KR20210124993A

KR20210124993A - 항-pd-1 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 약학적 용도

Info

Publication number: KR20210124993A
Application number: KR1020217025236A
Authority: KR
Inventors: 샤오링 구; 신 예; 후 게; 웨이캉 타오
Original assignee: 지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드; 샹하이 헨그루이 파마수티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2019-02-03
Filing date: 2020-01-31
Publication date: 2021-10-15
Also published as: BR112021015168A2; JP2022518588A; TW202045538A; CN112969716B; US20220098304A1; CN112969716A; EP3922647A1; MX2021009041A; EP3922647A4; AU2020213579A1; CA3128104A1; WO2020156509A1

Abstract

항-PD-1 항체, 이의 항원-결합 단편, 및 이의 약학적 용도가 제공된다. 구체적으로, 특정 CDR 영역 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 인간화 항-PD-1 항체, 항-PD-1 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물, 및 의약으로서의 이의 용도가 제공된다. 특히, PD-1 관련 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서 인간화 항-PD-1 항체의 용도가 제공된다.

Description

항-PD-1 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 약학적 용도

본 개시내용은 생명공학 분야에 속한다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 항-PD-1 항체 및 이의 적용에 관한 것이다.

여기의 기재는 본 발명에 관련된 배경 정보를 제공할 뿐이며 반드시 선행 기술을 구성하는 것은 아니다.

종양 면역요법(immunotherapy)은 종양 환자의 킬러 T 세포를 최대한 활용하고 동원하여 종양을 죽이는 치료법이다. 동시에, 종양세포 회피(evasion)는 종양 면역요법의 큰 장애물이다. 종양세포는 면역체계에 대한 그들 자체의 억제 효과를 사용하여 종양의 빠른 성장을 촉진한다. 종양의 면역 회피 기전과 종양에 대한 신체의 면역 반응 사이에는 매우 복잡한 관계가 있다. 종양 면역요법의 초기 단계에서는, 종양 특이적 킬러 T 세포가 생물학적 활성을 갖지만, 종양이 성장함에 따라 후기 단계에서 살해 기능을 잃는다.

인체에서 T 세포의 활성화는 두 가지 신호전달 경로 시스템을 채택한다. 항원 제시 세포에 의한 MHC-항원 펩티드의 제시에 의해 T 세포에 제공되는 첫 번째 신호에 더하여, T 세포가 정상적인 면역 반응을 생성할 수 있도록 하려면 일련의 공동-자극 분자(co-stimulatory molecule)에 의해 제공되는 두 번째 신호도 필요하다. 이 이중 신호전달 경로 시스템은 신체의 면역체계의 균형에 중요한 역할을 한다. 이는 자기 항원(self antigen)과 비자기 항원(non-self antigen)에 대한 신체의 서로 다른 면역 반응을 엄격하게 조절한다. 공동-자극 분자가 제공하는 두 번째 신호가 없으면, T 세포의 무반응 또는 지속적인 특정 면역 반응을 일으켜 내성(tolerance)을 유발한다. 따라서, 두 번째 신호전달 경로는 신체의 면역 반응의 전체 과정에서 매우 중요한 조절 역할을 한다.

Programmed Death-1(PD-1)은 1992년에 발견된 T 세포의 표면에 발현되는 단백질 수용체로 세포 사멸(cell apoptosis) 과정에 관여한다. PD-1은 CD28 패밀리에 속한다. PD-1은 세포독성 T 림프구 항원 4(cytotoxic T lymphocyte antigen 4, CTLA-4)와 23%의 아미노산 상동성(homology)을 가지나, CTLA와는 발현이 다르며 주로 활성화된 T 세포, B 세포, 골수 세포에서 발현된다. PD-1은 2개의 리간드를 가지는데, 각각 PD-L1 및 PD-L2이다. PD-L1은 주로 T 세포, B 세포, 대식세포 및 수지상 세포(DC)에서 발현되며, 세포에서의 발현은 활성화된 후에 상향 조절될 수 있다. PD-L2의 발현은 상대적으로 제한적이며 주로 활성화된 대식세포 및 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포에서 발현된다.

PD-L1은 PD-1 및 B7-1에 결합하여 면역체계를 억제한다. 종양 조직 미세 환경의 많은 종양세포 및 면역세포는 PD-L1을 발현한다. 유방암, 폐암(예를 들어, 비소세포폐암), 위암, 대장암, 신장암, 흑색종, 결장암, 방광암, 난소암, 췌장암 및 간암 그리고 기타 인간 종양 조직에서 PD-L1 단백질의 고발현이 검출되었으며, PD-L1의 발현 수준이 환자의 임상 양상(manifestation) 및 예후와 밀접한 관련이 있다는 새로운 연구 결과가 나왔다.

항-PD-1 모노클로날 항체는 PD-L1/PD-1의 결합을 차단함으로써 종양에 대한 환자 자신의 면역체계 반응을 극대화할 수 있어 종양세포를 죽이는 목적을 달성할 수 있다. 현재, 항-PD-1 항체인 펨브롤리주맙(Pembrolizumab; Merck keytruda, keytruda, Merck-Pemb, Merck-keytruda, Merck-PD-1, pembrolizumab이라고도 함) 및 노빌루맙(Novilumab; BMS Opdivo, Opdivo, BMS-Nivolumab, Novilumab이라고도 함)이 흑색종, 호지킨 림프종 환자, 비소세포폐암 및 기타 종양의 치료제로 FDA 승인을 받았다. 또한, WO200139722, WO2006121168, WO2010036959, WO2010089411, WO2011110604, WO2013173223, WO2013181634, US2014335093, US6803192B1, US8617546B2, 및 WO2015085847과 같은 특허 문헌들이 또한 다양한 항-PD-1 모노클로날 항체를 개시하고 있다.

발명의 개요

본 개시내용은 신규한 항-PD-1 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도를 제공한다.

일부 대안적인 구현예에서, 본 개시내용은 하기 i) 내지 iii) 중 어느 하나로부터 선택되는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다:

i) 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region)이 서열번호 8에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 HCDR1, 서열번호 9에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 HCDR2, 및 서열번호 10에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 8, 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역(light chain variable region)이 서열번호 11에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 LCDR1, 서열번호 12에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 LCDR2, 및 서열번호 13에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 LCDR3을 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편;

ii) 중쇄 가변 영역이 서열번호 14에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 HCDR1, 서열번호 15에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 HCDR2, 및 서열번호 16에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 8, 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역이 서열번호 17에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 LCDR1, 서열번호 12에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 LCDR2, 및 서열번호 18에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 LCDR3을 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및

iii) 중쇄 가변 영역이 서열번호 21에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 HCDR1, 서열번호 22에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 HCDR2, 및 서열번호 23에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역이 서열번호 24에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 LCDR1, 서열번호 25에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 LCDR2, 및 서열번호 26에 기재된 바와 같거나 이에 대하여 최대 3, 2 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가지는 LCDR3을 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 상기 언급된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 10^-7 M 이하의 해리 평형 상수(dissociation equilibrium constant)로 인간 PD-1에 결합한다. 일부 구현예에서, 이는 10^-8 M, 10^-9 M, 10^-10 M 또는 10^-11 M 이하의 해리 평형 상수로 인간 PD-1에 결합한다.

일부 대안적인 구현예에서, 본 개시내용은 중쇄 가변 영역이 서열번호 65에 기재된 HCDR1, 서열번호 66에 기재된 HCDR2, 및 서열번호 67에 기재된 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역이 서열번호 68에 기재된 LCDR1, 서열번호 12에 기재된 LCDR2, 및 서열번호 69에 기재된 LCDR3을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 그 서열들은 하기 표 1에 나타나 있다.

[표 1]

일부 대안적인 구현예에서, 상기 언급된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 8에 기재된 HCDR1, 서열번호 9에 기재된 HCDR2, 및 서열번호 10에 기재된 HCDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 12에 기재된 LCDR2, 서열번호 13에 기재된 LCDR3, 및 일반식 RSSQSX₁₃VHSX₁₄X₁₅X₁₆TYLE(서열번호 68)에 기재된 LCDR1을 포함하며, 여기서 X₁₃은 L 중에서 선택되고, X₁₄는 N, Q, L, T 또는 D 중에서 선택되고, X₁₅는 G, A 또는 V 중에서 선택되고, 및 X₁₆은 N 중에서 선택된다.

일부 대안적인 구현예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나로부터 선택된다:

(a) 각각 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 12 및 서열번호 13에 기재된 LCDR2 및 LCDR3, 및 서열번호 11, 47, 48, 49, 50, 51 또는 52에 기재된 LCDR1을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편;

(b) 각각 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 17, 서열번호 12 및 서열번호 18에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편;

(c) 각각 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 23에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편;

(d) 각각 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 12 및 서열번호 13에 기재된 LCDR2 및 LCDR3, 및 서열번호 11, 47, 48, 49, 50, 51 또는 52에 기재된 LCDR1을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및

(e) 중쇄 가변 영역이 각각 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 각각 서열번호 17, 서열번호 12 및 서열번호 18에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.

일부 구현예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호 49, 서열번호 12 및 서열번호 13에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.

일부 구현예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 각각 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 23에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 각각 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.

일부 대안적인 구현예에서, 본 개시내용은 하기 iv) 내지 vi) 중 어느 하나로부터 선택되는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다:

iv) 중쇄 가변 영역이 서열번호 4에 기재된 중쇄 가변 영역의 서열과 동일한 서열을 가지는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 5에 기재된 경쇄 가변 영역의 서열과 동일한 서열을 가지는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편;

v) 중쇄 가변 영역이 서열번호 6에 기재된 중쇄 가변 영역의 서열과 동일한 서열을 가지는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 7에 기재된 경쇄 가변 영역의 서열과 동일한 서열을 가지는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및

vi) 중쇄 가변 영역이 서열번호 19에 기재된 중쇄 가변 영역의 서열과 동일한 서열을 가지는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열번호 20에 기재된 경쇄 가변 영역의 서열과 동일한 서열을 가지는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.

상기 언급된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 뮤린 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 완전(fully) 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.

상기 언급된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.

일부 구현예에서, 인간화 항체는 인간 항체로부터 유래된 프레임워크 영역 또는 이의 프레임워크 영역 변이체을 포함한다.

일부 구현예에서, 프레임워크 영역 변이체는 인간 항체의 경쇄 프레임워크 영역 및/또는 중쇄 프레임워크 영역 각각에 최대 11개의 아미노산 역 돌연변이(back mutation)를 가진다.

일부 구현예에서, 프레임워크 영역 변이체는 하기 (f) 내지 (h) 중 어느 하나로부터 선택되는 돌연변이(들)를 포함한다:

(f) 경쇄 가변 영역에 포함된 2G 아미노산 역 돌연변이 및/또는 중쇄 가변 영역에 포함된 27Y, 48I, 67T, 69L, 82F 및 93T 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 역 돌연변이;

(g) 경쇄 가변 영역에 포함된 2V 아미노산 역 돌연변이, 및/또는 중쇄 가변 영역에 포함된 26D, 27F, 30T, 38K, 43H, 48I, 66K, 67A, 69L, 82F 및 93T 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 역 돌연변이; 및

(h) 경쇄 가변 영역에 포함된 42G, 44V 및 71Y 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 역 돌연변이, 및/또는 중쇄 가변 영역에 포함된 1K 및/또는 94S 아미노산 역 돌연변이.

상기 언급된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체 가변 영역을 포함한다:

(a2) 각각 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 중쇄 프레임워크 영역에 포함된 27Y, 48I, 67T, 69L, 82F 및 93T의 하나 이상의 아미노산 역 돌연변이를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

각각 서열번호 12 및 서열번호 13에 기재된 LCDR2 및 LCDR3, 및 서열번호 11, 47, 48, 49, 50, 51 또는 52에 기재된 LCDR1, 및 경쇄 프레임워크 영역에 포함된 2G 아미노산 역 돌연변이를 포함하는 경쇄 가변 영역;

(b2) 각각 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 중쇄 가변 영역에 포함된 26D, 27F, 30T, 38K, 43H, 48I, 66K, 67A, 69L, 82F 및 93T 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 역 돌연변이를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

각각 서열번호 17, 서열번호 12 및 서열번호 18에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 및 경쇄 프레임워크 영역에 포함된 2V 아미노산 역 돌연변이를 포함하는 경쇄 가변 영역;

(c2) 각각 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 23에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 중쇄 프레임워크 영역에 포함된 1K 및/또는 94S 아미노산 역 돌연변이를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및

각각 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 및 경쇄 프레임워크 영역에 포함된 42G, 44V 및 71Y 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 역 돌연변이를 포함하는 경쇄 가변 영역.

상기 언급된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기 (i) 내지 (o) 중 어느 하나로부터 선택되는 항체 가변 영역을 포함한다:

(i) 서열번호 4에 기재된 서열과 같거나 서열번호 4와 적어도 90%의 서열 동일성(identity)을 가지는 중쇄 가변 영역, 및/또는

서열번호 5에 기재된 서열과 같거나 서열번호 5와 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역;

(j) 서열번호 6에 기재된 서열과 같거나 서열번호 6과 적어도 90%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역, 및/또는

서열번호 7에 기재된 서열과 같거나 서열번호 7과 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역;

(k) 서열번호 19에 기재된 서열과 같거나 서열번호 19와 적어도 90%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역, 및/또는

서열번호 20에 기재된 서열과 같거나 서열번호 20과 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역;

(l) 서열번호 27, 30, 31 또는 32에 기재된 서열과 같거나, 서열번호 27, 30, 31 또는 32와 각각 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역, 및/또는

서열번호 28, 29, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 또는 64에 기재된 서열과 같거나, 서열번호 28, 29, 34, 35, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 또는 64와 각각 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역;

(m) 서열번호 33, 36, 37, 38, 39 또는 40에 기재된 서열과 같거나, 서열번호 33, 36, 37, 38, 39 또는 40과 각각 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역, 및/또는

서열번호 34, 35, 28, 29, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 또는 64에 기재된 서열과 같거나, 서열번호 34, 35, 28, 29, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 또는 64와 각각 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역;

(n) 서열번호 41, 45 또는 46에 기재된 서열과 같거나, 서열번호 41, 45 또는 46과 각각 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역, 및/또는

서열번호 42, 43 또는 44에 기재된 서열과 같거나, 서열번호 42, 43 또는 44와 각각 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역;

(o) 서열번호 70에 기재된 서열과 같거나 서열번호 70과 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역, 및/또는

서열번호 71에 기재된 서열과 같거나 서열번호 71과 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역; 및

(p) 서열번호 27, 30, 31 또는 32에 기재된 서열과 같거나, 서열번호 27, 30, 31 또는 32와 각각 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역, 및/또는

서열번호 34 또는 35에 기재된 서열과 같거나, 서열번호 34 또는 35와 각각 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역;

여기서 서열번호 70 및 서열번호 71의 서열은 표 2에 나타낸 바와 같은 일반식 서열로 표시된다:

[표 2]

일부 구현예에서, 항-PD-1 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 27에 기재된 바와 같거나 서열번호 27과 적어도 90% 동일성을 가지고, 항-PD-1 항체의 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 55에 기재된 바와 같거나 서열번호 55와 적어도 90% 서열 동일성을 가진다.

일부 구현예에서, 항-PD-1 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 46에 기재된 바와 같거나 서열번호 46과 적어도 90% 동일성을 가지고, 항-PD-1 항체의 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 43에 기재된 바와 같거나 서열번호 43과 적어도 90% 서열 동일성을 가진다.

상기 언급된 "적어도 90% 동일성(identity)"은 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가지는 것을 포함한다.

상기 언급된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 다른 구현예에서, 항체는 항체 불변 영역(constant region)을 추가로 포함한다; 일부 다른 구현예에서, 항체 불변 영역의 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 영역 및 이의 통상적인 변이체로부터 선택되고, 항체 불변 영역의 경쇄 불변 영역은 인간 항체

및 λ쇄 불변 영역 및 이의 통상적인 변이체로부터 선택된다; 일부 다른 구현예에서, 항체 불변 영역은 S228P, F234A 및 L235A의 하나 이상의 돌연변이가 도입된 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함하고, 예를 들어, S228P, F234A 및 L235A의 3개의 아미노산 돌연변이를 가지는 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함한다; 일부 다른 구현예에서, 항체는 서열번호 72 또는 서열번호 79에 기재된 중쇄 불변 영역, 및 서열번호 73에 기재된 경쇄 불변 영역을 포함한다.

상기 언급된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 서열번호 78에 기재된 경쇄 및 서열번호 77 또는 82에 기재된 중쇄; 또는

서열번호 75에 기재된 경쇄 및 서열번호 74, 76, 80 또는 81에 기재된 중쇄를 포함한다.

일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는,

서열번호 74에 기재된 중쇄 및 서열번호 75에 기재된 경쇄; 또는

서열번호 77에 기재된 중쇄 및 서열번호 78에 기재된 경쇄를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 언급된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 어느 하나와 인간 PD-1에 경쟁적으로 결합하거나 동일한 인간 PD-1 에피토프에 결합하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.

상기 언급된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 구현예에서, 항체는 이중특이성(bispecific) 항체 또는 다중특이성(multispecific) 항체이다.

항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')₂, 단일쇄 항체(single-chain antibody, scFv), 이량체화된(dimerized) V 영역(디아바디(diabody)) 및 이황화(disulfide) 결합 안정화된 V 영역(dsFv)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 전술한 것 중 어느 하나에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 인간 PD-1에 경쟁적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 개시된다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 치료학적 유효량의 전술한 것 중 어느 하나에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 치료학적 유효량의 상기 언급된 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 완충제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 또한 제공한다. 일부 구현예에서, 치료학적 유효량은 0.1 내지 3000 mg의 상기 언급된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 함유하는 조성물의 단위 용량(unit dose)을 지칭한다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 전술한 것 중 어느 하나에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하거나, 또는 상기 언급된 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산 분자를 또한 제공한다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 상기 언급된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 또한 제공한다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 전술한 것 중 어느 하나에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하는 단계, 또는 상기 언급된 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하는 단계를 포함하는, PD-1의 면역검출(immunodetection) 또는 결정(determination) 방법을 또한 제공한다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 상기 언급된 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 상기 언급된 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 키트를 또한 제공한다.

일부 구현예에서, PD-1 관련 질환에 대한 진단제(diagnostic agent)를 제조하는데 있어서 상기 언급된 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도가 제공된다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 전술한 것 중 어느 하나에 따른 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 상기 언급된 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 상기 언급된 약제학적 조성물, 또는 상기 언급된 핵산 분자의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환을 치료하는 방법을 또한 제공한다.

일부 구현예에서, 질환은 종양(tumor)이다.

일부 다른 구현예에서, 질환은 두경부 편평 세포 암종(head and neck squamous cell carcinoma), 두경부암, 뇌암, 신경교종(glioma), 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme), 신경모세포종(neuroblastoma), 중추신경계 암, 신경내분비 종양(neuroendocrine tumor), 인두암(pharyngeal cancer), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 식도암(esophageal cancer), 갑상선암, 악성 흉막 중피종(malignant pleural mesothelioma), 폐암, 유방암, 간암, 간종(hepatoma), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), 간담도암(hepatobiliary cancer), 췌장암, 위암, 위장관암(gastrointestinal cancer), 대장암, 결장암, 결장직장암, 신장암, 투명세포신세포암(clear cell renal cell carcinoma), 난소암, 자궁내막암(endometrial cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 방광암, 전립선암, 고환암, 피부암, 흑색종(melanoma), 백혈병, 림프종, 골암(bone cancer), 연골육종(chondrosarcoma), 골수종(myeloma), 다발성 골수종, 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 골수증식성 신생물(myeloproliferative neoplasm), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 전신 경쇄 아밀로이드증(systemic light chain amyloidosis) 및 메르켈 세포 암종(Merkel cell carcinoma) 중에서 선택된다; 이들 구현예 중 일부에서, 림프종은 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 원발성 종격동 거대 B-세포 림프종(primary mediastinal large B-cell lymphoma), 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma), 소림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma), T-세포/조직구 풍부 거대 B-세포 림프종(T-cell/histiocyte rich large B-cell lymphoma) 및 림프형질구성 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma) 중에서 선택되고, 폐암은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer) 및 소세포폐암(small cell lung cancer) 중에서 선택되며, 백혈병은 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프구성(lymphocytic) 백혈병, 림프모구성(lymphoblastic) 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 골수성 백혈병 중에서 선택된다; 일부 다른 구현예에서, 질환은 PD-L1 양성 흑색종, 폐암, 비소세포폐암, 유방암, 위암, 신장암, 방광암, 대장암 및 결장암 중에서 선택된다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서의, 전술한 것 중 어느 하나에 따른 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 상기 언급된 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 상기 언급된 약제학적 조성물, 또는 상기 언급된 핵산 분자의 용도를 또한 제공한다.

일부 구현예에서, 질환은 종양이다.

일부 다른 구현예에서, 질환은 두경부 편평 세포 암종, 두경부암, 뇌암, 신경교종, 다형성 교모세포종, 신경모세포종, 중추신경계 암, 신경내분비 종양, 인두암, 비인두암, 식도암, 갑상선암, 악성 흉막 중피종, 폐암, 유방암, 간암, 간종, 간세포암종, 간담도암, 췌장암, 위암, 위장관암, 대장암, 결장암, 결장직장암, 신장암, 투명세포신세포암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 전립선암, 고환암, 피부암, 흑색종, 백혈병, 림프종, 골암, 연골육종, 골수종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 골수증식성 신생물, 편평 세포 암종, 유잉 육종, 전신 경쇄 아밀로이드증 및 메르켈 세포 암종 중에서 선택된다; 이들 구현예 중 일부에서, 림프종은 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 원발성 종격동 거대 B-세포 림프종, 외투 세포 림프종, 소림프구성 림프종, T-세포/조직구 풍부 거대 B-세포 림프종 및 림프형질구성 림프종 중에서 선택되고, 폐암은 비소세포폐암 및 소세포폐암 중에서 선택되며, 백혈병은 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프모구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 골수성 백혈병 중에서 선택된다; 일부 다른 구현예에서, 질환은 PD-L1 양성 흑색종, 폐암, 비소세포폐암, 유방암, 위암, 신장암, 방광암, 대장암 및 결장암 중에서 선택된다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 의약으로서 사용하기 위한, 전술한 것 중 어느 하나에 따른 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 상기 언급된 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 상기 언급된 핵산 분자, 또는 상기 언급된 약제학적 조성물을 또한 제공한다.

일부 구현예에서, 의약은 PD-1 관련 질환의 치료 또는 예방을 위해 사용된다.

일부 구현예에서, 질환은 종양이다.

도 1: PD-1이 리간드에 결합하는 것을 차단하는 항-PD-1 항체의 시험 결과;
도 2: PBMC 세포로부터의 IFNγ 분비에 대한 항-PD-1 항체의 효과;
도 3: 마우스에서 결장암 MC38의 이종이식(xenograft) 종양에 대한 항-PD-1 항체의 효율성;
도 4: 마우스에서 결장암 MC38의 종양 부피에 대한 항-PD-1 항체의 효과.

개요

본 개시내용이 보다 쉽게 이해되도록 하기 위하여, 특정 기술 용어 및 과학 용어를 아래에서 구체적으로 정의한다. 본 명세서에서 달리 명확히 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 다른 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가진다.

용어 "programmed death 1", "programmed cell death 1", "단백질 PD-1", "PD-1", "PDCD1" 및 "hPD-1"은 상호교환적으로 사용되며 인간 PD-1 변이체, 이소타입(isotype), 종 상동체(species homolog), 및 PD-1과 공통되는 적어도 하나의 에피토프를 가지는 유사체(analog)를 포함한다. 완전한 PD-1 서열은 GenBank 수탁 번호 U64863으로 찾을 수 있다.

용어 "programmed death ligand-1(PD-L1)"은 PD-1의 두 가지 세포 표면 당단백질 리간드 중 하나로서(다른 하나는 PD-L2임), PD-1에 결합 시 T 세포 활성화 및 사이토카인 분비를 하향 조절한다. 본원에 사용된 용어 "PD-L1"은 인간 PD-L1(hPD-L1), hPD-L1 변이체, 이소타입 및 종간 상동체(interspecies homolog), 및 hPD-1과 공통되는 적어도 하나의 에피토프를 가지는 5개의 유사체를 포함한다. 완전한 hPD-L1 서열은 GenBank 수탁 번호 Q9NZQ7로 찾을 수 있다.

용어 "사이토카인(cytokine)"은 세포 집단에 의해 방출되고 세포간 매개체로서 다른 세포에 작용하는 단백질에 대한 일반적인 용어다. 이러한 사이토카인의 예에는 림포카인(lymphokine), 모노카인(monokine), 케모카인(chemokine) 및 전통적인 폴리펩타이드 호르몬이 포함된다. 예시적인 사이토카인은 인간 IL-2, IFN-γ, IL-6, TNFα, IL-17 및 IL-5를 포함한다.

본 개시내용에서 사용되는 아미노산의 3문자 코드(three-letter code) 및 1문자 코드(one-letter code)는 J. biol. chem, 243, p3558 (1968)에 개시된 바와 같다.

본 개시내용에 기재된 "항체"는 일반적으로 면역글로불린을 의미한다. 천연의 온전한 항체는 사슬간 이황화(disulfide) 결합으로 연결된 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 구성된 테트라펩티드(tetrapeptide) 사슬 구조이다. 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 아미노산 조성 및 서열이 다르므로, 이들의 항원성도 다르다. 이에 따라, 면역글로불린은 5가지 클래스로 나눌 수 있으며, 또는 면역글로불린의 이소타입으로 명명될 수 있는데, 즉 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE이며, 이들의 상응하는 중쇄는 각각 μ쇄, δ쇄, γ쇄, α쇄 및 ε쇄이다. 동일한 클래스의 Ig는 힌지 영역의 아미노산 조성과 중쇄 이황화 결합의 수 및 위치의 차이에 따라 서로 다른 서브클래스로 나눌 수 있다. 예를 들어, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 나눌 수 있다. 경쇄는 불변 영역의 차이에 의해 κ쇄 또는 λ쇄로 나뉜다. Ig의 5가지 클래스 각각은 κ쇄 또는 λ쇄를 가질 수 있다. 본 개시내용에서 언급된 항체는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하고, 이는 항원에 결합하는 능력을 유지하면서 면역글로불린에 기초하여 변형된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하며; 단일특이성(monospecific) 항체, 이중특이성(bispecific) 항체 또는 다중특이성(multispecific) 항체를 포함하고; 또한 1가(monovalent) 항체, 2가(bivalent) 항체 또는 다가(multivalent) 항체를 포함한다. 예를 들어, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 VH-CH1 및 적어도 하나의 VL-CL 구조를 포함하는 것일 수 있으며, 여기서 VH 및 VL 구조는 사슬간 상호작용을 기반으로 서로 접근하고 항원 결합 능력을 유지할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체의 항원-결합 단편은 1가 Fab 단편(Fab1 단편), 2가 Fab 단편(F(ab)2), 3가 Fab 단편(F(ab)3), 다가(2개 이상) Fab 단편이고, 또한 적어도 하나의 Fab 단편을 포함하는 다른 단일특이성, 이중특이성 또는 다중특이성 항원-결합 단편일 수 있다.

"이중특이성 항체"는 2개의 상이한 항원 또는 동일한 항원의 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체(단일쇄 항체와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함)를 지칭한다. 선행 기술은 다양한 구조를 가지는 이중특이성 항체를 개시하고 있다. IgG 분자의 완전성(integrity)에 따라, 이들은 IgG-유사 이중특이성 항체와 항체 단편형(antibody fragment-type) 이중특이성 항체로 나눌 수 있다. 항원 결합 영역의 수 및 배열(configuration)에 따라, 이들은 2가(bivalent), 3가(trivalent), 4가(tetravalent) 또는 그 이상의(more-valent) 이중특이성 항체로 나눌 수 있다. 구조가 대칭인지 여부에 따라, 이들은 대칭(symmetric) 구조 이중특이성 항체와 비대칭(asymmetric) 구조 이중특이성 항체로 나눌 수 있다. 이들 중, 항체 단편 기반 이중특이성 항체, 예를 들어 Fc 단편이 결여된 Fab 단편은, 하나의 분자 내에 둘 이상의 Fab 단편이 결합하여 이중특이성 항체를 형성한다. 이러한 항체는 더 낮은 면역원성 및 더 작은 분자량 및 더 높은 종양 조직 투과성을 가진다. 이 유형의 전형적인 항체 구조는 F(ab)2, scFv-Fab, (scFv)2-Fab, 등과 같은 이중특이성 항체이다; IgG-유사 이중특이성 항체(예를 들어 Fc 단편을 포함)의 경우, 이 유형의 항체는 더 큰 분자량을 가진다. Fc 단편은 후기 단계에서 항체의 정제를 돕고 용해도 및 안정성을 향상시킨다. Fc 모이어티는 또한 수용체 FcRn에 결합하여 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 전형적인 이중특이성 항체 구조 모델은 다음과 같다: KiH, CrossMAb, Triomab quadroma, FcΔAdp, ART-Ig, BiMAb, Biclonics, BEAT, DuoBody, Azymetric, XmAb, 2:1 TCBs, 1Fab-IgG TDB, FynomAb, two-in-one/DAF, scFv-Fab-IgG, DART-Fc, LP-DART, CODV-Fab-TL, HLE-BiTE, F(ab)2-CrossMAb, IgG-(scFv)2, Bs4Ab, DVD-Ig, Tetravalent-DART-Fc, (scFv)4-Fc, CODV-Ig, mAb2, F(ab)4-CrossMAb 및 다른 이중특이성 항체 (Aran F. Labrijn et al., Nature Reviews Drug Discovery volume 18, pages 585-608 (2019); Chen S1 et al., J Immunol Res. 2019 Feb 11; 2019:4516041 참조).

용어 "1가", "2가", "3가" 또는 "다가"는 항체 또는 폴리펩타이드 복합체에서 특정 수의 항원 결합 부위의 존재를 지칭한다. 예를 들어 "1가 항체"는 항체에 1개의 항원 결합 부위가 있음을 의미하고, "1가 폴리펩타이드 복합체"는 폴리펩타이드 복합체에 1개의 항원 결합 부위가 있음을 의미한다; "2가 항체"는 항체에 2개의 항원 결합 부위가 있음을 의미하고, "2가 폴리펩타이드 복합체"는 폴리펩타이드 복합체에 2개의 항원 결합 부위가 있음을 의미한다; "3가 항체"는 항체에 3개의 항원 결합 부위가 있음을 의미하고, "3가 폴리펩타이드 복합체"는 폴리펩타이드 복합체에 3개의 항원 결합 부위가 있음을 의미한다; "다가 항체"는 항체에 다중의(3개 이상의) 항원 결합 부위가 있음을 의미하고, "다가 폴리펩타이드 복합체"는 폴리펩타이드 복합체에 다중의(2개 이상의) 항원 결합 부위가 있음을 의미한다.

용어 "항체 융합 단백질(antibody fusion protein)"은 관심 단백질(폴리펩티드)과 면역글로불린을 연결하여 형성되는 생물학적으로 활성인 융합 단백질을 의미한다. 융합 단백질은 연결된 단백질과 면역글로불린 양자 모두의 생물학적 활성을 가진다.

항체 중쇄 및 경쇄의 N-말단 근처의 약 110개 아미노산의 서열은 매우 다양하게 변하며 가변 영역(variable region, Fv 영역)이고; C-말단 근처의 나머지 아미노산 서열은 비교적 안정하고 불변 영역(constant region)이다. 가변 영역은 3개의 초가변 영역(hypervariable region, HVR) 및 비교적 보존적인 서열을 가지는 4개의 프레임워크 영역(framework region, FR)을 포함한다. 항체의 특이성을 결정하는 3개의 초가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로도 알려져 있다. 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH) 각각은 3개의 CDR 영역 및 4개의 FR 영역으로 구성된다. 아미노 말단에서 카르복실 말단까지의 순서는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4이다. 경쇄의 3개의 CDR 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 지칭하고; 중쇄의 3개의 CDR 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 지칭한다.

본 개시내용의 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 완전 인간 항체, 바람직하게는 인간화 항체를 포함한다.

본 개시내용에서 "뮤린 항체"라는 용어는 당해 분야의 지식 및 기술에 따라 제조된 인간 PD-1에 대한 모노클로날 항체이다. 제조 과정에서, 시험 대상체에게 PD-1 항원을 주입한 후, 원하는 서열이나 기능적 특성을 가진 항체를 발현하는 하이브리도마를 분리한다. 본 개시내용의 바람직한 구현예에서, 뮤린 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 뮤린 κ, λ쇄 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하거나, 또는 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.

용어 "키메라 항체"는 뮤린 항체의 가변 영역과 인간 항체의 불변 영역을 융합시켜 형성된 항체로서, 뮤린 항체에 의해 유도되는 면역반응을 완화시킬 수 있다. 키메라 항체를 구축하려면 먼저 뮤린 특이적 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 구축하고, 다음으로 뮤린 하이브리도마 세포에서 가변 영역 유전자를 클로닝하고, 다음으로 필요에 따라 인간 항체의 불변 영역 유전자를 클로닝하고, 뮤린 가변 영역 유전자를 인간 불변 영역 유전자와 연결하여 키메라 유전자를 형성하고, 키메라 유전자를 발현 벡터에 삽입하고, 최종적으로 진핵생물 시스템 또는 원핵생물 시스템에서 키메라 항체 분자를 발현시키는 것이 필요하다. 본 개시내용의 바람직한 구현예에서, PD-L1 키메라 항체의 항체 경쇄는 인간 κ, λ쇄 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. PD-1 키메라 항체의 항체 중쇄는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하고, 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역을 포함하거나, 아미노산 돌연변이(예를 들어, L234A 및/또는 L235A 돌연변이, 및/또는 S228P 돌연변이)를 가지는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 변이체를 포함한다.

용어 "인간화 항체"는 CDR-이식(grafted) 항체로도 알려져 있으며, 인간 항체 가변 영역의 프레임워크에 뮤린 CDR 서열을 이식하여 생산된 항체를 말하며, 즉 상이한 유형의 인간 생식계열(germline) 항체 프레임워크 서열에서 생산되는 항체를 지칭한다. 뮤린 단백질 성분을 다량으로 운반하기 때문에 키메라 항체에 의해 유발되는 이질적인(heterogeneous) 반응을 이 항체는 극복할 수 있다. 이러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공개된 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참조에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스(인터넷 www.mrccpe.com.ac.uk/vbase에서 사용 가능), 뿐만 아니라 Kabat, EA, et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition 에서 찾을 수 있다. 면역원성의 감소에 의해 동시에 야기되는 활성의 감소를 피하기 위하여, 인간 항체 가변 영역 프레임워크 서열에 최소의 역전 돌연변이(reverse mutation) 또는 역 돌연변이(back mutation)을 수행하여 활성을 유지할 수 있다. 본 개시내용의 인간화 항체는 효모 디스플레이에 의해 CDR의 친화도 성숙(affinity maturation)을 추가로 처리한 인간화 항체를 또한 포함한다.

항원과 접촉하는 잔기로 인해, CDR 이식은 항원과 접촉하는 프레임워크 잔기로 인해 생성된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 항원에 대한 친화도를 감소시킬 수 있다. 이러한 상호작용은 체세포의 과돌연변이(hypermutation)의 결과일 수 있다. 따라서, 이러한 공여자 프레임워크 아미노산을 인간화 항체의 프레임워크에 이식하는 것이 여전히 필요할 수 있다. 항원 결합에 관여하는 비인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로부터의 아미노산 잔기는 동물 모노클로날 항체 가변 영역의 서열 및 구조를 조사함으로써 동정(identify)할 수 있다. 생식계열과는 다른 CDR 공여자 프레임워크 내 잔기는 관련된 것으로 간주될 수 있다. 가장 가까운 생식계열을 결정할 수 없는 경우, 서열은 높은 퍼센트의 유사도(similarity)를 가지는 서브클래스 또는 동물 항체 서열의 컨센서스 서열(consensus sequence)과 비교할 수 있다. 희귀 프레임워크 잔기는 체세포의 과돌연변이의 결과인 것으로 생각되며 따라서 결합에 중요한 역할을 한다.

본 개시내용의 일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 또는 뮤린 κ, λ쇄 또는 이의 변이체의 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하거나, 또는 인간 또는 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체의 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있고; 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4, 또는 아미노산 돌연변이(예를 들어, L234A 및/또는 L235A 돌연변이, 및/또는 S228P 돌연변이)를 가지는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 변이체의 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.

본 개시내용에 기재된 인간 항체 중쇄 불변 영역 및 인간 항체 경쇄 불변 영역의 "통상적인 변이체"는 선행기술에 개시되어 있으면서 항체 가변 영역의 구조와 기능을 변경하지 않는 중쇄 불변 영역 또는 경쇄 불변 영역의 변이체를 지칭한다. 예시적인 변이체는 부위-특이적 변형(site-directed modification) 및 중쇄 불변 영역의 아미노산 치환을 가지는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역 변이체를 포함한다. 특이적 치환은 YTE 돌연변이, L234A 및/또는 L235A 돌연변이, S228P 돌연변이, 및/또는 당업계에 알려진 노브-인투-홀(knob-into-hole) 구조를 얻기 위한 돌연변이(항체 중쇄가 노브-Fc 및 홀-Fc의 조합을 갖도록 만듦)와 같은 것이다. 이러한 돌연변이는 항체가 새로운 성질을 갖도록 하는 것이지만, 항체 가변 영역의 기능에는 변화가 없는 것으로 확인되었다.

"HuMAb", "인간 항체", "완전(fully) 인간 항체" 및 "완전한(complete) 인간 항체"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 인간으로부터 유래된 항체를 지칭하거나 항원 자극에 대한 반응으로 특정 인간 항체를 생산하도록 "조작(engineered)"되고 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있는 유전자 변형 유기체로부터 수득된 항체를 지칭할 수 있다. 일부 기술에서는, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자좌(loci)의 요소를 배아줄기세포주에서 유래된 유기체의 세포주에 도입하며, 여기서 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌는 이 세포주에 포함된 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌를 표적으로 하는 것에 의해 표적 파괴되었다. 형질전환(transgenic) 유기체는 인간 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있고, 유기체는 인간 항체를 분비하는 하이브리도마를 생산하는 데 사용될 수 있다. 인간 항체는 또한 중쇄 및 경쇄가 하나 이상의 인간 DNA 공급원으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 항체일 수 있다. 완전 인간 항체는 또한 유전자 또는 염색체 형질감염(transfection) 방법 및 파지 디스플레이 기술에 의해 작제되거나, 시험관내에서 활성화된 B 세포로부터 작제될 수 있으며, 이들 모두는 당업계에 공지되어 있다.

용어 "전장(full-length) 항체", "온전한(intact) 항체", "완전한(complete) 항체" 및 "전체(whole) 항체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 하기에 정의된 항원-결합 단편과는 구별되는 실질적으로 온전한 형태의 항체를 지칭한다. 이들 용어는 구체적으로 중쇄가 Fc 영역을 포함하는 항체를 지칭한다.

항체의 "항원-결합 단편" 또는 "기능적 단편"이라는 용어는 항원(예를 들어, PD-1)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 전장 항체의 단편을 사용하여 항체의 항원 결합 기능을 수행할 수 있음이 밝혀졌다. 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어에 포함된 결합 단편의 예로는 다음을 포함한다: (i) Fab 단편, 1가 단편은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된다; (ii) 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편의 2가 단편을 포함하는 F(ab')₂ 단편, (iii) Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인으로 구성된다; (iv) 항체의 한쪽 팔(arm)의 VH 및 VL 도메인으로 구성된 Fv 단편; (V) VH 도메인으로 구성된 단일 도메인 또는 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 (vii) 선택적으로 합성 링커에 의해 연결된 2개 이상의 분리된 CDR의 조합. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 재조합 방법을 사용하여 합성 링커에 의해 이들을 연결하여 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로 생산할 수 있다(단일쇄 Fv(scFv)라고 함; 예를 들어, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883 참조). 이러한 단일쇄 항체 역시 항체의 "항원-결합 단편"이라는 용어에 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되며, 단편의 기능은 온전한 항체의 경우와 동일한 방식으로 스크리닝된다. 항원 결합 모이어티는 재조합 DNA 기술에 의해 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 항체는 상이한 이소타입의 항체, 예를 들어, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체일 수 있다.

본 개시내용의 항원-결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', 단일쇄 항체(scFv), 이량체화된 V 영역(디아바디), 이황화 결합 안정화된 V 영역(dsFv), CDR-함유 펩티드 등을 포함한다.

Fab는 약 50,000의 분자량을 가지고 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편으로, IgG 항체 분자에 프로테아제(protease) 파파인(papain) (H 사슬의 224번 위치의 아미노산 잔기를 절단)을 처리하여 얻어지며, 여기서 H 사슬의 N-말단 쪽의 약 절반과 전체 L 사슬이 이황화 결합(들)에 의해 함께 연결된다.

본 개시내용의 Fab는 인간 PD-1을 특이적으로 인식하고 세포외 영역의 아미노산 서열 또는 이의 3차원 구조에 결합하는 본 개시내용의 모노클로날 항체를 파파인을 사용하여 처리함으로써 생산할 수 있다. 또한, Fab는 항체의 Fab를 암호화하는 DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하고 벡터를 원핵생물 유기체 또는 진핵생물 유기체에 도입하여 Fab를 발현시킴으로써 생산할 수 있다.

F(ab')2는 약 100,000의 분자량을 가지고 항원 결합 활성을 가지며 힌지 위치에서 연결된 2개의 Fab 영역을 포함하는 항체 단편으로, IgG의 힌지 영역에 있는 2개의 이황화 결합의 하부를 효소 펩신(pepsin)으로 분해함으로써(digesting) 얻어진다.

본 개시내용의 F(ab')2는 인간 PD-1을 특이적으로 인식하고 세포외 영역의 아미노산 서열 또는 이의 3차원 구조에 결합하는 본 개시내용의 모노클로날 항체를 펩신을 사용하여 처리함으로써 생산할 수 있다. 또한, F(ab')2는 후술하는 Fab'를 티오에테르 결합 또는 이황화 결합으로 연결함으로써 생산할 수 있다.

Fab'는 약 50,000의 분자량을 가지고 항원 결합 활성을 가지며 F(ab')2의 힌지 영역에서 이황화 결합을 절단하여 얻어지는 항체 단편이다. 본 개시내용의 Fab'는 PD-1을 특이적으로 인식하고 세포외 영역의 아미노산 서열 또는 이의 3차원 구조에 결합하는 결합하는 본 개시내용의 F(ab')2를 예를 들어 디티오트레이톨(dithiothreitol)과 같은 환원제를 사용하여 처리함으로써 생산할 수 있다.

또한, Fab'는 항체의 Fab' 단편을 암호화하는 DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입한 후, 벡터를 원핵생물 유기체 또는 진핵생물 유기체에 도입하여 Fab'를 발현시킴으로써 생산할 수 있다.

용어 "단일쇄 항체", "단일쇄 Fv" 또는 "scFv"는 링커에 의해 연결된 항체 중쇄 가변 도메인(또는 영역; VH) 및 항체 경쇄 가변 도메인(또는 영역; VL)을 포함하는 분자를 지칭한다. 이러한 scFv 분자는 다음과 같은 일반적인 구조를 가질 수 있다: NH₂-VL-링커-VH-COOH 또는 NH₂-VH-링커-VL-COOH. 선행 기술에서 적합한 링커는 반복된 GGGGS 아미노산 서열 또는 이의 변이체, 예를 들어 1 내지 4개의 반복된 서열을 갖는 변이체로 구성된다 (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). 본 개시내용에서 사용될 수 있는 다른 링커는 Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 및 Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. 에 기재되어 있다.

본 개시내용의 scFv는 다음 단계에 의해 생산될 수 있다: 인간 PD-1을 특이적으로 인식하고 세포외 영역의 아미노산 서열 또는 이의 3 차원 구조에 결합하는 본 개시내용의 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하는 단계, scFv를 암호화하는 DNA를 구축하는 단계, DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하는 단계, 및 이후 발현 벡터를 원핵생물 유기체 또는 진핵생물 유기체에 도입하여 scFv를 발현시키는 단계.

디아바디는 scFv가 이량체화된 항체 단편으로, 2가 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편이다. 2가 항원 결합 활성에서, 2개의 항원은 동일하거나 상이할 수 있다.

본 개시내용의 디아바디는 다음 단계에 의해 생산될 수 있다: 인간 PD-1을 특이적으로 인식하고 세포외 영역의 아미노산 서열 또는 이의 3 차원 구조에 결합하는 본 개시내용의 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하는 단계, 펩타이드 링커의 길이가 8개 이하의 아미노산 서열 잔기를 갖도록 scFv를 암호화하는 DNA를 작제하는 단계, DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하는 단계, 및 이후 발현 벡터를 원핵생물 유기체 또는 진핵생물 유기체에 도입하여 디아바디를 발현시키는 단계.

dsFv는 VH 및 VL 각각의 하나의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기로 대체된 폴리펩티드를 상기 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합을 통해 연결함으로써 얻어진다. 시스테인 잔기로 치환된 아미노산 잔기는 항체 3차원 구조의 예측에 기초하여 공지된 방법(Protein Engineering, 7, 697(1994))에 따라 선택될 수 있다.

본 개시내용의 dsFv는 다음 단계에 의해 생산될 수 있다: 인간 PD-1을 특이적으로 인식하고 세포외 영역의 아미노산 서열 또는 이의 3차원 구조에 결합하는 본 개시내용의 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하는 단계; dsFv를 암호화하는 DNA를 구축하는 단계; DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하는 단계; 및 이후 발현 벡터를 원핵생물 유기체 또는 진핵생물 유기체에 도입하여 dsFv를 발현시키는 단계.

CDR-함유 펩티드는 VH 또는 VL의 CDR(들)을 포함하는 하나 이상의 영역에 의해 구축된다. 다중 CDR을 함유하는 펩티드는 직접 연결되거나 또는 적합한 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다.

본 개시내용의 CDR-함유 펩티드는 하기 단계에 의해 생산될 수 있다: 인간 PD-1을 특이적으로 인식하고 세포외 영역의 아미노산 서열 또는 이의 3차원 구조에 결합하는 본 개시내용의 모노클로날 항체의 VH 및 VL의 CDR(들)을 암호화하는 DNA(들)을 구축하는 단계; DNA(들)를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하는 단계, 및 이후 발현 벡터를 원핵생물 유기체 또는 진핵생물 유기체에 도입하여 펩티드를 발현시키는 단계. CDR-함유 펩티드는 또한 화학적 합성 방법, 예를 들어 Fmoc 방법 또는 tBoc 방법에 의해 생산될 수 있다.

"아미노산 차이" 또는 "아미노산 돌연변이"라는 용어는 원래의 단백질 또는 폴리펩티드에 기초하여 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 가지는 것을 포함하여, 원래의 단백질 또는 폴리펩티드와 비교하여 단백질 또는 폴리펩티드 변이체에 아미노산 변화(들) 또는 돌연변이(들)의 존재를 지칭한다.

용어 "항체 프레임워크" 또는 "FR 영역"은 가변 도메인의 항원 결합 루프(CDR)에 대한 스캐폴드 역할을 하는 가변 도메인 VL 또는 VH의 모이어티를 지칭한다. 본질적으로, FR 영역은 CDR이 없는 가변 도메인이다.

용어 "상보성 결정 영역", "CDR" 또는 "초가변 영역"은 항원 결합에 주로 기여하는 항체의 가변 도메인 내의 6개의 초가변 영역 중 하나를 지칭한다. 일반적으로, 각 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3)이 있고, 각 경쇄 가변 영역에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)이 있다. 잘 알려진 방법(scheme) 중 하나를 사용하여 CDR의 아미노산 서열 경계를 결정할 수 있으며, 그러한 방법으로는 "Kabat" 넘버링 기준 (Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 참조), "Chothia" 넘버링 기준 (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273:927-948 참조) 및 ImmunoGenTics (IMGT) 넘버링 기준 (Lefranc M. P., Immunologist, 7, 132- 136 (1999); Lefranc, M. P., et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)) 등을 포함한다. 예를 들어, 고전적 형식의 경우, Kabat 기준에 따르면, 중쇄 가변 도메인(VH)의 CDR 아미노산 잔기의 번호는 31-35(HCDR1), 50-65(HCDR2) 및 95-102(HCDR3)이고; 경쇄 가변 도메인(VL)의 CDR 아미노산 잔기의 번호는 24-34(LCDR1), 50-56(LCDR2) 및 89-97(LCDR3)이다. Chothia 기준에 따르면, VH의 CDR 아미노산 잔기의 번호는 26-32(HCDR1), 52-56(HCDR2) 및 95-102(HCDR3)이고; VL의 아미노산 잔기의 번호는 26-32(LCDR1), 50-52(LCDR2) 및 91-96(LCDR3)이다. Kabat 및 Chothia 둘 다의 CDR 정의 조합에 따르면, CDR은 인간 VH의 아미노산 잔기 26-35(HCDR1), 50-65(HCDR2) 및 95-102(HCDR3), 및 인간 VL의 아미노산 잔기 24-34(LCDR1), 50-56(LCDR2) 및 89-97(LCDR3)로 구성된다. IMGT 기준에 따르면, VH의 CDR 아미노산 잔기의 번호는 대략 26-35(CDR1), 51-57(CDR2) 및 93-102(CDR3)이고, VL의 CDR 아미노산 잔기의 번호는 대략 27-32(CDR1), 50-52(CDR2) 및 89-97(CDR3)이다. IMGT 기준에 따라, IMGT/DomainGap Align 프로그램을 사용하여 항체의 CDR 영역을 결정할 수 있다.

용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기(antigenic determinant)"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위(예를 들어, PD-L1 분자 상의 특정 부위)를 지칭한다. 에피토프는 일반적으로 독특한 공간 구조에서 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 연속 또는 비연속 아미노산을 포함한다. 예를 들어, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G.E.Morris, Ed. (1996)를 참조하라.

용어 "특이적으로 결합한다(specifically bind)", "선택적으로 결합한다(selectively bind)", "선택적으로 결합한다(bind selectively)" 및 "특이적으로 결합한다(bind specifically)"는 소정의 항원 상의 에피토프에 대한 항체의 결합을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 약 10^-8 M 미만, 예를 들어 약 10^-9 M, 10^-10 M, 10^-11 M 미만 또는 그 이하의 친화도(KD)로 결합한다.

용어 "KD" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리(dissociation) 평형 상수를 의미한다. 일반적으로, 본 개시내용의 항체는, 예를 들어 표면 플라즈마 공명(SPR) 기술을 사용하여 BIACORE 기기에서 측정할 때 약 10^-7M 미만, 예를 들어 약 10^-8 M 또는 10^-9 M 미만의 해리 평형 상수(KD)로 PD-1에 결합한다.

"경쟁"이라는 용어가 동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항원 결합 단백질의 맥락에서 사용되는 경우(예를 들어, 중화 항원 결합 단백질 또는 중화 항체), 이는 항원 결합 단백질 간의 경쟁을 지칭하며, 다음의 분석에 의해 결정될 수 있다: 분석에서, 테스트할 항원 결합 단백질(예: 항체 또는 이의 면역학적 기능 단편)은 공통 항원(예: PD-1 또는 이의 단편)에 대한 참조 항원 결합 단백질(예: 리간드 또는 참조 항체)의 특이적 결합을 방지하거나 억제한다(예: 감소시킨다). 하나의 항원 결합 단백질이 다른 단백질과 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해 수많은 유형의 경쟁적 결합 분석을 사용할 수 있으며, 이러한 분석은 예를 들면 다음과 같다: 고체상 직접 또는 간접 방사선면역분석(radioimmunoassay, RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석 (예를 들어 Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (예를 들어 Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619 참조), 고체상 직접 표지(labelling) 분석, 고체상 직접 표지 샌드위치 분석 (예를 들어 Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press 참조); I-125 표지를 사용하는 고체상 직접 표지 RIA (예를 들어 Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25: 7-15 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (예를 들어 Cheung et al., 1990, Virology 176: 546-552 참조); 및 직접 표지 RIA (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). 일반적으로, 분석은 테스트되는 표지되지 않은 항원 결합 단백질을 운반하거나 또는 표지된 참조 항원 결합 단백질을 운반하는 세포 또는 고체 표면에 결합된 정제된 항원을 사용하는 것을 포함한다. 경쟁적 억제는 테스트되는 항원 결합 단백질의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지(라벨)의 양을 측정함으로써 측정된다. 일반적으로 테스트되는 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 분석에 의해 확인된 항원 결합 단백질(경쟁적 항원 결합 단백질)은 다음을 포함한다: 참조 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질; 및 참조 항원 결합 단백질의 결합 에피토프에 충분히 가까운 인접 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질로서, 상기 2개의 에피토프는 서로의 결합을 입체적으로 방해한다. 경쟁적 결합을 결정하는 데 사용되는 방법에 대한 추가적 세부사항은 본 명세서의 실시예에서 제공된다. 일반적으로 경쟁적 항원 결합 단백질이 과량으로 존재하는 경우, 이는 공통 항원에 대한 참조 항원 결합 단백질의 특이적 결합을 적어도 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70%-75% 또는 75% 또는 그 이상 억제한다(예를 들어 감소시킨다). 일부의 경우, 결합은 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 또는 97% 또는 그 이상 억제된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 지칭한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 바람직하게는 이중 가닥 DNA 또는 단일 가닥 mRNA 또는 변형된 mRNA이다. 핵산이 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여 있을 때, 핵산은 "작동가능하게 연결(operatively linked)"된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서가 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.

용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일 구현예에서, 벡터는 "플라스미드"이고, 이는 추가적 DNA 절편(segment)이 연결될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 다른 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이고, 추가적 DNA 절편이 바이러스 게놈에 연결될 수 있다. 본 명세서에 개시된 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있거나(예를 들어, 박테리아 복제 기원을 가지는 박테리아 벡터 및 에피솜(episomal) 포유동물 벡터), 또는 숙주 세포 내로 도입된 후 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제할 수 있다(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터).

항체 및 항원-결합 단편을 생산하고 정제하는 방법은 Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Chapters 5-8 및 15 와 같은 선행 기술에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 마우스를 인간 PD-1 또는 그의 단편으로 면역화하고, 수득된 항체를 재생성, 정제할 수 있고 아미노산 서열분석을 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다. 항원-결합 단편 또한 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 하나 이상의 인간 FR 영역이 유전 공학 방법을 사용하여 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 비인간 CDR 영역에 추가된다. 인간 FR 생식계열 서열은 IMGT 인간 항체 가변 영역 생식계열 유전자 데이터베이스와 MOE 소프트웨어를 비교하여 ImmunoGeneTics(IMGT) 웹사이트 http://imgt.cines.fr에서 얻거나, 또는 The Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351에서 얻을 수 있다.

용어 "숙주 세포"는 발현 벡터가 도입된 세포를 의미한다. 숙주 세포는 박테리아, 미생물, 식물 또는 동물 세포를 포함할 수 있다. 쉽게 형질전환될 수 있는 박테리아는 장내세균과(enterobacteriaceae)의 멤버, 예를 들어 대장균 또는 살모넬라 균주; 바실라세애(Bacillaceae), 예를 들어 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 폐렴구균(Pneumococcus); 연쇄상 구균(Streptococcus) 및 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)를 포함한다. 적합한 미생물은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다. 적합한 동물 숙주 세포주는 CHO(Chinese Hamster Ovary Cell Line) 및 NS0 세포를 포함한다.

본 개시내용의 조작된 항체 또는 항원-결합 단편은 통상적인 방법에 의해 제조 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA 서열을 클로닝하여 GS 발현 벡터로 재조합될 수 있다. 재조합 면역글로불린 발현 벡터는 CHO 세포에 안정적으로 형질감염될 수 있다. 보다 권장되는 선행 기술로서, 포유동물 발현 시스템은 특히 Fc 영역의 고도로 보존된 N-말단 부위에서 항체의 글리코실화를 유발할 수 있다. 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체를 발현시켜 안정한 클론을 얻는다. 생물반응기(bioreactor)의 무혈청 배지에서 양성 클론을 확장시켜 항체를 생산한다. 항체가 분비되는 배양 배지는 통상적인 기술에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 정제를 위해 조정된 버퍼와 함께 A 또는 G Sepharose FF 컬럼을 사용한다. 비특이적 결합 성분은 씻겨 나간다. 그런 다음 결합 항체를 pH 구배법으로 용출하고, 항체 단편을 SDS-PAGE로 검출하여 수집한다. 항체는 통상적인 방법에 의해 여과되고 농축될 수 있다. 가용성 혼합물 및 중합체 또한 통상적인 방법, 예를 들어 분자체(molecular sieve) 및 이온 교환으로 제거할 수 있다. 수득한 생성물은 예컨대 -70℃에서 즉시 동결하거나, 또는 동결 건조되어야 한다.

동물, 인간, 실험 대상체(subject), 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용될 때, "투여하는", "주는(giving)" 및 "치료하는"은 외인성 약제, 치료제, 진단제 또는 조성물이 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 장기 또는 생물학적 유체와 접촉하는 것을 지칭한다. "투여하는", "주는" 및 "치료하는"은 예를 들어 치료, 약동학, 진단, 연구 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 치료에는 시약과 세포의 접촉, 및 시약과 유체의 접촉이 포함되며, 여기서 유체는 세포와 접촉한다. "투여하는", "주는" 및 "치료하는"은 또한 예를 들어 시약, 진단, 결합 조성물에 의해 세포를 치료하는 것 또는 시험관내 및 생체외에서 또 다른 세포에 의해 세포를 치료하는 것을 지칭한다. 인간, 수의학 또는 연구 대상체에 적용될 때 "치료"는 치료적 치료, 예방 또는 예방 조치, 연구 및 진단 적용을 지칭한다.

"치료"는 내부적 또는 외부적 치료제, 예를 들어 본 개시내용의 결합 화합물 중 어느 하나를 포함하는 조성물을, 치료제가 치료 효과가 있는 것으로 알려진 질병의 하나 이상의 증상을 갖는 환자에게 투여하는 것을 지칭한다. 일반적으로, 치료제는 치료된 환자 또는 집단에서 질병의 하나 이상의 증상을 완화하여 그러한 증상의 퇴행(regression)을 유도하거나 임상적으로 측정되는 정도까지 그러한 증상의 발달을 억제하는데 효과적인 양으로 투여된다. 특정 질병 증상을 완화시키는 데 효과적인 치료제의 양("치료적 유효량"이라고도 함)은 다양한 요인, 예를 들어 환자의 질병 상태, 연령 및 체중, 및 환자에서 원하는 치료 효과를 내기 위한 약물의 능력에 따라 달라질 수 있다. 질병 증상이 완화되었는지 여부는 증상의 중증도 또는 진행을 평가하기 위해 의사 또는 기타 의료 전문가가 일반적으로 사용하는 임상 검사 방법을 통해 평가할 수 있다. 본 개시내용의 구현예(예를 들어, 치료 방법 또는 제품)가 각각의 표적 질환 증상의 완화에 효과가 없을 수 있으나, Student t-test, chi-square test, Mann and Whitney's U test, Kruskal-Wallis test(H test), Jonckheere-Terpstra test 및 Wilcoxon test와 같은 당업계에 알려진 임의의 통계적 테스트 방법에 따라 결정되는 바와 같이, 통계적으로 유의미한 수의 환자에서 표적 질환 증상을 감소시킬 것이다.

"보존적 변형(Conservative modification)" 또는 "보존적 대체 또는 치환"은 단백질의 생물학적 활성을 변화시키지 않으면서 변화가 빈번하게 이루어질 수 있도록 단백질의 아미노산을 유사한 특성(예를 들어, 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 주쇄 형태 및 강성(rigidity) 등)을 가지는 다른 아미노산으로 대체하는 것을 지칭한다. 당업자는 일반적으로 말해서 폴리펩티드의 비필수 영역에서 단일 아미노산 대체가 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않는다는 것을 알고 있다 (예를 들어 Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Page 224, (4th edition) 참조). 또한, 유사한 구조나 기능을 가진 아미노산의 대체는 생물학적 활성을 방해할 가능성이 없다. 예시적인 보존적 치환을 하기 표 "예시적인 아미노산 보존적 치환"에 기재하였다.

[표 3] 예시적인 아미노산 보존적 치환

"유효량" 또는 "유효 용량(effective dose)"은 임의의 하나 이상의 유익하거나 원하는 치료 결과를 얻는 데 필요한 약물, 화합물 또는 약제학적 조성물의 양을 지칭한다. 예방적 사용을 위해, 유익하거나 원하는 결과는 질병의 생화학, 조직학 및 행동 증상, 이의 합병증 및 질병의 발달 과정에서 발생하는 중간(intermediate) 병리학적 표현형을 포함하여, 위험의 제거 또는 감소, 중증도 감소 또는 질병 발병(onset)의 지연을 포함한다. 치료적 적용을 위해, 유익하거나 원하는 결과는 임상 결과, 예를 들어 본 개시내용의 다양한 표적 항원-관련 장애의 발병률을 감소시키거나 또는 장애의 하나 이상의 증상 개선하는 것, 장애 치료에 필요한 다른 제제의 용량을 감소시키는 것, 다른 제제의 치료 효과를 향상시키는 것, 및/또는 환자의 본 개시내용의 표적 항원-관련 장애의 진행을 지연시키는 것을 포함한다.

"외인성"이란 상황에 따라 유기체, 세포 또는 인체 외부에서 생성되는 물질을 지칭한다. "내인성"이란 상황에 따라 세포, 유기체 또는 인체 내부에서 생성되는 물질을 지칭한다.

"상동성(homology)"은 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이 또는 2개의 폴리펩티드 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 비교된 두 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 모노머 서브유닛에 의해 점유되는 경우, 예를 들어 두 DNA 분자의 각 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 분자는 해당 위치에서 상동이다. 두 서열 사이의 상동성 백분율은 두 서열이 공유하는 일치(matching) 또는 상동성인 위치의 개수를 비교된 위치의 개수로 나눈 값 × 100의 함수이다. 예를 들어, 최적의 서열 정렬에서, 두 서열의 10개 위치에서 6개의 일치 또는 상동성이 있는 경우, 두 서열은 60% 상동이고; 두 서열의 100개 위치에서 95개의 일치 또는 상동이 있는 경우, 두 서열은 95% 상동이다. 일반적으로, 2개의 서열이 정렬되는 경우, 최대 백분율 상동성을 제공하도록 비교가 이루어진다. 예를 들어, 비교는 BLAST 알고리즘에 의해 수행될 수 있으며, 여기서 알고리즘의 파라미터는 각 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐 각 서열 간의 최대 일치를 제공하도록 선택된다. 다음의 참조들은 서열 분석에 자주 사용되는 BLAST 알고리즘에 관한 것이다: BLAST ALGORITHMS: Altschul, S. F. et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T. L. et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S. F. et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. et al., (1997) Genome Res. 7:649-656. NCBI BLAST에 의해 제공되는 것과 같은 다른 통상적인 BLAST 알고리즘도 또한 당업자에게 잘 알려져 있다.

본원에서 사용되는 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이라는 표현은 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 이러한 모든 명칭은 자손(progeny)을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"라는 단어는 계대 수에 관계없이 1차 시험 세포 및 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한 고의적이거나 의도하지 않은 돌연변이로 인해, 모든 자손이 DNA 함량 측면에서 정확히 동일할 수는 없음을 이해해야 한다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가지는 돌연변이 자손이 포함된다. 상이한 명칭이 언급되는 경우 문맥으로부터 명확하게 이해될 것이다.

본원에서 사용되는 "중합효소 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 예를 들어 미국 특허 제4,683,195호에 기재된 바와 같이 핵산, RNA 및/또는 DNA의 미량의 특정 부분이 증폭되는 절차 또는 기술을 지칭한다. 일반적으로 말해서, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하기 위해서는 표적 영역의 말단 또는 외부로부터 서열 정보를 얻어야 할 필요가 있으며; 이들 프라이머는 증폭될 주형의 상응하는 가닥에 대해 서열 면에서 동일하거나 유사하다. 두 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭될 물질의 말단과 동일할 수 있다. PCR은 특정 RNA 서열, 전체 게놈 DNA의 특정 DNA 서열, 및 전체 세포성 RNA로부터 전사된 cDNA, 파지 또는 플라스미드 서열 등을 증폭하는 데 사용할 수 있다. 일반적으로 Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor, Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.)을 참조하라. 본 명세서에서 사용되는 PCR은 핵산 테스트 샘플을 증폭하기 위한 핵산 중합효소 반응 방법의 하나의 예로서 간주되나, 그러나 유일한 예는 아니며, 이 방법은 공지된 핵산을 프라이머로 사용하고 핵산 중합효소를 사용하여 핵산의 특정 부분을 증폭하거나 생성하는 것을 포함한다.

"단리된(isolated)"은 정제된 상태를 지칭하며, 이 경우 지정된 분자에 다른 생체분자, 예를 들어 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물 또는 기타 물질, 예를 들어 세포 파편(cell debris) 및 성장 배지가 실질적으로 없음을 의미한다. 일반적으로, "단리된"이라는 용어는 본 명세서에 기재된 화합물의 실험적 또는 치료적 사용을 상당히 방해하는 양으로 존재하지 않는 한, 이러한 물질의 완전한 부재 또는 물, 완충액 또는 염의 부재를 의미하는 것으로 의도되지는 않는다.

"선택적" 또는 "선택적으로"는 후술하는 이벤트 또는 환경이 발생할 수 있으나 반드시 발생하는 것은 아님을 지칭하며, 이 기재는 이벤트 또는 환경이 발생하거나 발생하지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, "선택적으로 1 내지 3개의 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는"은 특정 서열의 항체 중쇄 가변 영역이 존재할 수 있지만 존재하지 않아도 됨을 의미한다.

"약제학적 조성물"은 본원에 기재된 하나 이상의 화합물, 또는 그의 생리학적으로/약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭, 및 기타 화학적 성분, 예를 들어 생리학적으로/약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 포함하는 혼합물을 의미한다. 약제학적 조성물의 목적은 유기체에 대한 투여를 촉진하는 것으로, 이는 활성 성분의 흡수를 도와 생물학적 활성을 발휘하게 한다.

용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 항체 또는 항원-결합 단편의 전달을 위한 제제에 사용하기에 적합한 임의의 불활성 물질을 지칭한다. 담체는 접착 방지제, 결합제, 코팅제, 붕해제(disintegrant), 충전제 또는 희석제, 방부제(예컨대 항산화제, 항균제 또는 항진균제), 감미제, 흡수 지연제(absorption delaying agent), 습윤제, 유화제, 완충제 등일 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로판디올, 폴리에틸렌 글리콜 등) 덱스트로스, 식물성 오일(예: 올리브 오일), 식염수, 완충액, 완충 식염수, 및 등장화제, 예를 들어 당, 폴리올, 소르비톨 및 염화나트륨을 포함한다.

또한, 본 개시내용은 본 개시내용의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 유효 성분으로 포함하는, 표적 항원(예를 들어, PD-1) 양성 세포와 관련된 질환의 치료제를 포함한다.

본 개시내용에서 PD-1과 관련된 질환은 PD-1과 관련된 질환이기만 하면 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 개시내용의 분자에 의해 유도되는 치료 반응은 인간 PD-1에 결합한 다음 PD-1과 그의 리간드 PD-L1 및 PD-L2의 결합을 억제하거나, 또는 PD-1을 과발현하는 종양 세포를 사멸시킴으로써 달성될 수 있다. 따라서, 치료적 적용에 적합한 제제 및 제형에서, 본 개시내용의 분자는 종양 또는 암, 바람직하게는 흑색종, 결장암, 유방암, 폐암, 위암, 대장암, 신장암, 비소세포폐암, 방광암 등을 앓고 있는 사람들에게 매우 유용하다.

또한, 본 개시내용은 표적 항원(예를 들어 PD-1)의 면역검출 또는 결정 방법, 표적 항원(예를 들어 PD-1)의 면역검출 또는 결정용 시약, 표적 항원(예를 들어 PD-1)을 발현하는 세포의 면역검출 또는 결정 방법 및 표적 항원(예를 들어 PD-1) 양성 세포와 관련된 질병 진단용 진단제에 관한 것으로, 이는 표적 항원(예를 들어 인간 PD-1)을 특이적으로 인식하고 세포외 영역의 아미노산 서열 또는 그의 3차원 구조에 결합하는 본 개시내용의 항체 또는 항체 단편을 포함하여 활성 성분으로 사용된다.

본 개시내용에서, 표적 항원(예를 들어, PD-1)의 양을 검출 또는 측정하기 위해 사용되는 방법은 임의의 공지된 방법일 수 있다. 예를 들어, 면역검출 또는 측정 방법을 포함한다.

면역검출 또는 측정 방법은 표지된 항원 또는 항체를 사용하여 항체 또는 항원의 양을 검출하거나 측정하는 방법이다. 면역검출 또는 측정 방법의 예로는 방사선면역검정(radioimmunoassay, RIA), 효소 면역검정(enzyme immunoassay, EIA 또는 ELISA), 형광 면역검정(fluorescence immunoassay, FIA), 발광 면역검정(luminescence immunoassay), 웨스턴 블롯팅, 물리화학적 방법 등을 포함한다.

상기 언급된 PD-1 양성 세포와 관련된 질환은 본 개시내용의 항체 또는 항체 단편을 사용하여 PD-1 발현 세포를 검출 또는 측정함으로써 진단할 수 있다.

폴리펩티드를 발현하는 세포를 검출하기 위해, 공지된 면역검출 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 면역침전, 형광 세포 염색, 면역조직화학적 염색 등을 사용한다. 또한, FMAT8100HTS 시스템(Applied Biosystem)을 이용한 형광 항체 염색법을 사용할 수 있다.

본 개시내용에서, 표적 항원(예를 들어 PD-1)을 발현하는 세포를 함유할 가능성이 있는 한, 표적 항원(예를 들어 PD-1)의 검출 또는 측정에 사용되는 생체 내 샘플에 대해 특별한 제한은 없으며, 예를 들어, 조직구(histocyte), 혈액, 혈장, 혈청, 췌장액(pancreatic juice), 소변, 대변, 조직액 또는 배양액이 포함된다.

필요한 진단 방법에 따라, 본 개시내용의 모노클로날 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 진단제는 항원-항체 반응을 수행하기 위한 시약 또는 반응을 검출하기 위한 시약을 또한 포함할 수 있다. 항원-항체 반응을 수행하는 데 사용되는 시약으로는 완충액, 염 등을 포함한다. 검출에 사용되는 시약으로는 면역검출 또는 측정 방법에 일반적으로 사용되는 시약, 예를 들어 모노클로날 항체, 이의 항체 단편 또는 이의 접합체를 인식하는 표지된 제2 항체, 및 표지에 대응하는 기질 등을 포함한다.

항원의 제조

1. 항원의 구축:

인간 PD-1-IgG1Fc 융합 단백질은 N-말단에 인간 PD-1의 세포외 영역의 150개 아미노산 및 C-말단에 인간 IgG1의 Fc 단편(hIgG1Fc)으로 설계 및 합성된다. 고순도의 재조합 PD-1-Fc 단백질은 단백질 A(Protein A) 친화 컬럼으로 정제한 후에 얻을 수 있으며 항-PD-1 항체의 항원에 대한 결합을 검출하는데 사용된다.

인간 PD-1-IgG1Fc(서열번호 1):

MEFGLSWLFLVAILKGVQCPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

참고: 밑줄 친 부분은 신호 펩타이드이고, 정상 부분은 인간 PD-1의 세포외 영역이며, 기울임꼴(italicized) 부분은 hIgG1Fc이다 (신호 펩타이드 + 세포외 영역 + hIgG1Fc).

인간 PD-1-his(서열번호 2):

MEFGLSWLFLVAILKGVQCPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVGSSDYKDDDDKHHHHHH.

세포 내로 형질감염된 핵산에 의해 암호화되는 PD-1 항원(서열번호 3):

MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL.

항체의 제조

항-인간 PD-1 항체는 마우스를 면역화하여 생산할 수 있으며, 항-인간 PD-1 파지 마우스 면역 라이브러리로부터 수득할 수도 있다.

마우스를 면역화하여 항-인간 PD-1 항체를 제조하는 방법은 다음과 같다:

1. 면역화: 6-8주령 암컷 실험용 SJL 백색 마우스 및 6-8주령 암컷 Balb/c 백색 마우스. 수용 환경: SPF 수준. 마우스를 구입한 후, 20-25℃의 온도; 40-60% 습도에서 12/12시간 명암 주기를 조정하면서 실험실 환경에서 1주일 동안 수용하였다. 환경에 적응된 마우스를 각 그룹에 6-10 마리의 마우스로 하여 서로 다른 프로토콜에 따라 면역화하였다. 면역 항원은 정제된 재조합 단백질 PD-1-IgG1Fc(서열번호 1 참조), PD-1-his(서열번호 2 참조), 또는 항원으로서 PD-1으로 형질감염된 Jurkat/CHO-PD-1 세포(서열번호 3 참조)였다. 서로 다른 면역 어쥬번트(adjuvant) 또는 서로 다른 유형의 면역원(immunogen)과 조합된 단일 항원을 교차-면역화에 사용하였다. 접종 부위는 복강(abdominal cavity) 또는 등(back) 피부 아래였으며, 또는 두 부위에서 교대로 접종하였다. 면역 어쥬번트 TiterMax^® Gold Adjuvant(이하 Titermax라고 함, Sigma에서 구입, Cat. No. T2684) 및 Imject Alum Adjuvant(이하 Alum이라고 함, Pierce에서 구입, Cat. No. 77161)를 교차-면역화에 사용하였다. 항원 대 어쥬번트(Titermax)의 비율은 1:1 이었고, 항원 대 어쥬번트(Alum)의 비율은 3:1 이었으며, 25-50 μg/동물(1차 접종), 50 μg/동물(부스터 접종), 또는 1×10⁷ Jurkat/CHO-PD-1 세포/동물이었다. 0일째에, 25-50 μg/동물 유화된 항원을 복강내 주사하였으며, 1차 접종 후 1주일에 1회 또는 2주에 1회, Titermax와 Alum을 교대로 총 5-8회 사용하였다.

2. 세포 융합: 혈청에서 항체 역가가 높은 마우스를 비장 세포 융합을 위해 선택하였다. 스프린트 접종(sprint immunization) 72시간 후 마우스의 눈을 채혈하였다. 마우스는 목을 잡아당겨 희생시키고 소독을 위해 75% 에탄올에 넣었다. 비장 림프구를 골수종 세포 Sp2/0 세포(Chinese Academy of Sciences)에 융합하여 최적화된 PEG-매개 융합 절차를 적용하여 하이브리도마 세포를 얻었다. 융합된 하이브리도마 세포를 HAT 완전 배지(20% FBS, 1×HAT 및 1×OPI를 함유하는 RPMI-1640 배지)에 재현탁하고, 96-웰 세포 배양 플레이트에 분취하고(1×10⁵/150 μl/웰)에 분취하고, 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하고, 전체적으로 약 10-30개의 플레이트에 씨딩하였다. 융합 후 5일째에, HAT 완전 배지를 50 μl/웰로 첨가하고, 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 융합 후 7일부터 8일까지, 세포 성장 밀도에 따라, 배지를 200 μl/웰로 완전히 교환하고, 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하였다.

3. 하이브리도마 세포 스크리닝: 융합 7-9일 후, 세포 성장 밀도에 따라, ELISA 방법을 수행하여 PD-1에 대한 항체의 결합을 검출하였고, 양성 웰의 세포를 ELISA로 추가로 검출하여 PD-1/PDL1 결합의 차단을 검출하였다. 양성 웰의 배지를 교체하고 세포 밀도에 따라 적시에 세포를 24-웰 플레이트로 확장시켰다. 24-웰 플레이트로 옮겨진 세포주를 재검사한 후 보존하고 처음으로 서브클로닝하였다. 1차 서브클로닝 스크리닝에서 양성인 것을 보존하고, 단일 세포 클론을 얻을 때까지 2차 또는 3차 서브클로닝을 수행하였다. PD-1과 PDL1의 결합을 차단하는 효과가 있는 하이브리도마 세포를 다중 융합으로 수득하었다.

항-인간 PD-1 파지 마우스 면역 라이브러리를 통해 항-인간 PD-1 항체를 수득하는 방법은 다음과 같다:

1. 항-인간 PD-1 파지 마우스 면역 라이브러리 구축: 혈청 내 항체 역가가 높은 마우스의 비장을 선별하고, Trizol(Invitrogen Cat No. 15596-018)을 사용하여 조직 전체 RNA를 추출하였다. 역전사를 위해 PrimeScript?? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara Cat No. 6210A)를 사용하여 cDNA를 수득하였다. 라이브러리를 구성하기 위한 프라이머는 IMGT 데이터베이스에 따라 설계 및 합성하였다. 단일쇄 항체 단편을 3회의 PCR 반응을 통해 수득하였다. 단일쇄 항체 단편 및 변형된 라이브러리 구축 벡터 pCantab5E(Amersham Biosciences/GE Cat No. 27-9400-01)를 Sfi1(NEB Cat No.#R0123L)로 분해하고, 전기영동 후 E. Z. N. A.^® Gel Extraction Kit(Omega Cat No. D2500-02)로 정제 및 회수하였다. 그런 다음 T4 DNA ligase(NEB Cat No.#M0202L)를 사용하여 16℃에서 16-18시간 동안 라이게이션(ligation, 결찰)을 수행하고, 상기 키트를 정제 및 회수에 사용하고, 최종적으로 탈이온수로 용출을 수행하였다. 1 μg의 라이게이션 생성물을 취하여 전기-형질전환(electro-transformation)을 위해 컴피턴트 TG1(Lucigen Cat No. 60502-2) 바이알 1개와 혼합하고, 파라미터를 2.5 kV, 200Ω 및 25uF로 설정하여 전기천공기(electroporator)(Bio Rad Micropulser)로 전기-형질전환을 수행하였다. 형질전환을 10회 반복하였다. 생성물을 플레이트에 펴고 37℃에서 16-18시간 동안 거꾸로 배양하였다. 그런 다음 모든 콜로니를 분리하여 함께 혼합하고, 글리세린을 최종 농도 15%로 첨가하고, -80℃에서 보관하여 사용하였다.

2. 항-인간 PD-1 파지 마우스 면역 라이브러리의 스크리닝: 포장된 항-인간 PD-1 파지 면역 라이브러리(1×10¹²- 1×10¹³) 및 100 μl 스트렙토마이신 마이크로비드(Milenvi Biotec, Auburn, CA)를 2% 탈지유를 함유하는 인산염 완충 식염수(MPBS) 1ml 에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 마그네틱 스탠드에 놓고, 상청액을 수집하였다. 10 μg/ml 비오틴화된 인간 PD-1-ECD-his 단백질(Sino Biological에서 구입)을 상청액에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 100 μl의 스트렙타비딘 코팅된 마그네틱 비드(1 ml MPBS와 함께 사전 인큐베이션함)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그리고 선별을 위해 마그네틱 스탠드 시스템에 로딩하고, 상청액을 흡인하였다. 1 ml PBST(0.1% Tween-20을 함유하는 인산염 완충액)를 첨가하고 여러 번 뒤집었다. 완전한 흡인 후에 새로운 세척 용액을 첨가하고, 결합되지 않은 항체 단편을 제거하기 위해 11회 반복하고, 0.5 ml 용출 용액(450 μl PBS에 첨가된 50 μl 10 mg/ml 트립신 스톡 용액)을 첨가하였다. 상온에서 15분 동안 흔들어준 후, 마그네틱 스탠드에 놓고, 상청액을 새 EP 튜브에 흡인하였다. TG1을 2YT 배지에 씨딩하고 배양된 박테리아 밀도 OD600=0.4가 될 때까지 확장시켰다. 각 튜브에 1.75 ml의 TG1(OD600=0.4)을 첨가하고, 250 μl의 용출된 파지(파지)를 첨가하고, 37℃ 수욕(water bath)에서 30분 동안 인큐베이션하고, 역가 시험을 위해 구배 희석으로 플레이트에 펼쳤다. 나머지 TG1 용액을 원심분리하고, 플레이트에 펴고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

MACS 스크리닝(스트렙토마이신 마그네틱 비드, Invitrogen)과 비오틴화된 인간 PD-1-ECD-his 항원을 사용하여 파지 마우스 면역 라이브러리를 2-3 라운드 스크리닝하였고, PD-1에 결합할 수 있고 PD-1과 PD-L1의 결합을 차단할 수 있는 모노클로날 항체를 최종적으로 수득하고 시퀀싱에 의해 확인하였다. 항체의 가변 영역 서열을 수득하였다.

재조합 항원 단백질/항체의 정제

1. 하이브리도마 상청액의 분리 및 정제/단백질 G 친화성 크로마토그래피:

마우스 하이브리도마 상청액의 정제를 위해, 친화성 크로마토그래피용 단백질 G를 첫 번째 선택으로 하였다. 배양된 하이브리도마를 원심분리하여 상청액을 수집하고, 상청액의 부피에 따라 10-15% 부피의 1 M Tris-HCl(pH 8.0-8.5)을 첨가하여 상청액의 pH를 조절하였다. Protein G 컬럼의 경우, 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride)를 컬럼 부피의 3-5배로 사용하여 세척한 후, 순수한 물을 컬럼 부피의 3~5배로 사용하여 세척하였다; 평형 완충제로 1×PBS(pH 7.4)와 같은 완충 시스템을 컬럼 부피의 3-5배로 사용하여 컬럼을 평형화하였다; 세포 상청액을 로딩하고 낮은 유속을 사용하여 결합시켰고, 머무름 시간(retention time)이 약 1분 또는 그 이상이 되도록 이를 조절하였다; UV 흡수가 기준선으로 떨어질 때까지 1×PBS(pH 7.4)를 컬럼 부피의 3-5배로 사용하여 크로마토그래피 컬럼을 세척하였다; 샘플 용출을 위해 0.1 M 아세트산/소디움 아세테이트(pH 3.0) 완충액을 사용하였고, UV 검출에 따라 용출 피크를 수집하였고, 1 M Tris-HCl(pH 8.0)을 사용하여 용출된 생성물의 pH를 5-6으로 신속하게 조정하여 임시 보관하였다. 용출된 생성물의 경우, 용액 교체는 당업자에게 잘 알려진 방법으로 수행할 수 있으며, 예컨대 한외여과(ultrafiltration) 및 농축을 위해 한외여과 튜브를 사용하고 용액을 필요한 완충 시스템으로 교체하거나, 또는 G-25와 같은 분자 배제를 사용하여 탈염하고 필요한 완충 시스템으로 교체하거나, 또는 Superdex 200과 같은 고분해능 분자 배제 컬럼을 사용하여 용출된 생성물에서 응집된 성분을 제거하여 샘플 순도를 개선할 수 있다.

2. 단백질 또는 항체의 단백질 A 친화성 크로마토그래피 정제:

먼저, 항원 단백질 또는 항체를 발현하는 세포 배양물의 상청액을 고속으로 원심분리하여 상청액을 수집하였다. Protein A 친화성 컬럼의 경우, 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드를 컬럼 부피의 3-5배로 사용하여 세척한 후, 순수한 물을 컬럼 부피의 3-5배로 사용하여 세척하였다. 평형 완충제로 1×PBS(pH 7.4)와 같은 완충 시스템을 컬럼 부피의 3-5배로 사용하여 크로마토그래피 컬럼을 평형화하였다. 세포 상청액을 로딩하고 낮은 유속을 사용하여 결합시켰고, 머무름 시간이 약 1분 또는 그 이상이 되도록 이를 조절하였다. 결합이 완료된 후, UV 흡수가 기준선으로 떨어질 때까지 1×PBS(pH 7.4)를 컬럼 부피의 3-5배로 사용하여 크로마토그래피 컬럼을 세척하였다. 샘플 용출을 위해 0.1 M 아세트산/소디움 아세테이트(pH 3.0-3.5) 완충액을 사용하였고, UV 검출에 따라 용출 피크를 수집하였고, 1 M Tris-HCl(pH 8.0)을 사용하여 용출된 생성물의 pH를 5-6으로 신속하게 조정하여 임시 보관하였다. 용출된 생성물의 경우, 용액 교체는 당업자에게 잘 알려진 방법으로 수행할 수 있으며, 예컨대 한외여과(ultrafiltration) 및 농축을 위해 한외여과 튜브를 사용하고 용액을 필요한 완충 시스템으로 교체하거나, 또는 G-25와 같은 분자 배제를 사용하여 탈염하고 필요한 완충 시스템으로 교체하거나, 또는 Superdex 200과 같은 고분해능 분자 배제 컬럼을 사용하여 용출된 생성물에서 응집된 성분을 제거하여 샘플 순도를 개선할 수 있다.

실시예

본 개시내용은 실시예와 함께 하기에서 추가로 설명되지만, 이들 실시예는 본 개시내용의 범위를 제한하지 않는다. 본 개시내용의 실시예에서 조건이 구체적으로 기재되어 있지 않은 실험 방법은 일반적으로 Antibodies: A Laboratory Manual and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 와 같은 통상적인 조건에 따르거나; 또는 원료 또는 제품 제조사가 권장하는 조건에 따른다. 출처가 구체적으로 표시되어 있지 않은 시약은 시중에서 구할 수 있는 통상적인 시약이다.

실시예 1: 항-인간 PD-1 뮤린 항체 획득

상기 언급된 방법에 의해 수득된 항-인간 PD-1 뮤린 항체를 항원 결합 실험에 적용하고 스크리닝하여 활성이 양호한 항체의 다중 균주를 수득하였다: 여기에 M23, M32 및 M33이 포함되었다. 단일 세포 클론을 확장 및 배양하고, RNA를 추출하고, 마우스-Ig의 축퇴 프라이머를 사용하여 역전사 증폭(RT-PCR)을 수행하여 항체의 가변 영역 서열을 얻었다. 뮤린 항체 가변 영역 서열을 인간 항체 불변 영역 서열과 연결하였다. 뮤린 모노클로날 항체의 키메라 항체를 클로닝하여 재조합적으로 발현시키고, 수득한 모노클로날 항체 가변 영역 서열이 올바른지 확인하기 위해 시험관내 활성 실험을 수행하였다.

뮤린 항체 M23, M32 및 M33의 가변 영역 서열은 다음과 같이 결정되었다:

뮤린 항체 M23의 중쇄 가변 영역(서열번호 4):

QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPIHGLEWIGLIDPETGGTVYNQKFKDKTILTADKSSSTAYMEFRSLTSEDSAVYHCTRERFSYYGSTSDWYFDVWGTGTTVTVSS.

뮤린 항체 M23의 경쇄 가변 영역(서열번호 5):

DGLMTQTPLSLPVSLGDHASISCRSSQSLVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIK.

뮤린 항체 M32의 중쇄 가변 영역(서열번호 6):

QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASDFTFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGLFDPETGGIVYNQKFKGKAILTADKSSNTAYMEFRSLTSEDSAVYYCTREGYNRDWYFDVWGTGTTVTVSS.

뮤린 항체 M32의 경쇄 가변 영역(서열번호 7):

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHVPYAFGGGTKLEIK.

뮤린 항체 M33의 중쇄 가변 영역(서열번호 19):

KVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGVDTYYQDNVQGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTALYYCASPYGHGYFDVWGTGTTVTVSS.

뮤린 항체 M33의 경쇄 가변 영역(서열번호 20):

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDINNFLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK.

참고: 상기 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 서열에서, 밑줄은 Kabat 넘버링 시스템에 의해 결정된 CDR 서열이고, 다음과 같은 순서이다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

[표 4] 뮤린 항체 M23, M32 및 M33 중쇄 및 경쇄 CDR 영역 서열

참고: 표에서 항체 CDR 서열은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 결정된 것이다.

실시예 2: 항-인간 PD-1 모노클로날 항체의 인간화

IMGT 인간 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식계열 유전자 데이터베이스 및 MOE 소프트웨어 분석에 대해 정렬시킴으로써, M23, M32 및 M33 경쇄 및 중쇄 서열과 높은 동일성을 가지는 인간 생식계열 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식계열 유전자를 주형으로 선택하였다. 이들 3개의 뮤린 항체의 CDR을 상응하는 인간 항체 주형에 이식하여 각각 상응하는 인간화 항체를 구축하였다.

1. 뮤린 항체 M23의 인간화

1.1 뮤린 항체 M23의 인간화 프레임워크의 선택

뮤린 항체 M23의 인간화 경쇄 주형은 IGKV2-40*01 및 IGKJ4*01이고, 인간화 중쇄 주형은 IGHV1-69*02 및 IGHJ6*01이다. 인간화 후 가변 영역의 서열은 다음과 같다(밑줄은 CDR 서열이다):

Hu23VH-CDR 이식: (서열번호 27)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYEMHWVRQAPGQGLEWMGLIDPETGGTVYNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARERFSYYGSTSDWYFDVWGQGTTVTVSS.

Hu23VL-CDR 이식: (서열번호 28)

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK.

1.2 뮤린 항체 M23의 인간화 주형 선택 및 역 돌연변이 설계

[표 5] 뮤린 항체 M23 인간화 항체의 역 돌연변이

참고: 이식은 뮤린 항체 CDR이 인간 생식계열 FR 영역 서열에 이식되었음을 의미한다. 아미노산 잔기는 Kabat 넘버링 시스템에 의해 결정되고 주석을 단 것으로, 예를 들어 I2G는 Kabat 넘버링의 위치 2에 있는 I가 Kabat 넘버링 시스템에 따라 G로 다시 돌연변이된 것을 의미한다.

M23의 인간화 항체의 경쇄/중쇄 가변 영역 서열은 다음과 같다:

> Hu23VL1 (Hu23VL-CDR 이식과 동일함): (서열번호 28)

> Hu23VL2 (서열번호 29)

DGVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK.

> Hu23VH1 (Hu23VH-CDR 이식과 동일함): (서열번호 27)

> Hu23VH2 (서열번호 30)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSDYEMHWVRQAPGQGLEWMGLIDPETGGTVYNQKFKDRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARERFSYYGSTSDWYFDVWGQGTTVTVSS.

> Hu23VH3 (서열번호 31)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSDYEMHWVRQAPGQGLEWIGLIDPETGGTVYNQKFKDRTTLTADKSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCARERFSYYGSTSDWYFDVWGQGTTVTVSS.

> Hu23VH4 (서열번호 32)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSDYEMHWVRQAPGQGLEWIGLIDPETGGTVYNQKFKDRTTLTADKSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCTRERFSYYGSTSDWYFDVWGQGTTVTVSS.

1.3 뮤린 항체 M23의 인간화 서열 조합

뮤린 항체 M23의 인간화에 의해 수득된 항체 및 그의 가변 영역 조합을 하기 표에 나타내었다.

[표 6] 인간화 Hu23 항체 가변 영역의 조합

참고: "Hu23-1"은 경쇄 가변 영역이 Hu23VL1이고 중쇄 가변 영역이 Hu23VH1인 항체를 지칭하며, 이하 같다.

상기 표에 언급된 항체 경쇄/중쇄 가변 영역의 조합(예를 들어 Hu23-1)은 각각 항체 경쇄/중쇄 불변 영역과 연결되어 전장 항체를 형성할 수 있다; 본 개시내용에서 달리 명시하지 않는 한, 전장 항체를 형성할 때, 경쇄 가변 영역은 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역과 연결되어 항체 경쇄를 형성하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 72에 기재된 IgG4-AA 중쇄 불변 영역 또는 서열번호 79에 기재된 IgG4-P 중쇄 불변 영역과 연결되어 항체 중쇄를 형성하며, 항체 경쇄/중쇄 가변 영역의 조합을 지칭하는 상기 표의 명칭(예를 들어 Hu23-1)에 접미사 ".IgG4AA"가 붙으면 IgG4-AA 중쇄 불변 영역과 연결하여 형성된 전장 항체를 의미하고, 접미사 ".IgG4P"가 붙으면 IgG4-P 중쇄 불변 영역과 연결하여 형성된 전장 항체를 의미하는 바, 예를 들어, "Hu23-1.IgG4AA"는 Hu23VH1 중쇄 가변 영역과 서열번호 72에 기재된 IgG4-AA 중쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 중쇄, 그리고 Hu23VL1 경쇄 가변 영역과 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 경쇄를 연결하여 형성된 전장 항체를 의미한다. "Hu23-1.IgG4P"는 Hu23VH1 중쇄 가변 영역과 서열번호 79에 기재된 IgG4-P 중쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 중쇄, 그리고 Hu23VL1 경쇄 가변 영역과 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 경쇄를 연결하여 형성된 전장 항체를 의미한다.

2. 뮤린 항체 M32의 인간화

2.1 뮤린 항체 M32의 인간화 프레임워크의 선택

뮤린 항체 M32의 인간화 경쇄 주형은 IGKV2-40*01 및 IGKJ4*01이고, 인간화 중쇄 주형은 IGHV1-69*02 및 IGHJ6*01이다. 인간화 가변 영역의 서열은 다음과 같다(밑줄은 CDR 서열이다):

Hu32VH-CDR 이식: (서열번호 33) IGHV1-69*02 및 IGHJ6*01

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYEIHWVRQAPGQGLEWMGLFDPETGGIVYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYNRDWYFDVWGQGTTVTVSS.

Hu32VL-CDR 이식: (서열번호 34)

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYAFGGGTKVEIK.

2.2 뮤린 항체 M32의 인간화 주형 선택 및 역 돌연변이 설계

[표 7] 뮤린 항체 M32 인간화 항체의 역 돌연변이

참고: 이식은 뮤린 항체 CDR이 인간 생식계열 FR 영역 서열에 이식되었음을 의미한다. 아미노산 잔기는 Kabat 넘버링 시스템에 의해 결정되고 주석을 단 것으로, 예를 들어 I2V는 Kabat 넘버링의 위치 2에 있는 I가 Kabat 넘버링 시스템에 따라 V로 다시 돌연변이된 것을 의미한다.

뮤린 항체 M32의 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열은 다음과 같다:

> Hu32VL1 (Hu32VL-CDR 이식과 동일함): (서열번호 34)

> Hu32VL2 (서열번호 35)

DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYAFGGGTKVEIK.

> Hu32VH1 (Hu23VH-CDR 이식과 동일함): (서열번호 33)

> Hu32VH2 (서열번호 36)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFSDYEIHWVRQAPGQGLEWMGLFDPETGGIVYNQKFKGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGYNRDWYFDVWGQGTTVTVSS.

> Hu32VH3 (서열번호 37)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASDFTFSDYEIHWVRQAPGQGLEWMGLFDPETGGIVYNQKFKGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGYNRDWYFDVWGQGTTVTVSS.

> Hu32VH4 (서열번호 38)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFSDYEIHWVRQAPGQGLEWIGLFDPETGGIVYNQKFKGRATLTADKSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCTREGYNRDWYFDVWGQGTTVTVSS.

> Hu32VH5 (서열번호 39)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASDFTFTDYEIHWVRQAPGQGLEWIGLFDPETGGIVYNQKFKGRATLTADKSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCTREGYNRDWYFDVWGQGTTVTVSS.

> Hu32VH6 (서열번호 40)

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASDFTFTDYEIHWVKQAPGHGLEWIGLFDPETGGIVYNQKFKGKATLTADKSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCTREGYNRDWYFDVWGQGTTVTVSS.

2.3 뮤린 항체 M32의 인간화 서열 조합

뮤린 항체 M32의 인간화에 의해 수득된 항체 및 그의 가변 영역 조합.

[표 8] 인간화 항체 Hu32의 경쇄/중쇄 가변 영역의 조합

참고: 표에서 예를 들어 "Hu32-1"은 Hu32VL1의 항체 경쇄 가변 영역과 Hu32VH1의 중쇄 가변 영역의 조합을 가지는 항체를 지칭하며, 이하 같다.

상기 표에 언급된 항체 경쇄/중쇄 가변 영역의 조합(예를 들어 Hu32-1)은 각각 항체 경쇄/중쇄 불변 영역과 연결되어 전장 항체를 형성할 수 있다; 본 개시내용에서 달리 명시하지 않는 한, 전장 항체를 형성할 때, 경쇄 가변 영역은 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역과 연결되어 항체 경쇄를 형성하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 72에 기재된 IgG4-AA 중쇄 불변 영역 또는 서열번호 79에 기재된 IgG4-P 중쇄 불변 영역과 연결되어 항체 중쇄를 형성하며, 항체 경쇄/중쇄 가변 영역의 조합을 지칭하는 상기 표의 명칭(예를 들어 Hu32-1)에 접미사 ".IgG4AA"가 붙으면 IgG4-AA 중쇄 불변 영역과 연결하여 형성된 전장 항체를 의미하고, 접미사 ".IgG4P"가 붙으면 IgG4-P 중쇄 불변 영역과 연결하여 형성된 전장 항체를 의미하는 바, 예를 들어, "Hu32-1.IgG4AA"는 Hu32VH1 중쇄 가변 영역과 서열번호 72에 기재된 IgG4-AA 중쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 중쇄, 그리고 Hu32VL1 경쇄 가변 영역과 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 경쇄를 연결하여 형성된 전장 항체를 의미한다. "Hu32-1.IgG4P"는 Hu32VH1 중쇄 가변 영역과 서열번호 79에 기재된 IgG4-P 중쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 중쇄, 그리고 Hu32VL1 경쇄 가변 영역과 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 경쇄를 연결하여 형성된 전장 항체를 의미한다.

3. 뮤린 항체 M33의 인간화

3.1 뮤린 항체 M33의 인간화 프레임워크의 선택

뮤린 항체 M33의 인간화 경쇄 주형은 IGKV1-39*01 및 IGKJ4*01이고 인간화 중쇄 주형은 IGHV3-7 및 IGHJ6*01이다. 인간화 가변 영역의 서열은 다음과 같다(밑줄은 CDR 서열이다):

Hu33VH-CDR 이식 (서열번호 41):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGVDTYYQDNVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPYGHGYFDVWGQGTTVTVSS.

Hu33VL-CDR 이식 (서열번호 42):

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINNFLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK.

3.2 뮤린 항체 M33의 인간화 주형 선택 및 역 돌연변이 설계

[표 9] 뮤린 항체 M33 인간화 항체의 역 돌연변이

참고: 이식은 뮤린 항체 CDR이 인간 생식계열 FR 영역 서열에 이식되었음을 의미한다. 아미노산 잔기는 Kabat 넘버링 시스템에 의해 결정되고 주석을 단 것으로, 예를 들어 F71Y는 Kabat 넘버링의 위치 71에 있는 F가 Kabat 넘버링 시스템에 따라 Y로 다시 돌연변이된 것을 의미한다.

뮤린 항체 M33의 인간화 항체의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 서열은 다음과 같다:

> Hu33VL1 (Hu33VL-CDR 이식과 동일함): (서열번호 42)

> Hu33VL2 (서열번호 43)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINNFLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK.

> Hu33VL3 (서열번호 44)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINNFLNWYQQKPGGAVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK.

> Hu33VH1 (Hu33VH-CDR 이식과 동일함): (서열번호 41)

> Hu33VH2 (서열번호 45)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGVDTYYQDNVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPYGHGYFDVWGQGTTVTVSS.

> Hu33VH3 (서열번호 46)

KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGVDTYYQDNVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPYGHGYFDVWGQGTTVTVSS.

3.3 뮤린 항체 M33의 인간화 서열 조합

[표 10] 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 조합

참고: 표에서 예를 들어 "Hu33-6"은 Hu33VL2의 항체 경쇄 가변 영역과 Hu33VH3의 중쇄 가변 영역의 조합을 가지는 항체를 지칭하며, 이하 같다.

상기 표에 언급된 항체 경쇄/중쇄 가변 영역의 조합(예를 들어 Hu33-6)은 각각 항체 경쇄/중쇄 불변 영역과 연결되어 전장 항체를 형성할 수 있다; 본 개시내용에서 달리 명시하지 않는 한, 전장 항체를 형성할 때, 경쇄 가변 영역은 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역과 연결되어 항체 경쇄를 형성하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 72에 기재된 IgG4-AA 중쇄 불변 영역 또는 서열번호 79에 기재된 IgG4-P 중쇄 불변 영역과 연결되어 항체 중쇄를 형성하며, 항체 경쇄/중쇄 가변 영역의 조합을 지칭하는 상기 표의 명칭(예를 들어 Hu33-6)에 접미사 ".IgG4AA"가 붙으면 IgG4-AA 중쇄 불변 영역과 연결하여 형성된 전장 항체를 의미하고, 접미사 ".IgG4P"가 붙으면 IgG4-P 중쇄 불변 영역과 연결하여 형성된 전장 항체를 의미하는 바, 예를 들어, "Hu32-6.IgG4AA"는 Hu33VH3 중쇄 가변 영역과 서열번호 72에 기재된 IgG4-AA 중쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 중쇄, 그리고 Hu33VL2 경쇄 가변 영역과 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 경쇄를 연결하여 형성된 전장 항체를 의미한다. "Hu33-6.IgG4P"는 Hu33VH3 중쇄 가변 영역과 서열번호 79에 기재된 IgG4-P 중쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 중쇄, 그리고 Hu33VL2 경쇄 가변 영역과 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 경쇄를 연결하여 형성된 전장 항체를 의미한다.

4. 인간화 항체의 돌연변이

4.1 Hu23 인간화 항체의 돌연변이 항체

컴퓨터 시뮬레이션을 통해, Hu23 인간화 항체의 경쇄 LCDR1(서열번호 11)의 특정 부위의 아미노산에 부위-특이적 돌연변이를 수행하였으며, 그 구체적인 돌연변이는 표 11에 나타내었다.

[표 11] Hu23 경쇄 LCDR1의 돌연변이 서열

참고: Hu23LCDR1(N28Q)는 Hu23 인간화 항체 경쇄 가변 영역 Hu23VL1 또는 Hu23VL2의 Kabat 넘버링 기준에 따른 위치 28의 N이 Q로 돌연변이된 LCDR1 돌연변이 서열을 의미하고, Hu23LCDR1(G29A)는 Hu23 인간화 항체 경쇄 가변 영역 Hu23VL1 또는 Hu23VL2의 Kabat 넘버링 기준에 따른 위치 29의 G가 A로 돌연변이된 LCDR1 돌연변이 서열을 의미한다(CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 의해 결정된 것이다).

LCDR1 돌연변이 후 Hu23 인간화 항체 경쇄 가변 영역의 서열은 다음과 같다:

> Hu23VL1(N28Q) 서열은 다음과 같다:

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK

(서열번호 53)

> Hu23VL1(N28L) 서열은 다음과 같다:

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSLGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK

(서열번호 54)

> Hu23VL1(N28T) 서열은 다음과 같다:

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK

(서열번호 55)

> Hu23VL1(N28D) 서열은 다음과 같다:

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSDGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK

(서열번호 56)

> Hu23VL1(G29A) 서열은 다음과 같다:

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNANTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK

(서열번호 57)

> Hu23VL1(G29V) 서열은 다음과 같다:

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK

(서열번호 58)

> Hu23VL2(N28Q) 서열은 다음과 같다:

DGVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK

(서열번호 59)

> Hu23VL2(N28L) 서열은 다음과 같다:

DGVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSLGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK

(서열번호 60)

> Hu23VL2(N28T) 서열은 다음과 같다:

DGVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK

(서열번호 61)

> Hu23VL2(N28D) 서열은 다음과 같다:

DGVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSDGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK

(서열번호 62)

> Hu23VL2(G29A) 서열은 다음과 같다:

DGVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNANTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK

(서열번호 63)

> Hu23VL2(G29V) 서열은 다음과 같다:

DGVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNVNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK

(서열번호 64)

[표 12] Hu23 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 조합

참고: 표에서 예를 들어 "Hu23-11"은 Hu23VL1(N28T)의 항체 경쇄 가변 영역과 Hu23VH1의 중쇄 가변 영역의 조합을 가지는 항체를 지칭하며, 이하 같다.

상기 표에 언급된 항체 경쇄/중쇄 가변 영역의 조합(예를 들어 Hu23-11)은 각각 항체 경쇄/중쇄 불변 영역과 연결되어 전장 항체를 형성할 수 있다; 본 개시내용에서 달리 명시하지 않는 한, 전장 항체를 형성할 때, 경쇄 가변 영역은 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역과 연결되어 항체 경쇄를 형성하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 72에 기재된 IgG4-AA 중쇄 불변 영역 또는 서열번호 79에 기재된 IgG4-P 중쇄 불변 영역과 연결되어 항체 중쇄를 형성하며, 항체 경쇄/중쇄 가변 영역의 조합을 지칭하는 상기 표의 명칭(예를 들어 Hu23-11)에 접미사 ".IgG4AA"가 붙으면 IgG4-AA 중쇄 불변 영역과 연결하여 형성된 전장 항체를 의미하고, 접미사 ".IgG4P"가 붙으면 IgG4-P 중쇄 불변 영역과 연결하여 형성된 전장 항체를 의미하는 바, 예를 들어, "Hu23-11.IgG4AA"는 Hu23VH1 중쇄 가변 영역과 서열번호 72에 기재된 IgG4-AA 중쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 중쇄, 그리고 Hu23VL1(N28T) 경쇄 가변 영역과 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 경쇄를 연결하여 형성된 전장 항체를 의미한다. "Hu23-11.IgG4P"는 Hu23VH1 중쇄 가변 영역과 서열번호 79에 기재된 IgG4-P 중쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 중쇄, 그리고 Hu23VL1(N28T) 경쇄 가변 영역과 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 경쇄를 연결하여 형성된 전장 항체를 의미한다.

실험 결과는 부위 돌연변이 후 인간화 항체 Hu23LCDR1(N28Q), Hu23LCDR1(N28L), Hu23LCDR1(N28T), Hu23LCDR1(N28D), Hu23LCDR1(G29A) 및 Hu23LCDR1(G29V)가 모두 PD-1에 결합하는 능력을 유지하였음을 보여주었다(표 16).

4.2 Hu32 인간화 항체의 돌연변이 항체

M23으로부터 유래된 일련의 인간화 항체 Hu23 및 M32로부터 유래된 일련의 인간화 항체 Hu32는 서열 분석 결과 높은 서열 동일성을 가졌다. Hu23 경쇄 가변 영역 및 Hu32 중쇄 가변 영역을 새로운 경쇄 및 중쇄 가변 영역 조합으로 조합하였다. 실험 결과는 새로운 경쇄 및 중쇄 가변 영역 조합을 포함하는 인간화 항체가 PD-1 항원에 결합하는 능력을 유지함을 보여주었다(표 16).

[표 13] Hu32 및 Hu23 항체 가변 영역 컨센서스(consensus) 서열의 일반식

[표 14] Hu32 중쇄 가변 영역과 Hu23 경쇄 가변 영역의 조합

참고: 표에서 예를 들어 "Hu32a-85"는 Hu23VL1(N28T)의 항체 경쇄 가변 영역과 Hu32VH6의 중쇄 가변 영역을 가지는 항체를 지칭하며, 이하 같다.

상기 표에 언급된 항체 경쇄/중쇄 가변 영역의 조합(예를 들어 Hu32a-85)은 각각 항체 경쇄/중쇄 불변 영역과 연결되어 전장 항체를 형성할 수 있다; 본 개시내용에서 달리 명시하지 않는 한, 전장 항체를 형성할 때, 경쇄 가변 영역은 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역과 연결되어 항체 경쇄를 형성하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 72에 기재된 IgG4-AA 중쇄 불변 영역 또는 서열번호 79에 기재된 IgG4-P 중쇄 불변 영역과 연결되어 항체 중쇄를 형성하며, 항체 경쇄/중쇄 가변 영역의 조합을 지칭하는 상기 표의 명칭(예를 들어 Hu32a-85)에 접미사 ".IgG4AA"가 붙으면 IgG4-AA 중쇄 불변 영역과 연결하여 형성된 전장 항체를 의미하고, 접미사 ".IgG4P"가 붙으면 IgG4-P 중쇄 불변 영역과 연결하여 형성된 전장 항체를 의미하는 바, 예를 들어, "Hu32a-85.IgG4AA"는 Hu32VH6 중쇄 가변 영역과 서열번호 72에 기재된 IgG4-AA 중쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 중쇄, 그리고 Hu23VL1(N28T) 경쇄 가변 영역과 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 경쇄를 연결하여 형성된 전장 항체를 의미한다. "Hu32a-85.IgG4P"는 Hu32VH6 중쇄 가변 영역과 서열번호 79에 기재된 IgG4-P 중쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 중쇄, 그리고 Hu23VL1(N28T) 경쇄 가변 영역과 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 경쇄를 연결하여 형성된 전장 항체를 의미한다.

[표 15] Hu23 중쇄 가변 영역과 Hu32 경쇄 가변 영역의 조합

참고: 표에서 예를 들어 "Hu23a-57"은 Hu32VL1의 항체 경쇄 가변 영역과 Hu23VH1의 중쇄 가변 영역의 조합을 가지는 항체를 지칭하며, 이하 같다.

상기 표에 언급된 항체 경쇄/중쇄 가변 영역의 조합(예를 들어 Hu23a-57)은 각각 항체 경쇄/중쇄 불변 영역과 연결되어 전장 항체를 형성할 수 있다; 본 개시내용에서 달리 명시하지 않는 한, 전장 항체를 형성할 때, 경쇄 가변 영역은 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역과 연결되어 항체 경쇄를 형성하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 72에 기재된 IgG4-AA 중쇄 불변 영역 또는 서열번호 79에 기재된 IgG4-P 중쇄 불변 영역과 연결되어 항체 중쇄를 형성하며, 항체 경쇄/중쇄 가변 영역의 조합을 지칭하는 상기 표의 명칭(예를 들어 Hu32a-85)에 접미사 ".IgG4AA"가 붙으면 IgG4-AA 중쇄 불변 영역과 연결하여 형성된 전장 항체를 의미하고, 접미사 ".IgG4P"가 붙으면 IgG4-P 중쇄 불변 영역과 연결하여 형성된 전장 항체를 의미하는 바, 예를 들어, "Hu23a-57.IgG4AA"는 Hu23VH1 중쇄 가변 영역과 서열번호 72에 기재된 IgG4-AA 중쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 중쇄, 그리고 Hu32VL1 경쇄 가변 영역과 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 경쇄를 연결하여 형성된 전장 항체를 의미한다. "Hu23a-57.IgG4P"는 Hu23VH1 중쇄 가변 영역과 서열번호 79에 기재된 IgG4-P 중쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 중쇄, 그리고 Hu32VL1 경쇄 가변 영역과 서열번호 73에 기재된 카파쇄 불변 영역을 연결하여 형성된 경쇄를 연결하여 형성된 전장 항체를 의미한다.

5. 인간화 항체의 스크리닝

다양한 인간화 항체의 친화성 검출을 Biacore에 의해 수행하였고(방법에 대해서는 실험예 3 참조), 그 결과를 표 16에 나타내었다. 결과는 다양한 인간화 항체가 PD-1에 결합하는 능력을 유지하고, 일부 인간화 항체는 심지어 그의 뮤린 항체의 친화도에 실질적으로 근접한 친화성을 가진다는 것을 보여주었다.

[표 16] 인간 PD-1에 대한 Hu23 인간화 항체의 친화도

실시예 3. PD-1 인간화 항체의 구축 및 발현

각각의 인간화 항체 VH/VK 유전자 단편을 설계된 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 구축한 후, 이를 사용하여 발현 벡터 pHr(신호 펩티드 및 불변 영역 유전자(CH1-Fc/CL) 단편 포함)과의 상동 재조합에 의해 VH-CH1-Fc-pHr/VK-CL-pHr 벡터를 발현하는 전장 항체를 구축하였다. IgG4-P는 S228P(서열번호 72 또는 서열번호 79의 108번 위치에 해당) 돌연변이를 나타내고, IgG4-AA는 F234A(서열번호 72 또는 서열번호 79 서열의 114번 위치에 해당), L235A(서열번호 72 또는 서열번호 79의 115번 위치에 해당) 및 S228P(서열번호 72 또는 서열번호 79의 108번 위치에 해당) 돌연변이를 나타낸다. IgG4-AA 및 IgG4-P 항체 형식은 IgG4 항체 형식에서 단순 점 돌연변이를 통해 얻을 수 있다.

IgG4-AA 중쇄 불변 영역의 서열은 다음과 같다(서열번호 72):

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK.

항체 경쇄(카파쇄) 불변 영역의 서열은 다음과 같다(서열번호 73):

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

구축된 IgG4AA 형태의 전장 항체 서열은 다음과 같이 예시된다:

Hu23-11.IgG4AA 항체 중쇄(서열번호 74):

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYEMHWVRQAPGQGLEWMGLIDPETGGTVYNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARERFSYYGSTSDWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK.

Hu23-11.IgG4AA 경쇄(서열번호 75):

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

Hu32a-85.IgG4AA 중쇄(서열번호 76):

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASDFTFTDYEIHWVKQAPGHGLEWIGLFDPETGGIVYNQKFKGKATLTADKSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCTREGYNRDWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK.

Hu32a-85.IgG4AA 경쇄(Hu23-11.IgG4AA 경쇄와 동일함, 서열번호 75):

Hu33-6.IgG4AA 중쇄(서열번호 77):

KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGVDTYYQDNVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPYGHGYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK.

Hu33-6.IgG4AA 경쇄(서열번호 78):

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINNFLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

IgG4-P 중쇄 불변 영역의 서열은 다음과 같다(서열번호 79):

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK.

구축된 IgG4-P 형태의 전장 항체의 서열은 다음과 같이 예시된다:

Hu23-11.IgG4P 항체 중쇄(서열번호 80):

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYEMHWVRQAPGQGLEWMGLIDPETGGTVYNQKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARERFSYYGSTSDWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK.

Hu23-11.IgG4P 경쇄(Hu23-11.IgG4AA 경쇄와 동일함, 서열번호 75):

Hu32a-85.IgG4P 중쇄(서열번호 81):

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASDFTFTDYEIHWVKQAPGHGLEWIGLFDPETGGIVYNQKFKGKATLTADKSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCTREGYNRDWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK.

Hu32a-85.IgG4P 경쇄(Hu23-11.IgG4AA 경쇄와 동일함, 서열번호 75):

Hu33-6.IgG4P 중쇄(서열번호 82):

KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGVDTYYQDNVQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPYGHGYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK.

Hu33-6.IgG4P 경쇄(Hu33-6.IgG4AA 경쇄와 동일함, 서열번호 78):

실험예

실험예 1. 시험관 내 PD-1 리간드에 대한 항-PD-1 항체 결합 및 결합 차단의 ELISA 실험

종양 세포 표면의 PD-L1은 T 세포 표면의 PD-1과 결합하여 T 세포 증식을 억제한다. PD-1 항체는 PD-1에 결합하여 PD-L1/PD-1 신호전달 경로를 차단함으로써 T 세포 증식을 자극할 수 있다. PD-1/PD-L1 결합 차단 실험을 사용하여 신호 전달 경로에 대한 항-PD-1 항체의 차단 활성을 검출하였다.

본 실험에서, 96-웰 플레이트에 PD-1-His 단백질(Cat.# 10377H08H, Sino Biological)을 코팅한 후, 시험하고자 하는 항-PD-1 항체(항체: Hu23-11.IgG4AA, Hu32a-85.IgG4AA 및 Hu33-6.IgG4AA, 양성 대조군 항체: H005-1(WO2015085847의 H005-1 항체 참조) 포함)을 별도로 첨가하고 반응물을 인큐베이션하였다; 나중에, HRP-표지된 염소 항-인간 IgG(H+L) 항체(Cat. #109-035-003, Jackson ImmunoResearch)를 첨가하고 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후, HRP-표지된 염소 항-인간 IgG(H+L)의 결합량을 검출하였고, 리간드 PD-1에 대한 항-PD-1 항체의 결합의 EC₅₀ 값을 계산하였다.

본 실험에서, 96-웰 플레이트에 세포외 영역에서 Fc와 융합된 PD-1 단백질(PD-1-Fc, 서열은 서열번호 1 참조)을 코팅한 후, 시험하고자 하는 항-PD-1 항체(항체: Hu23-11.IgG4AA, Hu32a-85.IgG4AA 및 Hu33-6.IgG4AA, 양성 대조군 항체: H005-1(WO2015085847의 H005-1 항체 참조) 포함)를 별도로 첨가하고 인큐베이션하였다; 나중에, 비오틴-표지된 PD-L1/PD-L2를 첨가하고 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후, 비오틴-표지된 PD-L1/PD-L2의 결합량을 검출하였고, PD-L1/PD-L2에 대한 리간드의 결합을 차단하는 항-PD-1 항체의 IC₅₀ 값을 계산하였다.

CB 완충액 pH 9.6(1 L 증류수에 용해된 1.59 g Na₂CO₃ 및 2.93 g NaHCO₃)을 사용하여 PD-1-Fc를 1 μg/ml로 희석하고, 이를 96-웰 플레이트에 100 μl/웰의 부피로 첨가한 후 4℃에서 16시간 내지 20시간 동안 그대로 두었다. 96-웰 플레이트로부터 PBS 완충액을 흡인하고, 플레이트를 PBST(0.05% 트윈20을 함유하는 pH 7.4 PBS) 완충액으로 1회 세척하였다. 120 μl/웰 PBST/1% 우유를 첨가하고 차단을 위해 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 차단 용액을 제거하고 플레이트를 PBST 완충액으로 1회 세척하였다. 샘플 희석제(5% BSA, 0.05% 트윈20을 포함하는 pH 7.4 PBS)로 적절한 농도로 희석한 시험하고자 하는 항-PD-1 항체 90 μl를 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 사전 인큐베이션하였다. 10배 농도의 비오틴-표지된 PD-L1/PD-L2(Beijing Sino Biological Co., Ltd.)(10 μg/ml)를 10 μg/웰의 부피로 첨가하고, 진탕기에서 진탕하고 잘 섞은 다음, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 시스템을 제거하고 플레이트를 PBST로 6회 세척하였다. PBST 완충액으로 희석된 100 μl/웰 스트렙트아비딘-퍼옥시다제 중합체 1:400을 첨가하고 실온에서 50분 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 6회 세척하였다. 100 μl/웰 TMB를 첨가하고 실온에서 5-10분 동안 인큐베이션하였다. 100 μl/웰 1 M H₂SO₄를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 450 nm에서의 흡광도 값을 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 판독하고 PD-L1/PD-L2에 대한 리간드의 결합을 차단하는 항-PD-1 항체의 IC₅₀ 값을 계산하였다. 데이터를 하기 표 17에 구체적으로 나타내었다.

[표 17] PD-1에 결합하고 PD-L1/PD-L2에 대한 리간드의 결합을 차단하는 본 개시내용의 항-PD-1 항체의 ELISA

본 개시내용의 예시적인 항-PD-1 항체 Hu23-11.IgG4AA, Hu32a-85.IgG4AA 및 Hu33-6.IgG4AA는 모두 PD-L1/PD-L2에 대한 PD-1의 결합을 효과적으로 차단할 수 있고, 이들의 차단 활성은 양성 대조군 항체의 차단 활성과 유사하다.

실험예 2. 예시적인 항체의 리간드 차단 시험

PD-1과 PD-L1의 결합에 대한 항체의 차단 효과를 연구하였다. 실험과정을 간략히 설명하면 다음과 같다.

CHOK1/PD-L1 세포(Promega)를 분해하고, 96-웰 플레이트에 100 μL/웰로 첨가하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어 24시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군과 샘플을 PBS를 사용하여 원하는 농도로 희석하였다. Jurkat/PD-1 세포(PD-1으로 안정적으로 형질감염된 Jurkat 세포)를 계수하고 CHOK1/PD-L1 세포가 있는 세포 배양 플레이트에 특정 비율(90 μL/웰)로 씨딩하고, 10 μL/웰 희석된 항체(항체: Hu23-11.IgG4AA, Hu32a-85.IgG4AA 및 Hu33-6.IgG4AA, 양성 대조군 항체: H005-1, 음성 대조군: IgG4 단백질, 항체 구배 희석 농도: 0.3 mg/ml, 3 mg/ml, 30 mg/ml)를 첨가하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어 5시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 배양 플레이트를 꺼내어 실온에서 5분 동안 두었다. 그런 다음 50 μl Bio-Glo^TM 시약을 각 웰에 첨가하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후 플레이트를 판독하였다. 실험 결과를 도 1에 나타내었다.

결과는 본 개시내용의 예시적인 항-PD-1 항체 Hu23-11.IgG4AA, Hu32a-85.IgG4AA 및 Hu33-6.IgG4AA가 PD-1와 PD-L1의 결합을 효과적으로 차단할 수 있음을 보여주었다.

실험예 3. 예시적인 항체의 BIAcore 항체 친화성 실험

단백질 A 바이오센서 칩(Cat. # 29127556, GE)을 사용하여 IgG를 친화도 포착하였다. 인간 PD-1 항원(Cat.# 10377H08H, Sino Biological) 및 Cyno PD-1 항원(Sino Biological에서 구매)을 칩의 표면을 가로질러 흘려보내고, Biacore T200 기기를 사용하여 PD-1 항체 및 항원 PD-1 반응 신호의 실시간 검출에 의해 결합 및 해리 곡선을 수득하였다. 각 실험 사이클의 해리가 완료된 후, 바이오센서 칩을 세척하고 10 mM 글라이신-HCl pH 1.5 완충액으로 재생시켰다. 실험 완충액 시스템은 1×HBS-EP 완충 용액(Cat# BR-1001-88, GE)이었다. 실험 후, GE Biacore T200 Evaluation version 3.0 소프트웨어를 사용하여 데이터를 (1:1) Langmuir 모델과 피팅하여 친화도 값을 구하였다. 결과를 표 18에 나타내었다.

[표 18] 인간 PD1 및 유인원 PD-1에 대한 항-PD-1 항체의 친화도

결과는 본 개시내용의 예시적인 항-PD-1 항체 Hu23-11.IgG4AA, Hu32a-85.IgG4AA 및 Hu33-6.IgG4AA가 모두 인간 PD-1 및 유인원 PD-1에 결합할 수 있음을 보여주었다.

실험예 4. PBMC-T 림프구 활성화 실험에서 세포에 의한 IFNγ 분비에 대한 항체의 효과

항-PD-1 항체가 인간 1차 T 림프구의 기능에 미치는 영향을 연구하기 위하여, 인간 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 채취하여 정제하고, 투베르쿨린(TB)으로 5일간 자극한 후, 사이토카인 IFNγ의 분비량을 검출하였다. 실험과정을 간단히 설명하면 다음과 같다:

밀도 구배 원심분리(Stem Cell Technologies)를 위해 Ficoll-Hypaque(17-5442-02, GE)를 사용하여 신선한 혈액으로부터 PBMC를 수득하고, 37℃ 및 5% CO₂에서 10%(v/v) FBS(10099-141, Gibco)가 보충된 RPMI 1640(SH30809.01, GE) 배지에서 배양하였다.

새롭게 단리되고 정제된 PBMC를 RPMI 1640 배지를 사용하여 2×10⁶ 세포/ml의 밀도로 조정하였다. 40 μl 투베르쿨린(97-8800, Synbiotics)을 20 mL 세포 현탁액에 첨가하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 5일 동안 배양하였다. 5일째에, 전술한 배양된 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 새로운 RPMI 1640 배지에 재현탁하고, 1.1×10⁶ 세포/ml의 밀도로 조정하고, 96-웰 세포 배양 플레이트에 웰당 90 μl로 씨딩하였다. 동시에 PBS(B320, Shanghai BasalMedia Technologies Co., Ltd.)로 구배 희석된 항체 샘플(본 개시내용의 항체: Hu23-11.IgG4AA, Hu32a-85.IgG4AA 및 Hu33-6.IgG4AA, 양성 대조군 항체 H005-1, 및 음성 대조군 IgG4 단백질 포함, 항체 구배 희석 농도 0.3 mg/ml, 3 mg/ml 및 30 mg/ml)을 10μl/웰로 첨가하였다. 세포 배양 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어 3일 동안 인큐베이션하였다. 세포 배양 플레이트를 꺼내고 세포 배양 상청액을 원심분리(4000 rpm, 10분)에 의해 수집하였다. ELISA 방법(인간 IFN-γ 검출 키트(EHC102g.96, Neobioscience))을 사용하여 IFN-γ 수준을 검출하였다. 특정 작업에 대해서는 시약 지침을 참조하였다.

시험 결과를 도 2에 나타내었다. 결과는 본 개시내용의 항-PD-1 항체 Hu23-11.IgG4AA, Hu32a-85.IgG4AA 및 Hu33-6.IgG4AA가 모두 IFN-γ 분비를 효과적으로 활성화시킬 수 있음을 보여주었다.

실험예 5. 형질전환 PD-1 마우스에서 결장암 모델 MC38에 대한 항-PD-1 항체의 효과

MC38 세포를 90 마리의 hPD-1 TG 마우스(Biocytogen)의 오른쪽 갈비뼈에 5×10⁵ 세포/마우스/100 μl로 피하(subcutaneously) 접종하였다. 10일 후, 종양이 너무 크거나 너무 작은 동물은 제외시켰다. 약 120 mm³의 평균 종양 부피를 기준으로, 마우스를 무작위로 다음과 같이 나누었다: 블랭크 대조군 비히클(PBS), 양성 대조군 H005-1 3 mpk, Hu32a-85.IgG4AA 1 mpk, Hu32a-85.IgG4AA 3 mpk, Hu23-11.IgG4AA 1 mpk, Hu23-11.IgG4AA 3 mpk 및 Hu33-6.IgG4AA 3 mpk, 총 7개 그룹, 각 그룹 당 8 마리의 동물. 각 그룹의 항체는 0일째부터 시작하여 주 3회 복강내 주사하였다. 투여 첫 주 후, 종양이 유의하게 억제된 것으로 밝혀졌다. 2주와 3주에, 투여 빈도를 주 1회로 조정하여 총 5회 투여하였다. 종양 부피 및 동물 체중을 주 2회 모니터링하고 데이터를 기록하였다. 종양 부피가 2000 mm³를 초과하거나 대부분의 종양이 궤양이 있는 것으로 보이거나 체중이 20% 감소한 경우, 종양을 갖는 동물을 실험 종점으로 안락사시켰다.

종양 부피(TV) = 1/2 × L_long × L_short ²

종양 성장 속도(T/C%) = (T-T0)/(C-C0) × 100%

종양 성장 억제율(TGI%) = 1- T/C %

상기 식에서, T 및 T0는 항체 투여 그룹에서 각각 시험 종료 및 시험 개시시의 종양 부피를 나타내고, C 및 C0는 블랭크 대조군 그룹에서 각각 시험 종료 및 시험 개시시의 종양 부피를 나타낸다.

시험 결과를 표 19 및 도 3에 나타내었다. 시험 결과는 블랭크 대조군과 비교하여 본 개시내용의 항체가 모두 마우스 결장암 MC38 이종이식 종양의 성장을 유의하게 억제할 수 있음을 보여주었다. 그 중, Hu32a-85.IgG4AA-3 mpk 그룹이 가장 높은 종양 억제율을 보였고, 마지막 측정에서 종양 억제율은 77.64%였다. 투여 빈도를 주 3회로 3회 투여한 경우, 7일째 측정에서, 본 개시내용의 항체의 종양 억제율이 모두 양성 대조군 항체 H005-1의 억제율에 비해 유의하게 우수한 것으로 나타났다; 그 후, 투여 빈도를 주 1회로 감소시켰고, 2회 투여 후(21일째), 본 개시내용의 항체의 효능의 차이가 점차 증가하였고, 용량 의존적 방식을 나타내었으며, 그 중 Hu32a-85.IgG4AA는 동일한 용량의 H005-1보다 유의하게 더 우수하였다(p < 0.05). 또한, 종양 보유 마우스는 전체 투여 과정 동안 체중이 꾸준히 증가하여 모든 항-PD-1 항체에 잘 견뎌낼(tolerate) 수 있으며, 명백한 약물-유발 체중 감소 및 기타 증상이 발생하지 않았다.

[표 19] 마우스 결장암 MC38의 종양 성장 억제율(mm³)에 대한 항-PD-1 항체의 효과

실험예 6. 형질전환 PD-1 마우스에서 결장암 모델 MC38에 대한 항-PD-1 항체의 효과

형질전환 PD-1 마우스를 ISIS INNOVATION LIMITED, University Offices, Wellington Square, Oxford OX1 2JD, England 에서 구입하였고, Cephrim Biosciences, Inc.에서 사육하여 5세대 마우스를 얻었다. MC38 세포를 hPD-1 형질전환 마우스(반은 암컷 및 반은 수컷)에 5×10⁵개 세포/100 μl/동물로 오른쪽 갈비뼈 뒤에서 피하로 접종하였다. 마우스의 평균 종양 부피가 80-100 mm³에 도달했을 때, 체중 또는 종양이 너무 크거나 너무 작은 동물은 제외시켰다. 종양 부피에 따라, 종양 보유 마우스를 무작위로 다음의 5개 그룹(각각 8 마리 동물)으로 나누었다: 음성 대조군 hIgG 대조군 30mpk, H005-1 10 mpk, H005-1 30 mpk, Hu33-6.IgG4AA 10 mpk 및 Hu33-6.IgG4AA 30 mpk. 그룹핑 및 투여 날을 Day 0으로 설정하였다. 그룹핑 후, 22일의 기간 동안 각 약물을 이틀에 1회, 총 11회 복강내 투여하였다. 종양 부피를 주 2회 측정하고, 체중을 측정하고, 데이터를 기록하였다. 각 그룹의 동물 체중과 종양 부피는 모두 평균±표준편차(Mean±SEM)로 표시하였으며, Graphpad Prism 5와 Excel 소프트웨어를 사용하여 그래프를 작성하였으며, 통계분석에는 Student t test를 사용하였다.

종양 부피(TV) = 0.5236 × L_long × L_short ²

종양 성장 속도 T/C% = (T-T0)/(C-C0) × 100%

종양 성장 억제율 %TGI = 1- T/C %

시험 결과를 표 20 및 도 4에 나타내었다. 시험 결과는 대조군과 비교하여 본 개시내용의 항체가 마우스 결장암 MC38의 이종이식 종양의 성장을 유의하게 억제할 수 있음을 보여주었다. 그 중, Hu33-6.IgG4AA-30 mpk 그룹이 가장 높은 종양 억제율을 보였고, Day 20에서 종양 억제율이 80.4%였다. 저용량 그룹(10 mpk)에서, Hu33-6.IgG4AA-10 mpk의 효능이 양성 대조군 H005-1-10 mpk의 효능보다 우수하다.

[표 20] 마우스 결장암 MC38의 종양 부피에 대한 항-PD-1 항체의 효과

참고: 표에서 각 그룹의 평균 종양 부피의 단위는 mm³이다.

실시예 7. 사이노몰구스 원숭이에서 항-PD-1 항체의 약동학 시험

실험에 사용된 사이노몰구스 원숭이는 2-5세, 2-5 kg의 수컷 6 마리로, Guangdong Frontier Biotechnology Co., Ltd., 라이센스 번호: SCXK (Guangdong) 2015-0037, 동물 증명서 번호: 44613900000219에서 구입하였다.

수용 환경: 실내 온도는 18℃-26℃로 제어하였고, 상대 습도는 40%-70% 였으며, 조명은 12시간 동안 교대로 밝고 어둡게 하였다. 금식이 필요한 경우를 제외하고, 마우스는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다.

투여 전에 동물의 체중을 측정하였고, 체중은 2.81 내지 3.52 kg이었다. 투여는 앞다리 또는 뒷다리에 피하 정맥 주입을 위한 주입 펌프를 사용하여 수행하였다. 각 그룹의 용량은 모두 1 mg/kg(1 mpk)이었고, 약 30분의 투여 기간 동안 0.1 mL/kg/분의 속도로 1회 정맥 주사로 투여하였다. 투여 전 및 정맥 주입 시작 후 5분, 0.25시간, 0.5시간 (투여를 종료한 직후), 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 10일, 13일, 14일, 21일 및 28일에 뒷다리 정맥에서 동물의 전혈을 채취하여 혈청을 분리하였다. 이 중, 투여 전과 정맥 주입 시작 후 14일, 21일 및 28일에 약 2 mL의 전혈을 채취하였고, 나머지 채혈 시점에서는 약 1 mL의 전혈을 채취하였다. 혈청 내 혈중 약물 농도를 ELISA로 검출하고 약동학 분석을 수행하였다. 결과를 표 21에 나타내었다.

[표 21] 사이노몰구스 원숭이에서 인간화 항-PD1 항체의 약동학

결과는 Hu23-11.IgG4AA 및 Hu33-6.IgG4AA가 우수한 약동학적 활성을 가짐을 보여주었다.

명료한 이해를 위해, 전술한 본 발명은 도면 및 실시예를 통해 상세하게 설명되었지만, 설명 및 실시예는 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문서의 공개 내용은 참조로서 완전하고 명확하게 통합되었다.

SEQUENCE LISTING <110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO., LTD. SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> ANTI-PD-1 ANTIBODY, ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF AND PHARMACEUTICAL USE THEREOF <130> 2019 <160> 82 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 401 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> DOMAIN <223> Human PD-1-IgG1Fc sequence <400> 1 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn 20 25 30 Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn 35 40 45 Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu 50 55 60 Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala 65 70 75 80 Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val 85 90 95 Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala 100 105 110 Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala 115 120 125 Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr 130 135 140 Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr 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Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Gly Lys 450 <210> 75 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> DOMAIN <223> Hu23-11.IgG4AA/Hu32a-85.IgG4AA/Hu23-11.IgG4P/Hu32a-85.IgG4P light chain sequence <400> 75 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 76 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> DOMAIN <223> Hu32a-85.IgG4AA heavy chain sequence <400> 76 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 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Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 77 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> DOMAIN <223> Hu33-6.IgG4AA heavy chain sequence <400> 77 Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Val Asp Thr Tyr Tyr Gln Asp Asn Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Tyr Gly His Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 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Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 79 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> DOMAIN <223> IgG4-P heavy chain constant region sequence <400> 79 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 80 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> DOMAIN <223> Hu23-11. IgG4P antibody heavy chain sequence <400> 80 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Phe Ser Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Asp Trp Tyr Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 130 135 140 Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys 195 200 205 Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 210 215 220 Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Gly Lys 450 <210> 81 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> DOMAIN <223> Hu32a-85. IgG4P heavy chain sequence <400> 81 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Phe Asp Pro Glu Thr Gly Gly Ile Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Tyr Asn Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 82 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <221> DOMAIN <223> Hu33-6. IgG4P heavy chain sequence <400> 82 Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Val Asp Thr Tyr Tyr Gln Asp Asn Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Tyr Gly His Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445

Claims

중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
여기서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 65에 기재된 HCDR1, 서열번호 66에 기재된 HCDR2, 및 서열번호 67에 기재된 HCDR3을 포함하고; 및
경쇄 가변 영역은 서열번호 68에 기재된 LCDR1, 서열번호 12에 기재된 LCDR2, 및 서열번호 69에 기재된 LCDR3을 포함하며;
바람직하게는,
중쇄 가변 영역은 서열번호 8에 기재된 HCDR1, 서열번호 9에 기재된 HCDR2, 및 서열번호 10에 기재된 HCDR3을 포함하고; 및
경쇄 가변 영역은 서열번호 12에 기재된 LCDR2, 서열번호 13에 기재된 LCDR3, 및 일반식 RSSQSX₁₃VHSX₁₄X₁₅X₁₆TYLE(서열번호 68)에 기재된 LCDR1을 포함하며, 여기서 X₁₃은 L이고, X₁₄는 N, Q, L, T 및 D로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, X₁₅는 G, A 및 V로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 및 X₁₆은 N이다.
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
여기서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합은 하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나로부터 선택되고:
(a) 각각 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
각각 서열번호 12 및 서열번호 13에 기재된 LCDR2 및 LCDR3, 및 서열번호 11, 47, 48, 49, 50, 51 또는 52에 기재된 LCDR1을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(b) 각각 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
각각 서열번호 17, 서열번호 12 및 서열번호 18에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) 각각 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 23에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
각각 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(d) 각각 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
각각 서열번호 12 및 서열번호 13에 기재된 LCDR2 및 LCDR3, 및 서열번호 11, 47, 48, 49, 50, 51 또는 52에 기재된 LCDR1을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(e) 각각 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
각각 서열번호 17, 서열번호 12 및 서열번호 18에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
바람직하게는, 항-PD-1 항체가 하기에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함한다:
(a1) 각각 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
각각 서열번호 49, 서열번호 12 및 서열번호 13에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(a2) 각각 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 23에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
각각 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
하기 iv) 내지 vi) 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
iv) 서열번호 4에 기재된 중쇄 가변 영역의 서열과 동일한 서열을 가지는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 5에 기재된 경쇄 가변 영역의 서열과 동일한 서열을 가지는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
v) 서열번호 6에 기재된 중쇄 가변 영역의 서열과 동일한 서열을 가지는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 7에 기재된 경쇄 가변 영역의 서열과 동일한 서열을 가지는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
vi) 서열번호 19에 기재된 중쇄 가변 영역의 서열과 동일한 서열을 가지는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 20에 기재된 경쇄 가변 영역의 서열과 동일한 서열을 가지는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 뮤린 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 완전 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제4항에 있어서, 항-PD-1 항체가 인간화 항체이고, 상기 인간화 항체는 인간 항체로부터 유래된 프레임워크 영역 또는 이의 프레임워크 영역 변이체를 포함하며;
프레임워크 영역 변이체는 인간 항체의 경쇄 프레임워크 영역 및/또는 중쇄 프레임워크 영역 각각에 최대 11개의 아미노산 역 돌연변이(back mutation)를 가지고,
바람직하게는, 프레임워크 영역 변이체가 하기 (f) 내지 (h) 중 어느 하나로부터 선택되는 돌연변이(들)를 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
(f) 경쇄 가변 영역에 포함된 2G 아미노산 역 돌연변이, 및/또는
중쇄 가변 영역에 포함된 27Y, 48I, 67T, 69L, 82F 및 93T로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 역 돌연변이;
(g) 경쇄 가변 영역에 포함된 2V 아미노산 역 돌연변이, 및/또는
중쇄 가변 영역에 포함된 26D, 27F, 30T, 38K, 43H, 48I, 66K, 67A, 69L, 82F 및 93T로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 역 돌연변이; 및
(h) 경쇄 가변 영역에 포함된 42G, 44V 및 71Y로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 역 돌연변이, 및/또는
중쇄 가변 영역에 포함된 1K 및/또는 94S 아미노산 역 돌연변이;
여기서 아미노산 위치는 Kabat 기준에 따라 넘버링되고 결정된 것이다.
제4항에 있어서, 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합이 하기 (i) 내지 (o) 중 어느 하나로부터 선택되고:
(i) 서열번호 4에 기재된 서열과 같거나 서열번호 4와 적어도 90%의 서열 동일성(identity)을 가지는 중쇄 가변 영역, 및/또는
서열번호 5에 기재된 서열과 같거나 서열번호 5와 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역;
(j) 서열번호 6에 기재된 서열과 같거나 서열번호 6과 적어도 90%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역, 및/또는
서열번호 7에 기재된 서열과 같거나 서열번호 7과 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역;
(k) 서열번호 19에 기재된 서열과 같거나 서열번호 19와 적어도 90%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역, 및/또는
서열번호 20에 기재된 서열과 같거나 서열번호 20과 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역;
(l) 서열번호 27, 30, 31 또는 32에 기재된 서열과 같거나, 서열번호 27, 30, 31 또는 32와 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역, 및/또는
서열번호 28, 29, 34, 35, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 또는 64에 기재된 서열과 같거나, 서열번호 28, 29, 34, 35, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 또는 64와 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역;
(m) 서열번호 33, 36, 37, 38, 39 또는 40에 기재된 서열과 같거나, 서열번호 33, 36, 37, 38, 39 또는 40과 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역, 및/또는
서열번호 34, 35, 28, 29, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 또는 64에 기재된 서열과 같거나, 서열번호 34, 35, 28, 29, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 또는 64와 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역;
(n) 서열번호 41, 45 또는 46에 기재된 서열과 같거나, 서열번호 41, 45 또는 46과 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역, 및/또는
서열번호 42, 43 또는 44에 기재된 서열과 같거나, 서열번호 42, 43 또는 44와 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역; 및
(o) 서열번호 70에 기재된 서열과 같거나 서열번호 70과 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역, 및/또는
서열번호 71에 기재된 서열과 같거나 서열번호 71과 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역;
바람직하게는, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 조합이 하기 중에서 선택되는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
(p) 서열번호 27에 기재된 서열과 같거나 서열번호 27과 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역, 및/또는
서열번호 55에 기재된 서열과 같거나 서열번호 55와 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역; 또는
(q) 서열번호 46에 기재된 서열과 같거나 서열번호 46과 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 영역, 및/또는
서열번호 43에 기재된 서열과 같거나 서열번호 43과 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 경쇄 가변 영역.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 항체 불변 영역을 추가로 포함하고; 바람직하게는, 항체 불변 영역의 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 불변 영역 및 이들의 통상적인 변이체로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 항체 불변 영역의 경쇄 불변 영역은 인간 항체 κ 및 λ쇄 불변 영역 및 이들의 통상적인 변이체로 이루어진 그룹 중에서 선택되며; 보다 바람직하게는, 항체가 서열번호 72 또는 79에 기재된 중쇄 불변 영역 및 서열번호 73에 기재된 경쇄 불변 영역을 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 항체가 서열번호 78에 기재된 경쇄 및 서열번호 77 또는 82에 기재된 중쇄를 포함하거나; 또는 항-PD-1 항체가 서열번호 75에 기재된 경쇄 및 서열번호 74, 76, 80 또는 81에 기재된 중쇄를 포함하고; 바람직하게는, 항-PD-1 항체가
서열번호 74에 기재된 중쇄 및 서열번호 75에 기재된 경쇄; 또는
서열번호 77에 기재된 중쇄 및 서열번호 78에 기재된 경쇄를 포함하는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')₂, 단일쇄 항체(single-chain antibody, scFv), 이량체화된(dimerized) V 영역(디아바디(diabody)) 및 이황화(disulfide) 결합 안정화된 V 영역(dsFv)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 이중특이성 항체, 다중특이성 항체 또는 항체 융합 단백질인, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 인간 PD-1에 경쟁적으로 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
치료학적 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 치료학적 유효량의 제11항에 따른 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 완충제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하거나, 또는 제11항에 따른 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산 분자.
제13항에 따른 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하는 단계, 또는
제11항에 따른 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하는 단계를 포함하는, PD-1의 면역검출(immunodetection) 또는 결정(determination) 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제11항에 따른 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 키트.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제11항에 따른 단리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제12항에 따른 약제학적 조성물, 또는 제13항에 따른 핵산 분자의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, PD-1과 관련된 질환을 치료하는 방법;
여기서, 질환은 바람직하게는 종양(tumor)이고; 보다 바람직하게는 질환은 두경부 편평 세포 암종(head and neck squamous cell carcinoma), 두경부암, 뇌암, 신경교종(glioma), 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme), 신경모세포종(neuroblastoma), 중추신경계 암, 신경내분비 종양(neuroendocrine tumor), 인두암(pharyngeal cancer), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 식도암(esophageal cancer), 갑상선암, 악성 흉막 중피종(malignant pleural mesothelioma), 폐암, 유방암, 간암, 간종(hepatoma), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), 간담도암(hepatobiliary cancer), 췌장암, 위암, 위장관암(gastrointestinal cancer), 대장암, 결장암, 결장직장암, 신장암, 투명세포신세포암(clear cell renal cell carcinoma), 난소암, 자궁내막암(endometrial cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 방광암, 전립선암, 고환암, 피부암, 흑색종(melanoma), 백혈병, 림프종, 골암(bone cancer), 연골육종(chondrosarcoma), 골수종(myeloma), 다발성 골수종, 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 골수증식성 신생물(myeloproliferative neoplasm), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 전신 경쇄 아밀로이드증(systemic light chain amyloidosis) 및 메르켈 세포 암종(Merkel cell carcinoma)으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고; 보다 바람직하게는, 림프종은 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 원발성 종격동 거대 B-세포 림프종(primary mediastinal large B-cell lymphoma), 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma), 소림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma), T-세포/조직구 풍부 거대 B-세포 림프종(T-cell/histiocyte rich large B-cell lymphoma) 및 림프형질구성 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma)으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 폐암은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer) 및 소세포폐암(small cell lung cancer)으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되며, 백혈병은 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프구성(lymphocytic) 백혈병, 림프모구성(lymphoblastic) 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 골수성 백혈병으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고; 가장 바람직하게는, 질환은 PD-L1 양성 흑색종, 폐암, 비소세포폐암, 유방암, 위암, 신장암, 방광암, 대장암 및 결장암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.