KR20210141546A - 안정한 박테리아 추출물 제조 공정 및 이의 약제로서의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 시간 경과에 따라 실질적으로 증가된 안정성을 가진 신규한 안정한 박테리아 추출물 제제, 신규한 이의 제조 방법, 이러한 신규한 안정화된 박테리아 추출물에 기초한 약학 제형, 및 감염 및/또는 염증 및/또는 신생물 및/또는 세균불균형으로부터 야기된 급성 및 만성 면역학적 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 신규한 투여 경로 및 전달 장치에 관한 것이다.

Description

안정한 박테리아 추출물 제조 공정 및 이의 약제로서의 용도
본 발명은 시간 경과에 따라 실질적으로 증가된 안정성을 가진 신규한 안정한 박테리아 추출물 제제, 신규한 이의 제조 방법, 이러한 신규한 안정화된 박테리아 추출물에 기초한 약학 제형, 및 감염 및/또는 염증으로부터 야기된 급성 및 만성 면역학적 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 신규한 투여 경로 및 전달 장치에 관한 것이다.
경구, 비강 내, 기관 내, 폐 내, 경점막, 국소, 협측 등과 같은 광범위한 투여 경로뿐만 아니라, 환자의 질환 상태 및 병기(급성 병기, 악화 등)에 쉽게 적응될 수 있는 감염 및 염증을 치료하기 위해 인간 대상체에 투여될 수 있는, 시간 경과에 따라 안정적인, 액체 또는 고체의 약학 제형 개발에 대한 관심이 계속 증가하고 있다.
박테리아 감염은 종종 여러 호흡기 질환과 관련이 있으며 항생제 치료가 일반적이다. 이러한 질병 상태 및 악화를 치료하는데 있어서 항생제의 효능이 논쟁이 되어 왔다. 이의 남용은 비용 증가와 미생물 항생제 내성 증가 가능성과 관련되어 있다.
박테리아의 여러 균주로부터 유래된 항원을 함유하는 박테리아 추출물 세포용해물(lysate) 제제는 이러한 유기체에 의한 감염에 대한 내성을 증가시키는 것으로 나타났다. 이러한 박테리아 추출물 세포용해물이 효과를 발휘할 수 있는 방식은 여러 가지일 수 있으며 아직 완전히 이해되지 않았다. 수 많은 박테리아 추출물이 면역 자극제 및 항-종양제로 사용되어 왔다. 예를 들어, 우리는 바실러스 칼메트-게링(BCG: Bacillus Calmette-Guerin), 폴리사카라이드, 베타 1,3, 글루칸, 마루야마(Maruyama) 백신, 및 비피도박테리움(Bifidobacterium), L. 락티스(L. lactis), L. 퍼멘텀(L. fermentum), L. 애시도필러스(L. acidophilus) 및 S. 락티스(S. lactis)의 추출물을 언급할 수 있다. 이러한 추출물은 여러 방식으로 면역계를 자극하는 것으로 생각된다. 한 가지 중요한 방식은 림프구를 자극하여 사이토카인을 성장 및 생성하는 것이다. 이러한 사이토카인의 생산을 유도하는 능력은 면역계에서 매우 강력한 영향을 미친다.
특히, 몇몇 박테리아 추출물 제제가 상기도 장애의 치료 및/또는 예방을 위해 출원인에 의해 이미 성공적으로 개발되었다. 이와 관련하여, 우리는 특히 미국 특허 제9,463,209B2호에 기술된 바와 같이, 호흡기 감염을 자주 일으키는 여러 병원체 유래의 박테리아 세포용해물 추출물인 Broncho-Vaxom® 약물을 인용할 수 있다. Broncho-Vaxom®은 호흡기 감염, 재발성 호흡기 감염, 예컨대 급성 기관지염, 만성 기관지염, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 및 폐기종의 방지(prevention) 및 예방(prophylaxis)을 위해 경장 경구 경로를 통해 캡슐, 사쉐 또는 점적으로 투여되는 면역자극제이다. 이는 배양된 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 TNF-α 및 인터페론-γ 생산을 향상시키고, 폐포 대식세포의 활성화를 유도하고, 다형핵(polymorphonuclear) 백혈구에 의한 박테리아 사멸을 자극하는 것으로 나타났다. 본 출원인은 또한 락토바실러스 박테리아 추출물을 개발하였고 이러한 박테리아 세포용해물 추출물이 감염, 알러지, 자가면역 장애 및 염증을 치료하기 위한 경장 경구 경로를 통해 캡슐로 투여될 때 효율적임을 보여주었다(국제공개 WO2010/027344호 참조).
흡입된 바이러스, 박테리아 및 독소에 대한 기도와 폐와 같은 점막 표면의 지속적인 노출은 면역계에 대한 도전을 제시한다. 숙주가 바이러스 감염에 노출되고 이어서 미생물에 의해 중복감염되면 상황이 더욱 악화되어 사망률의 증가로 이어진다. 따라서, 인플루엔자(H1N1 등), 인간 리노바이러스(HRV), 호흡기세포융합 바이러스(rhinosyncitial virus, RV), 코로나바이러스(CoV, SARS-CoV, MERS-Cov, COVID-19 등)에 의한 감염에 따른 박테리아 2차 감염은 호흡기 의학이 직면한 긴급한 문제이다.
실험적으로, 수 많은 생체 내 연구는 경장 경구(enteral oral) 경로에 의해 투여된 박테리아 추출물 Broncho-Vaxom®이 호흡기 감염 모델에서 보호를 제공한다는 것을 입증하였다. 대부분의 연구에서 액체 박테리아 추출물뿐만 아니라 고체 약제 형태(동결건조물)를 사용하였지만, 안정성이 제한적이었다. 인간 투여량(7 mg 건조 중량 박테리아 추출물, 40 mg의 동결건조물)을 사용하는 생체 내 마우스 모델의 이러한 예는 인플루엔자 감염 후 2차 박테리아 및/또는 바이러스 감염으로부터 보호를 강화할 수 있음을 보여주었다(문헌[Pasquali et al, Frontiers in Medicine 2014, 1, 41]).
지방, 당 및 단백질이 풍부한 "정크 푸드"에서 유래하고 미생물총(microbiota)의 조절장애를 초래하는 추가 기능적 세균불균형(dysbiosis)(문헌[Clarence M. et al., Abstract, March 30 9, 2018 - St-John University, Queens])은 관련 후유증 및 동반 질환의 감소와 함께 마우스에서 Broncho-Vaxom®을 보충함으로써 정상화되었다.
따라서, 몇 년 동안, Broncho-Vaxom®은 면역 방어를 자극하고 통상의 호흡기 장애 및 관련 악화를 예방하기 위해 고체 형태(캡슐 또는 사쉐)의 경장 경로를 통해 투여되어 왔다. 경구 투여용으로 설계되고 조작된 이러한 박테리아 세포용해물 추출물의 보호 효과는 장(장-관련 림프 조직, GALT(gut-associated lymphoid tissue))에서 면역 반응을 개시한다. 이러한 장기는 기도로부터 폐 감염을 예방하고 치료하기 위해 무장한 폐에 면역 세포를 감지하고 보낸다. 따라서, 박테리아 세포용해물이 폐에 직접 노출되지 않는다. 반대로, 경장 경구 경로로부터 "경구 주변(perioral)" 투여 경로, 예컨대 비강 내, 비강, 흡입, 분무화(nebulization) 및 기관 내 경로로 이동함으로써, 안정화된 박테리아 세포용해물의 항-감염 효과가 감염이 발생하는 폐 세포 또는 비강 및 주변 점막에 직접 발생하는 것으로 추정된다. 점막 조직에 도달하는데 유리한 다른 "경구 주변" 경로는 감염이 자주 시작하는 설하 및 협측이다.
본 발명에 따르면, 신규한 박테리아 세포용해물 추출물 제형이 이러한 대안적인 경구 주변 투여 경로에 대해 개발되었고 따라서 가능한 감염 및 염증의 보다 넓은 경로에 더 적합하도록 개발되었다. 유해한 항원과 무해한 항원을 구별하는 점막의 능력은 병원체를 방어하고 신체의 고유한 염증 반응으로 인한 손상으로부터 보호하는데 중요하다.
그러나 이러한 박테리아 세포용해물 추출물은 지금까지 통상적으로 경장 경구 경로를 통해 고체 형태인 캡슐 또는 사쉐로 투여되어 왔다. 대안적인 투여 경로 및/또는 대안적인 약학 제형으로 이동할 때의 주요 기술적 어려움 중 하나는 이러한 박테리아 추출물이 특히 침강의 출현과 함께, 약간의 물리적 불안정성을 나타낸다는 것이다. 이러한 박테리아 추출물의 이러한 물리적 불안정성은 제조 공정, 제조 및 저장 동안 실질적인 문제이며, 따라서 대안적인 약학 제형 및/또는 대안적인 투여 경로 예컨대 비강 내, 폐, 기관 내, 점막, 경점막, 국소, 외부 피부 국소, 협측, 설하, 경구, 폐, 기관지 내, 또는 폐 내의 개발을 제한하는 요소이다. 규제 승인에 상당한 영향을 미치므로, 이러한 대안적인 경로 및 약학 형태에 적합한 안정적인 제형은 성공적인 치료용 박테리아 세포용해물-기반 의약품에 필수적이다.
따라서, 한편으로는 제조 공정 솔루션을 개선하고, 다른 한편으로는 더 넓은 투여 경로 및 대안적인 약학 형태를 가능하게 하기 위해, 이러한 박테리아 추출물의 응집 및 침전의 임의의 문제를 해결하고 개선된 안정화된 가용성 박테리아 추출물을 제공하는 것이 중요하였다.
중요하게도, 상기 신규한 안정한 박테리아 추출물 제형이 이제 경구 주변 또는 경구 투여에 적합한 특정 전달 장치를 사용하여 보다 정확한 투여량으로 투여될 수 있으며, 특히 사용자 친화적인 전달 장치, 예컨대 에어로졸, 비강 분무, 네뷸라이저, 펜을 사용하여 치료 순응도 및 환자의 편의를 증가시킬 수 있다. 또 다른 실질적인 이점은 상기 신규한 안정한 박테리아 추출물이 특히 3개월 내지 6세 사이의 영아, 유아뿐만 아니라 성인, 예컨대, 삼키는데 어려움이 있는 일부 노인과 같이 정제 또는 캡슐을 삼킬 수 없는 환자에게 경구 경로를 통해 액체 형태로 더 쉽게 투여할 수 있다는 것이다. 상기 박테리아 추출물의 대안적인 제형 예컨대 에멀젼, 마이크로에멀젼, 분산액, 크림 등은 투여 경로의 국소 또는 외부 피부 국소 유형에 대해 구상될 수 있다.
마지막으로, 상기 신규한 안정한 박테리아 추출물은 실온뿐만 아니라 저온에서도 침전되지 않는다. 따라서 상기 박테리아 추출물 약제는 환자 또는 약국에 의해 정상적인 조건에서 그대로 유지 및 보관될 수 있고, 약물 전달 장치가 막힐 위험이 전혀 없으므로, 박테리아 추출물의 정밀하고 정확한 투여량을 투여할 수 있다. 이러한 안정한 박테리아 추출물은 또한 제조 공정 동안 또는 최종 의약품의 제형화 동안 중간 의약품을 저장하기 위한 제약 산업에 주요한 이점을 제공한다.
따라서 본 발명은 개선된 안정성 특성을 갖고 따라서 다양한 약학 제형 및 투여 경로에 적합한 그람-양성 및/또는 그람-음성 박테리아 종으로부터 제조된 박테리아 추출물 제형에 관한 것이다. 특히, 상기 신규한 안정화된 박테리아 추출물 약학 조성물은 비강, 비강 내, 기관 내, 점막, 경점막, 국소, 협측, 설하, 경구, 폐, 기관지 내, 및/또는 폐 내 투여에 대해 제형화될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 신규한 안정화된 박테리아 추출물을 전달하기 위한 적합한 투여 형태 및 전달 시스템에 관한 것이다.
본 발명은 또한 감염 및/또는 염증 및/또는 신생물 및/또는 세균불균형으로 인한 급성 및 만성 면역학적 장애를 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.
본 발명은 마지막으로 환자에게 투여하기 전 최종 의약품으로서, 또는 의약품의 제조 및/또는 제형화 동안 액체, 반-고체 또는 에어로졸 형태의 안정한 박테리아 추출물을 제조하는 신규한 공정에 관한 것이다.
도 1은 알칼리성 세포용해 후 박테리아 추출물의 제조를 위한 접선 유동 여과(TFF: tangential flow filtration) 시스템의 다이어그램이다. 상기 다이어그램은 필터에 대한 두 가지 상이한 구성을 나타낸다: 모든 필터가 동시에 작동하는 병렬 모드와 필터가 직렬 모드로 구성된 구불구불한(serpentine) 모드.
도 2는 알칼리성 세포용해 후 박테리아 추출물의 정제에 사용되는 접선 유동 여과(TFF)의 다이어그램이다. 상기 다이어그램은 조 박테리아 추출물, 정제된 분획, 정용여과 배지, 순수한 유기산 또는 농축된 유기산 용액, 2개의 펌프, 마이크로필터 홀더, 나노필터/한외필터 홀더, 밸브, 막전위 압력 조절기(TMP: transmembrane pressure regulator), 프로펠러, pH 전극 및 폐기물에 대한 연결에 대한 상이한 용기를 나타낸다. 일련의 필터는 모든 필터가 동시에 작동하는 병렬 모드로 연결될 수 있거나 필터가 직렬로 구성된 구불구불한 모드가 사용될 수 있다.
도 3은 중복감염 실험의 연구 설계를 나타낸다: 바이러스성 폐 감염 후 박테리아성 폐 감염. 경구 경로(군 2) 대비 비강 내 경로(군 3 및 4) 및 식염수 비강 내(군 1)에 의한 OM 박테리아 추출물 투여의 투여 스케줄이 표시된다.
도 4는 중복감염 후 수득된 결과를 나타내며 비강 내 OM 박테리아 추출물 처리(i.n. 투여량 A=50 마이크로그램 및 투여량 B = 5 마이크로그램)가 경구(p.o. 7 밀리그램) OM 박테리아 추출물 및 식염수 대조군 처리된 동물에 비해 생존율이 유의하게 증가하였음을 나타낸다.
도 5는 중복감염 후 수득된 결과를 나타내며 예방적 비강 내 OM 박테리아 추출물 처리가 인플루엔자 박테리아 감염 후 이환율 및 사망률을 유의하게 완화함을 나타내며 본원에 식염수 대조군과 비교하여 경구(p.o.) 7 밀리그램 OM 박테리아 추출물 투여 대 비강 내(i.n.) 5 및 50 마이크로그램 OM 박테리아 추출물 둘 모두의 투여 후 임상 점수 측정과 함께 요약되어 있다.
도 6은 비강 내 경로를 통해 50 마이크로그램 OM 박테리아 추출물로 처리한 것에 비해(건강한 동물을 나타냄) 경구 경로를 통해 7 밀리그램 OM 박테리아 추출물로 처리된 마우스(본원에서 일시적인 거친 모발 코트로 예시됨)에서 관찰된 박테리아 감염 1일 후(도3의 개략도에서 8일째) 동반이환 징후의 차이를 나타내는 사진이다.
도 7은 중복감염 실험의 연구 설계를 나타낸다: 바이러스성 폐 감염 후 박테리아성 폐 감염. 비강 내(per nasal) 경로 대 기관 내(i.t.) 경로 대 식염수 대조군에 의한 OM 박테리아 추출물 투여의 투여 요법이 도면에 도시되어 있다.
도 8은 투여량 A(50 마이크로그램) 및 B(5 마이크로그램)의 OM 박테리아 추출물의 비강 내(i.n.) 및 기관 내(i.t.) 투여 대 비강 내(i.n.) 및 기관 내(i.t.) 식염수 대조군의 5일 후의 폐 조직의 바이러스 역가를 나타내는 그래프이다.
도 9는 50 마이크로그램(투여량 A.I.N) 및 5 마이크로그램(투여량 B.I.N) 또는 식염수(I.N.)를 가진 OM 박테리아 추출물로 비강 내 경로로 처리된 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 10은 비강 내 예방적 OM 박테리아 추출물 처리가 인플루엔자 박테리아 감염 후 이환율 및 사망률을 유의하게 완화함을 나타내는 그래프이며 본원에 식염수 대조군에 대한 비강 내 5 마이크로그램(투여량 A) 및 50 마이크로그램(투여량 B) 둘 모두의 투여 후 임상 점수 측정과 함께 요약되어 있다. 임상 효능은 투여량에 비례하였다.
도 11은 기관 내 경로를 따라 OM 박테리아 추출물 또는 식염수를 투여한 후 마우스의 생존을 나타내는 그래프이다. 50 마이크로그램(투여량 A I.T) 및 5 마이크로그램(투여량 B I.T) OM 박테리아 추출물.
도 12는 예방적 기관 내 OM 박테리아 추출물 처리가 이환율 및 사망률을 유의하게 완화함을 나타내는 그래프이며 본원에 50 마이크로그램(투여량 A.I.T) 및 5 마이크로그램(투여량 B.I.T) 투여량의 투여 후 임상 점수 측정과 함께 요약되어 있다.
도 13은 중복감염 실험의 연구 설계를 나타낸다: 대조군과 비교하여 OM 박테리아 추출물의 비강 내(per nasal) 및 경구 투여 후 다양한 투여량 및 요법을 사용하여 바이러스성 폐 감염에 이어 박테리아성 폐 감염에 이어 폐의 인플루엔자 바이러스 로딩 분석. 1군 내지 11군이 표 6에 기술되어 있다.
도 14는 OM 박테리아 추출물을 사용한 예방적 비강 내 처리 후 경구 처리와 비교한 감염 후 5일째에 폐 조직의 바이러스 역가를 나타내는 그래프이다.
도 15는 다양한 OM314A 안정한 박테리아 추출물로 예비-처리된 건강한 공여자 폐 생검에서 유래한 인간 1차 기관지 상피 세포(BEC: bronchial epithelial cell)에서 인간 리노바이러스(RV16) 감염률. (a) 유기산 또는 HCl을 함유하는 OM314A로 BEC 세포의 예비-처리를 1 MOI(Multiplicity Of Infection)의 RV-16으로 감염 1일 전에 수행하였다. RV-16의 mRNA 발현을 바이러스 복제의 지표로 사용하고 RV16(100%)에 대한 상대 값(퍼센트, 도 15a)으로 표현하였다. 대조군 1(0%)은 감염되지 않은 세포를 나타낸다. RV16-1은 RV16으로 24시간 동안 감염된 BEC 세포를 나타낸다. 막대는 평균 ± S.D를 나타낸다. 시험한 샘플: 대조군 1, RV16; OM314A 샘플: HCL; 10 HCL 중심; 부티르산; 부티르산 중심; 프로피온산; 프로피온산 중심; 아스파르트산; 아스파르트산 중심은 원심분리되지 않은 카운터 쌍과 비교된 원심분리 후 수득한 샘플 쌍의 상청액을 나타낸다. (b) 3가지 상이한 바이러스 농도를 사용하여 감염 후 24시간의 RV16 단백질 양성 인간 1차 BEC(n=3). (c) 0.1 MOI로 감염 후 24시간에 BEC(n=3)에서 다양한 OM314A 제제(20 μL/mL) 를 사용한 사전-배양(24 시간)의 효과. 막대는 평균 ± S.E.M을 나타낸다.
도 16은 인간 BEC로부터 인터페론 방출을 모니터링하는데 사용되는 프로토콜을 기술하는 실험 계획. 세포를 일-2(Day-2)일차에 씨딩하고, 일-1(Day-1)일차에 혈청을 제거하고 도 17 및 18에 나타낸바와 같이 OM314A 샘플(OM)로 24시간 동안 자극하였다. ELISA를 사용하여 인터페론 베타 및 감마의 투여량에 대해 표시된 시간에 세포 상청액을 수집하였다.
도 17: (a) HCL(0.1 내지 최대 50 마이크로그램/ml)로 중화된 OM 박테리아 추출물과 함께 인큐베이션 24시간 후 인간 BEC에 의한 유형 1 인터페론 베타(IFN-베타) 분비의 용량 반응. 막대는 n=5 공여자의 평균 ± S.D를 나타낸다. * = p < 24시간 대비 0.01. (b) RV16 감염 후 24시간에 걸쳐 인간 BEC(n=3)에 의한 IFNβ 분비. (c) 감염되지 않은(n=3) 인간 BEC에 의한 IFNβ 분비에 대한 다양한 OM314A(P1, P2, P3), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5) 제제의 농도-의존적 영향. 막대는 각 조건의 평균 ± S.E.M을 나타낸다.
도 18: (a) HCL(0.1 내지 최대 50 마이크로그램/ml)로 중화된 OM 박테리아 추출물과 함께 인큐베이션 24시간 후 인간 폐-유래 1차 상피 세포(BEC)에 의한 유형 2 인터페론 감마(IFN-감마) 분비의 용량 반응. 막대는 n=5 공여자의 평균 ± S.D를 나타낸다. * = p < 24시간 대조군 대비 0.01. (b) RV16 감염 후 24시간에 걸쳐 인간 BEC(n=3)에 의한 IFNγ 분비. (c) 감염되지 않은 인간 BEC에 의한 IFNγ 분비에 대한 다양한 OM314A(P1, P2, P3), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5) 제제의 농도-의존적 영향. 막대는 각 조건의 평균 ± S.E.M을 나타낸다.
도 19: 인간 폐-유래 1차 상피 세포(BEC)에 의한 항-바이러스 베타 β-디펜신-1 발현을 나타낸다. a) RV16 감염 후 24시간에 걸쳐 인간 BEC(n=3)에 의한 β-디펜신-1 분비에 대한 감염(3개의 상이한 농도)의 영향을 나타낸다. (b) 감염되지 않은 BEC(n=3)에 의한 β-디펜신-1의 분비에 대한 OM314A(P1, P2, P3), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5) 안정한 박테리아 추출물의 농도-의존적 영향을 나타낸다. 막대는 각 조건의 삼중복의 평균±S.E.M을 나타낸다.
도 20: ICAM-1 바이러스 수용체 발현. (a) RV16 감염 후 24시간에 걸쳐 인간 폐-유래 1차 상피 세포(n=3)에 의한 ICAM-1 수용체 발현을 나타낸다. (b) 감염된 1차 상피 세포(n=3)에 의한 ICAM-1의 발현에 대한 OM314A(P1, P2, P3), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5) 안정한 박테리아 추출물의 농도-의존적 영향을 나타낸다. 막대는 각 조건의 삼중복의 평균±S.E.M을 나타낸다.
도 21: 쥐(murine) 야생형(WT, 흑색 막대) 또는 TLR-4 녹-아웃-(TLR4-/-, 백색 막대) 유래 마우스 골수 유래 수지상 세포(BMDC)로부터의 톨-유사 수용체(TLR)-4-의존적 TNFα 방출을 나타낸다. 세포를 OM314A 안정한 박테리아 추출물(P1, P2, P3), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5)의 희석을 증가시키거나 동일한 희석 세트를 사용하는 대조군에 대해 LPS(2 μg/mL) 또는 산업용 배치(I.B #1619057)로 자극하였다. TNFα의 농도 수준을 유도 16시간 후 제조업체의 프로토콜에 따라 ELISA로 상청액에서 측정하였다.
도 22: 식염수 용액을 공급한 정상 식이 마우스 대조군, 정상 사료 식이 요법(NCD: normal chow diet(NCD-Sham)), 21개의 균주 세포용해물 유래의 박테리아 추출물로 처리한 정상 식이 마우스(NCD-BE), 식염수 용액을 공급한 고지방 식이 마우스 대조군(HFD-Sham) 및 21개의 균주 세포용해물 유래의 박테리아 추출물로 처리한 고지방 식이 마우스(HFD-BE)에서의 선형 판별 분석(LDA: linear Discriminant analysis) 점수를 나타낸다.
도 23: (a) 21개의 균주 세포용해물 유래의 박테리아 추출물 식이 전(Pre-diet), (b) 정상 사료 식이 요법 후 마우스(Post-NCD), (c) 고지방 식이 후(Post-HFD) 글루코스 농도의 그래프를 나타냄. 체중 증가를 위해, 마우스의 체중을 주 1회 칭량하였다. 음식 소비 측정은 주의 시작과 끝에 펠릿의 중량을 측정하여 주 1회 평가하였다. 큰 검은색 및 작은 별표의 유의한 표시(significance mark)는 그래프에 표시된 바와 같이 HFD-L. 플란타럼과 비교한 HFD-Sham과 HFD-BE와 비교한 HFD-Sham이며, 각각 유의한 값을 가졌다.
도 24는 체중 및 음식 소비를 나타낸다. (a) 식염수 용액을 공급한 고지방 식이 sham 대조군(HFD-Sham), 21개의 균주 세포용해물 유래의 박테리아 추출물로 처리돤 고지방 식이(HFD-BE) 및 L. 플란타럼(NCD-L plant)으로 처리한 고지방 식이의 체중을 나타내며 그램으로 표시된다. (b) 식염수 용액을 공급한 고지방 식이 sham 대조군(HFD-Sham)과 21개의 균주 세포용해물 유래의 박테리아 추출물로 처리한 고지방 식이(HFD-BE) 사이의 음식 소비 비교를 나타내며 그램으로 표시된다. 체중 증가를 위해, 마우스의 체중을 주 1회 칭량하였다. 음식 소비 측정은 주의 시작과 끝에 펠릿의 중량을 측정하여 주 1회 평가하였다. 원형 별표의 유의한 표시는 HFD-BE과 비교한 HFD-Sham이고, 정상 별표 유의한 * 표시는 그래프에 표시된 바와 같이 HFD-L. 플란타럼과 비교한 HFD-Sham이며, 각각 유의한 값을 갖는다.
도 25는 식염수 용액(HFD-Sham), 21개의 균주 세포용해물 유래의 박테리아 추출물(HFD-BE) 또는 L. 플란타럼(NCD-L plant)을 공급한 고지방 식이(HFD) 마우스에서 처리 전(PRE-DIET) 및 8주 처리 기간 끝(POST-DIET)에 42마리의 모든 마우스에서의 인슐린 내성 시험의 결과를 나타낸다. 일반적인 흑색 별표의 유의한 표시는 그래프에 표시된 바와 같이 HFD-BE와 비교한 HFD-Sham이다(p<0.0001).
도 26은 다양한 장내 종에 대한 21개의 박테리아 세포용해물 유래의 박테리아 추출물의 영향을 나타낸다. 16S 리보솜 RNA 서열분석 및 분석을 실시예 10에 기술된 바와 같이 수행하였다. a. 클로스트리디알레스 라흐노스피라세아 블라우티아(Clostridiales Lachnospiraceae blautia); b. 클로스트리디아 클로스트리디알레스 루미노코카세아(Clostridia Clostridiales ruminococcaceae) GCA-900066225; c. 클로스트리디알레스 루미노코카세아 루미노코카세아(Clsotridiales Ruminococcaceae ruminococcaceae) UCG-0101; d. 박테로이달레스 뮤리배큘라세아 비배양된 박테리움(Bacteroidales Muribaculaceae uncultured bacterium); e. 라흐노스피라세애(Lachnospiraceaeae)[유박테륨] 피시칸테나(fissicantena)군; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001
도 27은 용액 중 침전(불안정한 박테리아 추출물의 전형적인 예시로서 주어짐)을 나타내는 노이즈 스펙트럼을 나타낸다.
도 28은 맑은 용액(안정한 박테리아 추출물의 전형적인 예시로서 주어짐)을 나타내는 부드러운 스펙트럼을 나타낸다.
도 29: 공정 1 - 공정 1 - E3 - 중화된 여과액(OM314A)이 실온(20℃ +/- 5℃) 또는 4℃에서 적어도 4개월 동안 THP-1에 대한 MIP-3α 분비를 통해 유사한 생물활성을 나타냄을 보여주는 안정성 동안 생물분석 결과. 공정 1 T0을 4개월 동안 4℃ 및 실온(RT)에서 저장된 T4 샘플과 비교하였다.
도 30: 공정 2 - 공정 2 - E3 - 중화된 여과액(OM314A)이 실온(20℃ +/- 5℃) 또는 4℃에서 적어도 4개월 동안 THP-1에 대한 MIP-3α 분비를 통해 유사한 생물활성을 나타냄을 보여주는 안정성 동안 생물분석 결과. 공정 2 T0을 4개월 동안 4℃ 및 실온(RT)에서 저장된 T4 샘플과 비교하였다.
도 31: 공정 3 - 공정 3 - E3 - 중화된 여과액(OM314A)이 실온(20℃ +/- 5℃) 또는 4℃에서 적어도 5개월 동안 THP-1에 대한 MIP-3α 분비를 통해 유사한 생물활성을 나타냄을 보여주는 안정성 동안 생물분석 결과. 공정 3 T0을 5개월 동안 4℃ 및 실온(RT)에서 저장된 T5 샘플과 비교하였다.
도 32: 공정 5 - 공정 5 - E3 - 중화된 여과액(OM314A)이 실온(20℃ +/- 5℃) 또는 4℃에서 적어도 5개월 동안 THP-1에 대한 MIP-3α 분비를 통해 유사한 생물활성을 나타냄을 보여주는 안정성 동안 생물분석 결과. 공정 5 T0을 4개월 동안 4℃ 및 실온(RT)에서 저장된 T5 샘플과 비교하였다.
따라서 본 발명은 그람-양성 및/또는 그람-음성 박테리아 종의 알칼리성 세포용해 및 아세트산, 프로피온산, 락트산, 3-히드록시프로판산, 피루브산, 부타논산, 2-히드록시부타논산, 3-히드록시부타논산, 글루탐산, 아스파르트산, 이들의 조합, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 에스터 중에서 선택되는 하나 이상의 특정 유기산으로 중화하고, 상기 중화된 박테리아 추출물을 여과 정제하고, 상기 중화를 위해 사용된 유기산, 이들의 조합 또는 염 및 에스터를 첨가하여 최종 생리학적 pH로 조정함으로써 수득 가능한 안정한 정제된 박테리아 추출물에 관한 것이다.
본 출원인은 특정 유기산의 선택과 함께 세포용해물의 pH가 10 초과(±0.1의 pH 변화 포함)인 알칼리성 세포용해 후, 박테리아 추출물을 접촉시키면 놀랍게도 우수한 안정성 특성을 나타내는 박테리아 추출물을 유도함을 발견하였다. 보다 정확하게는, 본 발명에 따른 박테리아 추출물 제형은 액체 형태 하에 수 개월 동안 물리적 안정성을 유지하였다. 이어서 개선된 물리적 안정성을 가진 이러한 신규한 박테리아 추출물 제형은 환자에게 투여하기 위한 최종 약제로서 또는 약제학적 약물 제품의 제조 또는 제형화 동안 액체, 반-고체 또는 에어로졸 형태 하에 안정적으로 저장될 수 있다.
"안정한" 제형은 약제의 저장 동안 액체 형태로 또는 제조 또는 제형화 동안 중간 약물 제품으로서 액체 형태로 이의 물리적 안정성을 본질적으로 유지하는 박테리아 추출물을 의미하도록 의도된다. 상기 박테리아 추출물 제형은 투명도의 육안 검사 시, 또는 광 산란, 크기 배제 크로마토그래피(SEC: size exclusion chromatography), 또는 동적 광 산란에 의해 측정될 시 응집 및/또는 침전의 유의한 증가를 나타내지 않는 경우 약학 제형에서 물리적 안정성을 유지한다. 4℃, -20℃, 또는 -80℃에서 적어도 3개월, 또는 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 12개월 동안 실온에서 유의한 침전 또는 물리적 변화가 관찰되지 않는다. 바람직하게는, 10% 이하, 바람직하게는 5%의 응집 및 침전이 형성된다.
용어 "유기산"은 약산성 특성을 특징으로 하고 물의 존재 하에 완전히 해리되지 않는 유기 화합물을 지칭한다.
용어 "투여 경로의 대안적인 경로"는 일반적으로 경구 주변 및 경구 경로를 지칭하며 특히 비강 내, 기관 내, 점막, 경점막, 국소, 외부 피부 국소, 협측, 경구, 설하, 폐, 기관지 내, 및/또는 폐 내 투여 경로를 포함할 수 있다.
용어 "OM314A 박테리아 추출물"은 모라셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 및/또는 스트렙토코커스 생귀니스(Streptococcus sanguinis)를 포함하는, 상기도의 가장 흔한 박테리아 병원체 중 하나 이상으로부터 알칼리성 세포용해에 의해 추출된 정제된 박테리아 추출물 또는 세포용해물을 포함하는 다가 면역조절제를 지칭한다. 바람직하게는, 상기 OM314A 박테리아 추출물은 상기 박테리아 병원체의 하나 이상의 조합의 알칼리성 세포용해에 의해 수득될 수 있으며, 가장 바람직하게는 이는 8개의 상기 언급된 병원체를 포함한다. 상기 OM314A 박테리아 추출물은 본 발명에 따른 안정한 제형으로 제조되었으며 여러 과학 간행물 및 국제 공개 WO2008/109669호에 이전에 기술된 박테리아 추출물의 2세대에 해당한다. 본원에서 이하 "OM 박테리아 추출물"이라 지칭되는 1세대 박테리아 추출물은 캡슐 및 정제와 같은 고형의 삼키는 제형으로 환자에게 경구로 투여되며, 성인 및 어린이의 호흡기 감염 예방에 효과적인 것으로 나타났다. 또한, 여러 임상 시험이 수행되었으며 이러한 1세대 OM 박테리아 추출물의 경장 투여가 경구(per oral) 투여 시 어린이의 급성 호흡기 질환에 의해 유발되는 알러지성 천식 및 천명 발작을 예방하는 것으로 나타났다. 상기 1세대의 OM 박테리아 추출물 약제는 Broncho-Vaxom®의 상표명으로, 고체 형태로, 일반적으로 캡슐 또는 사쉐로 상업화되었으며, 이는 성인 치료의 경우 7 mg의 동결건조된 박테리아 추출물을 1일 1 캡슐, 어린이의 경우 3.5 mg의 동결건조된 박테리아 추출물을 1일 1 캡슐의 경구 및 용량 요법으로 환자에게 투여된다.
따라서, OM314A 박테리아 추출물은 - 1세대의 OM 박테리아 추출물과 달리 - OM 박테리아 추출물을 포함하는 2세대 약물을 지칭하지만, 액체, 기체 또는 고체 형태의 임의의 가능한 약제 형태로 제형화될 수 있도록 안정화되었으며, 이는 비강 내, 기관 내, 점막, 경점막, 국소, 협측, 경구, 설하, 폐, 기관지 내, 및/또는 폐 내를 포함하여 보다 넓은 가능한 투여 경로에 적합하다.
용어 "OM314B 박테리아 추출물"은 국제 공개 WO2010/027344호에 기술된 바와 같은 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 균주로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 종의 알칼리성 세포용해에 의해 수득 가능한 다가 백신을 지칭한다. 특히, 상기 안정한 박테리아 추출물은락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 카제이 디펜시스(Lactobacillus casei defensis), 락토바실러스 카제이 속 카제이(Lactobacillus casei ssp. casei), 15 락토바실러스 파라카제이(Lactobacil/us paracasei), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 및/또는 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii)로부터 선택된 하나 이상의 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 균주를 포함할 수 있다. 상기 OM314B 박테리아 추출물은 본 발명에 따른 안정한 제형으로 제조되었으며 국제 공개 WO2010/027344호에 이전에 기술된 2세대 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 추출물에 해당한다. 상기 OM314B 박테리아 추출물은 비강 내, 기관 내, 점막, 경점막, 국소, 협측, 경구, 설하, 폐, 기관지 내, 및/또는 폐 내 경로를 포함하여 다양한 가능한 투여 경로에 적합한, 액체, 기체 또는 고체 형태의 임의의 가능한 약제 형태로 제형화될 수 있도록 안정화되었다.
따라서, 상기 용어 "OM314C 박테리아 추출물"은 국제 공개 WO2008/109667호에 기술된 바와 같이 하나 이상의 대장균(Escherichia coli) 박테리아 균주의 알칼리성 세포용해에 의해 수득 가능한 안정한 박테리아 추출물을 지칭한다. 상기 OM314C 박테리아 추출물은 본 발명에 따른 안정한 제형으로 제조되었으며 국제 공개 WO2008/109667호에 이전에 기술된 2세대 대장균(Escherichia coli) 박테리아 추출물에 해당한다. 상기 2세대 OM314C 박테리아 추출물은 액체, 기체 또는 고체 형태의 임의의 가능한 약제 형태로 제형화될 수 있도록 안정화되었으므로, 비강 내, 기관 내, 점막, 경점막, 외부 피부 국소, 협측, 경구, 설하, 폐, 기관지 내, 및/또는 폐 내를 포함하여 다양한 투여 경로에 적합하다.
용어 "안정한 박테리아 추출물 제형"은 국제 공개 WO2008/109669호, WO2010/027344호, 또는 WO2008/109667호에 기술된 바와 같이 알칼리성 세포용해 추출로 수득 가능한 임의의 박테리아 추출물 약물의 안정화된 형태이지만, 전술된 바와 같이 비강 내, 기관 내, 점막, 경점막, 국소, 협측, 경구, 설하, 폐, 기관지 내, 및/또는 폐 내를 포함하여 대안적인 경로에 적합한 약제 형태로 변형된(adapted) 것을 지칭한다.
따라서, 본 발명에 따른 안정한 정제된 박테리아 추출물은 안정화됨에 따라 전술된 바와 같이 비강 내, 기관 내, 점막, 경점막, 국소, 협측, 경구, 설하, 폐, 기관지 내, 및/또는 폐 내를 포함하여 광범위한 투여 경로에 대해 임의의 약제 형태로 제형화될 수 있는 치료적 면역조절 특성을 가진 그람 양성 및/또는 그람 음성 박테리아 종의 임의의 조합의 박테리아 알칼리성 세포용해물을 포함할 수 있다.
제1 실시형태에 따르면, 신규한 안정한 박테리아 추출물 제형은 본 출원인의 국제 공개 WO2008/109669호에 기술된 바와 같은, 모라셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 및/또는 스트렙토코커스 생귀니스(Streptococcus sanguinis)로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 종의 박테리아 세포용해물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 실시형태에 따른 상기 신규한 안정한 박테리아 추출물 제형은 본원에서 이하 안정한 OM314A 박테리아 추출물 제형으로 지정되며 다음의 박테리아 종 모라셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 및 스트렙토코커스 생귀니스(Streptococcus sanguinis)의 알칼리성 세포용해에 의해 수득 가능하다.
이러한 실시형태에 따르면, 따라서 모라셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 및/또는 스트렙토코커스 생귀니스(Streptococcus sanguinis)로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 종으로부터 유도된 안정한 정제된 박테리아 추출물이 제공되며, 여기서 상기 박테리아 추출물은 박테리아 균주의 알칼리성 세포용해 및 아세트산, 프로피온산, 락트산, 3-히드록시프로판산, 피루브산, 부타논산, 2-히드록시부타논산, 3-히드록시부타논산, 글루탐산, 아스파르트산, 이들의 조합, 및/또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 에스터 중에서 선택된 하나 이상의 유기산으로 중화 후, 상기 중화된 추출물의 여과 정제, 및 상기 중화를 위해 사용된 동일한 유기산 또는 이들의 동일한 조합을 첨가하여 최종 생리학적 pH를 조정함으로써 수득 가능하다.
제2 실시형태에 따르면, 상기 안정한 박테리아 추출물 제형은 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 균주로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 종으로부터 제조된다. 특히, 상기 안정한 박테리아 추출물은 본 출원인의 국제 공개 WO2010/027344호에 기술된 바와 같은, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 카제이 디펜시스(Lactobacillus casei defensis), 락토바실러스 카제이 속 카제이(Lactobacillus casei ssp. casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacil/us paracasei), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 및/또는 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii)로부터 선택된 하나 이상의 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 균주를 포함할 수 있다.
따라서, 이러한 제2 실시형태에 따르면, 하나 이상의 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 균주로부터 유도된 안정한 정제된 박테리아 추출물이 제공되며, 여기서 상기 박테리아 추출물은 박테리아 균주의 알칼리성 세포용해 및 아세트산, 프로피온산, 락트산, 3-히드록시프로판산, 피루브산, 부타논산, 2-히드록시부타논산, 3-히드록시부타논산, 글루탐산, 아스파르트산, 이들의 조합, 및/또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 에스터 중에서 선택된 하나 이상의 유기산으로 중화 후, 상기 중화된 추출물의 여과 정제, 및 상기 중화를 위해 사용된 동일한 유기산 또는 이들의 동일한 조합을 첨가하여 최종 생리학적 pH를 조정함으로써 수득 가능하다.
제3 실시형태에서, 상기 안정한 박테리아 추출물은 하나 이상의 대장균(Escherichia coli) 박테리아 균주로부터 유도되며, 여기서 상기 박테리아 추출물은 박테리아 균주의 알칼리성 세포용해 및 아세트산, 프로피온산, 락트산, 3-히드록시프로판산, 피루브산, 부타논산, 2-히드록시부타논산, 3-히드록시부타논산, 글루탐산, 아스파르트산, 이들의 조합, 및/또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 에스터 중에서 선택된 하나 이상의 유기산으로 중화하고, 상기 중화된 추출물의 여과 정제하고, 상기 중화를 위해 사용된 동일한 유기산 또는 이들의 동일한 조합을 첨가하여 최종 생리학적 pH를 조정함으로써 수득 가능하다. 특히, 대장균(Escherichia coli) 박테리아 추출물은 본 출원인의 국제 공개 WO2008/109667호에 기술된 바와 같은 하나 이상의 대장균(Escherichia coli) 박테리아 균주를 포함할 수 있다.
이러한 제3 실시형태에 따르면, 따라서 하나 이상의 대장균(Escherichia coli) 박테리아 균주 유래의 안정한 정제된 박테리아 추출물이 제공되며, 여기서 상기 박테리아 추출물은 알칼리성 세포용해 및 아세트산, 프로피온산, 락트산, 3-히드록시프로판산, 피루브산, 부타논산, 2-히드록시부타논산, 3-히드록시부타논산, 글루탐산, 아스파르트산, 이들의 조합, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 에스터 중에서 선택된 하나 이상의 유기산으로 중화 후, 상기 중화된 추출물의 여과 정제하고 상기 중화를 위해 사용된 동일한 유기산 또는 이들의 동일한 조합을 첨가하여 최종 생리학적 pH를 조정함으로써 수득 가능하다.
상기 실시형태에서, 상기 박테리아 추출물은 상기 박테리아 종 각각으로부터의 적어도 하나의 균주를 포함하는 한편, 다른 실시형태에서, 상기 목록으로부터의 하나 이상의 특정 균주는 제거될 수 있거나 하나 이상의 상이한 균주로 치환될 수 있다.
상기 표시된 바와 같이, 그람+ 및/또는 그람- 박테리아의 임의의 다른 조합이 본 발명에 따라 제조되고 제형화될 수 있고 또한 개선된 안정성 특성을 나타낼 것이기 때문에 안정한 박테리아 추출물 제형의 제조를 임의의 이러한 특정 실시형태로 제한하려는 것은 아니다.
전형적으로, 상기 박테리아 추출물은 발효 후 열 비활성화 및 알칼리성 세포용해 및 여과에 의해 제조된다. 발효, 알칼리성 세포용해 및 여과는 당업계에 잘 알려져 있으며 특히 국제 공개 WO2008/109667호, WO2010/027344호, 및 WO2008/109669호에 기술되어 있다.
발효과정은 일반적으로 각 박테리아 균주를 배양 배지에서 적절한 광학 밀도로 성장시킴으로써 수행된다. 각 균주의 경우, 충분량의 물질을 수득하기 위해, 상기 배양 배지는 워킹 씨드 로트에서 발효 배양을 시작한 다음 보다 큰 발효 컨테이너로 이식배양될 수 있다. 예컨대, 발효과정은 700 nm에서 3.0 내지 5.0의 광학 밀도(OD)를 수득하기 위해, 30 내지 40℃, 예컨대 37℃에서 약 3 내지 6시간 동안 인큐베이션된, 0.1 내지 1.0 리터와 같은 소형 배양으로 시작할 수 있다. 소규모 배양 단계 후, 하나 또는 일련의 보다 큰 발효기에서의 추가 배양이 3 내지 10시간, 또는 8시간과 같이, 3시간 내지 20시간의 지속기간 동안 30℃ 내지 40℃에서 수행될 수 있다.
상기 배양 배지는 바람직하게는 프리온-관련 질환(즉, 광우병, 스크래피, 및 크로이펠츠-야콥병) 또는 기타 질환의 위험을 초래하지 않으므로 소 또는 양과 같은 동물 또는 프리온-관련 질환을 옮길 수 있는 임의의 다른 동물로부터 취해진 혈청 또는 육류 추출물과 같은 동물-기반 물질을 포함하지 않는 배지이다. 예컨대, 비-동물성 배지, 예컨대 식물-기반 배지, 예컨대 대두-기반 배지, 또는 합성 또는 반-합성 배지가 사용될 수 있다. 대안적으로, 말 혈청을 사용하는 배지 또는 프리온 관련 질환을 옮기지 않는 동물 종으로부터 취해진 물질을 포함하는 배지가 사용될 수 있다. 상기 배양 배지는 또한 이러한 질환 위험을 일으키지 않는 생물학적 추출물 예컨대 효모 추출물 및 말 혈청을 또한 포함할 수 있다. 일부 박테리아 종의 성장을 향상시키기 위해 보충 성장 인자가 또한 도입될 수 있다.
발효 후, 각 박테리아 균주 유래 또는 조합된 박테리아 균주 유래의 바이오매스는 일반적으로 열처리, 농축, 및 동결에 의해 비활성화된다.
알칼리성 세포용해가 염기성 조건 하에 박테리아 세포를 세포용해 하기 위해 사용되며 일반적으로 유기 또는 무기 염기를 사용하여 수행된다. 알칼리성 세포용해는 전형적으로 NaOH으로부터 수산화 이온의 농축 용액을 사용하여, 염기성 조건 하에서, 단일 박테리아 바이오매스 상에서 또는 박테리아 바이오매스 또는 발효 배치의 혼합물 상에서 수행될 수 있다.
알칼리성 세포용해는 바람직하게는 ± 0.1의 pH 변화를 가진, 약 10 초과의 pH에서 수행될 수 있다. 상기 세포용해 지속기간은 당업자에 의해 평가될 수 있으며 초기 박테리아 바이오매스 양에 따라 달라진다. 세포용해는 30 내지 60℃, 예컨대 30 내지 -40℃, 또는 35 내지 40℃의 범위의 온도, 예컨대 37℃에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 세포용해는 당업자에게 잘 알려진 바와 같이 육안 관찰에 기초하여 박테리아 세포가 모두 파괴된 것으로 보일 때 중단된다. 동일한 박테리아 속의 하나 이상의 균주를 사용할 때, 상기 균주는 함께 세포용해되거나 별도로 세포용해될 수 있다. 상기 균주는 따라서 세포용해 전 또는 후에 혼합될 수 있다.
세포용해 동안, 박테리아 세포가 파괴되고, 이의 성분이 분해되고 화학적으로 변형된다. 특히, 아미노산의 라세미화는 자연 단백질에서 발견되는 자연 발생 L-아미노산으로부터 D-아미노산을 생성한다. D-아미노산은 주로 또는 부분적으로 D-아미노산으로 구성된 단백질이 포유류 장에서 효율적으로 소화되지 않기 때문에, 추출물의 생체이용률을 증가시키는데 도움이될 수 있다. 따라서, 세포용해 동안 D-아미노산을 함유하도록 화학적으로 변형된 추출물 중의 항원 분자가 환자의 몸에서 더 장기간 유지되어, 잠재적으로 보다 강력한 면역자극 작용이 가능하다.
세포용해 후에, 본 발명에 따르면, 상기 박테리아 세포용해물은 중화되었다, 즉, 상기 세포용해물의 pH는 하나 이상의 특정 유기산의 첨가에 의해 5 내지 8 사이, 6 내지 8 사이, 6.3 내지 7.8 사이, 또는 6.5 내지 7.8 사이의 최종 pH로 조정될 것이다. 상기 하나 이상의 특정 유기산은 아세트산, 프로피온산, 락트산, 3-히드록시프로판산, 피루브산, 부타논산, 2-히드록시부타논산, 3-히드록시부타논산, 글루탐산, 아스파르트산, 이들의 조합, 및/또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 에스터 중에서 본 발명에 따라 선택될 수 있다.
이어서, 상기 세포용해물은 원심분리 및/또는 여과에 의해 정제되어 큰 세포 파편 또는 불충분하게 분해되었거나, 임의의 불용성 또는 미립자 물질인 임의의 성분이 제거되어 가용성 박테리아 추출물이 수득된다. 원심분리 및 여과를 포함하는 정제가 추출물에서 미립자 물질을 제거하기 위해 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, 세포용해물은 9000 g에서 원심분리된 후 1회 이상의 여과가 수행될 수 있다. 전형적으로, 상기 여과는 여러 통과 또는 사이클로 반복될 수 있는 마이크로필터(즉, 정밀여과) 또는 한외필터(즉, 한외여과)와 같은 하나 이상의 필터를 통해 추출물 또는 추출물의 혼합물의 통과를 포함할 수 있다. 예컨대, 보다 큰 공극 필터 상에서 여과 횟수를 연속하여 수행한 후 0.2-마이크론 필터와 같은, 보다 작은 공극 필터를 사용하는 정밀여과가 수행될 수 있다. 한외여과가 또한 추출물로부터 가용성 물질의 추출을 돕기 위해 사용될 수 있으며, 예컨대, 추가 정밀여과를 위해 한외여과 투과물을 재순환시킬 수 있다.
접선 유동 여과(TFF) 방법을 사용하여 추출물을 여과하고 더 큰 세포 파편으로부터 가용화된 분자를 추출할 수 있다. 이는 당업계에 잘 알려져 있으며, 특히 문헌[Wayne P. Olson (Separations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Application, Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, IL, U.S.A., pp. 126-135)]에 기술되어 있다. 여과 루프 공정의 예가 아래 도 1에 도시되어 있다. 이러한 공정을 시작할 때, 희석된 박테리아 세포용해물이 제1 탱크에 저장될 수 있다. 정밀여과(MF) 루프가 시작될 수 있으며, 생성물이 펌핑된다. 생성된 MF 잔류물은 재순환되는 반면, MF 투과물은 제2 탱크로 옮겨질 수 있다. 적합한 정도의 농도에 도달한 후, 한외여과(UF) 루프가 시작될 수 있다. UF 투과물은 세포용해물로부터 가용화된 화합물의 연속 추출을 위해 제1 탱크로 다시 재순환될 수 있는 반면 UF 잔류물은 제2 탱크에 저장될 수 있다. 연속 추출 동안, 탱크 1 및 2의 부피는 정밀여과 및 한외여과 투과물의 유속을 조절하여 조정될 수 있다. TFF 또는 다른 여과 방법을 사용하여, 몇몇 이러한 추출 사이클이 수행될 수 있다. TFF를 사용하는 실시형태에서, 마지막 사이클 말기에, 한외여과 루프가 중단될 수 있고 정밀여과 루프가 단독으로 수행될 수 있고, MF 투과물은 탱크 2로 옮겨진다. 상기 정밀여과 루프는 1.2 마이크론 내지 0.1 마이크론의 필터, 예컨대 0.65 내지 0.2 마이크론, 또는 0.45 마이크론의 필터가 장착되어 있을 수 있다. 교차류는 0.6 내지 2 bar, 예컨대 0.8 내지 1.5 bar 사이, 또는 1.0 bar의 막전위 압력(TMP:trans-membrane pressure)을 갖는 1000 리터/시간 m2(LHM) 내지 3000 LHM 사이, 예컨대 1500 내지 2500 LHM 사이, 또는 2000 LHM일 수 있다. 상기 한외여과 루프는 10 KDa 내지 1000 KDa, 예컨대 10 KDa 내지 100 KDa, 또는 10 KDa 내지 30 KDa, 또는 30 KDa 내지 100 KDa, 또는 30 KDa 내지 300 kDa, 또는 100 KDa 내지 300 kDa, 또는 30 KDa 내지 1000 kDa, 또는 100 KDa 내지 1000 kDa, 또는 300 KDa 내지 1000 kDa의 필터가 장착되어 있을 수 있다. 교차류는 0.2 내지 1.5 bar, 예컨대 0.4 내지 1.2 bar 사이, 또는 0.5 bar의 TMP를 갖는 30 LHM 내지 1000 LHM 사이, 예컨대 20 내지 500 LHM 사이일 수 있다.
5 내지 20 사이의 정용여과 부피를 사용하여 박테리아 세포 벽으로부터 가용화된 화합물을 추출할 수 있다. 정용여과 배지는 7 내지 11 사이의 pH 값으로 조정된 물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 8 내지 15 사이의 부피가 사용된다. 따라서, 예컨대, 일부 실시형태에서, 5 내지 15회 사이의 여과 사이클이 사용될 수 있으며, 일부 경우 8 내지 15 사이의 사이클, 예컨대 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 사이클이 사용될 수 있다.
임의의 불용성 입자 제거 외에, 이러한 여과는 또한 임의의 핵산 제거를 목표로 한다. 여과의 결과로, 상기 박테리아 추출물에 존재하는 핵산의 양은 100 마이크로그램/mL 미만으로 유지될 수 있다. 그러나, 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 큰 사카라이드 예컨대 선형 및 분지형 폴리사카라이드를 포함하는 사카라이드 성분, 및 특히 리포폴리사카라이드(LPS) 성분은 여과에 의해 보존될 수 있다. 실제로, 세포용해 공정 동안, 사카라이드(LPS 성분 포함)는 더 작은 구조로 절단되었거나 상이한 작용기로 대체되었다. 이와 관련하여, 이전에는 잠재적으로 독성인 LPS 성분을 포함하여 사카라이드 성분이 안전상의 이유로 박테리아 추출물에서 제거되어야 한다고 생각되었지만(미국특허 제5,424,287호 참조), 본 출원인은 이러한 성분이 사실상 추출물에 추가 항원을 제공하여 치료 효능을 향상시키기 때문에 LPS를 포함하는 사카라이드 성분이 안전하게 유지될 수 있음을 보여주었다. 추출물은 원하는 경우 추가로 희석, 농축 또는 원심분리될 수 있다.
정용여과 후, 알칼리성의 정제된 가용성 박테리아 추출물은 본 발명에 따라, 하나 이상의 특정 유기산을 첨가하여 추가로 조정되어 세포용해물이 중화되었다. 상기 유기산은 아세트산, 프로피온산, 락트산, 3-히드록시프로판산, 피루브산, 부타논산, 2-히드록시부타논산, 3-히드록시부타논산, 글루탐산, 아스파르트산, 이들의 조합, 및/또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 에스터 중에서 본 발명에 따라 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 박테리아 추출물 제형의 최종 pH는 5 내지 8 사이, 6 내지 8 사이, 6.3 내지 7.8 사이, 또는 6.5 내지 7.8 사이로 조정될 수 있다.
따라서, 이러한 정제된 가용성 박테리아 추출물은 본 발명에 따라 유리하게 액체로서 보존 및 저장될 수 있고 임의의 침강 또는 침전 없이 투명하게 유지될 수 있으며 따라서 우수한 물리적 안정성을 유지한다. 대안적으로, 상기 정제된 박테리아 추출물은 치료 용도 또는 추가의 생약(galenic) 공정을 위해 액체, 기체 또는 고체 형태 하에 이들을 재제형화하기 전에, 필요한 경우 동결건조될 수 있다.
박테리아 추출물 제형을 액체 제형으로 유지하는 경우, 이는 생물학적 활성을 유지하면서 시간 경과에 따른 우수한 물리적 안정성으로 실온에서 장기간 동안 저장될 수 있다. 유리하게는, 상기 박테리아 추출물은 제형화 공정 또는 저장 동안 응집체 및 침전물의 형성 없이 실온, 또는 4℃, -20℃ 또는 -80℃에서 저장될 수 있다. 본 발명에 따르면, 따라서 박테리아 추출물 제형에서 불용성이든 가용성이든, 임의의 응집체의 형성을 크게 감소시키는 것이 가능하였다. 또한, 개선된 물리적 안정성이 관찰되었을뿐 아니라, 상기 제형은 또한 생물학적 성분의 실질적인 화학적 분해 또는 변형 없이, 생산 또는 저장 동안 폴리사카라이드, 리포폴리사카라이드, 단백질, 라세미화된 아미노산 및 기타 생물학적 성분의 우수한 생물학적 활성을 유지하였다.
본 발명에 따른 박테리아 추출물 제형은 따라서 RT, 또는 4℃, -20℃, 또는 -80℃에서 적어도 1개월, 또는 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 24개월 동안 저장될 수 있으며, 상기 제형은 예컨대 빛, 온도, pH, 물의 영향에 의해 또는 부형제 및/또는 즉각적인 컨테이너 마개 시스템과의 반응에 의해 박테리아 추출물의 제조 및/또는 저장 동안 야기된 실질적인 물리적 변화를 나타내지 않는다. 또한, 동일한 저장 조건 하에 놓일때 알려진 초기 생물학적 활성의 동일한 박테리아 추출물 제형은 적어도 초기 생물학적 활성을 유지할 수 있었다. 관련 실시형태에서, 상기 박테리아 추출물은 상기 저장 기간 동안 표지된 만료일에 도달하지 않았다.
이와 같이 수득된 치료 활성의 가용성 박테리아 추출물의 주요 성분의 조성 및 화학적 특성이 액체 제형에서 정밀하게 측정되었고 시간 경과에 따라 유지되었다. 특히, 본원에서 상기 표시한 바와 같이, 상기 박테리아 추출물에 존재하는 핵산의 양은 100 g/mL 미만이다. 또한 상기 박테리아 추출물은 0.1 mg/mL 초과의 폴리사카라이드, 또는 0.1 내지 4.5 mg/mL 사이, 또는 0.1 내지 4 mg/mL 사이, 또는 0.1 내지 4 mg/mL 사이, 또는 0.1 내지 3.5 mg/mL 사이, 또는 0.6 내지 3 mg/mL 사이 또는 0.3 내지 1 mg/mL 사이 또는 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 또는 4.5 mg/mL에서 시작하거나 끝나는 범위, 예컨대, 0.4 내지 0.5 mg/mL의 폴리사카라이드를 포함한다. 또한, 가용화된 단백질의 수율이 Lowry에 의해 가용성 정제된 박테리아 추출물에서 측정될 수 있으며 예컨대 50% 초과일 수 있거나, 60% 초과일 수 있거나, 50 내지 90%일 수 있거나 60 내지 90%일 수 있다. 따라서, 상기 박테리아 추출물은 5 내지 75 mg/mL의 단백질, 또는 10 내지 65 mg/mL, 또는 20 내지 45 mg/mL, 또는 5 내지 40 mg/mL, 또는 5 내지 20 mg/mL, 또는 5 내지 10 mg/mL, 또는 6 내지 8 mg/mL의 단백질 또는 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 또는 75 mg/mL에서 시작하거나 끝나는 범위; 1.5 내지 2.5 mg/mL의 유리 아미노산(A.A.), 또는 1.5 내지 2 mg/mL, 또는 2 내지 2.5 mg/mL의 유리 A.A., 또는 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 또는 2.5 mg/mL에서 시작하거나 끝나는 범위의 의 유리 A.A.로서, 글루탐산(147.1 g/mol)으로부터 계산된 것; 및 0.3 내지 4.5 mg/mL의 폴리사카라이드 및 모노사카라이드, 또는 0.3 내지 4 mg/mL, 또는 0.4 내지 4 mg/mL, 또는 0.5 내지 3.5 mg/mL, 또는 0.6 내지 3 mg/mL 또는 0.3 내지 1 mg/mL 또는 0.4 내지 0.5 mg/mL와 같이, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 또는 4.5 mg/mL에서 시작하거나 끝나는 범위의 폴리사카라이드 및 모노사카라이드를 포함할 수 있다.
또한, 이러한 세포용해는 단백질의 부분적 가수분해뿐만 아니라 아미노산의 탈아미노화, 탈아미드화, 및 L에서 D로의 부분적인 라세미화를 초래한다. 세포용해 공정 동안 아미노산의 라세미화는 자연 단백질에서 발견되는 자연 발생 L-아미노산으로부터 D-아미노산을 생성한다. 상기 박테리아 추출물에 대한 분석 연구는 라세미화 비율을 결정하였다. D-아스파르트산, D-글루탐산, D-세린, D-메티오닌, D-히스티딘, D-알라닌, D-아르기닌, D-페닐알라닌, D-티로신, D-류신, 및 D-리신을 나타내는 피크가 관찰되었다. 이러한 종의 D-아미노산의 퍼센트는 3% 내지 40%의 범위였다. 따라서, 세린, 트레오닌, 히스티딘, 알라닌, 아르기닌, 티로신, 페닐알라닌, 류신, 및/또는 리신 중 하나 이상의 라세미화가 밝혀졌다. 하나 이상의 상기 아미노산 중 적어도 10%는 D에서 L로 라세미화될 수 있다. D-아미노산은 주로 또는 부분적으로 D-아미노산으로 구성된 단백질이 포유류 장에서 효율적으로 소화되지 않기 때문에, 상기 추출물의 생체이용률을 증가시키는데 유리할 수 있다. 따라서, 세포용해 동안 D-아미노산을 함유하도록 화학적으로 변형된 추출물 중의 항원 분자가 환자의 몸에서 더 장기간 유지되어, 잠재적으로 보다 강력한 면역자극 작용이 가능하다.
마지막으로, 본 발명에 따른 박테리아의 세포용해는 가수분해로 인해 0 내지 300 KDa 내지 0 내지 100 kDa, 또는 0 내지 60 kDa의 성분 분자의 분자량의 감소를 초래할 수 있다.
예로서, 상기 박테리아 추출물은 따라서 약 6 내지 8 mg/mL의 단백질, 1.5 내지 2.5 mg/mL의 아미노산(A.A.)(HCl 가수분해 후 측정됨) 및/또는 약 0.4 내지 0.5 mg/mL의 폴리사카라이드 및 모노사카라이드를 함유할 수 있다. 단백질 농도는 유럽 약전 2.5.33의 방법 2에 따라 Lowry 분석법으로 측정된다. 당 농도는 문헌[D. Herbert et al., Meth. Microbiol. 5B: 266 et seq. (1971)]에 따라 산 가수분해 및 유도체화 후에 분석된다. 글루타메이트(글루탐산) 농도는 문헌[Roth M., Fluorescence reaction for 아미노산s, Anal.Chem., 43, 880-882, (1971)]에 따라, 아미노산을 이소인돌 유도체로 전환하고 340 nm에서 흡광도를 측정하여 측정된다.
상기 표시된 바와 같이, 마우스에서 인간 투여량(7 mg 건조 중량 박테리아 추출물)의 고체 형태로 경구로 투여된 OM 박테리아 추출물이 인플루엔자 감염 후 2차 박테리아 감염으로부터의 보호를 향상시킬 수 있었음이 실험적으로 입증되었다(문헌[Pasquali et al, Frontiers in Medicine 2014, 1, 41]).
OM 박테리아 추출물의 투여 경로는 항상 경구(예컨대, 경장 경로)였고 성인 치료를 위한 용량 요법은 7 mg의 동결건조된 박테리아 추출물의 1일 1캡슐이었고, 어린이의 경우 3.5 mg의 동결건조된 박테리아 추출물의 1일 1캡슐이었다. 본 출원인은 그러나 비강 내, 기관 내, 점막, 경점막, 국소, 협측, 설하, 폐, 기관지 내, 및/또는 폐 내 경로와 같이 대안적인 경구 주변 비-경장 투여 경로를 통한 OM 박테리아 추출물의 투여가 강력한 면역 반응을 제공하고 가능한 감염 및/또는 염증에 대해 보다 효율적임을 발견하였다.
중요하게는, 이러한 신규한 경구 주변 투여 경로의 관찰된 우수한 치료 효과는 박테리아 추출물 약물의 투여량을 실질적으로 감소시켰다. 용량 요법은 매일 경구 주변 용량 요법으로 2개로 나눌 수 있으며, 성인 치료의 경우 3.5 mg의 동결건조된 박테리아 추출물과, 어린이의 경우 1.75 mg의 동결건조된 박테리아 추출물이다. 따라서 본 출원인에 의해 제공된 이러한 신규한 경구 주변 투여 경로는 보다 낮은 투여량으로 보다 높은 치료 효능을 제공함을 입증하였다.
또한, 본 출원인은 상기 박테리아 추출물-본원에서 전술된 안정화된 박테리아 추출물 제형이든 아니든 간에-의 이러한 신규한 경구 주변 투여 경로가 호흡기 및 폐에서 더 강력한 면역 반응을 유도하는 동시에, 또한 장 등과 같은 원위 부위에서 강력한 면역 반응을 생성함을 보여주었다.
특히, 상기 박테리아 추출물(안정한 제형이든 아니든 간에)의 경구 주변 투여는 감염 및/또는 염증 및/또는 신생물 및/또는 세균불균형으로부터 야기된 급성 및 만성 면역학적 장애로부터 환자를 보호하였다. 따라서 경구 주변 투여 경로는 일반적으로 의학적 상태를 악화시키고 만성 병리의 발병 위험을 증가시키는 이러한 병리 및 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법에서 특히 유용하고 효과적이다.
본 발명에 따르면, 감염은 알러지성 비염, 비염, 비인두염, 부비동염, 인두염, 편도염, 후두염, 기관염, 인후염, 인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 리노바이러스(HRV), 호흡기세포융합 바이러스(RV), 코로나바이러스(CoV, SARS-CoV, MERS-Cov, COVID-19 등), 크루프, 폐렴, 과민성 폐렴, 기관지폐렴, 기관지염, 세기관지염, 폐렴, 급성 하기도 감염이 있는 폐쇄성 폐 질환, 급성 상기도 감염이 있는 폐쇄성 폐 질환, 또는 상피 섬모 운동 장애 및/또는 점액 제거 장애가 있는 질환을 포함하는 상기도 및 하기도 감염 및/또는 관련 후유증을 포함할 수 있다. 감염은 또한 2차 감염, 비-호흡기 바이러스 감염, 비-호흡기 박테리아 감염, 전신 감염 예컨대 패혈증, 패혈성 쇼크 및 바이러스-유발 합병증을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 염증은 알러지성/아토피성 호흡기 및 비-호흡기 적응증 아토피 피부염, 급성 및/또는 만성 관련 피부염, 아나필락시스 및 식품 알러지를 포함할 수 있다. 상기 염증은 또한 광손상(예컨대 태양-유발 염증 및 발적 피부) 피부 위축, 피부 색소침착(패치/스폿), 광피부염(홍반: 염증 및 발적 피부), 모세혈관확장증, 쿠페로스, 또는 광선 각화증을 비롯하여 피부 장애, 염증이 있는 피부, 습진, 주사비(rosacea), 아토피성 피부염, 건선뿐만 아니라, 그레이브스 병, 하시모토병, 피부경화증(scleroderma), Ig 4 관련 질환, 또는 천포창 중에서 선택되는 T 헬퍼 2 우세 자가면역 적응증을 포함하는 염증, 및 호산구성 방광염, 호산구성 식도염, 호산구성 근막염. 호산구성 위장염, 고호산구성 증후군, 호산구 육아종증 다발관 혈관염(eosinophilic granulomatosis with polyangiitis), 호산구성 천식, 또는 호산구성 폐렴 중에서 선택되는 호산구성 적응증을 포함하는 염증을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 세균불균형 관련 장애는 천식, 당뇨병, 2형 당뇨병, 자가면역 질환, 저 섬유질 요법과 관련된 질환, 아토피성 피부염, 급성 및/또는 만성 관련 피부염, 건선, 염증성 장 질환, 대장염, 궤양성 대장염, 크론병, 비만, 대사성 질환 또는 장애, 간부전, NASH, NAFLD, 간 섬유증, 신부전, 저 섬유질 요법과 관련된 질환을 포함할 수 있다.
마지막으로, 신생물은 비만세포증, 비만 세포 백혈병, T 헬퍼 2 편향 및/또는 면역-억제된 종양과 같은 면역학적 장애가 있는 신생물 적응증을 포함할 수 있다.
따라서, 제1 양태에 따르면, 본 발명은 모라셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 및/또는 스트렙토코커스 생귀니스(Streptococcus sanguinis)로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 종의 알칼리성 세포용해에 의해 수득 가능한 정제된 박테리아 추출물에 관한 것으로서, 여기서 상기 박테리아 추출물은 100 마이크로그램/ml 미만의 핵산을 포함하며, 대상체에서, 감염 및/또는 염증 및/또는 신생물 및/또는 세균불균형으로부터 야기된 급성 및 만성 면역학적 장애의 치료 및/또는 예방 방법에서 사용하기 위한 것으로서, 여기서 안정한 제형이거나 안정한 제형이 아닌 상기 정제된 가용성 박테리아 추출물은 경구 주변 경로에 의해, 특히, 기관 내 흡입, 비강 내, 점막, 경점막, 외부 피부 국소, 협측, 설하, 폐, 기관지 내, 및/또는 폐 내 투여를 통해, 그리고 경장 경구 투여에 대해 사용된 투여량보다 적은 용량 요법으로 대상체에 투여된다.
본 발명은 또한 모라셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 및/또는 스트렙토코커스 생귀니스(Streptococcus sanguinis)로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 종의 알칼리성 세포용해에 의해 수득 가능한 정제된 박테리아 추출물에 관한 것으로서, 여기서 상기 박테리아 추출물은 100 마이크로그램/ml 미만의 핵산을 포함하며, 대상체에서, 알러지성 비염, 비염, 비인두염, 부비동염, 인두염, 편도염, 후두염, 기관염, 인후염, 인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 리노바이러스(HRV), 호흡기세포융합 바이러스(RV), 코로나바이러스(CoV, SARS-CoV, MERS-Cov, COVID-19 등), 크루프, 폐렴, 과민성 폐렴, 기관지폐렴, 기관지염, 세기관지염, 폐렴, 급성 하기도 감염이 있는 폐쇄성 폐 질환, 급성 상기도 감염이 있는 폐쇄성 폐 질환, 또는 상피 섬모 운동 장애 및/또는 점액 제거 장애, 2차 감염, 비-호흡기 바이러스 감염, 비-호흡기 박테리아 감염, 전신 감염 예컨대 패혈증, 패혈성 쇼크 및 바이러스-유발 합병증이 있는 질환을 포함하는 상기도 및 하기도 감염 및/또는 관련 후유증 중에서 선택된 감염을 치료 및/또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것이며, 여기서 안정한 제형이거나 안정한 제형이 아닌 상기 정제된 가용성 박테리아 추출물은 경구 주변 경로에 의해, 특히 기관 내 흡입, 비강 내, 점막, 경점막, 외부 피부 국소, 협측, 설하, 폐, 기관지 내, 및/또는 폐 내 투여를 통해 대상체에 투여된다.
본 발명은 또한 모라셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 및/또는 스트렙토코커스 생귀니스(Streptococcus sanguinis)로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 종의 알칼리성 세포용해에 의해 수득 가능한 정제된 박테리아 추출물에 관한 것으로서, 여기서 상기 박테리아 추출물은 100 마이크로그램/ml 미만의 핵산을 포함하며, 대상체에서, 알러지성/아토피성 호흡기 및 비-호흡기 적응증 아토피 피부염, 급성 및/또는 만성 관련 피부염, 아나필락시스 및 식품 알러지 중에서 선택되는 염증, 광손상(예컨대 태양-유발 염증 및 발적 피부) 피부 위축, 피부 색소침착(패치/스폿), 광피부염(홍반: 염증 및 발적 피부), 모세혈관확장증, 쿠페로스, 또는 광선 각화증을 비롯하여 피부 장애, 염증이 있는 피부, 습진, 주사비(rosacea), 아토피성 피부염, 건선, 및 그레이브스 병, 하시모토병, 피부경화증, Ig 4 관련 질환, 또는 천포창으로부터 선택되는 T 헬퍼 2 우세 자가면역 적응증으로부터 선택되는 염증, 및 호산구성 방광염, 호산구성 식도염, 호산구성 근막염. 호산구성 위장염, 고호산구성 증후군, 호산구 육아종증 다발관 혈관염, 호산구성 천식, 또는 호산구성 폐렴 중에서 선택되는 호산구성 적응증을 포함하는 염증의 치료 및/또는 예방 방법에서 사용하기 위한 것이며, 여기서 안정한 제형이거나 안정한 제형이 아닌 상기 정제된 가용성 박테리아 추출물은, 경구 주변 경로에 의해, 특히 기관 내 흡입, 비강 내, 점막, 경점막, 외부 피부 국소, 협측, 설하, 폐, 기관지 내, 및/또는 폐 내 투여를 통해 대상체에 투여된다.
본 발명은 또한 모라셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 및/또는 스트렙토코커스 생귀니스(Streptococcus sanguinis)로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 종의 알칼리성 세포용해에 의해 수득 가능한 정제된 박테리아 추출물에 관한 것으로서, 여기서 상기 박테리아 추출물은 100 마이크로그램/ml 미만의 핵산을 포함하며, 대상체에서, 천식, 당뇨병, 2형 당뇨병, 자가면역 질환, 저 섬유질 요법과 관련된 질환, 아토피성 피부염, 급성 및/또는 만성 관련 피부염, 건선, 염증성 장 질환, 대장염, 궤양성 대장염, 크론병, 비만, 대사성 질환 또는 장애, 간부전, NASH, NAFLD, 간 섬유증, 신부전, 또는 저 섬유질 요법과 관련된 질환 중에서 선택되는 세균불균형 관련 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것이며, 여기서 안정한 제형이거나 안정한 제형이 아닌 상기 정제된 가용성 박테리아 추출물은, 경구 주변 경로에 의해, 특히 기관 내 흡입, 비강 내, 점막, 경점막, 외부 피부 국소, 협측, 설하, 폐, 기관지 내, 및/또는 폐 내 투여를 통해 대상체에 투여된다.
본 발명은 마지막으로 모라셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 및/또는 스트렙토코커스 생귀니스(Streptococcus sanguinis)로부터 선택된 하나 이상의 박테리아 종의 알칼리성 세포용해에 의해 수득 가능한 정제된 박테리아 추출물에 관한 것으로서, 여기서 상기 박테리아 추출물은 100 마이크로그램/ml 미만의 핵산을 포함하며, 대상체에서, 비만세포증, 비만 세포 백혈병, T 헬퍼 2 편향 및/또는 면역-억제된 종양과 같은 면역학적 장애가 있는 신생물 적응증 중에서 선택되는 신생물의 치료 및/또는 예방 방법에서 사용하기 위한 것으로서, 여기서 안정한 제형이거나 안정한 제형이 아닌 상기 정제된 가용성 박테리아 추출물은 경구 주변 경로에 의해, 특히 기관 내 흡입, 비강 내, 점막, 경점막, 외부 피부 국소, 협측, 설하, 폐, 기관지 내, 및/또는 폐 내 투여를 통해 대상체에 투여된다.
이러한 제1 양태에 따르면, 상기 추출물은 상기 박테리아 종 각각으로부터 유래된 적어도 하나의 균주를 포함한다. 대안적으로, 상기 목록으로부터의 하나 이상의 특정 균주가 제거되거나 하나 이상의 상이한 균주로 대체될 수 있다. 바람직한 경구 주변 OM 박테리아 추출물의 경우, 상기 추출물은 상기도의 8종의 박테리아 병원체, 즉, 모라셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 및 스트렙토코커스 생귀니스(Streptococcus sanguinis)로부터 수득된다. 이러한 양태에 따른 박테리아 추출물은 또한 경구 주변 OM314A 박테리아 추출물, 즉 , 경구 주변 경로를 통해 투여되는 안정화된 형태의 OM 박테리아 추출물일 수 있다.
OM 박테리아 추출물은 하나 이상의 박테리아 종 즉 모라셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 및 스트렙토코커스 생귀니스(Streptococcus sanguinis)로부터, 바람직하게는 10 초과의 pH에서, 알칼리성 세포용해 및 100 마이크로그램/ml 미만의 핵산, 적어도 0.3 mg/mL의 사카라이드, 30 kDa 미만의 분자량을 가진 6 내지 8 mg/mL 사이의 단백질, 글루탐산(147 g/mol)과 동등한 1.5 내지 2.5 mg/mL 사이의 아미노산(HCl 가수분해 후 측정됨), 하나 이상의 라세미화된 아미노산이 아스파르트산, 아스파라진, 글루탐산, 글루타민, 세린, 메티오닌, 히스티딘, 알라닌, 아르기닌, 페닐알라닌, 티로신, 류신, 리신, 발린, 및 트레오닌으로부터 선택되는, L에서 D로 라세미화된 1 내지 80%의 상기 아미노산을 함유하도록 후속 정제에 의해 수득 가능하다. 추출물 특성 및 이들의 적합한 제조 방법에 대한 추가 개시내용이 본원에서 아래에 제공되어 있고 또한 국제 공개 WO2008/109669호에 제공되어 있으며, 이의 전체 내용은 인용되어 본원에 포함된다.
제1 양태에 따라서, 본 발명은 따라서 또한 상기도 및 하기도 감염, 관련 후유증 및/또는 2차 감염, 세균불균형 및/또는 세균불균형 관련 장애의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로서, 여기서 안정화되거나 안정화되지 않은 상기 경구 주변 OM 박테리아 추출물은 대상체에 기관 내 흡입, 비강 내, 점막, 경점막, 국소, 협측, 설하, 폐, 기관지 내, 또는 폐 내 투여를 통해, 그리고 일일 0.005 mg 내지 1 mg의 용량 요법으로, 즉 , 경장 경구 투여보다 낮은 투여량으로 대상체에 투여되며, 최적의 보호를 부여하는데 효과적이었다. 바람직하게는, 이러한 양태에 따른 박테리아 추출물은 OM 박테리아 추출물 또는 이의 안정화된 형태인 OM314A 박테리아 추출물이다. 또한, 이러한 양태에 따르면, 치료 및/또는 예방되는 2차 감염은 비-호흡기 바이러스 감염일 수 있다.
본 출원인은 다음의 실시예에서 이러한 제1 양태에 따른 OM 박테리아 추출물의 비강 내 투여가 인플루엔자 바이러스 감염 후 폐 조직에서 바이러스 역가를 실질적으로 감소시키고 경구 투여의 경우와 비교할 때 그리고 훨씬 적은 투여량으로 중복감염된 동물의 이환율 및 사망률이 감소됨을 분명하게 입증하였다. 실제로, 예방적 치료로서 이의 비강 내 또는 기관 내 투여는 경장 경로 투여보다 더 우수한 효능을 나타냈다. 비강 내 투여는 이러한 마우스 모델에서 인플루엔자에 대한 효과적인 예방적 치료를 구성하였으며 이러한 보호 효과는 용량 의존적인 것으로 나타났다. 본 출원인은 또한 이러한 제1 양태에 따른 정제된 박테리아 추출물의 기관 내 또는 비강 내 직접적인 투여가 이러한 2개의 글리코사미노글리칸의 큰 사슬 동형을 상향조절함으로써 이러한 박테리아 추출물이 염증 감소 및 항원 제시 증가와 같은 신규한 유익한 메커니즘과 관련되어 있음을 증명한다는 것을 입증하였다.
이러한 제1 양태에 따르면, 본 발명은 따라서 경구 주변 경로를 통해 치료 유효량의 OM 박테리아 추출물 또는 안정화된 형태인 OM314A를 투여하는 단계를 포함하는, 감염 및/또는 염증 및/또는 신생물 및/또는 세균불균형으로부터 초래된 급성 및 만성 면역학적 장애의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.
본 발명은 특히 알러지성 비염, 비염, 비인두염, 부비동염, 인두염, 편도염, 후두염, 기관염, 인후염, 인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 리노바이러스(HRV), 호흡기세포융합 바이러스(RV), 코로나바이러스(CoV, SARS-CoV, MERS-Cov, COVID-19), 크루프, 폐렴, 과민성 폐렴, 기관지폐렴, 기관지염, 세기관지염, 폐렴, 급성 하기도 감염이 있는 폐쇄성 폐 질환, 급성 상기도 감염이 있는 폐쇄성 폐 질환, 또는 상피 섬모 운동 장애 및/또는 점액 제거 장애, 2차 감염, 비-호흡기 바이러스 감염, 비-호흡기 박테리아 감염, 전신 감염 예컨대 패혈증, 패혈성 쇼크 또는 바이러스-유발 합병증이 있는 질환을 포함하는 상기도 및 하기도 감염 및/또는 관련 후유증 중에서 선택되는 감염의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로서, 이는 경구 주변 경로를 통해 치료 유효량의 OM 박테리아 추출물 또는 안정화된 형태인 OM314A를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 비제한적으로 T 헬퍼 1, T 헬퍼 17 및 T 헬퍼 2 면역 반응 사이의 불균형, T reg 불균형, 2형 과민증, 면역-억제, 호산구 증가증, 알러지 및 아토피를 포함하는 면역학적 장애의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로서 이는 경구 주변 경로를 통해 치료 유효량의 OM 박테리아 추출물 또는 안정화된 형태인 OM314A를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 알러지성/아토피성 호흡기 및 비-호흡기 적응증 아토피 피부염, 급성 및/또는 만성 관련 피부염, 아나필락시스 및 식품 알러지를 포함하는 염증, 광손상(예컨대 태양-유발 염증 및 발적 피부) 피부 위축, 피부 색소침착(패치/스폿), 광피부염(홍반: 염증 및 발적 피부), 모세혈관확장증, 쿠페로스, 광선 각화증을 비롯한 피부 장애, 염증이 있는 피부, 습진, 주사비(rosacea), 아토피성 피부염, 건선, 또는 그레이브스 병, 하시모토병, 피부경화증, Ig 4 관련 질환, 또는 천포창 중에서 선택되는 T 헬퍼 2 우세 자가면역 적응증을 포함하는 염증, 또는 호산구성 방광염, 호산구성 식도염, 호산구성 근막염. 호산구성 위장염, 고호산구성 증후군, 호산구 육아종증 다발관 혈관염, 호산구성 천식, 또는 호산구성 폐렴 중에서 선택되는 호산구성 적응증을 포함하는 염증의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로서 이는 경구 주변 경로를 통해 치료 유효량의 OM 박테리아 추출물 또는 안정화된 형태인 OM314A를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 천식, 당뇨병, 2형 당뇨병, 자가면역 질환, 저 섬유질 요법과 관련된 질환, 아토피성 피부염, 급성 및/또는 만성 관련 피부염, 건선, 염증성 장 질환, 대장염, 궤양성 대장염, 크론병, 비만, 대사성 질환 또는 장애, 간부전, NASH, NAFLD, 간 섬유증, 신부전, 또는 저 섬유질 요법과 관련된 질환을 포함하는 것 중에서 선택되는 세균불균형 관련 장애의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로서 이는 경구 주변 경로를 통해 치료 유효량의 OM 박테리아 추출물 또는 안정화된 형태인 OM314A를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 비제한적으로 T 헬퍼 1, T 헬퍼 17 및 T 헬퍼 2 면역 반응 사이의 불균형, T reg 불균형, 2형 과민증, 면역-억제, 호산구 증가증, 알러지 또는 아토피를 포함하는 면역학적 장애의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로서 이는 경구 주변 경로를 통해 치료 유효량의 OM 박테리아 추출물 또는 안정화된 형태인 OM314A를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 마지막으로 비만세포증, 비만 세포 백혈병, T 헬퍼 2 편향 및/또는 면역-억제된 종양과 같은 면역학적 장애를 가진 신생물 적응증 중에서 선택되는 신생물의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로서, 이는 경구 주변 경로를 통해 치료 유효량의 OM 박테리아 추출물 또는 안정화된 형태인 OM314A를 투여하는 단계를 포함한다.
제2 양태에 따르면, 본 발명은 또한 대상체에서 상기와 같이 감염 및/또는 염증 및/또는 신생물 및/또는 세균불균형으로부터 야기된 급성 및 만성 면역학적 장애의 치료 및/또는 예방 방법에서 사용하기 위한, 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 균주로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 종으로부터 알칼리성 세포용해에 의해 수득 가능한 박테리아 추출물에 관한 것으로서, 여기서 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 추출물은 안정한 제형이거나 안정한 제형이 아니고, 여기서 이는 경구 주변 경로에 의해, 특히 기관 내 흡입, 비강 내, 점막, 경점막, 외부 피부 국소, 협측, 설하, 폐, 기관지 내, 및/또는 폐 내 투여를 통해, 그리고 경장 경구 투여에 대해 사용된 투여량보다 낮은 용량 용법으로 대상체에 투여된다. 상기 박테리아 추출물은 바람직하게는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 카제이 디펜시스(Lactobacillus casei defensis), 락토바실러스 카제이 속 카제이(Lactobacillus casei ssp. casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacil/us paracasei), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 및 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii) 중 하나 이상을 포함하는 것으로부터 선택되는 하나 이상의 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 균주를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 양태에 따른 경구 주변 박테리아 추출물은 전술된 바와 같은 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 균주 또는 이의 안정화된 형태, 즉, OM314B 박테리아 추출물로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 종으로부터 알칼리성 세포용해에 의해 수득 가능한 박테리아 추출물이다.
이러한 제2 양태에 따르면, 본 발명은 따라서 감염 및/또는 염증 및/또는 신생물 및/또는 세균불균형으로부터 야기된 급성 및 만성 면역학적 장애의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로서, 이는 경구 주변 경로를 통해 치료 유효량의 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 추출물을 투여하는 단계를 포함한다.
따라서 본 발명은 특히 알러지성 비염, 비염, 비인두염, 부비동염, 인두염, 편도염, 후두염, 기관염, 인후염, 인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 리노바이러스(HRV), 호흡기세포융합 바이러스(RV), 코로나바이러스(CoV, SARS-CoV, MERS-Cov, COVID-19), 크루프, 폐렴, 과민성 폐렴, 기관지폐렴, 기관지염, 세기관지염, 폐렴, 급성 하기도 감염이 있는 폐쇄성 폐 질환, 급성 상기도 감염이 있는 폐쇄성 폐 질환, 또는 상피 섬모 운동 장애 및/또는 점액 제거 장애, 2차 감염, 비-호흡기 바이러스 감염, 비-호흡기 박테리아 감염, 전신 감염 예컨대 패혈증, 패혈성 쇼크 또는 바이러스-유발 합병증이 있는 질환을 포함하는 상기도 및 하기도 감염 및/또는 관련 후유증 중에서 선택되는 감염의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로서, 이는 경구 주변 경로를 통해 치료 유효량의 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 추출물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 비제한적으로 T 헬퍼 1, T 헬퍼 17 및 T 헬퍼 2 면역 반응 사이의 불균형, T reg 불균형, 2형 과민증, 면역-억제, 호산구 증가증, 알러지 및 아토피를 포함하는 면역학적 장애의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로서 이는 경구 주변 경로를 통해 치료 유효량의 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 추출물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 알러지성/아토피성 호흡기 또는 비-호흡기 적응증, 아토피성 피부염, 급성 및/또는 만성 관련 피부염, 아나필락시스 또는 식품 알러지 중에서 선택되는 염증, 광손상(예컨대 태양-유발 염증 및 발적 피부) 피부 위축, 피부 색소침착(패치/스폿), 광피부염(홍반: 염증 및 발적 피부), 모세혈관확장증, 쿠페로스, 또는 광선 각화증을 포함하는 피부 장애, 염증이 있는 피부, 습진, 주사비(rosacea), 아토피성 피부염, 건선, 또는 그레이브스 병, 하시모토병, 피부경화증, Ig 4 관련 질환, 또는 천포창 중에서 선택되는 T 헬퍼 2 우세 자가면역 적응증을 포함하는 염증, 또는 호산구성 방광염, 호산구성 식도염, 호산구성 근막염. 호산구성 위장염, 고호산구성 증후군, 호산구 육아종증 다발관 혈관염, 호산구성 천식, 또는 호산구성 폐렴 중에서 선택되는 호산구성 적응증을 포함하는 염증의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로서, 이는 경구 주변 경로를 통해 치료 유효량의 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 추출물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 천식, 당뇨병, 2형 당뇨병, 자가면역 질환, 저 섬유질 요법과 관련된 질환, 아토피성 피부염, 급성 및/또는 만성 관련 피부염, 건선, 염증성 장 질환, 대장염, 궤양성 대장염, 크론병, 비만, 대사성 질환 또는 장애, 간부전, NASH, NAFLD, 간 섬유증, 신부전, 또는 저 섬유질 요법과 관련된 질환을 포함하는 것 중에서 선택되는 세균불균형 관련 장애의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로서 이는 경구 주변 경로를 통해 치료 유효량의 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 추출물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 비만세포증, 비만 세포 백혈병, T 헬퍼 2 편향 및/또는 면역-억제된 종양과 같은 면역학적 장애가 있는 신생물 적응증을 포함하는 신생물의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로서, 이는 경구 주변 경로를 통해 치료 유효량의 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 추출물을 투여하는 단계를 포함한다.
락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 균주로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 종으로부터 알칼리성 세포용해에 의해 수득 가능한 안정한 박테리아 추출물은 일반적으로 코막힘 또는 콧물을 동반하는 통상의 감기 증상으로 지칭되는 비염 및/또는 알러지성 비염의 치료 및/또는 예방에 특히 유용하다.
제2 양태의 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명은 따라서 전술된 바와 같은 감염 및/또는 염증 및/또는 신생물 및/또는 세균불균형으로부터 야기된 급성 및 만성 면역학적 장애의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것으로서 이는 경구 주변 경로를 통해 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 균주로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 종으로부터 알칼리성 세포용해에 의해 수득 가능한 치료 유효량의 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 추출물을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 추출물은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 카제이 디펜시스(Lactobacillus casei defensis), 락토바실러스 카제이 속 카제이(Lactobacillus casei ssp. casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 및 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii) 중 하나 이상을 포함하는 것으로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 균주를 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 추출물은 전술된 바와 같은 안정화된 OM314B 박테리아 추출물이다.
이러한 제2 양태에 따른 안정한 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 추출물은 따라서 경구 주변 경로를 통해, 특히 기관 내 흡입 또는 비강 내 투여를 통해, 그리고 경장 경구 투여에 대해 사용된 투여량보다 낮은 용량 요법으로 투여된다.
바이러스 세포 역가의 감소 및 비제한적으로 H1N1, RSV에 대한 항바이러스 항체의 탑재로 생체 내에서 그리고 인간 RV(바이러스 수용체 ICAM-1의 감소를 동반한 IFN, β-디펜신의 유도로 예시됨)에 대한 시험관 내 효능으로 입증된, 상피 세포 표면에서 OM- 및 신규한 안정한 OM314A(P1, P2, P3), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5) 박테리아 추출물의 직간접적 항바이러스, 비특이적 활성을 고려하고, 따라서 OM- 및 신규한 안정한 OM314A(P1, P2, P3), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5)에 의한 상피 세포에 대한 바이러스 부착의 부착 손실(최대 손실)의 유도를 확인함으로써, 이러한 경구 주변 경로는 상기도 및 하기도 감염 예컨대 비염, 알러지성 비염, 비인두염, 부비동염, 인두염, 편도염, 후두염, 기관염, 인후염, 인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스, 인플루엔자(H1N1 등), 인간 리노바이러스(HRV), 호흡기세포융합 바이러스(RV), 코로나바이러스(CoV, SARS-CoV, MERS-Cov, COVID-19 등)으로 바이러스 감염 후 박테리아 2차 감염, 크루프, 폐렴, 기관지폐렴, 기관지염, 세기관지염, 급성 하기도 감염이 있는 폐쇄성 폐 질환, 급성 상기도 감염이 있는 폐쇄성 폐 질환, 상피 섬모 운동 장애 및/또는 점액 제거 장애가 있는 질환의 치료 및/또는 예방 방법에 특히 유용하고 효과적인 것으로 예상될 수 있다.
이러한 정제된 박테리아 추출물은 본원에 상기된 바와 같이 안정화될 수 있고, 따라서 고체, 반-고체, 액체, 또는 에어로졸 형태의 안정한 박테리아 추출물 제형으로서 투여될 수 있다.
안정화된 박테리아 추출물 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물이 또한 제공된다. 이러한 약학 조성물은 안정화되어 액체 제형으로 수 개월 동안 저장될 수 있으며 액체 또는 기화된 형태로 환자에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 이들은 액체 또는 에어로졸 약제로서 재제형화되기 전에 동결건조 및/또는 저장될 수 있다.
본 발명에 따른 안정한 약학 조성물은 특히 전술된 바와 같은 감염 및/또는 염증 및/또는 신생물 및/또는 세균불균형으로부터 야기된 급성 및 만성 면역학적 장애의 치료 및/또는 예방 방법에 유용하다.
이러한 약학 조성물은 액체, 기체 또는 에어로졸, 반-고체, 또는 고체의 임의의 형태로 수 개월 동안 안정하게 유지되기 때문에, 이들은 비강 내, 기관 내, 점막, 경점막, 국소, 협측, 설하, 경구, 폐, 기관지 내, 및/또는 폐 내 경로를 통한 투여에 대해 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 이들은 기관 내 흡입에 의해 또는 비강 내 경점막 경로에 의해 대상체에 투여될 수 있다.
특히 바람직한 것은 상기 조성물이 액체 또는 에어로졸이고 분무, 점적, 콜로이드, 미스트, 네뷸라로, 또는 미립화 증기로 제형화되는 약학 조성물이다. 또한 바람직한 약학 조성물은 액체 또는 반-고체 제형 예컨대 에멀젼, 마이크로에멀젼, 수성 분산액, 오일, 밀크, 발삼, 포말, 수성 또는 유성 로션, 수성 또는 유성 겔, 크림, 용액, 히드로알코올 용액, 히드로글리콜 용액, 히드로겔, 세럼, 연고, 무스, 페이스트, 또는 경피 패치일 수 있다. 특정 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 조성물은 고체이고 분말, 또는 분쇄 가능한(crushable) 정제로 제형화된다.
액체, 반-고체, 고체, 및 분무 의약품의 제조에서, 전술된 물질은 원하는 경우 임의의 첨가제 예컨대 비히클, 결합제, 향수, 향미제, 감미제, 착색제, 방부제, 항산화제, 안정화제, 및 계면활성제와 함께 적절하게 사용될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 상기 박테리아 추출물 약학 조성물은 비강 내 경로를 통해 투여되며 상기 조성물은 에멀젼, 현탁액, 콜로이드 형태, 미스트, 네뷸라, 미립화 증기 또는 분무, 비강 탐폰, 분말, 연고, 크림, 로션, 젤, 페이스트, 살베( salve), 용액, 팅크, 패치, 또는 스트립으로부터 선택된 형태일 수 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 박테리아 추출물 약학 조성물은 경구로 투여될 수 있으며 단회 용량(single dose) 컨테이너 또는 단일 용량(monodose) 컨테이너 예컨대 건조안(dry-eyes)의 점적액으로서 사용되는 생리학적 액체의 플라스틱 병과 유사한 단일 용량 플라스틱 병의 형태로, 또는 단일 용량 앰플 형태로 존재할 수 있다. 이러한 바람직한 실시형태에 따른 경구의 박테리아 추출물 액체 제형은 따라서 안정한 제형이며 장기간 동안 중화된(pH 7에 가까운) 액체 제형으로서 상기 단일 용량 컨테이너에 보관될 수 있다.
본 약학 조성물을 제조하기 위해, 박테리아 추출물은 통상적인 약제학적 배합 기술에 따라, 약학적으로 허용되는 담체, 보조제 및/또는 부형제와 혼합될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 임의의 표준 약학적인 담체, 예컨대 인산염 완충된 식염수 용액, 물, 및 에멀젼, 예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함한다. 상기 박테리아 추출물은 부가적으로 고체의 약학적인 부형제 예컨대 전분, 셀룰로스, 활석, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 소듐 클로라이드, 건조 탈지유 등을 함유할 수 있다. 액체 및 반고체 부형제는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원, 예컨대 땅콩 오일, 대두유, 광유, 세사미유 등을 비롯하여 다양한 오일로부터 선택될 수 있다. 특히 주사용 용액을 위한 액체 담체는 물, 식염수, 수성 덱스트로스, 및 글리콜을 포함한다. 담체, 안정화제 및 보조제의 예를 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, edited by E. W. Martin (Mack Publishing Company, 18th ed., 1990)]을 참조한다. 상기 약학 조성물은 또한 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 상기 약학 조성물은 분쇄 가능한 정제로 제형화될 수 있다. 상기 정제는 예컨대 손가락 압력으로 통째로 또는 가볍게 분쇄되어 투여될 수 있으며, 적합한 비히클에 뿌려질 수 있다. 상기 분쇄 가능한 정제는 개별적인 소단위의 코팅이 손상되지 않도록 공정에서 주의하여 직접 압축 공정 및 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 상기 분쇄 가능한 정제를 제조하기에 적합한 부형제는 모노- 및 디-사카라이드, 당, 폴리올 등, 또는 그 조합을 포함하여 전형적으로 츄어블 정제에 사용되는 것들을 포함한다. 예시적인 부형제는 만니톨, 솔비톨, 자일리톨, 말티톨, 락토즈, 수크로즈, 말토즈 또는 이들의 조합을 포함한다. 선택적인 약학적인 부형제 예컨대 희석제, 윤활제, 활택제, 감미제, 착색제 등, 또는 전술된 것 중 적어도 하나를 포함하는 조합물이 또한 압축 매트릭스에 포함될 수 있다. 상기 분쇄 가능한 정제는 제약 분야에 공지된 정제 제조 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
상기 박테리아 추출물 제형은 또한, 예컨대 금속 할라이드, 가장 바람직하게는 은 할라이드를 포함하는 콜로이드 형태로서 존재할 수 있다. 상기 하나 이상의 박테리아 추출물 및 보조제는 콜로이드 입자 내에 혼입되거나 이에 의해 캡슐화될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 하나 이상의 박테리아 추출물 및 보조제는 상기 콜로이드 입자의 표면 상에 부착될 수 있다. 활성제 및 보조제가 상기 입자에 부착되는 수단은 추출물, 보조제 및 콜로이드 입자의 특성에 따라 달라진다. 예컨대, 단백질은 입자 표면과의 소수성 상호작용을 통해 소수성 입자를 쉽게 흡착하거나 부착하고 중성 유화제의 일부를 대체한다.
본 발명은 부분적으로, 전술된 박테리아 추출물의 경구 주변 전달 시스템의 사용이 상당히 더 높은 항체 역가 및 향상된 면역 반응, 및 예방적 및 치료적 약학 조성물 둘 모두에서 사용하기 위한 다양한 항원의 면역원성을 향상시키기 위한 안전하고 효과적인 접근법을 제공한다는 놀라운 발견에 기초한 것이다.
본 발명에 따르고 본원의 다양한 실시형태에 기술된 바와 같이 적합한 투여량은 대상체의 상태, 연령 및 종에 따라 달라질 것이며 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 총 일일 투여량은 크게 감소되며 0.005 내지 1 mg, 바람직하게는 0.05 내지 0.5 mg, 가장 바람직하게는 0.1 내지 0.3 mg의 범위일 수 있고 이는 단일 또는 분할된 투여량으로서 투여될 수 있으며, 또한, 이것이 표시되는 경우에 상한을 또한 초과할 수 있다. 유리하게는, 경구 주변 경로를 통해 투여되는 투여량은 경구 경장 경로를 통해 투여되는 투여량보다 낮다(예컨대, 절반 투여량).
또 다른 양태는 본 발명에 따른 박테리아 추출물 제형의 전달 장치에 관한 것이다. 또한 상기도 및 하기도 감염, 관련 후유증 및/또는 2차 감염, 세균불균형 및/또는 세균불균형 관련 장애의 치료 및/또는 예방 방법에서 사용하기 위한 전달 장치가 제공된다.
본 발명에 따르면, 상기 박테리아 추출물 제형은 비강 취입기 장치, 비강 내 흡입기, 비강 내 분무 장치, 분무기(atomizer), 비강 분무 병, 단위 용량 컨테이너, 펌프, 점적기, 압착 병, 네뷸라이저, 정량 흡입기(MDI: metered dose inhaler), 가압 용량 흡입기(pressurized dose inhaler), 취입기, 양방향 장치, 용량 앰플, 비강 패드, 비강 스폰지, 및 비강 캡슐에 의해 비강 내 또는 기관 내 경로를 통해 투여될 수 있다.
비강 분무는 액체 또는 고체 비강 분무일 수 있다. 상기 박테리아 추출물 제형은 에어로졸로서 또는 비-에어로졸 형태로 투여될 수 있다. 상기 비강 전달 장치는 비강 공동에 정확한 유효 투여량을 투여하기 위해 계량될 수 있다. 상기 비강 전달 장치는 단일 단위 전달 또는 다중 단일 전달을 위한 것일 수 있다.
상기 박테리아 추출물 제형이 에어로졸로서 투여되는 경우, 이들은 표준 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 예컨대, 에어로졸 분무는 적합한 추진제 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 탄화수소, 압축 공기, 질소, 이산화탄소, 또는 기타 적합한 기체와 함께 가압된 컨테이너로부터 생성될 수 있다. 상기 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 펌프 분무 분배기는 특정 입자 또는 점적 크기를 가진 정량 또는 투여량을 분배할 수 있다. 상기 에어로졸은 액체 점적 또는 공기 중의(또는 기체 중의) 고체 분말의 현탁액 또는 분산액일 수 있다. 액체 점적은 예컨대 물 또는 비수성 용매와 같은 액체 중의 용액, 현탁액 및 분산액으로부터 형성될 수 있다. 에어로졸은 임의의 적합한 장치, 예컨대 MDI, 네뷸라이저, 또는 미스트 분무기에서 생성될 수 있다.
본 발명에 따른 에어로졸은 적합한 기계 장치를 사용하여 흡입(insufflated)되거나 흡입(inhaled)될 수 있다. 상기 장치는 예컨대 저장조 및 분무기를 포함할 수 있으며, 이는 분무 형태인 약학적인 투여량을 배출하도록 구성된 장치이다. 투여될 다수의 투여량은 선택적으로 액체 용액 또는 현탁액 또는 고체 미립자 제형, 예컨대 고체 미립자 혼합물로 저장조 내에 포함될 수 있다.
네뷸라이저 장치는 액체 형태의 치료제가 미스트로서 분무되도록 하는 고속 공기의 흐름을 생성한다. 상기 치료제는 액체 형태 예컨대 용액 또는 적합한 크기의 입자의 액체 현탁액으로 제형화된다. 상기 입자는 미세화된다. 상기 용어 "미세화"는 약 10 μm 미만의 직경을 가진 약 90% 이상의 입자를 갖는 것으로 정의된다. 적합한 네뷸라이저 장치는 예컨대 PARI GmbH(Sternberg, 독일)에 의해 상업적으로 제공된다. 다른 네뷸라이저 장치는 Respimat(Boehringer Ingelheim) 및 예컨대, 미국 특허 제7,568,480호 및 제6,123,068호, 국제 공개 WO 97/12687호에 기술된 것들을 포함한다.
DPI 장치는 흡기 동안 환자의 기류에 분산될 수 있는 자유-유동성 분말 형태의 박테리아 추출물 제형을 투여하는데 사용될 수 있다. 외부 에너지원을 갖는 DPI 장치가 또한 사용될 수 있다. 자유-유동성 분말을 달성하기 위해, 상기 박테리아 추출물 제형은 적합한 부형제(예컨대, 락토즈)와 함께 조합될 수 있다. 건조 분말 조합이 예컨대 약 1 μm 내지 약 100 μm 사이의 입자 크기를 가진 건조 락토즈와 벤조디아제핀 및 건조 블렌딩의 미세화된 입자를 조합함으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 상기 벤조디아제핀은 부형제 없이 제형화될 수 있다. 상기 제형은 건조 분말 분배기 내로, 또는 건조 분말 전달 장치와 함께 사용하기 위한 흡입 카트리지 또는 캡슐 내로 로딩된다. 상업적으로 제공되는 DPI 장치의 예는 Diskhaler (GlaxoSmith line, Research Triangle Park, N.C.)(미국특허 제5,035,237호); Diskus(GlaxoSmithKline)(미국특허 제6,378,519호; Turbuhaler(AstraZeneca, Wilmington, Del.)(미국특허 제4,524,769호); 및 Rotahaler(GlaxoSmithKline)(미국특허 제4,353,365호)를 포함한다.
MDI 장치는 압축된 추진제 기체를 사용하여 박테리아 추출물 제형의 측정된 양을 배출하는데 사용될 수 있다. MDI 투여용 제형은 액체화된 추진제 중의 박테리아 추출물 제형의 용액 또는 현탁액을 포함한다. 추진제의 예는 히드로플루오로알칸(HFA), 예컨대 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(HFA 134a) 및 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로-n-프로판, (HFA 227), 및 클로로플루오로카본, 예컨대 CC13F를 포함한다. MDI 투여용 HFA 제형의 추가 성분은 공-용매, 예컨대 에탄올, 펜탄, 물; 계면활성제, 예컨대 솔비탄 트리올리에이트, 올레산, 레시틴, 및 글리세린을 포함한다. 상기 박테리아 추출물 제형은 MDI 장치의 일부를 형성하는 에어로졸 캐니스터 내로 로딩된다.
상기 박테리아 추출물 제형은 비강 취입기를 통해 미소구체와 같은 분말로서 비강 공동에 전달될 수 있다. 상기 박테리아 추출물 제형은 고체 표면, 예컨대 담체에 흡수될 수 있다. 상기 분말 또는 미소구체는 건조, 공기-분배가능한 형태로 투여될 수 있다. 상기 분말 또는 미소구체는 취입기의 컨테이너에 저장될 수 있다. 대안적으로, 상기 분말 또는 미소구체는 캡슐, 예컨대 젤라틴 캡슐 내로, 또는 비강 투여를 위해 변형된 기타 단일 투여량 단위 내로 충진될 수 있다.
상기 박테리아 추출물 제형은 비강 분무 도포기를 통해 전달된다. 상기 조성물은 비강 내 분무-투여량 장치 또는 분무기(atomizer)에 배치될 수 있고 콧구멍의 점막으로 전달하기 위해 대상체의 콧구멍 내로 이를 분무함으로써 도포될 수 있다. 치료 효과를 위해 원하는 전신적 또는 국소적 수준을 달성하기 위해 충분량이 도포된다.
상기 박테리아 추출물 제형은 추가로 경구 흡입에 의해, 기관 내 경로를 통해, 호흡기, 즉, 폐 내로 투여될 수 있다. 이러한 기관 내는 고체 또는 액체의 에어로졸화 및 입 또는 목을 통한 폐로 에어로졸의 전달을 필요로 한다. 약물의 입자는 건조 분말 에어로졸 또는 액체 에어로졸로서 폐에 투여될 수 있다. 건조 분말 에어로졸은 일반적으로 건조 분말 흡입기(DPI) 흡입 장치를 사용하여 폐에 투여된다. 건조 분말 흡입기는 호흡 작동식 건조 분말 흡입기를 포함할 수 있으며, 예컨대 미국특허 제7,434,579호에 기술되어 있다. 정량-흡입기는 추진제, 추진제 혼합물, 또는 용매, 추진제, 및/또는 기타 부형제의 혼합물에 소형 압축된 에어로졸 분배기에 현탁된 약물을 포함한다. MDI 생성물은 최대 몇몇 백개의 계량된 용량의 약물을 방출할 수 있다. 각각의 작동은 수 마이크로그램(mcg) 내지 최대 밀리그램(mg)의 전형적으로 25 내지 100 마이크로리터 사이의 부피로 전달된 활성 성분을 포함할 수 있다.
전술된 바와 같이, 또 다른 유형의 액체 에어로졸 분배 장치는 네뷸라이저이며, 이는 제트, 진동 메쉬 또는 약물 입자를 함유하는 현탁액을 에어로졸화하기 위한 기타 수단을 사용한다.
본 발명에 따른 박테리아 추출물 제형은 추가로 보조제, 투과 증진제 및/또는 용매를 포함할 수 있다. 예컨대, 비강 내 전달을 위해, 투과 증진제를 사용하여 비강 점막을 통해 조성물의 침투를 향상시킬 수 있다. 하나 이상의 히드록실기를 함유하는 화합물은 투과 증진제로서 사용될 수 있다. 이러한 히드록실기-함유 화합물 일부는 또한 조성물에서 용매로서 작용할 수 있다. 투과 증진제로서 사용될 수 있는 히드록실기-함유 화합물의 비-제한적인 예는 알코올(예컨대 에탄올), 디올(예컨대 1,3-부탄디올, 1,2-부탄디올, 2,3-부탄디올, 및 1,4 부탄디올; 헥실렌 글리콜; 디프로필렌 글리콜; 1,5-펜탄디올; 1,2-펜탄디올; 1,8-옥탄디올; 에토헥사디올; p-멘탄-3,8 디올; 2-메틸-2,4-펜탄디올을 비롯한 1,2-프로판디올; 1,3-프로판디올; 부틸렌 글리콜로도 공지된 프로필렌 글리콜); 트리올(예컨대 글리세린), 폴리올(예컨대 다중 히드록실기를 함유하는 적합한 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리솔베이트, 및 솔비탄 에스터; 및 적합한 당 알코올 포함), 사이클리톨(예컨대 피니톨, 이노시톨), 환형 디올(예컨대 사이클로헥산 디올), 방향족 디올(예컨대 히드로퀴논, 비스페놀 A, 레조르시놀 및 카테콜)을 포함한다.
당업자는 본 기술이 또한 다른 투과 증진제에도 적용될 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명에 유용한 기타 투과 증진제의 비-제한적인 예는 다양한 약전 개요서에서 일반적으로 안전한 것으로 여겨지는(GRAS: Generally Recognized As Safe) 단순 장쇄 에스터이다. 이들은 단순 지방족, 불포화 또는 포화 에스터를 포함할 수 있다. 이러한 에스터의 비-제한적인 예는 이소프로필 미리스테이트, 미리스틸 미리스테이트, 옥틸 팔미테이트, 등을 포함한다. 비-제한적인 예의 기타 투과 증진제는 알코올(예컨대, 단쇄 및 장쇄 알코올), 폴리알코올, 아민 및 아미드, 우레아, 아미노산 및 이의 에스터, 아미드, 피롤리돈 및 이의 유도체, 테르펜, 지방산 및 이의 에스터, 거대환형 화합물, 설폭시드, 텐시드, 벤질디메틸암모늄 클로라이드, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드, 시네올, 코카미도프로필 베타인, 코카미도프로필 히드록시설타인, 도데실 피리디늄 클로라이드, 도데실아민, 헥사데실 트리메틸암모니오프로판 설포네이트, 리모넨, 리놀레산(OA), 리놀렌산(LA), 멘톨, 메틸 라우레이트, 메틸피롤리돈, N-데실-2-피롤리돈, NLS, 니코틴 설페이트, 노닐-l,3-디옥솔란, 옥틸 트리메틸암모늄 브로마이드, 올레일 베타인, PP, 폴리에틸렌글리콜 도데실 에터, 폴리옥시에텔렌 솔비탄 모노라우레이트(Tween 20, 또는 폴리솔베이트 20), SLA, 소듐 올리에이트, 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 옥틸 설페이트(SOS), 솔비탄 모노라우레이트(S20), 테트라케인, 및 트리톤 X-100을 포함한다. 상기 증진제는 적합해야 한다. 당업자는 또한 점막과 양립할 수 없거나 점막을 자극하는 물질을 피해야함을 이해할 것이다.
본 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 용매 또는 부형제의 예를 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients(Fifth Edition, Pharmaceutical Press, London and American Pharmacists Association, Washington, 2006)]과 같은 참고 문헌에서 확인할 수 있다. 본 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 용매의 비-제한적인 예는 비제한적으로 프로필렌 글리콜(1,2-디히드록시프로판, 2-히드록시프로판올, 메틸 에틸렌 글리콜, 메틸 글리콜 또는 프로판-1,2-디올로도 공지되어 있음), 에탄올, 메탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 글리콜, Cremophor EL 또는 폴리에톡실화된 캐스터유의 임의의 형태, 디프로필렌 글리콜, 디메틸 이소솔비드, 프로필렌 카보네이트, N-메틸피롤리돈, 글리코푸롤, 테트라에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 지방산 에스터, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
특히 바람직한 것은 상기도 및 하기도 감염, 관련 후유증 및/또는 2차 감염, 세균불균형 및/또는 세균불균형 관련 장애의 치료 및/또는 예방 방법에서 사용하기 위한 상기 제형을 포함하는 박테리아 추출물 제형 또는 약학 조성물이며, 이는 기관 내 흡입에 의해 또는 비강 내 경점막 경로에 의해 대상체에 투여된다.
비강 내 투여된 박테리아 추출물이 비강-관련 림프 조직(NALT) 또는 장-관련 림프 조직(GALT)에 영향을 미치고, 이어서 장에서 유래된 B-세포 및 T-세포 및 대식세포를 기관지-관련 림프구 조직으로 수송할 가능성이 있으며, 이는 호흡기에서 이러한 병원체에 대해 면역 반응으로 이어질 수 있다.
본 발명은 또한 바이러스 감염 및/또는 알러지 질환 또는 장애 예컨대 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 알러지 또는 자가면역의 바이러스-유발 악화를 치료, 예방, 또는 약화시키는 방법에 관한 것으로서 이는 대상체에 경구 주변 경로를 통해 치료 유효량의 본 발명의 안정한 박테리아 추출물을 투여하는 단계를 포함한다.
천식 상태는 스테로이드 내성 천식, 호중구 천식 또는 비-알러지성 천식일 수 있다. 알러지성 질환 또는 장애는 호산구성 질환 또는 장애일 수 있으며, 특히 질환 또는 장애는 결절, 호산구 증가증, 호산구성 류마티즘, 피부염 및 종창(NERDS)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 알러지성 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방 방법, 또는 천식, 비염, 피부염, 약물 반응, 호산구성 질환 또는 장애, 식도 및 위장 알러지로 이루어진 군으로부터 선택되는 알러지성 질환 또는 장애를 포함하는, 알러지성 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체의 상태의 개선을 위한 방법에 관한 것으로서, 이는 대상체에 경구 주변 경로를 통해 치료 유효량의 본 발명의 안정한 박테리아 추출물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 마지막으로 증가된 안정성을 가진 박테리아 추출물의 제조를 위한 신규한 추출 공정을 제공한다. 개선된 안정성을 가진 박테리아 추출물의 제조 공정은 다음의 단계를 포함한다:
a. 적합한 배양 배지에 각 박테리아 균주 종을 배양하는 단계,
b. ±0.1의 pH 변화를 가진, 바람직하게는 10 초과의 초기 pH에서 각 균주를 세포용해하는 단계,
c. 아세트산, 프로피온산, 락트산, 3-히드록시프로판산, 피루브산, 부타논산, 2-히드록시부타논산, 3- 히드록시부타논산, 글루탐산, 아스파르트산, 이들의 조합, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 에스터 중에서 선택되는 하나 이상의 유기산을 1 또는 2 단위 첨가하여 단계 (b)에서 수득된 추출물의 pH를 감소시키는 단계,
d. 단계 (c)의 생성물을 마이크로필터를 통해 적어도 1회 통과시키고 한외필터 상에 상기 생성물을 유지시켜 정제된 가용성 추출물을 수득하는 단계,
e. 단계 (b)에서 사용된 유기산 또는 이들의 조합물을 첨가하여 약 7(+/- 1.0)의 최종 pH로 조정하는 단계, 및
f. 약학적으로 허용되는 부형제 또는 비히클을 첨가하는 단계.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 상기 박테리아 추출물은 모라셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 및/또는 스트렙토코커스 생귀니스(Streptococcus sanguinis)로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 종으로부터 수득된다. 바람직하게는, 이러한 양태에 따른 박테리아 추출물은 상기도의 8종의 박테리아 병원체, 즉, 1세대 OM 박테리아 추출물 약물과 유사하게 모라셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 및 스트렙토코커스 생귀니스(Streptococcus sanguinis)로부터 유도된다.
본 발명의 제2 양태에 따르면, 상기 박테리아 추출물은 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 균주, 예컨대, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 카제이 디펜시스(Lactobacillus casei defensis), 락토바실러스 카제이 속 카제이(Lactobacillus casei ssp. casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 및 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii)로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 종으로부터 수득된다.
본 발명의 제3 양태에 따르면, 상기 박테리아 추출물은 국제 공개 WO2008/109667호에 기술된 바와 같은 하나 이상의 대장균(Escherichia coli) 박테리아 균주로부터 수득된다.
상기 세포용해는 60℃의 온도에서 40시간 내지 10일 동안 수행될 수 있다. 또한, 상기 공정에 사용될 수 있는 마이크로필터는 0.45 마이크론이고 한외필터는 30 KDa이다. 또한, 상기 공정의 부분 (c)는 접선 유동 여과를 포함하며, 여기서 상기 접선 유동 여과는 5 내지 15 사이클 동안 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 공정에 의해 수득 가능한 박테리아 추출물 제형 생성물 및/또는 약학 조성물에 관한 것이다.
실시예
실시예 1: 알칼리성 추출물을 안정화하는 공정
실시예 1.1: 안정한 박테리아 추출물(OM314A)의 제조를 위한 유기산의 첨가 알칼리성 OM314A 박테리아 추출물을 pH 5.0으로 산성화하는데 필요한 산의 양과 pH 7.0으로 조정하기 위한 NaOH 1N의 양의 사전 측정을 먼저 수행하였다.
25 mL의 OM314A 알칼리성 농축물을 50 mL의 팔콘 튜브에 도입하였다. 측정된 천연 pH는 일반적으로 약 pH 10.5이다. 천연 pH의 측정 후, 작은 자기 교반기를 튜브에 넣고 600 rpm에서 교반을 시작하였다. 각각의 선택된 유기산의 필요한 양은 pH 5.0(5.0±0.2)에 도달할 때까지 소량으로 단계적으로 도입하였다. 각각의 선택된 유기산의 부피 및 중량을 기록하였다. 이어서 산성 추출물을 5000g에서 5분 원심분리하고 상청액을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 이어서 안정화된 박테리아 추출물의 pH를 NaOH 1N을 사용하여 pH 7.0±0.2로 조정하고 사용된 NaOH 1N의 부피를 기록하였다.
두 번째 제조 시리즈에서, 35 mL의 OM314A 알칼리성 농축물을 pH 5.0(5.0±0.2)에 도달할 때까지 각각의 선택된 유기산의 필요한 양을 소량씩 단계적으로 첨가하여 pH 10.5에서 pH 5.0(5.0±0.2)으로 조정하였다. 산의 부피 및 중량을 기록하였다. 이어서 산성 추출물을 5000g에서 5분 원심분리하고 상청액을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 이어서 안정화된 박테리아 추출물의 pH를 NaOH 1N을 사용하여 pH 7.5±0.2로 조정하고 사용된 NaOH 1N의 부피를 기록하였다. 안정화된 박테리아 추출물의 멸균 샘플을 제조하기 위해 멸균 층류 캐비넷에서 유사한 절차를 수행하였다.
25 mL 또는 35 mL의 알칼리성 OM314A 박테리아 추출물 농축물을 50 mL의 팔콘 튜브에 도입하였다. 각각의 산은 미리 결정된 부피를 기준으로 첨가하거나 사전 측정에서 결정된 바와 같이 칭량하여 첨가하였다. 산성화를 초기 pH 5.0으로 수행하였으나 침전물이 형성되었다. 두 번째 단계에서 pH를 각각 7.0±0.2 및 7.5±0.2로 조정하였다. 유기산을 사용하여 pH 5로 조정하고 각각 pH 7.0 및 7.5로 추가 조정한 일부 용액은 실온에서 관찰한 기간 내내 투명하고 안정적으로 유지되었지만 4 내지 8℃에서는 저장 몇 주 후 침전물이 형성되지 않았다.
다음의 표 1은 OM314A 박테리아 추출물의 35 mL 용액에 대해 pH를 7.5로 조정하는데 사용되는 유기산 및 부피를 요약한 것이다.
산 액체 [순도 %] 고체 [순도 %] pH를 7.5로 조정하기 위해 첨가된 부피/중량 혼탁도 20℃ 내지 25℃에서의 안정성 4℃ 내지 8℃에서의 안정성
HCl (산 대조군) 액체, 25% 120 ㎕ 높음 안정하지 않음, 침전물 안정하지 않음, 침전물
포름산 액체, 98-100% 30 ㎕ 약간 혼탁 안정하지 않음, 침전물 안정하지 않음, 침전물
프로피온산 액체, 99% 70 ㎕ 약간 혼탁 상대적으로 안정함, 매우 소량의 침전물 상대적으로 안정함, 매우 소량의 침전물
아스파르트산 Solid > 98% 118 mg 맑은 용액 상대적으로 안정함, 매우 소량의 침전물 상대적으로 안정함, 매우 소량의 침전물
락트산 액체, 90% 120 ㎕ 약간 혼탁 상대적으로 안정함, 매우 소량의 침전물 상대적으로 안정함, 매우 소량의 침전물
3-히드록시- 프로판산 액체, 수용액으로서 30% 250 ㎕ 약간 혼탁 상대적으로 안정함, 매우 소량의 침전물 상대적으로 안정함, 매우 소량의 침전물
부타논산 액체, 99% 70 ㎕ 약간 혼탁 상대적으로 안정함, 매우 소량의 침전물 상대적으로 안정함, 매우 소량의 침전물
글루탐산 고체 150 mg 약간 혼탁 상대적으로 안정함, 소량의 침전물 상대적으로 안정함, 소량의 침전물
실시예 1.2. 무기 양이온 제거
실시예 7.1에서 전술된 바와 같이 유기산 안정화된 OM314A 추출물에 존재하는 무기 2가 양이온을 제거하기 위해, 25 mg의 암모늄 옥살레이트(1 mg/mL)를 첨가하였다. 강한 유백광(opalescence)과 함께 침전물이 형성되었다. 상기 침전물을 5000g에서 5분 동안 원심분리하고 맑은 상청액을 0.2 ㎛ 필터에 여과하였다. 맑은 샘플을 NaOH 1N을 사용하여 pH 7.0±0.1로 조정하였다. 공정의 어려움은 원심분리가 필요한 규모 확장(scaling-up)이다. 또한, 옥살레이트는 비강 내 또는 경구 주변 제형에 적합하지 않을 수 있다.
실시예 1.3. 유기산 안정화된 박테리아 추출물의 저분자 및 무기 염의 동시 제거 및 고분자 분획의 농축
pH 10.0 내지 11.0 사이의 알칼리성 박테리아 추출물을 정제 장치에 첨가하였으며, 4개의 용기, 2개의 펌프, 2개의 필터, 2개의 막전위 압력(TMP1 및 TMP2 압력 조절 밸브) 및 4개의 회전식 밸브 사이의 연결이 있는 다이어그램을 나타내는 도 2에 개략화되어 있다. 막전위 압력(TMP): 필터 막의 공급물에서 여과액 측으로 평균 가해진 압력. TMP [bar] = [(잔류물의 압력 + 여과액의 압력)/2] - 여과액의 압력. TMP1 및 TMP2 밸브는 필터의 여과액 측에서 압력을 생성하고 이는 막전위 압력(TMP)을 적절한 압력 값으로 조절한다.
정밀여과: 본 필터는 통상적으로 이러한 설정에서 0.45 내지 0.2 ㎛를 사용하여 입자를 제거하고 필터 공극을 통해 가용성(비-미립자) 물질을 통과시킨다.
한외여과 또는 나노여과: 이들 필터는 컷-오프 범위가 있는 매우 작은 구멍이 있다(컷-오프 값: 달톤 단위의 분자량으로 표현된 기공 크기(1 Da = 1 질량 단위, 1 kDa = 1000 질량 단위). 10 kDa 필터는 10 kDa 초과의 기공 또는 분자보다 더 큰 물질을 보유한다.
(http://www.merckmillipore.com/CH/de/ps-learning-centers/ultrafiltration-learning- center/optimization-process-simulation/d_eb.qB.ZWQAAAFAUV8ENHoL,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.***. com%2F#tmp 참조).
실시예 1.4: 본 발명에 따른 포매된 유기산을 함유하는 안정화된 박테리아 추출물로 이어지는 5-단계 공정의 예(도 2)
단계 1: 박테리아 세포 벽, 세포 벽 단편 및 가용성 물질을 함유하는 알칼리성 박테리아 추출물(pH 10 내지 11)을 펌프 1 및 정밀여과 0.45 ㎛ 필터가 장착된 용기 2(도 2)에 첨가하고 0.45 ㎛ 투과물을 용기 3에 연결하였다(도 2). 용기 3을 펌프 2(도 2)와 한외여과 10 KD(kDalton) 나노필터에 연결하여 10 KD 투과물을 용기 2로 다시 보냈다. 작은 분자와 희석된 소듐 히드록시드를 함유하는 투과물을 박테리아 추출물 활성 수용성 성분의 용기 2(도 2)에서 연속 추출에 사용하였다.
용기 2에서 박테리아 추출물의 초기 부피의 절반을 미세여과하고 0.45 ㎛ 투과물을 용기 3 내로 통과시켰다.
단계 2: 이어서 두 번째 여과 장치를 켜고(펌프 2) 5개의 용기 3으로부터 나온 10 kDa 투과물을 밸브 3을 사용하여 용기 2로 되돌렸다. 용기 2에 존재하는 조 박테리아 추출물의 박테리아 가용성 성분의 연속 추출을 총 10개의 초기 부피의 박테리아 추출물에 대해 10 KD 투과물을 추출에 사용하여 수행하였다.
단계 3: 본 단계는 용기 3에 존재하는 저분자량 성분을 제거하기 위해 수행하였으며, 정용여과 공정은 용기 1을 펌프 1에 연결하고 TMP1 조절을 미세조정하여 용기 2의 부피를 일정한 수준으로 유지시킴으로써 개시하였다. 용기 1은 정용여과 배지로서 소듐 히드록시드를 사용하여 pH 10.8 내지 11.0으로 조정된 물을 함유하였다. 정용여과 공정 동안, 용기 3의 한외여과 투과물을 밸브 3 및 최적의 유속으로 조정된 TMP2를 사용하여 폐기물에 연결시켰다. 용기 3의 정제된 박테리아 추출물에 존재하는 바람직하지 않은 작은 분자량 성분을 제거하기 위해 총 5개 부피의 정용여과 배지가 필요하였다.
단계 4: 용기 1과 펌프 1을 분리한 후 용기 3에 존재하는 정제된 추출물의 농축 단계를 수행하였다. 용기 3의 정제된 추출물 분획을 밸브 3을 통해 폐기물로 가는 투과물과 함께 초기 부피의 절반으로 농축하였다.
단계 5: 포매된 유기산 염을 형성하기 위해 유기산을 첨가하여 농축된 정제된 박테리아 분획을 안정화시켰다. 이러한 공정을 펌프 2와 밸브 2를 닫은 후에 수행하였다. 순수한 액체 유기산 또는 고체 유기산 각각에 대해 미리 정해진 부피를 밸브 4를 통해 용기 4에서 용기 3으로 첨가하여 7.5±0.2의 값에 도달하였다. pH 조정을 위해, 유기산을 첨가하는 동안 프로펠러를 켜고 용기 3에 장착된 pH 전극을 통해 pH를 조정하였다.
단계 6: pH 7.5에서 유기산 염의 형태의 농축된 정제된 박테리아 분획을 함유하는 용기 3을 멸균된 용기 5(멸균 백 또는 열 멸균된 스테인리스 강 용기)에 연결된 멸균 라인에 장착된 멸균 0.2 ㎛ 필터 장치를 사용하여 인라인으로 멸균하였다.
액상 제형의 최종 사용 및 경로(비강 내, 에어로졸 또는 고체로서 흡입)에 따라 펌프 2 및 밸브 3을 통해 폐기물에 연결된 한외여과를 사용하여 추가 농축을 적용하여, 초기 부피의 25%에 도달하였다. 유기산 염의 존재는 분무 건조 공정, 액적 및 에어로졸로서 직접 사용을 가능케 하는 고농축 정제된 분획의 달성을 가능케 하였다.
유사한 pH(7.5±0.5)를 가진 생성물을 포매된 염을 형성하는 상이한 유기산으로 수득하였다.
각각 3 kD, 10 kD, 30 kD, 100 kD, 300 kD 폴리설폰 접선 유동 필터 및 대안적인 접선 유동 필터 설계로서 10 kD, 30 kD, 100 kD, 300 kD 컷-오프를 사용하는 중공 섬유를 사용하여 동일한 공정을 반복하였다.
공정은 처음에 농축 단계(2배에서 500 mL에 도달하고 최대 5배 농축에서 200 mL 부피에 도달함)를 사용하여 1 L 실험실 규모에서 수행하였으며, pH 10.5 내지 pH 11.0에서 NaOH-물 용액을 사용하여 정용여과 단계에 의해 원치 않는 소분자를 세척하고 한외여과의 원하는 잔류물을 추가로 2배 더 농축하였다. 이어서 제제를 안정화시키기 위해 유기산을 첨가하여 pH 7.5±0.5에서 추출물에 존재하는 양으로 하전된 기를 가진 염을 형성하였다. 유사하게, 각각의 한외여과 필터의 각각 3 kD, 10 kD, 30 kD, 100 kD, 300 kD, 1000 kD인, 상이한 컷-오프를 사용하여 저분자 분획을 제거하는 한외여과 필터 상에서 농축 단계를 사용하여 고분자 분획의 농축을 수행하였다.
아래 표에 열거된 유기산은 7.5±0.5의 목표 pH 값으로 추가하였다. 박테리아 추출물의 양으로 하전된 가용성 고분자 분획의 포매된 유기산 염을 공정 동안 고분자 분획 내에 유지시켰다.
10 kD 컷-오프를 사용하여 파일럿 및 산업용 배치 크기를 제조하기 위해 10 L, 100 L 및 마지막으로 400 L에서 유사한 절차를 수행하였다.
바람직하게는, 저분자량 염 및 분자는 박테리아 추출물의 항바이러스 특성을 향상시키는 농축된 고분자량 분획을 유도하는 한외여과에 의해 제거될 수 있다. pH 10.8의 500 mL 박테리아 추출물을 10 kDa 폴리설폰 한외여과 필터가 장착된 실험실-규모 한외여과 시스템 상에 첨가하였다. 500 mL의 초기 부피를 약 120 내지 140 mL로 4배 농축한 후, pH 11±0.2의 NaOH-물을 사용하는 정용여과를 적용하였다. 5 부피의 정용여과 후, 잔류물을 100 mL로 농축하고 10 mL 분취량에 상이한 유기산을 첨가하기 전에 물로 최종 부피를 125 mL로 조정하였다.
본 공정을 상이한 박테리아 추출물 예컨대 OM 알칼리성 추출물 정제된 분획, 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 락토바실러스(Lactobacillus)의 알칼리성 추출물의 그람 양성 박테리아 정제된 분획 및 대장균(Escherichia coli), 클렙시엘라(Klebsiella), 브라나멜라(Branhamella), 헤모필러스(Hemophilus) 균주의 알칼리성 추출물의 그람 음성 박테리아 정제된 분획으로 적용하였다. 하기 표 2는 pH 7.5로 조정하는데 사용된 유기산을 요약한 것이다. 저분자 성분의 제거 후 박테리아 알칼리성 추출물 정제된 분획을 다음의 유기산을 사용하여 pH 7.5로 조정하고 이들의 안정성을 평가하였다.
산/유기산 혼탁도 20℃ 내지 25℃에서의 안정성 4℃ 내지 8℃에서의 안정성
포름산 약간 혼탁 불안정, 혼탁, 침전물 불안정, 혼탁, 침전물
프로판산 약간 혼탁 안정, 맑은 용액, 침전물 없음 안정, 맑은 용액, 침전물 없음
락트산 약간 혼탁 안정, 맑은 용액, 침전물 없음 안정, 맑은 용액, 침전물 없음
3-히드록시-프로판산 약간 혼탁 안정, 맑은 용액, 침전물 없음 안정, 맑은 용액, 침전물 없음
부타논산 맑은 용액 안정, 맑은 용액, 침전물 없음 안정, 맑은 용액, 침전물 없음
2-히드록시부타논산 맑은 용액 안정, 맑은 용액, 침전물 없음 안정, 맑은 용액, 침전물 없음
3-히드록시부타논산 맑은 용액 안정, 맑은 용액, 침전물 없음 안정, 맑은 용액, 침전물 없음
아스파르트산 맑은 용액 안정, 맑은 용액, 침전물 없음 안정, 맑은 용액, 침전물 없음
글루탐산 맑은 용액 안정, 맑은 용액, 침전물 없음 안정, 맑은 용액, 침전물 없음
실시예 1.5: 락토바실러스 퍼멘텀( Lactobacillus fermentum )(OM314B)의 유기산 안정화된 박테리아 추출물의 소분자 및 무기 염의 동시 제거 및 고분자 분획의 농축.
pH 10.5±0.3의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)의 1 L 부피의 알칼리성 박테리아 추출물을 0.45 ㎛ 마이크로필터 및 10 k달톤 컷 오프를 가진 제2 한외여과 필터가 있는 한외여과 시스템에 첨가하였다. 실시예 7.3 및 도 1에 기술된 바와 같이 두 필터 모두를 사용하여 박테리아 추출물을 정제하였다. 첫 번째 단계는 농축 단계 후 추출 매질로서 10 부피의 투과물 10 kD를 사용하는 연속 추출이었다.
이어서 pH 10으로 조정된 물에서 5 부피의 NaOH 용액을 사용하여 정용여과 공정을 수행하였다.
포매된 염을 형성하는 상이한 유기산을 첨가하기 전에 최종 4배 농축 단계를 추가하였다.
공정은 먼저 농축 단계(5배, 대략 200 mL까지 감소)를 사용하여 1 L 규모에서 수행하였으며, 원치 않는 소분자를 pH 10.5의 NaOH-물 용액 5 부피를 사용하여 정용여과 단계로 세척하였다. 이어서 제제를 안정화시키기 위해 하기 표 3에 열거된 유기산을 첨가하여 추출물에 존재하는 양으로 하전된 기를 가진 염을 형성하였다. 유사하게, 각각의 폴리설폰 필터의 각각 3 kD, 10 kD, 30 kD, 100 kD, 300 kD인, 상이한 컷-오프를 사용하여 저분자 분획을 제거하는 한외여과 필터 상에서 농축 단계를 사용하여 고분자 분획의 농축을 수행하였다.
하기 표에 열거된 유기산을 첨가하여 7.5±0.2의 목표 pH 값으로 추가하였다. 박테리아 추출물의 양으로 하전된 가용성 고분자 분획의 포매된 유기산 염을 공정 동안 고분자 분획 내에 유지시켰다.
다른 실시예에서 다음의 각각 3 kD, 30 kD, 100 kD, 300 kD인 폴리설폰 한외여과 필터 컷-오프를 사용하여 상기 공정을 반복하였다.
또 다른 실시예에서, 한외여과에 의해 저분자량 염 및 분자의 제거를 수행하여 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 추출물의 항바이러스 특성을 향상시키는 고분자량 분획을 농축하였다. pH 10.8의 500 mL의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 알칼리성 추출물을 10 k달톤 폴리설폰 한외여과 필터가 장착된 실험실 규모의 한외여과 시스템에 첨가하였다. 500 mL의 초기 부피를 약 120 내지 140 mL로 4배 농축한 후, pH 10.8 내지 11.0의 NaOH-물을 사용하는 정용여과를 적용하였다. 5 부피의 정용여과 후, 고분자 분획(잔류물)을 100 mL로 농축하고 10 mL 분취량에 상이한 유기산을 첨가하기 전에 물로 최종 부피를 125 mL로 조정하여 물리적 안정성 및 항바이러스 활성을 평가하였다.
하기 표 3은 > 10 k달톤의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 추출물 분획에 대해 pH를 7.5로 조정하는데 사용된 유기산을 열거한다.
산 / 유기산 혼탁도 20℃ 내지 25℃에서의 안정성 4℃ 내지 8℃에서의 안정성
포름산 약간 혼탁 불안정, 혼탁, 침전물 불안정, 혼탁, 침전물
프로판산 약간 혼탁 안정한, 맑은 용액, 침전물 없음 안정한, 맑은 용액, 침전물 없음
락트산 약간 혼탁 안정한, 맑은 용액, 침전물 없음 안정한, 맑은 용액, 침전물 없음
3-히드록시-프로판산 약간 혼탁 안정한, 맑은 용액, 침전물 없음 안정한, 맑은 용액, 침전물 없음
부타논산 맑은 용액 안정한, 맑은 용액, 침전물 없음 안정한, 맑은 용액, 침전물 없음
2-히드록시부타논산 맑은 용액 안정한, 맑은 용액, 침전물 없음 안정한, 맑은 용액, 침전물 없음
3-히드록시부타논산 맑은 용액 안정한, 맑은 용액, 침전물 없음 안정한, 맑은 용액, 침전물 없음
아스파르트산 맑은 용액 안정한, 맑은 용액, 침전물 없음 안정한, 맑은 용액, 침전물 없음
글루탐산 맑은 용액 안정한, 맑은 용액, 침전물 없음 안정한, 맑은 용액, 침전물 없음
다른 실시예에서, 보다 우수한 유속 및 더 짧은 공정 시간을 가진 접선 유동 필터 설계에 대한 대안으로서 정밀여과 중공 섬유 0.45 ㎛ 및 0.2 ㎛와 30 kD 및 100 kD 컷-오프가 있는 한외여과 중공 섬유를 사용하여 상기 공정을 반복하였다.
10 kD 컷-오프를 사용하여 파일럿 및 산업용 배치 크기를 제조하기 위해 10 L, 100 L 및 마지막으로 400 L에서 유사한 절차를 수행하였다.
실시예 1.6: 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) I 3929p(OM314B)에 대한 공정 및 분석적 특성분석
실시예 1.6.1 공정 4 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) I 3929p
세포용해: 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacilus fermentum) I 3929p 바이오매스를 실온에서 밤새 해동시켰다. 수행된 세포용해를 세포용해 kg 당 건조(dessication) 시 총 건조 중량(RS) 25 g을 포함하여 2 kg의 총 질량을 가진 세포용해를 하였다. 필요한 양의 바이오매스(바이오매스 RS 결과에 따라 다름)를 2500 mL 미니-캐스크(참조: Semadeni n°6863)에 넣고 40℃±5℃로 예열된 정제수로 2 kg qsp로 제조하였다. 이어서 NaOH 10 N(pH: NaOH 10 N의 2.8 mL로 조정된 9.98)을 사용하여 상기 용액의 pH를 10.0±0.1로 조정하였다.
알칼리성 세포용해를 교반 하에(생성 볼텍스가 1 cm가 되도록) 40 ℃±1 ℃의 따뜻한 방으로 옮겼다. 세포용해 4시간 00±5분 후, pH를 조절하였다(최종 세포용해 pH: 9.28).
세포용해 종료 시 세포용해물에 해당하는 샘플("공정 4-E1-세포용해물"로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
여과 1: 생성물 여과를 위한 설비를 다이어그램(도 2)에 따라 준비하였다. 여과 시스템은 2개의 여과 루프로 구성된다. 탱크(도 2의 용기 2), 펌프(도 2의 펌프 1) 및 0.45 ㎛의 컷-오프 지점이 있는 여과 시스템(도 2의 마이크로-필터)으로 구성된 첫 번째 정밀여과(MF로 지칭됨). 제2 루프, 한외여과(UF로 지칭됨)는 탱크(도 2의 용기 3), 펌프(도 2의 펌프 2) 및 30 kDa의 컷-오프 지점을 가진 여과 시스템(도 2의 한외여과 필터)으로 이루어져 있다. 여과를 2000 mL의 구현 부피로 실험실 규모에서 수행하였다.
공정을 시작하기 전에, 여러 배치에 대한 재현성에 대해 여과 시스템을 점검하였다. 생성물의 정확한 여과성을 검증하기 위해, 정규화된 수 투과성(NWP: Normalized Water Permeability)을 여과 시스템에서 수행하였다.
생산에 사용된 세포용해물을 1 cm의 생성물 볼텍스를 갖도록 교반하였다. 여과 공정이 시작되기를 기다리면서 생성물의 온도를 실온으로 냉각시켰다. 본 과정에서 초기 pH 조정이 없었으므로, 상기 여과 공정을 즉시 시작하였다.
초기 농축 단계: 여과의 첫 번째 단계에 대해 사용된 생성물은 다음의 파라미터를 가졌다: 세포용해 후 pH 조정 없음(pH: 9.28), 온도 38 ℃, 1 cm의 생성물 볼텍스를 갖도록 교반.
MF 루프 펌프(도 2의 펌프 1)를 생성물로 시스템을 충전하기 위한 공정 속도의 40%에서 시작하였다. 상기 단계가 완료되면, MF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
유속과 압력이 안정할 때, 여과 시스템을 조건화된 것으로 간주하였다. 이어서, MF 루프의 투과물 밸브를 열어 농축 계수 0.5(압력 입력: 270 mbar, 투과물 유속: 75 mL/분)로 생성물의 초기 농축을 수행하였다. 초기 농축 동안, 펌프(도 2의 펌프 1) 속도를 공정 속도의 100%(600 mL/분에 해당하는 100 rpm)로 점진적으로 증가시켰다.
상기 단계와 병행하여, UF 루프를 조건화하였다. UF 루프 펌프(도 2의 펌프 2)를 생성물로 시스템을 충전하기 위한 공정 속도의 40%에서 시작하였다. 상기 단계가 완료되면, UF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
정용여과: 1/2(0.5x) 농축 계수에 도달했을 때, UF 투과물을 열어 생성물의 정용여과를 시작하였다(압력 입력: 793 mbar, 투과물 유속: 53 mL/분). 최적의 생성물 추출을 위해, 도 2의 밸브 1에 의해 제어되는 MF TMP(Trans Membrane Pressure: 막전위 압력)를 850 mbar에서 설정해야 한다(압력 입력: 1060 mbar, 투과물 유속: 47 mL/분).
정용여과 동안, UF 펌프(도 2의 펌프 2)의 속도를 투과물 흐름 MF와 동일한 UF 투과물 흐름에 도달하도록 설정하였다. 실제로, MF 탱크(도 2의 용기 2)의 부피는 정용여과 단계 동안 가능한 안정적으로 유지되어야 했다.
정용여과를 사이클로 수행하였다. 초기 농축 말기에, MF 탱크(도 2의 용기 2)에 부피가 존재하였다. 이 부피가 MF 여과 시스템을 통과하면, 1 사이클이 실현되었다. 이러한 공정에서, 정용여과는 5 사이클이 필요했다.
최종 농축: 5회의 정용여과-사이클 말기에, UF 펌프를 정지시켰다. MF 입력 압력이 증가하기 시작하면, MF 펌프를 정지시켰다. 이러한 첫 번째 여과 단계 말기에, 관심 생성물에는 0.45 ㎛보다 작은 크기의 원소가 포함되어 있었다.
여과 2: 이어서 수확한 관심 생성물(질량: 996.0 g)에 30 kDa 컷-오프가 있는 UF 루프 상(도 2의 용기 3, 펌프 2 및 한외여과 필터)에서 5 사이클의 정제의 제2 단계를 수행하였다. 30 kDa 투과물을 밸브를 열어 폐기물로 폐기하였다(도 2). 정용여과를 위해 pH 10.0에서 NaOH 0.001 N 용액을 첨가함으로써 30 kDa 잔류물의 부피를 정제의 두 번째 여과 단계 동안 일정하게 유지시켰다. UF 루프 펌프(도 2의 펌프 2)를 생성물로 시스템을 충전하기 위해 공정 속도의 40%에서 시작하였다.
상기 단계가 완료되면, UF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
여과 시스템을 조건화 하면, UF 투과물을 열어 생성물의 여과 2를 시작하였다(압력 입력: 640 mbar, 투과물 유속: 108 mL/분). 최적의 생성물 추출을 위해, 도 2의 밸브 2 및 3에 의해 제어되는 MF TMP(Trans Membrane Pressure: 막전위 압력)를 850 mbar에서 설정해야 한다(압력 입력: 900 mbar, 투과물 유속: 134 mL/분).
여과 2 단계 동안, UF 탱크(도 2의 용기 3)의 부피는 가능한 안정적으로 유지되어야 했다. 따라서, UF 탱크(도 2의 용기 3)의 수위가 감소함에 따라, NaOH 0.001 M 용액을 첨가하였다. 첨가된 NaOH 0.001M 정용여과 용액의 부피에 해당하는 5 사이클은 수확된 관심 생성물의 부피의 5배와 동등하다(정용여과의 5 사이클).
여과 2 단계 말기에, 최종 생성물을 수확하고(질량: 951.4 g), 2등분으로 분리하였다. 상기 두 번째 여과 단계 말기에, 관심 생성물은 크기가 0.45 ㎛보다 작고 30 kDa보다 큰 원소를 함유하였다.
중화 전 여과액에 해당하는 샘플("공정 4-E2-여과액"으로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
이어서 여과액의 첫 번째 부분을 1% 프로피온산으로 pH 7.0±0.2(pH: 1% 프로피온산 0.5 mL로 조정된 7.13)으로 중화한 다음, 0.2 ㎛ 폴리에터설폰(PES 0.2 ㎛) 멸균 막으로 여과를 사용하여 생물안전성 캐비넷 하에서 멸균하였다.
상기 공정 말기의 중화된 여과액에 해당하는 샘플("공정 4-E3-중화된 여과액(프로피온산)" OM314B로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
동시에, 여과액의 두 번째 부분을 9등분으로 세분하였다. 이어서 이들 부분 각각을 염산 2.5 %(pH: 7.07)으로 또는 유기산(OM314B): 포름산 1/100(pH: 7.16), 아세트산 1/100(pH: 7.16), 3-히드록시-부타논산 1/100(pH: 7.14), 아스파르트산 0.1 %(pH: 7.18), 락트산 1/50(pH: 7.09), 글루탐산 0.1 %(pH: 7.14), 피루브산 1/100(pH: 7.16), 아스코르브산 0.1 %(pH: 7.18))으로 7.0±0.2로 중화하였다.
마지막으로, PES 0.2 ㎛ 멸균 막으로 여과를 사용하여 생물안전성 캐비넷 하에서 상이한 생성물을 멸균하였다.
본 공정 말기에 상이한 중화된 여과액에 해당하는 샘플("공정 4-E4-중화된 여과액(산 명칭)"으로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
샘플 코드 요약
세포용해물 공정 4-E1-세포용해물
여과액 공정 4-E2-여과액
표준 중화된 여과액 공정 4-E3-중화된 여과액 (프로피온산)
산 1 중화된 여과액 공정 4-E4-중화된 여과액 (염산)
산 2 중화된 여과액 공정 4-E4-중화된 여과액 (포름산)
산 3 중화된 여과액 공정 4-E4-중화된 여과액 (아세트산)
산 4 중화된 여과액 공정 4-E4-중화된 여과액 (3-히드록시-부타논산)
산 5 중화된 여과액 공정 4-E4-중화된 여과액 (아스파르트산)
산 6 중화된 여과액 공정 4-E4-중화된 여과액 (락트산)
산 7 중화된 여과액 공정 4-E4-중화된 여과액 (글루탐산)
산 8 중화된 여과액 공정 4-E4-중화된 여과액 (피루브산)
산 9 중화된 여과액 공정 4-E4-중화된 여과액 (아스코르브산)
실시예 1.6.2 분석적 특성분석 방법
a) 건조 중량 방법(세포용해물)
세포용해물의 건조 잔류물의 측정을 열중량 측정 원리에 따라 할로겐 건조에 의해 이루어졌다: 측정 작업을 시작할 때, 샘플의 중량을 정의한 다음, 샘플을 통합된 할로겐 히터로 신속하게 가열하고 습기를 증발시켰다. 건조하는 동안, 장치는 샘플을 연속적인 방식으로 칭량하였다. 건조를 끝내면, 건조 잔류물의 중량을 표시하였다.
세포용해물(M) 약 2 내지 5 g을 정확하게 칭량하였다. 다음의 파라미터를 사용하였다: 가열 모드: 점진적(progressive); 정지 모드: 일정한 중량; 최종 온도: 105℃. 분석을 끝내면, 수득된 잔류물의 최종 질량(m)을 나타내는 칭량 티켓이 자동으로 인쇄된다. 건조 잔류물(mg/g으로 표시됨) = (m/M) × 1,000. 측정은 샘플 상에서 직접적으로 5,000 × g에서 5분 원심분리 후(상청액) 수행하였다.
b) 건조 중량 방법(여과액)
여과액의 건조 중량을 105℃(오븐)에서 16시간 동안 건조된 약 5 g의 여과액을 사용하여 Ph. Eur. 2.2.32에 따라 수행하였다. 결과를 mg/g로 표현하였다.
c) Lowry 방법
본 분석은 알칼리성 구리 타르트레이트 용액 및 Folin 시약(Ph. Eur. 2.5.33 기준)과 단백질의 반응에 기초한다. 비색 반응으로 이어지는 2개의 단계가 존재한다: 알칼리성 매질에서 단백질과 구리 사이의 반응, 그리고 구리-처리된 단백질에 의한 Folin 시약의 후속 환원. 단백질은 750 nm에서 최대 흡광도를 갖는 특징적인 청색을 갖는 환원된 종을 생성하는 Folin 시약의 환원에 영향을 미쳤다. 결과는 소 혈청 알부민 단백질(BSA) 표준 곡선에 대해 상대적으로 표현하였다.
샘플 제조: 1.9 mL의 인산염 완충액 pH 11(1 L 물에 대해 3.55 g의 Na2HPO4 및 41 mL의 0.1 M NaOH)을 100 μL의 각 샘플에 첨가하고 볼텍싱하였다. BSA 표준 제조: BSA 용액을 인산염 완충액으로 희석하여 0 내지 420 ㎍/mL 사이의 6개 지점을 갖는 표준 곡선을 준비하였다. 절차: 20 μL의 샘플 및 표준 용액을 96웰 마이크로플레이트에 로딩하였다. 25 μL의 A 시약(Bio-Rad® Lowry 키트)를 각 웰에 즉시 첨가하고 실온에서 10분 인큐베이션하였다. 200 μL의 B 시약(Bio-Rad® Lowry 키트)을 첨가하고, 혼합하고 실온에서 20분 인큐베이션하였다. 혼합 후 750 nm에서 흡광도를 판독하였다. 결과: 단백질 농도를 표준 곡선으로부터 계산하였다: 단백질 농도(mg/mL) = [(y - b) / a] * 샘플 희석, y=샘플 흡광도; a=보정 곡선 기울기; b=보정 곡선 원점에서의 세로 좌표 및 단백질 mg/mL으로 표현된 결과를 가짐.
d) 총 당(총 sugar) 방법
탄수화물은 황산 매질에서 안트론과 함께 가열될 때 625 nm에서 흡수하는 발색단을 형성한다.
글루코스 표준 제조: D-글루코스를 가용화하고 정제수로 희석하여 0 내지 100(㎍/mL) 사이의 5개 지점을 가진 표준 곡선을 준비하였다. 절차: 0.1 mL의 조사될 용액(즉, 농축액) 및 0.9 mL의 정제수를 빙욕에 놓여진 튜브에 첨가하였다. 5.0 mL의 안트론 시약(85% 황산 100 mL 중의 160 mg의 안트론)을 첨가하고, 격렬하게 진탕하였다. 용액을 끓는 수조에서 15분 동안 가열한 다음, 빙욕에서 15분 동안 냉각시키고, 때때로 진탕하였다. 용액을 실온에서 15분 동안 방치하였다. 튜브를 볼텍싱하고, 용액을 측정 셀로 옮기고 625 nm에서 흡광도를 측정하기 전에 실온에서 30분 동안 방치하였다. 결과: 탄수화물 농도를 표준 곡선으로부터 계산하였다: 탄수화물 함량(mg/mL) = ([(y - b) / a] * 10)/(1,000), y=샘플의 흡광도; a=보정 곡선의 기울기; b=보정 곡선 원점에서의 세로 좌표 및 탄수화물 mg/mL으로 표현된 결과를 가짐.
e) 총 RNA 분석
총 RNA 정제 및 분석을 공급업체의 권장사항에 따라 RNeasy® 미니 키트 데이터 시트에 기초하여 수행하였다. 간단하게, 600 μL 박테리아 추출물을 RNeasy® 스핀 컬럼에 옮기고 8,000 × g에서 15초 동안 원심분리하였다. 이어서, 700 μL 완충액 RW1을 RNeasy® 컬럼에 첨가하고 8,000 × g에서 15초 동안 원심분리하여 스핀 컬럼 막을 세척하였다. 동일한 단계를 500 μL 완충액 RPE로 2회 수행하고 8,000 × g에서 15초 동안 및 8,000 × g에서 2분 동안 연속적으로 원심분리하였다. 완충액 RPE의 임의의 가능한 캐리오버(carryover)를 제거하기 위해, 스핀 컬럼을 최대 속도로 1분 동안 원심분리하였다. RNA를 용리하기 위해, 30 μL의 RNase가 없는 물을 스핀 컬럼 막에 직접 첨가하고 컬럼을 8,000 × g에서 1분 동안 원심분리 하였다. 정제된 총 RNA를 NanoDrop(ThermoFischer) 분광광도계로 260 nm에서 검출하였다.
f) 총 DNA 분석
총 DNA 정제 및 분석을 공급업체의 권장사항에 따라 DNeasy® 혈액 및 조직 키트 데이터 시트에 기초하여 수행하였다. 간단하게, 600 μL 박테리아 추출물을 DNeasy® 미니 스핀 컬럼에 옮기고 6,000 × g에서 1분 동안 원심분리하였다. 이어서, 500 μL 완충액 AW1을 DNeasy® 미니 컬럼에 첨가하고 6,000 × g에서 1분 동안 원심분리하였다. 500 μL 완충액 AW2를 첨가하고 스핀 컬럼을 20,000 × g에서 3분 동안 원심분리하여 DNA 막을 건조시켰다. 100 μL 완충액 AE를 DNeasy® 막에 첨가하고, 1분 동안 인큐베이션하고 6,000 × g에서 1분 동안 원심분리하여 DNA를 용리하였다. 최대 DNA 수율을 위해, 용출을 한번 반복하였다. 정제된 총 DNA를 NanoDrop 분광광도계로 260 nm에서 검출하였다.
g) 리무러스 앰보사이트(Limulus amebocyte) 세포용해물 LAL 분석
내독소 분석을 공급업체의 권장사항에 따라 PierceTM 발색 내독소(Chromogenic Endotoxin) Quant 키트 데이터 시트에 기초하여 수행하였다. 샘플의 고유한 색상이 흡광도 판독값을 변경하지 않도록 모든 샘플을 1:10으로 희석하였다. 간단하게, 내독소 표준 용액(0.1 내지 1.0 EU/mL 범위)을 내독소 저장 용액(10 EU/mL)으로부터 제조하였다. 50 μL 내독소 표준, 블랭크(내독소가 없는 물) 및 샘플을 웰 당 배치하였다. 50 μL 재구성 변형세포 세포용해물 시약(Amebocyte Lysate Reagent)을 첨가하고 플레이트를 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL 발색(Chromogenic) 기질 용액을 웰 당 첨가하고 37℃에서 6분 동안 인큐베이션하였다. 정확히 6분에, 50 μL의 정지 용액(25% 아세트산)을 첨가하였다. 광학 밀도를 분석을 완료한 직후 405 nm에서 측정하였다.
h) 아미노산 방법:
D- 및 L-아미노산 결정을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 수행하였다. 마이크로파 오븐에서 샘플을 가수분해 후, 키랄 티올 N-이소부티릴-L-시스테인과 함께 o-프탈디알레히드를 사용하여 아미노산을 유도체화하였다. 검출은 338 nm에서 UV 검출로 수행하였다(문헌[Bruckner, H., T. Westhauser, H. Godel. Liquid chromatographic determination of D- and L-amino acids by derivatization with 0-phthaldialdehyde and N-isobutyryl-L-cysteine. J. Chromatography A, 1995, 711, 201-21]).
염산(HCl) 0.01 N 중의 2.5 ㎛ol/mL에서 상이한 아미노산 아스파르트산(Asp), 세린(Ser), 글루탐산(Glu), 히스티딘(His), 아르기닌(Arg), 트레오닌(Thr), 알라닌(Ala), 티로신(Tyr), 발린(Val), 메티오닌(Met), 리신(Lys), 이소류신(Ile), 류신(Leu), 페닐알라닌(Phe), 글리신(Gly), 시스틴(Cys)을 사용하여 표준 용액을 제조하였다. 이러한 용액을 pH 9.2에서 0.1 M 소듐 테트라보레이트 데카히드레이트 완충액을 사용하여 이들 용액을 0.5 ㎛ol/mL로 희석하였다. 튜브에, 2.0 mL의 샘플 용액을 2.0 ml의 물, 240 ㎕의 1-도데칸티올 및 8 mL의 HCl 25%에 첨가하였다. 이들을 15분 동안 180℃, 1320 Watt에서 마이크로파 오븐에서 가수분해하였다. 용액을 실온에 방치하고 5 ㎛에서 여과하였다. 50.0 ㎕를 증발 건조시키고 100 ㎕의 HCl 0.01 N로 재구성하였다. 샘플 및 표준 용액을 10℃의 HPLC 시스템에 보관하고 다음의 주입 모드를 사용하여 주입하였다: pH 9.2의 5.0 ㎕의 0.1 M 소듐 테트라보레이트 데카히드레이트 완충액, 2.0 ㎕의 유도체화 용액(1.0 ml 메탄올에 가용화된 23 mg의 프탈디알레히드 및 50 mg의 N-이소부티릴-L-시스테인), 자동샘플러로 2.0 ㎕ 샘플 또는 표준 용액을 취하여, 5회 혼합하고, 주입하였다. HPLC 컬럼은 Supelco LC 18, 5 ㎛, 4.6 × 20 mm 예비-컬럼이 있는, Supelcosil C18, 5 ㎛, 4.6 × 250 mm이다. 용출을 위해, pH 5.9로 조정된 23 mM 소듐 아세테이트(용리액 A) 및 메탄올-아세토니트릴 혼합물(12:1, v/v)(용리액 B)으로부터 구배를 형성하였다. 구배를 45분 내에 4% B에서 33% B로 형성된 다음, 1 ml/분의 유속으로 30분(및 85%까지 헹굼 단계) 동안 56% B로 형성하였다. 유리 아미노산을 또한 HPLC 바이알에서 직접 E2-여과액 용액을 사용하여 HCl 가수분해 단계 없이 각 샘플에 대해 별도로 시험하였으며 가수분해 없이는 유리 아미노산이 검출되지 않았다.
i) 안정성 동안 수득된 분광광도법 결과
중화된 여과액 용액을 실온(20℃ +/- 5℃) 또는 4℃에서 안정하게 두었다. 각 시점에서, 용액의 흡광도를 300 내지 700 nm 사이에서 기록하였다. 스펙트럼 프로파일은 시각적으로 노이즈(예컨대, 도 27 - 용액에서 침전 표시) 또는 부드러움(예컨대, 도 27)로 평가하였다. 흡광도를 정량적 평가를 위해 320 nm에서 추출하였다.
j) 방출 결과:
모든 E2-여과액 용액을 처리 후 동결하였고 분석 전에 4℃에서 밤새 해동시켰다.
실시예 1.6.3. 방출(T0) 시 공정 4 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) I 3929p 최종 샘플의 분석적 특성분석
공정 4 샘플 결과
시험 샘플 결과 단위
건조 중량 (총) 공정 4-E1-세포용해물 27.7 [mg/g]
건조 중량 (상청액) 공정 4-E1-세포용해물 5.5 [mg/g]
건조 중량 (여과액) 공정 4-E2-여과액 1.5 [mg/g]
총 단백질 공정 4-E2-여과액 0.44 [mg/mL]
총 당 공정 4-E2-여과액 0.21 [mg/mL]
내독소 LAL* 공정 4-E3-중화된 여과액 (프로피온산) ND [EU/mL]
DNA** 공정 4-E3-중화된 여과액 (프로피온산) ND [㎍/mL]
RNA*** 공정 4-E3-중화된 여과액 (프로피온산) ND [㎍/mL]
ND = 검출되지 않음; *내독소 LAL: 검출 한계 = 0.1 EU/mL; **DNA: 검출 한계 = 3.60 ㎍/mL, 정량화 한계 = 12.01 ㎍/mL; ***RNA: 검출 한계 = 4.29 ㎍/mL, 정량화 한계 = 14.32 ㎍/mL
공정 4 - 총 아미노산
아미노산 농도
(㎛ol/mL) 		% / AA
(D vs L)
L-Asp 0.00 NA
D-Asp 0.00 NA
L-Glu 0.17 100
D-Glu 0.00 0
L-Ser 0.00 NA
D-Ser 0.00 NA
L-Thr 0.00 0
D-Thr 0.31 100
L-His 0.00 NA
Gly 0.00 NA
D-His 0.00 NA
L-Ala 0.11 NA
L-Arg 0.04 NA
D-Arg + D-Ala 0.00 NA
L-Tyr 0.00 NA
D-Tyr 0.00 NA
L-Val 0.00 NA
L-Met 0.00 NA
D-Met 0.00 NA
L-Cys 0.00 NA
D-Val 0.00 NA
L-Ile 0.00 NA
L-Phe 0.00 NA
D-Phe 0.00 NA
L-Leu 0.32 100
D-Ile 0.00 NA
D-Leu 0.00 0
L-Lys 0.08 100
D-Lys 0.00 0
공정 4 - 흡광도 측정을 통한 용액의 안정성
시점
(개월) 		공정 4
　 		프로피온산 염산 아스파르트산 포름산 락트산 3-히드록시-부타논산 아스코르브산 아세트산 피루브산 글루탐산 HCL 산업용 배치
1619064
T0 Abs [AU] 0.837 0.833 0.809 0.841 0.846 0.835 0.815 0.84 0.844 0.794 2.865
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
T1 4℃ Abs [AU] 0.852 0.847 0.829 0.857 0.857 0.851 0.836 0.869 0.866 0.807 3.17
R (%) 102% 102% 102% 102% 101% 102% 103% 103% 103% 102% 111%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
RT Abs [AU] 0.821 0.848 0.793 0.84 0.82 0.833 0.811 0.821 0.839 0.796 3.17
R (%) 98% 102% 98% 100% 97% 100% 100% 98% 99% 100% 111%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
T3 4℃ Abs [AU] 0.838 0.844 0.817 0.832 0.862 0.84 0.835 0.851 0.86 0.803 3.148
R (%) 100% 101% 101% 99% 102% 101% 102% 101% 102% 101% 110%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
RT Abs [AU] 0.816 0.853 0.808 0.848 0.823 0.85 0.823 0.825 0.851 0.806 3.159
R (%) 97% 102% 100% 101% 97% 102% 101% 98% 101% 102% 110%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
T6 4℃ Abs [AU] 0.884 0.866 0.804 0.837 0.834 0.819 0.816 0.839 0.836 0.778 3.046
R (%) 106% 104% 99% 100% 99% 98% 100% 100% 99% 98% 106%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
RT Abs [AU] 0.81 0.914 0.837 0.879 0.863 0.878 0.857 0.859 0.906 0.835 2.985
R (%) 97% 110% 103% 105% 102% 105% 105% 102% 107% 105% 104%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
Abs: 320 nm에서의 흡광도; RT: 실온 (20℃ +/- 5℃); 평가: 스펙트럼의 시각적 평가
염산으로 중화된 국제공개 WO 2008/109669호(OM-13-BV)에 기술된 산업용 배치(HCL 산업용 배치 1619064)는 중화 직후 T0에서 이미 시작하는 침전물을 나타냈다.
공정 4 - E4 - 중화된 여과액은 4℃ 또는 실온에서 적어도 6개월 동안 물리적으로 안정하였다. 이들은 이러한 조건 하에서 12개월 동안 안정적인 것으로 간주된다.
안정성 동안 수득된 Mip3-알파(CCL20) 결과:
케모카인(C-C 모티프) 리간드 20(CCL20) 또는 간 활성화 조절된 케모카인(LARC) 또는 대식세포 염증 단백질-3(MIP-3-알파, CCL20)는 CC 케모카인 패밀리에 속하는 작은 사이토카인이다. 이는 림프구에 대해 강하게 화학주성이며 호중구를 약하게 유인한다. CCL20은 림프구와 수지상 세포가 이들 조직을 둘러싸고 있는 상피 세포를 향해 화학주성을 통해 점막 림프 조직의 형성 및 기능에 연관되어 있다. CCL20은 케모카인 수용체 CCR6에 결합하고 활성화함으로써 표적 세포에 대한 효과를 이끌어낸다.
THP-1 세포주를 ATCC 컬렉션, #TIB-202에서 구입하였다. THP-1 세포주는 급성 단핵구 백혈병을 앓는 1세 남성의 말초 혈액으로부터 유래하였다. THP-1 작동 세포 은행(Working Cell Bank)의 바이알을 분화 후 대식세포-유사 세포로서 본 생물분석에서 사용하였다.
중화된 여과액 용액을 실온(20℃ +/- 5℃) 또는 4℃에서 안정하게 두었다. 샘플을 상이한 시점에서 채취하고 추가 생물분석을 위해 동결하였다. 모든 용액(T0 및 안정성 시점)을 분석 전에 4℃에서 밤새 해동시켰다.
분화: THP-1 세포를 세포 현탁액(1 × 106 세포/mL)에서 PMA의 최종 농도가 100 ng/mL이 되도록 Phorbol 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)를 사용하여 분화시켰다. 100.0 μL/웰의 PMA 세포 현탁액을 96웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 분배하였다. 세포를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
자극: 10개 점의 연속 희석(3.16-배 연속 희석)을 딥윌(deepweel) 플레이트에서 배양 배지로 수행하였다: 2 ㎍/mL에서 0.06 ㎍/mL의 PAM3CSK4(MIP-3α 분비에 대한 참조 양성 대조군). 6개 점의 연속 희석(3.16-배 연속 희석)을 딥윌 플레이트에서 배양 배지로 수행하였다: 딥웰의 첫 번째 웰로의 시험 샘플 200 μL + 400 μL 배양 배지, 이어서 190 μL를 410 μL의 배양 배지로 희석하였다(3.16-배). 100 μL/w의 상청액을 세포가 있는 플레이트로부터 제거하였다. 100.0 μL/w의 배양 배지를 세포가 있는 플레이트의 각 웰에 분배하였다. 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
상청액 수확: 각 웰의 75 μL를 수확하고 96 PP 마이크로플레이트에 분배하였다. 플레이트를 밀봉하고 ELISA 분석이 수행될 때까지 초저온 냉동고에 보관하였다. ELISA 시험: 마이크로플레이트 웰을 100.0　μL/웰 항-인간 MIP-3α(포획 항체)로 코팅하였다. 플레이트를 밀봉 호일로 덮고 적절하게 인큐베이션하였다. 인큐베이션을 완료한 후, 세척 단계를 자동화 마이크로플레이트 세척기로 수행하였다. 포화 단계 날에, 상청액 플레이트를 +4℃에서 해동시켰다. 포화 단계: 250.0 μL/웰의 희석 시약을 첨가하고(PBS 중의 1% BSA) 플레이트를 적절하게 인큐베이션하였다. 포화 단계 동안, 상청액 및 표준 MIP-3α에 대한 연속 희석을 제조하였다. 각 ELISA 플레이트에서 표준 곡선을 실행하였다. 인큐베이션을 완료한 후, 세척 단계를 수행하고, 웰에 샘플을 분배하고, 플레이트를 적절하게 인큐베이션하였다. 인큐베이션을 완료한 후, 세척 단계를 수행하고 비오티닐화된 염소 항-인간 MIP-3α(검출 항체 단계)를 분배하였다. 플레이트를 적절하게 인큐베이션하였다. 인큐베이션을 완료한 후, 세척 단계를 수행하고 스트렙타비딘-HRP 접합체를 분배하였다. 플레이트를 적절하게 인큐베이션하였다. 인큐베이션을 완료한 후, 세척 단계를 수행하고, 효소 기질을 첨가하고, 450 nm에서 OD를 판독하였다. ELISA 키트의 공급업체의 권장사항에 따라 540 nm에서 블랭크 감소 및 파장 보정을 수행하였다.
공정 4 - 안정 중 생물분석 결과는 공정 4 - E3 -중화된 여과액이 실온(20℃ +/- 5℃) 또는 4℃에서 적어도 1개월 동안 안정적임을 보여준다.
실시예 1.7 18 E. coli 균주의 폴리-알칼리성 세포용해물 혼합물
실시예 1.7.1. 18 E. coli 균주(OM314C)의 공정 n°5 폴리-알칼리성 세포용해물 혼합물
알칼리성 세포용해: 국제공개 WO2008/109667호에 기술된 E. coli 혼합물의 18개 균주의 알칼리성 세포용해물의 일부를 생산에서 회수하고 2500 mL 미니-캐스크(참조: Semadeni n°6863)에 저장하였다.
세포용해 종료 시 세포용해물에 해당하는 샘플("공정 5-E1-세포용해물"로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
여과 1 : 생성물의 여과 설비를 다이어그램에 따라 준비하였다(도 2). 여과 시스템은 2개의 여과 루프로 이루어져 있다. 탱크(도 2의 용기 2), 펌프(도 2의 펌프 1) 및 0.45 ㎛(도 2의 마이크로-필터의 컷-오프 점이 있는 여과 시스템으로 이루어진 첫 번째 정밀 여과(MF로 지칭됨). 두 번째 루프, 한외여과(UF로 지칭됨)는 탱크(도 2의 용기 3), 펌프(도 2의 펌프 2) 및 30 kDa(도 2의 한외여과 필터)의 컷-오프 점이 있는 여과 시스템으로 이루어져 있다. 여과는 2000 mL의 구현 부피로 실험실 규모에서 수행하였다.
공정을 시작하기 전에, 여과 시스템이 배치에 걸쳐 재현가능한지를 확인해야 했다. 생성물의 정확한 여과성을 검증하기 위해, 정규화된 수 투과성(NWP: Normalized Water Permeability)을 여과 시스템에서 수행하였다.
생산에 사용된 세포용해물을 먼저 정제수(500.8 g의 세포용해물 및 1502.7 g의 정제수)로 4회 희석하였다. 생성물을 1 cm의 생성물 볼텍스를 갖도록 교반하였다. 여과 공정이 시작되기를 기다리면서 생성물의 온도를 실온으로 냉각시켰다. 본 공정에서 pH 10.5 내지 10.8로 pH를 조정하였다(pH: 순수한 피루브산 2.1 mL로 조정된 10.68).
초기 농축: 여과의 첫 번째 단계에서 사용된 생성물은 다음의 파라미터를 가졌다(pH: 10.68), 온도 29 ℃, 1 cm의 생성물 볼텍스를 갖도록 교반). MF 루프 펌프(도 2의 펌프 1)를 생성물의 시스템을 충전하기 위한 공정 속도의 40%에서 시작하였다. 상기 단계가 완료되면, MF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
유속 및 압력이 안정적일 때, 여과 시스템이 조건화된 것으로 간주하였다. 이어서, MF 루프의 투과물 밸브를 열어 농축 계수 0.5(압력 입력: 270 mbar, 투과물 유속: 89 mL/분)로 생성물의 초기 농축을 수행하였다. 초기 농축 동안, 펌프(도 2의 펌프 1) 속도를 공정 속도의 100%(600 mL/분에 해당하는 100 rpm)로 점진적으로 증가시켰다.
상기 단계와 병행하여, UF 루프를 조건화하였다. UF 루프 펌프(도 2의 펌프 2)를 생성물로 시스템을 충전하기 위한 공정 속도의 40%에서 시작하였다. 상기 단계가 완료되면, UF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
정용여과: 0.5 농축 계수에 도달했을 때, UF 투과물을 열어 생성물의 정용여과를 시작하였다(압력 입력: 786 mbar, 투과물 유속: 80 mL/분). 최적의 생성물 추출을 위해, 도 2의 밸브 1에 의해 제어되는 MF TMP(Trans Membrane Pressure: 막전위 압력)를 850 mbar에서 설정해야 한다(압력 입력: 950 mbar, 투과물 유속: 60 mL/분).
정용여과 동안, UF 펌프(도 2의 펌프 2)의 속도를 투과물 흐름 MF와 동일한 UF 투과물 흐름에 도달하도록 설정하였다. 실제로, MF 탱크(도 2의 용기 2)의 부피는 정용여과 단계 동안 가능한 안정적으로 유지되어야 했다.
정용여과를 사이클로 수행하였다. 초기 농축 말기에, MF 탱크(도 2의 용기 2)에 부피가 존재하였다. 이 부피가 MF 여과 시스템을 통과하면, 1 사이클이 실현되었다. 이러한 공정에서, 정용여과는 5 사이클이 필요했다.
최종 농축: 5회의 정용여과 사이클 말기에, UF 펌프를 정지시켰다. MF 입력 압력이 증가하기 시작하면, MF 펌프를 정지시켰다. 이러한 첫 번째 여과 단계 말기에, 관심 생성물에는 0.45 ㎛보다 작은 크기의 원소가 포함되어 있었다.
여과 2: 이어서 수확한 관심 생성물(질량: 1146.3 g)에 30 kDa 컷-오프 점이 있는 UF 루프 상(도 2의 용기 3, 펌프 2 및 한외여과 필터)에서 5 사이클의 정제의 제2 단계를 수행하였다. 투과물은 도 2에서 언급된 폐기물이었다. pH 10.0의 NaOH 0.001 N 용액을 첨가하여, 상기 정제의 제2 여과 단계 동안 일정한 부피를 유지하였다.
UF 루프 펌프(도 2의 펌프 2)를 생성물로 시스템을 충전하기 위한 공정 속도의 40%에서 시작하였다. 상기 단계가 완료되면, UF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
여과 시스템이 조건화되면, UF 투과물을 열어 생성물의 여과 2가 시작되게 하였다(압력 입력: 650 mbar, 투과물 유속: 76 mL/분). 최적의 생성물 추출을 위해, 도 2의 밸브 2 및 3에 의해 제어되는 UF TMP(Trans Membrane Pressure: 막전위 압력)를 850 mbar에서 설정해야 한다(압력 입력: 950 mbar, 투과물 유속: 105 mL/분).
여과 2 단계 동안, UF 탱크(도 2의 용기 3)의 부피는 가능한 안정적으로 유지되어야 했다. 따라서, UF 탱크(도 2의 용기 3)의 수위가 감소함에 따라, NaOH 용액을 첨가하였다. 첨가된 NaOH 용액의 부피에 해당하는 5 사이클은 수확된 관심 생성물의 부피의 5배와 동등하다.
여과 2 단계 말기에, 최종 생성물을 수확하고(질량: 1042.7 g), 이어서 2등분으로 분리하였다. 상기 두 번째 여과 단계 말기에, 관심 생성물은 크기가 0.45 ㎛보다 작고 30 kDa보다 큰 원소를 함유하였다. 중화 전 여과액에 해당하는 샘플("공정 5-E2-여과액"으로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
이어서 여과액의 첫 번째 부분을 pH 7.0±0.2(pH: 피루브산 1/100 3 mL로 조정된 7.08)의 프루브산 1/100으로 중화한 다음, PES 0.2 ㎛ 멸균 막으로 여과를 사용하여 생물안전성 캐비넷 하에서 멸균하였다.
공정의 말기에 중화된 여과액에 해당하는 샘플("공정 5-E3-중화된 여과액(피루브산)", OM314C으로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
동시에, 여과액의 두 번째 부분을 9등분으로 세분하였다. 이어서 이들 부분 각각을 염산 2.5 %(pH: 7.09)으로 또는 유기산(OM314C): 포름산 1/100(pH: 7.11), 아세트산 1/100(pH: 6.97), 3-히드록시-부타논산 1/100(pH: 7.03), 아스파르트산 0.1 %(pH: 7.09), 락트산 1/100(pH: 7.15), 글루탐산 0.1 %(pH: 7.10), 프로피온산 1/100(pH: 7.10), 순수 아스코르브산 (pH: 7.04))으로 7.0±0.2로 중화하였다. 마지막으로, 상이한 생성물을 PES 0.2 ㎛ 멸균 막으로 여과를 사용하여 생물안전성 캐비넷 하에서 멸균하였다.
공정 말기에 상이한 중화된 여과액에 해당하는 샘플("공정 5- E4-중화된 여과액(산 명칭)"으로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
샘플 코드 요약:
세포용해물 공정 5-E1-세포용해물
여과액 공정 5-E2-여과액
표준 중화된 여과액 공정 5-E3-중화된 여과액 (피루브산)
산 1 중화된 여과액 공정 5-E4-중화된 여과액 (염산)
산 2 중화된 여과액 공정 5-E4-중화된 여과액 (포름산)
산 3 중화된 여과액 공정 5-E4-중화된 여과액 (아세트산)
산 4 중화된 여과액 공정 5-E4-중화된 여과액 (3-히드록시-부타논산)
산 5 중화된 여과액 공정 5-E4-중화된 여과액 (아스파르트산)
산 6 중화된 여과액 공정 5-E4-중화된 여과액 (락트산)
산 7 중화된 여과액 공정 5-E4-중화된 여과액 (글루탐산)
산 8 중화된 여과액 공정 5-E4-중화된 여과액 (프로피온산)
산 9 중화된 여과액 공정 5-E4-중화된 여과액 (아스코르브산)
실시예 1.7.2. 분석적 특성분석
분석적 방법이 1.6.2에 기술되어 있다.
방출(T0) 시 공정 5 최종 샘플의 분석적 특성분석
E2-여과액 용액을 처리 후 동결하였고 분석 전에 4℃에서 밤새 해동시켰다.
공정 5 - 분석 결과
시험 샘플 결과 단위
건조 중량 (총) 공정 5-E1-세포용해물 11.6 [mg/g]
건조 중량 (상청액) 공정 5-E1-세포용해물 12.0 [mg/g]
건조 중량 (여과액) 공정 5-E2-여과액 8.0 [mg/g]
총 단백질 공정 5-E2-여과액 5.9 [mg/mL]
총 당 공정 5-E2-여과액 0.19 [mg/mL]
내독소 LAL* 공정 5-E3-중화된 여과액 (피루브산) ND [EU/mL]
DNA** 공정 5-E3-중화된 여과액 (피루브산) 13.2 [㎍/mL]
RNA*** 공정 5-E3-중화된 여과액 (피루브산) 6.9 [㎍/mL]
ND = 검출되지 않음; *내독소 LAL: 검출 한계 = 0.1 EU/mL; **DNA: 검출 한계 = 3.60 ㎍/mL, 정량화 한계 = 12.01 ㎍/mL; ***RNA: 검출 한계 = 4.29 ㎍/mL, 정량화 한계 = 14.32 ㎍/mL
공정 5 - HCl 가수분해 후 총 아미노산
아미노산 농도
(㎛ol/mL) 		% / AA
(D vs L)
L-Asp 0.74 62
D-Asp 0.46 38
L-Glu 1.17 69
D-Glu 0.52 31
L-Ser 0.29 51
D-Ser 0.28 49
L-Thr 0.44 14
D-Thr 2.69 86
L-His 0.00 0
Gly 0.21 NA
D-His 0.19 100
L-Ala 1.26 NA
L-Arg 0.94 NA
D-Arg + D-Ala 0.43 NA
L-Tyr 0.51 76
D-Tyr 0.16 24
L-Val 0.83 84
L-Met 0.31 100
D-Met 0.00 0
L-Cys 0.11 NA
D-Val 0.16 16
L-Ile 0.44 100
L-Phe 0.70 66
D-Phe 0.36 34
L-Leu 1.53 91
D-Ile 0.00 0
D-Leu 0.16 9
L-Lys 0.85 83
D-Lys 0.18 17
a) 안정성 동안 수득된 분광광도법 결과
공정 5 - 흡광도 측정을 통한 용액의 안정성
시점
(방법) 		공정 5 피루브산 염산 아스파르트산 포름산 락트산 3-히드록시-부타논산 아스코르브산 아세트산 프로판산 글루탐산 HCL 산업용 배치 1619064
T0 Abs [AU] 1.668 1.559 1.273 1.634 1.567 1.591 1.602 1.59 1.847 1.394 2.865
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
T1 4℃ Abs [AU] 1.687 1.592 1.259 1.622 1.589 1.589 2.262 1.599 1.605 1.405 3.17
R (%) 101% 102% 99% 99% 101% 100% 141% 101% 87% 101% 111%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
RT Abs [AU] 1.679 1.565 1.265 1.631 1.602 1.598 2.868 1.595 1.597 1.397 3.17
R (%) 101% 100% 99% 100% 102% 100% 179% 100% 86% 100% 111%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
T3 4℃ Abs [AU] 1.694 1.64 1.295 1.643 1.61 1.601 2.466 1.592 1.649 1.408 3.148
R (%) 102% 105% 102% 101% 103% 101% 154% 100% 89% 101% 110%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
RT Abs [AU] 1.693 1.601 1.285 1.655 1.62 1.622 3.094 1.657 1.63 1.433 3.159
R (%) 101% 103% 101% 101% 103% 102% 193% 104% 88% 103% 110%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
T6 4℃ Abs [AU] 1.665 1.559 1.243 1.607 1.569 1.563 2.642 1.576 1.565 1.376 3.046
R (%) 100% 100% 98% 98% 100% 98% 165% 99% 85% 99% 106%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
RT Abs [AU] 1.707 1.657 1.337 1.728 1.672 1.691 2.964 1.683 1.686 1.427 2.985
R (%) 102% 106% 105% 106% 107% 106% 185% 106% 91% 102% 104%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
Abs: 320 nm에서의 흡광도; RT: 실온 (20℃ +/- 5℃); 평가: 스펙트럼의 시각적 평가
국제공개 WO 2008/109669호OM-13-BV)에 기술된 산업용 배치 1619064를 T0에서 시작하여 침전물에 존재하는 염산으로 중화시켰다.
아스코르브산을 제외하고, 공정 5 - E4 -중화된 여과액을 4℃ 또는 실온에서 적어도 6개월 동안 물리적으로 안정하였다. 이는 이러한 조건에서 12개월 동안 안정한 것으로 간주된다.
안정성 동안 수득된 Mip3-알파(CCL20) 결과:
도 32: 공정 5 - 안정성 동안 생물분석 결과는 공정 5 - E3 -중화된 여과액이 실온(20℃ +/- 5℃) 또는 4℃에서 적어도 5개월 동안 THP-1 상에서 MIP-3α 분비를 통해 유사한 생물활성을 보임을 나타냈다. 공정 5 T0을 4℃ 및 실온(RT)에서 4개월 동안 저장한 T5 샘플과 비교하였다.
실시예 1.8 공정 3: 스트렙토코커스 pn. 7466 알칼리성 세포용해물(OM314A)
실시예 1.8.1 공정 3: 스트렙토코커스 pn. 7466
알칼리성 세포용해: 2794 kg의 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneunomiae) 7466 바이오매스(배치 1418123 - 박스 34 및 35)를 세포용해 배럴에서 실온에서 밤새 해동시켰다. 240 g의 NaOH 10 N 및 4293 g의 NaCl 용액을 8 g/L으로 7327 g의 세포용해의 총 중량을 갖도록 첨가하였다. 알칼리성 세포용해를 8일 동안 150 rpm ± 5 rpm의 교반 하에 37℃ ± 2.5℃의 따뜻한 방으로 옮겼다. 세포용해 3시간 00 ± 30분 후, J0 OD를 제어하였다. 샘플을 100배로 희석하고 700 nm에서 분광광도계로 판독하였다(판독 OD: 0.258 및 최종 OD: 25.8). 각 작업 일에, 교반(150 rpm ± 5 rpm), 따뜻한 실온(37.0℃ ± 2.5℃) 및 pH를 제어하였다(J1 pH: 12.63 / J2 pH: 12.62 / J5 pH: 12.59 / J6 pH: 12.65 / J7 pH: 12.69 / J8 pH: 12.71). pH가 공정 범위에 들어가지 않는 경우, NaOH 10 N으로 조정을 수행해야 한다(J1: 10 mL의 NaOH 10 N / J2: 10 mL의 NaOH 10 N / J5: 10 mL의 NaOH 10 N / J6: 10 mL의 NaOH 10 N / J7: 10 mL의 NaOH 10 N).
세포용해 말기에, J8 OD를 제어하였다. 샘플을 5배 희석하고 700 nm에서 분광광도계로 판독하였다(판독 OD: 0.092 및 최종 OD: 0.46). J0 및 J8 사이의 델타 OD는 12.8보다 우수해야 했다(델타 OD: 25.34).
상기 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneunomiae) 7466 세포용해의 일부를 회수하여 2500 mL 미니-캐스크(참조: Semadeni n 6863)에 저장하였다. 세포용해 말기에 세포용해물에 해당하는 샘플("공정 3-E1-세포용해물"로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
여과 1: 생성물의 여과 설비를 다이어그램(도 2)에 따라 준비하였다. 여과 시스템은 2개의 여과 루프로 이루어져 있다. 탱크(도 2의 용기 2), 펌프(도 2의 펌프 1) 및 0.45 ㎛(도 2의 마이크로-필터)의 컷-오프 점이 있는 여과 시스템으로 이루어진 첫 번째 정밀 여과(MF로 지칭됨). 두 번째 루프, 한외여과(UF로 지칭됨)는 탱크(도 2의 용기 3), 펌프(도 2의 펌프 2) 및 10 kDa(도 2의 한외여과 필터)의 컷-오프 점이 있는 여과 시스템으로 이루어져 있다. 여과는 2000 mL의 구현 부피로 실험실 규모에서 수행하였다.
공정을 시작하기 전에, 여러 배치에 대한 재현성에 대해 여과 시스템을 점검하였다. 생성물의 정확한 여과성을 검증하기 위해, NWP(Normalized Water Permeability)를 여과 시스템에서 수행하였다.
생산에 사용된 세포용해물을 정제수(1000.0 g의 세포용해물 및 1000.0 g의 정제수)로 우선 2배 희석하였다. 생성물을 1 cm의 생성물 볼텍스를 갖도록 교반하였다. 여과 공정이 시작되기를 기다리면서 생성물의 온도를 실온으로 냉각시켰다. 본 공정에서 pH 10.5 내지 10.8로 pH를 조정하였다(pH: 순수한 3-히드록시- 부타논산 15 mL로 조정된 10.68).
초기 농축: 여과의 첫 번째 단계에서 사용된 생성물은 다음의 파라미터를 가졌다(pH: 10.68), 온도 29 ℃, 1 cm의 생성물 볼텍스를 갖도록 교반). MF 루프 펌프(도 2의 펌프 1)를 생성물의 시스템을 충전하기 위한 공정 속도의 40%에서 시작하였다. 상기 단계가 완료되면, MF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
유속 및 압력이 안정적일 때, 여과 시스템이 조건화된 것으로 간주하였다. 이어서, MF 루프의 투과물 밸브를 열어 농축 계수 0.5(압력 입력: 210 mbar, 투과물 유속: 50 mL/분)로 생성물의 초기 농축을 수행하였다. 초기 농축 동안, 펌프(도 2의 펌프 1) 속도를 공정 속도의 100%(600 mL/분에 해당하는 100 rpm)로 점진적으로 증가시켰다.
상기 단계와 병행하여, UF 루프를 조건화하였다. UF 루프 펌프(도 2의 펌프 2)를 생성물로 시스템을 충전하기 위한 공정 속도의 40%에서 시작하였다. 상기 단계가 완료되면, UF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
정용여과: 0.5 농축 계수에 도달했을 때, UF 투과물을 열어 생성물의 정용여과를 시작하였다(압력 입력: 680 mbar, 투과물 유속: 47 mL/분). 최적의 생성물 추출을 위해, 도 2의 밸브 1에 의해 제어되는 MF TMP(Trans Membrane Pressure: 막전위 압력)를 850 mbar에서 설정해야 한다(압력 입력: 995 mbar, 투과물 유속: 46 mL/분).
정용여과 동안, UF 펌프(도 2의 펌프 2)의 속도를 투과물 흐름 MF와 동일한 UF 투과물 흐름에 도달하도록 설정하였다. 실제로, MF 탱크(도 2의 용기 2)의 부피는 정용여과 단계 동안 가능한 안정적으로 유지되어야 했다.
정용여과를 사이클로 수행하였다. 초기 농축 말기에, MF 탱크(도 2의 용기 2)에 부피가 존재하였다. 이 부피가 MF 여과 시스템을 통과하면, 1 사이클이 실현되었다. 이러한 공정에서, 정용여과는 5 사이클이 필요했다.
최종 농축: 5회의 정용여과 사이클 말기에, UF 펌프를 정지시켰다. MF 입력 압력이 증가하기 시작하면, MF 펌프를 정지시켰다. 이러한 첫 번째 여과 단계 말기에, 관심 생성물에는 0.45 ㎛보다 작은 크기의 원소가 포함되어 있었다.
여과 2: 이어서 수확한 관심 생성물(질량: 945.7 g)에 10 kDa 컷-오프가 있는 UF 루프 상(도 2의 용기 3, 펌프 2 및 한외여과 필터)에서 5 사이클의 정제의 제2 단계를 수행하였다. 투과물은 도 2에서 언급된 폐기물이었다. pH 10.0의 NaOH 0.001 N 용액을 첨가하여, 상기 정제의 제2 여과 단계 동안 일정한 부피를 유지하였다.
UF 루프 펌프(도 2의 펌프 2)를 생성물로 시스템을 충전하기 위한 공정 속도의 40%에서 시작하였다. 상기 단계가 완료되면, UF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
여과 시스템이 조건화되면, UF 투과물을 열어 생성물의 여과 2가 시작되게 하였다(압력 입력: 690 mbar, 투과물 유속: 37 mL/분). 최적의 생성물 추출을 위해, 도 2의 밸브 2 및 3에 의해 제어되는 UF TMP(Trans Membrane Pressure: 막전위 압력)를 850 mbar에서 설정해야 한다(압력 입력: 945 mbar, 투과물 유속: 52 mL/분).
여과 2 단계 동안, UF 탱크(도 2의 용기 3)의 부피는 가능한 안정적으로 유지되어야 했다. 따라서, UF 탱크(도 2의 용기 3)의 수위가 감소함에 따라, NaOH 용액을 첨가하였다. 첨가된 NaOH 용액의 부피에 해당하는 5 사이클은 수확된 관심 생성물의 부피의 5배와 동등하다.
여과 2 단계 말기에, 최종 생성물을 수확하고(질량: 931.7 g), 이어서 2등분으로 분리하였다. 상기 두 번째 여과 단계 말기에, 관심 생성물은 크기가 0.45 ㎛보다 작고 10 kDa보다 큰 원소를 함유하였다.
중화 전 여과액에 해당하는 샘플("공정 3-E2-여과액"으로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
이어서 여과액의 첫 번째 부분을 pH 7.2 ± 0.2(pH: 3-히드록시-부타논산 1/100의 10 mL로 조정된 7.25)의 3-히드록시-부타논산 1/100으로 중화한 다음, PES 0.2 ㎛ 멸균 막으로 여과를 사용하여 생물안전성 캐비넷 하에서 멸균하였다.
본 공정 말기에 중화된 여과액에 해당하는 샘플("공정 3-E3-중화된 여과액(3-히드록시-부타논산)"으로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
동시에, 여과액의 두 번째 부분을 9등분으로 세분하였다. 이어서 이들 부분 각각을 염산 2.5 %(pH: 7.19)으로 또는 유기산(OM314A): 포름산 1/100(pH: 7.16), 아세트산 1/100(pH: 7.16), 피루브산 1/100(pH: 7.14), 아스파르트산 1/100(pH: 7.19), 락트산 1/100(pH: 7.06), 글루탐산 0.1%(pH: 7.13), 프로피온산 1/100(pH: 7.20), 순수 아스코르브산(pH: 7.20))으로 7.2±0.2로 중화하였다. 마지막으로, 상이한 생성물을 PES 0.2 ㎛ 멸균 막으로 여과를 사용하여 생물안전성 캐비넷 하에서 멸균하였다.
공정 말기에 상이한 중화된 여과액에 해당하는 샘플("공정 3- E4-중화된 여과액(산 명칭)"으로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
샘플 코드, 요약:
세포용해물 공정 3-E1-세포용해물
여과액 공정 3-E2-여과액
표준 중화된 여과액 공정 3-E3-중화된 여과액 (3-히드록시-부타논산)
산 1 중화된 여과액 공정 3-E4-중화된 여과액 (염산)
산 2 중화된 여과액 공정 3-E4-중화된 여과액 (포름산)
산 3 중화된 여과액 공정 3-E4-중화된 여과액 (아세트산)
산 4 중화된 여과액 공정 3-E4-중화된 여과액 (피루브산)
산 5 중화된 여과액 공정 3-E4-중화된 여과액 (아스파르트산)
산 6 중화된 여과액 공정 3-E4-중화된 여과액 (락트산)
산 7 중화된 여과액 공정 3-E4-중화된 여과액 (글루탐산)
산 8 중화된 여과액 공정 3-E4-중화된 여과액 (프로피온산)
산 9 중화된 여과액 공정 3-E4-중화된 여과액 (아스코르브산)
실시예 1.8.2 분석적 특성분석
분석 방법이 1.6.2에 기술되어 있다
방출(T0) 시 공정 3 최종 샘플의 분석적 특성분석
E2-여과액 용액을 처리 후 동결하였고 분석 전에 4℃에서 밤새 해동시켰다.
방출(T0) 시 결과:
공정 3- 분석 결과
시험 샘플 결과 단위
건조 중량 (총) 공정 3-E1-세포용해물 38.0 [mg/g]
건조 중량 (상청액) 공정 3-E1-세포용해물 38.8 [mg/g]
건조 중량 (여과액) 공정 3-E2-여과액 12.1 [mg/g]
총 단백질 공정 3-E2-여과액 9.9 [mg/mL]
총 당 공정 3-E2-여과액 0.67 [mg/mL]
내독소 LAL* 공정 3-E3-중화된 여과액 (3-히드록시-부타논산) ND [EU/mL]
DNA** 공정 3-E3-중화된 여과액 (3-히드록시-부타논산) 9.5 [㎍/mL]
RNA*** 공정 3-E3-중화된 여과액 (3-히드록시-부타논산) ND [㎍/mL]
ND = 검출되지 않음; *내독소 LAL: 검출 한계 = 0.1 EU/mL; **DNA: 검출 한계 = 3.60 ㎍/mL, 정량화 한계 = 12.01 ㎍/mL; ***RNA: 검출 한계 = 4.29 ㎍/mL, 정량화 한계 = 14.32 ㎍/mL.
공정 3 - HCl 가수분해 후 총 아미노산
아미노산 농도
(㎛ol/mL) 		% / AA
(D vs L)
L-Asp 1.39 53
D-Asp 1.25 47
L-Glu 2.11 59
D-Glu 1.44 41
L-Ser 0.33 48
D-Ser 0.36 52
L-Thr 0.56 13
D-Thr 3.71 87
L-His 0.00 0
Gly 0.46 NA
D-His 0.24 100
L-Ala 2.00 NA
L-Arg 1.00 NA
D-Arg + D-Ala 0.80 NA
L-Tyr 0.66 68
D-Tyr 0.31 32
L-Val 1.74 89
L-Met 0.42 100
D-Met 0.00 0
L-Cys 0.21 NA
D-Val 0.22 11
L-Ile 0.80 76
L-Phe 1.38 69
D-Phe 0.62 31
L-Leu 2.30 81
D-Ile 0.25 24
D-Leu 0.53 19
L-Lys 1.68 72
D-Lys 0.65 28
a) 안정성 동안 수득된 분광광도법 결과
공정 3 - 흡광도 측정을 통한 용액의 안정성
시점
(개월) 		　
공정 3
3-히드록시-부타논산 염산 아스파르트산 포름산 락트산 프로피온산 아스코르브산 아세트산 피루브산 글루탐산 HCL 산업용 배치 1619013
T0 Abs [AU] 1.105 1.056 0.74 1.125 1.087 1.099 1.267 1.142 1.258 0.888 3.038
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
T1 4℃ Abs [AU] 1.087 1.064 1.151 1.114 1.117 1.119 2.049 1.128 1.294 0.898 3.196
R (%) 98% 101% 156% 99% 103% 102% 162% 99% 103% 101% 105%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
RT Abs [AU] 1.134 1.121 0.757 1.17 1.143 1.165 3.488 1.243 1.372 0.951 3.033
R (%) 103% 106% 102% 104% 105% 106% 275% 109% 109% 107% 100%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
T3 4℃ Abs [AU] 1.104 1.112 0.738 1.166 1.124 1.141 3.302 1.155 1.316 0.891 3.127
R (%) 100% 105% 100% 104% 103% 104% 261% 101% 105% 100% 103%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
RT Abs [AU] 1.165 1.162 1.235 1.223 1.179 1.219 3.445 1.229 1.388 0.948 3.127
R (%) 105% 110% 167% 109% 108% 111% 272% 108% 110% 107% 103%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
Abs: 320 nm에서의 흡광도; RT: 실온 (20℃ +/- 5℃); 평가: 스펙트럼의 시각적 평가
국제공개 WO 2008/109669호에 기술된 산업용 배치 1619064를 염산으로 중화시키고 T0에서 시작하는 침전물을 제공하였다. 아스코르브산을 제외하고, 공정 3 - E4 -중화된 여과액은 적어도 3개월 동안 4℃ 또는 실온에서 물리적으로 안정하였다.
a) 안정성 동안 수득된 Mip3-알파(CCL20) 결과:
도 31 : 공정 3 - 안정성 동안 생물분석 결과는 공정 3 - E3 -중화된 여과액이 실온(20℃ +/- 5℃) 또는 4℃에서 적어도 5개월 동안 THP-1 상에서 MIP-3α 분비를 통해 유사한 생물활성을 보임을 나타냈다. 공정 3 T0을 4℃ 및 실온(RT)에서 5개월 동안 저장된 T5 샘플과 비교하였다.
실시예 1.9, 21개의 균주 다중세포용해물 안정한 박테리아 추출물 OM314A)
실시예 1.9.1 21개 균주 다중세포용해물 박테리아 추출물 제형의 안정화를 위한 공정 1
세포용해: 21개 균주의 다중세포용해물의 일부를 생산에서 회수하고 2500 mL 미니-캐스크(참조: Semadeni n 6863)에 저장하였다.
세포용해 말기에 세포용해물에 해당하는 샘플("공정 1-E1-세포용해물"로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
여과 1: 생성물의 여과 설비를 다이어그램(도 2)에 따라 준비하였다. 여과 시스템은 2개의 여과 루프로 이루어져 있다. 탱크(도 2의 용기 2), 펌프(도 2의 펌프 1) 및 0.45 ㎛(도 2의 마이크로-필터)의 컷-오프 점이 있는 여과 시스템으로 이루어진 첫 번째 정밀 여과(MF로 지칭됨). 두 번째 루프, 한외여과(UF로 지칭됨)는 탱크(도 2의 용기 3), 펌프(도 2의 펌프 2) 및 10 kDa(도 2의 한외여과 필터)의 컷-오프 점이 있는 여과 시스템으로 이루어져 있다. 여과는 2000 mL의 구현 부피로 실험실 규모에서 수행하였다.
공정을 시작하기 전에, 배치에 대한 재현성에 대해 여과 시스템을 점검하였다. 생성물의 정확한 여과성을 검증하기 위해, NWP(Normalized Water Permeability)를 여과 시스템에서 수행하였다.
생산에 사용된 세포용해물을 정제수(1000.6 g의 세포용해물 및 999.9 g의 정제수)로 우선 2배 희석하였다. 생성물을 1 cm의 생성물 볼텍스를 갖도록 교반하였다. 여과 공정이 시작되기를 기다리면서 생성물의 온도를 실온으로 냉각시켰다. 본 공정에서 pH 10.5 내지 10.8로 pH를 조정하였다(pH: 순수한 아스파르트산으로 조정된 10.77).
초기 농축: 여과의 첫 번째 단계에서 사용된 생성물은 다음의 파라미터를 가졌다(pH: 10.77), 온도 25℃, 1 cm의 생성물 볼텍스를 갖도록 교반). MF 루프 펌프(도 2의 펌프 1)를 생성물의 시스템을 충전하기 위한 공정 속도의 40%에서 시작하였다. 상기 단계가 완료되면, MF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
유속 및 압력이 안정적일 때, 여과 시스템이 조건화된 것으로 간주하였다. 이어서, MF 루프의 투과물 밸브를 열어 농축 계수 0.5(압력 입력: 300 mbar, 투과물 유속: 43 mL/분)로 생성물의 초기 농축을 수행하였다. 초기 농축 동안, 펌프(도 2의 펌프 1) 속도를 공정 속도의 100%(600 mL/분에 해당하는 100 rpm)로 점진적으로 증가시켰다.
상기 단계와 병행하여, UF 루프를 조건화하였다. UF 루프 펌프(도 2의 펌프 2)를 생성물로 시스템을 충전하기 위한 공정 속도의 40%에서 시작하였다. 상기 단계가 완료되면, UF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
정용여과: 0.5 농축 계수에 도달했을 때, UF 투과물을 열어 생성물의 정용여과를 시작하였다(압력 입력: 730 mbar, 투과물 유속: 58 mL/분). 최적의 생성물 추출을 위해, 도 2의 밸브 1에 의해 제어되는 MF TMP(Trans Membrane Pressure: 막전위 압력)를 850 mbar에서 설정해야 한다(압력 입력: 1010 mbar, 투과물 유속: 58 mL/분).
정용여과 동안, UF 펌프(도 2의 펌프 2)의 속도를 투과물 흐름 MF와 동일한 UF 투과물 흐름에 도달하도록 설정하였다. 실제로, MF 탱크(도 2의 용기 2)의 부피는 정용여과 단계 동안 가능한 안정적으로 유지되어야 했다.
정용여과를 사이클로 수행하였다. 초기 농축 말기에, MF 탱크(도 2의 용기 2)에 부피가 존재하였다. 이 부피가 MF 여과 시스템을 통과하면, 1 사이클이 실현되었다. 이러한 공정에서, 정용여과는 5 사이클이 필요했다.
최종 농축: 5회의 정용여과 사이클 말기에, UF 펌프를 정지시켰다. MF 입력 압력이 증가하기 시작하면, MF 펌프를 정지시켰다. 이러한 첫 번째 여과 단계 말기에, 관심 생성물에는 0.45 ㎛보다 작은 크기의 원소가 포함되어 있었다.
여과 2: 이어서 수확한 관심 생성물(질량: 1232.7 g)에 10 kDa 컷-오프 점이 있는 UF 루프 상(도 2의 용기 3, 펌프 2 및 한외여과 필터)에서 5 사이클의 정제의 제2 단계를 수행하였다. 투과물은 도 2에서 언급된 폐기물이었다. pH 10.0의 NaOH 0.001 N 용액을 첨가하여, 상기 정제의 제2 여과 단계 동안 일정한 부피를 유지하였다.
UF 루프 펌프(도 2의 펌프 2)를 생성물로 시스템을 충전하기 위한 공정 속도의 40%에서 시작하였다. 상기 단계가 완료되면, UF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
여과 시스템이 조건화되면, UF 투과물을 열어 생성물의 여과 2가 시작되게 하였다(압력 입력: 655 mbar, 투과물 유속: 37 mL/분). 최적의 생성물 추출을 위해, 도 2의 밸브 2 및 3에 의해 제어되는 UF TMP(Trans Membrane Pressure: 막전위 압력)를 850 mbar에서 설정해야 한다(압력 입력: 917 mbar, 투과물 유속: 57 mL/분).
여과 2 단계 동안, UF 탱크(도 2의 용기 3)의 부피는 가능한 안정적으로 유지되어야 했다. 따라서, UF 탱크(도 2의 용기 3)의 수위가 감소함에 따라, NaOH 용액을 첨가하였다. 첨가된 NaOH 용액의 부피에 해당하는 5 사이클은 수확된 관심 생성물의 부피의 5배와 동등하다.
여과 2 단계 말기에, 최종 생성물을 수확하고(질량: 1237.0 g), 이어서 2등분으로 분리하였다. 상기 두 번째 여과 단계 말기에, 관심 생성물은 크기가 0.45 ㎛보다 작고 10 kDa보다 큰 원소를 함유하였다.
중화 전 여과액에 해당하는 샘플("공정 1-E2-여과액"으로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
이어서 여과액의 첫 번째 부분을 pH 7.2 ± 0.2(pH: 0.1% 아스파르트산 65 mL로 조정된 7.20)의 0.1% 아스파르트산으로 중화한 다음, PES 0.2 ㎛ 멸균 막으로 여과를 사용하여 생물안전성 캐비넷 하에서 멸균하였다.
본 공정 말기에 중화된 여과액에 해당하는 샘플("공정 1-E3-중화된 여과액 (아스파르트산)" OM314A으로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
동시에, 여과액의 두 번째 부분을 9등분으로 세분하였다. 이어서 이들 부분 각각을 염산 2.5 %(pH: 7.19)으로 또는 유기산(OM314A): 포름산 1/100(pH: 7.16), 아세트산 1/100(pH: 7.20), 피루브산 1/100(pH: 7.12), 3-히드록시-부타논산 1/100(pH: 7.17), 락트산 1/100(pH: 7.19), 글루탐산 0.1%(pH: 7.09), 프로피온산 1/100(pH: 7.11), 순수 아스코르브산(pH: 7.20))으로 7.2±0.2로 중화하였다. 마지막으로, 상이한 생성물을 PES 0.2 ㎛ 멸균 막으로 여과를 사용하여 생물안전성 캐비넷 하에서 멸균하였다.
공정 말기에 상이한 중화된 여과액에 해당하는 샘플("공정 1- E4-중화된 여과액(산 명칭)" OM314A으로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
샘플 요약
세포용해물 공정 1-E1-세포용해물
여과액 공정 1-E2-여과액
표준 중화된 여과액 공정 1-E3-중화된 여과액 (아스파르트산)
산 1 중화된 여과액 공정 1-E4-중화된 여과액 (염산)
산 2 중화된 여과액 공정 1-E4-중화된 여과액 (포름산)
산 3 중화된 여과액 공정 1-E4-중화된 여과액 (아세트산)
산 4 중화된 여과액 공정 1-E4-중화된 여과액 (피루브산)
산 5 중화된 여과액 공정 1-E4-중화된 여과액 (3-히드록시-부타논산)
산 6 중화된 여과액 공정 1-E4-중화된 여과액 (락트산)
산 7 중화된 여과액 공정 1-E4-중화된 여과액 (글루탐산)
산 8 중화된 여과액 공정 1-E4-중화된 여과액 (프로피온산)
산 9 중화된 여과액 공정 1-E4-중화된 여과액 (아스코르브산)
실시예 1.9.2. 분석적 특성분석
분석 방법이 1.6.2에 기술되어 있다
a) 방출 시 결과:
E2-여과액 용액을 처리 후 동결하였고 분석 전 4℃에서 밤새 해동시켰다.
공정 1 - 분석 결과
시험 샘플 결과 단위
건조 중량 (총) 공정 1-E1-세포용해물 31.3 [mg/g]
건조 중량 (상청액) 공정 1-E1-세포용해물 30.0 [mg/g]
건조 중량 (여과액) 공정 1-E2-여과액 9.1 [mg/g]
총 단백질 공정 1-E2-여과액 7.3 [mg/mL]
총 당 공정 1-E2-여과액 0.10 [mg/mL]
내독소 LAL* 공정 1-E3-중화된 여과액 (아스파르트산) ND [EU/mL]
DNA** 공정 1-E3-중화된 여과액 (아스파르트산) 10.4 [㎍/mL]
RNA*** 공정 1-E3-중화된 여과액 (아스파르트산) ND [㎍/mL]
ND = 검출되지 않음; *내독소 LAL: 검출 한계 = 0.1 EU/mL; **DNA: 검출 한계 = 3.60 ㎍/mL, 정량화 한계 = 12.01 ㎍/mL; ***RNA: 검출 한계 = 4.29 ㎍/mL, 정량화 한계 = 14.32 ㎍/mL
공정 1 - 산 가수분해 후 총 아미노산
아미노산 농도
(㎛ol/mL) 		% / AA
(D vs L)
L-Asp 1.17 60
D-Asp 0.77 40
L-Glu 1.59 68
D-Glu 0.75 32
L-Ser 0.39 55
D-Ser 0.32 45
L-Thr 0.46 11
D-Thr 3.56 89
L-His 0.00 0
Gly 0.32 NA
D-His 0.35 100
L-Ala 1.71 NA
L-Arg 0.83 NA
D-Arg + D-Ala 0.50 NA
L-Tyr 0.61 77
D-Tyr 0.19 23
L-Val 1.23 90
L-Met 0.28 100
D-Met 0.00 0
L-Cys 0.11 NA
D-Val 0.13 10
L-Ile 0.61 77
L-Phe 1.03 73
D-Phe 0.38 27
L-Leu 1.83 88
D-Ile 0.19 23
D-Leu 0.26 12
L-Lys 1.82 81
D-Lys 0.42 19
안정성 동안 수득된 분광광도법 결과
공정 1 - 흡광도 측정을 통한 용액의 안정성
시점
(개월) 		　
공정 1
아스파르트산 염산 프로피온산 포름산 락트산 3-히드록시-부타논산 아스코르브산 아세트산 피루브산 글루탐산 *산업용 배치 1619013
T0 Abs [AU] 1.317 1.496 1.54 1.553 1.519 1.509 1.646 1.504 1.638 1.294 2.73
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
T1 4℃ Abs [AU] 1.329 1.496 1.552 1.574 1.53 1.528 2.144 1.543 1.66 1.325 3.032
R (%) 101% 100% 101% 101% 101% 101% 130% 103% 101% 102% 111%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
RT Abs [AU] 1.397 1.579 1.589 1.634 1.591 1.602 3.043 1.602 1.727 1.365 3.152
R (%) 106% 106% 103% 105% 105% 106% 185% 107% 105% 105% 115%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
T3 4℃ Abs [AU] 1.397 1.587 1.574 1.599 1.545 1.532 2.457 1.603 1.692 1.347 3.441
R (%) 106% 106% 102% 103% 102% 102% 149% 107% 103% 104% 126%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
RT Abs [AU] 1.438 1.66 1.679 1.705 1.687 1.693 2.831 1.688 1.769 1.423 3.232
R (%) 109% 111% 109% 110% 111% 112% 172% 112% 108% 110% 118%
평가 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈 부드러움 부드러움 부드러움 노이즈
Abs: 320 nm에서의 흡광도; RT: 실온 (20℃ +/- 5℃); 평가: 스펙트럼의 시각적 평가
국제공개 WO 2008/109669호에 21개의 균주 세포용해물로서 기술된 산업용 배치 1619064를 염산으로 중화하고 T0에서 시작하는 침전물을 제공하였다. 아스코르브산을 제외하고, 공정 1 - E4 -중화된 여과액은 적어도 3개월 동안 4℃ 또는 실온에서 물리적으로 안정하였다.
a) 안정성 동안 수득된 Mip3-알파(CCL20) 결과:
도 29: 공정 1 - 안정성 동안 생물분석 결과는 공정 1 - E3 -중화된 여과액이 실온(20℃ +/- 5℃) 또는 4℃에서 적어도 4개월 동안 THP-1 상에서 MIP-3α 분비를 통해 유사한 생물활성을 보임을 나타냈다. 공정 1 T0을 4℃ 및 실온(RT)에서 4개월 동안 저장한 T4 샘플과 비교하였다.
실시예 1.9 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus inflenzae) 8467(OM314A)
실시예 1.10.1 공정 2: 헤모필루스 인플루엔자 8467
세포용해: 13396 kg의 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) 바이오매스(배치 1419110 - 박스 10, 11, 12 및 13)를 세포용해 배럴에서 실온에서 밤새 해동시켰다. 692 g의 NaOH 10 N 및 12920 g의 NaCl 용액을 8 g/L로하여 27008 g의 세포용해의 총 중량을 갖도록 첨가하였다. 알칼리성 세포용해를 5일 동안 150 rpm ± 5 rpm의 교반 하에 37℃ ± 2.5℃의 따뜻한 방으로 옮겼다. 세포용해 3시간 00 ± 30분 후, J0 OD를 제어하였다. 샘플을 200배로 희석하고 700 nm에서 분광광도계로 판독하였다(판독 OD: 0.273 및 최종 OD: 54.6). 각 작업 일에, 교반(150 rpm ± 5 rpm), 따뜻한 실온(37.0℃ ± 2.5℃) 및 pH를 제어하였다(J1 pH: 11.87 / J2 pH: 11.74 / J5 pH: 11.45). pH가 공정 범위에 들어가지 않는 경우, NaOH 10 N으로 조정을 수행해야 한다(J1: 20 mL의 NaOH 10 N / J2: 20 mL의 NaOH 10 N). 세포용해 말기에, J8 OD를 제어하였다. 샘플을 100배로 희석하고 700 nm에서 분광광도계로 판독하였다(판독 OD: 0.169 및 최종 OD: 16.9). J0 및 J5 사이의 델타 OD 는 13.1보다 우수해야 했다(델타 OD: 37.7). 상기 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus inflenzae) 8467 세포용해의 일부를 회수하여 2500 mL 미니-캐스크(참조: Semadeni n 6863)에 저장하였다. 세포용해 말기에 세포용해물에 해당하는 샘플("공정 2-E1-세포용해물"로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
여과 1: 생성물의 여과 설비를 다이어그램(도 2)에 따라 준비하였다. 여과 시스템은 2개의 여과 루프로 이루어져 있다. 탱크(도 2의 용기 2), 펌프(도 2의 펌프 1) 및 0.45 ㎛(도 2의 마이크로-필터)의 컷-오프 점이 있는 여과 시스템으로 이루어진 첫 번째 정밀 여과(MF로 지칭됨). 두 번째 루프, 한외여과(UF로 지칭됨)는 탱크(도 2의 용기 3), 펌프(도 2의 펌프 2) 및 10 kDa(도 2의 한외여과 필터)의 컷-오프 점이 있는 여과 시스템으로 이루어져 있다. 여과는 2000 mL의 구현 부피로 실험실 규모에서 수행하였다.
공정을 시작하기 전에, 배치에 대한 재현성에 대해 여과 시스템을 점검하였다. 생성물의 정확한 여과성을 검증하기 위해, NWP(Normalized Water Permeability)를 여과 시스템에서 수행하였다.
생산에 사용된 세포용해물을 정제수(499.9 g의 세포용해물 및 1500.2 g의 정제수)로 우선 4배 희석하였다. 생성물을 1 cm의 생성물 볼텍스를 갖도록 교반하였다. 여과 공정이 시작되기를 기다리면서 생성물의 온도를 실온으로 냉각시켰다. 본 공정에서 pH 조정이 없었으므로, 여과 공정을 즉시 시작하였다.
초기 농축: 여과의 첫 번째 단계에서 사용된 생성물은 다음의 파라미터를 가졌다(pH: 11.23), 온도 32℃, 1 cm의 생성물 볼텍스를 갖도록 교반). MF 루프 펌프(도 2의 펌프 1)를 생성물의 시스템을 충전하기 위한 공정 속도의 40%에서 시작하였다. 상기 단계가 완료되면, MF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
유속 및 압력이 안정적일 때, 여과 시스템이 조건화된 것으로 간주하였다. 이어서, MF 루프의 투과물 밸브를 열어 농축 계수 0.5(압력 입력: 325 mbar, 투과물 유속: 45 mL/분)로 생성물의 초기 농축을 수행하였다. 초기 농축 동안, 펌프(도 2의 펌프 1) 속도를 공정 속도의 100%(600 mL/분에 해당하는 100 rpm)로 점진적으로 증가시켰다.
상기 단계와 병행하여, UF 루프를 조건화하였다. UF 루프 펌프(도 2의 펌프 2)를 생성물로 시스템을 충전하기 위한 공정 속도의 40%에서 시작하였다. 상기 단계가 완료되면, UF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
정용여과: 0.5 농축 계수에 도달했을 때, UF 투과물을 열어 생성물의 정용여과를 시작하였다(압력 입력: 880 mbar, 투과물 유속: 63 mL/분). 최적의 생성물 추출을 위해, 도 2의 밸브 1에 의해 제어되는 MF TMP(Trans Membrane Pressure: 막전위 압력)를 850 mbar에서 설정해야 한다(압력 입력: 1163 mbar, 투과물 유속: 68 mL/분).
정용여과 동안, UF 펌프(도 2의 펌프 2)의 속도를 투과물 흐름 MF와 동일한 UF 투과물 흐름에 도달하도록 설정하였다. 실제로, MF 탱크(도 2의 용기 2)의 부피는 정용여과 단계 동안 가능한 안정적으로 유지되어야 했다.
정용여과를 사이클로 수행하였다. 초기 농축 말기에, MF 탱크(도 2의 용기 2)에 부피가 존재하였다. 이 부피가 MF 여과 시스템을 통과하면, 1 사이클이 실현되었다. 이러한 공정에서, 정용여과는 5 사이클이 필요했다.
최종 농축: 5회의 정용여과 사이클 말기에, UF 펌프를 정지시켰다. MF 입력 압력이 증가하기 시작하면, MF 펌프를 정지시켰다. 이러한 첫 번째 여과 단계 말기에, 관심 생성물에는 0.45 ㎛보다 작은 크기의 원소가 포함되어 있었다.
여과 2: 이어서 수확한 관심 생성물(질량: 1039.1 g)에 10 kDa 컷-오프 점이 있는 UF 루프 상(도 2의 용기 3, 펌프 2 및 한외여과 필터)에서 5 사이클의 정제의 제2 단계를 수행하였다. 투과물은 도 2에서 언급된 폐기물이었다. pH 10.0의 NaOH 0.001 N 용액을 첨가하여, 상기 정제의 제2 여과 단계 동안 일정한 부피를 유지하였다.
UF 루프 펌프(도 2의 펌프 2)를 생성물로 시스템을 충전하기 위한 공정 속도의 40%에서 시작하였다. 상기 단계가 완료되면, UF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
여과 시스템이 조건화되면, UF 투과물을 열어 생성물의 여과 2가 시작되게 하였다(압력 입력: 650 mbar, 투과물 유속: 44 mL/분). 최적의 생성물 추출을 위해, 도 2의 밸브 2 및 3에 의해 제어되는 UF TMP(Trans Membrane Pressure: 막전위 압력)를 850 mbar에서 설정해야 한다(압력 입력: 960 mbar, 투과물 유속: 72 mL/분).
여과 2 단계 동안, UF 탱크(도 2의 용기 3)의 부피는 가능한 안정적으로 유지되어야 했다. 따라서, UF 탱크(도 2의 용기 3)의 수위가 감소함에 따라, NaOH 용액을 첨가하였다. 첨가된 NaOH 용액의 부피에 해당하는 5 사이클은 수확된 관심 생성물의 부피의 5배와 동등하다.
여과 2 단계 말기에, 최종 생성물을 수확하고(질량: 1033.9 g), 이어서 2등분으로 분리하였다. 상기 두 번째 여과 단계 말기에, 관심 생성물은 크기가 0.45 ㎛보다 작고 10 kDa보다 큰 원소를 함유하였다.
중화 전 여과액에 해당하는 샘플("공정 2-E2-여과액"으로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
이어서 여과액의 첫 번째 부분을 pH 7.2 ± 0.2(pH: 프로피온산 1/100 4.2 mL로 조정된 7.18)의 프로피온산 1/100으로 중화한 다음, PES 0.2 ㎛ 멸균 막으로 여과를 사용하여 생물안전성 캐비넷 하에서 멸균하였다.
본 공정 말기에 중화된 여과액에 해당하는 샘플("공정 2-E3-중화된 여과액(프로피온산)" OM314A으로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
동시에, 여과액의 두 번째 부분을 9등분으로 세분하였다. 이어서 이들 부분 각각을 염산 0.25 %(pH: 7.09)으로 또는 유기산(OM314A): 포름산 1/100(pH: 7.13), 아세트산 1/100(pH: 7.20), 피루브산 1/100(pH: 7.15), 아스파르트산 0.1%(pH: 7.12), 락트산 1/100(pH: 7.19), 글루탐산 0.1%(pH: 7.21), 3-히드록시-부타논산 1/100(pH: 7.16), 순수 아스코르브산(pH: 7.25))으로 7.2±0.2로 중화하였다. 마지막으로, 상이한 생성물을 PES 0.2 ㎛ 멸균 막으로 여과를 사용하여 생물안전성 캐비넷 하에서 멸균하였다.
공정 말기에 상이한 중화된 여과액에 해당하는 샘플("공정 2- E4-중화된 여과액(산 명칭)"으로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
샘플코드 요약:
세포용해물 공정 2-E1-세포용해물
여과액 공정 2-E2-여과액
표준 중화된 여과액 공정 2-E3-중화된 여과액 (프로피온산)
산 1 중화된 여과액 공정 2-E4-중화된 여과액 (염산)
산 2 중화된 여과액 공정 2-E4-중화된 여과액 (포름산)
산 3 중화된 여과액 공정 2-E4-중화된 여과액 (아세트산)
산 4 중화된 여과액 공정 2-E4-중화된 여과액 (피루브산)
산 5 중화된 여과액 공정 2-E4-중화된 여과액 (아스파르트산)
산 6 중화된 여과액 공정 2-E4-중화된 여과액 (락트산)
산 7 중화된 여과액 공정 2-E4-중화된 여과액 (글루탐산)
산 8 중화된 여과액 공정 2-E4-중화된 여과액 (3-히드록시-부타논산)
산 9 중화된 여과액 공정 2-E4-중화된 여과액 (아스코르브산)
실시예 1.10.2. 분석적 특성분석
분석 방법이 1.6.2에 기술되어 있다
방출 시(T0) 결과:
E2-여과액 용액을 처리 후 동결하였고 분석 전 4℃에서 밤새 해동시켰다.
공정 2 - 분석 결과
시험 샘플 결과 단위
건조 중량 (총) 공정 2-E1-세포용해물 24.5 [mg/g]
건조 중량 (상청액) 공정 2-E1-세포용해물 21.2 [mg/g]
건조 중량 (여과액) 공정 2-E2-여과액 8.4 [mg/g]
총 단백질 공정 2-E2-여과액 7.7 [mg/mL]
총 당 공정 2-E2-여과액 0.20 [mg/mL]
내독소 LAL* 공정 2-E3-중화된 여과액 (프로피온산) 16.2 [EU/mL]
DNA** 공정 2-E3-중화된 여과액 (프로피온산) ND [㎍/mL]
RNA*** 공정 2-E3-중화된 여과액 (프로피온산) ND [㎍/mL]
ND = 검출되지 않음; *내독소 LAL: 검출 한계 = 0.1 EU/mL; **DNA: 검출 한계 = 3.60 ㎍/mL, 정량화 한계 = 12.01 ㎍/mL; ***RNA: 검출 한계 = 4.29 ㎍/mL, 정량화 한계 = 14.32 ㎍/mL
공정 2 - 산 가수분해 후 총 아미노산
아미노산 농도
(㎛ol/mL) 		% / AA
(D vs L)
L-Asp 0.87 77
D-Asp 0.26 23
L-Glu 1.25 87
D-Glu 0.18 13
L-Ser 0.40 54
D-Ser 0.34 46
L-Thr 0.47 17
D-Thr 2.31 83
L-His 0.00 NA
Gly 0.21 NA
D-His 0.00 NA
L-Ala 1.18 NA
L-Arg 1.07 NA
D-Arg + D-Ala 0.11 NA
L-Tyr 0.51 85
D-Tyr 0.09 15
L-Val 0.68 100
L-Met 0.41 100
D-Met 0.00 0
L-Cys 0.08 NA
D-Val 0.00 0
L-Ile 0.58 100
L-Phe 0.63 84
D-Phe 0.12 16
L-Leu 1.31 100
D-Ile 0.00 0
D-Leu 0.00 0
L-Lys 1.67 94
D-Lys 0.12 6
a) 안정성 동안 수득된 Mip3-알파(CCL20) 결과:
도 30: 공정 2 - 안정성 동안 생물분석 결과는 공정 2 - E3 -중화된 여과액이 실온(20℃ +/- 5℃) 또는 4℃에서 적어도 4개월 동안 THP-1 상에서 MIP-3α 분비를 통해 유사한 생물활성을 보임을 나타냈다. 공정 2 T0을 4℃ 및 실온(RT)에서 4개월 동안 저장한 T4 샘플과 비교하였다.
실시예 1.11 - 21개 균주 박테리아 세포용해물 추출물 30 kDa(BE30kD, OM314A)
실시예 1.11.1 공정 6: 21개 균주 박테리아 세포용해물 추출물 30 kDa(BE30kD, OM314A)
세포용해: 21개 균주 박테리아 다중세포용해물(국제공개 WO 2008/109669호에 21개의 균주 세포용해물로 기술된 산업용 배치 1619064)의 일부를 회수하여 2500 mL 미니-캐스크(참조: Semadeni n°6863)에 저장하였다.
여과 1: 생성물의 여과 설비를 다이어그램(도 2)에 따라 준비하였다. 여과 시스템은 2개의 여과 루프로 이루어져 있다. 탱크(도 2의 용기 2), 펌프(도 2의 펌프 1) 및 0.45 ㎛(도 2의 마이크로-필터)의 컷-오프 점이 있는 여과 시스템으로 이루어진 첫 번째 정밀 여과(MF로 지칭됨). 두 번째 루프, 한외여과(UF로 지칭됨)는 탱크(도 2의 용기 3), 펌프(도 2의 펌프 2) 및 30 kDa(도 2의 한외여과 필터)의 컷-오프 점이 있는 여과 시스템으로 이루어져 있다. 여과는 2000 mL의 구현 부피로 실험실 규모에서 수행하였다.
공정을 시작하기 전에, 배치에 대한 재현성에 대해 여과 시스템을 점검하였다. 생성물의 정확한 여과성을 검증하기 위해, NWP(Normalized Water Permeability)를 여과 시스템에서 수행하였다.
생산에 사용된 세포용해물을 정제수(1000.2 g의 세포용해물 및 1000.1 g의 정제수)로 우선 2배 희석하였다. 생성물을 1 cm의 생성물 볼텍스를 갖도록 교반하였다. 여과 공정이 시작되기를 기다리면서 생성물의 온도를 실온으로 냉각시켰다. 본 공정에서 pH 10.5 내지 10.8(pH: 순수한 아스파르트산으로 조정된 10.73)으로 pH를 조정하였다.
초기 농축: 여과의 첫 번째 단계에서 사용된 생성물은 다음의 파라미터를 가졌다(pH: 10.73), 온도 25℃, 1 cm의 생성물 볼텍스를 갖도록 교반). MF 루프 펌프(도 2의 펌프 1)를 생성물의 시스템을 충전하기 위한 공정 속도의 40%에서 시작하였다. 상기 단계가 완료되면, MF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
유속 및 압력이 안정적일 때, 여과 시스템이 조건화된 것으로 간주하였다. 이어서, MF 루프의 투과물 밸브를 열어 농축 계수 0.5(압력 입력: 235 mbar, 투과물 유속: 52 mL/분)로 생성물의 초기 농축을 수행하였다. 초기 농축 동안, 펌프(도 2의 펌프 1) 속도를 공정 속도의 100%(600 mL/분에 해당하는 100 rpm)로 점진적으로 증가시켰다.
상기 단계와 병행하여, UF 루프를 조건화하였다. UF 루프 펌프(도 2의 펌프 2)를 생성물로 시스템을 충전하기 위한 공정 속도의 40%에서 시작하였다. 상기 단계가 완료되면, UF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
정용여과: 0.5 농축 계수에 도달했을 때, UF 투과물을 열어 생성물의 정용여과를 시작하였다(압력 입력: 734 mbar, 투과물 유속: 52 mL/분). 최적의 생성물 추출을 위해, 도 2의 밸브 1에 의해 제어되는 MF TMP(Trans Membrane Pressure: 막전위 압력)를 850 mbar에서 설정해야 한다(압력 입력: 1010 mbar, 투과물 유속: 48 mL/분).
정용여과 동안, UF 펌프(도 2의 펌프 2)의 속도를 투과물 흐름 MF와 동일한 UF 투과물 흐름에 도달하도록 설정하였다. 실제로, MF 탱크(도 2의 용기 2)의 부피는 정용여과 단계 동안 가능한 안정적으로 유지되어야 했다.
정용여과를 사이클로 수행하였다. 초기 농축 말기에, MF 탱크(도 2의 용기 2)에 부피가 존재하였다. 이 부피가 MF 여과 시스템을 통과하면, 1 사이클이 실현되었다. 이러한 공정에서, 정용여과는 5 사이클이 필요했다.
최종 농축: 5회의 정용여과 사이클 말기에, UF 펌프를 정지시켰다. MF 입력 압력이 증가하기 시작하면, MF 펌프를 정지시켰다. 이러한 첫 번째 여과 단계 말기에, 관심 생성물에는 0.45 ㎛보다 작은 크기의 원소가 포함되어 있었다.
여과 2: 이어서 수확한 관심 생성물(질량: 1179.6 g)에 30 kDa 컷-오프 점이 있는 UF 루프 상(도 2의 용기 3, 펌프 2 및 한외여과 필터)에서 5 사이클의 정제의 제2 단계를 수행하였다. 투과물은 도 2에서 언급된 폐기물이었다. pH 10.3의 NaOH 0.001 N 용액을 첨가하여, 상기 정제의 제2 여과 단계 동안 일정한 부피를 유지하였다.
UF 루프 펌프(도 2의 펌프 2)를 생성물로 시스템을 충전하기 위한 공정 속도의 40%에서 시작하였다. 상기 단계가 완료되면, UF 루프 상의 생성물의 재순환을 시작하고 펌프 속도를 공정 속도의 75%에 도달하도록 정기적으로 증가시켰다. 재순환을 통해 시스템에 존재하는 기포를 제거하여 친수성 여과 시스템을 조건화할 수 있다.
여과 시스템이 조건화되면, UF 투과물을 열어 생성물의 여과 2가 시작되게 하였다(압력 입력: 670 mbar, 투과물 유속: 67 mL/분). 최적의 생성물 추출을 위해, 도 2의 밸브 2 및 3에 의해 제어되는 UF TMP(Trans Membrane Pressure: 막전위 압력)를 850 mbar에서 설정해야 한다(압력 입력: 920 mbar, 투과물 유속: 88 mL/분).
여과 2 단계 동안, UF 탱크(도 2의 용기 3)의 부피는 가능한 안정적으로 유지되어야 했다. 따라서, UF 탱크(도 2의 용기 3)의 수위가 감소함에 따라, NaOH 용액을 첨가하였다. 첨가된 NaOH 용액의 부피에 해당하는 5 사이클은 수확된 관심 생성물의 부피의 5배와 동등하다.
여과 2 단계 말기에, 최종 생성물을 수확하였다(질량: 1070.5 g). 상기 제2 여과 단계 말기에, 관심 생성물은 크기가 0.45 ㎛보다 작고 30 kDa보다 큰 원소를 함유하였다.
이어서 여과액을 pH 7.2 ± 0.2(pH: 0.1% 아스파르트산 180 mL로 조정된 7.19)의 0.1% 아스파르트산으로 중화한 다음, PES 0.2 ㎛ 멸균 막으로 여과를 사용하여 생물안전성 캐비넷 하에서 멸균하였다.
본 공정 말기에 중화된 여과액에 해당하는 샘플("공정 6-E3-중화된 여과액 (아스파르트산)" OM314A으로 지칭됨)을 본 단계에서 수행하였다.
실시예 2: 비강 내, 기관 내, 흡입 및 경구 주변 용 안정한 제형
실시예 2.1: OM314A 안정화된 박테리아 추출물의 비강 내 제형
유기산 안정화된 OM314A 박테리아 추출물의 고분자 분획(>10 kD)을 멸균 식염수(주사용수 중의 0.9% NaCl)를 사용하여 5 mg 건조 중량/mL(1 내지 20 mg/mL 범위)의 최종 농도로 pH 7.5로 조정하고 0.2 μm 여과로 멸균하였다. 최종 용액을 0.25 mg의 유기산 안정화된 OM 박테리아 추출물(투여량 당 0.025 내지 0.1 mL 범위)을 함유하는 0.05 mL의 전형적인 투여량으로 비강 분무 의료 장치 바이알(10 mL, 1 내지 25 mL 범위)에 첨가하였다.
치료 투여량: 0.05 내지 1 mg을 함유하는 투여 당 0.025 내지 0.1 mL 범위의 단일 일일 투여량 및 격일(bi-daily) 투여량을 이러한 제형으로 달성할 수 있다.
실시예 2.2: 락토바실러스 퍼멘텀( Lactobacillus fermentum ) 안정화된 박테리아 추출물 20(OM314B)의 비강 내 제형
유기산 안정화된 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 박테리아 추출물(OM314B)의 고분자 분획(>10 kD)을 멸균 식염수(주사용수 중의 0.9% NaCl)를 사용하여 5 mg 건조 중량/mL(1 내지 20 mg/mL 범위)의 최종 농도로 pH 7.5로 조정하고 0.2 μm 여과로 멸균하였다. 최종 용액을 0.25 mg의 유기산 안정화된 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 정제된 박테리아 추출물(투여량 당 0.025 내지 0.1 mL 범위)을 함유하는 0.05 mL의 전형적인 투여량으로 비강 분무 의료 장치 바이알(10 mL, 1 내지 25 mL 범위)에 첨가하였다.
치료 투여량: 0.05 내지 1 mg을 함유하는 투여 당 0.025 내지 0.1 mL 범위의 단일 일일 투여량 및 격일(bi-daily) 투여량을 이러한 제형으로 달성할 수 있다.
실시예 2.3: 대장균( Escherichia coli ) 안정화된 박테리아 추출물(OM314C)의 비강 내 제형
유기산 안정화된 대장균(Escherichia coli) 박테리아 추출물의 고분자 분획(>10 kD)을 멸균 식염수(주사용수 중의 0.9% NaCl)를 사용하여 5 mg 건조 중량/mL(1 내지 20 mg/mL 범위)의 최종 농도로 pH 7.5로 조정하고 0.2 μm 여과로 멸균하였다. 최종 용액을 0.25 mg의 유기산 안정화된 대장균(Escherichia coli) 정제된 박테리아 추출물(투여량 당 0.025 내지 0.1 mL 범위)을 함유하는 0.05 mL의 전형적인 투여량으로 비강 분무 의료 장치 바이알(10 mL, 1 내지 25 mL 범위)에 첨가하였다.
치료 투여량: 0.05 내지 1 mg을 함유하는 투여 당 0.025 내지 0.1 mL 범위의 단일 일일 투여량 및 격일(bi-daily) 투여량을 이러한 제형으로 달성할 수 있다.
실시예 2.4: OM314A 박테리아 안정화된 추출물의 액체 점적 분무로서 흡입 제형
유기산 안정화된 OM314A 박테리아 추출물의 고분자 분획(>10 kD)을 멸균 식염수(주사용수 중의 0.9% NaCl)를 사용하여 5 mg 건조 중량/mL(1 내지 20 mg/mL 범위)의 최종 농도로 pH 7.5로 조정하고 0.2 μm 여과로 멸균하였다. 최종 용액을 0.5 mg의 유기산 안정화된 OM 박테리아 추출물(투여량 당 0.05 내지 0.4 mL 범위)을 함유하는 0.1 mL의 전형적인 투여량으로 분무-흡입기 의료 장치 바이알(10 mL, 1 내지 25 mL 범위)에 첨가하였다.
치료 투여량: 0.05 내지 8 mg을 함유하는 투여 당 0.05 내지 0.4 mL 범위의 단일 일일 투여량 및 격일(bi-daily) 투여량을 이러한 제형으로 달성할 수 있다.
실시예 2.5: 락토바실러스 퍼멘텀( Lactobacillus fermentum ) 박테리아 안정화된 추출물(OM314B)의 액체 점적 분무로서 흡입 제형
유기산 안정화된 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 박테리아 추출물(OM314B)의 고분자 분획(>10 kD)을 멸균 식염수(주사용수 중의 0.9% NaCl)를 사용하여 5 mg 건조 중량/mL(1 내지 20 mg/mL 범위)의 최종 농도로 pH 7.5로 조정하고 0.2 μm 여과로 멸균하였다. 최종 용액을 0.5 mg의 유기산 안정화된 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 정제된 박테리아 추출물(투여량 당 0.05 내지 0.4 mL 범위)을 함유하는 0.1 mL의 전형적인 투여량으로 분무-흡입기 의료 장치 바이알(10 mL, 1 내지 25 mL 범위)에 첨가하였다.
치료 투여량: 0.05 내지 8 mg을 함유하는 투여 당 0.05 내지 0.4 mL 범위의 단일 일일 투여량 및 격일(bi-daily) 투여량을 이러한 제형으로 달성할 수 있다.
실시예 2.6: OM314A 안정화된 박테리아 추출물의 고체 입차로서 흡입 제형
유기산 안정화된 OM314A 박테리아 추출물의 고분자 분획(>10 kD)을 멸균 식염수(주사용수 중의 0.9% NaCl)를 사용하여 10 mg 건조 중량/mL(1 내지 20 mg/mL 범위)의 최종 농도로 pH 7.5로 조정하고, 목록*의 하나 이상의 부형제 및 0.2 μm 여과로 멸균하였다. 일 실시예에서, 10 mg/mL의 박테리아 추출물 용액을 만니톨(25 mg/mL), 락토스(25 mg/mL) 및 Mg 스테아레이트(1 mg/mL)와 혼합하였다.
분무 건조 후에 분말을 정제(12 mg 정제)로 압축하였다. 분쇄 가능한 정제를 의료 장치(1 내지 7 ㎛ 범위의 입자 크기)에 분배하고 12 mg 정제의 흡입 투여량은 2 mg 박테리아 추출물이었다.
흡입을 위한 비제한적인 전형적인 부형제는 락토스, 글루코스, 만니톨, 트레할로스, Mg 스테아레이트, DPPC, DSPC, DMPC, 콜레스테롤, 류신, 트리류신, 폴록사머, 담즙염, 키토산, 트리메틸키토산, PLGA이다(검토를 위한 문헌[G. Pilcer, K. Amighi, International Journal of Pharmaceutics, 2010, 392, 1-19] 참조).
실시예 2.7: 락토바실러스 퍼멘텀( Lactobacillus fermentum ) 안정화된 박테리아 추출물(OM314B)의 고체 입자로서 흡입 제형
유기산 안정화된 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 박테리아 추출물(OM314B)의 고분자 분획(>10 kD)을 멸균 식염수(주사용수 중의 0.9% NaCl)를 사용하여 10 mg 건조 중량/mL(1 내지 20 mg/mL 범위)의 최종 농도로 pH 7.5로 조정하고, 목록*의 하나 이상의 부형제 및 0.2 μm 여과로 멸균하였다. 일 실시예에서, 10 mg/mL의 박테리아 추출물 용액을 만니톨(25 mg/mL), 락토스(25 mg/mL) 및 Mg 스테아레이트(1 mg/mL)와 혼합하였다.
분무 건조 후에 분말을 정제(12 mg 정제)로 압축하였다. 분쇄 가능한 정제를 의료 장치(1 내지 7 ㎛ 범위의 입자 크기)에 분배하고 12 mg 정제의 흡입 투여량은 2 mg 박테리아 추출물이었다.
흡입을 위한 비제한적인 전형적인 부형제는 락토스, 글루코스, 만니톨, 트레할로스, Mg 스테아레이트, DPPC, DSPC, DMPC, 콜레스테롤, 류신, 트리류신, 폴록사머, 담즙염, 키토산, 트리메틸키토산, PLGA이다(검토를 위한 문헌[G. Pilcer, K. Amighi, International Journal of Pharmaceutics, 2010, 392, 1-19] 참조).
실시예 3: 신규한 박테리아 추출물 제형의 보다 높은 안정성의 증거
실시예 1.1, 1,2, 1.3, 1.4에 따라 제조한 추출물 및 실시예 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5에 따라 제조한 제형을 아세트산, 프로피온산, 락트산, 3- 히드록시프로판산, 피루브산, 부타논산, 2-히드록시부타논산, 3-히드록시부타논산, 글루탐산, 아스파르트산, 및 이들의 조합 중에서 선택된 상이한 유기산을 사용하여 pH 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6으로 조정하였다.
5℃ ± 3℃ 및 실온 20℃ 내지 25℃에서 저장된 박테리아 추출물의 10 안정성은 0일 부터(pH 조정 후 15분 내지 120분 사이) 및 30일, 60일, 90일, 180일, 360일 후 상이한 시점에서 침전물의 존재에 대해 시각적으로 관찰하였다.
0일 부터(pH 조정 후 15분 내지 120분 사이) 및 30일, 60일, 90일 180일, 360일 후 상이한 시점에서 측정된 550, 600, 650, 700 nm에서 이들의 흡광도를 측정함으로써 가시-분광광도계를 사용하여 정량화를 수행하였다. 분광광도법을 물 샘플에 대해 수행하였다.
흡광도의 변화가 공정, 사용된 유기산 또는 유기산 조합 및 최종 pH 값에 따라 안정성이 표현된다.
실시예 4: 프리모 인플루엔자 감염 후 준치사 박테리아 감염의 동물 모델에서 OM 비강 내 대 경구 투여의 예방 및 치료 효능.
동물 모델에서 OM 박테리아 추출물의 경구 주변 투여를 실험적으로 시험하기 위한 목적으로 OM 박테리아 추출물(21개의 균주 세포용해물 유래의 박테리아 추출물)의 안정한 경구 주변 형태를 즉석으로 제조하였다. 이러한 즉석 경구 주변 형태는 시간 경과에 따라 안정하였지만 결과는 통찰력을 제공하고 경구 주변 투여의 실질적인 치료 이점을 입증하였다.
인플루엔자 바이러스 감염 후 폐 조직의 바이러스 역가를 감소시키고 (2) 중복감염된 동물(준치사 인플루엔자 바이러스 감염 후 준치사 박테리아 감염으로 처리된 동물)의 이환율 및 사망률의 감소시키는데 있어서의 즉석 경구 주변 OM 박테리아 추출물의 비강 내 투여의 효능을 OM 박테리아 추출물의 경구 투여와 비교하였다(도 3).
암컷 BALB/c 마우스(8주령, Charles River Laboratories)를 케타민 및 자일라솔을 복강 내 주입하여 마취시키고 50ul PBS 부피의 인플루엔자 균주 A/Puerto Rico8/34의 100 PFU를 비강 내로 접종하였다. 인플루엔자 감염 후 6일차에 박테리아 스타터 배양을 개시하였고, 이어서 인플루엔자 감염 후 7일차에 대수 성장으로 확장되었다.
경구 투여의 경우, 320 μL의 OM 농축물을 위관 영양법으로 투여하여 동물/일 당 OM 동결건조물의 활성 성분 360 mg/kg을 생성하였으며, 이는 마우스 당 7.2 mg의 활성 성분의 일일 투여이다(도 3). LPS의 비강 내 투여의 경우(COPD 모델 수행 범주 내), 사용된 투여량은 비강 투여량 당 7 마이크로그램 LPS였다. 문헌에서, 비강으로 1 마이크로그램의 LPS의 투여는 알러지성 염증을 예방하는 것으로 보고되었다. 시험 스케줄을 다음의 표 23에 요약하였다:
-10 내지 -1일 경구로 물 대조군 투여 (1군).
-10 내지 -1 경구로 OM 박테리아 추출물 투여 (2군).
-7, -5 및 -3일 즉석 비강 내 OM 박테리아 추출물 투여
(3 및 4군)
0일 인플루엔자 A 바이러스로 준치사 감염(비강으로 100 PFU,인플루엔자 균주 H1N1 PR/8/34)
5일 분석을 위해 군 당 5마리 동물 희생(1군 내지 4군)
5일 중간 채혈(군 당 12마리 동물, 1군 내지 4군)
7일 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)로 준-치사 감염(군 당 15마리 동물, 1군 내지 4군)
0, 7 내지 12일 체중, 온도, 임상 점수 및 치사를 매일 측정(군 당 12마리 동물, 1군 내지 4군)
12 내지 16일 동물이 완전히 회복될 때까지 체중, 온도, 임상 점수 및 치사를 격일로 측정(모든 잔여 동물)
통계를 GraphPad Prism 버전 5.0d를 사용하여 수행하였다. Student's 검정을 바이러스 로딩에 대해 수행하였다. 2원 ANOVA를 중량, 온도 및 임상 점수에 대해 수행하였다.
생존에 대한 곡선 비교를 하였다. 전반적으로, OM 박테리아 추출물 처리가 중복감염 모델에서 이환율 및 사망률로부터 마우스를 보호하였다. 이러한 보호 효과는 OM 박테리아 추출물의 점막 투여가 이의 효능(도 4, 5) 및 2차 박테리아 감염 후 동반이환(도 6)을 크게 향상시킬 수 있음을 시사하는 비강 내 치료에서 가장 두드러졌다.
실시예 5: 프리모 인플루엔자 감염 후 준치사 박테리아 감염의 동물 모델에서 비강 내 및 기관 내 OM 박테리아 추출물 투여의 예방 효과
도 7에 요약된 본 연구는 (1) 인플루엔자 바이러스 감염 후 폐 조직에서 바이러스 역가 감소(도 8) 및 (2) 임상 점수에 의해 입증되는 바와 같이 중복감염된 동물(준치사 인플루엔자 바이러스 감염 후 준치사 박테리아 감염으로 처리된 동물)의 이환율 및 사망률 감소(도 10 및 12)를 위한 예방적 치료 요법으로서 OM 박테리아 추출물(21개의 균주 세포용해물의 박테리아 추출물)의 비강 내 및 기관 내 투여의 효능을 입증하였다. OM 박테리아 추출물의 2개의 상이한 투여량인, 투여량 A(투여 당 50 마이크로그램의 활성 성분) 및 투여량 B(투여 당 5 마이크로그램의 활성 성분)를 시험하였다.
암컷 BALB/c 마우스(8주령, Charles River Laboratories)를 케타민과 자일라솔을 복강 내 주사하여 마취하고 PBS 부피의 인플루엔자 균주 A/Puerto Rico8/34 100 PFU를 비강 내 접종하였다.
마우스를 각각 15마리씩 6개 군으로 나누었다. 1군은 d7, d5, 및 d3일에 비강 내(i.n.) 경로를 통해 식염수 점적을 투여하였다(예방적 대조군). 2군은 d7, d5, 및 d3일에 비강 내 경로를 통해 OM 박테리아 추출물의 예방적 투여량 A를 투여하였다. 2군은 -7, -5, 및 -3일에 비강 내(i.n.) 경로를 OM 박테리아 추출물의 예방적 투여량 B를 투여하였다. 군 4는 -7, -5, 및 -3일에 기관 내로(i.t.) 식염수를 분무 투여 하였다. 군 5는 -7, -5, 및 -3일에 기관 내 경로를 통해 OM 박테리아 추출물의 예방적 투여량 A를 투여하였다. 군 6은 -7, -5, 및 -3일에 기관 내 경로를 통해 OM 박테리아 추출물의 예방적 투여량 B를 투여하였다.
마우스 당/시점 당 50 마이크로그램 활성 성분(투여량 A, 2.2 마이크로리터의 OM 박테리아 추출물 농축물 생성) 및 5 마이크로그램 활성 성분(투여량 B, 0.22 마이크로리터의 OM 박테리아 추출물 농축물 생성)으로 OM 박테리아 추출물 투여.
인플루엔자 감염 후 6일차에 스타터 배양을 시작하였고, 이어서 인플루엔자 감염 후 7일차에 대수기 성장으로 확장되었다.
연구 설계 및 투여 스케줄을 도 7 및 하기 표 24에 나타냈다.
-7, -5, -3일 비강 내로(1군) 또는 기관 내로(4군) 식염수 투여
-7, -5, -3일 비강 내로(2군 및 3군) 또는 기관 내로(5군 및 6군) OM 박테리아 추출물 투여
0일 인플루엔자 A 바이러스로 준치사 감염(비강으로 100 PFU, 인플루엔자 균주 H1N1 PR/8/34).
5일 분석을 위해 군 당 5마리 희생(1군 내지 6군).
7일 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)로 준치사 감염(군 당 10마리 동물, 1군 내지 6군)
7일 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)로 준치사 감염(군 당 12마리 동물, 1군 내지 3군).
0, 7 내지 12일 체중, 온도, 임상 점수 및 치사율 매일 측정(군 당 10마리 동물, 1군 내지 6군).
>12일 동물이 완전히 회복될 때까지 체중, 온도, 임상 점수 및 치사율을 2일 마다 또는 3일 마다 측정(남은 모든 동물)
동물을 케타민 및 자일라솔의 복강 내 주사로 마취하고 OM 박테리아 추출물을 50 마이크로리터의 총 부피의 50 마이크로그램 활성 성분(투여량 A, 2.2 마이크로리터의 OM 박테리아 추출물 농축물 생성) 또는 5 마이크로그램 활성 성분(투여량 B, 0.22 마이크로리터의 OM 박테리아 추출물 농축물 생성)으로 식염수 중 희석으로 비강 내 또는 기관 내 투여하였다.
동물을 케타민 및 자일라솔의 복강 내 주사로 마취하고 OM 박테리아 추출물을 50 마이크로리터의 총 부피의 50 마이크로그램 활성 성분(투여량 A, 2.2 마이크로리터의 OM 박테리아 추출물 농축물 생성) 또는 5 마이크로그램 활성 성분(투여량 B, 0.22 마이크로리터의 OM 박테리아 추출물 농축물 생성)으로 식염수 중 희석으로 비강 내 또는 기관 내 투여하였다.
통계를 GraphPad Prism 버전 5.0d를 사용하여 수행하였다. Student's I-검정을 바이러스 로딩에 대해 수행하였다. 2원 ANOVA를 체중, 온도 및 임상 점수에 대해 수행하였다.
생존에 대해 곡선을 비교하였다(도 8 및 10).
OM 박테리아 추출물(OM 투여량 B I.N.: 5 마이크로그램 및 OM 투여량 A I.N.: 50 마이크로그램 투여량)의 비강 내 투여한 동물의 예방적 치료는 PR8 감염 후 5일차에 측정된 폐 조직에서 바이러스 역가를 감소시켰다(도 8). 이러한 감소는 비강 내 경로에 의한 50 마이크로그램 투여량의 OM 박테리아 추출물에서 더 두드러진 반면 5 마이크로그램은 기관 내 경로에 의해 바이러스 입자를 제거하기에 충분하였다.
바이러스 역가 결과와 유사하게, 예방적 비강 내 OM 박테리아 추출물 치료는 인플루엔자 박테리아 감염 후 이환율 및 사망률을 상당히 경감시켰다. 50 마이크로그램 투여량의 OM 박테리아 추출물의 비강 치료는 90% 생존(OM 투여량 A I.N.), 5 마이크로그램 투여량의 OM 박테리아 추출물의 비강 치료는 40%생존(OM 투여량 B I.N.)을 나타낸 반면, 비강을 통한 식염수 대조군 비강(식염수 I.N.) 치료는 동물을 보호하지 못하였으며 감염 후 6일차에 사망하였다(도 9). 생존 결과와 유사하게, 임상 점수 및 체중 감소 측정값은 식염수 처리된 동물과 비교하여 50 마이크로그램 투여량의 OM 박테리아 추출물로 처리된 동물에서 유의하게 감소하였다(도 9). 50 마이크로그램 투여량의 OM 박테리아 추출물로 처리된 동물과 유사하게, 5 마이크로그램 투여량으로 처리된 동물도 또한 식염수 대조군 동물과 비교하여 감소된 임상 점수 및 체중 감소를 나타냈다; 그러나 5 마이크로그램 비강 내 투여량의 경우 효능은 더 낮았다.
동물의 예방적 5 마이크로그램 투여량 OM 박테리아 추출물의 기관 내 치료는 대조군 식염수 기관 내 처리된 동물에서 확인된 바이러스 역가 측정값과 비교하여 PR8 감염 후 5일차에 측정된 폐 조직에서 바이러스 역가의 가장 많은 감소를 나타냈다(도 8). 이환율 및 사망률과 관련하여, 기관 내 50 마이크로그램 투여량(OM 투여량 A I.T.) 및 5 마이크로그램 투여량(OM 투여량 B I.T.)의 OM 박테리아 추출물 치료 둘 모두는 식염수 대조군 처리된 동물(30%)과 비교하여 증가된 생존율(70%)을 나타냈으며, 10일차까지 투여량 비례 효과가 있었다(도 11). 이는 식염수 대조군과 비교하여, 기관 내 50 마이크로그램 및 5 마이크로그램 투여량의 OM 박테리아 추출물 치료된 동물 둘 모두에 대해 동일하게 감소된 임상 점수 측정값으로 요약된다.
요약하면, 예방적 비강 OM 박테리아 추출물 투여는 중복감염된 동물의 이환율 및 사망률의 유의한 감소 및 인플루엔자 감염 후 폐 조직에서 바이러스 역가 감소를 초래한다. 이러한 결과는 비강 내 경로를 통해 투여된 50 마이크로그램 투여량의 OM 박테리아 추출물 치료 요법 후 특히 분명했다. 놀랍게도, 예방적 기관 내 OM 박테리아 추출물 치료는 5 마이크로그램 투여량을 사용하여 더 높은 효능과 함께 이환율 및 사망률을 가장 우수하게 감소시켰으며 이는 더 깊은 표면 폐 노출에 의해 설명될 수 있다.
이러한 결과는 비강 내 및 기관 내 투여 둘 모두가 천식, COPD 및 기타 병원체와 같은 호흡기 질환에 대한 OM 박테리아 추출물 치료적 치료에 대해 매우 효과적인 투여 경로임을 분명하게 입증하였다.
실시예 6: 준치사 인플루엔자 감염의 동물 모델에서 본 발명에 따른 박테리아 추출물의 비강 내 투여를 위한 신규한 치료 요법
본 연구(도 13)는 인플루엔자 바이러스 감염 후 폐 조직에서 바이러스 역가를 감소시키는데 있어서 즉석으로 제조된 OM 박테리아 추출물(21개의 균주 세포용해물의 박테리아 추출물)의 비강 내 투여 효능을 보여주었다. 본 연구는 또한 OM 박테리아 추출물의 투여량-반응 관계를 입증하였다. 본 연구는 또한 두 가지 상이한 다중-용량 용법(6-투여량 및 3-투여량)의 비교와, 비강 내 치료 요법과 경구 투여간의 비교를 제공하였다. 암컷 7주령 BALB/c 마우스(특정 병원체 부재(Specific PathogenFree); SPF)를 Charles River Laboratories에서 구입하고 케이지 당 총 5마리의 마우스를 무작위로 할당하였다. 마우스를 매주 모니터링하고 연구 개시 전(연구 0일차) 7일 동안 시설에 적응시켰다. 연구 0일차에 마우스는 8주령이었다. 식수와 음식은 자유롭게 이용가능하였다. 마우스를 13개 군으로 나누었다: 1군 내지 11군은 활성 물질 OM 박테리아 추출물(OM)을 비강 내로 주었다. 12군은 물 대조군(320 μL, 경구, 매일, -10일 내지 -1일)이었고 13군은 음성 대조군(준치사 인플루엔자 바이러스 감염 단독)이었다. 표 25 및 26은 상이한 군 및 도 13에 개략된 치료 프로토콜을 나타낸다.
군 처리 군 투여량 / 스케줄 / 경로
1 2.5 마이크로그램, d-14, -12, -10, -7, -5, -3, 비강 내
2 5 마이크로그램, d-14, -12, -10, -7, -5, -3, 비강 내
3 25 마이크로그램, d-14, -12, -10, -7, -5, -3, 비강 내
4 50 마이크로그램, d-14, -12, -10, -7, -5, -3, 비강 내
5 100 마이크로그램, d-14, -12, -10, -7, -5, -3, 비강 내
6 2.5 마이크로그램, d-7, -5, -3, 비강 내
7 5 마이크로그램, d-7, -5, -3, 비강 내
8 25 마이크로그램, d-7, -5, -3, 비강 내
9 50 마이크로그램, d-7, -5, -3, 비강 내
10 100 마이크로그램, d-7, -5, -3, 비강 내
11 7.2 mg 경구, 매일, -10일 내지 -1일


군

약물

경로
바이러스 감염 전 투여 일
투여 당 부피(마이크로리터)
활성 성분 (마이크로그램)		 투여 당 목표량의 활성 성분을 수득하기 위해 사용된 농축된 약물 용
액의 부피
식염수 용액 (마이크로리터)
1 OM i.n. -14, -12, -10, -7, -5, -3 50 2.5 0.11 49.89
2 OM i.n. -14, -12, -10, -7, -5, -3 50 5 0.22 49.78
3 OM i.n. -14, -12, -10, -7, -5, -3 50 25 1.1 48.9
4 OM i.n. -14, -12, -10, -7, -5, -3 50 50 2.2 47.8
5 OM i.n. 14, -12, -10, -7, -5, -3 50 100 4.4 45.6
6 OM i.n. -7, -5, -3 50 2.5 0.11 49.89
7 OM i.n. -7, -5, -3 50 5 0.22 49.78
8 OM i.n. -7, -5, -3 50 25 1.1 48.9
9 OM i.n. -7, -5, -3 50 50 2.2 47.8
10 OM i.n. -7, -5, -3 50 100 4.4 45.6
11 OM p.o. 매일, -10 내지 -1 320 7200 320 N/A
12 물 p.o. 매일, -10 내지 -1 320 N/A N/A N/A
13 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
i.n. = 비강 내; p.o. = 경구
상기 연구 프로토콜에 명시된 날에, 마우스를 마취제인 이소플루란 Provet AG, Catalogue number: 2222)을 마우스가 포함된 플렉시글라스 챔버에 전달하는 보정된 기화기 시스템(VIP300, Provet, Vet.Med Center, Lyssach, CH)을 사용하여 마취하였다. 이어서 마취된 마우스에 총 부피 50 마이크로리터의 OM 박테리아 추출물 시험 물질을 투여하였으며, 이를 100ul 마이크로피펫을 사용하여 양쪽 콧구멍에 살포하였다.
바이러스 물질(Virapur(San Diego)에서 공급한 인플루엔자 바이러스 균주 PR8(A/Puerto Rico/8/34, H1N1))을 -75℃±10℃에 저장하고 투여 전에 해동하였다. 해동되면, 상기 물질을 A/PR/8/34에 대해 100 PFU/50 ㎕에 해당하는 차가운 PBS(4℃)에 희석하였다. 희석된 바이러스를 마우스에 투여할 때까지 얼음 위에서 유지시켰다. 동물을 체중 kg 당 9.75 mg 자일라솔 및 48.75 mg 케타솔로 복강 내 주사로 마취하고 각 동물에 50 ㎕ 바이러스 용액을 비강 내 접종으로 투여하였다.
5일차에 펜타바비톨(Streuli Pharma AG, Uznach, Cat: 1170139A)로 치사량의 복강 내 주사에 의해 동물을 희생시킨 직후 조직을 단리하였다(폐). 단리된 폐엽(Lung lobe)을 정량적 PCR에 의한 폐 조직의 바이러스 로딩 정량화를 위해 준비하였다. 단리된 폐엽 및 RNA를 TRI 시약(Molecular Research Center)으로 준비한 다음 DNase(Invitrogen)로 처리하여 게놈 DNA 오염을 방지한 다음 SuperScript III(Invitrogen)를 사용하여 역 전사에 의해 RNA를 cDNA로 전환하였다 cNDA를 SYBR Green(Stratagene) 을 사용하여 실시간 PCR(iCycler; Bio-Rad)에 의해 정량화하고 샘플을 GAPDH 발현 수준으로 정규화하였다. 모든 그래프를 Graphpad Prism Version 6으로 생성하고 1원 ANOVA를 적용하였다. 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM: Standard Error of the Mean)를 나타낸다.
본 연구의 결과는 OM 박테리아 추출물의 비강 내 투여가 본 연구에서 사용된 임의의 투여량에서 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 마우스를 효과적으로 보호하였으며 경구 경로와 비교하여 비강 내 경로에 의해 더 높은 효능을 보여주었다(도 14). 비처리 대조군과 비교하여, 경구 군 당 물 및 OM 박테리아 추출물 둘 모두에서 바이러스 제어의 명백한 개선이 있었다. 또한, 이러한 보호 효과는 본 실험에서 평가된 가장 최근의 가장 높은 투여량인, 5 마이크로그램에서 최대 100 마이크로그램까지 유의하게 투여량 의존적이었다. OM 박테리아 추출물의 6회 비강 내 투여를 받은 군이 가장 우수한 효능 및 가장 적은 편차를 나타냈지만, OM 박테리아 추출물 단독을 3회 투여받은 마우스도 또한 바이러스에 대해 유의하게 보호되었다. 이러한 데이터는 OM 박테리아 추출물이 가장 효과적인 투여 경로를 제공한다는 것을 입증하는 비강 내 투여 후 이전 실험을 분명하게 확인하였다. OM 박테리아 추출물의 3회 및 6회 처리 모두에서 명확한 투여량 반응이 입증되었기 때문에, 본 마우스 모델에서 인플루엔자에 대한 이러한 매우 효과적인 예방적 치료에서 투여량 및 요법이 중요하다고 결론지을 수 있다. 따라서 총 치료 기간이 길수록, 비강 내 투여와 같은 경구 주변의 빈도가 높을수록 그리고 투여량이 많을 수록 더 효과적일 것으로 예상할 수 있다.
실시예 7: 리노바이러스 도킹 단백질의 발현과 건강한 기증자로부터 유래한 1차 인간 상피에 대한 유형 1 및 유형 2 인터페론 반응에 대한 본 발명에 따른 박테리아 추출물의 효과.
건강한 기증자뿐만 아니라 COPD 및 천식 환자로부터 유래한 인간 폐 상피 세포에서 즉석으로 제조된 경구 주변 OM 박테리아 추출물(21개의 균주 세포용해물의 박테리아 추출물)의 항바이러스 활성에 대한 이전의 데이터가 공개되었다(문헌Roth M et al, PLoS ONE 2017, 12(11), e0188010]).
기관 내 경로(직접 폐 노출, 실시예 4, 5 및 6)를 통한 OM 박테리아 추출물에 의한 동물에서 입증된 항-바이러스 효능을 추적하기 위해 본 출원인은 인간 폐 기원의 1차 기관지 상피 세포(hBEC)를 사용하여 이러한 직접 폐 노출을 평가하였다. 기관 내 경로에 의해 마우스에서 수득된 결과를 모방하기 위해, 인간 기관지 폐 상피 세포를 21개의 균주 세포용해물(OM314A(P1, P2, P3), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5))의 신규한 안정한 OM 박테리아 추출물 제형에 직접 노출시켜 폐 세포로부터 항-바이러스 탑재 효능 반응을 평가하였다. 1차 상피 폐 세포에 대한 직접적인 항-바이러스 효과를 고려하여, 이러한 연구는 동물의 비강 내 및 기관 내 투여에 의해 이전에 제안된 바와 같이 폐가 OM 박테리아 추출물의 1차 표적 기관임을 확인하였다(실시예4, 5 및 6).
본 연구에서, 본 출원인은 OM 박테리아 추출물에 대한 세포 노출 결과와 리노바이러스 감염에 대한 이의 보호 효과를 분자 기반으로 입증하였다. 이를 위해, 단백질, mRNA 발현 및 면역형광에 대한 실험을 수행하였다. 여러 건강한 기증자, COPD 환자 및 천식 환자의 폐에서 유래한 인간 폐 상피 세포 배양물에 대한 RT-PCR뿐만 아니라, ELISA 및 면역형광 기법(트립판 블루 배제 염색으로 직접 세포 계수)을 사용하여 검출을 수행하였다.
BEC 단리 및 특성분석: 기관지 조직의 작은 조각(1 × 1 × 1 mm 내지 최대 2 × 2 × 2 mm)을 BEC 특이 배지 Cnt-PR-A(CellnTech, 스위스 베른 소재)로 사전 습윤된 세포 배양 용기 내에 두었다. 상기 배지를 2일 마다 교체하였고 세포를 분열 세포의 기계적 진탕으로 계대하였다. 세포를 E-Cadherin 및 Pan-Keratin의 양성 염색과, 피브로넥틴에 대한 음성 염색으로 특성분석하였다(문헌[Roth M et al, PLoS One. 2017; 12:e0188010]).
본 연구에서, 본 출원인은 신규한 안정한 OM 박테리아 추출물 제형의 선택된 세트와 리노바이러스 감염에 대한 예방적 항바이러스 효과의 우수한 결과를 분자 기반으로 입증하였다. 실험 판독값은 정량적 바이러스 로딩 변화뿐만 아니라, 비제한적으로 유형 1- 및 유형 2-인터페론과 같은 가용성 매개체를 비롯하여, hBEC에 의해 생성된 항-감염 및 항-염증 매개체였다. 이러한 생물학적 효과를 다음의 방법으로 측정하였다: 바이러스 로딩의 경우 RT-PCR에 의한 mRNA 검출 및 유형 1-인터페론(IFN-베타 및 유형 II-인터페론 감마)의 경우 ELISA에 의한 가용성 매개체 방출 검출. RV16 mRNA의 결정을 RV16에 대한 mRNA 퍼센트 및 RV16의 mRNA 발현 퍼센트로 표현된 항바이러스 효능과 함께 표 27에 열거된 상이한 제형에 대해 수행하였다.
실시예 7.1: 항바이러스 결과
시험한 다양한 신규한 안정한 OM 박테리아 추출물 제형(OM314A(P1, P2, P3), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5))으로 수득된 결과는 표준 OM 박테리아 추출물 HCl 제형과 유사하거나 이보다 개선된 항바이러스 효과를 나타낸다(도 15a). 본 시리즈에서, 여러 산이 제조 정제 공정에 통합된 신규한 제형으로 항바이러스 효과를 시험하였다(도 15c). "HCl"로 표지된 불안정한 액체 제형과 비교하여, 신규한 안정한 제형은 동등하거나 더 우수한 항바이러스 효능을 입증하였다. 사용한 OM314A(P1, P2, P3), OM314B (P4) 및 OM-314C(P5) 박테리아 추출물에 따라 그리고 한 가지 경우를 제외하고는, HCl 제형과 동등하거나 더 우수한 효능이 입증되었다(다른 샘플 제제와 함께 도 15a의 HCL 및 도 c의 I.B의 경우 RV16 mRNA 퍼센트와 비교).
도 15a에 해당하는 mRNA 퍼센트 대 RV16에 대한 mRNA 발현율
대조군 및 OM314A RV16 mRNA 퍼센트 RV16 mRNA 발현
음성 대조군 0.18 0.0000016
RV16-1 양성 대조군 100 0.0008809
HCl 61.7 0.0005436
HCl-중심 51.0 0.0004492
부티르산 61.0 0.0005377
부티르산-중심 51.6 0.0004546
프로피온산 53.2 0.0004687
프로피온산-중심 66.1 0.0005820
아스파르트산 39.4 0.0003467
아스파르트산-중심 35.6 0.0003136
실시예 7.2: 유형 1 및 유형 2 인터페론
1세대 OM 박테리아 추출물에 의한 유형 1 인터페론-베타 생산의 유도가 이전에 1차 골수-유래 수지상 세포(DC)에 대한 마우스 실험 세포 모델에서 기술되었다(문헌[Dang et al, Sci Rep. 2017 Mar 6;7:43844]). 간단하게, 건강한 기증자, 천식 및 COPD 환자로부터 채취한 인간 BEC 세포를 일-2(Day-2)차에 씨딩하고, 일-1(Day-1)에 혈청을 제거하고 개략도(도 16)에 지시된 바와 같이 OM314A(P1, P2, P3), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5)(농도 10 마이크로그램/mL)로 0, 24 및 48시간 동안 자극하였다. 이어서 세포 상청액을 ELISA를 사용하여 인터페론 베타 및 감마의 투여량에 대해 지시된 시간에 수집하였다.
이전의 OM 박테리아 추출물을 사용하여 BEC에 의한 본래의 INF 베타 및 감마 분비와 비교하여(도 17a 및 18a), 신규 OM314A(P1, P2, P3), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5) 안정화된 생성물은 도 17c 및 18c에서 유형 1 인터페론 베타 및 유형 2 인터페론 감마를 유사하거나 더 우수한 정도로 유도할 수 있었다(I.B.를 다른 생성물과 비교). 사용한 공정에 따라, 일부 현저한 차이가 관찰되었다. 본 연구에서, 모든 OM314 안정한 박테리아 추출물의 투여량 범위-유도된 인터페론 방출을 5개의 공여자를 기준으로 수행하였다. 5개의 공여자의 평균 인터페론 값을 도 17b 및 18b에 나타냈다. 참고로 IFN-의존적 방출이 OM 박테리아 추출물 농도로부터 수득된 도 17a 및 18a와 대조적으로, 20 마이크로리터의 최대 부피를 도 17c 및 18c에서 사용하였으며, 부피는 표준 OM 박테리아 추출물의 더 적은 양에 해당한다. 인터페론 알파는 세포 외 인간 BEC 세포 상에서 OM 박테리아 추출물에 의해 유도되지 않았고 신규한 안정한 OM314A(P1, P2, P3), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5)에 의해서도 유도되지 않았다(도시되지 않음).
실시예 8: 인간 폐 생검에서 유래한 1차 인간 상피 세포(BEC)에 대한 베타 β-디펜신-1 및 ICAM-1의 발현 변화에 대한 본 발명에 따른 박테리아 추출물의 보호, 항-바이러스 효과.
실시예 8.1: β-디펜신-1 및 ICAM-1
실시예 8과 관련하여 원래의 박테리아 추출물 OM으로 수득된 이전의 데이터와 체계적으로 비교한 후 신규의 안정한 OM314A(P1, P2, P3), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5) 제제를 평가하는데 추가로 추구하고자, 우리는 인간 BEC에도 또한 공개된 이전의 데이터를 확인하는 것을 목표로 하였지만 이전에 OM 박테리아 추출물에 의해 유도된 다른 항-바이러스 특징을 사용하였다(문헌[Roth et al. 2017]). 이는 인간 폐-유래 1차 상피 세포(BEC)에 의한 항-바이러스 베타 β-디펜신-1 발현을 산업용 배치(I.B. #1619057)와 동일하거나 더 우수한 정도로 유도하는 신규의 안정한 OM314A(P1, P2, P3), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5) 제제의 능력을 보여주는 보여주는 도 19에서 입증되었다. 동일하게, 이러한 항바이러스 효능은 또한 이러한 세포의 표면에 있는 리노 바이러스 ICAM-1의 감소로 입증되었다. 도 20b는 인간 BEC에 의한 ICAM-1 바이러스 수용체 발현을 산업용 배치(I.B. #1619057)와 동일한 정도로 감소시키는 신규의 안정한 OM314A(P1, P2, P3), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5) 제제의 능력을 보여준다. 따라서, 두 경우 모두에서 새로 제조된 안정한 박테리아 추출물 OM314가 공정, 박테리아 추출물 함량에 따라 유사하거나 우수한 차이로 이전의 OM 박테리아 표준의 역가 및 효능을 유지하는 능력을 확인하였다.
실시예 9: 마우스 골수-유래 수지상 세포로부터의 TNFα의 방출에 의해 입증되고 모니터링된 본 발명에 따른 박테리아 추출물의 어댑터 및 TLR-의존적 효과기 단백질 MyD88을 활성화시키는 능력.
실시예 9.1: BMDC 제조
새로 제조된 안정한 박테리아 추출물 OM314A(P1, P2, P3), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5)의 선천 면역 활성화 효능을 동일하거나 우수한 수준으로 유지하는 능력에 대한 조사를 더욱 확장하기 위해, 우리는 본래 Dang et al.(문헌[Sci Rep. 2017 Mar 6;7:43844])에서 광범위하게 예시된 OM 박테리아 표준의 항염증 및 조절 효과를 입증하는 동일한 연구를 수행하였다. 이를 위해, 활성화 시 필요한 모든 세포 구성요소를 사용하므로 하나의 단일이지만 요약 유형의 연구를 수행하였다. 표면 수용체(TLR), OM 박테리아 추출물이 보호를 유도하는데 필수적인 효과기 단백질(MyD88), 및 절단 및 세포질에서 핵(NFkB)으로의 전위(translocation) 시 사이토카인 방출을 유도하는 전사 인자로서, 배지에서 전사 및 사이토카인 방출이 측정된다(TNFα). 이를 위해, 마우스의 뼈에서 1차 골수-유래 수지상 세포를 사용하였다. 골수(BM) 세포를 6 내지 10주령 야생형 C57/BL6 또는 다양한 TLR 녹아웃 마우스(본원에 TLR4 녹아웃(TLR4 -/-) 및 WT 마우스로만 표시됨)의 대퇴골 및 경골에서 뼈를 차가운 PBS로 세척하여 추출하였다. BMDM의 후속 세포 처리 및 이들의 성숙 및 수지상 세포(BMDC)로의 분화를 Dang et al. 2017에 따라 수행하였다. 항-마우스 CD11c 및 항-마우스 MHCII 항체로 세포를 염색하여 배양물의 순도를 결정하고 CD11c+MHCIIhigh 세포의 퍼센트를 유동 세포 분석에 의해 분석하였다.
실시예 9.2: BMDC 자극 및 사이토카인 방출 측정
BMDC를 2 × l05 세포/웰의 밀도로 96-웰 조직 배양 플레이트에 플레이트하고 Enzo Life Sciences의 LPS(4 mg/mL)로, 또는 상이한 농도의 새로 제조된 안정한 박테리아 추출물 OM314A(P1, P2, P3), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5)로 16시간 동안 자극하였다. 도 21에서 참조로, 상이한 농도(50 내지 1600 ug/mL)의 산업용 배치(I.B. #1619056OM)의 박테리아 추출물을 사용하였다(좌측 상단 모서리). TNF-α 사이토카인의 농도를 eBioscience의 TNF-α 키트를 사용하여 제조사의 지침에 따라 ELISA 키트에 의해 무세포 상청액에서 측정하였으며, 도 21에 예시된 바와 같이, 모든 새롭게 제조된 안정한 박테리아 추출물 OM314A(P1, P2), OM314B(P4) 및 OM-314C(P5) 중 하나(3-히드록시-부타노이드-산 P3)는 야생형 정상 마우스의 대조군(I.B.)과 동일한 정도로 BMDC으로부터 TNF-α의 분비를 유도할 수 있었다. 흥미롭게도, 이러한 분비는 몇몇 경우 동등하거나 더 우수하였으며(투여량-의존적) 이는 이러한 상이한 박테리아 추출물 기원의 선별적 반응의 중요성을 입증한다. 동시에, 신규한 안정한 박테리아 추출물 OM314A P3, P4 및 P5는 TLR4 수용체가 BMDC로부터 TNF-α의 방출을 유도할 필요가 없었으며 그 이유는 이러한 사이토카인은 또한 이러한 TLR4(TLR4 -/-)의 부재 시에도 분비되었기 때문이다. LDA는 상이한 유기체가 상이한 군을 지배하고 i) BE(21개의 균주 세포용해물의 박테리아 추출물)가 HFD 마우스에서 유해한 박테리아 군을 방지하고 ii) 군 다양성을 증가시킨다는 것을 보여준다.
실시예 10: 고지방 식이를 유지하는 동물에서 장 내 세균불균형을 역전시키는 본 발명에 따른 박테리아 추출물의 경구 주변 투여 능력.
실시예 10.1: 미생물총의 평형의 중요성 및 분류학에 의한 세균불균형 및 미생물총 분석의 해로운 결과.
특정 미생물총 패턴은 다양하며 식이, 연령, 유전학 및 약물과 같은 다양한 외부 요인에 따라 달라진다(문헌[Dieterich et al. Med Sci (Basel). 2018;6(4): 116. Published 2018 Dec 14, doi: 10.3390/medsci6040116]). 미생물총이 항상성에 어떻게 기여할 수 있는지 보여주는 연구가 아직 시대의 시작 단계에 있지만, 미생물총 세균불균형이 특정 의학적 상태로 이어지는 정확한 메커니즘의 해명, 균형 잡힌 미생물총 유지의 중요성이 가장 중요하며 이러한 불균형을 회복하기 위해 긴급한 제품이 필요하다. 따라서, 장 내 세균총의 불리한 집단을 유리한 미생물 생태계로 회복시키면 인간의 질환을 예방할 수 있다(문헌[Young VB et al. BMJ 2017;356: j 831]). 임신 중 고지방 식이(HFD) 섭취의 지방독성 효과를 평가하기 위한 연구에서, 우리는 최근에 8주간의 HFD 섭취가 장 내 세균불균형, 산화 스트레스, 염증 증가 및 염증 유발 위험을 증가시켜 조기 분만(PTB: preterm birth)을 유도함을 보여주었다. 따라서, 본 실시예에서, 우리는 본 발명의 박테리아 추출물이 HFD 유도된 장 내 세균불균형 및 대사 및 면역 상태에 대한 관련 유해 영향을 역전시키는 능력을 결정하기 시작했다. 분류학의 결과는 도 22에 표시된 대로 선형 판별 분석(LDA) 점수의 측정을 가능하게 하였다. 이러한 도면은 특정 미생물-유기체에 대한 박테리아 세포용해물 특이적 효과를 보여준다. HFD 대조군 마우스(HFD Sham)에 존재하는 바람직하지 않은 클로스트리디알레스, 퍼무쿠테스, 클로스트리디아 및 블라우티아 종이 박테리아 추출물(HFD-BE)을 공급한 마우스에서 회복되었고 정상 사료 대조군 식이 마우스(NCD-Sham)에서도 적은 정도로 회복되었다. 또한, HFD의 소비에 의해 고갈되는 바람직한 유기체의 증가 수준이 또한 박테리아 세포용해물(HFD-BE 및 NCD-BE)을 공급한 마우스의 미생물총 함량에서 확인되었다. 선택된 종 세트의 증가 및 감소를 입증하는 표준 분류학적 분석과 달리, 도 22에서 입증된 LDA 점수는 4개 군(NCD-Sham, NCD-BE, HFD- Sham, HFD-BE) 각각의 별개의 종을 예시한다. LDA는 상이한 유기체가 상이한 군을 지배하고 i) BE(21개의 균주 세포용해물의 박테리아 추출물)가 HFD 마우스에서 해로운 박테리아 군을 예방하고 ii) 군 다양성을 증가시켜 본 발명의 박테리아 세포용해물의 긍정적인 효과를 확인한다는 것을 보여준다.
실시예 10.2: 방법, 동물, 음식 섭취, 글루코스 내성, 인슐린 저항성 및 식이.
2개의 상이한 마우스 계통 C57BL/6 및 CD1을 본 연구 전반에 걸쳐 사용하였다. C57BL/6 마우스는 고지방 식이(HFD)를 공급할 때 비만, 고혈당 및 인슐린 저항성이 되는 것으로 알려진 이점이 있는 근친 교배 계통이다. 반대로, CD1 마우스는 HFD를 섭취한 후 대사 장애가 경미하지만, 근친교배의 이점이 있으므로, HFD에 대한 특이 반응을 피할 수 있다. 마우스를 Jackson Laboratories(미국 메인주 바 하버 소재)에서 구입하였다. 각 계통의 동일한 수의 수컷 및 암컷 마우스를 각각 12시간의 낮과 밤 주기로, 24℃의 동물 관리 센터(Animal Care Center)에서 개별적으로 환기되는 케이지에 수용하고, 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. 60% 지방의, 고포화 지방 함량의, 주로 라드 및 대두유 유래 오일을 포함한 식이를 HFD-마우스에 제공하였고 13.3% 지방을 함유하는 NCD를 NCD-마우스에 제공하였다. 음식 및 물을 자유롭게 제공하였다. OM 박테리아 추출물을 14일 동안 비강 내 경로(0.05 mL)를 통해 또는 4주 및 8주 동안 매일 마우스의 입으로 직접 경구 경로를 통해(≤ 0.15 mL) 피펫팅으로 경구 주변 경로로 투여하였다. "sham 처리"(음성 대조군)를 받은 마우스에 14일 동안 1일 1회 0.05 mL의 물을 피펫팅으로(비강 내로) 또는 4주 및 8주 동안 매일 마우스의 입으로 직접 경구 경로를 통해(≤ 0.15 mL) 투여하였다. 양성 대조군. 장 내 세균불균형을 역전시키는 프로바이오틱인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 6일 동안 이들의 식수에 2 × 108 CFU/mL을 첨가함으로써 양성 대조군 마우스에 투여하였다. 장 내 미생물총에 대한 OM 박테리아 추출물 효과 분석: 분변 샘플을 수집하고 서열분석으로 16S rRNA를 분석하였다. 서열분석 후 샘플의 기능적 유전자를 특성분석하고 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG) 경로 분석을 사용하여 미생물 군집의 기능적 유전자간의 차이를 분석하였다. 이러한 유전자의 단백질 기능 분류를 오솔로그 군 클러스터(COG: Cluster of Orthologous Group) 패밀리 정보를 사용하여 예측하였다. OM 박테리아 추출물이 대사 상태에 미치는 영향 분석: 글루코스 내성 시험(GTT) 및 인슐린 내성 시험(ITT)을 8주 기간의 시작과 끝에 모든 마우스에서 수행하였다. 마우스를 8시간 동안 단식시킨 다음 인슐린을 포함하거나 포함하지 않은 2.0 g/kg 글루코스의 복강 내 주사를 시도하고 글루코스 수준을 0, 15, 30 및 60분에 측정할 것이다.
실시예 10.3: 21개의 박테리아 세포용해물의 박테리아 추출물(BE)의 다양한 속(genus)에 미치는 영향
부록 및 도 22에 요약된 데이터를 추가로 채우기 위해, BE에 의해 유도된 속의 여러 변화의 예가 도 26에 도시되어 있다. 본 실시예에서, BV는 유해한 속에 긍정적인 영향(성장 감소), 및 동시에 진정한 속의 성장에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 본 도면에 5가지 예가 도시되어 있다. (a) BE는 HFD에 의해 유발된 클로스트리디알레스 라흐노스피라세아 블라우티아 속을 감소시킨다; (b) BE는 HFD에 의해 유도된 클로스트리디아 클로스트리디알레스 루미노코카세아 GCA-900066225 속을 감소시킨다;(c) BE는 NCD 및 HFD 마우스 둘 모두에서 클로스트리디알레스 루미노코카세아 루미노코카세아 UCG-0101을 감소시킨다; (d) BE는 HDF에 의해 고갈된 박테로이달레스 뮤리배큘라세아 비배양된 박테리움을 회복시킨다; (e) BE는 라흐노스피라세아애 [유박테륨] 피시칸테나 군을 감소시킨다.
실시예 11: 글루코스 내성을 개선하기 위한 박테리아 추출물의 경구 주변 투여의 능력.
실시예 11.1: 21개의 균주 세포용해물의 박테리아 추출물의 식이 전(Pre-diet), 정상 사료 식이 요법 후 마우스(Post-NCD), 고지방 식이 후(Post-HFD) 글루코스 농도 시험.
박테리아 추출물에 의한 장 내 세균불균형의 교정에 더하여, 이러한 당뇨병 마우스에서 글루코스 내성을 또한 조사하였다. 이러한 파라미터는 임상적 관점에서 가장 중요하다. 도 23b의, L. 플란타럼이 아닌, 21개의 균주 세포용해물의 박테리아 추출물을 공급한 정상 사료 대조군 마우스(NCD-BE)(일반적으로 장 내 세균불균형의 재구성을 개선하기 위한 양성 대조군으로 사용됨)는 더 낮은 글루코스 농도에 의해 나타나는 바와 같이 글루코스 내성이 유의하게 증가하였다. 동일하게, 이러한 효과는 또한 도 23c에 도시된 바와 같이 21개의 균주 세포용해물의 박테리아 추출물을 공급한 고지방 식이 마우스(HFD-BE)에서 입증되었지만, 그 정도는 더 작았다.
실시예 11.2: 체중 및 음식 소비 평가
도 24에서, 두 파라미터를 대조군으로서 시험하였다. 결과는 21개의 균주의 세포용해물의 박테리아 추출물을 공급한 고지방 식이 마우스(HFD-BE)가 체중 증가를 유의하게 감소시킨다는 것을 보여준다. 이는 이러한 고지방 식이 마우스에서 예시된다(도 24a). 부수적으로, 이러한 체중 부재는 본원에서 대조군으로서 측정되고 표현된 음식 소비에 영향을 미치지 않고 발생하였다(도 24b). 흥미롭게도, 이러한 효과는 이러한 측정에 일반적으로 사용되는 l. 플란타럼보다 훨씬 더 효과적이었다.
실시예 11.3: 인슐린 내성 평가
고지방 식이(HDF) 요법에 노출된 당뇨병 마우스에서 21개의 균주 세포용해물의 박테리아 추출물(BE) 처리로 수득된 글루코스 내성에 대한 상기 언급된 보호 결과를 고려하여, 우리는 인슐린 수준이 보호 목적으로 수정되는지 추가로 조사하였다. 도 25는 참조로 설정된 처리 전(PRE-DIET) 및 고지방 식이 마우스(HFD)에서 처리 후(POST-DIET) 마지막 8주에서 모든 마우스(42)에서 인슐린 내성을 보여준다. 인슐린 저항성 감소를 나타내는 l. 플란타럼을 공급한 정상 사료 식이 마우스(NCD-L-plant.)에 대해 예측되는 바와 같이(도 25b), 21개의 세포용해물의 HFD-BE 박테리아 추출물을 공급한 마우스는 고지방 마우스에서 유의하게, 그리고 모든 시점에서 인슐린 저항성을 나타냈다. 21개의 세포용해물의 박테리아 추출물에 의한 이러한 보호 효과는 글루코스 데이터와 일치하며 이전 수치로부터 체중 증가가 없었으며, 당뇨병 환자에서 측정된 표준 파라미터의 긍정적인 재구성을 나타낸다. 따라서, 21개의 균주 세포용해물의 박테리아 추출물(BE)은 이러한 요법을 받는 만성 HFD 마우스에서 보호적 장 내 세균불균형을 유도할뿐만 아니라, 체중, 글루코스 및 인슐린과 관련된 본원에 예시된 관련 후유증, 21개의 균주 세포용해물의 박테리아 세포용해물에 의한 보호에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 확인한다.

Claims (32)

  1. 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아 종(species)의 박테리아 추출물로서,
    상기 박테리아 추출물은 상기 박테리아 종의 알칼리성 세포용해 및 아세트산, 프로피온산, 락트산, 3-히드록시프로판산, 피루브산, 부타논산, 2-히드록시부타논산, 3-히드록시부타논산, 글루탐산, 아스파르트산, 이들의 조합, 및/또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 에스터 중에서 선택되는 하나 이상의 유기산으로 중화 후, 상기 중화된 추출물을 여과하여 정제하고 상기 중화에 사용된 유기산 또는 이들의 조합을 첨가하여 최종 생리학적 pH로 조정함으로써 수득 가능한, 박테리아 추출물.
  2. 제1항에 있어서, 0 내지 300 kDa 내지 0 내지 100 kDa, 또는 0 내지 60 kDa의 분자량 성분의 감소된 분획을 포함하는, 박테리아 추출물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 알칼리성 세포용해는 ±0.1의 pH의 변화로 10 초과의 pH에서 수행되는, 박테리아 추출물.
  4. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 최종 pH는 5 내지 8, 6 내지 8, 6.3 내지 7.8, 또는 6.5 내지 7.8로 조정되는, 박테리아 추출물.
  5. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 박테리아 종은 모라셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 및/또는 스트렙토코커스 생귀니스(Streptococcus sanguinis) 중에서 선택되는, 박테리아 추출물.
  6. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 박테리아 종은 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 균주 중에서 선택되는, 박테리아 추출물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 락토바실러스 균주는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 카제이 디펜시스(Lactobacillus casei defensis), 락토바실러스 카제이 속 카제이(Lactobacillus casei ssp. casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 및/또는 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii) 중 하나 이상을 포함하는, 박테리아 추출물.
  8. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 박테리아 종은 대장균(Escherichia coli) 박테리아 균주 중에서 선택되는, 박테리아 추출물.
  9. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정한 정제된 박테리아 추출물은 100 마이크로그램/ml 미만의 핵산, 적어도 0.1 mg/mL의 사카라이드를 포함하는, 박테리아 추출물.
  10. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 추출물은 실온, 4℃, -20℃, 또는 -80℃에서 액체 형태로 안정한, 박테리아 추출물.
  11. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 따른 상기 박테리아 추출물 및 약학적으로 허용되는 부형제 또는 비히클을 포함하는 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 고체, 반-고체, 액체, 또는 에어로졸 제형 형태인, 약학 조성물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 조성물은 비강 내(intranasal), 기관 내(intratracheal), 점막(mucosal), 경점막(transmucosal), 외부 피부 국소(external skin topical), 협측(buccal), 설하(sublingual), 경구(oral), 폐(pulmonary), 기관지 내(intrabronchial), 및/또는 폐 내(intrapulmonary) 투여 경로용으로 제형화되는, 약학 조성물.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 액체 또는 에어로졸이고, 분무, 점적, 콜로이드, 미스트, 네뷸라, 및/또는 미립화 증기(atomized vapor)로 제형화되는, 약학 조성물.
  15. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 액체 또는 반-고체이고, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 수성 분산액, 오일, 밀크, 발삼, 포말, 수성 또는 유성 로션, 수성 또는 유성 겔, 크림, 용액, 히드로알코올 용액, 히드로글리콜 용액, 히드로겔, 세럼, 연고, 무스, 페이스트, 또는 경피 패치의 형태로 제형화되는, 약학 조성물.
  16. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 고체이고, 분말 및/또는 분쇄 가능한(crushable) 정제로 제형화되는, 약학 조성물.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 감염 및/또는 염증 및/또는 신생물 및/또는 세균불균형(dysbiosis)으로부터 야기된 급성 및 만성 면역학적 장애의 치료 및/또는 예방 방법에 사용하기 위한, 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 면역학적 장애는 T 헬퍼 1, T 헬퍼 17 및 T 헬퍼 2 면역 반응 사이의 불균형, T reg 불균형, 2형 과민증, 면역-억제, 호산구 증가증, 알러지 또는 아토피 중에서 선택되는, 약학 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 상기 감염은 상기도 및 하기도 감염 및/또는 관련 후유증 예컨대 알러지성 비염, 비염, 비인두염, 부비동염, 인두염, 편도염, 후두염, 기관염, 인후염, 인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스, 리노바이러스, 코로나바이러스, 크루프, 폐렴, 과민성 폐렴, 기관지폐렴, 기관지염, 세기관지염, 폐렴, 급성 하기도 감염을 동반한 폐쇄성 폐 질환, 급성 상기도 감염을 동반한 폐쇄성 폐 질환, 또는 상피 섬모 운동 장애 및/또는 점액 제거 장애를 동반한 질환 중에서 선택되는, 약학 조성물.
  20. 제17항에 있어서, 상기 감염은 2차 감염, 인플루엔자 바이러스 감염에 따른 박테리아 2차 감염, 비-호흡기 바이러스 감염, 비-호흡기 박테리아 감염, 전신 감염 예컨대 패혈증, 패혈성 쇼크 또는 바이러스-유발 합병증을 포함하는, 약학 조성물.
  21. 제17항에 있어서, 상기 염증은 알러지성/아토피성 호흡기 및 비-호흡기 적응증 아토피 피부염, 급성 및/또는 만성 관련 피부염, 아나필락시스 또는 식품 알러지 중에서 선택되는, 약학 조성물.
  22. 제17항에 있어서, 세균불균형 관련 장애는 비만, 천식, 당뇨병, 자가면역 질환, 저 섬유질 요법과 관련된 질환, 아토피성 피부염, 급성 및/또는 만성 관련 피부염, 건선, 대사성 질환, 예컨대 NASH 및 NAFLD, 및/또는 간 섬유증 중에서 선택되는, 약학 조성물.
  23. 제17항에 있어서, 상기 염증은 태양-유발 염증 및 발적 피부를 비롯한 광손상, 피부 위축, 피부 색소침착, 광피부염, 홍반, 모세혈관확장증, 쿠페로스, 또는 광선 각화증을 비롯하여 피부 장애, 염증이 있는 피부, 습진, 주사비(rosacea), 아토피성 피부염, 건선 중에서 선택되는, 약학 조성물.
  24. 제17항에 있어서, 상기 염증은 T 헬퍼 2 우세 자가면역 적응증, 예컨대 그레이브스 병, 하시모토병, 피부경화증(scleroderma), Ig 4 관련 질환, 또는 천포창 중에서 선택되는, 약학 조성물.
  25. 제17항에 있어서, 상기 염증은 호산구성 적응증, 예컨대 호산구성 방광염, 호산구성 식도염, 호산구성 근막염. 호산구성 위장염, 고호산구성 증후군, 호산구 육아종증 다발관 혈관염(eosinophilic granulomatosis with polyangiitis), 호산구성 천식, 또는 호산구성 폐렴 중에서 선택되는, 약학 조성물.
  26. 제17항에 있어서, 상기 신생물은 면역학적 장애(제17항에 열거된 바와 같음)가 있는 신생물 적응증, 예컨대 비만세포증, 비만 세포 백혈병, T 헬퍼 2 편향 및/또는 면역-억제된 종양 중에서 선택되는, 약학 조성물.
  27. 제17항에 있어서, 세균불균형 관련 장애는 궤양성 대장염을 포함하는 염증성 장 질환, 크론병, 대장염, 대사성 장애, 비만, 2형 당뇨병, NASH 및/또는 NAFLD를 포함하는 간 부전, 간 섬유증, 신부전, 자가면역 질환, 또는 저 섬유질 요법과 관련된 질환 중에서 선택되는, 약학 조성물.
  28. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 기관 내, 비강 내, 기관 내, 점막, 경점막, 국소 외부 피부, 협측, 설하, 경구, 폐, 기관지 내, 및/또는 폐 내 경로에 의해 대상체에 투여되는, 약학 조성물.
  29. 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간 또는 비-인간 동물 대상체인, 약학 조성물.
  30. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 포함하는 전달 장치로서,
    상기 전달 장치는 비강 취입기 장치, 비강 내 흡입기, 비강 내 분무 장치, 분무기(atomizer), 비강 분무 병, 단위 용량 컨테이너, 펌프, 점적기, 압착 병, 네뷸라이저, 정량 흡입기(MDI: metered dose inhaler), 가압 용량 흡입기(pressurized dose inhaler), 취입기, 양방향 장치, 용량 앰플, 비강 패드, 비강 스폰지, 및 비강 캡슐을 포함하는 군으로부터 선택되는, 전달 장치.
  31. 제30항에 있어서, 인간 대상체에서 상기도 및 하기도 감염, 관련 후유증 및/또는 2차 감염, 세균불균형 및 세균불균형 관련 장애의 치료 및/또는 예방 방법에서 사용하기 위한, 전달 장치.
  32. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항의 약학 조성물의 제조 공정으로서,
    a. 적합한 배양 배지에서 각 박테리아 균주 종을 배양하는 단계,
    b. 10 초과의 초기 pH에서 각 균주를 세포용해하는 단계,
    c. 아세트산, 프로피온산, 락트산, 3-히드록시프로판산, 피루브산, 부타논산, 2-히드록시부타논산, 3- 히드록시부타논산, 글루탐산, 아스파르트산, 이들의 조합, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 에스터 중에서 선택되는 하나 이상의 유기산을 1 또는 2 단위 첨가하여 단계 (b)에서 수득된 추출물의 pH를 감소시키는 단계,
    d. 단계 (c)의 생성물을 마이크로필터를 통해 적어도 1회 통과시키고 상기 생성물을 한외필터 상에 유지시켜 정제된 가용성 추출물을 수득하는 단계,
    e. 단계 (b)에서 사용된 유기산 또는 이들의 조합을 첨가하여 최종 pH를 약 7(+/- 1.0)로 조정하는 단계, 및
    f. 약학적으로 허용되는 부형제 또는 비히클을 첨가하는 단계를 포함하는, 공정.
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