KR20160064954A - 발모촉진 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발모촉진 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 발모촉진 방법은, 2계대 이상 배양한 인간 지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 소유래 혈청이 포함되지 않은 무혈청 배지에서 성장인자인 bFGF 또는 EGF를 별도로 첨가하여 배양하는 단계를 거친 배양 배지로부터, 줄기세포 배양액 100중량부를 수득하는 단계; 물 100 내지 300주량부에, 아연 0.001 내지 0.1 중량부, D-판테놀 5 내지 50 중량부 및 D-바이오틴 0.0001 내지 0.1 중량부를 혼합하여 혼합 용액을 준비하는 단계; 및 상기 줄기세포 배양액에 상기 혼합 용액을 혼합한 이후, 그 혼합물을 두피에 분사 또는 도포되는 방식에 의하여 발모를 촉진하는 것을 특징으로 한다.

Description

발모촉진 방법{METHOD FOR PROMOTING GROWTH OF HAIR}

본 기술은 탈모 치료 분야의 기술로서, 보다 구체적으로는 우수한 발모 효과를 갖고 시술을 매우 간소화할 수 있는 발모 촉진 방법에 관한 것이다.

최근 미용에 관심이 높아지면서 탈모 치로에 관한 관심 또한 높아지고 있다. 모발은 생명에 직접적인 중요한 생리적 기능은 가지고 있지 않지만 외부의 충격으로부터 완충과 자외선 차단, 외부자극으로부터 인체를 보호하며, 신체에 불필요한 비소, 수은, 아연 등의 중금속을 흡수하여 체외로 배출하는 기능을 가지고 있다. 모발은 모발이 성장하는 성장기(anagen), 성장이 멈추고 모구부가 축소되면서 대사과정이 늦어지는 퇴행기(catagen), 모낭이 수축되면서 모근이 위쪽으로 밀려 올라가 모발이 빠지게 되는 휴지기(telogen)로 구분되며, 같은 장소에서 새로운 모발이 생성됨으로 인해 오래된 모발이 탈락하고 성장기로 전환되는 모주기(hair cycle)을 가지고 일생동안 성장과 탈락을 반복한다.

이러한 모발이 정상적으로 있어야 할 곳에 없는 상태를 탈모라 하며, 그 원인으로 남성호르몬 관여에 의한 모포 기능의 저하, 두피생리기능의 저하, 두피 긴장에 의한 국소혈류장애, 영양불량, 스트레스, 약물에 의한 부작용, 유전적 요인, 화학물질, 백혈병, 결핵, 악성 임파종 등의 질병을 들고 있다. 위와 같은 기능 외에 탈모가 심한 경우 사회생활을 하는데 문제가 있을 수 있으며 심리적으로도 위축되어 심각한 영향을 미칠 수 있어 삶의 질 측면에서 탈모 치료는 매우 중요하다.

현재 탈모 치료법으로 가장 많이 쓰이고 있는 방법은 자기 자신의 머리털을 이용하여 이식하는 자가 모발이식 수술법과 미녹시딜과 프로페시아를 사용하는 약물 치료가 널리 사용되고 있다. 미녹시딜의 경우 혈관확장을 통한 모세포에 영양공급증가 및 칼륨 채널 개방 효과(potassium channel opening effect) 등이 모발 성장을 유도하며, 프로페시아의 경우 DHT(dihydrotestosterone)의 생성을 저해하는 효과로 모발 성장을 유도하지만 이 두 약물 모두 치료할 당시에는 발모 효능이 나타나나, 치료가 중단되면 탈모가 다시 진행되고 모발성장의 효과보다는 탈모방지의 효과가 더욱 크며, 프로페시아의 경우 성기능 장애, 임신한 여성의 경우 기형아 출산과 같은 부작용이 나타날 수 있다. 최근, 탈모와 관련된 유전자를 모낭에 전달하거나 유전자 발현을 차단하는 방법으로 시술되는 유전자 치료법이 개발되었으나, 치료의 효능 및 안전성이 불확실하고, 치료비용이 고가이어서 임상적용이 용이하지 않다는 문제점이 있다.

한편, 최근에는 줄기세포를 이용한 탈모치료 방법 등도 시도되고 있으나. 현재 줄기세포를 이용한 탈모치료 방법은 줄기세포를 탈모나 무모의 증상을 나타내는 부위에 직접 주입하여 모낭 세포로 분화하도록 유도하는 방법이 대부분인데, 이러한 방법은 자가 줄기세포가 아니면 치료가 불가능하며, 치료효과가 지속적으로 유지되지 못할 뿐만 아니라, 오랜 시간과 고가의 비용이 소요된다는 단점이 있다. 이러한 문제점을 개선하기 위하여 줄기세포가 아닌 줄기세포 배양 시 생산되는 배양액을 사용하여 탈모를 치료하고자 하는 시도가 이루어지고 있으나, 아직 상업화 수준의 실효성을 거두고 있지 못한 실정이다.

본 발명의 목적은 모발의 성장 촉진 효과가 매우 우수하고, 유효 성분의 인체 전달 방식이 매우 간단하여 조성물의 활용 가치가 매우 높은 발모촉진 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 의한 발모촉진 방법은, 2계대 이상 배양한 인간 지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 소유래 혈청이 포함되지 않은 무혈청 배지에서 성장인자인 bFGF 또는 EGF를 별도로 첨가하여 배양하는 단계를 거친 배양 배지로부터, 줄기세포 배양액 100중량부를 수득하는 단계; 물 100 내지 300주량부에, 아연 0.001 내지 0.1 중량부, D-판테놀 5 내지 50 중량부 및 D-바이오틴 0.0001 내지 0.1 중량부를 혼합하여 혼합 용액을 준비하는 단계; 및 상기 줄기세포 배양액에 상기 혼합 용액을 혼합한 이후, 그 혼합물을 두피에 분사 또는 도포되는 방식에 의하여 발모를 촉진하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 발모촉진 방법은, 줄기세포 배양의 부산물인 배양액을 활용함으로써, 줄기세포 배양의 경제적 효율을 도모할 수 있다.

무엇보다 중요한 점은, 본 발명에 따른 발모촉진 방법의 발모 촉진효과의 우수성이며, 대략 수 개월의 조성물 투여만으로도 확실한 발모효과가 발휘될 수 있다.

한편, 상기 발모촉진 방법은 두피나 두발에 단순히 분사, 분무 또는 도포하는 것만으로도 유효성분의 전달이 이루어질 수 있어 상기 발모촉진 방법을 이용한 시술이 매우 간소화될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 발모촉진 방법을 이용하여 탈모 환자에게 치료한 후의 시간 경과에 따른 모발 변화를 보여주는 사진이다.

이하 본 발명의 일 실시예에 따른 발모 촉진 방법을 자세하게 설명하도록 한다.

상기 발모 촉진 방법은, 2계대 이상 배양한 중간엽 줄기세포 배양배지로부터, 줄기세포 배양액을 수닥하는 단계를 포함한다. 상기 줄기세포 배양액은 다양한 첨가제를 포함한 배양배지뿐만 아니라 줄기세포의 배양 과정 중에 발생된 대사산물을 포함한다.

구체적으로, 상기 줄기세포 배양액의 수득과정은 (a) 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계; (b) 2 계대 이상 배양한 중간엽 줄기세포를 수집하여 무혈청 배지에서 생체적합성 스캐폴드와 3차원 배양하는 단계; 및 (c) 배양 배지를 수집하는 단계를 포함할 수 있다.

여기에서, (a) 중간엽 줄기세포의 배양은 기질배지 및 증식배지에서 배양한 후 계대 배양하는 것이 바람직하고, (b) 중간엽 줄기세포의 3차원 배양은 3일 간격으로 배지를 교환하면서 적어도 3회 이상 줄기세포 배양액을 얻는 것이 바람직하다. 그리고, 상기 무혈청 배지에 bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 EGF(epidermal growth factor) 중 적어도 하나를 첨가하여 배양할 수 있다.

또한, 생체적합성 스캐폴드는 세포 접착성인 표면을 갖는 세포 지지체로서 천연 및 합성 고분자일 수 있으며, 예를 들어 알지네이트, 단백질, 콜라젠, 피브린, 히알루론산, 셀룰로오스, 폴리(알파-하이드록시산) 계열, 폴리(비닐 알콜), 폴리안하이드라이드 등이 포함된다.

상기 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 중간엽 줄기세포 배양액 조성물은, 상기 방법에 따라 제조되어 다량의 성장인자와 사이토카인을 함유하며, 특히 VEGF 및 EGF를 고농도로 함유하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 본 발명의 중간엽 줄기세포 배양액 조성물은 종래의 배양액 조성물에 비하여 VEGF는 4 배 이상, EGF는 17 배 이상 함유한다.

본 발명은 무혈청 배지에서 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 효과적으로 배양하여 얻어지는 다량의 생리활성물질을 함유하는 줄기세포 배양액을 발모촉진용 조성물의 성분으로 포함하는 것이다. 배양에 사용하는 중간엽 줄기세포는 골수, 제대혈, 지방조직 등으로부터 얻을 수 있다. 특히 지방 유래 줄기세포는 비교적 접근이 수월하고 채취가 간단하며 한 개체로부터 다량을 얻을 수 있다는 장점이 있다.

본 발명에서는 중간엽 줄기세포를 배양하는 데 있어서 기저배지, 증식배지를 적절히 사용하여 배양함으로써, 다량의 중간엽 줄기세포를 단기간 내에 효과적으로 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에서는 배양액을 얻는 과정에서 무혈청 배지 중 생체적합성 스캐폴드를 이용하여 3차원 배양을 실시함으로써, 장기간 동안 세포를 안정하게 유지할 수 있어 다량의 세포배양액을 생산할 수 있다. 이처럼 본 발명의 방법에 따라 생산된 줄기세포 배양액은 종래의 세포배양법인 2차원 배양으로 생산된 배양액에 비해 VEGF, EGF와 같은 성장인자의 함량이 월등히 높은 것을 특징으로 한다. 중간엽 줄기세포는 인간의 골수, 지방조직, 제대혈 등에서 얻게 되므로 채취 가능한 양이 제한적이고, 이들 조직으로부터 얻어지는 중간엽 줄기세포의 양 또한 매우 한정적이다. 줄기세포 배양액을 임상적 용도로 사용하기 위해서는, 한정된 수의 세포에서 다량의 줄기세포 배양액을 얻는 것과 배양액 중에 포함되어 있는 생리활성물질의 함량이 높은 것이 바람직하다.

일반적으로 중간엽 줄기세포를 배양하고 유지하기 위해서는 소 유래 혈청이 필요한데, 세포배양액을 임상적 용도로 사용하기 위해서는 배양액 중에 소 유래 혈청이 포함되지 않는 것이 바람직하다. 중간엽 줄기세포의 배양배지에 소 유래 혈청이 포함되지 않을 경우 세포를 안정적으로 유지하기 어렵다.

본 발명에서는 소 유래 혈청이 포함되지 않은 무혈청 배지에서 중간엽 줄기세포를 안정적으로 배양할 수 있는 방법을 제공한다. 이 방법에 따라 얻어진 배양액은 기존의 방법으로 생산된 배양액에 비해 매우 고함량의 성장인자를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 배양 방법에 따라 얻어진 줄기세포 배양액 중 포함된 VEGF(vascular endothelial growth factor) 함량은 종래의 배양방법에 비해 약 4배 증가하여 현저히 개선된 효과를 제공하며, 따라서 임상적으로 매우 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라, 줄기세포를 피브린 글루와 같은 생체적합성 스캐폴드와 함께 3차원 배양을 실시할 경우, 세포배양을 위해 일반적으로 사용하는 플레이트를 사용하지 않고 간단한 형태의 바틀에서 배양이 가능하므로 매우 경제적이고 대용량의 배양액을 손쉽게 얻을 수 있다. 뿐만 아니라, 2차원 배양에서는 세포배양면의 크기에 따라 세포수가 제한되므로 줄기세포에서 분비되는 생리활성물질의 함량도 제한적인 반면, 본 발명에 따른 3차원 배양을 실시할 경우 세포수를 조정할 수 있으므로 배양액 중의 생리활성물질의 농도를 필요에 따라 증가시키는 것이 가능하다.

일반적으로 중간엽 줄기세포는 무혈청 배지에서 플레이트 배양을 할 경우 안정적으로 유지되지 않고 세포배양면으로부터 탈락되어 사멸하게 된다. 본 발명에서는 중간엽 줄기세포를 생체적합성 스캐폴드와 함께 배양함으로써, 부착하여 자라는 성질을 가진 중간엽 줄기세포가 3차원 스캐폴드 내에서 안정적으로 유지될 수 있도록 하였다. 생체적합성 스캐폴드의 한 예로서 피브린글루를 사용할 경우, 중간엽 줄기세포는 14일 동안 적어도 80% 이상의 생존율을 나타냈으며, 2차원 배양에 비해 고함량의 VEGF를 지속적으로 분비하였다.

또한, 본 발명의 방법에 따르면, 무혈청 배지에 bFGF(basic fibroblast growth factor) 및/또는 EGF(epidermal growth factor)를 첨가하여 배양할 경우 세포의 안정성 및 배양액 중 분비되는 성장인자의 함량을 증가시킬 수 있다.

본 명세서에서 "중간엽 줄기세포(mesenchy stem cells)"는 자기 증식이 가능하고 다분화능을 가지고 있으며, CD73+, CD90+, CD105+, CD14-, CD20-, CD34-, CD45-인 세포 표현형을 나타내는 세포를 의미하고, 골수, 지방조직, 제대혈 등에서 분리될 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 다만, 배양액의 유효 성분의 양적인 측면에서 지방유래 줄기세포가 바람직하다.

본 발명에서 "생리활성물질"은 세포나 신체의 기능에 영향을 미칠 수 있는 사이토카인, 세포성장인자 등을 통칭하여 나타낸다. "줄기세포 배양액"은 줄기세포를 배양한 세포배양 상등액을 지칭한다. 줄기세포 배양액은 줄기세포 배양 과정에서 세포로부터 분비되는 여러 가지 생리활성 물질을 함유하고 있다.

생체적합성 스캐폴드"는 세포와 친화성을 가지며 이른바 "세포 접착성"인 표면을 지닌 재료로 만들어지며 세포를 3차원적으로 부착하고 배양시킬 수 있는 지지체를 의미한다. 천연 유래 지지체의 예로는 알지네이트, 단백질, 콜라젠, 피브린, 히알루론산, 셀룰로오스 등이 있고 이에 한정되지는 않는다. 합성 고분자의 예를 들면 폴리(알파-하이드록시산) 계열, 폴리(비닐 알콜), 폴리안하이드라이드 등이 있으며 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서는 피브린 글루와 같은 생체적합성 스캐폴드와 함께 3차원 배양을 수행할 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양할 때 피브린 글루와 함께 3차원 배양을 실시함으로써, 인간 유래 성장인자, 특히 VEGF, EGF의 함량을 획기적으로 증가시킬 수 있다. 즉 2차원 배양에서는 저산소 조건을 주더라도 배양액 중 함유되는 VEGF 등의 함량을 높이는 데 한계가 있으며, 줄기세포 배양액을 1회 밖에 얻을 수 없지만, 3차원 배양에서는 줄기세포가 안정적으로 유지되면서 고농도의 세포성장인자를 지속적으로 분비하므로 3일에 한번씩 배양배지를 교환하면서 최소 3회 이상 배양배지를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 3차원 배양 방법에 따르면, 종래의 플레이트 배양과 달리, 바틀에서 배양이 가능하므로 대용량 생산이 가능하다.

상기 중간엽 줄기세포의 배양은 다음 과정에 따라 실시될 수 있으며, 세포배양에 사용되는 배지는 이에 한정되지 않는다.

(1) 중간엽 줄기세포의 배양

해당 조직에서 얻은 중간엽 줄기세포를 기질배지에 현탁시켜 10,000~40,000 cells/㎠의 농도로 배양용기에 접종한 후 배양한다. 기질배지는 10% 우혈청이 포함되어 있는 DMEM 또는 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth) 배지로, 약 24 시간 배양한다.

(2) 증식배지(expansion media)에서의 배양.

기질배지를 제거한 후, 증식배지에서 배양하여 부착성 세포를 증식시킨다. 증식배지는 10% 우혈청, 0.1~100 ng/㎖ 농도의 EGF(epidermal growth factor) 및/또는 0.1~100 ng/㎖ 농도의 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 DMEM 또는 DMEM/F12로, 부착성인 중간엽 줄기세포를 신속하게 증식시켜 세포 양을 단기간에 대량으로 증가시키는 작용을 한다.

(3) 계대 배양

세포가 배양용기 바닥의 80 내지 90%를 채우면 증식배지를 제거하고 트립신 처리를 통해 세포를 배양용기에서 떼어낸다. 계대배양을 위해서는 세포를 1:3~1:4로 희석하여 새로운 배양용기에서 증식배지와 함께 배양한다. 이와 같은 방법으로 추가적인 계대배양이 가능하다.

(4) 생체적합성 스캐폴드와 함께 배양

배양한 세포는 PBS로 3회 이상 세척하여 FBS를 제거해주고, 무혈청 배지에서 생체적합성 스캐폴드에 부착된 형태로 배양한다. 스캐폴드 내에서의 세포배양은 통상적인 세포배양 용기를 필요로 하지 않으므로, 무균 바틀 또는 culture bag에서 다량으로 배양이 가능하여 보다 낮은 비용으로 편리하게 배양할 수 있는 장점이 있다.

상기 줄기세포 배양액은 성장인자로서, VEGF, HGF, FCF, TFG-β1 및 EGF를 포함하고, 세포외 기질단백질로서, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 및 히알루론산을 포함할 수 있다.

상기 발모촉진용 조성물은 상기 줄기세포 배양액 100 중량부에 대하여, 0.001 내지 0.1 중량부를 갖는 아연을 포함한다. 또한, 상기 발모촉진용 조성물은 상기 줄기세포 배양액 100 중량부에 대하여, 5 내지 50 중량부를 갖는 판테놀계 화합물을 포함한다. 기 판테놀계 화합물의 예로서는, D-판네톨 등의 화합물을 들 수 있으며, 기타 판테놀 유도체 등이 사용될 수 있다.

상기 발모촉진용 조성물은 상기 줄기세포 배양액 100 중량부에 대하여, 0.0001 내지 0.1 중량부를 갖는 수용성 비타민을 포함한다. 상기 수용성 비타민으로서는, D-바이오틴 등이 사용될 수 있고 기타 다양한 형태의 수용성 비타민이 추가적으로 사용될 수 있다.

상기 각각의 성분, 아연, 판테놀계 화합물, 수용성 비타민 등은 수용액 상태로서, 상기 줄기세포 배양액과 혼합된다. 결국, 상기 발모촉진용 조성물에는 수용성 용매가 포함되어, 상기 줄기세포 배양액 100 중량부에 대하여 100 내지 300 중량부의 수용성 용매가 포함될 수 있다. 상기 수용성 용매로서는 식염수 등의 물 성분이 바람직하다.

상기 발모촉진용 조성물은 두피에 분무, 또는 분사 방식에 의하거나 단순히 두피에 균일하게 도포하는 것만으로도 모발 증식효과를 나타낼 수 있다. 즉, 주사제에 의한 두피 투여 방식 등에 의하지 않아도 되므로, 치료의 간소화가 가능할 수 있다.

이하에서는 본 발명의 일 실시예에 따른 발모촉진용 조성물의 발모 효과를 입증하기 위한 실험결과를 설명하도록 한다.

실시예:실험용 발모촉진용 조성물의 제조

하기 표 1과 같은 조성으로 발모촉진용 조성물을 제조하였다.

성분	줄기세포배양액	아연수용액			D-판테놀	D-바이오틴
부피	2cc	1cc(1mg)			1cc(250mg)	1cc(0.12mg)

실험용 발모촉진용 조성물 발모특성 평가

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 발모촉진용 조성물을 이용하여 탈모 환자에게 치료한 후의 시간 경과에 따른 모발 변화를 보여주는 사진이다.

대상 환자에게 상기와 같은 실시예에 의하여 제조된 발모촉진용 조성물을 일주일에 한 번씩, 7cc씩 분무 방법으로 치료하였다.

도 1을 참조하면, 관리전 상태에 대비하여 볼 때, 시간 경과에 따라서 모발의 증식이 확연하게 이루어진 것을 확인할 수 있었다. 특히, 단 2개월의 지료만으로도 유효성 있는 모발의 증식이 일어날 수 있음을 확인하였다. 탈모 환자의 유형에 따라 다소의 효과차가 발생할 것으로 사료되나 효과의 현저성이나 유효성은 충분히 확인되었다고 판단하였다.

Claims (3)

1. 2계대 이상 배양한 인간 지방세포 유래 중간엽 줄기세포를 소유래 혈청이 포함되지 않은 무혈청 배지에서 성장인자인 bFGF 또는 EGF를 별도로 첨가하여 배양하는 단계를 거친 배양 배지로부터, 줄기세포 배양액 100중량부를 수득하는 단계;
   물 100 내지 300주량부에, 아연 0.001 내지 0.1 중량부, D-판테놀 5 내지 50 중량부 및 D-바이오틴 0.0001 내지 0.1 중량부를 혼합하여 혼합 용액을 준비하는 단계;
   상기 줄기세포 배양액에 상기 혼합 용액을 혼합한 이후, 그 혼합물을 두피에 분사 또는 도포되는 방식에 의하여 발모를 촉진하는 발모촉진 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 줄기세포 배양액은, (a) 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계, 및 (b) 2계대 이상 배양한 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 생체적합성 스캐폴드와 함께 3차원 배양하는 단계를 거친 배양배지로부터 수득된 줄기세포 배양액인 것을 특징으로 하는 발모촉진 방법
3. 제1항에 있어서,
   상기 중간엽 줄기세포는 인간 지방세포유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는 발모촉진 방법.

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