TW202304485A - 用於增強免疫力的方法和組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了用於增強個體免疫力的新型組合物和方法。

Description

用於增強免疫力的方法和組合物
本發明涉及用於增強免疫力的方法和組合物。 相 關 申 請本申請要求2021年4月12日提交的美國臨時專利申請號63/173,947的優先權，其內容通過引用整體併入本文用於所有目的。
近年來，病毒和細菌感染在世界範圍內變得越來越普遍，並呈現嚴重的公共健康威脅。例如，由嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒2(SARS-CoV-2)引起的呼吸道疾病的冠狀病毒-2019(COVID-19)全球流行病已經影響全世界近12億人，包括超過260萬人死亡，對公共健康的威脅因大量的無症狀攜帶者而正在加劇。幾種有潜力的治療劑目前正在被積極研究和開發，以用於預防或者治療COVID-19，從而預防或改善其對受累患者的損害作用，而同時實驗疫苗正廣泛地被分配到一般人群中。
因此，對控制病毒和細菌感染以及減輕或消除它們的相關作用的新的、有意義的治療方法存在迫切需要。本研究的目的是鑒定用於預防嚴重感染結果和治療感染症狀的腸道微生物功能途徑和微生物代謝物。刺激這些腸道微生物功能途徑或直接補充有益微生物代謝物是增強免疫力，治療病毒或細菌感染(包括COVID-19)和促進從這些病毒或細菌疾病中恢復的潛在有效的手段。本發明通過舉例說明在病毒或細菌感染期間腸道微生物群的改變以及治療性微生物和細菌代謝物在預防、治療和恢復由這種感染引起的疾病和病況中的潛在作用來滿足這種需要和其它相關的需要。
在由病毒或細菌病原體引起的感染性疾病以及對這些疾病的預防，治療和從其恢復的背景下，本發明人進行了對腸道微生物功能途徑和微生物代謝物的廣泛研究。相關的途徑和代謝物已經被鑒定，現在它們為增強或改善個體的免疫力和預防或治療(例如，降低疾病嚴重程度)以及促進從感染性疾病如COVID-19中恢復提供了新的方法和組合物。
在第一方面，本發明提供了在個體中增強免疫力，預防或治療諸如COVID-19的病毒或細菌感染，或減輕疾病症狀或嚴重程度的方法。所述方法包括向個體施用有效量的組合物的步驟，所述組合物包含至少一種短鏈脂肪酸、L-異亮氨酸或一種或多種表3中所示的代謝物，或產生短鏈脂肪酸或L-異亮氨酸或這類代謝物的細菌，或它們的任意組合，條件是受試者除此以外不需要用短鏈脂肪酸或L-異亮氨酸或這類代謝物治療。在一些實施方案中，施用步驟包括經口攝入組合物，例如呈片劑、膠囊劑、溶液/懸浮液、乳液、糊劑、粉末劑的形式，或呈食品或飲料物品或其添加劑的形式。在一些實施方案中，所述組合物包含至少一種短鏈脂肪酸，任選地兩種或更多種不同的短鏈脂肪酸的組合。在一些實施方案中，所述組合物包含至少一種短鏈脂肪酸和L-異亮氨酸。在一些實施方案中，所述組合物包含至少一種產生短鏈脂肪酸或L-異亮氨酸或所述代謝物的細菌，任選地兩種或更多種不同細菌物種的組合，例如青春雙歧桿菌和陪伴糞球菌( Coprococcus comes)。在一些實施方案中，短鏈脂肪酸是乙酸、丙酸、丁酸或異丁酸。在一些實施方案中，短鏈脂肪酸可以是丁酸、丁酸鹽或丁酸甘油酯。在一些實施方案中，細菌是產生丁酸的革蘭氏陽性厭氧細菌。在一些實施方案中，所述細菌是普拉梭菌。在一些實施方案中，細菌是雙歧桿菌屬的物種，例如青春雙歧桿菌或陪伴糞球菌，然而在一些情況下不是青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌中的任何一種，或者至少不是青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌中的兩種，三種或更多種的組合。在一些實施方案中，受試者已經被診斷患有COVID-19或處於被SARS-CoV2感染的風險中。在一些實施方案中，特別是當受試者正在尋求治療(例如，減輕症狀或疾病嚴重程度)或預防COVID-19時，所述方法還包括向受試者施用已知有效抑制SARS-CoV2並促進患者從COVID-19恢復的一種或多種藥劑(例如，伊維菌素、維生素C、維生素D、槲皮素、褪黑激素、鋅、阿奇黴素、羥基氯喹、氟伏沙明或氟西汀，或其任意組合)，其可以在相同的組合物中或在第二單獨的組合物中。在一些實施方案中，受試者雖然正在從COVID-19恢復，但在疾病的活動階段結束後4周或更長時間仍然受長期持續的症狀的困擾。
在相關方面，本發明提供了組合物用於改善受試者免疫力的新用途。所述組合物包含有效量的(1)以下中的至少一種，可能兩種或更多種的活性成分：短鏈脂肪酸、L-異亮氨酸、表3中所示的代謝物，和產生所述短鏈脂肪酸或L-異亮氨酸或所述代謝物的細菌；和(2)生理學上可接受的賦形劑。在一些實施方案中，所述組合物基本上由活性成分加上一種或多種賦形劑組成。在一些實施方案中，受試者被診斷為患有COVID-19或受試者處於感染SARS-CoV-2的風險中，從而尋求對疾病的預防或治療(例如，降低疾病嚴重程度或症狀)。在一些實施方案中，所述組合物被配製用於經口攝入，例如以片劑、膠囊劑、溶液/懸浮液、乳液、糊劑、粉末劑的形式，或以食品或飲料物品或其添加劑的形式。在一些實施方案中，所述組合物包含短鏈脂肪酸和L-異亮氨酸，或至少兩種或更多種短鏈脂肪酸的組合，具有或不具有L-異亮氨酸。在一些實施方案中，所述組合物中的生理上可接受的賦形劑是澱粉、菊粉、燕麥麩、麥麩、纖維素、瓜爾膠或果膠。在一些實施方案中，特別是當組合物用於預防或治療COVID-19時，組合物可以進一步包含已知有效抑制SARS-COV2並促進患者從COVID-19恢復的一種或多種藥劑(例如，伊維菌素、維生素C、維生素D、槲皮素、褪黑激素、鋅、阿奇黴素、羥基氯喹、氟伏沙明或氟西汀或其任何組合)。在一些實施方案中，所述細菌是產生丁酸的革蘭氏陽性厭氧細菌。在一些實施方案中，所述細菌是普拉梭菌。在一些實施方案中，所述細菌是雙歧桿菌屬的物種，例如青春雙歧桿菌或陪伴糞球菌。在一些情況下，所述細菌不包括青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌中的任一種，或者所述細菌不包括青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌中的兩種或三種或更多種。
在第二方面，本發明提供了用於在受試者中提高免疫力、用於預防或治療受試者的諸如COVID-19的病毒或細菌感染、或用於減輕疾病症狀或嚴重程度的試劑盒。所述試劑盒包括至少兩個，可能更多的容器，每個容器含有包含有效量的一種或多種活性成分的組合物，所述活性成分可以是短鏈脂肪酸、L-異亮氨酸或表3中命名的化合物，或產生短鏈脂肪酸或L-異亮氨酸或所述化合物的細菌，或以上的任何組合。例如，第一和第二容器含有兩種不同的組合物，所述兩種不同的組合物包含兩種不同的短鏈脂肪酸或產生相同或不同的短鏈脂肪酸的兩種不同的細菌物種，例如產生丁酸的革蘭氏陽性厭氧細菌。所述試劑盒可以進一步包括含有已知有效抑制SARS-COV2和促進患者從COVID-19恢復的一種或多種藥劑(例如，伊維菌素、維生素C、維生素D、槲皮素、褪黑激素、鋅、阿奇黴素、羥基氯喹、氟伏沙明或氟西汀或其任何組合)的額外容器。此外，用戶說明手冊可以包括在試劑盒中，用於說明試劑盒的適當使用。
定義
“ 短 鏈 脂肪 酸 (SCFA)”是具有少於6個碳原子的脂肪酸。本文所用的SCFA包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和2-甲基丁酸以及它們的化學衍生物如鹽、酯等。
本文所用的術語“ SARS-CoV-2或嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒2”是指引起冠狀病毒疾病2019(COVID-19)的病毒。它也被稱為“COVID-19病毒”。
本文所用的術語“ 抑制 (inhibiting)”或“ 抑制 (inhibition)”是指對受試者中的靶生物過程的任何可檢測的負面影響，例如靶基因的RNA/蛋白表達、靶蛋白的生物活性、細胞信號轉導、細胞增殖、生物體特別是微生物的存在/水準。通常，抑制反映在與對照比較時，靶過程、或上述的下游參數之一中的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更大的降低。“抑制”還包括100%的降低，即完全消除、預防或清除靶生物過程或信號。其它相對術語如“抑制(suppressing)”、“抑制(suppression)”、“降低(reducing)”和“降低(reducion)”在本公開中以類似的方式使用，是指降低至不同的水準(例如，與對照水準相比，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更大的降低)直至完全消除靶生物過程或信號。另一方面，本公開中使用的術語如“活化(activate)”、“活化(activating)”、“活化(activation)”、“增加(increase)”、“增加(increasing)”、“促進(promote)”、“促進(promoting)”、“增強(enhance)”、“增強(enhancing)”或“增強(enhancement)”涵蓋不同水準(例如，與對照水準相比，至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%，60%、70%、80%、90%、100%、200%或更高，例如3、5、8、10、20倍的增加)的正向變化。
本文所用的術語“ 治 療 (treatment)”或“ 治 療 (treating)”包括解決疾病或病況的存在或後來發生此類疾病或病況的風險所採取的治療性和預防性措施。其涵蓋用於減輕進行中的症狀、抑制或減緩疾病進展、延遲症狀發作或消除或減少由此類疾病或病況引起的副作用的治療性或預防性措施。本背景下的預防性措施及其變型不需要100%消除事件的發生；相反，它們是指抑制或降低這種發生的可能性或嚴重程度或延遲這種發生。
術語疾病的“ 嚴 重 程度”是指疾病發展對患有該疾病的患者的良好狀態和健康造成不良影響的水準和程度，例如短期和長期的身體、精神和心理缺陷，直到並且包括患者的死亡。疾病的嚴重程度可以反映在必需的治療性和維持措施的性質和數量，患者恢復所需的持續時間，可能的恢復程度，患者完全恢復的百分比，需要長期護理的患者的百分比，和死亡率中。
接受本發明的組合物或治療方法的“ 患者”或“ 受 試 者”是任何年齡、性別和種族背景的人，通常是成年人，其可能未被診斷患有任何特定疾病或病症但需要增強免疫力(例如，處於病毒或細菌感染的風險中)，或其已經被診斷患有涉及諸如COVID-19的病毒或細菌感染的疾病或病症，表現出一種或多種相關的症狀，或其已經被診斷為涉及病毒或細菌感染(例如COVID-19)的這樣的疾病或病症並且已經基本上從該疾病中恢復，當仍持續經歷殘留的症狀(例如乏力、頭痛、噁心、頭暈、肌肉或關節痛或一般虛弱)持續長期的時間段(例如在疾病的活動階段結束後至少4周，即，如陰性核酸/PCR測試所示，不再檢測到病毒或細菌病原體的存在)。通常，接受根據本發明方法的治療以提高免疫力的患者或受試者除此以外不需要用相同的治療劑進行治療。例如，如果COVID-19患者正在接受根據所要求保護的方法的治療，則該患者未患有被相同的治療劑治療的與COVID-19無關的另一種疾病(例如，心血管疾病、糖尿病、胃腸病症和疾病，例如炎性腸病(IBD)、腸易激綜合症(IBS)或通過丁酸可治療的結腸炎)。儘管患者可以是任何年齡的，但在一些情況下，患者是至少40、45、50、55、60、65、70、75、80或85歲；在一些情況下，患者可以是40至45歲，或50至65歲，或65至85歲。
本文所用的術語“ 有效量”是指施用物質產生治療效果的量。所述效果包括預防，校正或抑制疾病/病況和相關併發症的症狀進展至任何可檢測的程度，例如病毒或細菌感染和相關病症(例如COVID-19)的一種或多種症狀。確切的量將取決於治療的目的，並且將由本領域技術人員使用已知技術來確定(參見，例如，Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(vols. 1-3, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compound ing(1999)；和Pickar, Dosage Calculations(1999))。
術語“ 約”在用於提及給定值時表示涵蓋該值的±10%的範圍。
“ 藥學 上可接受的”或“ 藥 理 學 上可接受的”賦形劑是這樣的物質，其不是生物有害的或在其他方面不需要的，即賦形劑可以與生物活性劑一起施用於個體而不引起任何不需要的生物效應。賦形劑也不會以有害的方式與其中包含賦形劑的組合物的任何組分相互作用。
術語“ 賦 形 劑”是指可存在于本發明組合物的最終劑型中的任何本質上輔助的物質。例如，術語“賦形劑”包括媒介物、黏合劑、崩解劑、填充劑(稀釋劑)、潤滑劑、助流劑(流動增強劑)、壓縮助劑、著色劑、甜味劑、防腐劑、懸浮劑/分散劑、成膜劑/包衣劑、調味劑和印刷油墨。
術語“ 抗 細 菌 劑”是指能夠抑制、阻抑或防止細菌物種的生長或增殖的任何物質。具有抗細菌活性的已知藥劑包括通常阻抑廣譜細菌物種增殖的各種抗生素，以及可抑制特定細菌物種增殖的藥劑，例如反義寡核苷酸、小抑制RNA等。術語“抗細菌劑”類似地定義為包括具有殺死幾乎所有細菌物種的廣譜活性的藥劑和特異性阻抑靶細菌增殖的藥劑。
當在描述含有活性成分的組合物的上下文中使用時，術語“ 基本上由 .... 組 成”是指這樣的事實，組合物不含有具有活性成分的任何類似或相關生物活性或能夠增強或阻抑活性的其它成分，而一種或多種非活性成分如生理上或藥學上可接受的賦形劑可存在於組合物中。例如，基本上由有效治療疾病如COVID-19或減輕疾病嚴重程度的藥劑(例如，SCFA或L-異亮氨酸或表3中所示的一種或多種化合物)組成的組合物是不含有任何其他藥劑的組合物，所述其他藥劑可對相同病症(例如，COVID-19)具有任何可檢測的預防或治療作用或可增強或降低所述活性成分對所述病症的預防或治療作用。 發明的詳細描述 I. 引言
SARS-CoV-2感染與改變的腸道微生物群組成有關。在SARS-CoV-2感染中，參與短鏈脂肪酸代謝的腸道細菌的系統發育組呈現減少。本研究旨在表徵COVID-19患者在疾病消退前後腸道微生物組的功能譜。對來自具有COVID-19的55例未用抗生素的患者和70例非COVID-19對照的糞便樣品進行鳥槍宏基因組測序。在住院期間和直到清除SARS-CoV-2病毒1個月後收集連續的糞便樣品(多達6個時間點)。結合疾病嚴重程度和血液免疫和炎性標誌物來評估糞便微生物途徑。還測定了疾病消退前後糞便樣品中微生物功能的變化，並使用代謝物靶分析來驗證這些功能。
與非COVID-19對照相比，COVID-19患者顯示出腸道微生物組功能的顯著變化(p＜0.05)，其特徵在於用於短鏈脂肪酸(SCFA)或L-異亮氨酸生物合成的腸道微生物組的能力受損和尿素產生的能力增強。代謝物靶分析顯示COVID-19患者的糞便樣品中SCFA和L-異亮氨酸的顯著較低的糞便濃度。在COVID-19患者中，糞便樣品中受損的SCFA和L-異亮氨酸生物合成在恢復後長達1個月持續。SCFA和L-異亮氨酸生物合成的缺乏和尿素產生的增加與疾病嚴重程度和血漿CXCL-10濃度，血小板計數，白蛋白和血紅蛋白水準顯著相關(均 p＜ 0.05)。
COVID-19患者的腸道微生物組表現出受損的SCFA和L-異亮氨酸生物合成能力，其甚至在疾病消退後持續。這兩種微生物功能與宿主免疫應答相關，這強調了腸道微生物功能在SARS-CoV-2感染發病機理和結果中的重要性。
除對SCFA和L-異亮氨酸的有益作用外，本研究還揭示了對L-1,2-丙二醇降解，雙歧桿菌分流(shunt)或4-去氧-L-蘇型-己-4-烯吡喃醛酸鹽(酯)(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranuronate)的有益作用，以及對尿素迴圈途徑的負面作用。這些發現轉化為施用SCFA (例如乙酸、丙酸、丁酸/異丁酸、戊酸/異戊酸和己酸)或L-異亮氨酸(包括產生SCFA或L-異亮氨酸的細菌)，增強L-1,2-丙二醇降解，雙歧桿菌分流或4-去氧-L-蘇型-己-4-烯吡喃醛酸鹽(酯)的化合物，或抑制、阻抑或破壞患者的脲素迴圈途徑的用於增強免疫力，例如用於預防、治療或改善從COVID-19的恢復的化合物。 II. 藥 物 組 合物和 施用
本發明還提供了藥物組合物，其包含有效量的短鏈脂肪酸(SCFA)、L-異亮氨酸、表3中所示的代謝物中的任一種、或產生SCFA或L-異亮氨酸或表3的代謝物的細菌，所述細菌在預防性和/或預防性應用中用於增強人的免疫力或用於降低涉及病毒或細菌感染的疾病的風險，治療這種疾病或病症(包括降低疾病嚴重程度和促進恢復)，例如COVID-19。本發明的藥物組合物適用於多種藥物遞送系統。用於本發明的合適製劑可見於 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 第17版(1985)。關於藥物遞送方法的簡要綜述，參見Langer, Science 249: 1527-1533(1990)。
本發明的藥物組合物可以通過各種途徑施用，例如通過經口攝入的全身施用或使用直腸栓劑的局部遞送。施用藥物組合物的優選途徑是對於70kg的成年人每天以約0.1-20、約0.14-14g、約0.5-5g、約1-3g，例如約1-2或約1.4g的SCFA或L-異亮氨酸或代謝物的日劑量，或能夠產生等量的SCFA或L-異亮氨酸或代謝物的活細菌經口施用。合適的劑量可以以單一日劑量或以合適的間隔提供的分開的劑量，例如以每天兩次，三次，四次或更多次的亞劑量施用。
為了製備含有SCFA、L-異亮氨酸，表3中所示的任何一種化合物或產生SCFA或L-異亮氨酸或表3中所示的化合物的細菌菌株或其任何組合的藥物組合物，使用一種或多種惰性和藥學上可接受的載體。藥物載體可以是固體或液體。固體形式製劑包括，例如，粉末劑、片劑、可分散顆粒、膠囊劑、扁囊劑和栓劑。固體載體可以是一種或多種還可以充當稀釋劑、調味劑、增溶劑、潤滑劑、助懸劑、黏合劑或片劑崩解劑的物質；它也可以是封裝材料。
在粉末劑中，載體通常是精細分散的固體，其與精細分散的活性組分例如SCFA如丁酸或產生SCFA的革蘭氏陽性厭氧細菌菌株混合。在片劑中，將活性成分與具有所需結合特性的載體以合適的比例混合，並壓制成所需的形狀和大小。
為了製備栓劑形式的藥物組合物，首先將低熔點蠟如脂肪酸甘油酯和可哥脂的混合物熔化，並通過例如攪拌將活性成分分散在其中。然後將熔化的均質混合物倒入合適尺寸的模具中並使其冷卻和固化。
粉末劑和片劑優選含有約5重量%至約70重量%的活性成分(例如，一種或多種SCFA，例如丁酸或產生至少一種SCFA的革蘭氏陽性厭氧細菌菌株)。合適的載體包括，例如，碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石粉、乳糖、糖、果膠、糊精、澱粉、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點蠟、可哥脂等。
藥物組合物可以包括活性成分的製劑，例如，一種或多種SCFA，例如丁酸或L-異亮氨酸、表3中的代謝物或能夠產生至少一種SCFA、L-異亮氨酸、表3的代謝物或其任何組合的革蘭氏陽性厭氧細菌菌株，其中封裝材料作為載體提供膠囊，其中活性成分(具有或不具有其他載體)被載體包圍，使得載體因此與活性成分關聯。以類似的方式，也可以包括囊劑。片劑、粉末劑、囊劑和膠囊劑可用作適於經口施用的固體劑型。
液體藥物組合物包括，例如，適於經口施用或局部遞送的溶液，懸浮液和適於經口施用的乳劑。活性組分(例如，一種或多種SCFA，例如丁酸，或L-異亮氨酸，或表3中命名的代謝物，或能夠產生至少一種SCFA, L-異亮氨酸或所述代謝物的革蘭氏陽性厭氧細菌菌株)的無菌水溶液或活性組分在包括水，緩衝水，鹽水，PBS，乙醇或丙二醇的溶劑中的無菌溶液是適於直腸施用的液體或半液體組合物的實例。所述組合物可以含有接近生理條件所需的藥學上可接受的輔助物質，例如pH調節劑和緩沖劑、張力調節劑、潤濕劑、洗滌劑等。
無菌溶液可以通過將活性組分(例如，一種或多種SCFA或L-異亮氨酸或表3中所示的化合物)溶解在期望的溶劑系統中，然後使所得溶液通過膜濾器以對其進行滅菌，或可選地，通過在無菌條件下將無菌活性組分溶解在先前滅菌的溶劑中來製備。可以將所得水溶液包裝以原樣使用，或凍幹，在施用前將凍幹製劑與無菌水性載體組合。製劑的pH通常為3-11，更優選5-9，最優選7-8。
含有活性劑的藥物組合物可被施用以用於預防性和/或治療性治療。在治療性應用中，將組合物以足以預防、治癒、逆轉或至少部分減緩或阻止病況及其併發症的症狀的量施用於已經患有由病毒或細菌感染例如COVID-19引起的疾病或病症的患者。足以實現此目的的量定義為“治療有效劑量”。有效用於該用途的量將取決於疾病或病況的嚴重程度和患者的體重和一般狀態，但通常對於70kg的患者為每天約0.05g至約5g的活性劑(例如，SCFA或L-異亮氨酸或表3中所示的化合物中的任一種，或能夠產生它們的細菌菌株)，更常用的是對於70kg的患者，劑量為每天約0.05g至約1g的活性劑。
在預防性應用中，將含有活性劑的藥物組合物以足以延緩或預防症狀發作的量施用于易感由病毒或細菌感染(例如COVID-19)引起的疾病或病症的患者或除此之外處於由病毒或細菌感染(例如COVID-19)引起的疾病或病症的風險中的患者。這樣的量定義為“預防有效劑量”。在這種使用中，活性劑的精確量再次取決於患者的健康狀態和體重，但對於70kg患者/天，通常為約0.05g至約5g的活性劑，對於70kg患者/天，更通常為約10mg至約1g。
組合物的單次或多次施用可以由治療醫師選擇劑量水準和模式來進行。在任何事件中，藥物製劑應提供足以有效治療性地或預防性地改善、減輕或逆轉患者的相關症狀或延遲症狀發作的量的活性劑。 III. 其他治 療劑
其他已知的一種或多種治療劑可以與在本發明的實踐中的活性劑(例如SCFA、L-異亮氨酸、表3中所示的一種或多種化合物或能夠產生SCFA或L-異亮氨酸或所述化合物的活細菌菌株)組合使用，以用於預防病毒或細菌感染(例如COVID-19)引起的疾病或病症、降低其風險、治療、降低其嚴重程度和促進從其恢復。在預防性或治療性應用中，這些先前已知的治療劑中的一種或多種可以與有效量的活性劑一起在單一組合物中或分別在兩種或多種不同組合物中同時給予患者。
例如，已知有效用於預防或治療COVID-19的藥物和補充劑包括伊維菌素、維生素C、維生素D、褪黑激素、槲皮素、鋅、羥基氯喹、氟西汀或氟伏沙明，以及一種或多種抗生素如阿奇黴素或強力黴素，可以與一種或多種細菌如青春雙歧桿菌或陪伴糞球菌的組合一起使用。然而，在一些情況下，所述組合物不包括青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌中的任一種，或不包括青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌中的任兩種、三種或更多種。它們可以與本發明的活性劑組合使用，以降低個體的SARS-COV2感染風險和通過降低疾病嚴重程度(包括發病率和死亡率)，減輕疾病的一種或多種症狀，以及促進從該疾病的恢復來治療COVID。特別地，鋅、羥基氯喹和阿奇黴素/強力黴素的組合以及伊維菌素、維生素C、維生素D、褪黑激素、槲皮素和鋅的組合在COVID預防和治療中都表現出高功效。因此，這些已知的藥物/補充劑組合可以與SCFA、L-異亮氨酸，表3中所示的一種或多種代謝物，或能夠產生SCFA或L-異亮氨酸或所述代謝物的活細菌細胞的活性劑一起用於本發明的方法中。
兩種示例性組合物分別包含(1)SCFA、L-異亮氨酸、青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌(任選地與低聚木糖、低聚果糖和抗性糊精一起)；和(2)醋酸鋅、醋酸鈣、短雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、低聚果糖，麥芽糖糊精。 IV. 試劑 盒
本發明還提供了根據本文公開的方法提高個體免疫力或治療感染性疾病如COVID-19的試劑盒。所述試劑盒通常包括多個容器，每個容器包含含有SCFA、L-異亮氨酸或能夠產生SCFA或L-異亮氨酸的活細菌菌株或其組合的組合物。任選地，提供這樣的組合物的另外的容器可以包括在試劑盒中，所述組合物包含另一種治療有效的化合物或已知有效用於預防和/或治療疾病，包括改善症狀和減輕疾病的嚴重程度，以及促進從該疾病恢復(例如在上一節中描述的或相關技術領域中已知的那些)的化合物的組合。在試劑盒的一些變型中，單一容器可包含藥物組合物，其包含兩種或更多種有效治療疾病(例如，COVID-19)的成分，例如SCFA、L-異亮氨酸或能夠產生SCFA或L-異亮氨酸加上上一部分中所述的或相關研究領域中已知的那些的活細菌菌株。試劑盒可以進一步包括提供關於如何分配藥物組合物的說明的資訊材料，包括對可以治療的患者的類型的描述(例如，已經接受感染性疾病(例如，COVID-19)的診斷或已經被認為具有感染該疾病的高風險的人類患者，例如，由於具有風險職業，例如醫療護理)，以及不包括在所要求保護的方法中的患者的類型(例如，患有胃腸疾病如炎性腸病、腸易激綜合症或結腸炎的那些)、施用劑量、頻率和方式等。 實施例
以下實施例僅以說明的方式提供，而不是以限制的方式提供。本領域技術人員將容易認識到可改變或修改以產生基本上相同或類似結果的各種非關鍵參數。    實施例1：與COVID-19相關的途徑和代謝物  引言
由嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)引起的冠狀病毒疾病(COVID-19)主要感染呼吸系統，但也影響其它器官，包括胃腸道(GI)道 1-4。最近的研究報導了SARS-CoV-2感染中腸道微生物組的改變 5-7，其特徵在於有益的(產生丁酸的)細菌，例如來自瘤胃球菌科( Ruminococcaceae)和毛螺菌科( Lachnospiraceae)的幾個屬呈現減少，並且機會性病原體，包括鏈球菌屬( Streptococcus)、羅氏菌屬( Rothia)、韋永氏球菌屬( Veillonella)和放線菌屬( Actinomyces)呈現富集 8；這些改變甚至在從COVID-19恢復後仍然存在。在COVID-19患者的糞便樣品中具有已知的免疫調節潛能的幾種腸道共生體，包括普拉梭菌( faecalibacterium prausnitzii)、直腸真桿菌( Eubacterium rectale)和雙歧桿菌( bifdobacteria)的表現不足反映了疾病嚴重程度和功能障礙的宿主免疫應答 9。
已知腸道微生物群調節對呼吸道病毒感染的宿主免疫應答 10-12。腸道微生物組分泌的代謝物(例如酪氨酸)可以通過肺部細胞產生的I型干擾素和炎症小體依賴性細胞因數來防止流感 13,14。微生物來源的代謝物是否還調節對SARS-COV-2感染的宿主免疫應答仍然是未知的。有趣的是，體外實驗表明，在腸道上皮類器官中，丁酸鹽下調SARS-CoV-2感染所必需的基因如血管緊張素轉化酶2 (ACE2)並上調TLR (Toll樣受體)抗病毒途徑 15。
重要的微生物活性是腸道微生物群的整個群落的累積功能的反映，並且該群落的平衡及其輸出決定了對健康或疾病的淨貢獻 16。解密SARS-CoV-2發病機理和嚴重程度中的微生物來源的丁酸鹽或其它代謝物的作用可闡明對腸道微生物群與抗SARS-CoV-2的宿主防禦之間的可能的機理聯繫的理解。
在本研究中，對55例具有COVID-19的未用抗生素治療的患者進行了前瞻性調查，並從入院隨訪直至出院後30天。利用宏基因組和代謝組學分析，表徵了腸道微生物組功能的變化和縱向動態與疾病嚴重程度和免疫應答的關係。使用靶向代謝組學分析進一步驗證該發現以檢查糞便微生物代謝物的改變。    方法 受 試 者招募和 樣 品收集
本研究由臨床研究倫理委員會(參考號2020.076)批准，並且所有患者提供了書面知情同意書。如先前的研究所述 17,18，在香港威爾斯親王醫院和***聯合醫院招募了2020年2月至5月患有COVID-19的患者。根據Wu等人報導的症狀 11，將患者分為四個嚴重程度組。簡言之，如果沒有肺炎的射線表現，則將患者分類為輕度，如果檢測到肺炎伴有發熱和呼吸道症狀，則將患者分類為中度，如果呼吸速率≥30次呼吸/分鐘，氧飽和度≤ 93%（當呼吸環境空氣時），或者PaO2/FiO2 ≤ 300 mmHg，則將患者分類為重度，如果呼吸衰竭需要機械通氣或者器官衰竭需要加強護理，則將患者分類為危重。住院患者的血液和糞便由醫院工作人員收集，而出院患者在隨訪期間提供糞便。將樣品在-80℃下儲存直至加工。 糞 便 DNA 提取
在Zuo等人中描述了詳細的方法 17。簡言之，用1ml ddH 2O預洗滌約0.1g糞便樣品，並通過以13,000×g離心1分鐘沉澱。隨後使用Maxwell® RSC PureFood GMO and Authentication試劑盒(Promega, Madison, Wisconsin)根據製造商的說明書從沉澱中提取糞便DNA。 鳥槍 宏基因 組學測 序和剖析
使用Nextera DNA Flex Library Prep Kit (Illumina, California USA)從提取的DNA製備測序文庫，並在位於香港中文大學的腸道微生物群研究中心的Illumina NovaSeq 6000系統上測序。每個樣品獲得平均2600 ± 330萬個讀數(6G數據)，3200 ± 460萬個讀數。
如下使用 Trimmomatic v0.36過濾並品質修整原始序列讀數 19：1. 修整低品質堿基(品質分數＜ 20)，2. 除去短於50bp的讀數，3. 跟蹤並切斷測序適配子。使用具有默認參數的 Kneaddata v0.7.3(網站： bitbucket.org/ biobakery/kneaddata/wiki/Home, 參考資料庫：GRCh38p12)過濾污染的人類讀數。
使用 humann2 v0.11.1從真菌富集DNA (Franzosa, 2018 # 6)的宏基因組中提取細菌分類群和功能組成的圖譜 20，其包括通過將讀數映射到分支特異性標誌物 21，通過 Bowtie2 v2.3.5 22參考ChocoPhlAn資料庫來注釋物種泛基因組，用 DIAMOND v2.0.4 23針對UniRef90通用蛋白質參考資料庫 24進行未映射的讀數的翻譯搜索，並參照Metacyc資料庫 25從產生的基因列表中收集途徑，經由 MetaPhlAn2進行的分類學鑒定。 血 漿細 胞因 數測 量
在抗凝劑處理的管中收集的全血樣品以2000 x g離心10分鐘並收集上清液。細胞因數趨化因數的濃度使用MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Immunology Multiplex Assay (Merck Millipore, Massachusetts USA)在Bio-Plex 200系統(Bio-rad laboratories, California, USA)上測量。使用人NT-proBNP ELISA試劑盒(Abcam, Cambridge, UK)測量NT-proBNP的濃度。 對糞 便代 謝 物 的定量
通過GC-MS/MS分析檢測短鏈脂肪酸(SCFA)，包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸。使用了Agilent 7890B氣相色譜儀與具有DB-5MS柱的7000D質譜儀(30m長× 0.25mm i.d.× 0.25 μm膜厚度，J&W Scientific, USA)。以1.2 mL/min的流速使用氦作為載氣。以無分流模式進行注射，並且注射體積為2 μL。將烘箱溫度在90℃保持1分鐘，以25℃/min的速率升高至100℃，以20℃/min的速率升高至150℃，並在150℃保持0.6分鐘，以25℃/min的速率進一步升高至200℃，在200℃下保持0.5分鐘。在運行3分鐘後，以多反應監測模式分析所有樣品。注射器入口和輸送管線的溫度分別保持在200℃和230℃。
通過LC-MS分析檢測L-異亮氨酸、尿素和L-精氨酸。LC-ESI-MS/MS系統(UPLC, ExionLC AD，網站：sciex.com.cn/；MS，QTRAP® 6500+系統，網站：sciex.com/)用於分析。L-異亮氨酸和L-精氨酸的分析條件如下：HPLC：柱，Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 (100 mm×2.1 mm i.d.,1.8 µm)；溶劑系統，含有0.05 %甲酸的水(A)，含有0.05 %甲酸的乙腈(B)。梯度開始於5% B (0-10分鐘)，增加至95% B (10-11分鐘)，並逐漸恢復至5% B (11-14分鐘)；流速：0.35 mL/min；溫度，40℃；注射體積：2μL。尿素的分析條件如下：HPLC：柱，Waters ACQUITY BEH Amide (100 mm × 2.1 mm i.d, 1.7μm)；溶劑系統，含0.1 %甲酸的水(A)，含0.1 %甲酸的乙腈(B)；梯度開始於95% B (0-4分鐘)，降低至50% B (4-5分鐘)，並逐漸恢復至95% B (5.1-10分鐘)；流速：0.35 mL/min；溫度，40℃；注射體積：2μL。ESI源運行參數如下：離子源，渦輪噴霧；源溫度550℃；離子噴霧電壓(IS)5500 V(正)，-4500 V(負)；用於單個MRM轉變的DP和CE用進一步的DP和CE優化來完成。 統計學 分析
將關於細菌分類群的豐度和功能的資料登錄Rv3.5.1。細菌分類群的資料通過總和標度(TSS)歸一化，並且關於功能性的資料通過Deseq2 (v1.26.0)基於相對對數表達(RLE)歸一化。使用vegan套裝程式(v2.5-3)基於Bray-Curtis差異進行非度量多維標度(NMDS)分析。使用Deseq2 (v 1.26.0)鑒定COVID-19患者和非COVID-19對照之間的不同微生物功能途徑。使用在Huttenhower Lab Galaxy實例(網站： huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)中實施的多變數線性分析模型(MaAsLin)統計框架來鑒定微生物途徑與疾病嚴重程度的關聯。應用cor和cor.test功能評價微生物途徑與患者血漿參數之間的斯皮爾曼相關性。使用pheatmap套裝程式(v1.0.10)產生熱圖。 資 料可用性
在BioProject登記號PRJNA689961下的Sequence Read Archive中可獲得為本研究產生的原始序列資料。    結果 COVID-19 患者的 臨 床 特徵
招募了55例實驗室確診為SARS-CoV-2感染的住院患者 [28例男性；平均值±標準誤差(s.e.), 28.8 ± 0.3歲]和70例對照。人口統計，臨床特徵和糞便收集時間表示於 表 1和 圖 1中。COVID-19患者的中位數住院時間為27天(IQR，4-45天)。18名患者在出院後隨訪長達1個月[中位數(IQR)，21 (14.5-23.6)天]。所有患者都未用抗生素，並且14例(25.4%)接受了至少一種抗病毒藥物。入院時17例(30.9%)患者出現發熱，5例(9.1%)患者出現腹瀉，24例(43.6%)患者出現呼吸症狀。根據COVID-19嚴重程度分級標準 26，將患者分類為為危重(1.8%)，嚴重(3.6%)，中度(21.8%)和輕度(72.7%)。
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COVID-19 患者的功能性 腸 道 微生物 組 改 變
為瞭解SARS-CoV-2感染如何影響COVID-19患者腸道微生物組的功能，從糞便宏基因組中提取了功能譜，包括基因豐度及其對應的途徑。首先研究COVID-19患者和非COVID-19對照在基線處的微生物途徑的組成(在入院後收集的第一糞便樣品)。非度量多維標度(NMDS)分析顯示COVID-19患者中微生物途徑的組成與非COVID-19對照顯著不同( 圖 2a, PERMANOVA檢驗，p ＜ 0.001)。在所有檢查的宿主因素(年齡，性別，共病，COVID-19疾病嚴重程度，糞便SARS-CoV-2病毒載量和抗病毒藥物)中，SARS-CoV-2感染和COVID-19疾病嚴重程度均顯著影響腸道微生物群的組成，其中COVID-19疾病嚴重程度顯示最大的效應量(R2 = 0.052,p ＜ 0.05, PERMANOVA檢驗， 圖 2c)。此外，與非COVID-19對照相比，COVID-19患者在其糞便中顯示出顯著較低的微生物途徑豐富度( 圖 2b, p ＜ 0.01)。這些結果表明SARS-COV-2感染與腸道微生物組的功能譜改變有關。 有益微生物功能的減少及其 與 COVID-19 嚴 重程度的 關聯
接下來詢問哪種微生物功能主要驅動COVID-19患者和對照的差異。通過DESeq2進行的差異分析表明，與非COVID-19對照相比，COVID-19患者在基線處的糞便樣品中，28條微生物途徑呈現減少，11條途徑呈現富集( 表 2, FDR ＜ 0.05)。在患有COVID-19的患者中，28條呈現減少的途徑中有10條與碳水化合物降解有關，這表明SARS-CoV-2感染的腸道微生物組降解碳水化合物的能力受損。與非COVID-19對照相比，在COVID-19患者中，參與丙酸和乙酸的生物合成的L-1,2-丙二醇降解和雙歧桿菌分流途徑分別減少了5.6和2.9倍( 表 2)。相比之下，在患有COVID-19的患者中，尿素迴圈途徑的豐度比對照高1.9倍。這些資料表明，COVID-19患者表現出短鏈脂肪酸產生能力受損，並表現出尿素生物合成能力增強。然後通過MaAsLin2分析將39種不同的途徑與COVID-19疾病嚴重程度相關聯。包括4-去氧-L-蘇型-己-4-烯吡喃醛酸鹽(酯)降解，L-異亮氨酸生物合成III和來自鈷啉醇醯胺I途徑的腺苷鈷胺素補救在內的三種途徑顯示出與COVID-19嚴重程度的顯著負相關( 圖 3a, FDR q ＜ 0.05)，而L-賴氨酸生物合成III，辮苷生物合成，尿素迴圈，preQ0生物合成和磷酸泛酸生物合成I顯示與COVID-19嚴重程度的顯著正相關( 圖 3b, FDR q ＜ 0.05)。其中，4-去氧-L-蘇型-己-4-烯吡喃醛酸鹽(酯)降解途徑與丙酮酸的產生有關，丙酮酸是短鏈脂肪酸發酵的關鍵代謝物 27,28。L-異亮氨酸生物合成III途徑與必需氨基酸L-異亮氨酸的生物合成相關 29；來自鈷啉醇醯胺I途徑的腺苷鈷胺素補救參與維生素B12的產生 30。這些微生物途徑的終產物是微生物群-宿主串擾中的關鍵介體，並且在調節宿主先天和適應性免疫力中起重要作用 31-33。COVID-19患者腸道中微生物途徑的改變可能對宿主生理和功能中有顯著影響。
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糞 便 SCFA 與 L- 異 亮氨酸生物合成 與 血 漿測 量 結 果的 相 關 性
SARS-CoV-2感染可以在COVID-19患者的子集中誘導功能障礙的免疫應答和因此的細胞因數風暴綜合症，導致更重度的疾病結果 34。這裡，比較患有輕度疾病(n= 40)的COVID-19患者和患有中度-重度疾病(n = 15)的COVID-19患者之間的細胞因數，趨化因數和炎症標誌物的血漿濃度。患有中度/重度疾病的COVID-19患者血漿CXCL10，乳酸脫氫酶(LDH), C反應蛋白(CRP)水準升高，血小板計數(PLT)，白蛋白和血紅蛋白水準降低(MaAsLin2, FDR q ＜ 0.05)( 圖 4a-f)。這些發現與其它報導一致，其它報導表明功能障礙的免疫應答與更差的COVID-19 病相關 35。
已知腸道微生物群調節宿主中先天和適應性免疫系統的發育和功能 36。為了探討腸道微生物群功能在調控對SARS-CoV-2感染的宿主免疫應答中的作用，進一步研究了微生物途徑與血液免疫標誌物嚴重程度的關係。L異亮氨酸生物合成途徑與血漿CXCL-10水準(Rho = -0.48, p = 0.01， 圖 4g)的呈負相關，而與血小板(Rho = 0.38, p = 0.01)和白蛋白(Rho = 0.36, p = 0.01)的血液水準呈正相關( 圖 4g)。此外，4-去氧-L-蘇型-己-4-烯吡喃醛酸鹽(酯)降解途徑表現出與血紅蛋白水準的正相關(Rho = 0.31, p = 0.03)( 圖 4g)。CXCL10是已知在COVID-19中與不良結果相關的促炎性趨化因數 37。在COVID-19中，低血小板計數也與COVID-19的重症和死亡率的風險增加有關 38。血漿中的血紅蛋白(HGB)和白蛋白水準回應於炎症而降低 39,40。這兩種途徑可能參與預防COVID-19中的過度發展性炎症。相比之下，尿素迴圈途徑表現出與血小板計數(Rho = -0.34, p = 0.02)和白蛋白(Rho = -0.30, p = 0.04)的血液水準的反相關。PreQ0生物合成途徑豐度顯示與CXCL-10的正相關和與血小板計數的負相關(Rho=-0.35, p = 0.03)(圖5h)。因此，這兩種途徑的過表達可能與更加功能障礙的免疫應答有關。總之，這些資料強調腸道微生物組可能在功能上校準抗SARS-CoV-2感染的宿主免疫力，從而影響COVID-19嚴重程度。 COVID-19 恢 復 後 SCFA 和 L- 異 亮氨酸生物合成的 的微生物功能受 損 延 長
為了探索在恢復後的患者中腸道微生物組的功能是否恢復，從19例患者中收集出院後的糞便樣品(出院後天數，中位數(IQR)，21 (16-23.5)天)( 圖 1)。非度量多維標度(NMDS)分析表明，COVID-19患者在恢復後的微生物途徑的組成似乎遠離患者的基線樣品聚簇(p ＜ 0.05，基線樣品對比出院後樣品，PERMANOVA)，並變得與非COVID-19對照相當( 圖 5a)。類似地，與基線相比，COVID-19患者出院後的微生物途徑的豐富度更高，並且顯示出與非COVID-19對照相當的水準( 圖 5b)。這些資料表明腸道微生物組的整體功能可以在疾病消退後恢復。研究在疾病消退後COVID-19患者中是否恢復了不同的微生物功能途徑(顯示在 表 2中)。在COVID-19基線微生物組中表現不足的16種微生物途徑在疾病消退後表現出持續的減少( 圖 5c)。有趣的是，這些途徑中的62.5% (16條中有10條)參與碳水化合物降解，表明COVID-19患者顯示出對碳水化合物降解的微生物功能的持續損害。此外，即使在疾病消退後，參與SCFA和L-異亮氨酸的雙歧桿菌分流，L-1,2-丙二醇降解，4-去氧-L-蘇型-己-4-烯吡喃醛酸鹽(酯)降解和L-異亮氨酸生物合成III仍呈現減少，表明在COVID-19患者中SCFA生物合成和L-異亮氨酸生物合成的能力持續受損。這些資料表明患者的腸道微生物組功能在COVID-19消退後僅部分恢復，而幾種特定的微生物功能仍然持續受損。 COVID-19 中 SCFA 和 L- 異 亮氨酸的 糞 便 濃 度 降低
糞便代謝組提供微生物活性的功能性讀出，並且可用作介導宿主-微生物組相互作用的介質 41。基於COVID-19患者和對照的糞便樣品的靶向代謝組分析，發現腸道微生物功能與腸道微生物代謝物的改變相關。L-1,2-丙二醇降解，雙歧桿菌分流和4-去氧-L-蘇型-己-4-烯吡喃醛酸鹽(酯)降解途徑與SCFA的產生有關，並且在COVID-19患者中減少(表2)。在COIVD-19患者中，SCFA (包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸)的糞便濃度顯著低於對照( 圖 6a)，進一步支持SARS-CoV-2感染可能影響腸道微生物組的SCFA產生能力。當COVID-19患者被分類成輕度疾病和中度/重度疾病時，與輕度疾病和對照相比，更多的中度/重度疾病患者顯示出更低濃度的所有類型的SCFA( 圖 6a)，表明SCFA的產生缺乏可能與更重度的疾病有關。COVID-19患者中L-異亮氨酸的濃度也低於對照(p ＜ 0.05，圖6b)。該結果與以下發現一致：L-異亮氨酸生物合成III途徑在具有COVID-19的患者中在微生物DNA水準表現不足( 表 2)。SARS-CoV-2感染可能與用於L-異亮氨酸生物合成的腸道微生物組的能力受損有關。類似地，與輕度患者和對照相比，參與尿素迴圈途徑的尿素和L-精氨酸在更嚴重的患者中在微生物DNA水準上被過度表現，在更嚴重的患者中在代謝物水準上也被過度表現( 圖 6b)。
對哪些細菌物種對這些微生物途徑的變化貢獻最大進行了檢驗。沒有一條途徑由任何單一物種支配，這表明這些途徑的改變可能由它們的功能的群落水準改變引起( 圖 11)。值得注意的是，細菌普拉梭菌是4-去氧-L-蘇型-己-4-烯吡喃醛酸鹽(酯)降解途徑和L-異亮氨酸生物合成III( 圖 11c 和 d)兩者的主要貢獻者，這表明普拉梭菌在對抗SARS-CoV-2感染中可能具有有益的作用。 討論
在本項研究中，首次表明COVID-19患者在腸道微生物功能方面具有顯著的改變，其具有受損的短鏈脂肪酸(SCFA)產生能力。由於微生物群落組成中存在顯著的個體間差異，因此描述微生物功能或代謝物在理解它們對疾病發病機理的貢獻中是重要的。SCFA，包括丁酸鹽，以及丙酸鹽和乙酸鹽，可以通過啟動抗炎免疫細胞和抑制炎症信號傳導途徑發揮抗炎作用 42。此外，丁酸鹽可保持腸道屏障的完整性以防止腸道內毒素和細菌的易位和迴圈，從而減少全身炎症反應 43。最近，發現丁酸鹽在腸道上皮類器官模型中通過下調SARS-CoV-2感染所必需的基因，如血管緊張素轉化酶2 (ACE2)和上調TLR (Toll樣受體)抗病毒途徑，來保護宿主免受病毒感染 15。產生丁酸鹽的兩種關鍵的厚壁菌門普拉梭菌和直腸真桿菌是健康結腸群落中最豐富的細菌，並且已被證明在COVID-19糞便樣品中減少 18。重要的是，本研究提供了以下證據：與對照相比，COVID-19患者，尤其是那些具有更嚴重症狀的患者顯示出降低的SCFA(包括丁酸鹽，乙酸鹽和丙酸鹽)的糞便濃度。這些資料強調腸道微生物群產生的SCFA可能在COVID-19發病機理和疾病嚴重程度中起重要作用。補充SCFA或產生SCFA的益生菌可能具有改善疾病結果的潛能，儘管這種假設需要進一步的證實。值得注意的是，COVD-19患者的SCFA生物合成能力受損持續直至疾病消退後一個月，這可能由於SCFA在宿主免疫力和代謝中的重要性而引起長期健康併發症。
在氨基酸消化和吸收過程中，腸道微生物群也在操縱氨基酸庫和譜中起關鍵作用，從而介導宿主的生理方面 44。發現COVID-19患者的腸道微生物群具有減弱的L-異亮氨酸生物合成能力，並且與對照相比，它們具有較低的L-異亮氨酸糞便濃度。最近的研究已經表明，L-異亮氨酸可以誘導宿主防禦肽(即，β-防禦素)的表達，其可以調節宿主先天和適應性免疫力並且減輕病原體對人和動物的有害作用 32,33。與此一致，本發明人發現L-異亮氨酸生物合成III途徑與疾病嚴重程度和促炎性趨化因數(CXCL-10)呈負相關。這些結果共同支持了由腸道微生物群產生的L-異亮氨酸可以通過調節宿主對SARS-COV-2感染的免疫應答來減輕COVID-19的嚴重程度。此外，L-異亮氨酸是支鏈氨基酸(BCAA)之一，其被認為是通過增加乏力物質(乳酸鹽、氨和5-HT)，能量代謝物(葡萄糖和游離脂肪酸)和肌肉疼痛物質(LDH和CK)的血清濃度來改善中樞和肌肉乏力的營養補充劑 45,46。有趣的是，觀察到出院後的患者仍然具有持續受損的L-異亮氨酸生物合成。這可以部分地解釋為什麼COVID-19存活者報告乏力和肌肉無力的持續症狀 47。
此外，已知腸道微生物群依賴性尿素代謝與宿主尿素平衡相關，並參與疾病進展 48。發現COVID-19樣品中富含與腸道微生物組相關的尿素迴圈，且其與疾病嚴重程度呈正相關。具有更嚴重症狀的患者顯示更高的糞便尿素濃度。Shen等人還觀察到COVID-19患者比非COVID-19病例具有更高的血清尿素濃度。改變的腸道微生物組可能與COVID-19感染期間尿素迴圈功能的破壞有關。然而，尿素迴圈的中斷如何影響疾病結果需要進一步研究。
本研究具有幾個優點。受試者都沒有用抗生素(已知其影響微生物組)，並且用連續的糞便樣品收集隨訪直到出院之後。特別引人注目的發現是人的腸道微生物功能的明顯特徵(即受損的SCFA)在病毒清除後持續存在，並且這些變化可能有助於所謂的“長COVID”的症狀，包括乏力和肌肉無力。儘管這仍然是推測性的，但它需要進一步的研究。由於SCFA和L-異亮氨酸的產生受膳食纖維和蛋白質的影響，在住院期間收集患者的飲食記錄以消除飲食的影響。所有患者均接受醫院提供的標準醫院飲食，這符合中國香港常用的習慣性飲食。因此，飲食中的顯著變化或改變不太可能影響該發現。
總之，本研究表明，在COVID-19中，腸道微生物功能受到擾動，包括SCAF和L-異亮氨酸生物合成降低和尿素產生增加。它強調腸道微生物組功能受損與COVID-19嚴重程度之間的相關性。需要進一步的研究來更好地理解受損的腸道微生物功能如何參與炎症和疾病結果，以及探索微生物功能產物和代謝物對抗COVID-19的治療潛能。    實施例2：與COVID-19相關的短鏈脂肪酸  方法 受 試 者招募和 樣 品收集
本試驗性研究包括除了標準護理外還接受合生元配方的合生元組的25名受試者以及僅接受標準護理的對照組(對照)的10名受試者。從2020年8月13日至2020年10月9日，在香港威爾斯親王醫院招募了18歲或以上的住院患者，其基於陽性逆轉錄酶聚合酶鏈反應(PCR)試驗確認了SARS-CoV-2感染的診斷。進入重症監護病房或使用呼吸機，已知有活動性心內膜炎病史，在進行血液透析，或在募集時懷孕的受試者被排除。排除由於免疫抑制而具有已知增加的感染風險的受試者，例如先前器官或造血幹細胞移植、中性粒細胞減少症(ANC ＜ 500個細胞/μl)或HIV和CD4 ＜ 200個細胞/μl。本研究中使用的合生元配方含有雙歧桿菌菌株(250億個CFU/膠囊)和益生元(低聚半乳糖、低聚木糖、抗性糊精)的混合物，並且以兩次相等的劑量(每天兩次4個膠囊)施用。在威爾斯親王醫院內部製備膠囊劑，並由我們的中心臨床研究藥房(Clinical Research Pharmacy)分配。根據兩個獨立的健康中國人宏基因組資料集(N = 1400)中與COVID-19減少的細菌物種的正相關性，得到選擇用於該配方的益生菌物種，並且在100例COVID-19患者的巨集基因組資料中進一步驗證 50。該配方旨在補充在COVID-19患者中報導的與增強免疫力相關的缺失細菌。指導受試者服用合生元膠囊劑(每日總共8粒)以及食物28天。所有患者每天都有由醫院提供的標準的三餐。還招募了在相同時間段內進入醫院的未接受經口合生元配方治療的COVID-19陽性受試者(對照)。醫院內患者的血液和糞便由醫院工作人員收集，而出院患者在隨訪當天提供糞便或在家自採樣。 糞 便 DNA 提取和 鳥槍 宏基因 組測 序和 剖析
與實施例1中所述的方法相同。 血 漿 中短 鏈 脂肪酸 (SCFA) 的靶向 檢測
將50 μl滅活血漿樣品加入到含有100 μL磷酸(36% v/v)溶液的1.5mL EP管中。將混合物渦旋3分鐘。加入150 μL MTBE (含有內參)溶液，然後渦旋3分鐘，並在冰上超聲5分鐘。然後，將混合物在4 °C下以12000r/min離心10分鐘。收集上清液，並用於6種SCFA (乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸)的氣相色譜-質譜(GC-MS/MS)分析。Agilent 7890B氣相色譜儀與具有DB-5MS柱的7000 D質譜儀(30m長× 0.25mm i.d.使用× 0.25 μm膜厚度，J&W Scientific，USA)用於進行糖的GC-MS/MS分析。以1.2 mL/min的流速使用氦作為載氣。以無分流模式進行注射，並且注射體積為2 μL。將烘箱溫度在90℃下保持1min，以25℃/min的速率升高至100℃，以20℃/min的速率升高至150℃，保持0.6min，以25℃/min的速率升高至200℃，在運行3min後保持0.5min。以多反應監測模式分析所有樣品。注射器入口和輸送管線溫度分別為200℃和230℃。 鼻咽拭子中 SARS-CoV-2 病毒 載 量 的 檢測
用即時RT-PCR測定測量鼻咽拭子的SARS-CoV-2病毒載量。用QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden，Germany)從鼻咽拭子樣品中提取病毒RNA。用即時RT-PCR定量SARS-CoV-2 RNA。從Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)購買了由美國疾病控制及預防中心(US Centers for Disease Control and Prevention)設計的引物-探針組N1 (2019-nCoV_N1-F：5’-GAC CCC AAA ATC AGC GAA AT-3’，2019-nCoV_N1-R：5’-TCT GGT TAC TGC CAG TTG AAT CTG-3’和2019-nCoV_N1-P：5’-FAM-ACC CCG CAT TAC GTT TGG ACC-BHQ1-3’)。1步即時RT-PCR反應含有10 μL提取的製劑，4 μL TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)，最終反應體積為20 μL。引物和探針濃度分別為0.5 μM和0.125 μM。用StepOnePlus即時PCR系統(Applied Biosystems)進行迴圈條件，25℃ 2分鐘，50℃ 15分鐘，95℃ 2分鐘，隨後進行45個迴圈的95℃ 15秒和55℃ 30秒。 細 胞因 數測 量
在室溫(RT)下以1,500xg離心全血10分鐘而不用制動後收集血漿樣品。使用Custom Premix Human Cyto Panel A 47 Plex (Millipore, # HCYTA-60K-47C)測量血漿中細胞因數和趨化因數的濃度。在第一次解凍時測量所有樣品。 血 漿 代 謝 物 的非靶向 測 量
對於非靶向代謝物測量，加入50 μL血漿和300 μL純甲醇。將混合物渦旋3分鐘並在4℃下以12,000rpm離心10分鐘。然後收集上清液並在4℃下以12,000rpm離心5分鐘。離心後，將混合物在-20℃冷凍30分鐘，然後在4℃以12000r/min離心3分鐘。使用150 μL上清液進行板上分析。使用LC-ESI-MS/MS系統分析樣品提取物。使用三重TOF質譜儀在資訊依賴的基礎上獲得MS/MS光譜。 統計學 分析
使用成對威爾科克森符號秩檢驗比較來自不同時間點的SCFA、IL-6和代謝物的濃度。分別用R中的Hmim和rmcorr套裝程式，通過重複的測量相關性，來評估SARS-COV-2的細菌相對豐度或CT值和SCFA的縱向相關性以及IL-6和代謝物的相關性。使用ggplot2或corr套裝程式視覺化所有的圖。    結果
評價乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸的血漿濃度。其中，在治療後，合生元組中的乙酸濃度顯著增加(p ＜ 0.001)，而在對照組中則沒有(p = 0.65)( 圖 7)。通過重複的測量相關分析表明，鼻咽拭子中SARS-CoV-2的迴圈閾值(CT)與血漿乙酸濃度呈正相關(R = 0.48, p = 0.046)，這表明血漿乙酸濃度與病毒載量呈負相關( 圖 8)。合生元治療後，合生元組的患者中11種物種的相對豐度發生明顯變化。其中，青春雙歧桿菌和陪伴糞球菌的相對豐度與血漿乙酸的濃度呈正相關( 圖 9)，而未分類的擬桿菌屬、內臟臭氣桿菌、未分類的嗜膽菌屬和沃氏嗜膽菌的相對豐度與血漿乙酸的濃度呈負相關( 圖 10)。
對來自SIM01組中的所有25名受試者和對照組中的10名受試者的血漿樣品進行非靶向代謝組分析。鑒定了總共743種具有鑒定資訊的化合物，其中20種化合物在SIM01組中上調，但在對照組中沒有上調( 圖 12 、 13)。在這些SIM01相關的代謝物中，其中的15種與SIM01組中的IL-6呈顯著負相關( 表 3)。IL-6是一種促炎性細胞因數，其可導致與COVID-19的嚴重程度呈正相關的高炎症反應。因此， 表 3中所列的一種或多種化合物的補充可有益於減輕COVID-19症狀並預防COVID-19患者的重症。
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本申請中引用的所有專利，專利申請和其它出版物，包括GenBank登錄號和等同物，出於所有目的通過引用整體併入本文。
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[ 圖 1]COVID-19患者(n = 55)的糞便樣品收集和住院時間的示意圖。“CoV”表示患有COVID-19的患者。“D0”表示患者的發病日期。
[ 圖 2]COVID-19患者的功能性腸道微生物組譜的改變。a. COVID-19和非COVID-19個體中微生物功能途徑的組成，其通過基於Bray-Curtis差異的NMDS (非度量多維標度)圖觀察。b. COVID-19和非COVID-19對照中微生物途徑的豐富度，其基於Chao1指數進行評價。通過曼-惠特尼檢驗確定顯著性的p值，並表示為***p＜ 0.001。c.宿主因素對微生物途徑組成的效應量。通過PERMANOVA分析確定效應量和統計學顯著性。***p＜ 0.001，**p＜ 0.01，*p＜ 0.05。
[ 圖 3]微生物途徑與COVID-19嚴重程度的關係。a.微生物途徑與疾病嚴重程度呈顯著負相關。b.微生物途徑與疾病嚴重程度呈正相關。將患有COVID-19的患者分類為輕度患者(n=40，包括具有輕度COVID-19症狀的患者)和非輕度患者(n=15，包括具有中度，重度和危重COVID-19症狀的患者)。微生物途徑的豐度與疾病嚴重程度之間的相關性通過微生物組多變數關聯與線性模型2 (MaAsLin2)來評估。
[ 圖 4]糞便SCFA和L-異亮氨酸生物合成與血漿測定結果的相關性。a、b、c. 血漿參數與疾病嚴重程度呈正相關。d、e、f. 血漿參數與疾病嚴重程度呈負相關。通過MaASLin2測定相關性分析。輕度患者包括具有輕度COVID-19症狀的患者，而非輕度患者包括具有中度，重度和危重COVID-19症狀的患者。g. 血漿參數與微生物途徑的斯皮爾曼相關性。藍色圓圈和正值表示正相關，紅色圓圈和負值表示反相關。大小和陰影表示相關性的大小，其中較暗的陰影顯示出比較亮的陰影更高的相關性。
[ 圖 5]COVID-19恢復後，SCFA和L-異亮氨酸生物合成的的微生物功能受損延長。a.非COVID-19對照以及COVID-19患者在基線和出院後的微生物途徑的組成，其通過基於Bray-Curtis差異的NMDS (非度量多維標度)圖觀察。通過PERMANOVA分析確定基線樣品與出院後樣品之間的統計學顯著性。b.非COVID-19對照以及COVID-19患者中在基線和出院後的微生物途徑的豐富度，其基於Chao1指數進行評價。通過曼-惠特尼檢驗確定顯著性的p值，並表示為*p＜ 0.05。c. 匯總COVID-19患者出院後腸道微生物組功能性變化的熱圖。圖左邊的標記表示微生物途徑，右邊的標記表示這些微生物途徑的親代類別。具有較高相對豐度的途徑被著色為紅色，而具有低相對豐度的途徑被著色為藍色。模組1代表這樣的微生物途徑，其在COVID-19患者中在基線時富集，並且在出院後向非COVID-19對照返回。模組2代表這樣的微生物途徑，其在COVID-19患者中呈現減少並且在出院後向非COVID-19對照返回。模組3代表這樣的微生物途徑，其與非COVID-19對照相比在COVID-19的患者呈現減少，同時在出院後保持持續減少。
[ 圖 6]COVID-19中SCFA和L-異亮氨酸的糞便濃度降低。a. COVID-19患者和非COVID-19對照中包括戊酸、丙酸、異戊酸、異丁酸、己酸、丁酸和乙酸的短鏈脂肪酸的糞便濃度。b. COVID-19患者和非COVID-19對照中L-異亮氨酸、尿素和L-精氨酸的糞便濃度。輕度患者包括具有輕度COVID-19症狀的患者，而非輕度患者包括具有中度，重度和危重COVID-19症狀的患者。通過韋爾奇t檢驗確定統計學顯著性。COVID-19患者與非COVID-19對照的顯著性差異表示為*p＜ 0.05，非輕度患者與非COVID-19對照的顯著性差異表示為#p＜ 0.05，###p＜ 0.01和###p＜ 0.001。
[ 圖 7]對照(n = 9)和合生元組(n = 22)的COVID-19患者在基線和第5周的血漿乙酸濃度的比較。通過配對威爾科克森符號秩檢驗分析血漿乙酸濃度變化的組間比較。說明了在基線和第5周來自相同患者的血漿乙酸濃度。來自同一患者的點用灰線連接。
[ 圖 8]通過重複的測量相關性分析了血漿乙酸濃度與來自COVID-19患者鼻咽拭子的SARS-CoV-2病毒的即時RT-PCR的迴圈閾值(CT)的相關性。每個點代表來自每個樣品的血漿乙酸濃度和CT值。來自同一患者的樣品用相同的顏色表示。彩色線顯示每名患者的重複的測量相關擬合。
[ 圖 9]通過重複的測量相關性分析了來自COVID-19患者的血漿乙酸濃度與青春雙歧桿菌和陪伴糞球菌的相對豐度之間的相關性。每個點代表來自每個樣品的血漿乙酸濃度和青春雙歧桿菌和陪伴糞球菌的相對豐度。來自同一患者的樣品用相同的顏色表示。彩色線顯示每名患者的重複測量相關擬合。
[ 圖 10]通過重複的測量相關性分析了來自COVID-19患者的血漿乙酸濃度與未分類的擬桿菌屬( Parabacteroides)、內臟臭氣桿菌( Odoribacter splanchnicus) 、未分類的嗜膽菌屬( Bilophila)和沃氏嗜膽菌( Bilophila wadsworthia)的相對豐度之間的相關性。每個點代表來自每個樣品的血漿乙酸濃度與未分類的擬桿菌屬、內臟臭氣桿菌、未分類的嗜膽菌屬和沃氏嗜膽菌的相對豐度。來自同一患者的樣品用相同的顏色表示。彩色線顯示每名患者的重複測量相關擬合。
[ 圖 11]COVID-19基線和非COVID-19糞便樣品中生物體對微生物途徑的貢獻。微生物的豐度基於相對對數表達(RLE)通過Deseq2歸一化。
[ 圖 12]火山圖分析顯示了接受SIM01組的COVID-19患者在第5周和基線之間血漿代謝物豐度的倍數變化。水平線描繪了統計學顯著性的閾值，其中p＜ 0.05，並且垂直線指示[log2倍變化]的閾值，其＞ 1。具有標記的紅點是指在SIM01組中顯著上調但在對照組中沒有顯著上調的那些代謝物。
[ 圖 13]通過非靶向代謝組學分析鑒定了在SIM01補充後顯著上調的20種代謝物的豐度。

Claims (23)

  1. 用於在受試者中增強免疫力、預防或治療COVID-19、或預防COVID-19的重症或減輕其症狀的方法，包括向所述受試者施用有效量的組合物，所述組合物包含短鏈脂肪酸、L-異亮氨酸、表3中所示的化合物，或產生所述短鏈脂肪酸或L-異亮氨酸或所述化合物的細菌，其中所述受試者除此以外不需要另外用所述短鏈脂肪酸或L-異亮氨酸或所述化合物治療。
  2. 如請求項1所述的方法，其中所述施用步驟包括經口攝入。
  3. 如請求項1所述的方法，其中所述組合物包含短鏈脂肪酸和L-異亮氨酸。
  4. 如請求項1所述的方法，其中所述短鏈脂肪酸是乙酸、丙酸、丁酸或異丁酸。
  5. 如請求項1所述的方法，其中所述細菌是普拉梭菌( Faecalibacterium prausnitzii)。
  6. 如請求項1所述的方法，其中所述細菌是雙歧桿菌屬的物種。
  7. 如請求項6所述的方法，其中所述細菌是青春雙歧桿菌( Bifidobacterium adolescentis)。
  8. 如請求項1所述的方法，其中所述細菌是陪伴糞球菌( Coprococcus comes)。
  9. 如請求項6所述的方法，其中所述細菌不是青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌( bifidobacterium bifidum)、長雙歧桿菌( bifidobacterium longum)、短雙歧桿菌( bifidobacterium breve)或嬰兒雙歧桿菌( bifidobacterium infantis)。
  10. 如請求項1所述的方法，其中所述受試者已被診斷患有COVID-19。
  11. 如請求項1所述的方法，其中所述短鏈脂肪酸是丁酸、丁酸鹽或丁酸甘油酯。
  12. 用於在受試者中改善免疫力、預防或治療COVID-19、或預防COVID-19的重症或減輕其症狀的組合物，其包含有效量的(1)短鏈脂肪酸、L-異亮氨酸、表3中所示的化合物、或產生短鏈脂肪酸或L-異亮氨酸的細菌和(2)生理學上可接受的賦形劑。
  13. 如請求項12所述的組合物，其中所述受試者被診斷患有COVID-19。
  14. 如請求項12所述的組合物，其被配製用於經口攝入。
  15. 如請求項12所述的組合物，其中所述組合物包含短鏈脂肪酸和L-異亮氨酸。
  16. 如請求項12所述的組合物，其中所述生理上可接受的賦形劑是澱粉、菊粉、燕麥麩、麥麩、纖維素、瓜爾膠或果膠。
  17. 如請求項12所述的組合物，其中所述細菌是普拉梭菌。
  18. 如請求項12所述的組合物，其中所述細菌是雙歧桿菌屬的物種。
  19. 如請求項18所述的組合物，其中所述細菌是青春雙歧桿菌。
  20. 如請求項12所述的組合物，其中所述細菌是陪伴糞球菌。
  21. 如請求項18所述的組合物，其中所述細菌不是青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌或嬰兒雙歧桿菌。
  22. 用於在受試者中改善免疫力、預防或治療COVID-19、或預防COVID-19的重症或減輕其症狀的試劑盒，其包含(1)第一組合物，其包含有效量的第一種短鏈脂肪酸、L-異亮氨酸、表3中所示的化合物，或產生所述短鏈脂肪酸或L-異亮氨酸或所述化合物的細菌；和(2)第二組合物，其包含有效量的第二種不同的短鏈脂肪酸、第二種不同的表3中所示的化合物、或第二種不同的產生短鏈脂肪酸的細菌、或第二種不同的產生表3中所示的第二種不同的化合物的細菌。
  23. 如請求項22所述的試劑盒，其中所述第一組合物和所述第二組合物包含兩種不同的產生丁酸的革蘭氏陽性厭氧細菌。
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