KR20210097388A - 점도와 탄성도가 향상된 히알루론산 수화겔 - Google Patents

점도와 탄성도가 향상된 히알루론산 수화겔 Download PDF

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Abstract

점도와 탄성도가 향상된 히알루론산 수화겔이 제공된다. 즉, 필러 시술용 수화겔은 제1 전자선을 조사하여 히알루론산 수용액을 가교시켜 제1 수화겔을 제조하는 단계; 및 제2 전자선을 조사하여 제1 수화겔의 펜던트 가교체를 적어도 부분적으로 제거하여 제2 수화겔을 형성하는 단계를 포함하여 제조된다.

Description

점도와 탄성도가 향상된 히알루론산 수화겔{HYALURONIC ACID HYDROGEL IMPROVING VISCOSITY AND ELASTICITY}
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명은 히알루론산을 가교시켜 마이크로겔을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 가교제 없이도 전자선을 조사하는 것만으로 히알루론산을 가교시킬 수 있는 필러 시술용 마이크로겔의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 필러 시술용 마이크로겔, 이를 이용한 주사용 필러 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 발명은 다당에 전자선을 조사하여 하이드로겔을 제조하는 방법 및 이로부터 제조된 하이드로겔에 관한 것이다. 상세하게는 히알루론산 등의 다당에 가교제를 실질적으로 첨가하지 않고도 가교를 유도하여 입자 형태의 하이드로겔을 제조하는 방법 및 이로부터 제조된 입자 형태의 하이드로겔에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 발명은 전자선을 이용하여 펜던트를 제거하는 필러 시술용 하이드로겔의 제조 방법에 관한 것이다. 상세하게, 히알루론산을 가교시켜 필러 시술용 하이드로겔을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 가교된 히알루론산의 하이드로겔에 전자선을 조사하여 펜던트의 제거를 유도하는 필러 시술용 하이드로겔의 제조 방법에 관한 것이다.
히알루론산은 복잡한 음전하성 다당류의 하나로 N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산으로 이루어진 고분자 화합물이다. 히알루론산은 주로 생체내의 연결조직, 피하조직, 신경조직 또는 관절 활액에 존재한다. 히알루론산은 스트렙토코커스속 등의 미생물 발효 또는 닭 벼슬 등에서 추출되어 다양한 분야에 이용되고 있다. 예를 들어, 히알루론산은 매우 뛰어난 생체 적합성을 가지고 있어 화장품 첨가제뿐만 아니라 관절강 주사제, 유착 방지제, 안과용 의약품 등으로 이용되고 있다. 또한, 히알루론산 겔은 조직수복생체재료 의료기기인 성형필러로도 많이 사용되고 있다.
한편 히알루론산 그 자체로는 효소와 활성산소에 의한 분해에 의해 체내에서 빠르게 배출될 수 있다는 난제가 보고됨에 따라 체내에서의 분해 기간을 연장시키기 위해 화학적으로 가교시켜 안정화하려는 다양한 시도가 있다.
즉, 히알루론산의 화학 구조적 안정성을 높여 생체 내에서의 분해 작용을 늦춰 물성 유지 기간을 길게 유지시키고자 1,4-부탄다이올 디글리시딜 에테르(1,4-Butanediol diglycidyl ether; BDDE) 등의 가교제를 첨가하여 히알루론산을 안정화시키는 기술이 개발되어 왔으며, 그 가운데 현존하는 히알루론산 및 히알루론산 유도체의 가교물의 생체 내 최대 유지 기간은 약 6개월 내지 24개월인 것으로 알려져 있다.
그러나 히알루론산을 안정화시키고자 가교제를 사용할 경우 발생하는 미반응된 잔류 가교제는 독성을 유발하여 체내 염증 반응을 야기할 수 있고, 특히 가교제의 일부 관능기가 미반응되어 형성되는 펜던트 가교체 등은 독성을 유발할 뿐만 아니라 하이드로겔의 물성을 약하게 할 수 있다는 문제점이 있다.
Kablik J, Monheit GD, Yu LP, Chang G and Gershkovich J. Dermatol Surg 2009, 35(S1): 302-312 (비특허문헌 2) Sungchul C, et al. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2014-11-16
비특허문헌 1 및 비특허문헌 2는 펜던트 가교체를 갖는 하이드로겔 고분자가 물성을 저하시킴을 보고하고 있다. 반면 하이드로겔의 물성을 원하는 수준으로 제어하기 위해 추가 가교제를 투입할 경우 인체에 적용하기에 적합하지 않은 독성을 나타내는 문제가 있다. 특히 FDA는 2ppm 이하의 미반응 가교제 농도를 요구하고 있다.
이와 같은 문제를 해결하기 위한 본 발명의 과제는 가교 하이드로겔의 물성을 향상시킴과 동시에 독성을 최소화할 수 있는 필러 시술용 하이드로겔의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 필러 시술용 하이드로겔의 제조 방법은 히알루론산 수용액에 가교제를 첨가하여 소정 시간동안 반응시켜 상기 히알루론산의 적어도 일부분이 가교된 제1 하이드로겔을 제조하는 단계; 상기 제1 하이드로겔을 플라스틱 재질의 제1 파우치에 밀봉하는 단계; 상기 제1 파우치에 밀봉된 제1 하이드로겔에 전자선을 조사하여 하이드로겔의 점도(viscosity) 및 탄성도(elasticity)가 증가된 제2 하이드로겔을 제조하는 단계; 및 상기 제1 파우치를 개방하여 상기 제2 하이드로겔의 기포를 제거하고, 상기 제1 파우치와 상이한 재질의 제2 파우치에 재포장하는 단계를 포함한다.
또 상기 가교제는 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르를 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 가교제는 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르만으로 이루어질 수 있다.
또한 상기 가교제는 1,4-비스(2,3-에폭시프로폭시)부탄, 1,4-비스글리시딜옥시부탄, 1,2-비스(2,3-에폭시프로폭시)에틸렌, 1-(2,3-에폭시프로필)-2,3-에폭시사이클로헥산, 및 1,3-부타디엔디에폭시드를 실질적으로 불포함할 수 있다.
상기 제2 하이드로겔은 상기 제1 하이드로겔의 펜던트 그룹(pendant group)이 적어도 부분적으로 제거되어 형성되어, 상기 제2 하이드로겔은 상기 제1 하이드로겔 보다 펜던트 가교체 형성비가 낮을 수 있다.
여기서 상기 펜던트 가교체 형성비는 하기 식 1에 따라 계산될 수 있다.
[식 1]
펜던트 가교체 형성비 = (펜던트 가교체 양) / (가교체 양)
나아가 상기 제2 하이드로겔의 펜던트 가교체 형성비는 상기 제1 하이드로겔의 펜던트 가교체 형성비의 50% 이하일 수 있다.
상기 전자선을 조사하는 단계는, a)상기 제1 파우치에 밀봉된 상기 제1 하이드로겔을 무빙 테이블 상에 배치하는 단계로서, 턴 테이블 또는 컨베이어 테이블을 포함하는 무빙 테이블 상에 배치하는 단계, b)상기 제1 하이드로겔의 위치 변화와 무관하게 상기 전자선이 동일 위치에 조사되도록 전자선 조사기의 위치를 고정하는 단계, 및 c)상기 무빙 테이블을 무빙시켜 상기 제1 하이드로겔을 소정 시간 동안 상기 전자선에 노출시키는 단계로서, 상기 무빙에 의해 상기 제1 하이드로겔이 소정의 주기와 휴지기를 가지고 전자선에 노출되는 단계를 포함할 수 있다.
여기서 상기 전자선은 0.1 kW 내지 1.0 kW의 세기로 조사될 수 있다.
또 상기 단계 c)에서, 상기 제1 하이드로겔이 상기 전자선에 노출되는 주기는 0.5초 내지 2초일 수 있다.
또한 상기 단계 c)에서, 상기 제1 하이드로겔이 상기 전자선에 노출되지 않는 휴지기는 50초 이상일 수 있다.
몇몇 실시예에서, 상기 제1 하이드로겔이 상기 전자선에 노출되는 주기는 총 30회 이상 수행될 수 있다.
상기 제1 파우치는 폴리염화비닐 필름으로 이루어질 수 있다.
또한 상기 제1 파우치의 두께는 0.1mm 내지 0.5mm일 수 있다.
상기 제2 파우치는 폴리에틸렌 필름, 폴리에틸렌테레프탈레이트 필름 및 폴리프로필렌 필름으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나로 이루어질 수 있다.
바람직한 실시예에서, 상기 가교제의 첨가량이 상기 히알루론산 수용액 대비 0.1 wt% 이하이거나 상기 히알루론산 수용액과 가교제의 반응시간이 1시간 이하일 때, 상기 제2 하이드로겔의 점도가 400 Pa·s 이상이거나 탄성도가 100 Pa 이상일 수 있다.
기타 실시예의 구체적인 사항들은 상세한 설명에 포함되어 있다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 가교된 히알루론산의 하이드로겔에 전자선(electron-beam)을 조사하여 펜던트 내지는 펜던트기의 제거를 유도하는 것으로서, 특히 펜던트 가교체와 같은 미반응 가교제의 반응을 유도할 수 있다.
이를 통해 종래의 방법보다 가교제를 소량으로 사용하거나 가교제와의 반응시간을 짧게 하더라도 하이드로겔의 물성을 동등 이상 수준으로 향상시킬 수 있고 독성 또한 현저히 감소시킬 수 있다.
즉, 적어도 일부가 미반응된 가교제 특히, 펜던트 가교체의 추가적인 반응을 유도할 수 있어 종래의 방법보다 가교제를 소량으로 사용하거나 가교제와의 반응시간을 짧게 하더라도 하이드로겔의 물성을 동등 이상 수준으로 향상시킬 수 있다.
또한, 이와 같이 원하는 물성을 얻기 위한 가교제의 사용량을 줄일 수 있을 뿐 아니라 펜던트 가교체와 같이 독성을 유발하는 미반응 가교제를 반응시켜 제거할 수 있기 때문에 하이드로겔의 독성 또한 현저히 감소시킬 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1은 BDDE가 히알루론산의 가교제로 사용된 경우 형성될 수 있는 구조체들을 나타낸 화학식이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 전자선 조사에 의해 BDDE의 펜던트 가교체가 반응하는 과정을 나타낸 화학식이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
즉, 본 발명이 제시하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, '및/또는'은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다. 또, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 '포함한다(comprises)' 및/또는 '포함하는(comprising)'은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. '내지'를 사용하여 나타낸 수치 범위는 그 앞과 뒤에 기재된 값을 각각 하한과 상한으로서 포함하는 수치 범위를 나타낸다. '약' 또는 '대략'은 그 뒤에 기재된 값 또는 수치 범위의 20% 이내의 값 또는 수치 범위를 의미한다.
이하 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다. 이하에서 기술되는 제1 발명과 제2 발명, 그리고 제3 발명은 서로 기술적 사상을 일부 공유하거나, 공유하지 않을 수 있다. 즉, 제1 발명, 제2 발명 및 제3 발명의 상세한 설명 중에서 서로 상충되는 기술적 사상이 존재할 경우 이는 당해 발명에 한하여 적용되는 것이고, 서로 상충되지 않는 기술적 사상에 대해서는 양 발명에 공통적으로 적용될 수 있는 것임을 본 기술분야에 속하는 통상의 기술자는 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
우선, 제1 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
[제1 발명]
본 발명의 일 실시예(즉, 제1 발명의 일 실시예)에 따른 필러 시술용 마이크로겔의 제조 방법은 18w/v% 내지 25w/v%의 히알루론산 수용액(제1 히알루론산 수용액)에 5kGy 내지 10kGy 선량의 전자선을 펄스 또는 임펄스 조사하여 히알루론산을 적어도 부분적으로 가교시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 히알루론산의 가교에 있어서 인체에 유해를 초래할 수 있는 가교제를 실질적으로 불포함할 수 있다.
명시적으로 다르게 기재되지 않는 한, 이하에서 전자선의 선량 단위는 그레이(Gy)를 사용하며, 중량 당 에너지로 표현될 수 있다. 또, 전자선의 선량률 단위는 Gy/s를 사용하며, 단위 시간 당 중량 당 에너지로 표현될 수 있다.
종래에는 히알루론산을 가교시키기 위해 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(BDDE) 등의 화합물을 가교제로서 첨가하였는데, 이러한 가교제들은 독성이 있기 때문에 미반응된 가교제가 잔류하여 피부내에 축적될 경우 염증을 일으키는 문제가 있었고, 이에 따라 미반응된 가교제를 제거하기 위해서는 별도의 제거 공정이 뒤따른다는 단점이 있었다. 그러나 본 발명의 실시예들에 따른 히알루론산의 가교 방법은 별도의 가교제 없이 전자선의 조사만으로 히알루론산을 가교시킬 수 있어, 미반응된 가교제가 잔류하여 인체에 독성을 유발하는 문제를 해결할 수 있고 이를 제거하는 별도의 공정이 필요하지 않다는 장점이 있다. 즉 본 발명에 따른 마이크로겔은 종래 사용되는 가교제, 또는 글리콜류의 가교 보조제 등을 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.
다른 실시예에서, 마이크로겔은 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol), PEG) 및/또는 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜에테르(poly(ethylene glycol) diglycidyl ether, PEGDE) 등의 가교제 내지는 가교 보조제를 더 포함하는 수용액이 가교되어 형성될 수도 있다.
전자선 가교를 통해 제조되는 마이크로겔은 Rheometer로 측정시 1Hz에서 점도(viscosity)가 15 내지 150Pa·s, 바람직하게는 약 45 내지 150Pa·s, 더 바람직하게는 약 100 내지 150Pa·s인 고점도의 겔로서 필러 시술용으로 사용하기에 적절한 점도를 가질 수 있다. 또 전자선 가교를 통해 제조되는 마이크로겔은 평균 입도가 약 30㎛ 내지 700㎛, 또는 약 40㎛ 내지 700㎛, 또는 약 50㎛ 내지 700㎛, 또는 약 100㎛ 내지 600㎛, 또는 약 150㎛ 내지 500㎛일 수 있다.
히알루론산의 가교가 적절히 일어나지 않아 나노 사이즈의 입자가 형성될 경우 점도가 너무 낮아 필러 시술용 머크겔에 사용하기 어렵기 때문에 본 발명의 실시예들과 같이 철저하게 설계된 조건으로 가교를 진행시키는 것이 중요하다.
히알루론산의 농도가 18w/v% 보다 낮을 경우 충분한 가교가 이뤄지지 않아 입자 크기가 감소하고 점도 하락을 야기할 수 있다. 반면 히알루론산의 농도가 25w/v%를 초과할 경우 입자 간의 뭉치거나 들러붙는 현상, 나아가 벌크겔이 형성될 수 있어 바람직하지 않다. 이 경우 겔화가 너무 진행되어 압출 기구 등을 이용한 주입이 곤란하고 필러 시술용으로 이용되기에 적합하지 않다.
전자선의 선량은 히알루론산 수용액의 농도와 밀접한 관련이 있는 것으로 추측된다. 다만 전술한 것과 같이 본 발명이 18w/v% 내지 25w/v% 농도 범위의 히알루론산 수용액을 이용하고 전자선을 펄스 또는 임펄스 조사할 경우, 전자선의 총 선량은 5kGy 내지 10kGy 범위, 또는 약 5kGy 내지 9kGy의 범위, 또는 약 5kGy 내지 8kGy의 범위에서 조사하는 것이 바람직함을 확인하였다. 전자선의 선량이 10kGy를 초과할 경우 히알루론산의 분해로 인해 입자 크기가 작아지고 최종적으로 겔의 점도가 낮아질 수 있다. 반면 전자선의 선량이 5kGy를 미달할 경우 입자 간의 뭉치거나 들러붙는 현상, 나아가 벌크겔이 형성되는 현상이 발생할 수 있어 바람직하지 않다.
상기 전자선의 선량은 히알루론산 수용액의 중량을 고려하여 선택될 수 있음을 통상의 기술자는 이해할 수 있을 것이다.
예를 들어 본 발명의 실시예들에서 사용되는 전자선의 에너지는 1MeV 내지 100 MeV일 수 있으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다. 또, 상기 18w/v% 내지 20w/v% 히알루론산 수용액을 제조하기 위한 히알루론산은 100kDa 이상, 또는 약 150kDa 이상, 또는 약 200kDa 이상의 분자량을 갖는 것을 이용할 수 있다. 만일 히알루론산의 분자량이 100kDa 이하일 경우 마이크로겔의 입도 제어가 어렵고 수백 나노 수준의 입자상 하이드로겔이 제조될 수 있다. 또, 히알루론산의 분자량의 상한은 약 500kDa, 또는 약 400kDa일 수 있다. 히알루론산의 분자량이 지나치게 클 경우 가교에 소요되는 시간이 과도하여 비경제적일 수 있다.
예시적인 실시예에서, 전자선의 조사는 소정의 주기를 갖는 형태로 수행될 수 있다. 예를 들어 펄스 조사 또는 임펄스 조사될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 '임펄스'는 극히 짧은 시간, 예컨대 수 밀리초 내지는 수십 밀리초의 시간 동안 충격이 가해지는 것을 의미한다. 이 경우 조사 주기(period)는 5초 내지 10초, 또는 약 6초 내지 8초일 수 있다. 조사 주기가 지나치게 짧을 경우 벌크 형태의 겔과 같이 가교가 이루어지거나, 또는 입자 간에 뭉치거나 들러붙는 현상이 발생할 수 있다. 조사 주기가 지나치게 길 경우 온전히 가교가 이루어지지 못하고 콜로이드와 겔이 혼합된 형태로 가교되고 점도가 현저하게 저하될 수 있다.
전자선의 조사가 수행되는 총 조사 시간은 가교가 이루어지는 마이크로겔의 형태에 따라 적절히 조절될 수 있으나, 예를 들어 약 10분 내지 30분일 수 있다. 총 조사 시간이 너무 짧으면 충분한 가교가 이루어지지 않을 수 있고 총 조사 시간이 너무 길면 입자 형태의 하이드로겔의 입도가 불균일해질 수 있다. 또, 조사 시간이 너무 길면 하이드로겔의 탁도가 증가할 수 있다.
전자선을 펄스 조사하는 경우 한 주기 내에서 전자선의 조사가 이루어지는 단위 조사 시간, 즉 펄스 폭(pulse width)은 약 3초 이하, 또는 약 2.5초 이하, 바람직하게는 약 2초 이하일 수 있다. 전술한 것과 같은 농도 및 선량의 조건 하에서 펄스 폭이 3초를 초과할 경우 입자 간에 뭉치거나 들러붙는 현상, 나아가 벌크 형태의 겔이 형성되는 현상이 발생할 수 있다. 펄스 폭의 하한은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 1 밀리초 이상, 또는 약 10 밀리초 이상, 또는 약 100밀리초 이상일 수 있다.
비제한적인 몇몇 실시예에서, 전자선을 펄스 조사하는 경우 전자선의 선량은 점차 증가하는 것이 바람직할 수 있다. 예컨대 전자선의 조사 횟수가 증가함에 따라 선량률은 점진적으로 증가할 수 있다. 즉, 선량률이 변화함에도 불구하고 총 선량은 모두 5kGy 내지 10kGy의 범위 내에 있을 수 있다. 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니나 전자선 조사로 인해 마이크로겔화가 진행되는 과정에서 가교 효율이 점차 감소하는 것으로 추측되며, 따라서 선량률(단위 시간 당 에너지량)을 점진적으로 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
몇몇 실시예에서 전자선을 조사하여 히알루론산을 가교시키는 단계는 50℃ 내지 60℃의 온도에서 수행될 수 있다.
한편, 상기 제1 히알루론산 수용액은 게니핀의 유도체를 더 포함할 수 있다. 게니핀의 유도체는 하기 화학식 1로 표현되는 것으로서 에폭시기를 가질 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00001
게니핀 및 게니핀의 유도체는 히알루론산과의 반응이 용이하며 히알루론산과 가교가 가능할 수 있다. 즉, 게니핀 및 게니핀의 유도체는 가교제(생체 친화성 가교제)로 기능할 수 있으나, 게니핀 및 게니핀 유도체의 기능이 용어 '가교제'에 국한되는 것은 아니다. 게니핀은 생체 독성이 매우 낮아(LD50 i.v. 382 mg/kg in mice) 잔류 성분의 제거가 실질적으로 불필요한 반면에 제조되는 머크겔의 물성을 개선할 수 있다. 즉, 하이드로겔의 가교율을 높일 수 있으며 게니핀 유도체는 히알루론산과의 분자간 가교 결합을 형성할 수 있다. 반면, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니나 게니핀 유도체 분자 간의 가교 결합은 실질적으로 이루어지지 않을 수 있다.
본 발명의 발명자는 히알루론산에 전자선을 조사하여 마이크로겔을 제조함에 있어서 게니핀이 아닌 게니핀의 유도체를 혼합할 경우 가교 효율이 증가하는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니나 본 발명의 베스트 모드에 있어서 히알루론산 수용액은 게니핀을 실질적으로 불포함할 수 있다.
게니핀 유도체의 함량 범위는 히알루론산 대비 약 0.1wt% 내지 0.5wt%일 수 있다. 만일 게니핀 유도체의 함량이 상기 범위를 초과할 경우 마이크로겔이 투명하지 못하고 불투명해져 필러 조성물로 적용이 곤란할 수 있다.
한편 몇몇 실시예에서, 전술한 것과 같이 제1 히알루론산 수용액을 준비하고, 제1 히알루론산 수용액에 전자선을 펄스 또는 임펄스 형태로 조사하기 시작한 이후에, 제1 히알루론산 수용액과 제2 히알루론산 수용액을 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제2 히알루론산 수용액을 혼합하는 단계는 전자선의 조사를 수행하는 것과 동시에 이루어질 수 있다. 즉, 전자선을 조사하는 도중에 제2 히알루론산 수용액을 더 혼합할 수 있고 전자선의 조사는 멈추지 않고 계속해서 수행될 수 있다.
제2 히알루론산 수용액은 제1 히알루론산 수용액 보다 더 높은 농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 제2 히알루론산 수용액의 농도의 하한은 약 20w/v%, 또는 약 21w/v%, 또는 약 22w/v%, 또는 약 23w/v%, 또는 약 24w/v%, 또는 약 25w/v%일 수 있다.
제1 히알루론산 수용액 내 히알루론산과 제2 히알루론산 수용액 내 히알루론산은 모두 마이크로겔의 형성에 기여할 수 있다. 본 실시예에 따라 추가적인 히알루론산을 혼합 및 가교시킬 경우 마이크로겔의 입도 균일성을 개선하고 탄성을 보다 향상시킬 수 있다. 만일 제2 히알루론산 수용액의 농도가 제1 히알루론산 수용액의 농도 보다 작을 경우 제1 히알루론산과 제2 히알루론산 간의 가교가 이루어지지 않고 입도 분포가 매우 커질 수 있다. 즉, 제2 히알루론산이 마이크로겔이 아니라 나노 사이즈의 겔을 형성할 수 있어 바람직하지 않다.
반면, 제2 히알루론산 수용액의 농도의 상한은 약 30w/v%일 수 있다. 제2 히알루론산 수용액의 농도가 30w/v%를 초과할 경우 벌크 형태의 겔이 제조될 수 있고 입도가 지나치게 커질 수 있다. 제2 히알루론산의 분자량은 제1 히알루론산과 동일하거나 상이할 수 있다.
몇몇 실시예에서, 제1 히알루론산과 제2 히알루론산 간의 혼합은 교반을 통해 수행될 수 있다. 이 경우 상기 교반은 호모게나이저 등을 이용할 수 있으나 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다. 교반 속도의 하한은 특별히 제한되지 않으나 효율적인 교반의 측면에서 약 500rpm 이상일 수 있다. 반면 교반 속도가 너무 크면 형성된 마이크로겔이 분쇄되거나, 또는 효율적인 가교가 이루어지지 않을 수 있다. 교반 속도의 상한은 약 1,000rpm일 수 있다.
전술한 것과 같이 마이크로 사이즈를 갖는 하이드로겔, 즉 마이크로겔을 필러 시술용으로 이용할 경우 입자의 입도 균일성이 매우 중요한 요소이다. 본 발명에 따르면 수십 마이크로 내지 수백 마이크로 수준의 입도를 가지며 입도 균일성이 우수한 마이크로겔을 수득할 수 있다.
상술한 본 발명의 실시예들에 따라 제조된 하이드로겔은 필러 시술용 머크겔로서 사용되기 위해 공지의 첨가 공정이나 멸균 공정 등을 추가적으로 거칠 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 필러 시술용 하이드로겔은 일반적으로 생리학적으로 허용되는 담체 유체, 예컨대 등장 완충액, 특히 바람직하게는 완충된 생리학적 식염수 용액을 포함할 수 있다.
예시적인 실시예에서, 본 발명의 필러 시술용 하이드로겔은 상기 조성물 100 중량부 대비 히알루론산의 체내 지속성 향상용 조성물을 1중량부 내지 20중량부로 포함할 수 있다.
본 발명의 필러 시술용 하이드로겔은 바람직하게는 미용적 질환을 치료하기 위해, 예컨대 피부의 주름살 또는 주름(예를 들어, 안면 주름 및 안면 주름살), 미간 주름, 비구순 주름, 턱 주름, 마리오네트 주름, 구강 교련, 입주위 주름살, 눈가 잔주름, 피부 함몰부, 흉터, 관자, 눈썹의 진피하 지지부, 광대 및 볼 지방 패드, 눈물 도랑, 코, 입술, 뺨, 입주위 영역, 안와하 영역, 안면 비대칭, 아래턱선 및 턱의 치료를 위해 투여될 수 있다. 또는, 치료적 적응증, 예컨대 복압성 요실금, 방광-요관 역류, 성대 주름 부전, 성대 주름 내측화를 치료하기 위해 투여될 수도 있다.
이하에서는 본 발명의 실시예들을 구체적인 제조예 및 실험예 등을 통해 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 머크 하이드로겔(hydrogel)의 제조 (실시예 1-1 내지 3-3)
약 200kDa의 히알루론산(hyaluronic acid)을 물에 녹여 5, 15 및 30 w/v% 수용액을 제조하고, 제조된 히알루론산 수용액에 직류형 전자선 가속기(electron-beam accelerator)를 사용하여 전자선을 1분간 하기 표 1과 같은 선량이 되도록 조사하여 히알루론산의 가교를 유도함으로써 실시예 1-1 내지 실시예 3-3의 하이드로겔을 제조하였다.
선량 / 농도 5 w/v% 15 w/v% 30 w/v%
0.1 kGy 실시예 1-1 실시예 2-1 실시예 3-1
3 kGy 실시예 1-2 실시예 2-2 실시예 3-2
10 kGy 실시예 1-3 실시예 2-3 실시예 3-3
실험예 1: 머크 하이드로겔의 점도(viscosity) 측정
Anton-Paar MCR 302 rheometer로 실시예 1-1 내지 실시예 3-3의 1 Hz에서의 점도를 측정하였으며, 결과는 하기 표 2와 같았다.
점도 (Pa·s)
실시예 1-1 0.038 실시예 2-1 0.051 실시예 3-1 0.17
실시예 1-2 196 실시예 2-2 882 실시예 3-2 1050
실시예 1-3 2 실시예 2-3 101 실시예 3-3 244
상기 표 2와 같은 점도는 실시예 1-1 내지 실시예 3-3의 벌크화 또는 겔화된 정도를 나타낼 수 있다. 실시예 1-1, 1-3, 2-1, 3-1의 경우 점도가 매우 낮고 가교가 충분히 이루어지지 않았거나, 나노 사이즈의 입자화가 이루어진 것으로 추측된다. 또한, 실시예 2-3 및 실시예 3-3의 경우 벌크화가 상당한 정도로 이루어진 것과 별개로, 머크겔이 균일한 점도를 갖지 못하고 부분적으로 상이한 점도를 갖는 것을 확인할 수 있었다. 특히 실시예 3-3의 경우 부분적으로 불투명한 정도가 심하였다.
이와 같이, 전자선의 선량이 3kGy에 가까울 수록, 히알루론산의 농도가 높을수록 가교가 잘되어 높은 점도 및 점탄성을 갖는 머크겔을 얻을 수 있음을 알 수 있다. 이는 전자선의 선량이 3kGy 보다 너무 낮으면 자유 라디칼의 생성이 어려워 가교가 충분히 일어나지 않고, 3kGy 보다 너무 높으면 히알루론산 사슬이 절단되어 분해가 일어나기 때문인 것으로 추측된다. 다만 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아님은 물론이다.
제조예 2: 마이크로겔의 제조 (실시예 4)
이번에는 상기 제조예 1을 통해 가장 바람직한 것으로 확인된 히알루론산의 농도와 전자선의 선량을 채택하여 약 200kDa 히알루론산 15w/v% 수용액에 3kGy 선량의 전자선을 조사하되, 전자선을 펄스 조사하여 히알루론산의 가교를 유도함으로써 실시예 4의 하이드로겔을 제조하였다.
구체적으로, 전자선의 펄스 조사가 총 20분 동안 7초의 주기를 갖도록 이루어지되, 각 주기 내에서 전자선은 2초간 조사되고 나머지 5초간 휴지기를 갖도록 하였다.
실험예 2: 마이크로겔의 입자 크기 및 점도 확인
실시예 4의 하이드로겔의 입자 크기를 DLS(Dynamic light scattering)로 확인하였으며, 그 결과는 도 1과 같았다. 또한, Anton-Paar MCR 302 rheometer로 실시예 4의 1 Hz에서 측정한 점도는 37Pa·s였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 전자선을 펄스 조사함으로써 상기 제조예 1을 통해 머크겔이 제조된 것과는 달리 필러 시술용으로 바로 사용하기에 적합한 입도를 갖는 마이크로겔이 제조되었음을 알 수 있다.
제조예 3: 마이크로겔의 제조 (실시예 5-1 내지 5-6)
상기 제조예 2와 동일한 방식으로 전자선을 펄스 조사하되, 히알루론산 수용액의 농도와 전자선의 총 선량을 하기 표 3과 같이 달리하여 히알루론산의 가교를 유도함으로써 실시예 5-1 내지 실시예 5-6의 하이드로겔을 제조하였다.
농도/선량 5kGy 10kGy
18w/v% 실시예 5-1 실시예 5-4
22w/v% 실시예 5-2 실시예 5-5
25w/v% 실시예 5-3 실시예 5-6
실험예 3: 마이크로겔의 입자 크기 확인
실시예 5-1 내지 실시예 5-6의 하이드로겔의 입자 크기를 DLS로 확인하였다.
도 2는 그 중 실시예 5-1, 5-2 및 5-6의 하이드로겔의 입자 크기를 DLS로 확인한 결과로서, (A) 내지 (C)는 각각 실시예 5-1, 5-2 및 5-6을 나타낸다. 도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 5-1, 5-2 및 5-6의 하이드로겔 입자가 도 1에 나타난 실시예 4의 하이드로겔 입자보다 균일하며, 특히 농도가 22w/v%인 것이 가장 입자가 균일함을 알 수 있다.
제조예 4: 마이크로겔의 제조 (실시예 6-1 내지 6-3)
상기 제조예 3의 실시예 5-2와 동일한 히알루론산 농도와 전자선 선량을 사용하되, 하기 표 4와 같이 펄스 방식을 달리하여 히알루론산의 가교를 유도함으로써 실시예 6-1 내지 실시예 6-3의 하이드로겔을 제조하였다.
각 주기 내 조사 시간
(단위 조사 시간)		 총 조사 시간
실시예 6-1 4초 20분
실시예 6-2 2초 5분
실시예 6-3 2초 80분
실험예 4: 마이크로겔의 입자 크기 확인
실시예 6-1 내지 실시예 6-3의 하이드로겔의 입자 크기를 DLS로 확인하였다.
도 3은 하이드로겔의 입자 크기를 DLS로 확인한 결과로서, (A) 내지 (C)는 각각 실시예 6-1, 6-2 및 6-3을 나타낸다. 도 3에 나타난 바와 같이, 각 주기 내 조사 시간인 단위 조사 시간이 2초보다 길거나 총 조사 시간이 20분보다 너무 짧거나 길면 입자 크기의 분포가 불균일해짐을 알 수 있다. 또, 실시예 6-2 및 6-3의 경우 입자 크기가 지나치게 감소하는 것을 확인하였다.
제조예 5: 고농도 히알루론산 수용액을 혼합하며 마이크로겔 제조 (실시예 7-1 내지 7-3)
상기 제조예 3의 실시예 5-2와 동일한 방법으로 히알루론산 수용액에 전자선을 펄스 조사하면서, 동시에 상기 히알루론산 수용액에 약 200kDa의 다른 히알루론산 수용액을 조금씩 가하면서 교반기로 혼합하였다. 교반기의 교반 속도 및 첨가해주는 히알루론산 수용액의 농도를 하기 표 5와 같이 달리하여 히알루론산의 가교를 유도함으로써 실시예 7-1 내지 실시예 7-3의 하이드로겔을 제조하였다.
교반 속도 (rpm) 농도 (w/v%)
실시예 7-1 1000 27
실시예 7-2 2000 27
실시예 7-3 1000 15
실험예 5: 마이크로겔의 입자 크기 확인
실시예 7-1 및 실시예 7-2의 하이드로겔의 입자 크기를 DLS로 확인하였다.
도 4는 하이드로겔의 입자 크기를 DLS로 확인한 결과로서, (A) 및 (B)는 각각 실시예 7-1 및 7-2를 나타낸다.
도 4에 나타난 바와 같이, 전자선의 펄스 조사와 함께 상대적으로 고농도의 히알루론산 수용액을 혼합하면 상기 실시예 5-2보다 입자 크기가 균일한 마이크로겔을 얻을 수 있고 입자 크기가 증가할 수 있으나, 실시예 7-2과 같이 혼합 시 교반 속도가 너무 높으면(2000rpm) 입자가 분쇄되어 바람직하지 않음을 알 수 있다.
한편, 실시예 7-3은 DLS 상에서 뚜렷한 피크를 얻기 어려웠는데, 이를 통해 첨가해주는 히알루론산 수용액의 농도가 상대적으로 낮을 경우 입자 크기의 분포가 매우 불균일해짐을 추측할 수 있다.
제조예 6: 생체 친화성 가교제를 첨가하여 마이크로겔을 제조 (실시예 8-1 및 8-2)
상기 제조예 3의 실시예 5-2와 동일한 방법으로 히알루론산 수용액에 전자선을 펄스 조사하되, 상기 히알루론산 수용액은 생체 친화성 가교제인 게니핀(Genipin; Sigma-Aldrich)과 하기 화학식 1로 표현되는 그 유도체를 각각 히알루론산 대비 0.5 wt%로 첨가한 것을 사용하였다(실시예 8-1 및 실시예 8-2). 하기 화학식 1의 게니핀 유도체는 공지된 합성 방법을 이용하여 제조한 것을 이용하였다. (J. Luo, et al., ChemMedChem (2012) 1661-8)
[화학식 1]
Figure pat00002
실험예 6: 마이크로겔의 점도 확인
Anton-Paar MCR 302 rheometer로 실시예 7-1 및 실시예 7-2의 1 Hz에서의 점도를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 6과 같았다.
점도 (Pa·s)
실시예 7-1 45
실시예 7-2 101
상기 표 6에 나타난 바와 같이, 게니핀을 첨가한 경우 마이크로겔의 점도에 큰 변화가 없는 반면, 상기 화학식 1로 표현되는 게니핀의 유도체를 첨가한 경우 마이크로겔의 점도가 상당한 수준으로 향상되었음을 알 수 있다.
앞서 설명한 것과 같이, 히알루론산 등의 생체 적합성 고분자에 전자선을 조사하여 나노 사이즈의 입자를 형성하는 것이 보고된 바 있다. 그러나 나노 사이즈의 입자는 필러 시술용 하이드로겔로 적용이 불가능한 한계가 있으며, 본 발명의 발명자는 마이크로 사이즈의 겔을 형성하기 위한 시도를 하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명에 따르면 단순히 입자의 크기를 나노 사이즈에서 마이크로 사이즈로 증가시키는 것을 넘어 전자선 가교 만으로 마이크로겔을 형성할 수 있다. 또 마이크로겔이 우수한 입도 및 점도를 가짐으로써 필러 시술 등을 위한 하이드로겔로서 바로 적용할 수 있다는 효과가 있다.
이하, 제2 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
[제2 발명]
(A)하이드로겔의 제조 방법
본 발명의 일 실시예(즉, 제2 발명의 일 실시예)에 따른 하이드로겔의 제조 방법은 (a)다당 수용액을 준비하는 단계, 및 (b)전자선을 조사하여 하이드로겔 입자를 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 이하 각 단계에 대하여 설명한다.
(a)다당 수용액을 준비하는 단계
본 명세서에서 사용되는 용어 '다당(polysaccharide)'은 3개 이상의 단당이 글리코시드 결합을 형성한 분자를 총칭한다. 다당은 올리고당을 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 상기 글리코시드 결합은 α-글리코시드 및 β-글리코시드를 포함할 수 있다. 다당은 분자 내에 하이드록실기, 아미노기 및/또는 카르복실산기 등을 가지고 있어 반응성이 우수할 수 있다.
다당은 생체 적합성을 가지고 수용성을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 다당의 예로는 젤라틴, 키토산(chitosan), 콜라겐, 만난, 덱스트란(dextran), 덱스트란설페이트, α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, 말토덱스트린(maltodextrin), 프룩토올리고당, 이소말토올리고당, 이눌린, 히알루론산(hyaluronic acid), 알지네이트(alginate), 글리코겐, 아밀로펙틴, 아밀로스, 수크로스, 아가로스, 갈락토스, 카르복시메틸덱스트란, 베타글루칸, 에피클로로히드린, 하이드록시에틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 푸코이단(fucoidan), 콘드로이틴 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 키토산, 만난, 히알루론산, 사이클로덱스트린, 덱스트란, 알지네이트, 프룩토올리고당, 이소말토올리고당, 푸코이단 또는 카르복시메틸덱스트란이거나, 또는 이들의 유도체일 수 있다. 더 바람직하게는 히알루론산, 덱스트란 또는 푸코이단이거나, 또는 이들의 유도체일 수 있다.
이러한 다당은 분자간 또는 분자내 가교 결합에 의해 하이드로겔을 형성할 수 있다. 다당의 가교는 후술할 바와 같이 전자선의 조사에 의해 수행될 수 있으며 추가적인 가교제의 혼합 없이도 진행될 수 있다. 즉, 가교제는 가교체의 점탄성을 증가시킬 수 있으나, 생체 내에서 분해되거나 또는 미반응된 잔류 가교제는 독성을 유발하여 체내에서 염증 반응을 야기할 수 있다. 따라서 이러한 미반응 가교제를 제거하기 위해서 가교제 제거 공정 등을 거쳐야 하는데 비경제성을 유발할 수 있다. 반면 본 발명에 따른 제조 방법에 따를 경우 전자선의 조사 만으로 다당을 가교시킬 수 있는 장점이 있다.
다당 수용액의 농도는 다당의 종류와 가교 반응성을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 다당 수용액의 농도는 약 0.1%(w/v), 또는 약 0.5%(w/v), 또는 약 0.7%(w/v), 또는 약 1.0%(w/v), 또는 약 2.0%(w/v), 또는 약 3.0%(w/v), 또는 약 4.0%(w/v), 또는 약 5.0%(w/v), 또는 약 6.0%(w/v), 또는 약 7.0%(w/v), 또는 약 8.0%(w/v), 또는 약 9.0%(w/v), 또는 약 10.0%(w/v), 또는 약 11.0%(w/v), 또는 약 12.0%(w/v), 또는 약 13.0%(w/v), 또는 약 14.0%(w/v), 또는 약 15.0%(w/v), 또는 약 16.0%(w/v), 또는 약 17.0%(w/v), 또는 약 18.0%(w/v), 또는 약 19.0%(w/v), 또는 약 20.0%(w/v), 또는 약 21.0%(w/v), 또는 약 22.0%(w/v), 또는 약 23.0%(w/v), 또는 약 24.0%(w/v), 또는 약 25.0%(w/v), 또는 약 30.0%(w/v), 또는 약 35.0%(w/v), 또는 약 40.0%(w/v), 또는 약 40.0%(w/v), 또는 약 50.0%(w/v)일 수 있다.
본 명세서에서 복수의 수치 값이 기재된 경우, 본 명세서는 임의의 두 수치를 각각 상한과 하한으로 하는 수치 범위를 함께 개시하는 것으로 이해될 수 있다. 예를 들어, 상기 다당 수용액의 농도는 약 0.1%(w/v) 내지 10.0%(w/v), 약 1.0%(w/v) 내지 15.0%(w/v), 또는 약 5.0%(w/v) 내지 20.0%(w/v)일 수 있다. 또한 본 명세서에서 두개 또는 그 이상의 수치 값이 기재된 경우, 본 명세서는 두개의 수치 사이에 존재하는 임의의 수치를 함께 개시하는 것으로 이해될 수 있다. 예를 들어, 상기 다당 수용액의 농도는 약 0.8%(w/v) 또는 약 0.9%(w/v)일 수도 있다.
다당 수용액 내 다당의 농도는 전자선의 조사에 의해 형성되는 하이드로겔의 형태에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 수용액의 농도가 너무 높을 경우 가교도와 점도가 높은 점탄성체가 형성될 수 있고, 수용액의 농도가 너무 낮을 경우 가교도와 점도가 낮은 점탄성체가 형성될 수 있다.
다당 또는 그 유도체의 분자량은 다당의 종류와 가교 반응성을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 다당의 분자량은 약 0.1kDa, 또는 약 0.5kDa, 또는 약 0.6kDa, 또는 약 0.7kDa, 또는 약 0.8kDa, 또는 약 0.9kDa, 또는 약 1.0kDa, 또는 약 1.1kDa, 또는 약 1.2kDa, 또는 약 1.3kDa, 또는 약 1.4kDa, 또는 약 1.5kDa, 또는 약 1.6kDa, 또는 약 1.7kDa, 또는 약 1.8kDa, 또는 약 1.9kDa, 또는 약 2.0kDa, 또는 약 3.0kDa, 또는 약 4.0kDa, 또는 약 5.0kDa, 또는 약 6.0kDa, 또는 약 7.0kDa, 또는 약 8.0kDa, 또는 약 9.0kDa, 또는 약 10kDa, 또는 약 11kDa, 또는 약 12kDa, 또는 약 13kDa, 또는 약 14kDa, 또는 약 15kDa, 또는 약 16kDa, 또는 약 17kDa, 또는 약 18kDa, 또는 약 19kDa, 또는 약 20kDa, 또는 약 30kDa, 또는 약 40kDa, 또는 약 50kDa, 또는 약 60kDa, 또는 약 70kDa, 또는 약 80kDa, 또는 약 90kDa, 또는 약 100kDa, 또는 약 150kDa, 또는 약 200kDa, 또는 약 250kDa, 또는 약 300kDa, 또는 약 350kDa, 또는 약 400kDa, 또는 약 450kDa, 또는 약 500kDa, 또는 약 600kDa, 또는 약 700kDa, 또는 약 800kDa, 또는 약 900kDa, 또는 약 1,000kDa, 또는 약 1,200kDa, 또는 약 1,400kDa, 또는 약 1,600kDa, 또는 약 1,800kDa, 또는 약 2,000kDa, 또는 약 2,500kDa, 또는 약 3,000kDa, 또는 약 3,500kDa, 또는 약 4,000kDa, 또는 약 4,500kDa, 또는 약 5,000kDa일 수 있다. 전술한 것과 같이, 본 발명에 따른 다당의 분자량은 상기에 기재된 임의의 두 수치를 각각 상한과 하한으로 하는 수치 범위, 및/또는 임의의 두 수치 사이의 수치값을 함께 개시하는 것으로 이해될 수 있다.
다당 수용액의 pH는 다당의 종류와 가교 반응성을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어 다당 수용액의 pH는 약 0.5, 또는 약 1.0, 또는 약 1.5, 또는 약 2.0, 또는 약 2.5, 또는 약 3.0, 또는 약 3.5, 또는 약 4.0, 또는 약 4.5, 또는 약 5.0, 또는 약 5.5, 또는 약 6.0, 또는 약 6.5, 또는 약 7.0, 또는 약 7.5, 또는 약 8.0, 또는 약 8.5, 또는 약 9.0, 또는 약 9.5, 또는 약 10.0, 또는 약 10.5, 또는 약 11.0, 또는 약 11.5, 또는 약 12.0, 또는 약 12.5, 또는 약 13.0, 또는 약 13.5, 또는 약 14.0일 수 있다. 전술한 것과 같이, 본 발명에 따른 다당 수용액의 pH는 상기에 기재된 임의의 두 수치를 각각 상한과 하한으로 하는 수치 범위, 및/또는 임의의 두 수치 사이의 수치값을 함께 개시하는 것으로 이해될 수 있다.
다당 수용액의 점도는 다당의 종류와 가교 반응성을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어 다당 수용액의 점도는 0.005Pa·s, 또는 약 0.01Pa·s, 또는 약 0.02Pa·s, 또는 약 0.03Pa·s, 또는 약 0.04Pa·s, 또는 약 0.05Pa·s, 또는 약 0.06Pa·s, 또는 약 0.07Pa·s, 또는 약 0.08Pa·s, 또는 약 0.09Pa·s, 또는 약 0.1Pa·s, 또는 약 0.2Pa·s, 또는 약 0.3Pa·s, 또는 약 0.4Pa·s, 또는 약 0.5Pa·s, 또는 약 0.6Pa·s, 또는 약 0.7Pa·s, 또는 약 0.8Pa·s, 또는 약 0.9Pa·s, 또는 약 1.0Pa·s일 수 있다. 전술한 것과 같이, 본 발명에 따른 다당 수용액의 점도는 상기에 기재된 임의의 두 수치를 각각 상한과 하한으로 하는 수치 범위, 및/또는 임의의 두 수치 사이의 수치값을 함께 개시하는 것으로 이해될 수 있다.
몇몇 실시예에서, 다당 수용액은 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol), PEG) 및/또는 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜에테르(poly(ethylene glycol) diglycidyl ether, PEGDE) 등의 글리콜 물질을 더 포함할 수 있다.
폴리에틸렌글리콜 단독, 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜에테르 단독, 또는 이들의 혼합물의 다당 수용액 중의 농도는 약 0.1%(w/v), 또는 약 0.5%(w/v), 또는 약 0.7%(w/v), 또는 약 1.0%(w/v), 또는 약 2.0%(w/v), 또는 약 3.0%(w/v), 또는 약 4.0%(w/v), 또는 약 5.0%(w/v), 또는 약 6.0%(w/v), 또는 약 7.0%(w/v), 또는 약 8.0%(w/v), 또는 약 9.0%(w/v), 또는 약 10.0%(w/v), 또는 약 11.0%(w/v), 또는 약 12.0%(w/v), 또는 약 13.0%(w/v), 또는 약 14.0%(w/v), 또는 약 15.0%(w/v), 또는 약 16.0%(w/v), 또는 약 17.0%(w/v), 또는 약 18.0%(w/v), 또는 약 19.0%(w/v), 또는 약 20.0%(w/v), 또는 약 21.0%(w/v), 또는 약 22.0%(w/v), 또는 약 23.0%(w/v), 또는 약 24.0%(w/v), 또는 약 25.0%(w/v), 또는 약 30.0%(w/v), 또는 약 35.0%(w/v), 또는 약 40.0%(w/v), 또는 약 40.0%(w/v), 또는 약 50.0%(w/v)일 수 있다. 전술한 것과 같이, 본 발명에 따른 글리콜의 농도는 상기에 기재된 임의의 두 수치를 각각 상한과 하한으로 하는 수치 범위, 및/또는 임의의 두 수치 사이의 수치값을 함께 개시하는 것으로 이해될 수 있다.
또 가교 결합을 촉진하기 위해 사염화탄소 등의 촉진제를 더 포함할 수도 있다. 또, 점도를 조절하기 위해 점도 조절제를 더 포함할 수 있다. 또한 다당 수용액은 종래 사용되는 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(1,4-Butanediol diglycidyl ether, BDDE) 등의 가교제는 불포함할 수 있다. 나아가 다당 수용액은 유기 용매는 불포함할 수 있다.
(b)전자선을 조사하는 단계
본 단계는 전술한 다당류의 가교를 유도하는 단계일 수 있다. 즉, 다당은 분자간 또는 분자내 가교 결합에 의해 하이드로겔을 형성할 수 있다. 예컨대, 다당 내에 존재하는 공유 결합이 끊어지고 비공유 전자쌍을 함유한 라디칼이 형성될 수 있다. 이에 따라 가교가 발생할 수 있으나, 본 발명이 어떠한 이론에 국한되지 않음은 물론이다.
전자선의 조사량, 즉 선량은 다당의 종류와 가교 반응성을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어 전자선의 선량은 약 0.01kGy, 또는 약 0.05kGy, 또는 약 0.1kGy, 또는 약 0.2kGy, 또는 약 0.3kGy, 또는 약 0.4kGy, 또는 약 0.5kGy, 또는 약 1.0kGy, 또는 약 1.5kGy, 또는 약 2.0kGy, 또는 약 2.5kGy, 또는 약 3.0kGy, 또는 약 3.5kGy, 또는 약 4.0kGy, 또는 약 4.5kGy, 또는 약 5.0kGy, 또는 약 5.5kGy, 또는 약 6.0kGy, 또는 약 6.5kGy, 또는 약 7.0kGy, 또는 약 7.5kGy, 또는 약 8.0kGy, 또는 약 8.5kGy, 또는 약 9.0kGy, 또는 약 9.5kGy, 또는 약 10.0kGy, 또는 약 11.0kGy, 또는 약 12.0kGy, 또는 약 13.0kGy, 또는 약 14.0kGy, 또는 약 15.0kGy, 또는 약 20.0kGy, 또는 약 25.0kGy, 또는 약 30.0kGy, 또는 약 40.0kGy, 또는 약 50.0kGy, 또는 약 60.0kGy, 또는 약 70.0kGy, 또는 약 80.0kGy, 또는 약 90.0kGy, 또는 약 100.0kGy, 또는 약 150.0kGy, 또는 약 200.0kGy, 또는 약 250.0kGy, 또는 약 300.0kGy, 또는 약 350.0kGy, 또는 약 400.0kGy, 또는 약 450.0kGy, 또는 약 500.0kGy일 수 있다. 전술한 것과 같이, 본 발명에 따른 전자선의 선량은 상기에 기재된 임의의 두 수치를 각각 상한과 하한으로 하는 수치 범위, 및/또는 임의의 두 수치 사이의 수치값을 함께 개시하는 것으로 이해될 수 있다.
전자선의 조사 시간은 다당의 종류와 가교 반응성을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어 전자선의 조사 시간은 약 1.0초, 또는 약 2.0초, 또는 약 3.0초, 또는 약 4.0초, 또는 약 5.0초, 또는 약 10.0초, 또는 약 15.0초, 또는 약 20.0초, 또는 약 25.0초, 또는 약 30.0초, 또는 약 35.0초, 또는 약 40.0초, 또는 약 45.0초, 또는 약 50.0초, 또는 약 55.0초, 또는 약 60.0초, 또는 약 90.0초, 또는 약 120.0초, 또는 약 150.0초, 또는 약 180.0초, 또는 약 210.0초, 또는 약 240.0초, 또는 약 270.0초, 또는 약 300.0초, 또는 약 360.0초, 또는 약 420.0초, 또는 약 480.0초, 또는 약 540.0초, 또는 약 600초, 또는 약 11분, 또는 약 12분, 또는 약 13분, 또는 약 14분, 또는 약 15분, 또는 약 16분, 또는 약 17분, 또는 약 18분, 또는 약 19분, 또는 약 20분, 약 30분, 또는 약 40분, 또는 약 50분, 또는 약 60분, 또는 약 70분, 또는 약 80분, 또는 약 90분, 또는 약 100분, 또는 약 110분, 또는 약 120분, 또는 약 150분, 또는 약 180분, 또는 약 분, 또는 약 분, 또는 약 분, 또는 약 300분, 또는 약 6시간, 또는 약 7시간, 또는 약 8시간, 또는 약 9시간, 또는 약 10시간일 수 있다. 전술한 것과 같이, 본 발명에 따른 전자선의 조사 시간은 상기에 기재된 임의의 두 수치를 각각 상한과 하한으로 하는 수치 범위, 및/또는 임의의 두 수치 사이의 수치값을 함께 개시하는 것으로 이해될 수 있다.
몇몇 실시예에서, 다당의 가교를 위한 전자선의 조사에 있어서, 전자선의 조사는 도중에 휴지기를 가지고 수행될 수 있다. 비제한적인 예시로서, 전자선을 약 10초간 조사한 후 약 20초를 조사하지 않고, 다시 전자선의 조사를 시작할 수 있다. 이러한 과정은 복수회 수행될 수 있다.
전자선의 선량률은 총 선량을 조사 시간으로 나눈 것으로 이해될 수 있다. 전자선의 선량률은 선량과 조사 시간을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 다당의 가교를 위한 전자선의 조사에 있어서, 전자선의 선량률은 증가하거나, 감소하거나, 유지되는 등의 패턴을 가지고 조사될 수 있다. 비제한적인 예시로서, 소정의 시간 동안 전자선의 선량률을 증가시키다가, 소정의 시간 동안 전자선의 선량률을 유지하다가, 다시 소정의 시간 동안 전자선의 선량률을 감소시킬 수 있다. 이러한 과정은 복수회 수행될 수도 있다.
전자선이 조사되는 동안 다당 수용액은 소정 온도가 유지될 수 있다. 온도는 다당의 종류와 가교 반응성을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어 가교 온도는 약 15℃, 또는 약 20℃, 또는 약 25℃, 또는 약 30℃, 또는 약 31℃, 또는 약 32℃, 또는 약 33℃, 또는 약 34℃, 또는 약 35℃, 또는 약 36℃, 또는 약 37℃, 또는 약 38℃, 또는 약 39℃, 또는 약 40℃, 또는 약 41℃, 또는 약 42℃, 또는 약 43℃, 또는 약 44℃, 또는 약 45℃, 또는 약 46℃, 또는 약 47℃, 또는 약 48℃, 또는 약 49℃, 또는 약 50℃, 또는 약 51℃, 또는 약 52℃, 또는 약 53℃, 또는 약 54℃, 또는 약 55℃, 또는 약 60℃, 또는 약 65℃, 또는 약 70℃, 또는 약 75℃, 또는 약 80℃일 수 있다. 전술한 것과 같이, 본 발명에 따른 가교 온도는 상기에 기재된 임의의 두 수치를 각각 상한과 하한으로 하는 수치 범위, 및/또는 임의의 두 수치 사이의 수치값을 함께 개시하는 것으로 이해될 수 있다.
몇몇 실시예에서, 다당의 가교를 위한 전자선의 조사에 있어서 온도는 증가하거나, 감소하거나, 유지되는 등의 패턴을 가질 수 있다. 비제한적인 예시로서, 소정의 시간 동안 온도를 증가시키다가, 소정의 시간 동안 온도를 유지하다가, 다시 소정의 시간 동안 온도를 감소시킬 수 있다. 이러한 과정은 복수회 수행될 수도 있다.
전자선이 조사되는 동안 다당 수용액은 호모게나이저 등을 이용하여 교반이 수행될 수 있다. 예를 들어 교반 속도는 약 500rpm, 또는 약 1,000rpm, 또는 약 1,100rpm, 또는 약 1,200rpm, 또는 약 1,300rpm, 또는 약 1,400rpm, 또는 약 1,500rpm, 또는 약 1,600rpm, 또는 약 1,700rpm, 또는 약 1,800rpm, 또는 약 1,900rpm, 또는 약 2,000rpm, 또는 약 2,100rpm, 또는 약 2,200rpm, 또는 약 2,300rpm, 또는 약 2,400rpm, 또는 약 2,500rpm, 약 2,600rpm, 또는 약 2,700rpm, 또는 약 2,800rpm, 또는 약 2,900rpm, 또는 또는 약 3,000rpm, 또는 약 3,500rpm, 또는 약 4,000rpm, 또는 약 4,500rpm, 또는 약 5,000rpm, 또는 약 6,000rpm일 수 있다. 전술한 것과 같이, 본 발명에 따른 교반 속도는 상기에 기재된 임의의 두 수치를 각각 상한과 하한으로 하는 수치 범위, 및/또는 임의의 두 수치 사이의 수치값을 함께 개시하는 것으로 이해될 수 있다.
(c)로딩체를 봉입하는 단계
몇몇 실시예에서, 가교된 하이드로겔에 로딩체 등이 탑재될 수 있다. 로딩 공정은 입자상 하이드로겔에 로딩체를 첨가한 후 교반하여 수행될 수 있다. 교반 속도는 특별히 제한되지 않으나, 교반 속도는 100rpm, 또는 약 200rpm, 또는 약 300rpm, 또는 약 400rpm, 또는 약 500rpm, 또는 약 1,000rpm, 또는 약 1,100rpm, 또는 약 1,200rpm, 또는 약 1,300rpm, 또는 약 1,400rpm, 또는 약 1,500rpm, 또는 약 1,600rpm, 또는 약 1,700rpm, 또는 약 1,800rpm, 또는 약 1,900rpm, 또는 약 2,000rpm, 또는 약 2,100rpm, 또는 약 2,200rpm, 또는 약 2,300rpm, 또는 약 2,400rpm, 또는 약 2,500rpm, 약 2,600rpm, 또는 약 2,700rpm, 또는 약 2,800rpm, 또는 약 2,900rpm, 또는 또는 약 3,000rpm, 또는 약 3,500rpm, 또는 약 4,000rpm, 또는 약 4,500rpm, 또는 약 5,000rpm, 또는 약 6,000rpm일 수 있다. 전술한 것과 같이, 본 발명에 따른 교반 속도는 상기에 기재된 임의의 두 수치를 각각 상한과 하한으로 하는 수치 범위, 및/또는 임의의 두 수치 사이의 수치값을 함께 개시하는 것으로 이해될 수 있다.
로딩체는 약물 전달 시스템(drug delivery system)에서 통상적으로 이용되는 공지의 것을 포함할 수 있다.
예를 들어서 로딩체는 약물을 포함할 수 있다. 또, 약물은 항생체, 항암제, 진통제, 소염제, 진해제, 거담제, 진정제, 근육 이완제, 간질 치료제, 궤양 치료제, 항우울제, 항알러지제, 강심제, 항부정맥제, 혈관 확장제, 이뇨제, 당뇨병 치료제, 응고 방지제, 지혈제, 항결절제, 호르몬제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
다른 예를 들어서 로딩체는 진단 표지자를 포함할 수 있다. 진단 표지자의 예로는 형광 물질, 방사성 동위원소, 조영제 등을 들 수 있다. 구체적으로, 컴퓨터단층촬영(CT)용 방사성 표지 물질은 99mTc, 123I, 125I, 111In, 67Ga, 177Lu, 201Tl 및 117mSn 등을 예시할 수 있다. 또, 양전자단층촬영용 표지 물질은 11C, 13N, 15O, 18F, 38K, 62Cu, 64Cu, 68Ga, 82Rb, 124I 및 89Zr 등을 예시할 수 있다. 또한 형광 물질의 예로는 CdSe, CdS, ZnS 및 ZnSe 등의 양자점을 들 수 있다.
초음파 조영제의 예로는 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로헥산, 설퍼헥사플루오라이드, 퍼플루오로펜탄 및 데카플루오로부탄 등을 들 수 있다.
(B)하이드로겔
본 발명에 따라 제조된 하이드로겔은 입자 형태를 가질 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 하이드로겔은 나노 사이즈 내지는 마이크로 사이즈를 가질 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔의 평균 입도는 약 10nm, 또는 약 20nm, 또는 약 30nm, 또는 약 40nm, 또는 약 50nm, 또는 약 60nm, 또는 약 70nm, 또는 약 80nm, 또는 약 90nm, 또는 약 100nm, 또는 약 150nm, 또는 약 200nm, 또는 약 250nm, 또는 약 300nm, 또는 약 350nm, 또는 약 400nm, 또는 약 450nm, 또는 약 500nm, 또는 약 550nm, 또는 약 600nm, 또는 약 700nm, 또는 약 800nm, 또는 약 900nm일 수 있다. 또는 하이드로겔의 평균 입도는 약 10㎛, 또는 약 20㎛, 또는 약 30㎛, 또는 약 40㎛, 또는 약 50㎛, 또는 약 60㎛, 또는 약 70㎛, 또는 약 80㎛, 또는 약 90㎛, 또는 약 100㎛, 또는 약 150㎛, 또는 약 200㎛, 또는 약 250㎛, 또는 약 300㎛, 또는 약 350㎛, 또는 약 400㎛, 또는 약 450㎛, 또는 약 500㎛, 또는 약 550㎛, 또는 약 600㎛, 또는 약 650㎛, 또는 약 700㎛, 또는 약 750㎛, 또는 약 800㎛일 수 있다. 전술한 것과 같이, 본 발명에 따른 하이드로겔의 평균 입도는 상기에 기재된 임의의 두 수치를 각각 상한과 하한으로 하는 수치 범위, 및/또는 임의의 두 수치 사이의 수치값을 함께 개시하는 것으로 이해될 수 있다.
(C)하이드로겔 조성물
본 발명에 따른 입자상 하이드로겔은 일반적으로 생리학적으로 허용되는 담체 유체, 예컨대 등장 완충액, 특히 바람직하게는 완충된 생리학적 식염수 용액을 포함할 수 있다.
몇몇 실시예에서, 하이드로겔 조성물은 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 보존제, pH 조절제 및/또는 점도 조절제 등을 더 포함할 수도 있다.
하이드로겔 조성물의 점도는 레오미터(Rheometer)로 20℃ 및 1Hz 조건에서 측정된 것일 수 있다. 예를 들어, 입자 상의 하이드로겔의 점도는 약 0.0001Pa·s, 또는 약 0.001Pa·s, 또는 약 0.01Pa·s, 또는 약 0.1Pa·s, 또는 약 1.0Pa·s, 또는 약 2.0Pa·s, 또는 약 3.0Pa·s, 또는 약 4.0Pa·s, 또는 약 5.0Pa·s, 또는 약 6.0Pa·s, 또는 약 7.0Pa·s, 또는 약 8.0Pa·s, 또는 약 9.0Pa·s, 또는 약 10.0Pa·s, 또는 약 11.0Pa·s, 또는 약 12.0Pa·s, 또는 약 13.0Pa·s, 또는 약 14.0Pa·s, 또는 약 15.0Pa·s, 또는 약 16.0Pa·s, 또는 약 17.0Pa·s, 또는 약 18.0Pa·s, 또는 약 19.0Pa·s, 또는 약 20.0Pa·s, 또는 약 25.0Pa·s, 또는 약 30.0Pa·s, 또는 약 35.0Pa·s, 또는 약 40.0Pa·s, 또는 약 45.0Pa·s, 또는 약 50.0Pa·s, 또는 약 60.0Pa·s, 또는 약 70.0Pa·s, 또는 약 80.0Pa·s, 또는 약 90.0Pa·s, 또는 약 100.0Pa·s, 또는 약 200.0Pa·s, 또는 약 300.0Pa·s, 또는 약 400.0Pa·s, 또는 약 500.0Pa·s, 또는 약 600.0Pa·s, 또는 약 700.0Pa·s, 또는 약 800.0Pa·s, 또는 약 900.0Pa·s, 또는 약 1,000Pa·s, 또는 약 2,000Pa·s, 또는 약 3,000Pa·s일 수 있다. 전술한 것과 같이, 본 발명에 따른 하이드로겔의 점도는 상기에 기재된 임의의 두 수치를 각각 상한과 하한으로 하는 수치 범위, 및/또는 임의의 두 수치 사이의 수치값을 함께 개시하는 것으로 이해될 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 제조예에 대하여 설명한다.
하기 표 7과 같은 배합에 따라 다당 수용액을 준비하고 전자선을 조사하였다. 다당 수용액의 용매는 멸균수만을 이용하여 별도의 유기 용매는 첨가하지 않았다. 전자선은 직류형 전자선 가속기를 이용하였다.
다당 분자량
(kDa)		 수용액 농도
(w/v%)		 전자선 선량
(kGy)		 시간
(s)		 온도
(℃)
제조예 1 히알루론산 5.0 0.1 5.0 150~ 39
제조예 2 히알루론산 5.0 1.0 5.0 150~ 39
제조예 3 히알루론산 5.0 5.0 5.0 150~ 39
제조예 4 히알루론산 5.0 15.0 5.0 150~ 39
제조예 5 히알루론산 5.0 20.0 5.0 150~ 39
제조예 6 히알루론산 5.0 0.1 15.0 150~ 40
제조예 7 히알루론산 5.0 1.0 15.0 150~ 40
제조예 8 히알루론산 5.0 5.0 15.0 150~ 40
제조예 9 히알루론산 5.0 15.0 15.0 150~ 40
제조예 10 히알루론산 5.0 20.0 15.0 150~ 40
제조예 11 히알루론산 5.0 0.1 30.0 150~ 45
제조예 12 히알루론산 5.0 1.0 30.0 150~ 45
제조예 13 히알루론산 5.0 5.0 30.0 150~ 45
제조예 14 히알루론산 5.0 15.0 30.0 150~ 45
제조예 15 히알루론산 5.0 20.0 30.0 150~ 45
제조예 16 히알루론산 5.0 0.1 100.0 210~ 48
제조예 17 히알루론산 5.0 1.0 100.0 210~ 48
제조예 18 히알루론산 5.0 5.0 100.0 210~ 48
제조예 19 히알루론산 5.0 15.0 100.0 210~ 48
제조예 20 히알루론산 5.0 20.0 100.0 210~ 48
제조예 21 히알루론산 5.0 0.1 150.0 300~ 48
제조예 22 히알루론산 5.0 1.0 150.0 300~ 48
제조예 23 히알루론산 5.0 8.0 150.0 300~ 48
제조예 24 히알루론산 5.0 15.0 150.0 300~ 48
제조예 25 히알루론산 5.0 20.0 150.0 300~ 48
또, 하기 표 8과 같은 배합에 따라 다당 수용액을 준비하고 전자선을 조사하였다. 다당 수용액의 용매는 멸균수만을 이용하여 별도의 유기 용매는 첨가하지 않았다. 전자선은 직류형 전자선 가속기를 이용하였다.
다당 분자량
(kDa)		 수용액 농도
(w/v%)		 전자선 선량
(kGy)		 시간
(s)		 온도
(℃)
제조예 26 덱스트란 7.0 0.1 5.0 90~ 38
제조예 27 덱스트란 7.0 2.0 5.0 90~ 38
제조예 28 덱스트란 7.0 15.0 5.0 90~ 38
제조예 29 덱스트란 7.0 20.0 5.0 150~ 38
제조예 30 덱스트란 7.0 25.0 5.0 300~ 38
제조예 31 덱스트란 7.0 0.1 10.0 90~ 38
제조예 32 덱스트란 7.0 2.0 10.0 90~ 38
제조예 33 덱스트란 7.0 15.0 10.0 90~ 38
제조예 34 덱스트란 7.0 20.0 10.0 150~ 38
제조예 35 덱스트란 7.0 25.0 10.0 300~ 38
제조예 36 덱스트란 11.0 0.1 15.0 90~ 38
제조예 37 덱스트란 11.0 2.0 15.0 90~ 38
제조예 38 덱스트란 11.0 15.0 15.0 90~ 38
제조예 39 덱스트란 11.0 20.0 15.0 150~ 38
제조예 40 덱스트란 11.0 25.0 15.0 300~ 38
제조예 41 덱스트란 10.0 0.1 25.0 90~ 38
제조예 42 덱스트란 10.0 2.0 25.0 90~ 38
제조예 43 덱스트란 10.0 15.0 25.0 90~ 38
제조예 44 덱스트란 10.0 20.0 25.0 150~ 38
제조예 45 덱스트란 10.0 25.0 25.0 300~ 38
또, 하기 표 9와 같은 배합에 따라 다당 수용액을 준비하고 전자선을 조사하였다. 다당 수용액의 용매는 멸균수만을 이용하여 별도의 유기 용매는 첨가하지 않았다. 전자선은 직류형 전자선 가속기를 이용하였다.
다당 분자량
(kDa)		 수용액 농도
(w/v%)		 전자선 선량
(kGy)		 시간
(s)		 온도
(℃)
제조예 46 푸코이단 2.0 7.0 10.0 120~ 40
제조예 47 푸코이단 2.0 10.0 20.0 120~ 40
제조예 48 푸코이단 2.0 10.0 50.0 120~ 40
제조예 49 푸코이단 2.0 15.0 50.0 120~ 40
제조예 50 푸코이단 2.0 25.0 50.0 360~ 40
또, 하기 표 10과 같은 배합에 따라 다당 수용액을 준비하고 전자선을 조사하였다. 다당 수용액의 용매는 멸균수만을 이용하여 별도의 유기 용매는 첨가하지 않았다. 전자선은 직류형 전자선 가속기를 이용하였다.
다당 분자량
(kDa)		 수용액 농도
(w/v%)		 전자선 선량
(kGy)		 시간
(s)		 온도
(℃)
제조예 51 푸룩토올리고당 10.0 5.0 4.0 30~ 40
제조예 52 푸룩토올리고당 10.0 10.0 7.0 60~ 40
제조예 53 푸룩토올리고당 10.0 10.0 15.0 120~ 40
제조예 54 푸룩토올리고당 10.0 15.0 15.0 120~ 40
제조예 55 푸룩토올리고당 10.0 15.0 21.5 150~ 40
제조예 56 푸룩토올리고당 10.0 20.0 21.5 150~ 40
제조예 57 푸룩토올리고당 10.0 20.0 25.0 180~ 40
제조예 58 푸룩토올리고당 10.0 20.0 30.5 180~ 40
제조예 59 푸룩토올리고당 10.0 22.0 30.5 180~ 40
제조예 60 푸룩토올리고당 10.0 22.0 50.0 360~ 40
또, 하기 표 11과 같은 배합에 따라 다당 수용액을 준비하고 전자선을 조사하였다. 다당 수용액의 용매는 멸균수만을 이용하여 별도의 유기 용매는 첨가하지 않았다. 전자선은 직류형 전자선 가속기를 이용하였다.
다당 분자량
(kDa)		 수용액 농도
(w/v%)		 전자선 선량
(kGy)		 시간
(s)		 온도
(℃)
제조예 61 이소말토올리고당 7.0 4.0 7.0 90~ 41
제조예 62 이소말토올리고당 7.0 10.0 7.0 90~ 45
제조예 63 이소말토올리고당 7.0 11.0 7.0 90~ 45
제조예 64 이소말토올리고당 7.0 12.0 7.0 90~ 45
제조예 65 이소말토올리고당 7.0 15.0 7.0 90~ 45
제조예 66 이소말토올리고당 7.0 4.0 15.0 180~ 41
제조예 67 이소말토올리고당 7.0 10.0 15.0 180~ 45
제조예 67 이소말토올리고당 7.0 11.0 15.0 180~ 45
제조예 69 이소말토올리고당 7.0 12.0 15.0 180~ 45
제조예 70 이소말토올리고당 7.0 15.0 15.0 180~ 45
이하, 제3 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
[제3 발명]
본 발명의 일 실시예에 따른 필러 시술용 하이드로겔의 제조 방법은 하기 단계들을 포함할 수 있다. 하기 단계들은 영문자의 순서대로 수행될 수 있으나, 본 발명이 반드시 이에 국한되는 것은 아니다.
(a) 히알루론산 수용액에 가교제를 첨가하여 상기 히알루론산의 적어도 일부분이 가교된 하이드로겔(제1 하이드로겔)을 제조하는 단계
(b) 상기 하이드로겔을 플라스틱 재질의 제1 파우치에 밀봉하는 단계
(c) 상기 파우치에 밀봉된 하이드로겔에 전자선(electron-beam)을 조사하여 변형된 하이드로겔(제2 하이드로겔)을 제조하는 단계
(d) 상기 파우치를 개방하여 상기 하이드로겔의 기포를 제거하고 제2 파우치에 재포장하는 단계
명시적으로 다르게 기재되지 않는 한, 이하에서 전자선의 출력 단위는 와트(W)를 사용하며, 단위시간 당 에너지(J/sec)로 표현될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 단위를 상기 단위와 호환이 가능한 차원(dimension)을 가진 다른 단위로 변환하여 이해하는 것도 자명하다 할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '펜던트(pendant)' 또는 '펜던트 기(pendant group)'는 부속기를 의미한다. 상기 펜던트는 잠재적인 반응성을 갖거나, 또는 갖지 않을 수 있다. 또, 용어 '펜던트 가교체'는 펜던트기를 가진 상태의 가교체를 의미한다.
이하, 각 단계에 대해 상세하게 설명한다.
단계 (a)
가교제는 히알루론산의 고분자 사슬들을 화학 결합을 통해 가교시킬 수 있는 것으로서, 알킬디엑폭시류, 디글리시딜에테르류, 디비닐설폰류 및 에피클로르히드린류 등에서 선택될 수 있다. 가교제는 히알루론산과 반응할 수 있는 한쌍의 관능기를 가진 이관능성 화합물일 수 있다. 예시적인 실시예에서, 상기 가교제는 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(1,4-Butanediol diglycidyl ether, BDDE), 1,2,7,8-디에폭시옥탄(1,2,7,8-Diepoxyoctane), 1,5-헥사디엔디에폭시드(1,5-Hexadiene diepoxide) 및 비스페놀 A 디글리시딜에테르 (Bisphenol A diglycidyl ether)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 가교제는 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르을 포함할 수 있다. 더 바람직하게는, 상기 가교제는 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르 만으로 이루어질 수도 있다.
몇몇 실시예에서, 상기 가교제는 1,4-비스(2,3-에폭시프로폭시)부탄(1,4-Bis(2,3-epoxypropoxy)butane), 1,4-비스글리시딜옥시부탄(1,4-Bisglycidyloxybutane), 1,2-비스(2,3-에폭시프로폭시)에틸렌(1,2-Bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 1-(2,3-에폭시프로필)-2,3-에폭시사이클로헥산(1-(2,3-Epoxypropyl)-2,3-epoxycyclohexane) 및 1,3-부타디엔 디에폭시드(1,3-Butadiene diepoxide)을 불포함할 수 있다. 전술한 가교제들은 전자선 조사를 통해 펜던트기의 제거가 용이하지 않을 수 있다. 이에 대해서는 상세하게 후술한다.
이와 같은 가교제를 첨가하여 히알루론산과 반응시키면 가교체를 형성하며 히알루론산의 적어도 일부분을 가교시킬 수 있다. 상기 가교의 방법은 전술한 제1 발명 및/또는 제2 발명에 따라 수행될 수도 있고, 이에 제한되지 않는 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 이 경우 일부 가교제는 적어도 부분적으로 미반응될 수 있다.
예를 들어 도 1과 같이 BDDE가 가교제로 사용될 경우, BDDE는 양쪽 말단의 에폭시드기(epoxide group)가 모두 히알루론산과 반응하여 양 히알루론산 사슬을 연결하는 가교체를 형성할 수 있으나(도 1의 A), 일부 BDDE는 양쪽 말단의 에폭시드기가 모두 반응하지 않아 완전 미반응된 가교제로서 잔류할 수 있다(도 1의 B). 특히, 또 다른 일부의 BDDE는 한쪽 말단의 에폭시드기만이 히알루론산과 반응하고 다른 말단의 에폭시드기는 반응하지 않은, 마치 펜던트(pendant) 기와 같은 형상의 불완전한 가교체를 형성할 수 있다(도 1의 C). 한편, 도 1의 히알루론산 주쇄와 가교제의 화학 구조 및 결합 구조는 예시적인 것일 뿐 본 발명이 이에 제한되지 않음은 물론이다. 또, 본 명세서에서는 불완전 가교체, 즉 펜던트기를 갖는 가교체를 '펜던트 가교체'라는 용어로 지칭한다.
펜던트 가교체는 가교제의 양이나 반응시간을 조절하여 그 발생량을 감소시킬 수 있으나, 종래의 기술에 따를 때 히알루론산의 가교시 필연적으로 발생한다. 특히 하이드로겔을 인체 주입용 필러로 사용할 경우 요구되는 물성이 매우 제한적이나 펜던트 가교체를 감소시키기 위해 반응 조건을 제어할 경우 필러 시술용 하이드로겔로 적용할 수 없는 문제가 있었다. 비제한적인 예시로, 가교제의 양이나 반응시간을 증가시킬 경우 펜던트 가교체의 형성율을 감소시킬 수 있으나, 점도 및 탄성도가 지나치게 높아져 필러 시술용 하이드로겔로 적용할 수 없다. 이러한 이유로 필러 하이드로겔 시장의 세계 1위 기업인 주비던(Juvidon) 社의 제품의 펜던트 가교체 형성비는 약 10% 내외인 실정이다.
한편 펜던트 가교체의 형성비가 높을 경우 히알루론산의 하이드로겔을 무르게 하여 점도 및 탄성도 등의 물성과 안정성을 떨어뜨릴 수 있고, 미반응된 잔류 가교제처럼 세포 독성이나 염증 등을 유발할 수도 있다(Kablik J, Monheit GD, Yu LP, Chang G and Gershkovich J. Dermatol Surg 2009, 35(S1): 302-312; Sungchul C, et al. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2014-11-16).
따라서, 후술하는 바와 같이 본 발명의 실시예들에 따라 펜던트 가교체의 추가 반응을 유도하여 펜던트 가교체를 제어하는 것은 하이드로겔의 물성 향상과 독성 감소 등을 위해 매우 중요한 문제이며, 본 발명의 발명자는 종래 필러 시술용 하이드로겔과 실질적으로 동일한 수준의 물성을 유지하는 동시에 펜던트 가교체의 형성비가 현저히 감소될 수 있는 제조 방법에 착안하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
예시적인 실시예에서 히알루론산은 100 kDa 이상인 것을 사용할 수 있고, 히알루론산 수용액의 농도는 5 내지 30 mg/mL일 수 있으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
또, 가교제의 첨가량은 히알루론산 수용액 대비 0.01 내지 10 wt%일 수 있고, 가교제 첨가 후 반응시간은 0.5 내지 8시간일 수 있으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니며, 히알루론산의 분자량, 가교제의 첨가량, 반응 조건 등은 공지의 것을 이용할 수 있음을 통상의 기술자는 명확히 이해할 수 있을 것이다.
단계 (b)
상기 단계 (a)에서 가교제와 반응시켜 얻은 히알루론산의 하이드로겔을 의료용 파우치와 같은 플라스틱 재질의 제1 파우치에 담고 밀봉한다. 본 명세서에서 '밀봉'이란 파우치가 완전히 밀봉되어 하이드로겔이 외부와 완전히 차단된 것뿐만 아니라 일부분이 개방된 파우치 내에 하이드로겔이 외부로 흐르지 않도록 수용된 상태도 포함하는 의미이다. 비제한적인 예시로서, 파우치에 밀봉된 하이드로겔이 차지하는 부피는 파우치가 제공하는 내부 부피의 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상일 수 있다.
제1 파우치가 제공하는 내부 부피는 약 100ml 내지 200ml, 또는 약 150ml일 수 있다. 제1 파우치의 내부 부피는 후술할 단계 (c)에서 전자선의 에너지와 관련이 있을 수 있으나 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
후술하는 바와 같이 전자선을 투과시켜 내부의 하이드로겔의 추가 가교를 유도할 수 있는 것이라면 제1 파우치의 색깔은 제한되지 않으나, 바람직하게는 투명도가 높은 폴리염화비닐(PVC) 필름을 이용할 수 있다.
예시적인 실시예에서, 제1 파우치는 폴리에틸렌(PE) 필름, 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET) 필름 또는 폴리프로필렌(PP) 필름을 이용하지 않는 것이 바람직할 수 있다. 폴리에틸렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트 및 폴리프로필렌 필름은 폴리염화비닐과 마찬가지로 우수한 투명도를 나타낼 수 있으나, 전자선이 지속적으로, 반복적으로 투과하기에 내구성이 충분하지 못할 수 있다. 즉, 제1 파우치의 재질로 폴리염화비닐 필름을 이용할 경우 후술할 단계 (c)에서 전자선을 충분한 에너지로 조사하여 펜던트기 내지는 펜던트 가교체를 제거할 수 있다. 반면, 제1 파우치의 재질로 폴리에틸렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트 및 폴리프로필렌 필름을 이용할 경우 후술할 단계 (c)에서 제1 파우치가 손상되는 등의 문제가 발생할 수 있다.
전술한 폴리에틸렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트 및 폴리프로필렌 필름 또한 두께를 충분하게 할 경우 내구성 문제가 다소 해결될 수 있으나, 제1 파우치의 필름 두께가 증가함에 따라 전자선의 투과율이 급격하게 저하되어 하이드로겔이 부분적으로 탄화되거나, 단계 (c)에 수행되는 공정과 시간이 복잡화될 수 있다.
예시적인 실시예에서, 본 발명에 따라 폴리염화비닐 재질로 이루어진 제1 파우치의 두께는 약 0.1mm 내지 0.5 mm일 수 있다. 전술한 바와 같이 폴리염화비닐 파우치는 전자선이 투과되기에 용이하여 상대적으로 박형의 파우치를 이용할 수 있는 장점이 있다.
몇몇 실시예에서, 단계 (b)에서 제1 하이드로겔을 제1 파우치에 밀봉한 후에, 밀봉된 제1 하이드로겔을 에이징하는 단계를 더 포함할 수 있다. 단계 (a)에서 준비된 제1 하이드로겔은 반응 과정에서 상대적으로 고온 상태를 유지하며 에너지가 잔존할 수 있다. 제1 하이드로겔을 충분히 에이징하지 않고 후술할 단계 (c)를 통해 전자선이 조사될 경우 펜던트기의 제거가 진행되기 보다는 하이드로겔의 탄화 내지는 경화가 진행되고 하이드로겔의 투명도가 저하될 수 있다.
에이징은 약 10분 내지 1시간 동안 수행될 수 있다. 에이징 시간이 10분에 미달할 경우 에이징의 효과가 미미하며 전술한 문제가 발생할 수 있다. 또, 에이징은 25℃ 내지 30℃의 온도 범위에서 수행될 수 있다. 에이징의 온도가 25℃ 미만이면 제1 하이드로겔의 점도와 탄성이 급격하게 저하되며 전자선 조사 시에 펜던트 제거 효과가 미미할 수 있다. 반면 에이징의 온도가 약 30℃ 이상, 또는 약 35℃ 이상이면 에이징의 목적을 달성하지 못할 수 있다.
단계 (c)
하이드로겔이 밀봉된 파우치에 전자선을 조사하면 전자선이 파우치를 투과하여 하이드로겔 내 미반응된 가교제의 반응을 유도할 수 있고, 특히 펜던트 가교체의 미반응된 관능기의 반응을 유도함으로써 펜던트 그룹을 적어도 부분적으로 제거할 수 있다. 예를 들어 도 2와 같이 BDDE가 가교제로 사용된 경우, 펜던트 가교체(도 1의 A)의 미반응된 한쪽 말단의 에폭시드기가 전자선 조사에 의해 다른 히알루론산 사슬과 반응함으로써 양 히알루론산 사슬을 연결하는 가교체(도 2의 B)로 변환될 수 있다. 즉, 전자선 조사를 통해 펜던트 가교체를 제어함으로써 하이드로겔의 물성을 향상시키고 독성을 감소시킬 수 있는데, 이와 같은 펜던트 가교체의 제어 정도는 하기 식 1에 따라 계산되는 펜던트 가교체 형성비로 나타낼 수 있다.
[식 1]
펜던트 가교체 형성비 = (펜던트 가교체 양) / (가교체 양)
상기 식 1에서 가교체란 양쪽 말단 모두 히알루론산에 연결된 완전한 가교체를 의미하고, 펜던트 가교체와 가교체의 양은 각 구조체의 수 또는 질량으로 나타낼 수 있다.
전자선이 조사된 하이드로겔은 펜던트 가교체의 미반응 말단이 반응함에 따라 펜던트 가교체의 양은 감소하고 가교체의 양은 증가하기 때문에 펜던트 가교체 형성비가 감소한다. 즉, 단계 (c)에서 제조된 하이드로겔(제2 하이드로겔)은 단계 (a)에서 제조된 하이드로겔(제1 하이드로겔)보다 펜던트 가교체 형성비가 낮다. 바람직하게는, 제2 하이드로겔의 펜던트 가교체 형성비는 제1 하이드로겔의 펜던트 가교체 형성비의 약 60% 이하, 또는 약 50% 이하, 또는 약 40% 이하일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 구체적인 제조 조건에 따라 상기 펜던트 가교체 형성비의 바람직한 범위도 달라질 수 있음을 자명하게 이해할 것이다. 다만 본 발명은 인체를 상대로 한 필러 시술에 적합한 물성을 가지면서도, 동시에 펜던트 형성비를 현격하게 저하시킬 수 있는 효과에 대해 부각하고자 함이다.
예시적인 실시예에서, 전자선을 조사하는 단계(단계 (c))는 하기 세부 단계들을 포함하여 이루어질 수 있다.
a)상기 제1 파우치에 밀봉된 제1 하이드겔을 무빙 테이블 상에 배치하는 단계
b)전자선 조사기의 위치를 고정하는 단계
c)무빙 테이블을 무빙시켜 제1 하이드로겔이 소정의 주기와 휴지기를 갖도록 전자선에 노출시키는 단계
무빙 테이블은 턴 테이블 또는 컨베이어 테이블을 포함할 수 있다. 다만 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니며, 놓여진 제1 하이드로겔의 위치를 반복적으로, 주기적으로, 또는 계획적으로 변경할 수 있으면 특별히 제한되지 않는다. 또, 전자선 조사기는 특정 위치에 고정되고 전자선은 해당 지점에만 조사될 수 있다. 즉, 무빙 테이블에 놓여진 제1 하이드로겔의 위치 변화와 무관하게 동일한 지점에 조사되도록 전자선 조사기를 고정 배치할 수 있다.
상기 전자선은 0.1 kW 내지 1.0 kW의 세기와 출력을 가지고 조사될 수 있다. 전자선이 상기의 세기를 가지고 일정 지점에 조사되는 동안, 제1 하이드로겔은 무빙 테이블 상에 놓여 상기 전자선이 조사되는 지점을 지나가는 것을 반복할 수 있다. 본 명세서에서, 제1 하이드로겔이 전자선에 조사되는 구간을 '주기'로, 제1 하이드로겔이 전자선에 노출되지 않는 구간을 '휴지기'로 표현한다.
예시적인 실시예에서, 전술한 범위의 에너지를 갖는 전자선을 이용하는 경우에, 제1 하이드로겔이 전자선에 조사되는(또는 노출되는) 주기는 약 0.5초 내지 2초일 수 있다. 만일 상기 주기가 0.5초에 미달하면 전자선이 펜던트 가교체의 제거에 기여하기에 필요한 문턱 에너지를 넘지 못해 추가 가교 내지는 펜던트기의 제거가 실질적으로 이루어지지 않을 수 있다. 반면, 상기 주기가 2초를 초과하면 추가 가교 내지는 펜던트기의 제거가 이루어지기 보다, 하이드로겔의 탄화가 진행되고 하이드로겔의 색이 불투명해질 수 있다.
또한 예시적인 실시예에서, 전술한 범위의 에너지를 갖는 전자선을 이용하는 경우에, 제1 하이드로겔에 전자선이 조사되지 않는(또는 노출되지 않는) 휴지기는 약 50초 이상일 수 있다. 예를 들어, 휴지기는 약 50초 이상 120초 이하, 또는 약 50초 이상 90초 이하, 또는 약 50초 이상 60초 이하일 수 있다. 만일 상기 휴지기가 50초에 미달하면 추가 가교 내지는 펜던트기의 제거가 이루어지기 보다, 하이드로겔의 탄화가 진행될 수 있다. 상기 휴지기의 상한은 특별히 제한되지 않으나, 공정의 신속성 측면에서 약 120초 이하, 또는 약 90초 이하, 또는 약 60초 이하일 수 있다.
상기 주기와 휴지기의 시간은 무빙 테이블의 무빙 속도 또는 회전 속도를 통해 제어될 수 있다. 또, 무빙 테이블 상에는 복수개의 밀봉된 제1 하이드로겔이 놓여질 수 있다.
즉, 전술한 세부 단계 c)는 상기 주기와 상기 휴지기가 교번적으로 반복되어 수행될 수 있다. 이 때, 전체 주기의 횟수는 총 30회 이상 40회 이하일 수 있다. 이 경우 상기 휴지기는 총 29회 내지 39회일 수 있으나 본 발명이 이에 제한되지 않음은 물론이다. 세부 단계 c)가 30회에 미달하여 수행될 경우 펜던트 가교체의 충분한 제거가 이루어지지 않을 수 있고, 물성 향상과 독성 저하 효과가 미비할 수 있다. 반면, 세부 단계 c)가 40회를 초과하여 수행될 경우 공정의 신속성 내지는 용이성 측면에서 바람직하지 않을 수 있다.
전술한 바와 같이 전자선의 조사시간과 출력을 치밀하게 제어하여 펜던트 가교체의 반응만을 선택적으로 유도함으로써 하이드로겔의 물성을 효과적으로 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 본 단계를 통해 제2 하이드로겔은 제1 하이드로겔에 비해 점도와 탄성이 증가할 수 있다. 상세한 예를 들어, 제2 하이드로겔의 점도는 400 Pa·s 내지 1600 Pa·s의 범위에 있을 수 있다. 또, 제2 하이드로겔의 탄성도는 100 Pa 내지 300 Pa의 범위에 있을 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 전자선 조사는 주로 펜던트 가교체의 반응을 유도하지만 완전 미반응된 가교제의 반응 또한 유도할 수 있음은 자명하다 할 것이다.
단계 (d)
상기 단계 (c)에서 전자선을 조사한 제2 하이드로겔이 밀봉된 제1 파우치를 개방하고 하이드로겔의 기포를 제거한다. 탈포 공정은 공지의 방법을 통해 수행될 수 있다. 그리고 탈포된 제2 하이드로겔은 제2 파우치에 옮겨 담아 재포장되어 최종 제품으로서 취급되거나, 몇몇 실시예에 따라 필러 시술용으로 사용되기 위해 공지의 첨가 공정이나 멸균 공정 등을 추가적으로 거칠 수 있다.
예시적인 실시예에서, 제2 파우치는 폴리에틸렌(PE) 필름, 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET) 필름 및 폴리프로필렌(PP) 필름으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나로 이루어질 수 있다. 제2 파우치에 밀봉된 제2 하이드로겔은 상대적으로 장시간 동안 보존될 수 있다. 따라서 염소(Cl) 성분을 불포함한 파우치를 이용하는 것이 인체에 대한 무해성 측면에서 바람직할 수 있다. 또, 제2 파우치의 두께는 제1 파우치의 두께 보다 두꺼울 수 있다. 앞서 설명한 것과 같이 제1 파우치는 전자선 조사의 대상이 되는 것으로서, 전자선의 조사 세기 등을 고려하여 두께가 선택되어야 하나, 제2 파우치는 포장에 사용되기에 적합한 통상적인 두께를 갖는 파우치를 이용할 수 있다.
몇몇 실시예에서, 본 발명의 필러 시술용 하이드로겔은 일반적으로 생리학적으로 허용되는 담체 유체, 예컨대 등장 완충액, 특히 바람직하게는 완충된 생리학적 식염수 용액을 포함할 수 있다.
비제한적인 예시로서, 본 발명의 필러 시술용 하이드로겔은 상기 조성물 100 중량부 대비 히알루론산의 체내 지속성 향상용 조성물을 1중량부 내지 20중량부로 포함할 수 있다.
본 발명의 필러 시술용 하이드로겔은 바람직하게는 미용적 질환을 치료하기 위해, 예컨대 피부의 주름살 또는 주름(예를 들어, 안면 주름 및 안면 주름살), 미간 주름, 비구순 주름, 턱 주름, 마리오네트 주름, 구강 교련, 입주위 주름살, 눈가 잔주름, 피부 함몰부, 흉터, 관자, 눈썹의 진피하 지지부, 광대 및 볼 지방 패드, 눈물 도랑, 코, 입술, 뺨, 입주위 영역, 안와하 영역, 안면 비대칭, 아래턱선 및 턱의 치료를 위해 투여될 수 있다. 또는, 치료적 적응증, 예컨대 복압성 요실금, 방광-요관 역류, 성대 주름 부전, 성대 주름 내측화를 치료하기 위해 투여될 수도 있다.
이상에서와 같이 본 발명의 실시예들에 따른 필러 시술용 하이드로겔의 제조 방법은 전자선 조사를 통해 펜던트 가교체와 같은 불완전 가교체를 완전한 가교체로 변환하기 때문에 종래의 제조방법에 비해 가교제를 소량으로 사용하거나 가교제와의 반응시간을 짧게 하더라도 하이드로겔의 물성을 동등 이상 수준으로 향상시킬 수 있다.
또한, 이와 같이 원하는 물성을 얻기 위한 가교제의 사용량을 줄일 수 있을 뿐 아니라 펜던트 가교체와 같이 독성을 유발하는 미반응 가교제를 반응시켜 제거할 수 있어 하이드로겔의 독성 또한 현저히 감소시킬 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따라 제조된 제2 하이드로겔의 물성은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 단계 (a)에서 사용된 가교제의 첨가량이 히알루론산 수용액 대비 0.1 wt% 이하이거나 히알루론산 수용액과 가교제의 반응시간이 1시간 이하인 경우를 기준으로, 제2 하이드로겔은 점도가 400 Pa·s 이상, 또는 약 600 Pa·s 이상, 또는 약 700 Pa·s 이상, 또는 약 900 Pa·s 이상, 또는 약 1,000 Pa·s 이상일 수 있다. 또, 제2 하이드로겔은 탄성도가 100 Pa 이상, 또는 약 300 Pa 이상, 또는 약 400 Pa 이상, 또는 약 500 Pa 이상, 또는 약 600 Pa 이상일 수 있다. 즉, 종래에 알려진 제품 수준의 점도와 탄성도를 나타내어 필러 시술용 하이드로겔로 사용되기에 적합한 동시에, 현저하게 적은 수준의 펜던트 가교체를 포함할 수 있다.
이하에서는 본 발명의 실시예들을 구체적인 제조예 및 실험예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 가교된 히알루론산의 제1 하이드로겔 제조 (실시예 1-1 내지 실시예 1-4)
약 400 kDa의 히알루론산(hyaluronic acid) 15 mg/mL를 증류수 1 L에 녹인 후 가교제로서 BDDE(1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르) 0.1 wt%를 첨가하여 40℃에서 500 rpm으로 교반하며 4시간 동안 반응시켜, 가교된 히알루론산의 하이드로겔(hydrogel)을 제조하였다(실시예 1-1).
또한, BDDE의 첨가량 또는 반응시간을 하기 표 12와 같이 달리하여 실시예 1-2 내지 실시예 1-4의 하이드로겔도 제조하였다.
실시예 히알루론산 BDDE (wt%) 반응시간(h)
실시예 1-1 약 400 kDa
15 mg/mL		 0.1 1
실시예 1-2 0.1 4
실시예 1-3 2.0 1
실시예 1-4 2.0 4
제조예 2: 제2 하이드로겔 제조 (실시예 2-1 내지 실시예 2-4)
상기 BDDE로 가교되어 제조된 실시예 1-1 내지 실시예 1-4의 하이드로겔을 0.3 mm 두께의 투명한 PVC 필름으로 이루어진 의료용 파우치에 각각 옮겨 담아 밀봉하였다. 파우치의 용량은 150ml를 이용하였다. 그리고 30℃로 유지되는 암실에서 15분 동안 보관하였다.
제1 하이드로겔이 담긴 파우치를 터닝 테이블위에 고정시킨 후 터닝 테이블을 회전시켰다. 회전 속도는 1rpm으로 설정하였다. 터닝 테이블의 회전속도가 일정해졌을 때, 직류형 전자선 가속기(electron-beam accelerator)로 0.1 kW의 전자선을 터닝 테이블의 일부분에 조사하였다. 제1 하이드로겔이 담긴 파우치가 터닝 테이블과 함께 회전하면서 1분에 1회씩 간헐적으로 노출되도록 하였다. 그리고 총 30바퀴 회전한 후 전자선 조사를 중단하였다.
그 다음 파우치를 개방하고 하이드로겔의 기포를 제거하여 하기 표 13과 같은 실시예 2-1 내지 실시예 2-4의 히알루론산의 제2 하이드로겔을 제조하였다.
실시예 추가 가교 대상 전자선 조사
실시예 2-1 실시예 1-1 회전속도: 1rpm
출력(kW): 0.1
PVC 필름(0.3 mm) 사용
실시예 2-2 실시예 1-2
실시예 2-3 실시예 1-3
실시예 2-4 실시예 1-4
실험예 1: 실시예 1-1 내지 실시예 2-4의 물성 측정
제조된 실시예 1-1 내지 실시예 2-4의 점도(shear viscosity), 탄성도(elasticity) 및 펜던트 가교체 형성비를 측정하였다.
점도는 Shear rate 0.05 s-1, 35℃ 조건 하에서 측정하였고, 탄성도는 Frequency 1 Hz, 35℃ 조건 하에서 측정하였다. 펜던트 가교체 형성비는 다음과 같은 방법으로 측정하였다(Kablik J, Monheit GD, Yu LP, Chang G and Gershkovich J. Dermatol Surg 2009; 35(S1): 302-312).
실시예 1-1 내지 실시예 2-4의 각 샘플을 37℃ 및 pH 5.0의 아세테이트 버퍼에서 72시간 동안 Streptomyces 유래의 히알루로니다아제(hyaluronidase)(VWR Scientific, Bridgeport, NJ)로 분해시켜 올리고당(oligosaccharide)을 얻었다. 올리고당을 고성능 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography; HPLC)를 사용하여 분석하였다. HPLC는 음이온 교환 컬럼(Anionic exchange Column, 4x250mm, CarboPac PA 100, Dionex Corporation, Sunnyvale, CA)을 갖는 것을 사용하였다. HPLC는 각 올리고당 단편을 음전하에 따라 분리하는데, 히알루로니다아제의 불완전 분해는 올리고당의 사이즈에 따른 용출 패턴을 야기한다. 히알루로니다아제는 가교체를 분해시키지 못하기 때문에, 옥타사카라이드(octasaccharide) 이상의 계류시간에서 용출되는 피크를 관측하는 것은 가교된 특정 올리고당의 존재를 나타낸다. 따라서, 가교된 비율은 지연 용출된 피크의 합계로서 결정되는데, 전체 피크 면적은 각 단편의 농도에 비례하기 때문에 가교된 부분 또는 펜던트 가교체 부분의 상대적인 비율이 결정될 수 있다.
이에 따라 얻은 데이터를 하기 식 2 및 식 3에 대입하여 펜던트 가교체 형성비를 구하였다.
[식 2]
총 개질 정도 (%) = 가교체 비율 (%) + 펜던트 가교체 비율 (%)
[식 3]
펜던트 가교체 형성비 = 펜던트 가교체 비율 (%) / 가교체 비율 (%)
측정된 점도, 탄성도 및 펜던트 가교체 형성비는 하기 표 14와 같았다.
실시예 점도(Pa·s) 탄성도(Pa) 펜던트 가교체 형성비
실시예 1-1 409.1 103.5 1.9
실시예 1-2 498.3 154.2 1.6
실시예 1-3 741.0 210.3 2.1
실시예 1-4 888.9 339.8 1.7
실시예 2-1 701.2 306.3 0.9
실시예 2-2 930.2 439.1 0.5
실시예 2-3 1243.7 590.7 0.8
실시예 2-4 1397.6 686.0 0.6
상기 표 14를 참고하면, BDDE의 첨가량이 많을수록, 반응시간이 길수록 점도 및 탄성도는 높고 펜던트 가교체 형성비는 낮은 경향이 있음을 알 수 있는데, 실시예 1-1 내지 실시예 1-4를 전자선 조사로 추가 가교하여 얻은 실시예 2-1 내지 실시예 2-4는 점도 및 탄성도가 추가 가교 전보다 현저히 향상되었음을 확인할 수 있다. 실시예 2-1 내지 실시예 2-4의 펜던트 가교체 형성비가 추가 가교 전보다 현저히 낮아진 점을 고려하면 이와 같은 점도 및 탄성도의 향상은 전자선 조사에 의한 펜던트 가교체의 반응에 기인한 것으로 생각할 수 있다.
이를 통해, 히알루론산의 가교시 BDDE와 같은 가교제를 상대적으로 소량으로 사용하거나 상기 가교제와의 반응시간을 상대적으로 짧게 하더라도 추가적인 전자선 조사를 통해 펜던트 가교체의 반응을 유도하여 히알루론산을 추가적으로 가교함으로써 필요한 수준 또는 우수한 수준의 물성을 확보할 수 있음을 알 수 있다.
제조예 3: 전자선의 조사 시간 및 출력 변경 (실시예 3-1 내지 실시예 3-12)
상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 하이드로겔을 제조하여 0.3 mm 두께의 투명한 PVC 필름으로 이루어진 의료용 파우치에 각각 옮겨 담아 밀봉하였다. 그리고 상기 제조예 2와 동일하게 터닝 테이블을 이용하여 하이드로겔이 담긴 파우치를 전자선에 간헐적으로 노출시키되, 하기 표 15와 같이 총 조사시간 및 출력을 달리하도록 회전 속도를 제어하였다. 전자선 조사가 끝난 후 파우치를 개방하고 하이드로겔의 기포를 제거하여 하기 표 15와 같은 실시예 3-1 내지 실시예 3-12의 추가 가교된 히알루론산의 하이드로겔을 제조하였다.
실시예 조사시간(sec) 출력(kW) 파우치
실시예 3-1 약 0.3 0.01 PVC 필름(0.3 mm) 사용
실시예 3-2 약 0.3 0.1
실시예 3-3 약 0.3 1.0
실시예 3-4 약 1 0.01
실시예 3-5 (실시예 2-2) 약 1 0.1
실시예 3-6 약 1 1.0
실시예 3-7 약 2 0.01
실시예 3-8 약 2 0.1
실시예 3-9 약 2 1.0
실시예 3-10 약 10 0.01
실시예 3-11 약 10 0.1
실시예 3-12 약 10 1.0
실험예 2: 실시예 3-1 내지 실시예 3-12의 물성 측정
제조된 실시예 3-1 내지 실시예 3-12의 점도, 탄성도 및 펜던트 가교체 형성비를 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 16과 같았다.
실시예 점도(Pa·s) 탄성도(Pa) 펜던트 가교체 형성비
실시예 3-1 512.6 151.1 0.8
실시예 3-2 527.0 154.9 0.8
실시예 3-3 683.5 176.4 0.7
실시예 3-4 885.0 427.2 0.4
실시예 3-5 (실시예 2-2) 930.2 439.1 0.5
실시예 3-6 1132.3 636.0 0.2
실시예 3-7 1026.7 551.8 0.4
실시예 3-8 1073.0 605.1 0.4
실시예 3-9 1273.0 725.1 0.2
실시예 3-10 N/A(하이드로겔 연소로 물성 측정 불가)
실시예 3-11 N/A(하이드로겔 연소로 물성 측정 불가)
실시예 3-12 N/A(하이드로겔 연소로 물성 측정 불가)
상기 표 16을 참고하면, 전자선의 조사시간이 길수록, 출력이 높을수록 점도 및 탄성도와 같은 물성이 대체로 향상되었으나, 조사시간이 약 0.3초일 때는 펜던트 가교체 형성비 및 이에 따른 물성 향상이 미미했고, 출력이 0.1 kW 미만일 때는 출력 상승에 따른 펜던트 가교체 형성비의 변화가 작아 이에 따른 물성 증가 효율 또한 좋지 않았다. 한편, 조사시간이 10초일 때는 하이드로겔이 전자선에 의해 일부 연소되는 문제가 발생하였다.
제조예 4: 파우치의 재질 변경 (실시예 4-1 내지 실시예 4-4)
상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 하이드로겔을 제조하여 하기 표 17과 같은 다양한 재질의 0.3 mm 두께의 투명한 필름으로 구성된 의료용 파우치에 각각 옮겨 담아 밀봉하였다. 그리고 상기 제조예 2와 동일한 방법으로 전자선을 조사하였다.
실시예 파우치 재질(0.5 mm) 전자선 조사
실시예 4-1 (실시예 2-2) PVC 필름 양호
실시예 4-2 PE 필름 파우치 터짐
실시예 4-3 PET 필름 파우치 터짐
실시예 4-4 PP 필름 파우치 터짐
제조예 5: 파우치의 두께 변경 (실시예 5-1 내지 실시예 5-4)
상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 하이드로겔을 제조하여 하기 표 18과 같은 다양한 재질 및 두께의 필름으로 구성된 의료용 파우치에 각각 옮겨 담아 밀봉하였다. 그리고 상기 제조예 2와 동일한 방법으로 전자선을 조사하였다.
실시예 파우치 재질 파우치 두께(mm) 전자선 조사
실시예 5-1(실시예 2-2) PVC 0.3 회전속도: 1rpm
출력(kW): 0.1
PVC 필름(0.3 mm) 사용
실시예 5-2 PVC 0.7
실시예 5-3 PE 필름 1.0
실시예 5-4 PET 필름 1.0
실시예 5-5 PP 필름 1.0
실험예 4: 실시예 5-1 내지 실시예 5-5의 물성 측정
제조된 실시예 5-1 내지 실시예 5-5의 점도, 탄성도 및 펜던트 가교체 형성비를 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 19와 같았다.
실시예 점도(Pa·s) 탄성도(Pa) 펜던트 가교체 형성비
실시예 5-1(실시예 2-2) 930.2 439.1 0.5
실시예 5-2 895.7 490.1 0.4
실시예 5-3 719.3 368.2 0.7
실시예 5-4 604.6 298.1 0.5
실시예 5-5 749.1 327.4 0.4
상기 표 19를 참고하면, 실시예 5-1의 물성이 가장 우수한 것을 확인할 수 있다. 실시예 5-1과 동일하게 PVC 필름을 이용하되 두께를 증가시킨 실시예 5-2 또한 물성이 증가하나, 실시예 5-1에 비해 현저하게 낮은 것을 알 수 있다.
그 외 파우치 필름이 터지지 않도록 두께를 보강한 실시예 5-3 내지 실시예 5-5의 경우 물성 상승 효과가 미미한 것을 확인할 수 있다.
제조예 6: 가교제 종류 변경 (실시예 6-1 내지 실시예 6-4)
상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 다양한 가교제를 이용하여 하이드로겔을 0.3 mm 두께의 투명한 PVC 필름으로 이루어진 의료용 파우치에 각각 옮겨 담아 밀봉하였다. 그리고 상기 제조예 2와 동일한 방법으로 전자선을 조사하였다.
실시예 가교제
실시예 6-1(실시예 2-2) BDDE
실시예 6-2 1,4-Bis(2,3-epoxypropoxy)butane
실시예 6-3 1-(2,3-Epoxypropyl)-2,3-epoxycyclohexane
실시예 6-4 1,3-Butadiene diepoxide
실험예 5: 실시예 6-1 내지 실시예 6-4의 물성 측정
제조된 실시예 5-1 내지 실시예 5-5의 점도 및 탄성도를 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 21과 같았다.
실시예 점도(Pa·s) 탄성도(Pa)
실시예 6-1(실시예 2-2) 930.2 439.1
실시예 6-2 610.6 307.0
실시예 6-3 678.4 316.4
실시예 6-4 712.5 310.5
상기 표 21을 참고하면, 실시예 6-1의 물성이 가장 우수한 것을 확인할 수 있다. 그 외 실시예 6-2 내지 실시예 6-4의 경우 물성 상승 효과가 미미한 것을 확인할 수 있다. 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니나, 적어도 본 발명에서 사용한 펜던트 제거 공정 조건에 의할 경우 해당 가교제의 추가 반응이 진행되지 않기 때문일 수 있다.
앞서 설명한 것과 같이, 히알루론산 등의 생체 적합성 고분자에 BDDE 등의 가교제를 첨가하여 하이드로겔을 형성하는 것이 보고된 바 있다. 그러나 BDDE와 같은 가교제는 적어도 일부분이 미반응되어 하이드로겔 물성의 악화와 세포 독성을 유발하는 펜던트 가교체 등을 형성하는 한계가 있으며, 본 발명자는 미반응된 가교제를 추가적으로 반응시키기 위한 시도를 하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 실시예들에 따르면 미반응된 가교제 특히, 펜던트 가교체와 같은 불완전 가교체를 완전한 가교체로 변환하여 히알루론산의 추가적인 가교를 유도하기 때문에, 종래의 제조방법에 비해 가교제를 소량으로 사용하거나 가교제와의 반응시간을 짧게 하더라도 하이드로겔의 물성을 동등 이상 수준으로 향상시킬 수 있다. 또한, 이에 따라 원하는 물성을 얻기 위한 가교제의 사용량을 줄일 수 있을 뿐 아니라 펜던트 가교체와 같이 독성을 유발하는 미반응 가교제를 반응시켜 제거할 수 있기 때문에, 하이드로겔의 독성 또한 현저히 감소시킬 수 있다.
이상에서 본 발명의 실시예를 중심으로 설명하였으나 이는 단지 예시일 뿐 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 실시예의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위에서 이상에 예시되지 않은 여러 가지의 변형과 응용이 가능함을 알 수 있을 것이다.
따라서 본 발명의 범위는 이상에서 예시된 기술 사상의 변경물, 균등물 내지는 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에 구체적으로 나타난 각 구성요소는 변형하여 실시할 수 있다. 그리고 이러한 변형과 응용에 관계된 차이점들은 첨부된 청구 범위에서 규정하는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (1)

  1. 필러 시술용 수화겔로서,
    제1 전자선을 조사하여 히알루론산 수용액을 가교시켜 제1 수화겔을 제조하는 단계; 및
    제2 전자선을 조사하여 제1 수화겔의 펜던트 가교체를 적어도 부분적으로 제거하여 제2 수화겔을 형성하는 단계를 포함하여 제조된 수화겔.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Kablik J, Monheit GD, Yu LP, Chang G and Gershkovich J. Dermatol Surg 2009, 35(S1): 302-312 (비특허문헌 2) Sungchul C, et al. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2014-11-16

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