KR20210137075A - 중간엽 줄기세포의 혈관형성 잠재력을 향상시키는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 중간엽 줄기세포 (MSC)의 혈관형성 잠재력을 향상시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 약 1 kPa 내지 100 kPa의 강성도를 갖고 매트릭스 단백질로 코팅된 기질 상에서 상기 MSC를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 MSC는, 약 1 kPa 내지 100 kPa의 강성도를 갖고 매트릭스 단백질로 코팅된 기질 상에서 배양되지 않는 것을 제외하고 동일한 조건에서 배양되는 MSC와 비교하여 향상된 혈관형성 잠재력을 갖는다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 향상되는 혈관형성 잠재력을 갖는 MSC, 및 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 말초 동맥 질환 (PAD)을 가진 대상체에서 CAD 또는 PAD를 치료하기 위한 개선된 MSC의 치료적 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell: MSC)의 영양 및 면역조절 분비 특성을 통해 관상 동맥 질환 (coronary artery disease: CAD) 및 말초 동맥 질환 (peripheral artery disease: PAD)을 치료하기 위한 중간엽 줄기세포 (MSC)의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 기질 코팅이 MSC로부터 혈관형성 촉진 분비 (pro-angiogenic secretion)를 유도하는 세포 공학 방법의 개발에 관한 것이다.
관상 동맥 질환 (CAD) 및 말초 동맥 질환 (PAD)은 가장 흔한 유형의 심장 질환이며, 대부분의 심장 마비를 유발한다. 예를 들어, CAD는 호주에서 27분마다 호주인 1명이 사망하는, 주요 사망 원인이다.
손상 부위에 사이토카인을 직접 전달하는 것과 같은 기존의 혈관형성 요법 (angiogenesis therapies)은 종종 바람직하지 않은 부작용을 겪는다. 더욱이, 중증 혈관재생불능 CAD 환자는 심장 이식이 유일한 옵션으로 남아 있으며, 이는 적절한 공여자의 부족에 의해 제한된다.
줄기세포-기반 요법 (Stem cell-based therapy)이 가능한 대체 치료법으로 대두되었지만, 이들 세포가 숙주에 통합되는 능력에는 한계가 있다. 미세혈관 밀도 (혈관형성) 증가 및 후속하는 대형 혈관 리모델링 (동맥생성)을 자극함으로써 CAD 치료를 위해 표적 유전자 및 세포-기반 요법이 탐구되었다.
그러나 심혈관 손상 후에 기능을 향상시키기 위해 MSC를 사용하는 시험은 세포 사멸 수준이 높고, 미세 환경에 대한 세포 반응의 비균질성 (heterogeneity)으로 인해 약간의 성공만을 거두었다. MSC가 재생 의학 (regenerative medicine)에서 상당한 잠재력을 보여주었지만, 조직 배양 폴리스티렌에서 장기간 배양 (증식)은 분비 활성을 방해하고, 임상 시험에서 상당한 가변성이 있었다.
따라서, MSC 생존 및 MSC 균질성을 개선할 필요가 있다.
임의의 선행 기술 간행물이 본원에 언급되는 경우, 이러한 참고 문헌은 해당 문헌이 호주 또는 임의의 다른 국가에서 당해 기술분야에서 통상의 일반적 지식의 일부를 형성한다고 인정하는 것은 아니라고 이해되어야 한다.
본 개시내용은 혈관형성 촉진 ("프라이밍")이 되도록 MSC로부터 MSC 분비 프로파일을 정규화하기 위한, 세포 배양 기질로서 단백질-접합된 하이드로겔 매트릭스의 용도에 관한 것이다. 그와 같이 수행함으로써, 본 개시내용은 CAD 및 PAD를 치료하기 위한 MSC의 치료 효능을 향상시키는 개선된 세포 배양 매트릭스에 관한 것이다.
본 개시내용은 내피 세포 관생성 (endothelial cell tubulogenesis)을 포함하는 모델 분석법 (model assays)을 통해 결정되는 바와 같이, MSC로부터 혈관형성 촉진 인자의 분비를 최대화하는 매트릭스 조건을 확인한다. 놀랍게도, 개시된 매트릭스 상에서 배양된 MSC는 액체 질소에서 냉동보존될 수 있고, 해동 후에 프라이밍된 혈관형성 촉진 표현형을 유지할 수 있다.
기질 특성 만을 통해 원하는 세포 활성을 유도하는 것은 저산소증 또는 성장 인자 치료를 사용하는 방법에 비해, 제조의 단순성 및 세포 공급원에 대한 최소한의 수정을 포함하는 많은 이점을 갖는다.
본 개시내용에 따라 제조된 MSC는 혈관형성 촉진 분비체 (pro-angiogenic secretome)를 갖고, CAD 및 PAD를 치료하는데 유용하다.
제1 양상은 중간엽 줄기세포 (MSC)의 혈관형성 잠재력을 향상시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 약 1 kPa 내지 100 kPa의 강성도 (stiffness)를 갖고 매트릭스 단백질로 코팅된 기질 상에서 상기 MSC를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 MSC는, 약 1 kPa 내지 100 kPa의 강성도를 갖고 매트릭스 단백질로 코팅된 기질 상에서 배양되지 않는 것을 제외하고 동일한 조건에서 배양되는 MSC와 비교하여 향상된 혈관형성 잠재력을 갖는다.
또한, 향상된 혈관형성 잠재력을 갖는 중간엽 줄기세포 (MSC)를 제조하는 방법이 개시되며, 상기 방법은 약 1 kPa 내지 100 kPa의 강성도를 갖고 매트릭스 단백질로 코팅된 기질 상에서 상기 MSC를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 MSC는, 약 1 kPa 내지 100 kPa의 강성도를 갖고 매트릭스 단백질로 코팅된 기질 상에서 배양되지 않는 것을 제외하고 동일한 조건에서 배양되는 MSC와 비교하여 향상된 혈관형성 잠재력을 갖는다.
상기 방법은 인 비트로일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 강성도는 약 1 kPa, 10 kPa, 또는 40 kPa이다.
일 구체예에서, 상기 매트릭스 단백질은 콜라겐, 피브로넥틴 또는 라미닌이다.
일 구체예에서, 상기 기질은 약 10 kPa의 강성도를 가지며, 피브로넥틴으로 코팅된다.
일 구체예에서, 상기 기질은 약 1 kPa 또는 10 kPa의 강성도를 가지며, 피브로넥틴 및 콜라겐으로 코팅된다.
일 구체예에서, 상기 기질은 약 25 μg/mL의 매트릭스 단백질로 코팅된다.
일 구체예에서, 상기 기질은 폴리아크릴아미드를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 MSC는 WO2017/156580에 따라 제조된다.
일 구체예에서, 상기 방법은 상기 기질 상에서 MSC를 배양한 후에 상기 MSC를 냉동보존하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구체예에서, 상기 방법은 냉동보존된 MSC를 해동하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 향상된 혈관형성 잠재력은 냉동보존 및 해동 후에도 지속된다.
일 구체예에서, 향상된 혈관형성 잠재력은 관생성 분석법을 사용하여 측정된다.
제2 양상은 제1 양상의 방법에 의해 향상되는 혈관형성 잠재력을 갖는 중간엽 줄기세포 (MSC)를 제공한다.
제3 양상은 약 1 kPa 내지 100 kPa의 강성도를 갖고 매트릭스 단백질로 코팅된 기질 상에서 MSC를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 중간엽 줄기세포 (MSC)를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 MSC는, 약 1 kPa 내지 100 kPa의 강성도를 갖고 매트릭스 단백질로 코팅된 기질 상에서 배양되지 않는 것을 제외하고 동일한 조건에서 배양되는 MSC와 비교하여 향상된 혈관형성 잠재력을 갖는다.
일 구체예에서, 상기 제3 양상의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이다.
제4 양상은 제2 양상의 MSC 또는 제3 양상의 조성물을 포함하는 용기 (container)를 제공한다.
제5 양상은 제2 양상의 MSC 또는 제3 양상의 조성물, 또는 제4 양상의 용기를 포함하는 키트 (kit)를 제공한다.
제6 양상은 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 말초 동맥 질환 (PAD)을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 CAD 또는 PAD를 가진 대상체에게 제2 양상의 MSC를 투여하는 단계를 포함한다.
추가로 또는 대안으로서, 상기 제6 양상은 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 말초 동맥 질환 (PAD)을 가진 대상체에서 CAD 또는 PAD 치료용 약제의 제조에 있어서 제2 양상의 MSC의 용도를 제공한다.
추가로 또는 대안으로서, 상기 제6 양상은 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 말초 동맥 질환 (PAD)을 가진 대상체에서 CAD 또는 PAD를 치료하는 방법에 사용하기 위해 제2 양상의 MSC를 제공한다.
도 1은 줄기세포 혈관형성 촉진 (stem cell proangiogenesis)에서 매트릭스의 생물학적 및 물리적 조성의 영향을 조사하는 실험 디자인의 개략도이다.
도 2는 냉동보존 후에 프라이밍된 MSC에서 혈관형성 촉진 효과의 지속성을 테스트하는 실험 디자인의 개략도이다.
도 3은 관생성 분석법의 개략도이다. 마스터 세그먼트 (master segments)는 노란색으로 표시되고, 마스터 정션 (master junction)이라고 하는, 1개의 분지와 독점적으로 관련되지 않은 2개의 정션에 의해 구분된 (delimited) 트리 (tree) 조각으로 구성된다. 마스터 정션은 적어도 3개의 마스터 세그먼트를 연결하는 정션이다. 선택적으로, 2개의 근접한 마스터 정션은 고유한 마스터 정션으로 융합될 수 있다. 마스터 정션은 빨간색으로 표시된다. 메쉬 (meshes)는 세그먼트 또는 마스터 세그먼트로 둘러싸인 영역이다. 메쉬는 파란색으로 표시된다.
도 4는 매트릭스의 생물학적 및 물리적 조성이 MSC 형태에 영향을 미친다는 것을 보여주는 현미경 사진이다. 상이한 코팅을 가진 폴리아크릴아미드 겔에서 배양된 MSC는 기질 강성도 (좌측: 1 kPa, 중간: 10 kPa, 및 우측: 40 kPa) 및 각 기질에 접합된 ECM 단백질 (상단: 콜라겐, 중간: 피브로넥틴, 하단: 라미닌)에 따라 상이한 세포 형태 및 액틴 필라멘트 조직 (적색)을 보여주었다. 핵은 DAPI, 4- 6-디아미디노-2-페닐인돌로 대조염색되었다.
도 5는 관 형성을 측정하는 관생성 분석법의 결과를 나타내는 막대 그래프이고, 여기서 HMVEC는 다양한 강성도의 하이드로겔 및 매트릭스 단백질 조성물에 걸쳐 배양된 MSC로부터의 조건화된 배지로 처리되었다. A: 마스터 세그먼트의 총 길이; B: 분지의 총 길이; C: 총 길이; D: 세그먼트의 총 길이.
도 6. (A) 폴리아크릴아미드 겔 제조 및 접합. (B) 다양한 강성도의 하이드로겔 및 리간드 조성물에 걸쳐 배양된 MSC로부터의 조건화된 배지로 처리한 후에 평균 인간 미세혈관 내피 세포 (HMVEC) 관 면적. (C) 양성 및 음성 대조군 하에 HMVEC의 이미지. (C) (상단) 피브로넥틴 0.5, 10 및 40 kPa인 각 조건의 배지에서 배양된 HMVEC, (하단) 기질 강성도는 MSC 세포 확산 특성을 변화시키고, 이의 분비 프로파일에 영향을 준다. *는 p < 0.05를 나타낸다.
도 7은 피브로넥틴 및 콜라겐 I의 조합 (좌측), 1 kPa 콜라겐 (중앙) 및 10 kPa 피브로넥틴 (우측)으로 코팅된 표준 조직 배양 플레이트 (TCPS)로부터의 배지를 사용한 HMVEC 배양의 위상차 현미경 사진이고, 막대 그래프는 상기 3가지 조건을 정량화하였다. * p < 0.05.
도 8은 마스터 세그먼트의 총 길이를 측정하는 관생성 분석법의 결과를 나타내는 막대 그래프이고, 여기서 HMVEC는 냉동보존 전 (좌측) 및 후 (우측)에, 다양한 강성도의 하이드로겔 및 매트릭스 단백질 조성물에 걸쳐 배양된 MSC로부터의 조건화된 배지로 처리되었다. 프라이밍된 MSC는 냉동보존 후에 관 형성을 유도하는 이의 능력을 유지하였다. 좌측, * p < 0.05. 우측, p < 0.05, one-way ANOVA.
도 9는 2개의 매트릭스 단백질로 코팅된 하이드로겔 상에서 MSC를 배양한 후에 관생성 분석법의 도식적 표현, 관생성 분석법의 정량분석, 및 관 형성을 보여주는 각 조건의 위상차 현미경 사진을 제공한다. MSC 배양 전에, 상기 하이드로겔을 피브로넥틴 12.5 μg/mL 및 콜라겐 12.5 μg/mL의 조합으로 코팅하였다. 상기 2개의 매트릭스 단백질의 조합은 냉동보존 후에 MSC의 혈관형성 잠재력을 증가시켰다.
도 2는 냉동보존 후에 프라이밍된 MSC에서 혈관형성 촉진 효과의 지속성을 테스트하는 실험 디자인의 개략도이다.
도 3은 관생성 분석법의 개략도이다. 마스터 세그먼트 (master segments)는 노란색으로 표시되고, 마스터 정션 (master junction)이라고 하는, 1개의 분지와 독점적으로 관련되지 않은 2개의 정션에 의해 구분된 (delimited) 트리 (tree) 조각으로 구성된다. 마스터 정션은 적어도 3개의 마스터 세그먼트를 연결하는 정션이다. 선택적으로, 2개의 근접한 마스터 정션은 고유한 마스터 정션으로 융합될 수 있다. 마스터 정션은 빨간색으로 표시된다. 메쉬 (meshes)는 세그먼트 또는 마스터 세그먼트로 둘러싸인 영역이다. 메쉬는 파란색으로 표시된다.
도 4는 매트릭스의 생물학적 및 물리적 조성이 MSC 형태에 영향을 미친다는 것을 보여주는 현미경 사진이다. 상이한 코팅을 가진 폴리아크릴아미드 겔에서 배양된 MSC는 기질 강성도 (좌측: 1 kPa, 중간: 10 kPa, 및 우측: 40 kPa) 및 각 기질에 접합된 ECM 단백질 (상단: 콜라겐, 중간: 피브로넥틴, 하단: 라미닌)에 따라 상이한 세포 형태 및 액틴 필라멘트 조직 (적색)을 보여주었다. 핵은 DAPI, 4- 6-디아미디노-2-페닐인돌로 대조염색되었다.
도 5는 관 형성을 측정하는 관생성 분석법의 결과를 나타내는 막대 그래프이고, 여기서 HMVEC는 다양한 강성도의 하이드로겔 및 매트릭스 단백질 조성물에 걸쳐 배양된 MSC로부터의 조건화된 배지로 처리되었다. A: 마스터 세그먼트의 총 길이; B: 분지의 총 길이; C: 총 길이; D: 세그먼트의 총 길이.
도 6. (A) 폴리아크릴아미드 겔 제조 및 접합. (B) 다양한 강성도의 하이드로겔 및 리간드 조성물에 걸쳐 배양된 MSC로부터의 조건화된 배지로 처리한 후에 평균 인간 미세혈관 내피 세포 (HMVEC) 관 면적. (C) 양성 및 음성 대조군 하에 HMVEC의 이미지. (C) (상단) 피브로넥틴 0.5, 10 및 40 kPa인 각 조건의 배지에서 배양된 HMVEC, (하단) 기질 강성도는 MSC 세포 확산 특성을 변화시키고, 이의 분비 프로파일에 영향을 준다. *는 p < 0.05를 나타낸다.
도 7은 피브로넥틴 및 콜라겐 I의 조합 (좌측), 1 kPa 콜라겐 (중앙) 및 10 kPa 피브로넥틴 (우측)으로 코팅된 표준 조직 배양 플레이트 (TCPS)로부터의 배지를 사용한 HMVEC 배양의 위상차 현미경 사진이고, 막대 그래프는 상기 3가지 조건을 정량화하였다. * p < 0.05.
도 8은 마스터 세그먼트의 총 길이를 측정하는 관생성 분석법의 결과를 나타내는 막대 그래프이고, 여기서 HMVEC는 냉동보존 전 (좌측) 및 후 (우측)에, 다양한 강성도의 하이드로겔 및 매트릭스 단백질 조성물에 걸쳐 배양된 MSC로부터의 조건화된 배지로 처리되었다. 프라이밍된 MSC는 냉동보존 후에 관 형성을 유도하는 이의 능력을 유지하였다. 좌측, * p < 0.05. 우측, p < 0.05, one-way ANOVA.
도 9는 2개의 매트릭스 단백질로 코팅된 하이드로겔 상에서 MSC를 배양한 후에 관생성 분석법의 도식적 표현, 관생성 분석법의 정량분석, 및 관 형성을 보여주는 각 조건의 위상차 현미경 사진을 제공한다. MSC 배양 전에, 상기 하이드로겔을 피브로넥틴 12.5 μg/mL 및 콜라겐 12.5 μg/mL의 조합으로 코팅하였다. 상기 2개의 매트릭스 단백질의 조합은 냉동보존 후에 MSC의 혈관형성 잠재력을 증가시켰다.
"관상 동맥 질환 (coronary artery disease)" 또는 "CAD"는 관상 동맥이 좁아져서 심장으로의 혈류가 감소되어, 그러므로 산소 공급이 감소되는 것을 의미한다. CAD는 또한 "관상 심장 질환 (coronary heart disease)" 또는 "CHD"라고도 한다.
"말초 동맥 질환 (peripheral artery disease)" 또는 "PAD"는 사지에 혈액, 그러므로 산소를 공급하는 동맥이 좁아지는 것을 의미한다.
"죽상동맥경화증 (Atherosclerosis)"은 CAD 및 PAD 모두를 포함하므로, 본 개시내용은 또한 죽상동맥경화증을 치료하는 것과 관련이 있다.
본원에서 사용되는, "중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell)" 또는 "MSC"는 골수, 지방 조직 (지방), 태반 및 제대혈을 포함하는 광범위한 조직으로부터 분리될 수 있는 특정 타입의 줄기세포를 나타낸다. MSC는 또한 "중간엽 기질 세포 (mesenchymal stromal cells)"로도 알려져 있다.
MSC는 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자와 같은 생체활성 분자를 분비하며, 면역계를 조절하는 능력을 갖는다. MSC는 생착 (engraftment)에 의존하지 않고 면역계에서의 효과 및 재생을 촉진하는 것으로 나타났다. 다시 말해서, 상기 MSC 자체는 반드시 숙주로 통합될 필요는 없으며, 오히려 이들은 효과를 발휘하고, 그 다음에 짧은 시간내에 제거된다. 그러나 MSC는 생착될 수 있다.
치료용 MSC는 "자가 (autologous)" 또는 "동종이형 (allogeneic)"일 수 있다. 본원에서 사용되는, "자가"는 예를 들어 골수 또는 지방 조직으로부터 단리된 자신의 세포로 환자를 치료하는 것을 의미하는 반면, "동종이형"은 공여자로부터의 세포를 사용하여 다른 사람을 치료하는 것을 의미한다. 동종이형 MSC는 유도 만능성 줄기세포 (induced pluripotent stem cell) 또는 iPSC를 통해 공여자로부터 유래될 수 있다. 대안으로서, 동종이형 MSC는 배아 줄기세포 (embryonic stem cell) 즉, ESC로부터 유래될 수 있다. 그렇지 않으면, 동종이형 MSC는 또한 예를 들어 공여자의 골수, 지방 조직, 탯줄 조직 또는 혈액, 또는 하악 제3대구치 (mandibular third molar)의 발달 중인 치배 (tooth bud)와 같은 어금니 세포 (molar cells)를 포함하는 다른 출처로부터 유래될 수 있다.
동종이형 MSC는 다른 사람에서 면역 반응을 유발하지 않으므로, 공여자를 수혜자에 대해 면역-매칭할 필요가 없다. 이는 중요한 상업적 이점을 갖는다.
본원에서 사용되는, "만능성 줄기세포 (pluripotent stem cell)" 또는 "PSC"는 무한하게 자기 재생되고, 임의의 다른 세포 타입으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 만능성 줄기세포에는 배아 줄기세포 (ESC) 및 유도 만능성 줄기세포 (iPSC)의 두가지 주요 타입이 있다.
본원에서 사용되는, "배아 줄기세포 (embryonic stem cell)" 또는 "ESC"는 시험관 수정 요법을 완료하고, 잉여 배아를 가진 환자의 동의를 얻어, 기증된 5 내지 7일 된 배아로부터 단리된 세포를 의미한다. ESC의 사용은 인간 배아로부터 세포를 추출하는 것에 대한 윤리적인 우려로 어느 정도 장애가 있다.
적합한 인간 PSC는 H1 및 H9 인간 배아 줄기세포 (human embryonic stem cells: hESCs)를 포함한다. H1 및 H9 hESCs는 예를 들어 WiCell, Madison, WI 53719 USA로부터 입수 가능하다.
본원에서 사용되는, "유도 만능성 줄기세포 (induced pluripotent stem cell)" 또는 "iPSC"는 성체 세포 (adult cell) 유래의 ESC-유사 세포를 의미한다. iPSC는 ESC와 매우 유사한 특성을 가지고 있지만, iPSC는 배아로부터 유래되지 않기 때문에 ESC와 관련된 윤리적인 우려를 피할 수 있다. 대신에, iPSC는 전형적으로 만능성 상태로 돌아가도록 "재프로그램된" 완전 분화된 성체 세포로부터 유래된다.
적합한 인간 iPSC는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 섬유모세포 (fibroblast) 유래 iPSC 19-9-7T, MIRJT6i-mND1-4 및 MIRJT7i-mND2-0, 및 골수 단핵세포 유래 iPSC BM119-9를 포함하고, 예를 들어 WiCell, Madison, WI 53719 USA로부터 입수 가능하다. 다른 적합한 iPSC는 Cellular Dynamics International of Madison, WI, USA로부터 입수할 수 있다.
본 개시내용의 일 구체예에 따르면, MSC는 MCA (mesenchymoangioblast) 잠재력을 가진 EMH lin-KDR+APLNR+PDGFRalpha+ 원시 중배엽 세포로부터 형성되고, WO2017/156580에 따라 생성될 수 있다. WO2017/156580은 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
WO2017/156580에 따라 제조되고, 선택적으로 WO2018/090084에 따라 분석된 인간 MSC는 본 개시내용에 따라 혈관형성 프라이밍의 대상이 될 수 있다. 당업자에게 알려진 다른 MSC도 본 개시내용에 따라 혈관형성 프라이밍의 대상이 될 수 있다.
매트릭스 단백질은 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질을 포함할 수 있다. 매트릭스 단백질은 하기를 포함할 수 있다: 라미닌; 콜라겐, 예를 들어 콜라겐 I 또는 콜라겐 IV; 피브로넥틴; 엘라스틴; 프로테오글리칸, 예를 들어 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 또는 케라탄 설페이트. 매트릭스 단백질은 포유동물의 것일 수 있다. 매트릭스 단백질은 인간 또는 비-인간 포유동물의 것일 수 있다. 당업자는 이들 및 기타 매트릭스 단백질을 알고 있을 것이다.
상기 기질 또는 하이드로겔은 2개 이상의 매트릭스 단백질로 코팅될 수 있다.
상기 기질 또는 하이드로겔은 약 1, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 7.5, 8, 9, 10, 11, 12, 12.5, 13, 14, 15, 16, 17, 17.5, 18, 19, 20, 21, 22, 22.5, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 μg/mL, 또는 이의 ± 10%의 상기 매트릭스 단백질로 코팅될 수 있다. 일 구체예에서, 콜라겐이 12.5 μg/mL로 상기 기질 또는 하이드로겔 상에 코팅된다. 일 구체예에서, 피브로넥틴이 12.5 μg/mL로 상기 기질 또는 하이드로겔 상에 코팅된다.
약 1 kPa 내지 100 kPa, 또는 이의 ± 10%의 강성도에 걸쳐 있는 기질 또는 하이드로겔 제제를 사용하여 배양에서 MSC를 프라이밍할 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔 제제는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 kPa, 또는 이의 ± 10%를 갖는다. 1 kPa 내지 100 kPa의 강성도는 정상 및 병리학적 심장 조직 강성도의 범위에 걸쳐 있다.
상기 기질 또는 하이드로겔은 폴리비닐 알코올, 소듐 폴리아크릴레이트, 아크릴레이트 폴리머 및 친수성 기가 풍부한 코폴리머, 또는 자연 발생 하이드로겔 예컨대 아가로스, 메틸셀룰로스, 히알루로난, 또는 엘라스틴-유사 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 하이드로겔은 폴리아크릴아미드를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 기질 또는 하이드로겔은 약 1 kPa 또는 이의 ± 10%의 강성도를 가지며, 콜라겐으로 코팅된다. 다른 구체예에서, 상기 하이드로겔은 약 10 kPa 또는 이의 ± 10%의 강성도를 가지며, 피브로넥틴으로 코팅된다. 다른 구체예에서, 상기 하이드로겔은 약 1 kPa 내지 10 kPa, 1 kPa 또는 10 kPa, 또는 이들의 ± 10%의 강성도를 가지며, 피브로넥틴 및 콜라겐으로 코팅된다.
상기 MSC는 상기 매트릭스 단백질로 코팅된 기질 상에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일, 또는 이의 ± 10% 동안 배양될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 MSC는 상기 매트릭스 단백질로 코팅된 기질 상에서 약 2일, 또는 이의 ± 10% 동안 배양된다.
"혈관형성 (angiogenesis)"은 기존 정맥, 동맥 및 모세혈관의 내피 세포 (EC)로부터 새로운 혈관이 형성되는 것을 의미한다.
"혈관형성 잠재력 (angiogenic potential)"은 혈관형성을 촉진하는 MSC의 잠재력 또는 능력을 의미한다.
본원에서 사용되는, "향상된" 혈관형성 잠재력은 MSC, 예컨대 본 개시내용에 따라 제조된 테스트 MSC가, 약 1 kPa 내지 100 kPa의 강성도를 갖고 매트릭스 단백질로 코팅된 기질 상에서 배양되지 않는 것을 제외하고 동일한 조건에서 배양되는 MSC, 예컨대 참조 또는 대조군 MSC와 비교하여, 혈관형성을 촉진하는 잠재력 또는 능력의 증가를 의미하고, 여기서 테스트 MSC 및 참조 MSC의 혈관형성 잠재력은 혈관형성 분석법을 사용하여 객관적으로 측정된다. 다시 말해서, 본 개시내용의 MSC는 이의 참조 또는 대조군 MSC와 비교하여 향상된 혈관형성 잠재력을 갖는다. 상기 용어 "참조" 및 "대조군"은 당업자에 의해 이해될 수 있다.
혈관형성 분석법은 혈관형성 잠재력을 평가하는데 사용될 수 있다. 혈관형성 분석법은 인 비트로 또는 인 비보일 수 있다. 일반적으로, 인 비트로 분석법은 혈관형성 과정의 특정 단계를 모니터링한다. 혈관형성 분석법은 하기를 평가할 수 있다: 증식 (예: 세포 계수, 비색 또는 DNA 합성 포함); 이동 (예: 상처 치유, 인간 진피 미세혈관 내피 세포 (HDMEC) 발아, 매트릭스 분해, Boyden 챔버, 파고키네틱 트랙 (phagokinetic track) 포함); 관 형성 (예: MATRIGEL, 공동-배양 포함); 흉부대동맥 고리 (thoracic aorta ring); 망막 모델 (retina model); 병아리 융모막 요막 (chick chorioallantoic membrane); 제브라피쉬 (zebrafish); 각막 혈관형성 (corneal angiogenesis); 이종 이식; 또는 MATRIGEL plug. 혈관형성 분석법은 상업적으로 이용 가능하다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에서 사용된 관생성 분석법은 혈관형성을 나타내는 인 비트로 분석법으로서 당해 분야에서 허용된다. 상기 분석법에서 관생성은 예를 들어 약 1, 2, 4, 8 또는 16시간, 또는 이의 ± 10%에서 정량분석될 수 있다.
예를 들어, 용어 "기질", "매트릭스" 및 "하이드로겔"은 본원에서 상호교환 가능하게 사용되며, 명백하게 반대되는 의도가 없는 한, 한정되는 것으로 간주되어서는 안된다.
예를 들어, 용어 "강성도" (또는 "강성") 및 "강직도 (rigidity)" 또는 ("강직")은 본원에서 상호교환 가능하게 사용되며, 한정되는 것으로 간주되어서는 안된다.
본 개시내용의 MSC 또는 본 개시내용의 MSC를 포함하는 조성물은 비경구 경로 (예: 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 근육내, 또는 경피)로 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 MSC 또는 약학적 조성물은 정맥내 또는 동맥내로 투여된다.
본 개시내용의 MSC 또는 본 개시내용의 MSC를 포함하는 약학적 조성물은 단독으로 또는 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 조합하여 단일 또는 다중 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다.
본 개시내용의 약학적 조성물은 당해 분야에 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있고 (예: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed. (2005), A. Gennaro et al., Lippincott Williams & Wilkins), 본원에 개시된 MSC, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 및/또는 부형제를 포함할 수 있다.
또한, 본 개시내용의 MSC 또는 본 개시내용의 MSC를 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 용기를 포함하는, 제품 및/또는 키트가 제공된다. 상기 용기는 본 개시내용의 MSC 또는 본 개시내용의 MSC를 포함하는 약학적 조성물을, 선택적으로 단위 투여 용량으로 포함하는 보틀, 바이알 또는 주사기일 수 있다. 예를 들어, 일회용 용기, 선택적으로 주사기 중에 본 개시내용의 MSC 또는 본 개시내용의 MSC를 포함하는 약학적 조성물을 주사 가능할 수 있다. 상기 제품 및/또는 키트는 본원에 개시된 방법에 따라 대상체의 치료를 나타내는, 인쇄된 지침 및/또는 라벨 등을 추가로 포함할 수 있다.
"단위 투여 형태 (unit dosage form)"로 형성되어 투여 및 투여량 균일성을 용이하게 할 수 있고, 치료적으로 유효한 양의 본 개시내용의 MSC 또는 본 개시내용의 MSC를 요구되는 약학적 부형제, 담체 및/또는 희석제와 조합하여 포함하는 약학적 조성물을 함유하는, 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭한다. 일 구체예에서, 상기 단위 투여 형태는 밀봉된 용기이고, 멸균된다.
용어 "치료적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)"은 대상체에서 CAD 또는 PAD를 치료하는데 유효한, 본 개시내용의 MSC 또는 본 개시내용의 MSC를 포함하는 약학적 조성물의 양을 지칭한다.
용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 치료적 치료 및 예방적 또는 방지 조치 모두를 지칭하고, 상기 목적은 대상체에서 CAD 또는 PAD를 방지, 감소 또는 개선하거나, 또는 대상체에서 CAD 또는 PAD의 진행을 지연 (감속)시키는데 있다. 치료를 필요로 하는 대상체는 CAD 또는 PAD를 이미 가지고 있는 대상체뿐만 아니라, CAD 또는 PAD가 예방 또는 개선되어야 하는 대상체도 포함한다.
용어 "예방하는", "예방", "예방적" 또는 "예방적인"은 CAD 또는 PAD가 발생하는 것을 막거나, 또는 이의 발생을 방해하거나, 방어하거나, 또는 방지하는 것을 지칭한다. 예방을 필요로 하는 대상체는 CAD 또는 PAD가 발병하기 쉬울 수 있다.
용어 "개선하다" 또는 "개선"은 CAD 또는 PAD의 감소, 줄어듦 또는 제거를 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "대상체"는 포유동물을 지칭할 수 있다. 상기 포유동물은 영장류, 구체적으로 인간일 수 있거나, 또는 가축, 동물원 동물 또는 반려 동물일 수 있다. 본원에 개시된 MSC, 조성물 및 방법이 인간의 의학적 치료에 적합하다는 것이 특히 고려됨에도 불구하고, 이는 또한 말, 소 및 양과 같은 가축, 개 및 고양이 같은 반려 동물, 또는 고양이과 동물 (felids), 개과 동물 (canids), 소과 동물 (bovids) 및 발굽동물 (ungulates)과 같은 동물원 동물의 치료를 포함하는 수의학적 치료에도 적용 가능하다.
본 명세서에서 다르게 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술 분야의 통상의 기술자가 공개된 문헌을 참조하여 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
하기 청구범위 및 본 발명의 설명에서, 명시적인 언어 또는 필수적인 함축으로 인해 문맥에서 달리 요구하는 경우를 제외하고, 용어 "포함하다" 또는 변형인 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 포괄적인 의미로 사용되며, 즉 기재된 특징의 존재를 명시하지만, 본 발명의 다양한 구체예에서 추가적인 특징의 존재 또는 부가를 배제하지 않는다.
실험 디자인이 도 1 및 도 2에 도시되어 있다. 실험 결과는 도 3 내지 9에 도시되어 있다.
본 도면에서 상기 매트릭스의 생물학적 및 물리적 조성이 MSC 형태에 영향을 주었음을 보여주었다. MSC는 겔의 강성도 및 각 기질에 접합된 단백질에 따라, 세포 형태 및 액틴 필라멘트 조직의 측면에서 상이하게 나타났다 (도 4). 세포는 모든 조건에서 둥근 형태를 보였고, 1 kPa 피브로넥틴 그룹에서 더 두드러진 세포 응집을 보였다 (도 4, 좌측 중간). 더 높은 강성도의 겔에서, MSC는 확산되었다. 특히, 10 kPa 피브로넥틴 기질 상에 시딩된 세포는 서로 정렬될 수 있었다 (도 4, 중간 라인, 중앙). 콜라겐 코팅된 표면에서 배양된 세포는 더 높은 강성도의 기질에서도 세포 응집을 유지하였다.
또한, 본 도면에서 특정 기질 강성도 및 매트릭스 단백질의 조합에 의해 관 형성이 자극된다는 것을 보여주었다. 상기 하이드로겔 상에서 2일 배양 후에, 각 조건으로부터 세포 배양 배지를 수집하였고, 이를 사용하여 관생성 분석법을 수행하였다. 관 형성은 8시간 후에 평가되었다. 결과로부터 모든 콜라겐 및 피브로넥틴 코팅된 표면이 정상 조직 배양 플레이트 (TCPS), 및 피브로넥틴 및 콜라겐 I의 조합으로 코팅된 TCPS보다 더 나은 관 형성을 유도할 수 있었음을 보여주었다. 또한, 10 kPa 콜라겐으로부터의 조건화된 배지는 양성 대조군보다 더 높은 관 형성을 보여주었다 (도 5). 다양한 강성도의 겔 상에 피브로넥틴 및 콜라겐을 모두 코팅한 경우, 1 kPa 및 10 kPa에서 최상의 관생성을 보였다 (도 9).
실시예
실시예 1
WO2017/156580에 따라 제조되고, 선택적으로 WO2018/090084에 따라 분석되는 인간 MSC를 사용하였다.
하이드로겔 접합의 경우, 폴리아크릴아미드 상에 산화된 단백질을 프린팅하기 위해 포토-리소그래피 (photo-lithography)를 사용하여 폴리디메틸실록산 (PDMS) 스탬프를 제작하였다. 1-40 kPa에 걸친 하이드로겔 제제를 조사하였고; 하이드로겔의 기계적 특성은 나노인덴테이션 (nanoindentation)을 통해 확인하였다. 매트릭스 단백질인 라미닌, 콜라겐 I 및 피브로넥틴을 산화시키고, 기질 상에 단독 및 조합하여 패턴화하였다. 단백질 표면 밀도는 요오드화 (iodination)를 사용하여 확인하였다.
2일 후에 상기 MSC로부터 조건화된 배지를 수집하였다. 혈관형성 활성은 인 비트로 관생성 분석을 사용하여 프로브하였고, 여기서 조건화된 배지를 인간 미세혈관 내피 세포 (hMVEC)를 함유하는 성장 인자 고갈된 매트리겔 (matrigel)에 부가하였다. 관 형성의 이미지를 8시간에서 수집하고, ImageJ (NIH)를 사용하여 정량분석하였다.
냉동보존 전 및 후에 활성화된 상태의 지속성에 대해 혈관형성 촉진 상태를 프라이밍하는 조건을 조사하였다.
실시예 2
상업적으로 이용 가능한 사이토카인 어레이를 사용하여 혈관형성 촉진 사이토카인 패널에 대해 관생성을 촉진하는 MSC-조건화 배지 (MSC-conditioned media)를 프로파일링할 것이다.
매트릭스 메탈로프로테아제 (matrix metalloprotease: MMP) 분해성 펩티드와 가교된 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA) 하이드로겔 내에 MSC를 캡슐화할 것이다. 상기 물질 내에 혼입하기 위해 아크릴화되는 혈관형성 분비체를 촉진하는 단백질을 스크린에서 확인하였다. 기계적 특성은 PEGDA 분자량을 통해 조정되고, 나노인덴테이션으로 평가할 것이다. HMVEC의 인 비트로 관생성 및 항체 어레이를 사용하여 상기 캡슐화된 MSC로부터의 분비를 평가할 것이다.
실시예 3 - 인간 PSC를 MSC로 분화하기 위한 프로토콜
설명 | 판매사 / 카탈로그 # 또는 참조 # |
DMEM/F12 기본 배지 | Invitrogen / A1516901 |
E8 보충제 | Invitrogen / A1517101 |
비트로넥틴 | Life Technologies / A14700 |
콜라겐 IV | Sigma / C5533 |
H-1152 ROCK 억제제 | EMD Millipore / 555550 |
Y27632 디하이드로클로라이드 ROCK 억제제 | Tocris / 1254 |
FGF2 | Waisman Biomanufacturing / WC-FGF2-FP |
인간 내피-SFM | Life Technologies / 11111-044 |
stemline II 조혈 줄기세포 증식 배지 | Sigma / S0192 |
GLUTAMAX | Invitrogen / 35050-061 |
인슐린 | Sigma / I9278 |
염화리튬 (LiCl) | Sigma / L4408 |
콜라겐 I 용액 | Sigma / C2249 |
피브로넥틴 | Life Technologies / 33016-015 |
DMEM/F12 | Invitrogen / 11330032 |
재조합 인간 BMP4 | Peprotech / 120-05ET |
액티빈 A | Peprotech / 120-14E |
Iscove 변형 Dulbecco 배지 (IMDM) | Invitrogen / 12200036 |
Ham F12 영양 믹스 | Invitrogen / 21700075 |
중탄산나트륨 | Sigma / S5761 |
L-아스코르브산 2-포스페이트 Mg2+ | Sigma / A8960 |
1-티오글리세롤 | Sigma / M6145 |
소듐 셀레나이트 | Sigma / S5261 |
비필수 아미노산 | HyClone / SH30853.01 |
화학적으로 정의된 지질 농축물 | Invitrogen / 11905031 |
배아 전달 등급 물 (embryo transfer grade water) | Sigma / W1503 |
폴리비닐 알콜 (PVA) | MP Bio / 151-941-83 |
홀로-트란스페린 | Sigma / T0665 |
ES-CULT M3120 | Stem Cell Technologies / 03120 |
STEMSPAN 무혈청 증식 배지 (SFEM) | Stem Cell Technologies / 09650 |
L-아스코르브산 | Sigma / A4544 |
PDGF-BB | Peprotech / 110-14B |
표 1에 열거된 시약은 당해 기술분야의 기술자에게 알려져 있으며, 허용되는 조성물, 예를 들어 IMDM 및 Ham F12를 갖는다. GLUTAMAX는 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드를 포함하며, 통상 0.85% NaCl 중 200 mM로 공급된다. GLUTAMAX는 배양된 세포가 디펩티드 결합을 절단할 때 L-글루타민을 방출한다. 화학적으로 정의된 지질 농축물은 아라키돈산 2 mg/L, 콜레스테롤 220 mg/L, DL-α-토코페롤 아세테이트 70 mg/L, 리놀레산 10 mg/L, 리놀렌산 10 mg/L, 미리스트산 10 mg/L, 올레산 10 mg/L, 팔미트산 10 mg/L, 팔미톨산 10 mg/L, 플루로닉 F-68 90 g/L, 스테아르산 10 mg/L, TWEEN 80® 2.2 g/L 및 에틸 알콜을 포함한다. H-1152 및 Y27632는 매우 강력한 세포-투과성, 선택적 ROCK (Rho-관련된 코일형 코일 형성 단백질 세린/트레오닌 키나제) 억제제이다.
10X IF6S | 양 | 최종 농도 |
IMDM | 1 패키지, 1 L용 분말 |
5X |
Ham F12 영양 믹스 | 1 패키지, 1 L용 분말 |
5X |
중탄산나트륨 | 4.2 g | 21 mg/mL |
L-아스코르브산 2-포스페이트 Mg2+ | 128 mg | 640 μg/mL |
1-티오글리세롤 | 80 μL | 4.6 mM |
소듐 셀레나이트 (0.7 mg/mL 용액) | 24 μL | 84 ng/mL |
GLUTAMAX | 20 mL | 10X |
비 필수 아미노산 | 20 mL | 10X |
화학적으로 정의된 지질 농축물 | 4 mL | 10X |
배아 전달 등급 물 | ~ 200 mL | NA |
IF9S | 양 | 최종 농도 |
IF6S | 5 mL | 1X |
폴리비닐 알콜 (PVA; 20 mg/mL 용액) | 25 mL | 10 mg/mL |
홀로-트란스페린 (10.6 mg/mL 용액) | 50 μL | 10.6 μg/mL |
인슐린 | 100 μL | 20 μg/mL |
배아 전달 등급 물 | ~ 50 mL | NA |
분화 배지 | 양 | 최종 농도 |
IF9S | 36 mL | 1X |
FGF2 | 1.8 μg | 50 ng/mL |
LiCl (2M 용액) | 36 μL | 2mM |
BMP4 (100 μg/mL 용액) | 18 μL | 50 ng/mL |
액티빈 A (10 mg/mL 용엑) | 5.4 μL | 1.5 ng/mL |
M-CFM | 양 | 최종 농도 |
ES-CULT M3120 | 40 mL | 40% |
STEMSPAN SFEM | 30 mL | 30% |
인간 내피-SFM | 30 mL | 30% |
GLUTAMAX | 1 mL | 1X |
L-아스코르브산 (250 mM 용액) | 100 μL | 250 μM |
LiCl (2M 용액) | 50 μL | 1 mM |
1-티오글리세롤 (100 mM 용액) | 100 μL | 100 μM |
FGF2 | 600 ng | 20 ng/mL |
M-SFEM | 양 | 최종 농도 |
인간 내피-SFM | 5 L | 50% |
STEMLINE II HSFM | 5 L | 50% |
GLUTAMAX | 100 mL | 1X |
1-티오글리세롤 | 87 μL | 100 μM |
FGF2 | 100 μg | 10 ng/mL |
프로토콜
1. 비트로넥틴 코팅된 (0.5 μg/cm2) 플라스틱 웨어 (plastic ware) 상에, E8 완전 배지 (DMEM / F12 기본 배지 + E8 보충제) + 1 μM H1152에서 iPSC를 해동하였다. 도말된 iPSC를 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 인큐베이션하였다.
2. 비트로넥틴 코팅된 (0.5 μg/cm2) 플라스틱 웨어 상에, E8 완전 배지 (ROCK 억제제 없음)에서 iPSC를 3회 계대로 증식하고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 인큐베이션하고, 그 다음에 분화 과정을 개시하였다.
3. iPSC를 수확한 다음, E8 완전 배지 + 10 μM Y27632 중에 콜라겐 IV 코팅된 (0.5 μg/cm2) 플라스틱 웨어 상에 5x103 세포/cm2의 단일 세포/작은 콜로니로서 iPSC를 시딩하고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
4. E8 완전 배지 + 10 μM Y27632를 분화 배지로 대체하고, 37 ℃, 5% CO2, 5% O2 (저산소)에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.
5. 분화 배지 부착 배양물로부터 콜로니 형성 세포를 단일 세포 현탁액으로 수확하고, M-CFM 현탁 배양물로 전달한 후에, 37℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 12일 동안 인큐베이션하였다.
6. 콜로니를 수확한 다음, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 I 코팅된 (0.67 μg/cm2 피브로넥틴, 1.2 μg/cm2 콜라겐 I) 플라스틱 웨어 상에 콜로니 (계대 0)를 시딩하고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
7. 콜로니를 수확한 다음, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 웨어 상에 1.3x104 세포/cm2의 단일 세포 (계대 1)로서 시딩하고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
8. 콜로니를 수확한 다음, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 웨어 상에 1.3x104 세포/cm2의 단일 세포 (계대 2)로서 시딩하고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
9. 콜로니를 수확한 다음, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 웨어 상에 1.3x104 세포/cm2의 단일 세포 (계대 3)로서 시딩하고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
10. 콜로니를 수확한 다음, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 웨어 상에 1.3x104 세포/cm2의 단일 세포 (계대 4)로서 시딩하고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
11. 콜로니를 수확한 다음, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 웨어 상에 1.3x104 세포/cm2의 단일 세포 (계대 5)로서 시딩하고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
12. 단일 세포로 수확하고 최종 산물을 동결시켰다.
Claims (19)
- 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell: MSC)의 혈관형성 잠재력을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 약 1 kPa 내지 100 kPa의 강성도 (stiffness)를 갖고 매트릭스 단백질로 코팅된 기질 상에서 상기 MSC를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 MSC는, 약 1 kPa 내지 100 kPa의 강성도를 갖고 매트릭스 단백질로 코팅된 기질 상에서 배양되지 않는 것을 제외하고 동일한 조건에서 배양되는 MSC와 비교하여 향상된 혈관형성 잠재력을 갖는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 강성도는 약 1 kPa, 10 kPa, 또는 40 kPa인 것인 방법.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 매트릭스 단백질은 콜라겐, 피브로넥틴 또는 라미닌인 것인 방법.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 약 10 kPa의 강성도를 가지며, 피브로넥틴으로 코팅되는 것인 방법.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 약 1 kPa 또는 10 kPa의 강성도를 가지며, 피브로넥틴 및 콜라겐으로 코팅되는 것인 방법.
- 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 약 25 μg/mL의 매트릭스 단백질로 코팅되는 것인 방법.
- 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 폴리아크릴아미드를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC는 WO2017/156580에 따라 제조되는 것인 방법.
- 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질 상에서 MSC를 배양한 후에 상기 MSC를 냉동보존하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 냉동보존된 MSC를 해동하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 향상된 혈관형성 잠재력은 냉동보존 및 해동 후에도 지속되는 것인 방법.
- 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 향상된 혈관형성 잠재력은 관생성 분석법 (tubulogenesis assay)을 사용하여 측정되는 것인 방법.
- 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 방법에 의해 향상되는 혈관형성 잠재력을 갖는 중간엽 줄기세포 (MSC).
- 약 1 kPa 내지 100 kPa의 강성도를 갖고 매트릭스 단백질로 코팅된 기질 상에서 중간엽 줄기세포 (MSC)를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 중간엽 줄기세포 (MSC)를 포함하는 조성물로서, 상기 MSC는, 약 1 kPa 내지 100 kPa의 강성도를 갖고 매트릭스 단백질로 코팅된 기질 상에서 배양되지 않는 것을 제외하고 동일한 조건에서 배양되는 MSC와 비교하여 향상된 혈관형성 잠재력을 갖는 것인 조성물.
- 청구항 13에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물인 것인 조성물.
- 청구항 12의 MSC 또는 청구항 13 또는 14의 조성물을 포함하는 용기 (container).
- 청구항 12의 MSC, 청구항 13 또는 14의 조성물, 또는 청구항 15의 용기를 포함하는 키트 (kit).
- 관상 동맥 질환 (coronary artery disease: CAD) 또는 말초 동맥 질환 (peripheral artery disease: PAD)을 치료하는 방법으로서, CAD 또는 PAD를 가진 대상체에게 청구항 12의 MSC 또는 청구항 13 또는 14의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 말초 동맥 질환 (PAD)을 가진 대상체에서 CAD 또는 PAD 치료용 약제의 제조에 있어서 청구항 12의 MSC 또는 청구항 13 또는 14의 조성물의 용도.
- 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 말초 동맥 질환 (PAD)을 가진 대상체에서 CAD 또는 PAD를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 청구항 12의 MSC 또는 청구항 13 또는 14의 조성물.
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