KR20210098491A - 무작위 올리고뉴클레오티드를 생성하고 그 서열을 결정하는 방법 - Google Patents

무작위 올리고뉴클레오티드를 생성하고 그 서열을 결정하는 방법 Download PDF

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Abstract

무작위 올리고뉴클레오티드는 새롭게 생성된 분자에 존재하는 핵산 염기의 서열에 대한 불완전한 정보로 생성된다. 올리고뉴클레오티드의 서열이 그 후에 결정된 다음, 이러한 올리고뉴클레오티드는 다양한 잠재적 용도를 위해 가공될 수 있다.

Description

무작위 올리고뉴클레오티드를 생성하고 그 서열을 결정하는 방법
관련 출원(들)에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 11월 30일에 출원된 공동-계류중인 미국 임시특허출원번호 62/773,671에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 통합된다.
상이한 핵산을 결합함으로써, 매우 많은 수의 상이한 올리고뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드가 생성될 수 있다. 현재, 이들 분자의 합성은 정확성을 요구하며, 이는 분자에 존재하는 뉴클레오티드 염기의 서열을 올리고뉴클레오티드를 생성하기 이전에 알 수 있도록 하기 위함이다.
일부 경우에, 다수의 무작위 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 고유한 문자 태그로 작용하여, DNA의 개별 분자를 표지할 수 있다. 이 고유한 태깅은 일부 분석에 유용하며, 예를 들어, 증폭 전에 분자를 태깅하여 분석의 정확성을 향상시킨다. Zheng et al. (2014) Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing, Nature Medicine 20:1479-84 참조. 최근 발명은 암호 기법(cryptography)을 위해 고유한 분자 태그를 사용한다(Sawaya의 PCT/US17/058076 출원, PCT 공개 WO 2018/081113 참조). 이 암호 기법 기술은 많은 수의 고유 분자 태그를 생성해야 하고, 또한 이러한 태그의 서열이 알려져야 한다.
따라서, 알려진 서열을 갖는 많은 수의 고유한 올리고뉴클레오티드를 가능한 저렴하고 효율적으로 생성할 필요가 있다.
본원에서 설명된 본 발명은 올리고뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 합성에 관한 것이다. 본원에 설명된 방법은, 올리고뉴클레오티드를 생성하는, 핵산의 무작위 서열의 생성에 관한 것으로, 여기에서 올리고뉴클레오티드의 서열은 생성 후, 전체적으로 또는 부분적으로, 결정될 때까지 알려지지 않는다. 일 양상에서, 본 발명의 특정 구체예는 하기 3 단계를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 생성하는 방법을 포함한다: a) 뉴클레오티드를 분자에 무작위로 첨가하여 올리고뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계; b) 생성된 분자에 존재하는 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계; 및 c) 생성된 분자를 유용한 형태로 가공하는 단계.
무작위 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해, 특정 구체예는 포스포라미디트 화학(phosphoramidite chemistry)을 사용하여 뉴클레오티드를 합성한다. 일부 구체예에서, 포스포라미디트 반응에 대한 제어는 자동화된 기기, 예컨대 반응에 사용되는 화학 시약을 조절하는 미세유체 컬럼, 및/또는 반응을 국소화하기 위해 사용되는 마이크로어레이 및/또는 마이크로웰을 통해 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드를 생성할 때 반응에 사용되는 시약 및/또는 재료를 최소화하기 위해 공간 제어가 사용된다. 공간 제어 방법은 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있으며, 광-기반 반응을 제어하기 위해 사용되는 마이크로미러 장치, 및/또는 반응에 사용되는 시약을 조절하기 위해 사용되는 잉크젯 기술을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 무작위 올리고뉴클레오티드를 생성할 때 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스페라제(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 사용하는 것과 같은 효소 공정을 사용하여 합성된다. 이러한 구체예에서, 효소는 반응을 최적화하고 올리고뉴클레오티드가 무작위로 생성되는 것을 보장하도록 설계될 수 있다.
일부 구체예에서, 비교적 짧은 무작위 올리고뉴클레오티드가 생성된 다음, 무작위로 결합되어 더 긴 무작위 올리고뉴클레오티드를 형성한다. 일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드의 이 무작위 결합은 다단계 과정이며, 여기에서 다수의 짧은 무작위 올리고뉴클레오티드가 결합되어 더 긴 무작위 올리고뉴클레오티드를 형성하고, 이어서 결합되어 더 긴 올리고뉴클레오티드를 형성하고, 원하는 크기의 분자가 생성될 때까지 이러한 방식으로 진행된다.
일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 원하는 것보다 더 긴 길이로 생성된다. 이러한 구체예에서, 생성된 분자는 절단, 분해 및/또는 용해되어 더 짧은 분자를 형성한다.
일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 생성된 후에 크기-분리된다. 이들 구체예 중 일부에서, 원치 않는 크기의 무작위로 생성된 분자는 폐기되거나 더 많은 분자의 무작위 생성을 위한 것과 같은 공정의 이전 단계에서 재사용된다.
일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 다른 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 이러한 구체예에서, 상기 다른 올리고뉴클레오티드는 무작위로 생성된 분자의 적용에 활용되는 기능적 요소의 역할을 할 수 있다. 일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 다른 올리고뉴클레오티드 상에서 직접 생성된다. 예를 들어, 알려진 올리고뉴클레오티드의 세트를 포함하는 마이크로어레이는 올리고뉴클레오티드가 무작위로 생성될 수 있는 기질로 사용될 수 있으며, 그 결과 부분적으로 알려진 서열 및 부분적으로 알려지지 않은 서열을 갖는 분자가 생성된다.
일부 구체예에서, 생성되는 무작위 올리고뉴클레오티드는 부분적으로만 무작위이므로, 분자의 생성 동안, 분자의 일부가 완전히 무작위하지는 않다. 이들 구체예에서, 생성되는 분자의 완전히 무작위하지 않은 측면은 완전히 알려지고, 부분적으로 알려지고, 및/또는 부분적으로 추정될 수 있다.
일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 여과되어 특정 원치 않는 분자를 제거한다. 이러한 원치 않는 분자는 원치 않는 크기 및/또는 원치 않는 서열 조성의 분자, 및/또는 이들 분자의 의도된 용도에 원치 않는 임의의 다른 특성을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 이들의 서열을 결정하기 전에 가공되거나 및/또는 변형되어야 하며, 예를 들어, 이들을 다른 올리고뉴클레오티드에 라이게이션하여 주어진 서열 기술에 사용되는 프로토콜에 적합하게 해야 한다.
무작위로 생성된 분자의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해, 특정 구체예는 무작위 올리고뉴클레오티드가 생성될 때 서열을 직접적으로 결정한다. 즉, 무작위로 생성된 분자의 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드가 분자에 첨가된 직후 또는 얼마 지나지 않은 후에 결정, 측정 또는 업데이트된다. 이러한 구체예에서, 뉴클레오티드를 첨가하는 반응은, 예를 들어 관찰 가능한 반응 부산물을 생성하는 마이크로웰 국소화 반응을 사용하여 직접적으로 관찰될 수 있다.
일부 구체예에서, 무작위로 생성된 분자의 서열은 분자가 전체적으로 생성된 후에 결정된다. 서열의 결정은 특정 장비, 예컨대 Pacific Biosciences의 실시간 시퀀서 및/또는 나노포어 시퀀서가 필요하며, 이는 개별 분자를 정확하게 시퀀싱 할 수 있다. 서열이 결정된 후, 원하는 서열을 갖는 분자가 회수될 수 있다.
일부 경우에, 무작위로 생성된 분자에 존재하는 정확한 뉴클레오티드 서열에 대한 불확실성이 남아있다. 이러한 불확실성은 폴리뉴클레오티드 시퀀싱의 대부분의 적용에 일반적으로 요구되는 낮은 불확실성과 비교하여 상대적으로 높게 유지될 수 있다.
일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드의 고유표시(signature)가 얻어지며, 이는 올리고뉴클레오티드의 서열에 상응하나 분자에 존재하는 뉴클레오티드의 정확한 서열을 나타내지는 않는다. 예를 들어, 무작위 올리고뉴클레오티드는 고유표시를 얻을 수 있는 나노포어를 통과할 수 있다. 이 고유표시는 무작위 올리고뉴클레오티드의 정확한 서열을 얻기에 불충분할 수 있지만, 그럼에도 불구하고 유사한 나노포어 또는 유사한 장치를 통해 다시 보내지는 경우 무작위 올리고뉴클레오티드를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
분리와 같은 방법을 사용하여 크기를 선택함으로써 가공되나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 원치 않는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제거하여 특정 뉴클레오티드 서열에 대해 스크리닝된다. 이러한 구체예에서, 원치 않는 올리고뉴클레오티드에 대해 상보적 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 마이크로어레이와 같은 표면에 또는 올리고뉴클레오티드에 부착된 자기 비드의 사용을 통해 부착될 수 있으며, 이는 원하는 올리고뉴클레오티드로부터 원치 않는 올리고뉴클레오티드를 여과하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 제한 효소를 사용하여 특정 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 절단한다. 이 절단(digestion)은 올리고뉴클레오티드의 크기를 줄여서 이들을 더 작은 올리고뉴클레오티드로 분해한다. 일부 구체예에서, 이러한 더 작은 올리고뉴클레오티드는 크기 선택되고 더 큰 올리고뉴클레오티드로부터 분리될 수 있다.
일부 구체예에서, 무작위로 생성된 올리고뉴클레오티드는 다른 올리고뉴클레오티드 상에 라이게이션되며, 예를 들어 T-A 라이게이션 또는 통상의 기술자에 의해 사용되는 임의의 다른 방법을 사용한다. 이 라이게이션을 사용하여 무작위 올리고뉴클레오티드를 다른 목적을 위해 기술에 통합시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 무작위로 생성된 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이며, 최종 분자가 모두 완전히 이중 가닥이 되도록 상보 가닥이 생성된다. 일부 구체예에서, 상보 가닥은 중합효소 및 무작위 축퇴(degenerate) 프라이머를 사용하여 생성된다. 일부 구체예에서, 생성된 분자는 부분적으로 이중 가닥이고, 프라이머는 나머지 상보 가닥을 생성하기 위해 중합효소에 필요하지 않다.
도 1은 본원에 설명된 바와 같은 기질 상의 무작위 올리고뉴클레오티드의 생성을 위한 작업 흐름도를 도시한다.
도 2는 본원에 설명된 바와 같은 더 작은 올리고뉴클레오티드로부터 무작위 올리고뉴클레오티드의 생성을 위한 작업 흐름도를 도시한다.
도 3A-3C는 본원에 설명된 바와 같은 무작위 올리고뉴클레오티드가 생성될 수 있는 단계, 및 그의 서열이 후속적으로 결정되는 것을 도시한다.
도 4A-4C는 본원에 설명된 바와 같은 무작위 올리고뉴클레오티드가 생성될 수 있는 단계, 및 그의 서열이 후속적으로 결정되는 것을 도시한다.
다양한 구체예가 본원에 설명되며, 통상의 기술자는 본원에 설명된 구체예가 단지 예로서 제공된다는 것을 인식할 것이다. 통상의 기술자는 본 발명에서 벗어나지 않고 본 발명의 특정 양상을 변경, 치환 및/또는 변화시킬 수 있다. 본원에 설명된 본 발명은 특정 물질, 시약 또는 특정 공정에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 용어는 이의 구현에 필요한 본 발명의 양상을 설명하기 위해 사용되며, 제한하려는 의도가 아니다.
본원에서 설명된 기술은 종종 단수 형태 “a”, “an” 또는 “the”를 사용하는 특정 경우를 참조하지만, 단수 형태의 이러한 경우에 대한 언급은 이러한 경우가 별개로 또는 단독으로 발생하는 적용으로 본 발명을 제한하지 않는다. 통상의 기술자는 본 발명의 적용을 위해 이러한 경우가 얼마나 자주 발생해야 하는지, 그리고 이러한 경우가 병렬로 또는 직렬로 발생하는지 여부를 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 분자를 지칭할 때 “무작위(random)” 또는 “무작위로 생성된(randomly-generated)”은 상기 분자가 뉴클레오티드를 분자에 무작위로 첨가하는 것에 의해 생성되었기 때문에 무작위 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드와 같은 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 “올리고뉴클레오티드”는 특정 형태의 당 포스페이트 백본에 의해 서로 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기의 서열을 포함하는 분자를 지칭한다. 서로 연결된 뉴클레오티드의 수는 최소 2개에서 최대 1천개 이상의 임의의 수일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 “올리고뉴클레오티드”는 용어 “폴리뉴클레오티드”와 상호교환 가능하다. 용어 “올리고뉴클레오티드” 또는 “폴리뉴클레오티드”가 지칭하는 핵산 중합체의 정확한 길이는 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 “고유표시(signature)”는 분자로 만들어질 수 있는 임의의 화학적, 생물학적 또는 물리적 측정을 지칭하며, 이는 완벽한 식별 여부에 관계없이 미래에 해당 분자를 측정하기 위해 사용될 수 있다.
현재의 뉴클레오티드 합성 방법은 적어도 두 가지 특성을 가진다. 첫째, 알려진 핵산 서열을 사용하여 원하는 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 새롭게 생성된 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 매우 높은 정확도, 예를 들어 99% 이상의 정확도로 생성되는 것이 바람직하다. 둘째, 올리고뉴클레오티드의 생성은 일반적으로 일제히(en masse) 발생하는 것이 바람직하며, 즉, 많은 동일한 올리고뉴클레오티드가 동시에 생성된다.
본원에 설명된 본 발명에 따르면, 무작위 올리고뉴클레오티드의 서열은 그 서열이 그의 사용 전에 결정될 수 있다면, 무작위 올리고뉴클레오티드 생성 전에 반드시 알려질 필요는 없다. 또한, 일부 적용의 경우, 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 2017년 10월 24일에 출원된 Sawaya 의 PCT/US17/058076, PCT출원 공개번호 WO 2018/081113에 설명된 분자 암호 기법의 경우, 올리고뉴클레오티드의 정확한 서열은 완벽하게 또는 전체로서 알려질 필요는 없다. 일부 적용의 경우, 다른 무작위 올리고뉴클레오티드와 구별하기 위해 서열에 대한 충분한 지식만 있으면 된다. 사실, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은, 그의 사용 전에 올리고뉴클레오티드의 “고유표시”가 결정되고, 그 고유표시가 올리고뉴클레오티드를 다른 무작위 올리고뉴클레오티드와 구별할만큼 충분히 구별되는 한, 알려질 필요가 없다.
무작위 올리고뉴클레오티드의 고유성은 또한 일부 적용에 필요하다. 이들 적용에서, 예컨대 분자 암호 기법(PCT/US17/058076, PCT출원 공개번호 WO 2018/081113)에서, 정확히 동일한 서열을 갖는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 갖는 것은 이상적이지 않다. 이러한 적용 중 일부가 고유하지 않은 올리고뉴클레오티드의 존재를 용인할 수 있을지라도, 정확히 동일한 서열을 갖는 많은(예: 수천, 수만, 또는 수백만 이상) 올리고뉴클레오티드를 갖는 데에는 거의 사용되지 않는다. 그러므로, 본 발명은 현재의 뉴클레오티드 합성 방법과 비교하여 독특한 접근법을 취하며, 독특한 문제를 해결한다.
본 발명은 하기에 의해 고유한, 무작위 올리고뉴클레오티드를 생성한다: a) 적어도 하나의 뉴클레오티드를 무작위로 분자에 첨가하여 핵산을 포함하는 적어도 하나의 분자를 생성하는 단계로서, 여기에서 생성된 분자는 무작위 올리고뉴클레오티드인 단계; b) 상기 무작위 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계; 및 c) 상기 무작위 올리고뉴클레오티드의 특정 특징을 사용하여 무작위 올리고뉴클레오티드를 선택하는 단계. 특정 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드를 선택하는 것은 이를 다양한 용도를 위해 제조하기 위해 올리고뉴클레오티드를 가공하는 것의 일부이다. 특정 구체예에서, 상기 분자를 측정한다. 특정 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 그 올리고뉴클레오티드를 측정하기 위해 사용되는 유사하거나 동일한 측정 기술을 사용하여 확인될 수 있다.
본원에서 설명된 분자를 생성하기 위한 분자 및 올리고뉴클레오티드의 합성은 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 이들 방법은 비제한적으로 포스포라미디트 화학(phosphoramidite chemistry) 및/또는 효소-기반 합성을 포함할 수 있다.
Hughes and Ellington (2017) “Synthetic DNA synthesis and assembly: putting the synthetic in synthetic biology”. Perspect. Biol.; 9: a023812; 및 Kosuri and Church (2014) “Large-scale de novo DNA synthesis: technologies and applications.” Nature Methods; 11:499-507에서 설명된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 다수의 방법이 이용가능하며, 이들 각각은 본원에 참조로 통합된다. 이들 방법은 무작위 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 그 자체로 이용되거나 조합될 수 있다. 본원에 설명된 무작위 올리고뉴클레오티드를 생성하는 방법은 본 발명에서 이용될 수 있는 예이지만, 본 발명은 특정 올리고뉴클레오티드 합성 방법에 제한되지 않는다. 올리고뉴클레오티드 합성의 최신 기술이 발전함에 따라, 올리고뉴클레오티드 합성의 대안적인 방법이 본 발명에서 무작위 올리고뉴클레오티드의 생성에 이용될 수 있다.
현재, 대규모의 저비용 뉴클레오티드 합성은 마이크로어레이 합성기에서 포스포라미디트 화학을 사용하여 발생한다. 이 방법으로 합성하면 다수 올리고뉴클레오티드를 높은 서열 정확도로 병렬로 생성할 수 있다. 이들 방법에 대한 상세는 Heller (2002) DNA microarray technology: devices, systems, and applications. Annu Rev Biomed Eng., 4:129-53; 및 LeProust et al., (2010) Synthesis of high-quality libraries of long (150mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process. Nucleic Acids Res. 38(8): 2522-40에서 설명되며, 이들 각각은 본원에 참조로 통합된다.
특정 구체예에서, 특정 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 포스포라미디트 합성을 사용하여 마이크로어레이 또는 마이크로웰에서 병렬로 합성되며(비제한적으로 상기 LeProust; 및 미국 특허번호 Bruhn et al.의 6,458,583; Gao et al.의 7,544,793; Banyai et al.의 9,555,388와 같은 현재 기술과 함께, 이들 각각은 본원에 참조로 통합됨), 이들 동일한 뉴클레오티드는 무작위 올리고뉴클레오티드가 생성되는 기질의 역할을 한다.
도 1을 참조하면, 단계 101은 기질 올리고뉴클레오티드 102를 링커 분자 103상에 생성하며, 이는 예를 들어, 비제한적으로, 마이크로어레이 또는 자기 비드 104에 연결될 수 있다. 단계 105에서, 무작위 올리고뉴클레오티드 106은 기질 올리고뉴클레오티드 102 상에 생성된다. 단계 107에서, 비-무작위 또는 알려진 올리고뉴클레오티드 108은 성장하는 분자 상에 생성된다. 단계 109는 생성된 분자를 사용을 위해 가공하는 것, 또는 원하는만큼 여러 번 반복될 수 있는 임의의 조합으로 단계 105 또는 단계 107을 반복하는 것일 수 있다.
기질 올리고뉴클레오티드 102는, 일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드의 향후 사용을 용이하게 하는 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 기질 올리고뉴클레오티드 102는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR) 프로토콜에서 뉴클레오티드 증폭을 위한 프라이머로서 작용할 수 있는 적절한 서열을 포함할 수 있다. 이들 기질 올리고뉴클레오티드 102는 또한, 일부 구체예에서, 생성되는 올리고뉴클레오티드를 확인하는 데 도움이 되는 인덱스로서의 역할을 할 수 있다. 또한, 이들 기질 올리고뉴클레오티드 102는 또한, 일부 구체예에서, 어댑터로서 작용하거나, 여기에서 논의된 기능에 제한되지 않는 다른 기능을 제공할 수 있다. 알려진 서열의 올리고뉴클레오티드에 연결된 생성된 무작위 올리고뉴클레오티드 106은, 일부 구체예에서, 그 후 특정 알려진 서열 108을 갖는 올리고뉴클레오티드의 생성을 위한 기질로서 작용할 수 있다. 그 후, 일부 구체예에서, 보다 무작위인 올리고뉴클레오티드 106는 또한 이 분자 상에 생성될 수 있고, 일부 구체예에서, 그 후 알려진 서열의 더 많은 올리고뉴클레오티드가 생성될 수 있고, 이러한 방식으로, 원하는 분자가 생성될 때까지 알려진 것과 알려지지 않은 무작위 서열 모이어티의 생성을 번갈아가며 할 수 있다.
동일한 올리고뉴클레오티드의 그룹이 마이크로어레이 상에 나란히 합성되어, 무작위 올리고뉴클레오티드의 합성을 위한 기질의 역할을 한 후, 일부 구체예에서, 포스포라미디트 합성을 사용하여 이들 기질 올리고뉴클레오티드 102 상에서 무작위 올리고뉴클레오티드 합성이 발생한다. 마이크로어레이 상에서의 전통적인 합성과 달리, 무작위 올리고뉴클레오티드 106을 생성하기 위해 사용된 무작위 합성은 지시되지 않았거나(undirected), 또는 일부 구체예에서, 부분적으로 지시되어(partially directed) 생성되는 정확한 서열이 완전히 알려지지 않거나, 또는 부분적으로 지시될 때, 부분적으로 알려지지 않는다. 본원에서 사용된, “부분적으로 지시된(partially directed)”은 선택된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 완전히 무작위가 아닌 방식으로 올리고뉴클레오티드에 첨가하는 것을 지칭한다.
일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 DNA를 효소적으로 합성하는 단백질, 예컨대 말단데옥시뉴클레오티드전달효소(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)를 사용하여 합성된다. 일부 구체예에서, 이들 단백질 효소는 무작위 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 특이적으로 설계되어, 효소에 의해 이전에 생성된 무작위 올리고뉴클레오티드의 임의의 서열 모이어티에 의존하는 특정 올리고뉴클레오티드를 합성하지 않는다.
일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 미국 특허번호 Williams의 9,845,501; 및 Turner et al.의 7,302,146와 유사하지만 이에 제한되지 않는 시스템에서 마이크로웰 내에서 합성되며, 이들 각각은 본원에 참조로 통합된다. 이러한 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드의 합성은 라벨링 분자, 예컨대 미국 특허번호 Williams의 9,845,501; 및 Korlach의 8,580,539 내에서 논의된 라벨링 기술의 사용을 포함하며, 이들 각각은 본원에 참조로 통합된다. 분자의 라벨링은 뉴클레오티드가 무작위 올리고뉴클레오티드에 첨가된 직후 또는 얼마 지나지 않은 후에 합성되는 무작위 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하는 역할을 한다. 이들 구체예에서, 이 과정에 의해 생성되는 무작위 올리고뉴클레오티드는 단지 단기간 동안 알려지지 않은 서열이다. 새로 첨가된 뉴클레오티드가 알려지고, 그에 따라 올리고뉴클레오티드의 서열이 결정된다. 이들 구체예에서, 새로 생성된 올리고뉴클레오티드는 또 다른 무작위 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드가 화학적으로 결합된 기질 올리고뉴클레오티드가 된다. 서열은 그 후 무작위 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드가 첨가된 후에 결정된다. 이는 대략적으로 알려진 길이와 대략적으로 알려진 또는 완전히 알려진 서열의 무작위 올리고뉴클레오티드가 생성될 때까지 이러한 방식으로 계속된다. 이러한 구체예에서, 방법은 (a) 올리고뉴클레오티드를 무작위로 생성하는 것, 및 (b) 그 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하는 것을 번갈아가며 한다. 이러한 구체예에서 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하는 방법은 무작위로 생성된 올리고뉴클레오티드의 서열 조성을 결정하는 방법에 대해 아래에서 더 상세히 논의된다.
올리고뉴클레오티드의 완전히 지시되지 않은 합성은 이들 올리고뉴클레오티드의 향후 사용에 문제가 될 수 있는 일부 무작위 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 예를 들어, 호모폴리머 연속(homopolymer runs), 예컨대 “CCCC” 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는, 비특이적 어닐링을 야기하거나 및/또는 일부 시퀀싱 플랫폼에서 시퀀싱 문제를 일으킬 수 있다(Xu et al, (2009) Design of 240,000 orthogonal 25mer DNA barcode probes, PNAS, Vol. 107 No. 7 pp. 2289-2294 참조). 이들의 합성 전에 이들 및 기타 이상적이지 않은 무작위 올리고뉴클레오티드를 피하기 위해, 반응에 사용되는 시약은 잉크젯 기술을 사용하여 특정 구체예에서 부분적으로 지시될 수 있고, 예를 들어 미국 특허번호 Caren et al.의 6,221,653; Okamoto et al의 6,476,215; 및 미국 특허번호 Schleifer et al.의 6,077,674; 및 Dellinger et al.의 7,572,907에 설명된 바와 같으며, 각각은 본원에 참조로 통합된다.
특정 구체예에서, 반응은 또한 마이크로미러를 사용하여 광-제어 반응을 조절하기 위해 부분적으로 지시될 수 있으며, 예컨대 미국 특허번호 Sandstrom의 6,545,758 및 Cerrina et al.의 7,157,229에 설명된 것들이 있고, 각각은 본원에 참조로 통합된다. 올리고뉴클레오티드의 무작위 합성에 대한 부분적 제어의 예는 주어진 뉴클레오티드 염기의 양을 제한하는 것일 것이다. 예를 들어, 호모폴리머 시토신의 연속(run)이 주어진 적용에 대해 이상적이지 않은 경우, 시토신 이외의 뉴클레오티드 염기가 유리하게 지시될 수 있고, 예를 들어, 무작위 올리고뉴클레오티드의 합성에서 잉크젯 기술을 사용할 수 있다. 또한, 광 제어 반응은 마이크로미러로 변형될 수 있다. 빛 제어 반응을 사용하면, 반응에 근접한 용액에 존재하는 것으로 추정되거나 알려진 뉴클레오티드 염기에 따라 특정 핵산 염기가 선호되거나 비선호될 수 있다.
특정 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드가 생성된 후, 비-무작위 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드가 무작위 올리고뉴클레오티드에 부착되며, 이는 무작위 올리고뉴클레오티드 상에 직접 생성되거나, 및/또는 비-무작위 올리고뉴클레오티드를 무작위 올리고뉴클레오티드에 라이게이션에 의해 부착하는 것에 의한다.
특정 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 다단계 방법으로 생성된다. 상기 방법은 적어도 하나의 더 짧은 무작위 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함한다. 더 짧은 무작위 올리고뉴클레오티드는 그 후 결합되어 더 긴 무작위 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 더 긴 무작위 올리고뉴클레오티드는 그 후 결합되어 더욱 긴 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 무작위 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 효소 또는 포스포라미디트 화학에 의해 지시된 분자 결합을 사용하는 라이게이션을 통해 결합되어 더 긴 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 특정 구체예에서, 여과 단계를 사용하여 무작위 올리고뉴클레오티드 생성의 하나 이상의 단계에서 원치 않는 무작위 올리고뉴클레오티드를 제거한다. 특정 구체예에서, 다단계 방법은 하기를 포함한다: 하나의 뉴클레오티드를 또 다른 뉴클레오티드에 무작위로 첨가하여 무작위 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계; 제1 무작위 올리고뉴클레오티드를 또 다른 하나의 무작위 올리고뉴클레오티드에 무작위로 결합하는 단계; 상기 무작위 올리고뉴클레오티드를 특정 특징에 대해 스크리닝하는 단계; 특정 특징을 갖는 무작위 올리고뉴클레오티드를 제거하는 단계; 및 나머지 무작위 올리고뉴클레오티드를 무작위로 결합하는 단계. 상기 스크리닝, 제거, 및 결합 단계를 반복하여 원하는 특징을 갖는 무작위 올리고뉴클레오티드를 창출할 수 있다.
도 2를 참조하면, 특정 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 이량체(dimers) 또는 2-량체(two-mers)를 포함한다. 이량체 202는 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 4가지 상이한 유형의 핵산 염기, A=아데노신, T=티미딘, C=시토신, 및 G=구아닌이 주어지면, 2개의 뉴클레오티드의 16개 상이한 조합이 있다. 따라서, 이량체는 16개 상이한 서열 중 하나 일 수 있다: AT, TA, CG, GC, CA, AC, CT, TC, GA, AG, GT, TG, AA, TT, CC, GG.
4-량체(four-mer) 203은 4개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 4-량체 올리고뉴클레오티드는 핵산 염기의 162개 조합을 가진다. 4-량체 올리고뉴클레오티드가 이량체 올리고뉴클레오티드를 결합함으로써 생성되는 경우, 4-량체 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 특정 구체예에서 호모폴리머 올리고뉴클레오티드에 대해 스크리닝될 수 있다. 호모폴리머 올리고뉴클레오티드는 단일 유형의 뉴클레오티드 염기, 예를 들어 AAAA, TTTT, CCCC, 및 GGGG를 포함한다. 이 스크리닝은, 그 자체가 호모폴리머 올리고뉴클레오티드이고, 그러므로 이상적이지 않고 무작위로 생성된 호모폴리머 올리고뉴클레오티드에 상보적인 말단 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 마이크로어레이를 통해 4-량체 올리고뉴클레오티드를 세척하는 것과 같은 과정에 의해 발생할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구체예에서, 이량체는 무작위 이량체이고, 4-량체는 무작위 4-량체다.
특정 구체예에서, 원치 않는 올리고뉴클레오티드에 대한 스크리닝은 무작위 올리고뉴클레오티드의 생성 동안 발생한다. 스크리닝은 원치 않는 올리고뉴클레오티드에 상보적 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 필터로서 사용하는 것에 의해 발생하며, 상기 필터는 원치 않는 올리고뉴클레오티드에 결합하여 그것을 무작위 올리고뉴클레오티드의 용액으로부터 제거한다.
도 2에 나타낸 바와 같은, 예시적인 구체예에서, 이량체 201은 무작위로 결합되어(202) 4-량체 올리고뉴클레오티드 203을 생성한다. 162개의 가능한 결과적인 4-량체 올리고뉴클레오티드가 있다. 4-량체 올리고뉴클레오티드는 그 후 원치 않는 올리고뉴클레오티드에 대해 스크리닝된다(204). 나머지 4-량체의 수는 162 - x이고, 여기에서 x = 스크리닝된 원치 않는 올리고뉴클레오티드의 수이다. 나머지 4-량체 205는 그 후 결합되어(206) 8-량체 207을 생성하며, 이는 8개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 8-량체의 수는 (162 - x)2)이고, 여기에서 x = 스크리닝된 원치 않는 올리고뉴클레오티드의 수이다. 단계 208은 스크리닝 단계를 반복하거나, 결합 단계를 반복하거나, 또는 반복 단계 또는 스크리닝 단계의 임의의 조합을 반복하는 것이다. 단계 208은 원하는만큼 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 알려진 서열의 올리고뉴클레오티드와 화학적으로 결합된다. 이들 알려진 올리고뉴클레오티드는, 일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드의 3' 및/또는 5' 말단에 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, 이 과정은 여러 번 발생하여, 무작위 올리고뉴클레오티드와 알려진 서열의 올리고뉴클레오티드의 조합을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 생성한다.
일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드가 생성된 후, 이들은 원치 않는 올리고뉴클레오티드에 대해 여과될 수 있다. 원치 않는 올리고뉴클레오티드에 대한 여과는 무작위 뉴클레오티드가 다른 올리고뉴클레오티드와 물리적으로 연결되기 전 또는 후에 발생할 수 있다. 상기 다른 올리고뉴클레오티드는 알려진 서열, 부분적으로 무작위 서열, 또는 완전히 알려지지 않은 서열을 가질 수 있다. 이 여과는 원치 않는 올리고뉴클레오티드를 제거함으로써 발생할 수 있다. 원치 않는 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 크기를 기반으로, 예를 들어, 컬럼-기반 크기 분리 기술을 사용하여, 생성된 올리고뉴클레오티드를 여과함으로써 제거될 수 있다.
특정 구체예에서, 원치 않는 올리고뉴클레오티드를 제거하는 것은 다른 필터링 과정, 예컨대 원치 않는 서열에 대한 필터링과 조합하여 발생할 수 있다. 원치 않는 서열에 대한 필터링은 임의의 하기 방법 또는 이의 조합에 의해 달성될 수 있다: 원치 않는 올리고뉴클레오티드를 표면 또는 비드에 결합된 상보적 올리고뉴클레오티드에 결합시키고, 이어서 원치 않는 올리고뉴클레오티드로부터 원하는 올리고뉴클레오티드를 세척하는 것; 원치 않는 올리고뉴클레오티드를 원치 않는 올리고뉴클레오티드의 분해를 촉진할 수 있는 단백질에 결합된 상보적 올리고뉴클레오티드에 결합시키는 것; 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 원치 않는 올리고뉴클레오티드를 절단함으로써, 크기를 감소시켜 크기별로 후속 여과를 가능하게 하여 원치 않는 뉴클레오티드를 제거하는 것; 및/또는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다른 방법을 사용하여 원치 않는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 걸러내는 것.
생성된 무작위 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해, 다양한 시퀀싱 기술이 개별적으로 또는 조합되어 사용될 수 있다. 통상의 기술자는 가장 좋고 바람직한 시퀀싱 기술(들)을 결정할 수 있으며, 시퀀싱 기술이 발전함에 따라, 이러한 기술은 본 발명에 따른 서열을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 중요하게는, 무작위 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해 사용되는 시퀀싱 기술은 무작위 올리고뉴클레오티드가 시퀀싱된 후 사용을 위해 수집될 수 있도록 해야 하거나, 또는 대안적으로, 무작위 올리고뉴클레오티드가 시퀀싱된 후 수집될 수 있는 카피 또는 상보적 올리고뉴클레오티드를 생성해야 한다. 이 요구사항은 생성된 무작위 올리고뉴클레오티드가 그들의 서열이 결정된 후에 사용될 수 있도록 한다.
특정 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 그의 서열의 결정 전에 가공되어야 한다. 이 가공은 통상의 기술자가 인식할 수 있는 바와 같은, 무작위 올리고뉴클레오티드에 뉴클레오티드의 첨가, 크기 또는 서열에 기초한 특정 올리고뉴클레오티드의 제거, 및/또는 무작위 올리고뉴클레오티드가 존재하는 용액의 변경을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 시퀀싱을 위해 준비하기 위해 무작위 올리고뉴클레오티드를 가공하는 특정 방법은 사용할 시퀀싱 방법에 따라 다르다. 핵산의 사슬을 시퀀싱하는 방법이 변경됨에 따라, 시퀀싱을 위해 준비하기 위해 무작위 올리고뉴클레오티드를 가공하는 것도 변경될 수 있으며, 통상의 기술자는 시퀀싱을 위해 준비하기 위해 무작위 올리고뉴클레오티드를 가공하는 적절한 방법을 결정할 수 있다.
특정 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 시퀀싱 후에 수집될 필요가 있다. 시퀀싱 후 뉴클레오티드의 수집을 가능하게 하는 시퀀서에 대한 잠재적 옵션은 Pacific Biosciences 단일-분자 실시간 시퀀서이며, 이는 예를 들어 Eid et al. (2009) “Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules”, Science 323(5910):133-38에서 논의되었다. 본원에서 설명된 시퀀서는 복제될 때 폴리뉴클레오티드에 통합될 때 뉴클레오티드를 고유하게 확인할 수 있는 지표 분자를 사용하여 실시간으로 폴리뉴클레오티드를 복제하는 중합효소를 관찰한다.
결과는 본 발명이 사용될 수 있는 일부 상황에 대해 이상적이지 않은데, 이들 폴리뉴클레오티드가 시퀀싱 된 후의 추출이 원래 시퀀싱된 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 생성할 것이기 때문이다. 예를 들어, 무작위로 생성된 올리고뉴클레오티드는 분자 암호 기법, 예컨대 출원 PCT/US17/058076 WO 공개 WO 2018/081113설명된 바와 같이 사용되는 경우, 중복 올리고뉴클레오티드는 이상적이지 않다. 합성된 폴리뉴클레오티드는, 일부 구체예에서, 시퀀싱될 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 대한 비드의 부착을 사용하여 원래의 폴리뉴클레오티드로부터 분리될 수 있지만, 다른 접근법이 더 나은 수율을 제공할 수 있다.
일부 구체예에서, 합성된 폴리뉴클레오티드를 원래의 폴리뉴클레오티드로부터 분리하기 위한 접근법은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드, 또는 부분적으로 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 무작위로 생성하는 것일 것이다. 이러한 구체예에서, 시퀀싱 동안 생성된 분자의 카피는 무작위로 생성된 올리고뉴클레오티드에 대한 상보체일 것이다. 시퀀싱될 분자가 헤어핀 루프(예컨대, Pacific Biosciences 서열 준비, Travers et al.의 미국 특허번호 9,404,146에서 현재 사용되며, 각각은 본원에 참조로 통합됨)를 함유하지 않는다고 가정하면, 새로 합성된 폴리뉴클레오티드 및 원래의 상보 분자는 시퀀서에서 추출될 수 있는 알려진 서열을 갖는 무작위로 생성된 이중 가닥 올리고뉴클레오티드일 것이다.
특정 구체예에서, 시퀀싱 기술은 무작위 올리고뉴클레오티드를 직접 생성한 다음 즉시 그 서열을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 시퀀싱 기술은 지표 분자를 관찰함으로써 중합효소와 폴리뉴클레오티드 간의 반응을 관찰하는데, 이는 주어진 뉴클레오티드 염기가 시퀀싱할 폴리뉴클레오티드에 통합되었음을 나타낸다. 특정 구체예에서, 반응은 무작위로 생성되는 올리고뉴클레오티드를 연장하는 TdT와 같은 효소에 의해 이상적으로 지시된다.
도 3A-C를 참조하면, 일부 구체예에서, 반응은 효소 “a” 302를 함유하는 마이크로웰 301에서 발생한다. 특정 구체예에서, 효소 302는 TdT이다.
도 3B를 참조하면, 특정 구체예에서, 효소 302 (“a”), 그리고 뉴클레오티드 “b” 303이 올리고뉴클레오티드 304에 무작위로 첨가된 직후 또는 얼마 지나지 않은 후에, 지표 분자 “c” 305가 관찰될 수 있다 306.
도 3C를 참조하면, 특정 구체예에서, 시약은 미세유체를 사용하여 마이크로웰 301에 첨가되고 307, 마이크로웰 301로부터 제거된다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드에 대한 새로운 뉴클레오티드의 첨가는 무작위로 첨가되며, 이는 효소에 근접한 용액이 대략적으로 동일한 양의 다양한 뉴클레오티드 염기를 함유하기 때문이다. 다른 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드를 합성하는 효소를 둘러싼 용액은 동일한 비율의 뉴클레오티드 염기를 함유하지 않으므로, 올리고뉴클레오티드의 조성은, 여전히 무작위이지만, 동일한 비율의 각 뉴클레오티드 염기를 가질 것으로 예상되지 않는다. 일부 구체예에서, 효소를 둘러싼 용액은 특정 비율의 뉴클레오티드 염기를 함유하도록 지시되어 무작위 올리고뉴클레오티드의 생성을 지시한다. 이 지시는, 예를 들어, 무작위 올리고뉴클레오티드의 조성을 제어하기 위해 다른 것보다 특정 뉴클레오티드 염기의 포함을 선호할 수 있다.
서열이 결정된 후 올리고뉴클레오티드를 회수할 수 있는 능력을 갖는 또 다른 시퀀싱 기술은 나노포어 시퀀서(nanopore sequencers)이며, 예컨대 Loman and Watson (2015) “Successful test launch for nanopore sequencing” Nature Methods volume 12, pages 303-304에 설명되었고, 이는 본원에 참조로 통합된다. 특정 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 전체적으로 생성된 다음, 무작위 올리고뉴클레오티드의 서열을 직접 결정하는 나노포어 시퀀서를 사용하여 서열이 결정되고, 그 후에 올리고뉴클레오티드가 회수된다.
다른 구체예에서, 나노포어 기술은 지표 분자를 사용함으로써 올리고뉴클레오티드에 대한 무작위 뉴클레오티드의 통합을 관찰하기 위해 사용되며, 이는 본원에 참조로 통합된 Fuller et al. (2016), “Real-time single-molecule electronic DNA sequencing by synthesis using polymer-tagged nucleotides on a nanopore array,” PNAS, May 10, 2016, Vol. 113 No. 19, pp. 5233-5238 (available at www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1601782113)와 유사하지만 동일하지 않다.
도 4A-C는 나노포어 어레이 상의 폴리머-태그 뉴클레오티드를 사용한 합성에 의한 실시간 단일 분자 전자 DNA 시퀀싱을 예시한다. 이는 무작위 올리고뉴클레오티드의 생성을 관찰 할 수 있게 하며, 그 서열은 생성 후 얼마 지나지 않아 또는 직후에 결정된다.
도 4A를 참조하면, 분자 401은 나노포어 403에 근접한 멤브레인 402에 부착된다. 무작위 올리고뉴클레오티드 406은 분자 401에 부착된다. 특정 구체예에서, 분자 401은 효소 TdT이다.
도 4B-C를 참조하면, 분자 “a” 401이 뉴클레오티드 404 “b”를 무작위 올리고뉴클레오티드 406에 무작위로 첨가한 후, 지표 분자 “c” 405는 나노포어 403을 자유롭게 통과하여, 신호를 생성한다.
일부 구체예에서, 생성되는 올리고뉴클레오티드의 서열이 완전히 무작위임을 보장하기 위해 반응 용액에서 뉴클레오티드 염기를 조절해야 한다. 완전히 무작위인 서열을 사용하는 경우, 무작위 올리고뉴클레오티드의 임의의 주어진 위치에 하나의 뉴클레오티드 염기의 존재는 무작위 올리고뉴클레오티드의 또 다른 위치에 뉴클레오티드 염기의 존재 또는 부재를 예측하는 데 사용될 수 없다.
올리고뉴클레오티드의 서열이 올리고뉴클레오티드가 생성된 직후 또는 얼마 지나지 않은 후에 결정되거나, 올리고뉴클레오티드가 현재 생성될 때 결정되는 구체예에서, 이 생성 주변의 용액은, 일부 구체예에서, 제어될 수 있다. 일부 구체예에서, 미세유체 제어 메커니즘이 사용되며, 여기에서 마이크로채널이 반응성 용액을 조절하여, 용액이 반응성 영역 또는 마이크로웰을 가로질러 흐르도록 한다. 일부 구체예에서, 잉크젯 기술을 이용하여 반응성 용액을 실시간으로 조절한다. 일부 구체예에서, 특정 농도의 뉴클레오티드 염기를 함유하는 용액의 흐름은 반응성 표면 또는 마이크로웰을 가로질러 세척된다. 일부 구체예에서, 열 또는 광-기반 반응과 같은 지향성 에너지는 반응에 영향을 미치는 에너지의 방향에 대한 마이크로미러 및/또는 다른 형태의 제어를 사용하여 제어된다.
일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드의 정확한 서열은 확실하게 결정되지 않는다. 무작위 올리고뉴클레오티드의 정확한 서열에 대한 지식은 무작위 올리고뉴클레오티드의 일부 용도의 경우 필요하지 않을 수 있다. 무작위 올리고뉴클레오티드의 일부 용도의 경우, 주어진 무작위 올리고뉴클레오티드의 서열에 대한 불완전한 정보는 해당 올리고뉴클레오티드를 다른 무작위로 생성된 올리고뉴클레오티드와 구별하기에 충분하다. 따라서, 일부 구체예에서, 부분적 서열 정보, 또는 부분적으로 부정확한 서열 정보가 무작위로 생성된 올리고뉴클레오티드로부터 얻어진다. 일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드의 “고유표시”는 시퀀서로부터 얻어지며, 이는 이어서 무작위로 생성된 올리고뉴클레오티드를 확인하거나 및/또는 이를 다른 무작위 올리고뉴클레오티드와 구별하기 위해 사용될 수 있다. 이 고유표시는, 예를 들어 멤브레인에 내장된 포어를 통한 무작위 올리고뉴클레오티드의 통과로부터 수득된 전기 신호이거나, 또는 또 다른 분자 또는 효소와의 상호작용으로부터 수득된 분자의 운동학적 고유표시일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 다음, 주어진 시퀀싱 방법에서 얻은 고유표시를 사용하여 무작위 올리고뉴클레오티드를 확인할 수 있다. 예를 들어, 동일하거나 유사한 시퀀싱 플랫폼에서 결합된 올리고뉴클레오티드를 시퀀싱할 때, 무작위 올리고뉴클레오티드가 무작위 올리고뉴클레오티드에 라이게이션된 또 다른 올리고뉴클레오티드에 대한 식별자로서 사용되는 프로토콜에서 무작위 올리고뉴클레오티드가 확인될 수 있다.
무작위로 생성된 분자를 가공하는 방법
본 발명의 방법에 의해 생성된 무작위 올리고뉴클레오티드는 다양한 기술, 예컨대 분자 암호 기법 (PCT 출원번호 PCT/US17/058076) 또는 미국 특허공개번호 2015/0211050; 및 2015/0211061에 설명된 방법과 같은 분자 수준 확인을 요구하는 다른 방법에 사용될 수 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 통합된다. 무작위로 생성된 분자를 가공하는 방법은 무작위로 생성된 분자를 사용하는 기술에 따라 다르다.
일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 특정 특징을 갖는 특정 올리고뉴클레오티드를 선택함으로써 이들의 서열을 결정하기 전에 가공된다. 이 가공은 효율적인 시퀀싱을 가능하게 하고, 시퀀서에 의해 생성된 뉴클레오티드 서열은 정확하고, 사용되는 올리고뉴클레오티드에 대해서만 생성된다. 그러나, 일부 구체예에서, 또한 올리고뉴클레오티드의 서열이 결정된 후 가공하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어, 생성될 올리고뉴클레오티드의 서열이 그 생성 직후 또는 얼마 지나지 않은 후에 결정될 때 필요할 것이다. 이는 또한 큰 무작위 올리고뉴클레오티드를 생성하고, 그 서열이 그 후에 결정될 때 필요할 수 있으며, 이 큰 무작위 올리고뉴클레오티드는 사용 전에 더 작은 올리고뉴클레오티드로 가공되어야 한다.
일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 선택 기술, 예컨대, 이에 제한되지 않지만, 컬럼 분리를 사용하여 크기에 대해 선택함으로써 가공된다. 원치 않는 크기의 분자는 원하는 크기의 분자에서 분리하여, 원하는 경우 특정 수의 뉴클레오티드 염기를 함유하는 분자를 선택할 수 있다.
일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 이상적이지 않은 및/또는 원치 않는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제거함으로써 특정 서열에 대해 스크리닝된다. 이러한 구체예에서, 원치 않는 올리고뉴클레오티드에 대한 상보적 뉴클레오티드 서열을 갖는 무작위 올리고뉴클레오티드는 마이크로어레이와 같은 표면에 또는 무작위 올리고뉴클레오티드에 부착된 자기 비드의 사용을 통해 부착될 수 있다. 무작위 올리고뉴클레오티드는 그 후 마이크로어레이에서 세척함으로써 이 표면에 도입되거나, 또는 자기 비드를 함유하는 용액에 도입될 수 있다. 원하는 무작위 올리고뉴클레오티드는 용액이 마이크로어레이를 세척한 후 용액에 남아있거나, 또는 자기 비드가 제거될 때 용액에 남아있다. 통상의 기술자는 특정 올리고뉴클레오티드 서열에 대해 스크리닝하는 최상의 기술을 결정하여 최종 혼합물에서 이러한 원치 않는 분자의 존재를 피할 수 있다.
일부 구체예에서, 제한 효소를 사용하여 특정 서열을 갖는 무작위 올리고뉴클레오티드를 절단한다. 이 절단은 올리고뉴클레오티드의 크기를 줄여서, 더 작은 올리고뉴클레오티드로 분해한다. 이러한 더 작은 분자는 크기 선택되고 더 큰 올리고뉴클레오티드로부터 분리될 수 있다.
일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 라이게이션 및/또는 다른 방법으로 다른 올리고뉴클레오티드 상에 부착되며, 예를 들어 T-A 라이게이션 또는 통상의 기술자에 의해 사용되는 임의의 다른 방법을 사용한다. 이 라이게이션을 사용하여 무작위 올리고뉴클레오티드를 다른 목적을 위해 기술에 통합시킬 수 있으며, 예를 들어 미국 특허공개번호 2015/0211050; 및 2015/0211061에 개시된 목적이 있다.
일부 구체예에서, 생성된 무작위 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드의 서열이 결정되는 과정은 단일 가닥 무작위 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 시퀀싱된 무작위 올리고뉴클레오티드가 완전히 단일 가닥이고 이들의 원하는 사용에 이들이 이중 가닥이어야 하는 경우, 일부 구체예에서, 기술이 사용되어 상보적 서열을 갖는 가닥을 생성한다. 그러한 기술 중 하나는 DNA 중합효소를 무작위의 축퇴 프라이머와 함께 사용하여 일치하는 가닥을 생성하는 것일 수 있다. 무작위 프라이머가 항상 필요한 것은 아니다. 일부 구체예에서, 무작위로 생성된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 이들의 서열의 결정 전 또는 그 동안에 이중 가닥 DNA 분자에 부착된다. 특정 구체예에서, 무작위로 생성된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 그들의 서열이 결정된 후 이중 가닥 DNA 분자에 라이게이션된다. 일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 알려진 서열 모이어티를 갖는 분자에 부착되며, 이에 대한 특정 프라이머는 중합효소를 사용하여 상보적 가닥을 생성하기 위해 설계될 수 있다.
일부 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드가 원하는 형태로 가공된 후, 이들은 포장될 수 있고, 이 포장은 용액에 존재하는 서열로 라벨링될 수 있다. 일부 구체예에서, 무작위로 생성된 분자가 분자 암호 기법(PCT/US17/058076 참조)에 사용될 것일 때, 용액 내 분자의 정확한 서열 및/또는 고유표시가 안전하게 유지되어야 하며, 이러한 구체예에서 존재하는 서열에 대한 정보는 분자의 용액과 함께 포장되지 않고, 대신 별도의 포장으로 전송되거나, 서열 정보가 포함된 데이터 파일이 적절한 당사자에게 안전하게 전달되도록 할 수 있다.
본 발명이 특정 바람직한 구체예를 참조하여 상세하게 설명되었지만, 설명된 바와 같은 본 발명의 하나 이상의 독립적인 양상의 범위 및 사상 내에서 변형 및 수정이 존재한다.

Claims (19)

  1. 하기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 생성하는 방법:
    a. 적어도 하나의 뉴클레오티드를 무작위로 분자에 첨가하여 뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 분자를 생성하는 단계로서, 여기에서 생성된 분자는 무작위 올리고뉴클레오티드인 것인 단계;
    b. 상기 무작위 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하는 단계; 및
    c. 상기 무작위 올리고뉴클레오티드의 특정 특징을 사용하여 무작위 올리고뉴클레오티드를 선택하는 단계.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 무작위 올리고뉴클레오티드는 포스포라미디트 화학을 사용하여 생성되는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 무작위 올리고뉴클레오티드는 효소 공정을 사용하여 생성되는 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 무작위 올리고뉴클레오티드는 마이크로웰 내에서 생성되는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 무작위 올리고뉴클레오티드는 마이크로어레이 상에서 생성되는 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 무작위 올리고뉴클레오티드를 선택하기 위해 사용되는 특징은 뉴클레오티드의 특정 서열인 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 무작위 올리고뉴클레오티드를 선택하기 위한 특징은 무작위 올리고뉴클레오티드의 크기인 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 무작위 올리고뉴클레오티드는 적어도 부분적으로 알려진 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 상에서 생성되는 것인 방법.
  9. 청구항 3에 있어서, 지표 분자는 뉴클레오티드가 분자에 첨가된 후에 반응성이 되는 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 핵산 염기를 분자에 첨가하는 것은 부분적으로 지시되는 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 미세유체를 사용하여 반응 조건을 제어하는 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 지향성 에너지(directed energy)를 사용하여 반응 조건을 제어하는 것인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 무작위 올리고뉴클레오티드의 특성은 나노포어(nanopore)를 사용하여 측정되는 것인 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 선택된 올리고뉴클레오티드는 특정 용도를 위해 제조되는 것인 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 유사하거나 동일한 측정 기술을 사용하여 상기 무작위 올리고뉴클레오티드가 확인될 수 있도록, 상기 무작위 올리고뉴클레오티드를 측정하는 것인 방법.
  16. 하기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 생성하는 방법:
    a. 하나의 뉴클레오티드를 또 다른 뉴클레오티드에 무작위로 첨가하여 무작위 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계;
    b. 제1 무작위 올리고뉴클레오티드를 또 다른 하나의 무작위 올리고뉴클레오티드와 결합하는 단계로서, 여기에서 상기 제1 무작위 올리고뉴클레오티드는 상기 다른 무작위 올리고뉴클레오티드에 무작위로 결합되는 것인 단계;
    c. 상기 무작위 올리고뉴클레오티드를 특정 특징에 대해 스크리닝하는 단계;
    d. 특정 특징을 갖는 무작위 올리고뉴클레오티드를 제거하는 단계; 및
    e. 나머지 무작위 올리고뉴클레오티드를 무작위로 결합하는 단계.
  17. 청구항 16에 있어서, 단계 c 내지 e 중 임의의 것을 반복하여 원하는 특징을 갖는 무작위 올리고뉴클레오티드를 창출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 무작위 올리고뉴클레오티드를 스크리닝하기 위해 사용된 특징은 무작위 올리고뉴클레오티드의 크기를 포함하는 것인 방법.
  19. 청구항 16에 있어서, 상기 무작위 올리고뉴클레오티드를 스크리닝하기 위해 사용된 특징은 무작위 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
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