KR102070881B1 - 전자선 가교를 이용한 히알루론산 마이크로겔의 제조 방법 및 필러 시술용 하이드로겔로서의 용도 - Google Patents

Abstract

필러 시술용 마이크로겔의 제조 방법이 제공된다. 상기 마이크로겔의 제조 방법은 18w/v% 내지 25w/v%의 제1 히알루론산 수용액에 5kGy 내지 10kGy 선량의 전자선을 펄스 또는 임펄스 조사하여 히알루론산을 적어도 부분적으로 가교시키는 단계를 포함한다.

Description

전자선 가교를 이용한 히알루론산 마이크로겔의 제조 방법 및 필러 시술용 하이드로겔로서의 용도{METHOD OF PREPARING MICRO-GEL USING ELECTRON-BEAM CROSS LINKING AND USE OF HYDROGEL FOR FILLER PROCEDURE}

본 발명은 히알루론산을 가교시켜 마이크로겔을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 가교제 없이도 전자선을 조사하는 것만으로 히알루론산을 가교시킬 수 있는 필러 시술용 마이크로겔의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 필러 시술용 마이크로겔, 이를 이용한 주사용 필러 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

히알루론산은 복잡한 음전하성 다당류의 하나로 N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산으로 이루어진 고분자 화합물로서, 생체내의 연결조직, 피하조직, 신경조직 또는 관절 활액에 존재한다. 히알루론산은 매우 뛰어난 생체 적합성 때문에 스트렙토코커스속 등의 미생물 발효 또는 닭 벼슬 등에서 추출되어 화장품 첨가제뿐만 아니라 관절강 주사제, 유착 방지제, 안과용 의약품 등으로 이용되고 있다. 또한, 히알루론산 겔은 조직수복생체재료 의료기기인 성형필러로도 많이 사용되고 있다.

한편 히알루론산 그 자체로는 효소와 활성산소에 의한 분해에 의해 체내에서 빠르게 배출될 수 있다는 난제가 보고됨에 따라, 체내에서의 분해 기간을 연장시키기 위해 화학적으로 가교시키려는 다양한 시도가 있었다.

즉, 히알루론산의 화학 구조적 안정성을 높여 생체 내에서의 분해 작용을 늦춰 물성 유지 기간을 길게 유지시키고자, 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(1,4-Butanediol diglycidyl ether; BDDE) 등의 가교제를 첨가하여 히알루론산을 안정화시키는 기술이 개발되어 왔으며, 그 가운데 현존하는 히알루론산 가교체 및 히알루론산 유도체 가교물의 생체 내 최대 유지 기간은 약 6개월 내지 24개월인 것으로 알려져 있다.

다만 히알루론산의 생체내 체류기간을 증진시키고자 단순히 가교제량만을 증량하여 수득한 고점탄성의 히알루론산 가교체는 생체내에서 분해되거나 미반응된 잔류 가교제 성분이 독성을 유발하여 염증 반응을 야기할 수 있다는 문제점이 있다.

또한 이러한 잔류 가교제를 제거하기 위해서는 추가적인 제거 공정을 거쳐야 하는데, 이는 히알루론산 필러를 제작하는 공정에 대해 비경제성을 유발한다는 문제가 있다.

한국 공개특허공보 제10-2019-0067653호 (특허문헌 2) 한국 공개특허공보 제10-2018-0096562호

이와 같은 문제를 해결하기 위한 본 발명의 과제는 히알루론산에 전자선(electron-beam)을 조사하여 별도의 가교제 없이도 가교 반응을 일으킴으로써 독성을 갖는 가교제가 첨가되어 발생하는 문제를 미연에 방지하는 것이다.

또한 특정 조건 하에서 히알루론산을 가교시켜 고점도 및 큰 입자를 갖는 마이크로 사이즈의 하이드로겔을 제조함으로써 주사용 필러 조성물로 사용할 수 있는 수준의 점도와 생체 내 안정성을 갖는 하이드로겔을 제공하는 것이다.

아울러 전자선의 조사와 함께 가교제를 사용하되 생체 친화적인 가교제를 사용함으로써 미반응된 잔류 가교제를 제거하기 위한 추가적인 공정이 생략할 수 있는 마이크로겔의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 필러 시술용 마이크로겔의 제조 방법은, 18w/v% 내지 25w/v%의 제1 히알루론산 수용액에 5kGy 내지 10kGy 선량의 전자선을 펄스 또는 임펄스 조사하여 히알루론산을 적어도 부분적으로 가교시키는 단계를 포함한다.

또, 상기 전자선을 펄스 또는 임펄스 조사할 경우, 조사 주기(period)는 5초 내지 10초일 수 있다.

상기 전자선을 펄스 조사할 경우, 조사 시간은 3초 이하일 수 있다.

또한 상기 전자선의 총 조사 시간은 10분 내지 60분일 수 있다.

여기서 상기 히알루론산을 가교시키는 단계는 50℃ 내지 60℃의 온도에서 수행될 수 있다.

또 상기 히알루론산은 100kDa 이상 500kDa 이하의 분자량을 가질 수 있다.

몇몇 실시예에서, 상기 전자선의 조사를 시작한 이후에, 상기 제1 히알루론산 수용액보다 높은 농도를 갖는 제2 히알루론산 수용액을 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다.

여기서 상기 제2 히알루론산 수용액의 농도의 상한은 30w/v%일 수 있다.

상기 제1 히알루론산 수용액과 상기 제2 히알루론산 수용액의 교반 속도는 500rpm 내지 1,000rpm일 수 있다.

또 상기 전자선의 조사는 상기 제2 히알루론산 수용액의 혼합과 동시에 계속해서 수행될 수 있다.

상기 제1 히알루론산 수용액은 히알루론산의 중량을 기준으로 0.1wt% 내지 0.5wt%의 게니핀 유도체로서, 하기 화학식 1로 표현되는 게니핀 유도체를 더 포함할 수 있다.

[화학식 1]

반면 상기 제1 히알루론산 수용액은 게니핀을 실질적으로 불포함할 수 있다.

기타 실시예의 구체적인 사항들은 상세한 설명에 포함되어 있다.

본 발명의 실시예들에 따르면, 히알루론산에 전자선을 조사하여 별도의 가교제 없이도 가교 반응을 일으킴으로써, 독성을 갖는 가교제가 첨가되어 발생하는 문제를 미연에 방지할 수 있다.

또한, 특정 조건 하에서 히알루론산을 가교시켜 곧바로 마이크로 사이즈의 입상 하이드로겔을 제조함으로써 주사용 필러 조성물로 사용할 수 있는 수준의 점도를 갖는 하이드로겔을 제공할 수 있다.

또한 후속 공정을 통한 입자 크기의 제어가 용이하여, 예를 들어 필러 시술에 사용될 수 있는 수준의 마이크로 사이즈의 입자 크기를 갖는 하이드로겔을 제공할 수 있다.

아울러, 전자선의 조사와 함께 생체 친화적인 가교제를 사용함으로써, 미반응된 잔류 가교제를 제거하기 위한 추가적인 공정이 불필요하다는 장점이 있다.

본 발명의 실시예들에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 4에 따라 제조된 마이크로겔의 입자 크기를 DLS로 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예 5-1, 실시예 5-2 및 실시예 5-6에 따라 제조된 마이크로겔의 입자 크기를 DLS로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 6-1, 실시예 6-2 및 실시예 6-3에 따라 제조된 마이크로겔의 입자 크기를 DLS로 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예 7-1 및 실시예 7-2에 따라 제조된 마이크로겔의 입자 크기를 DLS로 확인한 결과이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

즉, 본 발명이 제시하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, '및/또는'은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다. 또, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 '포함한다(comprises)' 및/또는 '포함하는(comprising)'은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. '내지'를 사용하여 나타낸 수치 범위는 그 앞과 뒤에 기재된 값을 각각 하한과 상한으로서 포함하는 수치 범위를 나타낸다. '약' 또는 '대략'은 그 뒤에 기재된 값 또는 수치 범위의 20% 이내의 값 또는 수치 범위를 의미한다.

본 명세서에서 전자선의 선량 단위는 그레이(Gy)를 사용하며, 중량 당 에너지로 표현될 수 있다. 또, 전자선의 선량률 단위는 Gy/s를 사용하며, 단위 시간 당 중량 당 에너지로 표현될 수 있다.

이하 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 필러 시술용 마이크로겔의 제조 방법은 18w/v% 내지 25w/v%의 히알루론산 수용액(제1 히알루론산 수용액)에 5kGy 내지 10kGy 선량의 전자선을 펄스 또는 임펄스 조사하여 히알루론산을 적어도 부분적으로 가교시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 히알루론산의 가교에 있어서 인체에 유해를 초래할 수 있는 가교제를 실질적으로 불포함할 수 있다.

종래에는 히알루론산을 가교시키기 위해 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(BDDE) 등의 화합물을 가교제로서 첨가하였는데, 이러한 가교제들은 독성이 있기 때문에 미반응된 가교제가 잔류하여 피부내에 축적될 경우 염증을 일으키는 문제가 있었고, 이에 따라 미반응된 가교제를 제거하기 위해서는 별도의 제거 공정이 뒤따른다는 단점이 있었다. 그러나 본 발명의 실시예들에 따른 히알루론산의 가교 방법은 별도의 가교제 없이 전자선의 조사만으로 히알루론산을 가교시킬 수 있어, 미반응된 가교제가 잔류하여 인체에 독성을 유발하는 문제를 해결할 수 있고 이를 제거하는 별도의 공정이 필요하지 않다는 장점이 있다. 즉 본 발명에 따른 마이크로겔은 종래 사용되는 가교제, 또는 글리콜류의 가교 보조제 등을 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.

다른 실시예에서, 마이크로겔은 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol), PEG) 및/또는 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜에테르(poly(ethylene glycol) diglycidyl ether, PEGDE) 등의 가교제 내지는 가교 보조제를 더 포함하는 수용액이 가교되어 형성될 수도 있다.

전자선 가교를 통해 제조되는 마이크로겔은 Rheometer로 측정시 1Hz에서 점도(viscosity)가 15 내지 150Pa·s, 바람직하게는 약 45 내지 150Pa·s, 더 바람직하게는 약 100 내지 150Pa·s인 고점도의 겔로서 필러 시술용으로 사용하기에 적절한 점도를 가질 수 있다. 또 전자선 가교를 통해 제조되는 마이크로겔은 평균 입도가 약 30㎛ 내지 700㎛, 또는 약 40㎛ 내지 700㎛, 또는 약 50㎛ 내지 700㎛, 또는 약 100㎛ 내지 600㎛, 또는 약 150㎛ 내지 500㎛일 수 있다.

히알루론산의 가교가 적절히 일어나지 않아 나노 사이즈의 입자가 형성될 경우 점도가 너무 낮아 필러 시술용 머크겔에 사용하기 어렵기 때문에 본 발명의 실시예들과 같이 철저하게 설계된 조건으로 가교를 진행시키는 것이 중요하다.

히알루론산의 농도가 18w/v% 보다 낮을 경우 충분한 가교가 이뤄지지 않아 입자 크기가 감소하고 점도 하락을 야기할 수 있다. 반면 히알루론산의 농도가 25w/v%를 초과할 경우 입자 간의 뭉치거나 들러붙는 현상, 나아가 벌크겔이 형성될 수 있어 바람직하지 않다. 이 경우 겔화가 너무 진행되어 압출 기구 등을 이용한 주입이 곤란하고 필러 시술용으로 이용되기에 적합하지 않다.

전자선의 선량은 히알루론산 수용액의 농도와 밀접한 관련이 있는 것으로 추측된다. 다만 전술한 것과 같이 본 발명이 18w/v% 내지 25w/v% 농도 범위의 히알루론산 수용액을 이용하고 전자선을 펄스 또는 임펄스 조사할 경우, 전자선의 총 선량은 5kGy 내지 10kGy 범위, 또는 약 5kGy 내지 9kGy의 범위, 또는 약 5kGy 내지 8kGy의 범위에서 조사하는 것이 바람직함을 확인하였다. 전자선의 선량이 10kGy를 초과할 경우 히알루론산의 분해로 인해 입자 크기가 작아지고 최종적으로 겔의 점도가 낮아질 수 있다. 반면 전자선의 선량이 5kGy를 미달할 경우 입자 간의 뭉치거나 들러붙는 현상, 나아가 벌크겔이 형성되는 현상이 발생할 수 있어 바람직하지 않다.

상기 전자선의 선량은 히알루론산 수용액의 중량을 고려하여 선택될 수 있음을 통상의 기술자는 이해할 수 있을 것이다.

예를 들어 본 발명의 실시예들에서 사용되는 전자선의 에너지는 1MeV 내지 100 MeV일 수 있으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다. 또, 상기 18w/v% 내지 20w/v% 히알루론산 수용액을 제조하기 위한 히알루론산은 100kDa 이상, 또는 약 150kDa 이상, 또는 약 200kDa 이상의 분자량을 갖는 것을 이용할 수 있다. 만일 히알루론산의 분자량이 100kDa 이하일 경우 마이크로겔의 입도 제어가 어렵고 수백 나노 수준의 입자상 하이드로겔이 제조될 수 있다. 또, 히알루론산의 분자량의 상한은 약 500kDa, 또는 약 400kDa일 수 있다. 히알루론산의 분자량이 지나치게 클 경우 가교에 소요되는 시간이 과도하여 비경제적일 수 있다.

예시적인 실시예에서, 전자선의 조사는 소정의 주기를 갖는 형태로 수행될 수 있다. 예를 들어 펄스 조사 또는 임펄스 조사될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 '임펄스'는 극히 짧은 시간, 예컨대 수 밀리초 내지는 수십 밀리초의 시간 동안 충격이 가해지는 것을 의미한다. 이 경우 조사 주기(period)는 5초 내지 10초, 또는 약 6초 내지 8초일 수 있다. 조사 주기가 지나치게 짧을 경우 벌크 형태의 겔과 같이 가교가 이루어지거나, 또는 입자 간에 뭉치거나 들러붙는 현상이 발생할 수 있다. 조사 주기가 지나치게 길 경우 온전히 가교가 이루어지지 못하고 콜로이드와 겔이 혼합된 형태로 가교되고 점도가 현저하게 저하될 수 있다.

전자선의 조사가 수행되는 총 조사 시간은 가교가 이루어지는 마이크로겔의 형태에 따라 적절히 조절될 수 있으나, 예를 들어 약 10분 내지 30분일 수 있다. 총 조사 시간이 너무 짧으면 충분한 가교가 이루어지지 않을 수 있고 총 조사 시간이 너무 길면 입자 형태의 하이드로겔의 입도가 불균일해질 수 있다. 또, 조사 시간이 너무 길면 하이드로겔의 탁도가 증가할 수 있다.

전자선을 펄스 조사하는 경우 한 주기 내에서 전자선의 조사가 이루어지는 단위 조사 시간, 즉 펄스 폭(pulse width)은 약 3초 이하, 또는 약 2.5초 이하, 바람직하게는 약 2초 이하일 수 있다. 전술한 것과 같은 농도 및 선량의 조건 하에서 펄스 폭이 3초를 초과할 경우 입자 간에 뭉치거나 들러붙는 현상, 나아가 벌크 형태의 겔이 형성되는 현상이 발생할 수 있다. 펄스 폭의 하한은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 1 밀리초 이상, 또는 약 10 밀리초 이상, 또는 약 100밀리초 이상일 수 있다.

비제한적인 몇몇 실시예에서, 전자선을 펄스 조사하는 경우 전자선의 선량은 점차 증가하는 것이 바람직할 수 있다. 예컨대 전자선의 조사 횟수가 증가함에 따라 선량률은 점진적으로 증가할 수 있다. 즉, 선량률이 변화함에도 불구하고 총 선량은 모두 5kGy 내지 10kGy의 범위 내에 있을 수 있다. 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아니나 전자선 조사로 인해 마이크로겔화가 진행되는 과정에서 가교 효율이 점차 감소하는 것으로 추측되며, 따라서 선량률(단위 시간 당 에너지량)을 점진적으로 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.

몇몇 실시예에서 전자선을 조사하여 히알루론산을 가교시키는 단계는 50℃ 내지 60℃의 온도에서 수행될 수 있다.

한편, 상기 제1 히알루론산 수용액은 게니핀의 유도체를 더 포함할 수 있다. 게니핀의 유도체는 하기 화학식 1로 표현되는 것으로서 에폭시기를 가질 수 있다.

[화학식 1]

게니핀 및 게니핀의 유도체는 히알루론산과의 반응이 용이하며 히알루론산과 가교가 가능할 수 있다. 즉, 게니핀 및 게니핀의 유도체는 가교제(생체 친화성 가교제)로 기능할 수 있으나, 게니핀 및 게니핀 유도체의 기능이 용어 '가교제'에 국한되는 것은 아니다. 게니핀은 생체 독성이 매우 낮아(LD50 i.v. 382 mg/kg in mice) 잔류 성분의 제거가 실질적으로 불필요한 반면에 제조되는 머크겔의 물성을 개선할 수 있다. 즉, 하이드로겔의 가교율을 높일 수 있으며 게니핀 유도체는 히알루론산과의 분자간 가교 결합을 형성할 수 있다. 반면, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니나 게니핀 유도체 분자 간의 가교 결합은 실질적으로 이루어지지 않을 수 있다.

본 발명의 발명자는 히알루론산에 전자선을 조사하여 마이크로겔을 제조함에 있어서 게니핀이 아닌 게니핀의 유도체를 혼합할 경우 가교 효율이 증가하는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니나 본 발명의 베스트 모드에 있어서 히알루론산 수용액은 게니핀을 실질적으로 불포함할 수 있다.

게니핀 유도체의 함량 범위는 히알루론산 대비 약 0.1wt% 내지 0.5wt%일 수 있다. 만일 게니핀 유도체의 함량이 상기 범위를 초과할 경우 마이크로겔이 투명하지 못하고 불투명해져 필러 조성물로 적용이 곤란할 수 있다.

한편 몇몇 실시예에서, 전술한 것과 같이 제1 히알루론산 수용액을 준비하고, 제1 히알루론산 수용액에 전자선을 펄스 또는 임펄스 형태로 조사하기 시작한 이후에, 제1 히알루론산 수용액과 제2 히알루론산 수용액을 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제2 히알루론산 수용액을 혼합하는 단계는 전자선의 조사를 수행하는 것과 동시에 이루어질 수 있다. 즉, 전자선을 조사하는 도중에 제2 히알루론산 수용액을 더 혼합할 수 있고 전자선의 조사는 멈추지 않고 계속해서 수행될 수 있다.

제2 히알루론산 수용액은 제1 히알루론산 수용액 보다 더 높은 농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 제2 히알루론산 수용액의 농도의 하한은 약 20w/v%, 또는 약 21w/v%, 또는 약 22w/v%, 또는 약 23w/v%, 또는 약 24w/v%, 또는 약 25w/v%일 수 있다.

제1 히알루론산 수용액 내 히알루론산과 제2 히알루론산 수용액 내 히알루론산은 모두 마이크로겔의 형성에 기여할 수 있다. 본 실시예에 따라 추가적인 히알루론산을 혼합 및 가교시킬 경우 마이크로겔의 입도 균일성을 개선하고 탄성을 보다 향상시킬 수 있다. 만일 제2 히알루론산 수용액의 농도가 제1 히알루론산 수용액의 농도 보다 작을 경우 제1 히알루론산과 제2 히알루론산 간의 가교가 이루어지지 않고 입도 분포가 매우 커질 수 있다. 즉, 제2 히알루론산이 마이크로겔이 아니라 나노 사이즈의 겔을 형성할 수 있어 바람직하지 않다.

반면, 제2 히알루론산 수용액의 농도의 상한은 약 30w/v%일 수 있다. 제2 히알루론산 수용액의 농도가 30w/v%를 초과할 경우 벌크 형태의 겔이 제조될 수 있고 입도가 지나치게 커질 수 있다. 제2 히알루론산의 분자량은 제1 히알루론산과 동일하거나 상이할 수 있다.

몇몇 실시예에서, 제1 히알루론산과 제2 히알루론산 간의 혼합은 교반을 통해 수행될 수 있다. 이 경우 상기 교반은 호모게나이저 등을 이용할 수 있으나 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다. 교반 속도의 하한은 특별히 제한되지 않으나 효율적인 교반의 측면에서 약 500rpm 이상일 수 있다. 반면 교반 속도가 너무 크면 형성된 마이크로겔이 분쇄되거나, 또는 효율적인 가교가 이루어지지 않을 수 있다. 교반 속도의 상한은 약 1,000rpm일 수 있다.

전술한 것과 같이 마이크로 사이즈를 갖는 하이드로겔, 즉 마이크로겔을 필러 시술용으로 이용할 경우 입자의 입도 균일성이 매우 중요한 요소이다. 본 발명에 따르면 수십 마이크로 내지 수백 마이크로 수준의 입도를 가지며 입도 균일성이 우수한 마이크로겔을 수득할 수 있다.

상술한 본 발명의 실시예들에 따라 제조된 하이드로겔은 필러 시술용 머크겔로서 사용되기 위해 공지의 첨가 공정이나 멸균 공정 등을 추가적으로 거칠 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 필러 시술용 하이드로겔은 일반적으로 생리학적으로 허용되는 담체 유체, 예컨대 등장 완충액, 특히 바람직하게는 완충된 생리학적 식염수 용액을 포함할 수 있다.

예시적인 실시예에서, 본 발명의 필러 시술용 하이드로겔은 상기 조성물 100 중량부 대비 히알루론산의 체내 지속성 향상용 조성물을 1중량부 내지 20중량부로 포함할 수 있다.

본 발명의 필러 시술용 하이드로겔은 바람직하게는 미용적 질환을 치료하기 위해, 예컨대 피부의 주름살 또는 주름(예를 들어, 안면 주름 및 안면 주름살), 미간 주름, 비구순 주름, 턱 주름, 마리오네트 주름, 구강 교련, 입주위 주름살, 눈가 잔주름, 피부 함몰부, 흉터, 관자, 눈썹의 진피하 지지부, 광대 및 볼 지방 패드, 눈물 도랑, 코, 입술, 뺨, 입주위 영역, 안와하 영역, 안면 비대칭, 아래턱선 및 턱의 치료를 위해 투여될 수 있다. 또는, 치료적 적응증, 예컨대 복압성 요실금, 방광-요관 역류, 성대 주름 부전, 성대 주름 내측화를 치료하기 위해 투여될 수도 있다.

이하에서는 본 발명의 실시예들을 구체적인 제조예 및 실험예 등을 통해 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 머크 하이드로겔(hydrogel)의 제조 (실시예 1-1 내지 3-3)

약 200kDa의 히알루론산(hyaluronic acid)을 물에 녹여 5, 15 및 30 w/v% 수용액을 제조하고, 제조된 히알루론산 수용액에 직류형 전자선 가속기(electron-beam accelerator)를 사용하여 전자선을 1분간 하기 표 1과 같은 선량이 되도록 조사하여 히알루론산의 가교를 유도함으로써 실시예 1-1 내지 실시예 3-3의 하이드로겔을 제조하였다.

선량 / 농도	5 w/v%	15 w/v%	30 w/v%
0.1 kGy	실시예 1-1	실시예 2-1	실시예 3-1
3 kGy	실시예 1-2	실시예 2-2	실시예 3-2
10 kGy	실시예 1-3	실시예 2-3	실시예 3-3

실험예 1: 머크 하이드로겔의 점도(viscosity) 측정

Anton-Paar MCR 302 rheometer로 실시예 1-1 내지 실시예 3-3의 1 Hz에서의 점도를 측정하였으며, 결과는 하기 표 2와 같았다.

점도 (Pa·s)
실시예 1-1	0.038	실시예 2-1	0.051	실시예 3-1	0.17
실시예 1-2	196	실시예 2-2	882	실시예 3-2	1050
실시예 1-3	2	실시예 2-3	101	실시예 3-3	244

상기 표 2와 같은 점도는 실시예 1-1 내지 실시예 3-3의 벌크화 또는 겔화된 정도를 나타낼 수 있다. 실시예 1-1, 1-3, 2-1, 3-1의 경우 점도가 매우 낮고 가교가 충분히 이루어지지 않았거나, 나노 사이즈의 입자화가 이루어진 것으로 추측된다. 또한, 실시예 2-3 및 실시예 3-3의 경우 벌크화가 상당한 정도로 이루어진 것과 별개로, 머크겔이 균일한 점도를 갖지 못하고 부분적으로 상이한 점도를 갖는 것을 확인할 수 있었다. 특히 실시예 3-3의 경우 부분적으로 불투명한 정도가 심하였다.

이와 같이, 전자선의 선량이 3kGy에 가까울 수록, 히알루론산의 농도가 높을수록 가교가 잘되어 높은 점도 및 점탄성을 갖는 머크겔을 얻을 수 있음을 알 수 있다. 이는 전자선의 선량이 3kGy 보다 너무 낮으면 자유 라디칼의 생성이 어려워 가교가 충분히 일어나지 않고, 3kGy 보다 너무 높으면 히알루론산 사슬이 절단되어 분해가 일어나기 때문인 것으로 추측된다. 다만 본 발명이 어떠한 이론에 국한되는 것은 아님은 물론이다.

제조예 2: 마이크로겔의 제조 (실시예 4)

이번에는 상기 제조예 1을 통해 가장 바람직한 것으로 확인된 히알루론산의 농도와 전자선의 선량을 채택하여 약 200kDa 히알루론산 15w/v% 수용액에 3kGy 선량의 전자선을 조사하되, 전자선을 펄스 조사하여 히알루론산의 가교를 유도함으로써 실시예 4의 하이드로겔을 제조하였다.

구체적으로, 전자선의 펄스 조사가 총 20분 동안 7초의 주기를 갖도록 이루어지되, 각 주기 내에서 전자선은 2초간 조사되고 나머지 5초간 휴지기를 갖도록 하였다.

실험예 2: 마이크로겔의 입자 크기 및 점도 확인

실시예 4의 하이드로겔의 입자 크기를 DLS(Dynamic light scattering)로 확인하였으며, 그 결과는 도 1과 같았다. 또한, Anton-Paar MCR 302 rheometer로 실시예 4의 1 Hz에서 측정한 점도는 37Pa·s였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 전자선을 펄스 조사함으로써 상기 제조예 1을 통해 머크겔이 제조된 것과는 달리 필러 시술용으로 바로 사용하기에 적합한 입도를 갖는 마이크로겔이 제조되었음을 알 수 있다.

제조예 3: 마이크로겔의 제조 (실시예 5-1 내지 5-6)

상기 제조예 2와 동일한 방식으로 전자선을 펄스 조사하되, 히알루론산 수용액의 농도와 전자선의 총 선량을 하기 표 3과 같이 달리하여 히알루론산의 가교를 유도함으로써 실시예 5-1 내지 실시예 5-6의 하이드로겔을 제조하였다.

농도/선량	5kGy	10kGy
18w/v%	실시예 5-1	실시예 5-4
22w/v%	실시예 5-2	실시예 5-5
25w/v%	실시예 5-3	실시예 5-6

실험예 3: 마이크로겔의 입자 크기 확인

실시예 5-1 내지 실시예 5-6의 하이드로겔의 입자 크기를 DLS로 확인하였다.

도 2는 그 중 실시예 5-1, 5-2 및 5-6의 하이드로겔의 입자 크기를 DLS로 확인한 결과로서, (A) 내지 (C)는 각각 실시예 5-1, 5-2 및 5-6을 나타낸다. 도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 5-1, 5-2 및 5-6의 하이드로겔 입자가 도 1에 나타난 실시예 4의 하이드로겔 입자보다 균일하며, 특히 농도가 22w/v%인 것이 가장 입자가 균일함을 알 수 있다.

제조예 4: 마이크로겔의 제조 (실시예 6-1 내지 6-3)

상기 제조예 3의 실시예 5-2와 동일한 히알루론산 농도와 전자선 선량을 사용하되, 하기 표 4와 같이 펄스 방식을 달리하여 히알루론산의 가교를 유도함으로써 실시예 6-1 내지 실시예 6-3의 하이드로겔을 제조하였다.

	각 주기 내 조사 시간 (단위 조사 시간)	총 조사 시간
실시예 6-1	4초	20분
실시예 6-2	2초	5분
실시예 6-3	2초	80분

실험예 4: 마이크로겔의 입자 크기 확인

실시예 6-1 내지 실시예 6-3의 하이드로겔의 입자 크기를 DLS로 확인하였다.

도 3은 하이드로겔의 입자 크기를 DLS로 확인한 결과로서, (A) 내지 (C)는 각각 실시예 6-1, 6-2 및 6-3을 나타낸다. 도 3에 나타난 바와 같이, 각 주기 내 조사 시간인 단위 조사 시간이 2초보다 길거나 총 조사 시간이 20분보다 너무 짧거나 길면 입자 크기의 분포가 불균일해짐을 알 수 있다. 또, 실시예 6-2 및 6-3의 경우 입자 크기가 지나치게 감소하는 것을 확인하였다.

제조예 5: 고농도 히알루론산 수용액을 혼합하며 마이크로겔 제조 (실시예 7-1 내지 7-3)

상기 제조예 3의 실시예 5-2와 동일한 방법으로 히알루론산 수용액에 전자선을 펄스 조사하면서, 동시에 상기 히알루론산 수용액에 약 200kDa의 다른 히알루론산 수용액을 조금씩 가하면서 교반기로 혼합하였다. 교반기의 교반 속도 및 첨가해주는 히알루론산 수용액의 농도를 하기 표 5와 같이 달리하여 히알루론산의 가교를 유도함으로써 실시예 7-1 내지 실시예 7-3의 하이드로겔을 제조하였다.

	교반 속도 (rpm)	농도 (w/v%)
실시예 7-1	1000	27
실시예 7-2	2000	27
실시예 7-3	1000	15

실험예 5: 마이크로겔의 입자 크기 확인

실시예 7-1 및 실시예 7-2의 하이드로겔의 입자 크기를 DLS로 확인하였다.

도 4는 하이드로겔의 입자 크기를 DLS로 확인한 결과로서, (A) 및 (B)는 각각 실시예 7-1 및 7-2를 나타낸다.

도 4에 나타난 바와 같이, 전자선의 펄스 조사와 함께 상대적으로 고농도의 히알루론산 수용액을 혼합하면 상기 실시예 5-2보다 입자 크기가 균일한 마이크로겔을 얻을 수 있고 입자 크기가 증가할 수 있으나, 실시예 7-2과 같이 혼합 시 교반 속도가 너무 높으면(2000rpm) 입자가 분쇄되어 바람직하지 않음을 알 수 있다.

한편, 실시예 7-3은 DLS 상에서 뚜렷한 피크를 얻기 어려웠는데, 이를 통해 첨가해주는 히알루론산 수용액의 농도가 상대적으로 낮을 경우 입자 크기의 분포가 매우 불균일해짐을 추측할 수 있다.

제조예 6: 생체 친화성 가교제를 첨가하여 마이크로겔을 제조 (실시예 8-1 및 8-2)

상기 제조예 3의 실시예 5-2와 동일한 방법으로 히알루론산 수용액에 전자선을 펄스 조사하되, 상기 히알루론산 수용액은 생체 친화성 가교제인 게니핀(Genipin; Sigma-Aldrich)과 하기 화학식 1로 표현되는 그 유도체를 각각 히알루론산 대비 0.5 wt%로 첨가한 것을 사용하였다(실시예 8-1 및 실시예 8-2). 하기 화학식 1의 게니핀 유도체는 공지된 합성 방법을 이용하여 제조한 것을 이용하였다. (J. Luo, et al., ChemMedChem (2012) 1661-8)

[화학식 1]

실험예 6: 마이크로겔의 점도 확인

Anton-Paar MCR 302 rheometer로 실시예 7-1 및 실시예 7-2의 1 Hz에서의 점도를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 6과 같았다.

점도 (Pa·s)
실시예 7-1	45
실시예 7-2	101

상기 표 6에 나타난 바와 같이, 게니핀을 첨가한 경우 마이크로겔의 점도에 큰 변화가 없는 반면, 상기 화학식 1로 표현되는 게니핀의 유도체를 첨가한 경우 마이크로겔의 점도가 상당한 수준으로 향상되었음을 알 수 있다.

앞서 설명한 것과 같이, 히알루론산 등의 생체 적합성 고분자에 전자선을 조사하여 나노 사이즈의 입자를 형성하는 것이 보고된 바 있다. 그러나 나노 사이즈의 입자는 필러 시술용 하이드로겔로 적용이 불가능한 한계가 있으며, 본 발명의 발명자는 마이크로 사이즈의 겔을 형성하기 위한 시도를 하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명에 따르면 단순히 입자의 크기를 나노 사이즈에서 마이크로 사이즈로 증가시키는 것을 넘어 전자선 가교 만으로 마이크로겔을 형성할 수 있다. 또 마이크로겔이 우수한 입도 및 점도를 가짐으로써 필러 시술 등을 위한 하이드로겔로서 바로 적용할 수 있다는 효과가 있다.

이상에서 본 발명의 실시예를 중심으로 설명하였으나 이는 단지 예시일 뿐 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 실시예의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위에서 이상에 예시되지 않은 여러 가지의 변형과 응용이 가능함을 알 수 있을 것이다.

따라서 본 발명의 범위는 이상에서 예시된 기술 사상의 변경물, 균등물 내지는 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에 구체적으로 나타난 각 구성요소는 변형하여 실시할 수 있다. 그리고 이러한 변형과 응용에 관계된 차이점들은 첨부된 청구 범위에서 규정하는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (5)

18w/v% 내지 25w/v%의 제1 히알루론산 수용액에 5kGy 내지 10kGy 선량의 전자선을 펄스 또는 임펄스 조사하여 히알루론산을 적어도 부분적으로 가교시키는 단계를 포함하는 필러 시술용 마이크로겔의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 전자선을 펄스 또는 임펄스 조사할 경우, 조사 주기(period)는 5초 내지 10초이고,
상기 전자선을 펄스 조사할 경우, 한 주기 내에서 조사 시간은 3초 이하이며,
상기 전자선의 총 조사 시간은 10분 내지 60분인 것을 특징으로 하는 필러 시술용 마이크로겔의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 히알루론산을 가교시키는 단계는 50℃ 내지 60℃의 온도에서 수행되고,
상기 히알루론산은 100kDa 이상 500kDa 이하의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 필러 시술용 마이크로겔의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 전자선의 조사를 시작한 이후에,
상기 제1 히알루론산 수용액보다 높은 농도를 갖는 제2 히알루론산 수용액을 혼합하는 단계를 더 포함하되,
상기 제2 히알루론산 수용액의 농도의 상한은 30w/v%이고,
상기 제1 히알루론산 수용액과 상기 제2 히알루론산 수용액의 교반 속도는 500rpm 내지 1,000rpm이고,
상기 전자선의 조사는 상기 제2 히알루론산 수용액의 혼합과 동시에 계속해서 수행되는 것을 특징으로 하는 필러 시술용 마이크로겔의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 제1 히알루론산 수용액은 히알루론산의 중량을 기준으로 0.1wt% 내지 0.5wt%의 게니핀 유도체로서, 하기 화학식 1로 표현되는 게니핀 유도체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 필러 시술용 마이크로겔의 제조 방법.
[화학식 1]

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