KR20220004097A - 신경 망막과 망막 색소 상피 세포와 하이드로겔을 포함하는 복합체 및 그의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트와 하이드로겔을 포함하는 복합체로서, 신경 망막 및 망막 색소 상피 세포 시트가 각각 인간 다능성 줄기 세포 유래이고, 신경 망막에 있어서, 적어도 시세포층을 포함하는 신경 망막층이 형성되어 있고, 시세포층은 적어도 시세포, 시세포 전구 세포 및 망막 전구 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 세포를 포함하고, 하이드로겔의 융해점이 20℃ 내지 40℃이고, 신경 망막 및 망막 색소 상피 세포 시트의 전체가 하이드로겔에 포매되어 있고, 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트는 각각의 표면의 접선 방향이 대략 평행하고 있고, 신경 망막의 정상 단부면과 망막 색소 상피 세포 시트의 정상 단부면이 마주 보고 있고, 양자가 하이드로겔에 의해 격리되어서 접촉하고 있지 않은 복합체.

Description

신경 망막과 망막 색소 상피 세포와 하이드로겔을 포함하는 복합체 및 그의 제조 방법
본 발명은 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트와 하이드로겔을 포함하는 복합체 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
진행된 노인성 황반 변성증 등의 시세포와 망막 색소 상피(RPE) 세포가 동시에 장애가 된 경우에는, 신경 망막(NR)과 망막 색소 상피(RPE) 세포의 동시 이식이 바람직하다고 알려져 있다.
망막 색소 변성 등 망막 조직의 장애에 기초하는 질환에 대한 망막의 이식 치료와 관련하여, 다능성 줄기 세포로부터 신경 망막 또는 망막 색소 상피(RPE) 세포를 제조하는 방법의 연구가 활발하게 행해지고 있다. 다능성 줄기 세포로부터 신경 망막을 제조하는 방법으로서, 예를 들어 다능성 줄기 세포의 응집체를, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지 안에서 부유 배양함으로써 신경 망막을 얻는 방법(특허문헌 1, 2 및 비특허문헌 1)이 알려져 있다. 또한, 다능성 줄기 세포로부터 RPE 세포를 제조하는 방법으로서, 예를 들어 레티노인산 수용체 안타고니스트를 포함하는 배지 안에서 유도한 망막 전구 세포로부터 RPE 세포를 얻는 방법(특허문헌 3)이 알려져 있다. 그러나, 따로따로 조제된 NR과 RPE 세포의 양자가 생체 망막에 있어서의 망막 조직과 마찬가지로 방향성을 가지고 정확하게 국재되어 있는 상태로, 양자를 포함하는 망막 조직을 제조하는 방법은 알려져 있지 않다.
한편, 지금까지 이식에 있어서 젤라틴을 이용하는 기술이 검토되어 왔다. 예를 들어 시세포층을 잘라낼 때의 잘라냄 용이성을 개선하기 위해서, 생체 망막 조직을 젤라틴으로 굳히는 방법(비특허문헌 2), 온도 감수성 젤라틴으로 생체 망막 조직을 포매하는 방법(비특허문헌 3), 부서지기 쉬운 태아 조직을 보호하기 위해서 인간 태아 유래 망막 조직을 젤라틴으로 포매하는 방법(비특허문헌 4) 등을 들 수 있다.
국제공개 제2015/025967호 국제공개 제2016/063986호 국제공개 제2012/173207호
Kuwahara A. et al., "Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue", Nature Communications, 6, 6286(2015) Taylor et al., "The epidemiology of infection in trachoma." IOVS 1989 Aug; Volume 30, Issue 8, p1823-1833 M'Barek et al., "Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration", Sci. Transl. Med. 2017 Dec; Volume 9, Issue 421 Seiler et al., "Cell replacement and visual restoration by retinal sheet transplants", Prog Retin Eye Res. 2012 Nov; 31(6): 661-687
본 발명자들의 검토에 의하면, 하이드로겔로 포매한 신경 망막 및 망막 색소 상피 세포 시트를 포함하는 복합체를 제조할 때 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트가 분리되어 있기 때문에, 이식까지의 조작의 과정에서 복합체가 무너지기 쉬워 이식에 적합한 복합체를 제조할 수 없다고 하는 과제를 발견했다. 또한, 본 발명자들의 검토에 의하면, 하이드로겔로 포매한 신경 망막 및 망막 색소 상피 세포 시트를 포함하는 복합체를 제조할 때에, 따로따로 제조된 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트를 직접적으로 장시간 접촉시키면, 물리적인 접촉에 의해 세포가 상해를 입어버리는 것이 판명되었다.
한편, 하이드로겔이 분해되기 어려우면, 이식한 신경 망막과 동시에 이식한 RPE 세포 혹은 호스트의 RPE 세포와의 상호 작용 또는 이들 세포의 사이에서의 물질의 이동이 어렵다고 하는 관점에서, 하이드로겔은 이식 후 빠르게 용해되고, 분해 및 흡수되는 것이 바람직하다.
그래서 본 발명은 상기 사정을 감안하여, 이식에 적합한 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트의 복합체 및 그의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들이 예의 연구한 결과, 예를 들어 융해점이 체온 부근인 하이드로겔을 저온 조건 하에 고농도로 굳힘으로써, 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트의 복합체의 취급이 용이해져서, 이식에 적합한 망막 조직을 제공할 수 있는 것을 발견했다. 특히, 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트 사이 그리고 그 주위에 하이드로겔을 개재시킴으로써 세포 상해를 방지할 수 있고, 또한 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트의 복합체의 취급이 용이해져서, 이식에 적합한 망막 조직을 제공할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 각 발명에 관한 것이다.
[1]
신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트와 하이드로겔을 포함하는 복합체로서,
상기 신경 망막 및 상기 망막 색소 상피 세포 시트가 각각 인간 다능성 줄기 세포 유래이고,
상기 신경 망막에 있어서, 적어도 시세포층을 포함하는 신경 망막층이 형성되어 있고, 상기 시세포층은 적어도 시세포, 시세포 전구 세포 및 망막 전구 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 세포를 포함하고,
상기 하이드로겔의 융해점이 20℃ 내지 40℃이고,
상기 신경 망막 및 상기 망막 색소 상피 세포 시트의 전체가 상기 하이드로겔에 포매되어 있고, 상기 신경 망막과 상기 망막 색소 상피 세포 시트는 각각의 표면의 접선 방향이 대략 평행하고 있고, 상기 신경 망막의 정상 단부면과 상기 망막 색소 상피 세포 시트의 정상 단부면이 마주 보고 있고, 양자가 상기 하이드로겔에 의해 격리되어서 접촉하고 있지 않은, 복합체.
[2]
상기 하이드로겔의 젤리 강도가 1000g 내지 2000g인, 상기 [1]에 기재된 복합체.
[3]
상기 하이드로겔의 농도가 10중량% 내지 50중량%인, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 복합체.
[4]
상기 하이드로겔의 pH가 6.5 내지 7.5인, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 것에 기재된 복합체.
[5]
상기 하이드로겔이 생분해성을 갖는, 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 것에 기재된 복합체.
[6]
상기 하이드로겔이 젤라틴의 하이드로겔인, 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 것에 기재된 복합체.
[7]
상기 젤라틴이 알칼리 처리 및/또는 가열 처리된 젤라틴인, 상기 [6]에 기재된 복합체.
[8]
상기 신경 망막이, 인간 다능성 줄기 세포를 분화 유도해서 얻어진 세포 응집체에서 얻어지는 신경 망막이고,
상기 세포 응집체가 적어도 제1 상피 조직 및 제2 상피 조직을 포함하고, 상기 제1 상피 조직은 인간 신경 망막을 포함하고, 제2 상피 조직은 상기 제1 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기의 연속성과 다른 표면의 접선의 기울기의 연속성을 갖고, 또한 망막계 세포 이외의 세포 및/또는 망막 색소 상피 세포를 포함하고,
상기 신경 망막이, 상기 세포 응집체에 있어서의 제2 상피 조직으로부터 가장 떨어진 제1 상피 조직 상의 영역을 포함하는, 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 것에 기재된 복합체.
[9]
신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트와 하이드로겔을 포함하는 복합체의 제조 방법으로서,
상기 신경 망막 및 상기 망막 색소 상피 세포 시트가 각각 인간 다능성 줄기 세포 유래이고,
상기 신경 망막에 있어서, 적어도 시세포층을 포함하는 신경 망막층이 형성되어 있고, 상기 시세포층은 적어도 시세포, 시세포 전구 세포 및 망막 전구 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 세포를 포함하고,
상기 하이드로겔의 융해점이 20℃ 내지 40℃이고,
상기 방법이,
(1) 용기 안에 상기 망막 색소 상피 세포 시트 및 상기 신경 망막 중 어느 한쪽을 설치하는 제1 공정과,
(2) 유동 상태의 하이드로겔을, 상기 한쪽을 설치한 상기 용기에 첨가하는 제2 공정과,
(3) 냉각하고, 상기 한쪽의 전체를 포매하도록 상기 하이드로겔을 굳혀, 상기 한쪽과 상기 하이드로겔을 구비하는 제1 하이드로겔층을 형성하는 제3 공정과,
(4) 상기 제1 하이드로겔층 중의 상기 한쪽과, 상기 망막 색소 상피 세포 시트 및 상기 신경 망막의 다른 쪽이 각각의 표면의 접선 방향이 대략 평행이 되고, 또한 상기 신경 망막의 정상 단부면과 상기 망막 색소 상피 세포의 정상 단부면이 마주 보도록, 상기 제1 하이드로겔층 상에 상기 다른 쪽을 더 설치하는 제4 공정과,
(5) 유동 상태의 하이드로겔을, 상기 다른 쪽을 더 설치한 상기 용기에 첨가하는 제5 공정과,
(6) 냉각하고, 상기 제1 하이드로겔층 및 상기 다른 쪽의 전체를 포매하도록 상기 하이드로겔을 굳혀, 상기 제1 하이드로겔층과 상기 다른 쪽과 상기 하이드로겔을 구비하는 제2 하이드로겔층을 형성하는 제6 공정
을 포함하는, 제조 방법.
[10]
상기 제3 공정에 있어서 2℃ 내지 8℃로 냉각하는, 상기 [9]에 기재된 제조 방법.
[11]
상기 제6 공정에 있어서 2℃ 내지 8℃로 냉각하는, 상기 [9] 또는 [10]에 기재된 제조 방법.
[12]
제6 공정 후에, (7) 상기 복합체를 10℃ 내지 20℃에서 보존하는 제7 공정을 더 포함하는, 상기 [9] 내지 [11] 중 어느 것에 기재된 제조 방법.
[13]
상기 하이드로겔의 젤리 강도가 1000g 내지 2000g인, 상기 [9] 내지 [12]에 기재된 제조 방법.
[14]
상기 하이드로겔의 농도가 10중량% 내지 50중량%인, 상기 [9] 내지 [13]에 기재된 제조 방법.
[15]
상기 하이드로겔의 pH가 6.5 내지 7.5인, 상기 [9] 내지 [14] 중 어느 것에 기재된 제조 방법.
[16]
상기 하이드로겔이 생분해성을 갖는, 상기 [9] 내지 [15] 중 어느 것에 기재된 제조 방법.
[17]
상기 하이드로겔이 젤라틴의 하이드로겔인, 상기 [9] 내지 [16] 중 어느 것에 기재된 제조 방법.
[18]
상기 젤라틴이 알칼리 처리 및/또는 가열 처리된 젤라틴인, 상기 [17]에 기재된 제조 방법.
[19]
상기 신경 망막이, 인간 다능성 줄기 세포를 분화 유도해서 얻어진 세포 응집체에서 얻어지는 신경 망막이고,
상기 세포 응집체가 적어도 제1 상피 조직 및 제2 상피 조직을 포함하고, 상기 제1 상피 조직은 인간 신경 망막을 포함하고, 제2 상피 조직은 상기 제1 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기의 연속성과 다른 표면의 접선의 기울기의 연속성을 갖고, 또한 망막계 세포 이외의 세포 및/또는 망막 색소 상피 세포를 포함하고,
상기 신경 망막이, 상기 세포 응집체에 있어서의 제2 상피 조직으로부터 가장 떨어진 제1 상피 조직 상의 영역을 포함하는, 상기 [9] 내지 [18] 중 어느 것에 기재된 제조 방법.
[20]
상기 [1] 내지 [8] 중 어느 것에 기재된 복합체를 유효 성분으로서 함유하는, 의약 조성물.
[21]
상기 [1] 내지 [8] 중 어느 것에 기재된 복합체를 함유하여 이루어지는, 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환의 치료약.
[22]
상기 [1] 내지 [8] 중 어느 것에 기재된 복합체를 함유하여 이루어지는, 이식용 조성물.
[23]
환자의 안저 또는 망막 아래(Subretinal Space)에 이식하기 위한, [22]에 기재된 이식용 조성물.
[24]
이식된 환자에 있어서, 이식된 복합체의 신경 망막이 해당 환자의 신경 망막층을 향하고, 이식된 복합체의 망막 색소 상피 세포 시트가 해당 환자의 망막 색소 상피층을 향한 상태로 생착하도록 이식되기 위한, [23]에 기재된 이식용 조성물.
[25]
이하의 공정을 포함하는, 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환의 치료 방법:
(1) [1] 내지 [8] 중 어느 것에 기재된 복합체를 환자의 안저 또는 망막 아래(Subretinal Space)에 이식하는 공정,
(2) 환자의 생체 내에 있어서, 이식된 복합체의 신경 망막이 해당 환자의 신경 망막층을 향하고, 이식된 복합체의 망막 색소 상피 세포 시트가 해당 환자의 망막 색소 상피층을 향한 상태로 생착되는 공정.
본 발명에 따르면, 이식에 적합한 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트의 복합체 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이 가능하게 된다.
도 1은 실시예 1에 있어서의, hES 세포 유래 신경 망막 (A), hES 세포 유래 부유 RPE (B) 및 hES 세포 유래 RPE 세포 시트 (C)를 현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 화상이다.
도 2는 실시예 5에 있어서의, pH5의 젤라틴으로 3일간 포매하고, 회복 배양한 후의 hES 세포 유래 신경 망막의 형태를 현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 화상이다.
도 3은 실시예 5에 있어서의, pH7의 젤라틴으로 3일간 포매하고, 회복 배양한 후의 hES 세포 유래 신경 망막의 형태를 현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 화상이다.
도 4는 실시예 5에 있어서의, hES 세포 유래 신경 망막에 대하여 DAPI, RCVRN 및 HLA 클래스I로 면역 염색을 행한 결과 및 CRX::Venus의 형광(pH5)을 나타내는 형광 현미경 화상이다.
도 5는 실시예 5에 있어서의, hES 세포 유래 신경 망막에 대하여 DAPI, RCVRN 및 HLA 클래스I로 면역 염색을 행한 결과 및 CRX::Venus의 형광(pH7)을 나타내는 형광 현미경 화상이다.
도 6은 실시예 5에 있어서의, hES 세포 유래 신경 망막에 대하여 DAPI, 에즈린(Ezrin) 및 ColIV로 면역 염색을 행한 결과 및 CRX::Venus의 형광을 나타내는 형광 현미경 화상이다.
도 7은 실시예 5에 있어서의, hES 세포 유래 신경 망막에 대하여 DAPI, Chx10 및 Pax6으로 면역 염색을 행한 결과 및 CRX::Venus의 형광을 나타내는 형광 현미경 화상이다.
도 8은 실시예 5에 있어서의, hES 세포 유래 신경 망막에 대하여 DAPI, 카스파제(Caspase)3, Chx10 및 Ki67로 면역 염색을 행한 결과를 나타내는 형광 현미경 화상이다.
도 9는 실시예 7의 실험 수순을 나타내는 개념도이다.
도 10은 실시예 7에 있어서의, 망막 색소 상피(RPE) 시트 위에 신경 망막(NR)이 놓여 있는 샘플 (1) 및 샘플 (2)를 나타내는 사진이다.
도 11은 실시예 7에 있어서의, RPE 시트 위에 NR이 놓여 있는 샘플 (1) 및 샘플 (2)의 CRX::Venus의 형광을 나타내는 형광 현미경 화상이다.
도 12는 실시예 7에 있어서의, 젤라틴의 잘라내기 작업의 수순을 나타내는 사진이다.
도 13은 실시예 7에 있어서의, 포매된 인간 ES 세포 유래 RPE와 신경 망막 복합체의 절편에 대하여 CRX::Venus의 형광을 나타내는 형광 현미경 화상이다.
도 14는 실시예 7에 있어서의, 젤라틴 접착 직후의 포매된 인간 ES 세포 유래 RPE와 신경 망막 복합체의 절편에 대하여 DAPI로 염색을 행한 결과 및 CRX::Venus의 형광을 나타내는 형광 현미경 화상이다.
도 15는 실시예 8에 있어서의, 조직 절편 중의 인간 세포 및 RPE 세포에 대하여 DAPI, Stem121 및 RPE65로 면역 염색을 행한 결과 및 CRX::Venus의 형광을 나타내는 형광 현미경 화상이다.
도 16은 실시예 8에 있어서의, 조직 절편 중의 인간 세포 및 RPE 세포에 대하여 DAPI, Stem121 및 RPE65로 면역 염색을 행한 결과 및 CRX::Venus의 형광을 나타내는 형광 현미경 화상이다.
도 17은 실시예 8에 있어서의, 조직 절편 중의 인간 세포 및 RPE 세포에 대하여 DAPI, HuNu 및 MITF로 면역 염색을 행한 결과를 나타내는 형광 현미경 화상이다.
도 18은 실시예 8에 있어서의, 조직 절편 중의 인간 세포 및 RPE 세포에 대하여 DAPI, HuNu, MITF 및 BF로 면역 염색을 행한 결과를 나타내는 형광 현미경 화상이다.
도 19는 실시예 8에 있어서의, 조직 절편 중의 인간 세포 및 RPE 세포에 대하여 DAPI, HuNu, MITF 및 Iba-1로 면역 염색을 행한 결과를 나타내는 형광 현미경 화상이다.
도 20은 실시예 8에 있어서의, 조직 절편 중의 인간 세포 및 RPE 세포에 대하여 DAPI, HuNu, MITF 및 Iba-1로 면역 염색을 행한 결과를 나타내는 형광 현미경 화상이다.
도 21은 실시예 9에 있어서의, RPE 세포 시트 위에 NR이 놓여 있는 것을 나타내는 현미경 화상 (A) 및 CRX::Venus의 형광을 나타내는 형광 현미경 화상 (B)이다.
〔정의〕
「줄기 세포」란, 분화능 및 증식능(특히 자기 복제능)을 갖는 미분화된 세포를 의미한다. 줄기 세포에는, 분화 능력에 따라 다능성 줄기 세포(pluripotent stem cell), 복능성 줄기 세포(multipotent stem cell), 단능성 줄기 세포(unipotent stem cell) 등의 아집단이 포함된다. 다능성 줄기 세포란, 인비트로에 있어서 배양하는 것이 가능하고, 또한 3배엽(외배엽, 중배엽, 내배엽) 및/또는 배체외 조직에 속하는 세포 계보 모두로 분화될 수 있는 능력(분화 다능성 (pluripotency))을 갖는 줄기 세포를 말한다. 복능성 줄기 세포란, 모든 종류는 아니지만, 복수종의 조직이나 세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는 줄기 세포를 의미한다. 단능성 줄기 세포란, 특정한 조직이나 세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는 줄기 세포를 의미한다.
「다능성 줄기 세포」는 수정란, 클론배, 생식 줄기 세포, 조직 내 줄기 세포, 체세포 등으로부터 유도할 수 있다. 다능성 줄기 세포로서는, 배아 줄기 세포(ES 세포: Embryonic stem cell), EG 세포(Embryonic germ cell), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포: induced pluripotent stem cell) 등을 들 수 있다. 간엽계 줄기 세포(mesenchymal stem cell; MSC)에서 얻어지는 Muse 세포(Multi-lineage differentiating stress enduring cell)나, 생식 세포(예를 들어 정소)로부터 제작된 GS 세포도 다능성 줄기 세포에 포함된다.
1998년에 인간 배아 줄기 세포가 수립되어 있어, 재생 의학에도 이용되고 있다. 배아 줄기 세포는 내부 세포 응집체를 피더 세포 상 또는 bFGF를 포함하는 배지 안에서 배양함으로써 제조할 수 있다. 배아 줄기 세포의 제조 방법은, 예를 들어 WO96/22362, WO02/101057, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718 등에 기재되어 있다. 배아 줄기 세포는 소정의 기관으로부터 입수할 수 있고, 또한 시판품을 구입할 수도 있다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포인 KhES-1, KhES-2 및 KhES-3은 교토 대학 재생 의과학 연구소로부터 입수 가능하다. 인간 배아 줄기 세포인 Crx::Venus주(KhES-1 유래)는 국립 연구 개발 법인 이화학 연구소로부터 입수 가능하다.
「인공 다능성 줄기 세포」란, 체세포를 공지된 방법 등에 의해 초기화(reprogramming)함으로써, 다능성을 유도한 세포이다.
인공 다능성 줄기 세포는 2006년, 야마나카 등에 의해 마우스 세포에서 수립되었다(Cell, 2006, 126(4), pp.663-676). 인공 다능성 줄기 세포는 2007년에 인간 섬유아세포에서도 수립되어, 배아 줄기 세포와 마찬가지로 다능성과 자기 복제능을 갖는다(Cell, 2007, 131(5), pp.861-872; Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920; Nat.Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106).
인공 다능성 줄기 세포는 구체적으로, 섬유아세포나 말초혈 단핵구 등분화한 체세포를, Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc(c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28, Esrrb 등을 포함하는 초기화 유전자군에서 선택되는 복수의 유전자의 조합 중 어느 것의 발현에 의해 초기화해서 다분화능을 유도한 세포를 들 수 있다. 바람직한 초기화 인자의 조합으로서는, (1) Oct3/4, Sox2, Klf4 및 Myc(c-Myc또는 L-Myc), (2) Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28 및 L-Myc(Stem Cells, 2013; 31:458-466)를 들 수 있다.
인공 다능성 줄기 세포로서, 유전자 발현에 의한 직접 초기화로 제조하는 방법 이외에, 화합물의 첨가 등에 의해 체세포로부터 인공 다능성 줄기 세포를 유도할 수도 있다(Science, 2013, 341, pp.651-654).
또한, 주화된 인공 다능성 줄기 세포를 입수하는 것도 가능하며, 예를 들어 교토 대학에서 수립된 201B7 세포, 201B7-Ff 세포, 253G1 세포, 253G4 세포, 1201C1 세포, 1205D1 세포, 1210B2 세포, 1231A3 세포 등의 인간 인공 다능성 세포주가 교토 대학 및 iPS 아카데미아 재팬 가부시키가이샤로부터 입수 가능하다. 주화된 인공 다능성 줄기 세포로서, 예를 들어 교토 대학에서 수립된 Ff-I01 세포 및 Ff-I14 세포가 교토 대학에서 입수 가능하다.
본 명세서에 있어서, 다능성 줄기 세포는 바람직하게는 배아 줄기 세포 또는 인공 다능성 줄기 세포이며, 보다 바람직하게는 인공 다능성 줄기 세포이다.
본 명세서에 있어서, 다능성 줄기 세포는 인간의 다능성 줄기 세포이며, 바람직하게는 인간 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포) 또는 인간 배아 줄기 세포(ES 세포)이다.
인간 iPS 세포 등의 다능성 줄기 세포는 당업자에게 주지된 방법으로 유지 배양 및 확대 배양에 회부할 수 있다.
「망막 조직(Retinal tissue)」이란, 생체 망막에 있어서 각 망막층을 구성하는 망막계 세포가 1종류 또는 복수 종류, 일정한 질서에 따라 존재하는 조직을 의미하고, 「신경 망막(Neural Retina)」은 망막 조직이며, 후술하는 망막층 중 망막 색소 상피층을 포함하지 않는 내측의 신경 망막층을 포함하는 조직을 의미한다.
「망막계 세포」란, 생체 망막에 있어서 각 망막층을 구성하는 세포 또는 그의 전구 세포를 의미한다. 망막계 세포에는, 시세포(간체 시세포, 추체 시세포), 수평 세포, 아마크린 세포, 개재 신경 세포, 망막 신경절 세포(신경절 세포), 쌍극 세포(간체 쌍극 세포, 추체 쌍극 세포), 뮐러글리아 세포, 망막 색소 상피(RPE) 세포, 모양체 주연부 세포, 이들의 전구 세포(예: 시세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포 등), 망막 전구 세포 등의 세포가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 망막계 세포 중 신경 망막층을 구성하는 세포로서, 구체적으로는 시세포(간체 시세포, 추체 시세포), 수평 세포, 아마크린 세포, 개재 신경 세포, 망막 신경절 세포(신경절 세포), 쌍극 세포(간체 쌍극 세포, 추체 쌍극 세포), 뮐러글리아 세포, 및 이들의 전구 세포(예: 시세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포 등) 등의 세포를 들 수 있다.
「성숙한 망막계 세포」란, 인간 성인의 망막 조직에 포함될 수 있는 세포를 의미하고, 구체적으로는 시세포(간체 시세포, 추체 시세포), 수평 세포, 아마크린 세포, 개재 신경 세포, 망막 신경절 세포(신경절 세포), 쌍극 세포(간체 쌍극 세포, 추체 쌍극 세포), 뮐러글리아 세포, 망막 색소 상피(RPE) 세포, 모양체 주연부 세포 등의 분화된 세포를 의미한다. 「미성숙한 망막계 세포」란, 성숙한 망막계 세포로의 분화가 결정지어져 있는 전구 세포(예: 시세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포, 망막 전구 세포 등)를 의미한다.
시세포 전구 세포, 수평 세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포, 아마크린 세포 전구 세포, 망막 신경절 세포 전구 세포, 뮐러글리아 전구 세포, 망막 색소 상피 전구 세포란, 각각 시세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포, 뮐러글리아 세포, 망막 색소 상피 세포로의 분화가 결정지어져 있는 전구 세포를 말한다.
「망막 전구 세포」란, 시세포 전구 세포, 수평 세포 전구 세포, 쌍극 세포 전구 세포, 아마크린 세포 전구 세포, 망막 신경절 세포 전구 세포, 뮐러글리아 세포, 망막 색소 상피 전구 세포 등 중 어느 것의 미성숙한 망막계 세포로도 분화될 수 있는 전구 세포이며, 최종적으로 시세포, 간체 시세포, 추체 시세포, 수평 세포, 쌍극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포, 망막 색소 상피 세포 등 중 어느 것의 성숙한 망막계 세포로도 분화될 수 있는 전구 세포를 의미한다.
「시세포(photoreceptor cell)」란, 망막의 시세포층에 존재하고, 광 자극을 흡수하여 전기 신호로 변환하는 역할을 갖는다. 시세포에는, 밝은 곳에서 기능하는 추체(cone)와 어두운 곳에서 기능하는 간체(杆體)(또는 간체(桿體), rod)의 2종류가 있다. 시세포는 시세포 전구 세포로부터 분화되고, 성숙한다. 세포가 시세포 혹은 시세포 전구 세포인지의 여부는, 당업자이면 예를 들어 후술하는 세포 마커(시세포 전구 세포에서 발현하는 Crx 및 Blimp1, 시세포에서 발현하는 리커버린, 성숙 시세포에서 발현하는 로돕신, S-옵신(Opsin) 및 M/L-옵신 등)의 발현, 외절 구조의 형성 등에 의해 용이하게 확인할 수 있다. 일 양태에 있어서, 시세포 전구 세포는 Crx 양성 세포이며, 시세포는 로돕신, S-옵신 및 M/L-옵신 양성 세포이다.
망막계 세포의 존재는 망막계 세포의 마커(이하, 「망막계 세포 마커」라고 하는 경우가 있다.)의 발현의 유무에 의해 확인할 수 있다. 망막계 세포 마커의 발현 유무, 또는 세포 집단 혹은 조직에 있어서의 망막계 세포 마커 양성 세포의 비율은 당업자이면 용이하게 확인할 수 있다. 예를 들어 시판 중인 항체를 사용한 플로 사이토메트리, 면역 염색 등의 방법에 의해, 특정한 망막계 세포 마커 양성 세포의 수를 전체 세포수로 나눔으로써 확인할 수 있다.
망막계 세포 마커로서는, 망막 전구 세포에서 발현하는 Rx(Rax라고도 한다) 및 PAX6, 신경 망막 전구 세포에서 발현하는 Rx, PAX6 및 Chx10, 시세포 전구 세포에서 발현하는 Crx 및 Blimp1 등을 들 수 있다. 또한, 쌍극 세포에서 강 발현하는 Chx10, 쌍극 세포에서 발현하는 PKCα, Goα, VSX1 및 L7, 망막 신경절 세포에서 발현하는 TuJ1 및 Brn3, 아마크린 세포에서 발현하는 칼레티닌(Calretinin) 및 HPC-1, 수평 세포에서 발현하는 칼빈딘(Calbindin), 시세포 및 시세포 전구 세포에서 발현하는 리커버린(Recoverin), 간체 세포에서 발현하는 로돕신(Rhodopsin), 간체 시세포 및 간체 시세포 전구 세포에서 발현하는 Nrl, 추체 시세포에서 발현하는 S-옵신 및 LM-옵신, 추체 세포, 추체 시세포 전구 세포 및 신경절 세포에서 발현하는 RXR-γ, 추체 시세포 중, 분화 초기에 출현하는 추체 시세포 또는 그의 전구 세포에서 발현하는 TRβ2, OTX2 및 OC2, 수평 세포, 아마크린 세포 및 신경절 세포에서 공통되게 발현하는 Pax6, 망막 색소 상피 세포에서 발현하는 RPE65 및 Mitf, 뮬러 세포에서 발현하는 CRALBP 등을 들 수 있다.
「양성 세포」란, 특정한 마커를 세포 표면 상 또는 세포 내에 발현하고 있는 세포를 의미한다. 예를 들어 「Chx10 양성 세포」란, Chx10 단백질을 발현하고 있는 세포를 의미한다.
「망막 색소 상피 세포」란, 생체 망막에 있어서 신경 망막의 외측에 존재하는 상피 세포를 의미한다. 세포가 망막 색소 상피 세포인지의 여부는 당업자이면, 예를 들어 후술하는 세포 마커(RPE65, Mitf, CRALBP, MERTK, BEST1 등)의 발현이나, 멜라닌 과립의 존재(흑갈색), 세포간의 밀착 연접, 다각형·포석상의 특징적인 세포 형태 등에 의해 용이하게 확인할 수 있다. 세포가 망막 색소 상피 세포의 기능을 갖는지의 여부는, VEGF 및 PEDF 등의 사이토카인의 분비능 등에 의해 용이하게 확인할 수 있다. 일 양태에 있어서, 망막 색소 상피 세포는 RPE65 양성 세포, Mitf 양성 세포, 또는 RPE65 양성 그리고 Mitf 양성 세포이다.
「망막 색소 상피 세포 시트」란, 망막 색소 상피 세포가 적어도 이차원의 방향으로 생물학적 결합에 의해 서로 접착하고, 단일 또는 복수의 세포로 구성되는 단층 또는 중층의 시트상의 구조체를 의미한다.
「망막층」이란 망막을 구성하는 각 층을 의미하고, 구체적으로는 망막 색소 상피층, 시세포층, 외경계막, 외과립층, 외망상층, 내과립층, 내망상층, 신경절 세포층, 신경 섬유층 및 내경계막을 들 수 있다.
「신경 망막층」이란 신경 망막을 구성하는 각 층을 의미하고, 구체적으로는 시세포층, 외경계막, 외과립층, 외망상층, 내과립층, 내망상층, 신경절 세포층, 신경섬유층 및 내경계막을 들 수 있다. 「시세포층」이란 망막층(신경 망막층)의 1종이며, 신경 망막의 가장 외측에 형성되고, 시세포(간체 시세포, 추체 시세포), 시세포 전구 세포 및 망막 전구 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 세포를 많이 포함하는 망막층을 의미한다. 각각의 세포가 어느 망막층을 구성하는 세포일지는 공지된 방법, 예를 들어 세포 마커의 발현 유무 또는 발현의 정도 등에 의해 확인할 수 있다.
「세포 응집체」(Cell Aggregate)란, 복수의 세포끼리가 접착해서 입체 구조를 형성하고 있는 것이면 특별히 한정은 없고, 예를 들어 배지 등의 매체 중에 분산되어 있었던 세포가 집합해서 형성하는 덩어리, 또는 세포 분열을 거쳐서 형성되는 세포의 덩어리 등을 의미한다. 세포 응집체에는, 특정한 조직을 형성하고 있는 경우도 포함된다.
「스피어(sphere)상 세포 응집체」는 구상에 가까운 입체적인 형을 갖는 세포 응집체를 의미한다. 구상에 가까운 입체적인 형이란 삼차원 구조를 갖는 형이며, 이차원면에 투영했을 때에, 예를 들어 원형 또는 타원형을 나타내는 구상형, 및 구상형이 복수 융합해서 형성되는 형상(예를 들어 이차원으로 투영한 경우에 2 내지 4개의 원형 혹은 타원형이 겹쳐져서 형성하는 형을 나타낸다)을 들 수 있다. 일 양태에 있어서, 응집체의 코어부는 소포성 층상 구조를 갖고, 명시야 현미경 하에서는, 중앙부가 어둡고 외연 부분이 밝게 관찰된다고 하는 특징을 갖는다.
「모양체 주연부 유사 구조체」란, 모양체 주연부와 유사한 구조체이다. 「모양체 주연부(ciliary marginal zone; CMZ)」로서는, 예를 들어 생체 망막에 있어서 신경 망막과 망막 색소 상피의 경계 영역에 존재하는 조직이며, 또한 망막의 조직 줄기 세포(망막 줄기 세포)를 포함하는 영역을 들 수 있다. 모양체 주연부는 모양체 가장자리(ciliarymargin) 또는 망막 가장자리(retinal margin)라고도 불리며, 모양체 주연부, 모양체 가장자리 및 망막 가장자리는 동등한 조직이다. 모양체 주연부는 망막 조직에 대한 망막 전구 세포, 분화 세포의 공급, 망막 조직 구조의 유지 등에 중요한 역할을 하고 있는 것이 알려져 있다. 모양체 주연부의 마커 유전자로서는, 예를 들어 Rdh10 유전자(양성), Otx1 유전자(양성) 및 Zic1(양성)을 들 수 있다.
「정상 단부면(apical)」이란, 상피 조직에 있어서 뮤코 다당이 풍부하고(PAS 염색 양성), 라미닌 및 IV형 콜라겐을 많이 포함하는 50-100㎚의, 상피 세포가 산생된 기저(basal)측의 층(기저막)이 존재하는 기저막측과는 반대측에 형성되는 표면(표층면)을 말한다. 「기저막」이란, 라미닌 및 IV형 콜라겐을 많이 포함하는 50-100㎚의, 상피 세포가 산생된 기저(basal)측의 층(기저막)을 의미한다. 일 양태에 있어서, 시세포 또는 시세포 전구 세포가 확인되는 정도로 발생 단계가 진행된 망막 조직에 있어서는, 외경계막이 형성되고, 시세포, 시세포 전구 세포가 존재하는 시세포층(외과립층)에 접하는 면을 말한다. 또한, 이러한 정상 단부면은 정상 단부면의 마커(예: 비정형(atypical)-PKC(이하, 「aPKC」라 약칭한다), E-카드헤린(cadherin), N-카드헤린)에 대한 항체를 사용하여, 당업자에게 주지된 면역 염색법 등으로 동정할 수 있다.
「연속 상피 조직」이란, 연속 상피 구조를 갖는 조직이다. 연속 상피 구조란, 상피 조직이 연속하고 있는 상태이다. 상피 조직이 연속하고 있다는 것은, 예를 들어 상피 조직에 대한 접선 방향으로 10세포 내지 107세포, 바람직하게는 접선 방향으로 30세포 내지 107세포, 더욱 바람직하게는 102세포 내지 107세포 배열되어 있는 상태이다.
예를 들어, 망막 조직에 있어서 형성되는 연속 상피 구조는 망막 조직이 상피 조직에 특유한 정상 단부면을 갖고, 정상 단부면이 신경 망막층을 형성하는 각 층 중 적어도 시세포층(외과립층) 등과 대략 평행하게, 또한 연속적으로 망막 조직의 표면에 형성된다. 예를 들어, 다능성 줄기 세포로부터 제작한 망막 조직을 포함하는 세포 응집체의 경우, 응집체의 표면에 정상 단부면이 형성되고, 표면에 대하여 접선 방향으로 10세포 이상, 바람직하게는 30세포 이상, 보다 바람직하게는 100세포 이상, 더욱 바람직하게는 400세포 이상의 시세포 또는 시세포 전구 세포가 규칙적으로 연속해서 배열된다.
「하이드로겔」이란, 삼차원의 그물눈 구조로 가교된 고분자의 내부에 물 등의 액체를 도입한 것이다. 하이드로겔을 형성하는 고분자로서는, 예를 들어 젤라틴, 콜라겐, 펙틴, 히알루론산, 알긴산 등을 들 수 있다. 본 명세서에 있어서의 「하이드로겔」의 구체적인 물성 등은 후술한다.
〔복합체〕
본 발명의 일 양태는, 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트와 하이드로겔을 포함하는 복합체이다.
본 발명에 관한 복합체에 있어서, 신경 망막 및 망막 색소 상피 세포 시트는 인간 다능성 줄기 세포 유래이다. 본 발명에 관한 복합체에 있어서, 신경 망막 및 망막 색소 상피 세포 시트는 각각 인간 다능성 줄기 세포 유래이다. 신경 망막에 있어서 적어도 시세포층을 포함하는 신경 망막층이 형성되어 있고, 시세포층은 적어도 시세포, 시세포 전구 세포 및 망막 전구 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 세포를 포함한다. 망막 색소 상피 세포 시트는, 망막 색소 상피 세포가 다각형 또는 포석상의 세포 형태로 형성하는 시트상의 구조를 갖는다. 신경 망막 및 망막 색소 상피 세포 시트의 전체는 하이드로겔에 포매되어 있고, 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트는 각각의 표면의 접선 방향이 대략 평행하고 있고, 신경 망막의 정상 단부면과 망막 색소 상피 세포의 정상 단부면이 마주 보고 있고, 양자가 하이드로겔에 의해 격리되어서 접촉하지 않고 있다.
<신경 망막의 제조>
신경 망막은 다능성 줄기 세포 유래이고, 구체적으로 다능성 줄기 세포를 분화 유도함으로써 얻을 수 있다. 분화 유도는 WO2011/055855, WO2013/077425, WO2015/025967, WO2016/063985, WO2016/063986, WO2017/183732, PLoS One. 2010 Jan 20; 5(1):e8763., Stem Cells. 2011 Aug; 29(8):1206-18., Proc Natl Acad Sci USA. 2014 Jun 10; 111(23): 8518-23, Nat Commun. 2014 Jun 10; 5:4047에 개시되어 있는 방법을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다.
신경 망막은 신경 망막의 세포 응집체로서 제조된다. 구체적인 일 양태로서, 하기 공정 (A), (B) 및 (C)를 포함하는 방법에 의해 신경 망막의 세포 응집체를 조제할 수 있다.
(A) 다능성 줄기 세포를 피더 세포 비존재 하에서, 1) TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및/또는 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질, 그리고 2) 미분화 유지 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 공정,
(B) 무혈청 배지 안에서 부유 배양함으로써 세포 응집체를 형성시키는 공정,
(C) 공정 (B)에서 얻어진 세포 응집체를, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지 안에서 더 부유 배양하는 공정.
본 방법은 예를 들어 WO2016/063985, WO2017/183732에도 개시되어 있고, 보다 상세히는 WO2016/063985, WO2017/183732를 참조하는 것이 가능하다.
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질이란, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로, 즉 Smad 패밀리에 의해 전달되는, 시그널 전달 경로를 저해하는 물질을 나타내고, 구체적으로는 TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질(예: SB431542, LY-364947, SB-505124, A-83-01 등), 노달/액티빈(Nodal/Activin) 시그널 전달 경로 저해 물질(예: SB431542, A-83-01 등) 및 BMP 시그널 전달 경로 저해 물질(예: LDN193189, 도르소모르핀(Dorsomorphin) 등)을 들 수 있다. 이들 물질은 시판되고 있어 입수 가능하다.
소닉·헤지호그(이하, 「Shh」라고 기재하는 경우가 있다.) 시그널 전달 경로 작용 물질이란, Shh에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질이다. Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 PMA(퍼모파민(Purmorphamine)), SAG(Smoothened Agonist) 등을 들 수 있다.
TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는 망막계 세포로의 분화를 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어, SB431542는 통상 0.1 내지 200μM, 바람직하게는 2 내지 50μM의 농도로 사용된다. A-83-01은 통상 0.05 내지 50μM, 바람직하게는 0.5 내지 5μM의 농도로 사용된다. LDN193189는 통상 1 내지 2000nM, 바람직하게는 10 내지 300nM의 농도로 사용된다. SAG는 통상 1 내지 2000nM, 바람직하게는 10 내지 700nM의 농도로 사용된다. PMA는 통상 0.002 내지 20μM, 바람직하게는 0.02 내지 2μM의 농도로 사용된다.
공정 (A)에 있어서의 피더 프리(feeder-free) 조건에서의 다능성 줄기 세포의 배양에 있어서는, 배지로서 미분화 유지 인자를 포함하는 상기 피더 프리 배지를 사용해도 된다.
공정 (A)에 있어서의 피더 프리 조건에서의 다능성 줄기 세포의 배양에 있어서는, 피더 세포를 대신하는 기반을 다능성 줄기 세포에 제공하기 위해서, 적절한 매트릭스를 기반으로서 사용해도 된다. 기반으로서 사용할 수 있는 매트릭스로서는, 라미닌(Nat Biotechnol 28, 611-615, (2010)), 라미닌 단편(Nat Commun 3, 1236, (2012)), 기저막 표품(Nat Biotechnol 19, 971-974, (2001)), 젤라틴, 콜라겐, 헤파란황산프로테오글리칸, 엔탁틴, 비트로넥틴(Vitronectin) 등을 들 수 있다.
공정 (A)에 있어서의 다능성 줄기 세포의 배양 시간은, 공정 (B)에 있어서 형성되는 세포 응집체의 질을 향상시키는 효과가 달성 가능한 범위에서 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.5 내지 144시간이다. 일 양태에 있어서, 바람직하게는 2 내지 96시간, 보다 바람직하게는 6 내지 48시간, 더욱 바람직하게는 12 내지 48시간, 보다 더욱 바람직하게는 18 내지 28시간(예, 24시간)이다.
무혈청 배지의 준비 및 세포 응집체의 형성은 상술과 마찬가지로 실시할 수 있다.
일 양태에 있어서, 공정 (B)에 있어서 사용되는 배지는 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함한다. 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 상술한 것을 상술한 농도로 사용할 수 있다. 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질은 바람직하게는 부유 배양 개시 시부터 배지에 포함된다. 배지에는 ROCK 저해제(예, Y-27632)를 첨가해도 된다. 배양 시간은 예를 들어 12시간 내지 6일간이다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이란, BMP에 의해 매개되는 시그널 전달 경로를 증강할 수 있는 물질이다. BMP 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 BMP2, BMP4 혹은 BMP7 등의 BMP 단백질, GDF7 등의 GDF 단백질, 항BMP 수용체 항체, 또는 BMP 부분 펩티드 등을 들 수 있다. BMP2 단백질, BMP4 단백질 및 BMP7 단백질은 예를 들어 R&D Systems사로부터, GDF7 단백질은 예를 들어 와코 준야쿠로부터 입수 가능하다.
사용되는 배지는, 예를 들어 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가된 무혈청 배지 또는 혈청 배지(바람직하게는 무혈청 배지)를 들 수 있다. 무혈청 배지, 혈청 배지는 상술한 바와 같이 준비할 수 있다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는 망막계 세포로의 분화를 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어 인간 BMP4 단백질의 경우에는, 약 0.01nM 내지 약 1μM, 바람직하게는 약 0.1nM 내지 약 100nM, 보다 바람직하게는 약 1nM 내지 약 10nM, 더욱 바람직하게는 약 1.5nM(55ng/mL)의 농도가 되도록 배지에 첨가한다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은, 공정 (A)의 부유 배양 개시로부터 약 24시간 후 이후에 첨가되어 있으면 되고, 부유 배양 개시 후 수일 이내(예를 들어, 15일 이내)에 배지에 첨가해도 된다. 바람직하게는, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은 부유 배양 개시 후 1일째 내지 15일째까지의 사이, 보다 바람직하게는 1일째 내지 9일째까지의 사이, 가장 바람직하게는 3일째에 배지에 첨가한다.
구체적인 양태로서, 예를 들어 공정 (B)의 부유 배양 개시 후 1 내지 9일째, 바람직하게는 1 내지 3일째에, 배지의 일부 또는 전부를 BMP4를 포함하는 배지로 교환하고, BMP4의 최종 농도를 약 1 내지 10nM로 조제하고, BMP4의 존재 하에서 예를 들어 1 내지 12일, 바람직하게는 2 내지 9일, 더욱 바람직하게는 2 내지 5일간 배양할 수 있다. 여기에 있어서, BMP4의 농도를 동일 농도로 유지하기 위해, 1회 혹은 2회 정도 배지의 일부 또는 전부를 BMP4를 포함하는 배지로 교환할 수 있다. 또는 BMP4의 농도를 단계적으로 줄일 수도 있다.
상기 공정 (A) 내지 공정 (C)에 있어서의 배양 온도, CO2 농도 등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 또한 CO2 농도는 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5%이다.
상기 공정 (C)에 있어서의 배양 기간을 변동시킴으로써, 신경 망막의 세포 응집체에 포함되는 망막계 세포로서, 여러가지 분화 단계의 망막계 세포를 제조할 수 있다. 즉, 미성숙한 망막계 세포(예: 망막 전구 세포, 시세포 전구 세포)와 성숙한 망막계 세포(예: 시세포)를 다양한 비율로 포함하는, 신경 망막의 세포 응집체 중의 망막계 세포를 제조할 수 있다. 공정 (C)의 배양 기간을 연장시킴으로써, 성숙한 망막계 세포의 비율을 증가시킬 수 있다.
상기 공정 (B) 및/또는 공정 (C)는 WO2017/183732에 개시된 방법을 사용할 수도 있다. 즉, 공정 (B) 및/또는 공정 (C)에 있어서, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 더 포함하는 배지에서 부유 배양하고, 신경 망막의 세포 응집체를 형성할 수 있다.
공정 (B) 및/또는 공정 (C)에 사용하는 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질로서는, Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않고, 단백질, 핵산, 저분자 화합물 등 중 어느 것이어도 된다. Wnt에 의해 매개되는 시그널은 프리즐드(Frizzled(Fz)) 및 LRP5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6)의 헤테로 2량체로서 존재하는 Wnt 수용체를 개재해서 전달된다. Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질로서는, 예를 들어 Wnt 또는 Wnt 수용체에 직접 작용하는 물질(항Wnt 중화 항체, 항Wnt 수용체 중화 항체 등), Wnt 또는 Wnt 수용체를 코드하는 유전자의 발현을 억제하는 물질(예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등), Wnt 수용체와 Wnt의 결합을 저해하는 물질(가용형 Wnt 수용체, 우성 음성 Wnt 수용체 등, Wnt 안타고니스트, Dkk1, 세르베루스(Cerberus) 단백질 등), Wnt 수용체에 의한 시그널 전달에서 기인하는 생리 활성을 저해하는 물질[CKI-7(N-(2-아미노에틸)-5-클로로이소퀴놀린-8-술폰아미드), D4476(4-[4-(2,3-디히드로-1,4-벤조디옥신-6-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드), IWR-1-endo (IWR1e)(4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-헥사히드로-1,3-디옥소-4,7-메타노-2H-이소인돌-2-일]-N-8-퀴놀리닐-벤즈아미드), 그리고 IWP-2(N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라히드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]아세트아미드) 등의 저분자 화합물 등] 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질로서, 이들을 1종 또는 2종 이상 포함하고 있어도 된다. CKI-7, D4476, IWR-1-endo(IWR1e), IWP-2 등은 공지된 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이며, 시판품 등을 적절히 입수 가능하다. Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질로서 바람직하게는 IWR1e가 사용된다.
공정 (B)에 있어서의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도는 양호한 세포 응집체의 형성을 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어 IWR-1-endo의 경우에는, 약 0.1μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 0.3μM 내지 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 1μM 내지 약 10μM, 더욱 바람직하게는 약 3μM의 농도가 되도록 배지에 첨가한다. IWR-1-endo 이외의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용하는 경우에는, 상기 IWR-1-endo의 농도와 동등한 Wnt 시그널 전달 경로 저해 활성을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다.
공정 (B)에 있어서, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 배지에 첨가하는 타이밍은 빠른 쪽이 바람직하다. Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질은, 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시로부터 통상 6일 이내, 바람직하게는 3일 이내, 보다 바람직하게는 1일 이내, 보다 바람직하게는 12시간 이내, 더욱 바람직하게는 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시에 배지에 첨가된다. 구체적으로는, 예를 들어 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 첨가한 기초 배지의 첨가나, 해당 기초 배지에 대한 일부 혹은 전부의 배지 교환을 행할 수 있다. 공정 (A)에서 얻어진 세포를, 공정 (B)에 있어서 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질에 작용시키는 기간은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시에 배지에 첨가한 후, 공정 (B) 종료 시(BMP 시그널 전달 경로 작용 물질 첨가 직전)까지 작용시킨다. 더욱 바람직하게는, 후술하는 바와 같이 공정 (B) 종료 후(즉 공정 (C)의 기간 중)에도, 계속해서 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질에 폭로시킨다. 일 양태로서는, 후술하는 바와 같이 공정 (B) 종료 후(즉 공정 (C)의 기간 중)에도, 계속해서 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질에 작용시켜서, 망막 조직이 형성될 때까지 작용시켜도 된다.
공정 (C)에 있어서, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질로서는 전술한 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질 중 어느 것을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 공정 (B)에서 사용한 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질과 동일한 종류의 것을 공정 (C)에 있어서 사용한다.
공정 (C)에 있어서의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도는 망막 전구 세포 및 망막 조직을 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어 IWR-1-endo의 경우에는 약 0.1μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 0.3μM 내지 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 1μM 내지 약 10μM, 더욱 바람직하게는 약 3μM의 농도가 되도록 배지에 첨가한다. IWR-1-endo 이외의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 사용하는 경우에는, 상기 IWR-1-endo의 농도와 동등한 Wnt 시그널 전달 경로 저해 활성을 나타내는 농도로 사용되는 것이 바람직하다. 공정 (C)의 배지 중의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도는, 공정 (B)의 배지 중의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도를 100으로 했을 때 바람직하게는 50 내지 150, 보다 바람직하게는 80 내지 120, 더욱 바람직하게는 90 내지 110이고, 제2 공정의 배지 중의 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도와 동등한 것이 보다 바람직하다.
Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질의 배지에 대한 첨가 시기는, 망막계 세포 혹은 망막 조직을 포함하는 응집체 형성을 달성할 수 있는 범위에서 특별히 한정되지 않지만, 빠르면 빠른 쪽이 바람직하다. 바람직하게는, 공정 (C) 개시 시에 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 배지에 첨가된다. 보다 바람직하게는, 공정 (B)에 있어서 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 첨가된 후, 공정 (C)에 있어서도 계속해서(즉, 공정 (B)의 개시 시부터) 배지 안에 포함된다. 더욱 바람직하게는, 공정 (B)의 부유 배양 개시 시에 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 첨가된 후, 공정 (C)에 있어서도 계속해서 배지 안에 포함된다. 예를 들어, 공정 (B)에서 얻어진 배양물(Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 배지 중의 응집체의 현탁액)에 BMP 시그널 전달 작용 물질(예, BMP4)을 첨가하면 된다.
Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질에 작용시키는 기간은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시에 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 첨가되는 경우에 있어서, 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시를 기산점으로 해서 2일간에서 30일간, 보다 바람직하게는 6일간에서 20일간, 8일간에서 18일간, 10일간에서 18일간, 또는 10일간에서 17일간(예를 들어, 10일간)이다. 다른 양태에 있어서 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질에 작용시키는 기간은, 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시에 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질이 첨가되는 경우에 있어서, 공정 (B)에 있어서의 부유 배양 개시 시를 기산점으로 해서 바람직하게는 3일간에서 15일간(예를 들어, 5일간, 6일간, 7일간)이며, 보다 바람직하게는 6일간에서 10일간(예를 들어, 6일간)이다.
상술한 방법으로 얻은 신경 망막의 세포 응집체를 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질, 및/또는 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 안에서 3일간 내지 6일간 정도의 기간 배양(공정 (D)) 후, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 배지 안에서 30일간 내지 60일간 정도 배양(공정 (E))함으로써, 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 신경 망막을 제조할 수도 있다.
일 양태로서, 공정 (A) 내지 (C)에서 얻어진 신경 망막의 세포 응집체이며, 공정 (B)의 부유 배양 개시 후 6 내지 30일째, 10 내지 20일째(10일째, 11일째, 12일째, 13일째, 14일째, 15일째, 16일째, 17일째, 18일째, 19일째 또는 20일째)의 신경 망막의 세포 응집체로부터, 상기 공정 (D) 및 공정 (E)에 의해 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 신경 망막을 제조할 수 있다.
Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 구체적인 Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 GSK3β 저해제(예를 들어, 6-브로모인디루빈-3'-옥심(6-Bromoindirubin-3'-oxime(BIO)), CHIR99021, 켄파울론(Kenpaullone))를 들 수 있다. 예를 들어 CHIR99021의 경우에는, 약 0.1μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 1μM 내지 약 30μM의 범위를 들 수 있다.
FGF 시그널 전달 경로 저해 물질로서는, FGF에 의해 매개되는 시그널 전달을 저해할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. FGF 시그널 전달 경로 저해 물질로서는, 예를 들어 SU-5402, AZD4547, BGJ398 등을 들 수 있다. 예를 들어 SU-5402의 경우, 약 0.1μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 1μM 내지 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 5μM의 농도로 첨가한다.
상기 공정 (E)의 일부 또는 전부의 공정은 WO2019/017492에 개시된 연속 상피 조직 유지용 배지를 사용해서 배양할 수 있다. 즉, 연속 상피 조직 유지용 배지를 사용해서 배양함으로써, 신경 망막의 연속 상피 구조를 유지할 수 있다. 일례로서, 뉴로베이슬(Neurobasal) 배지(예: 서모 피셔 사이언티픽사 제조, 21103049)에 B27 서플리먼트(예: 서모 피셔 사이언티픽, 12587010)를 배합한 배지를 연속 상피 조직 유지용 배지로서 들 수 있다.
상기 공정 (E)의 일부 또는 전부의 공정에 있어서, 세포 증식용 기초 배지, 연속 상피 조직 유지용 배지 또는 이들의 혼합 배지 중 어느 것의 배지를 사용하고 있는 경우에도, 갑상선 호르몬 시그널 전달 경로 작용 물질을 더 포함해도 된다. 갑상선 호르몬 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지에서 배양함으로써, 신경 망막에 포함되는 쌍극 세포, 아마크린 세포, 신경절 세포 또는 수평 세포 등의 비율이 낮고, 또한 시세포 전구 세포의 비율을 증대시킨 신경 망막을 포함하는 세포 응집체의 제조가 가능하게 된다.
본 명세서에 있어서 갑상선 호르몬 시그널 전달 경로 작용 물질이란, 갑상선 호르몬에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질이며, 갑상선 호르몬 시그널 전달 경로를 증강할 수 있는 것이면 특별히 한정은 없다. 갑상선 호르몬 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 트리요오드티로닌(이하, T3으로 생략하는 경우가 있다), 사이록신(이하, T4로 생략하는 경우가 있다), 갑상선 호르몬 수용체(바람직하게는 TRβ 수용체) 아고니스트 등을 들 수 있다.
갑상선 호르몬 시그널 전달 경로 작용 물질로서 T3을 사용하는 경우에는, 예를 들어 0.1 내지 1000nM의 범위가 되도록 배지에 첨가할 수 있다. 바람직하게는 1 내지 500nM; 보다 바람직하게는 10 내지 100nM; 더욱 바람직하게는 30 내지 90nM; 더욱 보다 바람직하게는 60nM 전후의 농도의 T3에 상당하는 갑상선 호르몬 시그널 전달 항진 활성을 갖는 농도를 들 수 있다. 갑상선 호르몬 시그널 전달 경로 작용 물질로서 T4를 사용하는 경우에는, 예를 들어 1nM 내지 500μM의 범위가 되도록 배지에 첨가할 수 있다. 바람직하게는 50nM 내지 50μM; 보다 바람직하게는 500nM 내지 5μM의 범위이다. 기타의 갑상선 호르몬 수용체 아고니스트를 사용하는 경우, 상술한 농도의 T3 또는 T4가 나타내는 아고니스트 활성과 동일 정도의 활성을 나타내는 농도이면 된다.
공정 (E)에 있어서 사용되는 배지는 적절히 L-글루타민, 타우린, 혈청 등을 포함하고 있어도 된다. 공정 (E)에 있어서 사용되는 배지는, 일례에 있어서 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질, FGF 시그널 전달 경로 저해 물질, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질, SHH 시그널 전달 경로 작용 물질, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 작용 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상(바람직하게는 전부)을 첨가하지 않은 배지이다.
상술한 방법에 의해 신경 망막의 세포 응집체를 제조할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명에 관한 신경 망막은 시세포층 및 내층을 포함하는 신경 망막층을 포함하고, 시세포층에 있어서 시세포 전구 세포 및 시세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 세포를 포함하고, 또한 상피 조직의 구조를 갖고, 정상 단부면과 기저를 갖는다. 상피 조직의 구조는 연속 상피 구조인 것이 바람직하다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 관한 신경 망막은 핀셋, 나이프, 가위 등을 사용해서 신경 망막의 세포 응집체로부터 잘라냄으로써 얻을 수 있다. 스피어상의 신경 망막의 세포 응집체로부터 잘라냄으로써, 신경 망막 시트를 얻을 수 있다. 신경 망막 시트란, 상술한 신경 망막층의 층 구조를 유지한 중층의 시트상의 구조체를 의미한다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 관한 신경 망막은 인간 다능성 줄기 세포를 분화 유도해서 얻어진, 세포 응집체에서 얻어지는 신경 망막이어도 된다. 상기 세포 응집체가 적어도 제1 상피 조직 및 제2 상피 조직을 포함하고, 제1 상피 조직은 인간 신경 망막을 포함하고, 제2 상피 조직은 제1 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기의 연속성과 다른 표면의 접선의 기울기의 연속성을 갖고, 또한 망막계 세포 이외의 세포 및/또는 망막 색소 상피 세포를 포함하고 있어도 된다. 제2 상피 조직에 포함되는 망막계 세포 이외의 세포는 안구 관련 조직 및 뇌척수 조직의 세포를 들 수 있고, 안구 관련 조직으로서는, 망막 색소 상피 세포 및 모양체 주연부 구조체를 들 수 있다. 본 발명에 관한 신경 망막은 눈으로 보아 당해 응집체로부터 제2 상피 조직을 포함하지 않도록 신경 망막을 잘라냄으로써 얻을 수 있다. 본 발명에 관한 신경 망막은 상기 세포 응집체에 있어서의 제2 상피 조직으로부터 가장 떨어진 제1 상피 조직 상의 영역, 특히 제1 상피 조직의 중심 부근의 영역을 포함하고 있어도 된다. 일 양태에 있어서, 본 발명에 관한 신경 망막은 연속 상피 조직의 중심 부근의 영역을 포함하고 있어도 된다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 관한 신경 망막은
(1) 다능성 줄기 세포 유래이고,
(2) 3차원 구조를 갖고,
(3) 시세포층 및 내층을 포함하는 복수의 층 구조를 갖는 신경 망막층을 포함하고,
(4) 시세포층이, 시세포 전구 세포 및 시세포로 이루어지는 군이 선택되는 1종 이상의 세포를 포함하고,
(5) 내층이 망막 전구 세포, 신경절 세포, 아마크린 세포 및 쌍극 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 세포를 포함하고,
(6) 신경 망막층의 표면이 정상 단부면을 갖고,
(7) 정상 단부면을 따라 존재하는 시세포층의 내측에 내층이 존재하고,
(8) 신경 망막의 표면의 총 면적에 대하여, 신경 망막층의 면적이 50% 이상이며,
(9) 신경 망막층의 정상 단부면의 총 면적에 대하여, 연속 상피 구조의 면적이 80% 이상인 것
을 특징으로 하는 신경 망막이다.
당해 신경 망막은, (3) 시세포층 및 내층을 포함하는 복수의 층 구조를 갖는 신경 망막층을 포함한다. (6) 및 (7)에 기재된 바와 같이, 시세포층은 당해 신경 망막의 외측(표면)에 존재하지만, 내층에도 이소성의 시세포층이 존재해도 된다.
당해 신경 망막은, (5) 내층이 망막 전구 세포, 신경절 세포, 아마크린 세포 및 쌍극 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 세포를 포함하는데, 이소성의 시세포 전구 세포 및 시세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 세포를 포함해도 된다. 일 양태에 있어서, 신경절 세포, 아마크린 세포, 수평 세포의 함유율이 총 세포수의 30% 이하인 신경 망막, 신경절 세포, 아마크린 세포, 수평 세포 및 쌍극 세포의 함유율이 총 세포수의 30% 이하인 신경 망막, 및/또는 쌍극성 세포의 함유율이 총 세포수의 10% 이하인 신경 망막도 제공된다.
당해 신경 망막은, (8) 신경 망막의 표면의 총 면적에 대하여 신경 망막층의 면적이 40% 이상이며, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 60% 이상이다. 당해 신경 망막은, (9) 신경 망막층의 정상 단부면의 총 면적에 대하여 연속 상피 구조의 면적이 60% 이상이며, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상이다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 관한 신경 망막의 긴 직경은 예를 들어 300㎛ 내지 3300㎛여도 되고, 바람직하게는 600㎛ 내지 2500㎛, 보다 바람직하게는 1100㎛ 내지 1700㎛이다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 관한 신경 망막의 짧은 직경은 예를 들어 100㎛ 내지 2000㎛여도 되고, 바람직하게는 200㎛ 내지 1500㎛, 보다 바람직하게는 400㎛ 내지 1100㎛이다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 관한 신경 망막의 높이는 예를 들어 50㎛ 내지 1500㎛여도 되고, 바람직하게는 100㎛ 내지 1000㎛, 보다 바람직하게는 200㎛ 내지 700㎛이다.
일 양태에 있어서, 본 발명에 관한 신경 망막의 체적은 예를 들어 0.001㎣ 내지 4.0㎣여도 되고, 바람직하게는 0.01㎣ 내지 1.5㎣, 보다 바람직하게는 0.07㎣ 내지 0.57㎣이다.
신경 망막의 긴 직경, 짧은 직경 및 높이를 측정하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 현미경 하에서 촬상한 화상으로부터 측정하면 된다. 예를 들어, 세포 응집체로부터 잘라낸 신경 망막에 대해서 절단면을 대물 렌즈측으로 향한 상태에서 촬상한 정면 화상과, 절단면이 대물 렌즈로부터 보아서 수직이 되도록 기울인 상태에서 촬상한 옆면 화상을 실체 현미경으로 촬상하고, 촬상한 화상으로부터 측정할 수 있다. 여기서 긴 직경이란, 정면 화상에 있어서 해당 시트 단면 상의 2개의 단부점을 연결하는 선분 중, 가장 긴 선분 및 그의 길이를 의미한다. 짧은 직경이란, 정면 화상에 있어서 해당 시트 단면 상의 2개의 단부점을 연결하는 선분에서 긴 직경과 직교하는 선분 중, 가장 긴 선분 및 그의 길이를 의미한다. 높이란, 해당 시트 단면에 직교하는 선분에서, 해당 시트 단면과의 교점과 망막 시트의 정점을 단부점으로 하는 선분 중 가장 긴 선분 및 그의 길이를 의미한다. 해당 시트의 체적이란, 신경 망막이, 단면이 긴 직경을 통과하도록 반으로 쪼갠 타원체라고 근사한 다음, 이하의 계산식에 따라 산출한 체적을 의미한다.
체적=2/3×원주율(π)×(긴 직경/2)×(짧은 직경/2)×높이
<망막 색소 상피 세포 시트의 제조>
망막 색소 상피(RPE) 세포는 다능성 줄기 세포 유래이고, 구체적으로 다능성 줄기 세포를 분화 유도함으로써 얻을 수 있다. 망막 색소 상피 세포를 제조하는 방법은 WO2005/070011, WO2006/080952, WO2011/063005, WO2012/173207호, WO2015/053375호, WO2015/053376호, WO2015/068505호, WO2017/043605, [Stem Cell Reports, 2(2), 205-218(2014)] 및 [Cell Stem Cell, 10(6), 771-785(2012)]에 개시되어 있는 방법을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다. 또한, 상술한 WO2016/063985에 기재된 방법을 개량함으로써 망막 색소 상피(RPE) 세포 시트를 조제하는 것도 가능하다. 망막 색소 상피 세포는 세포 시트 또는 스피어상 세포 응집체로서 제조되어도 된다. 스피어상 세포 응집체로서 제조된 경우, 예를 들어 핀셋, 나이프, 가위 등을 사용해서 세포 응집체를 절개함으로써 RPE 세포 시트를 조제 가능하다.
WO2016/063985에 기재된 방법의 개량법으로서는, 상술한 방법 중, 다능성 줄기 세포를 피더 세포 비존재 하에서, 1) 분화 유도 1일 전에 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질로 처리하고, 2) 분화 유도 개시 시에 소닉·헤지호그 시그널 전달 경로 작용 물질을 처리하지 않는 조건에서 배양한다. 그 후, 상술한 공정 (B) 및 (C)를 행한다. 또한, 상기 공정 (D)의 개시 시기를 빠르게 하는 쪽이 바람직하다. 구체적으로는, 공정 (B)의 부유 배양 개시 9일 전후(예: 7일, 8일, 9일, 10일, 11일 후)에 공정 (D)를 개시한다. 그 후, 상술한 공정 (E)를 실시하면 된다. 본 방법에 의해, 스피어상의 RPE 세포의 세포 응집체가 얻어진다. 당해 세포 응집체를 분산시켜서 세포 현탁액으로 해도 되고, 핀셋, 나이프, 가위 등을 사용해서 세포 응집체를 절개함으로써 RPE 세포 시트를 조제할 수도 있다. 분산시킨 세포 현탁액을 접착 배양으로 배양함으로써, RPE 세포 시트를 조제할 수도 있다.
망막 색소 상피 세포 시트는 신경 망막의 세포 응집체와 접촉시키기 전에, 다각형 또는 포석상의 세포 형태를 가질 때까지 더 배양해도 된다. 이 경우의 배지는 특별히 한정되지 않지만, 망막 색소 상피 세포의 유지 배지(이하, RPE 유지 배지라고 기재하는 경우도 있다.)로 교환하여 더 배양할 수도 있다. 그에 의해, 더욱 확실하게 멜라닌 색소 침착 세포군이나 기저막에 접착하는 다각 편평 상의 형태를 갖는 세포군을 관찰할 수 있다. RPE 유지 배지에 의한 배양은 망막 색소 상피 세포의 콜로니가 형성되는 한 한정되지 않지만, 예를 들어 3일에 1회 이상의 빈도로 전량 배지 교환을 행하면서 5 내지 20일간 정도 배양을 행한다. 당업자이면 당해 형태를 확인하면서, 배양 기간을 용이하게 설정할 수 있다. 망막 색소 상피 세포의 유지 배지는 예를 들어 [IOVS, March 2004, Vol.45, No.3, Masatoshi Haruta 등], [IOVS, November 2011, Vol. 52, No. 12, Okamoto 등], [Cell Science 122(17), Fumitaka Osakadar 등, February 2008, Vol. 49, No. 2, Gamm 등]에 기재된 것을 사용할 수 있다.
일 양태에 있어서, 망막 색소 상피 세포 시트의 긴 직경은 예를 들어 3㎜ 내지 50㎜, 5㎜ 내지 30㎜, 10㎜ 내지 20㎜ 등의 범위여도 된다.
일 양태에 있어서, 망막 색소 상피 세포 시트의 짧은 직경은 예를 들어 2㎜ 내지 40㎜, 5㎜ 내지 30㎜, 10㎜ 내지 20㎜ 등의 범위여도 된다.
망막 색소 상피 세포 시트의 멜라닌 색소 침착의 정도는 특별히 한정되지 않는다. 망막 색소 상피 세포 시트 중에 포함되는 망막 색소 상피 세포에 있어서의 멜라닌 색소 침착의 정도는 세포간에서 동일 정도인 쪽이 바람직하다. 일 양태로서, 망막 색소 상피 세포 시트의 평균 멜라닌 함유량은 20pg/세포 미만, 15pg/세포 미만, 10pg/세포 미만, 8pg/세포 미만, 7pg/세포 미만, 6pg/세포 미만, 5pg/세포 미만, 4pg/세포 미만, 3pg/세포 미만, 2pg/세포 미만, 1pg/세포 미만이어도 된다. 또한, 망막 색소 상피 세포 시트의 평균 멜라닌 함유량은 0.1pg/세포 이상, 0.5pg/세포 이상, 1pg/세포 이상, 2pg/세포 이상, 5pg/세포 이상이어도 된다.
망막 색소 상피 세포 시트 중의 멜라닌 함유량은, 예를 들어 망막 색소 상피 세포 시트를 분산시킨 후, NaOH 등을 사용해서 추출한 세포 추출물을 사용하여 분광 광도계 등을 사용하여 측정할 수 있다. 평균 멜라닌 함유량은, 멜라닌 함유량을 망막 색소 상피 세포 시트에 포함되는 총 세포수로 나눔으로써 구할 수 있다.
<하이드로겔>
본 발명에 있어서의 하이드로겔은 세포를 살아 있는채로 포매할 수 있는 것이면 되고, 예를 들어 젤라틴의 하이드로겔, 콜라겐의 하이드로겔, 펙틴의 하이드로겔, 히알루론산의 하이드로겔, 알긴산의 하이드로겔이어도 되고, 바람직하게는 젤라틴의 하이드로겔이다. 이들 하이드로겔은 생분해성 및 원하는 융해점을 갖기 때문에 취급하기 쉽고, 또한 높은 생착률을 기대할 수 있다. 생분해성이란, 생체 내의 효소 등에 의해 분해되어 흡수 혹은 배설되는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서의 하이드로겔은, 융해점이 20℃ 내지 40℃의 범위인 하이드로겔이다. 즉, 이식한 경우에 체온으로 융해된다고 하는 특징을 갖는다. 이하, 「젤라틴」을 예로 그의 물성을 상세히 기재한다. 젤라틴 이외의 하이드로겔에 대해서, 후술하는 젤라틴과 마찬가지의 물성을 갖는 하이드로겔이 바람직하다.
「젤라틴」이란, 물에 불용성인 콜라겐을 예를 들어 산 혹은 알칼리로 전처리하고, 열가수분해하는 등에 의해 가용화한 것이다. 본 명세서에 있어서 특별한 기재가 없으면 하이드로겔의 상태의 젤라틴을 의미하지만, 「젤라틴의 하이드로겔」이라고 명확화해서 기재하는 경우도 있다. 가열에 의해 콜라겐의 3본쇄 나선의 분자 구조가 깨지고, 랜덤한 3개의 분자로 나뉘는 것에 의해 가용화된다. 젤라틴의 원재료로서는, 주로 소뼈 및 소가죽, 돼지가죽, 돼지뼈, 물고기 비늘 등이 사용된다. 이들 콜라겐 원재료로부터 젤라틴을 추출하기 위해서, 염산이나 황산 등의 무기산 혹은 석회를 사용하여 원료의 전처리를 행한다. 원료의 전처리 조건에 의해, 전자를 산 처리 젤라틴(또는 A타입 젤라틴), 후자를 알칼리 처리(석회 처리) 젤라틴(B타입 젤라틴)이라 칭하는 경우도 있다. 산 처리 젤라틴과 알칼리 처리 젤라틴에서는 젤라틴의 성질이 다르다. 또한, 가열 처리에 의해 가수분해를 행함으로써, 젤라틴의 분자량은 저하되고, 용해도는 향상되어, 동일한 조건에 있어서 젤리 강도는 저하된다. 예를 들어 온수(50℃ 내지 80℃)에 의해 가열 처리할 수도 있고, 복수회 반복해도 된다. 시판 중인 젤라틴을 입수하는 것도 가능하며, 예를 들어 젤라틴 LS-H(닛타 젤라틴(주), 돼지가죽 알칼리 처리 젤라틴, 비가열 처리 젤라틴, 고젤리 강도), 젤라틴 LS-W(닛타 젤라틴(주), 돼지가죽 알칼리 처리 젤라틴, 가열 처리 젤라틴, 저젤리 강도)를 들 수 있다. 알칼리 처리(석회 처리) 젤라틴(B타입 젤라틴)이 바람직하고, 가열 처리 젤라틴이 바람직하다.
콜라겐은 약 10만의 분자량을 갖는 3개의 폴리펩티드쇄(α쇄)로 구성되어 있다. 콜라겐 분자가 가열 처리에 의해 변성되면, 3개의 α쇄(α 성분)로 나뉜다. 그 이외에 α쇄의 2량체(β 성분: 약 20만의 분자량)와 3량체(γ 성분: 약 30만의 분자량)도 생성될 수 있다. 또한, 젤라틴의 처리 공정에 의해 콜라겐, 젤라틴의 분자간 또는 분자내 결합의 일부도 랜덤하게 절단되기 때문에, 젤라틴은 다양한 분자량을 갖는 분자의 집합체이다. 가열 처리의 유무 등에 따라 다르지만, 통상 시판 젤라틴은 몇만 내지 몇백만의 분자량 분포를 갖는다. 일 양태로서, 젤라틴에서는 50% 이상(바람직하게는 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상)이 약 10만 내지 약 30만의 범위에 포함되는 분자량 분포가 바람직하다. 또한, 젤라틴의 바람직한 평균 분자량은 약 5만 내지 약 100만, 약 10만 내지 약 80만, 약 10만 내지 약 60만, 약 20만 내지 약 50만, 약 30만 내지 약 50만의 범위이다.
또한, 분자량 분포 및 평균 분자량은 당업자이면 주지 알려진 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 고속 액체 크로마토그래프를 사용하여 젤라틴 수용액을 겔 여과법에 의해 크로마토그램을 구함으로써 분자량 분포를 추정하고, 또한 풀루란 환산 등에 의해 평균 분자량을 추정할 수 있다.
「등이온점」이란, 단백질, 혹은 양성 전해질의 수용액이, 다른 이온이 공존하지 않는 상태(물이 전리되어 생성하는 수소 이온, 수산화물 이온, 대상이 되는 양성 전해질 그 자체의 이온을 제외한다)에서 나타내는 pH를 의미한다. 등이온점은 당업자이면 주지 알려진 방법에 의해 측정할 수 있다. 구체예로서, 이온 교환 수지에 의해 탈염한 검액(젤라틴 수용액)의 pH계에 의해 수소 이온 농도를 측정하면 된다. 예를 들어 젤라틴의 제조 공정에 있어서 알칼리 처리를 행하면, 대부분이 탈아미드되어 있기 때문에 등이온점은 약 pH5로 낮아진다. 이에 반해, 산 처리 젤라틴에서는 탈아미드율이 낮고, 콜라겐에 가까운 pH7 내지 9의 등이온점을 나타낸다. 젤라틴 수용액은 등이온점보다 저pH측에서 +(플러스), 고pH측에서는 -(마이너스)로 하전된다. 본 명세서에 있어서의 하이드로겔(젤라틴 등)은 약 pH4 내지 약 pH7, 약 pH5 내지 약 pH7, 약 pH6 내지 약 pH7의 등이온점을 나타내는 쪽이 바람직하다.
젤라틴을 포함하는 하이드로겔은 가열 또는 냉각에 의해 용액이 겔로부터 졸, 졸로부터 겔로 상변화된다. 젤라틴 등의 하이드로겔은 냉각해서 유동성을 상실함으로써 겔(젤리)화되고, 가열해서 유동성을 획득함으로써 졸(수용액)화된다. 젤라틴을 예로 들면, 젤라틴이 젤리화되는 것은 냉각에 의해 젤라틴 분자의 일부가 콜라겐과 마찬가지의 나선 구조를 취함으로써 분자간에 네트워크를 형성하기 때문이다. 여기서 「융해점」이란, 일정 압력 하에서 졸화되는 온도를 의미하고, 「응고점」이란, 일정 압력을 하에서 겔화되는 온도를 의미한다. 상술한 바와 같이, 냉각을 계속하면 보다 견고한 겔을 형성한다. 본 명세서에 있어서의 하이드로겔은 융해점이 20℃ 내지 40℃(예: 20℃ 내지 35℃, 25℃ 내지 35℃, 30℃ 내지 40℃, 35℃ 내지 40℃)이다. 일반적으로, 겔의 융점은 네트워크의 강도의 척도이며, 하이드로겔의 농도 및 분자량의 상승에 수반하여 하이드로겔(예: 젤라틴)의 융해점은 상승한다. 또한, 예를 들어 당류에 의해 고형분을 증가시키면 융해점 및 응고점은 상승하는 경향이 있다. 이와 같이, 일정한 범위에서 융해점 및 응고점을 변동시키는 것이 가능하다.
하이드로겔의 융해점의 측정 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 JIS K6503에 정해진 방법에 의해 측정할 수 있다. 구체적으로는, 검액(예: 10w/w% 농도의 젤라틴 용액)을 직경 10㎜의 유리관 중에서, 말단 5㎜의 위치로부터 45㎜의 높이의 겔을 만들고, 말단 5㎜가 아래에 오도록 수조에 넣어 승온했을 때, 겔이 녹아서 말단의 기포의 상단이 10㎜ 상승한 온도를 융해점으로 하면 된다.
하이드로겔의 응고점의 측정 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 JIS K6503에 정해진 방법에 의해 측정할 수 있다. 구체적으로는, 35℃로 한 검액(예: 10w/w% 농도의 젤라틴 용액)을 35℃의 완충욕을 갖는 15℃의 수조에서 교반하면서 서서히 냉각시켜서, 복귀 현상(용액을 교반했을 때에 발생하는 기포 등이, 교반을 멈추었을 때, 관성으로 교반 방향으로 움직이지 않고 역의 방향으로 되돌아가는 현상)이 확인되었을 때의 온도를 응고점이라 하면 된다. 복귀 현상을 확인하기 쉽게 하기 위해서, 검액에는 여과지편 등을 넣어 두어도 된다.
하이드로겔의 「젤리 강도」란, 겔을 형성한 물체의 기계적 강도를 의미한다. 통상 일정 형상의 겔을 변형시키는 데 요하는 힘 또는 겔을 파단시키는 데 요하는 힘(단위: g, dyne(s)/㎠ 또는 g/㎠)으로 표현되고, 주로 겔의 경도의 척도이다. 또한, 1다인(dyne(s))은 질량 1그램(g)의 물체에 작용할 때, 그 방향으로 1센티미터 매초매초(㎝/s2)의 가속도를 부여하는 힘이라 정의된다. 예를 들어 젤라틴을 포함하는 하이드로겔의 젤리 강도는 그의 농도, 온도, pH 및 공존 물질 등에 따라 변동이 있지만, 동일 조건에서는 분자량 등의 고유한 성질에 의존해서 변화한다. 젤라틴의 「젤리 강도」는, 예를 들어 일본 약전 약식발 0531 제3호나 JIS K6503에 정해진 방법으로 시험된다. 구체적으로는 젤라틴 용액을 10℃에서 17시간 냉각해서 조제한 젤리의 표면을, 2분의 1인치(12.7㎜) 직경의 플런저로 4㎜ 밀어 내리는 데 필요한 하중을 젤리 강도로 한다. 통상, 젤라틴 농도가 증가함에 따라서 젤리 강도도 증가한다. 또한, 통상, 산성 pH(예: pH4 이하) 및 알칼리성 pH(예: pH8 이상)에 있어서는 젤라틴의 젤리 강도는 크게 저하된다. 또한, 어느 일정한 범위(예: 분자량 3만 내지 7만)에서는 분자량이 높을수록 젤리 강도는 높아지지만, 어느 정도 이상(예: 분자량 10만 이상)이 되면 젤리 강도는 일정해진다. 또한, 통상, 겔화에는 20℃ 이하에서의 냉각이 필요하며, 예를 들어 4℃ 내지 20℃ 정도의 냉각 온도의 범위에 있어서, 냉각 온도가 낮을수록 젤리 강도는 높아진다. 분자의 배향이나 네트워크 형성하는 반응은 비교적 늦은 속도로 진행되므로, 그의 내부에 있어서는 겔 형성 후에도 분자간의 네트워크가 형성되기 때문에, 냉각 개시 후 1 내지 5시간 정도를 거쳐서 젤리 강도는 상승한다. 또한, 급속하게 냉각하는 쪽이 젤리 강도는 상승한다. 분자가 배향될 시간적 여유없이 분자간에 촘촘하게 네트워크가 형성되기 때문이다.
본 명세서에 있어서 예를 들어 10℃ 내지 20℃에 있어서, 포매되는 세포나 조직에 영향을 주지 않는 범위이며, 또한 복합체의 통상의 이식 조작 등에 있어서 하이드로겔이 무너지지 않을 정도의 젤리 강도이면 된다. 젤리 강도는 5중량% 내지 30중량% 정도의 하이드로겔(젤라틴)에 있어서, 예를 들어 하이드로겔(젤라틴)의 젤리 강도는 JIS K6503에 정해진 방법에 있어서 50g 이상, 100g 이상, 200g 이상, 500g 이상, 1000g 이상, 1200g 이상, 1300g 이상, 1400g 이상 또는 1500g 이상이어도 된다. 또한, 하이드로겔(젤라틴)의 젤리 강도는 3000g 이하, 2500g 이하 또는 2000g 이하여도 된다.
「점도」란, 유체의 끈기의 강도를 나타내는 지표이다. 당업자이면, 주지 알려진 방법에 의해 점도를 측정할 수 있다. 예를 들어, JIS K6503에 정해진 방법으로 측정할 수 있다. 즉, 일정량의 젤라틴 용액(60℃, 6.67%)이 피펫형 점도계를 유하하는 시간을 점도값(단위: mPa·s)으로 환산하면 된다.
젤라틴을 포함하는 하이드로겔의 졸 상태에 있어서의 점도는 젤라틴 등의 농도나 계의 온도, pH, 공존 염류 등에 의해 영향을 받는다. 일반적으로, 젤라틴 등의 농도의 상승이나 온도의 저하에 수반하여 점도는 상승한다. 예를 들어 B타입 젤라틴에서 점도는 pH에 의존하고, 등이온점의 pH 부근에 있어서 점도가 최소가 된다. 한편, A타입 젤라틴에 있어서는, 점도와 pH에 현저한 관계는 확인되지 않는다.
젤라틴을 포함하는 하이드로겔의 점도는 후술하는 복합체를 형성할 수 있는 정도의 점도이면 특별히 한정은 없다. 살아 있는 세포를 포매하기 위해서 세포에 대한 대미지를 고려하면, 약 40℃(약 30℃ 내지 약 50℃ 정도)의 하이드로겔을 사용해서 세포를 포매할 필요가 있다. 따라서, 약 40℃(30℃ 내지 50℃ 정도)에 있어서 세포를 포매하는 데 필요한 정도의 점도, 예를 들어 2 내지 50mPa·s(5 내지 30mPa·s) 정도의 점도를 나타내는 하이드로겔을 들 수 있다.
「기포율」이란, 검체의 원래의 체적(V0)에 대한 기포를 포함하는 전체 체적(V1)의 비율(V1/V0)을 의미한다. 기포율은 낮은 쪽이 바람직하다. 구체적으로는, 1.2 이하(바람직하게는 1.15 이하, 1.1 이하, 1.05 이하)이다. 기포율은, 예를 들어 사진용 젤라틴 시험법인 파기(PAGI)법 제10판(2006년판)에 의해 측정할 수 있다. 구체적으로는, 메스실린더에 넣은 50℃의 50mL의 검액을 진폭 300㎜, 진동수 145회/분으로 1분간 진동시킨 후, 진동 정지로부터 3분 후에 기포를 포함하는 전체 체적을 판독하면 된다.
본 명세서에 기재된 하이드로겔은 이식에 의해 생체 내에 투여하기 때문에, 일본 약전에서 정하는 순도 시험의 기준을 클리어하고 있는 쪽이 바람직하다. 예를 들어, 일본 약전에 있어서 젤라틴 및 정제 젤라틴의 품질 규격과 시험법이 정해져 있고, 구체적으로는 하기의 기준을 충족한다.
(1) 이취 및 불용물 본품 1.0g에 물 40mL를 첨가하고, 가열해서 녹일 때, 액은 불쾌취가 없다. 또한, 이 액은 맑거나, 또는 흐려지는 경우가 있어도 약간이며, 그 색은 색의 비교액 A보다 진하지 않다.
(2) 아황산염 60ppm 이하
(3) 중금속 50ppm 이하(20ppm 이하)
(4) 비소 1ppm 이하
(5) 수은 0.1ppm 이하
(6) 건조 감량 15.0% 이하
(7) 강열 잔분 2.0% 이하
하이드로겔의 농도는 각종 조작에 의한 붕괴나 조작 중의 용해 등을 방지한다고 하는 관점에서, 높은 쪽이 바람직하다. 하이드로겔의 농도는 하이드로겔을 용해시키는 매체(용매)에 대한 하이드로겔의 비율이다. 하이드로겔의 농도는, 예를 들어 젤라틴을 사용하는 경우, 10중량% 내지 50중량%여도 되고, 바람직하게는 25중량% 내지 50중량%, 30중량% 내지 50중량%, 또는 20중량% 내지 40중량%이다.
하이드로겔의 농도는 상술한 범위가 되도록, 계량한 하이드로겔에 대하여 적절한 매체에 의해 용해시키면 된다. 매체는 세포에 영향을 주지 않는 것이면 되며, 예를 들어 HBSS 등의 완충염 용액 등을 들 수 있다.
하이드로겔의 pH는 포매하는 조직이나 이식 후의 생체에 대한 상해를 경감시킬 목적으로, 중성 부근이 바람직하다. 예를 들어 6 내지 8 또는 6.5 내지 7.5여도 되고, 바람직하게는 7 내지 7.5이다. 하이드로겔의 pH는 용액 혹은 졸 상태에 있어서의 pH로서 측정하면 된다. 상술한 바와 같이 당해 pH 범위이면, 젤리 강도가 크게 저하되는 일도 없다. 하이드로겔의 pH의 측정 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 시판 중인 pH계나 pH 시험지에 의해 측정할 수 있다.
일 양태에 있어서, 하이드로겔은 생분해성을 갖는 하이드로겔인 것이 바람직하다. 복합체를 인간에게 이식한 후, 생분해성의 하이드로겔의 생분해에 의해, 이식된 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트가 서서히 접촉하고, 성숙 후에는 생체 망막과 마찬가지로 시세포의 외절이 망막 색소 상피 세포 시트와 접촉하는 것이 바람직하다. 또한, 접촉하지 않아도, 이식한 망막 색소 상피 세포 시트가 신생 혈관의 삼출을 억제하는 기능, 및/또는 레티노이드 사이클이나 외절의 탐식, 영양 등의 공급을 할 수 있는 기능을 갖고 있으면 된다. 주된 생체 구성 성분인 콜라겐을 처리함으로써 얻어지는 젤라틴은 생분해성을 갖는 하이드로겔이다.
일 양태에 있어서, 본 명세서에 있어서의 하이드로겔은 20℃ 내지 40℃의 범위의 융해점을 갖고, 또한 하기의 물성의 하나 이상을 충족하는 하이드로겔이 바람직하다.
(1) 조제 방법: 알칼리 처리 및/또는 가열 처리
(2) 평균 분자량: 약 10만 내지 약 50만
(3) 농도: 10중량% 내지 50중량%(바람직하게는 25중량% 내지 50중량%, 30중량% 내지 50중량%, 또는 20중량% 내지 40중량%)
(4) 젤리 강도: 50g 이상, 100g 이상, 200g 이상, 500g 이상, 1000g 이상, 1200g 이상, 1300g 이상, 1400g 이상 또는 1500g 이상(3000g 이하, 2500g 이하 또는 2000g 이하)
(5) pH: 6 내지 8(바람직하게는 6.5 내지 7.5, 7 내지 7.5)
(6) 등이온점: 산성 영역(약 pH4 내지 약 pH7, 약 pH5 내지 약 pH7, 약 pH6 내지 약 pH7)
(7) 기포율: 1.2 이하(바람직하게는 1.15 이하, 1.1 이하, 1.05 이하)
(8) 점도: 약 40℃(30℃ 내지 50℃ 정도)에 있어서, 약 5 내지 30mPa·s.
<복합체의 구조>
일 양태에 있어서, 본 발명에 관한 복합체에 있어서 하이드로겔은 신경 망막 및 망막 색소 상피 세포 시트의 전체를 포매한다. 「포매」란, 세포 등이 하이드로겔에 매립된 상태로 덮여 있는 것을 의미한다. 신경 망막 및 망막 색소 상피 세포 시트를 포매한다는 것은, 예를 들어 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트 사이 및 그 주위에 하이드로겔이 존재하는 상태여도 된다. 또한, 본원에 있어서는, 특히 따로따로 제조 또는 단리한 신경 망막 및 망막 색소 상피 세포 시트의 사용을 예정하고 있기 때문에, 망막 색소 상피 세포가 신경 망막층과 함께 연속하는 상피 구조를 구성하지 않는다.
복합체에 있어서 하이드로겔이 단층 구조를 가져도 되고, 2층 이상의 구조를 가져도 된다. 일 양태에 있어서는, 복합체는 망막 색소 상피 세포 시트만을 포매하는 제1 하이드로겔층과, 제1 하이드로겔층 및 신경 망막을 포매하는 제2 하이드로겔층을 구비하고 있어도 된다. 다른 양태에 있어서는, 복합체는 신경 망막만을 포매하는 제1 하이드로겔층과, 제1 하이드로겔층 및 망막 색소 상피 세포 시트를 포매하는 제2 하이드로겔층을 구비하고 있어도 된다.
본 발명에 관한 복합체에 있어서, 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트는 각각 접선 방향이 대략 평행하고 있다. 「접선 방향이 대략 평행하고 있다」란, 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트가 마주 보는 면의 접선 방향이 평행하고 있는 것을 의미한다. 또한, 본 발명에 관한 복합체에 있어서, 신경 망막의 정상 단부면과 망막 색소 상피 세포의 정상 단부면이 마주 보고 있다. 즉, 신경 망막의 정상 단부면과 망막 색소 상피 세포의 정상 단부면이 근접한 상태로 존재한다.
일 양태에 있어서, 복합체 중의 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트가 하이드로겔로 격리되어서 접촉하지 않는다. 그 때문에, 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트가 기계적인 접촉에 의한 세포의 상해를 저감시킬 수 있다. 또한, 「신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트가 접촉하지 않는다」는 것은, 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트가 물리적으로 접하고 있지 않은 것을 의미한다. 하이드로겔에 의해 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트가 접촉하지 않는 것은, 예를 들어 눈으로 보는 것(예: 현미경 하)에 의해 확인할 수 있다.
본 발명에 관한 복합체에 있어서, 하이드로겔에 포매되는 신경 망막으로서는 단일의 연속된 신경 망막이어도 되고, 복수의 연속된 신경 망막이어도 된다. 1개의 복합체에 의해 보다 넓은 범위의 망막 조직의 장애 상태 또는 망막 조직의 손상 상태를 치료할 수 있기 때문에, 복수의 신경 망막을 포매하는 것이 바람직하다. 이 경우, 복수의 신경 망막은 각각의 정상 단부면이 동일한 방향을 향해서 가로 일렬로 배열되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 하이드로겔에 포매되는 망막 색소 상피 세포 시트는 단일의 연속된 시트상의 망막 색소 상피 조직이어도 되고, 복수의 연속된 시트상의 망막 색소 상피 조직이어도 된다. 복수의 망막 색소 상피 조직이 하이드로겔에 포매되는 경우, 각각 망막 색소 상피 조직의 정상 단부면이 동일한 방향을 향해서 가로 일렬로 배열되어 있는 것이 바람직하다.
〔복합체의 제조 방법〕
본 발명의 일 양태는, 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트와 하이드로겔을 포함하는 복합체의 제조 방법이다. 본 발명에 관한 제조 방법에 있어서, 제조되는 복합체, 그리고 복합체에 포함되는 신경 망막, 망막 색소 상피 세포 시트 및 하이드로겔은, 상술한 복합체에 있어서 설명한 것과 마찬가지 양태를 적용할 수 있다.
본 발명에 관한 제조 방법에 있어서, 신경 망막 및 망막 색소 상피 세포 시트는 인간 다능성 줄기 세포 유래이다. 하이드로겔의 융해점은 20℃ 내지 40℃이고, 예를 들어 상술한 하이드로겔을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 하이드로겔은 젤라틴의 하이드로겔이다.
신경 망막 및 망막 색소 상피 세포 시트를 세포외 매트릭스(예: 콜라겐) 상에서 배양하여 제조한 경우, 신경 망막 및 망막 색소 상피 세포 시트의 회수에는 세포외 매트릭스를 분해하는 효소(예: 콜라게나아제)에 의한 박리를 행하는 경우가 있다. 그 경우에는, 당해 효소의 혼입을 방지하기 위해서, 배지 등에 의해 복수회 세정하는 것이 바람직하다.
복합체의 제조 방법으로서, 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트를 동시에 포매하는 방법(1단계 포매법이라고도 한다), 또는 신경 망막 및 망막 색소 상피 세포 시트 중 어느 것을 먼저 포매해서 하이드로겔층을 형성시키고, 그 후 당해 하이드로겔층과 신경 망막 및 망막 색소 상피 세포 시트의 다른 한쪽을 포매하는 방법(2단계 포매법이라고도 한다)을 들 수 있다. 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트의 물리적인 접촉을 피하기 위해서, 2단계로 포매하는 쪽이 바람직하다.
본 발명에 관한 제조 방법은, 일 양태에 있어서 2단계 포매법이며,
(1) 용기 안에 상기 망막 색소 상피 세포 시트 및 상기 신경 망막 중 어느 한쪽을 설치하는 제1 공정과,
(2) 유동 상태의 하이드로겔을, 상기 한쪽을 설치한 용기에 첨가하는 제2 공정과,
(3) 냉각하고, 상기 한쪽의 전체를 포매하도록 하이드로겔을 굳혀, 상기 한쪽과 하이드로겔을 구비하는 제1 하이드로겔층을 형성하는 제3 공정과,
(4) 제1 하이드로겔층 중의 상기 한쪽과, 상기 망막 색소 상피 세포 시트 및 상기 신경 망막의 다른 쪽이 각각의 표면의 접선 방향이 대략 평행이 되고, 또한 신경 망막의 정상 단부면과 망막 색소 상피 세포의 정상 단부면이 마주 보도록, 제1 하이드로겔층 상에 상기 다른 쪽을 더 설치하는 제4 공정과,
(5) 유동 상태의 하이드로겔을, 상기 다른 쪽을 더 설치한 용기에 첨가하는 제5 공정과,
(6) 냉각하고, 제1 하이드로겔층 및 신경 망막의 전체를 포매하도록 하이드로겔을 굳혀, 제1 하이드로겔층과 상기 다른 쪽과 하이드로겔을 구비하는 제2 하이드로겔층을 형성하는 제6 공정
을 포함한다.
(1) 제1 공정에 있어서, 용기 안에 망막 색소 상피 세포 시트 및 신경 망막 중 어느 한쪽을 설치하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 핀셋이나 시트를 건져 올리는 평평한 기구 등에 의해 설치할 수 있다. 용기는 특별히 한정되지 않고, 망막 색소 상피 세포 시트 또는 신경 망막의 사이즈에 따라 적절하게 선택 할 수 있지만, 예를 들어 샤알레나 슬라이드 유리, 실리콘 시트, 플라스틱 용기 등을 들 수 있다.
(2) 제2 공정에 있어서, 하이드로겔을 용기에 첨가하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 피펫맨이나 스포이트로 첨가하는 방법에 의해 행할 수 있다. 제1 공정에 있어서 망막 색소 상피 세포 시트를 설치한 경우에는, 망막 색소 상피 세포 시트가 시트상을 유지할 수 있도록, 조용히 천천히 첨가하는 것이 바람직하다. 유동 상태의 하이드로겔의 온도는 세포에 대한 대미지를 고려해서, 예를 들어 약 25℃ 내지 약 50℃, 바람직하게는 30℃ 내지 40℃여도 된다.
(3) 제3 공정에 있어서, 용기마다 예를 들어 2℃ 내지 8℃, 바람직하게는 4℃ 내지 5℃로 냉각하고, 제1 공정에 있어서 설치된 망막 색소 상피 세포 시트 및 신경 망막 중 어느 한쪽을 포매하도록 하이드로겔을 굳혀, 제1층의 하이드로겔을 형성한다. 제3 공정에서의 냉각 온도는 융해점으로부터 15℃ 내지 25℃ 낮은 온도(바람직하게는 20℃ 내지 25℃)이면 된다. 냉각 시간은 하이드로겔이 굳으면 되고, 하이드로겔의 종류에 따라 상이하지만, 저온에 의한 세포에 대한 악영향을 고려해서 가능한 한 빠른 쪽이 바람직하다. 예를 들어 10분 내지 1시간이어도 되고, 5분 내지 3시간 또는 5시간 이상이어도 된다. 냉각 수단은 특별히 한정하지 않지만, 예를 들어 얼음 위, 4℃ 냉장고, 보냉제 위 등을 들 수 있다.
(4) 제4 공정에 있어서, 제1층의 하이드로겔 상에 망막 색소 상피 세포 시트 및 신경 망막 중 다른 쪽을 설치하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 핀셋이나 약숟가락 등을 사용하는 방법에 의해 설치할 수 있다. 이때에 망막 색소 상피 세포 시트와 신경 망막이 각각의 표면의 접선 방향이 대략 평행이 되고, 또한 신경 망막의 정상 단부면과 망막 색소 상피 세포의 정상 단부면이 마주 보도록 설치한다. 이 상태로 설치함으로써, 생체의 망막과 마찬가지의 배향으로 이식할 수 있다.
(5) 제5 공정에 있어서, 유동 상태의 하이드로겔의 온도는 세포에 대한 대미지를 고려해서, 예를 들어 약 25℃ 내지 약 50℃, 바람직하게는 30℃ 내지 40℃여도 된다. 제5 공정의 유동 상태의 하이드로겔의 온도는 제2 공정의 것과 동일해도 되고, 상이해도 된다.
제5 공정에 있어서, 제2 공정과 마찬가지의 수단에 의해 하이드로겔을 용기에 첨가할 수 있다. 이때, 제1 공정에 있어서 설치된 망막 색소 상피 세포 시트 및 신경 망막 중 어느 한쪽을 포매하는 제1층의 하이드로겔과, 망막 색소 상피 세포 시트 및 신경 망막 중 다른 쪽을 싸서 안에 넣도록, 또한 양자의 위치 관계를 해치지 않도록, 조용히 천천히 기포가 가능한 한 들어가지 않도록 첨가하는 것이 바람직하다.
(6) 제6 공정에 있어서, 제3 공정과 마찬가지로 냉각할 수 있다.
일 양태에 있어서는, 본 발명의 복합체의 제조 방법은 제6 공정 후에, (7) 당해 복합체를 10℃ 내지 20℃에서 보존하는 제7 공정을 더 포함해도 된다. 저온 상태는 세포에 있어서의 스트레스인 한편, 온도를 상승시키면 하이드로겔이 용해되고 및/또는 젤리 강도의 저하에 의해 취급하기 어려워진다. 따라서, (7) 제7 공정에 있어서 당해 복합체를 보존하는 온도는 예를 들어 8℃ 내지 25℃, 바람직하게는 10℃ 내지 20℃이다. 제7 공정에 있어서, 고정 후 더 냉각해도 된다. 냉각 온도는 융해점으로부터 5℃ 내지 15℃ 낮은 온도(바람직하게는 10℃ 내지 15℃ 낮은 온도)여도 된다.
상술한 2단계 포매법에 있어서, 먼저 망막 색소 상피 세포 시트를 하이드로겔로 포매하는 쪽이 바람직하다.
본 발명에 관한 제조 방법은, 일 양태에 있어서 1단계 포매법이며,
(1) 용기 안에 망막 색소 상피 세포 시트 및 신경 망막을 설치하는 제1 공정과,
(2) 유동 상태의 하이드로겔을, 망막 색소 상피 세포 시트 및 신경 망막을 설치한 용기에 첨가하는 제2 공정과,
(3) 냉각하고, 망막 색소 상피 세포 시트 및 신경 망막의 전체를 포매하도록 하이드로겔을 굳혀, 망막 색소 상피 세포 시트, 신경 망막 및 하이드로겔을 구비하는 하이드로겔층을 형성하는 제3 공정
을 포함한다.
제1 공정에 있어서, 망막 색소 상피 세포 시트와 신경 망막이 각각의 표면의 접선 방향이 대략 평행이 되고, 또한 신경 망막의 정상 단부면과 망막 색소 상피 세포의 정상 단부면이 마주 보도록 핀셋으로 위치를 조정하면서 설치한다. 이 상태로 설치함으로써, 생체의 망막과 마찬가지의 배향으로 이식할 수 있다.
제2 공정 및 제3 공정은 2단계 포매법에 있어서 기재한 바와 같이 실시하면 된다. 또한, 2단계 포매법에 있어서의 제7 공정을 더 포함해도 된다.
〔의약 조성물, 치료약 및 치료 방법〕
본 발명의 일 양태로서, 본 발명에서 얻어지는 복합체를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물을 들 수 있다. 의약 조성물은 본 발명의 복합체 외에, 바람직하게는 의약으로서 허용되는 담체를 더 포함한다.
의약 조성물은 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환의 치료에 사용할 수 있다. 망막 조직의 장애에 기초하는 질환으로서는, 예를 들어 망막변성 질환, 황반 변성증, 노인성 황반 변성, 망막 색소 변성, 녹내장, 각막 질환, 망막 박리, 중심성 장액성 망맥락막증, 추체 디스트로피, 추체 간체 디스트로피 등의 안과 질환을 들 수 있다. 망막 조직의 손상 상태로서는, 예를 들어 시세포나 망막 색소 상피 세포 등이 변성사되어 있는 상태 등을 들 수 있다.
의약으로서 허용되는 담체로서는, 생리적인 수성 용매(생리 식염수, 완충액, 무혈청 배지 등)를 사용할 수 있다. 필요에 따라, 의약 조성물에는 이식 의료에 있어서, 이식하는 조직 또는 세포를 포함하는 의약에 통상 사용되는 보존제, 안정제, 환원제, 등장화제 등을 배합시켜도 된다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명에서 얻어지는 복합체를 함유하여 이루어지는, 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환의 치료약을 들 수 있다.
본 발명의 치료약은 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환을 갖는 환자에, 본 발명에서 얻어지는 복합체를 이식함으로써 망막 조직의 장애 상태 또는 망막 조직의 손상 상태를 치료할 수 있다. 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환으로서는, 상술한 질환을 들 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명에서 얻어지는 복합체를 함유하여 이루어지는 이식용 조성물을 들 수 있다. 환자의 안저 또는 망막 아래(Subretinal Space)에 이식하기 위해서, 본 발명의 복합체를 사용할 수 있다. 또한, 이식된 환자에 있어서, 이식된 복합체의 신경 망막이 해당 환자의 신경 망막층을 향하고, 이식된 복합체의 망막 색소 상피 세포 시트가 해당 환자의 망막 색소 상피층을 향한 상태로 생착하도록 이식되기 때문에, 본 발명의 복합체를 사용할 수 있다. 이식용 조성물은 본 발명의 복합체 외에, 바람직하게는 의약으로서 허용되는 담체를 더 포함하며, 의약으로서 허용되는 담체는 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 양태로서, 이하의 공정을 포함하는, 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환의 치료 방법을 들 수 있다.
(1) 본 발명에서 얻어지는 복합체를 환자의 안저 또는 망막 아래(Subretinal Space)에 이식하는 공정,
(2) 환자의 생체 내에 있어서, 이식된 복합체의 신경 망막이 해당 환자의 신경 망막층을 향하고, 이식된 복합체의 망막 색소 상피 세포 시트가 해당 환자의 망막 색소 상피층을 향한 상태로 생착되는 공정.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명에서 얻어지는 복합체를 이식을 필요로 하는 대상(예를 들어, 안과 질환이 일어나 있는 눈의 망막 아래)에 이식하는 것을 포함하는, 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환을 치료하는 방법을 들 수 있다. 망막 조직의 장애에 기초하는 질환의 치료약으로서, 또는 당해 망막 조직의 손상 상태에 있어서 해당하는 손상 부위를 보충하기 위해서, 본 발명의 복합체를 사용할 수 있다. 이식을 필요로 하는, 망막 조직의 장애에 기초하는 질환을 갖는 환자, 또는 망막 조직의 손상 상태의 환자에게 본 발명의 복합체를 이식하고, 당해 장애를 받은 망막 조직을 보충함으로써, 망막 조직의 장애에 기초하는 질환, 또는 망막 조직의 손상 상태를 치료할 수 있다. 이식 방법으로서는, 예를 들어 안구의 절개 등에 의해 손상 부위의 망막 아래에 이식용의 본 발명의 복합체를 이식하는 방법을 들 수 있다. 이식하는 방법으로서는, 예를 들어 가는 관을 사용해서 주입하는 방법이나 핀셋으로 집어서 이식하는 방법을 들 수 있고, 가는 관으로서는 주사 바늘 등을 들 수 있다.
실시예
이하에 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 전혀 이들에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1 인간 ES 세포로부터 SFEBq법에 의한 망막 색소 상피 세포 시트(RPE 세포 시트) 및 신경 망막의 제작>
Crx::Venus 리포터 유전자를 갖도록 유전자 개변한 인간 ES 세포(KhES-1주, (비특허문헌 3))를, 「Scientific Reports, 4, 3594(2014)」에 기재된 방법에 준해서 피더 프리 조건 하에서 배양했다. 피더 프리 배지로서는 StemFit 배지(상품명: AK03N, 아지노모토사제), 피더 세포를 대신하는 기반으로서 Laminin511-E8(상품명, 닛피사제)을 사용했다.
구체적인 인간 ES 세포의 유지 배양 조작은 이하와 같이 행하였다. 먼저, 서브컨플루엔트(배양 면적의 6할이 세포로 덮이는 정도)가 된 인간 ES 세포를 PBS로 세정 후, TrypLE Select(상품명, Life Technologies사제)를 사용해서 단일 세포로 분산했다. 그 후, 단일 세포로 분산된 인간 ES 세포를 Laminin511-E8로 코팅한 플라스틱 배양 디쉬에 파종하고, Y27632(ROCK 저해 물질, 10μM) 존재 하, StemFit 배지에서 피더 프리 조건 하에서 배양했다. 상기 플라스틱 배양 디쉬로서 6웰 플레이트(이와키사 제조, 세포 배양용, 배양 면적 9.4㎠)를 사용한 경우, 상기 단일 세포로 분산된 인간 ES 세포의 파종 세포수는 1웰당 0.4 내지 1.2×104 세포로 했다. 파종한 1일 후에, Y27632를 포함하지 않는 StemFit 배지로 교환했다. 이후, 1 내지 2일마다 1회, Y27632를 포함하지 않는 StemFit 배지로 배지 교환했다. 그 후, 서브컨플루엔트 1일 전이 될 때까지 피더 세포 비존재 하(피더 프리 조건 하)에서 배양했다. 당해 서브컨플루엔트 1일 전의 인간 ES 세포를, SB431542(TGFβ 시그널 전달 경로 저해 물질, 5μM) 및 SAG(Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300nM)의 존재 하(사전 조건(Precondition) 처리)에서, 1일간 피더 프리 조건 하에서 배양했다.
인간 ES 세포를 PBS로 세정 후, TrypLE Select를 사용해서 세포 분산액 처리하고, 추가로 피펫팅 조작에 의해 단일 세포로 분산한 후, 단일 세포로 분산된 인간 ES 세포를 비세포 접착성의 96웰 배양 플레이트(상품명: PrimeSurface 96웰 V바닥 플레이트, 스미토모 베이크라이트사제)의 1웰당 1.2×104 세포가 되도록 100μL의 무혈청 배지에 부유시키고, 37℃, 5% CO2로 부유 배양했다. 그 때의 무혈청 배지(gfCDM+KSR)에는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1:1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노티오글리세롤, 1×화학적으로 규정된 지질 농축액(Chemically defined lipid concentrate)을 첨가한 무혈청 배지를 사용했다.
부유 배양 개시 시(부유 배양 개시 후 0일째)에, 상기 무혈청 배지에 Y27632(ROCK 저해 물질, 최종 농도 10μM) 및 SAG(Shh 시그널 전달 경로 작용 물질, 300nM 또는 30nM, 0nM)를 첨가했다. 부유 배양 개시 후 3일째에, Y27632 및 SAG를 포함하지 않고, 인간 재조합 BMP4(상품명: Recombinant Human BMP-4, R&D사제)를 포함하는 배지를 사용하여, 외래성의 인간 재조합 BMP4를 최종 농도 1.5nM로 포함하는 배지를 50μL 첨가했다. 부유 배양 개시 후 6일째 이후, 3일에 1회, Y27632 및 SAG 및 인간 재조합 BMP4를 포함하지 않는 배지로 절반량 교환했다. 신경 망막 및 RPE 세포 시트 모두, 여기까지의 제조 방법은 동일한 방법으로 실시했다.
(신경 망막의 제조 방법)
당해 부유 배양 개시 후 15일부터 18일째의 응집체를 90㎜의 저접착 배양 접시(스미토모 베이크라이트사제)에 옮기고, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질(CHIR99021, 3μM) 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질(SU5402, 5μM)을 포함하는 무혈청 배지(DMEM/F12 배지에 1% N2 보충제(Supplement)가 첨가된 배지)에서 37℃, 5% CO2로 3 내지 4일간 배양했다. 그 후, 90㎜의 저접착 배양 접시(스미토모 베이크라이트사제)에서, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않고 혈청을 포함하는 DMEM/F12 배지(이하, NucT0 배지라고 하는 경우도 있다)에서 장기 배양했다. 부유 배양 개시 후(분화 유도) 40일째 이후, Wnt 시그널 전달 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 배지(NucT0 배지와 NucT2 배지의 혼합 배지, 이하 NucT1 배지라고 하는 경우도 있다)에서 장기 배양했다. 부유 배양 개시 후(분화 유도) 60일째 이후, 갑상선 호르몬 시그널 전달 경로 작용 물질 T3을 포함하는 뉴로베이슬 배지(이하, NucT2 배지라고 하는 경우도 있다)에서 장기 배양(부유 배양 개시 후 80일부터 150일 정도)함으로써, 스피어상의 신경 망막 및 PRE 세포를 얻었다. 신경 망막 및 RPE 세포를 픽업했다. 스피어상의 인간 ES 세포 유래 RPE를 안과용 가위로 전개해서 절개하고, 1층의 시트상으로 해서 RPE 세포 시트를 얻었다.
현미경을 사용하여 관찰한 결과, 인간 ES 세포주에 있어서, 층 구조를 갖는 신경 망막(NR) 및 RPE 세포가 분화되는 것을 알 수 있다(도 1의 A 및 B).
또한, 이 스피어상의 RPE 세포를 iMatrix511로 코팅한 디쉬에 접착해서 B27 및 200mM L-글루타민(Glutamine)을 포함하는 DMEM, F12 배지(SFRM 배지라고 한다)에 SB431542(WAKO사)와 bFGF(WAKO사)를 첨가해서 배양하고, 확대 배양 후, 양호한 RPE의 개소를 픽업해서 계대했다. 확대 배양 후, STEM-CELLBANKER(등록상표; 니폰 젠야쿠 고교 가부시키가이샤)로 동결 보존했다. 동결 보존한 RPE를 다시 iMatrix511로 코팅한 디쉬 상에서 확대 배양 후, beMatrix 저엔도톡신화 콜라겐액(닛타 젤라틴사 CollagenAT)을 사용하여, 콜라겐 겔화시킨 뒤에 1개월간, F10(Sigma사)에 10% FBS를 첨가한 배지에서 배양 후, SFRM 배지에 SB431543 및 bFGF를 첨가해서 배양한바, 육각형 구조를 갖는 RPE 세포 시트를 제작할 수 있는 것을 알 수 있다(도 1의C). 이와 같이 해서 제작한 RPE 세포 시트는 콜라게나아제(Collagenase)(Roche사)를 사용해서 콜라겐 겔을 소화하고, 회수할 수 있다. 이하의 실시예에서는, 실시예 1과 마찬가지 방법으로 망막 색소 상피 세포 시트(RPE 세포 시트) 및 신경 망막을 제조했다.
<실시예 2 실험 조건의 검토-젤라틴의 농도와 녹기 용이함->
망막 아래에 젤라틴을 이식할 때 가능한 한 저농도로 이식하고, 빠르게 용해 및 흡수·분해되는 쪽이 바람직하다. 한편으로, 이식 시에 젤라틴이 바로 녹을 것 같으면 취급하기 어려워지기 때문에, 최적의 농도를 검토했다.
젤라틴 LS-W(닛타 젤라틴사제)를 10중량%, 15중량%, 20중량%, 25중량%, 30중량%의 농도가 되도록 HBSS(Gibco사제)를 사용해서 37℃에서 용해시키고, 각각을 슬라이드 유리 위에 몇방울 적하했다. 적하 후, 4℃의 냉장고 안에 30분 인큐베이트했다. 인큐베이트 후, 슬라이드 유리를 수직으로 세운 상태에서 실온(25℃)에 5분 정도 두고, 흘러내리는 것을 지표로 녹기 용이함을 검토했다.
그 결과, 10중량%, 15중량%, 20중량%의 농도의 경우, 실온에서 빠르게 녹는 것을 알 수 있다. 반면에, 25중량% 이상의 농도의 경우, 실온에 있어서 굳어진 그대로인 것을 알 수 있다. 따라서, 실시예 3 이후에서 젤라틴의 농도는 30중량% 로 실시하는 것으로 했다.
<실시예 3 실험 조건의 검토-젤라틴이 녹는 온도->
젤라틴 LS-W(닛타 젤라틴사제)의 용해 온도에 대해서 검토했다. 젤라틴 LS-W를, 37℃에서 HBSS를 사용해서 30중량%가 되도록 용해시키고, 4℃, 16℃, 26℃, 37℃에서 1일 인큐베이트했다. 또한, 4℃에서의 보관은 냉장고에서, 16℃, 26℃ 및 37℃ 보관은 각각의 온도로 설정한 CO2 인큐베이터 안에서 실시했다.
하루 후에 관찰한바, 4℃ 및 16℃에서 젤라틴은 굳어진 그대로였던 데 반해, 26℃ 및 37℃에서 젤라틴은 완전히 용해되었다. 따라서, 30중량% 젤라틴 L-SW의 용해 온도는 16℃부터 26℃ 사이에 있는 것을 알 수 있다.
<실시예 4 실험 조건의 검토-pH 조정과 녹기 용이함->
HBSS(Gibco사제)에 용해한 30중량% 젤라틴 LS-W(닛타 젤라틴사제)는 pH5.0 내지 6.0 부근의 산성이며, 아시도시스 등 세포에 대하여 좋지 않은 영향이 생각된다. 그래서, 100uL의 30중량% 젤라틴 L-SW에 대하여 1.2N NaOH를 1uL, 2uL, 3uL또는 4uL 첨가함으로써, pH6 부근, pH7 부근, pH8 부근으로 조정했다.
각각의 pH로 조정한 젤라틴의 성질(녹기 용이함)이 변하지 않는지를 검토하기 위해서, 인간 ES 세포 유래 신경 망막을 5 내지 10개 포매한 상태에서, 16℃로 설정한 5% CO2 인큐베이터 안에서 1일 및 3일 인큐베이트했다. 그 결과, 중성 부근으로 조정한 젤라틴은 16℃에 있어서 1 내지 3일간 굳어진 그대로였다. 따라서, pH 조정으로 중성으로 해도 젤라틴의 특성은 변함없는 것을 알 수 있다. 따라서, 젤라틴 LS-W(닛타 젤라틴사제)는 중성 영역에 있어서도 용해 온도에 큰 변화는 없는 것을 알 수 있다. 실시예 5 이후에는, pH는 7 부근에서 사용하는 것으로 했다.
<실시예 5 젤라틴 포매한 hES 세포 유래 신경 망막의 독성 시험>
고농도(30중량%) 및 산성 영역 또는 중성 영역의 PH를 갖는 젤라틴 L-SW(닛타 젤라틴사제)가 세포의 생존 및 분화에 미치는 영향에 대해서 검토를 행하였다. hES 세포 유래 신경 망막을 30중량%의 젤라틴(pH5 또는 pH7)으로 3일간 포매하고 16℃에서 보존했다. 그 후, 약 37℃에서 인큐베이트함으로써 젤라틴을 녹이고 나서, 3일간, 9일간, 14일간 증식 배지 안에서 회복 배양했다. 그 후, 현미경 하에 있어서 조직의 형태 및 각종 마커의 발현 등을 면역 염색에 의해 확인했다.
현미경 하에 있어서 조직의 형태를 확인한 결과, 30중량%의 젤라틴으로 3일간 포매하고 16℃에서 보존한 인간 ES 세포 유래 신경 망막은 3일간 배양 후에 약간 세포사나 층 구조의 흐트러짐이 보였지만(도 2 및 도 3, 화살표), 9일간 이상 배양하면, 문제없이 회복하는 것을 알 수 있다(도 2 및 도 3). 또한, pH5의 젤라틴은 직후의 대미지가 강한 점에서, 중성 부근의 젤라틴의 바람직한 것을 확인할 수 있었다(도 2).
신경 망막에서는 통상 조건 하에서 HLA 클래스1이 발현하고 있지 않지만, 염증 조건 하가 되면 발현이 상승하는 것을 알 수 있다. 그래서, hES 세포 유래 신경 망막의 형태 및 HLA 클래스1의 발현에 대해서, pH5와 pH7의 젤라틴으로 포매하고, 보관한 후, 14일간 회복 배양하여 비교했다. 그 결과, pH5의 젤라틴으로 포매 및 보관한 경우, hES 세포 유래 신경 망막의 층 구조 및 연속 상피 구조는 잘 유지되고 있고 리커버린 양성의 시세포가 확인되었지만, 일부 연속 상피 구조가 무너져서 로제트화되어 있는 것이 확인되었다(도 4). 로제트화된 장소에서는 HLA 클래스1의 발현이 상승하고 있고, 젤라틴의 산성도에 의한 대미지의 가능성이 생각된다. 한편, pH7의 젤라틴으로 포매 및 보관한 경우, hES 세포 유래 신경 망막의 층 구조는 잘 유지되고 있고, 리커버린 양성의 시세포가 다수 확인되었다(도 5). 또한, HLA 클래스1의 발현은 인정되지 않았다(도 5).
이어서, 젤라틴은 기저막 성분인 콜라겐을 분해시킨 것이기 때문에, 젤라틴에 의해 hES 세포 유래 신경 망막의 정상 단부(Apical) 및 기저(basal)의 극성이나 층 구조(연속 상피 구조)의 붕괴, 분화 유도의 촉진, 또는 아포토시스 등이 야기될 가능성에 대해서 검토했다. 구체적으로는, 14일간의 회복 배양 후에 있어서의 인간 ES 세포 유래 신경 망막의 정상 단부 및 기저의 극성의 변화, 분화 유도의 촉진 유무(전구 세포의 존재 확인) 및 아포토시스 유도의 유무를, 각각의 마커를 면역 염색함으로써 확인했다. 결과를 도 6 내지 8에 나타낸다.
그 결과, 정상 단부 및 기저의 극성은 유지된 그대로이며, 젤라틴의 영향이 없는 것이 나타났다(에즈린: Apical 마커, R&D Systems사 제조, Col IV:Collagen IV·Basal 마커, Abcam사제)(도 6). 또한, 망막 마커에 대해서, Crx(TaKaRa사제), Chx10(Exalpha사제) 및 Pax6(BD사제) 각각의 양성 세포의 국재는 정확하게 유지되고 있고, 젤라틴의 영향은 없는 것이 나타났다(Crx: 시세포 전구 세포, Chx10&Pax6: 망막 전구 세포, Pax6: 아마크린 세포)(도 7). 망막 전구 세포도 존재하고 있었다. 또한, 아포토시스에 대해서, 활성형 카스파제3(BD사제) 양성의 아포토시스를 일으키고 있는 세포는 거의 확인되지 않고, 젤라틴의 영향은 없는 것이 나타났다(도 8). 이들 영향에 대해서, pH의 차이에 의한 차이도 확인되지 않았다.
이상의 결과로부터, 젤라틴으로 3일간 포매하고 16℃에서 보존한 인간 ES 세포 유래 신경 망막은 젤라틴을 녹인 직후에는 조금 대미지가 보였지만, 문제없이 회복하는 것을 알 수 있다. 또한, pH5의 젤라틴은 직후의 대미지가 강한 점에서, 중성 부근의 젤라틴이 바람직한 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 6 인간 ES 세포 유래 신경 망막의 30중량% 젤라틴 LS-W에 대한 병렬 포매>
실시예 1과 동일한 방법으로 제조한 부유 배양 개시 후 80일부터 150일의 인간 ES 세포 유래 신경 망막을 안과용 가위로 잘라내어 이식 가능한 크기로 준비하고, 60㎝ dish(스미토모 베이크라이트사) 위에 놓고, 배지를 제거했다. 위에서부터 37℃에서 가열한 30중량% 젤라틴 LS-W(닛타 젤라틴사제)를 20 내지 30uL 적하하고, 잘라낸 신경 망막을 가로로 나란히 배치하고, 4℃에서 30분간 냉각했다. 그 결과로부터, 가로로 연속하여 이식편을 복수개 연속해서 준비할 수 있었다. 젤라틴을 첨가하고 나서 가로로 나란히 배치함으로써, 이식할 때에 복수개의 이식편을 동시에 준비할 수 있는 것을 알 수 있다.
<실시예 7 인간 ES 세포 유래 RPE와 인간 ES 세포 유래 신경 망막의 30중량% 젤라틴 LS-W에 대한 2단계 포매>
실시예 1과 동일한 방법으로 제조한 부유 배양 개시 후 80일부터 150일의 인간 ES 세포 유래 신경 망막 및 RPE 세포 시트를 준비했다. 젤라틴으로 굳히기 위한 용기로서, 슬라이드 유리(마츠나미 가라스사) 위의 양 끝에 스페이서로서 200㎛ 두께의 실리콘 시트 2매를 겹친 400um의 실리콘 시트를 놓았다. RPE 세포 시트를 슬라이드 유리 위에 정치했다. 위에서부터 52℃에서 가열한 30중량% 젤라틴 LS-W(닛타 젤라틴사제)를 50uL 적하하고, 위에서부터 슬라이드 유리를 겹치고, 4℃에서 20분간 냉각했다. 냉각 후, RPE를 매몰시킨 겔을 박리하고, 반전시켜 RPE의 정상 단부면을 상측으로 했다. 실시예 1에서 제작한 신경 망막 조직으로부터 잘라낸 신경 망막을 정상 단부면이 아래(RPE측)가 되도록 RPE 세포 시트 위에 놓고, 52℃의 젤라틴 LS-W를 위에서부터 적하하고 커버 유리를 씌웠다. 4℃에서 20분간 냉각했다. 실시예 7의 수순을 도 9에 나타낸다.
냉각 후, RPE 세포 시트와 신경 망막이 굳어진 상태로 회수할 수 있었다. 현미경을 사용해서 관찰한 바, RPE 세포 시트 위에 신경 망막이 놓여 있는 것이 확인되었다(도 10 및 11). 또한, 메스나 핀셋을 사용해서 주위의 불필요한 젤라틴을 제거한 후, 슬라이드 유리에 접착되어 있는 젤라틴을 박리하고, 핀셋으로 회수했다(도 12). 이 인간 ES 세포 유래 RPE 세포 시트와 신경 망막의 복합체를 PBS로 세정하고, 4% PFA를 사용해서 15분간 추가로 4℃에서 고정했다. PBS로 세정 후, 30% 수크로오스 용액에 침지했다. 그 후, 클리오 몰드에 OCT 컴파운드를 사용해서 포매했다. 크라이오스탯으로 12㎛의 절편을 제작했다. 이 절편에 대하여 공초점 현미경(Leica사제 SP-8)으로 관찰을 행하였다. 그 결과, 인간 ES 세포 유래 신경 망막 및 RPE 세포 시트가 젤라틴에 의해 격리되어 접촉하지 않지만, 근접하고 있는 것을 알 수 있다(도 13 및 14). 이 결과로부터, 젤라틴을 사용하여 2단계로 포매함으로써, 인간 ES 세포로부터 각각 따로따로 분화 유도한 RPE 세포 시트와 신경 망막이, 젤라틴에 의해 격리되어서 접촉하지 않고 있지만 근접한 상태로 얻을 수 있는 것을 알 수 있다.
<실시예 8 NR-RPE 세포 시트의 이식 및 생착 확인>
실시예 7의 방법으로 제작한 젤라틴으로 굳힌 인간 ES 세포 유래 RPE 세포 시트 및 신경 망막의 복합체를 메스와 가위를 사용하여 이식침으로 빨아들일 수 있도록 가늘고 길게 잘라냈다. 잘라낸 복합 시트에 대해서 유리 캐필러리를 사용하여 흡인하고, 누드 래트의 망막 아래에 이식했다. 이식은 안구의 일부를 절개하고, 절개 부위로부터 유리 캐필러리를 초자체에 침입시켜서 망막 아래에 이식했다. 이식 1주일 후, 래트로부터 안구 적출하고, 파라포름알데히드 고정해서 수크로오스 치환했다. 크라이오스탯으로 12㎛의 조직 절편을 제작했다. 잘라낸 절편에 대하여 면역 염색에 의해, 인간 세포질 마커 특이적 마우스 모노클로날 항체(상품명: Stem121, TaKaRa사제), 항RPE65 항체(상품명: RPE65 Antibody, Millipore사제), 항HuNu 항체(Millipore사제), 항MITF 항체(ExAlpha사제), 항Iba1 항체(Wako사제)를 사용하여 각각 조직 절편 중의 인간 세포 및 RPE 세포를 염색하고, 이식 후의 이식편을 평가했다. 인간 세포를 염색함으로써, 이식한 인간 유래 세포인지의 여부를 판단했다.
염색한 조직을 공초점 현미경(상품명: TCS SP8, 라이카사제)을 사용해서 형광 관찰을 행하였다. 결과를 도 15 내지 20에 나타낸다. Stem121과 RPE65로 염색한 절편을 관찰한바, 이식편(Graft) 유래의 RPE와 그의 바로 상측에 CRX::Venus 양성의 시세포 로제트(Rosette)가 관찰되었다. 이 결과로부터, NR-RPE 세포 시트의 동시 이식에서는 NR과 RPE 세포는 방향성을 가지고 동시 이식 및 생착이 가능한 것이 나타났다.
<실시예 9 인간 ES 세포 유래 RPE 시트와 인간 ES 세포 유래 신경 망막의 30중량% 젤라틴 L-SW에 대한 1단계 포매>
실시예 1과 동일한 방법으로 제조한 부유 배양 개시 후 80일부터 150일의 인간 ES 세포 유래 신경 망막 및 RPE 세포 시트를 준비했다. 제조한 인간 ES 세포 유래 RPE 세포 시트를 콜라게나아제를 사용해서 콜라겐 겔로부터 회수하고, 충분히 세정 후, 60㎜ dish(스미토모 베이크라이트사) 위에 놓았다. 또한, 10개의 인간 ES 세포 유래 신경 망막을 안과용 가위로 잘라내고, RPE 세포 시트 위에 놓았다. 위에서부터 37℃에서 가열한 30중량% 젤라틴 LS-W(닛타 젤라틴사제)를 20 내지 30uL 적하하고, 핀셋을 사용해서 신경 망막과 RPE의 위치 관계를 조정하고, 4℃에서 30분간 냉각했다.
냉각 후, 주위의 여분의 부분을 메스를 사용해서 절제하고, RPE 세포 시트와 신경 망막을 굳어진 상태로 회수할 수 있었다. 현미경을 사용해서 관찰한 바, RPE 세포 시트 위에 NR이 놓여 있는 것이 확인되었다(도 21). 도 21의 A는 현미경 화상, 도 21의 B는 CRX::Venus의 형광을 나타내는 형광 현미경 화상을 나타낸다. 이 결과로부터, 인간 ES 세포로부터 각각 따로따로 분화 유도한 RPE 세포 시트와 신경 망막을, 젤라틴을 사용해서 1단계로 포매할 수 있는 것을 알 수 있다. 또한, 1단계로 포매한 경우에 있어서도, 신경 망막과 RPE 세포 시트가 젤라틴에 의해 격리되어서 접촉하지 않고 있지만 근접한 상태로 얻어지는 경우도 있었다.
본 발명에 따르면, 이식에 적합한 신경 망막과 망막 색소 상피 세포의 복합체 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이 가능해진다.

Claims (25)

  1. 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트와 하이드로겔을 포함하는 복합체로서,
    상기 신경 망막 및 상기 망막 색소 상피 세포 시트가 각각 인간 다능성 줄기 세포 유래이고,
    상기 신경 망막에 있어서, 적어도 시세포층을 포함하는 신경 망막층이 형성되어 있고, 상기 시세포층은 적어도 시세포, 시세포 전구 세포 및 망막 전구 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 세포를 포함하고,
    상기 하이드로겔의 융해점이 20℃ 내지 40℃이고,
    상기 신경 망막 및 상기 망막 색소 상피 세포 시트의 전체가 상기 하이드로겔에 포매되어 있고, 상기 신경 망막과 상기 망막 색소 상피 세포 시트는 각각의 표면의 접선 방향이 대략 평행하고 있고, 상기 신경 망막의 정상 단부면과 상기 망막 색소 상피 세포 시트의 정상 단부면이 마주 보고 있고, 양자가 상기 하이드로겔에 의해 격리되어서 접촉하고 있지 않은, 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔의 젤리 강도가 1000g 내지 2000g인, 복합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하이드로겔의 농도가 10중량% 내지 50중량%인, 복합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔의 pH가 6.5 내지 7.5인, 복합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔이 생분해성을 갖는, 복합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔이 젤라틴의 하이드로겔인, 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 젤라틴이 알칼리 처리 및/또는 가열 처리된 젤라틴인, 복합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 망막이, 인간 다능성 줄기 세포를 분화 유도해서 얻어진 세포 응집체에서 얻어지는 신경 망막이고,
    상기 세포 응집체가 적어도 제1 상피 조직 및 제2 상피 조직을 포함하고, 상기 제1 상피 조직은 인간 신경 망막을 포함하고, 제2 상피 조직은 상기 제1 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기의 연속성과 다른 표면의 접선의 기울기의 연속성을 갖고, 또한 망막계 세포 이외의 세포 및/또는 망막 색소 상피 세포를 포함하고,
    상기 신경 망막이, 상기 세포 응집체에 있어서의 제2 상피 조직으로부터 가장 떨어진 제1 상피 조직 상의 영역을 포함하는, 복합체.
  9. 신경 망막과 망막 색소 상피 세포 시트와 하이드로겔을 포함하는 복합체의 제조 방법으로서,
    상기 신경 망막 및 상기 망막 색소 상피 세포 시트가 각각 인간 다능성 줄기 세포 유래이고,
    상기 신경 망막에 있어서, 적어도 시세포층을 포함하는 신경 망막층이 형성되어 있고, 상기 시세포층은 적어도 시세포, 시세포 전구 세포 및 망막 전구 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 세포를 포함하고,
    상기 하이드로겔의 융해점이 20℃ 내지 40℃이고,
    상기 방법이,
    (1) 용기 안에 상기 망막 색소 상피 세포 시트 및 상기 신경 망막 중 어느 한쪽을 설치하는 제1 공정과,
    (2) 유동 상태의 하이드로겔을, 상기 한쪽을 설치한 상기 용기에 첨가하는 제2 공정과,
    (3) 냉각하고, 상기 한쪽의 전체를 포매하도록 상기 하이드로겔을 굳혀, 상기 한쪽과 상기 하이드로겔을 구비하는 제1 하이드로겔층을 형성하는 제3 공정과,
    (4) 상기 제1 하이드로겔층 중의 상기 한쪽과, 상기 망막 색소 상피 세포 시트 및 상기 신경 망막의 다른 쪽이 각각의 표면의 접선 방향이 대략 평행이 되고, 또한 상기 신경 망막의 정상 단부면과 상기 망막 색소 상피 세포의 정상 단부면이 마주 보도록, 상기 제1 하이드로겔층 상에 상기 다른 쪽을 더 설치하는 제4 공정과,
    (5) 유동 상태의 하이드로겔을, 상기 다른 쪽을 더 설치한 상기 용기에 첨가하는 제5 공정과,
    (6) 냉각하고, 상기 제1 하이드로겔층 및 상기 다른 쪽의 전체를 포매하도록 상기 하이드로겔을 굳혀, 상기 제1 하이드로겔층과 상기 다른 쪽과 상기 하이드로겔을 구비하는 제2 하이드로겔층을 형성하는 제6 공정
    을 포함하는, 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제3 공정에 있어서 2℃ 내지 8℃로 냉각하는, 제조 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 제6 공정에 있어서 2℃ 내지 8℃로 냉각하는, 제조 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제6 공정 후에, (7) 상기 복합체를 10℃ 내지 20℃에서 보존하는 제7 공정을 더 포함하는, 제조 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔의 젤리 강도가 1000g 내지 2000g인, 제조 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔의 농도가 10중량% 내지 50중량%인, 제조 방법.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔의 pH가 6.5 내지 7.5인, 제조 방법.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔이 생분해성을 갖는, 제조 방법.
  17. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔이 젤라틴의 하이드로겔인, 제조 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 젤라틴이 알칼리 처리 및/또는 가열 처리된 젤라틴인, 제조 방법.
  19. 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 망막이, 인간 다능성 줄기 세포를 분화 유도해서 얻어진 세포 응집체에서 얻어지는 신경 망막이고,
    상기 세포 응집체가 적어도 제1 상피 조직 및 제2 상피 조직을 포함하고, 상기 제1 상피 조직은 인간 신경 망막을 포함하고, 제2 상피 조직은 상기 제1 상피 조직의 표면에 있어서의 접선의 기울기의 연속성과 다른 표면의 접선의 기울기의 연속성을 갖고, 또한 망막계 세포 이외의 세포 및/또는 망막 색소 상피 세포를 포함하고,
    상기 신경 망막이, 상기 세포 응집체에 있어서의 제2 상피 조직으로부터 가장 떨어진 제1 상피 조직 상의 영역을 포함하는, 제조 방법.
  20. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 유효 성분으로서 함유하는, 의약 조성물.
  21. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 함유하여 이루어지는, 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환의 치료약.
  22. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 함유하여 이루어지는, 이식용 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 환자의 안저 또는 망막 아래에 이식하기 위한, 이식용 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 이식된 환자에 있어서, 이식된 복합체의 신경 망막이 해당 환자의 신경 망막층을 향하고, 이식된 복합체의 망막 색소 상피 세포 시트가 해당 환자의 망막 색소 상피층을 향한 상태로 생착하도록 이식되기 위한, 이식용 조성물.
  25. 이하의 공정을 포함하는, 망막 조직의 장애 또는 망막 조직의 손상에 기초하는 질환의 치료 방법:
    (1) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 환자의 안저 또는 망막 아래에 이식하는 공정,
    (2) 환자의 생체 내에 있어서, 이식된 복합체의 신경 망막이 해당 환자의 신경 망막층을 향하고, 이식된 복합체의 망막 색소 상피 세포 시트가 해당 환자의 망막 색소 상피층을 향한 상태로 생착되는 공정.
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