KR20210119047A

KR20210119047A - 새우흰반점바이러스 감염병 진단용 키트

Info

Publication number: KR20210119047A
Application number: KR1020200035410A
Authority: KR
Inventors: 이형우; 배윤희
Original assignee: 이형우
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2020-03-24
Publication date: 2021-10-05
Also published as: KR102384510B1

Abstract

본 발명은 새우흰반점바이러스(WSSV)를 고가의 장비 없이 비전문가도 손쉽고 신속하면서 정확하게 진단할 수 있는 키트 및 방법을 제공함으로써 수산물 정밀 검역에 소요되는 시간 및 공정을 줄여줄 뿐 만 아니라 새우 경작지에 심각한 폐사를 일으키는 원인이 되는 상기 바이러스의 감염 및 확산을 조기에 차단하여 비용 측면에서도 경제적인 효과를 기대할 수 있다.

Description

새우흰반점바이러스 감염병 진단용 키트{A kit for diagnosing infection of white spot syndrome virus}

본 발명은 새우 경작지에 심각한 폐사의 문제를 일으키는 원인이 되는 바큐로바이러스(Baculovirus)의 일종인 새우흰반점바이러스를 민감도 있게 검출하는 WSSV 진단용 프라이머 또는 프로브 세트를 포함하는 키트에 관한 것이다.

흰반점증후군바이러스(white spot syndrome virus; WSSP)는 니마비리대과(Nimaviridae) 위스포바이러스속(Whispovirus)에 속하는 병원균으로 흰반점병(white spot disease; WSD)의 원인이 되는 바이러스에 해당한다. 또한, 흰반점증후군바이러스(WSSV)는 이중 가닥 DNA 바이러스이며, 외피 바이러스 입자의 크기는 길이 240 내지 380nm, 직경은 70 내지 159nm이고, 유전체의 길이는 290 내지 305kb에 이르는 것으로 VP35, VP28, VP19, VP26, VP24의 5개의 주요 단백질로 구성되어 있는 것이 특징이다.

국제수역사무국(OIE)는 WSSV 감염 숙주로서 해수, 기수 및 담수에서 서식하는 새우류, 게, 가재 등을 포함하는 넓은 범위의 수생 갑각류를 정의하고 있으며, 이와 더불어 야생 갑각류 및 조개류 등을 질병 매개체로 지정하였다. 이 바이러스로 인한 최초의 전염병은 1992년 대만에서 발생한 것이지만 흰반점 증후군으로 인한 피해에 대한 보고는 1993년 중국에서 나왔으며, 같은 해 일본과 한국에서 1994년에 태국, 인도, 말레이시아가 발생했으며 1996년에는 동아시아와 남아시아에 심각한 영향을 미쳤다. 1995년 말 미국, 1998년 중남미, 1999년 멕시코, 2000년 필리핀, 2011년 사우디 아라비아에서 보고되었다. 이 바이러스는 최근 2016년 11월 호주 퀸즐랜드에서 발견된 것으로 보고되었다.

이렇듯 흰반점증후군바이러스 감염증은 치명적이고 전염성이 매우 강해 일부 집단 새우 발병으로 전제 집단 대량 폐사를 일으켜 수산업에 큰 피해를 줄 수 있으며, 이에 대한 치료제 또한 없는 실정인 만큼 감염시 조기에 진단을 함으로써 대량 폐사를 막는 것이 무엇보다 중요하다 할 것이다.

종래의 기술에서는 새우흰반점바이러스 감염증 진단을 위해 임상적 특징, 감염균주의 분리 및 동정, 간접면역형광법(indirect immunofluorescence assay; IFA)에 의한 혈원형 분석(serotyping) 및 PCR 증폭에 의한 유전형 분석 등을 사용하였다. 또한, 등록특허 제 10-1503511호에는 새우흰반점바이러스의 진단용 프라이머 세트와 이를 포함하는 키트를 이용하는 방법에 대하여 기재하고 있다. 하지만 상기 방법인 일반 PCR법은 통상적으로 여러 감염증의 진단에 사용되지만 최소 2시간 이상이 소요되며, 프라이머의 길이도 21 내지 24bp로서 특이도, 민감도 면에서 떨어질 수 있으며, 초기에 진단하기 어렵고, 교차반응이 일어나며, 결과의 해석에 숙련된 전문가가 필요하다는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 RPA법을 이용하여 비전문가도 손쉽게 보다 높은 정확도로 검출 가능하고 다양한 변이에 대응할 수 있는 서열의 새우흰반점바이러스 감염증에 대한 효과적인 진단용 키트를 고안하였다.

본 발명의 목적은 바큐로바이러스(Baculovirus)의 일종인 새우흰반점바이러스(white spot syndrome virus; WSSV)에 의한 감염증을 진단하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 새우흰반점바이러스(WSSV) 감염증의 원인 유전자 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 새우흰반점바이러스(WSSV) 감염증의 진단 마커용 변이 유전자를 제공한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구현예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구현예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구현예" 또는 "구현예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구현예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구현예" 또는 "구현예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구현예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서 내에 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 일 구체예에서, "재조합효소 중합효소 증폭 반응(Recombinase polymerase amplification; RPA)”이란 핵산의 빠른 등온 증폭을 위한 방법이다. 일정한 온도에서 사용되는 효소와 단백질(재조합효소, 단일 가닥 결합 단백질 및 가닥 이동성 DNA 중합효소(strand displacing DNA polymerase))의 특정 조합에 의존하여 증폭한다. 엑소-프로브를 통해 RPA 증폭산물의 실시간 검출이 가능하다. 형광 물질은 혼성화된 엑소-프로브의 내부 무염기 부위 유사체(abasic site mimic, 예를 들어 테트라하이드로퓨란 (THF)을 들 수 있다)에서 엑소뉴클레아제 III 절삭을 통한 형광단(fluorophore) 및 소광물질(quencher) 등을 사용할 수 있다. 형광 신호는 랩톱(ESEQuant Tubescanner 장치, Qiagen Lake Constance GmbH, Stockach, Germany)을 포함하는 무게가 1.2kg인 현장 진단 스캐너를 통해 실시간으로 측정된다. 예를 들어, 비오틴 또는 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)로 표지된 역방향 프라이머를 사용하여 분석에 필요한 단계 수를 줄이기 위해 다른 표지 전략의 사용을 조사한 것이다. 사용된 증폭 온도를 최적화하고 표면 차단제를 사용하고자 한 방법이다. 이러한 변화의 조합은 1 * 10^-15 M의 검출 한계(LOD)를 낮추어 훨씬 더 신속한 증폭 및 검출 프로토콜을 용이하게 한 방법이다(J. Clin. Microbiol., 50 (2012), pp. 2234-2238). 역전사 재조합효소 중합효소 증폭(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RPA)은 상기한 RPA 방법에서 역전사 효소를 첨가한 것이다.

본 발명의 일 구체예에서, "프라이머(primer)"란 짧은 서열의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로서 목적하는 DNA 또는 RNA의 반대편 가닥의 상보적 위치에 특이적으로 부착되어 유전자의 증폭(amplification)을 개시하는 역할을 하는 올리고뉴클레오티드로서, 바람직하게는 새우흰반점바이러스의 VP28 유전자를 타깃으로 하는 특이적 항원 유전자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 유사한 서열일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, "프로브(probe)"란, 목적하는 유전자에 특이적으로 부착되어 목적 유전자를 확인 및/또는 검출하는 탐침자를 포괄적으로 포함하는 광의의 개념이며, 바람직하게는 새우흰반점바이러스의 VP28 유전자를 타깃으로 특이적 항원 유전자에 특이적으로 결합하는 화합물, 항체, 단백질, 올리고뉴클레오티드 등 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열 5'-CATCACTGCTGT GATCAGGCTACTTCAAGA [FAM-dT] G [THF] C [BHQ-dT] GATGTGTCCTTTGA-[3'-block]의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 서열의 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 유사한 서열일 수 있다. 또한, 상기 프로브는 용이한 검출을 위한 표지를 하나 이상 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, "키트(kit)"란 새우흰반점바이러스의 DNA 또는 RNA를 증폭 및/또는 검출하여 새우흰반점바이러스 감염 여부를 예측할 수 있는 검진용 기기를 의미하며, 새우흰반점바이러스에 감염되었을 것으로 의심되는 대상체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 새우흰반점바이러스의 감염 여부를 확인할 수 있는 형태라면 제한이 없다. 바람직하게는 새우흰반점바이러스의 VP28 유전자를 타깃으로 특이적 항원 유전자에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브 또는 프라이머 세트를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 본 발명의 프라이머 세트를 포함할 수 있으며, 또는 새우흰반점바이러스에 특이적으로 결합하는 항체(antibody) 또는 앱타머(aptamer)를 포함하는 형태일 수 있으나, 새우흰반점바이러스의 DNA를 증폭 및/또는 검출하여 새우흰반점바이러스 감염 여부를 예측할 수 있는 형태라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, "검출(detection)"이란 새우흰반점바이러스에 감염되었을 것으로 의심되는 대상체의 감염 여부를 판단하는 방법에 관한 것으로서, 상기 균의 단백질, DNA, 또는 RNA를 확인하여 감염 여부를 확인하는 방법을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, "생물학적 시료(biological sample)"란 새우흰반점바이러스에 감염된 대상체에서 상기 새우흰반점바이러스의 단백질, DNA, 또는 RNA를 포함하고 있는 모든 시료를 의미하며, 상기 대상체는 바람직하게는 갑각류 등일 수 있으며, 보다 바람직하게는 새우일 수 있으나, 상기 새우흰반점바이러스의 단백질, DNA, 또는 RNA를 확인할 수 있는 시료라면 이에 제한되지 않는다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3에 대응하는 프라이머 염기쌍 또는 프로브를 포함하는 새우흰반점바이러스(WSSV) 감염증 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 프라이머 염기쌍은 서열번호 1 및 2이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 프로브는 5'- CATCACTGCTGT GATCAGGCTACTTCAAGA [FAM-dT] G [THF] C [BHQ-dT] GATGTGTCCTTTGA-[3'-block]이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 새우흰반점바이러스는 바큐로바이러스(Baculovirus)의 일종에 해당하는 감염 질환에 의한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 프라이머쌍은 검체 내의 새우흰반점바이러스를 검출하는 용도로 사용되는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3에 대응하는 프로브 또는 프라이머 염기쌍을 시료에 첨가하는 단계를 포함하는 인비트로상(in-vitro)에서 새우흰반점바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 프로브는 5'- CATCACTGCTGT GATCAGGCTACTTCAAGA [FAM-dT] G [THF] C [BHQ-dT] GATGTGTCCTTTGA-[3'-block]이다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 프라이머 염기쌍은 서열번호 1 및 2이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 시료로 재조합효소 중합효소 증폭 (recombinase polymerase amplification, RPA)하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 RPA 단계에서 반응 온도는 37℃ 내지 42℃이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 RPA 단계에서 반응 시간은 10분 내지 20분이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 새우흰반점바이러스는 바큐로바이러스(Baculovirus)의 일종으로서, 새우흰반점바이러스(WSSV) 감염증을 유발하는 것이다.

본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 1, 및 2로 표시되는 프라이머 염기쌍을 포함하는 바큐로바이러스(Baculovirus) 감염병 진단용 키트를 제공하고, 상기 바큐로바이러스는 흰반점증후군바이러스(white spot syndrome virus)인 키트를 제공하며, 상기 키트는 프로브를 추가로 포함하는 것인 키트를 제공하며, 상기 프로브는 5'-CATCACTGCTGT GATCAGGCTACTTCAAGA [FAM-dT] G [THF] C [BHQ-dT] GATGTGTCCTTTGA-[3'-block]인 키트를 제공하며, 상기 키트는 재조합효소 중합효소 증폭 반응(Recombinase polymerase amplification)용인 것인 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 서열번호 1, 및 2로 표시되는 프라이머 염기쌍을 검체에 첨가하는 단계를 포함하는 in-vitro에서 바큐로바이러스를 검출하는 방법을 제공하고, 상기 바큐로바이러스는 흰반점증후군바이러스(white spot syndrome virus)인 방법을 제공하며, 상기 방법은 프로브를 추가로 첨가하는 것인 방법을 제공하며, 상기 프로브는 5'-CATCACTGCTGT GATCAGGCTACTTCAAGA [FAM-dT] G [THF] C [BHQ-dT] GATGTGTCCTTTGA-[3'-block]인 방법을 제공하며, 상기 검출은 재조합효소 중합효소 증폭 반응을 이용하는 것인 방법을 제공하며, 상기 재조합효소 중합효소 증폭의 반응 온도는 37℃ 내지 42℃인 방법을 제공하며, 상기 재조합효소 중합효소 증폭의 반응 시간은 10분 내지 20분인 방법을 제공한다.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명에서 제공하는 새우흰반점바이러스(White spot syndrome virus; WSSP) 감염 진단 키트는 개체에서 새우흰반점바이러스 감염에 대하여 효과적이고 빠르게 검출 및 진단하여, 새우흰반점바이러스 감염에 대한 예방 및 치료 효과를 우수하게 하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 다양한 국가에서 발견된 새우흰반점바이러스(White spot syndrome virus; WSSP)를 VP-28 유전자를 이용하여 각 국가별 일치율의 정도를 분석한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 다양한 국가의 VP-28 유전자를 비교하여 프라이머 프로브를 디자인하기 위한 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 새우흰반점바이러스에 대한 프라이머 및 프로브의 효율을 평가한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 고안된 프라이머(132F/485R primer)를 이용하여 새우흰반점바이러스를 검출하기 위한 일반 PCR법을 수행하여 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 반응 시간에 따라 기본 키트를 이용하여 새우흰반점바이러스를 검출하기 위한 RPA 반응을 비교한 것을 나타내는 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 새우흰반점바이러스(WSSV) 검출용 프라이머 및 프로브 세트의 제조

본 발명자들은 보다 높은 정확도로 새우흰반점바이러스에 대한 검출이 가능하게 하기 위하여 인도, 베트남, 방글라데시, 일본, 미국, 중국, 인도네시아, 태국, 멕시코 및 우리나라 각 국가별 VP-28 유전자를 비교하여 프라이머와 프로브를 디자인하고자 하였다(도 1 및 도 2 참조). 상기 국가 별 유전자의 일치율의 정도를 백분율로 환산하여 나타내었으며, 최종적으로 각 국가별 유전자로부터 디자인된 새우흰반점바이러스 검출용 프라이머 세트 및 프로브는 하기 표 1과 같다.

프라이머	프라이머 시퀀스(5’-3’)	비고
132 F	GATTGCTGTATTTATTGTGATTTTTAGGTATCAC	서열번호 1
485 R	ATACCAGTGATGTTGATCTTTCTTGATGTGTTGTT	서열번호 2
프로브	프로브 시퀀스(5’-3’)	비고
257 P	CATCACTGCTGT GATCAGGCTACTTCAAGA [FAM-dT] G [THF] C [BHQ-dT] GATGTGTCCTTTGA-[3'-block]	-

본 발명자들은 보다 높은 정확도로 새우흰반점바이러스에 대한 검출이 가능하며 다양한 변이에 대응할 수 있는 하기 표 2의 서열(서열번호 3) 및 이의 서열을 포함하는 효과적인 진단용 키트를 고안하였다.

타깃 유전자	시퀀스	비고
VP 28	ATCACTGCTGTGATTGCTGTATTTATTGTGATTTTTAGGTATCACAACACTGTGACCAAGACCATCGAAACCCACACAGACAATATCGAGACAAACATGGATGAAAACCTCCGCATTCCTGTGACTGCTGAGGTTGGATCAGGCTACTTCAAGATGACTGATGTGTCCTTTGACAGCGACACCTTGGGCAAAATCAAGATCCGCAATGGAAAGTCTGATGCACAGATGAAGGAAGAAGATGCGGATCTTGTCATCACTCCCGTGGAGGGCCGAGCACTCGAAGTGACTGTGGGGCAGAATCTCACCTTTGAGGGAACATTCAAGGTGTGGAACAACACATCAAGAAAGATCAACATCACTGGTATGCAGA	서열번호 3

새우흰반점바이러스 DNA를 0.1pg부터 100ng까지 연속 희석(serial dilution)하였다. EXO RT 키트(TwistDx Co. UK)에 상기 프라이머 및 프로브를 혼합하여, 재조합효소 중합효소 증폭(recombinase polymerase amplification, RPA) 반응을 실시하였다. 그러나, 당 업계에 공지되어 있는 것이라면, 상기한 키트에 한정되는 것은 아니다. 상기 RPA 반응은 T8 UV 스캐너 상에서 39℃에서 20분간 반응시켰다. RPA 반응은 10 내지 100 카피(copy) 혹은 1.0pg까지 희석된 바이러스 유전자까지 검출할 수 있도록 높은 민감도를 보유한 것으로 확인되었다. DNA를 1.0pg부터 100ng까지 희석한 모든 샘플이 15분 내지 20분 이내에 양성 반응을 보이는 것을 확인하였다(도 3 참조).

실시예 2: 기존 PCR 방법과 RPA 반응 혼합물 조성 및 반응 조건에 따른 민감도 비교

고안한 프라이머로 실시간 RPA 이외에도 기본 키트를 이용한 전기영동 상에서 유전자 증폭을 확인하는 방법에도 응용 가능한지를 조사하였다. 일반 PCR법에 상기 고안된 132F/485R 프라이머를 이용하여 바이오니아 프리-믹스 키트(Bioneer Pre-Mix kit)로 새우흰반점바이러스 DNA를 0.0001ng에서 100ng으로 연속 희석하여 실험을 수행한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 결과를 참조하면 일반 PCR 법으로 확인한 결과 충분히 육안으로 겔 상에서 관찰 가능하였다. 즉 0.01ng를 로딩한 것까지의 새우흰반점바이러스 DNA를 검출할 수 있었다. 일반 PCR 방법으로는 0.01ng까지 검출이 가능한 것에 비하여, 실시간 재조합효소 중합효소 증폭반응(recombinase polymerase amplification, RPA)에 의해 생성된 증폭산물(amplicon)을 아가로스겔 전기영동으로 확인하였다. 이때, 새우흰반점바이러스 DNA를 0.01pg까지 희석하여 증폭시켰으며 또한, 이로부터 20분 안에 충분한 RPA 증폭이 일어남을 알 수 있었다(도 5 참조). 그 결과 실시간 PCR 기기가 없는 실험실에서 유용한 방법임을 검증하였다.

결론적으로, 본 발명에 따른 방법은 실시간 PCR 기기, T8 UV 스캐너, 또는 T16 스캐너를 이용할 수 없는 새우 사육 현장에서 활용 가능하다는 장점이 있다. 반응 온도 범위가 37℃ 내지 42℃이고, 보다 바람직하게는 39℃에서, 10 내지 100 카피 또는 1.0pg까지의 바이러스 유전자 샘플을 검출할 수 있으며, 새우 양식 현장에서 의심 검체 발생시 고가의 장비 없이 유전자 분리에서부터 결과 분석까지 30분 이내, 바람직하게는 10분 내지 20분 이내로 신속하게 비전문가도 손쉽게 확진할 수 있어 새우흰반점바이러스의 확산 방지에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> LEE, Hyeong Woo <120> A kit for diagnosing infection of white spot syndrome virus <130> PDPB201869 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 132F <400> 1 gattgctgta tttattgtga tttttaggta tcac 34 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 485R <400> 2 ataccagtga tgttgatctt tcttgatgtg ttgtt 35 <210> 3 <211> 370 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> VP28 <400> 3 atcactgctg tgattgctgt atttattgtg atttttaggt atcacaacac tgtgaccaag 60 accatcgaaa cccacacaga caatatcgag acaaacatgg atgaaaacct ccgcattcct 120 gtgactgctg aggttggatc aggctacttc aagatgactg atgtgtcctt tgacagcgac 180 accttgggca aaatcaagat ccgcaatgga aagtctgatg cacagatgaa ggaagaagat 240 gcggatcttg tcatcactcc cgtggagggc cgagcactcg aagtgactgt ggggcagaat 300 ctcacctttg agggaacatt caaggtgtgg aacaacacat caagaaagat caacatcact 360 ggtatgcaga 370

Claims

서열번호 1, 및 2로 표시되는 프라이머 염기쌍을 포함하는, 바큐로바이러스(Baculovirus) 감염병 진단용 키트.
제 1항에 있어서,
상기 바큐로바이러스는 흰반점증후군바이러스(white spot syndrome virus)인, 키트.
제 1항에 있어서,
상기 키트는 프로브를 추가로 포함하는 것인, 키트.
제 3항에 있어서,
상기 프로브는 5'-CATCACTGCTGT GATCAGGCTACTTCAAGA [FAM-dT] G [THF] C [BHQ-dT] GATGTGTCCTTTGA-[3'-block]인, 키트.
제 1항에 있어서,
상기 키트는 재조합효소 중합효소 증폭 반응(Recombinase polymerase amplification)용인 것인, 키트.
서열번호 1, 및 2로 표시되는 프라이머 염기쌍을 검체에 첨가하는 단계를 포함하는, in-vitro에서 바큐로바이러스를 검출하는 방법.
제 6항에 있어서,
상기 바큐로바이러스는 흰반점증후군바이러스(white spot syndrome virus)인, 방법.
제 6항에 있어서,
상기 방법은 프로브를 추가로 첨가하는 것인, 방법.
제 8항에 있어서,
상기 프로브는 5'-CATCACTGCTGT GATCAGGCTACTTCAAGA [FAM-dT] G [THF] C [BHQ-dT] GATGTGTCCTTTGA-[3'-block]인, 방법.
제 6항에 있어서,
상기 검출은 재조합효소 중합효소 증폭 반응을 이용하는 것인, 방법.
제 10항에 있어서,
상기 재조합효소 중합효소 증폭의 반응 온도는 37℃ 내지 42℃인, 방법.
제 10항에 있어서,
상기 재조합효소 중합효소 증폭의 반응 시간은 10분 내지 20분인, 방법.