Gly 35 40 45 Glu Ile Ile Met Asp Gln Leu Glu Glu Thr Lys Leu Lys Phe Arg Cys 50 55 60 Cys Gln Phe Asn Leu Cys Asn Lys Ser 65 70 <210> 72 <211> 321 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CRIg (VSIG4) isoform 2 <400> 72 Met Gly Ile Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Gly His Leu Thr Val Asp 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro 20 25 30 Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly 35 40 45 Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro 50 55 60 Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala 65 70 75 80 Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val 85 90 95 Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr 100 105 110 Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp 115 120 125 Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Leu Ser Val Ser Lys Pro Thr 130 135 140 Val Thr Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Val Pro Gln Gly Met Arg 145 150 155 160 Ile Ser Leu Gln Cys Gln Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ile Ser Tyr Ile 165 170 175 Trp Tyr Lys Gln Gln Thr Asn Asn Gln Glu Pro Ile Lys Val Ala Thr 180 185 190 Leu Ser Thr Leu Leu Phe Lys Pro Ala Val Ile Ala Asp Ser Gly Ser 195 200 205 Tyr Phe Cys Thr Ala Lys Gly Gln Val Gly Ser Glu Gln His Ser Asp 210 215 220 Ile Val Lys Phe Val Val Lys Asp Ser Ser Lys Leu Leu Lys Thr Lys 225 230 235 240 Thr Glu Ala Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr 245 250 255 Val Lys Gln Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr Leu Gly 260 265 270 Glu Thr Ser Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro Val Phe Ala Ile Ile 275 280 285 Leu Ile Ile Ser Leu Cys Cys Met Val Val Phe Thr Met Ala Tyr Ile 290 295 300 Met Leu Cys Arg Lys Thr Ser Gln Gln Glu His Val Tyr Glu Ala Ala 305 310 315 320 Arg

Claims (23)

  1. CRIg(Complement receptor of the immunoglobulin superfamily)의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 CD59 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편; 및 CD59 또는 이의 변이체는 링커에 의해 결합된 것인, 융합단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 링커는 펩타이드 링커, 면역글로불린 단편 또는 이의 조합인 것인, 융합단백질.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 면역글로불린 단편은 DANG 변이 또는 NG 변이를 포함하는 것인, 융합단백질.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 면역글로불린 단편은 서열번호 5, 서열번호 19 또는 서열번호 62를 포함하는 것인, 융합단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 CD59는 서열번호 24를 포함하는 것인, 융합단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 CD59은 CD59의 단편인 것인, 융합단백질.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 CD59의 단편은 서열번호 24의 26번째 내지 102번째 또는 26번째 내지 95번째의 아미노산을 포함하는 것인, 융합단백질.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 CD59 변이체는 서열번호 24의 66번째 아미노산 또는 69번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인, 융합단백질.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 CD59 변이체는 서열번호 24의 아미노산 서열에서 K66Q, K66A 및 H69Q로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환이 일어난 것인, 융합단백질.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 하기 구조식 (I) 또는 (II)로 이루어진 것인, 융합단백질:
    N'-X-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-Y-C'(I)
    N'-Y-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-X-C'(II)
    이때, 상기 구조식 (I) 및 (II)에 있어서,
    상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
    상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
    상기 X는 CRIg의 세포외도메인 또는 이의 단편이고,
    상기 Y는 CD59 또는 이의 변이체이며,
    상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,
    상기 n 및 m은 각각 독립적으로, O 또는 1이며,
  12. 제11항에 있어서,
    상기 링커(1)이 서열번호 29 또는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 링커(2)가 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 11, 서열번호 18 및 서열번호 22로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것인, 융합단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 융합단백질 이량체는 동형이량체(Homodimer)인 것인, 융합단백질 이량체.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 48, 서열번호 55 및 서열번호 59로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것인, 폴리뉴클레오티드.
  19. 제17항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  20. 제19항의 벡터가 도입된 형질전환 세포.
  21. 제1항의 융합단백질; 또는 제15항의 이량체를 유효성분으로 포함하는 안질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 안질환은 노화-관련 황반 변성(AMD), 지도모양 위축증(GA), 맥락막 혈관신생(CNV), 포도막염, 당뇨병성 및 다른 허혈-관련 망막증, 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 힙펠-린다우병, 눈의 히스토플라스마증, 망막 중심 정맥 폐색(CRVO), 각막 혈관신생 및 망막 혈관신생으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 안질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 약학 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하는 것인, 안질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
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